JP2544637B2 - Modified human lysozyme, gene encoding the same and method for producing modified human lysozyme - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、殺菌剤、保存剤、医薬品などとして幅広く
使用される、天然型とは異なった塩濃度依存性及び水素
イオン濃度依存性を有する改変ヒト・リゾチーム、これ
をコードする遺伝子、該遺伝子を組込んだプラスミド及
び該改変ヒト・リゾチームの製造方法に関するものであ
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Industrial field of application) The present invention is widely used as a bactericide, a preservative, a drug, etc. and has a salt concentration dependency and a hydrogen ion concentration dependency different from those of the natural type. The present invention relates to modified human lysozyme, a gene encoding the same, a plasmid incorporating the gene, and a method for producing the modified human lysozyme.

（従来技術及びその問題点） リゾチームは分子量約14700のβ−（１−４）−Ｎ−
アセチルムラミダーゼ型の酵素活性を有するタンパク質
であって細菌の細胞壁を形成するペプチドグリカン中の
Ｎ−アセチルムラミン酸との間のグリコシド結合を選択
的に切断することができる酵素である。リゾチームは、
人の涙、乳や、ニワトリの卵白など高等動物の生体内に
広く分布し、多くの細菌に対して殺菌剤として作用し、
細菌感染より生体を防御する物質として働いている。ニ
ワトリ卵白には特に多くのリゾチームが含まれており、
比較的容易に単離できるため、種々の腐敗性食品の保存
に使用することができる。例えば、肉製品（A.アカシ
ら、J.Jap.J.Zootechnical Sci.42、289、1971）、ワイ
ンまたは酒（M.ヤジマら、J.Ferm.Technol.46、782、19
68）などの保存、また、乳児用乳製品、例えばミルク成
分の保存などに使用することができる。また、歯みがき
等医薬部外品の添加物として利用することができる（特
公昭55−49562号）。また、血液凝固及び止血作用、抗
炎症作用等をも有するので、これらを対象とした医薬品
としても利用できる。しかしながら、ニワトリ卵白由来
のリゾチームを使用するばあいには、しばしば発疹、発
赤などの過敏症状の現れることがあり、これは異種蛋白
による免疫応答による副作用とみなされる。このため本
発明者らは、このような免疫応答による副作用の問題の
ないヒト・リゾチームについて既に遺伝子工学的手法に
よる生産法（特開昭61−78383号、同61−78387号及び同
62−6679号）を提案している。リゾチームの示す溶菌活
性は作用環境の塩濃度及び水素イオン濃度（pH）により
大きく影響を受ける（たとえばR.C.DavisらBiochim.Bio
phys.Acta178、294、1969）ことが知られているが、リ
ゾチームの用途のうち特に食品の防腐に用いる場合に
は、その性格上使用可能な塩濃度あるいは水素イオン濃
度（pH）の制約のために、使用できない場合がある。そ
こで、天然に得られるリゾチームの至適域とは異なる塩
濃度域あるいは水素イオン濃度域において良好な溶菌活
性を示すリゾチームを容易にしかも大量に得る方法の確
立が望まれていた。(Prior art and its problems) Lysozyme is a β- (1-4) -N- with a molecular weight of about 14700.
It is a protein having an acetylmuramidase-type enzyme activity and is an enzyme capable of selectively cleaving a glycosidic bond with N-acetylmuramic acid in peptidoglycan forming a bacterial cell wall. Lysozyme
Widely distributed in the body of higher animals such as human tears, milk, and egg white of chickens, acting as a bactericidal agent against many bacteria,
It works as a substance that protects the body from bacterial infection. Chicken egg white contains a lot of lysozyme,
Since it can be isolated relatively easily, it can be used for preservation of various spoilage foods. For example, meat products (A. Akashi et al., J. Jap. J. Zootechnical Sci. 42, 289, 1971), wine or liquor (M. Yajima et al., J. Ferm. Technol. 46, 782, 19).
68) etc., and also for the storage of baby dairy products, eg milk components. It can also be used as an additive to quasi drugs such as toothpaste (Japanese Patent Publication No. 55-49562). Further, since it also has a blood coagulation and hemostatic action, an anti-inflammatory action, etc., it can be used as a drug for these. However, when lysozyme derived from chicken egg white is used, hypersensitivity symptoms such as rash and redness often appear, which is considered to be a side effect of an immune response caused by a heterologous protein. Therefore, the present inventors have already proposed a method for producing human lysozyme, which has no problem of side effects due to such an immune response, by a genetic engineering method (Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-78383, 61-78387 and 61-78387).
No. 62-6679) is proposed. The lytic activity of lysozyme is greatly affected by salt concentration and hydrogen ion concentration (pH) in the working environment (eg RC Davis et al. Biochim. Bio).
phys.Acta 178, 294, 1969) is known, but when used for preserving foods among the applications of lysozyme, due to the nature of salt or hydrogen ion concentration (pH) that can be used. In some cases, it cannot be used. Therefore, it has been desired to establish a method for easily obtaining a large amount of lysozyme having a good lytic activity in a salt concentration range or a hydrogen ion concentration range different from the optimum range of naturally obtained lysozyme.

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは既に天然に得られるヒト・リゾチームと
同一のアミノ酸配列を有するヒト・リゾチームに対応す
る遺伝子を化学合成（M.ムラキらAgric.Biol.Chem.,5
0、713、1986）し、それを酵母菌を用いる分泌発現系に
より発現させることを特徴とするヒト・リゾチームの微
生物学的製造法（Y.ヂガミらGene,43、273、1986）を確
立している。本発明はヒト・リゾチームの立体構造（C.
C.F.BlakeらNarure,NewBiol.232、12、1971）上、分子
表面に位置するアミノ酸残基を変換して荷電性アミノ酸
残基の数を増減させることにより、リゾチーム分子表面
の陽電荷を増加あるいは減少させると、天然に得られる
ヒト・リゾチームとはその活性における塩濃度依存性
（又は至適塩濃度）及び水素イオン濃度依存性（又は至
適水素イオン濃度）という性質が異なる改変ヒト・リゾ
チームを遺伝子工学的に製造することができるとの知見
に基づいてなされたのである。(Means for Solving Problems) The present inventors have already chemically synthesized a gene corresponding to human lysozyme having the same amino acid sequence as that of human lysozyme obtained naturally (M. Muraki et al. Agric. Biol. Chem. .,Five
0, 713, 1986) and a method for producing human lysozyme by expressing it by a secretory expression system using yeast (Y. Zigami et al. Gene, 43, 273, 1986) was established. ing. The present invention relates to the three-dimensional structure of human lysozyme (C.
CFBlake et al., Narure, New Biol. 232, 12, 1971), increase or decrease the positive charge on the surface of lysozyme molecule by converting amino acid residues located on the surface of the molecule to increase or decrease the number of charged amino acid residues. And genetically engineered modified human lysozyme, which differs from naturally-occurring human lysozyme in its activity-dependent salt concentration (or optimal salt concentration) and hydrogen ion concentration dependency (or optimal hydrogen ion concentration). It was made based on the knowledge that it can be manufactured in a targeted manner.

すなわち、本発明は天然型ヒト・リゾチームの構成ア
ミノ酸の少なくとも１つが他のアミノ酸で置換され、ヒ
ト・リゾチームの分子表面に位置する荷電性アミノ酸残
基の数が増加又は減少した、塩濃度依存性及び水素イオ
ン濃度依存性が天然型と異なる改変ヒト・リゾチームを
提供する。That is, in the present invention, at least one of the constituent amino acids of natural human lysozyme is substituted with another amino acid, and the number of charged amino acid residues located on the surface of the molecule of human lysozyme is increased or decreased. And a modified human lysozyme having a hydrogen ion concentration dependence different from that of the natural type.

また本発明は該改変ヒト・リゾチームをコードする遺
伝子、該遺伝子を組込んだプラスミド、及び該プラスミ
ドを含む酵母を培養することにより該改変ヒト・リゾチ
ームを製造する方法を提供する。The present invention also provides a method for producing the modified human lysozyme by culturing a gene encoding the modified human lysozyme, a plasmid incorporating the gene, and a yeast containing the plasmid.

天然型ヒト・リゾチームが第２図に示すアミノ酸配列
及びDNA配列を有することは例えばAgric.Bicl.Chem.4
9、2829（1985）や50、713（1986）に記載されている。
該アミノ酸配列における酸性アミノ酸残基AspやGluを−
１とし、塩基性残基であるLys、Argを＋１として合計す
ると天然型ヒト・リゾチームの前記合計は＋８となる。
これはリゾチームの等電点が約11（強塩基性）であるこ
ととも一致し、リゾチームの基質となる菌体の表層には
負荷電が多いので、溶菌活性において酵素と基質との間
に静電的相互作用があることが想像される。The fact that natural human lysozyme has the amino acid sequence and DNA sequence shown in FIG. 2 is, for example, Agric. Bicl. Chem. 4
9 , 2829 (1985) and 50 , 713 (1986).
The acidic amino acid residues Asp and Glu in the amino acid sequence
If the total number is 1, and the basic residues Lys and Arg are set to +1 and summed, the total of natural human lysozyme will be +8.
This is consistent with the fact that the isoelectric point of lysozyme is approximately 11 (strongly basic), and there are many negative charges on the surface layer of the bacterial cells that are the substrate for lysozyme. It is envisioned that there is electrical interaction.

そして、リゾチームの溶菌活性にはその分子表面に存
在する正荷電が強く係わることがニワトリ卵白リゾチー
ムを用いた化学修飾（R.C.DaviesらBiochim.Biophys.Ac
ta,178、306、1969）などの結果から示唆されている
が、遺伝子工学的手法を用いるアミノ酸残基の置換によ
り、表面荷電の変更を行う場合には、生産されたヒト・
リゾチームポリペプチド鎖が酵素活性を有する立体構造
へ折り畳まれるのに障害とならないようなアミノ酸残基
の置換位置を選択することが極めて重要である。このた
め、目的とする改変ヒト・リゾチームのアミノ酸配列の
設計を行うにあたってヒト・リゾチームと類縁のニワト
リ卵白、ヒヒ乳、ウシ胃のリゾチームのアミノ酸配列
（P.JollesらMol.Cell.Biochem.,63、165、1984）を比
較参照することにより、アミノ酸配列上保存性が低く、
従って、アミノ酸残基を置換してもヒト・リゾチームの
活性を損うことが少ないアミノ酸残基を選択し、対応す
るアミノ酸残基で置換することにより、表面荷電を変化
させた改変ヒト・リゾチームを得るのがよい。And, the lysozyme's lytic activity is strongly related to the positive charge present on the surface of the molecule. Chemical modification using chicken egg white lysozyme (RCDavies et al. Biochim. Biophys. Ac
ta, 178, 306, 1969), etc., but when the surface charge is changed by substituting amino acid residues using genetic engineering techniques, the
It is extremely important to select the substitution position of the amino acid residue that does not hinder the folding of the lysozyme polypeptide chain into the three-dimensional structure having enzymatic activity. Therefore, in designing the amino acid sequence of the target modified human lysozyme, the amino acid sequence of chicken lysozyme, which is related to human lysozyme, baboon milk, bovine stomach lysozyme (P. Jolles et al. Mol. Cell. Biochem., 63 , 165, 1984), the amino acid sequence has low conservation,
Therefore, by selecting an amino acid residue that does not impair the activity of human lysozyme even if the amino acid residue is replaced, and substituting it with the corresponding amino acid residue, a modified human lysozyme with a changed surface charge can be obtained. Good to get.

具体的には、置換すべきアミノ酸を、いわゆる“似た
もの同志を比べる”ことにより決定する。つまり、一次
構造上及び三次構造上、近縁のｃ−typeリゾチーム
（例、ヒト、ヒヒ、ウシ、ニワトリ）のアミノ酸配列を
比較し、第１図に示すように荷電アミノ酸残基に着目す
る。例えば、ヒト・リゾチームの41番目のアミノ酸残基
はアルギニンであるが、ヒヒやニワトリではグルタミン
が対応する。すなわち41番目のアミノ酸をアルギニンか
らグルタミンに変換することにより、立体構造的なひず
みを小さくおさえて、正荷電を一つ減らすことができ
る。また74番目のアミノ酸をバリンからアルギニンに変
換すれば逆に正荷電を一つ増やすことができる。このよ
うに類縁種に存在するが荷電の異なるヒト・リゾチーム
分子の表面に存在するアミノ酸残基の部位を選択してリ
ゾチーム表面の荷電状態を変える設計法は、ヒト・リゾ
チームの立体構造的なひずみをできるだけ少なくし、酵
素活性を保持する上で有効である。ここでヒト・リゾチ
ームの任意の数の構成アミノ酸を置換することができる
が、１又は２個のアミノ酸を置換するのがよい。Specifically, the amino acid to be replaced is determined by so-called "compare similar ones". That is, the amino acid sequences of c-type lysozyme (eg, human, baboon, bovine, chicken), which are closely related to each other in terms of primary structure and tertiary structure, are compared, and the charged amino acid residues are focused on as shown in FIG. For example, the 41st amino acid residue of human lysozyme is arginine, but baboon and chicken correspond to glutamine. That is, by converting the 41st amino acid from arginine to glutamine, it is possible to reduce the three-dimensional structural strain and reduce one positive charge. In addition, if the 74th amino acid is converted from valine to arginine, the positive charge can be increased by one. In this way, the design method to change the charge state of the surface of lysozyme by selecting the site of the amino acid residue existing on the surface of the human lysozyme molecule, which is present in the related species but with different charges, is the conformational strain of human lysozyme. Is effective in keeping the enzyme activity as low as possible. Here, any number of constituent amino acids of human lysozyme can be substituted, but it is preferable to substitute 1 or 2 amino acids.

次に、変異誘発性DNAオリゴマーを、公知の方法（例
えば、P.L.deHasethらNucleic Acid Res.,11、773、（1
983）参照）に準じて合成し、これをギャップド・デュ
ープレックス法（例えば、M.マツムラらMol.Gen.Gene
t.,204、355（1986）により、第２図に示すヒト・リゾ
チーム遺伝子の相当部位に導入する。Next, the mutagenic DNA oligomer was subjected to a known method (for example, PLde Haseth et al. Nucleic Acid Res., 11, 773, (1
983)), and the gapped duplex method (for example, M. Matsumura et al. Mol. Gen. Gene).
t., 204, 355 (1986), it is introduced into the corresponding site of the human lysozyme gene shown in FIG.

具体的には、化学合成ヒト・リゾチーム遺伝子を商業
的に入手しうるベクターであるM13mp11RFDNAにクローン
化することにより得たプラスミドを用いて大腸菌JM101
株を形質転換して得られる一本鎖DNAを鋳型DNAとし、こ
れに目的のアミノ酸残基の変異を導入するための化学合
成DNAオリゴマー（上記の変異誘発性DNAオリゴマー）を
用いる公知の種々の部位特異的突然変異導入方法（例え
ばM.J.ZollerらNucl.Acids.Res.,10、6487、1982やW.Kr
amerらNucl.Acids.Res.,12、9441、1984など）及び分子
生物学における公知の方法（例えば、モレキュラー ク
ローニング（Molecular Cloning,1982、Cold Spring Ha
rbor Lab.）により、目的の改変ヒト・リゾチームをコ
ードする遺伝子を得ることができる。また得られた変異
ヒト・リゾチーム遺伝子の発現ならびに生産された変異
ヒト・リゾチームの回収は公知の方法（Y.ヂガミらGen
e,43、273、1986）を用いておこなうことができる。こ
こに示した方法により、ヒト・リゾチームのアミノ酸配
列中Val74→Arg、Gln126→Arg、Arg41→Glnあるいは、A
rg101→Ser等の変異を単独にあるいは複数有する改変ヒ
ト・リゾチームを取得することが可能であるが、これ以
外に類縁リゾチーム間のアミノ酸配列の比較から類推可
能な変異を有するヒト・リゾチーム遺伝子、及びそれを
有する発現プラスミドを公知の酵母菌に導入し、この酵
母菌の培養によって取得される改変ヒト・リゾチーム蛋
白質もまた本発明の範囲内に含有されると考えるべきで
ある。Specifically, Escherichia coli JM101 was prepared using a plasmid obtained by cloning the chemically synthesized human lysozyme gene into M13mp11RFDNA, which is a commercially available vector.
A single-stranded DNA obtained by transforming a strain is used as a template DNA, and various chemically known DNA oligomers (the above-mentioned mutagenic DNA oligomers) for introducing a mutation of an amino acid residue of interest into the template DNA are used. Site-directed mutagenesis methods (eg MJ Zoller et al. Nucl. Acids. Res., 10, 6487, 1982 and W. Kr.
amer et al. Nucl. Acids. Res., 12, 9441, 1984, etc., and known methods in molecular biology (eg, Molecular Cloning, 1982, Cold Spring Ha.
rbor Lab.) makes it possible to obtain the gene encoding the desired modified human lysozyme. Expression of the obtained mutant human lysozyme gene and recovery of the produced mutant human lysozyme gene are known methods (Y. Digami et al.
e, 43, 273, 1986). By the method shown here, Val74 → Arg, Gln126 → Arg, Arg41 → Gln or A in the amino acid sequence of human lysozyme was used.
It is possible to obtain a modified human lysozyme having a single mutation or a plurality of mutations such as rg101 → Ser, but in addition to this, a human lysozyme gene having a mutation that can be inferred from comparison of amino acid sequences between related lysozymes, and It should be considered that the modified human lysozyme protein obtained by introducing an expression plasmid having the same into a known yeast and culturing the yeast is also included in the scope of the present invention.

（発明の効果） 表面荷電を変化させた改変ヒト・リゾチームは、天然
型ヒト・リゾチームと比較して、その溶菌活性の反応様
式が顕著にことなることが判明した。即ち、天然型より
も分子表面の正荷電を多くした改変ヒト・リゾチーム
は、（１）高いイオン強度下、あるいは（２）高いpH条
件下で天然型よりも活性を示した。また、正荷電を少な
くした、改変ヒト・リゾチームは逆に（１）低いイオン
強度下、あるいは（２）低いpH条件下で天然型よりも高
い活性を示した。(Effect of the invention) It has been found that the modified human lysozyme having a changed surface charge has a significantly different reaction pattern of lytic activity as compared with natural human lysozyme. That is, the modified human lysozyme, which had more positive charges on the surface of the molecule than the natural type, exhibited activity more than that of the natural type under (1) high ionic strength or (2) high pH conditions. On the contrary, the modified human lysozyme with less positive charge showed higher activity than the natural type under (1) low ionic strength or (2) low pH conditions.

これらの結果は幅広いリゾチームの用途のうち、その
溶菌活性を利用する場合（例えば食品の腐敗防止用添加
剤として利用する場合など）その作用環境に応じて、適
切な改変ヒト・リゾチームを利用することにより、天然
型よりも高い効果が期待できる。These results indicate that among the wide range of uses of lysozyme, when utilizing its lytic activity (for example, when it is used as an additive to prevent food spoilage), it is necessary to use an appropriate modified human lysozyme depending on its working environment. Therefore, a higher effect than the natural type can be expected.

次に実施例により本発明を説明する。 Next, the present invention will be described with reference to examples.

（実施例） 1.改変ヒト・リゾチームの設計法 置換すべきアミノ酸を、前述した“似たもの同志を比
べる”ことにより決定した。つまり、一次構造上及び三
次構造上、近縁のｃ−typeリゾチーム（例、ヒト、ヒ
ヒ、ウシ、ニワトリ）のアミノ酸配列を比較し、荷電性
アミノ酸残基に着目（第１図参照）して、天然型ヒト・
リゾチームのアミノ酸配列の（ａ）74番目のバリンをア
ルギニンで置換、（ｂ）126番目のグルタミンをアルギ
ニンで置換、（ｃ）41番目のアルギニンをグルタミンで
置換、（ｄ）101番目のアルギニンをセリンで置換、
（ｅ）74番目と126番目のバリンとグルタミンをそれぞ
れアルギニンで置換又は（ｆ）41番目と101番目のアル
ギニンをそれぞれグルタミンとセリンで置換することを
決定した。(Example) 1. Method for designing modified human lysozyme The amino acid to be substituted was determined by "compare similar ones" described above. That is, the amino acid sequences of closely related c-type lysozymes (eg, human, baboon, bovine, chicken) in primary structure and tertiary structure were compared, and the charged amino acid residues were focused (see FIG. 1). , Natural human
In the amino acid sequence of lysozyme, (a) 74th valine was replaced with arginine, (b) 126th glutamine was replaced with arginine, (c) 41th arginine was replaced with glutamine, (d) 101st arginine was replaced with serine. Replaced by,
(E) It was decided to replace the 74th and 126th valine and glutamine with arginine, respectively, or (f) the 41st and 101st arginine with glutamine and serine, respectively.

2.変異遺伝子の作製法 前記置換を行うために用いる変異誘発性DNAオリゴマ
ーを、公知の方法（例えば、 P.L.deHasethらNucleic Acid Res.,11、773（1983）参
照）に準じて、固相合成法により、Applied Biosystems
社製のDNA合成機（Medel 380A）を用いて合成した。合
成したオリゴマーのDNA配列は以下の通りであり、変異
誘発部位を下線で示した。2. Method for constructing mutant gene The mutagenic DNA oligomer used for the above substitution can be prepared by solid phase synthesis according to a known method (see, for example, PLdeHaseth et al. Nucleic Acid Res., 11, 773 (1983)). By Applied Biosystems
It was synthesized using a DNA synthesizer (Medel 380A) manufactured by the company. The DNA sequence of the synthesized oligomer is as follows, and the mutagenesis site is underlined.

ａ） Val74→Arg （５′）−GGCGCCCGTAACGCCTGT−（３′） ｂ） Gln126→Arg （５′）−GACAATACGTTAGAGGTTGTGG−（３′） ｃ） Arg41→Gln （５′）−TACAACACTCAAGCTACTAAC−（３′） ｄ） Arg101→Ser （５′）−GAGAGTCGTTTCAGACCCAC−（３′） 例えば、ａ）Val74→Argはヒト・リゾチームの74番目
のアミノ酸をバリンからアルギニンに変換するためのオ
リゴマーを表す。a) Val74 → Arg (5 ′)-GGCGCC CGT AACGCCTGT- (3 ′) b) Gln126 → Arg (5 ′)-GACAATACGTT AGA GGTTGTGG- (3 ′) c) Arg41 → Gln (5 ′)-TACAACACT CAA GCTACTAAC− (3 ′) d) Arg101 → Ser (5 ′)-GAGAGTCGTT TCA GACCCAC- (3 ′) For example, a) Val74 → Arg represents an oligomer for converting the 74th amino acid of human lysozyme from valine to arginine. .

これらのオリゴマーを、第２図に示すヒト・リゾチー
ム遺伝子の相当部位に、ギヤップド・デュープレックス
法（例えば、M.マツムラらMol.Gen.Genet.,204、355（1
986））により導入した。These oligomers were added to the corresponding sites of the human lysozyme gene shown in FIG. 2 by the geared duplex method (for example, M. Matsumura et al. Mol. Gen. Genet., 204, 355 (1
986)).

ヒト・リゾチーム遺伝子（HLYSIG）を含むSall−Hind
lll断片を制限酵素Sall及びHindlllで切断し、M13mp11R
F（amber）へ連結後、相当する一本鎖DNAを精製した（M
13mp11−HLYSIG）。Sall-Hind containing human lysozyme gene (HLYSIG)
The lll fragment was cleaved with restriction enzymes Sall and Hindlll, and M13mp11R
After ligation to F (amber), the corresponding single-stranded DNA was purified (M
13mp11-HLYSIG).

これにM13mp11RF（WT）のSall−Hindlll分解物を加え
95℃３分間加熱後、急冷し、適量のNaClを添加、68℃、
30分間保持することによりアニールさせた。アニールし
たギャップド・デュープレックスをアガロースゲルで精
製した。精製物はヒト・リゾチーム遺伝子に相当する範
囲（Sall−Hindlll）に一本鎖“ウィンドウ”を有す
る。このギャップド・デュープレックスの“ウィンド
ウ”に変異誘発性オリゴマー（a,b,c,d,a＋b,c＋ｄ）を
55℃で１時間アニールさせ、dNTPおよびクレノウポリメ
ラーゼによりオリゴマーを伸長し、T4−DNAリガーゼで
連結した。第３図に示すように、目的の変異リゾチーム
遺伝子をサプレッサー欠損の大腸菌（JM105株）で選択
した。変異したDNA配列を公知のジデオキシ法（Sanger.
F,Science,214、1205（1981））により確かめた。Add S13-Hindlll degradation product of M13mp11RF (WT) to this
After heating at 95 ℃ for 3 minutes, quench, add appropriate amount of NaCl, 68 ℃,
It was annealed by holding it for 30 minutes. The annealed gapped duplex was purified on an agarose gel. The purified product has a single-stranded "window" in the region corresponding to the human lysozyme gene (Sall-Hindlll). Mutagenic oligomers (a, b, c, d, a + b, c + d) are placed in the "window" of this gapped duplex.
After annealing at 55 ° C for 1 hour, the oligomer was extended with dNTP and Klenow polymerase and ligated with T4-DNA ligase. As shown in FIG. 3, the mutant lysozyme gene of interest was selected in suppressor-deficient E. coli (JM105 strain). The mutated DNA sequence was analyzed by the known dideoxy method (Sanger.
F, Science, 214, 1205 (1981)).

3.発現プラスミドの構築と発現 1.で作製した変異ヒト・リゾチーム遺伝子を含むSall
−Hindlll断片を、分泌発現用プラスミドYEp−HLYSIG
（Y.ヂガミらGene,43、273（1986））の野生型リゾチー
ム遺伝子（Sall−Hindlll）部分と置き換えた（第４図
参照）。こうして新たに得られたYEp−HLYSIG′を公知
の形質転換法（例えば、イトーらJ.Bacteriol.,153、16
3（1983）参照）に従って酵母に導入し発現させる（Y.
ヂガミらGene,43、273（1986））と、改変リゾチームが
培地中に分泌生産された。得られた改変ヒト・リゾチー
ムは、２に示した遺伝子に対応して順にａ）R74、ｂ）R
126、ｃ）Q41、ｄ）S101と命名した。また混合オリゴマ
ーを使って同時に２種類の変異を持つ改変ヒト・リゾチ
ーム、ａ＋ｂ）R74＋R126やｃ＋ｄ）Q41＋S101も同様に
作製した。3. Construction of expression plasmid and expression Sall containing mutant human lysozyme gene prepared in 1.
-Hindlll fragment is used as a secretory expression plasmid YEp-HLYSIG
(Y. Digami et al. Gene, 43, 273 (1986)) was replaced with the wild-type lysozyme gene (Sall-Hindlll) portion (see FIG. 4). The YEp-HLYSIG ′ thus newly obtained was transformed by a known transformation method (for example, Ito et al. J. Bacteriol., 153, 16).
3 (1983)) and introduced into yeast for expression (Y.
Digami et al., Gene, 43, 273 (1986)) and modified lysozyme were secreted and produced in the medium. The modified human lysozymes obtained were a) R74 and b) R in order corresponding to the genes shown in 2.
126, c) Q41, d) S101. In addition, a modified human lysozyme having two mutations at the same time, a + b) R74 + R126 and c + d) Q41 + S101, was also prepared by using the mixed oligomers in the same manner.

4.改変ヒト・リゾチームの単離・精製 各形質変換体を液体培地で30℃、72時間培養し、その
培養液を凍結乾燥して粗酵素を濃縮した。つづいて透析
により脱塩後、陽イオン交換カラムクロマトグラフ（Ph
armacia社製MonoS）で精製した。これらの精製手順は、
Y.ヂガミらGene,43、273（1986）に記載されている。4. Isolation and Purification of Modified Human Lysozyme Each transformant was cultured in a liquid medium at 30 ° C for 72 hours, and the culture solution was freeze-dried to concentrate the crude enzyme. Then, after desalting by dialysis, a cation exchange column chromatograph (Ph
It was purified by armacia MonoS). These purification procedures are
Y. Digami et al., Gene, 43, 273 (1986).

得られた改変ヒト・リゾチームについて、SDS−PAGE
を用いた電気泳動を行った結果を第５図に示すが、分子
量にはほとんど差がないことがわかる。またPAGEを用い
て電気泳動を行った結果を第６図に示すが第６図より確
かに電荷がかわっていることがわかる。尚、図中W.T.は
天然型ヒト・リゾチーム（シグマ社からの購入品）であ
る。SDS-PAGE of the obtained modified human lysozyme
Fig. 5 shows the result of the electrophoresis using C., but it can be seen that there is almost no difference in the molecular weight. The results of electrophoresis using PAGE are shown in Fig. 6, and it can be seen from Fig. 6 that the charges are certainly changed. In the figure, WT is natural human lysozyme (purchased from Sigma).

5.リゾチーム活性の測定法 リゾチーム活性は溶菌反応初速度で評価した。即ち、
Ｍrskyの方法（Anal.Biochem.,128、77（1983）参
照）に準じて、以下の方法で行った。Micrococcus lyso
deikticus菌体懸濁液（凍結乾燥菌体25mg/100ml 10mM
MES緩衝液（pH6.2））900μに、試料（0.3μg/ml）10
0μを添加し、すばやく混合後、25℃、1min間の濁度
（650nmの吸光度）の減少を測定し活性（反応初速度）
とした。尚、活性測定の標準品として用いた天然型ヒト
・リゾチームはシグマ社より購入した市販品である。5. Method for measuring lysozyme activity Lysozyme activity was evaluated by the initial rate of lysis reaction. That is,
According to the method of Mrsky (see Anal.Biochem., 128, 77 (1983)), the following method was used. Micrococcus lyso
deikticus cell suspension (lyophilized cells 25 mg / 100 ml 10 mM
MES buffer (pH 6.2)) 900μ, sample (0.3μg / ml) 10
Add 0 μm, mix rapidly, and measure the decrease in turbidity (absorbance at 650 nm) at 25 ° C for 1 min to determine the activity (initial reaction rate)
And The natural human lysozyme used as a standard product for activity measurement is a commercial product purchased from Sigma.

ｉ）イオン強度はMES緩衝液にNaClを適当濃度添加して
調整した。i) The ionic strength was adjusted by adding NaCl to MES buffer at an appropriate concentration.

ii）pHに対する活性依存性の測定には、各pHに応じて以
下のように緩衝液を使い分けた。ii) For the measurement of the activity dependence on pH, the buffer solution was properly used as follows according to each pH.

pH5.5 6.0 6.5: 10mM MES（２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝
液 pH7.0 7.5: 10mM HEPES（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′
−２−エタンスルホン酸）緩衝液 pH8.0 8.5: 10mM EPPS（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′
−３−プロパンスルホン酸）緩衝液 pH9.0 10.0: 10mM CHES（２−Ｎ−シクロヘキジルアミノエタンスル
ホン酸）緩衝液 6.改変ヒト・リゾチームの性質 表面の正荷電を増す変異体（R74、R126、R74＋R126）
とりわけR74＋R126は、高いイオン強度、0.12M＜NaCl＜
0.25Mで天然型ヒト・リゾチーム（W.T.）より高い活性
を示し、逆に正荷電を減らす変異体（Q41、S101、Q41＋
S101）、特にQ41＋S101は、低いイオン強度、OM＜NaCl
＜0.06Mの条件で天然型（W.T.）より高い活性を示した
（第７図参照）。pH5.5 6.0 6.5: 10 mM MES (2-N-morpholinoethanesulfonic acid) buffer solution pH 7.0 7.5: 10 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine N ')
-2-ethanesulfonic acid) buffer solution pH8.0 8.5: 10 mM EPPS (N-2-hydroxyethylpiperazine N '
(3-propanesulfonic acid) buffer pH 9.0 10.0: 10 mM CHES (2-N-cyclohexylaminoethanesulfonic acid) buffer 6. Properties of modified human lysozyme Mutants (R74, R126) that increase the positive charge on the surface , R74 + R126)
Especially R74 + R126 has high ionic strength, 0.12M <NaCl <
Mutants that show higher activity than native human lysozyme (WT) at 0.25 M and conversely reduce positive charge (Q41, S101, Q41 +
S101), especially Q41 + S101, has low ionic strength, OM <NaCl
Under the condition of <0.06M, the activity was higher than that of the natural type (WT) (see FIG. 7).

また、酵素反応のpHに関して、R74＋R126は高いpH条
件（例えば、100mM NaCl、7.0＜pH＜9.5）で高い活性を
もち、Q41＋S101は低いpH（例えば、40mM NaCl、5.5＜p
H＜7.5）で野生型やり高い活性を示した（第８図参
照）。Regarding the pH of the enzyme reaction, R74 + R126 has high activity under high pH conditions (eg, 100 mM NaCl, 7.0 <pH <9.5), and Q41 + S101 has low pH (eg, 40 mM NaCl, 5.5 <p).
H <7.5) showed high activity in the wild type (see FIG. 8).

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第１図は、一文字表記による天然型ｃ−typeリゾチーム
のアミノ酸配列であり、上からヒト、ヒヒ、ウシ、ニワ
トリ由来のリゾチームを示す。但し、ヒト以外のものに
ついては相違部位のみを示した。 第２図は、合成したヒト・リゾチーム遺伝子。上段にア
ミノ酸、下段にDNA配列を示す。矢印はシグナルペプチ
ドの切断点を示す。 第３図は、ギャップド・デュープレックス法による変異
遺伝子の作製法を示す。 第４図は、Ga110プロモーター、ニワトリリゾチームの
シグナル配列を利用した酵母でのヒト・リゾチーム発現
用プラスミドを示す。 第５図及び第６図は、本発明の改変ヒト・リゾチームの
電気泳動を示す。 第７図は、イオン強度に対する活性の違いを比較した結
果を示し、第８図は、pHに対する活性の違いを比較した
結果を示す。FIG. 1 is an amino acid sequence of natural c-type lysozyme expressed by one-letter code, showing lysozyme derived from human, baboon, bovine, and chicken from the top. However, only the different sites are shown for those other than humans. Figure 2 shows the synthesized human lysozyme gene. The amino acid is shown in the upper row and the DNA sequence is shown in the lower row. The arrow indicates the cleavage point of the signal peptide. FIG. 3 shows a method for producing a mutant gene by the gapped duplex method. FIG. 4 shows a plasmid for expressing human lysozyme in yeast, which utilizes the Ga110 promoter and the signal sequence of chicken lysozyme. 5 and 6 show electrophoresis of the modified human lysozyme of the present invention. FIG. 7 shows the result of comparing the difference in activity with respect to ionic strength, and FIG. 8 shows the result of comparing the difference in activity with respect to pH.

フロントページの続き (72)発明者 田中 秀明 茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地 工業技術院化学技術研究所内 (72)発明者 森川 正章 神奈川県横浜市神奈川区千若町１―３ 日清製油株式会社研究所内 審査官 村上 騎見高Front page continued (72) Inventor Hideaki Tanaka, 1-1 Higashi, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki Inside Institute for Chemical Research, Institute of Industrial Science and Technology (72) Inventor Masaaki Morikawa 1-3, Chiwaka-cho, Kanagawa-ku Yokohama Nisshin Oil In-house researcher Examiner Kimitaka Murakami

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】天然型ヒト・リゾチームの構成アミノ酸の
少なくとも１つが他のアミノ酸で置換され、ヒト・リゾ
チームの分子表面に位置する荷電性アミノ酸残基の数が
増加又は減少した、塩濃度依存性及び水素イオン濃度依
存性が天然型と異なる改変ヒト・リゾチーム。1. Salt-concentration dependence in which at least one of the constituent amino acids of natural human lysozyme is substituted with another amino acid, and the number of charged amino acid residues located on the surface of the molecule of human lysozyme is increased or decreased. And modified human lysozyme whose dependence on hydrogen ion concentration is different from the natural type. 【請求項２】ヒト・リゾチームの１次配列上の保存性が
低いアミノ酸が、ヒトと類縁種のリゾチームの対応する
アミノ酸であって、ヒト・リゾチームの該アミノ酸とは
荷電の異なるアミノ酸で置換されている特許請求の範囲
第（１）項記載の改変ヒト・リゾチーム。2. An amino acid having low conservativeness in the primary sequence of human lysozyme is replaced with an amino acid corresponding to human and lysozyme, which has a different charge from the amino acid of human lysozyme. The modified human lysozyme according to claim (1). 【請求項３】天然型ヒト・リゾチームのアミノ酸配列の
（ａ）74番目のバリンがアルギニンで置換、（ｂ）126
番目のグルタミンがアルギニンで置換、（ｃ）41番目の
アルギニンがグルタミンで置換、（ｄ）101番目のアル
ギニンがセリンで置換、（ｅ）74番目と126番目のバリ
ンとグルタミンがそれぞれアルギニンで置換又は（ｆ）
41番目と101番目のアルギニンがそれぞれグルタミンと
セリンで置換されている特許請求の範囲第（１）項記載
の改変ヒト・リゾチーム。3. Amino acid sequence of natural human lysozyme (a) 74th valine is replaced with arginine, (b) 126
The glutamine of the th is replaced by arginine, (c) the arginine of the 41st is replaced by glutamine, (d) the arginine of the 101st is replaced by serine, (e) the valine and glutamine of 74th and 126th are replaced by arginine, respectively, or (F)
The modified human lysozyme according to claim (1), wherein the 41st and 101st arginines are substituted with glutamine and serine, respectively. 【請求項４】天然型ヒト・リゾチームの構成アミノ酸の
少なくとも１つが他のアミノ酸で置換され、ヒト・リゾ
チームの分子表面に位置する荷電性アミノ酸残基の数が
増加又は減少した、塩濃度依存性及び水素イオン濃度依
存性が天然型と異なる改変ヒト・リゾチームをコードす
る変異型ヒト・リゾチーム遺伝子。4. Salt concentration dependence, wherein at least one of the constituent amino acids of natural human lysozyme is substituted with another amino acid, and the number of charged amino acid residues located on the molecular surface of human lysozyme is increased or decreased. And a mutant human lysozyme gene that encodes a modified human lysozyme whose hydrogen ion concentration dependence differs from that of the natural type. 【請求項５】天然型ヒト・リゾチームのアミノ酸配列の
（ａ）74番目のバリンがアルギニンで置換、（ｂ）126
番目のグルタミンがアルギニンで置換、（ｃ）41番目の
アルギニンがグルタミンで置換、（ｄ）101番目のアル
ギニンがセリンで置換、（ｅ）74番目と126番目のバリ
ンとグルタミンがそれぞれアルギニンで置換又は（ｆ）
41番目と101番目のアルギニンがそれぞれグルタミンと
セリンで置換されている改変リゾチームをコードする特
許請求の範囲第（４）項記載の変異型ヒト・リゾチーム
遺伝子。5. Amino acid sequence of natural human lysozyme (a) 74th valine is replaced with arginine, (b) 126
The glutamine of the th is replaced by arginine, (c) the arginine of the 41st is replaced by glutamine, (d) the arginine of the 101st is replaced by serine, (e) the valine and glutamine of 74th and 126th are replaced by arginine, respectively, or (F)
The mutant human lysozyme gene according to claim (4), which encodes a modified lysozyme in which the 41st and 101st arginines are substituted with glutamine and serine, respectively. 【請求項６】天然型ヒト・リゾチームの構成アミノ酸の
少なくとも１つが他のアミノ酸で置換され、ヒト・リゾ
チームの分子表面に位置する荷電性アミノ酸残基の数が
増加又は減少した、塩濃度依存性及び水素イオン濃度依
存性が天然型と異なる改変ヒト・リゾチームをコードす
る変異型ヒト・リゾチーム遺伝子と酵母で機能する分泌
シグナル遺伝子とからなる前駆体遺伝子を酵母のプロモ
ーターとターミネーターの間に挿入した改変ヒト・リゾ
チーム分泌発現用プラスミド。6. A salt concentration dependence, wherein at least one of the constituent amino acids of natural human lysozyme is substituted with another amino acid, and the number of charged amino acid residues located on the molecular surface of human lysozyme is increased or decreased. And a modification in which a precursor gene consisting of a mutant human lysozyme gene encoding a modified human lysozyme and a secretory signal gene that functions in yeast is inserted between the yeast promoter and terminator Human lysozyme secretory expression plasmid. 【請求項７】変異型ヒト・リゾチーム遺伝子が、天然型
ヒト・リゾチームのアミノ酸配列の（ａ）74番目のバリ
ンがアルギニンで置換、（ｂ）126番目のグルタミンが
アルギニンで置換、（ｃ）41番目のアルギニンがグルタ
ミンで置換、（ｄ）101番目のアルギニンがセリンで置
換、（ｅ）74番目と126番目のバリンとグルタミンがそ
れぞれアルギニンで置換又は（ｆ）41番目と101番目の
アルギニンがそれぞれグルタミンとセリンで置換されて
いる改変リゾチームをコードするものである特許請求の
範囲第（６）項記載のプラスミド。7. In the mutant human lysozyme gene, valine at position 74 (a) of the amino acid sequence of natural human lysozyme is replaced with arginine, (b) glutamine at position 126 is replaced with arginine, and (c) 41. The arginine of the th is replaced by glutamine, (d) the arginine of the 101st is replaced by serine, (e) the valine and glutamine of the 74th and the 126th are replaced by arginine respectively, or (f) the arginine of the 41st and 101th is respectively The plasmid according to claim (6), which encodes a modified lysozyme substituted with glutamine and serine. 【請求項８】天然型ヒト・リゾチームの構成アミノ酸の
少なくとも１つが他のアミノ酸で置換され、ヒト・リゾ
チームの分子表面に位置する荷電性アミノ酸残基の数が
増加又は減少した、塩濃度依存性及び水素イオン濃度依
存性が天然型と異なる改変ヒト・リゾチームをコードす
る変異型ヒト・リゾチーム遺伝子と酵母で機能する分泌
シグナル遺伝子とからなる前駆体遺伝子を酵母のプロモ
ーターとターミネーターの間に挿入した改変ヒト・リゾ
チーム分泌発現用プラスミドを含む酵母を培養し培養液
中に分泌された改変ヒト・リゾチームを単離、精製する
ことを特徴とする改変ヒト・リゾチームの製造法。8. A salt concentration dependence, wherein at least one of the constituent amino acids of natural human lysozyme is substituted with another amino acid, and the number of charged amino acid residues located on the molecular surface of human lysozyme is increased or decreased. And a modification in which a precursor gene consisting of a mutant human lysozyme gene encoding a modified human lysozyme and a secretory signal gene that functions in yeast is inserted between the yeast promoter and terminator A method for producing modified human lysozyme, which comprises culturing yeast containing a plasmid for secreting expression of human lysozyme, isolating and purifying modified human lysozyme secreted in the culture medium.