JP2531246B2 - 耐熱性dnaポリメラ―ゼおよびその製法 - Google Patents
耐熱性dnaポリメラ―ゼおよびその製法Info
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- JP2531246B2 JP2531246B2 JP21333088A JP21333088A JP2531246B2 JP 2531246 B2 JP2531246 B2 JP 2531246B2 JP 21333088 A JP21333088 A JP 21333088A JP 21333088 A JP21333088 A JP 21333088A JP 2531246 B2 JP2531246 B2 JP 2531246B2
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- dna polymerase
- thermostable dna
- nucleic acid
- phosphate
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、耐熱性DNAポリメラーゼおよびその製法に
関する。さらに詳しくは、本発明はサーマス(Thermu
s)属に属する菌株、例えばサマー・モフィラス(Therm
us thermophilus)が生産する熱安定性に優れたDNAポリ
メラーゼおよびその製法に関する。
関する。さらに詳しくは、本発明はサーマス(Thermu
s)属に属する菌株、例えばサマー・モフィラス(Therm
us thermophilus)が生産する熱安定性に優れたDNAポリ
メラーゼおよびその製法に関する。
本発明の耐熱性DNAポリメラーゼは、核酸の増幅およ
び塩基配列決定等の遺伝子操作技術に用いられる。
び塩基配列決定等の遺伝子操作技術に用いられる。
(従来の技術) 従来から知られている耐熱性DNAポリメラーゼとして
は、サーマス・アクアティカスYT−I(Thermus aquati
cusYT−I:ATCC 25104)由来のものが知られている。エ
イ・チエン(A.Chien)ら、〔J.Bacteril.(1976年)12
7巻、1550〜1557頁〕は、サーマス・アクアティカスYT
−I(Thermus aquaticusYT−I)から、DNAポリメラー
ゼの単離及び精製法を開示し、この酵素の酵素的性質
(温度、pH、2価イオン濃度等の影響)を報告してい
る。
は、サーマス・アクアティカスYT−I(Thermus aquati
cusYT−I:ATCC 25104)由来のものが知られている。エ
イ・チエン(A.Chien)ら、〔J.Bacteril.(1976年)12
7巻、1550〜1557頁〕は、サーマス・アクアティカスYT
−I(Thermus aquaticusYT−I)から、DNAポリメラー
ゼの単離及び精製法を開示し、この酵素の酵素的性質
(温度、pH、2価イオン濃度等の影響)を報告してい
る。
またサーマス・アクアティカスYT−I由来DNAポリメ
ラーゼ(以下Taqポリメラーゼと呼ぶ)の利用法とし
て、既存の核酸配列を初めに存在する量に比べて大量に
増幅する方法が、サイキ(Saiki)らのScience,230巻、
1350〜1354頁(1985年)及びサイキ(Saiki)らのBio/T
echnology、3巻、1008〜1012頁(1985年)、及び特開
昭63−102677号公報に記載されている。この方法は、核
酸の変性、鋳型とプライマーのアニリングプライマーの
伸長の各工程からなり、この工程のくり返すことにより
増幅する。このプライマー伸長工程で、DNAポリメラー
ゼが用いられる。耐熱性DNAポリメラーゼを用いた場
合、熱によって酵素活性が破壊されないので、各変性工
程の後に酵素を添加する必要がないと言う利点がある。
しかしながらTaqポリメラーゼをこの工程に用いた場
合、各工程のくり返し、特に、核酸の変性工程(約90℃
〜105℃への加温)において酵素活性の低下が起り、充
分な増幅が得られない短所があった。したがってより耐
熱性の高いポリメラーゼが望まれていた。
ラーゼ(以下Taqポリメラーゼと呼ぶ)の利用法とし
て、既存の核酸配列を初めに存在する量に比べて大量に
増幅する方法が、サイキ(Saiki)らのScience,230巻、
1350〜1354頁(1985年)及びサイキ(Saiki)らのBio/T
echnology、3巻、1008〜1012頁(1985年)、及び特開
昭63−102677号公報に記載されている。この方法は、核
酸の変性、鋳型とプライマーのアニリングプライマーの
伸長の各工程からなり、この工程のくり返すことにより
増幅する。このプライマー伸長工程で、DNAポリメラー
ゼが用いられる。耐熱性DNAポリメラーゼを用いた場
合、熱によって酵素活性が破壊されないので、各変性工
程の後に酵素を添加する必要がないと言う利点がある。
しかしながらTaqポリメラーゼをこの工程に用いた場
合、各工程のくり返し、特に、核酸の変性工程(約90℃
〜105℃への加温)において酵素活性の低下が起り、充
分な増幅が得られない短所があった。したがってより耐
熱性の高いポリメラーゼが望まれていた。
(問題点を解決するための手段) 本発明者らは、上記問題点を解決するため、従来の耐
熱性DNAポリメラーゼよりも熱安定性に優れた耐熱性DNA
ポリメラーゼを見い出すことを目的として鋭意研究を重
ねた結果、サーマス属に属する菌株からより熱安定性に
優れた耐熱性DNAポリメラーゼを見い出すことに成功し
た。
熱性DNAポリメラーゼよりも熱安定性に優れた耐熱性DNA
ポリメラーゼを見い出すことを目的として鋭意研究を重
ねた結果、サーマス属に属する菌株からより熱安定性に
優れた耐熱性DNAポリメラーゼを見い出すことに成功し
た。
すなわち本発明はpH8.0において85℃、2時間の処理
によって、その残存活性が少なくとも約60%である耐熱
性DNAポリメラーゼおよびサーマス属に属する菌株を培
養し、培養物から、pH8.5において85℃、2時間の処理
によって、その残存活性が少なくとも約60%である耐熱
性DNAポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性D
NAポリメラーゼの製法である。
によって、その残存活性が少なくとも約60%である耐熱
性DNAポリメラーゼおよびサーマス属に属する菌株を培
養し、培養物から、pH8.5において85℃、2時間の処理
によって、その残存活性が少なくとも約60%である耐熱
性DNAポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性D
NAポリメラーゼの製法である。
本発明の酵素を生産する菌株としては、サーマス属に
属する菌株、例えばサーマス・サーモフィラスHB8(ATC
C 27634)などが挙げられる。
属する菌株、例えばサーマス・サーモフィラスHB8(ATC
C 27634)などが挙げられる。
本発明の酵素を製造するに当っては、サーマス属に属
する菌株、例えばサーマス・サーモフィラスHB8(ATCC
27634)を通常の方法で培養する。使用する培地組成
は、使用菌株が、資化しうる炭素源、窒素源、無機物、
その他栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、
天然培地いずれも使用できる。例えば炭素源としては、
グルコース、シュークロース、デキストリン、糖蜜など
が使用される。窒素源としては、例えばペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などの窒素含有
天然物や、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、グル
タミン酸などのアミノ酸など、無機あるいは有機の窒素
化合物が、使用される。
する菌株、例えばサーマス・サーモフィラスHB8(ATCC
27634)を通常の方法で培養する。使用する培地組成
は、使用菌株が、資化しうる炭素源、窒素源、無機物、
その他栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、
天然培地いずれも使用できる。例えば炭素源としては、
グルコース、シュークロース、デキストリン、糖蜜など
が使用される。窒素源としては、例えばペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などの窒素含有
天然物や、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、グル
タミン酸などのアミノ酸など、無機あるいは有機の窒素
化合物が、使用される。
培養は、通常振盪培養あるいは、通気攪拌培養で行な
う。培養温度は50℃〜80℃の範囲、好ましくは、75℃付
近、培養pHは、5〜10の範囲、好ましくはpH7〜9に制
御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株
が生育すれば、実施できる。培養期間は、通常1〜3日
間で生育し菌体内に耐熱性DNAポリメラーゼが生成蓄積
される。
う。培養温度は50℃〜80℃の範囲、好ましくは、75℃付
近、培養pHは、5〜10の範囲、好ましくはpH7〜9に制
御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株
が生育すれば、実施できる。培養期間は、通常1〜3日
間で生育し菌体内に耐熱性DNAポリメラーゼが生成蓄積
される。
本発明の酵素の精製方法は一般使用される精製法を用
いればよい。例えば抽出法には、超音波破砕、ガラスビ
ーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性
剤など、いずれを用いてもよい。さらに抽出液について
は、公知の硫安や芒硝などの塩析法、塩化マグネシウム
や塩化カルシウムなどの金属凝集法、さらにはDEAE(ジ
エチルアミノエチル)セファロース、CM(カルボキシメ
チル)セファロースなどのイオン交換体クロマト法など
により精製することができる。
いればよい。例えば抽出法には、超音波破砕、ガラスビ
ーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性
剤など、いずれを用いてもよい。さらに抽出液について
は、公知の硫安や芒硝などの塩析法、塩化マグネシウム
や塩化カルシウムなどの金属凝集法、さらにはDEAE(ジ
エチルアミノエチル)セファロース、CM(カルボキシメ
チル)セファロースなどのイオン交換体クロマト法など
により精製することができる。
次に本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの理化学的性質
について述べる。
について述べる。
(1) 作用 核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためのデオ
キシリボヌクレオシド−3リン酸の結合を触媒する。鋳
型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためには、核酸鎖の他
に、鋳型鎖にアニールし得るオリゴヌクレオチドのプラ
イマーおよび、鋳型塩基と相補し得る4種類のデオキシ
リボヌクレオシド−3リン酸を必要とする。
キシリボヌクレオシド−3リン酸の結合を触媒する。鋳
型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためには、核酸鎖の他
に、鋳型鎖にアニールし得るオリゴヌクレオチドのプラ
イマーおよび、鋳型塩基と相補し得る4種類のデオキシ
リボヌクレオシド−3リン酸を必要とする。
(2) 至適pHが75℃付近において、約7.8〜8.5であ
る。
る。
(3) 至適温度が約75℃である。
(4) Mg2+を要求し、その至適濃度が6〜20mMであ
る。Mg2+以外の金属イオン、例えばMn2+等でも、その一
部を代替することが出来る。
る。Mg2+以外の金属イオン、例えばMn2+等でも、その一
部を代替することが出来る。
(5) 至適塩濃度が約10mM〜30mMのNaCl又はKClであ
る。
る。
(6) pH8.0において85℃、2時間の処理によって、
その残存活性が少なくとも約60%である。
その残存活性が少なくとも約60%である。
(7) 分子量が約85,000〜95,000ダルトン(SDS−ポ
リアクリルアミド電気泳動による)である。
リアクリルアミド電気泳動による)である。
次に本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの活性測定法を
示す。
示す。
500mM Tris塩酸緩衝液、pH8.0(25℃にての値) 100mM MgCl2 2mM dATP,dCTP,dGTP 2mM〔3H〕TTP 100mM 2−メルカプトエタノール 上記液5μに、1μg/μの活性化した仔牛胸線5
μを加え、さらに蒸留水35μを加え反応液とする。
反応液45μに酵素液5μを添加し、ゆるやかに混和
後、75℃で30分間加温する。
μを加え、さらに蒸留水35μを加え反応液とする。
反応液45μに酵素液5μを添加し、ゆるやかに混和
後、75℃で30分間加温する。
反応終了後、氷上にて、0.1Mピロリン酸ナトリウム50
μ、1M過塩素酸100μを加え、1時間以上氷上に放
置する。この後、GF/Cフィルター(Whatman社製)にて
濾過を行なう。フィルターを0.1N塩酸及び冷エタノール
で洗浄し、フィルターを液体シンチレーションカウンタ
ー(アロカLSC−700)にて、〔3H〕を測定し、酸不溶画
分への〔3H〕TTPの取り込み量を計算する。
μ、1M過塩素酸100μを加え、1時間以上氷上に放
置する。この後、GF/Cフィルター(Whatman社製)にて
濾過を行なう。フィルターを0.1N塩酸及び冷エタノール
で洗浄し、フィルターを液体シンチレーションカウンタ
ー(アロカLSC−700)にて、〔3H〕を測定し、酸不溶画
分への〔3H〕TTPの取り込み量を計算する。
本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの活性の表示は上記
条件下で30分間に10nmolesのTTPの酸不溶画分への取り
込みを1単位(U)とした。
条件下で30分間に10nmolesのTTPの酸不溶画分への取り
込みを1単位(U)とした。
本発明の耐熱性DNAポリメラーゼはpH8.0において85
℃、2時間の処理によって、その残存活性が少なくとも
60%であり、従来のDNAポリメラーゼより耐熱性に優れ
る。
℃、2時間の処理によって、その残存活性が少なくとも
60%であり、従来のDNAポリメラーゼより耐熱性に優れ
る。
(実施例) 以下実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
実施例1 ポリペプトン1.0%、酵母エキス0.5%、NaCl0.2%を
含む培地(pH7.5)100mlを500ml容坂口フラスコに移
し、121℃で、15分間オートクレーブ殺菌を行なった。
放冷した後、種菌としてサーマスサーモフィラスHB8(A
TCC27634)を同培地に一白金耳接種し、70℃で24時間振
盪培養し、種培養液とした。次に同培地6を10・ジ
ャーファメンターに移し、121℃、15分間オートクレー
ブを行なった。放冷後これに種培養液100mlを移し、400
rpm、通気量2/分、70℃で10時間培養した。
含む培地(pH7.5)100mlを500ml容坂口フラスコに移
し、121℃で、15分間オートクレーブ殺菌を行なった。
放冷した後、種菌としてサーマスサーモフィラスHB8(A
TCC27634)を同培地に一白金耳接種し、70℃で24時間振
盪培養し、種培養液とした。次に同培地6を10・ジ
ャーファメンターに移し、121℃、15分間オートクレー
ブを行なった。放冷後これに種培養液100mlを移し、400
rpm、通気量2/分、70℃で10時間培養した。
培養液6を遠心分離にて集菌し、10mM2−メルカプ
トエタノール、5%グリセロールを含むK−リン酸緩衝
液pH7.5(以下緩衝液Aとする)に懸濁した。超音波破
砕機(海上電気製、19KHz)にて20分間処理し、遠心分
離してその上清液を得た。上清液を硫安塩析後、緩衝液
Aに対して透析を行なった。この液を緩衝液Aにて平衡
化したDEAE−セファロースCL−6B(ファルマシア社製)
カラクロマトグラフィーに供し、0〜0.5M NaClを含む
緩衝液A溶出画分にDNAポリメラーゼ活性を得た。活性
画分を50mM緩衝液Aに対して透析した。同透析液を緩衝
液Aにて平衡化したフォスホセルロースP−11(Whatma
n社製)カルクロマトグラフィーに供し、0〜0.5M NaCl
を含む緩衝液A溶出画分にDNAポリメラーゼ活性を得
た。活性画分を緩衝液Aに対して透析した。さらに同透
析液を緩衝液Aにて平衡化したnative DNAセルロース
(ファルマシア社製)カラムクロマトグラフィーに供
し、0〜0.5M NaClを含む緩衝液A溶出画分に1,200UのD
NAポリメラーゼを得た。
トエタノール、5%グリセロールを含むK−リン酸緩衝
液pH7.5(以下緩衝液Aとする)に懸濁した。超音波破
砕機(海上電気製、19KHz)にて20分間処理し、遠心分
離してその上清液を得た。上清液を硫安塩析後、緩衝液
Aに対して透析を行なった。この液を緩衝液Aにて平衡
化したDEAE−セファロースCL−6B(ファルマシア社製)
カラクロマトグラフィーに供し、0〜0.5M NaClを含む
緩衝液A溶出画分にDNAポリメラーゼ活性を得た。活性
画分を50mM緩衝液Aに対して透析した。同透析液を緩衝
液Aにて平衡化したフォスホセルロースP−11(Whatma
n社製)カルクロマトグラフィーに供し、0〜0.5M NaCl
を含む緩衝液A溶出画分にDNAポリメラーゼ活性を得
た。活性画分を緩衝液Aに対して透析した。さらに同透
析液を緩衝液Aにて平衡化したnative DNAセルロース
(ファルマシア社製)カラムクロマトグラフィーに供
し、0〜0.5M NaClを含む緩衝液A溶出画分に1,200UのD
NAポリメラーゼを得た。
得られたDNAポリメラーゼの理化学的性質は次の通り
であった。周知の通り、DNAポリメラーゼの活性測定法
は、実験的バラツキが大きいため、図示したデータは典
型的な例を示したものである。
であった。周知の通り、DNAポリメラーゼの活性測定法
は、実験的バラツキが大きいため、図示したデータは典
型的な例を示したものである。
(1) 至適pH サーマス・サーモフィラスHB8(ATCC 27634)の生産
するDNAポリメラーゼの反応pHの影響を求めた。緩衝液
は、50mM Tris(ヒドロキシメチル・アミノメタン)塩
酸緩衝液を用いて行なった。各pHでの活性測定結果は第
1図に示す通りで、至適pHは8.0付近であった。
するDNAポリメラーゼの反応pHの影響を求めた。緩衝液
は、50mM Tris(ヒドロキシメチル・アミノメタン)塩
酸緩衝液を用いて行なった。各pHでの活性測定結果は第
1図に示す通りで、至適pHは8.0付近であった。
(2) 至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は第2
図に示す通り、至適温度は75℃付近であった。
図に示す通り、至適温度は75℃付近であった。
(3) 至適Mg2+濃度 本酵素はMg2+を要求する。各Mg2+濃度での活性測定の
結果は第3図に示す通りで、至適Mg2+濃度は5mM〜20mM
付近であった。
結果は第3図に示す通りで、至適Mg2+濃度は5mM〜20mM
付近であった。
(4) 至適塩濃度 各塩濃度における酵素活性を測定した。その結果は第
4図に示す通りとなった。第4図中、◎−◎はNaCl、○
−○はKClを示す。
4図に示す通りとなった。第4図中、◎−◎はNaCl、○
−○はKClを示す。
(5) 熱安定性 本発明の酵素をpH8.0で、75℃〜98℃で2時間加熱
後、残存活性を測定した。その結果は第5図に示す通り
となった。対照として市販の、サーマス・アクアティカ
スYT−I由来の耐熱性DNAポリメラーゼについても同様
の実験を行なった。第5図中、◎−◎は本発明の酵素、
○−○はサーマス・アクティカスYT−I由来の酵素を示
す。
後、残存活性を測定した。その結果は第5図に示す通り
となった。対照として市販の、サーマス・アクアティカ
スYT−I由来の耐熱性DNAポリメラーゼについても同様
の実験を行なった。第5図中、◎−◎は本発明の酵素、
○−○はサーマス・アクティカスYT−I由来の酵素を示
す。
(6) 分子量 SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により測定したと
ころ、約85,000〜95,000であった。
ころ、約85,000〜95,000であった。
(発明の効果) 本発明では、熱安定性により優れた耐熱性DNAポリメ
ラーゼが得られ、遺伝子増幅において有効に利用し得
る。
ラーゼが得られ、遺伝子増幅において有効に利用し得
る。
【図面の簡単な説明】 第1図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの至適pHを
示す。 第2図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの至適温度
を示す。 第3図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの至適Mg2+
濃度を示す。 第4図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの至適塩濃
度を示す。 第5図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの温度安定
性を市販のTaqポリメラーゼと比較したものである。
示す。 第2図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの至適温度
を示す。 第3図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの至適Mg2+
濃度を示す。 第4図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの至適塩濃
度を示す。 第5図は、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼの温度安定
性を市販のTaqポリメラーゼと比較したものである。
Claims (2)
- 【請求項1】次の性質: (1)作用 核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためのデオキ
シリボヌクレオシド−3リン酸の結合を触媒する、 (2)基質特異性 4種類のデオキシリボヌクレオシド−3リン酸を基質と
する、 (3)至適温度 約75℃、 (4)分子量 85,000〜95,00ダルトン(SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動)、 (5)耐熱性 pH8.0において85℃、2時間の処理によって、その残存
活性が少なくとも約60%である、 を有する耐熱性DNAポリメラーゼ。 - 【請求項2】サーマス属に属する菌株を培養し、培養物
から、次の性質: (1)作用 核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためのデオキ
シリボヌクレオシド−3リン酸の結合を触媒する、 (2)基質特異性 4種類のデオキシリボヌクレオシド−3リン酸を基質と
する、 (3)至適温度 約75℃、 (4)分子量 85,000〜95,00ダルトン(SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動)、 (5)耐熱性 pH8.0において85℃、2時間の処理によって、その残存
活性が少なくとも約60%である、 を有する耐熱性DNAポリメラーゼを採取することを特徴
とするDNAポリメラーゼの製法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21333088A JP2531246B2 (ja) | 1988-08-26 | 1988-08-26 | 耐熱性dnaポリメラ―ゼおよびその製法 |
US07/398,178 US5192674A (en) | 1988-08-26 | 1989-08-24 | Thermostable dna polymerase thermus thermophilus and a method of producing the same |
EP19890115701 EP0359006B1 (en) | 1988-08-26 | 1989-08-25 | A thermostable DNA polyerase and a method of producing the same |
DE1989623503 DE68923503T2 (de) | 1988-08-26 | 1989-08-25 | Thermostabile DNA-Polymerase und Verfahren zur Herstellung davon. |
US07/894,085 US5413926A (en) | 1988-08-26 | 1992-06-05 | Thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus HB-8 |
US07/893,735 US5242818A (en) | 1988-08-26 | 1992-06-05 | Method of producing a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21333088A JP2531246B2 (ja) | 1988-08-26 | 1988-08-26 | 耐熱性dnaポリメラ―ゼおよびその製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0260585A JPH0260585A (ja) | 1990-03-01 |
JP2531246B2 true JP2531246B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=16637372
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21333088A Expired - Lifetime JP2531246B2 (ja) | 1988-08-26 | 1988-08-26 | 耐熱性dnaポリメラ―ゼおよびその製法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
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