JP2523700B2 - エステル加水分解酵素の製造方法 - Google Patents
エステル加水分解酵素の製造方法Info
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- JP2523700B2 JP2523700B2 JP62265860A JP26586087A JP2523700B2 JP 2523700 B2 JP2523700 B2 JP 2523700B2 JP 62265860 A JP62265860 A JP 62265860A JP 26586087 A JP26586087 A JP 26586087A JP 2523700 B2 JP2523700 B2 JP 2523700B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエステル加水分解酵素の製造方法に関し、さ
らに詳しくは、植物病原糸状菌類を高級脂肪酸又はそれ
らのエステル類を含む培地で培養し、エステル加水分解
酵素を効率良く生産する方法に関する。
らに詳しくは、植物病原糸状菌類を高級脂肪酸又はそれ
らのエステル類を含む培地で培養し、エステル加水分解
酵素を効率良く生産する方法に関する。
〔従来の技術及びその問題点〕 一般に植物に感染するような糸状菌類は、植物表面に
存在するエステル化合物を加水分解するエステル加水分
解酵素を生産することが知られており、この酵素は植物
表面上の長鎖脂肪酸エステル及び長鎖脂肪酸エステルポ
リマーを分解する作用をもつ。
存在するエステル化合物を加水分解するエステル加水分
解酵素を生産することが知られており、この酵素は植物
表面上の長鎖脂肪酸エステル及び長鎖脂肪酸エステルポ
リマーを分解する作用をもつ。
即ち、糸状菌類は植物表面を溶解することから農薬散
布時に同時散布をおこない農薬効力を増強させるための
農薬効力増強剤としての利用（特開昭61−178907号公
報）や固体脂肪酸エステルの分解、有機合成反応への利
用が考えられている。しかしながら、これらの糸状菌類
は通常の培養条件においてはエステル分解酵素を生産し
ないことが知られており、酵素を得るための培地中に酵
素誘導物質として植物表面のポリエステル層を加えるこ
とが検討されているが、ポリエステル層を大量に入手す
ることが困難であること、酵素の生産効率が低いこと等
の問題点があった。
布時に同時散布をおこない農薬効力を増強させるための
農薬効力増強剤としての利用（特開昭61−178907号公
報）や固体脂肪酸エステルの分解、有機合成反応への利
用が考えられている。しかしながら、これらの糸状菌類
は通常の培養条件においてはエステル分解酵素を生産し
ないことが知られており、酵素を得るための培地中に酵
素誘導物質として植物表面のポリエステル層を加えるこ
とが検討されているが、ポリエステル層を大量に入手す
ることが困難であること、酵素の生産効率が低いこと等
の問題点があった。
本発明者らは、これらの問題点を解決すべく鋭意研究
した結果、これらの糸状菌類は高級脂肪酸あるいはその
エステル類を含有する培地で培養することによってエス
テル分解酵素を短時間に効率良く生産できることを見い
だし本発明を完成した。
した結果、これらの糸状菌類は高級脂肪酸あるいはその
エステル類を含有する培地で培養することによってエス
テル分解酵素を短時間に効率良く生産できることを見い
だし本発明を完成した。
即ち本発明は、コレトトリカム（Colletotrichum）
属、及びグレオスポリウム（Gloeosporium）属からなる
群から選ばれる植物病原糸状菌類を高級脂肪酸又はそれ
らのエステル類を含む培地中で培養し、培養物からエス
テル加水分解酵素画分を採取することを特徴とする、植
物表面に存在するエステル化合物を加水分解するエステ
ル加水分解酵素画分の製造方法を提供するものである。
属、及びグレオスポリウム（Gloeosporium）属からなる
群から選ばれる植物病原糸状菌類を高級脂肪酸又はそれ
らのエステル類を含む培地中で培養し、培養物からエス
テル加水分解酵素画分を採取することを特徴とする、植
物表面に存在するエステル化合物を加水分解するエステ
ル加水分解酵素画分の製造方法を提供するものである。
本発明に係る植物病原糸状菌類は植物表面のポリエス
テル層を分解しながら侵入する糸状菌であり、コレトト
リカム（Colletotrichum）属、及びグレオスポリウム
（Gloeosporium）属からなる群から選ばれる。
テル層を分解しながら侵入する糸状菌であり、コレトト
リカム（Colletotrichum）属、及びグレオスポリウム
（Gloeosporium）属からなる群から選ばれる。
本発明に用いられる高級脂肪酸としては飽和又は不飽
和の炭素数12〜26の脂肪酸が好ましく、更に好ましくは
16〜24の不飽和脂肪酸であり、高級脂肪酸エステル類と
しては上述の脂肪酸と各種アルコールとのエステル、例
えばラウリルアルコール、ノニルフェニルアルコール、
ペンタエリスリトール、エチレングリコール、グリセリ
ン、ソルビトール、マンニトール、グルコース、マンノ
ース等のアルコールとのエステルが挙げられ、好ましく
はグリセリンの高級脂肪酸エステルである。
和の炭素数12〜26の脂肪酸が好ましく、更に好ましくは
16〜24の不飽和脂肪酸であり、高級脂肪酸エステル類と
しては上述の脂肪酸と各種アルコールとのエステル、例
えばラウリルアルコール、ノニルフェニルアルコール、
ペンタエリスリトール、エチレングリコール、グリセリ
ン、ソルビトール、マンニトール、グルコース、マンノ
ース等のアルコールとのエステルが挙げられ、好ましく
はグリセリンの高級脂肪酸エステルである。
本発明において、糸状菌類を培養する培地には必要に
より上記以外の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源
等を含有させることができる。無機塩としては、硝酸ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸
ナトリウム、塩化カリウム、硫安、硫酸第一鉄、パント
テン酸カルシウム、塩化カルシウム、ホウ酸、硫酸亜
鉛、硫酸銅、モリブデン酸等の組み合わせが挙げられ、
炭素源、窒素源としては、ジャガイモ抽出液、酵母抽出
液、ガゼインペプトン、大豆ペプトン、トリブチスペプ
トン、カサミノ酸、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキ
ス、アンモニウム塩、デンプン、デキストリン、グルコ
ース、フラクトース、マンノース、スクロース、ラクト
ース、グリセリン等の組み合わせが挙げられる。
より上記以外の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源
等を含有させることができる。無機塩としては、硝酸ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸
ナトリウム、塩化カリウム、硫安、硫酸第一鉄、パント
テン酸カルシウム、塩化カルシウム、ホウ酸、硫酸亜
鉛、硫酸銅、モリブデン酸等の組み合わせが挙げられ、
炭素源、窒素源としては、ジャガイモ抽出液、酵母抽出
液、ガゼインペプトン、大豆ペプトン、トリブチスペプ
トン、カサミノ酸、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキ
ス、アンモニウム塩、デンプン、デキストリン、グルコ
ース、フラクトース、マンノース、スクロース、ラクト
ース、グリセリン等の組み合わせが挙げられる。
本発明において、培地中の高級脂肪酸又はそのエステ
ル類の濃度は菌の種類、エステルの種類によっても異な
るが、0.1〜50g/が好ましく、前記無機塩の濃度は０
〜50g/、炭素源、窒素源の濃度は０〜50g/が好まし
い。培養温度は20℃〜34℃の範囲であればよいが、好ま
しくは24℃〜28℃である。培地中のpHは3.5〜8.5の範囲
とするのが好ましい。
ル類の濃度は菌の種類、エステルの種類によっても異な
るが、0.1〜50g/が好ましく、前記無機塩の濃度は０
〜50g/、炭素源、窒素源の濃度は０〜50g/が好まし
い。培養温度は20℃〜34℃の範囲であればよいが、好ま
しくは24℃〜28℃である。培地中のpHは3.5〜8.5の範囲
とするのが好ましい。
本発明の培養に於いては直接本培養を行ってもよい
が、前培養を行って菌体を十分増殖させた後、本培養培
地へ移植することが望ましい。前培養を行う際には高級
脂肪酸又はそのエステル類を培地中に最初から加えても
良いが、前培養では高級脂肪酸又はそのエステル類以外
の炭素源で培養し、常法に従って菌体を培養液から分離
後、水性媒体、例えばリン酸緩衝液などで洗浄を行って
から本培養培地へ菌体を移植しても構わない。培地中に
生成したエステル加水分解酵素は必要に応じてイオン交
換樹脂カラム等の常法を用いて単離・精製を行っても構
わないが、培地を限外ろ過等を行うことによって濃縮し
て用いても構わない。
が、前培養を行って菌体を十分増殖させた後、本培養培
地へ移植することが望ましい。前培養を行う際には高級
脂肪酸又はそのエステル類を培地中に最初から加えても
良いが、前培養では高級脂肪酸又はそのエステル類以外
の炭素源で培養し、常法に従って菌体を培養液から分離
後、水性媒体、例えばリン酸緩衝液などで洗浄を行って
から本培養培地へ菌体を移植しても構わない。培地中に
生成したエステル加水分解酵素は必要に応じてイオン交
換樹脂カラム等の常法を用いて単離・精製を行っても構
わないが、培地を限外ろ過等を行うことによって濃縮し
て用いても構わない。
次に本発明で得られるエステル加水分解酵素（エステ
ラーゼ）の活性測定法を示す。
ラーゼ）の活性測定法を示す。
（１） エステラーゼ活性 パラニトロフェニルブチレートを基質とし、酵素反応
後生成するパラニトロフェノールの量を405nmにおける
吸光度を測定して定量する。
後生成するパラニトロフェノールの量を405nmにおける
吸光度を測定して定量する。
＜方法＞ パラニトロフェニルブチレート（半井化学製）0.42mM
（最終反応器において）、エマルゲン810（花王製）2m
g、pH6.8,100mMリン酸緩衝液2.8ml及び酵素液又は培養
液0.2mlを添加して得られる最終容量3mlの反応液を用
い、28℃にて405nmにおける吸光度の変化を記録する。
あらかじめパラニトロフェノールの405nmにおける吸光
度を測定し、酵素反応時における吸光度の変化量から加
水分解によって生じたパラニトロフェノールの量を産出
する。
（最終反応器において）、エマルゲン810（花王製）2m
g、pH6.8,100mMリン酸緩衝液2.8ml及び酵素液又は培養
液0.2mlを添加して得られる最終容量3mlの反応液を用
い、28℃にて405nmにおける吸光度の変化を記録する。
あらかじめパラニトロフェノールの405nmにおける吸光
度を測定し、酵素反応時における吸光度の変化量から加
水分解によって生じたパラニトロフェノールの量を産出
する。
活性は1U＝パラニトロフェノール１μmolを１分間に
産出する酵素量で示した。
産出する酵素量で示した。
（２） 植物表面ポリエステル分解活性 トリチウムでラベルしたキュウリの表皮0.2mgに、pH
7.8,100mMリン酸緩衝液を50μ加えた後、酵素液又は
濃縮した培養液を50μ添加して30℃にて反応を行う。
反応終了後、塩酸を適当量添加して反応液を酸性にした
後、エーテル抽出を行い、エーテル層へ移行する酵素分
解産物のトリチウム量を液体シンチレーションカウンタ
ーによって測定する。
7.8,100mMリン酸緩衝液を50μ加えた後、酵素液又は
濃縮した培養液を50μ添加して30℃にて反応を行う。
反応終了後、塩酸を適当量添加して反応液を酸性にした
後、エーテル抽出を行い、エーテル層へ移行する酵素分
解産物のトリチウム量を液体シンチレーションカウンタ
ーによって測定する。
活性については、 を求め相対活性として比較した。
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらの例に限定されるものではない。
本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１ ジャガイモ200gの熱水抽出液に酵母抽出物（Difco社
製）2gを加え、蒸溜水を用いて１に調製した後、120
℃にて15分間滅菌し、コレトトリカム・ラゲナリウム
（Colletotrichum lagenarium）の胞子を１×104個／
濃度で接種し、27℃にて２日間振とう培養して前培養
とした。この培養液をろ過し、菌体のみをMgSO4・7H2O
0.5g、K2HPO41.0g、KCl0.5g、NaNO32.0g、FeSO4・7H2O
0.01g、オリーブオイル1.5g、水１を含む滅菌培地中
へ移植した後、27℃にて10時間培養した。
製）2gを加え、蒸溜水を用いて１に調製した後、120
℃にて15分間滅菌し、コレトトリカム・ラゲナリウム
（Colletotrichum lagenarium）の胞子を１×104個／
濃度で接種し、27℃にて２日間振とう培養して前培養
とした。この培養液をろ過し、菌体のみをMgSO4・7H2O
0.5g、K2HPO41.0g、KCl0.5g、NaNO32.0g、FeSO4・7H2O
0.01g、オリーブオイル1.5g、水１を含む滅菌培地中
へ移植した後、27℃にて10時間培養した。
エステラーゼ活性については培養液を200μ用いて
前項記載の方法で測定を行った。植物表面ポリエステル
の分解活性については培養液の上澄を80％アセトン処理
後、生じた沈殿を透析し20mlのリン酸緩衝液に溶解した
ものを酵素液として用い前項記載の方法によって測定し
た。
前項記載の方法で測定を行った。植物表面ポリエステル
の分解活性については培養液の上澄を80％アセトン処理
後、生じた沈殿を透析し20mlのリン酸緩衝液に溶解した
ものを酵素液として用い前項記載の方法によって測定し
た。
結果を表１に示す。
実施例２ コレトトリカム・ラゲナリウム（Colletotrichum lag
enarium）の胞子を用いて、実施例１と同様に２日間前
培養を行った後、培養液中にトリオレインを1.5g加えて
27℃にて10時間培養した。
enarium）の胞子を用いて、実施例１と同様に２日間前
培養を行った後、培養液中にトリオレインを1.5g加えて
27℃にて10時間培養した。
培養液のエステラーゼ活性及び植物表面ポリエステル
分解活性については実施例１と同様に測定した。
分解活性については実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。
実施例３ コレトトリカム・グレオスポリオイデス（Colletotri
chum groeosporioides）の胞子を用いて実施例１と同様
に２日間前培養を行った後、エイコサペンタエン酸1.0g
を培地へ添加してさらに10時間27℃にて培養を行った。
chum groeosporioides）の胞子を用いて実施例１と同様
に２日間前培養を行った後、エイコサペンタエン酸1.0g
を培地へ添加してさらに10時間27℃にて培養を行った。
培養液のエステラーゼ活性及び植物表面ポリエステル
分割活性については実施例１と同様に測定した。
分割活性については実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。
比較例１ コレトトリカム・ラゲナリウム（Colletotrichum lag
enarium）の胞子を実施例１と同様に２日間前培養を行
った後、前培養液から菌体を分離し、菌体のみをジャガ
イモエキス及び酵母抽出液を含む培地へ移植した。移植
後27℃にて10時間培養を行った。
enarium）の胞子を実施例１と同様に２日間前培養を行
った後、前培養液から菌体を分離し、菌体のみをジャガ
イモエキス及び酵母抽出液を含む培地へ移植した。移植
後27℃にて10時間培養を行った。
培養液のエステラーゼ活性及び植物表面ポリエステル
分解活性については実施例１と同様に測定した。
分解活性については実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。
比較例２ コレトトリカム・グレオスポリオイデス（Colletotri
chum groeosporioides）の胞子を実施例１と同様に２日
間前培養を行った後、植物表皮ポリエステル膜を1.0g添
加して27℃にて10時間培養した。
chum groeosporioides）の胞子を実施例１と同様に２日
間前培養を行った後、植物表皮ポリエステル膜を1.0g添
加して27℃にて10時間培養した。
培養液のエステラーゼ活性及び植物表面ポリエステル
分解活性については実施例１と同様に測定した。
分解活性については実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。
Claims (1)
- 【請求項１】コレトトリカム（Colletotrichum）属、及
びグレオスポリウム（Gloeosporium）属からなる群から
選ばれる植物病原糸状菌類を高級脂肪酸又はそれらのエ
ステル類を含む培地中で培養し、培養物からエステル加
水分解酵素画分を採取することを特徴とする、植物表面
に存在するエステル化合物を加水分解するエステル加水
分解酵素画分の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62265860A JP2523700B2 (ja) | 1987-10-21 | 1987-10-21 | エステル加水分解酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62265860A JP2523700B2 (ja) | 1987-10-21 | 1987-10-21 | エステル加水分解酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01108984A JPH01108984A (ja) | 1989-04-26 |
| JP2523700B2 true JP2523700B2 (ja) | 1996-08-14 |
Family
ID=17423089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62265860A Expired - Fee Related JP2523700B2 (ja) | 1987-10-21 | 1987-10-21 | エステル加水分解酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2523700B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592049A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-20 | 北京工商大学 | 一种黑曲霉酯水解酶AnCu3、编码基因及其在水解DEHP中的应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5037768B2 (ja) * | 2001-09-27 | 2012-10-03 | 三菱レイヨン株式会社 | 光学活性２−メチル−１，３−プロパンジオールモノエステルの製造方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5063188A (ja) * | 1973-10-05 | 1975-05-29 | ||
| JPS5763086A (en) * | 1980-09-30 | 1982-04-16 | Agency Of Ind Science & Technol | Production of lipase |
-
1987
- 1987-10-21 JP JP62265860A patent/JP2523700B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5063188A (ja) * | 1973-10-05 | 1975-05-29 | ||
| JPS5763086A (en) * | 1980-09-30 | 1982-04-16 | Agency Of Ind Science & Technol | Production of lipase |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592049A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-20 | 北京工商大学 | 一种黑曲霉酯水解酶AnCu3、编码基因及其在水解DEHP中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01108984A (ja) | 1989-04-26 |
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Legal Events
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