JP2517894B2 - Chimeric P450-producing strain that simultaneously expresses ferredoxin and ferredoxin reductase - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ末端のミクロソーム
への局在化シグナル配列とＣ末端の成熟型のミトコンド
リア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０に関する。さら
に具体的には、ミクロソームへの局在化シグナルと考え
られているウシ副腎Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ酸
残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からなる成
熟型ラット肝ミトコンドリアＰ４５０_C25 からなるキメ
ラ体Ｐ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシン還元
酵素を同時に酵母内で大量生産させる発現プラスミドに
関する。さらに、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０
からなるキメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレド
キシン還元酵素を同時に発現する酵母菌株に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a chimeric P450 comprising an N-terminal microsomal localization signal sequence and a C-terminal mature mitochondrial P450. More specifically, a chimera P450 consisting of a mature rat liver mitochondrial P450 _C25 consisting of a signal sequence consisting of the N-terminal 15 amino acid residues of bovine adrenal P450 17α, which is considered to be a localization signal to microsomes, and 501 amino acids, The present invention relates to an expression plasmid for simultaneously producing ferredoxin and ferredoxin reductase in yeast in large quantities. Furthermore, N-terminal microsomal localization signal sequence and C-terminal mature mitochondrial P450
To a yeast strain that simultaneously expresses a chimeric P450, ferredoxin, and ferredoxin reductase.

【０００２】[0002]

【従来の技術】以下、本明細書で用いるキメラ体Ｐ４５
０という言葉は、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５
０からなるＰ４５０を意味する。Ｐ４５０は微生物から
哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在するヘムタンパ
ク質であり、電子伝達系の末端酵素として種々の脂溶性
化合物を基質として１原子酸素添加反応を触媒する。電
子伝達系の末端酵素であるＰ４５０は分子種が多様であ
り、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非常に広
範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。哺乳動
物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素から、ミ
クロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。前者で
は、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌ
クレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤＰ
Ｈからの電子をＰ４５０へ供給し、後者では、フラビン
アデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に含有す
るＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および、非ヘ
ム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシンが
ＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することによ
り、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する。PRIOR ART Chimera P45 used in the present specification
The term 0 refers to the N-terminal microsomal localization signal sequence and the C-terminal mature mitochondrial P45.
It means P450 consisting of 0. P450 is a heme protein that exists widely in the living world from microorganisms to mammals, and catalyzes a one-atom oxygen addition reaction as a terminal enzyme of an electron transfer system using various lipid-soluble compounds as substrates. Since P450, which is the terminal enzyme of the electron transfer system, has various molecular species and each has different substrate specificity, a very wide range of fat-soluble compounds can be hydroxylated. Mammalian P450-dependent electron transfer system is divided into microsomal type and mitochondrial type based on its constituent enzymes. In the former, NADPH containing flavin adenine dinucleotide and flavin mononucleotide as coenzymes in the molecule
-Cytochrome P450 reductase (reductase) is NADP
Electrons from H are supplied to P450, and in the latter, NADPH-ferredoxine reductase containing flavin adenine dinucleotide as a coenzyme in the molecule and ferredoxin containing non-heme iron as a coenzyme in the molecule are converted from NADPH. By supplying these electrons to P450, it catalyzes the hydroxylation reaction on various fat-soluble substrates.

【０００３】本発明者らはすでに、数種のミクロソーム
型Ｐ４５０及び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの
組換え体酵母菌株を用いることにより、工業的に有用な
水酸化反応を行うことに成功した。すなわち、ラット肝
Ｐ４５０c 遺伝子、ウシ副腎Ｐ４５０17α遺伝子やＰ４
５０c21 遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺伝子を含
む発現プラスミドを作製し、これら発現プラスミドで酵
母を形質転換することにより、該酵素を産生する酵母菌
株を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１−４７３
８０、特開平２−３１６８０）。これらの酵母菌株はそ
れぞれのＰ４５０分子種に依存した１原子酸素添加活性
を示した。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵
素遺伝子を単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵
母内発現に成功した（特開昭６２−１９０８５、特開平
２−５１５２５）。さらに、発明者らは、Ｐ４５０と還
元酵素の両酵素を産生する酵母菌株（特開昭６２−１０
４５８２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モ
ノオキシゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３−４４
８８８、特開平２−２３８７０、特願平１−７１２５
０）。こうした技術により、本発明者らはこれらＰ４５
０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なアセトア
ミノフェンやステロイドホルモン中間体の製造を可能に
した。The present inventors have already produced several microsomal P450s and reductases in yeast, and by using these recombinant yeast strains, to carry out an industrially useful hydroxylation reaction. Successful. That is, rat liver P450c gene, bovine adrenal P45017α gene and P4
Each of the 50c21 genes was isolated, expression plasmids containing these genes were prepared, and yeasts were transformed with these expression plasmids to obtain a yeast strain that produces the enzyme (Japanese Patent Laid-Open No. 61-56072, Japanese Laid-Open Patent Application No. 61-56072). 1-473
80, JP-A-2-31680). These yeast strains showed monoatomic oxygenation activity depending on their respective P450 molecular species. In addition, the rat liver reductase gene and yeast reductase gene were isolated, and the expression of the enzyme having P450 reducing ability in yeast was succeeded (JP-A-62-19085, JP-A-2-51525). Furthermore, the inventors of the present invention have found that a yeast strain producing both P450 and reductase (JP-A-62-10).
4582) and a novel monooxygenase having the functions of both enzymes in one molecule (JP-A-63-44).
888, JP-A-2-23870, and Japanese Patent Application No. 1-7125.
0). With such technology, the present inventors
Using the 0-producing yeast strain, it became possible to produce acetaminophen and steroid hormone intermediates useful as pharmaceuticals.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】一方、ミトコンドリア
型Ｐ４５０に関しては、ミトコンドリア型Ｐ４５０分子
種であるラット肝Ｐ４５０c25 依存性の１原子酸素添加
活性を発揮する酵母菌株を創製した（特願２−２５８２
６２）。 しかし、ラット肝Ｐ４５０c25 依存性の１原
子酸素添加活性を発揮する酵母菌株におけるＰ４５０c2
5 産生量は低く、菌体当たりの活性が低かったため、本
発明者らは、さらに大量にＰ４５０c25 を産生する酵母
菌株を創製することを目的とした。さらに、ラット肝Ｐ
４５０c25 依存性の１原子酸素添加活性発現にはＰ４５
０c25 の他、ウシ副腎アドレノドキシン（以下、ＡＤＸ
と略す）およびウシ副腎アドレノドキシン還元酵素（以
下、ＡＤＲと略す）の２酵素が必要である。そこで本発
明者らは、１ステップの１原子酸素添加活性発現のバイ
オリアクターの作出を試みた。On the other hand, with respect to mitochondrial P450, a yeast strain exhibiting P450c25-dependent one-atom oxygen addition activity, which is a mitochondrial P450 molecular species, was created (Japanese Patent Application No. 22582).
62). However, P450c2 in a yeast strain that exhibits P450c25-dependent monoatomic oxygenation activity in rat liver
Since the amount of 5 produced was low and the activity per cell was low, the present inventors aimed to create a yeast strain that produces P450c25 in a larger amount. Furthermore, rat liver P
P45 for 450c25-dependent one-atom oxygenation activity expression
0c25, bovine adrenal adrenodoxin (hereinafter referred to as ADX
Abbreviated) and bovine adrenal adrenodoxin reductase (hereinafter abbreviated as ADR). Therefore, the present inventors attempted to create a bioreactor expressing one-step oxygen-addition activity in one step.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】ラット肝Ｐ４５０c25
は、５３３アミノ酸からなる前駆体として細胞質で合成
されたのち、ミトコンドリアに輸送される。その際、ミ
トコンドリアのシグナルとして機能するアミノ末端部分
の３２アミノ酸が除去され、５０１アミノ酸からなる成
熟型Ｐ４５０c25 （分子量約５７ｋＤ）がミトコンドリ
ア膜に局在する。一方、Ｐ４５０17αはウシ副腎ミクロ
ソームの酵素で、Ｎ末端の疎水性アミノ酸配列がミクロ
ソームへの局在化シグナルとして機能する。そこで、本
発明者らは、本来ミトコンドリアに存在する酵素をミク
ロソームに局在化させることにより酵母内での産生量を
上昇させることを目的として、ラット肝Ｐ４５０c25 の
ミトコンドリア移行シグナル部分をミクロソーム膜への
挿入のためのシグナルと考えられるウシ副腎Ｐ４５０17
αのＮ末端１５アミノ酸に置換したキメラＰ４５０c25
を酵母で発現させるプラスミドを構築した。また、キメ
ラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡＤＲがミクロソーム膜
上で電子伝達系を構築し、モノオキシゲナーゼ活性を発
揮することを目的としてキメラＰ４５０c25 、成熟型Ａ
ＤＸおよび成熟型ＡＤＲの３酵素を同時に発現するプラ
スミドを構築した。その際、同一のプロモーター、ター
ミネーターを用いると酵母の継代培養中にプラスミド内
での組み換えが起こることから、３酵素を別々のプロモ
ーター、ターミネーターにより発現させた。[Means for Solving the Problems] Rat liver P450c25
Is synthesized in the cytoplasm as a precursor consisting of 533 amino acids and then transported to mitochondria. At that time, 32 amino acids in the amino terminal portion that functions as a mitochondrial signal are removed, and mature P450c25 (molecular weight of about 57 kD) consisting of 501 amino acids is localized in the mitochondrial membrane. On the other hand, P45017α is an enzyme of bovine adrenal microsomes, and the N-terminal hydrophobic amino acid sequence functions as a localization signal for microsomes. Therefore, the present inventors have aimed to increase the amount of production in yeast by localizing the enzyme originally present in mitochondria to microsomes, and to transfer the mitochondrial translocation signal part of rat liver P450c25 to the microsomal membrane. Bovine adrenal P45017 considered a signal for insertion
Chimeric P450c25 with N-terminal 15 amino acids of α substituted
Was constructed in yeast. In addition, chimera P450c25, ADX and ADR construct an electron transfer system on the microsomal membrane to exert monooxygenase activity, and chimera P450c25, mature A
A plasmid was constructed that simultaneously expresses three enzymes, DX and mature ADR. At that time, if the same promoter and terminator are used, recombination occurs in the plasmid during subculture of yeast. Therefore, the three enzymes were expressed by different promoters and terminators.

【０００６】[0006]

【発明の効果】発現された、ほとんどのキメラＰ４５０
c25 はミクロソーム画分に存在した。従って、Ｐ４５０
17α由来のＮ末端１５アミノ酸残基が酵母内でミクロソ
ーム膜へのシグナルの役割を果たし、本来はミトコンド
リアの膜蛋白であるＰ４５０c25 を酵母ミクロソームで
発現させることに成功した。また、キメラＰ４５０c25
産生量は菌体当たり約２×１０⁵ 分子であり、シグナル
の置換によりＰ４５０c25 の産生量を約１０倍上昇させ
ることができた。さらに、ミクロソーム画分は、ＡＤＸ
とＡＤＲを添加することにより、ＴＨＣ、ビタミンＤ3
、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対し、高い水酸化
活性を示した。特に、１α−ビタミンＤ3 に対する水酸
化活性は元の５０１アミノ酸からなる成熟型Ｐ４５０C2
5 よりもはるかに高く、１５アミノ酸残基の付加がＰ４
５０C25 の膜における存在状態を変化させ、活性を上昇
させたと思われる。また、キメラＰ４５０C25 、ＡＤＸ
およびＡＤＲの同時発現株はモノオキシゲナーゼ活性を
発揮しているので、本発明者らは、酵母ミクロソーム膜
上でＡＤＲからＡＤＸを経てキメラＰ４５０C25 という
電子伝達系を構築することに成功した。従って、この菌
株をステロイド化合物や活性型ビタミンＤ3 などの水酸
化反応に１ステップで行うことができる簡便なバイオリ
アクターとして利用できる。特に、菌体培養液中に基質
を添加し、一定時間後に有機溶媒等で抽出することによ
り容易に反応産物を回収することができるため、バイオ
リアクターとして有用である。EFFECT OF THE INVENTION Most of the expressed chimeric P450
c25 was present in the microsomal fraction. Therefore, P450
The N-terminal 15 amino acid residues derived from 17α served as a signal to the microsomal membrane in yeast, and succeeded in expressing P450c25, which is originally a mitochondrial membrane protein, in yeast microsomes. Also, chimera P450c25
The production amount was about 2 × 10 ⁵ molecules per bacterial cell, and it was possible to increase the production amount of P450c25 by about 10 times by replacing the signal. Furthermore, the microsomal fraction is ADX
And Vitamin D3 by adding ADR
It showed a high hydroxylation activity for 1α-hydroxyvitamin D3. In particular, the hydroxylation activity for 1α-vitamin D3 is the mature P450C2 consisting of the original 501 amino acids.
Much higher than 5, the addition of 15 amino acid residues is P4
It seems that the presence of 50C25 in the membrane was changed and the activity was increased. In addition, chimera P450C25, ADX
Since the co-expressing strains of ADR and ADR exert monooxygenase activity, the present inventors succeeded in constructing an electron transfer system called chimeric P450C25 from ADR through ADX on the yeast microsomal membrane. Therefore, this strain can be used as a simple bioreactor capable of performing a hydroxylation reaction of steroid compounds and active vitamin D3 in one step. In particular, it is useful as a bioreactor because the reaction product can be easily recovered by adding the substrate to the cell culture medium and extracting after a certain time with an organic solvent or the like.

【０００７】以下、本発明をさらに詳細に説明する。本
発明のキメラＰ４５０がＮ末端に有するミクロソームへ
の移行シグナルとしては、ウシ副腎Ｐ４５０17αに限ら
ず、他のミクロソーム型Ｐ４５０の移行シグナルを用い
ることが可能である。さらに、本発明のキメラＰ４５０
がＣ末端に有する成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０と
しては、ラット肝Ｐ４５０c25 に限らず、他のミトコン
ドリア型Ｐ４５０を用いることが可能である。また、本
発明のウシ副腎Ｐ４５０17αおよびラット肝Ｐ４５０c2
5 をコードするｃＤＮＡはすでに公知であり、通常の操
作法でこれを単離することができる。本発明のキメラＰ
４５０c25 を発現する発現プラスミドはウシ副腎Ｐ４５
０17αのＮ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡを合成
し、成熟型ラット肝Ｐ４５０c25 をコードするｃＤＮＡ
領域と連結した後、遺伝子を酵母アルコール脱水素酵素
（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝子のプロモーターおよび
同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ
５（Methods in Enzymology, 101, partC, p192-201 ）
に挿入し構築することができる。また、この発現プラス
ミド上に成熟型ＡＤＲおよび成熟型ＡＤＸの発現ユニッ
トを挿入することにより、３酵素を同時に発現させるた
めのプラスミドを構築することができる。ただし、プロ
モーターおよびターミネーターはＡＤＨに限定されず、
酵母内で効率的に機能するものであればよい。また、３
酵素を同時に発現させるプラスミドのプロモーターおよ
びターミネーターは同一でなく、それぞれ異なっている
ほうが好ましい。その理由は、継代培養した場合、プラ
スミド上での組み換えば起こる可能性が低いからであ
る。また、３酵素の発現ユニットへの挿入位置、挿入方
向はそれぞれ酵素の発現量にほとんど影響を与えない。
宿主として酵母を用いることが好ましいが、さらに酵母
サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株が、望ましい。
キメラＰ４５０c25 遺伝子を含む発現プラスミドあるい
は３酵素同時発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換
は、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）を用いる方法、プロトプ
ラスト法など公知の方法で行うことができる。本発明に
より得られる形質転換酵母の培養は通常のグルコース、
窒素源などを含む培地において通常の培養方法により行
うことができる。このようにして得られた形質転換酵母
菌体を培養することによりキメラＰ４５０c25 を製造す
ることができる。The present invention will be described in more detail below. The translocation signal to the microsome possessed by the chimeric P450 of the present invention at the N-terminus is not limited to bovine adrenal P450 17α, but other microsomal P450 translocation signals can be used. Furthermore, the chimeric P450 of the present invention
The mature mitochondrial P450 having a C-terminal at is not limited to rat liver P450c25, but other mitochondrial P450 can be used. In addition, bovine adrenal P45017α and rat liver P450c2 of the present invention
The cDNA encoding 5 is already known and can be isolated by a usual operation method. Chimera P of the present invention
The expression plasmid expressing 450c25 is bovine adrenal P45
A cDNA corresponding to the N-terminal amino acid sequence of 017α was synthesized to encode a mature rat liver P450c25 cDNA.
The yeast expression vector pAAH having the promoter and terminator of the yeast alcohol dehydrogenase (hereinafter abbreviated as ADH) gene after ligation to the region.
5 (Methods in Enzymology, 101, partC, p192-201)
Can be inserted and constructed. Further, by inserting the mature ADR and mature ADX expression units into this expression plasmid, a plasmid for expressing three enzymes simultaneously can be constructed. However, the promoter and terminator are not limited to ADH,
It may be any one that functions efficiently in yeast. Also, 3
It is preferable that the promoter and terminator of the plasmid for expressing the enzyme simultaneously are not the same but different from each other. The reason is that when subcultured, recombination on a plasmid is unlikely to occur. In addition, the insertion position and the insertion direction of the three enzymes into the expression unit have little effect on the expression levels of the enzymes.
It is preferable to use yeast as a host, but the yeast Saccharomyces cerevisiae strain AH22 is more preferable.
Transformation of a host yeast with an expression plasmid containing the chimeric P450c25 gene or a three-enzyme co-expression plasmid can be performed by a known method such as a method using alkali metal (LiCl) or a protoplast method. Culture of the transformed yeast obtained by the present invention is usually glucose,
It can be performed by a usual culture method in a medium containing a nitrogen source and the like. The chimeric P450c25 can be produced by culturing the transformed yeast cells thus obtained.

【０００８】[0008]

【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。 実施例１ 発現プラスミドｐＡＭＳ２５および３酵素同
時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、通常２０〜２
００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素類を市販す
るメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品に添付した
反応条件で実施した。キメラ体Ｐ４５０ _C25 発現プラス
ミドｐＡＭＳ２５を図１に従い構築した。ラット肝Ｐ４
５０c25 発現プラスミドｐＡＣ２５（特願平２−２５８
３６２）を構築した際、得られたプラスミドｐＵＣ２５
ＮをＰｓｔＩで部分消化した後ＥｃｏＲＩ消化し、得ら
れたＤＮＡ断片に合成リンカー（配列番号１に示す。）
を挿入し、得られたプラスミドからＨｉｎｄIII −Ｓａ
ｃＩ断片を調製した。一方、ｐＵＣ２５ＣＨ（特願平２
−２５８２６２）からＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII 断片を調
製し、これら両断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位に
同時に挿入することによりプラスミドｐＵＭＳ２５を得
た。次に、ｐＵＭＳ２５から得たＨｉｎｄIII 断片をベ
クターｐＡＡＨ５Ｎ（特開平２−５１５２５）のＨｉｎ
ｄIII 部位に挿入することにより発現プラスミドｐＡＭ
Ｓ２５を構築した。EXAMPLES The present invention is described in detail below based on examples.
I do. However, the present invention is not limited to this embodiment.
Needless to say. Example 1 Expression plasmid pAMS25 and 3 enzymes
Construction of transient expression plasmid pRXMS25 In the following examples, restriction enzyme digestion of DNA and
Dephosphorylation of DNA by rephosphatase
The reaction such as DNA binding by gauze is usually 20 to 2
These enzymes are commercially available using a reaction volume of 00 μl.
Attached to the product by a manufacturer (for example, Takara Shuzo Co., Ltd.)
It was carried out under the reaction conditions. Chimera P450 _C25Expression plus
The mid pAMS25 was constructed according to FIG. Rat liver P4
50c25 expression plasmid pAC25 (Japanese Patent Application No. 2-258)
362) was constructed, the resulting plasmid pUC25
N was partially digested with PstI followed by EcoRI digestion to obtain
Synthetic linker (shown in SEQ ID NO: 1) to the generated DNA fragment.
HindIII-Sa was inserted from the resulting plasmid.
The cI fragment was prepared. On the other hand, pUC25CH (Japanese Patent Application No. 2
-258262) to prepare the SacI-HindIII fragment.
And both of these fragments at the HindIII site of pUC19.
Plasmid pUMS25 was obtained by inserting at the same time.
Was. Next, the HindIII fragment obtained from pUMS25 was probed.
Hin of the pactor pAAH5N (JP-A-2-51525)
Expression plasmid pAM by inserting at the dIII site
S25 was constructed.

【０００９】成熟型ＡＤＸ（特願平２−１３６４９６に
記載）をコードするＨｉｎｄIII 断片をベクターｐＧＡ
ＨＮ（ベクターｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター、タ
ーミネーターのかわりにＰＧＫプロモーター、ターミネ
ーターを含む）のＰＧＫプロモーター、ターミネーター
（特願平２−１３６４９６に記載）の間に挿入すること
により発現プラスミドｐＧＸを得た。また、成熟型ＡＤ
Ｒ（特開昭６３−１１２９８６に記載）をコードするＨ
ｉｎｄIII 断片をベクターｐＰＡＨＮ（ベクターｐＡＡ
Ｈ５ＮのＡＤＨプロモーター、ターミネーターのかわり
にＧＡＰプロモーター、ターミネーター（特開昭６３−
１１２９８６に記載）を含む）のＧＡＰプロモーター、
ターミネーターの間に挿入することによりｐＰＲを得
た。ｐＰＲをＮｏｔＩで部分消化して得られたＤＮＡ断
片とｐＧＸから得られたＮｏｔＩ断片とのリガーゼ反応
を行うことによりＡＤＲ、ＡＤＸ同時発現プラスミドｐ
ＲＸ５を得た。次にｐＲＸ５をＮｏｔＩで部分消化し、
ｐＡＭＳ２５より得たＮｏｔＩ断片（３．７ｋｂ）を連
結することによりキメラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡ
ＤＲ同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５を得た。A HindIII fragment encoding mature ADX (described in Japanese Patent Application No. 2-136496) is used as a vector pGA.
An expression plasmid pGX was obtained by inserting the HN (including the PGK promoter and terminator in place of the ADH promoter and terminator of vector pAAH5N) between the PGK promoter and terminator (described in Japanese Patent Application No. Hei 2-136964). Also, mature AD
H encoding R (described in JP-A-63-112986)
The indIII fragment was added to the vector pPAHN (vector pAA
Instead of the ADH promoter and terminator of H5N, a GAP promoter and terminator (Japanese Patent Laid-Open No. 63-
GAP promoter of 1) described in 112986),
PPR was obtained by inserting between terminators. By ligating the DNA fragment obtained by partially digesting pPR with NotI and the NotI fragment obtained from pGX, ADR and ADX coexpression plasmid p
RX5 was obtained. Then pRX5 was partially digested with NotI,
Chimera P450c25, ADX and A were obtained by ligating the NotI fragment (3.7 kb) obtained from pAMS25.
A DR co-expression plasmid pRXMS25 was obtained.

【００１０】実施例２ 発現プラスミドによる酵母の形
質転換 サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（ＡＴＣＣ ３８
６２６）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２
％ポリペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８時
間培養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、集
菌した。菌体を、 ０．２Ｍ ＬｉＣｌ溶液１ｍｌで洗
浄したのち、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液２０μｌに懸濁した。
これに、７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３
０μｌ、発現プラスミドｐＡＭＳ２５溶液１０μｌ（約
１μｇＤＮＡ）を添加して、充分に混合したのち、３０
℃で１時間インキュベートした。ついで、１４０μｌの
水を加えＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．
６７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｍｌヒスチ
ジン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキュベ
ートすることにより、プラスミドを保持する形質転換体
を得た。Example 2 Transformation of Yeast with Expression Plasmid Saccharomyces cerevisiae AH22 (ATCC 38
626) to 5 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2%
% Polypeptone, 2% glucose), the cells were cultured at 30 ° C. for 18 hours, and then 1 ml of the yeast culture solution was centrifuged to collect the cells. The cells were washed with 1 ml of 0.2 M LiCl solution and then suspended in 20 μl of 1 M LiCl solution.
To this, add 70% polyethylene glycol 4000 solution 3
0 μl and 10 μl of the expression plasmid pAMS25 solution (about 1 μg DNA) were added and mixed well, then 30
Incubated at 0 ° C for 1 hour. Then, 140 μl of water was added to the SD synthetic medium plate (2% glucose, 0.
67% yeast nitrogen source amino acid-free, 20 μg / ml histidine, 2% agar) and incubated at 30 ° C. for 3 days to obtain a transformant carrying the plasmid.

【００１１】実施例３ キメラ体Ｐ４５０c25 の生産 実施例３で得たＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株、ＡＨ２２／
ｐＲＸＭＳ２５株およびコントロールＡＨ２２／ｐＡＡ
Ｈ５株を合成培地（８％ グルコース、５．４％ 酵母
窒素源アミノ酸不含、１６０μｇ／ｍｌ ヒスチジン）
３００ｍｌでそれぞれ約２×１０⁷ 細胞／ｍｌまで培養
し、集菌後１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）
で洗浄したのち、同緩衝液２ｍｌに懸濁した。２本のキ
ュベットに菌懸濁液を１ｍｌずつ分注し、サンプル側キ
ュベットに一酸化炭素を吹き込んだのち、両キュベット
にジチオナイト５〜１０ｍｇを添加した。よく攪拌した
のち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測定し、Δε
(450nm-490nm) ＝９１ｍＭ ^{- 1} ｃｍ^{- 1} をもとにしてヘ
ム含有Ｐ４５０量を算出した。その結果、ＡＨ２２／ｐ
ＡＭＳ２５および、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株は、そ
れぞれ菌体あたり２×１０5 分子および１×１０5 分子
のヘム含有Ｐ４５０を産生することが判明した。それに
対して、コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株ではヘム
含有Ｐ４５０の産生は認められなかった。Example 3 Production of chimeric P450c25 AH22 / pAMS25 strain obtained in Example 3, AH22 /
pRXMS25 strain and control AH22 / pAA
The H5 strain was used as a synthetic medium (8% glucose, 5.4% yeast).
No nitrogen source amino acid, 160 μg / ml histidine)
About 2 x 10 each for 300 ml⁷ Cultivate up to cells / ml
After harvesting, 100 mM potassium phosphate (pH 7.0)
After washing with, it was suspended in 2 ml of the same buffer. Two keys
Dispense 1 ml of the bacterial suspension into each tube, and
After blowing carbon monoxide into the cuvette, both cuvettes
To this was added 5-10 mg of dithionite. Well stirred
After that, the difference spectrum of 400 to 500 nm is measured, and Δε
(450nm-490nm) = 91mM ^-1cm^-1Based on
The amount of P450 contained in aluminum was calculated. As a result, AH22 / p
AMS25 and AH22 / pRXMS25 strains are
2 × 10 5 and 1 × 10 5 molecules per cell, respectively
Were found to produce P450 containing heme. in addition
In contrast, the control AH22 / pAAH5 strain had haem
No production of contained P450 was observed.

【００１２】実施例４ 酵母のミクロソーム画分におけ
るビタミンＤ3 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 ２５位
水酸化活性およびＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株菌体から調製したミクロソー
ム画分を用いて、活性を測定した。形質転換酵母菌株か
らの細胞分画は以下の方法に従った。形質転換体の約２
×１０7 菌体／ｍｌ培養液から約４×１０^{1 0} 菌体分を
集菌し、ザイモアーゼ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２．０Ｍソルビトール、０．１ｍＭ
ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍ
ｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ）に懸濁し、３０℃で
１時間インキュベートしてスフェロプラストを調製し
た。これをソニケーションバッファー（１０ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６５Ｍ ソルビトール、
０．１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ ペプ
スタチン）に懸濁し、テフロンホモジナイザーでホモジ
ナイズすることにより菌体を破砕した。Example 4 Measurement of Vitamin D3, 1α-Hydroxyvitamin D3 25-position hydroxylation activity and THC27-position hydroxylation activity in yeast microsome fractions The activity was measured using microsome fractions prepared from AH22 / pAMS25 strain cells. Was measured. The cell fractionation from the transformed yeast strain was according to the following method. About 2 of transformants
About 4 × 10 10 bacterial cells were collected from × 10 ⁷ bacterial cells / ml culture solution, and a zymoase solution (10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 2.0 M sorbitol, 0.1 mM was added.
Dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, 0.3 m
g / ml zymolyase 100T) and suspended for 1 hour at 30 ° C. to prepare spheroplasts. Sonication buffer (10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 0.65 M sorbitol,
0.1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDT
A, 1 μg / ml leupeptin, 1 μg / ml pepstatin), and the cells were disrupted by homogenizing with a Teflon homogenizer.

【００１３】３０００×ｇ、５分間の遠心分離により、
沈澱１を取り除き、上清１’を得た。沈澱１をソニケー
ションバッファーに懸濁し再度ホモジナイズしたのち、
３０００×ｇ、５分間遠心分離し沈澱１（未破砕菌体・
核画分）および上清１”を得た。上清１’および１”を
併せて上清１とし、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、沈澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。
上清２をさらに１２０，０００×ｇ、７０分間遠心分離
し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質画
分）に分けた。各画分の還元型ＣＯ結合差スペクトルを
測定したところ、約８０％のキメラ体Ｐ４５０c25 がミ
クロソーム画分に存在したため、ミクロソーム画分を用
いて活性を測定した。以下に示す反応系（２ｍｌ）のう
ちＮＡＤＰＨ以外を混合し、３７℃で５分間インキュベ
ートした後、ＮＡＤＰＨを添加し、反応を開始した。１
０、３０分後、反応液 0.5 ml を分取し、5 mlのベンゼ
ンを添加し、遠心分離により得られたベンゼン層を乾固
し、以下に示した条件下でＨＰＬＣにより分析した。By centrifugation at 3000 × g for 5 minutes,
The precipitate 1 was removed to obtain a supernatant 1 '. After suspending Precipitate 1 in sonication buffer and homogenizing again,
Precipitate 1 (unbroken cell
Nuclear fraction) and supernatant 1 "were obtained. The supernatants 1'and 1" were combined and designated as supernatant 1, centrifuged at 10,000 xg for 20 minutes, and precipitated 2 (mitochondrial fraction) and supernatant. Got 2.
The supernatant 2 was further centrifuged at 120,000 × g for 70 minutes, and separated into a precipitate 3 (microsome fraction) and a supernatant 3 (cytoplasmic fraction). When the reduced CO bond difference spectrum of each fraction was measured, about 80% of the chimeric P450c25 was present in the microsome fraction, so the activity was measured using the microsome fraction. Of the reaction system (2 ml) shown below, other than NADPH was mixed, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and NADPH was added to start the reaction. 1
After 0 and 30 minutes, 0.5 ml of the reaction solution was collected, 5 ml of benzene was added, the benzene layer obtained by centrifugation was dried, and analyzed by HPLC under the conditions shown below.

【００１４】 ［反応系］ １．ミクロソーム画分：ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株（0.8 nmol キメラ体P450_C25 /5 .3 mg 蛋白質を含む） ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株 （5.3 mg 蛋白質を含む） ２．ウシ副腎アドレノドキシン還元酵素 0.8 nmol ３．アドレノドキシン 8.0 nmol ４．基質 終濃度 200 μＭ ５．ＮＡＤＰＨ 終濃度 1.0 〜2.0 mM ６．Tris-HCl (pH 7.8) 100.0 mM ７．ＥＤＴＡ 0.5 〜1.0 mM ［ＨＰＬＣ分析条件］ カラム ：μBondapakC18 （φ 4 × 300 mm ） 検出 ：Ａ265 (ヒ゛タミン D 3 , 1 α-ヒト゛ロキシヒ゛タミンD 3
),放射性検出器 (3 H-THC) 流速 ：1.0 ml/min 温度 ：50 ℃ 溶出条件 0〜 5分 80 % 5〜15分 80 % 〜 100 %の直線濃度勾配 15〜25分 100 %[Reaction system] 1. Microsome fraction: AH22 / pAMS25 strain (containing 0.8 nmol chimera P450 _C25 / 5.3 mg protein) AH22 / pAAH5 strain (containing 5.3 mg protein) 2. Bovine adrenal adrenodoxin reductase 0.8 nmol 3. Adrenodoxin 8.0 nmol 4. Substrate final concentration 200 μM 5. NADPH final concentration 1.0 to 2.0 mM 6. Tris-HCl (pH 7.8) 100.0 mM 7. EDTA 0.5 to 1.0 mM [HPLC analysis condition] Column: μBondapak C18 (φ 4 × 300 mm) Detection: A265 (Betamine D 3, 1 α-human doxyvitamin D 3
), Radioactive detector (3 H-THC) Flow rate: 1.0 ml / min Temperature: 50 ° C Elution condition 0 to 5 minutes 80% 5 to 15 minutes 80% to 100% linear concentration gradient 15 to 25 minutes 100%

【００１５】ビタミンＤ3 、および１α−ヒドロキシビ
タミンＤ3 を基質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５
株ミクロソーム画分において、２５位水酸化物の産生が
認められた。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では
２５位水酸化物への変換は認められず、ＡＨ２２／ｐＡ
ＭＳ２５株における２５位水酸化活性がキメラ体Ｐ４５
０c25 に依存することが示唆された。ＡＤＲ，ＡＤＸ無
添加の場合、活性を示さないことから、ミクロソーム膜
に存在するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素からは電子が
伝達されないことがわかった。また、ＮＡＤＰＨ無添加
では活性を示さず、ＮＡＤＰＨ、ＡＤＸ、ＡＤＲ添加時
に形成されるＮＡＤＰＨ→ＡＤＲ→ＡＤＸ→キメラ体Ｐ
４５０c25 という電子伝達系の構築にともなって、モノ
オキシゲナーゼ活性が発揮されたと思われる。When vitamin D3 and 1α-hydroxyvitamin D3 are used as substrates, AH22 / pAMS25
In the strain microsome fraction, production of the 25th hydroxide was observed. In the control AH22 / pAAH5 strain, conversion to the 25-position hydroxide was not observed, and AH22 / pA
25-position hydroxylation activity in MS25 strain is chimera P45
It was suggested to depend on 0c25. Since no activity was exhibited in the case where ADR and ADX were not added, it was found that electrons were not transferred from NADPH-P450 reductase existing in the microsomal membrane. Further, it shows no activity when NADPH is not added, and NADPH → ADR → ADX → chimera P formed when NADPH, ADX, and ADR are added.
It seems that the monooxygenase activity was exhibited along with the construction of the electron transfer system of 450c25.

【００１６】反応時間１０分において算出された代謝回
転速度は 7.4 mol/molP450/minであり、ＡＨ２２／ｐＡ
Ｃ２５株（特願２−２５８２６２）のミトコンドリア画
分において得られた代謝回転速度 0.14 mol/molP450/mi
n に比べて約５０倍高いことがわかった。また、ビタミ
ンＤ3 に対する２５位水酸化活性は 0.28 mol/molP450/
min であった。〔3 Ｈ〕−ＴＨＣを基質とした場合、Ａ
Ｈ２２／ｐＡＭＳ２５株ミクロソーム画分は、ＴＨＣ２
７位水酸化体（ＴｅＨＣ）への変換が検出された。コン
トロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では活性が認められ
ず、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株における活性がキメラ体
Ｐ４５０c25 に依存することが示唆された。反応時間１
０分において算出されたＴＨＣに対する代謝回転速度は
23 mol/molP450/min であった。The turnover rate calculated at a reaction time of 10 minutes was 7.4 mol / mol P450 / min, and AH22 / pA
Turnover rate 0.14 mol / mol P450 / mi obtained in mitochondrial fraction of C25 strain (Japanese Patent Application No. 2-258262)
It was found to be about 50 times higher than n. In addition, the 25th hydroxylation activity for vitamin D3 is 0.28 mol / mol P450 /
It was min. When [3 H] -THC is used as a substrate, A
The H22 / pAMS25 strain microsome fraction is THC2
Conversion to the 7-position hydroxide (TeHC) was detected. No activity was observed in the control AH22 / pAAH5 strain, suggesting that the activity in the AH22 / pAMS25 strain depends on the chimeric P450c25. Reaction time 1
The turnover rate for THC calculated at 0 minutes is
It was 23 mol / mol P450 / min.

【００１７】実施例５ ３者同時発現株ＡＨ２２／ｐＲ
ＸＭＳ２５株におけるＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株の培養液 (1.6 × 10⁷ 菌
体/ml)に終濃度１０μＭになるように［2 Ｈ］−ＴＨＣ
を添加し、１４時間後の培養液１ｍｌを分取し、ジクロ
ロメタン２ｍｌにより抽出し、ジクロロメタン層を乾固
した後８０μｌのアセトニトリルに溶解し、そのうち５
０μｌをＨＰＬＣにより実施例４に記述した条件で分析
した。但し、検出は放射活性検出装置（パッカード社
ＴＲＡＣＥ７１４０）を用いた。その結果、添加した基
質ＴＨＣの１９％がＴｅＨＣに変換したことが分かっ
た。この変換はコントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株に
は見られなかったことから、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５
株においてキメラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡＤＲが
酵母細胞内で電子伝達系を構成し、モノオキシゲナーゼ
活性を発揮したことが分かった。Example 5 Three-way coexpression strain AH22 / pR
Measurement of THC 27-hydroxylation activity in XMS25 strain [2 H] -THC to a final concentration of 10 μM in the culture solution of AH22 / pRXMS25 strain (1.6 × 10 ⁷ cells / ml).
Was added, and 1 ml of the culture broth after 14 hours was collected, extracted with 2 ml of dichloromethane, the dichloromethane layer was dried, and then dissolved in 80 μl of acetonitrile.
0 μl was analyzed by HPLC under the conditions described in Example 4. However, the detection was carried out using a radioactivity detector (Packard
TRACE 7140) was used. As a result, it was found that 19% of the added substrate THC was converted to TeHC. Since this conversion was not found in the control AH22 / pAAH5 strain, AH22 / pRXMS25
It was found that in the strain, chimeric P450c25, ADX and ADR constituted an electron transfer system in yeast cells and exhibited monooxygenase activity.

【００１８】本発明により提供される形質転換酵母は分
子内にヘムを含有するキメラ体Ｐ４５０c25 を産生す
る。キメラ体Ｐ４５０c25 は酵母のミクロソーム膜に局
在し、ウシ副腎ＡＤＸおよびＡＤＲの添加によりビタミ
ンＤ3 および１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対して２
５位水酸化活性を示し、ＴＨＣに対し２７位水酸化活性
を示した。本来、Ｐ４５０c25 はミトコンドリア内膜に
存在するタンパク質であるが、ミトコンドリアへの輸送
シグナルを除去し、ミクロソーム型Ｐ４５０17αのＮ末
端１５アミノ酸残基（ミクロソーム膜へのシグナルとし
て機能する）を付加することにより、酵母細胞内局在性
をミトコンドリアからミクロソームへ変換することがで
きた。このような膜酵素の局在性の変換はこれまでに例
がない。Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ酸残基は疎水
性が高く、ミクロソーム膜へのシグナルの役割を果たし
ていると考えられるが、シグナルとしての特殊性はな
く、他のミクロソーム膜タンパク質のシグナルとの代替
も可能である。The transformed yeast provided by the present invention produces a chimeric P450c25 containing heme in the molecule. The chimeric P450c25 is localized in the microsomal membrane of yeast, and by the addition of bovine adrenal ADX and ADR, 2 to vitamin D3 and 1α-hydroxyvitamin D3
It showed a hydroxylation activity at the 5-position and a hydroxylation activity at the 27-position with respect to THC. Originally, P450c25 is a protein that exists in the inner mitochondrial membrane, but by removing the transport signal to mitochondria and adding the N-terminal 15 amino acid residues of microsomal P45017α (which functions as a signal to the microsomal membrane), Yeast subcellular localization could be converted from mitochondria to microsomes. No such conversion of membrane enzyme localization has hitherto been possible. The N-terminal 15 amino acid residues of P45017α are highly hydrophobic and are considered to play the role of a signal to the microsomal membrane, but they have no specificity as a signal and can be substituted with the signals of other microsomal membrane proteins. is there.

【００１９】シグナルの置換に基づく膜酵素の局在性を
ミトコンドリアからミクロソームへ変化させることによ
り、酵母菌体あたりのＰ４５０c25 産生量は約１０倍
に、またＰ４５０分子あたりの１α−ヒドロキシビタミ
ンＤ3 ２５位水酸化活性を約５０倍に上昇させることが
できた。したがって、菌体あたりの１α−ヒドロキシビ
タミンＤ3 ２５位水酸化能は約５００倍に上昇したこと
になる。キメラ体Ｐ４５０c25 をバイオリアクターとし
て用いることにより、カルシウムの代謝調節、細胞分化
促進や細胞性免疫機能を調節に重要な役割を果たし、骨
粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性クル病などの
治療に有効である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
3 を製造することが可能である。By changing the localization of the membrane enzyme based on signal substitution from mitochondria to microsomes, the amount of P450c25 produced per yeast cell was increased about 10 times, and 1α-hydroxyvitamin D3 25 position per P450 molecule was increased. The hydroxylation activity could be increased about 50 times. Therefore, the 1α-hydroxyvitamin D3 25-position hydroxylation ability per cell was increased about 500 times. By using the chimeric P450c25 as a bioreactor, it plays an important role in regulation of calcium metabolism, promotion of cell differentiation and regulation of cell-mediated immune function, such as osteoporosis, chronic renal failure, and vitamin D resistant rickets. 1α, 25-dihydroxyvitamin D effective for treatment
It is possible to manufacture 3.

【００２０】また、キメラ体Ｐ４５０c25 、ＡＤＸおよ
びＡＤＲの同時発現株菌体をバイオリアクターとして用
いることは現在行われている活性型ビタミンＤ3 の複雑
な化学合成法を単純化するのに有効な手段であると考え
られる。一方、大量に産生されるキメラＰ４５０c25 は
容易に精製することができ、これに対する抗体を脳腱黄
色腫症の診断薬として利用することができる。The use of chimeric P450c25, ADX and ADR co-expressing strains as a bioreactor is an effective means for simplifying the complicated chemical synthesis method of active vitamin D3 which is currently performed. It is believed that there is. On the other hand, the chimeric P450c25 produced in large quantities can be easily purified, and an antibody against this can be used as a diagnostic agent for cerebral tendon xanthomatosis.

【００２１】また、Ｐ４５０c25 だけではなく、他のミ
トコンドリア型Ｐ４５０をキメラＰ４５０として大量に
生産することも可能である。それにより、前記のＰ４５
０c25 が示す２５位水酸化活性だけでなく、他の部位を
水酸化することが可能となるので、そのようなキメラＰ
４５０は、バイオリアクターとして有用である。In addition to P450c25, other mitochondrial P450s can be produced in large quantities as chimeric P450s. As a result, the above P45
In addition to the 25-position hydroxylation activity shown by 0c25, it is possible to hydroxylate other sites.
450 is useful as a bioreactor.

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー 配列 1 AATTCAAGCT TAAAAAAATG TGGCTGCTCC TGGCTGTCTT TCTGCTCACC CTCGCCTATT 60 GTTCGA ATTTTTTTAC ACCGACGAGG ACCGACAGAA AGACGAGTGG GAGCGGATAA TAGCGATCCC TGCA 74 ATCGCTAGGG SEQ ID NO: 1 Sequence Length: Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic Linker Sequence 1 AATTCAAGCT TAAAAAAATG TGGCTGCTCC TGGCTGTCTT TCTGCTCACC CTCGCCTATT 60 GTTCGA ATTTTTTTAC ACCGACGAGG ACCGAGTGAATTA TAGCGATCCC TGCA 74 ATCGCTAGGG

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の発現プラスミドｐＡＭＳ２５の構築工
程の説明図である。制限酵素切断部位は、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｎｃ：ＮｃｏＩ，Ｓ：ＳａｃＩ，Ｈ：ＨｉｎｄIII,
Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｎ：ＮｏｔＩを示す。FIG. 1 is an explanatory view of a construction process of an expression plasmid pAMS25 of the present invention. The restriction enzyme cleavage site is E: EcoR
I, Nc: NcoI, S: SacI, H: HindIII,
P: PstI and N: NotI are shown.

【図２】発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築工程の説
明図である。制限酵素切断部位は、Ｈ：ＨｉｎｄIII 、
Ｎ：ＮｏｔＩを示す。FIG. 2 is an explanatory diagram of a construction process of an expression plasmid pRXMS25. The restriction enzyme cleavage site is H: HindIII,
N: NotI is shown.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/02 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical display location C12R 1: 865) (C12N 9/02 (C12N 9/02 C12R 1: 865) C12R 1: 865) (C12P 21/02 C (C12P 21/02 C12R 1: 865) C12R 1: 865) 9162-4B C12N 15/00 ZNAA

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】ウシ副腎Ｐ４５０ _１７ αのＮ末端１５アミ
ノ酸からなるシグナル配列をＮ末端に有し、５０１アミ
ノ酸残基からなる成熟型のラット肝Ｐ４５０ _Ｃ２５ をＣ
末端に有するキメラＰ４５０、ウシ副腎アドレノドキシ
ン還元酵素、ウシ副腎アドレノドキシンを同時に発現す
る酵母菌株。 1. N-terminal 15 amino acids of bovine adrenal P450 ₁₇ α
A signal sequence consisting of amino acid is present at the N-terminus,
The mature form of rat liver _{P450 C25} consisting Roh acid residues C
Chimeric P450 with end, bovine adrenal adrenodoxy
Co-reductase and bovine adrenal adrenodoxin
Yeast strain. 【請求項２】下記の制限酵素地図で表されるプラスミド
ｐＲＸＭＳ２５を保持する酵母菌株。 2. A plasmid represented by the following restriction enzyme map.
A yeast strain carrying pRXMS25. 【請求項３】下記の制限酵素地図で表されるプラスミド
ｐＲＸＭＳ２５を保持するサッカロミセス・セレビシェ
ＡＨ２２（ＡＴＣＣ３８６２６）／ｐＲＸＭＳ２５。 3. A plasmid represented by the following restriction enzyme map.
Saccharomyces cerevisiae holding pRXMS25
AH22 (ATCC38626) / pRXMS25. 【請求項４】ウシ副腎Ｐ４５０ _１７ αのＮ末端１５アミ
ノ酸からなるシグナル配列をＮ末端に有し、５０１アミ
ノ酸残基からなる成熟型のラット肝Ｐ４５０ _Ｃ２５ をＣ
末端に有するキメラＰ４５０、ウシ副腎アドレノドキシ
ン還元酵素、ウシ副腎アドレノドキシンを酵母内で同時
発現させるプラスミド。 4. N-terminal 15 amino acids of bovine adrenal P450 ₁₇ α
A signal sequence consisting of amino acid is present at the N-terminus,
The mature form of rat liver _{P450 C25} consisting Roh acid residues C
Chimeric P450 with end, bovine adrenal adrenodoxy
Reductase and bovine adrenal adrenodoxin simultaneously in yeast
The plasmid to be expressed. 【請求項５】下記の制限酵素地図で表されるプラスミド
ｐＲＸＭＳ２５。 5. A plasmid represented by the following restriction enzyme map.
pRXMS25.