JP2517861B2 - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents
固定化酵素の製造方法Info
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- JP2517861B2 JP2517861B2 JP3329540A JP32954091A JP2517861B2 JP 2517861 B2 JP2517861 B2 JP 2517861B2 JP 3329540 A JP3329540 A JP 3329540A JP 32954091 A JP32954091 A JP 32954091A JP 2517861 B2 JP2517861 B2 JP 2517861B2
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素の製造方法
の改良に関するものである。さらに詳しくいえば、本発
明は、バイオリアクターの素子として用いられる均質で
活性の高い固定化酵素を極めて効率よく製造する方法に
関するものである。
の改良に関するものである。さらに詳しくいえば、本発
明は、バイオリアクターの素子として用いられる均質で
活性の高い固定化酵素を極めて効率よく製造する方法に
関するものである。
【0002】
【従来の技術】近年、バイオテクノロジーの進展に伴
い、固定化酵素や固定化微生物を素子とするバイオリア
クターによる有用物質を生産するシステムは急速な発展
を遂げ、例えばアミノ酸、有機酸、核酸関連物質、糖
質、化学薬品、医薬品などの製造、あるいは食品の製造
・加工、アルコールやメタンなどのエネルギー物質の生
産、さらには分析・計測分野、医療分野、環境浄化分野
などにおいて利用されはじめている。
い、固定化酵素や固定化微生物を素子とするバイオリア
クターによる有用物質を生産するシステムは急速な発展
を遂げ、例えばアミノ酸、有機酸、核酸関連物質、糖
質、化学薬品、医薬品などの製造、あるいは食品の製造
・加工、アルコールやメタンなどのエネルギー物質の生
産、さらには分析・計測分野、医療分野、環境浄化分野
などにおいて利用されはじめている。
【0003】このバイオリアクターは、酵素又微生物を
固定化し、その生体触媒としての反応特性を利用する化
学反応システムであって、従来の化学反応触媒を使用す
る反応に比べて、(1)常温、常圧の穏和な条件下で反
応が行われる、(2)反応特異性が高く、特定の物質し
か産生しない、(3)構造特異性や立体特異性の物質が
得られる、(4)省エネルギー性である、などの特徴を
有している。
固定化し、その生体触媒としての反応特性を利用する化
学反応システムであって、従来の化学反応触媒を使用す
る反応に比べて、(1)常温、常圧の穏和な条件下で反
応が行われる、(2)反応特異性が高く、特定の物質し
か産生しない、(3)構造特異性や立体特異性の物質が
得られる、(4)省エネルギー性である、などの特徴を
有している。
【0004】このようなバイオリアクターの素子として
用いられる固定化酵素を得るための酵素の固定化方法と
しては、従来担体結合法、架橋法及び包括法などが主に
用いられているが、これらの方法はそれぞれ長所及び短
所を有しており、必ずしも十分に満足しうる方法とはい
えない。
用いられる固定化酵素を得るための酵素の固定化方法と
しては、従来担体結合法、架橋法及び包括法などが主に
用いられているが、これらの方法はそれぞれ長所及び短
所を有しており、必ずしも十分に満足しうる方法とはい
えない。
【0005】例えば、前記担体結合法は、その結合様式
により、物理的吸着やイオン結合などによる非共有結合
型固定化法と化学的反応による共有結合型固定化法に大
別することができる。しかしながら、非共有結合型固定
化法は、担体と酵素タンパク質との結合力が弱いため
に、得られた固定化酵素の利用範囲が制限されるのを免
れないし、一方、共有結合型固定化法は、酵素タンパク
質のアミノ酸側鎖の化学的反応性を利用しているため、
結合については極めて安定であるものの、新たな化学結
合を形成させることにより、酵素タンパク質を失活させ
るおそれがある上、酵素タンパク質中には同種のアミノ
酸側鎖(例えば、リジンのアミノ基、アスパラギン酸及
びグルタミン酸のカルボキシル基など)があり、このも
のが固定化反応に関与するために、固定化部位を制御す
ることが極めて困難であるなどの欠点を有している。
により、物理的吸着やイオン結合などによる非共有結合
型固定化法と化学的反応による共有結合型固定化法に大
別することができる。しかしながら、非共有結合型固定
化法は、担体と酵素タンパク質との結合力が弱いため
に、得られた固定化酵素の利用範囲が制限されるのを免
れないし、一方、共有結合型固定化法は、酵素タンパク
質のアミノ酸側鎖の化学的反応性を利用しているため、
結合については極めて安定であるものの、新たな化学結
合を形成させることにより、酵素タンパク質を失活させ
るおそれがある上、酵素タンパク質中には同種のアミノ
酸側鎖(例えば、リジンのアミノ基、アスパラギン酸及
びグルタミン酸のカルボキシル基など)があり、このも
のが固定化反応に関与するために、固定化部位を制御す
ることが極めて困難であるなどの欠点を有している。
【0006】また、架橋法による固定化法においては、
前記の共有結合型固定化法と同様に架橋部位を制御する
ことは極めて困難であるという欠点がある。さらに、包
括法による固定化法は、このような欠点はないものの、
包括に用いられるゲルを作成するための条件が使用する
酵素タンパク質にとってか酷であるため、破壊されるお
それがある上、酵素の反応基質や生成物の包括ゲルへの
透過についても配慮しなければならない。
前記の共有結合型固定化法と同様に架橋部位を制御する
ことは極めて困難であるという欠点がある。さらに、包
括法による固定化法は、このような欠点はないものの、
包括に用いられるゲルを作成するための条件が使用する
酵素タンパク質にとってか酷であるため、破壊されるお
それがある上、酵素の反応基質や生成物の包括ゲルへの
透過についても配慮しなければならない。
【0007】他方、酵素タンパク質のカルボキシ末端側
に短いアミノ酸配列を導入しても、酵素の機能はほとん
ど影響を受けないことが知られている〔特開平1−14
4992号公報、「メソッズ・イン・エンザイモロジー
(Methods in Enzymology)」、
第185巻、第129ページ(1990年)〕。
に短いアミノ酸配列を導入しても、酵素の機能はほとん
ど影響を受けないことが知られている〔特開平1−14
4992号公報、「メソッズ・イン・エンザイモロジー
(Methods in Enzymology)」、
第185巻、第129ページ(1990年)〕。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記共有結
合型担体結合法による酵素タンパク質の固定化における
欠点を克服し、酵素タンパク質の失活を抑え、かつ固定
化部位を容易に制御しうる共有結合型担体結合法によ
り、均質で活性の高い固定化酵素を効率よく製造する方
法を提供することを目的としてなされたものである。
合型担体結合法による酵素タンパク質の固定化における
欠点を克服し、酵素タンパク質の失活を抑え、かつ固定
化部位を容易に制御しうる共有結合型担体結合法によ
り、均質で活性の高い固定化酵素を効率よく製造する方
法を提供することを目的としてなされたものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、酵素タンパク
質のカルボキシ末端側に短いアミノ酸配列を導入して
も、酵素の機能はほとんど影響を受けないことに着目
し、システイン残基をカルボキシ末端とする数個のアミ
ノ酸残基から成るアミノ酸配列を所望の酵素タンパク質
のカルボキシ末端側に導入して改変酵素タンパク質を調
製したのち、そのカルボキシ末端のシステイン残基のメ
ルカプト基を介して固定化担体に結合させることによ
り、その目的を達成しうることを見出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに至った。
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、酵素タンパク
質のカルボキシ末端側に短いアミノ酸配列を導入して
も、酵素の機能はほとんど影響を受けないことに着目
し、システイン残基をカルボキシ末端とする数個のアミ
ノ酸残基から成るアミノ酸配列を所望の酵素タンパク質
のカルボキシ末端側に導入して改変酵素タンパク質を調
製したのち、そのカルボキシ末端のシステイン残基のメ
ルカプト基を介して固定化担体に結合させることによ
り、その目的を達成しうることを見出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに至った。
【0010】すなわち、本発明は、酵素タンパク質のカ
ルボキシ末端側に、システイン残基をカルボキシ末端と
する数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を導入し
て改変酵素タンパク質を調製したのち、そのカルボキシ
末端のシステイン残基におけるメルカプト基を介して固
定化担体に結合させることを特徴とする固定化酵素の製
造方法を提供するものである。
ルボキシ末端側に、システイン残基をカルボキシ末端と
する数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を導入し
て改変酵素タンパク質を調製したのち、そのカルボキシ
末端のシステイン残基におけるメルカプト基を介して固
定化担体に結合させることを特徴とする固定化酵素の製
造方法を提供するものである。
【0011】本発明方法においては、まず所望の酵素タ
ンパク質のカルボキシ末端側に、システイン残基をカル
ボキシ末端とする数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸
配列を導入することが必要である。該アミノ酸配列を導
入する方法については特に制限はなく、公知の方法を用
いることができるが、例えば遺伝子組換え法により、所
望の酵素タンパク質のカルボキシ末端側に、該アミノ酸
配列を導入して成る改変酵素タンパク質を調製するのが
有利である。
ンパク質のカルボキシ末端側に、システイン残基をカル
ボキシ末端とする数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸
配列を導入することが必要である。該アミノ酸配列を導
入する方法については特に制限はなく、公知の方法を用
いることができるが、例えば遺伝子組換え法により、所
望の酵素タンパク質のカルボキシ末端側に、該アミノ酸
配列を導入して成る改変酵素タンパク質を調製するのが
有利である。
【0012】この遺伝子組換え法においては、所望の酵
素タンパク質を暗号化する遺伝子DNAを用いて、該酵
素タンパク質のカルボキシ末端部分を暗号化する配列部
分を化学合成DNAで置き換えることにより、カルボキ
シ末端がシステイン残基となるように短いアミノ酸配列
が導入された改変酵素タンパク質を暗号化する遺伝子D
NAを作成したのち、これを発現用プラスミドなどのベ
クターに組込んで発現ベクターを構築し、次いで大腸菌
などの宿主に導入して発現させ、宿主菌体から改変酵素
タンパク質を分離精製することにより、目的の改変酵素
タンパク質を作成することができる。したがって、ここ
では、ジヒドロ葉酸還元酵素について具体例を示すが、
任意の酵素タンパク質でも同様に行うことができるのは
もちろんのことである。
素タンパク質を暗号化する遺伝子DNAを用いて、該酵
素タンパク質のカルボキシ末端部分を暗号化する配列部
分を化学合成DNAで置き換えることにより、カルボキ
シ末端がシステイン残基となるように短いアミノ酸配列
が導入された改変酵素タンパク質を暗号化する遺伝子D
NAを作成したのち、これを発現用プラスミドなどのベ
クターに組込んで発現ベクターを構築し、次いで大腸菌
などの宿主に導入して発現させ、宿主菌体から改変酵素
タンパク質を分離精製することにより、目的の改変酵素
タンパク質を作成することができる。したがって、ここ
では、ジヒドロ葉酸還元酵素について具体例を示すが、
任意の酵素タンパク質でも同様に行うことができるのは
もちろんのことである。
【0013】本発明方法においては、このようにして得
られた改変酵素タンパク質のカルボキシ末端のシステイ
ン残基のメルカプト基の反応を利用して、固定化担体に
該酵素タンパク質を結合させ固定化させる。該システイ
ン残基のメルカプト基の反応を利用することにより、穏
和な条件で特異的に共有結合を作ることができる〔「生
物化学実験法8、SH基の化学修飾」学会出版センター
刊行(1978年)〕。特にチオール‐ジスルフィド交
換反応は、システイン残基に特有のものであり、他のア
ミノ酸側鎖では起こらない。また、メルカプト基は、金
属イオン(特に、水銀イオン)と結合してメルカプチド
を生成するし、ハロゲン化アルキルを含む化合物は、メ
ルカプト基を穏和な条件でアルキル化する。さらに、N
‐エチルマレイミドなどを代表とする容易に分極可能な
二重結合をもつ化合物と付加化合物を形成する。このよ
うな反応は、pHなどの条件を適当に選択することによ
りメルカプト基に対して特異的に引き起こすことができ
る。これらの反応を利用して、酵素タンパク質のカルボ
キシ末端に導入されたシステイン残基のメルカプト基の
みを共有結合を介して固定化担体につなぐことができ
る。なお、本発明においては、固定化反応の具体例とし
て、チオール‐ジスルフィド交換反応を示しているが、
もちろん該固定化反応はこの例に限定されるものではな
い。
られた改変酵素タンパク質のカルボキシ末端のシステイ
ン残基のメルカプト基の反応を利用して、固定化担体に
該酵素タンパク質を結合させ固定化させる。該システイ
ン残基のメルカプト基の反応を利用することにより、穏
和な条件で特異的に共有結合を作ることができる〔「生
物化学実験法8、SH基の化学修飾」学会出版センター
刊行(1978年)〕。特にチオール‐ジスルフィド交
換反応は、システイン残基に特有のものであり、他のア
ミノ酸側鎖では起こらない。また、メルカプト基は、金
属イオン(特に、水銀イオン)と結合してメルカプチド
を生成するし、ハロゲン化アルキルを含む化合物は、メ
ルカプト基を穏和な条件でアルキル化する。さらに、N
‐エチルマレイミドなどを代表とする容易に分極可能な
二重結合をもつ化合物と付加化合物を形成する。このよ
うな反応は、pHなどの条件を適当に選択することによ
りメルカプト基に対して特異的に引き起こすことができ
る。これらの反応を利用して、酵素タンパク質のカルボ
キシ末端に導入されたシステイン残基のメルカプト基の
みを共有結合を介して固定化担体につなぐことができ
る。なお、本発明においては、固定化反応の具体例とし
て、チオール‐ジスルフィド交換反応を示しているが、
もちろん該固定化反応はこの例に限定されるものではな
い。
【0014】タンパク質は、一般に高次構造を形成して
おり、その側鎖の動きは制限されている。したがって、
末端に存在するアミノ酸側鎖を除いて、その反応性は一
般に低い。本発明では、カルボキシ末端がシステイン残
基である数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列例え
ばGly-Gly-Gly-Cysを導入し、カルボキシ末端の運動性
を高め、メルカプト基の反応性を特に高めて特異性を増
大させていることも、本発明の特徴の1つである。
おり、その側鎖の動きは制限されている。したがって、
末端に存在するアミノ酸側鎖を除いて、その反応性は一
般に低い。本発明では、カルボキシ末端がシステイン残
基である数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列例え
ばGly-Gly-Gly-Cysを導入し、カルボキシ末端の運動性
を高め、メルカプト基の反応性を特に高めて特異性を増
大させていることも、本発明の特徴の1つである。
【0015】次に、本発明の実施態様を酵素タンパク質
としてジヒドロ葉酸還元酵素を用いた例について説明す
ると、まず、カルボキシ末端がシステイン残基となるよ
うな短いアミノ酸配列が導入された改変ジヒドロ葉酸還
元酵素を暗号化する遺伝子DNA、すなわち改変ジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子DNAがプラスミドなどのベクタ
ーに組込まれた発現ベクターを構築する。本発明におい
ては、このジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子として大腸菌由
来のものを用いるが、この大腸菌由来の遺伝子は、本発
明者らにより、すでにクローンニングが行われており、
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DNAが組込まれた
発現ベクターも作成されている(特公平1−48756
号公報)。さらに改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DN
Aが組込まれた発現ベクターも作成されている(特開昭
63−267276号公報、特開平1−252289号
公報)。したがって、これらの公知の技術を利用するこ
とにより、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子か
らカルボキシ末端がシステイン残基である改変ジヒドロ
葉酸還元酵素を暗号化する改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子DNAが組込まれた発現ベクターを容易に構築する
ことができる。
としてジヒドロ葉酸還元酵素を用いた例について説明す
ると、まず、カルボキシ末端がシステイン残基となるよ
うな短いアミノ酸配列が導入された改変ジヒドロ葉酸還
元酵素を暗号化する遺伝子DNA、すなわち改変ジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子DNAがプラスミドなどのベクタ
ーに組込まれた発現ベクターを構築する。本発明におい
ては、このジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子として大腸菌由
来のものを用いるが、この大腸菌由来の遺伝子は、本発
明者らにより、すでにクローンニングが行われており、
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DNAが組込まれた
発現ベクターも作成されている(特公平1−48756
号公報)。さらに改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DN
Aが組込まれた発現ベクターも作成されている(特開昭
63−267276号公報、特開平1−252289号
公報)。したがって、これらの公知の技術を利用するこ
とにより、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子か
らカルボキシ末端がシステイン残基である改変ジヒドロ
葉酸還元酵素を暗号化する改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子DNAが組込まれた発現ベクターを容易に構築する
ことができる。
【0016】ところで一般に、形質転換された微生物
に、外来タンパク質遺伝子を効率よく発現させ、目的と
するタンパク質を量産させるには、該外来タンパク質遺
伝子の転写効率や翻訳効率を高めたり、該外来タンパク
質遺伝子のコピー数を多くすることが必要である。そし
て該外来遺伝子の転写効率を高めるために、一般に外来
タンパク質遺伝子の上流に強力なプロモーターを結合さ
せることが行われている。したがって、前記発現ベクタ
ーは、改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DNAの上流に
適当なプロモーターを結合したものが好ましい。また、
この発現ベクターは、宿主微生物に導入するが、この発
現ベクターが導入された微生物の選択は、通常該ベクタ
ーの薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で該微生物を培
養して生育する微生物を選ぶことにより行われるので、
該発現ベクターには薬剤耐性遺伝子DNAも組込まれて
いるのが望ましい。
に、外来タンパク質遺伝子を効率よく発現させ、目的と
するタンパク質を量産させるには、該外来タンパク質遺
伝子の転写効率や翻訳効率を高めたり、該外来タンパク
質遺伝子のコピー数を多くすることが必要である。そし
て該外来遺伝子の転写効率を高めるために、一般に外来
タンパク質遺伝子の上流に強力なプロモーターを結合さ
せることが行われている。したがって、前記発現ベクタ
ーは、改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DNAの上流に
適当なプロモーターを結合したものが好ましい。また、
この発現ベクターは、宿主微生物に導入するが、この発
現ベクターが導入された微生物の選択は、通常該ベクタ
ーの薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で該微生物を培
養して生育する微生物を選ぶことにより行われるので、
該発現ベクターには薬剤耐性遺伝子DNAも組込まれて
いるのが望ましい。
【0017】次に、このようにして得られた発現ベクタ
ーは、大腸菌などの宿主微生物に公知の方法によって導
入し、宿主微生物を形質転換させて、所望の改変ジヒド
ロ葉酸還元酵素を産生する形質転換微生物を作出する。
宿主微生物の発現ベクター導入の有無についての選択
は、前記したように、ベクターの薬剤耐性マーカーに基
づく選択培地で微生物を培養して生育する微生物を選択
すればよい。
ーは、大腸菌などの宿主微生物に公知の方法によって導
入し、宿主微生物を形質転換させて、所望の改変ジヒド
ロ葉酸還元酵素を産生する形質転換微生物を作出する。
宿主微生物の発現ベクター導入の有無についての選択
は、前記したように、ベクターの薬剤耐性マーカーに基
づく選択培地で微生物を培養して生育する微生物を選択
すればよい。
【0018】この形質転換微生物の作出は、例えば化学
合成法により得られた2本の23ヌクレオチド5′-GATC
CTGGGTGGCTGTTAAC-3′及び5′-TCGACTTAACAGCCACCGAC-
3′(ただし、式中のAはアデニン、Tはチミン、Gは
グアニン、Cはシトシンを意味する)から成るDNAを
アニールさせ、一方プラスミドpMEK2(特開平1−
252289号公報参照、ジヒドロ葉酸還元酵素‐メチ
オニンエンケファリン融合タンパク質を暗号化する遺伝
子DNA、プロモーター、トリメトプリム耐性及びアン
ピシリン耐性遺伝子DNAなどを含有)に適当な制限酵
素を作用させて切断し、DNA断片を得、このDNA断
片と前記のアニールさせた化学合成DNAとをT4DN
Aリガーゼを用いて結合させたのち、これを形質転換法
に従ってエシエリヒア・コリ(以下E.Coliと略記
する)に導入し、次いでアンピシリンナトリウム及びト
リメトプリムを含む栄養寒天培地を用いて、形質転換株
を選択した。
合成法により得られた2本の23ヌクレオチド5′-GATC
CTGGGTGGCTGTTAAC-3′及び5′-TCGACTTAACAGCCACCGAC-
3′(ただし、式中のAはアデニン、Tはチミン、Gは
グアニン、Cはシトシンを意味する)から成るDNAを
アニールさせ、一方プラスミドpMEK2(特開平1−
252289号公報参照、ジヒドロ葉酸還元酵素‐メチ
オニンエンケファリン融合タンパク質を暗号化する遺伝
子DNA、プロモーター、トリメトプリム耐性及びアン
ピシリン耐性遺伝子DNAなどを含有)に適当な制限酵
素を作用させて切断し、DNA断片を得、このDNA断
片と前記のアニールさせた化学合成DNAとをT4DN
Aリガーゼを用いて結合させたのち、これを形質転換法
に従ってエシエリヒア・コリ(以下E.Coliと略記
する)に導入し、次いでアンピシリンナトリウム及びト
リメトプリムを含む栄養寒天培地を用いて、形質転換株
を選択した。
【0019】このようにして作出された形質転換株はカ
ルボキシ末端がシステイン残基である改変ジヒドロ葉酸
還元酵素を大量に産生することを確認するとともに、こ
の形質転換株から公知の方法により、図1に示す制限酵
素切断地図を有するプラスミドpCYS1を調製した。
ルボキシ末端がシステイン残基である改変ジヒドロ葉酸
還元酵素を大量に産生することを確認するとともに、こ
の形質転換株から公知の方法により、図1に示す制限酵
素切断地図を有するプラスミドpCYS1を調製した。
【0020】このプラスミドpCYS1の制限酵素Bg
IIIによる切断によって得られる約700ヌクレオチ
ド長のDNAについて、公知の方法により塩基配列を決
定し、目的の化学合成DNAが正しく組込まれているこ
とを確認し、さらにこの決定したDNAの塩基配列か
ら、改変ジヒドロ葉酸還元酵素のアミノ酸配列を決定し
た。
IIIによる切断によって得られる約700ヌクレオチ
ド長のDNAについて、公知の方法により塩基配列を決
定し、目的の化学合成DNAが正しく組込まれているこ
とを確認し、さらにこの決定したDNAの塩基配列か
ら、改変ジヒドロ葉酸還元酵素のアミノ酸配列を決定し
た。
【0021】前記改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DN
Aは、式
Aは、式
【化1】 で示される塩基配列を有している。なお、この中の記号
A,T,G及びCは前記と同じ意味をもち、塩基配列を
配列表配列番号2に示す。なお、この配列表における塩
基配列の番号はジヒドロ葉酸還元酵素を暗号化するDN
A配列中1番目のアミノ酸のメチオニンのコードATGのA
を1番として数えている。また、ジヒドロ葉酸還元酵素
を暗号化する部分は、3塩基より成るアミノ酸のコード
で区切って示している。
A,T,G及びCは前記と同じ意味をもち、塩基配列を
配列表配列番号2に示す。なお、この配列表における塩
基配列の番号はジヒドロ葉酸還元酵素を暗号化するDN
A配列中1番目のアミノ酸のメチオニンのコードATGのA
を1番として数えている。また、ジヒドロ葉酸還元酵素
を暗号化する部分は、3塩基より成るアミノ酸のコード
で区切って示している。
【0022】この配列の末端は、制限酵素BgIIIの
認識切断部位を有し、任意のベクターに組み込むことが
可能である。改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発
現プラスミドpCYS1は、E.Coli菌体中に安定
に保持され、pCYS1を含有するE.Coliは、微
工研にFERM BP‐3600として寄託されてい
る。
認識切断部位を有し、任意のベクターに組み込むことが
可能である。改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発
現プラスミドpCYS1は、E.Coli菌体中に安定
に保持され、pCYS1を含有するE.Coliは、微
工研にFERM BP‐3600として寄託されてい
る。
【0023】このpCYS1は、プラスミドpMEK2
(特開平1−252289号公報)のBamHIとXh
oI部位の間の配列を、前記した二本鎖DNAで置き換
えることにより作出される。このpCYS1は4637
塩基対から成り、宿主にアンピシリン耐性及びトリメト
プリム耐性を付与する。図1の制限酵素切断地図に、そ
れぞれの遺伝子の位置が示されており、図中Ampで示
したのがアンピシリン耐性遺伝子の位置であり、DHF
Rで示した部位がトリメトプリム耐性を与えるジヒドロ
葉酸還元酵素の遺伝子の部位である。前記のBgIII
部位にはさまれた改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子部位
は、図中では黒く塗りつぶした矢印で表わされている。
oriはプラスミドの複製に必要な部位、pは改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子の高効率発現に必要なプロモー
ターの位置を示している。
(特開平1−252289号公報)のBamHIとXh
oI部位の間の配列を、前記した二本鎖DNAで置き換
えることにより作出される。このpCYS1は4637
塩基対から成り、宿主にアンピシリン耐性及びトリメト
プリム耐性を付与する。図1の制限酵素切断地図に、そ
れぞれの遺伝子の位置が示されており、図中Ampで示
したのがアンピシリン耐性遺伝子の位置であり、DHF
Rで示した部位がトリメトプリム耐性を与えるジヒドロ
葉酸還元酵素の遺伝子の部位である。前記のBgIII
部位にはさまれた改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子部位
は、図中では黒く塗りつぶした矢印で表わされている。
oriはプラスミドの複製に必要な部位、pは改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子の高効率発現に必要なプロモー
ターの位置を示している。
【0024】前記の改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の
配列を発現させることにより、式
配列を発現させることにより、式
【化2】 で示されるアミノ酸配列を有する改変ジヒドロ葉酸還元
酵素を発現させることができる。なお、この式のアミノ
酸配列における番号は、ジヒドロ葉酸還元酵素1番目の
アミノ酸のメチオニンから起算したものであり、また、
Alaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアス
パラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシスティ
ン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Gl
yはグリシン、Hisヒスチジン、Ileはイソロイシ
ン、Leuはロイシン、Lysはリジン、Metはメチ
オニン、Pheはフェニルアラニン、Proはプロリ
ン、Serはセリン、Thrはスレオニン、Trpはト
リプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンのア
ミノ酸単位を示す。
酵素を発現させることができる。なお、この式のアミノ
酸配列における番号は、ジヒドロ葉酸還元酵素1番目の
アミノ酸のメチオニンから起算したものであり、また、
Alaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアス
パラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシスティ
ン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Gl
yはグリシン、Hisヒスチジン、Ileはイソロイシ
ン、Leuはロイシン、Lysはリジン、Metはメチ
オニン、Pheはフェニルアラニン、Proはプロリ
ン、Serはセリン、Thrはスレオニン、Trpはト
リプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンのア
ミノ酸単位を示す。
【0025】この改変ジヒドロ葉酸還元酵素は、165
個のアミノ酸残基から成る酵素タンパク質であり、補酵
素NADPH存在下にジヒドロ葉酸を還元してテトラヒ
ドロ葉酸を生成する反応を触媒する。野生型のジヒドロ
葉酸還元酵素は159個のアミノ酸残基から成り、15
2番目のアミノ酸残基がシステイン残基であることを除
けば上記配列の1から159番目までの配列と全く同一
の配列である。
個のアミノ酸残基から成る酵素タンパク質であり、補酵
素NADPH存在下にジヒドロ葉酸を還元してテトラヒ
ドロ葉酸を生成する反応を触媒する。野生型のジヒドロ
葉酸還元酵素は159個のアミノ酸残基から成り、15
2番目のアミノ酸残基がシステイン残基であることを除
けば上記配列の1から159番目までの配列と全く同一
の配列である。
【0026】改変ジヒドロ葉酸還元酵素中には、2個の
システイン残基が存在するが(85番目と165番
目)、そのメルカプト基の反応性は全く異なっており、
中性(pH7.0)、室温(15〜30℃)での、5,
5′‐ジチオビス(2‐ニトロ安息香酸)を用いたチオ
ール‐ジスルフィド交換反応では、85番目のシステイ
ン残基では全く反応しないのに対して、165番目のシ
ステイン残基では迅速に反応し約数分でその反応を完結
する。また、野生型ジヒドロ葉酸還元酵素中にも、2個
のシステイン残基が存在するが(85番目と152番
目)、そのメルカプト基の反応性は低く、同様な反応条
件で85番目のシステイン残基では全く不活性であり、
152番目のシステイン残基における反応性は、改変ジ
ヒドロ葉酸還元酵素165番目のシスティン残基におけ
る反応性の数分の1である。
システイン残基が存在するが(85番目と165番
目)、そのメルカプト基の反応性は全く異なっており、
中性(pH7.0)、室温(15〜30℃)での、5,
5′‐ジチオビス(2‐ニトロ安息香酸)を用いたチオ
ール‐ジスルフィド交換反応では、85番目のシステイ
ン残基では全く反応しないのに対して、165番目のシ
ステイン残基では迅速に反応し約数分でその反応を完結
する。また、野生型ジヒドロ葉酸還元酵素中にも、2個
のシステイン残基が存在するが(85番目と152番
目)、そのメルカプト基の反応性は低く、同様な反応条
件で85番目のシステイン残基では全く不活性であり、
152番目のシステイン残基における反応性は、改変ジ
ヒドロ葉酸還元酵素165番目のシスティン残基におけ
る反応性の数分の1である。
【0027】発現プラスミドベクターpCYS1が導入
された形質転換E.Coli(微工研菌寄FERM B
P‐3600)の培養は、該E.Coliの生育に必要
な炭素源や窒素源などの栄養源及び無機成分などを含む
培地中において行うことができる。
された形質転換E.Coli(微工研菌寄FERM B
P‐3600)の培養は、該E.Coliの生育に必要
な炭素源や窒素源などの栄養源及び無機成分などを含む
培地中において行うことができる。
【0028】該炭素源としては、例えばグルコース、デ
ンプン、ショ糖、モラッセ、デキストリンなどが、窒素
源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水
分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウム
塩などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、マ
ンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸などの
陰イオンを含む塩が挙げられる。
ンプン、ショ糖、モラッセ、デキストリンなどが、窒素
源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水
分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウム
塩などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、マ
ンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸などの
陰イオンを含む塩が挙げられる。
【0029】培養の形態は液体培養が好ましく、工業的
には深部通気かくはん培養を行うのが有利である。培養
温度はE.Coliが生育し、改変ジヒドロ葉酸還元酵
素が生産される範囲で適宜選ばれるが、通常20〜40
℃の範囲の温度で選ばれる。培養時間は条件により左右
されるが、酵素が最高収量に達する時間を見計らって適
当な時期に培養を終了すればよい。
には深部通気かくはん培養を行うのが有利である。培養
温度はE.Coliが生育し、改変ジヒドロ葉酸還元酵
素が生産される範囲で適宜選ばれるが、通常20〜40
℃の範囲の温度で選ばれる。培養時間は条件により左右
されるが、酵素が最高収量に達する時間を見計らって適
当な時期に培養を終了すればよい。
【0030】このようにして得られた培養物は、ろ過又
は遠心分離などの手段により菌体を回収し、次いでこの
菌体をボールミルや超音波による機械的破砕方法やリゾ
チームなどの酵素的破砕方法で破砕し、必要に応じてキ
レート剤や界面活性剤を添加して改変ジヒドロ葉酸還元
酵素を可溶化して分離採取し、精製すればよい。精製方
法については、例えば改変ジヒドロ葉酸還元酵素含有溶
液を減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナトリウムなどでの
塩析処理、メタノールやエタノール、アセトンなどの親
水性有機溶媒での分別沈殿などの手段を適宜選択し、組
み合わせて沈殿を得たのち、さらにこの改変ジヒドロ葉
酸還元酵素を含有する沈殿物を、必要に応じて、水又は
緩衝液に溶解し、透析膜にて透析して、より低分子量の
不純物を除去してもよく、また、吸着剤やゲルろ過剤な
どによるイオン交換クロマトグラフィー、サイズ分離ゲ
ルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどにより精
製してもよい。これらの精製方法は1種用いてもよい
し、2種以上を組み合わせて用いてもよく、あるいは1
種以上の精製方法を繰り返して用いてもよい。
は遠心分離などの手段により菌体を回収し、次いでこの
菌体をボールミルや超音波による機械的破砕方法やリゾ
チームなどの酵素的破砕方法で破砕し、必要に応じてキ
レート剤や界面活性剤を添加して改変ジヒドロ葉酸還元
酵素を可溶化して分離採取し、精製すればよい。精製方
法については、例えば改変ジヒドロ葉酸還元酵素含有溶
液を減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナトリウムなどでの
塩析処理、メタノールやエタノール、アセトンなどの親
水性有機溶媒での分別沈殿などの手段を適宜選択し、組
み合わせて沈殿を得たのち、さらにこの改変ジヒドロ葉
酸還元酵素を含有する沈殿物を、必要に応じて、水又は
緩衝液に溶解し、透析膜にて透析して、より低分子量の
不純物を除去してもよく、また、吸着剤やゲルろ過剤な
どによるイオン交換クロマトグラフィー、サイズ分離ゲ
ルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどにより精
製してもよい。これらの精製方法は1種用いてもよい
し、2種以上を組み合わせて用いてもよく、あるいは1
種以上の精製方法を繰り返して用いてもよい。
【0031】本発明においては、このようにして得られ
たシステイン残基をカルボキシ末端に有する精製改変ジ
ヒドロ葉酸還元酵素を固定化するが、この固定化は、シ
ステイン残基のメルカプト基と反応する官能基を有する
固定化担体を利用することによって行われる。この際使
用する固定化担体については、システイン残基のメルカ
プト基と特異的に反応する官能基を有する担体であれば
よく特に制限はないが、例えば市販のチオプロピルセフ
ァローズ6Bなどを用いることができる。
たシステイン残基をカルボキシ末端に有する精製改変ジ
ヒドロ葉酸還元酵素を固定化するが、この固定化は、シ
ステイン残基のメルカプト基と反応する官能基を有する
固定化担体を利用することによって行われる。この際使
用する固定化担体については、システイン残基のメルカ
プト基と特異的に反応する官能基を有する担体であれば
よく特に制限はないが、例えば市販のチオプロピルセフ
ァローズ6Bなどを用いることができる。
【0032】このチオプロピルセファローズ6Bは、改
変ジヒドロ葉酸還元酵素と中性条件で混合するのみで、
チオプロピルセファローズ6B1g当り、改変ジヒドロ
葉酸還元酵素約0.3mgを固定化することができる。
変ジヒドロ葉酸還元酵素と中性条件で混合するのみで、
チオプロピルセファローズ6B1g当り、改変ジヒドロ
葉酸還元酵素約0.3mgを固定化することができる。
【0033】このようにして固定化された改変ジヒドロ
葉酸還元酵素は活性であり、ガラスカラムに充填して酵
素反応器として用いたところ、4℃で流速10ml/分
という高流速条件でも、約500mgの少量の固定化ゲ
ルを用いるだけで酵素反応をほぼ完全に完了させること
ができ、その有効性を確認することができた。
葉酸還元酵素は活性であり、ガラスカラムに充填して酵
素反応器として用いたところ、4℃で流速10ml/分
という高流速条件でも、約500mgの少量の固定化ゲ
ルを用いるだけで酵素反応をほぼ完全に完了させること
ができ、その有効性を確認することができた。
【0034】固定化した改変ジヒドロ葉酸還元酵素の酵
素活性は、反応液〔0.05mMのジヒドロ葉酸、0.
06mMのNADPH、50mMのリン酸緩衝液(pH
7.0)〕をペリスタポンプを用いてガラスカラムに充
填して酵素反応器に連続的に送り込み、適当な時間後に
溶出した溶液を分取し、その溶液の340nmの吸光度
を測定し、カラムに通す前の溶液の340nmの吸光度
との差を算出することにより求める。この際、過剰量の
ジヒドロ葉酸還元酵素を用いて反応させたときの340
nmの吸光度の全変化を100%の転換効率として用い
る。
素活性は、反応液〔0.05mMのジヒドロ葉酸、0.
06mMのNADPH、50mMのリン酸緩衝液(pH
7.0)〕をペリスタポンプを用いてガラスカラムに充
填して酵素反応器に連続的に送り込み、適当な時間後に
溶出した溶液を分取し、その溶液の340nmの吸光度
を測定し、カラムに通す前の溶液の340nmの吸光度
との差を算出することにより求める。この際、過剰量の
ジヒドロ葉酸還元酵素を用いて反応させたときの340
nmの吸光度の全変化を100%の転換効率として用い
る。
【0035】このような固定化方法を用いることによ
り、固定化担体と結合する部位としては酵素タンパク質
のカルボキシ末端だけに限定することが可能となり、こ
のことにより、従来の固定化方法で障害となっていた固
定化反応による酵素それ自体の活性の低下及び固定化さ
れた酵素の不均一性などを解消することができる。
り、固定化担体と結合する部位としては酵素タンパク質
のカルボキシ末端だけに限定することが可能となり、こ
のことにより、従来の固定化方法で障害となっていた固
定化反応による酵素それ自体の活性の低下及び固定化さ
れた酵素の不均一性などを解消することができる。
【0036】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
【0036】実施例1 pCYS1の作成 ホスホアミダイト法により化学合成された2本の23ヌ
クレオチドすなわち5′-GATCCTGGGTGGCGGCTGTTAAC-3′
及び5′-TCGACTTAACAGCCGCCACCGAC-3′からなるDNA
それぞれを、約0.1ml(約0.01μgのDNAを
含んでいる)ずつ採り、これを60℃でインキュベート
することによって両DNAをアニールさせた(これをD
NA1と呼ぶ)。
クレオチドすなわち5′-GATCCTGGGTGGCGGCTGTTAAC-3′
及び5′-TCGACTTAACAGCCGCCACCGAC-3′からなるDNA
それぞれを、約0.1ml(約0.01μgのDNAを
含んでいる)ずつ採り、これを60℃でインキュベート
することによって両DNAをアニールさせた(これをD
NA1と呼ぶ)。
【0037】pMEK2(特開平1−252289号公
報)約1μgを、BamHIとXhoIを用いて切断し
たのち、その後エタノールでDNAを沈殿させた。沈殿
したDNAを70wt%エタノールで洗ったのち、エタ
ノールを除き、減圧下に沈殿を乾燥させた。制限酵素に
よるDNAの切断などの組換えDNAに係わる各操作
は、いずれも、マニアティスらの方法〔「モレキュラル
・クローニング・エイ・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(198
2年)(Molecular Cloning A L
oboratory Manual,Cold Spr
ing Harbor Laboratory (19
82)」〕に従って行った。切断したpMEK2断片と
DNA1をT4DNAリガーゼを用いて結合し、形質転
換法に従って、大腸菌に取り込ませた。形質転換株を、
50mg/mlのアンピシリンナトリウム及び10mg
/mlのトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培地11
中に、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウム、5
gのイーストエキス、5gのポリペプトン、15gの寒
天を含む)を用いて、アンピシリン耐性及びトリメトプ
リム耐性で選択した。さらに、得られた形質転換株を培
養し、その菌体が作る全タンパク質をSDS‐ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法〔「ネイチャー(Natur
e)」第227巻、第680ページ(1970年)〕に
従って分析した。分子量マーカーとしてラクトアルブミ
ン(分子量14,200)、トリプシンインヒビター
(分子量20,100)、トリプシノーゲン(分子量2
4,000)、カルボニックアンヒドラーゼ(分子量2
9,000)、グリセロアルデヒド3‐リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(分子量36,000)、卵アルブミン(分子
量45,000)及び牛血清アルブミン(分子量66,
000)を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の1
0から20%濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、改変
ジヒドロ葉酸還元酵素を大量に発現する菌体が約80%
の頻度で得られた。
報)約1μgを、BamHIとXhoIを用いて切断し
たのち、その後エタノールでDNAを沈殿させた。沈殿
したDNAを70wt%エタノールで洗ったのち、エタ
ノールを除き、減圧下に沈殿を乾燥させた。制限酵素に
よるDNAの切断などの組換えDNAに係わる各操作
は、いずれも、マニアティスらの方法〔「モレキュラル
・クローニング・エイ・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(198
2年)(Molecular Cloning A L
oboratory Manual,Cold Spr
ing Harbor Laboratory (19
82)」〕に従って行った。切断したpMEK2断片と
DNA1をT4DNAリガーゼを用いて結合し、形質転
換法に従って、大腸菌に取り込ませた。形質転換株を、
50mg/mlのアンピシリンナトリウム及び10mg
/mlのトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培地11
中に、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウム、5
gのイーストエキス、5gのポリペプトン、15gの寒
天を含む)を用いて、アンピシリン耐性及びトリメトプ
リム耐性で選択した。さらに、得られた形質転換株を培
養し、その菌体が作る全タンパク質をSDS‐ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法〔「ネイチャー(Natur
e)」第227巻、第680ページ(1970年)〕に
従って分析した。分子量マーカーとしてラクトアルブミ
ン(分子量14,200)、トリプシンインヒビター
(分子量20,100)、トリプシノーゲン(分子量2
4,000)、カルボニックアンヒドラーゼ(分子量2
9,000)、グリセロアルデヒド3‐リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(分子量36,000)、卵アルブミン(分子
量45,000)及び牛血清アルブミン(分子量66,
000)を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の1
0から20%濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、改変
ジヒドロ葉酸還元酵素を大量に発現する菌体が約80%
の頻度で得られた。
【0038】この菌体から、田中らの方法〔「ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol
ogy)」第121巻、第354ページ(1975
年)〕に従って、プラスミドを調製し、pCYS1と名
づけた。このpCYS1のBglIIによる切断によっ
て得られる約700ヌクレオチド長のDNAについて、
M13ファージを用いたジデオキシ法〔「メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー(Mehtods in Enz
ymology)」第101巻、第20ページ(198
3年)〕に従って塩基配列を決定し、目的の化学合成D
NAが正しく組み込まれていることを確認した。また、
決定したDNA配列から、改変ジヒドロ葉酸還元酵素の
アミノ酸配列を決定した。
ル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol
ogy)」第121巻、第354ページ(1975
年)〕に従って、プラスミドを調製し、pCYS1と名
づけた。このpCYS1のBglIIによる切断によっ
て得られる約700ヌクレオチド長のDNAについて、
M13ファージを用いたジデオキシ法〔「メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー(Mehtods in Enz
ymology)」第101巻、第20ページ(198
3年)〕に従って塩基配列を決定し、目的の化学合成D
NAが正しく組み込まれていることを確認した。また、
決定したDNA配列から、改変ジヒドロ葉酸還元酵素の
アミノ酸配列を決定した。
【0039】実施例2 pCYS1を導入した大腸菌か
ら改変ジヒドロ葉酸還元酵素の分離精製 改変ジヒドロ葉酸還元酵素の分離精製は、(1)菌体の
培養、(2)菌体の破砕、(3)DEAE‐トヨパール
カラム処理、(4)メソトリキセート(MTX)結合ア
フィニティクロマトグラフィー及び(5)DEAE‐ト
ヨパールカラムクロマトグラフィーの工程を経て行っ
た。
ら改変ジヒドロ葉酸還元酵素の分離精製 改変ジヒドロ葉酸還元酵素の分離精製は、(1)菌体の
培養、(2)菌体の破砕、(3)DEAE‐トヨパール
カラム処理、(4)メソトリキセート(MTX)結合ア
フィニティクロマトグラフィー及び(5)DEAE‐ト
ヨパールカラムクロマトグラフィーの工程を経て行っ
た。
【0040】(1)菌体の培養 pCYS1を含有する大腸菌の培養は、6リットルのY
T+Ap培地(培地1リットル中に、5gのNaCl、
8gのトリプトン、5gのイーストエキス及び50mg
のアンピシリンナトリウムを含む液体培地)で、37℃
で対数成長期の後期で培養した。培養した菌体は、5,
000回転/分の遠心分離により集め、培地6リットル
より湿重量約17gの菌体が得らた。
T+Ap培地(培地1リットル中に、5gのNaCl、
8gのトリプトン、5gのイーストエキス及び50mg
のアンピシリンナトリウムを含む液体培地)で、37℃
で対数成長期の後期で培養した。培養した菌体は、5,
000回転/分の遠心分離により集め、培地6リットル
より湿重量約17gの菌体が得らた。
【0041】(2)菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の2倍の緩衝液1
(0.1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH
7.0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕
した。菌体破砕液を5,000回転、10分間遠心分離
し、上清を得た。さらに、上清を、35,000回転、
1時間超遠心分離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
(0.1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH
7.0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕
した。菌体破砕液を5,000回転、10分間遠心分離
し、上清を得た。さらに、上清を、35,000回転、
1時間超遠心分離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
【0042】(3)DEAE‐トヨパールカラム処理 この操作は、次のMTX結合アフィニティクロマトグラ
フィーによる精製工程の前処理の目的で行った。無細胞
抽出液を、あらかじめ0.1MのKClを含む緩衝液1
で平衡化したDEAEトヨパールカラムにかけ、0.1
MのKClを含む緩衝液1でカラムを洗い、酵素の溶出
は、0.3MのKClを含む緩衝液1を用いて行った。
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画し、分画した溶出液についてDHFR活性を測定して
酵素活性が含まれる画分を集めた。
フィーによる精製工程の前処理の目的で行った。無細胞
抽出液を、あらかじめ0.1MのKClを含む緩衝液1
で平衡化したDEAEトヨパールカラムにかけ、0.1
MのKClを含む緩衝液1でカラムを洗い、酵素の溶出
は、0.3MのKClを含む緩衝液1を用いて行った。
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画し、分画した溶出液についてDHFR活性を測定して
酵素活性が含まれる画分を集めた。
【0043】(4)MTX結合アフィニティクロマトグ
ラフィー 上記の操作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液
1で平衡化したMTX結合セファローズアフィニティカ
ラムに吸着させた。吸着後、1MのKClを含む緩衝液
2(0.1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウ
ム緩衝液、pH8.5)で洗浄した。洗浄は、カラムか
らの溶出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が
0.1以下になるまで同緩衝液を流し続けた。酵素の溶
出は、1MのKClと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用
いて行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画した。分画した溶出液についてDHFR活
性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集めた。得られ
た酵素液を、緩衝液1に対して、3回透析した。
ラフィー 上記の操作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液
1で平衡化したMTX結合セファローズアフィニティカ
ラムに吸着させた。吸着後、1MのKClを含む緩衝液
2(0.1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウ
ム緩衝液、pH8.5)で洗浄した。洗浄は、カラムか
らの溶出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が
0.1以下になるまで同緩衝液を流し続けた。酵素の溶
出は、1MのKClと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用
いて行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画した。分画した溶出液についてDHFR活
性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集めた。得られ
た酵素液を、緩衝液1に対して、3回透析した。
【0044】(5)DEAE‐トヨパールカラムクロマ
トグラフィー 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したD
EAE‐トヨパールカラムに吸着させたのち、0.1M
のKClを含む緩衝液1で洗浄した。洗浄は、カラムか
らの溶出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が
0.01以下になるまで同緩衝液を流し続けた。酵素の
溶出は、緩衝液1を用いて0.1Mから0.3MのKC
lの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量ずつフ
ラクションコレクターを用いて分画した。分画した溶出
液について280nmの吸光度とジヒドロ葉酸還元酵素
とを測定した。酵素活性/280nmの吸光度の値が、
一定な画分を集めた。
トグラフィー 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したD
EAE‐トヨパールカラムに吸着させたのち、0.1M
のKClを含む緩衝液1で洗浄した。洗浄は、カラムか
らの溶出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が
0.01以下になるまで同緩衝液を流し続けた。酵素の
溶出は、緩衝液1を用いて0.1Mから0.3MのKC
lの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量ずつフ
ラクションコレクターを用いて分画した。分画した溶出
液について280nmの吸光度とジヒドロ葉酸還元酵素
とを測定した。酵素活性/280nmの吸光度の値が、
一定な画分を集めた。
【0045】以上の操作により、ジヒドロ葉酸還元酵素
の高度精製均一化を、再現性良く行うことができた。精
製の際の酵素活性は、反応液〔0.05mMのジヒドロ
葉酸、0.06mMのNADPH、12mMの2‐メル
カプトエタノール、50mMのリン酸緩衝液(pH7.
0)〕を、1mlのキュベットとり、これに酵素液を加
え、340nmの吸光度の時間変化を測定することによ
り行った。酵素1ユニットは、上記反応条件において、
1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに
必要な酵素量として定義した。
の高度精製均一化を、再現性良く行うことができた。精
製の際の酵素活性は、反応液〔0.05mMのジヒドロ
葉酸、0.06mMのNADPH、12mMの2‐メル
カプトエタノール、50mMのリン酸緩衝液(pH7.
0)〕を、1mlのキュベットとり、これに酵素液を加
え、340nmの吸光度の時間変化を測定することによ
り行った。酵素1ユニットは、上記反応条件において、
1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに
必要な酵素量として定義した。
【0046】以上の結果を表1に示す。湿重量約17g
の菌体から、約130mgの均一に精製された改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素が得られた。なお表1における精製工
程は、無細胞抽出液、DEAE‐トヨパールカラム
処理、MTX結合アフィニティクロマトグラフィー及
びDEAE‐トヨパールカラムクロマトグラフィーを
表わす。
の菌体から、約130mgの均一に精製された改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素が得られた。なお表1における精製工
程は、無細胞抽出液、DEAE‐トヨパールカラム
処理、MTX結合アフィニティクロマトグラフィー及
びDEAE‐トヨパールカラムクロマトグラフィーを
表わす。
【0047】
【表1】
【0048】実施例3 改変ジヒドロ葉酸還元酵素にお
けるシステイン残基のメルカプト基の反応性 改変ジヒドロ葉酸還元酵素中における、システイン残基
のメルカプト基の反応性を5,5′‐ジチオビス(2‐
ニトロ安息香酸)を用いて測定した。
けるシステイン残基のメルカプト基の反応性 改変ジヒドロ葉酸還元酵素中における、システイン残基
のメルカプト基の反応性を5,5′‐ジチオビス(2‐
ニトロ安息香酸)を用いて測定した。
【0049】緩衝液として、2.5mMのEDTAを含
む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)を用い
た。タンパク質の濃度は0.7mg/mlであり、ま
た、5,5′‐ジチオビス(2‐ニトロ安息香酸)は2
mMの濃度、反応の温度は15℃であった。反応は5,
5′‐ジチオビス(2‐ニトロ安息香酸)を添加するこ
とにより開始し、反応に伴い遊離する5‐チオ‐2‐ニ
トロフェノールの412nmの吸光度の増加で測定し
た。その結果を図2に示す。
む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)を用い
た。タンパク質の濃度は0.7mg/mlであり、ま
た、5,5′‐ジチオビス(2‐ニトロ安息香酸)は2
mMの濃度、反応の温度は15℃であった。反応は5,
5′‐ジチオビス(2‐ニトロ安息香酸)を添加するこ
とにより開始し、反応に伴い遊離する5‐チオ‐2‐ニ
トロフェノールの412nmの吸光度の増加で測定し
た。その結果を図2に示す。
【0050】図2において、(1)はタンパク質として
本発明の改変ジヒドロ葉酸還元酵素〔2個のシステイン
残基(85番目と165番目)を有する〕を用いた場
合、(2)はタンパク質として野生型ジヒドロ葉酸還元
酵素〔2個のシステイン残基(85番目と152番目)
を有する〕を用いた場合、及び(3)はジヒドロ葉酸還
元酵素変異体〔DHFR(C152E)‐IQI、特開
昭63−267276号公報、1個のシステイン残基
(85番目)を有する〕を用いた場合を示す。
本発明の改変ジヒドロ葉酸還元酵素〔2個のシステイン
残基(85番目と165番目)を有する〕を用いた場
合、(2)はタンパク質として野生型ジヒドロ葉酸還元
酵素〔2個のシステイン残基(85番目と152番目)
を有する〕を用いた場合、及び(3)はジヒドロ葉酸還
元酵素変異体〔DHFR(C152E)‐IQI、特開
昭63−267276号公報、1個のシステイン残基
(85番目)を有する〕を用いた場合を示す。
【0051】この図2から、本発明におけるジヒドロ葉
酸還元酵素の反応性が著しく高いこと〔曲線(1)〕、
85番目のシステイン残基はこの条件では全く反応しな
いこと〔曲線(3)〕、野生型ジヒドロ葉酸還元酵素中
の152番目のシステインの反応性が改変酵素タンパク
質中のカルボキシ末端のシステインの反応性に比べて数
分の1以下であること〔曲線(2)〕が容易に分かる。
このように、カルボキシ末端がシステイン残基である数
個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を導入したこと
により、反応性の高いメルカプト基が得られた。
酸還元酵素の反応性が著しく高いこと〔曲線(1)〕、
85番目のシステイン残基はこの条件では全く反応しな
いこと〔曲線(3)〕、野生型ジヒドロ葉酸還元酵素中
の152番目のシステインの反応性が改変酵素タンパク
質中のカルボキシ末端のシステインの反応性に比べて数
分の1以下であること〔曲線(2)〕が容易に分かる。
このように、カルボキシ末端がシステイン残基である数
個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を導入したこと
により、反応性の高いメルカプト基が得られた。
【0052】実施例4 改変ジヒドロ葉酸還元酵素のチ
オプロピルセファローズ6Bへの固定化 固定化担体として、ファルマシア社より市販されている
チオプロピルセファローズ6Bを用いた。乾燥重量が2
8mg、52mg、108mgのそれぞれのゲルに、
0.35mg/mlの改変ジヒドロ葉酸還元酵素2ml
(2.5mMのEDTAを含む10mMリン酸カリウム
緩衝液、pH8.0、の溶液)を加え、室温で2時間放
置し、上清中の酵素活性を測定し、その減少量から固定
化された改変ジヒドロ葉酸還元酵素量を求めたところ、
チオプロピルセファローズ6Bゲル1g当り酵素タンパ
ク質約0.3mgが結合することが判明した。次に、チ
オプロピルセファローズ6B10gに改変ジヒドロ葉酸
還元酵素100mlを加え、室温で一晩反応させ、その
後ガラスフィルターを用いてゲルを分離後、2.5mM
のEDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH
7.0)で洗浄し、次の実験に用いた。
オプロピルセファローズ6Bへの固定化 固定化担体として、ファルマシア社より市販されている
チオプロピルセファローズ6Bを用いた。乾燥重量が2
8mg、52mg、108mgのそれぞれのゲルに、
0.35mg/mlの改変ジヒドロ葉酸還元酵素2ml
(2.5mMのEDTAを含む10mMリン酸カリウム
緩衝液、pH8.0、の溶液)を加え、室温で2時間放
置し、上清中の酵素活性を測定し、その減少量から固定
化された改変ジヒドロ葉酸還元酵素量を求めたところ、
チオプロピルセファローズ6Bゲル1g当り酵素タンパ
ク質約0.3mgが結合することが判明した。次に、チ
オプロピルセファローズ6B10gに改変ジヒドロ葉酸
還元酵素100mlを加え、室温で一晩反応させ、その
後ガラスフィルターを用いてゲルを分離後、2.5mM
のEDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH
7.0)で洗浄し、次の実験に用いた。
【0053】実施例5 固定化された改変ジヒドロ葉酸
還元酵素の酵素活性 実施例4で得られた固定化ゲルをガラスカラム(直径約
1.5cm)に種々の量を詰め、これにペリスタポンプ
を用いて種々の流速で完全に脱気した活性測定液〔0.
05mMのジヒドロ葉酸、0.06mMのNADPH、
1mMのEDTA、50mMのリン酸緩衝液(pH7.
0)〕を流し、流出液の340nmの吸光度を測定し、
カラム通過後の吸光度の減少量を求めた。この値を利用
して酵素反応の程度(転換率%)を算出した。なお、酵
素反応は、4℃で行った。
還元酵素の酵素活性 実施例4で得られた固定化ゲルをガラスカラム(直径約
1.5cm)に種々の量を詰め、これにペリスタポンプ
を用いて種々の流速で完全に脱気した活性測定液〔0.
05mMのジヒドロ葉酸、0.06mMのNADPH、
1mMのEDTA、50mMのリン酸緩衝液(pH7.
0)〕を流し、流出液の340nmの吸光度を測定し、
カラム通過後の吸光度の減少量を求めた。この値を利用
して酵素反応の程度(転換率%)を算出した。なお、酵
素反応は、4℃で行った。
【0054】図3は、流速10ml/minという非常
に速い流速を用いて固定化酵素ゲルの量を変化させたと
きの、反応効率を示す。乾燥ゲル換算約0.5g以上で
はほとんど100%の効率で酵素反応が進み、非常に少
量のゲルでバイオリアクターが構成できることを示して
いる。また、それ以下では、ゲルの量に依存して反応効
率が変化し、酵素量が律速であることを示している。
に速い流速を用いて固定化酵素ゲルの量を変化させたと
きの、反応効率を示す。乾燥ゲル換算約0.5g以上で
はほとんど100%の効率で酵素反応が進み、非常に少
量のゲルでバイオリアクターが構成できることを示して
いる。また、それ以下では、ゲルの量に依存して反応効
率が変化し、酵素量が律速であることを示している。
【0055】図4は、乾燥ゲル換算80mgという非常
に少量の固定化酵素ゲルを用いて流速を変化させたとき
の反応効率を示す。流速の増大に伴って反応効率が低下
した。
に少量の固定化酵素ゲルを用いて流速を変化させたとき
の反応効率を示す。流速の増大に伴って反応効率が低下
した。
【0056】以上の結果から、極少量の固定化酵素ゲル
を用い、10ml/minという高流速で、かつ4℃と
いう低温でも、非常に高い効率で固定化された改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素が働くことが分る。
を用い、10ml/minという高流速で、かつ4℃と
いう低温でも、非常に高い効率で固定化された改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素が働くことが分る。
【0057】
【発明の効果】本発明の共有結合型担体結合法による
と、酵素タンパク質の失活を抑え、かつ固定化部位を容
易に制御しうるので、均質で活性の高い固定化酵素を効
率よく製造することができる。
と、酵素タンパク質の失活を抑え、かつ固定化部位を容
易に制御しうるので、均質で活性の高い固定化酵素を効
率よく製造することができる。
【0058】 本発明方法で得られた固定化
酵素は、各種有用物質の生産に利用されるバイオリアク
ターの素子として好適に用いられる。
酵素は、各種有用物質の生産に利用されるバイオリアク
ターの素子として好適に用いられる。
【図1】 プラスミドpCYS1の制限酵素
切断地図。
切断地図。
【図2】 各種酵素におけるシステイン残基
のメルカプト基の反応性を示すグラフ。
のメルカプト基の反応性を示すグラフ。
【図3】 固定化された改変ジヒドロ葉酸還
元酵素によるジヒドロ葉酸還元反応における反応効率の
ゲル依存性を示すグラフ。
元酵素によるジヒドロ葉酸還元反応における反応効率の
ゲル依存性を示すグラフ。
【図4】 固定化された改変ジヒドロ葉酸還
元酵素によるジヒドロ葉酸還元反応における反応効率の
流速依存性を示すグラフ。
元酵素によるジヒドロ葉酸還元反応における反応効率の
流速依存性を示すグラフ。
Claims (1)
- 【請求項1】 酵素タンパク質のカルボキシ末端側に、
システイン残基をカルボキシ末端とする数個のアミノ酸
残基から成るアミノ酸配列を導入して改変酵素タンパク
質を調製したのち、これをそのカルボキシ末端のシステ
イン残基におけるメルカプト基を介して固定化担体に結
合させることを特徴とする固定化酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3329540A JP2517861B2 (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 固定化酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3329540A JP2517861B2 (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 固定化酵素の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0833485A JPH0833485A (ja) | 1996-02-06 |
JP2517861B2 true JP2517861B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=18222506
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3329540A Expired - Lifetime JP2517861B2 (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 固定化酵素の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2517861B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018207932A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 国立大学法人広島大学 | 癌の診断デバイス |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3740529B2 (ja) * | 2002-05-23 | 2006-02-01 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 配向制御したタンパク質の固定化方法およびそれを利用したタンパク質の整列固定化方法 |
CN110607296B (zh) * | 2018-06-15 | 2023-04-07 | 上海雅心生物技术有限公司 | 重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化 |
CN116676295B (zh) * | 2023-05-30 | 2024-02-27 | 江南大学 | 一种耐有机试剂的β-琼胶酶突变体及固定化酶的应用 |
-
1991
- 1991-11-18 JP JP3329540A patent/JP2517861B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018207932A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 国立大学法人広島大学 | 癌の診断デバイス |
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0833485A (ja) | 1996-02-06 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |