JP2515394B2 - Liposomal formulation containing γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 １） 技術分野 本発明は、下記一般式（Ｉ）で示されるγ−Ｌ−グル
タミル−Ｌ−システイン誘導体またはその酸化型２量体
を有効成分として含有するリポソーム製剤及びその組織
グルタチオンレベルの向上剤，白内障治療剤，肝疾患治
療剤への応用に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION 1) Technical Field The present invention relates to a liposome preparation containing a γ-L-glutamyl-L-cysteine derivative represented by the following general formula (I) or an oxidized dimer thereof as an active ingredient: The present invention relates to application to a tissue glutathione level improving agent, a cataract treatment agent, and a liver disease treatment agent.

２） 背景技術 リポソームは、内部に水層を閉じ込めた二層膜よりな
る閉鎖小胞である。リポソームを構造面から大別する
と、単一の膜状二層体を有する大小２種類の単ラメラベ
シクル，および，水層により互いに次の二層体から離さ
れた複数の同心状二層体により特徴づけられる玉ねぎ状
構造を有する多重ラメラベシクルに分けられる。リポソ
ームは、バルク水相から隔離された疎水相と疏水性二相
膜を持つことから、水溶性および疎水性の両物質を保持
させることが可能であり、薬物の担体として注目されて
いる。リポソームを薬物担体として使うと、投与部位へ
のリポソームの滞留，体内分布の制御、薬物の分離から
の保護，安定化、吸収性、移行性の改善、ターゲッテイ
ングのデザインも可能、などのメリットのため、薬物の
治療効果を高めたり毒性を低下させたりすることが期待
できる。 2) Background Art Liposomes are closed vesicles composed of a bilayer membrane in which an aqueous layer is enclosed. When liposomes are roughly classified from the structural aspect, they are composed of two large and small unilamellar vesicles having a single membranous bilayer and a plurality of concentric bilayers separated from each other by an aqueous layer. It is divided into multilamellar vesicles with an onion-like structure that is characterized. Since the liposome has a hydrophobic phase separated from the bulk aqueous phase and a hydrophobic biphasic membrane, it can hold both a water-soluble substance and a hydrophobic substance, and is attracting attention as a drug carrier. When liposomes are used as drug carriers, they have advantages such as retention of liposomes at the administration site, control of biodistribution, protection from separation of drugs, stabilization, improvement of absorption and migration, and design of targeting. Therefore, it can be expected to enhance the therapeutic effect of the drug or reduce the toxicity.

前記一般式（Ｉ）で示されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ
−システイン誘導体またはその酸化型２量体のうち、Ｒ
がエチルのものは、特公昭63−61302号の記載によて公
知であり、ＲがC₃〜C₁₀の直鎖状，分岐状もしくは環状
炭化水素基、または芳香族が置換したC₁〜C₅の直鎖もし
くは分岐状炭化水素基のものは、特開昭62−173807号に
記載されており、またＲがメチルのものは、Floheらの
Ｚ、Klin、Chem.n.Klin.Biochem.,8巻,149−155頁（197
0）の記載によって公知であり特願昭62−180030号にも
記載されている。Γ-L-glutamyl-L represented by the general formula (I)
R among cysteine derivatives or oxidized dimers thereof
Is known as described in JP-B-63-61302, and R is a C _{3 to} C ₁₀ linear, branched or cyclic hydrocarbon group, or an aromatic-substituted C ₁ to The C ₅ linear or branched hydrocarbon group is described in JP-A-62-173807, and the R is methyl is described by Flohe et al. In Z, Klin, Chem.n.Klin.Biochem. ., Vol. 8, pp. 149-155 (197
It is publicly known by the description of (0) and is also described in Japanese Patent Application No. 62-180030.

Floheらの文献は、Ｒがメチルである一般式（Ｉ）で
示されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン誘導体
が、グルタチオンパーオキシダーゼの基質となり、グル
タチオンに比べて20〜30％の効率で利用されることを示
したものであるが、他の有用性を示唆する記述は一切含
まれていない。これに対し、先に挙げた当該公報または
２つの出願特許には、前記一般式（Ｉ）で示されるγ−
Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル誘導体または
その酸化型２量体が、グルタチオン生合成中間体のエス
テル誘導体であり、良好な膜透過性を有し、組織に効率
良く取り込まれた後、脱エステル化を受けて速やかにグ
ルタチオンへと生合成されることにより、組織グルタチ
オンレベルの向上作用を有していること、肝疾患治療
剤，白内障治療剤および腎疾患治療剤として有用である
ことなどが記載されている。According to Flohe et al., A γ-L-glutamyl-L-cysteine derivative represented by the general formula (I) in which R is methyl serves as a substrate for glutathione peroxidase and is used with an efficiency of 20 to 30% as compared with glutathione. However, it does not contain any description that suggests other usefulness. On the other hand, in the above-mentioned publication or the two patent applications, the γ-type represented by the general formula (I) is used.
The L-glutamyl-L-cysteine ester derivative or its oxidized dimer is an ester derivative of a glutathione biosynthesis intermediate, has good membrane permeability, is efficiently taken up by tissues, and is then deesterified. It is described that it has a tissue glutathione level-improving effect by being rapidly biosynthesized into glutathione in response to it, and is useful as a liver disease therapeutic agent, a cataract therapeutic agent, and a renal disease therapeutic agent. ing.

白内障は、透明なレンズとして高度に分化した組織で
ある水晶体が白濁し、視力低下する疾患である。白濁
は、レンズを構成するクリスタリンというSH基を多く持
った水溶性タンパク質が高分子凝集を起こし、屈折率の
不連続を生ずることによる。このクリスタリンの凝集
は、２つの要因すなわち、クリスタリン自体の修飾に
よる変性、水晶体膜機能が損傷されることによって生
じるクリスタリン周囲のイオンバランスの乱れ、の相乗
効果によって進行すると考えられている。その２つの要
因が発生する原因の重要なものとして、過酸化水素，ス
ーパーオキサイドによる酸化，光酸化，などの酸化的ス
トレスや化学修飾を引き起こす異常代謝物の蓄積などが
挙げられる。水晶体は肝臓と並んで、抗酸化や解毒等に
より組織保護に重要な役割を演じているグルタチオンを
最む多く含む組織として知られている。そして、水晶体
のグルタチオンは先述の種々の酸化的ストレスや毒物の
消去に主役を演じ、透明性維持に役立っているものと考
えられる。白内障眼水晶体において還元型グルタチオン
が減少することは、ヒトおよび各種実験動物において古
くから認められている。ヒトの老人性および糖尿病性白
内障においても還元型グルタチオンの動態は、酸化還元
機能を司る代表格として重要視されている。Cataract is a disease in which the lens, which is a highly differentiated tissue as a transparent lens, becomes cloudy and the visual acuity deteriorates. The cloudiness is due to the fact that the water-soluble protein, which has many SH groups called crystallin, which composes the lens, causes macromolecular aggregation, resulting in discontinuity in the refractive index. It is considered that the aggregation of crystallin proceeds by a synergistic effect of two factors, namely, denaturation by modification of crystallin itself and disorder of ion balance around crystallin caused by damage to lens membrane function. An important cause of these two factors is the accumulation of abnormal metabolites that cause oxidative stress such as hydrogen peroxide, superoxide oxidation and photooxidation, and chemical modification. The lens, along with the liver, is known as a tissue that contains the most abundant glutathione, which plays an important role in tissue protection by antioxidation and detoxification. It is considered that glutathione in the crystalline lens plays a leading role in eliminating various oxidative stresses and poisons described above, and helps maintain transparency. Reduction of reduced glutathione in the cataract lens has long been recognized in humans and various experimental animals. Even in human senile and diabetic cataracts, the kinetics of reduced glutathione is regarded as a representative example of the redox function.

肝臓は、（１）糖質，タンパク質，脂質，核酸，ビタ
ミン，ホルモンなどの代謝，（２）解毒、（３）血液凝
固因子の生成，血縁循環の調節、（４）胆汁の産生、な
どの機能をもち、生体の化学工場として物質代謝とその
調節の大部分を担っている。グルタチオンは肝臓中に５
〜7mMと高濃度に存在し、（１）グルタチオンパーオキ
シダーゼの触媒作用により過酸化水素やスーパーオキサ
イドを還元して不活性化させたり、（２）グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼの触媒作用により毒物と反応
し、グルタチオン抱合体として細胞外に排出することに
より、解毒に重要な役割を演じている。肝疾患において
還元型グルタチオンが減少することは、プロムベンゼン
やアセトアミノフェン等の薬物性肝障害で認められてお
り、また最近ではその他のヒト肝炎においても血中グル
タチオンの低下が見られるとの報告があり明らかにされ
つつある。The liver has (1) metabolism of carbohydrates, proteins, lipids, nucleic acids, vitamins, hormones, etc., (2) detoxification, (3) production of blood coagulation factors, regulation of blood circulation, (4) production of bile, etc. It has a function and plays a major role in substance metabolism and its regulation as a biochemical factory. Glutathione is 5 in the liver
Present at a high concentration of ~ 7mM, (1) hydrogen peroxide and superoxide are reduced and inactivated by the catalytic action of glutathione peroxidase, and (2) they react with poisons by the catalytic action of glutathione-S-transferase. However, it plays an important role in detoxification by excreting extracellularly as a glutathione conjugate. Decreased reduced glutathione in liver diseases has been observed in drug-induced liver disorders such as prombenzene and acetaminophen, and recently, a decrease in blood glutathione has also been observed in other human hepatitis. Is being revealed.

グルタチオンの前述の生理的機能は、白内障の親展阻
止，治療や肝機能改善に留まらず、中毒，妊娠中毒にお
ける中毒物質の中和，解毒，抗癌剤副作用の軽減，放射
線障害保護，日焼け防止，耐熱性増大，各種アレルギー
疾患，皮膚疾患の治療，鎮咳去痰，それに最近では心筋
梗塞や脳梗塞などの虚血再循環時に発生するスープーオ
キサイドによる組織障害の防止，などに重要と考えられ
ている。The above-mentioned physiological functions of glutathione are not limited to the protection of cataract confidentiality, treatment and improvement of liver function, but also neutralization of poisoning substances in poisoning and pregnancy poisoning, detoxification, reduction of side effects of anticancer agents, radiation damage protection, sun protection, heat resistance. It is considered to be important for the increase, treatment of various allergic diseases, skin diseases, antitussive and expectorant, and recently prevention of tissue damage caused by soup oxide which occurs during ischemic recirculation such as myocardial infarction and cerebral infarction.

生体各組織のグルタチオンは老化によって低下するこ
とが知られており、このことが白内障，高血圧，動脈硬
化，糖尿病，胃潰瘍，癌，腎臓病，呼吸器疾患，脳およ
び心疾患等各種成人病の一因となっていることも考えら
れる。It is known that glutathione in each tissue of the living body is lowered by aging, which is one of various adult diseases such as cataract, hypertension, arteriosclerosis, diabetes, gastric ulcer, cancer, kidney disease, respiratory disease, brain and heart disease. It is also possible that the cause.

以前よりいろいろな方法でこの還元型グルタチオンを
投与する試みがなされているが、その投与効果について
は未だ明確とはなっていない。また、外因性のグルタチ
オは膜透過性が低いため組織移行性が極めて悪く血中半
減期も数分と短いことが知られている。そのため現在の
ところ還元型グルタチオンはそのままでは水晶体内ある
いは肝臓をはじめとする各種組織内へ直接取り込まれる
のは難しいとする考えが有力である。Attempts have been made to administer this reduced glutathione in various ways from before, but the effect of administration has not yet been clarified. Further, it is known that exogenous glutathione has a very low permeability to tissues because of its low membrane permeability, and has a short blood half-life of only a few minutes. Therefore, it is currently thought that it is difficult to directly incorporate reduced glutathione into the lens or into various tissues such as the liver as it is.

しかるに、本発明で用いる前記一般式（Ｉ）で示され
るγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル誘導体
またはその酸化型２量体は、既述の如く、良好な膜透過
性を有し、組織グルタチオンレベルの向上作用を有して
いる。However, the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative represented by the general formula (I) or the oxidized dimer thereof used in the present invention has good membrane permeability as described above, and It has the effect of improving glutathione levels.

前記一般式（Ｉ）で示されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ
−システインエステル誘導体またはその酸化型２量体の
白内障治療剤としての有効性は、幼若マウスにグルタチ
オン生合成第一段階の阻害剤BSOを皮下投与しグルタチ
オンを低下させたとき発症してくる白内障が、これら誘
導体の皮下投与でグルタチオン低下が緩和されることに
より有意に抑制されることから明らかにされている。し
かし、これら誘導体を点眼して白内障治療剤としての有
効性を調べた例は、先に引用した３件の特許のいずれに
も記載されていない。Γ-L-glutamyl-L represented by the general formula (I)
-The effectiveness of the cysteine ester derivative or its oxidized dimer as a therapeutic agent for cataracts is the cataract that develops when glutathione is lowered by subcutaneous administration of the first stage inhibitor of glutathione biosynthesis, BSO, to young mice. However, subcutaneous administration of these derivatives alleviates the decrease in glutathione and is significantly suppressed. However, an example of examining the effectiveness of these derivatives as a therapeutic agent for cataract by instilling them is not described in any of the three patents cited above.

一般に、点眼された薬物の眼内への移行はきわめて少
ないことが知られている。これは、次の２つの理由によ
るものと考えられている。すなわち、点眼された薬物
がきわめて速く結膜襄から排出されてしまう。角膜に
は特に水溶性薬剤に対するバリアー機能がある。そこ
で、薬物の排出による損失を防ぎ眼と薬物の接触時間を
増加させることにより、角膜からの透過率を増大させる
ために種々の製剤研究がなされている。そのためには、
点眼液に粘性を与えると共に、角膜表面に対する吸着
性，親和性，あるいは表面活性の変化を与える作用など
を合せ持たせることが重要と考えられている。In general, it is known that the transfer of an instilled drug into the eye is extremely small. This is considered to be due to the following two reasons. That is, the instilled drug is very rapidly discharged from the conjunctival fold. The cornea particularly has a barrier function against water-soluble drugs. Therefore, various formulation studies have been conducted in order to increase the permeability from the cornea by preventing the loss due to excretion of the drug and increasing the contact time between the eye and the drug. for that purpose,
It is considered important to give viscosity to the ophthalmic solution as well as to exert an action of changing the adsorptivity, affinity, or surface activity to the corneal surface.

Ｒがエチルである前記一般式（Ｉ）で示されるδ−Ｌ
−グルタミル−Ｌ−システインエステル誘導体またはそ
の酸化型２量体の肝疾患治療剤としての有効性は、培養
肝細胞実験において見られた当該化合物の細胞内グルタ
チオンレベル向上作用に基づく四塩化炭素障害防止作用
および幼若マウスに当該化合物を皮下投与した時に見ら
れた良好な肝組織グルタチオンレベル向上作用などによ
り示唆されている。Δ-L represented by the general formula (I), wherein R is ethyl.
-Glutamyl-L-cysteine ester derivative or its oxidized dimer is effective as a therapeutic agent for liver diseases. The prevention of carbon tetrachloride injury based on the intracellular glutathione level-enhancing effect of the compound found in the experiment of cultured hepatocytes. It is suggested by the action and the good action of improving the glutathione level in the liver tissue which was observed when the compound was subcutaneously administered to young mice.

しかし、上記ｒ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエ
チルエステルまたはその酸化型２量体の肝組織到達性お
よび組織グルタチオンレベル向上作用の持続性について
は、更に改善の余地があるものと思われる。However, it seems that there is room for further improvement in the liver tissue accessibility and the persistence of the tissue glutathione level improving action of the r-L-glutamyl-L-cysteine ethyl ester or its oxidized dimer.

３） 発明の開示 本発明者らは、組織グルタチオン向上作用を有する前
記一般式（Ｉ）で示されるｒ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−シ
ステインエステル誘導体またはその酸化型２量体
の、（）点眼用白内障治療剤としての利用について、ラ
ットの実験的糖尿病性白内障モデルを用いて種々検討を
加えた結果、リポソームにこれら誘導体を組み込んだ場
合に最も強い発症抑制効果を認めること、同時にその場
合に薬効に比例した最も強くかつ最も持続的な水晶体グ
ルタチオン低下抑制効果すなわち組織グルタチオンレベ
ルの向上作用を認めること等を見出すと共に、（２）肝
疾患治療剤としての利用についても、培養肝細胞を使っ
た免疫的肝障害モデルを用いて種々検討を加えた結果、
前述と同様のリポソーム製剤が優れた障害抑制効果を示
すことを見出し、本発明に到達した。3) DISCLOSURE OF THE INVENTION The inventors of the present invention have () eye drops of an r-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative represented by the general formula (I) or an oxidized dimer thereof having an action of improving tissue glutathione. As a result of various studies on the use as a therapeutic agent for cataract using an experimental diabetic cataract model in rats, the strongest onset suppressing effect was observed when these derivatives were incorporated into liposomes, and at the same time, the drug efficacy was improved. It was found that there is a proportionally strongest and most persistent inhibitory effect on lens glutathione lowering, that is, an effect of improving tissue glutathione level. (2) Regarding the use as a therapeutic agent for liver diseases, immunologically using cultured hepatocytes As a result of various studies using the liver injury model,
The present inventors have found that the same liposome preparation as that described above has an excellent inhibitory effect on the disorder, and arrived at the present invention.

すなわち、本発明は前記一般式（Ｉ）で示されるγ−
Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル誘導体または
その酸化型２量体を有効成分として含有するリポソーム
製剤およびその組織グルタチオンレベルの向上剤，白内
障治療剤，肝疾患治療剤への応用に関する。That is, the present invention provides γ-represented by the general formula (I).
The present invention relates to a liposome preparation containing an L-glutamyl-L-cysteine ester derivative or an oxidized dimer thereof as an active ingredient and its application to a tissue glutathione level improving agent, a cataract therapeutic agent, and a liver disease therapeutic agent.

前記一般式（Ｉ）中、ＲはC₁〜C₂の炭化水素基、また
はC₃〜C₁₀の直鎖状，分岐状もしくは環状炭化水素基、
または芳香族が置換したC₁〜C₅の直鎖もしくは分岐状炭
化水素基を表わす。In the general formula (I), R is a C _{1 to} C ₂ hydrocarbon group, or a C _{3 to} C ₁₀ linear, branched or cyclic hydrocarbon group,
It also represents an aromatic-substituted C ₁ -C ₅ straight-chain or branched hydrocarbon group.

また、酸化型２量体とは、前記一般式（Ｉ）の化合物
が、２分子間の脱水素反応によりジスルフィド結合（−
Ｓ−Ｓ−）を形成し２量体となったものである。In addition, the oxidized dimer means that the compound of the general formula (I) has a disulfide bond (-
S-S-) to form a dimer.

前記一般式（Ｉ）で示されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ
−システインエステル誘導体またはその酸化型２量体
は、例えば、特公昭63−61302号，特願昭62−173807
号，特願昭62−180030号に記載の方法によって製造する
ことができる。Γ-L-glutamyl-L represented by the general formula (I)
-Cysteine ester derivatives or oxidized dimers thereof are described, for example, in JP-B-63-61302 and JP-B-62-173807.
It can be produced by the method described in Japanese Patent Application No. 62-180030.

前記一般式（Ｉ）において、Ｒは具体的には、メチル
基，エチル基,n−ヘキシル基,n−オクチル基，イソプロ
ピル基,2−メチル−２−プロペニル基，シクロヘキシル
基，ベンジル基などが挙げられる。前記一般式（Ｉ）で
示される化合物は、これらＲの具体的な基が結合した全
てのγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル誘導
体を包含するが、その代表的化合物としては、γ−Ｌ−
グルタミル−Ｌ−システインエチルエステルなどが挙げ
られる。In the general formula (I), R specifically includes a methyl group, an ethyl group, an n-hexyl group, an n-octyl group, an isopropyl group, a 2-methyl-2-propenyl group, a cyclohexyl group, a benzyl group, and the like. Can be mentioned. The compound represented by the general formula (I) includes all γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivatives to which specific groups of R are bonded, and a typical compound thereof is γ-L. −
Glutamyl-L-cysteine ethyl ester and the like can be mentioned.

本発明のリポソームの構造は、単ラメラ，多重ラメラ
であるか、またはそれらの混合ラメラであるか、または
定義されないラメラであって良い。The structure of the liposomes of the present invention may be unilamellar, multilamellar, or mixed lamellae, or undefined lamellae.

リポソームの膜構成基剤としては、ホスファチジルコ
リン，ホスファチジルエタノールアミン，ホスファチジ
ルセリン，ホスファチジルイノシトール，リゾホスファ
チジルコリン，スフィンゴミエリン，卵黄レシチン，大
豆レシチン等の天然もしくは合成のリン脂質または水素
添加リン脂質，グリセロ糖脂質，セチルガラクトサイド
の如きアルキルグリコサイド，ジアルキル型合成界面活
性剤などの１種または２種以上の混合物が挙げられる
が、代表的なものとしては、ジパルミトイルホスファチ
ジルコリンなどが挙げられる。Examples of the membrane constituent base of liposomes include natural or synthetic phospholipids or hydrogenated phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, lysophosphatidylcholine, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, glyceroglycolipids, One or a mixture of two or more of alkyl glycosides such as cetyl galactoside, dialkyl type synthetic surfactants and the like can be mentioned, but representative examples include dipalmitoylphosphatidylcholine and the like.

リポソームの膜構成成分には、必要に応じて、コレス
テロールやコレスタン等のステロール類を膜安定化剤と
して、ステアリルアミン，ジセチルホスフェート，ホス
ファチジン酸，ガングリオシド等を荷電物質として、ビ
タミンＥなどのトコフェロール等を抗酸化剤として加え
ることができる。As necessary, the membrane components of the liposome include sterols such as cholesterol and cholestane as membrane stabilizers, stearylamine, dicetyl phosphate, phosphatidic acid, gangliosides as charged substances, and tocopherols such as vitamin E. Can be added as an antioxidant.

本発明のリポソーム調製法には特に制限はなく、これ
まで知られている種々のリポソーム調製法が利用でき
る。The liposome preparation method of the present invention is not particularly limited, and various known liposome preparation methods can be used.

例えば、膜形成基剤に、必要により膜安定化剤，荷電
物質，その他の親脂質性添加物を加え、さらに脂質２分
子膜に保持される親脂性化合物である場合には該薬物を
も加え、これらをクロロホルム，エタノール等の有機溶
媒に溶解し、溶媒を減圧留去して薄膜を形成させ、これ
に親水性薬物である場合には該薬物を加えた水溶液、好
ましくは防腐剤，安定剤，浸透圧調節剤等を含む緩衝液
を加え、得られた混液を振盪、好ましくは超音波振盪
し、懸濁液となし、次いで溶媒を除去して薬物封入リポ
ソームを得る。For example, if necessary, a membrane stabilizer, a charged substance, and other lipophilic additives are added to the membrane-forming base, and in the case of a lipophilic compound retained on a lipid bilayer membrane, the drug is also added. , These are dissolved in an organic solvent such as chloroform or ethanol, the solvent is distilled off under reduced pressure to form a thin film, and in the case of a hydrophilic drug, an aqueous solution containing the drug, preferably a preservative, a stabilizer , A buffer solution containing an osmotic pressure adjusting agent and the like is added, and the obtained mixed solution is shaken, preferably ultrasonically shaken to form a suspension, and then the solvent is removed to obtain a drug-encapsulated liposome.

本発明のリポソーム製剤の場合、懸濁液調製後、溶媒
を必ずしも除かなくてもよく有効成分の薬剤が遊離型と
して共存していてもよい。In the case of the liposome preparation of the present invention, the solvent may not necessarily be removed after the suspension is prepared, and the active ingredient drug may coexist as a free form.

このリポソーム製剤は、そのまま使用することもでき
るが、生理食塩水等で洗浄後、必要により凍結乾燥し、
種々の製剤形態、例えば懸濁液剤，錠剤，カプセル剤，
ペレット，顆粒剤，粉末剤等に調製することもできる。This liposome preparation can be used as it is, but after washing with physiological saline or the like, lyophilization if necessary,
Various formulations such as suspensions, tablets, capsules,
It can also be prepared into pellets, granules, powders and the like.

リポソームに封入可能なγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−シ
ステインエステル誘導体（Ｉ）またはその酸化型２量体
の濃度は、リポソームの形態および誘導体の種類によっ
て異なるが、0.001〜55mg/mlであり、好ましくは0.1〜3
5mg/mlである。The concentration of the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative (I) or its oxidized dimer that can be encapsulated in the liposome is 0.001 to 55 mg / ml, although it varies depending on the form of the liposome and the kind of the derivative, and is preferably Is 0.1 to 3
It is 5 mg / ml.

本発明のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステ
ル誘導体（Ｉ）またはその酸化型２量体のリポソーム製
剤を、組織グルタチオンレベルの向上剤，白内障治療
剤，肝疾患治療剤として用いる場合、患者の症状の程度
により異なるが、通常成人１日あたり0.2mg〜20g程度を
用いる。投与法は経口ないし非経口的に、１日１ないし
８回に分割投与することができる。When the liposome preparation of the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative (I) or its oxidized dimer of the present invention is used as a tissue glutathione level improving agent, a cataract treating agent, a liver disease treating agent, Although it depends on the degree of symptoms, an adult usually uses about 0.2 mg to 20 g per day. The administration method can be orally or parenterally and divided into 1 to 8 times a day.

４） 実施例 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。4) Examples Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples.

代表として、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエ
チルエステル（γ−GCE）保持したジパルミトイルホス
ファチジルコリン（DPPC）のリポソーム製剤について記
したが、本発明はこれに限定されるものではない。As a representative, a liposome preparation of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) retaining γ-L-glutamyl-L-cysteine ethyl ester (γ-GCE) was described, but the present invention is not limited thereto.

実施例１ リポソームに組み込まれたγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−シ
ステインエステル誘導体の調製 ここでは代表として、ジパルミトイルホスファチジル
コリン（DPPC）のリポソーム体に、γ−Ｌ−グルタミル
−Ｌ−システインエチルエステル（γ−GCE）を組み込
む場合について、２つの具体例を示す。本発明のリポソ
ーム調製法は以下の具体例で制限されるものではない。Example 1 Preparation of γ-L-Glutamyl-L-Cysteine Ester Derivative Incorporated in Liposomes Here, as a representative example, γ-L-glutamyl-L-cysteine ethyl ester (γ -GCE) is incorporated, two specific examples are shown. The liposome preparation method of the present invention is not limited to the following specific examples.

例１−１） ナシ型フラスコにDPPCを入れ少量のクロロホルムで溶
かした後、、ロータリーエバポレーターを用いてクロロ
ホルムを減圧留去して壁面にDPPCの薄膜を形成させる。
続いてデシケーター中で２時間減圧乾燥し、完全にクロ
ロホルムを除く。これに、DPPCと等重量のγ−GCEを加
え、最終目的濃度（たとえば、DPPC,γ−GCE各２〜35mg
/ml）に見合った緩衝液を入れてγ−GCEを良く溶かした
後、プローブ型超音波処理装置を用い、窒素気流下，氷
浴中，約20分超音波処理して、γ−GCE含有DPPCリポソ
ームを得る。Example 1-1) DPPC was placed in a pear-shaped flask and dissolved in a small amount of chloroform, and then chloroform was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to form a DPPC thin film on the wall surface.
Then, it is dried under reduced pressure in a desiccator for 2 hours to completely remove chloroform. To this, γ-GCE of the same weight as DPPC was added, and the final target concentration (for example, DPPC, γ-GCE 2 to 35 mg each)
γ-GCE is thoroughly dissolved in a suitable buffer solution, and then sonicated for about 20 minutes in an ice bath under a nitrogen stream using a probe-type sonicator to contain γ-GCE. Obtain DPPC liposomes.

例１−２） DPPC,γ−GCEを等重量容器に取り、最終目的濃度（実
施例１−１）参照）に見合った緩衝液を加えた後、窒素
置換して密閉し、浴槽型超音波処理装置にセットし、浴
槽中を回転させながら約15分間超音波処理して、γ−GC
E含有DPPCリポソームを得る。Example 1-2) DPPC and γ-GCE were placed in an equal weight container, a buffer solution corresponding to the final target concentration (see Example 1-1) was added, and then the atmosphere was replaced with nitrogen and sealed, and bath-type ultrasonic waves were used. Set it in the processing unit, sonicate for about 15 minutes while rotating in the bath, and
Obtain E-containing DPPC liposomes.

実施例２ ラットの実験的糖尿病性白内障に対するγ−GCE含有DPP
Cリポソームの発症抑制効果 ［実験の方法］ 図１に実験スケジュールを模式的にあらわした。一夜
絶食した６週齢の雄性Wistar系ラットに、糖尿病を惹起
させるため50mg/Kgのストレプトゾトシン（STZ）を１回
腹腔内投与し、３日後に確認のため尿検査を行ない確か
に糖が検出された個体だけを以後の実験に用いた。γ−
GCE含有DPPCリポソーム点眼液は、実施例１に従って、
γ−GCE,DPPC各2mgがHANKS液1ml中に含まれる組成のも
のを調製した。対照薬として、前述の点眼液からDPPCを
除いたγ−GCEのみからなる点眼液、および、γ−GCEを
除いた空のDPPCリポソーム点眼液についても調べた。実
験群はSTZ投与，点眼投与いずれも行なわない正常対
照群、STZ投与後、薬物を投与しない無処置糖尿病
群、STZ投与後、γ−GCE点眼群、STZ投与後、空のD
PPCリポソーム点眼群、STZ投与後、γ−GCE含有DPPC
リポソーム点眼群とした。点眼は１眼当り１回10μ
を、STZ投与後４日目から61日目まで毎日、１日３回４
時間毎に行なった。白内障の観察はSTZ投与後27日目
（４週目）より毎週１回細隙灯顕微鏡を用いて行ない、
その進行度をカタラクトカメラ（cataract camera）に
て撮影して４群にグレード分けした。すなわち、白内障
進行度０は未発症、１は白濁が初めて出現しその範囲が
限られているもの、３は白濁が進行し全体に及んだも
の、２は１と３の中間の進行度を意味する。観察はSTZ
投与後62日目（９週目）まで行ない、最終点眼日の翌日
または翌々日に屠殺して水晶体中のグルタチオン含量を
DTNBとグルタチオンリダクターゼを用いたリサイクリン
グ法にて測定した。Example 2 γ-GCE-containing DPP for experimental diabetic cataract in rats
Inhibitory effect of C liposome [Experimental method] Fig. 1 schematically shows the experimental schedule. Six-week-old male Wistar rats fasted overnight were given 50 mg / Kg streptozotocin (STZ) once intraperitoneally to induce diabetes mellitus, and a urinalysis was performed 3 days later to confirm that sugar was detected. Only those individuals that were used in the subsequent experiments. γ−
GCE-containing DPPC liposome ophthalmic solution was prepared according to Example 1
A composition having 2 mg each of γ-GCE and DPPC contained in 1 ml of HANKS solution was prepared. As a control drug, the eye drops containing only γ-GCE obtained by removing DPPC from the above-mentioned eye drops and the empty eye drops containing DPPC liposomes free of γ-GCE were also examined. The experimental group was a normal control group that did neither STZ administration nor eye drop administration, after STZ administration, untreated diabetic group without drug administration, after STZ administration, γ-GCE eye drop group, after STZ administration, empty D
PPC liposome eye drop group, γ-GCE-containing DPPC after administration of STZ
It was set as a liposome eye drop group. Instillation is 10μ per eye
Daily from day 4 to day 61 after administration of STZ 4 times 3 times a day
It was done every hour. Observation of cataract was performed once a week using a slit lamp microscope from the 27th day (4th week) after STZ administration,
The progress was taken with a cataract camera and graded into 4 groups. That is, a cataract progression degree of 0 is not developed, 1 is cloudiness that appears for the first time and its range is limited, 3 is that cloudiness has progressed to the entire extent, 2 is an intermediate degree between 1 and 3. means. Observation is STZ
It is carried out until 62 days (9th week) after the administration and sacrificed one day after the last instillation or two days after the last instillation to determine the glutathione content in the lens.
It was measured by the recycling method using DTNB and glutathione reductase.

［結果］ 白内障発症抑制効果 図２に、STZ投与後55日目の各実験群の白内障進行度
を示す。[Results] Cataract onset suppression effect Fig. 2 shows the degree of cataract progression in each experimental group on day 55 after STZ administration.

図中の黒丸１つは１眼に対応する。 One black circle in the figure corresponds to one eye.

白内障の発症は、無処置糖尿病群および空のDPPCリポ
ソーム点眼群では全例に認められたが、γ−GCE点眼群
では67％であり、また、γ−GCE含有DPPCリポソーム点
眼群では45％に認めたのみであり、しかもその程度は軽
度であった。The onset of cataract was observed in all cases in the untreated diabetic group and the empty DPPC liposome eye drop group, but was 67% in the γ-GCE eye drop group, and 45% in the γ-GCE-containing DPPC liposome eye drop group. It was only admitted, and the degree was mild.

すなわち、ラット実験的糖尿病性白内障に対するγ−
GCEの点眼による発症抑制効果は、γ−GCE含有DPPCリポ
ソーム投与群において最も強く認められることがわか
る。この効果は、空のDPPCリポソームには薬効が認めら
れないことから、確実にγ−GCE含有DPPCリポソームに
由来するものであると言える。That is, γ-for rat experimental diabetic cataract
It can be seen that the effect of GCE to suppress the onset of eye drops is most strongly observed in the γ-GCE-containing DPPC liposome-administered group. It can be said that this effect is definitely derived from the γ-GCE-containing DPPC liposome, since no drug effect was observed in the empty DPPC liposome.

図３に、無処置糖尿病群とγ−GCE含有DPPCリポソー
ム点眼群の白内障発症の推移を比較して示した。FIG. 3 shows changes in cataract onset between the untreated diabetic group and the γ-GCE-containing DPPC liposome eye drop group.

図中の黒丸１つは１眼に対応する。また、横線は、各
時点での白内障進行度の平均グレードを表わしている。One black circle in the figure corresponds to one eye. The horizontal line represents the average grade of cataract progression at each time point.

無処置糖尿病群では、41日目には全例が発症し、その
後も悪化の一途をたどっているのに対し、γ−GCE含有D
PPCリポソーム点眼群では41日目においては33％,62日目
においても45％が発症したに留まり、しかもその程度は
軽度で、一旦発症しても進行が抑えられている傾向が認
められた。In the untreated diabetic group, all cases developed on Day 41 and continued to worsen thereafter, whereas γ-GCE-containing D
In the PPC liposome instillation group, 33% of the disease was observed on day 41 and 45% on day 62, and the degree was mild and the progression was suppressed even after the onset.

すなわち、γ−GCE含有DPPCリポソーム点眼は、ラッ
ト実験的糖尿病性白内障に対し、有意な発症抑制効果お
よび白内障進行遅延効果を有することがわかる。That is, it is found that the γ-GCE-containing DPPC liposome eye drop has a significant onset suppressing effect and a cataract progression delaying effect on rat experimental diabetic cataract.

水晶体グルタチオン含量低下を抑制する効果 図４に、最終点眼の翌日または翌々日の各群の水晶体
グルタチオン含量を、正常対照群を100として相対値で
示した。Effect of suppressing decrease in lens glutathione content FIG. 4 shows the lens glutathione content of each group on the day after the final instillation or on the day after the final instillation, relative to the normal control group as 100.

最終点眼の翌日の水晶体グルタチオン含量は、無処置
糖尿病群および空のDPPCリポソーム点眼群では25％程度
に低下していたのに対し、γ−GCE点眼群，γ−GCE含有
DPPCリポソーム点眼群では50％程度の低下に留まってい
る。このことは、水晶体グルタチオン含量低下を抑制す
る作用が、白内障発症抑制効果と相関していることを示
している。The lens glutathione content on the day after the final instillation was reduced to about 25% in the untreated diabetic group and the empty DPPC liposome instillation group, while the γ-GCE instillation group and γ-GCE were included.
In the eye drop group of DPPC liposomes, the decrease was only about 50%. This indicates that the action of suppressing the decrease in the lens glutathione content is correlated with the cataract onset suppressing effect.

最終点眼の翌々日の水晶体グルタチオン含量は、γ−
GCE点眼群では無処置糖尿病群と同じレベルまで低下し
てしまうのに対し、γ−GCE含有DPPCリポソーム点眼群
では正常群の40％程度と無処置糖尿病群より有意に高い
レベルに留まっている。The lens glutathione content two days after the final instillation was γ-
In the GCE instillation group, the level decreased to the same level as in the untreated diabetic group, whereas in the γ-GCE-containing DPPC liposome instillation group, it was about 40% of the normal group, which was significantly higher than that in the untreated diabetic group.

以上のことから、γ−GCE含有DPPCリポソーム点眼
は、ラット実験的糖尿病性白内障における水晶体グルタ
チオン含量低下を有意に抑制すること、および、その効
果の持続性に関してγ−GCE点眼よりも優れていること
がわかる。From the above, γ-GCE-containing DPPC liposome eye drops significantly suppress the lens glutathione content reduction in rat experimental diabetic cataract, and that it is superior to γ-GCE eye drops in terms of the duration of its effect. I understand.

実施例３ 免疫的肝障害に対するγ−GCE含有DPPCリポソームの障
害抑制効果 ［実験の方法］ 抗ラット肝細胞膜兎抗体は、ラット肝より調製した肝
細胞細胞膜を家兎に免疫して作成した。ラット単離肝細
胞はコラーゲナーゼ潅流法にて調製し、これに抗肝細胞
膜抗体とγ−GCE含有DPPCリポソームまたは比較対照と
して抗肝細胞膜抗体とグリチルリチン酸（GA）を添加
し、37℃にて10分間培養を行ない肝細胞より遊出するGP
T,GOT,LDHを測定し膜損傷の指標とした。薬剤による酵
素遊出の抑制率は（１−添加群の酵素遊出率／非添加群
の酵素遊出率）×100％の式で算定した。Example 3 Damage-inhibiting effect of γ-GCE-containing DPPC liposome on immune liver damage [Method of experiment] An anti-rat hepatocyte membrane antibody was prepared by immunizing a rabbit with a hepatocyte membrane prepared from rat liver. Rat isolated hepatocytes were prepared by the collagenase perfusion method, to which anti-hepatocyte membrane antibody and γ-GCE-containing DPPC liposome or anti-hepatocyte membrane antibody and glycyrrhizic acid (GA) were added as a control, and the mixture was incubated at 37 ° C. GP that migrates from hepatocytes after 10 minutes of culture
T, GOT and LDH were measured and used as an index of membrane damage. The inhibitory rate of enzyme migration by the drug was calculated by the formula: (1-enzyme migration rate of addition group / enzyme migration rate of non-addition group) x 100%.

［結果］ 第１表に、単離肝細胞に予め薬物をそれぞれ終濃度0.
1mM γ−GCE,および0.25mM GAとなるように添加した場
合の、酵素遊出抑制率の比較を示した。[Results] Table 1 shows that the isolated hepatocytes were preliminarily supplemented with a drug at a final concentration of 0.
The comparison of the enzyme transmigration inhibition rate when adding 1 mM γ-GCE and 0.25 mM GA was shown.

すなわち、GA添加群に比し、γ−GCE含有リポソーム
群が、より低濃度であるにもかかわらず、有意に高い免
疫的肝障害抑制効果を有していることがわかる。その作
用機作は、γ−GCE含有リポソームの著しい膜安定化効
果に基づくものと推定され、このことは当該リポソーム
製剤が、ウイルス性肝炎罹患時における抗ウイルス抗体
による肝細胞障害を抑制するのに有用であることを示唆
している。 That is, it can be seen that the γ-GCE-containing liposome group has a significantly higher immunosuppressive effect on immune hepatic injury than the GA-added group, although the concentration is lower. The mechanism of action is presumed to be based on the remarkable membrane-stabilizing effect of γ-GCE-containing liposomes, which means that the liposome preparation suppresses hepatocellular injury due to antiviral antibodies during viral hepatitis. Suggests that it is useful.

第２表に、γ−GCE含有リポソームの酵素遊出抑制作
用の濃度依存性について調べた結果を示す。Table 2 shows the results of examining the concentration dependence of the enzyme emigration suppressive action of the γ-GCE-containing liposome.

すなわち、γ−GCE含有DPPCリポソームの酵素遊出抑
制作用は濃度が高くなるにつれて強まり、γ−GCEの終
濃度が0.5mMに達したときに、最も著明な抑制効果を示
していることがわかる。 That is, it can be seen that the enzyme transmigration inhibitory effect of γ-GCE-containing DPPC liposomes increased as the concentration increased, and showed the most remarkable inhibitory effect when the final concentration of γ-GCE reached 0.5 mM. .

以上の結果より、本発明のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
システインエステル誘導体（Ｉ）を含有するリポソーム
製剤は、慢性肝炎の大部分を占めるウイルス性肝炎の治
療において、現在繁用されているグリチルリチンよりも
優れた効果を発揮する可能性が示唆された。From the above results, γ-L-glutamyl-L- of the present invention
It was suggested that the liposome preparation containing the cysteine ester derivative (I) may exert a superior effect to the currently widely used glycyrrhizin in the treatment of viral hepatitis, which accounts for the majority of chronic hepatitis.

４） 発明の効果 本発明のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステ
ル誘導体（Ｉ）またはその酸化型２量体を含有するリポ
ソーム製剤は、投与部位における滞留時間が長く流出が
少ない、薬効の持続性と組織移行性が高いなどの効果が
期待され、（１）組織グルタチオンレベルの向上剤とし
て用いた場合、背景技術に記した、中毒中和をはじめ
とするグルタチオンの各種薬効をより優れた形で発現
し、グルタチオン低下が一因となる各種成人病の予防
・治療により優れた効果を示すこと、（２）点眼用白内
障治療薬として用いた場合、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
システインエステル誘導体（Ｉ）またはその酸化型２量
体の良好な水晶体移行によってグルタチオン濃度が上昇
し白内障の発症抑制および進行防止に極めて強力な作用
を発揮すること、また（３）肝疾患治療剤として用いた
場合、免疫的肝障害に対し膜安定化作用に基づくものと
思われる抑制効果を発揮することから、ウイルス性肝炎
治療にも優れた効果を有していること、などが推定され
る。4) Effects of the Invention A liposome preparation containing the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative (I) or an oxidized dimer thereof of the present invention has a long residence time at the administration site and little outflow, and sustained drug efficacy. It is expected to have effects such as high bioavailability and tissue transferability. (1) When used as a tissue glutathione level enhancer, it has a better effect on glutathione, including neutralization of poisoning, described in the background art. Which is more effective in the prevention and treatment of various adult diseases caused by the decrease in glutathione, and (2) when used as a therapeutic agent for eye drop cataracts, γ-L-glutamyl-L-
Good lens transfer of cysteine ester derivative (I) or its oxidized dimer increases the glutathione concentration and exerts an extremely powerful action for suppressing the onset and progression of cataract, and (3) as a liver disease therapeutic agent When used, it exerts an inhibitory effect on immune liver damage, which is thought to be based on a membrane stabilizing action, and therefore it is presumed that it also has an excellent effect on treatment of viral hepatitis.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

図１は、本発明のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン
エステル誘導体（Ｉ）を含有するリポソーム製剤の白内
障治療への応用に用いた薬効評価系を示す図である。 図２は、ラットSTZ惹起糖尿病性白内障モデルにおい
て、本発明のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエス
テル誘導体（Ｉ）を含有するリポソーム製剤が、最も優
れた白内障発症抑制効果を有していることを示す図であ
る。 図３は、ラットSTZ惹起糖尿病性白内障モデルにおい
て、本発明のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエス
テル誘導体（Ｉ）を含有するリポソーム製剤が、有意な
白内障の発症抑制効果および進行遅延効果を有している
ことを示す図である。 図４は、ラットSTZ惹起糖尿病性白内障モデルにおい
て、本発明のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエス
テル誘導体（Ｉ）を含有するリポソーム製剤が、最も強
くかつ持続的な水晶体グルタチオン含量低下抑制効果を
有していることを示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a drug efficacy evaluation system used for application of a liposome preparation containing the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative (I) of the present invention to the treatment of cataract. FIG. 2 shows that in a rat STZ-induced diabetic cataract model, a liposome preparation containing the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative (I) of the present invention has the most excellent cataract onset suppressing effect. FIG. FIG. 3 shows that in a rat STZ-induced diabetic cataract model, the liposome preparation containing the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative (I) of the present invention has significant cataract onset suppressing effect and progression delaying effect. It is a figure showing what is doing. FIG. 4 shows that, in a rat STZ-induced diabetic cataract model, the liposome preparation containing the γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative (I) of the present invention has the strongest and lasting inhibitory effect on the decrease in lens glutathione content. It is a figure which shows having.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−26516（ＪＰ，Ａ) 特公 昭63−61302（ＪＰ，Ｂ１) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) References JP 64-26516 (JP, A) JP 63-61302 (JP, B1)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】一般式 で示されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステ
ル誘導体またはその酸化型２量体を有効成分として含有
するリポソーム製剤。1. A general formula A liposome preparation containing, as an active ingredient, a γ-L-glutamyl-L-cysteine ester derivative represented by or an oxidized dimer thereof. 【請求項２】Ｒがエチル基である請求項１記載のリポソ
ーム製剤。2. The liposome preparation according to claim 1, wherein R is an ethyl group. 【請求項３】リポソームの膜構成素材がジパルミトイル
ホスファチジルコリンである請求項１または２記載のリ
ポソーム製剤。3. The liposome preparation according to claim 1 or 2, wherein the constituent material of the liposome membrane is dipalmitoylphosphatidylcholine. 【請求項４】有効成分が遊離型として共存する請求項１
乃至３のうちいずれか１項記載のリポソーム製剤。4. The active ingredient coexists as a free form.
4. The liposome preparation according to any one of items 1 to 3. 【請求項５】組織グルタチオンレベルの向上剤である請
求項１乃至４のうちいずれか１項記載のリポソーム製
剤。5. The liposome preparation according to any one of claims 1 to 4, which is an agent for improving tissue glutathione level. 【請求項６】白内障治療剤である請求項１乃至４のうち
いずれか１項記載のリポソーム製剤。6. The liposome preparation according to claim 1, which is a therapeutic agent for cataracts. 【請求項７】肝疾患治療剤である請求項１乃至４のうち
いずれか１項記載のリポソーム製剤。7. The liposome preparation according to any one of claims 1 to 4, which is a therapeutic agent for liver diseases.