JP2506340C

JP2506340C -

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Publication number: JP2506340C
Authority: JP
Original assignee: ザロツクフエラーユニバーシテイ
Publication date: 1999-10-18

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【発明の詳細な説明】（本発明の目的）従って、本発明の主たる目的は、哺乳動物におけるある同化酵素活性に抑制的
な効果を与える、モジュレータ物質の調製方法を提供することである。本発明の別の目的は、例えば感染などの侵入刺激が存在することが疑われる哺
乳動物において、モジュレータ物質の存在を検出する方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、哺乳動物におけるモジュレータ物質の有害な影響と
たたかうために効果があると思われる薬剤等の物質をスクリーニングする方法、
及び関連するアッセイ系を提供することである。本発明の更に別の目的は、モジュレータ物質の活性の有害な効果を和らげるか
そらせるため、この活性を調製する哺乳動物の処理方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、モジュレータ物質或いはその結合パートナーをベー
スとする、治療方法のための薬剤組成物を提供することである。本発明の更に別の目的は、本発明のモジュレータ物質を利用する腫瘍組織の治
療方法及び組成物を提供することである。本発明のその他の目的及び利益は、添附図面と関連して説明される以下の記載
を参照することにより、当業者には明らかになるであろう。（本発明の説明）本発明はその一つの局面においては、本明細書においてモジュレータ物質もし
くはカシェクチン(cachectin)と記載する特定因子の分離及び同定に関し、この
モジュレータ物質もしくはカシェクチンとは、例えばバクテリア，ビールス，あ
る種の腫瘍，プロトゾア，及び例えば内毒素などのその他の毒素のような侵入性
刺激を特徴的に伴う刺激物質と記載する物質により刺激を受けるマクロファージ
（大食細胞）及びマクロファージ細胞系に存在することが知られている。親出願
である米国特許出願第414,098号に開示される中間物質に対し、本発明のモジュ
レータ物質は前記中間物質の一つの成分であることが確認されており、このモジ
ュレータ物質は哺乳類細胞のある種のものに新陳代謝を生じさせ、それにより同
比状態から異化状態に変化させて宿主を侵入性刺激に対し身構えさせる能力を有
するように見える。特に本発明によるモジュレータ物質は同化酵素リポプロテインリパーゼ(LPL)
を作用を抑圧するようであり、かくしてこのことは宿主の免疫系とそのエネルギ
ー貯蔵組織の連通系の一部としての作用を果すことを示唆している。このモジュ
レータ物質はまた脂肪細胞の分化を阻害するようであり、筋肉細胞中のグリコー
ズの取り込みを増大するから、理論上、侵入刺激に応じ作用して脂肪組織，筋肉
などのエネルギー貯蔵組織に対し影響を及ぼし、それにより侵入物とたたかうエ
ネルギーの差し迫った必要に応ずるようにすると考えられる。このようにしてモ
ジュレータ物質は宿主の細胞活性の異化状態への変換を促進して、侵入物とたた
かうエネルギーを供給しうるようにする。侵入が短期間である場合には宿主は迅
速に回復し消費したエネルギーを補充する。しかし侵入が連続的であるか慢性的
な性質のものである場合にはエネルギーの消尽，悪液質，ショック，そして最終
的には死に至る。本発明のモジュレータ物質の一つの態様においては、分子量がほぼ17,000ダル
トンであり等電点がほぼ4.7-4.8である蛋白質を含むことが確認された。この特
定されたモジュレータ物質は二量体或いはそれ以上の多量体で存在しており、こ
のことは、その分離についての研究結果から確認されており、実施例Ｉ及びIIに
記載されている。この試験結果では更にモジュレータ物質が、細胞の高い親和性
を有する特定の需要体と相互作用して結合することが確められた。特に実施例Ｉ
のデータは、細胞あたりほぼ10⁴の高親和性結合部位の存在，及び対応する結合
定数（Ka）が３×10⁹であることを示唆している。後に記載するように、このこ
とは、本発明のモジュレータ物質の活性及び特に結合機構が明らかに際立ってい
るため、本発明モジュラー物質と公知技術による既知因子との間の構造的及び機
能的な相違を示唆するものである。モジュレータ物質の別の特徴は、内毒素に基
づくショックを阻止するために有効な抗体を発現させることができることである。このことは実施例Ｘに示されている。以上に述べた活性のほか、本発明のモジュレータ物質はある活性をもたないと
いう点でも特徴ずけられる。特に本発明のモジュレータ物質はメディエータ物質
（中間物質）に比し、同化酵素アセチルコエンジム（補酵素）Ａカルボキシラー
ゼと脂肪酸シンセターゼのいずれかを抑圧する能力をもたないか、或いは赤色細
胞の成長及び分化を阻止する点で異なっている。同様にこのモジュレータ物質は
公知因子であるインターロイキン１に対し、白血球活性剤活性をもたない点でこ
となっている。またこのモジュレータはマウスにおける発熱，或いは筋肉蛋白質
劣化を生じさせる能力が欠けているようである。モジュレータ物質とそのプリカ
ーサ（前駆物質）であるメディエータ物質の双方の特徴を同定するために役立つ
活性の以上のような相違は、後に記載する実施例に極めて詳細に記載されている
。モジュレータ物質の調製については、先にごく簡単に論じられており、種々の
細胞の培養を開始することにより、浸入性刺激を生ずる刺激物質を処理しうるこ
とが確認されている。特に細胞系RAW264.7はプリカーサであるメディエータ物質
の調製を開始するために利用することができ、このメディエータ物質からモジュ
レータ物質を分離することができる。特に、後に詳細に説明するようにマウスの
マクロファージ細胞系RAW264.7を使用することによって、分析及び精製をするた
めに十分な量の分離を行うことができる。当然のことではあるが他の細胞系を用
いてモジュレータ物質を分離するためのプリカーサであるメディエータ物質、も
しくはモジュレータ物質それ自体を調製することができ、本発明はこのような可
能性を除外するものではない。従って別の手段、例えば遺伝子工学的再現による
方法も本発明では考慮されている。本発明によるモジュレータ物質は実施例IIに示すようにマウスを用いて分離さ
れ分析された。その結果ヒトにみられるような公知の蛋白質腫瘍壊死因子(TNF)に若干類似する
ことがわかった。実施例IIに見られるような実験の完了後の研究により、このモ
ジュレータ蛋白質の完全な連鎖の説明が可能になり、この連鎖は第23図に呈示さ
れている。かくして成熟したモジュレータ蛋白質連鎖は156アミノ酸として定義
される。更にこのアミノ酸連鎖に関連するモジュレータのmRNAを同定され、この
開示された蛋白質の組換型を調製するために採用された。採用された方法は、内
毒素誘導RAW264.7細胞からmRNAを分離し、mRNAを含む適当なベクター（媒介体）
を調製し、これを次に大腸菌に導入した。転換は、組換型プラズミドDNAを用い
て高い効率で生じた（即ち、μｇDNAあたりほぼ10⁸組換型細菌）その後合成オリ
ゴヌクレオチドプローブ（長さ45np）が形成され、溶解バクテリアコロニーによ
る位置雑種によりcDNAライブラリーでスクリーニングするために使用され、連鎖
化はジデオキシヌクレオチド法により行われた。以下の手順は未公開実験の抜粋であり、当業者にはよく知られた組換型技術の
一般原則の多くを採用しているものであることがわかるであろう。従って本発明
はこのモジュレータ物質の調製にかかわるものであるが、より詳しくは、公知組
換型技術による第23図に示したアミノ酸連鎖を有する物質の調製にかかわる。実施例IIに示したモジュレータのアミノ酸連鎖はヒトのTNFに類似しているが
、多くの特定アミノ酸単位に差のあることは、蛋白質相互の間に類似性と共に相
違点もあることを示唆している。特に、マウス細胞の刺激に由来するモジュレー
タ物質は、人間の腫瘍壊死因子（TNF）に関して最近得られた公知構造データと
の比較による実施例IIの研究から類似性と相違点とがわかり、相違点は主として
あるアミノ酸残基の数及び性質に由来するものであることがわかった。研究の結
果更に、マウスにおけるモジュレータ物質のある活性が、ヒトのTNFの耐腫瘍性
能力に類似する能力であることを示唆していることがわかった。かくして本発明の別の局面においては、ある治療能力を有するモジュレータ物
質が提供され、この治療能力は、なかでも腫瘍細胞知能の治療について述べた活
性のほか、非腫瘍性細胞における同化酵素にかかわる活性を含む。従って第一の
局面においては、本発明は、腫瘍発生細胞の治療方法を包含し、この方法は、そ
の治療のため適当な形態と態様で一定量のモジュレータ物質を投与することから
なる。モジュレータ物質或いはその結合体もしくはその他の配位子は薬剤組成物の形
で調製され、適当なキャリアを含み、腫瘍を有する患者に対しその治療のため種
々の方法で投与しうるような、適当な強度を有するように形成される。種々の投
与方法を採用することができ、例えば皮下注射，静脈注射及び腸腔内注射，カテ
ーテル法などの非経口投与法が含まれる。モジュレータ物質の平均投与量は様々
であり、特に資格ある医者の判断と処方を基準にしなければならない。これに関連して、このモジュレータ物質は、先に概略を述べたように非腫瘍発
生細胞についての治療効果も有し、従って例えば悪液質，ショックなどの治療に
も使用することができる。特にこのモジュレータ物質は種々の哺乳動物と抗体自
体をつくりだすことができ、この場合、例えば溶解したネズミ脾臓リンパ球及び
骨髄腫細胞を利用したハイブリドーマ法のような公知の方法を採用することがで
きる。生成した抗体を次に適当な薬剤組成物に調製し、侵入性刺激物を有する宿
主に投与して悪液質を防ぐか治療するようにする。同様にこのモジュレータ物質は動物体に接種しうるのに適した形に調製し、先
述のような疾病状態に対して免疫をもたせるようにしてもよい。ある用途は農業
用動物に適用するものである。即ちウシに、適当な薬剤組成物に調製した免疫量
を接種し、それにより感染した時に体重の損失に対して免疫があるようにしても
よい。更にこれに関連して内毒素耐性マウスの研究によりモジュレータ物質の別の治療
適用可能性が考えられた。この適用について、動物は、侵入刺激に応じたモジュ
レータ物質の生成に対する抵抗性を基準にして観察され選択される。免疫化につ
き、このことは農業用動物に同様に実際的な適用可能性を付与するものであり、
例えばモジュレータ物質を合成することができるという基準に基づいて選択され
た雌牛は、細菌或いはビールスの感染を受けている間引続きミルクを出すことが
できる。別の適用可能性は、動物を遺伝学的に改良してモジュレータ物質の合成
に抵抗性のあるようにするものである。このことは、組換型のモジュレータ物質
の調製に関し先に述べたような公知の遺伝学的技術により行うことができる。以上に述べたような腫瘍治療用途に関し、薬剤組成物の正確な投与量，投与間
隔及び投与方法は、医療に通じた人、資格ある医師の指示により変動してよい。同様に悪液質の治療についてもモジュレータ物質及びモジュレータ物質に対す
る抗体の双方を調製することができ、ショック状態の治療に用いることができる
。投与は先述したような態様で行う。正確な投与量及び投与間隔は、被投与者の
年齢，体重，全体的な健康状態及びモジュレータ物質の濃度等を考慮して資格あ
る医師により決定されてよい。別の治療用途は、モジュレータ物質の決定的な抑圧効果を利用するものであり
、従ってモジュレータ物質は肥満症の治療に用いられる。このような場合、適当
な薬剤組成物に調製されたモジュレータ物質は資格ある医師の処方通りに肥満状
態の患者に投与され脂肪分を除去し、それににより肥満状態を軽減する。本発明はまた様々の診断用途に適用され、これは、本発明のモジュレータ物質
により影響を受ける活性を限定する侵入性刺激を検出する方法を含む。既に、述
べたように、モジュレータ物質は種々の方法によってそれ自体の抗体を作るために使用することができ、このような抗体は分離して、疑わしい哺乳類宿主
におけるモジュレータ物質の存在を試験するために使用することができる。モジュレータ物質に対する抗体は、よく知られたハイブリドーマ法を含む標準
的な方法でつくって分離することができる。抗体はあたかも抗体に対する抗原で
あるかのように、別の種に使用することもできる。いずれの型の抗体もモジュレ
ータ物質活性の存在と程度を決定するために使用することができる。便宜のため
、モジュレータ物質に対する抗体を以下の説明ではAb₁と記載し、別の種に適用
される抗体をAb₂と記載する。侵入性刺激を保有していることが疑われている宿主におけるモジュレータ物質
活性の存在は、このような目的に適用される通常の免疫学的手順により確められ
る。多くの有用な手順が知られている。特に有用な三種の手順においては、検出
可能なラベルでラベルしたモジュレータ物質が利用されるか、検出可能なラベルをラベルした抗体Ab₁，もしくは検出可能
なラベルでラベルした抗体Ab₂が利用される。これらの手順は以下の式に要約さ
れる。式中の星印（＊）は粒子がラベルされていること、また“Mod”はモジュ
レータ物質を指す：Ａ．Mod^*＋Ab₁＝Mod^*Ab₁ Ｂ．Mod＋Ab₁＝ModAb₁ ^* Ｃ．Mod＋Ab₁＋Ab₂＝ModAb₁Ab₂ ^* これらの手順及びその適用はすべて当業者にはよく知られているものであるか
ら、本発明の範囲内で利用できる。“競合的”な手順である上記Ａの手順は米国
特許第3,654,090号及び3,850,752号に記載されている。“サンドイッチ”の手順
Ｃは米国再発行特許第31,006号及び米国特許第4,016,043号に記載されている。
これ以外の手順、例えば“二重抗体”法或いは“DASP”法なども知られている。いずれの場合でもモジュレータ物質は抗体もしくは結合パートナーと複合体を
形成し、複合体の一構成体は検出可能なラベルでラベルされている。複合体が形成されている
こと、及び必要な場合その量がどれ位か、はラベル検出に適用される公知の方法
で決定することができる。以上の説明からAb₂の特徴的な性質は、これがAb₁と反応することであることが
わかる。これは、ある哺乳類でつくられたAb₁が抗体Ab₂を生成するための抗原と
して別の種の哺乳類動物に使用されたからである。例えば、Ab₂は抗原としてAb₁
を用いて山羊で生成することができるが、このAb₂は従って抗ウサギ抗体となり
うる。このことの説明の便宜のためAb₁をモジュレータ物質抗体と記載し、Ab₂を
モジュレータ物質抗体と反応する抗体、もしくは“抗一抗体”と記載する。これらの研究のためにもっともよく使われるラベルは放射性元素，酵素，紫外
線にさらされた時には蛍光を発する化学薬品等である。ラベルとして使用することのできる多くの蛍光物質が知られている。これらは
、例えばフルオレセイン，ローダミン及びオーラミンである。特定された検出物質は、山羊中
につくられイソチオシアネートれによりフルオレセインと共役結合する抗ウサギ
抗体である。モジュレータ物質或いはその結合パートナーもまた放射性元素或いは酵素でラ
ベルすることができる。放射性元素は今日入手することのできるいずれかのカウ
ント手段によって検出可能である。好ましい同位元素¹⁴Ｃ，¹³¹Ｉ，³Ｈ，¹²⁵Ｉ
，及び³⁵Ｓである。酵素ラベルも同様に有用であり、現在利用することのできる比色法，分光光度
法，蛍光分光度法或いは気体定量法によって検出可能である。酵素は、例えばカ
ルボジイミド類，ジイソシアネート類，グルタールアルデヒド等の架橋分子との
反応により、選ばれた粒子と共役結合する。これらの手順に利用することのでき
る多くの酵素が知られている。好ましいものはパーオキシダーゼ，β−グルクロンダーゼ，β−Ｄ−グルコシ
ダーゼ，β− Ｄ−ガラクトシダーゼ，ウレアーゼ，グルコースオキシダーゼ，とパーオキシダ
ーゼ，酸フォスファターゼである。米国特許第3,654,090号，第3,850,752号及び
第4,016,043号は例としてラベル物質及びその方法について開示している。本発明に従って開発され利用されるアッセイ（検定）系はレセプタアッセイと
して知られている方法である。レセプタアッセイにおいては、アッセイ（検定）
される物質は適切にラベルされ、次いである細胞質試験コロニー，例えば3T3-L1
細胞系が先ず分化され、次いである量のラベルされた物質が接種される。その後
、ラベルされた物質がどの程度細胞レセプタに結合したかを決定するための研究
がなされる。このようにして物質相互の間の差異が確認される。この手順は特に
後に呈示する実施例Ｉに述べられている。かくして、実施例Ｉに詳細に示されているように、ある量のモジュレータ物質
が放射性元素でラベルされ、その後最近分化した3T3-L1細胞を用いて結合度の研究が行われる。種々の量のラベルしたモジュレータ物質を含
む溶液が調製され、細胞標本に接種されその後培養された。得られた細胞単層を
洗浄し、溶解し、標準誤差が５％以下となるのに十分な時間ガンマカウンターで
カウントした。このデータを次にスキャッチャード（Scatchard）分析処理し、
その後物質活性に関する観察及び結論が出された。以上の手順は例示的なもので
あるけれども、アッセイされる物質の細胞結合能力が特性となる場合にレセプタ
アッセイがどのように行われ利用されるかが理解されよう。本発明の別の態様においては、医療専門家に使用されるのに適した商業的な試
験キットが製造され、これは疑わしい哺乳類宿主におけるモジュレータ物質活性
の存否を決定するために使用される。上述した試験方法に従いこのようなキット
の一種は少なくともラベルしたモジュレータ物質もしくはその結合パートナー，
及びこれに特異性のある抗体を含む。別のものは少なくともAb₁とラベルしたAb₂を含む。更に別のものは少なくともAb₁と更に、もち
ろん選択される方法、例えば“競合法”，“サンドイッチ法”，“DASP法”，等
の方法に従い指示書を含む。このキットは例えば緩衝剤，安定剤等の補助反応剤
を含んでいてもよい。かくして、侵入性刺激に対する哺乳動物宿主の反応を顕示するための試験キッ
トは下記を含む：（イ）モジュレータ物質もしくはこれに特異性のある結合パートナーを、直接
或いは間接に、検出可能ラベルでラベルすることにより得られる所定量の、少な
くとも一種のラベルした免疫化学反応成分；（ロ）他の反応剤；及び（ハ）キットの指示書。より特定すると、診断キットは下記を含む：（イ）免疫溶剤を生成するため一般的に固体相に結合されるか、或いは適当な
タグ札などの最終使用形態に結合されている公知量の上記モジュレータ物質（もしくはその結合パートナー）；（ロ）必要によりその他の反応剤；及び（ハ）このような試験キットの使用説明書別の実施態様においては、試験キットは共述の目的を達成するために作られ使
用され、所定の処方（例えば“競合法”，“サンドイッチ法”，“二重抗体法”
等）に従って作用するものであって下記を含む：（イ）モジュレータ物質を検出可能ラベルに結合することにより得られるラベ
ルされた素子；（ロ）一種もしくは数種の補足的な免疫化学反応剤であって、そのうちの少な
くとも一種は配位子もしくは不動配位子であり下記の群：（ｉ）ラベルされた素子（イ）と結合することのできる配位子；（ii）ラベルされた素子（イ）の結合パートナーと結合することのできる配位
子；（iii）決定される成分の少なくとも一種と結合することのできる配位子；（iv）決定される成分の少なくとも一種の結合パートナーの少なくとも一種と
結合することのできる配位子；のうちから選ばれる配位子である反応剤；（ハ）モジュレータ物質とこれに特異性のある結合パートナーとの免疫化学反
応による一種もしくは数種の素子の検出及び／もしくは決定のため、処理を行う
ための指示書。以上のように、モジュレータ物質と反作用するのに有効な潜在的な薬剤をスク
リーニングするためのアッセイ系が調製される。第１手順では、試験薬剤が刺激
を受けたマクロファージ標本に投与されて、モジュレータ物質の生成に及ぼす効
果を決定する。別の手順では、モジュレータ物質は3T3-L1系のような細胞試験系
に導入され、考えられる薬剤が生成する細胞培養体中に導入されこの後培養体は
、薬剤の添加により、或いは公知モジュレータ物質の添加量の効果から、モジュレータ物質活性の変化が観察される。既に述べたように、以下の実施例はモジュレータ物質の分離及び同定の詳細を
示すものであると共に、このモジュレータ物質と、出願人或いは当業界の人々に
よって既に特定されている因子との間の活性の相違及び類似性を示すような活性
にかかわる観察が示されている。当然のことながら以下に示すような特定の物質
及び方法は単に説明のためだけのものであり、従って以下の例は本発明を限定す
るものではない。（実施例）実施例Ｉ本実施例においては、3T3-L1細胞からのモジュレータ物質の分離が行われる。
分離物の研究の結果、これは17キロダルトンの蛋白質であって、特定の高親和性
レセプタにより脂肪細胞及びいくつかの他の細胞型に結合するものであることが
わかった。物質及び方法 3T3-L1細胞培養体及びバイオアッセイ：3T3- L1細胞を１ウェルあたり100,000細胞の密度で24ウェルのリンブロプレート（フ
ローラボラトリーズ，インナーポレーテッド社製，バージニア州マクリーン）に
培養した。培地は10％雌牛血清を補充したダルベコ社の修正イーグル培地（ギブ
コラボラトリーズ社製，ニューヨーク州グランドアイランド）を用いた。 37℃で10％Co₂雰囲気中においた。培地は１日おきに取替えた。１週間後、10
％ウシ胎児血清(FBS)、10μｇ／mlのウシインシュリン、0.5mMメチルイソブチル
キサンチン及び1.0μＭデキサメタゾンを補充した培地で48時間培養することに
より細胞は分化した。分化した細胞は、10％FBS及び50ng／mlウシインシュリン
を含む培地（１日おきに取替えた）中で、１週間後バイオアッセイ或いは結合検
査のために使用するまで保持した。 0.1mlの容量のアッセイされる標本が、それぞれ1.0mlの培地を含む分化3T3-L1
細胞の夫々のウエルに適用され、12乃至18時間37℃で、 10％Co₂培養器中に置かれた。この培養の終期に培地は吸引され、10％FBS，50ng
／mlインシュリン及び10U/mlヘパリンを含有する0.5mlのDMEと交換した。37℃で
１時間後、ヘパリン解放可能なLPL活性を、ニルソン−エール及びショッツ(Nils
son-Ehle and SchOtz)法により測定した。 LPL活性ｘを有する標本中の全LPL抑圧比率(PTS)は次のように定義された：PTS
＝(C-x/C-m)×100，ここで、Ｃは粗メディエータ（中間物質）にさらされていな
い3T3-L1細胞のウエルによりつくられるLPL活性であり、またｍはヘパリン化培
地単独のLPL活性である。日毎のアッセイ変化を避けるため、この未知標本結果
を、すべてのバイオアッセイに含まれる粗中間物質の標準試料と比較した。粗メ
ディエータ物質のこの標準試料は小さな管に部分標本化され、−80℃で保蔵され
た。バイオ活性の1Uは、1.0mlアッセイ系に標準試料1.0μlを添加した場合に対
応するPTSを産出するカシェクチンの量と規定された。粗メディエータ物質の標準溶液の使用もまた、未知標本に存在す
るバイオ活量の量の直線的な予想量を確認するものであった。メディエータの製造：RAW264.7細胞を生成させ、５％Co₂雰囲気中で37℃に保
持したRPMI中に合流させた。メディエータ分泌の誘発前に、RAW264.7細胞を、PH
7.4の25mMヘーペス(Hepes)（リサーチオーガニックス，インコーポレイテッド社
製，オハイオ州クリーブランド）で緩衝させたハンクス(Hanks)平衡食塩溶液（
ギブコラボラトリーズ社製）で洗浄し、汚染血清蛋白質を除去した。それぞれの
フラスコを、１μｇ／ｍの大腸菌LPS（ディフコラボラトリーズ社製，ミシガ
ン州デトロイト）とpH7.4の50mMヘープスを含有する100mlのRPMI1640培地で刺激
した。37℃で22時間培養した後、培地を0.22μｍのフィルターで濾過し、−20℃
で凍結した。メディエータの精製：855mlの凍結貯蔵培地を融解し、PM-10フィルター（アミ
コンコーポレーション社製，マサチューセッツ州ダンバース）により、撹拌セルを用いて４℃で50psiの窒素雰囲気化で濃縮した。最初の
容量の２％に濃縮した後、得られた蛋白質溶液を蒸留水で繰返し希釈し、等電焦
点化する前に標本の脱塩化をするように再濃縮した。等電焦点化は、400mlの容量をもつ水冷コラム中で４℃の温度下で行われた。
このコラム中で、中心部に蛋白質標本が層化するようにしてグリセロール勾配が
以下のように調製された：40乃至21％（容量／容量）のグリセロールの直線勾配
が加えられた；標本はぜん動性ポンプで供給された；19乃至０％（容量／容量）
のグリセロール勾配が、標本上に層化された。勾配の上半分及び下半分の両方に
、水で１：16に希釈されたpH3-10のサーバライト(Servalyte）（サーバファイン
バイオケミカルズ社製，ニューヨーク州ガーデンシティパーク）を含むようにし
た。標本はその無塩濃厚液（55ml容量）を4.3mlのサーバライト，pH3-10，及び1
6.7ｇのグリセロールと混合することにより調製した。陽極溶液（コラム底部）は40％グリセロールに溶かした0.01Mのイシドジ酢酸であり
、陰極溶液（コラム上部）はＨ₂Ｏに溶かした0.01Mエチレンジアミンであった。
分離は初期電流18mA，初期電圧630Ｖで行われた。電圧は、処理中電流が低下す
ると増大したが、出力は16Ｗを越えないようにした。 24時間後、コラムから重力により150滴の断片が導出された。沈澱した蛋白質
は、４℃で20分間にわたり3,000gの遠心分離により除去された。フェノールレッ
ド溶液の滴がそれぞれの上澄液に添加され、酸性標本は、飽和三塩基りん酸ナト
リウム液を添加することにより中和され、塩基性標本は30％りん酸溶液の添加に
より中和された。カシェクチンバイオ活性は、それぞれの断片のバイオ活性のピ
ークに対応する２μｌをアッセイすることにより決定され、ピーク断片は更に精
製するためにプールされた。プールされたピーク断片は、両性電解質及びグリセロールを除去するために、
ダルベコのりん酸塩緩衝食塩水(PBS)（ギブコラボラトリーズ社製）を用いて数回にわたり透
析した。透析された物質（容積94ml）を、ベッド容積が2.0mlとしてコンカナバ
リンＡ(CON A)セファローゼコラム（ファーマシアファインケミカルズ社製，ス
ウェーデンウプサラ）に通過させた。補足的に10mlのPBSを、この樹脂に通過さ
せるようにし、濾過残留物と共にプールした。濾液を４℃の蒸留水を用いて２回
透析し、凍結乾燥した。 pH6.8の30mMトリ−HCl緩衝液、５％グリセロール，１mMのβ−メルカプトエタ
ノール及び0.002％のブロムフェノールブルーを含有する２ml溶液中で標本を再
溶解し、非変質状態で電気泳動させた。この標本を、６−13％の直線ポリアクリ
ルアミド勾配の、1.5mm×14.2cm×13.6cm径の手抜ゲルからなる積重ねゲルを通
した。トリグリセリン緩衝系は次のように使用された：陰極緩衝液は38mMトリ塩
基及び40mMグリセリンであった；陽極緩衝液は63mMトリ塩基及び50mM HClであった；積重ねゲル緩衝剤はpH6.8の0.125ト−HCLであった；また
分離ゲル緩衝液はpH8.8（最終濃度）の0.375Ｍトリ−HCLであった。アクリルア
ミド（29.2％）に加え、このモノマー溶液は0.8％のビス−アクリルアミドを含
んでいた。不純物を除去するために、このモノマー溶液はアンバーライトMB-1樹
脂（マリンクロート社製，ミズーリ州セントルイス）を用いて一晩撹拌された。標本は、ブロムフェノールブルーマーカーがゲル底に達するまで20mAの定常電
流で４℃の温度で電気泳動した。電気泳動終了後、１cmのゲルを手抜ゲルの側縁
から除去した。何故なら電圧によってこれら側縁域に水平でない移動が生じたか
らである。残るゲルは２mm間隔で水平にスライスした。夫々のスライス片をポリ
プロピレン管中の２mlの50mM重炭酸アンモニウム溶液中で12時間ゆるやかに撹拌
して拡散させることにより、スライス片から蛋白質が回収された。電気溶離は、
フランシス，R.T.，ジュニアほかによりＪ．CHROMATOGR.,298:115,1984年，に記載されているようにして、管状ゲ
ル装置中で3,500ダルトンのカットオフ透析膜を用いて行われた。かくして得られた断片はその活性がアッセイされ、純度を測定するため、非還
元及び遠元状態で10−15％の直線勾配ゲル中に硫酸ドデシルナトリウム（SDS-PA
GE）を含有する非変質系において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動が行われた
。蛋白質帯は、レイ，Ｅ（Wray,E）ほかによりANAL.BIOCHEM.118:197,1981年，
に記載されているようにして、銀痕跡により視覚化された。分析コラムクロマトグラフィ：ゲル濾化は、PH7.8の0.1mM重炭酸アンモニウム
で平行させた、７mm×１ｍのガラスコラム中の微細グレードのセファデックスＧ
−75（ファーマシアファインケミカルズ社製）を用いて実施した。カシェクチン
サブユニットの大きさを決定するための実験において、酵素グレード尿素（ベセ
ダリサーチラボラトリーズ社製，メリーランド州ベセダ）を標本及び溶離液に添加し
、断片は、バイオアッセイの前に個別にPBSで透析した。放射性ヨウ素化カシェクチンによる研究：精製されたカシェクチンはヨード法
により放射性ラベルをした。遊離ヨウ素は、セファデックスＧ−25ゲルによる濾
過及び透析により除去した。結合検査は、最近分化した3T3-L1細胞(0.2ml径あた
り４×10⁵細胞）を含む24-ウエルリンブロプレートを用いて実施した。結合検査
のために使用される溶液は、10％FBS，50ng／mlインシュリン，及びpH7.4の50mM
ヘーペス緩衝液を含有するDME培地からなる。種々の量のラベルしたカシェクチ
ンがこの溶液に添加された。特に注意することがない限り、培養は氷の上で４日
間、ゆるやかに撹拌しつつ実施された。次に細胞単層が、1.0の1MのNaOHで溶液
化した1.0mlの培地で３回洗浄され、ガンマカウンターを用いて標準誤差が＜５
％となるのに十分な時間カウントされた。筋肉細胞ラインC2（スタンフォード大学メディカルスクールのヘレンブラウ教
授の手による，カリフォルニア州パロアルト）もまたカシェクチン結合のため分
析された。細胞を成長させて、24−ウエルのリングロプレートに合流するように
した。プレートは雌牛皮膚コラーゲン（カルバイオケム−ベーリングコーポレー
ション社，カリフォルニア州ラジョラ）を用いて予備処理した。予備処理は、35
ml水中で50mgのコラーゲンをオートクレーブ処理し、殺菌溶液を、プレートあた
り24のウエルのそれぞれに適用することにより行われた。次に溶液を吸引し、プ
レートを、積層流フード中の紫外線により乾燥するにまかせた。使用された成長
培地は、20％FBS及び0.5％ニワトリ胚抽出液（ギブコラボラトリーズ社）を補充
したDMEであった。培養体は、５％Co₂雰囲気中で37℃に保持された。培地は毎日
変えられ、細胞は、２％ウマ血清（ギブコラボラトリーズ社）を含むDMEを添加
することにより合流するようになった時に、筋管を精製するように誘導された。48時間後、細胞は結合検査のために使用された。C2筋管
に結合するカシェクチンの測定は、3T3-L1細胞について記載したのと同様の方法
で行われた。 NCS雌マウスがロックフェラー大学のラボラトリーアニマルリサーチセ
ンターから得られた。マウスの赤血球(RBC)が、既に述べたようにヘバリン化マ
ウス血液を微結晶セルローズを濾過させることにより得られた。脾臓リンパ球は
、フィコール−ハイパック（ファーマシアファインケミカルズ社）による沈澱法
によって得られた。赤血球及びリンパ球に結合するカシェクチンの測定は、3T3-
L1細胞の場合に採用されたのと同様の手順により行われた。しかしながら、ラベ
ルしたカシェクチンの培養が1.5mlのエッペンドルフ管（ブリンクマンインス
トルメンツ社，ニューヨーク州ウエストベリー）中で行われた。４×10⁷マウスR
BC及び１×10⁷マウスリンパ球がそれぞれの結合アッセイで使用された。マイク
ロフュージ（ベックマンインストルメンツ社，カリフォルニア州フラートン）を用いて４℃で３度遠心
分離処理を行うことにより洗浄が完了した。細胞のペレットは直接にカウントさ
れた。粗肝細胞膜は、pH7.4の５mMヘーペス10ml中に、２ｇのマウス肝臓（湿重量）
を均質化することにより得られた。このホモジネート（均質体）を同じ緩衝液で
50mlに希釈し、５分間４℃で、200ｇで遠心分離した。上澄液を２mlの一定部分
に分割し、10分間のスピンで48,000ｇにペレット化した。得られたペレットはそ
れぞれ0.5mlの、10％FBSを補充したDMEに懸濁化し、これにラベルしたカシェク
チン（１ng／ml）を、ラベルしていないカシェクチン（300ng/ml）と共に、或い
はこれを含めることなく添加した。結合は４℃で４時間で生じるようにした。膜
、48,000ｇの遠心分離により、新鮮な培地を用いて３回洗浄した。ペレットはそ
の放射活性がカウントされた。インターロイキン１（IL-1）活性のアッセイ：これは、標準試料として組換型IL-1を用いて既に述べたようにして行われた。蛋白質の決定：蛋白質濃度の測定は、市販のコーマッシーベースによる蛋白質
反応剤（バイオラドラボラトリーズ社，カリフォルニア州リッチモンド）を用
いて行われた。結果 RAW264.7細胞からのカシェクチンの調製及び粗溶液における特徴：50mlの培地
中の^-10⁵Ｕのカシェクチンのバイオ活性が、10⁸RAW264.7細胞を含む融合性フラ
スコから得られた。この粗メディエータの特徴的な活性は、^-４×10⁵Ｕ／mg蛋白
質であることが定期的に観察された。極く少量の補足的なカシェクチンは、細胞
をLPSと共に長く培養することにより、或いはLPSを含む新鮮な培地で再刺激する
ことにより得られた。対照的に特有な活性の片鱗は、このような試みがなされた
時に観察された。中性pHで−20℃で粗試料を数週間保蔵した後でも、或いは４℃で５日間保蔵し
た後でも、バイオ活性の損失みられなかった。しかしながらバイオ活性は酸性pHでは不安定で
あることが観察されており、pH5.0で４℃で24時間後には半分になっていた。低
いpHにおける不安定性は、20％グリセロールを添加することによって減少する。
このため、等電焦点化は、サッカローゼよりもグリセロール中で行われ、この処
理はできるだけ迅速に行う。濃縮化及び等電焦点化：バイオ活性は、述べてきたような条件下で圧力透析が
行われる場合には保有物質と排他的に結合している。50倍濃縮化後の回収率は通
常＞90％であり、表Ｉに見られるようにしばしば極めて高くなる。表Ｉのデータ
は代表的な分離法の場合の数値である。濃縮化物質の等電焦点処理によりバイオ活性の等電点は4.7であることがわか
った（第１図）。両性電解質それ自体はバイオアッセイを干渉しない。等電焦点
化後のバイオ活性の回収率は変動し（10-60％）、主としてコラムに添加される
蛋白質の全量に依存した。等電焦点化中のバイオ活性の低下は、粗濃縮物中に存
在する他の蛋白質とカシェクチンとの共同的な沈澱反応の結果であるように見え
た。何故なら収率の低さは、蛋白質の大量の分離及び沈澱物の大量の精製と関連
していたからである。等電焦点化前に、粗メディエータ物質に添加されるトレーサとしての放射性ラベル精製カ
シェクチンにかかわる後の実験は、この結論を支持するものであった。少量の標
本（蛋白質全量が50mg或いはこれ以下）をコラムに添加，グリセロール勾配の使
用、及び分離時間を短くすることにより（24時間或いはそれ以下）、また分画化
後標本を直ちに中和することにより、回収率は最大となった。コンＡ−セファローズ(Con A-Seprarose)クロマトグラフィ：いくつかの蛋白
質種が、バイオ活性の損失が殆どないか全くないコンＡ−セファローズによる親
和性クロマトグラフィにより除去された。コンＡ−セファローズを大量に使用し
た場合には、カシェクチン活性の回復は低いものであった。これは多分この樹脂
との疎水性相互反応によるものであろう。何故なら、活性は0.1Mのα−メチルマ
ノサイドの添加によっては解放されなかったからである。ページ：非変質状態下でページ(PAGE)後、単一の蛋白質帯域と関連した、ゲル上のある位置でバイオ活性のすべてが観察され
た（第２，３図）。この段階でバイオ活性の10-20％のみが、電気泳動によって
或いは蛋白質を希釈重炭酸アンモニウム緩衝液中に蛋白質を拡散させることによ
って、スライスしたゲルから回復した。拡散時間を長くすること、抽出を繰り返
すこと、及び多量の緩衝液を使用することは、殆ど効果がなかった。回復は、高
濃度の標本をゲルに適用することにより、また精製アクリルアミドモノマーをゲ
ル試料に使用することにより最大となった。電気泳動的に精製されたカシェクチンのSDS-PAGE分析：分離物の見掛けの均質
性は、SDS-PAGE系における電気泳動によって確認された。SDSゲルに適用された
、カシェクチン活性と関連する精製蛋白質は、分子量17,000の唯一の帯域をもっ
ていた（第３図）。精製カシェクチンのマイクログラム量がSDSゲル中で電気泳
動処理されると、バイオ活性は電気溶出によって固定されていないスライスから回復した。この活性は17,000の分子量の蛋白質の存
在と一致していた；バイオ活性はゲルの他の域からは得られなかった（第４図）
。精製カシェクチンの分子量：カシェクチンの粗濃縮物をセファデックス（Seph
adex）G-75ゲル濾過により分析したところ、バイオ活性溶離プロフィルは、分子
星が＞70,000であることを示した。しかし粗濃縮物が６Ｍ尿素の存在下でゲル濾
過により分離された時、17,000（デキストランスケール）の分子量が得られ、こ
のことは他の蛋白質との非共役マルチマー或いは凝固体の生成を示唆している（
データは示されていない）。精製カシェクチンがSDSゲル上で分析された時、還元標本及び非還元標本共に
、17,000の見掛け分子量を示した。セファックスＧ−75コラムによる精製カシェ
クチンのゲル濾過によって計算された分子量は35,000であり、このことは非共役
二量体の存在を示している（データは示されていない）。放射線ヨウ素処理及び結合の研究：精製ホルモンがヨウ素法により¹²⁵Ｉを放
射線ラベルされた。^〜70％のバイオ活性が回収され、最初の特異活性は^〜１×10
⁶cpm/μｇ蛋白質であった。このラベルされた物質をSDS-PAGE処理をして、スラ
イスしたゲルを測定したところ、放射能の殆どは分子量17,000の蛋白質と関連し
ていた。クロールアミンＴを使用した蛋白質をラベルする試みは、バイオ活性の
完全な損失に終った。精製した、放射線ヨウ素化ホルモンは迅速かつ特異的に、37℃及び０℃の両方
で培養3T3-L1脂肪細胞と結合した（第5A図及び5B図参照）。ラベルしないカシェ
クチンの25,000U/mlを添加した結果は、検査したすべての時点でラベルした蛋白
質による結合を阻害した。説明した条件下で、２−３時間以内に平行状態になっ
た。結合したラベル量の、時間に依存する減少が37℃で観察され、これはおそら
くレセプタにより媒介されるエンドサイト−シスを反映している。結合特性はスキャッチャード(Scatchard)分析により検査された（第6A図）。
このデータは細胞あたり^〜10⁴高親和性位置の存在及び３×10⁹の関連定数（ka）
を示唆している。分化3T3-L1細胞及び未分化“前脂肪細胞”の双方が、同様の親
和力及び密度を有するレセプタを保有していた。筋肉細胞系C2も特異カシェクチ
ンレセプタを保有しており、この場合にも細胞あたり^〜10⁴高親和性位置と、３
×10⁹のKaが観察された（第6B図）。マウス肝臓膜試料もまた特異カシェクチン
結合を示した。一方、赤血球及びリンパ球は検出可能な量のカシェクチンレセプ
タが欠けていた（細胞あたり＜200コピー）。 IL-1活性のアッセイ：同様の大きさ、組織発生及び内毒素誘導性の観点から、
分離される蛋白質がIL-1と同じであるように考えられた。RAW264.7細胞により精
製する多量のカシェクチンは、しかしこれがそうではないことを示唆するもので
あった。特に、カシェクチンを引き出すために使用される条件下でロイコサイト
活性化因子(LAF)活性により測定されるように、細胞はごく僅かのIL-1しか生成しな
いことがわかったからである。精製カシェクチン試料は、組換型IL-1が10^-11Ｍで検出されるような条件下で
、１mMまでの広い範囲の濃度にわたってアッセイされた時にLAF活性が欠けてい
た。更に、高度に精製された組換型IL-1のマイクロモル濃度のものは、レセプタ
結合について放射線ヨウ素化カシェクチンに匹敵するものではなかった。従って
カシェクチンはIL-1から区別されるように見える。議論以上の実験において、精製蛋白質がマクロファージ誘導メディエータから分離
され、これは単一の分子量がSDSゲル上で17,000であり、等電点が4.7であること
がわかった。非変質状態で、精製蛋白質は明らかに二量体として存在した。１Ｕのバイオ活性は分離モノマーの^〜２×10^-15モルに対応する。従ってモジ
ュレータ物質であるカシェクチンの２pH溶液は叙上のバイオアッセイ法により容易に検出可能
である。特異活性のこの推定は最少にしなければならない。なぜなら未知の量の
蛋白質が精製中生物学的に不活性になるかもしれなかったからである。カシェクチンの分離はネズミマクロファージ細胞系RAW264.7の使用によって容
易になり、この細胞は分析及び精製のための蛋白質の大量生産を可能にするもの
であった。この細胞は均質であることに加え、内毒素刺激中血清を含まない培地
中に保持することができた。RAW264.7細胞系は、アベルソン白血病ビールスによ
るマウス腹腔細胞の変成により生産することができた。この細胞はマクロファー
ジと形態学的及び機能的に類似する。この細胞はIgGの補体及びFc断片のための
レセプタを有し、食作用中性赤，オプソニンRBC，ラテックスビーズを受け入れ
ることができる。RAW264.7細胞によりつくられるカシェクチン活性と、チオグリ
コレート−引き出し腹腔マクロファージによる活性との間の著しい類似性については、既に実証されている。 LPS-刺激を受けたRAW264.7細胞もしくは刺激を受けなかった細胞に由来する培
地のSDS-PAGE分析の結果は、カシェクチンが内毒素誘導型の分泌性蛋白質の一種
であることがわかった。これは刺激を受けたRAW264.7細胞から分泌される蛋白質
全量の１−５％を構成し、SDSゲル上で、明瞭な17,000の分子量帯域として見え
る。刺激を受けなかった細胞からの培地は完全にカシェクチンバイオ活性及び17
,000の分子量帯域が欠けている。精製カシェクチンの特異活性の見積りに基ずき
、17,000分子量の蛋白質が、調製細胞培地に存在するバイオ活性の全部でなくと
も殆どの理由になっているように見える。他のモノカイン（例えばインターフェ
ロン，グルココーチコイド−桔抗因子、或いはその他マクロファージによりつく
られるバイオ活性）に対するモジュレータ物質の関係は十分に検定されていない
が、以上に提示したバイオ活性データから、モジュレータ物質であるカシェクチ
ンが、IL-1 とはその分子量及び等電点における類似性にもかかわらず相違している。ラベルされたカシェクチンを用いて、カシェクチンに対する特異レセプタの存
在が分化3T3-L1細胞及び前脂肪細胞、C2筋肉細胞，マウス肝臓細胞膜で実証され
た。一方、レセプタは、マウス赤血球及びリンパ球には検出されなかった。3T3-
L1細胞及びC2細胞のレセプタ濃度は細胞あたり^〜10⁴であった。Ka，レセプタ瀕
度、はカシェクチン濃度の函数として示すことができた。3T3-L1細胞中のレセプ
タ瀕度が僅かに５％（２×10^-11Ｍについて得られた）で、LPLの70−80％抑制を
得るために十分である。この型の関係は、多くの他のホルモンレセプター結合系
で観察された。マクロファージは特徴的な内分泌細胞でないけれども、これはモノカインであ
るカシェクチンをつくりだすことができ、これは古典的な意味ではホルモンと記
載されている。何故ならこれは細胞の特定の群、及び影響により、高親和性レセプタを通じ、他の細胞型の挙動によりつくられるものであるからである。
そのため、これは細網内皮組織細胞の内分泌の一つの例を呈示する。筋肉，肝臓
及び脂肪性組織がカシェクタのレセプタを有する、という事実から、広範囲の生
物学的応答が考えられる。以上の結果は、カシェクチンが、急激な感染に応答して哺乳動物がそのエネル
ギーを、増大する代謝のために動員するのに貢献する役割をも示唆するものであ
る。寄生虫感染の場合のように慢性的な場合、カシェクチンは、最終的に宿主の
悪液質状態を和らげる蛋白質及びリピドの異化作用に貢献する。上述実験後に行なわれたその他の研究は、モジュレータ物質の特定構造を解明
するものである。ボイトラーほかによっても報告されるこれらの研究は以下の実
施例IIに記載される。実施例II RAW264.7（マウスマクロファージュ）から精製された時には、カシェクチン
はpHが4.7 でありサブユニット寸法は17kdであり、非共有結合マルチマー（multimer）を生
成することを示していた。カシェクチンのレセプタ（受容体）は非腫瘍性培養細
胞であり正常なマウス肝臓膜であることが確められた。本実施例において、高収率の精製法を採用した研究の結果、マウスカシェクチ
ンの構造がより詳しく解明された。高度の相同性がマウスカシェクチンのＮ−末
端連鎖と、最近ヒト腫瘍壊死因子(TNF)について決定され、ペニカ，Ｄ．，ほか
によりNATURE，312号：724-729ページ，1984年，及びＴ．シライほかによりNATU
RE，313号，803−806ページ，1985年に報告されているＮ−末端連鎖との間にあ
ることがわかった。精製カシェクチンはまた試験管内において効力あるTNF活性
を有している。このような研究の手順及び結果を以下に示す。材料及び方法カシェクチンパイオ活性(LPL抑圧)は、既に述べたような3T3−L1細胞を用いて
アッセイされた。TNF活性はアクチノマイシンＤ処理Ｌ-929細胞を用いて標準細胞もアッセ
イ法により測定された。リポポリサッカライド刺激RAW264.7細胞に由来する粗カシェクチンの50倍濃縮
液が、実施例Ｉにおいて記載されたような撹拌細胞中のPM-10膜（アミコン社，
マサチューセッツ州ダンバー）を用いて調製された、標本を超濾過細胞から除去
する前に、オクチルグルコシド（シグマ社，ミズーリ州セントルイス）が１％(w
/v)の濃縮液に添加された。非イオン性遅延剤の添加は、次の処理において高回
収率を達成するためには必須である。標本は0.22μフィルターを通過し、モノＱ（高性能陰イオン交換）コラム（FP
LC；ファーマシア社，スウェーデン国ウプサラ）に適用された。全蛋白質のほぼ
60％がコラムを直接的に通過した。カシェクチンは、pH7.8の0.38Mのトリ塩素の
濃厚液中で鋭いピークとして溶離した（第７図）。ほぼ80％のホルマンが三つの
分画として回収された。モノＱ（FPLC陰イオン交換）クロマトグラフィー：オクチルグルコシドを分散
剤として含有する濃縮粗RAW267.4培地がコラムに適用された。カシェクチンは、
0.3M乃至0.5Mトリ−Cl（シグマケミカル社，ミズーリ州セントルイス）勾配を
使用して、流速0.33ml／分、34分間にわたって溶出させた。光学的密度(280mm)
は実線により表示される。点線は溶出に使用されるトリ−Cl緩衝液のモル濃度で
ある。網状線（クロスハッチ）或いはカシェクチンバイオ活性の分布を示し、線
で示されている（夫々の点はそれぞれのバイアアッセイの結果を示す）。差込み
図：銀痕跡SDSポリアクリルアミド勾配ゲル（10％〜15％アクリルアミド）は粗
物質の分離と連続するコラム分画，レーンあたり１μｌを示す）。分子量マーカ
ーは一番左のレーンに示されている。矢印はカシェクチン（分子量＝17kd）に対
応する帯域を示す。全蛋白質のほぼ60％は非保持分画（図示せず）として溶出した。カシェクチンバイオ活性のピークは0.38Mトリ−Clの濃度で溶
出する。もっとも高い活性を有する三つの分画は更に精製するためにプールした
。スーパーローズ12（FPLCゲル濾過）クロマトグラフィ：モノＱ分画化からのプ
ールした分画を凍結乾燥し、蒸溜水に再溶解し、コラムに適用した。クロマトグ
ラフィは流量0.3ml／分で、0.1M酢酸アンモニウム中で実施した。0.2mlの標本量
が夫々の分離に使用された。実線は280mmにおけるODを示す。網状線は、バイオ活性測定により検定される
カシェクチンの存在を示す。矢印は、スーパーローズ塔に適用される分子量マー
カーの溶出域を示す。挿入図：SDSポリアクリルアミド勾配ゲル（10〜15％アク
リルアミド）は、スーパーローズ12ゲル濾過により得られる連続する分画（レー
ンあたり１μｌ部分）の電気泳動輪郭を示すOL及びＰは標準分子量；Ｑはプール
されたモノＱ分画（スーパーローズ12分離の出発材料）。これら分画はプールされ、凍結乾燥され、0.4mlの蒸溜水中で再溶解された。
標本を次に高性能ゲル濾過クロマトグラフィ（スーパーローズ12；ファーマシア
社製）処理した（第８図）カシェクチンは、五重構造に一致する87kdの分子量に対応した位置に常に溶出
した。分子は非イオン系遅延剤の存在下に容易に解離する。五重構造がバイオ活
性に必須のものであるかどうかは明らかではない。カシェクチンピークの痕跡端は95％以上純粋であると考えられ、最初のメディ
エータ物質（中間物質）を調製するために使用される旧来の精製法により製造さ
れる均質溶液と同様にほぼ10⁷Ｕのカシェクチンバイオ活性／mg蛋白質を含有し
ていた。TNF活性はこの試料によりアッセイされた。ほぼ1.2×10⁷Ｕ／mgの蛋白
質が精製標本中に測定され、粗物質の標本中の3.7×10⁴Ｕ／mg蛋白質と比較され
た。精製ヒトTNFの特異活性は2.9×10⁷Ｕ／mg蛋白質であると報告されている。アミノ酸組成物とその連鎖の決定に使用されるための、残ったカシェクチンに
富むスーパーローズ12分画は、パン，ｙ−C.EほかによりJ.CHROMATOG.297号；13
-19ページ，1984年に既に記載されているＣ８コラム（スペルコ社，ペンシルバ
ニア州ベラフォンテ）を使用して、逆相クロマトグラフィにより更に精製された
。カシェクチンは、30-40％アクリロニトリルの濃度で溶出した。40pモルの高度
に精製された蛋白質を６ＮのＨClで加水分解し、組成分析に使用した。200pモル
を連鎖に使用したウォーターズ社（マサチューセッツ州ミルフォード）の高性能
液体クロマトグラフィ（HPLC）系、及びアプライドバイオシステムズ社（カリ
フォルニア州フォースター市）のマイクロシークェンシング装置，470A型，がこ
れらの手順に採用された。マウスカシェクチンのアミノ酸組成物が第II表に、ヒトTNFの組成物(DNA連鎖
により決定)と比較されており、後者はペニカほか（既述）により報告されているものである。強い類似性が一見して明らかである。両蛋白
質はなかんずく酸性及び疎水性である。スレオニン(thr)，バリン(val)，アラニ
ン(ala)，ヒスチジン(his)，アルギニン(arg)、及びシステイン(cys)の残基の同
じ数値が両者に見られる。 * かっこ内の数はヒトTHFについてペニカほか（既述）により決定された組成物
にかかわる。また、“ND”は、決定されなかった数である。同様に、マウスカシェクチンのＮ−末端アミノ酸連鎖（一番上の行）の性質は
、ヒトTNFの対応する連鎖（一番下の行）と比較的一致していることがわかった
。あいまいな残基は“？”で示される。一致している残基を下線で示してある。マウスカシェクチンＨ₂Ｎ−leu-arg-ser-ser-ser-glu-asn-ser-ser-as p-pro-pro-val-ala-？− ヒトTNF マウスカシェクチン val-val-ala-asn... ヒトTNF val-val-ala-asn... 上記連鎖分析によれば、マウスカシェクチンとヒトTNFのＮ−末端連鎖との間
に強い相同関係がある。最初の19の残基のうち５個を除き一致している。Ｌ−92
9細胞に対する精製カシェクチンの細胞溶解効果と共に上記データを考えてみると、単一の蛋白質種がカシ
ェクチンと、ネズミのマクロファージ調製培地のTNF活性の原因となっていると
考えられる。更にこの蛋白質は高度に保存されているようである。上述研究の結果からまた既に先に述べたように、モジュレータの完全な同定が
行われ、上記の分画連鎖及び第23図に示す完全な連鎖との比較によって類似点と
相違点の双方が明らかになった。このもっとも新しい情報のより詳しい分析は、
従って現在進行中である。カシェクチンは、培養3T3-L1脂肪細胞及びC2筋管の１細胞あたりほぼ10,000コ
ピーで存在する特異レセプタに結合されることが既に実証された。ホルモン−レ
セプタ相互作用のKaは、スキャッチャード（Scatchud）分析により３×10⁹Ｍ^-1
であることがわかった。正常なマウス肝臓膜もまたカシェクチンを有効に結合す
る。酵素活性の低下はホルモンの低下後直ちに観察され、これは明らかにLPLバ
イオ合成の特異抑制の結果である。正味の蛋白質合成及び細胞不安定性は影響を受けない。既に論じたように、本モジュレータ物質は、このモジュレータ物質を特徴ずけ
る明らかな特性を複合して形成する多くの活性をも有している。このモジュレー
タ物質活性のいくつかは、公知物質と相違させる。特にこのモジュレータ物質は、同化酵素リポプロティンリバーゼを実質的に完
全に抑制し、この抑制は既に或いは後に記載するように濃度によって変化する。
モジュレータはまた脂肪細胞の分化を阻止し、グルコースの取り込みを増大して
筋肉細胞に運ぶ。後者の活性はプリカーサであるメディエータ物質（中間物質）
にみられるが、インターロイキン１には欠けている。これと対照的に、モジュレータ物質はそのメディエータプレカーサに対し、脂
肪酸シンセターゼ或いはアセチルCo酵素Ａカルボキシラーゼを抑制する能力が欠
けているか、或いはホルモン感性リパーゼの活性を増大する能力が欠けていることによって区別される。モジュレータ物質とそのプリカーサとはインター
ロイキン１に対しロイコサイト活性化が欠けていること、またマウスに発熱を引
き起す能力もしくは蛋白質劣化を生じさせる能力が欠けていることによって区別
される。上述特徴のほか、モジュレータ物質はまたマウスの体重減を生じさせる能力も
有し、また宿主を内毒素によるショックから保護するためのそれ自体の抗体を生
成する能力をもつことを実証する。これら活性のすべては以下の実施例で説明さ
れる。実施例III 既に述べたように先に発明したメディエータ物質及びこのモジュレータ物質で
あるカシェクチンの双方共、酵素リポプロティンリパーゼ(LPL)の活性を抑圧す
る。この能力は、特定の培養された脂肪細胞（3T3-L1細胞）について行なわれた
実験で見出され、この実験においてこのような抑制は実質的に完全であることが
確かめられた。特に95％より高い抑制が報告された。これと対照的に、インターロイキン１と同定された物質はリポプロティンリパ
ーゼの活性をある程度抑制したことがわかったが、しかしこの効果は限定された
ものであり、投与されるインターロイキン１の濃度に依存しないものであった。
ボイターほか（既述）に述べられているように、これと対照的にカシェクチン及
びメディエータ物質は、LPL活性を実質的に完全に抑制する能力をもっているこ
とがわかった。これらの観察を実証するために、ある量の組換型インターロイキ
ン１（ｒIL-1）及び精製カシェクチンを用いていくつかの実験を行い、この仮説
を確認した。行った実験手順は以下の通りである。材料及び方法細胞培養：3T3-L1細胞を成長させて24-ウェルリンプロプレートに合流させ、
分化させて、マホーニー J.R.ジュニアほかによりJ.IMMUNOL.134号，1673ペー
ジ，1985年，に記載されているように脂肪細胞を生成するようにした。簡単にいうと、細胞を、10％雌牛血
清を含むダルベコ修正イーグル培地(DME)に10⁵／mlの密度でプレート処理した。
この培地を一日おきに代えた。培養体が合流に達した一週間後、10％ウシ胎児血
清，10μｇ／mlウシインシュリン，0.05Mメチルイソブチルキザンチン，及び1.0
μＭデキサメタゾンを含むDMEに48時間さらした。その後、これを、10％FBS及び
50ng／6mlウシインシュリンを含むDMEに保持し、一日おきに代えた。DMEはギブ
コ社（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入し雌牛血清と定義されてお
り、特徴的なウシ胎児血清はハイクローンラボラトリーズ（ユタ州ローガン）
から購入した。細胞は分化して４日後にレセプタアッセイに使用されるか、分化
して１週間後にLPL抑制のバイオアッセイに使用された。レセプタアッセイ：レセプタにかかわる研究は、ボイトラーほか（既述）に記
載されるような、カシェクチンレセプタの特徴化に使用したと同じ放射線ラベルをした物質を使用して行なわれた。カシェクチンレセプタア
ッセイについてはホイテルほかによりJ.EXP.MED.,161号，984-995ページ，1985
年に詳しく記載されており、ここでは、放射線ラベルをしたカシェクチンをその
特異レセプタから置き代えるためのIL-1の能力を試験するために使用された。簡
単には、上述のように調製された3T3-L1細胞単層に、10％FBS及びpH7.4の50mMヘ
ープス、及びほぼ10-11μＭの放射線ラベルをしたカシェクチントレーサを含むD
MEを重ねた。ラベルしていないIL-1，もしくはカシェクチン（積極比較例）の溶
液が添加された。夫々の系の最終容積は0.2mlであった。反応は０℃で４日間、
揺動シェーカー上で行なわれた。この培養の終りに、細胞単層を３回同じヘープ
ス緩衝培地で洗浄し、1.0ml，1MのNaOHで溶解し、パッカードガンマカウンター
で、標準誤差が＜５％となるために十分な時間カウントした。カシェクチン及びIL-1によるLPL抑圧のバイオアッセイ：24ウェルのリングロプレート中で先述のように調製した3T3-L1細胞
の上層に、10％FBS及び50ng／mlインシュリンを補充したDMEの正確に1.0mlを導
入した。カシェクチン又は組換えIL-1の精製試料を夫々のウェルに添加し、完全
に混合した。いずれのメディエータにもさらされていない比較細胞単層を、すべ
てのアッセイに含めるようにした。 LPLアッセイ：以上のように処理した細胞単層から培地を吸引した。10％FBS，
50ng／mlインシュリン，及び10U／mlヘパリンを含むDMEの0.5mlを次に夫々単層
に添加した。１時間後、ニルソン−エール及びショッツの方法に従って75μｌの
培地を、LPL活性についてアッセイした。LPL抑圧パーセント（メディエータのい
ずれかにさらされない比較単層に関して）は、ボィトラーほか（既述）に記載さ
れているようにして計算された。組換えIL-1：これは、ピーターロメディコ博士（ホフマンラロッシュ社，
分子遺伝学部）の御好意によるものである。モノカイン（ほぼ100μＭ濃度）を5MグアニジンＨC
lの溶液とした。グアニジンＨClはサブミリモル濃度に希釈された時には、叙上
の系におけるLPLに影響を及ぼさなかった。 IL-1に対する抗血清：山羊で得られたネズミIL-1に対するこの抗血清はスチー
ブンミズル教授の御好意により得られた。 IL-1の中性化：50mMヘーペス，pH7.4，及び10％FBSを含有するDMEに抗血清を
既に述べた時間にわたって希釈した。精製組換えIL-1を50pMの最終濃度液中に添
加した。氷上で１時間後、溶液の15μｌ分を細胞単層に添加し、最終IL-1濃度を
0.75pMとした。LPL抑制のアッセイは、16時間の培養後通常のように行われた。結果精製された組換えIL-1によるLPL活性の抑制：組換えIL-1を3T3-L1細胞に添加
することによって、LPL活性は部分的に抑制された。第９図に示すように、IL-1
は、フェムト(Fempt)モル範囲の濃度でLPL活性を抑制することができた。かくして叙上の系においてほぼ10^-
¹⁸モルのホルモンを検出することができた。しかしながらホルモンのμＭの濃度
ではこの条件で50％以上はLPLを減ずることができなかったが、90乃至95％の抑
制は、カシェクチンのnM濃度で達成することができた。3T3-L1細胞を時々分けて
加えることにより、ｒIL-1に対しより高い感応性が得られ、一般的には50％抑制
が可能な最大限であり、いずれの場合でも抑制効果が85％を越えることはなかっ
た。カシェクチンとIL-1の双方が培養3T3-L1細胞に添加された時、これらの効果は
補足的であり、相互に依存関係はないように見えた。例えば50％抑制（最大感応
性）を得るために十分な量のIL-1を、50％抑制を得るために十分な量のカシェク
チンと共に添加したところ、ほぼ75％の抑制が観察された。相乗効果は観察され
なかった。特異ヤギαIL-1血清を使用する組換えIL-1によるLPL抑制の阻害：0.75pMのIL-
1を培養3T 3-L1細胞に添加した時、80％のLPL抑制が得られた（この実験における最大感応
）。このｒIL-1を特異中和抗血清と予備培養することにより、この反応は完全に
なくなった。減少量の血清を添加することにより、中間レベルの抑制が得られた
（第10図）。中和に使用した濃度範囲では、LPL表徴に血清の直接的な影響は見
られなかった（データは示されていない）。従って使用されるｒIL-1試料による
LPL抑制は、確かにモノカインの存在に帰因するものであり、汚染細菌蛋白質、
或いはIL-1の分離に採用される反応剤によるものでないように考えられる。 3T3-L1レセプタ位置のための放射線ラベルしたカシェクチンに匹敵するIL-1の
欠如：既に述べたように、放射線ラベルしたカシェクチンは、3T3-L1細胞のみな
らず他の組織にも存在する高親和性レセプタ（ボイトラーほか、既述）に対して
結合することができ、またnM濃度のラベルしないホルモンにより容易に置き代え
られる。0.1μＭ及び1.0μＭ濃度の精製組換えIL-1の添加により、この放射線レセプタアッセイにおいては、トレーサカシェクチンの
著しい置き代えは生じなかった（第11図）。従ってIL-1は、3T3-L1におけるLPL
の抑制を引出す一方、カシェクチンレセプタに結することなく抑制することがで
きると考えられる。しかしながら、インターロイキン１によるLPL抑制のパターンは、アジポサイ
トにおけるLPLの95％以上の抑制が共に可能な本発明のメディエータ或いはカシ
ェクチンのパターンと異なっている。カシェクチンによるLPLの抑制及びIL-1に
よるLPLの抑制は補足的であり依存関係にない；IL-1の最大抑制濃度の存在下で
も、カシェクチンの添加により更に抑制が達成される。 IL-2との比較：ディナレロ（既述）が論じているように、インターロイキン１
と同定された因子は、ある免疫調整活性効果を有する他の因子（そのあるものは
インターロイキン２と確認されている）と異なっている。以前はＴ細胞成長因子として知られているインターロイキン２はＴ細胞によりつくられ、リンパ
球に対し直接成長信号を送る活性を有する。IL-2の製造は、また、ある場合には
生体内でIL-1により制御される。LPL抑制に関し、IL-2がIL-1と同じ活性を有す
るかどうかを確認することは、従って興味あることである。従ってボイトラーほかはJ.EXP.MED.,161号，984-995ページにおいてIL-2のLPL
抑制活性を調べ、これが存在しないことを知った。明らかにIL-2はこの特徴をIL
-1と共有しておらず、従って同様に、粗メディエータ物質と、その分離物である
本発明のモジュレータ物質、即ちカシェクチンとの双方と区別することができる
。要約すると、メディエータ物質、その分離カシェクチン及びIL-1のすべてはLP
Lに対して抑制効果を有するが、メディエータ物質とカシェクチンとによる効果
はIL-1のそれと構造的かつ機能的に異なり、このことはこれら物質自体が異なっ
ていることを示唆している。更にこれら三種の物質はIL-2と異なっており、そのため別々の特徴が試験される物質それぞ
れについて考えられる。実施例IV 米国特許出願第414,098号において、先述メディエータ物質が酵素アセチルCoA
カルボキシラーゼ及び脂肪酸シンテターゼに及ぼす効果が研究され、メディエー
タ物質は両酵素の合成に干渉することによってこれらを阻害することが確められ
た。この実験では、前記第414,098号の実施例IIのアッセイ系がとりあげられ、
インターロイキン１とカシェクチンのそれぞれについて適用が行われた。精製IL
-1及びカシェクチンがボイトラー及びセラミ（既述）に開示されているように調
製され、調製培地で得られた内毒素の存在下に培養されたマウス腹腔滲出液細胞
内に使用された。かくして、3T3-L1細胞はIL-1とカシェクチンのそれぞれにさらされ、計24時間
培養され、アセチルCoAカルボキシラーゼと脂肪酸シンテターゼ活性の測定が３時間，６時間及び20時間後のそれぞれに行なわれた。いずれ
の場合にも、夫々の因子で培養した細胞の、ジギトニン解放シトソル分画はどち
らの酵素の活性も減少させることはなく、従ってIL-1もモジュレータ物質である
カシェクチンも同化酵素であるアセチルCoAカルボキシラーゼ及び／もしくは脂
肪酸シンテターゼに抑制効果を及ぼすことはないことがわかった。従ってこのよ
うにしてこのモジュレータ物質は、明らかに粗メディエータと区別されるが、イ
ンターロイキン１と類似性を有していることがわかる。実施例Ｖこの実施例は、“慢性疾病における悪液質のネズミモデル：3T3-L1脂肪性線維
芽細胞における内毒素誘導マクロファージ分泌蛋白質賦活異化作用”なる論文に
未公開事実としてまとめられており、本出願人及び共同研究者の一人によって行
なわれた研究から抜粋したものである。この研究において、脂肪細胞新陳代謝阻
害に及ぼす粗メディエータ物質の役割は更に研究され、特にメディエータがトリアシル
グリセロールの細胞による解放に基づく異化活性に及ぼす効果に焦点があてられ
た。この脂肪分解活性は直接に測定され、ホルモン感応リパーゼとcAMPの活性が
参照され、その結果、メディエータは脂肪分解及びホルモン感応リパーゼの活性
の役割及び範囲に著しい効果を及ぼすこと、しかしcAMPレベルと活性は実際上影
響を受けないことがわかった。この研究で採用された手順は以下の通りである。材料及び種々の方法種々の反応剤・材料及び手順が、この分野において従前報告されている作業に
利用されているようにして、採用された。かくしてイソプロテレノール，ACTH，
〔32P〕Pi，LPL及びマウス腹腔マクロファージが慣用入手源から入手されるか、
調製された。cAMPの放射線免疫アッセイが、ワトキンほかによりJ.BIOL.CHEM．
，257号，14719号，1982年，に報告されているようにして実施された。 3T3-L1細胞培養：3T3-L1プレアジポサイトがペカラほかによりPRO.NATL.ACAD.
Scl.USA,80号，2743ページ，1983年，に記載されているようにして、10％ウシ胎
児血清を含むダルベコ修正イーグル培地中で培養された。培地に、0.5mMイソブ
チル−メチルキサンチン，１μＭデキサメタゾン；及び培地１mlあたりインシュ
リン10μｇを補充することにより、合流後２日で分化が生じた。48時間後この培
地を除去し、10％ウシ胎児血清及びインシュリンのみを補充した培地と取り替え
た。４日後細胞の90％以上がアジポサイト表現型を示した時、培地を代え、細胞
をインシュリンなしに14日間保持した。脂肪分解：脂肪分解は、ピンターほかにより、ARCH.BIOCHEM.BIOPHS.121号，4
04ページ，1961年，に示すようにして、グリセロール解放について測定した。細
胞はpH7.4の２％ウシ血清アルブミン（分画Ｖ）と共にクレブスリンガーりん酸
塩緩衝液で洗浄し、2.0mlの同じ培地中で１乃至２時間37℃で培養した。培養は培地を除去することによって終アレ，
これを10％トリクロロ酢酸で調整した。この混合物を10分間2,500ｒpmで遠心分
離し、トリクロロ酢酸をエーテルで抽出した後、結合酵素系を用いて上澄み液の
グリセロール含量を測定した：試料(0.167ml)を、0.14mMのATP，1.2mMのフォス
フェノールピルビン酸塩，0.20mMのNADH，1.5単位のグリセロキナーゼ（カンジ
ダマイコデルマ）、1.35単位のキナーゼピルビン酸（ウサギ筋肉）、及び2.8
単位のラクターゼデヒドロゲナーゼ（ウシ心臓）を入れたキャベットに添加した
。試料中のグリセロールの量は酸化NADHに比例する。グリセロールの解放は、10
⁶細胞あたりもしくはmg蛋白質あたりの単位時間に解放される全ｎモルであると
報告されている。上記条件下で、グリセロールの解放は、少なくとも３時間一定
であった。グリセロール解放に及ぼすメディエータ或いはイソプロテレノールの効果：内
毒素処理マウス腹腔マクロファージュからの調整された培地(400μｌ)が、種々の時間間隔に
わたって、分化3T3-L1細胞(4.2×10⁶細胞／皿)の培養培地(3.5ml)に添加された
。この量は、15時間後リポプロティンリパーゼの活性を90％抑制するために十分
な量である。培養の終りに培地が除去され、２％BSAを含有するクレブス−リン
ガーりん酸塩緩衝液で細胞単層が洗浄され、グリセロール解放が１乃至２時間監
視された。イソプロテレノールを用いて行った研究において、細胞単層が、２％BSAを含
有するクレブスリンガーりん酸塩緩衝液で２回洗浄され、同じ緩衝液で培養され
た。飽和レベルのイソプロテレノール（３μＭ）が添加され、培養混合物中への
グリセロール解放が１乃至２時間監視された。細胞抽出液の調製及びホルモン感応リパーゼのアッセイ：ホルモン感応リパー
ゼを含有する溶解細胞抽出液が、カワムラほかによりPROC．NATL．ACAD.Sci.USA
,78号，732ページ，1981 年，に記載されているようにして調製された。先ず培地が代えられ、細胞単層が
、ヘパリン（10単位／ml）を含有する培地で60分間培養された。培地を除去し、
細胞単層をpH7.4のダルベコりん酸塩緩衝食塩水で、一度はpH7.4，10mMのトリ−
ＨCl／１mMのEDTA／0.25Ｍのショ糖，で２度洗浄した。細胞を掻き落し、１分間
1000xgで遠心分離した。パックした細胞を10mMのトリ−ＨCl，pH7.4；１mMのEDT
A；及び0.25Ｍのショ糖；の２容中で均質化し、１時間、40,000xgで遠心分離し
た。上澄液をヘパリン−セファローズ親和性コラムに適用して、リポプロティン
リパーゼを吸着するようにした。発出液は、血清の添加により活性化しない脂肪
溶解活性を有し、これはリポプロティンリパーゼが存在しないことを示すもので
ある。抽出液標本(0.07ml)を全量0.1mlの５mMマグネシウムアセテート／0.5mMのATP/
0.01mMのcAMP/1mMのEDTA／25mAのトリＨCl，pH8，に５分間30℃で培養し、リパ
ーゼを賦活化した。アッセイは、0.3mM〔3Ｈ〕−トリオレイン7.5×10⁵cpm/μモル）、50mMのりん酸ナ
トリウム、ウシ血清アルブミン５mg／ml、２mMのEDTA，pH7.0，を含有する基質
混合物(0.7ml)の添加により開始した。30分間の培養後、メタノール，クロロホ
ルム，及びヘプタン（1.41:1.25:1.0からなる抽出混合液の３mlを添加した。ト
リシェート（トリチウムを含有する）オレイン酸を、液／液部分によりエステル
化オレイン酸から分離し、放射能をカワムラほか（既述）が記載しているように
して測定した。結果細胞の脂肪分解に及ぼすメディエータプロティンの効果：以前の実験により、
内毒素又は内毒素処理マクロファージからの調整培地にさらしたマウス精巣上体
脂肪パッドが著しい重量減少を生じることが実証された（Ｍ．カワカミ；ベカラ
，Ｐ．Ｈ．；セラミ，Ａ．，未公開データ）。この観察は、粗メディエータ物質
についてもともと開示された脂質生成抑制に対応する貯蔵トリアシルグリセロールの除去、に至る脂肪分解活性を示している。メディ
エータに15時間さらす間に、グリセロール解放により測定される脂肪分解は漸次
増大し、基準のほぼ150%になった。グリセロール解放の最大活性のために必要な
時間は、膜組織と結合するリポプロティンリパーゼの最大抑制について観察され
る時間に対応する。メディエータに17時間さらした後、溶解細胞抽出液でアッセ
イすると、ホルモン感応リパーゼ活性は以下の第III表に示すように60−70％増
加した。第III表 3T3-L1脂肪性線維芽細胞のホルモン感応リパーゼに及ぼすマクロファージメジ
エータの効果：細胞は分画するように誘導され、実験手順に記載されたように保
持された。ホルモン感応リパーゼを含有する溶解可能分画が対照細胞、及び内毒
素処理マウス腹腔マクロファージからの調整培地に17時間さらされた細胞、から
得られた。抽出液は直接にアッセイされるか、或いは、実験手順に記載されたようにアッセイする前に、cAMP及びATPの存在下に５分間培
養された。数値は、４種の実験の平均±標準偏差である。 cAMP及びATP存在下で対照抽出液を培養した結果、リパーゼ活性が２倍になっ
た。しかしメディエータ処理細胞から調整した抽出液の培養の場合には、このよ
うな刺激は観察されなかった。同じ実験において、飽和レベルのβ−アドレナリン作用拮抗イソプロテレノー
ル（３μＭ）（ワトキンスほか、J.BIOL．CHEM.,257号，14719ページ，1982年）
にさらされた細胞は、310ｎモル／時間／mg蛋白質のグリセロール解放最大値を
示した。これは、以下の第IV表に示す315nモル／時間／mg蛋白質のメディエータ
処理細胞の最大値に較べられる。第IV表 3T3-L1脂肪性線維芽細胞からのグリセロール解放最大率：3T3-L1細胞をメディ
エータに対し17時間、もしくはイソプロテレノールに対し１時間さらし、グリセ
ロール解放を、実験手順に記載したようにして測定した。数値は４種の実験の平
均値±標準偏差である。比較として、開示されたように調整された精製カシェクチン、及びIL-1がそれ
ぞれ、内毒素処理マウス腹腔マクロファージに由来する培地について記載された
のと同じ条件で分化させた3T3-L1細胞で培養された。その後、ホルモン感応リパ
ーゼを含有する溶解分画が同様の方法で調整され、直接にアッセイされた。その
結果、ｎモル／時間／mg蛋白質で表わされたホルモン感応リバーゼ活性は上記第IV表の対照細胞のそれと同じであった。以上のデータから、粗メディエータ物質は脂肪分解及びホルモン感応リパーゼ
の活性を刺激するように見える一方、この活性は、本発明のモジュレータ物質、
もしくは公知の因子として固定されIL-1として表わされている物質のいずれによ
っても実証されていない、と結論ずけることができる。実施例VI この実施例は、トルティほか（既述）の研究に由来するものであって、アジポ
サイトにおける脂肪生成酵素活性を抑制する機能を果すメディエータ物質の機構
を明らかにするために行われた。安定した脂肪生成細胞系(TA1)の内毒素刺激マ
クロファージ培養における調整培地の効果は、チャプマンほかによりJ.BIOL.CHE
M.259号，15548-15555ページ，1984年に記載されているように、脂肪細胞分化の
間圧出が増加する遺伝子のcDNAクローンを用いて検査された。メディエータは、脂肪誘導遺伝子の発生圧出を逆方向にかつ特異的に阻害し、この
ことは、これら遺伝子の転写活性化を阻害することにより生ずるものであること
がわかった。更に、成熟脂肪細胞がメディエータにさらされる時には、脂肪生成
中に誘発されたこれら遺伝子のmRNAは減少し、急速に予備分化レベルに近ずく。
TA1細胞は、チャプマンほか（既述）が記載しているように、組織培養体単層に
合流後ほぼ３日で典型的な脂肪細胞形態を発生させる。分化の形態学的証拠と並
行して、分化後その圧出が明らかであるいくつかの遺伝子が同定された（クロー
ン１，10，28，47）。これら脂肪誘導mRNAは、転写活性のため大部分が或いはす
べてが圧出される。これら脂肪遺伝子の座標誘導に及ぼすメディエータの影響を
測定するために、メディエータを予備合流TA1細胞、及び合流に達した日の後の
細胞に添加した。これらから分離された全RNA及び、合流６日後の比較細胞を、
その圧出が脂肪細胞中に観察されるが前脂肪細胞中には観察されないような遺伝子の放射線ラベルcDMAでプローブした。第12図に示す
ように、メディエータ処理によって脂肪誘導mRNAの蓄積が阻止される。リピド蓄
積もまた、メディエータ処理によって完全に阻止される。メディエータによって
処理されるTA1脂肪細胞培養体は、スダンIV痕跡による中性リピドが出現するこ
となく（データは示されていない）、23日間にもわたって保持された。しかしな
がら、培地からメディエータを除去すると、脂肪細胞形態が、脂肪生成誘導遺伝
子の発言、即ちクローン１（第13図）のように、復元した。遺伝子発言の抑制はメディエータの一般的な効果ではない；例えば第12図から
明らかなように、β−アクチンmRNAのレベルは影響を受けない。更に、メディエ
ータによる前脂肪細胞培養体の処理は細胞の成長或いは生育力に影響を与えるも
のではない。第12図の実験に似た構成の一連の実験において、細胞の増殖は細胞
数のカウントにより、³Ｈ−チミジン結合により測定された。比較例及びメディエータ処理培養体は、合流点における細胞数の増加及
び³Ｈ−チミジン結合減少によっては区別することができない。トリパンブルー
排除及びクロナール成長アッセイによって測定されるような細胞の成長力もまた
比較例及びメディエータ処理細胞に等しい（データは示されていない）。脂肪特異性mRNA蓄積のメディエータ阻害が転写的に制御されるかどうかを測定
するために、各転写アッセイが行われた。第14図は、クローン１及び28の遺伝子
転写における正常な発生増加がメディエータにより阻害されることを示している
。次いで、同様な結果がグリセロフォスフェートデヒドロゲナーゼ（B.スピーグ
ルマンの行為による）及びクローン47からのcDNAについて得られた（データは示
されていない）。補足的な実験におけるメディエータ添加後GPDのmRNAレペル減
少は、GPDの酵素活性の減少と平行している（データは示されていない）。しか
しながらメディエータ処理は、転写活性の非特異性減少の原因となるものではない：前合流細胞，分化脂肪細胞，及び分化中メ
ディエータで処理した細胞におけるβ−アクチンの転写率は等しい（第１４図）
。成熟した哺乳動物においては、脂肪細胞は、殆ど或いはまったく増殖しない。
かくしてメディエータが前合流TA1細胞に添加された時、分化中脂肪遺伝子発言
の抑制は、これら脂肪遺伝子が発育中座標的にいかに調整されるかを理解するた
めには有用であるけれども、哺乳類悪液質の現実的なモデルをおそらく表現する
ものではない。生体内状況をモデル化するためこれら細胞をより忠実に利用する
よう、成熟脂肪細胞培養体がつくられこの細胞にメディエータが添加された。メ
ディエータに４乃至６日さらした後、多くの細胞はその中性リピドを失った。典
型的な実験において、細胞の70−80％は、メディエータがこれら培養体に最初に
添加された時大型リピド滴を有している；６日後、細胞のほぼ10％は同定可能ト
リグリセリドをスーダンIII 痕跡上に有する。第15図に示すように、脂肪特異性RNAの変質はリピド可動化よ
りも迅速に生ずる。成熟TA1脂肪細胞にメディエータ添加後12乃至24時間で、こ
のようなRNAレベルは90％以上減少することが観察された。かくして遺伝子発言
の劇的かつ座標的な変質は、リピドメディエータ誘導可動化に第一の重要性とな
っているようにみえる。これらのデータを集めた特定手順を示す図の説明は以下の通りである。第12図：10T/2C18細胞の５−アザシチジン処理に由来する安定した脂肪生成細
胞系であるTA1細胞が、10％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したイーグルベーザ
ル培地で生長した。10^-6Ｍメキサメタゾンが、合流後最初の３日間培地中に存在
し、合流後最初の６日間５μg/mlウシインシュリンが存在した。マクロファージ
細胞系RAW264からの調整培地を、10μの濃度で合流２日前に予備脂肪細胞培養体
にまず添加した。これは培養脂肪細胞のリポプロティンリパーゼ活性の90％を抑制した。細胞にはホルモンを０日（合流日），３日目に再補充し
た。細胞は６日目に回収した。全RNAが、チャーグインほかによりBIOCHEMISTRY
，18号，5294−5299ページ，1979年記載されている方法で分離し、点ブロット装
置(BRL)中のニトロセルローズに適用した。ニックは、発言が分化TA1脂肪細胞の
みに見られる遺伝子のcDNAクローン（クローン１，10，41及びグリセロフェスフ
ェートデヒドロゲナーゼ）を書き直し、またβ−アクチンcDNAクローン（Ｐ．ガ
ニング及びＬ．ケーデスの行為による）を、チャプマンほか（既述）に記載され
ている交雑条件下でこれらフィルターを探査するために使用した。フィルターを
洗浄し、強化スクリーンを用いて、−70℃でXAR5フィルムに露光した。第13図：第12図について記載されたようにして点ブロットが形成された。メデ
ィエータ（Ｋ）が、示された時間に培地中に存在していた。 RNAは、合流後６，９及び12日目にクローン１のcDNAについて分析された。第14図：転写アッセイが、バニスほかによりPROC.NATL.ACAD.SCl.,USA,81号，
4241−4245ページ，1984年、及びイスラエルとホィットロックによりJ.BIOL.CHE
M.,259号，5400−5402ページ，1984年，に記載され、ナイトほかにより脂肪細胞
について修正されたような方法を使用して行なわれた。培養細胞は４℃に冷却さ
れ、培地が吸引され、りん酸塩緩衝食塩水で洗浄された。１mlの低張性緩衝液（
20mMのトリ／ＨCl，pH8.0;4mMのMgCl₂；６mMのCaCl₂；0.5mMのジラオスレイトー
ル）がプレートに添加された。５分後、１mlの溶解緩衝液（0.6Mのショ糖，0.2%
のNP−40，及び0.5mMのジチオスレィトール）が添加し、細胞を組織培養皿から
掻き落した。ダウンス均質化の後、核が500gのペレット化され、再懸濁緩衝液（
0.25Ｍのショ糖；10mMのトリ／ＨCl，pH8.0；10mMのMgCl；１mMのジチオスレイ
トール）で一度洗浄され、再ペレット化され、次いで50mMのヘープス，pH8.0； 90mMのNH₄Cl；５mMのMgCl；0.5mMのMnCl₂；２mMのジチオスレイトール；0.1mMの
EDTA；それぞれ0.4mMのATP,CTP,GTP；10％グリセロール；及び10μｇ／mlのウシ
血清アルブミン中で再懸濁した。核は2mCi／mlの濃度で32P-UTP(600Ci/mモル，I
CN)と共に、40分間25℃でゆるやかに揺動させながら培養した。 RNAは、スミスほかがCELL，15号，615-626ページ，1978年に記載しておりナイ
トほかにより修正した方法によって核から回収し、交雑させて線状cDNAしとし、
これはニトロセルローズフィルターに適用し、真空オーブン中で、80℃で２時間
焼いた。フィルターの予備交雑及び交雑条件はフリードマンほかにより、CELL，
38号，745-755ページ，1984年に記載されている通りであった。交雑は３日間、4
2℃で、クローン１及び28、及びβ−アクチンとpEMBLプラスシド比較例について
、脂肪cDNAの点に150μｌの容積で、反応混合物あたりほぼ15×10⁶cpmで行った
。第15A図：メジェータ物質の10μｌ/mlが、第12図に記載されたように分化した
６日目脂肪細胞培養体に添加された。全RNAは、メディエータにさらされた後指
定した回数ビスから分離され、点ブロット装置（シュライヒャー及びシュール）
によりニトロセルローズに適用した。フィルターは指定したCDNAで探査され、洗
浄され、ラジオオートグラムが作られ、レポーティングインテグレータにとりつ
けたホーファGS300型濃度計（ヒューレット−パッカード社製）を用いて走査さ
れた。示された点は、細胞のRNAを合計するようにcDNAプローブを用いて適用RNA
の量の差を標準に一致させた。第15B図：これらノーザン分析のため、12μｇの全RNAが最終濃度である2.2Mホ
ルムアルデヒド，30％ホルムアミド，10mMのNaＨ₂PO₄，PH7.0に導入され、56℃
で15分間加熱された。試料は、マニアチスほかにより“分子クローン：実験室手
順”（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー：コールドスプリングハーバーラボラトリ，202-203ページ，1982年）、に記載されているよ
うに2.2Mのホルムアルデヒド、20mMのMOPS，pH7.0，5.0mMの酢酸ナトリウム及び
１mMのEDTA，の最終濃度の1.0％アガローズホルムアルデヒドゲル中で電気泳動
させた。ゲルは蒸留水で３分間洗浄し、10mMのNaPO₄(PH7.4)及び１mMのEDTAで２
回30分間の洗浄を行い、次いでニトロセルローズに移した。挿入部は、クローン
47DNAでプローブした典型的なノーザン分析を示す。以上に述べた実験は、先に発見されたメディエータ物質に対応する内毒素刺激
マクロファージの粗調整培地と、ボイトラーほか（既述）により最近、均質化す
るまで精製されたプロティンカシェクチンの双方を用いて実施された。比較試験
がインターロイキン１（マウス組換えIL-1，ホフマン−ラロシュ社のP.ロメディ
コの行為による）を用いて行われ、IL-1は脂肪細胞分化を抑制しないことがわか
った。かくしてメディエータ物質とこのモジュレータ物質カシェクチンの両方が脂肪細胞分化に抑制的な影響を与える。実施例VII この実験においては、筋肉細胞によるグルコースの取り込み及び新陳代謝の活
性が研究された。侵入刺激に応じて生ずるショックに随判する異化活性を促進す
るのと同じ因子が、同様にショック中に存在する低血糖を招束するグルコースの
消費に影響を及ぼし或いはいくらか原因的な効果を与えていることが推論された
。この仮説を支持するものとして、皮下注射されるメディエータ物質の粗試料は
、内毒素抗性C3H/HeJマウスにおける低血糖の原因となること、また、粗メディ
エータとモジュレータであるカシェクチンの双方が２−デオキシグルコース移動
を増加すること、が観察された。従って粗メディエータ及びこのモジュレータは
、共に、感染に応答する新陳代謝の制御にある役割を果していることが疑われ、
粗メディエータ物質、このモジュレータ，カシェクチン，と共にインターロイキン１を加えて比較研究を行い、L6筋肉細胞におけるグルコースの取り
込み及び移動を測定した。手順及び結果は以下の通りである。材料ウエストファル法により分離したイー・コリ0.127：B8からの内毒素（リポポ
リサッカライド）をディフコラブ社（ミシガン州デトロイト）から購入した。細
胞培養培地及び雌牛血清はギブコラブ社（ニューヨーク州グランドアイランド）
から、またウシ胎児血清はステライルシステムズ社（ユタ州ローガン）から得
た。３−イソブチルメチルキサンチンはアルドリッチケミカル社（ウィスコンシ
ン州ミルウォーキー）から；デキサメタゾン及びCPKアッセイキットはシグマ
ケミカル社（ミズーリ州セントルイス）から；インシュリンはエリリリー社（
インディアナ州インディアナポリス）；グリセロールトリ〔９，10(n)-³Ｈ〕
オレイン酸，Ｕ−14Ｃ−グルコース及び２−デオキシ−Ｄ〔１−³Ｈ〕グルコー
スはアメルシャム社（イリノイ州アーリントンハイツ）、２−メチル（3H）イソブチル酸はニューイングラン
ドニュークリア社（マサチューセッツ州ボストン）；トリオレインは又チェッ
クプレップ社（ミネソタ州エリシアン）；アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチド及びラクテートデヒドロゲナーゼはベーリンガーマンハイム社（インディ
アナ州インディアナポリス）から得た。方法 3T3-L1細胞培養：3T3-L1前脂肪細胞は、10％ウシ胎児血清をダルベコ修正イー
グル培地(DME培地)中で、既に記載したように培養した。脂肪細胞表現型に至る
分化が誘導された。合流２日後、培地し、0.5mMのイソブチル−メチルキサンチ
ン，１μＭデキサメタゾン及びmlあたり10μｇのインシュリンが補充された。48
時間後、イソブチル−メチルキサンチン，デキサメタゾン及びインシュリンを含
有するこの培地が除去され、その代りにインシュリンをmlあたり50ngの減少濃度
で含有する培地が使用された。 L6細胞培養筋芽細胞系，L6，がカリフォルニア州サンジエゴのサルクイン
スティチュートのデビッドシューベルト博士の御好意で得られた。この細胞を
５％Co₂中において37℃で、10％ウシ胎児血清−DME中に保持され、標準手順によ
りトリプシンを加えられ、５×10³細胞／mlの濃度でプレート化された。合流は
一週間後生じた。筋管への分化は、細胞が合流に達した後、24時間インシュリン
（10μｇ／ml）で処理することにより促進された。腹腔滲出性細胞及びメディエータ物質の調製：腹腔滲出細胞は、使用５日前に
無菌ブリュワーのチオグリコレート培地（ディフコラグー，ミシガン州デトロ
イト；マウスあたり３ml）を腹腔内注射したNCS/SPFマウス（25-33g;ロックフェ
ラーユニバーシティ，ブリーディングコロニー）から腹腔内洗浄することに
より得られた。この手順を採用して得られた滲出細胞はいくらか汚染リンパ球を
含んだマクロファージを主としていた。この細胞（４×10⁵細胞／cm²）は、３日間血清のないRPMI-1640培地中で培養
し、その後非粘着性細胞は通常の食塩水で３回洗浄することにより除去された。
更に粘着する細胞は主としてマクロファージであった。この細胞を、生体内使用
のための内毒素の５μｇ／mlもしくは試験管内使用のための0.1μｇ／mlの存在
下、もしくは不存在下に、血清のないRPMI-1640培地で更に20時間培養した。培
養培地は培養後除去され、４℃で５分間1000×ｇで遠心分離した。内毒素にさら
された細胞から得られた調整培地の上澄み液は、メディエータ物質を含有してい
た。調整培地を１カ月間−80℃で保存した後、活性に相違はみられなかった。２−デオキシグルコーズ運搬：L6細胞中の２−デオキシグルコーズの蓄積は、
3T3-L1細胞についての修正手順により測定された。L6細胞は６cm組織培養皿で合
流するように成長し、筋芽細胞におけるアッセイのため合流時に使用されるか、筋管におけるアッセイのためインシュリンで分化された。マクロファージ
メディエータ、部分的に精製したメディエータ或いはリポポリサッカライドが、
２mlのクリブス−リンガーヘープス(128mMのNaCl，5.2mMのＫCl，1.4mMのCaCl₂
，１mMのMgSO₄，10mMのヘープス，pH7.4)(KRH)を用いてプレートを３回洗浄する
前にほぼ24時間、もしくは指定した時間添加された。インシュリン及び／もしく
はシトカラシンが指定したように添加され、プレートは、２−デオキシ−³Ｈ−
グルコーズ（２μCi／μＭ，02mM）の添加前に30分間培養された。10分後、プレ
ートは冷たい（４℃）25mMグルコーズKRHで洗浄した。緩衝液は吸引され、1.5ml
の10％硫酸ドデシルナトリウムをプレートに添加し、細胞を溶解するため30分間
室温に放置した。細胞は掻きとりピペットで懸濁させることにより、プレートか
ら取り除いた。生成する混合物は、10秒間，２回，ブランソンソニケータ上で、
中間動力でソニケート（Sonicate）処理され、液体シンチレーションカウンタにより放射能が測定された。精製IL-1がこれまでの実験のように得られ、メディエータ及びその分離物に関
して述べたのと同様にして、L6細胞と共に培養した。結果一般的に、メディエータ物質とその分離物は共に２−デオキシグルコースの移
動を、1-6筋芽細胞及び細管により増加させ、メディエータの投与量が高い場合
には７倍にもなり、またこの硬化は投与量に依存する。これと対称的に、IL-1が
存在する培地や移動に影響を与えない。例えば、24時間間隔で、10分あたりの培養により取り込まれる２−デオキシグ
ルコーズを測定した結果、皮革細胞の取り込みは12.5±3.8であり、精製カシェ
クチンは30.3±0.01である一方、IL-1培地と接触する細胞は−3.4±0.26であっ
た。参考のため、既知のグルコーズ移動にかかわる物質であるインシュリンを細
胞で24時間培養し２−デオキシグルコーズで取り込みを刺激して53.9±3.4とした。従って、粗末メディエータ物質とこの分離
物は、少なくともこの研究においては、インシュリンと同程度にはグルコーズの
取り込みに影響を与えないけれども、両物質共にグルコーズ移動の著しい刺激物
質であることは明らかであり、この能力に欠けるIL-1とは明確な対照をなしてい
る。結論として、上述実験は、モジュレータであるカシェクチンとそのプリカーザ
であるメディエータは筋肉細胞におけるグルコーズ移動を刺激する活性をもって
おり、インターロイキン１はもっていないことを示している。実施例VIII 粗メディエータ物質とその分離物であるカシェクチン双方の活性及び特性を調
べる努力の一つとして、この例においては、C3H/HeJ（内毒素耐性）マウスにお
ける体重損失及び食物取り込みに及ぼす影響を観察することにより、メディエー
タとその分離物の生体内投与に関する体重減を研究した。発熱の発生に及ぼすこれら夫々の因子の効果に関する皮革研究をも行った。イ
ンターロイキン１に関し傑出した文献を参照することにより、特にディナレロ（
既述）による論文から、IL-1はマウスの発熱の原因となることがわかった（ディ
ナレロの65−66ページ，及びこれに引用される先行文献参照）。重量減及び発熱
に関するデータ及び結果は以下の通りである。材料及び方法マクロファージメディエータの調製腹腔滲出細胞は、カワカミほかによりJ.EXP.MED.154号，631ページ，1981年，
に記載されているように、使用６日前に３mlの無菌ブリュワーのチオグリコレー
ト培地を注射し、食塩水で洗浄したNCSもしくはC3H/HeNマウス（オス，20-25g）
の腹腔洗浄により得られた。細胞（２×10⁶細胞／μｌ）は、RPMI1640（ギブコ
社製）で再懸濁させた。非粘着性細胞は、同じ培地で３回洗浄して除去された。
残る粘着性マクロファージは、５μｇ／mlの内毒素及び50μｇ／ml の硫酸ゲンタマイシンを含有する血清を含まないRPMI1640培地中で20乃至24時間
培養された。マクロファージ培養培地は回収され、遠心分離され、溶液は−78℃
で貯蔵された。試料の蛋白質含量は15-18μｇ／mlであり、特異活性は約300U／m
gであった。この単位は、限定された条件下で分化3T3-L1細胞に及ぼすリポプロ
ティンリパーゼ活性を50％抑制することが可能なマクロファージ因子の量である
ことがわかった。内毒素によって活性化されないマクロファージは、リポプロテ
ィンリバーゼ抑制活性を示さなかった。マクロファージ分泌生成物もまた、PM10膜を用いたアミコン濃縮器により濃縮
された。３回濃縮した溶液が調製された（動物に注射したもとの溶液より２倍，
５倍，及び10倍縮少）。メディエータの注射：C3H/HeJマウス（オス，18−25ｇ）に、上述溶液を毎日
２回、腹腔内注射した。食物の取り込みは、代謝ケージを使用して測定した。体
重は、マウスを毎日秤量することにより測定した。この間体温も毎日監視した。図面の説明：以下の図面の説明は、体重減のデータ及び実施態様のデータであ
る。第16図は、食物取り込みに及ぼすマクロファージメディエータの効果を示す。
５つの群のC3H/HeJマウス（１群あたり６匹のマウス）が（ｃ）50μｇ／mlの内
毒素を含むRPMI1640（比較例）、（１）内毒素活性マクロファージ培養培地（マ
クロファージメディエータ）、（２）マクロファージメディエータ２倍濃縮、（
３）マクロファージメディエータ５倍濃縮、（４）マクロファージメディエータ
10倍濃縮、の溶液、を１日２回、腹腔内注射された（一匹あたり0.5ml）。夫々
の群のマウスの平均食物取り込みは、０日目では100％であった。代謝ケージ（
一群あたり３匹）が使用された。第17図は、第16図の実験を施したマウスの体重の相対的な変化を示す。０日に
おける各群のマウス体重の平均を100％とした。第18図は、体重に及ぼすマクロファージメディエータ中止の効果を示す。（3H
/HeJマウス（１群あたり５匹）は、（Ｃ）50μｇ／ml内毒素を含むRPMI1640、（
A1）10倍濃縮マクロファージメディエータ（この群の１匹は２日目に死んだ）、
及び（A2）５倍濃縮マイクロファージメディエータ）、の溶液を１日２回（１匹
あたり0.5ml）注射された。０日における各群のマウス体重の平均を100％とした
。結果内毒素活性マイクロファージからのメディエータを注射されたマウスは、投与
量に依存する食品取り込みの減少を示した（第１６図）。一般にメディエータを
投与されたマウス群のすべては、その食物取り込み量が急激に低下した。２日間
続いたこの急激な状態は、マウスが比較例（低投与量）のレベルまで食物取り込
み量を増加するか、或いはその食物取り込み量の限界（高い投与量）に至る第二
状態に変った。この第二状態は、注射されたマクロファージメディエータの量に依存する。メディエータの投与量がもっとも高い群は、食物取り込
み量が劇的に低下し（60％）、最初の投与后３日目に死んだ。すべての群におけ
る水分取り込み量は食物取り込み量に対応している（データは示されていない）
。この実験におけるマウス体重の変化は第17図に示されている。体重は、食物取
り込み量と同時に、メディエータ濃度に関し投与量に依存して低下した。メディ
エータの投与量がもっとも少ないマウスは、比較例のマウスに較べ、正常な食物
取り込み量であったにもかかわらず体重減が継続した。投与量がより高いマウス
は、最初の体重の15％が減少した。投与量がもっとも高い場合には、６匹のマウ
スすべてが、投与２日後に死んだ。200μｇの内毒素を毎日投与した比較例群の
６匹のマウスは、食物取り込みは正常であった。マクロファージメディエータに関運するカシェクチン効果は、その投与中止に
より逆になった（第18図）。第17図の実験に使用した高濃度の二種の溶液に類似するマクロフ
ァージメディエータの二種の溶液が、二つの群のマウス（１群あたり３匹）に注
射されたが、もっとも高い投与（曲線A1）は２日間に限定されるか、或いは濃縮
度が低い溶液（曲線A2）を10日間にわたって継続した。前者の群に属する１匹の
マウスが生き延びることができなかったほかは、すべてのマウスがもとの体重に
戻った。起りうる最近の汚染に対して安心しうるよう、注射したマウスから血液が培養
され、これが無菌であることが確められた。マクロファージメディエータを投与
されたマウスの粗大−及び微小病理学的検査の結果、注目するような事実は発見
されなかった。上述体重減実験のある面は、モジュレータ物質の量を限定して行い、正式のデ
ータは集められなかったが、実験者により、モジュレータ物質はマウスの体重減
を生ずるのと同様の効果を発揮することが観察された。メディエータの投与期間中、そして食物取り込みの測定中、マウスの体温も測
定され、体温は一定のままであり上昇しなかったことが観察された。体温におけ
る唯一の変化は、死亡前の最後の日のものであり、この時点でマウスは瀕死の状
態にあり予想される体温低下がみられた。C3H/HeJマウスに分離カシェクチンが
注射された時にも、発熱はみられなかった。体温測定の結果に基いて、インターロイキン１は熱の発生に影響を与えるけれ
ども、このような効果は、モジュレータ物質、或いはそのプリカーサであるメデ
ィエータ物質のいずれにしても存在しない、という結論が得られた。実施例IX メディエータ物質、その分離カシェクチン、及びインターロイキン１相互の比
較を、蛋白質劣化活性について行った。発熱の促進と同様、蛋白質劣化は、文献
には、インターロイキン１の一つの活性であることが記載されている、ディナレ
ロ（既述）、71−72ページ、特に72ページの副見出しＡ参照。従ってメディエータ物質、及びその分離物であるモジュレ
ータ物質が同様の特性を有するかどうかを決定することは望ましいことである。
かくして筋肉片を、精製IL-1の投与量と同じ量のメディエータ物質、及びその分
離物のそれぞれと共に培養した。その後筋肉片を観察したが、筋肉の蛋白質分解
の発生はみとめられなかった。これに基づき、メディエータ物質もモジュレータ
物質も蛋白質劣化に関与せず、インターロイキンと相違があることが結論された
。実施例Ｘこのモジュレータを使用する用途のうちで、モジュレータが抗体を発生するよ
うに使用し、抗体は、例えばある種の細菌感染によって生ずるショックの抑制或
いはショックをそらすような治療用途に使用できることが仮定された。ボイトラ
ー，ミルサーク及びセラミによって行われた未刊行検査において、特異ポリクロ
ナールウサギ抗血清がネズミカシェクチンに対して生じ、BALB/Cマウスは、大腸菌リポポリサッカライト(LPS)の投与前、投与時、及
び投与後に、これにより受動的に免疫となった。手順及び結果は以下の通りであ
る。材料及び方法モジュレータ物質であるカシェクチンは、実施例IIに既に記載されたように精
製された。精製蛋白質は、SDS-ポリアクリルアミド系抜ゲル中で電気泳動させる
ことにより、免疫化に使用するために調製した。ゲルは電気泳動完了後スライス
し、ほぼ５μｇの均質蛋白質（なおゲルスライス中に含有されている）を、1.0m
lの0.05M酢酸アンモニウム溶液及び1.0mlのフロインドの完全補助液中に乳濁化
した。ニュージーランドホワイト雌ウサギに、複数の皮下位置にこの物質を注射
した。フロインドの完全補助液を用いて上述のように調製した2.5μｇのカシェ
クチンを、１カ月間隔で、４回補足的に注射した。ウサギは４日間出血し、最終
的な注射後６日間出血した。免疫血清は、ヨード法により、125Ｉをラベルしたカシェクチンを沈澱する能力について試験された（第19
図）。ほぼ50％のトレーサが、血清の１：30,000希釈により沈澱した；予備免疫
血清は反応しなかった。免疫血清及び予備免疫血清の特異正を免疫ブロッティン
グ法により分析した（第20図）。ネズミカシェクチンに対応する単一の種が、LP
Sで前に培養されたRAW264.7差細胞からのブロット移動が免疫血清にさらされた
時に、ラベルされた。予備免疫血清は反応を示さなかった。免疫血清も予備免疫
血清も、J.IMMUNOL.,76号，377ページ，1956年，に記載されたネーターほかの方
法、或いはLPSの免疫ブロッティング法により検定されたような、LPSと反応する
抗体を含んでいなかった。オスBALB/Cマウスに対し400μｇのLPSの腹腔内注射の1.5時間前に、免疫血清
を注射した時著しい保護効果が見られ（第Ｖ表）、これは、予備免疫血清或いは
非免疫血清で処理した比較マウスについて観察された致死率と対照的である。LPSの投与後、群のすべてのマウスは病気のようであり熱性の反応をなした
（データは示されていない）。かくして免疫血清はLPSの発熱効果を消散せしめ
るものでなかった。同様の防護レベルは、免疫血清から調製されたIgGを、LPSの
注射前にマウスに投与した時にも観察された。一方、非免疫血清から調製された
IgGはマウスを防護するものでなかった（データは示されていない）。免疫血清による防護の程度を検定するため、種々の量のLPSが、５時間前に50
μｌの非免疫血清もしくは50μｌ免疫血清を注射されたマウスに投与された（第
21図）。免疫けっんで処理されたマウスにおけるLPSのLD₅₀は、非免疫血清で処
理された比較例マウスのLD₅₀より著しく高いことは明らかである。 LPS投与の時間に対し抗血清を投与される時間は、防護効果を生じさせるため
に決定的な重要さをもつことがわかった。LPSの投与３もしくは６時間前に免疫
血清を注射されたマウスは、 LPS注射時もしくはその数時間後に受動的に免疫を受けたマウスよりも、著しく
良好である（第22図）。この事実は、内毒素がカシェクチン生成をその投与後す
ぐに引き出すものであること、またカシェクチンはその致命傷をごく短時間に和
らげるものであることを示唆している。ウサギにおいては、LPSの静脈内投与後
数分間でカシェクチンが生成され、ピークプラズマレベルが２時間後に観察され
、その後急激にレベル低下が生ずる。従ってこの例においては、ウサギはごく短
時間高レベルのホルモンにさらされる；防護が達成されるとすればこの時間間隔
内に有効な抗体濃度が存在しなければならない。以上に提示したデータは、LPSの致命的効果を媒介するカシェクチンの役割の
証拠を与えるものである。カシェクチンは明らかに、LPSによる生ずる種々の病
理学的効果のメディエータとして唯一のものである。なぜなら受動的な免疫を受
けたマウスは熱症的となり病気のように見え、弱まるからである。カシェクチン
は、 LPSの致命的な効果を引きだすために例えば他のメディエータ（例えばインター
ロイキン１，インターフェロン，及びリンパトキシン）と協調して作用すること
もできる。マウスは、他の大抵の哺乳動物に比較し、LPSの効果に比較的耐性があること
に注意しなければならない；例えばウサギは、ほぼ1000倍感応性が強い。LPS感
応性種においては、カシェクチンはショックの媒介者としてより著しい役割をな
す。カシェクチンに対する免疫化は、従ってより高いレベルの防護を導き出すと
考えられる。敗血病（或いは多の原因）によるショックをうけた動物におけるカシェクチン
に対する、抗血清による受動的免疫化の考えうる用途は更に研究の必要がある。
明らかな可能性は、カシェクチンの合成或いはそのレセプタへの結合を阻害しう
る薬剤は、宿主の免疫系に対する妥協を考えることなく有用なものとなる、とな
りうることである。以下の図は、採用される手順及びその結果について、より詳しい説明を与える
ものである。図の説明：第19図は、¹²⁵Ｉをラベルしたネズミカシェクチンの免疫沈澱を図で表わした
ものである。免疫血清（実線）は既に記載したように調製された。予備免疫血清
は同じ動物から得られた。免疫沈澱反応は円錐ポリプロピレン管中で行われた。
血清標本は、１％RIAグレードウシ血清アルブミン（シグマケミカル社，ミズー
リ州セントルイス）(PBS/BSA)を含有するダルベコのりん酸塩緩衝食塩水を用い
て、所定最終濃度となるように希釈された。０；血清は添加されない。既に述べ
たようにして調製された２μｌ（ほぼ0.2ng；1.4×10⁴）のラベルしたカシェク
チン溶液が20μｌの希釈血清と混合された。この時点で洗浄Ｓ．オウレアス最近
アブソーバント（マイルスラポラトリーズ社，インディアナ州エルクハルト）と
蒸溜水との１：５懸濁液の10μｌをそれぞれの管に添加した。30分後、 1.0mlのPBS/BSAをそれぞれの管に添加した。標本を迅速に混合し、免疫沈澱物を
ベックマンマイクロフュージを用いて沈降させた。上澄み液を吸引し、ペレット
を、パッカード社のオートガンマシンチレーション分光計，578型，を用いて
放射能を測定した。結果を沈澱CPMパーセントで示した。他のウサギからの非免
疫血清（データは示されていない）も、ラベルしたカシェクチンを沈澱させるこ
とができない。第20図は、粗末RAW264.7細胞調製培地、及びLPSのウエスタンブロットのラジ
エオートグラフである。レーン１（ａ及びｂ）：50μg大腸菌株0127：B8LPS（デ
ィフコ社，ミシガン州デトロイト）。レーン2-6(a)及び2-5(b)：実施例１で示し
たように調製され50倍に濃縮されたLPS-刺激RAW264.7細胞（マウスマクロファー
ジ）調製培地（全蛋白質量ほぼ４０μｇを含む）の25μｌ。標本は、10-15%のSD
S−ホポポリアクリルアミド勾配ゲルに適用された。電気泳動完了後、蛋白質が
電磁ブロッティング装置（バイオラドラポラトリーズ社、カリフォルニア州リッチモンド）を用いてニトロセルロ
ーズ紙（シュライヒャーアンドシュール社，ニューハンプシャー州キーン）
に移された。免疫（ａ）、及び予備免疫（ｂ）血清が、希釈率１：300でイトロ
セルローズブロットに適用され、反応帯域は ¹²⁵Ｉをラベルした蛋白質Ａ（ニ
ューイングランドニュークリア社，マサチューセッツ州ボストン）で同定され
た。（ａ）に見える帯域は、精製放射性ヨウ素蛋白質が電気泳動処理され、マー
カーとして平行に移された時には、分子量が正確にネズミカシェクチンに対応し
ている。予備免疫血清がブロットに適用された時には、反応性蛋白質は観察され
ない。第21図は、免疫血清及び非免疫血清を有するマウスにおける内毒素LD₅₀の概算
のプロット図である。オスBALB/Cマウス（19−21ｇ）がランダムに11群にわけら
れ、夫々の群は15乃至17匹となるようにした。４つの群（三角）で、マウスは、
免疫血清を無菌等張食塩水に１：４で希釈した200μｌを腹腔内注射することにより予備処理をした；残る７つの群（開
放円）で、マウスは同じ量の１：４希釈非免疫血清で予備処理をした。５時間後
、無菌食塩水に溶解した大腸菌株0127：B8LPSの種々の量の腹腔内注射をマウス
に施した。生存は、LPS注射48時間後すべての群で継続した。曲線はデータに加
入され、LD₅₀の計算は、ブリスにより、Ｑ．，Ｊ．PHARMACOL.,11号，192ページ
，1938年に、リッチフィールドほかによりJ.PHARMACOL.EXP.THER.,96号，99ペー
ジ，1949年，に記載されているように行われた。水平軸は、LD₅₀決定の95％信用
性限界を示している（非免疫血清で処理したマウスのための91μｇ，及び免疫血
清で処理したマスウのための227μｇ）。マウスに対し免疫血清をより多量（200
μｌまで）投与したことによっては、生存が改善されない（データは示されてい
ない）。第22図は、LPS処理に伴うカプラン−マイア生存プロットを示す。80匹のオスB
ALB/Cマウス（19−21ｇ）が、不規則に、16匹ずつの５群に分けた。大腸菌株0127：B8LPS（
ディフコ社，ミシガン州デトロイト）の400μｇ腹腔内注射前６時間，３時間，
周時，及び３時間後，６時間後に、200μｌの抗カシェクチン血清200μｌを腹腔
内注射することにより、マウスを防護した。生存測定は、LPS注射後所定の時間
点で行われた。生存率は、マウスに対し、LPS投与６時間前に予備処理した場合
（Ａ）にもっともよかった。これら数値に対する生存率の著しい低下は、マウス
に対し抗カシェクチン血清をLPS投与時（Ｃ）に行った場合、或いはLPS投与３時
間後（Ｄ）、或いはLPS投与６時間後（Ｅ）に行った場合にみられた。夫々の群
における生存の時間との関連確立が、LPS投与６時間前防護群のそれと等しい、
という帰無仮説(null hypothesis)の試験が、ゲハン法（ゲハンによるBIOMETRIK
A,52号，203ページ，1965年参照）を用いて行われた；Ｐ値（単一尾通常分布）
は、夫々の曲線について示されている。第Ｖ表．１．メスBALB/Cマウス（20−24ｇ）を、不規則に６群に分け、免疫ウサ
ギ及び非免疫ウサギからの血清を、400μｇの大腸菌株0127：B8LPSの腹腔内注射
をする１時間前及び１時間半前に、腹腔内注射することにより予備処理した。血
清標本を無菌等張食塩水で希釈し、最終容積が１匹のマウスあたり0.2mlとして
注射した。LPSもまた無菌食塩水もまた希釈し、0.2mlの容積で注射した。致死率
を毎日記録し、死亡が、３日間にわたっていずれの群でも観察されなかった時に
、実験は完全なものになったと考えられた。上記の数値は、LPS注射７日後の生
存マウスの数を表わしている。２．二重尾大分布上記の例から、本モジュレータ物質は、理論化された治療可能性を確かに有していることは明らかである。かくして、モジュ
レータ物質或いはその結合パートナーが適切に投与されている範囲において患者
の同化もしくは異化状態のかかわる細胞的及び組織的条件の望ましくない程度と
関連する病的条件の緩和或いは減少が達成される。従ってモジュレータは有効な
治療用ツールであるが、その完全な可能性はまだ十分に明らかにされているわけ
ではない。本発明は別の形態或いは方法でも、その基本的な特徴から逸脱することなく具
体化もしくは実施することができる。従って本発明の開示は、特許請求の範囲に
記載される要件を説明するものであり、これを限定するものでなく、均等な内容
の変更はすべて本発明に含まれるものであることが理解されるべきである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Object of the present invention)   Accordingly, a primary object of the present invention is to inhibit certain anabolic enzyme activities in mammals.
It is an object of the present invention to provide a method for preparing a modulator substance, which can provide various effects.   Another object of the present invention is to provide a baby suspected of having an invasive stimulus, such as an infection.
Smell of milk animals And to provide a method for detecting the presence of a modulator substance.   Yet another object of the present invention is to address the deleterious effects of modulator substances in mammals.
A method of screening for substances such as drugs that are thought to be effective for fighting,
And related assay systems.   Yet another object of the present invention is to mitigate the deleterious effects of modulator substance activity.
In order to deflect, it is an object of the present invention to provide a method of treating a mammal to prepare this activity.   Yet another object of the present invention is to provide a modulator substance or its binding partner based.
To provide a pharmaceutical composition for a method of treatment.   Yet another object of the present invention is to cure tumor tissue utilizing the modulator materials of the present invention.
It is to provide therapeutic methods and compositions.   Other objects and advantages of the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings.
Refer to Will be apparent to those skilled in the art. (Description of the present invention)   The invention, in one aspect, provides a modulator material herein.
Or the separation and identification of specific factors described as cachectin.
Modulator substances or cachectin are, for example, bacteria, viruses, a
Invasive, such as certain tumors, protozoa, and other toxins such as endotoxins
Macrophages stimulated by substances described as stimulants characteristically accompanied by stimulation
(Macrophages) and macrophage cell lines. Parent application
US Patent Application No. 414,098, US Pat.
It has been confirmed that the carburetor substance is one component of the intermediate substance.
The dilator substance causes the metabolism of certain mammalian cells, thereby
Capable of changing the ratio state to a catabolic state to prepare the host for invasive stimuli
Looks like you do.   In particular, the modulator substance according to the invention is an anabolic lipoprotein lipase (LPL)
Appear to suppress the action of the host, and this is how the host's immune system and its energy
-Suggests that it acts as part of the storage system's communication system. This module
It also appears to inhibit adipocyte differentiation, and glycogen in muscle cells.
In theory, it increases the uptake of fat tissue,
Impacts energy storage tissues such as
It is believed that it will respond to the urgent need of energy. In this way
The dilator substance promotes the conversion of the host's cellular activity to a catabolic state, resulting in invaders.
So that the energy can be supplied. If the invasion is brief, the host
Recovers quickly and replenishes energy expended. But penetration is continuous or chronic
Energy, exhaustion of cachexia, shock, and ultimate
Eventually leads to death.   In one embodiment of the modulator material of the present invention, the molecular weight is approximately 17,000 dal
It was confirmed that the protein contained proteins having an isoelectric point of about 4.7-4.8 tons. This feature
The specified modulator substance exists as a dimer or higher multimer.
This has been confirmed from the results of research on its separation, and is described in Examples I and II.
Are listed. The test results further indicate that the modulator substance has a higher affinity for cells.
It has been confirmed that it interacts with and binds to a specific demander having In particular, Example I
Data of almost 10 per cell^FourOf a high-affinity binding site for and corresponding binding
Constant (Ka) is 3 × 10⁹Is suggested. This will be described later.
This means that the activity and especially the binding mechanism of the modulator substance according to the invention is clearly distinguished.
Therefore, the structural and functional differences between the modular material of the invention and known factors according to the prior art
It suggests a functional difference. Another feature of modulator materials is that
Antibodies that are effective in preventing That is what you can do. This is shown in Example X.   In addition to the activities described above, the modulator substances of the present invention must have certain activities.
It can be distinguished in that respect. In particular, the modulator substance of the present invention is a mediator substance.
(Intermediate), acetylcoenzyme (coenzyme) A carboxyl
Have no ability to suppress either
They differ in that they inhibit vesicle growth and differentiation. Similarly, this modulator material
It has no leukocyte activator activity against interleukin 1, a known factor.
It has become. This modulator is also used for fever or muscle protein in mice.
It appears to lack the ability to cause degradation. Modulator substances and their precursors
To identify the characteristics of both mediator substances that are precursors
Such differences in activity are described in greater detail in the examples below.
.   The preparation of modulator materials has been discussed very briefly above, and various
By initiating cell culture, stimulators that produce invasive stimuli can be treated.
And has been confirmed. In particular, cell line RAW264.7 is a precursor mediator substance.
From this mediator substance.
The separator material can be separated. In particular, as described in detail below,
Analysis and purification was achieved by using the macrophage cell line RAW264.7.
A sufficient amount of separation can be performed. Naturally, using other cell lines
And a mediator substance that is a precursor for separating the modulator substance.
Alternatively, the modulator material itself can be prepared, and the present invention
It does not exclude performance. Thus by other means, for example by genetic engineering reproduction
Methods are also contemplated in the present invention.   Modulator substances according to the invention can be isolated using mice as described in Example II.
And analyzed. Somewhat similar to known protein tumor necrosis factor (TNF) as found in humans
I understand. Post-completion studies such as those found in Example II have shown that
It is possible to explain the complete linkage of the durator protein, which is presented in Figure 23.
Have been. The mature modulator protein chain is thus defined as 156 amino acids
Is done. Furthermore, the mRNA of the modulator related to this amino acid chain was identified,
It has been employed to prepare recombinant forms of the disclosed proteins. The method adopted was
Isolate mRNA from toxin-derived RAW264.7 cells and appropriate mRNA-containing vector (vehicle)
Was prepared, which was then introduced into E. coli. Conversion is performed using recombinant plasmid DNA
And produced with high efficiency (ie, almost 10⁸Recombinant bacteria)
A gonucleotide probe (45 np long) is formed and
Used to screen a cDNA library with different hybrids
Conversion was performed by the dideoxynucleotide method.   The following procedure is an excerpt from an undisclosed experiment, which describes a recombinant technology well known to those skilled in the art.
You can see that it employs many of the general principles. Therefore, the present invention
Is involved in the preparation of this modulator material, but is more specifically
It involves the preparation of a substance having the amino acid chain shown in FIG. 23 by a substitution technique.   Although the amino acid chain of the modulator shown in Example II is similar to human TNF,
Differences in many specific amino acid units are associated with similarities between proteins.
It suggests that there are differences. In particular, modulation derived from mouse cell stimulation
Data are based on recently obtained known structural data on human tumor necrosis factor (TNF).
From the study of Example II by comparison of
It was found to be derived from the number and properties of certain amino acid residues. Research conclusion
In addition, certain activity of modulator substances in mice is indicative of the tumor resistance of human TNF.
Suggests that the ability is similar to the ability I understand.   Thus, in another aspect of the invention, a modulator object having a therapeutic capacity
Quality is provided, and this therapeutic capacity is particularly relevant for the treatment of tumor cell intelligence.
In addition to sex, it includes activities related to anabolic enzymes in non-neoplastic cells. Therefore the first
In aspects, the invention includes a method of treating tumor-producing cells, the method comprising:
Administration of a fixed amount of modulator substance in a suitable form and manner for the treatment of
Become.   The modulator substance or its conjugate or other ligand may be in the form of a pharmaceutical composition.
Containing a suitable carrier for the treatment of patients with tumors
It is formed to have appropriate strength so that it can be administered in various ways. Various throws
Administration methods, such as subcutaneous injection, intravenous injection and intestinal injection,
Includes parenteral administration methods such as catheterization. Varying average dose of modulator substance
And must be based on the judgment and prescription of a qualified physician. No.   In this context, this modulator substance has a non-tumorigenic effect as outlined above.
It also has a therapeutic effect on living cells, and is therefore useful for treating cachexia, shock, etc.
Can also be used. In particular, this modulator material can be used with various mammals and antibody autoantibodies.
The body can be made, in which case, for example, dissolved murine spleen lymphocytes and
Known methods such as the hybridoma method using myeloma cells can be adopted.
Wear. The resulting antibody is then formulated into a suitable pharmaceutical composition and the host with the invasive stimulant
Primarily given to prevent or treat cachexia.   Similarly, the modulator material may be prepared in a form suitable for inoculation into an animal body.
Immunity may be imparted to the above disease states. One application is agriculture
For animals. That is, the amount of immunity prepared in bovine
To be immune to weight loss when infected
Good. In this context, further treatment of modulator substances by studying endotoxin-resistant mice
Applicability was considered. For this application, animals should be able to
Observed and selected on the basis of the resistance to the formation of the generator material. Immunization
This gives agricultural animals a practical applicability as well,
For example, it is selected based on the criteria that a modulator substance can be synthesized.
Cows may continue to milk while infected with bacteria or viruses.
it can. Another possibility is the genetic modification of animals to synthesize modulator substances.
Is to be resistant to This is because the recombinant modulator material
Can be prepared by known genetic techniques as described above.   For the above-mentioned tumor treatment applications, the exact dose of the pharmaceutical composition,
Separation and dosing regimens may vary according to the medical practitioner and the direction of a qualified physician.   Similarly, for the treatment of cachexia, modulator substances and modulator substances
Antibodies can be prepared and used to treat shock conditions
. Administration is performed in the manner described above. The exact dose and dosing interval will depend on the recipient.
Qualifications take into account age, weight, overall health and modulator concentration, etc.
May be determined by a doctor.   Another therapeutic use is to take advantage of the crucial suppression effect of modulator substances.
Thus, modulator substances are used in the treatment of obesity. In such a case,
Modulator substance prepared in a suitable pharmaceutical composition is obese as prescribed by a qualified physician
To remove fat and reduce obesity.   The present invention also applies to various diagnostic applications, including the modulator substances of the present invention.
And methods for detecting invasive stimuli that limit the activity affected by Already stated
As noted, modulator materials produce their own antibodies by a variety of methods. Such antibodies can be isolated and used in suspicious mammalian hosts.
Can be used to test for the presence of a modulator substance.   Antibodies to modulator substances are standardized, including the well-known hybridoma method.
Can be separated by a simple method. An antibody is an antigen for an antibody
As if, it could be used for another species. Both types of antibodies are modular
Can be used to determine the presence and extent of protein substance activity. For convenience
In the following description, antibodies to modulator substances are referred to as Ab₁And apply to another species
Antibodies Ab_TwoIt is described.   Modulator substances in hosts suspected of possessing invasive stimuli
The presence of activity is ascertained by routine immunological procedures applied for such purposes.
You. Many useful procedures are known. Three particularly useful procedures include detection
Modulator objects labeled with possible labels Abs whose quality is utilized or labeled with a detectable label₁Or detectable
Ab labeled with various labels_TwoIs used. These steps are summarized in the following equations:
It is. In the formula, an asterisk (*) indicates that the particle is labeled, and “Mod” indicates a module.
Refers to the generator material:   A. Mod^*+ Ab₁= Mod^*Ab₁   B. Mod + Ab₁= ModAb₁ ^*   C. Mod + Ab₁+ Ab_Two= ModAb₁Ab_Two ^*   Are all of these procedures and their applications well known to those skilled in the art?
Thus, it can be used within the scope of the present invention. Procedure A above, a "competitive" procedure, is a US
It is described in Patent Nos. 3,654,090 and 3,850,752. “Sandwich” procedure
C is described in U.S. Pat. No. 31,006 and U.S. Pat. No. 4,016,043.
Other procedures, such as the "dual antibody" method or the "DASP" method, are also known.   In each case, the modulator substance forms a complex with the antibody or binding partner.
Forming and compounding One constituent of the body is labeled with a detectable label. Complex is formed
And, if necessary, the amount, are known methods applied to label detection
Can be determined.   Ab from the above explanation_TwoThe characteristic property of this is that this is Ab₁Is to react with
Recognize. This is an Ab made in a mammal₁Is an antibody Ab_TwoTo produce an antigen and
Because it was used by other species of mammals. For example, Ab_TwoIs Ab as antigen₁
Can be generated in goats using this Ab_TwoIs thus an anti-rabbit antibody
sell. Ab for convenience of explanation of this₁Is referred to as a modulator substance antibody, and Ab_TwoTo
An antibody that reacts with a modulator substance antibody, or "anti-antibody".   The most commonly used labels for these studies are radioactive elements, enzymes, ultraviolet
Chemicals that fluoresce when exposed to radiation.   Many fluorescent materials are known that can be used as labels. They are
For example full Olesein, rhodamine and auramine. The identified detection substance is in goats
Anti-rabbit conjugated to fluorescein by isothiocyanate
Antibodies.   Modulator substances or their binding partners may also be radioactive elements or enzymes.
Can be bell. Radioactive elements are available on any cow available today.
Can be detected by the client means. Preferred isotope¹⁴C,¹³¹I,^ThreeH,¹²⁵I
,as well as³⁵S.   Enzyme labels are equally useful, and colorimetric and spectrophotometric methods currently available
Detection, fluorescence spectroscopy or gas determination. Enzymes, for example,
With cross-linked molecules such as rubodiimides, diisocyanates, glutaraldehyde
By the reaction, the particles are conjugated to the selected particles. Can be used for these steps
Many enzymes are known.   Preferred are peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucose.
Dase, β- D-galactosidase, urease, glucose oxidase, and peroxidase
And acid phosphatase. U.S. Patent Nos. 3,654,090, 3,850,752 and
No. 4,016,043 discloses by way of example a label substance and its method.   Assay systems developed and used in accordance with the present invention are receptor assays.
It is a known method. In receptor assays, assays
The substance to be labeled is appropriately labeled, and then a certain cytoplasmic test colony, eg, 3T3-L1
The cell line is first differentiated and then inoculated with an amount of labeled material. afterwards
To determine the extent to which labeled substances have bound to cell receptors
Is made. In this way, the differences between the substances are confirmed. This procedure is especially
This is described in Example I, presented later.   Thus, as shown in detail in Example I, an amount of modulator material
3T3-L1 cells labeled with radioactive elements and subsequently differentiated Is used to study the degree of coupling. Contains various amounts of labeled modulator material
A solution was prepared, inoculated into a cell specimen, and then cultured. The resulting cell monolayer
Wash, dissolve, and use a gamma counter for a time sufficient for standard error to be 5% or less.
Counted. This data is then processed for Scatchard analysis,
Thereafter, observations and conclusions regarding the substance activity were made. The above procedure is an example
However, if the cell binding capacity of the substance being assayed is
It will be understood how the assay is performed and used.   In another embodiment of the present invention, a commercial test suitable for use by medical professionals.
A test kit was produced, which indicated modulator activity in the suspected mammalian host.
Used to determine the presence or absence of Such a kit according to the test method described above
At least one labeled modulator substance or its binding partner,
And antibodies specific to it. Another is few At least Ab₁Ab labeled_Twoincluding. Still another is at least Ab₁And more
Of course, the method selected, for example, "Competition method", "Sandwich method", "DASP method", etc.
Include instructions according to the method of This kit includes auxiliary reagents such as buffers and stabilizers
May be included.   Thus, test kits to demonstrate the response of the mammalian host to invasive stimuli
Includes:   (B) Directly connect the modulator substance or its specific binding partner
Alternatively, indirectly, a small amount of a given amount obtained by labeling with a detectable label
At least one labeled immunochemical reaction component;   (B) other reactants; and   (C) Kit instructions.   More specifically, the diagnostic kit includes:   (A) generally combined with a solid phase to produce an immunological solvent, or
Known quantities associated with end use forms such as tag tags Said modulator substance (or a binding partner thereof);   (B) other reactants as required; and   (C) Instruction manual for such a test kit   In another embodiment, the test kit is made and used to achieve the stated purpose.
Used and prescribed (eg, "competitive method", "sandwich method", "double antibody method")
Etc.), including:   (B) label obtained by binding a modulator substance to a detectable label;
Device   (B) one or several supplementary immunochemicals, of which only a few
At least one kind is a ligand or an immobile ligand, and the following group:   (I) a ligand capable of binding to the labeled element (a);   (Ii) Coordination capable of binding to the binding partner of the labeled device (A)
Child;   (Iii) a ligand capable of binding to at least one of the determined components;   (Iv) at least one binding partner of at least one of the components to be determined
A ligand capable of binding; a reactant being a ligand selected from the group consisting of:   (C) immunochemical reaction between a modulator substance and its specific binding partner
Perform processing to detect and / or determine one or several elements in response
Instructions for.   As described above, screening potential drugs effective to react with modulator substances
An assay system for leaning is prepared. In the first procedure, the test drug is stimulated
Administered to macrophage specimens that have received
Determine the fruit. In another procedure, the modulator substance is used in a cell test system such as the 3T3-L1 system.
Is introduced into the cell culture where the potential drug is produced, after which the culture is
The effect of the addition of a drug or the amount of a known modulator substance Thus, a change in modulator substance activity is observed.   As already mentioned, the following examples provide details of the separation and identification of modulator materials.
As shown and provided to the applicant or to those of skill in the art.
Activities that show differences and similarities in activity with previously identified factors
Observations relating to are shown. Naturally, certain substances as shown below
And methods are merely illustrative, and the following examples therefore limit the invention.
Not something. (Example)Example I   In this example, a modulator substance is separated from 3T3-L1 cells.
Isolate studies have shown that this is a 17 kilodalton protein with a specific high affinity
May bind to adipocytes and some other cell types by receptors
all right.     Materials and methods 3T3-L1 cell culture and bioassay: 3T3- L1 cells were plated at a density of 100,000 cells per well in a 24-well
Roller Laboratories, Innerporated, McLean, VA)
Cultured. The medium was Dulbecco's modified Eagle's medium (given
Laboratories, Grand Island, NY) was used.   10% Co at 37 ° C_TwoIn the atmosphere. The medium was changed every other day. One week later, 10
% Fetal bovine serum (FBS), 10 μg / ml bovine insulin, 0.5 mM methyl isobutyl
Culture for 48 hours in a medium supplemented with xanthine and 1.0 μM dexamethasone
The cells became more differentiated. Differentiated cells were 10% FBS and 50 ng / ml bovine insulin
One week later, in a medium (replaced every other day) containing
It was kept until used for inspection.   A 0.1 ml volume of the specimen to be assayed contains 3 ml of differentiated 3T3-L1 containing 1.0 ml of medium each.
Applied to each well of cells and at 37 ° C for 12-18 hours, 10% Co_TwoPlaced in the incubator. At the end of this culture, the medium is aspirated and 10% FBS, 50ng
Was replaced with 0.5 ml DME containing 1 / ml insulin and 10 U / ml heparin. At 37 ° C
One hour later, heparin-releasable LPL activity was determined by Nilsson-Ale and Shotts (Nils).
son-Ehle and SchOtz).   The total LPL suppression ratio (PTS) in a sample with LPL activity x was defined as: PTS
= (C-x / C-m) x 100, where C is not exposed to crude mediator (intermediate)
Is the LPL activity produced by the wells of 3T3-L1 cells, and m is the heparinization medium.
It is the LPL activity of the land alone. To avoid daily assay changes, this unknown sample result
Was compared to a standard sample of crude intermediate included in all bioassays. Coarse
This standard sample of the diator substance is partially sampled in small tubes and stored at -80 ° C.
Was. 1 U of bioactivity is equivalent to adding 1.0 μl of standard sample to a 1.0 ml assay system.
Amount of cachectin producing corresponding PTS It was prescribed. The use of standard solutions of crude mediator substances is also present in unknown specimens.
It confirmed the linear expected amount of bioactivity.   Manufacture of mediators: Generate RAW264.7 cells, 5% Co_TwoKeep at 37 ℃ in atmosphere
Merged into RPMI. Prior to inducing mediator secretion, RAW264.7 cells, PH
7.4 25mM Hepes (Research Organics, Inc.)
Hanks Balanced Salt Solution (Cleveland, Ohio)
Gib Laboratories) to remove contaminating serum proteins. each
The flask was filled with 1 μg / m E. coli LPS (manufactured by Difco Laboratories, Inc.
(Detroit, NJ) and 100 ml of RPMI1640 medium containing 50 mM Hepes pH 7.4
did. After culturing at 37 ° C. for 22 hours, the medium was filtered through a 0.22 μm filter, and stored at −20 ° C.
Frozen.   Mediator purification: Thaw 855 ml of frozen storage medium and use PM-10 filter
Made by Corporation, Dunbar, Mass. And concentrated using a stirred cell at 4 ° C. under a nitrogen atmosphere of 50 psi. the first
After concentration to 2% of the volume, the obtained protein solution is repeatedly diluted with distilled water,
Prior to spotting, the sample was reconcentrated to desalinate.   Isoelectric focusing was performed at a temperature of 4 ° C. in a water-cooled column with a capacity of 400 ml.
In this column, a glycerol gradient was created by stratifying the protein specimen in the center.
Prepared as follows: linear gradient of glycerol from 40 to 21% (vol / vol)
Was added; specimens were supplied by peristaltic pump; 19-0% (vol / vol)
A glycerol gradient was stratified on the specimen. On both the upper and lower halves of the gradient
, PH 3-10 Servalyte diluted 1:16 with water (Server Fine
Bio-Chemicals Inc., Garden City Park, NY)
Was. Specimens were prepared by adding the salt-free concentrate (55 ml volume) to 4.3 ml of Servelite, pH 3-10, and 1
Prepared by mixing with 6.7 g glycerol. anode The solution (bottom of the column) is 0.01M isidodiacetic acid dissolved in 40% glycerol
And the catholyte solution (upper column) is H_TwoIt was 0.01M ethylenediamine dissolved in O.
The separation was performed at an initial current of 18 mA and an initial voltage of 630 V. The voltage decreases during the process
Then, the output increased, but the output did not exceed 16W.   Twenty-four hours later, a drop of 150 drops was drawn from the column by gravity. Precipitated protein
Was removed by centrifugation at 3,000 g for 20 minutes at 4 ° C. Phenol red
Drops of chloride solution are added to each supernatant, and acidic specimens are washed with saturated tribasic sodium phosphate.
Neutralized by adding lium solution, basic specimens are treated with 30% phosphoric acid solution
More neutralized. Cachendin bioactivity is a measure of the bioactivity of each fragment.
The peak fragment was determined by assaying 2 μl corresponding to
Pooled to make.   The pooled peak fragments are used to remove ampholytes and glycerol,
Dalbeco glue Several times using phosphate buffered saline (PBS) (Gib Laboratories)
Was analyzed. The dialyzed material (volume 94 ml) was converted to a concanava with a bed volume of 2.0 ml.
Lin A (CON A) Sepharose Column (Pharmacia Fine Chemicals,
Weeden Uppsala). An additional 10 ml of PBS is passed through this resin.
And pooled with the filter residue. Filtrate twice using distilled water at 4 ° C
Dialyzed and lyophilized.   30 mM tri-HCl buffer, pH 6.8, 5% glycerol, 1 mM β-mercaptoeta
Re-prepare the specimen in a 2 ml solution containing ethanol and 0.002% bromophenol blue.
It was dissolved and electrophoresed in an unaltered state. This sample was subjected to 6-13% linear polyacrylic acid.
It passes through a stacked gel consisting of a hand-drawn gel with a diameter of 1.5 mm × 14.2 cm × 13.6 cm on a luamide gradient.
did. The triglycerin buffer system was used as follows: cathode buffer was 38 mM trisalt
Group and 40 mM glycerin; the anode buffer was 63 mM tribase and And 50 mM HCl; the stacking gel buffer was 0.125 g HCL at pH 6.8;
The separating gel buffer was 0.375 M tri-HCL at pH 8.8 (final concentration). Acrylic
In addition to amide (29.2%), this monomer solution contains 0.8% bis-acrylamide.
I was out. To remove impurities, this monomer solution was mixed with Amberlite MB-1
The mixture was stirred overnight using a fat (Marine Clot, St. Louis, Mo.).   Specimens are subjected to a constant current of 20 mA until the bromophenol blue marker reaches the bottom of the gel.
Electrophoresis was performed at a temperature of 4 ° C. in a stream. After electrophoresis, remove the 1cm gel and remove the side edge of the gel.
Removed from Why did the voltage cause non-horizontal movement in these marginal areas?
It is. The remaining gel was sliced horizontally at 2 mm intervals. Each sliced piece into poly
Gently stirred in 2 ml of 50 mM ammonium bicarbonate solution in a propylene tube for 12 hours
Then, the protein was recovered from the sliced pieces. Electroelution is
Francis, R.T., Junior, etc. J. CHROMATOGR., 298: 115, 1984.
This was done using a 3,500 dalton cut-off dialysis membrane in a vacuum apparatus.   The fragment thus obtained is assayed for its activity, and its purity is determined.
Sodium dodecyl sulfate (SDS-PA) in a 10-15% linear gradient gel
GE) in a non-denatured system containing polyacrylamide gel electrophoresis
. The protein band is described by ANAL. BIOCHEM. 118: 197, 1981 by Wray, E et al.
Was visualized by silver traces as described in.   Analytical column chromatography: Gel filtration is 0.1mM ammonium bicarbonate with PH7.8
Fine grade Sephadex G in a 7 mm x 1 m glass column
-75 (Pharmacia Fine Chemicals) was used. Cachentin
In experiments to determine subunit size, enzyme grade urea (be
Dali Search Laboratories, Beseda, MD) was added to the sample and eluent.
The fragments were individually dialyzed against PBS prior to the bioassay.   Study with radioiodinated cachentin: Iodine method for purified cachendin
Was radioactively labeled. Free iodine was filtered through Sephadex G-25 gel.
Removed by excess and dialysis. Binding studies were performed on recently differentiated 3T3-L1 cells (0.2 ml
4 × 10^FiveCells) containing 24-well Limbro plates. Join inspection
The solution used for 10% FBS, 50 ng / ml insulin, and 50 mM pH 7.4
Consists of DME medium containing Hepes buffer. Various amounts of labeled cashews
Was added to this solution. Culture on ice for 4 days unless otherwise noted.
In the meantime, it was carried out with gentle stirring. The cell monolayer is then dissolved in 1.0 M NaOH at 1.0.
Were washed three times with 1.0 ml of conditioned medium and the standard error was <5 using a gamma counter.
The time was counted long enough to be%.   Muscle cell line C2 (Helenblau at Stanford Medical School)
(Palo Alto, Calif.), Also due to the binding of cashectin.
Was analyzed. Allow cells to grow and merge into 24-well Ringlo plates
did. Plate is cow skin collagen (Calbiochem-Bering Corp.)
(La Jolla, Calif.). Preliminary processing is 35
Autoclaved 50 mg of collagen in ml water and disinfected solution
This was done by applying to each of the 24 wells. Then aspirate the solution and press
The rate was allowed to dry by UV light in a laminated flow hood. Used growth
Medium supplemented with 20% FBS and 0.5% chicken embryo extract (Gib Laboratories)
DME. Culture is 5% Co_TwoIt was kept at 37 ° C. in the atmosphere. Medium is daily
Changed, cells were supplemented with DME containing 2% horse serum (Gib Laboratories)
Purify myotubes when they begin to merge You were induced to. After 48 hours, the cells were used for binding studies. C2 myotube
The measurement of cachectin binding to is similar to that described for 3T3-L1 cells
Made in   NCS female mouse is at Laboratory Animal Research Center at Rockefeller University
Obtained from the company. Mouse red blood cells (RBCs) are
Mouse blood was obtained by filtering microcrystalline cellulose. Spleen lymphocytes
By Ficoll-Hypaque (Pharmacia Fine Chemicals)
Obtained by. The measurement of cachexin binding to erythrocytes and lymphocytes was performed using 3T3-
The procedure was similar to that employed for L1 cells. However,
1.5 ml of Eppendorf tube (Brinkman Insulin)
(Torments, Westbury, NY). 4 × 10⁷Mouse R
BC and 1 × 10⁷Mouse lymphocytes were used in each binding assay. Microphone
Lofuge (Beckman   (Instruments, Fullerton, Calif.) 3 times at 4 ° C.
The washing was completed by performing the separation treatment. Cell pellets are counted directly
Was.   Crude hepatic cell membrane was obtained by culturing 2 g of mouse liver (wet weight) in 10 ml of 5 mM Hepes pH 7.4.
Was obtained by homogenization. This homogenate (homogeneous) is
Diluted to 50 ml and centrifuged at 200 g for 5 minutes at 4 ° C. Aliquot 2 ml of supernatant
And pelletized to 48,000 g by spinning for 10 minutes. The resulting pellet is
Suspend each in 0.5 ml of DME supplemented with 10% FBS and label it with cashew
Chin (1 ng / ml) together with unlabeled cachectin (300 ng / ml)
Was added without this. Coupling was allowed to occur in 4 hours at 4 ° C. film
Were washed three times with fresh medium by centrifugation at 48,000 g. The pellet
Was counted for radioactivity.   Interleukin 1 (IL-1) activity assay: This was performed as previously described using recombinant IL-1 as a standard sample.   Determination of protein: The protein concentration is measured using a commercially available Commassie-based protein.
Reactant (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)
It was done.     result Preparation of cashetin from RAW264.7 cells and characterization in crude solution: 50ml of medium
In^-Ten^FiveThe bioactivity of U cachen is 10⁸Confluent fur containing RAW264.7 cells
Obtained from Suko. The characteristic activity of this crude mediator is^-4 × 10^FiveU / mg protein
Quality was regularly observed. Only a small amount of supplementary cachechetin is used in cells
By prolonged incubation with LPS or with fresh medium containing LPS
Was obtained. By contrast, a unique scaly activity is such an attempt
Sometimes observed.   Store the crude sample at -20 ° C at neutral pH for several weeks or at 4 ° C for 5 days.
Even after No loss of io activity was observed. However, bioactivity is unstable at acidic pH
It was observed that it was halved after 24 hours at pH 5.0 and 4 ° C. Low
Instability at low pH is reduced by adding 20% glycerol.
For this reason, isoelectric focusing is performed in glycerol rather than in saccharose,
Work as quickly as possible.   Concentration and isoelectric focusing: Bioactivity can be measured by pressure dialysis under the conditions described.
When performed, it is exclusively associated with the holding substance. Recovery after 50-fold concentration
Always> 90%, often very high as seen in Table I. Table I data
Are numerical values for typical separation methods.   The isoelectric point of the bioactivity is found to be 4.7 by isoelectric focusing of the enriched material.
(Fig. 1). The ampholytes themselves do not interfere with the bioassay. Isoelectric focus
The recovery of bioactivity after conversion varies (10-60%) and is mainly added to the column
Dependent on the total amount of protein. Decreased bioactivity during isoelectric focusing is present in the crude concentrate.
Appears to be the result of a co-precipitation reaction of cachectin with other proteins present
Was. Because low yields are associated with massive separation of proteins and large purification of precipitates
Because he was. Isoelectric focus Before purification, radiolabeled purification reagent as a tracer added to the crude mediator material
Later experiments involving Sectin supported this conclusion. Small mark
Add this (total amount of protein 50 mg or less) to the column and use a glycerol gradient.
Use and shorten the separation time (24 hours or less) and fractionation
Immediate neutralization of the post sample maximized recovery.   Con A-Seprarose chromatography: Some proteins
The parent species is the parent by Con A-Sepharose with little or no loss of bioactivity.
It was removed by compatibility chromatography. Con A-Sepharose
, The recovery of cachectin activity was low. This is probably this resin
It may be due to hydrophobic interaction with Because the activity is 0.1M α-methyl
It was not released by the addition of nocide.   page: After page under non-altered condition, All of the bioactivity is observed at a location on the gel associated with one protein band
(FIGS. 2 and 3). At this stage only 10-20% of the bioactivity is
Alternatively, by diffusing the protein into dilute ammonium bicarbonate buffer,
And recovered from the sliced gel. Prolong the diffusion time, repeat extraction
And the use of large amounts of buffer had little effect. Recovery is high
Concentrated specimens are applied to the gel and purified acrylamide monomer is
It was maximized by using it for the sample.   SDS-PAGE analysis of electrophoretically purified cachentin: Apparent homogeneity of the isolate
Sex was confirmed by electrophoresis in an SDS-PAGE system. Applied to SDS gel
Purified proteins associated with cachectin activity have only one band with a molecular weight of 17,000.
(Fig. 3). Microgram quantities of purified cachectin were used to swim in SDS gels.
Once activated, the bioactivity is fixed by electroelution. Recovered from undefined slice. This activity is limited to proteins with a molecular weight of 17,000.
Bioactivity was not obtained from other areas of the gel (FIG. 4)
.   Molecular weight of purified cashetin: Crude Kashectin concentrate is separated by Sephadex
adex) Analysis by G-75 gel filtration revealed that the bioactive elution profile was molecular
The star showed> 70,000. However, the crude concentrate was gel filtered in the presence of 6M urea.
When separated by filtration, a molecular weight of 17,000 (dextran scale) is obtained.
This suggests the formation of unconjugated multimers or coagulates with other proteins (
Data not shown).   When purified cachectin was analyzed on an SDS gel, both reduced and non-reduced samples
, 17,000. Refined cachet by SEFAX G-75 column
The molecular weight calculated by gel filtration of Kuching is 35,000, indicating that
Indicates the presence of dimer (data shown It has not been).   Study on radioiodine treatment and binding: Purified hormone is obtained by iodine method¹²⁵Release I
Ray labeled.^~70% bioactivity is recovered, the first specific activity is^~1 × 10
⁶cpm / μg protein. SDS-PAGE of this labeled substance
Most of the radioactivity was associated with a protein with a molecular weight of 17,000,
I was Attempts to label proteins using chloramine T have been
The result was a complete loss.   Purified, radioiodinated hormone is rapidly and specifically available at both 37 ° C and 0 ° C.
Bound to cultured 3T3-L1 adipocytes (see FIGS. 5A and 5B). Unlabeled cachet
The result of the addition of 25,000 U / ml of Kuching indicates that the labeled protein was
Inhibition of binding by quality. Under the described conditions, it becomes parallel within 2-3 hours
Was. A time-dependent decrease in the amount of bound label was observed at 37 ° C, which was probably
And reflects endocytosis mediated by the receptor.   Binding properties were examined by Scatchard analysis (FIG. 6A).
This data per cell^~Ten^FourPresence of high affinity sites and 3 × 10⁹Related constant of (ka)
It suggests. Both differentiated 3T3-L1 cells and undifferentiated “preadipocytes” have similar parental status.
It possessed a receptor with harshness and density. Muscle cell line C2 is also a unique cashew
Receptor, and in this case also^~Ten^FourHigh affinity position, 3
× 10⁹Was observed (FIG. 6B). Mouse liver membrane samples are also specific
Demonstrated binding. Red blood cells and lymphocytes, on the other hand, have detectable amounts of
Was missing (<200 copies per cell).   Assay for IL-1 activity: From the viewpoint of similar size, tissue development and endotoxin induction,
The separated proteins appeared to be the same as IL-1. More RAW264.7 cells
The large amount of cachectin produced, however, suggests that this is not the case.
there were. In particular, leucocyte under the conditions used to extract cachectin
Activity Cells produce very little IL-1 as measured by activator (LAF) activity.
Because it turned out to be.   The purified cachectin sample contained 10 recombinant IL-1^-11Under conditions such as those detected by M
Lack of LAF activity when assayed over a wide range of concentrations up to 1 mM
Was. In addition, micromolar concentrations of highly purified recombinant IL-1 are
It was not comparable to radioiodinated cachendin for binding. Therefore
Cachentin appears to be distinguished from IL-1.     Discussion   In the above experiments, the purified protein was separated from the macrophage-derived mediator.
It has a single molecular weight of 17,000 on an SDS gel and an isoelectric point of 4.7.
I understood. In its unaltered state, the purified protein was clearly present as a dimer.   1 U of bioactivity is^~2 × 10^-15Corresponds to mole. So moji
Curator material Is a 2 pH solution of Kashectin that can be easily detected by the bioassay described above.
It is. This estimation of specific activity must be minimized. Because of the unknown quantity
The protein may have become biologically inactive during purification.   Isolation of cachectin was achieved by using the murine macrophage cell line RAW264.7.
Facilitates the production of large quantities of proteins for analysis and purification.
Met. The cells are homogenous and have serum-free medium during endotoxin stimulation.
Could be held inside. The RAW264.7 cell line was from Abelson Leukemia Virus.
Can be produced by denaturing mouse peritoneal cells. This cell is a macro fur
Morphologically and functionally similar to This cell is used for complement and Fc fragments of IgG.
Has a receptor, accepts phagocytic neutral red, opsonin RBC, latex beads
Can be Cachentin activity produced by RAW264.7 cells and thioglycol
Correlation between cholate-activity by drawn peritoneal macrophages New similarities have already been demonstrated.   Cultures derived from LPS-stimulated RAW264.7 cells or unstimulated cells
The results of SDS-PAGE analysis of the ground show that cachectin is a type of endotoxin-derived secretory protein.
It turned out to be. This is a protein secreted from stimulated RAW264.7 cells
Consisting of 1-5% of the total, visible on the SDS gel as a distinct 17,000 molecular weight band
You. Medium from unstimulated cells has complete cachetectin bioactivity and 17
000 molecular weight band is missing. Based on estimation of specific activity of purified cachectin
, 17,000 molecular weight proteins are not all of the bioactivity present in the prepared cell culture media
Seems to be the reason for most. Other monokines (eg, interface
Ron, Glucocorticoid-challenge or other macrophages
The relationship of modulator substances to bioactivity) has not been fully assayed
However, from the bioactivity data presented above,
Is IL-1 And despite its similarity in molecular weight and isoelectric point.   Using labeled cachendin, the presence of a specific receptor for cachentin
Is demonstrated in differentiated 3T3-L1 cells and preadipocytes, C2 muscle cells, and mouse liver cell membranes
Was. On the other hand, the receptor was not detected in mouse red blood cells and lymphocytes. 3T3-
Receptor concentration of L1 and C2 cells per cell^~Ten^FourMet. Ka, receptor dying
The degree could be expressed as a function of the cachectin concentration. Recept in 3T3-L1 cells
Only 5% (2 × 10^-11M) for 70-80% suppression of LPL
Enough to get. This type of relationship is related to many other hormone receptor binding systems.
Was observed.   Although macrophages are not characteristic endocrine cells, they are monokines.
Can be made, which is called a hormone in the classical sense.
It is listed. This is because, depending on the particular group of cells and their effects, high affinity This is because it is created by the behavior of other cell types through the sex receptor.
As such, it represents one example of endocrine secretion of reticuloendothelial tissue cells. Muscle, liver
And the fact that adipose tissue has the receptor for cachetsta,
A physical response is possible.   These results indicate that cacheshectin responds to acute infection and that mammals
Also suggests a role in contributing to the recruitment of energy for increased metabolism.
You. In chronic cases, such as in the case of parasitic infections, cachectin eventually becomes host
Contributes to the catabolism of proteins and lipids that relieve cachexia.   Other studies performed after the above experiments reveal specific structures of modulator materials
Is what you do. These studies, also reported by Boitler et al.
It is described in Example II.Example II   When purified from RAW264.7 (mouse macrophage),
Has a pH of 4.7 And the subunit size is 17 kd, producing non-covalent multimers.
Was shown. Kashectin receptors are non-neoplastic culture cells
Vesicles and normal mouse liver membranes.   In this example, as a result of a study employing a high-yield purification method, mouse cashew
The structure of the compound was elucidated in more detail. High homology is to the N-terminus of mouse cachectin
End chaining and recently determined for human tumor necrosis factor (TNF) have been described by Penica, D .; , Etc.
Nature, No. 312: pp. 724-729, 1984; NATURA by Shirai and others
RE, 313, pp. 803-806, N-terminal linkage reported in 1985.
I found out. Purified cachectin also has potent TNF activity in vitro
have.   The procedure and results of such a study are set forth below.Materials and methods   Cachentin pio activity (LPL suppression) was determined using 3T3-L1 cells as described above.
Assay Was. TNF activity was determined using actinomycin D-treated L-929 cells as well as standard cells.
It was measured by the A method.   50-fold enrichment of crude cachectin from lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells
The solution was applied to PM-10 membranes in stirred cells (Amicon, Inc., as described in Example I).
Removed from ultrafiltered cells, prepared using Dunbar, Mass.
Octyl glucoside (Sigma, St. Louis, Mo.) 1% (w
/ v) was added to the concentrate. Addition of non-ionic retardant is high in the next process
Essential for achieving yields.   The sample passes through a 0.22μ filter and is passed through a Mono Q (high performance anion exchange) column (FP
LC; Pharmacia, Uppsala, Sweden). Almost all of the protein
60% passed directly through the column. Kashectin is a 0.38M trichloride with a pH of 7.8.
It eluted as a sharp peak in the concentrate (FIG. 7). Almost 80% of Holmans have three
Minute Collected as a painting.   Mono Q (FPLC anion exchange) chromatography: Disperse octyl glucoside
Concentrated crude RAW 267.4 medium containing as an agent was applied to the column. Kashectin
0.3M to 0.5M Tri-Cl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gradient
Eluted at a flow rate of 0.33 ml / min for 34 minutes. Optical density (280mm)
Is indicated by a solid line. The dotted line is the molarity of the tri-Cl buffer used for elution.
is there. Reticulated line (cross hatch) or distribution of cachectin bioactivity, line
(Each dot represents the results of a respective via assay). Plug-in
Figure: Silver trace SDS polyacrylamide gradient gel (10% -15% acrylamide) is coarse
Column fractionation following material separation, showing 1 μl per lane). Molecular weight marker
-Is shown in the leftmost lane. Arrows point to cachentin (molecular weight = 17 kd)
The corresponding band is indicated.   Nearly 60% of total protein is non-retained (not shown) As eluted. The peak of cachectin bioactivity was dissolved at a concentration of 0.38 M tri-Cl.
Put out. The three fractions with the highest activity were pooled for further purification
.   Super Rose 12 (FPLC gel filtration) chromatography:
The filtered fraction was lyophilized, redissolved in distilled water and applied to a column. Chromatog
The luffy was performed in 0.1 M ammonium acetate at a flow rate of 0.3 ml / min. 0.2 ml sample volume
Was used for each separation.   The solid line indicates the OD at 280 mm. Reticulated lines are assayed by bioactivity measurements
Indicates the presence of cachectin. The arrow indicates the molecular weight marker applied to the Super Rose Tower.
The elution area of Kerr is shown. Inset: SDS polyacrylamide gradient gel (10-15%
Lilamide) is a continuous fraction obtained by superrose 12 gel filtration
OL and P showing the electrophoretic profile (1 μl portion per unit) are standard molecular weight; Q is pool
Mono Q fraction (starting material for Superrose 12 separation).   These fractions were pooled, lyophilized and redissolved in 0.4 ml of distilled water.
The samples were then subjected to high performance gel filtration chromatography (Super Rose 12; Pharmacia).
(Manufactured by Sharp) (Fig. 8)   Cachendin is always eluted at a position corresponding to a molecular weight of 87 kd corresponding to the quintuple structure
did. The molecule dissociates easily in the presence of a nonionic retarder. Fivefold structure is bio-active
It is not clear whether it is essential for gender.   The trace end of the cachentin peak is considered to be more than 95% pure and the first media
Manufactured by traditional purification methods used to prepare eta substances (intermediates)
Almost 10⁷U cachenectin bioactivity / mg protein
I was TNF activity was assayed with this sample. Almost 1.2 × 10⁷U / mg protein
Quality was measured in purified samples and 3.7 x 10 in crude material samples^FourU / mg protein compared to
Was. Specific activity of purified human TNF is 2.9 × 10⁷U / mg protein.   The remaining cachectin to be used in determining the amino acid composition and its linkage
The enriched Superrose 12 fraction is described in J. CHROMATOG. 297; 13 by Pan, y-C.E.
-19 page, C8 column already described in 1984 (Superco, Pennsylvania)
(Bellafonte, N.A.) using reverse phase chromatography.
. Cachentin eluted at a concentration of 30-40% acrylonitrile. 40pmol altitude
The purified protein was hydrolyzed with 6N HCl and used for composition analysis. 200pmol
Waters (Milford, Mass.) High Performance Using Chains
Liquid chromatography (HPLC) system and Applied Biosystems
Micro-sequencing equipment of Forster City, Fornia, Model 470A,
Adopted for these procedures.   Table II shows the amino acid composition of mouse cachectin and the composition of human TNF (DNA linkage).
And the latter is Penica et al. (Described above). It has been reported by Strong similarities are apparent at first glance. Both proteins
The quality is, inter alia, acidic and hydrophobic. Threonine (thr), Valine (val), Alani
Residues (ala), histidine (his), arginine (arg), and cysteine (cys)
The same numbers can be seen for both. * Numbers in parentheses are compositions determined by Penica et al. (Described above) for human THF
Concerned. “ND” is an undecided number.   Similarly, the nature of the N-terminal amino acid sequence (top row) of mouse cachendin is
Found to be relatively consistent with the corresponding linkage in human TNF (bottom row)
. Ambiguous residues are indicated by "?". Matching residues are underlined. Mouse cachetectin H_TwoN-leu-arg-ser-ser-ser-glu-asn-ser-ser-as p-pro-pro-val-ala-? − Human TNF Mouse cachetectinval-val-ala-asn... Human TNFval-val-ala-asn...   According to the above linkage analysis, the relationship between mouse cachendin and the N-terminal linkage of human TNF was
Have strong homology. It is identical except for five of the first 19 residues. L-92
Purified cachet for 9 cells Considering the above data together with the cytolytic effect of Kuching, a single protein species is
Ectin and TNF activity in murine macrophage preparation media
Conceivable. In addition, this protein appears to be highly conserved.   From the results of the above studies and as already mentioned above, a complete identification of the modulator
The comparison of the fractionation sequence described above and the complete sequence shown in FIG.
Both differences became apparent. A more detailed analysis of this newest information
Therefore it is currently in progress.   Cachechetin provides approximately 10,000 cells per cell in cultured 3T3-L1 adipocytes and C2 myotubes.
Has been demonstrated to bind to specific receptors present in the pea. Hormones
The Ka for the septum interaction was 3 × 10 by Scatchud analysis.⁹M^-1
It turned out to be. Normal mouse liver membranes also effectively bind cachexin
You. A decrease in enzyme activity was observed immediately after a decrease in hormones, which was clearly
Specific suppression of Io synthesis It is the result of the system. Net protein synthesis and cell instability are not affected.   As previously discussed, the modulator material is characterized by this modulator material.
It also has many activities that combine to form distinct properties. This mod
Some of the substance activities differ from known substances.   In particular, this modulator material substantially completes the anabolic enzyme lipoprotein ribose.
Total suppression, this suppression varying with concentration as already or described below.
Modulators also block adipocyte differentiation and increase glucose uptake
Carry to muscle cells. The latter activity is a precursor mediator substance (intermediate substance)
But lacking in interleukin 1.   In contrast, a modulator material binds its mediator precursor to a lipid.
Lack of ability to inhibit fatty acid synthetase or acetyl-Co enzyme A carboxylase
Or lacks the ability to increase the activity of hormone-sensitive lipase Are distinguished by The modulator material and its precursor are
Lack of leucocyte activation for leukin 1 and fever in mice
Distinguished by lack of ability to cause or cause protein degradation
Is done.   In addition to the above characteristics, modulator substances also have the ability to cause weight loss in mice.
And produce its own antibodies to protect the host from endotoxin shock.
Demonstrate the ability to All of these activities are described in the examples below.
It is.Example III   As already mentioned, the mediator substance invented earlier and this modulator substance
Certain cachectins both suppress the activity of the enzyme lipoprotein lipase (LPL)
You. This ability was performed on specific cultured adipocytes (3T3-L1 cells)
Have been found in experiments in which such suppression is virtually complete.
Sure Was called. In particular, suppressions higher than 95% were reported.   In contrast, the substance identified as interleukin 1 is lipoprotein lipa
Was found to have reduced the activity of the enzyme to some extent, but this effect was limited.
And did not depend on the concentration of interleukin-1 administered.
In contrast, as described by Boyter et al.
And mediator substances have the ability to substantially completely suppress LPL activity.
I understood. To substantiate these observations, a certain amount of recombinant interleukin
A number of experiments were carried out using purified protein 1 (rIL-1) and purified
It was confirmed. The experimental procedure performed is as follows.   Materials and methods Cell culture: Growing 3T3-L1 cells and confluent to 24-wellulin proplate,
After differentiation, Mahoney J.R. Jr. et al., J. IMMUNOL.134, p.1673
Di, 1985, To produce fat cells as if they were. Briefly, cells, 10% cow blood
10 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DME) containing Qing^FivePlated at a density of / ml.
This medium was changed every other day. One week after the cultures reach confluence, 10% fetal bovine blood
Clear, 10 μg / ml bovine insulin, 0.05 M methyl isobutylxanthine, and 1.0
The cells were exposed to DME containing μM dexamethasone for 48 hours. After that, this was added to 10% FBS and
The cells were kept in DME containing 50 ng / 6 ml bovine insulin and changed every other day. Give DME
Co. (Grand Island, NY) purchased and defined as cow serum
And the characteristic fetal bovine serum is Hyclone Laboratories (Logan, Utah)
Purchased from. Cells are used for receptor assays 4 days after differentiation or
One week later, it was used in a bioassay for LPL suppression.   Receptor assays: Receptor studies are described in Boitler et al.
Used to characterize the cachectin receptor as described This was done using the same radiolabeled material. Cachentin receptor
Hustel et al., J.EXP.MED., No.161, pp.984-995, 1985
In this year, radiolabeled cachectin is
Used to test the ability of IL-1 to displace specific receptors. Simple
Simply add the 3T3-L1 cell monolayer prepared as described above to 50 mM 10% FBS and pH 7.4.
D containing a radioactively labeled cashectin tracer at about 10-11 μM
ME was layered. Dissolution of unlabeled IL-1 or cachectin (positive comparative example)
The liquid was added. The final volume of each system was 0.2 ml. The reaction was carried out at 0 ° C. for 4 days.
Made on a rocking shaker. At the end of this culture, the cell monolayer is
Wash with buffered medium, dissolve in 1.0 ml, 1M NaOH, packard gamma counter
And counted for a time sufficient for the standard error to be <5%.   Bypass of LPL suppression by cachectin and IL-1 OAssay: 3T3-L1 cells prepared as described above in a 24-well Ringlo plate
In the upper layer, introduce exactly 1.0 ml of DME supplemented with 10% FBS and 50 ng / ml insulin.
Entered. A purified sample of cachectin or recombinant IL-1 is added to each well, and
Was mixed. All control cell monolayers that have not been exposed to any mediators
Were included in all assays.   LPL assay: The medium was aspirated from the cell monolayer treated as described above. 10% FBS,
0.5 ml of DME containing 50 ng / ml insulin and 10 U / ml heparin is then added to each monolayer
Was added. After 1 hour, 75 μl according to the method of Nilsson-Yale and Schotts
The medium was assayed for LPL activity. LPL suppression percentage (mediator
(For comparative monolayers not subject to misalignment) are described in Bottler et al.
Calculated as it is.   Recombinant IL-1: This is Dr. Peter Romedico (Hoffman La Roche,
Faculty of Molecular Genetics) Thanks to Monokine (almost 100 μM concentration) is converted to 5M guanidine HC
l of solution. Guanidine HCl, when diluted to sub-millimolar concentrations,
Had no effect on LPL in this system.   Antiserum to IL-1: This antiserum against murine IL-1 obtained in goats
The courtesy of Professor Bun Mizul.   IL-1 neutralization: Antiserum to DME containing 50 mM Hepes, pH 7.4, and 10% FBS
Dilute over the time stated. Add purified recombinant IL-1 to a final concentration of 50 pM.
Added. After 1 hour on ice, a 15 μl aliquot of the solution was added to the cell monolayer and the final IL-1 concentration was adjusted.
0.75 pM. Assays for LPL suppression were performed as usual after 16 hours of culture.result Inhibition of LPL activity by purified recombinant IL-1: Add recombinant IL-1 to 3T3-L1 cells
By doing so, LPL activity was partially suppressed. As shown in FIG. 9, IL-1
Is the Fempt molar range LPL activity was able to be suppressed at the concentration in the box. Thus almost 10 in the orbital system^-
¹⁸Mole hormones could be detected. However, the concentration of the hormone μM
Under these conditions, the LPL could not be reduced by more than 50% under this condition, but it could be reduced by 90 to 95%.
Control could be achieved with nM concentration of cachectin. Separate 3T3-L1 cells from time to time
Addition gives higher sensitivity to rIL-1, generally 50% less
Is the maximum possible and in any case the suppression effect does not exceed 85%
Was.   When both cachectin and IL-1 are added to cultured 3T3-L1 cells, their effects are
They seemed to be complementary and independent of each other. For example, 50% reduction (maximum sensitivity
A sufficient amount of IL-1 to obtain 50% inhibition.
Almost 75% inhibition was observed when added with tin. Synergy is observed
Did not.   Inhibition of LPL suppression by recombinant IL-1 using specific goat αIL-1 serum: 0.75 pM IL-
Incubate 3T 80% LPL suppression was obtained when added to 3-L1 cells (maximal sensitivity in this experiment)
). By pre-culturing this rIL-1 with a specific neutralizing antiserum, this reaction was completely
lost. Addition of reduced amounts of serum resulted in intermediate levels of suppression
(Figure 10). At the concentration range used for neutralization, there was no direct effect of serum on LPL expression.
Not shown (data not shown). Therefore depending on the rIL-1 sample used
LPL suppression is indeed attributable to the presence of monokines, contaminating bacterial proteins,
Alternatively, it is believed that it is not due to the reactants employed in the separation of IL-1.   IL-1 comparable to radiolabeled cachectin for 3T3-L1 receptor location
lack: As already mentioned, radiolabeled cachectin is not available for all 3T3-L1 cells.
For high-affinity receptors (Boitler et al., Already mentioned)
Can bind and is easily replaced by unlabeled hormone at nM concentration
Can be 0.1 μM and 1.0 μM concentrations of purified recombinant IL-1 In this radiation receptor assay, the addition of tracer ca
No significant replacement occurred (Fig. 11). Thus, IL-1 is the LPL in 3T3-L1
Can be suppressed without binding to the cachexin receptor.
It is thought that it can come.   However, the pattern of LPL suppression by interleukin 1 was
Mediator or oak according to the present invention, which can both suppress LPL in the
Different from Jectin pattern. Inhibition of LPL and IL-1 by cachectin
Inhibition of LPL is complementary and independent; in the presence of maximum inhibitory concentrations of IL-1
Again, suppression is achieved by the addition of cachentin.   Comparison with IL-2: Interleukin 1 as discussed by Dinarero (described above)
Factors identified as having other immunomodulatory activity effects (some of which are
Interleukin 2). Formerly T cell Interleukin 2, known as the long factor, is produced by T cells and
It has the activity of sending a growth signal directly to the sphere. The production of IL-2 also, in some cases,
It is controlled in vivo by IL-1. IL-2 has the same activity as IL-1 for LPL suppression
Checking if it is, is therefore of interest.   Therefore, Voitler et al., In J. EXP.MED.
The inhibitory activity was examined and found to be absent. Clearly, IL-2 has this feature
-1 and is therefore also a crude mediator substance and its isolates
Can be distinguished from both the modulator substance of the invention, i.e.
.   In summary, all of the mediator substances, their separated cachectin and IL-1 are LP
Has an inhibitory effect on L, but the effect of mediator substance and cachectin
Are structurally and functionally different from those of IL-1, which means that these substances themselves are different.
Suggests that Furthermore these The three substances are different from IL-2, so each substance whose distinct characteristics are tested
Think about it.Example IV   In U.S. Patent Application No. 414,098, the aforementioned mediator substance is the enzyme acetyl-CoA
The effects on carboxylase and fatty acid synthetase have been studied and
Substances are found to inhibit these enzymes by interfering with their synthesis.
Was. In this experiment, the assay system of Example II of No. 414,098 was taken up,
The application was performed for each of interleukin 1 and cachectin. Purified IL
-1 and Kashectin were prepared as disclosed in Boitler and Cerami (described above).
Mouse peritoneal exudate cells produced and cultured in the presence of endotoxin obtained in conditioned media
Used within.   Thus, 3T3-L1 cells were exposed to each of IL-1 and cachectin for a total of 24 hours.
Cultured, acetyl-CoA carboxylase and fatty acid synthetase Measurements of protease activity were made after 3, 6, and 20 hours, respectively. Either
In both cases, the digitonin-released cytosol fraction of cells cultured with each factor is
It does not reduce the activity of these enzymes, and IL-1 is also a modulator
Cashetin is also an anabolic enzyme acetyl-CoA carboxylase and / or fat
It was found that they had no inhibitory effect on fatty acid synthetase. So this is
This modulator material is thus clearly distinguished from the crude mediator,
It turns out that it has similarity with interleukin 1.Example V   This example describes a murine model of cachexia in chronic disease: 3T3-L1 fatty fibers.
Endotoxin-Induced Macrophage Secretory Protein-Activated Catabolism in Blast Cells "
It has been compiled as undisclosed facts and has been filed by the applicant and one of its collaborators.
It is an excerpt from the research done. In this study, adipocyte metabolism
Harmful The role of crude mediator substances is further studied, especially when the mediator is a triacyl
Focuses on the effects of glycerol on catabolic activity based on cellular release
Was. This lipolytic activity is measured directly and the activity of hormone-sensitive lipase and cAMP is measured.
As a result, the mediator has the activity of lipolysis and hormone-sensitive lipase.
Have a significant effect on the role and extent of cAMP, but cAMP levels and activities may
It turned out to be unaffected. The procedure adopted in this study is as follows.     Materials and various methods   A variety of reagents, materials and procedures are involved in the work previously reported in this area.
Adopted as used. Thus, isoproterenol, ACTH,
[32P] Pi, LPL and mouse peritoneal macrophages are obtained from conventional sources,
Was prepared. A radioimmunoassay for cAMP was published by Watkin et al. in J. BIOL.
, 257, 14719, as reported in 1982. It was carried out.   3T3-L1 cell culture: 3T3-L1 pre-adipocytes were PRO.NATL.ACAD.
USA, 80, page 2743, 1983, 10% fetal calf.
Cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium containing baby serum. Add 0.5 mM Isobu to the medium.
Chill-methylxanthine, 1 μM dexamethasone; and insulin per ml of medium
Supplementation with 10 μg of phosphorus resulted in differentiation two days after merging. 48 hours later
Remove the soil and replace with medium supplemented with 10% fetal bovine serum and insulin only.
Was. After 4 days, when more than 90% of the cells show the adiposite phenotype, change the medium and
Was kept without insulin for 14 days.   Lipolysis: Lipolysis is performed by Pinter et al., ARCH.BIOCHEM.BIOPHS.121, 4
Glycerol release was measured as shown on page 04, 1961. Fine
The vesicles were incubated with 2% bovine serum albumin (fraction V) at pH 7.4 and Krebs Ringer phosphate
Wash with salt buffer, 2.0 ml of the same medium And incubated at 37 ° C for 1 to 2 hours. The culture is terminated by removing the medium,
This was adjusted with 10% trichloroacetic acid. Centrifuge this mixture at 2,500 rpm for 10 minutes.
Separate and extract trichloroacetic acid with ether.
The glycerol content was determined: A sample (0.167 ml) was prepared with 0.14 mM ATP, 1.2 mM phosphate.
Phenolpyruvate, 0.20 mM NADH, 1.5 units glycerokinase (Candi
Damaicoderma), 1.35 units of kinase pyruvate (rabbit muscle), and 2.8 units
Was added to the cave containing units of lactase dehydrogenase (bovine heart)
. The amount of glycerol in the sample is proportional to the oxidized NADH. Glycerol release is 10
⁶Total nmol released per unit time per cell or per mg protein
It has been reported. Under the above conditions, the release of glycerol is constant for at least 3 hours
Met.   Effect of mediator or isoproterenol on glycerol release: Inside
Toxin treatment mau Conditioned medium (400 μl) from the peritoneal macrophage at various time intervals
Over time, differentiated 3T3-L1 cells (4.2 × 10⁶(Cells / dish) in culture medium (3.5 ml)
. This amount is sufficient to inhibit lipoprotein lipase activity by 90% after 15 hours.
Amount. At the end of the culture, the medium is removed and Krebs-lin containing 2% BSA
The cell monolayer is washed with gar phosphate buffer and glycerol release is monitored for 1-2 hours.
Was watched.   In studies performed with isoproterenol, cell monolayers contained 2% BSA.
Washed twice with Krebs Ringer's phosphate buffer, and cultured in the same buffer.
Was. Saturated levels of isoproterenol (3 μM) were added and added to the culture mixture.
Glycerol release was monitored for 1-2 hours.   Preparation of cell extract and assay of hormone-sensitive lipase: Hormone sensitive ripper
Lysed cell extract containing lysate was purified by Kawamura et al. In PROC. NATL. ACAD.Sci.USA
, Issue 78, p. 732, 1981 , Prepared as described in First, the medium is changed and the cell monolayer is
For 60 minutes in a medium containing heparin (10 units / ml). Remove the medium,
The cell monolayer was washed with darbeco phosphate buffered saline at pH 7.4, and once
Washed twice with HCl / 1 mM EDTA / 0.25 M sucrose. Scrape cells for 1 minute
Centrifuged at 1000xg. Packed cells with 10 mM Tri-HCl, pH 7.4; 1 mM EDT
A; and 0.25 M sucrose; and homogenized for 1 hour at 40,000 xg.
Was. The supernatant is applied to a heparin-Sepharose affinity column and lipoproteins are applied.
Lipase was adsorbed. Effluent is fat that is not activated by the addition of serum
Has lytic activity, indicating the absence of lipoprotein lipase
is there.   Extract solution (0.07 ml) was used for a total volume of 0.1 ml of 5 mM magnesium acetate / 0.5 mM ATP /
Incubate for 5 minutes at 30 ° C in 0.01 mM cAMP / 1 mM EDTA / 25 mA tri-HCl, pH 8, and
Activated. A Assay is 0.3 mM [3H] -triolein 7.5 × 10^Fivecpm / μmol), 50 mM sodium phosphate
Substrate containing thorium, bovine serum albumin 5 mg / ml, 2 mM EDTA, pH 7.0
Started by addition of the mixture (0.7 ml). After incubation for 30 minutes, methanol and chloropho
Lum and heptane (3 ml of an extraction mixture consisting of 1.41: 1.25: 1.0 were added.
Richeate (containing tritium) oleic acid is converted to ester by liquid / liquid part
As described by Kawamura et al. (Described above).
And measured.result Effect of mediator protein on cell lipolysis: According to previous experiments,
Mouse epididymis exposed to conditioned media from endotoxin or endotoxin-treated macrophages
Fat pads have been demonstrated to produce significant weight loss (M. Kawakami; Bekara)
, P. H. Serami, A .; , Unpublished data). This observation shows that the crude mediator substance
Corresponds to the lipogenesis inhibition originally disclosed for Shows lipolytic activity leading to the removal of stored triacylglycerols. Medi
Lipolysis, measured by glycerol release, gradually increases during 15 hours of exposure to eta
Increased to almost 150% of the standard. Necessary for maximum activity of glycerol release
Time is observed for maximal inhibition of lipoprotein lipase binding to membrane tissue
Time. After 17 hours exposure to mediator, assay with lysed cell extract
The hormone-sensitive lipase activity increased by 60-70% as shown in Table III below.
Added.Table III Effect of macrophage media on hormone-sensitive lipase of 3T3-L1 fatty fibroblasts
Eta effect:Cells are induced to fractionate and stored as described in the experimental procedures.
Was held. Lysable fraction containing hormone-sensitive lipase is used for control cells and endotoxin
Cells exposed for 17 hours to conditioned medium from untreated mouse peritoneal macrophages
Obtained. Extracts can be assayed directly or Incubate for 5 minutes in the presence of cAMP and ATP before assaying as described in
Nourished. Values are means ± standard deviation of four experiments.  Culture of control extract in the presence of cAMP and ATP resulted in a doubling of lipase activity
Was. However, in the case of culture of extract prepared from mediator-treated cells,
No stimulus was observed.   In the same experiment, saturating levels of β-adrenergic antagonist isoproterenol
(3 μM) (Watkins et al., J. BIOL. CHEM., 257, p. 14719, 1982)
Cells exposed to a maximum glycerol release of 310 nmol / hr / mg protein
Indicated. This is the mediator of 315 nmol / hr / mg protein shown in Table IV below.
place Compared to the maximum value of the physiologic cells.   Table IV Maximum rate of glycerol release from 3T3-L1 fatty fibroblasts: Medication of 3T3-L1 cells
Exposure to eta for 17 hours or isoproterenol for 1 hour
Roll release was measured as described in the experimental procedure. Numerical values are the average of four experiments.
Mean ± standard deviation.   As a comparison, purified cachendin adjusted as disclosed and IL-1
Each described a medium derived from endotoxin-treated mouse peritoneal macrophages.
The cells were cultured in 3T3-L1 cells differentiated under the same conditions as described above. Then hormone-sensitive lipa
Lysate containing lysates were prepared in a similar manner and assayed directly. That
As a result, the hormone expressed as nmol / hour / mg protein The sensitive rivase activity was the same as that of the control cells in Table IV above.   Based on the above data, the crude mediator substance is lipolytic and hormone-sensitive lipase.
This activity, while appearing to stimulate the activity of
Or any of the substances fixed as known factors and represented as IL-1
It can be concluded that it has not been proven.Example VI   This example is derived from the work of Torti et al.
Mechanism of mediator substance that functions to suppress lipogenic enzyme activity at site
Made to clarify. Endotoxin-stimulated cells of a stable adipogenic cell line (TA1)
The effect of the conditioned medium on clophage culture was described by Chapman et al.
M.259, pages 15548-15555, 1984,
Interleave expression was tested using cDNA clones of the gene that increased. Me The diator reversely and specifically inhibits the developmental expression of fat-inducing genes,
That is caused by inhibiting the transcriptional activation of these genes
I understood. In addition, when mature adipocytes are exposed to mediators,
Induced mRNA of these genes is reduced during and rapidly approaches pre-differentiation levels.
TA1 cells, as described by Chapman et al.
Approximately three days after merging, typical adipocyte morphology develops. Morphological evidence and normality of differentiation
And identified several genes whose expression was evident after differentiation (clones).
1, 10, 28, 47). These fat-derived mRNAs are mostly or
Everything is extruded. Influence of mediator on coordinate induction of these fat genes
To measure the mediator pre-merge TA1 cells, and after the day when the merger was reached,
Added to cells. Total RNA isolated from these cells and comparative cells 6 days after confluence were
The extrusion is observed in adipocytes but in preadipocytes Was probed with a radiolabeled cDMA of the gene that was not observed. Shown in Figure 12
Thus, accumulation of fat-induced mRNA is prevented by mediator treatment. Lipid storage
The product is also completely prevented by the mediator treatment. By mediator
The treated TA1 adipocyte cultures show neutral lipids due to Sudan IV traces.
Indeed (data not shown), it was retained for 23 days. But
However, when mediators are removed from the medium, adipocyte morphology changes
The child's remarks, that is, clone 1 (FIG. 13), were restored.   Suppression of gene speech is not a general effect of mediators; for example, from FIG.
As can be seen, the level of β-actin mRNA is not affected. Furthermore, Medieval
Treatment of a preadipocyte culture with a cell culture may affect cell growth or viability.
Not. In a series of experiments similar in configuration to the experiment in FIG.
By counting the number,^ThreeMeasured by H-thymidine binding Was done. The comparative example and the mediator-treated culture increased the number of cells at the junction.
And^ThreeNo distinction can be made by the reduced H-thymidine binding. Trypan blue
The viability of cells as measured by exclusion and clonal growth assays is also
Equal to comparative and mediator treated cells (data not shown).   Determine if mediator inhibition of fat-specific mRNA accumulation is transcriptionally regulated
To do so, each transcription assay was performed. FIG. 14 shows the genes of clones 1 and 28.
Shows that normal increase in transcription is inhibited by mediators
. Subsequently, similar results were obtained with glycerophosphate dehydrogenase (B. sp.
(From Le Mans) and cDNA from clone 47 (data shown).
It has not been). GPD mRNA reper reduction after mediator addition in supplemental experiments
Less is paralleled by a decrease in the enzymatic activity of GPD (data not shown). Only
Mediator treatment, on the other hand, Not responsible for heterosexual loss: pre-merging cells, differentiated adipocytes, and differentiating
The transcription rate of β-actin in cells treated with the diator is equal (FIG. 14).
.   In a mature mammal, fat cells grow little or no at all.
Thus, when a mediator is added to pre-merged TA1 cells, adifferent fat gene says
Control of these fat genes is coordinately coordinated during development
Useful for, but likely to represent, realistic models of mammalian cachexia
Not something. Use these cells more faithfully to model in vivo situations
Thus, mature adipocyte cultures were made and mediators were added to the cells. Me
After 4-6 days of exposure to the diator, many cells have lost their neutral lipids. Scripture
In a typical experiment, 70-80% of the cells were initially treated with mediators in these cultures.
Has large lipid droplets when added; after 6 days, almost 10% of cells are identifiable
Liglyceride to Sudan III Has on traces. As shown in Fig. 15, the alteration of fat-specific RNA is not lipid mobilization.
Occurs quickly. 12-24 hours after mediator addition to mature TA1 adipocytes,
RNA levels were observed to decrease by more than 90%. Thus gene remarks
The dramatic and coordinate alteration of lipids is of primary importance for lipid mediator-induced mobilization.
Looks like it's   The description of the figure showing the specific procedure for collecting these data is as follows.   Fig. 12: Stable adipogenic cells derived from 5-azacitidine treatment of 10T / 2C18 cells
Eagle Baser supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum
Grew in a medium. Ten^-6M mexamethasone is present in the medium for the first 3 days after confluence
However, 5 μg / ml bovine insulin was present for the first 6 days after merging. Macrophages
Preadipocyte cultures 2 days prior to confluence of conditioned medium from cell line RAW264 at a concentration of 10μ
Was added first. This is lipoprotein lipase in cultured adipocytes 90% of the activity was suppressed. Cells are replenished with hormones on day 0 (confluence day) and day 3
Was. Cells were harvested on day 6. Total RNA is BIOCHEMISTRY
No. 18, No. 5, pp. 5294-5299, 1979.
Applied to nitrocellulose in a cell (BRL). Nick says that differentiation of TA1 adipocytes
CDNA clones of the genes found in this gene (clone 1, 10, 41 and glycerofesfu)
Re-write the β-actin cDNA clone (P.
And L.N. Kaedes), described in Chapman et al.
These filters were used to probe under hybridizing conditions. Filter
It was washed and exposed to XAR5 film at -70 ° C using an intensifying screen.   Fig. 13: Point blots were formed as described for FIG. Mede
The eta (K) was present in the medium at the times indicated.   RNA was cloned on days 6, 9 and 12 after confluence One cDNA was analyzed.   FIG. 14: Transcription assay performed by PROC.NATL.ACAD.SCl., USA, 81, by Vanice et al.
4241-4245, 1984, and J.BIOL.CHE by Israel and Whitlock
M., 259, pp. 5400-5402, 1984, and adipocytes by Knight et al.
This was done using a method as modified. Cultured cells are cooled to 4 ° C
The medium was aspirated and washed with phosphate buffered saline. 1 ml of hypotonic buffer (
20 mM Tri / HCl, pH 8.0; 4 mM MgCl_Two6 mM CaCl_Two; 0.5mM Jiraos Leito
Was added to the plate. After 5 minutes, 1 ml of lysis buffer (0.6M sucrose, 0.2%
NP-40 and 0.5 mM dithiothreitol) were added and cells were removed from tissue culture dishes.
Scratched. After dounce homogenization, nuclei were pelleted in 500 g and resuspended in buffer (
0.25 M sucrose; 10 mM tri / HCl, pH 8.0; 10 mM MgCl; 1 mM dithiothrei
Torr), repelleted, then 50 mM Hepes, pH 8.0; 90 mM NH_FourCl; 5 mM MgCl; 0.5 mM MnCl_Two2 mM dithiothreitol; 0.1 mM
EDTA; 0.4 mM ATP, CTP, GTP each; 10% glycerol; and 10 μg / ml bovine
Resuspended in serum albumin. The nucleus is 32P-UTP (600Ci / mmol, I at a concentration of 2mCi / ml).
The cells were cultured with CN) at 25 ° C. for 40 minutes with gentle rocking.   RNA is described by Smith et al. In CELL, No. 15, pp. 615-626, 1978.
The nucleic acid was recovered from the nucleus by the method modified by
This is applied to a nitrocellulose filter and placed in a vacuum oven at 80 ° C for 2 hours
Baked. The preliminary crossing and crossing conditions of the filter were determined by Friedman et al.
No. 38, pages 745-755, 1984. Crossing is 3 days, 4
At 2 ° C, clones 1 and 28, and β-actin and pEMBL plusside comparative examples
, In a volume of 150 μl at the point of the fat cDNA, approximately 15 × 10⁶went with cpm
.   Fig. 15A: 10 μl / ml of magenta material differentiated as described in FIG.
Day 6 was added to adipocyte cultures. Total RNA is transferred to the finger after exposure to the mediator.
Separated from screws for a specified number of times, and spot blotter (Schleicher and Schul)
To nitrocellulose. The filter is probed with the specified cDNA and washed.
Purified, radioautograms made, and reporting integrators
Scanning was performed using a Ketahofa GS300 densitometer (Hewlett-Packard).
Was. The point shown is the RNA applied using a cDNA probe to sum the RNA of the cells.
The difference in the amount of the was matched to the standard.   FIG. 15B: For these Northern analyses, 12 μg of total RNA was at a final concentration of 2.2 M
Formaldehyde, 30% formamide, 10 mM NaH_TwoPO_Four, Introduced into PH7.0, 56 ℃
For 15 minutes. The sample was prepared by Maniatis et al.
In order ”(Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratories, pp. 202-203, 1982).
2.2M formaldehyde, 20mM MOPS, pH 7.0, 5.0mM sodium acetate and
Electrophoresis in 1.0% agarose formaldehyde gel at a final concentration of 1 mM EDTA
I let it. The gel was washed with distilled water for 3 minutes and 10 mM NaPO_Four(PH7.4) and 1mM EDTA 2
Washing was performed for 30 minutes, and then transferred to nitrocellulose. Insertion section is clone
Shows a typical Northern analysis probed with 47 DNA.   The experiments described above demonstrate endotoxin stimulation in response to previously discovered mediator substances.
Recently, a coarse conditioned medium of macrophages and homogenization by Boitler et al.
This was performed using both purified protein cachetsin. Comparative test
Is Interleukin 1 (mouse recombinant IL-1, P. romedi from Hoffman-La Roche)
IL-1 does not suppress adipocyte differentiation.
Was. Thus the mediator substance and this modulator substance cashew Both chins have an inhibitory effect on adipocyte differentiation.     Example VII   In this experiment, glucose uptake and metabolic activity by muscle cells were examined.
Sex was studied. Promotes catabolic activity associated with shock induced by invasive stimuli
The same factors are associated with glucose, which also contributes to hypoglycemia present during shock.
Inferred to affect consumption or have some causal effect
.   In support of this hypothesis, crude samples of mediator substances injected subcutaneously
May cause hypoglycemia in endotoxin-resistant C3H / HeJ mice,
Both the eta and the modulator cachentin transfer 2-deoxyglucose
Was observed. Therefore, the crude mediator and this modulator
, Both are suspected to play a role in controlling metabolism in response to infection,
Crude mediator substance, this modulator, cachentin Glucose uptake in L6 muscle cells was performed in a comparative study with the addition of terleukin 1.
And migration were measured. The procedure and results are as follows.       material   Endotoxin (Lipopo) from E. coli 0.127: B8 isolated by Westfal method
Resuccharide) was purchased from Difcolabs (Detroit, MI). Fine
Cell culture medium and cow serum are from Gibcolab (Grand Island, NY)
And fetal bovine serum were obtained from Steril Systems (Logan, Utah).
Was. 3-Isobutylmethylxanthine is available from Aldrich Chemical (Wisconsin).
Dexamethasone and CPK assay kits from Sigma
From Chemical Company (St. Louis, Mo.);
Indianapolis, Indiana); glycerol tri [9,10 (n)-^ThreeH]
Oleic acid, U-14C-glucose and 2-deoxy-D [1-^ThreeH] Glucose
Is Amersham (Illinois) Arlington Heights, Ill.), 2-methyl (3H) isobutyric acid is New England
De Nuclear (Boston, MA); Triolein also checks
Prep (Elysian, MN); Acetylpyridine Adenine Dinucleotide
Otide and lactate dehydrogenase are available from Boehringer Mannheim (India)
Indianapolis, Ana).     Method 3T3-L1 cell culture: 3T3-L1 preadipocytes, Dulbecco's modified 10% fetal bovine serum
Cultures were performed as described previously in Guru's medium (DME medium). Leads to adipocyte phenotype
Differentiation was induced. Two days after the confluence, the medium was cultured, and 0.5 mM isobutyl-methylxanthine was added.
Supplemented with 1 μM dexamethasone and 10 μg insulin per ml. 48
After time, include isobutyl-methylxanthine, dexamethasone and insulin.
This medium has been removed and instead has a reduced concentration of 50 ng of insulin per ml
Was used.   L6 cell culture A myoblast cell line, L6, is a Salquin in San Diego, California.
The courtesy of Dr. David Schubert of the Institute. This cell
5% Co_TwoAt 37 ° C. in 10% fetal bovine serum-DME, according to standard procedures.
Trypsin added, 5 × 10^ThreePlated at a concentration of cells / ml. Merging
One week later. Differentiation into myotubes is performed 24 hours after the cells reach confluence.
(10 μg / ml).   Preparation of peritoneal exudative cells and mediator substances: 5 days before use
Sterile brewer thioglycolate medium (Difco Lagou, Detroit, Michigan)
NCS / SPF mouse (25-33 g; Rockfeet)
Peritoneal lavage from La University, a bleeding colony)
More obtained. The exudate cells obtained using this procedure will produce some contaminating lymphocytes.
The macrophages that contained were mainly.   This cell (4 × 10^FiveCells / cm^Two) For 3 days in serum-free RPMI-1640 medium
Non-adherent cells were then removed by washing three times with normal saline.
The cells that adhere further were mainly macrophages. Use these cells in vivo
Of 5 μg / ml of endotoxin for in vitro or 0.1 μg / ml for in vitro use
The cells were cultured for an additional 20 hours in serum-free RPMI-1640 medium, in the absence or absence. Culture
The nutrient medium was removed after culture and centrifuged at 1000 xg for 5 minutes at 4 ° C. Exposed to endotoxin
The supernatant of the conditioned medium obtained from the isolated cells contains mediator substances.
Was. After storing the conditioned medium at -80 ° C for one month, no difference in activity was seen.   2-Deoxyglucose transport: The accumulation of 2-deoxyglucose in L6 cells is
It was measured by a modified procedure for 3T3-L1 cells. L6 cells are combined in a 6 cm tissue culture dish.
Grow to flow and used at confluence for assays in myoblasts Or differentiated with insulin for assays in myotubes. Macrophages
Mediator, partially purified mediator or lipopolysaccharide,
2 ml of Cribbs-Ringer Hepes (128 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.4 mM CaCl_Two
, 1 mM MgSO_FourWash the plate three times with 10 mM Hepes, pH 7.4) (KRH)
Added approximately 24 hours before or as specified. Insulin and / or
Was added as indicated by cytochalasin and the plates were treated with 2-deoxy-^ThreeH-
The cells were cultured for 30 minutes before the addition of glucose (2 μCi / μM, 02 mM). 10 minutes later,
The plates were washed with cold (4 ° C.) 25 mM glucose KRH. Buffer is aspirated, 1.5 ml
Add 10% sodium dodecyl sulfate to the plate and allow 30 minutes to lyse the cells
Leave at room temperature. Cells can be removed from the plate by scraping and suspending with a pipette.
Removed. The resulting mixture is run on a Branson sonicator twice for 10 seconds.
Sonicate treatment with intermediate power, liquid Radioactivity was measured by a body scintillation counter.   Purified IL-1 was obtained as in previous experiments and was associated with mediators and their isolates.
As described above, the cells were cultured with L6 cells.result   Generally, both the mediator substance and its isolates transfer 2-deoxyglucose.
Motility is increased by 1-6 myoblasts and tubules, with high mediator doses
And the cure is dose dependent. In contrast to this, IL-1
Does not affect existing media or migration.   For example, at a 24-hour interval, 2-deoxygen taken up by culture per 10 minutes
As a result of measurement of leather, the uptake of leather cells was 12.5 ± 3.8, indicating that the purified
Cutin is 30.3 ± 0.01 while cells in contact with IL-1 medium are −3.4 ± 0.26.
Was. For reference, insulin, a known substance involved in glucose transport, is
Incubate with cells for 24 hours and collect with 2-deoxyglucose. Implantation was stimulated to 53.9 ± 3.4. Therefore, the crude mediator substance and this separation
The substance, at least in this study, is as glucose-soluble as insulin.
Both substances do not affect uptake, but are significant stimulants of glucose transport
Quality is clear and in sharp contrast to IL-1 which lacks this ability.
You.   In conclusion, the above experiments demonstrate that the modulator cachechectin and its precursor
Mediators have activity to stimulate glucose migration in muscle cells
This indicates that interleukin 1 is not present.     Example VIII   The activity and properties of both the crude mediator substance and its isolate, cashetin
As one of the efforts, in this example, C3H / HeJ (endotoxin resistant) mice were used.
By observing the effects on body weight loss and food intake during
The body weight loss on the in vivo administration of tannin and its isolates was studied.   Leather studies were also conducted on the effects of each of these factors on the development of fever. I
By reference to outstanding literature on Interleukin 1, in particular Dinarero (
The above-mentioned article has shown that IL-1 causes fever in mice.
(See Narero, pp. 65-66, and references cited therein). Weight loss and fever
The data and results for are as follows.     Materials and methods Preparation of macrophage mediator   Peritoneal exudate cells were reported by Kawakami et al., J. EXP. MED. 154, p. 631, 1981,
Six days before use, 3 ml of sterile brewer thioglycolate as described in
NCS or C3H / HeN mice (male, 20-25 g) injected with saline medium and washed with saline
Was obtained by peritoneal washing. Cells (2 × 10⁶Cells / μl) were converted to RPMI1640 (Gibco
Was resuspended. Non-adherent cells were removed by washing three times with the same medium.
The remaining adherent macrophages contained 5 μg / ml endotoxin and 50 μg / ml 20-24 hours in serum-free RPMI1640 medium containing gentamicin sulfate
Cultured. Macrophage culture medium is collected, centrifuged, and the solution is -78 ° C.
Stored in. The protein content of the sample is 15-18 μg / ml and the specific activity is about 300 U / m
g. This unit affects lipoproliferation on differentiated 3T3-L1 cells under limited conditions.
The amount of macrophage factor that can suppress tin lipase activity by 50%
I understand. Macrophages that are not activated by endotoxin
It did not show inulinase inhibitory activity.   Macrophage secretion products are also concentrated by an Amicon concentrator using PM10 membrane
Was done. A three-fold concentrated solution was prepared (twice the original solution injected into the animal,
5 times and 10 times reduction).   Mediator injection: Apply the above solution daily to C3H / HeJ mice (male, 18-25g)
Two intraperitoneal injections were made. Food uptake was measured using metabolic cages. body
Weight weigh mice daily Was measured. During this time, body temperature was also monitored daily.   Description of the drawings: The following description of the drawings is data of weight loss and data of the embodiment.
You.   FIG. 16 shows the effect of macrophage mediator on food uptake.
Five groups of C3H / HeJ mice (six mice per group) contained (c) 50 μg / ml
RPMI1640 containing toxin (Comparative Example), (1) Endotoxin-active macrophage culture medium
Clophage mediator), (2) Macrophage mediator 2-fold concentration, (
3) Macrophage mediator 5 times concentrated, (4) Macrophage mediator
A 10-fold concentrated solution was injected intraperitoneally twice daily (0.5 ml per animal). Respectively
The average food uptake of the mice in group I was 100% at day 0. Metabolic cage (
(3 per group) were used.   FIG. 17 shows the relative changes in body weight of the mice subjected to the experiment of FIG. On day 0
The average of the mouse weight of each group in each group was 100%.   FIG. 18 shows the effect of discontinuing macrophage mediator on body weight. (3H
/ HeJ mice (5 per group) were (C) RPMI1640 containing 50 μg / ml endotoxin, (
A1) 10-fold concentrated macrophage mediator (one in this group died on day 2),
And (A2) 5-fold concentrated microphage mediator) twice a day (one animal
0.5 ml per injection). The average of the mouse weight of each group on day 0 was taken as 100%
.     result   Mice injected with mediators from endotoxin-active microphages
A dose dependent decrease in food uptake was shown (FIG. 16). Generally a mediator
All of the groups of mice that were administered had a sharp decrease in their food intake. 2 days
This rapid state was followed by the mice taking up food to the level of the comparative (low dose).
Increase the food intake or limit its food intake (higher doses)
Changed to a state. This second condition is due to the injected macrophage media. Depends on the amount of eta. The group with the highest mediator dose is food intake
The dose was dramatically reduced (60%) and died three days after the first dose. In all groups
Water uptake corresponds to food uptake (data not shown)
.   The change in mouse weight in this experiment is shown in FIG. Weight is food intake
Simultaneously with the loading, the mediator concentration decreased in a dose-dependent manner. Medi
The mice with the lowest dose of eta had a normal diet compared to the mice of the comparative example.
Despite the uptake, weight loss continued. Higher dose mice
Reduced their initial weight by 15%. At the highest dose, 6 mice
All died two days after dosing. 200 μg of endotoxin was administered daily
Six mice had normal food uptake.   The cachexin effect associated with macrophage mediators has been
More reversed (Fig. 18). Macrophs similar to the two concentrated solutions used in the experiment of FIG.
Two solutions of phage mediator were injected into two groups of mice (three per group).
Shot, but the highest dose (curve A1) is limited to 2 days or concentrated
The lesser solution (curve A2) was continued for 10 days. One of the former group
All mice returned to their original weight, except that they could not survive.
I returned.   Blood is grown from injected mice to relieve of recent possible contamination
This was confirmed to be sterile. Administer macrophage mediator
Gross and micropathological examination of isolated mice reveals notable facts
Was not done.   Certain aspects of the weight loss experiments described above were performed with limited amounts of modulator material, and
Data was not collected, but the experimenter suggested that modulator substance could
Was observed to produce the same effect as producing   Mice's body temperature was also measured during the administration of the mediator and during the measurement of food intake.
It was observed that body temperature remained constant and did not rise. At body temperature
The only change that occurred was the last day before death, at which point the mice were moribund.
The body temperature was low and expected. Separated cachexin in C3H / HeJ mice
No fever was seen at the time of injection.   Based on the results of body temperature measurements, interleukin 1 may affect the generation of heat.
However, such an effect may be caused by the modulator substance or its precursor, the media.
It was concluded that none of the eta substances were present.     Example IX   Mediator substances, their separated cachectin and interleukin-1 mutual ratio
Comparisons were made for protein degradation activity. As well as promoting fever, protein degradation
Describes that it is one of the activities of interleukin 1,
B (described above), pages 71-72, especially page 72 See subheading A. Therefore, the mediator substance and its isolate,
It is desirable to determine whether a data material has similar properties.
Thus, the muscle pieces were treated with the same amount of mediator substance as the dose of purified IL-1 and its corresponding amount.
Culture was performed with each of the detachments. After that, the muscle pieces were observed, but muscle protein degradation was observed.
No outbreaks were noted. Based on this, the mediator substance is also a modulator
It was concluded that the substance did not contribute to protein degradation and was different from interleukin.
.     Example X   Of the uses for which this modulator is used, the modulator generates antibodies.
Antibodies can be used to suppress or reduce shock caused, for example, by certain bacterial infections.
Or it could be used for therapeutic applications that divert shock. Boytra
Unpublished tests performed by the
Naral rabbit antiserum is raised against murine sheectin BALB / C mice were administered before, during and after administration of E. coli lipopolysaccharite (LPS).
This resulted in passive immunization after administration and administration. The procedure and results are as follows
You.     Materials and methods   The modulator substance cachectin was purified as previously described in Example II.
Was made. Purified protein is electrophoresed on SDS-polyacrylamide-based gel
Thus, it was prepared for use in immunization. Gel slices after electrophoresis
Approximately 5 μg of homogeneous protein (still contained in the gel slice) was
Emulsification in 1 ml of 0.05 M ammonium acetate solution and 1.0 ml of Freund's complete auxiliary solution
did. New Zealand White female rabbits are injected with this substance in multiple subcutaneous locations
did. 2.5 μg of a cachet prepared as described above using Freund's complete auxiliary solution
Kutin was supplemented four times at monthly intervals. Rabbits bleed for 4 days
Bleeding for 6 days after the primary injection. Immune serum is obtained by the iodine method. And was tested for its ability to precipitate 125 I-labeled cachectin (No. 19).
Figure). Approximately 50% of the tracer was precipitated by a 1: 30,000 dilution of serum;
Serum did not react. Immune blotting for specificity of immune serum and preliminary immune serum
Analysis (Fig. 20). A single species corresponding to murine sheectin is LP
Blot transfer from RAW264.7 differential cells previously cultured in S was exposed to immune serum
Sometimes, it was labeled. Pre-immune sera showed no response. Pre-immunization of immune serum
Serum was also from Noether and others described in J. IMMUNOL., No. 76, pp. 377, 1956.
Reacts with LPS as assayed by immunoblotting or LPS
It did not contain antibodies.   1.5 h prior to intraperitoneal injection of 400 μg LPS into male BALB / C mice
(Table V), which shows a significant protective effect when injected with
In contrast to the mortality observed for control mice treated with non-immune serum. You. After LPS administration, all mice in the group appeared ill and had a febrile response
(Data not shown). Thus, immune serum dissipates the fever effect of LPS
Was not something. A similar level of protection was achieved by converting IgG prepared from immune serum to LPS
It was also observed when administered to mice before injection. Meanwhile, prepared from non-immune serum
IgG did not protect mice (data not shown).   To test the degree of protection by the immune serum, various amounts of LPS were added 50 hours before.
μl non-immune serum or 50 μl immune serum was administered to injected mice (No.
21). LD of LPS in mice treated with immunoassay.₅₀Treated with non-immune serum
LD of control comparative mouse₅₀Obviously it is much higher.   The time when the antiserum is administered relative to the time when LPS is administered may be
Was of crucial importance. Immunization 3 or 6 hours before LPS administration
Mice injected with serum Significantly higher than mice passively immunized at or several hours after LPS injection
Good (Figure 22). This fact indicates that endotoxin reduces cachexin production after its administration.
And it is very easy to extract
It suggests that it is irresistible. In rabbits, after intravenous administration of LPS
Within a few minutes, cachentin is formed and peak plasma levels are observed after 2 hours.
After that, the level suddenly drops. Therefore, in this example, the rabbit is very short
Exposure to high levels of hormones for hours; this time interval, if protection is achieved
There must be an effective antibody concentration within.   The data presented above suggest a role for cachectin in mediating the lethal effects of LPS.
Gives evidence. Cacheshectin is clearly a variety of diseases caused by LPS
It is the only mediator of physical effects. Because of passive immunity
The gizziness mouse becomes feverish and looks sick and weakens. Cachentin
Is To elicit the fatal effects of LPS, for example, other mediators (eg,
Act in concert with leukin 1, interferon, and lymphotoxin)
You can also.   Mice are relatively resistant to the effects of LPS compared to most other mammals
Note that rabbits are almost 1000 times more sensitive. LPS feeling
In responding species, cachexin plays a more prominent role as a mediator of shock.
You. Immunization against cachectin would therefore lead to higher levels of protection
Conceivable.   Kashectin in animals shocked by sepsis (or multiple causes)
The potential use of passive immunization with antisera against, requires further study.
Obvious possibility could inhibit the synthesis of cachectin or its binding to its receptor
Drugs can be useful without compromising the host's immune system.
It is possible.   The following figure gives a more detailed explanation of the procedure adopted and its consequences
Things.     Figure description:   FIG.¹²⁵Graphic representation of the immunoprecipitation of murine sheectin labeled I
Things. Immune serum (solid line) was prepared as previously described. Pre-immune serum
Was obtained from the same animal. Immunoprecipitation reactions were performed in conical polypropylene tubes.
Serum specimens were 1% RIA grade bovine serum albumin (Sigma Chemical Co., Mizuho)
St. Louis, RI) (PBS / BSA) containing Dulbecco's phosphate buffered saline
And diluted to a predetermined final concentration. 0; no serum is added. Already mentioned
2 μl (approximately 0.2 ng; 1.4 × 10^Four) Labeled Kashek
The tin solution was mixed with 20 μl of diluted serum. At this point, the washing S.P. Aureas recently
Absorbant (Milesrapolatory, Elkhart, IN)
10 μl of a 1: 5 suspension in distilled water was added to each tube. After 30 minutes, 1.0 ml of PBS / BSA was added to each tube. Mix the sample quickly and remove the immunoprecipitate.
Sedimentation was performed using a Beckman microfuge. Aspirate supernatant and pellet
Using an autogamma scintillation spectrometer, type 578, manufactured by Packard
Radioactivity was measured. The results were expressed as percent precipitated CPM. Non-immune from other rabbits
Plasmid serum (data not shown) can also precipitate labeled cachexin.
I can't do that.   FIG. 20 shows the results of Western blot of crude RAW 264.7 cell preparation medium and LPS.
It is an autograph. Lane 1 (a and b): 50 μg E. coli strain 0127: B8LPS (de
(Ifco, Detroit, Michigan). Lanes 2-6 (a) and 2-5 (b): shown in Example 1.
LPS-stimulated RAW264.7 cells (mouse macrophages) prepared as above and concentrated 50-fold
Di) 25 μl of conditioned medium (containing approximately 40 μg of total protein). Specimens are 10-15% SD
S-hopo polyacrylamide gradient gel was applied. After completion of electrophoresis, protein
Electromagnetic blotting device (Bio Nitrocellulosics using Radola Polarities, Richmond, CA)
Paper (Schleicher and Sur, Keene, NH)
Was moved to Immunization (a) and pre-immunization (b) were performed in vitro at a dilution of 1: 300.
Applies to cellulosic blots and the reaction zone is¹²⁵Protein A labeled with I (d)
Ewing Land Nuclear, Boston, Mass.)
Was. The band visible in (a) shows the purified radioactive iodine protein subjected to electrophoresis and
When transferred in parallel as a kerr, the molecular weight accurately corresponds to murine
ing. Reactive proteins were observed when the pre-immune serum was applied to the blot.
Absent.   FIG. 21 shows endotoxin LD in mice with immune and non-immune sera.₅₀Approximate
FIG. Male BALB / C mice (19-21g) randomly divided into 11 groups
Each group consisted of 15 to 17 animals. In four groups (triangles), the mice
Immune serum diluted 1: 4 in sterile isotonic saline Pretreatment was performed by intraperitoneal injection of the diluted 200 μl; the remaining seven groups (open
Mice were pretreated with the same amount of 1: 4 diluted non-immune serum. 5 hours later
Mice injected various amounts of intraperitoneal injection of E. coli strain 0127: B8LPS dissolved in sterile saline
It was applied to. Survival continued in all groups 48 hours after LPS injection. Curves are added to the data
Entered, LD₅₀Is calculated by Bliss, Q. , J. et al. PHARMACOL., Issue 11, page 192
, 1938, J. PHARMACOL.EXP.THER., 96, p. 99
Ji, 1949, performed as described. Horizontal axis is LD₅₀95% credit of decision
Showing sex limit (91 μg for mice treated with non-immune serum, and immune blood
227 μg for masu treated with Qing). Mice were given larger amounts of immune serum (200
do not improve survival (data shown).
Absent).   FIG. 22 shows a Kaplan-Myer survival plot with LPS treatment. 80 male B
ALB / C mouse (19-21 g) were randomly divided into 5 groups of 16 animals each. E. coli strain 0127: B8LPS (
(Difco, Detroit, Mich.) 6 hours, 3 hours before intraperitoneal injection of 400 μg
At weekly, and after 3 hours and 6 hours, 200 μl of anti-cashectin serum 200 μl was intraperitoneally injected.
The mice were protected by intra-injection. Survival measurement is performed at a predetermined time after LPS injection.
Made at the point. Survival rate is based on pretreatment of mice 6 hours before LPS administration
(A) was the best. Significant reductions in viability relative to these numbers
When anti-cachectic serum was administered at the time of LPS administration (C), or at 3 PM of LPS administration
This was observed when the test was performed immediately after (D) or 6 hours after LPS administration (E). Group of each
Has an established association with time of survival in the protection group 6 hours before LPS administration,
The test of the null hypothesis is that the Gehan method (BIOMETRIK by Gehan)
A, 52, p. 203, 1965); P value (single tail normal distribution)
Are shown for each curve. Table V. 1. Female BALB / C mice (20-24 g) were randomly divided into 6 groups,
Intraperitoneal injection of 400 μg of E. coli strain 0127: B8LPS with serum from guinea pigs and non-immunized rabbits
One hour before and one and a half hours prior to pretreatment, the animals were pre-treated by intraperitoneal injection. blood
Dilute the clarified sample with sterile isotonic saline to a final volume of 0.2 ml per mouse.
Injected. LPS and sterile saline were also diluted and injected in a volume of 0.2 ml. Mortality
Was recorded daily and no mortality was observed in any group for 3 days.
The experiment was considered complete. The above figures are for the raw 7 days after LPS injection.
The number of existing mice is shown. 2. Double tail large distribution   From the above example, the modulator material is theoretically It is clear that it does have a potential therapeutic potential. Thus, the module
To the extent that the substance or its binding partner is properly administered.
The undesired extent of cellular and tissue conditions involved in the anabolic or catabolic state of
Alleviation or reduction of the associated morbidity is achieved. Therefore the modulator is effective
Although it is a therapeutic tool, its full potential is not yet fully defined
is not.   The invention may be implemented in other forms or methods without departing from its essential characteristics.
It can be embodied or performed. Accordingly, the disclosure of the present invention is set forth in the following claims.
Explains the requirements to be described, not limiting, and is equivalent
It should be understood that all modifications of the above are included in the present invention.

【図面の簡単な説明】第１図は、等電焦点コラムから取り出された液体標本からとったモジュレータ
物質のバイオアッセイ結果を示すグラフ；第２図は、ゲル電気泳動後に行われたモジュレータ物質標本の、バイオアッセ
イ結果を示すグラフであって、ゲルのスライスがカットされ、バイオ活性が、重
炭酸アンモニウム溶液中に拡散させることにより、夫々のスライスから溶出した
。バイオ活性単位は、ゲル底からの、夫々のスライスの位置を基準としてプロッ
トした。第３図は、モジュレータ物質分離物分画の、SDS-PAGE分析結果を示すラジオオ
ートグラム（放射性物質描画記録）である。内毒素誘導もしくは誘導しないRAW2
64.7細胞培養体からの粗培地標本、及び精製中間物を、10−15％線状ポリアクリ
ルアミド勾配ゲル中で電気泳動処理した。標本は、電気泳動前に蒸留水で透析し
た。以下の説明は、オートラジオグラムに示されるレーン（列）の内容を示す：
（１）150μｌの非誘導RAW264.7細胞培地；（２）50μｌの誘導RAW264.7細胞培
地；（３）等電焦点化コラムからのプール分画の10μｌ標本；（４）コンＡ−セ
ファローズ濾液の25μｌ標本；（５）非変質条件下でPAGE処理により得られるピーク分画の80μｌ標本（均質カシェクチン）
。矢印はカシェクチンを示し、これは非誘導細胞の培地には完全に欠けているが
、誘導細胞の培地の主要成分である。カシェクチンは、上記の精製工程により連
続的に加えられる。すべてのレーン（スペーサレーンを含む）で可視的な分子量
帯域はβ−メルカプトエタノール不純物であり、これは標本それ自体には存在し
ない。第４図は、本発明による精製モジュレータ物質のSDS-PAGE分析結果を示すグラ
フである。精製カシェクチンの20μｇ標本を、SDS存在下で２分間煮沸し、非変
質条件下で10−15％線状ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動処理した。このゲ
ルの連続的な２−mmスライスを電気溶出し、電気溶出分画を、10％FBSを含有す
るDMEで１：100に希釈した。その10μｌをバイオ活性についてアッセイした。第5A及び第5B図は、精製モジュレータ物質について行った放射線ラベルの結合
の研究結果を示すグラフである。第6A及び6B図は、本発明によるモジュレータ物質について行われた放射線ヨー
ド化及び結合に関して、スキャッチャード分析の結果を示すグラフである。第７図は、粗濃縮RAW267.4培地について行われたモノ（QFPLC陰イオン効果）
クロマトグラフィに対応するオートラジオグラムであって、挿入写真は、粗物質
と連続的なコラム分画の分離を示す銀痕跡SDSポリアクリルアミド勾配ゲルをあ
らわす。第８図は、最初に行われたモノ−Ｑ分画化処理により得られた分画のスーパー
ローズ12（FPLCゲル濾過）を示すオートラジオグラムである。挿入写真は、この
濾過に由来する連続する分画の電気泳動輪郭を示すSDSポリアクリルアミド勾配
ゲルを示す。第９図は、精製IL-1及び本発明モジュレータ物質を3T3-L1に添加した結果を示
すグラフである。第10図は、培養3T3-L1細胞に対し組換型IL-1及びヤギ中和抗血清を添加した結
果を示すグラフである。第11図は、モジュレータ物質結合の放射線レセプタアッセイ結果を示すグラフ
であって、部分ａにおいて、組換型IL-1がラベルしたモジュレータに匹敵するよ
うにしてあり、部分ｂにおいては、ラベルされていないモジュレータ物質が同じ
系で匹敵するようにしてある。結合は、夫々のアッセイにおいて、3T3-L1細胞が
結合する加入CPMのパーセント表示であらわれている。かっこ〔〕は結合平均，
±SEM，を指す。第12図は、合流２日前に前脂肪細胞培養体にRAW264.7細胞からの培地が添加さ
れているTA1細胞からの、mRNAの分離結果を示す写真図である。第13図は、第12図と同様にして行われた点ブロット試験の結果を示す写真図で
ある。第14図は、脂肪細胞に特異性のあるmRNA蓄積に対するモジュレータの抑制が転
写的に関連があるかどうか、を決定するために行われた転写アッセイに基ずく点ブロット試験
の結果を示す写真図である。第15A図は、第12図に関連する手順により分化した脂肪細胞培養体にモジュレ
ータ物質を添加した結果を示すグラフである。RNAは、モジュレータ物質にさら
した後所定回数分離され、点ブロット装置においてニトロセルローズに適用され
、その後、このフィルターは所定cDNAでプローブ探針され、洗浄され、オートラ
ジオグラム化され、その後走査された。第15B図は、RNAのノーザン分析結果を示す写真図であって、この場合、標本は
アガローズホルムアルデヒドゲル中で先ず電気泳動処理され、蒸留水，りん酸ナ
トリウム及びEDTAで洗浄した後、ゲルはニトロセルローズに移された。第16図は、比較的な、植物取り込み実験の結果を示すグラフであって、比較マ
ウスと、本発明モジュレータを投与されたマウスとについて実際の食物取り込み
を測定したものである。第17図は、第16図に示す相対的な食物取り込み実験に参加したマウス体重の相
対的な変化を示すグラフである。第18図は、モジュレータ物質の投与を中止した場合におけるマウス体重に及ぼ
す影響を示すグラフである。第19図は、本発明によるモジュレータ物質の放射線ラベル標本の免疫沈澱結果
を示す。第20図は、免疫血清及び免疫血清を比較するための、電気泳動後に行われたウ
エスタンブロット分析の結果を示す写真図である。第21図は、免疫血清及び非免疫前血清の投与を受けたマウスにおける内毒素LD
₅₀の結果を示すグラフである。第22図は、５群にわけられ、大腸菌のある量を投与６時間前，３時間前，投与
と同時，投与３時間後，及び６時間後に抗モジュレータ血清を腹腔内投与したBA
LB/Cマウスについて、LPS処理後のカプラン−マイア生存率を示すグラフである
。第23図は、マウスから回収したモジュレータ物質のアミノ酸連鎖である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the results of a bioassay of a modulator material taken from a liquid sample taken from an isoelectric focusing column; FIG. 2 is a modulator material sample performed after gel electrophoresis 5 is a graph showing the results of the bioassay, wherein the gel slices were cut and the bioactivity eluted from each slice by diffusing into the ammonium bicarbonate solution. Bioactive units were plotted relative to the position of each slice from the bottom of the gel. FIG. 3 is a radioautogram (drawing record of radioactive substance) showing the results of SDS-PAGE analysis of the fractionated modulator substance. RAW2 with or without endotoxin induction
Crude media preparations from 64.7 cell cultures and purified intermediates were electrophoresed in 10-15% linear polyacrylamide gradient gels. Specimens were dialyzed against distilled water before electrophoresis. The following description shows the contents of the lanes (rows) shown in the autoradiogram:
(1) 150 μl uninduced RAW264.7 cell culture medium; (2) 50 μl induced RAW264.7 cell culture medium; (3) 10 μl specimen of pool fraction from isoelectric focusing column; (4) Con A-Sepharose 25 μl sample of filtrate; (5) 80 μl sample of peak fraction obtained by PAGE treatment under non-denaturing conditions
. Arrows indicate cachectin, which is completely lacking in the medium of non-induced cells but is a major component of the medium of induced cells. Cachentin is added continuously by the purification steps described above. The molecular weight band visible in all lanes (including the spacer lane) is a β-mercaptoethanol impurity, which is not present in the specimen itself. FIG. 4 is a graph showing the results of SDS-PAGE analysis of the purified modulator substance according to the present invention. A 20 μg sample of purified cachectin was boiled for 2 minutes in the presence of SDS and electrophoresed in a 10-15% linear polyacrylamide gel under non-denaturing conditions. Successive 2-mm slices of the gel were electroeluted and the electroeluted fraction was diluted 1: 100 with DME containing 10% FBS. 10 μl were assayed for bioactivity. FIGS. 5A and 5B are graphs showing the results of radiolabel binding studies performed on purified modulator materials. 6A and 6B are graphs showing the results of Scatchard analysis for radiation iodination and binding performed on modulator materials according to the present invention. Fig. 7 shows the results (QFPLC anion effect) performed on crude concentrated RAW267.4 medium.
Autoradiogram corresponding to chromatography, inset photo shows silver trace SDS polyacrylamide gradient gel showing separation of crude and continuous column fractions. FIG. 8 is an autoradiogram showing Super Rose 12 (FPLC gel filtration) of the fraction obtained by the initial Mono-Q fractionation treatment. The inset shows an SDS polyacrylamide gradient gel showing the electrophoretic profile of successive fractions from this filtration. FIG. 9 is a graph showing the results of adding purified IL-1 and the modulator substance of the present invention to 3T3-L1. FIG. 10 is a graph showing the results of adding recombinant IL-1 and goat neutralizing antiserum to cultured 3T3-L1 cells. FIG. 11 is a graph showing the results of a radioreceptor assay of modulator substance binding, in which the recombinant IL-1 is comparable to the modulator labeled in part a and the label is labeled in part b. No modulator material is comparable in the same system. Binding is expressed in each assay as a percentage of the added CPM bound by 3T3-L1 cells. Brackets [] are combined averages,
± SEM. FIG. 12 is a photograph showing the results of separating mRNA from TA1 cells in which a medium from RAW264.7 cells was added to a preadipocyte culture two days before confluence. FIG. 13 is a photograph showing the results of a dot blot test performed in the same manner as in FIG. FIG. 14 is a photographic diagram showing the results of a dot blot test based on a transcription assay performed to determine whether suppression of the modulator on adipocyte-specific mRNA accumulation is transcriptionally relevant. It is. FIG. 15A is a graph showing the result of adding a modulator substance to an adipocyte culture differentiated by the procedure related to FIG. The RNA was separated a predetermined number of times after exposure to the modulator material and applied to nitrocellulose in a spot blotter, after which the filter was probed with the specified cDNA, washed, autoradiographed and then scanned. . FIG. 15B is a photographic diagram showing the results of Northern analysis of RNA, in which the sample was first electrophoresed in an agarose formaldehyde gel, washed with distilled water, sodium phosphate and EDTA, and Transferred to nitrocellulose. FIG. 16 is a graph showing the results of a comparative plant uptake experiment, in which actual food uptake was measured for a comparative mouse and a mouse to which the modulator of the present invention was administered. FIG. 17 is a graph showing the relative change in body weight of the mice participating in the relative food uptake experiment shown in FIG. FIG. 18 is a graph showing the effect on mouse body weight when administration of a modulator substance was stopped. FIG. 19 shows the results of immunoprecipitation of a radiolabeled sample of the modulator substance according to the present invention. FIG. 20 is a photograph showing the results of Western blot analysis performed after electrophoresis to compare immune sera and immune sera. FIG. 21 shows endotoxin LD in mice receiving immune serum and non-immune pre-serum.
₃₅ is a graph showing ₅₀ results. FIG. 22 shows BA divided into 5 groups, in which a certain amount of E. coli was administered intraperitoneally with anti-modulator serum 6 hours before administration, 3 hours before administration, simultaneously with administration, 3 hours after administration, and 6 hours after administration.
4 is a graph showing Kaplan-Myer survival rate after LPS treatment for LB / C mice. FIG. 23 shows an amino acid chain of a modulator substance recovered from a mouse.

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）カケクチンに対する薬学的に有効量の一種類の抗体であって、前記
カケクチンが、明白に白血球賦活化活性を欠く一方で、同化酵素リポプロテイン
リパーゼの活性を実質的に完全に抑制すること、脂肪細胞の分化を阻止すること
、筋肉細胞内のグルコースの取込みを増加させること、及び自身に対する抗体を
産生してエンドトキシン誘発敗血性ショックに抗して自身を保護することを可能
とすることと、（ｂ）薬学的に有効な担体と、からなるカケクチンの有害効果としてのショックの発生または悪液質の治療のた
めの医薬組成物。２．前記カケクチンが、侵入刺激を伴う刺激物質と共にインキュベーションを
行った動物マクロファージ細胞から由来可能である特許請求の範囲第１項記載の
医薬組成物。３．前記カケクチンが、クローンによる複製により産生された細胞に由来する
特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記載の医薬組成物。４．前記カケクチンが、下記のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１項ま
たは第２項記載の医薬組成物： LEU ARG SER SER SER GLN ASN SER SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS VAL VAL ALA ASN HIS GLN VAL GLU GLU GLN LEU GLU TRP LEU SER GLN ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY HET ASP LEU LYS ASP ASN GLN LEU VAL VAL PRO ALA ASP GLY LEU TYR LEU VAL TYR SER GLN VAL LEU PHE LYS GLY GLN GLY CYS PRO ASP TYR VAL LEU LEU THR HIS THR VAL SER ARG PHE ALA ILE SER TYR GLN GLU LYS VAL ASN LEU LEU SER ALA VAL LYS SER PRO CYS PRO LYS ASP THR PRO GLU GLY ALA GLU LEU LYS PRO TRP TYR GLU PRO ILE TYR LEU GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY ASP GLN LEU SER ALA GLU VAL ASN LEU PRO LYS TYR LEU ASP PHE ALA GLU SER GLY GLN VAL TYR PHE ARG VAL ILE ALA LEU ５．ショックの発生の治療のための特許請求の範囲第１項記載の医薬組成物。６．悪液質の治療のための特許請求の範囲第１項記載の医薬組成物。[Claims] 1. (A) a pharmaceutically effective amount of one of the antibodies to cachectin, wherein said cachectin substantially lacks leukocyte activation activity while substantially completely inhibiting the activity of the anabolic enzyme lipoprotein lipase; Inhibiting the differentiation of adipocytes, increasing glucose uptake in muscle cells, and producing antibodies to itself to enable protection against endotoxin-induced septic shock; (B) a pharmaceutical composition for treating shock generation or cachexia as a detrimental effect of cachectin, comprising a pharmaceutically effective carrier; 2. 2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein said cachectin can be derived from animal macrophage cells incubated with a stimulus with an invasive stimulus. 3. 3. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the cachectin is derived from a cell produced by replication by a clone. 4. 3. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the cachectin has the following amino acid sequence: LEU ARG SER SER SER GLN ASN SER SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS VAL VAL ALA ASN HIS GLN VAL GLU GLU GLN LEU GLU TRP LEU SER GLN ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY HET ASP LEU LYS ASP ASN GLN LEU VAL VAL PRO ALA ASP GLY LEU TYR LEU VAL TYR SER GLN VAL LEU PHE LYS GLY GLN GLY CYS PRO LEU LEU THR HIS THR VAL SER ARG PHE ALA ILE SER TYR GLN GLU LYS VAL ASN LEU LEU SER ALA VAL LYS SER PRO CYS PRO LYS ASP THR PRO GLU GLY ALA GLU LEU LYS PRO TRP TYR GLU PRO ILE TYR LEU GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY ASP GLN LEU SER ALA GLU VAL ASN LEU PRO LYS TYR LEU ASP PHE ALA GLU SER GLY GLN VAL TYR PHE ARG VAL ILE ALA LEU A pharmaceutical composition according to claim 1 for the treatment of the occurrence of shock . 6. A pharmaceutical composition according to claim 1 for the treatment of cachexia .