JP2024522860A - 新規なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び1,4-ブタンジオール生産方法 - Google Patents
新規なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び1,4-ブタンジオール生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024522860A JP2024522860A JP2023579221A JP2023579221A JP2024522860A JP 2024522860 A JP2024522860 A JP 2024522860A JP 2023579221 A JP2023579221 A JP 2023579221A JP 2023579221 A JP2023579221 A JP 2023579221A JP 2024522860 A JP2024522860 A JP 2024522860A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microorganism
- converting
- hydroxybutyrate
- dehydrogenase
- poly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 128
- 229920002791 poly-4-hydroxybutyrate Polymers 0.000 title claims abstract description 120
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 83
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 153
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 160
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 160
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 160
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 130
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 121
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 117
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 117
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 117
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 51
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 38
- 108010084086 Succinate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 34
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 102000005566 Succinate-Semialdehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 33
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 32
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 29
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 27
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 108010093796 4-hydroxybutyrate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 25
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 25
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 23
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 21
- VNOYUJKHFWYWIR-FZEDXVDRSA-N succinyl-coa Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-FZEDXVDRSA-N 0.000 claims description 21
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 claims description 20
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 claims description 20
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 19
- 101710096706 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase Proteins 0.000 claims description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 19
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims description 19
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 18
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 17
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 17
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- BAMBWCGEVIAQBF-CITAKDKDSA-N 4-hydroxybutyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 BAMBWCGEVIAQBF-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 15
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 15
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 14
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 14
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N isocitric acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 claims description 13
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 claims description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 claims description 11
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 claims description 11
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 10
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 10
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 10
- 108010022393 phosphogluconate dehydratase Proteins 0.000 claims description 10
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 10
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 10
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 101000713310 Homo sapiens Sodium bicarbonate cotransporter 3 Proteins 0.000 claims description 8
- 101710130569 Isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase Proteins 0.000 claims description 8
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 claims description 8
- 102100036911 Sodium bicarbonate cotransporter 3 Human genes 0.000 claims description 8
- 108050008732 Malate synthase A Proteins 0.000 claims description 7
- 108050008733 Malate synthase G Proteins 0.000 claims description 7
- WXSKVKPSMAHCSG-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(=O)C(O)=O WXSKVKPSMAHCSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000006589 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004306 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- WPAMZTWLKIDIOP-UCORVYFPSA-N 2-keto-3-deoxy-L-galactonic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)CC(=O)C(O)=O WPAMZTWLKIDIOP-UCORVYFPSA-N 0.000 claims description 5
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000009836 Aconitate hydratase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010009924 Aconitate hydratase Proteins 0.000 claims description 5
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 5
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 229940006015 4-hydroxybutyric acid Drugs 0.000 claims description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 241000186570 Clostridium kluyveri Species 0.000 claims description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 3
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 claims description 3
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 claims description 3
- 238000005979 thermal decomposition reaction Methods 0.000 claims description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-N succinic semialdehyde Chemical compound OC(=O)CCC=O UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- OVPRPPOVAXRCED-WVZVXSGGSA-K 2-dehydro-3-deoxy-6-phosphonato-D-gluconate(3-) Chemical compound [O-]P(=O)([O-])OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC(=O)C([O-])=O OVPRPPOVAXRCED-WVZVXSGGSA-K 0.000 claims 3
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 20
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 16
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 15
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 13
- 101150118781 icd gene Proteins 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 101150015622 pyk gene Proteins 0.000 description 13
- UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-M 4-oxobutanoate Chemical compound [O-]C(=O)CCC=O UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 101100351124 Bacillus subtilis (strain 168) pckA gene Proteins 0.000 description 12
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 12
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 101100322911 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) aksF gene Proteins 0.000 description 11
- 101150052159 maeA gene Proteins 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 10
- 101150053890 EDA gene Proteins 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 7
- 101710142730 2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase Proteins 0.000 description 6
- 102100040341 E3 ubiquitin-protein ligase UBR5 Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 5
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 101150094017 aceA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150036393 aceB gene Proteins 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 101150031436 sucD gene Proteins 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 101100242035 Bacillus subtilis (strain 168) pdhA gene Proteins 0.000 description 3
- 101100350224 Bacillus subtilis (strain 168) pdhB gene Proteins 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101100236536 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) glcB gene Proteins 0.000 description 3
- 101100310802 Dictyostelium discoideum splA gene Proteins 0.000 description 3
- -1 GltA Proteins 0.000 description 3
- 101100123255 Komagataeibacter xylinus aceC gene Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 101000746457 Neisseria gonorrhoeae UPF0213 protein in glnA 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101100134871 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceE gene Proteins 0.000 description 3
- 101100406344 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceF gene Proteins 0.000 description 3
- 241001148115 Rhizobium etli Species 0.000 description 3
- 101150001446 aceK gene Proteins 0.000 description 3
- 101150070136 axeA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 101150090240 edd gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 101150116082 glcB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150106096 gltA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 101150108859 maeB gene Proteins 0.000 description 3
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 101150100525 pykA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150053304 pykF gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- OVPRPPOVAXRCED-WVZVXSGGSA-N 2-dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconic acid Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC(=O)C(O)=O OVPRPPOVAXRCED-WVZVXSGGSA-N 0.000 description 2
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150056162 4hbD gene Proteins 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 101150107914 Ubr5 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 101150005925 aspC gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 101150027837 ecaA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 101150042350 gltA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 2
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 101150048611 phaC gene Proteins 0.000 description 2
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- PIAOXUVIBAKVSP-UHFFFAOYSA-N γ-hydroxybutyraldehyde Chemical compound OCCCC=O PIAOXUVIBAKVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100533902 Arabidopsis thaliana SPL13A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100533904 Arabidopsis thaliana SPL13B gene Proteins 0.000 description 1
- 101100455080 Bacillus subtilis (strain 168) lmrB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150061009 C1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 102100034229 Citramalyl-CoA lyase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101100489694 Clostridium kluyveri (strain ATCC 8527 / DSM 555 / NCIMB 10680) 4hbD gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108020004687 Malate Synthase Proteins 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192656 Nostoc Species 0.000 description 1
- 241000192673 Nostoc sp. Species 0.000 description 1
- 101100438196 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) ecaA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100070556 Oryza sativa subsp. japonica HSFA4D gene Proteins 0.000 description 1
- 101100043227 Oryza sativa subsp. japonica SPL13 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- IDJZVKFLJCAQHF-HRXFNJBOSA-N S-[2-[3-[[(2R)-4-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 4-hydroxybutanethioate Chemical compound OCCCC(=O)SCCNC(CCNC([C@@H](C(COP(OP(OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12)O)OP(=O)(O)O)(=O)O)(=O)O)(C)C)O)=O)=O.OCCCC(=O)SCCNC(CCNC([C@@H](C(COP(OP(OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12)O)OP(=O)(O)O)(=O)O)(=O)O)(C)C)O)=O)=O IDJZVKFLJCAQHF-HRXFNJBOSA-N 0.000 description 1
- 101150099282 SPL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000011929 Succinate-CoA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010075728 Succinate-CoA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 1
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 1
- 101100492609 Talaromyces wortmannii astC gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101150116772 aatA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000071 poly(4-hydroxybutyrate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 101150109655 ptsG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 108010037073 succinate semialdehyde reductase Proteins 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 101150062776 yccA gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01061—4-Hydroxybutyrate dehydrogenase (1.1.1.61)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01024—Succinate-semialdehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.24)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
- C12Y208/03—CoA-transferases (2.8.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本出願は、新規なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオール生産方法並びにポリ-4-ヒドロキシブチレート生産経路を利用する微生物に関する。
Description
本出願は、新規なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオール生産方法並びにポリ-4-ヒドロキシブチレート生産経路を利用する微生物に関する。
1,4-ブタンジオールを生産するために、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。微生物を用いた1,4-ブタンジオール生産は、概して4-ヒドロキシブチルアルデヒド生成反応を伴うが(特許文献1)、4-ヒドロキシブチルアルデヒドはアルデヒドの一種として微生物に有害な短所がある。
また、現在まで知らされたバイオ1,4-ブタンジオール生産技術の一つであり、1,4-ブタンジオール直接発酵でブドウ糖において発酵を通じて1,4-ブタンジオールを微生物から直接生産する方法であるが、1,4-ブタンジオール自体の微生物に対する毒性により生産性に制約がある。したがって、効果的なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオールの生産能の増加のための研究が依然として必要なのが実情である。
Pearson et al(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444
Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277
Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453
Devereux,J.,et al,Nucleic Acids Research 12:387(1984)
Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)
Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994
[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073
Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482
Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)
Gribskov et al(1986)Nucl.Acids Res.14:6745
J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual、2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York、1989
F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York
Sambrook et al.,supra、9.50-9.51,11.7-11.8
Nakashima N et al.,Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci.2014;15(2):2773-2793
Sambrook et al.Molecular Cloning 2012
Weintraub,H. et al.,Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews - Trends in Genetics,Vol.1(1)1986
Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16
Sambrook et al.,Molecular cloning:A Laboratory Manual,Thrid Ed,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)
Proc.Natl.Acad.Sci,USA、2000,97,6640-6645
本出願の解決しようとする課題は、新規なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び1,4-ブタンジオール生産方法並びにポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオール生産用微生物を提供することにある。
本出願の一つの目的は、1,4-ブタンジオール生産方法を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオール生産用微生物を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオール生産用微生物を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法を提供する。
本出願の方法または微生物を利用する場合、効果的なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び1,4-ブタンジオール生産が可能である。
これを具体的に説明すれば、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態はそれぞれの異なる説明及び実施形態にも適用できる。即ち、本出願で開示された多様な要素のすべての組合せが本出願の範疇に属する。また、下記の具体的な記述により本出願の範疇が制限されるとは見られない。また、本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照に挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
本出願の一つの様態は、下記(1)~(5)を含む1,4-ブタンジオール生産方法を提供する:
(1)スクシニル-coA(succinyl-coA;SuCoA)をスクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)に変換する段階;
(2)スクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)を4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)に変換する段階;
(3)4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)を4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)に変換する段階;
(4)二つ以上の4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)を重合してポリ-4-ヒドロキシブチレート(poly-4-hydroxybutyrate;P4HB)を生産する段階;及び
(5)ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解させる段階。
(1)スクシニル-coA(succinyl-coA;SuCoA)をスクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)に変換する段階;
(2)スクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)を4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)に変換する段階;
(3)4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)を4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)に変換する段階;
(4)二つ以上の4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)を重合してポリ-4-ヒドロキシブチレート(poly-4-hydroxybutyrate;P4HB)を生産する段階;及び
(5)ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解させる段階。
上記(1)~(4)は、それぞれスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(succinate semialdehyde dehydrogenase)、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(4-hydroxybutyric acid dehydrogenase)、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ(4-hydroxybutyryl-CoA transferase)、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ(Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase)からなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド;上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用するものであってもよいが、これに制限されない。
上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼからなる群から選択されるいずれか一つ以上は、外来ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターを含む微生物により強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
ブドウ糖発酵で直接1,4-ブタンジオールを生産する場合には、1,4-ブタンジオールの微生物に対する毒性により生産性に制約がある。一方、本出願において細胞親和的なポリ-4-ヒドロキシブチレートを優先的に生産するため、本出願の生産方法は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産性が増加したものであってもよい。また、本出願は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産段階で遺伝子を導入し、オキサロアセテートを利用した還元型TCA経路を活性化;高生産性発酵工程;及び/又は還元型TCA経路を通じて発酵で発生する二酸化炭素を再利用してポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が増加したものであってもよい。また、このようなポリ-4-ヒドロキシブチレート生産性の増加により1,4-ブタンジオールの生産性がさらに増加したものであってもよい。
本出願の1,4-ブタンジオール生産方法は、TCA経路(TCA cycle)、還元型TCA経路(reductive TCA cycle)、及びグリオキシレート経路(glyoxylate cycle)からなる群から選択されるいずれか一つ以上の経路をさらに含むことができる。上記経路は、スクシニル-coAに変換するものであってもよい。
一具現例として、本出願の1,4-ブタンジオール生産方法は、TCA経路を含むものであってもよい。そのとき、ブドウ糖の一分子は、解糖過程(glycolysis pathway)を通じて生産されたピルベートがTCA経路を経てスクシニル-coAに変換される。
上記TCA経路は、(a1)ピルベートをアセチル-coAに変換する段階;(b1)アセチル-coA及びオキサロアセテートをシトレートに変換する段階;(c1)シトレートをイソシトレートに変換する段階;(d1)イソシトレートをα-ケトグルタレートに変換する段階;(e1)α-ケトグルタレートをスクシニル-coAに変換する段階;及び(f1)ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を含むこともできる。
上記(d1)は、イソシトレートからα-ケトグルタレート及び二酸化炭素に変換される段階であってもよく、上記(e1)は、α-ケトグルタレートからスクシニル-coA及び二酸化炭素に変換される段階であってもよい。
一具現例として、上記(a1)~(f1)は、それぞれピルベートデヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)、シトレートシンターゼ(citrate synthase)、アコニターゼ(aconitase)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(α-ketoglutarate dehydrogenase)、及びピルベートカルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)からなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド;上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用するものであってもよいが、これに制限されない。
上記生産方法は、(g1)ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階をさらに含むものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記(g1)は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(phosphoenolpyruvate carboxylase)ポリペプチド;上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用するものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の生産方法は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択される一つ以上の制限条件においてホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子(ppc)の転写が阻害を受けないものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の生産方法は、窒素、リン、硫黄、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上を制限させる段階を含むものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の生産方法は、窒素、リン、硫黄、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上が制限させる段階を含めても、上記制限させる段階を含まない方法に比べてポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオールが生産が減少しないものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記転写は、プロモーターにより阻害を受けないものであってもよいが、これに制限されない。上記プロモーターは、プロモーター活性を有する配列番号45で示されるポリヌクレオチドであってもよく、上記プロモーター活性を有する配列番号45で示されるヌクレオチド配列の目的遺伝子は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドであってもよい。窒素制限の条件でppcの転写が阻害を受けないプロモーターを用いる場合、rTCA経路が強化され、ポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオールの生産が増加され得る。窒素制限の条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子(ppc)の転写が阻害を受けないながら野生型ppcプロモーターと同等以上の活性を有するプロモーターを用いる場合、ポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオールの生産に効果的である。
一具現例として、上記生産方法は、(g1)段階が強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の1,4-ブタンジオール生産方法は、還元型TCA経路を含むものであってもよい。上記還元型TCA経路を通じてオキサロアセテートは、酸化的TCA経路に含まれた脱カルボキシル化(decarboxylation)過程を経ないため、付加的な二酸化炭素発生なしにマレート(malate)、フマレート(fumarate)、及びスクシネート(succinate)を経てスクシニル-coAに変換される。
上記還元型TCA経路は、(a2)オキサロアセテートをマレートに変換する段階;(b2)マレートをフマレートに変換する段階;(c2)フマレートをスクシネートに変換する段階;及び(d2)スクシネートをスクシニル-coAに変換する段階からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むものであってもよいが、これに制限されない。
本出願の生産方法は、上記還元型TCA経路に先立ち、(e2)ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階がさらに含まれたものであってもよい。上記(e2)は、上記(g1)と同様であってもよい。
一具現例として、本出願の生産方法は、還元型TCA経路が強化されたものであってもよく、上記還元型TCA経路強化は、(e2)ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階の強化を含んでもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記還元型TCA経路は、下記(I)~(XII)からなる群から選択されるいずれか一つ以上により強化されたものであってもよいが、これに制限されない:
(I)ピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)弱化;(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase)強化;(III)カルボニックアンヒドラーゼ(carbonic anhydrase)強化;(IV)シトレートシンターゼ(citrate synthase)調節;(V)ピルベートカルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)強化;(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NAD+-dependent malate dehydrogenase)弱化;(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NADP+-dependent malate dehydrogenase)弱化;(VIII)ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(phosphogluconate dehydratase)弱化;(IX)2-ケト-4-ヒドロキシグルタレート:2-ケト-3-デオキシグルコネート6-ホスフェートアルドラーゼ(2-keto-4-hydroxyglutarate:2-keto-3-deoxygluconate 6-phosphate aldolase;KHG/KDPG aldolase)弱化;(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)弱化;(XI)グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント(glucose-specific PTS enzyme IIBC component)弱化;及び(XII)重炭酸塩トランスポーター(bicarbonate transporter)強化。
(I)ピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)弱化;(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase)強化;(III)カルボニックアンヒドラーゼ(carbonic anhydrase)強化;(IV)シトレートシンターゼ(citrate synthase)調節;(V)ピルベートカルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)強化;(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NAD+-dependent malate dehydrogenase)弱化;(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NADP+-dependent malate dehydrogenase)弱化;(VIII)ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(phosphogluconate dehydratase)弱化;(IX)2-ケト-4-ヒドロキシグルタレート:2-ケト-3-デオキシグルコネート6-ホスフェートアルドラーゼ(2-keto-4-hydroxyglutarate:2-keto-3-deoxygluconate 6-phosphate aldolase;KHG/KDPG aldolase)弱化;(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)弱化;(XI)グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント(glucose-specific PTS enzyme IIBC component)弱化;及び(XII)重炭酸塩トランスポーター(bicarbonate transporter)強化。
一具現例として、上記ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階は、ピルビン酸キナーゼ弱化及びカルボニックアンヒドラーゼ強化;ピルビン酸キナーゼ弱化及びホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化;シトレートシンターゼ調節及びホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化;シトレートシンターゼ調節及びカルボニックアンヒドラーゼ強化;及びピルビン酸キナーゼ弱化、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化、及びピルベートカルボキシラーゼ強化により強化されたものであってもよく、選択的に、カルボニックアンヒドラーゼ強化、NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化、NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化、KHG/KDPGアルドラーゼ弱化、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化、グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント弱化;及び/又は重炭酸塩トランスポーター強化で構成される群から選択されるいずれか一つ以上により強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記還元型TCA経路は、(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化;(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;及び/又は
(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化を含むこともできる。
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;及び/又は
(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化を含むこともできる。
一具現例として、上記還元型TCA経路は、(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼが強化されたものであってもよい。
一具現例として、上記還元型TCA経路は、(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ及び(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼが弱化されたものであってもよい。
一具現例として、上記還元型TCA経路は、(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが弱化されたものであってもよい。
一具現例として、本出願のrTCA経路を通じて発酵で発生する二酸化炭素を再利用してポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオール生産収率を増加させるものであってもよい。
一具現例として、本出願の1,4-ブタンジオール生産方法は、グリオキシレート経路を含むものであってもよい。
上記グリオキシレート経路は、(a3)イソシトレートをグリオキシレート(glyoxylate)及びスクシネート(succinate)に変換する段階;(b3)グリオキシレート(glyoxylate)及びアセチル-coAをマレート及びcoAに変換する段階;(c3)シトレートをイソシトレートに変換する段階;(d3)ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階;(e3)ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階;(f3)オキサロアセテート及びアセチル-coAをシトレートに変換する段階;(g3)マレートをフマレートに変換する段階;(h3)フマレートをスクシネートに変換する段階;及び(i3)スクシネートをスクシニル-coAに変換する段階で構成される群からいずれか一つ以上をさらに含むものであってもよいが、これに制限されない。上記(f3)は(b1)と、上記(g3)は(b2)と、上記(h3)は(c2)と、上記(i3)は上記(d2)と同様であってもよい。
一具現例として、上記グリオキシレート経路は、(i)シトレートシンターゼ(citrate synthase)強化;(ii)イソシトレートデヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)弱化;(iii)イソシトレートリアーゼ(isocitrate lyase)強化;(iv)イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼ(Isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase)強化;(v)マレートシンターゼG(malate synthase G)強化;及び(vi)マレートシンターゼA(malate synthase A)強化からなる群から選択されるいずれか一つ以上によるものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記グリオキシレート経路を含む本出願の方法は、(j3)α-ケトグルタレートをスクシニル-coAに変換する段階及び/又は(k3)オキサロアセテートをマレートに変換する段階がさらに弱化されたものであってもよいが、これに制限されない。
上記グリオキシレート経路の生成物であるスクシネート及びマレートは、いずれも還元型TCA経路を利用してスクシニル-coAに変換されてもよい。
本出願において、「スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(succinate semialdehyde dehydrogenase)」は、スクシニル-coA(succinyl-coA;SuCoA)がスクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)に変換される反応を触媒できる酵素である。上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、SucDと混用され得る。
一具現例として、本出願のSucDタンパク質は、クロストリジウム・クライベリ(Clostridium Kluyveri)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りSucDに含まれる。一具現例として、本出願のSucDタンパク質は、配列番号1またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、sucD、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記sucD遺伝子は、例えば、配列番号2の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(4-hydroxybutyric acid dehydrogenase)」は、スクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)が4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)に変換される反応を触媒できる酵素である。上記4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼは、スクシネートセミアルデヒドレダクターゼ(succinate semialdehyde reductase)及び4HbDと混用され得る。
一具現例として、本出願の4HbDタンパク質は、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限り4HbDに含まれる。一具現例として、本出願の4HbDタンパク質は、配列番号3またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は4hbD、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記4hbD遺伝子は、例えば、配列番号4の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ(4-hydroxybutyryl-CoA transferase)」は、4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)が4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)に変換される反応を触媒できる酵素である。上記4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼはOrfZと混用され得る。
一具現例として、本出願のOrfZタンパク質は、クロストリジウム・クライベリ(Clostridium Kluyveri)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りOrfZに含まれる。一具現例として、本出願のOrfZタンパク質は、配列番号5またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ遺伝子は、orfZ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記orfZ遺伝子は、例えば、配列番号6の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記SucD、4HbD、及び/又はOrfZのアミノ酸及び遺伝子配列はUS 9084467 B2から得ることができるが、これに制限されない。
本出願において、「ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ(Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase)」は、二つ以上の4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)をポリ-4-ヒドロキシブチレート(poly-4-hydroxybutyrate;P4HB)で重合する反応を触媒できる酵素である。上記ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼはPhaCと混用され得る。
一具現例として、本出願のPhaCタンパク質は多様な微生物由来であってもよく、具体的には、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)またはルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)由来であってもよく、これら由来の融合タンパク質であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りPhaCに含まれる。
一具現例として、本出願のPhaCタンパク質は、配列番号7またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
一具現例として、上記PhaCのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、WO 2014058655 A1から得ることができるが、これに制限されない。
本出願において、ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ遺伝子は、phaC、ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記phaC遺伝子は、例えば、配列番号8の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、ピルベートデヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)はピルベートがアセチル-coAに変換される反応を触媒できる酵素;シトレートシンターゼ(citrate synthase)はオキサロアセテート及びアセチル-coAを縮合してシトレートを生成する反応を触媒できる酵素;アコニターゼ(aconitase)はシトレートがイソシトレートに変換される反応を触媒できる酵素;イソシトレートデヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)はイソシトレートがα-ケトグルタレートに変換される反応を触媒できる酵素;α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(α-ketoglutarate dehydrogenase)はα-ケトグルタレートがスクシニル-coAに変換される反応を触媒できる酵素;スクシニル-coAシンテターゼ(succinyl-coA synthetase)はスクシニル-coAがスクシネートに変換される反応を触媒できる酵素;及びピルベートカルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)はピルベートがオキサロアセテートに変換される反応を触媒できる酵素を意味する。
上記ピルベートデヒドロゲナーゼないしピルベートカルボキシラーゼはTCA経路に含まれる酵素であってもよく、微生物または生産方法に内在的なものであってもよく、または野生型酵素に比べて強化されたものであってもよい。
本出願において、「ピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)」は、ホスホエノールピルベート(phosphoenolpyruvate;PEP)がピルベートに変換される反応を触媒できる酵素である。上記ピルビン酸キナーゼはPykと混用され得る。
一具現例として、本出願のPykタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りPykに含まれる。
一具現例として、本出願のPykタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りPykに含まれる。一具現例として、本出願のPykタンパク質は、配列番号9、配列番号11またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、ピルビン酸キナーゼ遺伝子は、pykA、pykF、及びピルビン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記pykA、pykF遺伝子は、例えば、配列番号10または配列番号12の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase)」はホスホエノールピルベートがオキサロアセテートに変換される反応を触媒する酵素である。上記ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼはPPCと混用され得る。
一具現例として、本出願のPPCタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りPPCに含まれる。
一具現例として、本出願のPPCタンパク質は、強化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りPPCに含まれる。一具現例として、本出願のPPCタンパク質は、配列番号13またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子は、ppc及びホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ppc遺伝子は、例えば、配列番号14の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の微生物は、窒素(nitrogen)、硫黄(sulfur)、リン(phosphorous)、及びマグネシウム(magnesium)で構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でもポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能があり、特に、その増加した生産能を有するものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の微生物は、窒素(nitrogen)、硫黄(sulfur)、リン(phosphorous)、及び/又はマグネシウム(magnesium)制限の条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子(ppc)の転写が阻害を受けないプロモーターをさらに含むものであってもよい。上記プロモーターは、プロモーター活性を有する配列番号45で示されるポリヌクレオチドであってもよく、上記プロモーター活性を有する配列番号45で示されるヌクレオチド配列の目的遺伝子は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドであってもよい。窒素制限の条件でppcの転写が阻害を受けないプロモーターを用いる場合、ポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオールの生産を増加することができる。既存の大腸菌のppc発現は、窒素制限の条件で阻害を受けるが、微生物は、窒素制限の条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子(ppc)の転写が阻害を受けないながら野生型ppcプロモーターと同等以上の活性を有するプロモーターを用いる場合、ポリ-4-ヒドロキシブチレート及び/又は1,4-ブタンジオールの生産に効果的である。
本出願において、「カルボニックアンヒドラーゼ(carbonic anhydrase)」は、ヒドロゲンカルボネート(hydrogencarbonate)を二酸化炭素及び水に変換することを触媒できる酵素である。上記カルボニックアンヒドラーゼは、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼの補助役割をする酵素であってもよく、PPCの円滑な性能発揮のためには、重炭酸塩(Bicarbonate;HCO3-)の供給が必要であるが、カルボニックアンヒドラーゼは、二酸化炭素からHCO3-を生産できる酵素であってもよい。上記カルボニックアンヒドラーゼはEcaAと混用され得る。
一具現例として、本出願のEcaAタンパク質は、ノストック属(Nostoc sp.)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りEcaAに含まれる。
一具現例として、本出願のEcaAタンパク質は、強化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りEcaAに含まれる。一具現例として、本出願のEcaAタンパク質は、配列番号15またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、カルボニックアンヒドラーゼ遺伝子は、ecaA及びカルボニックアンヒドラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ecaA遺伝子は、例えば、配列番号16の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「シトレートシンターゼ(citrate synthase)」オキサロアセテート及びアセチル-coAを縮合してシトレートを生成する反応を触媒できる酵素である。上記シトレートシンターゼはGltAと混用され得る。
一具現例として、本出願のGltAタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りGltAに含まれる。
一具現例として、本出願のGltAタンパク質は調節されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りGltAに含まれる。一具現例として、本出願のGltAタンパク質は、配列番号17またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、シトレートシンターゼ遺伝子はgltA及びシトレートシンターゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記gltA遺伝子は、例えば、配列番号18の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「ピルベートカルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)」は、ピルベートと二酸化炭素がオキサロアセテートに変換される反応を触媒できる酵素である。上記ピルベートカルボキシラーゼはPycと混用され得る。
一具現例として、本出願のPycタンパク質は、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りPycに含まれる。
一具現例として、本出願のPycタンパク質は、強化されたものであってもよく、外来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りPycに含まれる。一具現例として、本出願のPycタンパク質は、配列番号19またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子は、pyc及びピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記pyc遺伝子は、例えば、配列番号20の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NAD+-dependent malate dehydrogenase)」は、マレートをピルベートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼはMaeAと混用され得る。
一具現例として、本出願のMaeAタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りMaeAに含まれる。
一具現例として、本出願のMaeAタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りMaeAに含まれる。一具現例として、本出願のMaeAタンパク質は、配列番号21またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、maeA及びNAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記maeA遺伝子は、例えば、配列番号22の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NADP+-dependent malate dehydrogenase)」は、マレートをピルベートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼはMaeBと混用され得る。
一具現例として、本出願のMaeBタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りMaeBに含まれる。
一具現例として、本出願のMaeBタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りMaeBに含まれる。一具現例として、本出願のMaeBタンパク質は、配列番号23またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、maeB及びNADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記maeB遺伝子は、例えば、配列番号24の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(phosphogluconate dehydratase」は、6-ホスホ-D-グルコネート(6-phospho-D-gluconate)が2-デヒドロ-3-デオキシ-6-ホスホ-D-グルコネート(2-dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconate)に変換される反応を触媒できる酵素である。上記ホスホグルコン酸デヒドラターゼはEDDと混用され得る。
一具現例として、本出願のEDDタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りEDDに含まれる。
一具現例として、本出願のEDDタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りEDDに含まれる。一具現例として、本出願のEDDタンパク質は、配列番号25またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子は、edd及びホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記edd遺伝子は、例えば、配列番号26の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「2-ケト-4-ヒドロキシグルタレート:2-ケト-3-デオキシグルコネート6-ホスフェートアルドラーゼ(2-keto-4-hydroxyglutarate:2-keto-3-deoxygluconate 6-phosphate aldolase;KHG/KDPG aldolase)」は、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタレートをグリセルアルデヒド-3-ホスフェート及びピルベートへの変換を触媒できる酵素である。上記ホスホグルコン酸デヒドラターゼはKHG/KDPGアルドラーゼ、Edaと混用され得る。
一具現例として、本出願のEdaタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りEdaに含まれる。
一具現例として、本出願のEdaタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りEdaに含まれる。一具現例として、本出願のEdaタンパク質は、配列番号27またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、KHG/KDPGアルドラーゼ遺伝子は、eda及びKHG/KDPGアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記eda遺伝子は、例えば、配列番号28の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)」は、2-オキソグルタレート及びアスパラギン酸塩をグルタメート及びオキサロアセテートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼはAspCと混用され得る。
一具現例として、本出願のAspCタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りAspCに含まれる。
一具現例として、本出願のAspCタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りAspCに含まれる。一具現例として、本出願のAspCタンパク質は、配列番号29またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、aspC、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記aspC遺伝子は、例えば、配列番号30の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント(glucose-specific phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system(PTS) enzyme IIBC component)」は、ブドウ糖の輸送に関与する酵素であるPTSの部分である。一具現例として、上記グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネントは、ホスホエノールピルベートpoolを増加させ、還元型TCA経路を強化させることができる。上記グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネントはIIBCと混用され得る。
一具現例として、本出願のIIBCタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りIIBCに含まれる。
一具現例として、本出願のIIBCタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りIIBCに含まれる。一具現例として、本出願のIIBCタンパク質は、配列番号31またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント遺伝子は、ptsG、グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネントをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ptsG遺伝子は、例えば、配列番号32の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「重炭酸塩トランスポーター(bicarbonate transporter)」は、重炭酸塩(bicarbonate)を輸送する運搬体であり、二酸化炭素の細胞内流入を増加させる。上記重炭酸塩トランスポーターはSbtAと混用され得る。
一具現例として、本出願のSbtAタンパク質は、シネコシスティス属(Synechocystis sp.)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りSbtAに含まれる。
一具現例として、本出願のSbtAタンパク質は、強化されたものであってもよく、外来であってもよく、シアノバクテリア(Cyanobacteria)由来であってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りSbtAに含まれる。一具現例として、本出願のSbtAタンパク質は、配列番号33またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、SbtA遺伝子は、sbtA、重炭酸塩トランスポーターをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記sbtA遺伝子は、例えば、配列番号34の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「イソシトレートデヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)」は、イソシトレートを2-オキソグルタレートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記イソシトレートデヒドロゲナーゼはIcdと混用され得る。
一具現例として、本出願のIcdタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りIcdに含まれる。
一具現例として、本出願のIcdタンパク質は、弱化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りIcdに含まれる。一具現例として、本出願のIcdタンパク質は、配列番号35またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、Icd遺伝子は、icd、イソシトレートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記icd遺伝子は、例えば、配列番号36の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「イソシトレートリアーゼ(isocitrate lyase)」は、イソシトレートをグリオキシレート及びスクシネートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記イソシトレートリアーゼはAceAと混用され得る。
一具現例として、本出願のAceAタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りAceAに含まれる。
一具現例として、本出願のAceAタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りAceAに含まれる。一具現例として、本出願のAceAタンパク質は、配列番号37またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、AceA遺伝子は、aceA、イソシトレートリアーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記aceA遺伝子は、例えば、配列番号38の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼ(Isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase)」は、イソシトレートデヒドロゲナーゼをリン酸化または脱リン酸化を触媒できる酵素である。一具現例として、上記イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼはIcdを弱化させることができる、上記イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼはAceKと混用され得る。
一具現例として、本出願のAceKタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りAceKに含まれる。
一具現例として、本出願のAceKタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りAceKに含まれる。一具現例として、本出願のAceKタンパク質は、配列番号39、またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、AceK遺伝子は、aceK、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記aceK遺伝子は、例えば、配列番号40の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「マレートシンターゼG(malate synthase G)」は、グリオキシレートとアセチル-coAをマレートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記マレートシンターゼGはGlcBと混用され得る。
一具現例として、本出願のGlcBタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りGlcBに含まれる。
一具現例として、本出願のGlcBタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りGlcBに含まれる。一具現例として、本出願のGlcBタンパク質は、配列番号41またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、GlcB遺伝子は、glcB、マレートシンターゼGをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記glcB遺伝子は、例えば、配列番号42の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
本出願において、「マレートシンターゼA(malate synthase A)」は、グリオキシレートとアセチル-coAをマレートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記マレートシンターゼAはAceBと混用され得る。
一具現例として、本出願のAceBタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りAceBに含まれる。
一具現例として、本出願のAceBタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りAceBに含まれる。一具現例として、本出願のAceBタンパク質は、配列番号43またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る(essentially consisting of)ものであってもよい。
本出願において、AceB遺伝子は、aceB、マレートシンターゼAをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記aceB遺伝子は、例えば、配列番号44の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
上記酵素(例えば、SucDなど)のアミノ酸配列は、公知のデータベースであるNCBIのGenBankなど多様なデータベースでその配列を得ることができるが、これに制限されない。
本出願において「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質」、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはタンパク質」または「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願において用いられることは自明である。例えば、上記アミノ酸配列のN末端、内部、そして/またはC末端にタンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生し得る突然変異、そのサイレント突然変異(silent mutation)または保存的置換を有する場合である。
具体的には、本出願のタンパク質は、特定配列番号のアミノ酸配列を含んだり、または特定配列番号のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、上記相同性または同一性を有し、上記タンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有しても本出願の範囲内に含まれることは自明である。
上記「保存的置換(conservative substitution)」は、あるアミノ酸を類似した構造的及び/又は化学的性質を有するもう一つのアミノ酸で置換させることを意味する。このようなアミノ酸の置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び/又は両親媒性(amphipathic nature)における類似性に基づいて発生する。通常、保存的置換は、ポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさない。
本出願において用語、「相同性(homology)」または「同一性(identity)」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列の相互間の同一または類似の程度を意味し、百分率で表示することができる。用語、相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に利用され得る。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用できる。実質的に、相同性を有したり(homologous)または同一の(identical)配列は、一般に、配列全体または全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%に該当する一部分と中程度または高いストリンジェントな条件(stringent conditions)でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドで一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]:2444でのようなデフォルトパラメータを利用して「FASTA」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定することができる。または、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.、2000,Trends Genet. 16:276-277)(バージョン5.0.0または以降のバージョン)で行われるような、ニードルマン-ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(Needleman and Wunsch、1970,J. Mol. Biol. 48:443-453)を使用して決定することができる(GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.,et al,Nucleic Acids Research 12:387 (1984))、BLASTP,BLASTN,FASTA (Atschul,[S.] [F.,] [ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403 (1990);Guide to Huge Computers,Martin J. Bishop,[ED.,] Academic Press,San Diego、1994、及び[CARILLO ETA/。](1988) SIAM J Applied Math 48:1073を含む)。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのBLAST、またはClustalWを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Smith and Waterman,Adv. Appl. Math (1981) 2:482において公知となっているように、例えば、Needleman et al. (1970)、J Mol Biol. 48:443のようなGAPコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、GAPプログラムは、2つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号(即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の数を除した値と定義することができる。GAPプログラムのためのデフォルトパラメータは、(1)2進法比較マトリックス(同一性のために1そして非同一性のために0の値を含む)及びSchwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp. 353-358 (1979)により開示された通り、Gribskov et al(1986)Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス(またはEDNAFULL (NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス);(2)各ギャップのための3.0のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の0.10ペナルティ(またはギャップ開放ペナルティ10、ギャップ延長ペナルティ0.5);及び(3)末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
また、任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術範囲内であり、当業者によく知られている方法(例えば、J. Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual、2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York、1989;F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)で決定することができる。
本出願の遺伝子(例えば、sucD)は、公知のデータベースであるNCBIのGenBankなど多様なデータベースでその配列を得ることができるが、これに制限されない。
本出願の遺伝子(例えば、sucD)は、公知のデータベースであるNCBIのGenBankなど多様なデータベースでその配列を得ることができるが、これに制限されない。
一例として、クロストリジウム・クライベリ由来のsucD遺伝子は配列番号2;アラビドプシス・サリアナ由来の4hbD遺伝子は配列番号4;クロストリジウム・クライベリ由来のorfZ遺伝子は配列番号6;シュードモナス・プチダ/ルストニア・ユートロファ由来のポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ融合タンパク質phaC3/C1遺伝子は配列番号8;エシェリキア・コリ由来のpykA、pykF、ppc、gltA、maeA、maeB. edd、eda、ptsG、icd、aceA、aceK、glcB、及びaceB遺伝子は、それぞれ配列番号10、12、14、18、22、24、26、28、30、32、36、38、40、42、及び44;ノストック属由来のecaA遺伝子は配列番号16;リゾビウム・エトリ由来のpyc遺伝子は配列番号20;及びシネコシスティス属由来のsbtA遺伝子は配列番号34の塩基配列を含んだり、有したり、からなるものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の遺伝子は、エシェリキア属またはコリネバクテリウム属微生物に適するようにコドン最適化したものであってもよいが、これに制限されない。
本出願において用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体(monomer)が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体(polymer)であり、一定の長さ以上のDNA鎖である。
本出願のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、コドンの縮退性(degeneracy)により、または特定のポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。上記ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、及び/又は44の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
また、本出願のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、公知の遺伝子配列から製造されてもよいプローブ、例えば、本出願の塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションし、本出願のアミノ酸配列をコードする配列であれば、制限なく含まれ得る。上記「ストリンジェントな条件(stringent condition)」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献(例えば、J. Sambrook et al.、同上)に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高いポリヌクレオチド同士、40%以上、具体的には、90%以上、より具体的には、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、さらに具体的には、99%以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションし、それより相同性または同一性が低いポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション(southern hybridization)の洗浄条件である60℃、1ХSSC、0.1% SDS、具体的には60℃、0.1ХSSC、0.1% SDS、より具体的には68℃、0.1ХSSC、0.1% SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、具体的には2回~3回洗浄する条件を列挙することができる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、DNAに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含むことができる。
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用いて上述の条件を用いて探知することができる。また、上記Tm値は60℃、63℃または65℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適切に調節することができる。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は当該技術分野によく知られている(Sambrook et al.,supra、9.50-9.51,11.7-11.8参照)。
本出願において、ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用することは、上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物を培養及び/又は上記培養された微生物または培地から特定物質(例えば、スクシネートセミアルデヒド、4-ヒドロキシブチレート、または4-ヒドロキシブチリルcoAなど)を回収することであってもよいが、これに制限されない。
本出願の生産方法における「弱化」は、特定の経路または段階の弱化であってもよく、上記経路や段階に関与する酵素の弱化であってもよい。上記弱化は、不活性化(inactivation)、欠乏(deficiency)、下向き調節(down-regulation)、減少(decrease)、低下(reduce)、減衰(attenuation)などの用語と混用され得る。上記酵素の弱化は、上記酵素ポリペプチド;上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を減少、欠失、または不活性化させることであってもよい。本出願の生産方法が微生物を利用できるという点から、本出願の生産方法における「弱化」は「ポリペプチド活性の弱化」も含む。
本出願の生産方法における「強化」は、特定の経路または段階の強化であってもよく、上記経路や段階に関与する酵素の強化であってもよい。上記強化は、活性化(activation)、上向き調節(up-regulation)、過発現(overexpression)、増加(increase)などの用語と混用され得る。上記酵素の強化は、上記酵素ポリペプチド;上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を増加、活性化、または過発現させることであってもよい。本出願の生産方法が微生物を利用できるという点から、本出願の生産方法における「強化」は、ポリペプチド活性の「強化」も含む。
本出願において用語、「調節」は、上記「強化」及び/又は「弱化」であってもよいが、これに制限されない。
本出願において、上記(5)ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解する段階は、化学的方法を利用するものであってもよく、熱分解、水素化、またはこれらの組合せを利用するものであってもよいが、ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解できる限り、これに制限されない。
本出願のもう一つの様態は、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物を提供する。
上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、下記の1,4-ブタンジオール、TCA経路、還元型TCA経路、ピルベートデヒドロゲナーゼ、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、(I)~(XII)、(i)~(vi)、及びこれと関連した酵素などは、他の様態で説明した通りである。
本出願において、上記微生物は、細胞親和的なポリ-4-ヒドロキシブチレートを優先的に生産することであるため、本出願の微生物は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が増加したものであってもよく、これにより、1,4-ブタンジオールの生産能がさらに増加したものであってもよい。また、本出願の微生物は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産段階で遺伝子を導入してオキサロアセテートを利用した還元型TCA経路の活性化;高生産性の発酵工程;及び/又は還元型TCA経路を通じて発酵から発生する二酸化炭素を再利用してポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が増加したものであってもよい。
一具現例として、上記微生物は、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼで構成される群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチドの活性が強化されたものであってもよい:
一具現例として、上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及び/又はポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼをコードする遺伝子は、外来から導入されたものであってもよいが、これに制限されない。
一例として、上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び/又は4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼをコードする遺伝子はクルロストリジウム・クライベリ由来であってもよく、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)由来であってもよいが、これに制限されない。
一例として、上記ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)またはルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)由来であってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記微生物はTCA経路を含むものであってもよい。
一具現例として、上記微生物は、ピルベートデヒドロゲナーゼ、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、及びピルベートカルボキシラーゼからなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含むものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の微生物は、還元型TCA経路を含んでもよく、強化されたものであってもよい。
一具現例として、本出願の微生物は、下記(I)~(XII)からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むものであってもよいが、これに制限されない:
(I)ピルビン酸キナーゼ弱化;
(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化;
(III)カルボニックアンヒドラーゼ強化;
(IV)シトレートシンターゼ調節;
(V)ピルベートカルボキシラーゼ強化;
(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VIII)ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化;
(IX)2-ケト-4-ヒドロキシグルタレートKDPG:2-ケト-3-デオキシグルコネート6-ホスフェートアルドラーゼ弱化;
(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化;
(XI)グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント弱化;及び
(XII)重炭酸塩トランスポーター強化
(I)ピルビン酸キナーゼ弱化;
(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化;
(III)カルボニックアンヒドラーゼ強化;
(IV)シトレートシンターゼ調節;
(V)ピルベートカルボキシラーゼ強化;
(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VIII)ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化;
(IX)2-ケト-4-ヒドロキシグルタレートKDPG:2-ケト-3-デオキシグルコネート6-ホスフェートアルドラーゼ弱化;
(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化;
(XI)グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント弱化;及び
(XII)重炭酸塩トランスポーター強化
一具現例として、本出願の微生物は、(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化;
(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;及び/又は
(X)アスパラギン酸塩アミノトランストランスフェラーゼ弱化を含んでもよい。
(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;及び/又は
(X)アスパラギン酸塩アミノトランストランスフェラーゼ弱化を含んでもよい。
一具現例として、本出願の微生物は、(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化を含めてもよい。
一具現例として、本出願の微生物は、(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化及び(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化を含めてもよい。
一具現例として、本出願の微生物は、(X)アスパラギン酸アミノトランストランスフェラーゼ弱化を含んでもよい。
一具現例として、上記ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子は外来遺伝子であってもよく、具体的にはリゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)由来であってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、上記シトレートシンターゼの調節は、遺伝子変異によるものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の微生物は、グリオキシレート経路を含んでもよく、強化されたものであってもよい。
一具現例として、本出願の微生物は、下記(i)~(vi)からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むものであってもよいが、これに制限されない:
(i)シトレートシンターゼ強化;
(ii)イソシトレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(iii)イソシトレートリアーゼ強化;
(iv)イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼ強化;
(v)マレートシンターゼG強化;及び
(vi)マレートシンターゼA強化。
(i)シトレートシンターゼ強化;
(ii)イソシトレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(iii)イソシトレートリアーゼ強化;
(iv)イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼ強化;
(v)マレートシンターゼG強化;及び
(vi)マレートシンターゼA強化。
上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼなどは、他の様態で説明した通りである。
一具現例として、本出願の微生物は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でもポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能があるものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の微生物は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択される一つ以上の制限条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子(ppc)の転写が阻害を受けないものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願の微生物は、窒素、リン、硫黄、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でも上記栄養素制限がない条件に比べてポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が維持されたり減少しないものであってもよいが、これに制限されない。
一具現例として、本出願において目的とするポリペプチド(例えば、SucD、PhaC、OrfZ)が含まれたり強化された微生物は、目的とするポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを含むものであってもよい。
本出願のベクターは、適した宿主内で目的ポリペプチドを発現させるように適した発現調節領域(または発現調節配列)に作動可能に連結された上記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むDNA製造物を含むことができる。上記発現調節領域は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係がなく複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
本出願で用いられるベクターは、特に、限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてpWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、及びCharon21Aなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてpDZ系、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及びpET系などを使用することができる。具体的には、pDZ、pDC、pDCM2(大韓民国公開特許公報第10-2020-0136813号)、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pIMR53ベクターなどを使用することができる。
一例として、細胞内染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え(homologous recombination)により行われるが、これに限定されない。上記染色体挿入の有無を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含むことができる。上記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入の有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤(selective agent)が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存したり、他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願において用語、「形質転換」は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞あるいは微生物内に導入して宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置したり、染色体外に位置したりに関係なく、これらすべてを含むことができる。また、上記ポリヌクレオチドは、目的ポリペプチドをコードするDNA及び/又はRNAを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態でも導入することができる。例えば、上記ポリヌクレオチドは、自主的に発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入することができる。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含むことができる。上記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
また、上記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と上記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
一具現例として、本出願のスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物は、これらを含まない微生物に比べてスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ活性が強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
本出願において用語「微生物」または「菌株」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されるなどの原因により特定の機序が強化された微生物であってもよい。
一具現例として、本出願の微生物は、エシェリキア属(Genus Escherichia)またはコリネバクテリウム属(Genus Corynebacterium)であってもよく、具体的には、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)であってもよいが、これに制限されない。
本出願の微生物は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産用であってもよく、これから生産されたポリ-4-ヒドロキシブチレートは、化学的工程により1,4-ブタンジオールを生産し、本出願の微生物が1,4-ブタンジオールの生産に用いられるが、これに制限されない。
本出願の微生物は、本出願の強化または導入の対象となるポリペプチド(例えば、SucD、4HbD、OrfZ、PhaC、PPC、EcaA、Glta、Pyc、AceK、及び/又はAceAなど)、これをコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む微生物;本出願の強化または導入の対象となるポリペプチドまたは遺伝子を発現するように変形された微生物;本出願の強化または導入の対象となるポリペプチドまたは遺伝子を発現する微生物;本出願のポリペプチドまたは遺伝子を活性を有する微生物;本出願の弱化の対象となるポリペプチド(例えば、Pyk、GltA、MaeA、MaeB、Edd、Eda、及び/又はAspCなど)が弱化するように変形された微生物;及び/又は本出願の弱化の対象となるポリペプチドまたは遺伝子またはその活性が弱化された微生物(例えば、組換え菌株)であってもよいが、これに制限されない。
本出願の微生物は、自然的に本出願のポリペプチド(例えば、SucD、MaeAなど)、1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能を有している微生物;またはポリペプチド、1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能がない親株に本出願の強化または導入の対象となるポリペプチド、遺伝子、ポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターが導入されたり、弱化の対象となる遺伝子またはポリヌクレオチドまたはその活性が弱化されてポリペプチドが強化または弱化、または1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が強化されたり付与された微生物であってもよいが、これに制限されない。
一例として、本出願の微生物は、本出願のポリペプチド、遺伝子、ポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターで形質転換(これにより、強化、弱化、導入など)され、1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレートを生産できたり生産能が増加した微生物をすべて含むことができる。
例えば、本出願の微生物は、天然の野生型微生物、1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレートを生産する微生物に本出願のポリペプチドが発現または弱化され、1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が増加した組換え微生物であってもよい。上記1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が増加した組換え微生物は、天然の野生型微生物または本出願のポリペプチド非変形微生物(即ち、野生型遺伝子を含む微生物、本出願の遺伝子が強化されたり導入されない微生物、または本出願の遺伝子が弱化されていない微生物)に比べて1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
一例として、上記生産能が増加した組換え微生物は、変異前の親株または非変形微生物の1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能に比べて約0.001%以上または0.01%以上、1,4-ブタンジオール及び/又はポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能が高くなったものであってもよいが、変異前の親株または非変形微生物の生産能に比べて+値の増加量を有する限り、これに制限されない。上記用語「約(about)」は、±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1などをすべて含む範囲であり、約という用語の後に出てくる数値と同等または類似の範囲の数値をすべて含むが、これに制限されない。
本出願において用語「非変形微生物」は、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む微生物を除くものではなく、野生型微生物または天然型微生物自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化する前の微生物を意味する。例えば、上記非変形微生物は、本明細書に記載されたポリペプチドが発現していないか、弱化されていないか、導入される前の微生物を意味する。上記「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変形前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部または全体の変形は、(a)微生物内染色体挿入用ベクターを利用した相同組換えまたは遺伝子はさみ(engineered nuclease,e.g.,CRISPR-Cas9)を利用したゲノム編集及び/又は(b)紫外線及び放射線などのような光及び/又は化学物質処理により誘導されてもよいが、これに制限されない。上記遺伝子の一部または全体の変形方法には、DNA組換え技術による方法が含まれ得る。例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを上記微生物に注入して相同組換え(homologous recombination)が起きるようにして遺伝子の一部または全体の欠損が行われる。上記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において用語、ポリペプチド活性の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少したりまたは活性がないことをいずれも含む概念である。上記弱化は、不活性化(inactivation)、欠乏(deficiency)、下向き調節(down-regulation)、減少(decrease)、低下(reduce)、減衰(attenuation)などの用語と混用され得る。
上記弱化は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自らの活性が本来微生物が有するポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、これをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳(translation)の阻害などにより、細胞内で全体的なポリペプチド活性の程度及び/又は濃度(発現量)が天然型菌株に比べて低い場合、上記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び/又はポリヌクレオチドが発現されてもポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。上記「内在的活性」は、自然的または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化する場合、形質変化前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下向き調節、低下、減衰」するということは、形質変化前の母菌株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性に比べて低くなったことを意味する。
このようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られている任意の方法により行われるが、これに制限されるものではなく、当該分野によく知られた多様な方法の適用により達成することができる(例えば、Nakashima N et al.,Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014;15(2):2773-2793,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012など)。
具体的には、本出願のポリペプチド活性の弱化は
1)ポリペプチドをコードする遺伝子全体または一部の欠損;
2)ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域(または発現調節配列)の変形;
3)ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形(例えば、アミノ酸配列上の1以上のアミノ酸の削除/置換/付加);
4)ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化するように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の1以上の核酸塩基の削除/置換/付加);
5)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
6)ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的で結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入;
7)リボソーム(ribosome)の付着が不可能な2次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加;
8)ポリペプチドをコードする遺伝子配列のORF(open reading frame)の3’末端に反対方向に転写するプロモーターの付加(Reverse transcription engineering,RTE);または
9)上記1)~8)から選択された2以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
1)ポリペプチドをコードする遺伝子全体または一部の欠損;
2)ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域(または発現調節配列)の変形;
3)ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形(例えば、アミノ酸配列上の1以上のアミノ酸の削除/置換/付加);
4)ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化するように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の1以上の核酸塩基の削除/置換/付加);
5)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
6)ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的で結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入;
7)リボソーム(ribosome)の付着が不可能な2次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加;
8)ポリペプチドをコードする遺伝子配列のORF(open reading frame)の3’末端に反対方向に転写するプロモーターの付加(Reverse transcription engineering,RTE);または
9)上記1)~8)から選択された2以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
例えば、
上記1)ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換またはマーカー遺伝子での交換であってもよい。
上記1)ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換またはマーカー遺伝子での交換であってもよい。
また、上記2)発現調節領域(または発現調節配列)の変形は、欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより発現調節領域(または発現調節配列)上の変異発生、またはさらに弱い活性を有する配列での交換であってもよい。上記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
また、上記5)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換するものであってもよいが、これに制限されない。
また、上記3)及び4)のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列または上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより配列上の変異発生、またはさらに弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列での交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成させることにより、遺伝子の発現を阻害したり弱化させることができるが、これに制限されない。
上記6)ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入は、例えば、文献[Weintraub,H. et al.,Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews - Trends in Genetics,Vol.1(1) 1986]を参考にすることができる。
上記7)リボソーム(ribosome)の付着が不可能な2次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加は、mRNA翻訳を不可能にしたり速度を低下させることであってもよい。
上記8)ポリペプチドをコードする遺伝子配列のORF(open reading frame)の3’末端に反対方向に転写するプロモーターの付加(Reverse transcription engineering,RTE)は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化することであってもよい。
本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」は、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。上記強化は、活性化(activation)、上向き調節(up-regulation)、過発現(overexpression)、増加(increase)などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上向き調節、過発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すことをすべて含むことができる。上記「内在的活性」は、自然的または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化する場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「強化」、「上向き調節」、「過発現」または「増加」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び/又は濃度(発現量)に比べて向上したことを意味する。
上記強化は、外来のポリペプチドを導入したり、内在的なポリペプチドの活性強化及び/又は濃度(発現量)を通じて達成することができる。上記ポリペプチドの活性の強化の有無は、当該ポリペプチドの活性程度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
上記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野によく知られた多様な方法の適用が可能であり、目的ポリペプチドの活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び/又はタンパク質工学を利用したことであってもよいが、これで制限されない(例えば、Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012など)。
具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は
1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加;
2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換;
3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
4)ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形;
5)ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形);
6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入;
7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化;
8)ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾;または
9)上記1)~8)から選択された2以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加;
2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換;
3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
4)ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形;
5)ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形);
6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入;
7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化;
8)ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾;または
9)上記1)~8)から選択された2以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
より具体的には、
上記1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製され、機能できるベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞内の染色体内に1コピーまたは2コピー以上の導入により達成されることであってもよい。上記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われるが、これに制限されない。上記ベクターは、前述した通りである。
上記1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製され、機能できるベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞内の染色体内に1コピーまたは2コピー以上の導入により達成されることであってもよい。上記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われるが、これに制限されない。上記ベクターは、前述した通りである。
上記2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域(または発現調節配列)を活性が強力な配列での交換は、例えば、上記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより配列上の変異発生、またはさらに強い活性を有する配列での交換であってもよい。上記発現調節領域は、特に、これに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、そして転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターで交換させることであってもよいが、これに制限されない。
公知となった強力なプロモーターの例としては、CJ1~CJ7プロモーター(米国特許第7662943号明細書)、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、gapAプロモーター、SPL7プロモーター、SPL13(sm3)プロモーター(米国特許第10584338号明細書)、O2プロモーター(米国特許第10273491号明細書)、tktプロモーター、yccAプロモーターなどがあるが、これに制限されない。
上記3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これに制限されない。
上記4)及び5)のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列または上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより配列上の変異発生、またはさらに強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列での交換であってもよいが、これに限定されるものではない。上記交換は、具体的に相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われるが、これに制限されない。この時に用いられるベクターは、染色体挿入の有無を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含むことができる。上記選別マーカーは、前述した通りである。
上記6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、上記ポリペプチドと同一/類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内導入であってもよい。上記外来ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドと同一/類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限がない。上記導入に利用される方法は、公知となった形質転換方法を当業者が適切に選択して行われ、宿主細胞内で上記導入されたポリヌクレオチドが発現することによりポリペプチドが生成され、その活性が増加することができる。
上記7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したことであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化した転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したことであってもよい。
上記8)ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を公知のタンパク質の配列情報が貯蔵されたデータベースと比較することにより、配列の類似性程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、これに基づいて構造を確認し、変形したり化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現したポリペプチドの活性または濃度を基準として増加したり、当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において用語、ポリペプチド活性の「調節」は、上記ポリペプチド活性の「強化」及び/又はポリペプチド活性の「弱化」であってもよいが、これに制限されない。一具現例として、GltAは、活性が強化または弱化されたものであってもよいが、これに制限されない。
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物を培養する段階を含むポリ-4-ヒドロキシブチレート(poly-4-hydroxybutyrate,poly(4-hydroxybutyrate);P4HB)の生産方法を提供する。
本出願において用語、「ポリ-4-ヒドロキシブチレート」は4-ヒドロキシブチレートの重合体であり、ポリエステルに属する化合物である。上記ポリ-4-ヒドロキシブチレートは、ポリ-4-ヒドロキシブタノエート(poly-4-hydroxybutanoate,P4HA)と混用されてもよく、下記の化学式1で示されてもよいが、これに制限されない。
(上記nは1以上の整数)
本出願において、用語「培養」とは、本出願の微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願において、培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件により行われる。このような培養過程は、選択される菌株により当業者が容易に調整して用いることができる。具体的には、上記培養は、回分式、連続式及び/又は流加式であってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び/又はビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件の下で温度、pHなどを調節して培養することができる。
本出願の培養において培養温度は20~35℃、具体的には25~35℃、28~35℃を維持してもよく、約10~160時間、約20時間~130時間、約24時間~120時間、約36時間~120時間、約48時間~120時間、約48時間、約72時間、または約120時間培養してもよいが、これに限定されるものではない。
本出願の培養により生産されたポリ-4-ヒドロキシブチレートは、培地中に分泌されたり微生物内に残留することができる。
本出願のポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、上記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組合せ(手順に無関係、in any order)を、例えば、上記培養する段階前に、さらに含むことができる。
本出願のポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法は、上記微生物の培養による培地(培養が行われた培地)または本出願の微生物からポリ-4-ヒドロキシブチレートを回収する段階をさらに含むことができる。上記回収する段階は、上記培養する段階後にさらに含まれてもよい。
上記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などにより当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して目的とするポリ-4-ヒドロキシブチレートを収集(collect)することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理(塩析法)、抽出、細胞破砕、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー(ゲルろ過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、HPLCまたはこれらの方法を組み合わせて用いられてもよく、当該分野に公知となった適切な方法を利用して培地または微生物から目的とするポリ-4-ヒドロキシブチレートを回収することができる。
また、本出願のポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法は、さらに精製段階を含むことができる。上記精製は、当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して行うことができる。一例として、本出願のポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法が回収段階と精製段階をいずれも含む場合、上記回収段階と精製段階は、手順に関係なく異時的(または連続的)で行われたり、同時にまたは一つの段階に統合されて行われるが、これに制限されるものではない。
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物を培養する段階;上記微生物または培地からポリ-4-ヒドロキシブチレートを回収する段階;及びポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解する段階を含む1,4-ブタンジオール生産方法を提供する。
本出願の1,4-ブタンジオール生産方法は、本出願の微生物が生産したポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解する段階をさらに含んでもよい。本出願の1,4-ブタンジオール生産方法において、上記分解する段階は、上記培養する段階または上記回収する段階後にさらに含んでもよい。上記分解する段階は、当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して行うことができる。一具現例として、上記ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解する段階は、熱分解、水素化、またはこれらの組合せであってもよい。
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物またはその培養物を含むポリ-4-ヒドロキシブチレート生産用組成物を提供する。
上記微生物、ポリ-4-ヒドロキシブチレートなどは他の様態で説明した通りである。
本出願の組成物は、通常使用される任意の適した賦形剤をさらに含むことができ、このような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物またはその培養物のポリ-4-ヒドロキシブチレート生産への使用を提供する。
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物またはその培養物の1,4-ブタンジオール生産への使用を提供する。
上記微生物、ポリ-4-ヒドロキシブチレートなどは他の様態で説明した通りである。
以下、本出願を実施例により、さらに詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、したがって、本出願の権利範囲をこれに限定することには意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術分野において熟練した通常の技術者であれば、十分に理解し、容易に実施することができる。
実施例1:ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ発現調節及び酸化的TCA(Oxidative TCA)経路を利用したP4HB生産
1-1:酸化的TCA(Oxidative TCA;oTCA)経路を利用したP4HB生産経路
大腸菌においてブドウ糖を用いてP4HB生産を評価した。ブドウ糖は、ホスホトランスフェラーゼ(Phosphotransferase)システムを通じて一つのホスホエノールピルベート(Phosphoenolpyruvate;PEP)と一つのアセチル-coA及び二酸化炭素で酸化することができる。PEPは、一つの二酸化炭素を固定し、オキサロアセテート(oxaloacetate)にホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase;PPC)により変換することができる。アセチル-coAとオキサロアセテートはシトレート(citrate)を経て2個の二酸化炭素と一つのスクシニル-CoA(succinyl-coA)に酸化されることができる。ポリ-4-ヒドロキシブチレート(P4HB)は、このTCA経路の中間物質であるスクシニル-CoAから生産が可能であってもよい。スクシニル-CoAからP4HBの生産は、NADHあるいはNADPH依存的なスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(succinate semialdehyde dehydrogenase;SucD)によりスクシニルセミアルデヒド(succinyl semialdehyde)に変換される。スクシニルセミアルデヒドは、NADH依存的な4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(4-hydroxybutyric acid dehydrogenase;4HbD)により4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)に変換され、これは、さらに4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ(4-hydroxybutyryl-CoA transferase;OrfZ)により4-ヒドロキシブチリル-coA(4-hydrxybutyril-CoA)に変換することができる。最終的に、ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ(Poly(3-hydroxyalkanoate)polymerase;PhaC)により4-ヒドロキシブチリル-coA(4-hydrxybutyril-CoA)からポリ-4-ヒドロキシブチレート(poly-4-hydroxybutyrate;P4HB)が生成されるようにした。
1-1:酸化的TCA(Oxidative TCA;oTCA)経路を利用したP4HB生産経路
大腸菌においてブドウ糖を用いてP4HB生産を評価した。ブドウ糖は、ホスホトランスフェラーゼ(Phosphotransferase)システムを通じて一つのホスホエノールピルベート(Phosphoenolpyruvate;PEP)と一つのアセチル-coA及び二酸化炭素で酸化することができる。PEPは、一つの二酸化炭素を固定し、オキサロアセテート(oxaloacetate)にホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase;PPC)により変換することができる。アセチル-coAとオキサロアセテートはシトレート(citrate)を経て2個の二酸化炭素と一つのスクシニル-CoA(succinyl-coA)に酸化されることができる。ポリ-4-ヒドロキシブチレート(P4HB)は、このTCA経路の中間物質であるスクシニル-CoAから生産が可能であってもよい。スクシニル-CoAからP4HBの生産は、NADHあるいはNADPH依存的なスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(succinate semialdehyde dehydrogenase;SucD)によりスクシニルセミアルデヒド(succinyl semialdehyde)に変換される。スクシニルセミアルデヒドは、NADH依存的な4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(4-hydroxybutyric acid dehydrogenase;4HbD)により4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)に変換され、これは、さらに4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ(4-hydroxybutyryl-CoA transferase;OrfZ)により4-ヒドロキシブチリル-coA(4-hydrxybutyril-CoA)に変換することができる。最終的に、ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ(Poly(3-hydroxyalkanoate)polymerase;PhaC)により4-ヒドロキシブチリル-coA(4-hydrxybutyril-CoA)からポリ-4-ヒドロキシブチレート(poly-4-hydroxybutyrate;P4HB)が生成されるようにした。
前述したSucD、4HbD、OrfZ、PhaC、PPC及びこれらの遺伝子配列は、配列番号1~配列番号8、配列番号13、及び配列番号14に示した。
1-2:ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ発現調節用プロモーターの製作
菌体成長に必須の窒素源を制限することにより菌体成長を抑制させ、炭素の流れを目標物質であるP4HBに誘導させることにより、その生産性を増加させることにした。ただし、大腸菌のホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase)をコードするppc遺伝子のプロモーターが窒素制限の条件で調節因子(Nac,DNA-binding transcriptional dual regulator)により発現が阻害されるため、これを克服するためのプロモーターを製作することにした。
菌体成長に必須の窒素源を制限することにより菌体成長を抑制させ、炭素の流れを目標物質であるP4HBに誘導させることにより、その生産性を増加させることにした。ただし、大腸菌のホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase)をコードするppc遺伝子のプロモーターが窒素制限の条件で調節因子(Nac,DNA-binding transcriptional dual regulator)により発現が阻害されるため、これを克服するためのプロモーターを製作することにした。
このために、野生のプロモーター(Pn)と同等またはそれ以上の発現強度を有し、調節因子Nacの影響を受けないプロモーターを製作し、Pnプロモーター配列は、次の通りである。
5’-TCGCAGCATTTGACGTCACCGCTTTTACGTGGCTTTATAAAAGACGACGAAAAGCAAAGCCCGAGCATATTCGCGCCAATGCGACGTGAAGGATACAGGGCTATCAAACGATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAAT-3’(配列番号60)
その結果、下記表1に示されるように、Pnと同一の強度のプロモーター1種(Psynk1)及び約15倍強いプロモーター1種(PsynK2)を確認した。
培地は、ブドウ糖を炭素源とするM9-最少培地を用い、48時間、800rpm、37℃の条件で96ウェルプレートで培養後、吸光度を測定した。
1-3:P4HB生産菌株の製作
実施例1-2で製作したプロモーター3種を実施例1-1のP4HB生合成経路が構築されている微生物菌株に導入し、P4HB生産菌株である次のような微生物3種を製作した。下記のSucD、4HbD、OrfZ、PhaC、PPC及びこれらの遺伝子配列は、配列番号1~配列番号8、配列番号13、及び配列番号14に示した。
実施例1-2で製作したプロモーター3種を実施例1-1のP4HB生合成経路が構築されている微生物菌株に導入し、P4HB生産菌株である次のような微生物3種を製作した。下記のSucD、4HbD、OrfZ、PhaC、PPC及びこれらの遺伝子配列は、配列番号1~配列番号8、配列番号13、及び配列番号14に示した。
目標遺伝子の発現のために用いられたプロモーターはPuspA、PsynK1、及びPsynK2があり、これらに関する遺伝子情報はecocyc.orgとparts.igem.orgで得ることができる。用いられたプロモーター配列は、次の通りである。
- PsynK1(5’-tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc-3’);配列番号45
- PsynK2(5’-ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc-3’);配列番号46
- PuspA(5’-AACCACTATCAATATATTCATGTCGAAAATTTGTTTATCTAACGAGTAAGCAAGGCGGATTGACGGATCATCCGGGTCGCTATAAGGTATAGTTCGCAGG ACGCGGGTGACGTAACGGCACAAGAAACG-3’);配列番号47
- PsynK2(5’-ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc-3’);配列番号46
- PuspA(5’-AACCACTATCAATATATTCATGTCGAAAATTTGTTTATCTAACGAGTAAGCAAGGCGGATTGACGGATCATCCGGGTCGCTATAAGGTATAGTTCGCAGG ACGCGGGTGACGTAACGGCACAAGAAACG-3’);配列番号47
前述したP4HB生合成経路が構築されている微生物の製作には、汎用的に用いられる技術を適用した(代表文献:Sambrook et al.,Molecular cloning:A Laboratory Manual,Thrid Ed,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001))。具体的には、目的遺伝子は、公知のデータベースで遺伝子情報を収得し、遺伝子及びそのためのプライマーを製作し、PCR(polymerase chain reaction)を通じて対象遺伝子を増幅することにより、目的とするベクター(pCL)にリガーゼを用いて導入した。または、化学的に合成する方法も用い、これは、大腸菌で発現が円滑になされるように、コドン最適化が必要な場合に用いた。目標遺伝子の発現のためには、プロモーターとターミネーターをPCRを通じて対象遺伝子に連結した。このように製作されたベクターを対象菌株に導入するために、一般的な熱衝撃(Heat shock)技術を用いた。さらに高い効率が必要な場合は、電気穿孔(Electroporation)技術を用いた。
遺伝子発現以外に染色体上で特定遺伝子の弱化/欠失はオリゴマーを用い、一般に知られたRed/ET recombineeringを用い、関連技術はDatsenko and Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci,USA、2000,97,6640-6645)に報告された技術を用いた。欠失に用いられたオリゴマーは、次の通りである。
pykF-Left(配列番号48)
GAAAGCAAGTTTCTCCCATCCTTCTCAACTTAAAGACTAAGACTGTCATG
pykF-right(配列番号49)
GATATACAAATTAATTCACAAAAGCAATATTACAGGACGTGAACAGATGC
pykA-Left(配列番号50)
TTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGTCAACGGAGTATTACATG
pykA-right(配列番号51)
TGGCGTTTTCGCCGCATCCGGCAACGTACTTACTCTACCGTTAAAATACG
maeB-left(配列番号52)
TTCAGGGTAAGCGTGAGAGTTAAAAAAAATTACAGCGGTTGGGTTTGCGC
maeB-right(配列番号53)
TTGCCCACACACTTTATTTGTGAACGTTACGTGAAAGGAACAACCAAATG
maeA-left(配列番号54)
CCCGGTAGCCTTCACTACCGGGCGCAGGCTTAGATGGAGGTACGGCGGTA
maeA-right(配列番号55)
GGCCGACGCCCTGGCGGTAAAGCAAAGACGATAAAAGCCCCCCAGGGATG
aspC-left(配列番号56)
TTTTCAGCGGGCTTCATTGTTTTTAATGCTTACAGCACTGCCACAATCGC
aspC-right(配列番号57)
TACCCTGATAGCGGACTTCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCATG
Icd-left(配列番号58)
AACGTGGTGGCAGACGAGCAAACCAGTAGCGCTCGAAGGAGAGGTGAATG
Icd-right(配列番号59)
CCCGTTAATAAATTTAACAAACTACGGCATTACATGTTTTCGATGATCGC
GAAAGCAAGTTTCTCCCATCCTTCTCAACTTAAAGACTAAGACTGTCATG
pykF-right(配列番号49)
GATATACAAATTAATTCACAAAAGCAATATTACAGGACGTGAACAGATGC
pykA-Left(配列番号50)
TTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGTCAACGGAGTATTACATG
pykA-right(配列番号51)
TGGCGTTTTCGCCGCATCCGGCAACGTACTTACTCTACCGTTAAAATACG
maeB-left(配列番号52)
TTCAGGGTAAGCGTGAGAGTTAAAAAAAATTACAGCGGTTGGGTTTGCGC
maeB-right(配列番号53)
TTGCCCACACACTTTATTTGTGAACGTTACGTGAAAGGAACAACCAAATG
maeA-left(配列番号54)
CCCGGTAGCCTTCACTACCGGGCGCAGGCTTAGATGGAGGTACGGCGGTA
maeA-right(配列番号55)
GGCCGACGCCCTGGCGGTAAAGCAAAGACGATAAAAGCCCCCCAGGGATG
aspC-left(配列番号56)
TTTTCAGCGGGCTTCATTGTTTTTAATGCTTACAGCACTGCCACAATCGC
aspC-right(配列番号57)
TACCCTGATAGCGGACTTCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCATG
Icd-left(配列番号58)
AACGTGGTGGCAGACGAGCAAACCAGTAGCGCTCGAAGGAGAGGTGAATG
Icd-right(配列番号59)
CCCGTTAATAAATTTAACAAACTACGGCATTACATGTTTTCGATGATCGC
1-4:P4HB生産菌株のP4HB生産能の評価
実施例1-3で製作した菌株3種のP4HB生産テストを進めるためにフラスコ実験を行った。培養条件は48時間、230rpm、及び30℃であり、培地は、以前に公開された資料を基に製作して用いた(米国特許第9,084,467号明細書)。具体的には、1xE2最少培地に1x微量元素(Trace salt solution)を添加して培地を製造し、その炭素:窒素比率(C/N ratio)を30:1に調節して用いた。
実施例1-3で製作した菌株3種のP4HB生産テストを進めるためにフラスコ実験を行った。培養条件は48時間、230rpm、及び30℃であり、培地は、以前に公開された資料を基に製作して用いた(米国特許第9,084,467号明細書)。具体的には、1xE2最少培地に1x微量元素(Trace salt solution)を添加して培地を製造し、その炭素:窒素比率(C/N ratio)を30:1に調節して用いた。
P4HB分析条件は、公開された文献(米国特許第9,084,467号明細書)を参照して設定した。簡略に説明すると、前述したように、菌株3種の培養物をそれぞれ1mL採取して4,000rpmで菌体を回収した。回収した菌株を凍結乾燥した後、サンプルのブタノール溶解(Butanolysis)を進めるための製剤(Dioxane溶液に99.9%のブタノール及び4N HClを添加した製剤)を添加し、93℃で6時間熱処理した。熱処理した溶液を600rpmで相分離させ、有機相(Organic phase)を採取してガスクロマトグラフィー(GC)分析した。4-ヒドロキシブチレート(4HB)の標準試薬は10%のγ-ブチロラクトン(γ-butyrolactone)を用いて製造した。
上記のような条件を用いて分析を進めた結果、下記表3に示されるように、窒素制限を受けていないプロモーターであるPsynK1を含む菌株でPnを含む菌株よりP4HB濃度が22%向上したことを確認した。
一方、表3から過度に強いプロモーターを用いる場合(PsynK2)、窒素制限因子に影響を受けなくてもP4HB生産性が向上しないことをさらに確認した。
実施例2:還元型TCA(rTCA)経路を利用したP4HBの生産
ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼのカルボキシル化反応により固定された二酸化炭素を還元型TCA経路を利用してP4HB生産経路で誘導することにした。還元型TCA経路を通じたP4HB生産においてホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ酵素を通じてホスホエノールピルベートから生成されたオキサロアセテートは、酸化的(oxidative)TCA経路に含まれた脱カルボキシル化(decarboxylation)過程を経ないため、二酸化炭素の発生なしにマレート(malate)、フマレート(fumarate)、及びスクシネート(succinate)を経てスクシニル-CoAまで還元することができる。生成されたスクシニル-CoAは、実施例1-1の経路と同様の方法を経てP4HBに変換することができる。
ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼのカルボキシル化反応により固定された二酸化炭素を還元型TCA経路を利用してP4HB生産経路で誘導することにした。還元型TCA経路を通じたP4HB生産においてホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ酵素を通じてホスホエノールピルベートから生成されたオキサロアセテートは、酸化的(oxidative)TCA経路に含まれた脱カルボキシル化(decarboxylation)過程を経ないため、二酸化炭素の発生なしにマレート(malate)、フマレート(fumarate)、及びスクシネート(succinate)を経てスクシニル-CoAまで還元することができる。生成されたスクシニル-CoAは、実施例1-1の経路と同様の方法を経てP4HBに変換することができる。
効率的なrTCA経路の活性化のために、ピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)遺伝子(pykFA)が除去された菌株(下記の菌株番号4)を製作した。製作した菌株3種は下記表4に示し、下記の菌株番号3は前述した表2の菌株番号3と同一である。下記のSucD、4HbD、OrfZ、PhaC、PPC及びこれらの遺伝子配列は、配列番号1~配列番号8、配列番号13、及び配列番号14に示した。また、下記のMaeAB、AspC、PykFA、及びこれらの遺伝子配列は、配列番号9~配列番号12、配列番号21~配列番号24、配列番号29、配列番号30に示した。
ピルビン酸キナーゼを除去する場合、PEPからピルベートに向かう炭素の流れを制御し、PEPの細胞内の濃度を保存し、これに基づいてPEPカルボキシラーゼ経路の活性化を促進することができる。これを通じてrTCA経路に必須のオキサロアセテートの細胞内の濃度を高めることを示唆する。
追加的に、確保されたオキサロアセテートとマレートなどのrTCA経路上の競争経路を除去するために、アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase;AspC)とマレートデヒドロゲナーゼ(malic enzyme;MaeAB)をさらに除去した菌株も製作(上記菌株番号5)し、rTCA基盤のP4HB生産評価を進めた。
上記の表4の菌株を対象に、実施例1-4と同様の方法でP4HB生産性評価を行い、rTCA経路が活性化される場合、菌体成長が向上し、図7に示されるように、rTCA経路が導入された菌株(菌株番号4及び5)でrTCA経路が導入されていない菌株(菌株番号3)に比べてP4HB収率が約28%から最大43%まで向上したことを確認した。rTCA経路を利用する場合、既存の48wt%水準のP4HB理論的最大収率を58wt%まで向上させることができた。
実施例3:グリオキシレート経路を利用したP4HBの生産
グリオキシレート経路(Glyoxylate cycle)を利用してP4HB生産を行うことにより、2-オキソグルタレート(2-oxoglutartate)の脱カルボキシル化(decarboxylation)経路を迂回して二酸化炭素への炭素損失を減らし、結果的に、P4HBの生産収率を増加させることにした。
グリオキシレート経路(Glyoxylate cycle)を利用してP4HB生産を行うことにより、2-オキソグルタレート(2-oxoglutartate)の脱カルボキシル化(decarboxylation)経路を迂回して二酸化炭素への炭素損失を減らし、結果的に、P4HBの生産収率を増加させることにした。
この経路の活性化のために、TCA経路上のイソシトレートデヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase;icd)を除去し、炭素の流れを強制的にグリオキシレート経路に誘導させた。グリオキシレート経路の活性化のために、大腸菌由来のイソシトレートリアーゼ(isocitrate lyase;aceA)及びマレートシンターゼ(malate synthase;aceB)を導入するが、導入される微生物内の既存の野生型プロモーターを合成プロモーターで交換してブドウ糖基盤のカタボリック抑制(Catabolic repression)を受けないようにした。製作した菌株2種は、下記表5に示した。下記のSucD、4HbD、OrfZ、PhaC、PPC及びこれらの遺伝子配列は、配列番号1~配列番号8、配列番号13、及び配列番号14に示した。また、下記のIcd、AceBA、及びその遺伝子配列は、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号43、及び配列番号44に示した。
そのとき、グリオキシレート経路の生成物であるスクシネートとマレートはいずれも還元型TCA経路を利用してスクシニル-CoAに変換することができる。生成されたスクシニル-CoAは、上記実施例1-1のP4HB生成経路を通じてP4HBに変換することができる。このように製作された菌株の発酵時、グルタミン酸(glutamate)を外部で補強するために、Monosodium glutamate(MSG)50mMを添加した。このように製作された菌株をブドウ糖培地に培養してPHA生産を確認した結果、図8に示されるように、2.7g/LのPHAが生産されること(菌株番号7 GLU+MSG)を確認した。グリオキシレート経路が導入されていない菌株(菌株番号6)でPHA生産は0.9g/Lに止まり、グリオキシレート経路が導入されていてもブドウ糖がない場合(菌株番号7 MSG)、PHAの生産は観測されなかった。本方法を通じて既存の理論的最大収率48wt%から58wt%まで向上させることができた。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
Claims (38)
- (1)スクシニル-coA(succinyl-coA;SuCoA)をスクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)に変換する段階;
(2)スクシネートセミアルデヒド(succinate semialdehyde;SSA)を4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)に変換する段階;
(3)4-ヒドロキシブチレート(4-hydroxybutyrate;4HB)を4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)に変換する段階;
(4)二つ以上の4-ヒドロキシブチリルcoA(4-hydroxybutyryl coA;4HBCoA)を重合してポリ-4-ヒドロキシブチレート(poly-4-hydroxybutyrate;P4HB)を生産する段階;及び
(5)ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解する段階を含む1,4-ブタンジオール生産方法。 - 前記(1)~(4)は、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(succinate semialdehyde dehydrogenase)、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(4-hydroxybutyric acid dehydrogenase)、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ(4-hydroxybutyryl-CoA transferase)、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼ(Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase)からなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド;前記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用する、請求項1に記載の生産方法。
- 前記生産方法は、TCA経路をさらに含む、請求項1に記載の生産方法。
- 前記TCA経路は
(a1)ピルベートをアセチル-coAに変換する段階;
(b1)アセチル-coA及びオキサロアセテートをシトレートに変換する段階;
(c1)シトレートをイソシトレートに変換する段階;
(d1)イソシトレートをα-ケトグルタレートに変換する段階;
(e1)α-ケトグルタレートをスクシニル-coAに変換する段階;及び
(f1)ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項3に記載の生産方法。 - 前記生産方法は、(g1)ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階をさらに含む、請求項1に記載の生産方法。
- 前記(g1)は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(phosphoenolpyruvate carboxylase)ポリペプチド;前記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物;及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用する、請求項5に記載の生産方法。
- 前記生産方法は、(g1)ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階が強化された、請求項1に記載の生産方法。
- 前記生産方法は、還元型TCA経路(reductive TCA cycle)をさらに含む、請求項1に記載の生産方法。
- 前記還元型TCA経路は、(a2)オキサロアセテートをマレートに変換する段階;
(b2)マレートをフマレートに変換する段階;
(c2)フマレートをスクシネートに変換する段階;及び
(d2)スクシネートをスクシニル-coAに変換する段階からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項8に記載の生産方法。 - 前記生産方法は、(e2)ホスホエノールピルベートからピルベートに変換する段階が弱化された、請求項8に記載の生産方法。
- 前記還元型TCA経路は、下記(I)~(XII)からなる群から選択されるいずれか一つ以上により強化された、請求項8に記載の生産方法:
(I)ピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)弱化;
(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEP carboxylase)強化;
(III)カルボニックアンヒドラーゼ(carbonic anhydrase)強化;
(IV)シトレートシンターゼ(citrate synthase)調節;
(V)ピルベートカルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)強化;
(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NAD+-dependent malate dehydrogenase)弱化;
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ(NADP+-dependent malate dehydrogenase)弱化;
(VIII)ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(phosphogluconate dehydratase)弱化;
(IX)2-ケト-4-ヒドロキシグルタレートKDPG:2-ケト-3-デオキシグルコネート6-ホスフェートアルドラーゼ(2-keto-4-hydroxyglutarate:2-keto-3-deoxygluconate 6-phosphate;KHG/KDPG aldolase)弱化;
(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)弱化;
(XI)グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント(glucose-specific PTS enzyme IIBC component)弱化;及び
(XII)重炭酸塩トランスポーター(bicarbonate transporter)強化。 - 前記生産方法は、グリオキシレート経路をさらに含む、請求項1に記載の生産方法。
- 前記グリオキシレート経路は
(a3)イソシトレートをグリオキシレート及びスクシネートに変換する段階;
(b3)グリオキシレート及びアセチル-coAをマレート及びcoAに変換する段階;
(c3)シトレートをイソシトレートに変換する段階;
(d3)ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階;
(e3)ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階;
(f3)オキサロアセテートをシトレートに変換する段階;
(g3)マレートをフマレートに変換する段階;
(h3)フマレートをスクシネートに変換する段階;及び
(i3)スクシネートをスクシニル-coAに変換する段階で構成される群からいずれか一つ以上をさらに含む、請求項12に記載の生産方法。 - (j3)α-ケトグルタレートをスクシニル-coAに変換する段階が弱化された、請求項13に記載の生産方法。
- (k3)オキサロアセテートをマレートに変換する段階が弱化された、請求項13に記載の生産方法。
- 前記グリオキシレート経路は、(i)~(vi)からなる群から選択されるいずれか一つ以上により強化された、請求項13に記載の生産方法:
(i)シトレートシンターゼ(citrate synthase)強化;
(ii)イソシトレートデヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)弱化;
(iii)イソシトレートリアーゼ(isocitrate lyase)強化;
(iv)イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼ(Isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase)強化;
(v)マレートシンターゼG(malate synthase G)強化;及び
(vi)マレートシンターゼA(malate synthase A)強化。 - スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物。
- 前記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼ、及びポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼで構成される群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチドは外来導入された、請求項17に記載の微生物。
- 前記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び4-ヒドロキシブチリル-coAトランスフェラーゼポリペプチドはクロストリジウム・クライベリ(Clostridium kluyveri)由来であり、前記4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼポリペプチドはアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)由来であり、前記ポリ(3-ヒドロキシアルカノエート)ポリメラーゼはシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)またはルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)由来である、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、TCA経路を含む、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、ピルベートデヒドロゲナーゼ、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、及びピルベートカルボキシラーゼからなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、還元型TCA経路を含む、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、下記(I)~(XII)からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項17に記載の微生物:
(I)ピルビン酸キナーゼ弱化;
(II)ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化;
(III)カルボニックアンヒドラーゼ強化;
(IV)シトレートシンターゼ調節;
(V)ピルベートカルボキシラーゼ強化;
(VI)NAD+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VII)NADP+依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(VIII)ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化;
(IX)2-ケト-4-ヒドロキシグルタレートKDPG:2-ケト-3-デオキシグルコネート6-ホスフェートアルドラーゼ弱化;
(X)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化;
(XI)グルコース特異的PTS酵素IIBCコンポーネント弱化;及び
(XII)重炭酸塩トランスポーター強化。 - 前記微生物は、グリオキシレート経路を含む、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、下記(i)~(vi)からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項17に記載の微生物:
(i)シトレートシンターゼ強化;
(ii)イソシトレートデヒドロゲナーゼ弱化;
(iii)イソシトレートリアーゼ強化;
(iv)イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼ強化;
(v)マレートシンターゼG強化;及び
(vi)マレートシンターゼA強化。 - 前記微生物は、1,4-ブタンジオール生産に利用される、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、ポリ-4-ヒドロキシブチレート生産用である、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属である、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でもポリ-4-ヒドロキシブチレート生産能がある、請求項17に記載の微生物。
- 前記微生物は、プロモーター活性を有する配列番号45で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項17に記載の微生物。
- 前記プロモーター活性を有する配列番号45で示されるヌクレオチド配列の目的遺伝子は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドである、請求項30に記載の微生物。
- 請求項17~31のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階を含むポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法。
- 前記生産方法は、前記微生物または培地からポリ-4-ヒドロキシブチレートを回収する段階を含む、請求項32に記載のポリ-4-ヒドロキシブチレート生産方法。
- 前記微生物を培養する段階は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素を制限した培地で微生物を培養する段階を含む、請求項32に記載の生産方法。
- 請求項17~31のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階;
前記微生物または培地からポリ-4-ヒドロキシブチレートを回収する段階;及び
ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解する段階を含む1,4-ブタンジオール生産方法。 - 前記ポリ-4-ヒドロキシブチレートを1,4-ブタンジオールに分解する段階は、熱分解、水素化、またはこれらの組合せである、請求項35に記載の1,4-ブタンジオール生産方法。
- 請求項17に記載の微生物またはその培養物を含むポリ-4-ヒドロキシブチレート生産用組成物。
- 請求項17に記載の微生物またはその培養物のポリ-4-ヒドロキシブチレート生産への使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2021-0083270 | 2021-06-25 | ||
KR20210083270 | 2021-06-25 | ||
PCT/KR2022/009082 WO2022270991A1 (ko) | 2021-06-25 | 2022-06-24 | 신규한 폴리-4-하이드록시부티레이트 및 1,4-부탄다이올 생산방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024522860A true JP2024522860A (ja) | 2024-06-21 |
Family
ID=84544676
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023579221A Pending JP2024522860A (ja) | 2021-06-25 | 2022-06-24 | 新規なポリ-4-ヒドロキシブチレート及び1,4-ブタンジオール生産方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4349994A1 (ja) |
JP (1) | JP2024522860A (ja) |
KR (1) | KR20230000995A (ja) |
CN (1) | CN117916385A (ja) |
WO (1) | WO2022270991A1 (ja) |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100620092B1 (ko) | 2004-12-16 | 2006-09-08 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 |
MY195387A (en) * | 2009-06-04 | 2023-01-18 | Genomatica Inc | Microorganisms for the Production of 1,4-Butanediol and Related Methods |
CN102781901B (zh) * | 2010-02-11 | 2016-08-03 | 梅塔玻利克斯公司 | 用于从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯生物质制备单体组分的方法 |
US20130034884A1 (en) * | 2011-06-22 | 2013-02-07 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto |
BR112014023317A8 (pt) * | 2012-03-20 | 2017-10-03 | Metabolix Inc | Método para produção de poli(4-hidroxibutirato) a partir de um material de partida renovável |
KR102023618B1 (ko) * | 2012-07-27 | 2019-09-20 | 삼성전자주식회사 | 1,4-bdo 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 1,4-bdo의 제조방법 |
KR20140016654A (ko) | 2012-07-30 | 2014-02-10 | 삼성전자주식회사 | 대장균 내에서 1,4-부탄디올의 생합성에 사용되는 효소의 개량과 개선된 유전자를 스크리닝 하는 방법 |
BR112015007560B1 (pt) | 2012-10-10 | 2021-08-31 | Cj Cheiljedang Corporation | Composições de copolímero de poliidroxialcanoato e métodos de preparação das mesmas, composição de mistura de polímero e composição de biomassa |
KR101632642B1 (ko) | 2015-01-29 | 2016-06-22 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 프로모터 및 그의 용도 |
CN108559747B (zh) | 2016-08-31 | 2021-08-31 | Cj第一制糖株式会社 | 新型启动子及其应用 |
KR102278000B1 (ko) | 2020-03-17 | 2021-07-15 | 씨제이제일제당 주식회사 | 프리페네이트 디하이드라타아제 활성 강화를 통한 l-트립토판을 생산하는 방법 |
-
2022
- 2022-06-24 WO PCT/KR2022/009082 patent/WO2022270991A1/ko active Application Filing
- 2022-06-24 CN CN202280057841.9A patent/CN117916385A/zh active Pending
- 2022-06-24 JP JP2023579221A patent/JP2024522860A/ja active Pending
- 2022-06-24 KR KR1020220077824A patent/KR20230000995A/ko unknown
- 2022-06-24 EP EP22828838.7A patent/EP4349994A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20230000995A (ko) | 2023-01-03 |
EP4349994A1 (en) | 2024-04-10 |
WO2022270991A1 (ko) | 2022-12-29 |
CN117916385A (zh) | 2024-04-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7378621B2 (ja) | 新規な分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体及びそれを用いたロイシン生産方法 | |
KR102277407B1 (ko) | 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 | |
KR102274484B1 (ko) | 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 알파 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
KR102273639B1 (ko) | 신규한 이중기능성 메틸렌테트라히드로폴레이트 탈수소효소/메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
KR102279696B1 (ko) | 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
KR102273640B1 (ko) | 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 감마 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
EP4282958A1 (en) | Novel citrate synthase variant and method for producing l-valine using same | |
EP4349994A1 (en) | Novel method for producing poly-4-hydroxybutyrate and 1,4-butanediol | |
EP4056694A1 (en) | Novel type ii citrate synthase variant, and method for producing l-lysine using same | |
JP2024503049A (ja) | GlxR蛋白質変異体またはこれを利用したスレオニン生産方法 | |
EP4092042A1 (en) | Novel branched-chain amino acid permease variant and method for producing l-valine using same | |
RU2794279C1 (ru) | Новый вариант 2-изопропилмалатсинтазы и способ получения L-валина с его применением | |
EP4092115B1 (en) | Novel dihydrolipoamide acetyltransferase variant and method for producing l-valine using same | |
RU2794484C1 (ru) | Новый вариант dahp синтазы и способ получения l-лизина с его применением | |
KR102281370B1 (ko) | 신규한 2-이소프로필말레이트합성효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
RU2793441C1 (ru) | Новый вариант белка сборки праймосомы и способ получения l-лизина с его применением | |
RU2793429C1 (ru) | Новый вариант дигидролипоамидацетилтрансферазы и способ получения l-валина с его применением | |
RU2795053C1 (ru) | НОВЫЙ ВАРИАНТ КОМПОНЕНТА СИСТЕМЫ ОТТОКА Со/Zn/Cd И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ | |
RU2792640C1 (ru) | Новый вариант глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и способ получения l-валина с его применением | |
JP2024506685A (ja) | 新規なクエン酸シンターゼ変異体及びそれを用いたo-アセチル-l-ホモセリンまたはl-メチオニン生産方法 | |
EP4101926A1 (en) | Novel glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase variant and method for producing l-valine using same | |
JP2024507936A (ja) | 新規なクエン酸シンターゼ変異体及びそれを用いたl-アミノ酸生産方法 | |
KR20240105656A (ko) | 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도 | |
EP4060031A1 (en) | Novel dahp synthase variant, and method for producing l-lysine using same | |
EP4092041A1 (en) | Novel whib-affiliated transcriptional regulator whca variant and method for producing l-valine using same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240119 |