JP2024521403A - 細胞リプログラミングのための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、細胞リプログラミングのための方法および医薬組成物、ならびにリプログラミングされた細胞を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、細胞をリプログラミングする方法は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、またはＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現を低減させる工程を含むか、あるいはバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、第２のバリア遺伝子の発現も低減する。別の実施形態では、リプログラミング方法は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の発現を低減させる工程を含む。【選択図】図４ｊ
Description
相互参照
本特許出願は、２０２１年６月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２０８，４１４の利益を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に援用される。
本特許出願は、２０２１年６月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２０８，４１４の利益を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に援用される。
連邦政府によって支援される研究に関する陳述
本発明は、カリフォルニア州再生医療機構によって与えられたＤＩＳＣ２－１０１１０、ならびに米国国立衛生研究所によって与えられたＲ０１ ＨＬ１４９９９２およびＲ０１ ＨＬ１４８８２７の下の政府支援により作られた。政府は本発明において一定の権利を有している。
本発明は、カリフォルニア州再生医療機構によって与えられたＤＩＳＣ２－１０１１０、ならびに米国国立衛生研究所によって与えられたＲ０１ ＨＬ１４９９９２およびＲ０１ ＨＬ１４８８２７の下の政府支援により作られた。政府は本発明において一定の権利を有している。
分化かつ特殊化した細胞型から別の細胞型への直接的な系統リプログラミングは、再生医療の主要な目標である。リプログラミングのプロセスは、系統決定因子（ＬＤＦ）（例えば、転写因子（ＴＦ）および／またはｍｉＲＮＡ）の過剰発現によって誘発することができ、系統決定因子は、線維芽細胞などの分化細胞を、人工多能性幹細胞、神経細胞、および心筋細胞に変換するために使用されてきた。しかし、このような状況で、運命に問題がある細胞（ｆａｔｅ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｃｅｌｌ）のごく一部分しかリプログラミングを受けないことがほとんどの試験により報告され、それにより、現在では臨床応用が制限されている。
一態様では、本開示は、異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成する方法を提供する。本方法は、上記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、上記異なる細胞型の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程であって、上記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子が含まれる、工程を含む。
別の態様では、本開示は、異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成する方法を提供する。本方法は、上記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、上記異なる細胞型の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される、少なくとも２つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子はＳｐ７をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、上記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、上記異なる細胞型の細胞において少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＳＰＢ３、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、ＯＬＦＭＬ３、ＴＣＴＡ、およびＥＦＨＤ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、上記少なくとも１つのバリア遺伝子の上記発現レベルの低下後７２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、上記少なくとも１つのバリア遺伝子の上記発現レベルの低下後４８時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、上記少なくとも１つのバリア遺伝子の上記発現レベルの低下後２４時間以内に増加する。
いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、またはＰＢＭＣである。
いくつかの実施形態では、方法は、上記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、上記異なる細胞型の細胞のクロマチン構造を変化させる工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、上記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、上記異なる細胞型の細胞は、上記少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されたタンパク質に結合されるモチーフの数が減少している。
いくつかの実施形態では、モチーフはＡＰ－１モチーフを含む。
いくつかの実施形態では、関心対象の細胞は、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または人工多能性幹細胞である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴＬ１、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＭＹＯＤからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記異なる細胞型の細胞と比較して、関心対象の細胞は、少なくとも１つの心臓マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心臓マーカーは、ＡＣＴＣ１、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰＢからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記異なる細胞型の細胞と比較して、関心対象の細胞は、少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ４およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記異なる細胞型の細胞と比較して、関心対象の細胞は、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーは、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程は、上記異なる細胞型の細胞を、上記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞は体細胞である。いくつかの実施形態では、関心対象の細胞は体細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、上記異なる細胞型の細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態に変換する工程をさらに含む。
別の態様では、本開示は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の少なくとも１つの阻害剤と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物であって、上記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、第２のバリア遺伝子の少なくとも第２の阻害剤が含まれる、医薬組成物を提供する。
ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の少なくとも１つの阻害剤と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子はＳｐ７をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの阻害剤は、上記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子を含む。
別の態様では、本開示は、修復または回復を必要とする対象の損傷を受けた組織に対する機能的および構造的な完全性を修復または回復するための方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される医薬組成物を有効量で上記対象に投与する工程を含む。
少なくとも１つの系統決定因子を投与する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
いくつかの実施形態では、１つの系統決定因子は、上記医薬組成物の投与後７２時間以内に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、上記医薬組成物の投与後４８時間以内に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、上記医薬組成物の投与後２４時間以内に投与される。いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は心臓組織であり、上記少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、またはＴＢＸ５である。
いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は神経組織であり、上記少なくとも１つの系統決定因子は、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、またはＭＹＴＬ１である。いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は骨格筋組織であり、上記少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＯＤである。いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は幹細胞系統であり、上記少なくとも１つの系統決定因子は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはＭＹＣである。
別の態様では、本開示は、細胞移植を必要とするレシピエントに細胞移植を実施するための方法を提供し、本方法は、ドナーの第１の細胞から第２の細胞を生成する工程であって、上記ドナーが上記レシピエントと免疫適合性であり、上記第２の細胞が本明細書に開示される方法に従って生成される工程、および上記第２の細胞を上記レシピエントに移植する工程を含む。
いくつかの実施形態では、レシピエントと上記ドナーは同一の個体である。いくつかの実施形態では、第１の細胞は、線維芽細胞または内皮細胞である。いくつかの実施形態では、第２の細胞は、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または幹細胞様細胞である。
別の態様では、本開示は、異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成するための方法を提供し、本方法は、異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、異なる細胞型の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程であって、少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子が含まれる、工程を含む。
別の態様では、本開示は、第１の細胞型を有する第１の複数の細胞および培地を含む医薬組成物を提供し、上記医薬組成物は、第１の細胞型と比較して、異なる細胞型の第２の複数の細胞を得る工程、第２の複数の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程であって、上記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子が含まれる工程、あるいは第２の複数の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程を含むプロセスによって作られる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子はＳｐ７をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、第２の複数の細胞において少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＳＰＢ３、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、ＯＬＦＭＬ３、ＴＣＴＡ、およびＥＦＨＤ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロセスは、第１の複数の細胞において少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後７２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後４８時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後２４時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、またはＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、プロセスは、第２の複数の細胞のクロマチン構造を変化させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞の野生型細胞と比較して、第２の複数の細胞は、上記少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されたタンパク質に結合されるモチーフの数が減少している。いくつかの実施形態では、モチーフはＡＰ－１モチーフを含む。いくつかの実施形態では、第１の複数の細胞は、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴＬ１、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＭＹＯＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞と比較して、第１の複数の細胞は、少なくとも１つの心臓マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心臓マーカーは、ＡＣＴＣ１、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰＢからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞と比較して、第１の複数の細胞は、少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ４およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞と比較して、第１の複数の細胞は、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーは、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程は、第２の複数の細胞を、上記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞は体細胞である。いくつかの実施形態では、第１の複数の細胞は体細胞である。いくつかの実施形態では、プロセスは、第２の複数の細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態に変換する工程をさらに含む。
参照による援用
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により援用されるように具体的かつ個々に示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に援用される。
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により援用されるように具体的かつ個々に示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に援用される。
以下の本発明の実施形態の詳細な説明は、添付された図面と共に読まれると、より一層理解されるだろう。本発明を説明する目的で、現在例示されている実施形態が図面に示される。しかし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成および手段に限定されないことを理解されたい。
患者の損傷を受けた細胞を置き換えることは、再生医療の最終的な目標である。直接的な細胞リプログラミング（ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）とも称される分化転換は、その目標を達成するための潜在的な方法のうちの１つである。分化転換のプロセスは、既存の分化細胞を必要とされる細胞型に変換する。１つの遺伝子プログラムをダウンレギュレートし、かつ新たな遺伝子プログラムをアップレギュレートすることを、同時に、または続けてのいずれかで行うことにより、１つの細胞型が別の細胞型に直接変換され得る。目標を達成するための別の潜在的な方法は、リプログラミングである。リプログラミングにより、分化細胞は多能性に戻るように誘導される。多能性の状態により、細胞はほとんど全ての細胞型に分化できるようになる。（Ｃｈｒｉｓ Ｊｏｐｌｉｎｇ，Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ｂｏｕｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：ｔｈｒｅｅ ｒｏｕｎｔｅｓ ｔｏ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，７９－８９（Ｆｅｂ．２０１１））。言い換えれば、分化転換によって、誘導された中間の多能性状態を介して移行する必要なく、ある体細胞型を別の細胞系統へ直接リプログラミングすることが可能になる。典型的な細胞リプログラミングでは、細胞は先ず人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態に変換され、次いで所望の系統を下って分化し、大量のリプログラミングされた細胞を生成する。
分化転換および／またはリプログラミングのプロセスは、系統決定因子（ＬＤＦ）（例えば、転写因子（ＴＦ）および／またはｍｉＲＮＡ）の過剰発現によって誘発することができ、系統決定因子は、線維芽細胞などの分化細胞を、人工多能性幹細胞、神経細胞、および心筋細胞に変換するために使用されてきた。しかし、このような状況で、運命に問題がある細胞のごく一部分しか分化転換および／またはリプログラミングを受けないことがほとんどの試験により報告され、それにより、現在では臨床応用が制限されている。したがって、増強された分化転換および／またはリプログラミングのニーズが存在している。本開示は、概して、増強された細胞リプログラミングおよび増強された細胞分化転換のための方法に関する。特に、異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成するための方法、医薬組成物、修復または回復を必要とする対象の損傷を受けた組織に対する機能的および構造的な完全性を修復または回復するための方法、および移植を必要とするレシピエントの細胞移植を実施するための方法が、本明細書に開示される。
いくつかの態様は、説明のための例示的適用を参照して以下に記載される。多数の具体的な詳細、関連性、および方法が、本明細書に記載される特徴の十分な理解を提供するために言及されることが理解されるべきである。しかし、関連する技術分野における当業者は、１つ以上の具体的な詳細なしで、または他の方法とともに本明細書に記載される特徴が実施可能であることを容易に認識するであろう。本明細書に記載される特徴は、いくつかの作用が異なる順序で、かつ／または他の作用もしくは事象と同時に生じ得るので、作用または事象の説明される順序によって限定されない。さらに、本明細書に記載される特徴に従って方法論を実施するために、すべての説明される作用または事象が必要とされるとは限らない。
本明細書で使用される用語は、特定の事例のみを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図していない。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、複数形を同様に含むことが意図されている。分子量などの物理的特性、または化学式などの化学的特性に関する範囲が本明細書で使用されているとき、範囲のすべての組合せと部分的な組合せ、および範囲内の具体的な実施形態が包含されるように意図されている。数または数の範囲について言及するときの用語「約」は、言及される数または数の範囲が、実験的な可変性の範囲内の（または統計的実験誤差内の）概算であることを意味し、故に、数または数の範囲は明示された数または数の範囲の１％～１５％の間で変動することがある。用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「有している（ｈａｖｉｎｇ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの関連語）は、他の実施形態において、例えば、本明細書に記載される任意の合成物、組成物、方法、またはプロセスなどの実施形態が、記載された特徴「～からなる」または「～から本質的になる」場合があることを除外することを意図したものではない。
定義
本明細書で使用されるとき、「直接的なリプログラミング」または「分化転換」という用語は、中間の多能性状態または前駆細胞型を経ることなく、細胞がある分化細胞型から別の細胞型に変換するプロセスを指す。例えば、分化細胞（例えば、線維芽細胞）の細胞表現型は、線維芽細胞がより分化しなかった表現型中間体（例えば、人工多能性幹細胞）に完全にリプログラミングされることなく、異なる分化細胞（心筋細胞）へ変化する。
本明細書で使用されるとき、「直接的なリプログラミング」または「分化転換」という用語は、中間の多能性状態または前駆細胞型を経ることなく、細胞がある分化細胞型から別の細胞型に変換するプロセスを指す。例えば、分化細胞（例えば、線維芽細胞）の細胞表現型は、線維芽細胞がより分化しなかった表現型中間体（例えば、人工多能性幹細胞）に完全にリプログラミングされることなく、異なる分化細胞（心筋細胞）へ変化する。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞型」は、細胞の明確な形態学的または機能的形態を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「リプログラミング」は、部分的または最終的に分化した体細胞の分化状態を、変化または逆転するプロセスを指す。リプログラミングは部分的または完全であり得、すなわち、体細胞の分化状態は、部分的または完全に逆転され得る。いくつかの実施形態では、体細胞が人工多能性幹細胞にリプログラミングされると、リプログラミングは完了する。しかし、リプログラミングは、例えば任意のそれほど分化していない状態への逆転など、部分的であり得る。例えば、最終分化細胞を、分化多能性細胞などのあまり分化していない状態の細胞に逆転させることである。
本明細書で使用されるとき、用語「多能性幹細胞」（ＰＳ細胞）は、正しい条件下でいくつかの異なる細胞型の後代を産生することができる細胞である。ＰＳ細胞は、適切な宿主において奇形腫を形成する能力、または培養において３つの胚葉すべての組織型を表すマーカーが着色可能な細胞に分化する能力など、当該技術分野で許容された標準的な試験に従って、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の三胚葉のそれぞれの誘導体である後代を産生することができる。成人の体細胞からリプログラミングされた人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）と同様に、胚性幹（ＥＳ）細胞などの様々な型の胚細胞もＰＳ細胞の定義に含まれている。
本明細書で使用されるとき、用語「体細胞」は、卵子、***などの生殖細胞以外の任意の細胞であって、そのＤＮＡを次世代に直接移入しない細胞を指す。典型的には、体細胞は限定された多能性を有するか、または多能性がない。本明細書中で使用される体細胞は、自然に存在するか、または遺伝子組換えされていることがある。
本明細書で使用されるとき、「系統決定因子」または「ＬＤＦ」という用語は、系統決定を調節し、かつ細胞運命を決定する転写因子（ＴＦ）またはｍｉＲＮＡを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＡＪＳＺ」は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＺＮＦ２０７の４つのＴＦを指す。用語「ｓｉＡＪＳＺ」は、ＡＪＳＺを標的とするｓｉＲＮＡの組合せを指し、各ｓｉＲＮＡはＡＪＳＺ遺伝子のうちの１つを標的とする。
本明細書で使用されるとき、用語「ＡＢＭ」は、遺伝子Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、およびＭｙｔｌ１を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＭＧＴ」は、遺伝子Ｍｅｆ２ｃ、Ｇａｔａ４、およびＴｂｘ５を指す。
本明細書で使用されるとき、「リプログラミングアゴニスト遺伝子」または「アゴニスト遺伝子」という用語は、細胞リプログラミングを引き起こすか、または誘導することができるタンパク質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用されるとき、「リプログラミングアゴニスト」または「アゴニスト」という用語は、細胞リプログラミングを引き起こすか、または誘導するタンパク質を指す。
本明細書で使用されるとき、「リプログラミングバリア遺伝子」または「バリア遺伝子」という用語は、細胞リプログラミングを防ぐか、または阻害することができるタンパク質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用されるとき、「リプログラミングバリア」または「バリア」という用語は、細胞リプログラミングを防ぐか、または阻害することができるタンパク質を指す。
リプログラミングおよび分化転換の方法
本開示は、増強された細胞リプログラミングおよび増強された細胞分化転換のための方法を提供する。
本開示は、増強された細胞リプログラミングおよび増強された細胞分化転換のための方法を提供する。
一態様では、本開示は、異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成するための方法であって、上記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、上記異なる細胞型の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程であって、上記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子が含まれる、工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＮＣＥＨ１と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＨＥＸＩＭを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。い
くつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。
くつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。
別の態様では、本開示は、異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成するための方法であって、上記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、上記異なる細胞型の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される、少なくとも２つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＺＮＦ２０７と、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、Ｓｐ７と、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、Ｓｐ７と、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、お よびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第５のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７からなる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる。
いくつかの実施形態では、方法は、異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、異なる細胞型の細胞において少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＳＰＢ３、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、ＯＬＦＭＬ３、ＴＣＴＡ、およびＥＦＨＤ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＭＥＦ２Ｃである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＨＳＰＢ３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＴＰＰ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＥＭＣ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＰＰＩＣである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＩＬ７Ｒである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＯＬＦＭＬ３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＴＣＴＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子はＥＦＨＤ１である。
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後１０日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後９日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後８日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後７日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後６日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後５日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後４日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後７２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後６０時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後４８時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後４２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後３６時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後３０時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後２４時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後１８時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後１２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後６時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後３時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後１時間以内に増加する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前１０日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前９日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前８日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前７日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前６日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前５日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前４日以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前７２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前６０時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前４８時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前４２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前３６時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前３０時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前２４時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前１８時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前１２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前６時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前３時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下前１時間以内に増加する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下と同時に増加する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つの系統決定因子の上流の抑制遺伝子を阻害することによって増加され得る。いくつかの実施形態では、抑制遺伝子は、抑制遺伝子を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス小分子ノンコーディングＲＮＡ（ｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、抑制遺伝子は、抑制遺伝子を標的とする少なくとも１つの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって阻害され得る。いくつかの実施形態では、抑制遺伝子は、遺伝子編集ツールによって阻害され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、抑制遺伝子は、抑制遺伝子を標的とする小分子によって阻害され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、細胞の少なくとも１つの系統決定因子の過剰発現によって増加され得る。いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも１つの系統決定因子の過剰発現は、少なくとも１つの系統決定因子を保持する少なくとも１つのベクターを細胞にトランスフェクトすることにより達成され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのベクターはウイルスである。ウイルスは、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウィルスであり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴＬ１、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＭＹＯＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＥＦ２Ｃである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＧＡＴＡ４である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＴＢＸ５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＡＳＣＬ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＢＲＮ２である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＴＬ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＯＣＴ４である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＫＬＦ４である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＳＯＸ２である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＣである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＯＤである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、およびＭＹＴＬ１を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、およびＴＢＸ５を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＭＹＣを含むか、またはこれらからなる。
いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞は任意の細胞型であり得る。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞は体細胞であり得る。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞は、上皮細胞、神経細胞、筋細胞、または結合組織細胞であり得る。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞は分化細胞であり得る。いくつかの実施形態では、分化細胞は完全に分化していてもよく、または部分的に分化していてもよい。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。
いくつかの実施形態では、本方法は、異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、異なる細胞型の細胞のクロマチン構造を変化させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、異なる細胞型の細胞のクロマチン構造を変化させる工程は、クロマチンへの少なくとも１つのバリア遺伝子の直接結合パターンを変化させることを含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞の野生型の細胞と比較して、異なる細胞型の細胞クロマチン構造を変化させる工程は、ゲノム全体にわたって散在する、ＡＰ－１モチーフを濃縮したオープンクロマチンへの少なくとも１つのバリア遺伝子の結合パターンを変化させることを含み、それによってクロマチンを再構成し、かつ細胞運命リプログラミングを促進する少なくとも１つのＬＤＦの能力が制限される。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、異なる細胞型の細胞のクロマチン構造を変化させる工程は、原型的なＡＰ－１（ＴＲＥ：ＴＧＡＣＴＣＡ）モチーフを介した、クロマチンへの少なくとも１つのバリア遺伝子結合のパターンを変化させることを含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、異なる細胞型の細胞のクロマチン構造を変化させる工程は、部分的なＡＰ－１モチーフ（ＣＲＥ：ＴＧＡＣＧＴ－）を介した、クロマチンへの少なくとも１つのバリア遺伝子結合のパターンを変化させることを含む。
いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、異なる細胞型の細胞は、少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されたタンパク質に結合されるモチーフの数が減少している。いくつかの実施形態では、クロマチンに対する少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されるタンパク質の数が減少する。いくつかの実施形態では、ＡＰ－１モチーフを濃縮したオープンクロマチンに結合する少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されるタンパク質の数が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されるタンパク質によるクロマチンへの結合の数が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＳＰ７、またはＺＮＦ２０７である。
いくつかの実施形態では、関心対象の細胞は任意の細胞型であり得る。いくつかの実施形態では、関心対象の細胞は体細胞であり得る。いくつかの実施形態では、関心対象の細胞は、上皮細胞、神経細胞、筋細胞、または結合組織細胞であり得る。いくつかの実施形態では、関心対象の細胞は完全に分化していてもよく、または部分的に分化していてもよい。いくつかの実施形態では、関心対象の細胞は、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または人工多能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、異なる細胞型の細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態に変換する（ｃｏｖｅｒｔｉｎｇ）工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞と比較して、関心対象の細胞は、特定の細胞系統の少なくとも１つの分化マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、分化マーカーは少なくとも１つの心臓マーカーであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心臓マーカーは、ＡＣＴＣ１、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰＢからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、分化マーカーは少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーは、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、異なる細胞型の細胞と比較して、関心対象の細胞は、少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ４およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される。
バリア遺伝子の発現レベルを低下させる方法
少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、当業者に知られている任意の遺伝子編集ツールを使用することによって低下することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つの遺伝子編集ツールと接触させることによって減少される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。場合によっては、遺伝子編集ツールまたはシステムは、本明細書に開示されるバリア遺伝子またはその一部と相補的なガイドポリヌクレオチドと複合体を形成できる。さらに、場合によっては、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡが、本明細書に開示されるバリア遺伝子内の標的配列またはバリア遺伝子に隣接する標的配列を結合する配列を含む。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドが、本明細書に開示されるバリア遺伝子の一部を結合する。標的配列はミスマッチを含有する場合があるが、依然として遺伝子編集ツールまたはシステムの結合および機能性を可能にし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、トランスポゾンベースのヌクレアーゼ、アルゴノート、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ－ＴＡＬである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス小分子ノンコーディングＲＮＡ（ｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、上記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子と接触させることによって低下される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリア遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を標的とする少なくとも１つの小分子と接触させることによって低下される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを調節する調節タンパク質の遺伝子を標的とする遺伝子編集ツールと接触させることによって低下される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリアの発現レベルを調節する調節タンパク質を標的とする小分子と接触させることによって低下される。
少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、当業者に知られている任意の遺伝子編集ツールを使用することによって低下することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つの遺伝子編集ツールと接触させることによって減少される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。場合によっては、遺伝子編集ツールまたはシステムは、本明細書に開示されるバリア遺伝子またはその一部と相補的なガイドポリヌクレオチドと複合体を形成できる。さらに、場合によっては、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡが、本明細書に開示されるバリア遺伝子内の標的配列またはバリア遺伝子に隣接する標的配列を結合する配列を含む。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドが、本明細書に開示されるバリア遺伝子の一部を結合する。標的配列はミスマッチを含有する場合があるが、依然として遺伝子編集ツールまたはシステムの結合および機能性を可能にし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、トランスポゾンベースのヌクレアーゼ、アルゴノート、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ－ＴＡＬである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス小分子ノンコーディングＲＮＡ（ｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、上記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子と接触させることによって低下される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリア遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を標的とする少なくとも１つの小分子と接触させることによって低下される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを調節する調節タンパク質の遺伝子を標的とする遺伝子編集ツールと接触させることによって低下される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルは、異なる細胞型の細胞を、少なくとも１つのバリアの発現レベルを調節する調節タンパク質を標的とする小分子と接触させることによって低下される。
医薬組成物
別の態様では、本開示は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の少なくとも１つの阻害剤と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物であって、上記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、第２のバリア遺伝子の少なくとも第２の阻害剤が含まれる、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＮＣＥＨ１と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＨＥＸＩＭを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２およびＮＣＥＨ１を含む。
別の態様では、本開示は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の少なくとも１つの阻害剤と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物であって、上記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、第２のバリア遺伝子の少なくとも第２の阻害剤が含まれる、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＮＣＥＨ１と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２からなる群から選択される第２のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＨＥＸＩＭを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＣＨＳＴ２およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１５を含む。い
くつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。
くつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、およびＮＣＥＨ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１を含む。
別の態様では、本開示は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の少なくとも１つの阻害剤と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＺＮＦ２０７と、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、Ｓｐ７と、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第３のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢおよびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＺＮＦ２０７およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、Ｓｐ７と、ＺＮＦ２０７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＡＴＦ７ＩＰ、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＡＴＦ７ＩＰを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＪＵＮＢ、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第４のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＪＵＮＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰと、ＪＵＮＢと、ＺＮＦ２０７と、Ｓｐ７と、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される第５のバリア遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＦＯＸＡ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＨＥＸＩＭ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＭＡＲＣＡ５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＳＯＸ１５を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＣＨＳＴ２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、およびＮＣＥＨ１を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７からなる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの阻害剤は、少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス小分子ノンコーディングＲＮＡ（ｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの阻害剤は、上記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの阻害剤は、少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つの遺伝子編集ツールである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ツールはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの阻害剤は、少なくとも１つのバリア遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を標的とする少なくとも１つの小分子である。
薬学的に許容可能な担体の非限定的な例としては、脂質、糖類、アミノ酸、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、デキストロース、トレハロース、トリロイシン、ロイシン、マンニトール、マルチトール、キシリトール、グリシン、ソルビトール、エリスリトール、ホスファチジルコリン（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥなど）、カルシウム塩（例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム）、鉄塩、デンプン、炭水化物、シクロデキストリン、セルロース、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびそれらの誘導体が挙げられる。
薬学的に許容可能な賦形剤の非限定的な例としては、脂質、糖類、アミノ酸、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、デキストロース、トレハロース、トリロイシン、ロイシン、メチオニン、マンニトール、マルチトール、キシリトール、グリシン、ソルビトール、エリスリトール、ホスファチジルコリン（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥなど）、デンプン、炭水化物、シクロデキストリン、カルシウム塩（例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム）、鉄塩、セルロース、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびそれらの誘導体が挙げられる。
別の態様では、本開示は、第１の細胞型を有する第１の複数の細胞および培地を含む医薬組成物を提供し、上記医薬組成物は、（ｉ）第１の細胞型と比較して、異なる細胞型の第２の複数の細胞を得る工程と、（ｉｉ）第２の複数の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程であって、上記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子が含まれるか、または第２の複数の細胞においてＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の発現レベルが低下する、工程とを含むプロセスによって作られる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子は、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子はＳｐ７をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、第２の複数の細胞において少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＳＰＢ３、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、ＯＬＦＭＬ３、ＴＣＴＡ、およびＥＦＨＤ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロセスは、第１の複数の細胞において少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後７２時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後４８時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルは、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルの低下後２４時間以内に増加する。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、またはＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、プロセスは、第２の複数の細胞のクロマチン構造を変化させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞の野生型細胞と比較して、第２の複数の細胞は、上記少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されたタンパク質に結合されるモチーフの数が減少している。いくつかの実施形態では、モチーフはＡＰ－１モチーフを含む。いくつかの実施形態では、第１の複数の細胞は、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴＬ１、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＭＹＯＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞と比較して、第１の複数の細胞は、少なくとも１つの心臓マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心臓マーカーは、ＡＣＴＣ１、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰＢからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞と比較して、第１の複数の細胞は、少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ４およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞と比較して、第１の複数の細胞は、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーは、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程は、第２の複数の細胞を、上記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第２の複数の細胞は体細胞である。いくつかの実施形態では、第１の複数の細胞は体細胞である。いくつかの実施形態では、プロセスは、第２の複数の細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態に変換する工程をさらに含む。
組織再生
別の態様では、本開示は、修復または回復を必要とする対象の損傷を受けた組織に対する機能的および構造的な完全性を修復または回復するための方法を提供し、方法は、本明細書に開示される医薬組成物を有効量で対象に投与する工程を含む。
別の態様では、本開示は、修復または回復を必要とする対象の損傷を受けた組織に対する機能的および構造的な完全性を修復または回復するための方法を提供し、方法は、本明細書に開示される医薬組成物を有効量で対象に投与する工程を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの系統決定因子を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後１０日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後９日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後８日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後７日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後６日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後５日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後４日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後７２時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後６０時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後４８時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後４２時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後３６時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後３０時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後２４時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後１８時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後１２時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後６時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後３時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与後１時間以内に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与の前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前１０日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前９日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前８日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前７日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前６日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前５日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前４日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前７２時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前６０時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前４８時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前４２時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前３６時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前３０時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前２４時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前１８時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前１２時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前６時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前３時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与前１時間以内に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、医薬組成物の投与と同時に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴＬ１、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＭＹＯＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＥＦ２Ｃである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＧＡＴＡ４である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＴＢＸ５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＡＳＣＬ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＢＲＮ２である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＴＬ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＯＣＴ４である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＫＬＦ４である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＳＯＸ２である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＣである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＯＤである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、およびＭＹＴＬ１を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、およびＴＢＸ５を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの系統決定因子は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＭＹＣを含むか、またはこれらからなる。
いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は心臓組織であり、上記少なくとも１つの系統決定因子は、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、またはＴＢＸ５である。いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は神経組織であり、上記少なくとも１つの系統決定因子は、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、またはＭＹＴＬ１である。いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は骨格筋組織であり、上記少なくとも１つの系統決定因子はＭＹＯＤである。いくつかの実施形態では、損傷を受けた組織は幹細胞系統であり、上記少なくとも１つの系統決定因子は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはＭＹＣである。
細胞移植
別の態様では、本開示は、細胞移植を必要とするレシピエントに細胞移植を実施するための方法を提供し、方法は、（ｉ）ドナーの第１の細胞から第２の細胞を生成する工程であって、ドナーはレシピエントと免疫適合性であり、第２の細胞が本明細書に開示される方法に従って生成される、工程と、（ｉｉ）上記レシピエントに第２の細胞を移植する工程とを含む。
別の態様では、本開示は、細胞移植を必要とするレシピエントに細胞移植を実施するための方法を提供し、方法は、（ｉ）ドナーの第１の細胞から第２の細胞を生成する工程であって、ドナーはレシピエントと免疫適合性であり、第２の細胞が本明細書に開示される方法に従って生成される、工程と、（ｉｉ）上記レシピエントに第２の細胞を移植する工程とを含む。
いくつかの実施形態では、レシピエントとドナーは同一の個体である。いくつかの実施形態では、レシピエントとドナーは異なる個体である。いくつかの実施形態では、第１の細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、またはＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、第２の細胞は、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または幹細胞様細胞である。
本明細書で引用される文献および出版物はすべて、参照により本明細書に援用される。
以下の実施例は本発明のいくつかの実施例をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、それらの例示的な性質によって、当業者に知られている他の手順、方法論、または技術が代替的に使用され得ることが理解されるだろう。
実施例１：ゲノムワイドなｓｉＲＮＡスクリーニングで同定されるバリア遺伝子
ハイスループットｓｉＲＮＡスクリーニングを使用して、線維芽細胞中での心臓リプログラミング（ＣＲ）を制限するＴＦを同定した。図１ａに示されるように、心臓系統レポーター導入遺伝子（Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ）を保持し、心臓ＬＤＦであるＭｅｆ２ｃ、Ｇａｔａ４、およびＴｂｘ５（ＭＧＴ）のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性過剰発現後に心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）へ直接リプログラミングできる、不死化マウス胚性線維芽細胞（ｉＭＧＴ－Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ－ＭＥＦ、以降ｉＭＧＴ－ＭＥＦと称する）を利用した。このＣＲアッセイ用に最適化された条件下で、運命に問題がある細胞の約６％のみが、３日間のＤｏｘ処理の後にＭｙｈ６－ｅＧＦＰ＋を発現し（図５ａ）、ＣＲに対する内因性バリアの同定に理想的なプラットフォームが得られた。
ハイスループットｓｉＲＮＡスクリーニングを使用して、線維芽細胞中での心臓リプログラミング（ＣＲ）を制限するＴＦを同定した。図１ａに示されるように、心臓系統レポーター導入遺伝子（Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ）を保持し、心臓ＬＤＦであるＭｅｆ２ｃ、Ｇａｔａ４、およびＴｂｘ５（ＭＧＴ）のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性過剰発現後に心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）へ直接リプログラミングできる、不死化マウス胚性線維芽細胞（ｉＭＧＴ－Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ－ＭＥＦ、以降ｉＭＧＴ－ＭＥＦと称する）を利用した。このＣＲアッセイ用に最適化された条件下で、運命に問題がある細胞の約６％のみが、３日間のＤｏｘ処理の後にＭｙｈ６－ｅＧＦＰ＋を発現し（図５ａ）、ＣＲに対する内因性バリアの同定に理想的なプラットフォームが得られた。
ゲノムワイドなＴＦスクリーニングを実施するために、－１日目にｉＭＧＴ－ＭＥＦに１４３５個のＴＦを対象としたｓｉＲＮＡのライブラリーをトランスフェクトし、０日目にＤｏｘで処理してＭＧＴ発現を誘導し、３日目に、自動蛍光顕微鏡法によるＣＲ効率（Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ＋ｉＣＭの割合）の評価のために画像化した。スクリーニングにより、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（図１ｂおよび提出された補足表１を参照されたい）と比較してＣＲ効率が有意に増加した（ｉＣＭで１．２５倍超の増加、ｐ＜０．０５）、６９個のｓｉＲＮＡを同定した。上位２０のヒットを独立したｓｉＲＮＡで検証し、８つのＴＦ（Ａｔｆ７ｉｐ、Ｆｏｘａ１、Ｈｅｘｉｍ２、Ｊｕｎｂ、Ｓｍａｒｃａ５、Ｓｏｘ１５、Ｓｐ７、およびＺｆｐ２０７）を標的とするｓｉＲＮＡの最終群は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌと比較してＣＲ効率をロバストに増加させる（１．２～３．８倍、ｐ＜０．０５）ことが見出されたため（図１ｃ、図１ｄ、および図５ｂ）、これらのＴＦはｉＭＥＦにおけるＣＲに対するバリアとして同定された。
８つのバリアＴＦが連携して作用し得るかどうかを判定するために、８つの検証済みのｓｉＲＮＡのあらゆる可能な組合せ（合計２５５個の組合せ）をＣＲアッセイにおいて試験した（図１ｅ）。この分析により、単一の最も効率的なｓｉＲＮＡであるｓｉＡｔｆ７ｉｐと比較してＣＲ効率が有意に増強した、４つのｓｉＲＮＡの組合せを同定した（図１ｆおよび提出された補足表２を参照されたい）。Ａｔｆ７ｉｐ、Ｊｕｎｂ、Ｓｐ７、およびＺｆｐ２０７に対するｓｉＲＮＡからなるこの組合せは、ＣＲアッセイにおけるＭｙｈ６－ｅＧＦＰ発現細胞の存在量を約６％から約３５～４０％に増加させ、ＣＲ効率はｓｉＣｏｎｔｒｏｌと比較して約６倍、およびｓｉＡｔｆ７ｉｐ単独と比較して約１．５倍増加することが認められる（図１ｇおよび図１ｈ）。これらの結果は、それぞれＡＴＦ相互作用、ＡＰ－１、Ｓｐ、およびジンクフィンガータンパク質ファミリーのメンバーである、Ａｔｆ７ｉｐ、Ｊｕｎｂ、Ｓｐ７、およびＺｆｐ２０７が機能的に相互作用することで、ｉＭＥＦにおける細胞運命リプログラミングに対抗することを示唆する。
実施例２：ＡＪＳＺはヒト線維芽細胞における心臓リプログラミングの保存されたバリアである。
本実施例は、Ａｔｆ７ｉｐ、Ｊｕｎｂ、Ｓｐ７、およびＺｆｐ２０７といった４つの遺伝子が、保存されたバリア遺伝子であることを実証する。ＭＧＴによる初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）のＣＲを調査し、ＡＪＳＺのバリア機能が進化的に保存されるかどうかを判定した。
本実施例は、Ａｔｆ７ｉｐ、Ｊｕｎｂ、Ｓｐ７、およびＺｆｐ２０７といった４つの遺伝子が、保存されたバリア遺伝子であることを実証する。ＭＧＴによる初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）のＣＲを調査し、ＡＪＳＺのバリア機能が進化的に保存されるかどうかを判定した。
その結果、ＨＤＦが４つのＴＦすべてを発現し（図６ａ）、ｓｉＡＪＳＺトランスフェクションがＡＪＳＺ転写を効果的に抑制できる（図６ｂ）ことを確認した。－１日目、ＨＤＦにｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、０日目にＭＧＴレトロウイルスを形質導入した。３日目のｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、ｓｉＡＪＳＺをトランスフェクトされたＨＤＦにおいて、サルコメア遺伝子（ＡＣＴＣ１、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２）、イオンチャネル（ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２）、および分泌因子（ＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ）を含む心臓マーカーの発現が、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクトされたＨＤＦと比較して、有意に増加した（２～８倍、ｐ＜０．０５）ことが実証された（図６ｃ）。これらの所見と一致して、心臓マーカーのα－アクチニン（ＡＣＴＮ１）の免疫染色により、ｓｉＡＪＳＺをトランスフェクトされたＨＤＦのうちＡＣＴＮ１＋細胞が、ＭＧＴ過剰発現後３０日目のｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクトされたＨＤＦと比較して、約３．２倍増加した（５％から１６％まで）ことが明らかとなった（ｐ＜０．０５；図１ｉおよび図１ｊ）。重要なことに、ＡＪＳＺのＫＤ後に観察されたＣＲ効率の増加には、具体的に、サルコメア様構造およびカルシウムトランジェントを含む、成熟ＣＭの構造的および機能的な表現型の獲得が伴った（図６ｄおよび図６ｅ）。これらの結果により、ＣＲに対するバリアとしてのＡＪＳＺの機能がマウス線維芽細胞とヒト線維芽細胞との間で保存されることが示される。
実施例３：系統および細胞型に依存せずリプログラミングに対するバリアとして作用するＡＪＳＺ
本実施例は、ＡＪＳＺのバリア機能が心臓リプログラミングに制限されず、さらに神経などの別の体細胞系統へのリプログラミングの効率を増加できることを実証する。ＳｉＣｏｎｔｒｏｌおよびｓｉＡＪＳＺをトランスフェクトされたＨＤＦを、神経ＬＤＦであるＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、およびＭｙｔｌ１（ＡＢＭ）を保持するＤｏｘ感受性レンチウイルスで形質導入した。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクトされた細胞と比較して、ＡＢＭ過剰発現後３日目に、ＡＪＳＺのＫＤは、ＭＡＰ２＋およびＴＵＪ１＋神経細胞様細胞の生成を約２．３倍（７．３％から約１７％）増強し（図１ｋ、図１ｌ）、これに付随して、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１を含む神経細胞特異的マーカー２１の転写を約２倍（ｐ＜０．０５）増加させた（図７ａ～７ｂ）。これにより、ヒト初代線維芽細胞における細胞運命安定性に対するＡＪＳＺ媒介性調節は系統に依存しないことが示される。
本実施例は、ＡＪＳＺのバリア機能が心臓リプログラミングに制限されず、さらに神経などの別の体細胞系統へのリプログラミングの効率を増加できることを実証する。ＳｉＣｏｎｔｒｏｌおよびｓｉＡＪＳＺをトランスフェクトされたＨＤＦを、神経ＬＤＦであるＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、およびＭｙｔｌ１（ＡＢＭ）を保持するＤｏｘ感受性レンチウイルスで形質導入した。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクトされた細胞と比較して、ＡＢＭ過剰発現後３日目に、ＡＪＳＺのＫＤは、ＭＡＰ２＋およびＴＵＪ１＋神経細胞様細胞の生成を約２．３倍（７．３％から約１７％）増強し（図１ｋ、図１ｌ）、これに付随して、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１を含む神経細胞特異的マーカー２１の転写を約２倍（ｐ＜０．０５）増加させた（図７ａ～７ｂ）。これにより、ヒト初代線維芽細胞における細胞運命安定性に対するＡＪＳＺ媒介性調節は系統に依存しないことが示される。
ＡＪＳＺのバリアの役割が、内皮細胞などの非線維芽細胞型に保存されるかどうかを評価した。先ず、本発明者らは、初代ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）中でＡＪＳＺが発現されること（図７ｃ）、およびそれらの発現を特定のｓｉＲＮＡによって効率的に抑制できることを確認した（図７ｄ）。本発明者らは、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクトされたＨＡＥＣと比較して、３日目にレトロウイルス媒介性ＭＧＴ過剰発現と組み合わせたＡＪＳＺのＫＤが心臓遺伝子発現を有意に増強し（２～１０倍、ｐ＜０．０５）（図７ｅ～７ｆ）、２０日目にＡＣＴＮ１＋ｉＣＭの生成が約１．５倍（ｐ＜０．０５）有意に増加したこと（図１ｍ～１ｎ）を見出した。これらの結果から、細胞運命リプログラミングに対するバリアとしての、ＡＪＳＺの細胞型非依存的な役割が示唆される。
実施例４：ＡＪＳＺ媒介性バリア機構は、線維芽細胞において基底状態で有効である。
本実施例は、ＡＪＳＺ媒介性バリア機構がＴＦ誘導性細胞運命の問題が生じる前に、線維芽細胞において基底状態で能動的に作用していることを実証する。本発明者らは、ＡＪＳＺのＫＤのタイミングがＬＤＦ過剰発現と比較してリプログラミング効率に影響を及ぼすかどうかを判定した（図８ａ）。ＭＧＴ誘導と比較して、－１日目のｓｉＡＪＳＺトランスフェクションがＣＲ効率をロバストに増強した一方で、ＭＧＴ過剰発現後１日目までのＡＪＳＺのＫＤの遅延がＣＲ効率における改善を排除した（図４ｂ～４ｃ）。さらに、ＭＧＴ過剰発現の－２日目または－３日目の早期のＡＪＳＺのＫＤは、ＡＪＳＺのＫＤがＣＲ効率を改善する能力を有意にかつ漸進的に低下させた（図４ｄ～４ｅ）。
本実施例は、ＡＪＳＺ媒介性バリア機構がＴＦ誘導性細胞運命の問題が生じる前に、線維芽細胞において基底状態で能動的に作用していることを実証する。本発明者らは、ＡＪＳＺのＫＤのタイミングがＬＤＦ過剰発現と比較してリプログラミング効率に影響を及ぼすかどうかを判定した（図８ａ）。ＭＧＴ誘導と比較して、－１日目のｓｉＡＪＳＺトランスフェクションがＣＲ効率をロバストに増強した一方で、ＭＧＴ過剰発現後１日目までのＡＪＳＺのＫＤの遅延がＣＲ効率における改善を排除した（図４ｂ～４ｃ）。さらに、ＭＧＴ過剰発現の－２日目または－３日目の早期のＡＪＳＺのＫＤは、ＡＪＳＺのＫＤがＣＲ効率を改善する能力を有意にかつ漸進的に低下させた（図４ｄ～４ｅ）。
実施例５：ＡＪＳＺは、ＡＰ－１モチーフへの結合を介してクロマチンと広く相互作用する。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑを使用して、処理前のＨＤＦ（ｕｎｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ＨＤＦ）中のＡＪＳＺのＤＮＡ結合部位の特徴付けを行った（図２ａ）。この分析により、２つの複製にわたりＪＵＮＢについて９１，１９６個、ＡＴＦ７ＩＰについて４４，１００個、ＳＰ７について１９，１６９個、およびＺＮＦ２０７について４１３５個の複製ピーク（結合部位）を同定した。ＡＪＳＺ結合部位のゲノム分布の調査により、ほとんどの相互作用（８８～９５％）がイントロン領域および遺伝子間領域内で生じることが明らかとなった（図２ｂおよび図９ａ）。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、これは、ＡＪＳＺ媒介性バリア機構が、主にクロマチン構成の調節における長距離相互作用および／または構造的役割からなり得ることを示唆する。モチーフ濃縮分析（Ｈｏｍｅｒ）により、ＨＤＦにおいて、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７が原型のＡＰ－１（ＴＲＥ：ＴＧＡＣＴＣＡ）モチーフを介してクロマチンに優先的に結合する一方で、ＡＴＦ７ＩＰが、部分的なＡＰ－１モチーフ（ＣＲＥ：ＴＧＡＣＧＴ－）を介して相互作用したこと（図２ｃおよび図９ｂ）が明らかとなった。したがって、ＡＰ－１モチーフに結合することは、基底状態のＨＤＦにおけるＡＪＳＺのクロマチンとの相互作用特有の分子の特徴である。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑを使用して、処理前のＨＤＦ（ｕｎｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ＨＤＦ）中のＡＪＳＺのＤＮＡ結合部位の特徴付けを行った（図２ａ）。この分析により、２つの複製にわたりＪＵＮＢについて９１，１９６個、ＡＴＦ７ＩＰについて４４，１００個、ＳＰ７について１９，１６９個、およびＺＮＦ２０７について４１３５個の複製ピーク（結合部位）を同定した。ＡＪＳＺ結合部位のゲノム分布の調査により、ほとんどの相互作用（８８～９５％）がイントロン領域および遺伝子間領域内で生じることが明らかとなった（図２ｂおよび図９ａ）。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、これは、ＡＪＳＺ媒介性バリア機構が、主にクロマチン構成の調節における長距離相互作用および／または構造的役割からなり得ることを示唆する。モチーフ濃縮分析（Ｈｏｍｅｒ）により、ＨＤＦにおいて、ＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７が原型のＡＰ－１（ＴＲＥ：ＴＧＡＣＴＣＡ）モチーフを介してクロマチンに優先的に結合する一方で、ＡＴＦ７ＩＰが、部分的なＡＰ－１モチーフ（ＣＲＥ：ＴＧＡＣＧＴ－）を介して相互作用したこと（図２ｃおよび図９ｂ）が明らかとなった。したがって、ＡＰ－１モチーフに結合することは、基底状態のＨＤＦにおけるＡＪＳＺのクロマチンとの相互作用特有の分子の特徴である。
実施例６：ＡＪＳＺは、細胞運命リプログラミング中にＡＰ－１モチーフへの結合を介してクロマチン再構成を変化させる
本実施例は、いかなる特定の理論に束縛されず、細胞運命リプログラミング中に、ＬＤＦによって誘導されたクロマチン再構成に対抗するために、ＡＪＳＺとＡＰ－１モチーフとの間の相互作用が寄与し得ることを実証する。基底状態（未処理）の、またはｓｉＣｏｎｔｒｏｌもしくはｓｉＡＪＳＺをトランスフェクトされたＨＤＦにおけるＭＧＴ過剰発現の２日後のＨＤＦから、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑを実施して、単細胞クロマチンアクセシビリティープロファイルを生成した。基底状態（２０，６２７個の細胞）およびＭＧＴ＋ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ細胞（１５，８５９個の細胞）のＨＤＦのｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）クラスタリングにより、細胞集団がコンパクトな連続体（図２ｄ～２ｅ）として分布したことが示され、異なる細胞集団間のクロマチンアクセシビリティープロファイルが著しく異ならなかったことが示された。対照的に、ＭＧＴ＋ｓｉＡＪＳＺ細胞（８９６６個の細胞）のｔ－ＳＮＥクラスタリングにより、残りの細胞集団から著しく分岐したクロマチンアクセシビリティープロファイルを有する離散的な細胞集団（クラスター＃２）（黒色の矢印、図２ｆ）を同定した。このクラスターは、この条件下で調査された全細胞の約１３％を表し、ＣＲアッセイにおいてｓｉＡＪＳＺトランスフェクションおよびＭＧＴ過剰発現後に生成されたＡＣＴＮ１＋ｉＣＭの観測された割合（約１６％）に顕著に類似している（図１ｉ～１ｊ）。クラスター１および３～７と比較して、差次的アクセス可能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ；ＤＡ）転写開始部位（ＴＳＳ）を有する遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析の比較により、クラスター＃２における心臓の用語の５～１０倍の濃縮（ｐ＜０．０００１）が明らかとなった（図９ｃおよび提出された補足表３を参照されたい）。これらの用語は横紋筋収縮および筋原線維形成を含み、ＮＫＸ２－５、ＡＣＴＡ１、およびＮＰＰＡなどの多様な心臓特異的遺伝子に関与していた（図９ｄ）。集合的に、これらの結果により、１）クラスター＃２が、ＣＲを示すエピジェネティックな特徴を提示する細胞集団を表すこと、および２）ＡＪＳＺが、このプロセス中のクロマチンアクセシビリティー動態を調節することが示される。
本実施例は、いかなる特定の理論に束縛されず、細胞運命リプログラミング中に、ＬＤＦによって誘導されたクロマチン再構成に対抗するために、ＡＪＳＺとＡＰ－１モチーフとの間の相互作用が寄与し得ることを実証する。基底状態（未処理）の、またはｓｉＣｏｎｔｒｏｌもしくはｓｉＡＪＳＺをトランスフェクトされたＨＤＦにおけるＭＧＴ過剰発現の２日後のＨＤＦから、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑを実施して、単細胞クロマチンアクセシビリティープロファイルを生成した。基底状態（２０，６２７個の細胞）およびＭＧＴ＋ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ細胞（１５，８５９個の細胞）のＨＤＦのｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）クラスタリングにより、細胞集団がコンパクトな連続体（図２ｄ～２ｅ）として分布したことが示され、異なる細胞集団間のクロマチンアクセシビリティープロファイルが著しく異ならなかったことが示された。対照的に、ＭＧＴ＋ｓｉＡＪＳＺ細胞（８９６６個の細胞）のｔ－ＳＮＥクラスタリングにより、残りの細胞集団から著しく分岐したクロマチンアクセシビリティープロファイルを有する離散的な細胞集団（クラスター＃２）（黒色の矢印、図２ｆ）を同定した。このクラスターは、この条件下で調査された全細胞の約１３％を表し、ＣＲアッセイにおいてｓｉＡＪＳＺトランスフェクションおよびＭＧＴ過剰発現後に生成されたＡＣＴＮ１＋ｉＣＭの観測された割合（約１６％）に顕著に類似している（図１ｉ～１ｊ）。クラスター１および３～７と比較して、差次的アクセス可能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ；ＤＡ）転写開始部位（ＴＳＳ）を有する遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析の比較により、クラスター＃２における心臓の用語の５～１０倍の濃縮（ｐ＜０．０００１）が明らかとなった（図９ｃおよび提出された補足表３を参照されたい）。これらの用語は横紋筋収縮および筋原線維形成を含み、ＮＫＸ２－５、ＡＣＴＡ１、およびＮＰＰＡなどの多様な心臓特異的遺伝子に関与していた（図９ｄ）。集合的に、これらの結果により、１）クラスター＃２が、ＣＲを示すエピジェネティックな特徴を提示する細胞集団を表すこと、および２）ＡＪＳＺが、このプロセス中のクロマチンアクセシビリティー動態を調節することが示される。
リプログラミングを経験している、ＡＪＳＺレベルが低下した細胞（ｓｉＡＪＳＺ＋ＭＧＴ ＨＤＦにおけるクラスター＃２細胞；ドメイン１）および非リプログラミングまたはリプログラミング抵抗性状態（未処理のＨＤＦまたはｓｉＣｏｎｔｒｏｌ＋ＭＧＴ ＨＤＦ；ドメイン２）のＡＪＳＺレベルが正常な細胞においてＤＡクロマチンのすべての領域をマッピングした。興味深いことには、２つの相互に排他的なドメインは、ゲノム中に均一に散在し（図２ｇおよび図１０ａ～１０ｂ）、ＤＡクロマチンの短い領域（＜６００ｂｐ）からなり（図２ｈ）、ドメイン１およびドメイン２についてそれぞれ約４．５Ｍｂｐおよび約７Ｍｂｐに及んでいた。これらの発見により、いかなる特定の理論によっても束縛されずに、細胞運命リプログラミング中に、ＡＪＳＺがゲノムワイドな規模でクロマチンアクセシビリティーを調節することが示された。次に、基底状態のＨＤＦ中のどちらか一方へのドメインへのＡＪＳＺ結合頻度を比較して、ＡＪＳＺが、ドメイン１またはドメイン２のクロマチンアクセシビリティーの調節に直接的な役割を果たすことができるかどうかを判定した。ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＣｈＩＰ－ｓｅｑデータの統合により、ドメイン１のクロマチンと比較して、ドメイン２へのＡＪＳＺ結合の頻度が著しく高いことが明らかとなった（５．７倍、図２ｉ）。この観測と一致して、ドメイン２のモチーフ濃縮分析は、ドメイン１と比較して、ドメイン２においてＡＰ－１モチーフ（１モチーフ／ｋｂ）の約４倍の濃縮を示し（図２ｊ）、特に、これらのＡＰ－１モチーフは、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ（図２ｃ）によってＪＵＮＢおよびＺＮＦ２０７のクロマチン結合に対して同定した配列と同じ配列（ＴＧＡＣＴＣＡ）を含有していた（図１０ｃおよび補足表４を参照されたい）。反対に、ドメイン１のモチーフ濃縮分析により、ドメイン２（図２ｊ）と比較して、ドメイン１（０．６モチーフ／ｋｂ）におけるＭＥＦ２モチーフの約３．５倍の濃縮が明らかとなり、心臓ＬＤＦであるＭＥＦ２Ｃの標準結合配列が含まれていた（図１０ｄおよび補足表４を参照されたい）。いかなる特定の理論に限定されることなく、これらの結果は、ドメイン２のクロマチン中のＡＰ－１モチーフへのＡＪＳＺのゲノムワイドな結合により、ＬＤＦであるＭＥＦ２Ｃがクロマチンを再構成し、かつドメイン１の開放を促進する能力が損なわれるモデルと一致しており、それによって、細胞運命変換に対抗する（図２ｋ）。
実施例７：ＡＪＳＺは、細胞運命リプログラミング中の転写の調節において近接的な役割を果たす
プロモーターＴＳＳ領域へのＡＪＳＺ結合（－１ｋｂｐ、＋０．１ｋｂｐ）は、基底状態のＨＤＦにおける全ＡＪＳＺ－クロマチン相互作用の１０％未満を占めたが（図２ｅおよび図１０ａ）、合計９３９２個のコアプロモーター領域がＡＪＳＺによって結合された（補足表５を参照されたい）。ＭＧＴ過剰発現の２日後に、対照およびＡＪＳＺのＫＤ ＨＤＦのゲノムワイドなＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。７３６個の差次的発現（ＤＥ）遺伝子を同定し、そのうち５０１個と２３５個が、それぞれＡＪＳＺのＫＤによってそれぞれダウンレギュレートおよびアップレギュレートされた（ｐ＜０．０５、図３ａおよび提出された補足表６を参照されたい）。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットの統合後、ＤＥ遺伝子の約２／３（７３６個中４６０個）が、ＨＤＦにおける４つのバリアＴＦの少なくとも１つによってそれらのコアプロモーター領域で結合することを見出した（図３ｂおよび提出された補足表７を参照されたい）。特に、コアプロモーター結合はＤＥ遺伝子の約７５％の遺伝子ダウンレギュレーションと相関し（図３ｂ）、したがって、細胞運命リプログラミング中の転写の調節においてＡＪＳＺが優勢的に活性化する役割が示された。これに関連して、コアプロモーター結合ＤＥ遺伝子のＧＯ分析によって、細胞運命の特定、心筋分化、線維芽細胞増殖、コラーゲンの組織化、およびＴＧＦβシグナル伝達に関する用語の有意な濃縮が明らかとなり、線維芽細胞において細胞運命調節転写プログラムの制御へのＡＪＳＺの潜在的な関与が実証された（図３ｃおよび提出された補足表８を参照されたい）。さらに、コアプロモーター結合に対する個々のＡＪＳＺ ＴＦ寄与の評価により、プロモーターの９７％がＨＤＦにおけるＪＵＮＢによって結合されることが明らかとなった（図３ｄ）。これに関連して、結合部位分布の分析により、ＪＵＮＢ結合が標的化プロモーターのＴＳＳで中心におかれ（図３ｅ）、ダウンレギュレートされた（ＴＡＧＬＮ）遺伝子およびアップレギュレートされた（ＭＥＦ２Ｃ）遺伝子の両方で観察できることが示された（図３ｆ～３ｇ）。まとめると、これらの結果により、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ＡＪＳＺが、ＤＥ遺伝子のＴＳＳへのＪＵＮＢ結合を介して、リプログラミング中の線維芽細胞（ＴＧＦβ、コラーゲン組織化、増殖）および細胞運命調節転写プログラムの調節において近接的な役割を果たすことが示される。
プロモーターＴＳＳ領域へのＡＪＳＺ結合（－１ｋｂｐ、＋０．１ｋｂｐ）は、基底状態のＨＤＦにおける全ＡＪＳＺ－クロマチン相互作用の１０％未満を占めたが（図２ｅおよび図１０ａ）、合計９３９２個のコアプロモーター領域がＡＪＳＺによって結合された（補足表５を参照されたい）。ＭＧＴ過剰発現の２日後に、対照およびＡＪＳＺのＫＤ ＨＤＦのゲノムワイドなＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。７３６個の差次的発現（ＤＥ）遺伝子を同定し、そのうち５０１個と２３５個が、それぞれＡＪＳＺのＫＤによってそれぞれダウンレギュレートおよびアップレギュレートされた（ｐ＜０．０５、図３ａおよび提出された補足表６を参照されたい）。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットの統合後、ＤＥ遺伝子の約２／３（７３６個中４６０個）が、ＨＤＦにおける４つのバリアＴＦの少なくとも１つによってそれらのコアプロモーター領域で結合することを見出した（図３ｂおよび提出された補足表７を参照されたい）。特に、コアプロモーター結合はＤＥ遺伝子の約７５％の遺伝子ダウンレギュレーションと相関し（図３ｂ）、したがって、細胞運命リプログラミング中の転写の調節においてＡＪＳＺが優勢的に活性化する役割が示された。これに関連して、コアプロモーター結合ＤＥ遺伝子のＧＯ分析によって、細胞運命の特定、心筋分化、線維芽細胞増殖、コラーゲンの組織化、およびＴＧＦβシグナル伝達に関する用語の有意な濃縮が明らかとなり、線維芽細胞において細胞運命調節転写プログラムの制御へのＡＪＳＺの潜在的な関与が実証された（図３ｃおよび提出された補足表８を参照されたい）。さらに、コアプロモーター結合に対する個々のＡＪＳＺ ＴＦ寄与の評価により、プロモーターの９７％がＨＤＦにおけるＪＵＮＢによって結合されることが明らかとなった（図３ｄ）。これに関連して、結合部位分布の分析により、ＪＵＮＢ結合が標的化プロモーターのＴＳＳで中心におかれ（図３ｅ）、ダウンレギュレートされた（ＴＡＧＬＮ）遺伝子およびアップレギュレートされた（ＭＥＦ２Ｃ）遺伝子の両方で観察できることが示された（図３ｆ～３ｇ）。まとめると、これらの結果により、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ＡＪＳＺが、ＤＥ遺伝子のＴＳＳへのＪＵＮＢ結合を介して、リプログラミング中の線維芽細胞（ＴＧＦβ、コラーゲン組織化、増殖）および細胞運命調節転写プログラムの調節において近接的な役割を果たすことが示される。
実施例８：ＡＪＳＺは、アゴニストおよびバリアのネットワークの転写調節を介して細胞運命リプログラミングに対抗する
ＡＪＳＺが、細胞運命リプログラミング中の転写のバリアおよび近位のレギュレーターの両方として作用すること（図１および図３）を考慮すると、それらがリプログラミングバリア遺伝子をアップレギュレートしながら、リプログラミングに必要とされる遺伝子（＝アゴニスト）をダウンレギュレートすることで、細胞運命安定性を促進する可能性がある（図４ａ）。ｉＭＧＴ－ＭＥＦ ＣＲアッセイにおいてｓｉＲＮＡ媒介性ＫＤ方略を使用して、トップ２５パーセンタイルのコアプロモーター結合遺伝子およびダウンレギュレートされた遺伝子を、リプログラミング機能に対するバリアについて、ＭＧＴ＋ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに対してＭＧＴ＋ｓｉＡＪＳＺ条件で試験した（提出された補足表９を参照されたい）。ＣＲ効率がロバストに増強した（１．５～２倍、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１；図４ｂ～４ｄ）ｓｉＣｈｓｔ２およびｓｉＮｃｅｈ１の２つのヒットを同定し、その結果、プロテオグリカン構造内の６－Ｏ硫酸化を媒介する炭水化物スルホトランスフェラーゼ２（Ｃｈｓｔ２）、ならびに脂肪滴形成および血小板活性化因子合成を調節する中性コレステロールエステルヒドロラーゼ１（Ｎｃｅｈ１）のリプログラミングの役割に対する新たなバリアを発見した。ｓｉＡＪＳＺ誘導性ＣＲアッセイにおけるリプログラミングの必要条件について、ＭＧＴ＋ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに対してＭＧＴ＋ｓｉＡＪＳＺ条件でトップ２５パーセンタイルのコアプロモーター結合遺伝子およびアップレギュレートされた遺伝子に対するｓｉＲＮＡをスクリーニングして、ＡＪＳＺ調節リプログラミングアゴニストを同定した（図４ｅ）（提出された補足表１０を参照されたい）。このアプローチにより、ＡＪＳＺのＫＤによって誘導されたＣＲ効率を５０％以下低下させた６１個のｓｉＲＮＡが同定され（図４ｆ）、これらのうち、９つのｓｉＲＮＡヒットが細胞生存率に効果がなく、さらなる分析のために選択された（図４ｇ～４ｈ）。９つのアゴニストは、細胞運命特定（Ｍｅｆ２ｃ）、タンパク質のフォールディングおよび分解（Ｅｍｃ１、Ｈｓｐｂ３、Ｐｐｉｃ、Ｔｐｐ１）、炎症およびＴＧＦβシグナル伝達（Ｉｌ７ｒ、Ｏｌｆｍｌ３、Ｔｃｔａ）、ならびにＡＴＰ恒常性（Ｅｆｈｄ１）の調節に関与する、４つの遺伝子カテゴリー（図４ｇ～４ｈ）に分類され得る。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、これらのデータは、ＡＪＳＺがアゴニストおよびバリアのリプログラミングの下流ネットワークの発現を調整することにより細胞運命リプログラミングに対抗することを示す。
ＡＪＳＺが、細胞運命リプログラミング中の転写のバリアおよび近位のレギュレーターの両方として作用すること（図１および図３）を考慮すると、それらがリプログラミングバリア遺伝子をアップレギュレートしながら、リプログラミングに必要とされる遺伝子（＝アゴニスト）をダウンレギュレートすることで、細胞運命安定性を促進する可能性がある（図４ａ）。ｉＭＧＴ－ＭＥＦ ＣＲアッセイにおいてｓｉＲＮＡ媒介性ＫＤ方略を使用して、トップ２５パーセンタイルのコアプロモーター結合遺伝子およびダウンレギュレートされた遺伝子を、リプログラミング機能に対するバリアについて、ＭＧＴ＋ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに対してＭＧＴ＋ｓｉＡＪＳＺ条件で試験した（提出された補足表９を参照されたい）。ＣＲ効率がロバストに増強した（１．５～２倍、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１；図４ｂ～４ｄ）ｓｉＣｈｓｔ２およびｓｉＮｃｅｈ１の２つのヒットを同定し、その結果、プロテオグリカン構造内の６－Ｏ硫酸化を媒介する炭水化物スルホトランスフェラーゼ２（Ｃｈｓｔ２）、ならびに脂肪滴形成および血小板活性化因子合成を調節する中性コレステロールエステルヒドロラーゼ１（Ｎｃｅｈ１）のリプログラミングの役割に対する新たなバリアを発見した。ｓｉＡＪＳＺ誘導性ＣＲアッセイにおけるリプログラミングの必要条件について、ＭＧＴ＋ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに対してＭＧＴ＋ｓｉＡＪＳＺ条件でトップ２５パーセンタイルのコアプロモーター結合遺伝子およびアップレギュレートされた遺伝子に対するｓｉＲＮＡをスクリーニングして、ＡＪＳＺ調節リプログラミングアゴニストを同定した（図４ｅ）（提出された補足表１０を参照されたい）。このアプローチにより、ＡＪＳＺのＫＤによって誘導されたＣＲ効率を５０％以下低下させた６１個のｓｉＲＮＡが同定され（図４ｆ）、これらのうち、９つのｓｉＲＮＡヒットが細胞生存率に効果がなく、さらなる分析のために選択された（図４ｇ～４ｈ）。９つのアゴニストは、細胞運命特定（Ｍｅｆ２ｃ）、タンパク質のフォールディングおよび分解（Ｅｍｃ１、Ｈｓｐｂ３、Ｐｐｉｃ、Ｔｐｐ１）、炎症およびＴＧＦβシグナル伝達（Ｉｌ７ｒ、Ｏｌｆｍｌ３、Ｔｃｔａ）、ならびにＡＴＰ恒常性（Ｅｆｈｄ１）の調節に関与する、４つの遺伝子カテゴリー（図４ｇ～４ｈ）に分類され得る。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、これらのデータは、ＡＪＳＺがアゴニストおよびバリアのリプログラミングの下流ネットワークの発現を調整することにより細胞運命リプログラミングに対抗することを示す。
実施例９：バリアネットワークのＡＪＳＺ媒介性調節は、系統および細胞型に依存しない。
本実施例は、バリアネットワークのＡＪＳＺ媒介性調節が系統および／または細胞型に特異的ではなかったことを実証する。ＡＪＳＺのＫＤ後のＨＤＦおよびＨＡＥＣを用いた神経および心臓のリプログラミングアッセイにおける９つのアゴニストおよび２つのバリアの発現を評価した。注目すべきことに、ＡＪＳＺのＫＤは、バリア遺伝子（ＣＨＳＴ２およびＮＣＥＨ１）の系統および細胞型に依存しないダウンレギュレーションをもたらし、３日間のリプログラミング後のリプログラミングアゴニスト（ＭＥＦ２Ｃ、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、およびＥＦＨＤ１）の保存されたアップレギュレーションと一致していた（図４ｉ）。これらの結果は、いかなる特定の理論に限定されるものではないが、ＡＪＳＺが、分化細胞の細胞運命安定性を制御する、細胞のプロセス（例えば、細胞運命特定、プロテオームリモデリング、プロテオグリカン硫酸化）の調節に特化した保存されたバリアネットワークの発現を近接的に調整することを実証する（図４ｊ）。
本実施例は、バリアネットワークのＡＪＳＺ媒介性調節が系統および／または細胞型に特異的ではなかったことを実証する。ＡＪＳＺのＫＤ後のＨＤＦおよびＨＡＥＣを用いた神経および心臓のリプログラミングアッセイにおける９つのアゴニストおよび２つのバリアの発現を評価した。注目すべきことに、ＡＪＳＺのＫＤは、バリア遺伝子（ＣＨＳＴ２およびＮＣＥＨ１）の系統および細胞型に依存しないダウンレギュレーションをもたらし、３日間のリプログラミング後のリプログラミングアゴニスト（ＭＥＦ２Ｃ、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、およびＥＦＨＤ１）の保存されたアップレギュレーションと一致していた（図４ｉ）。これらの結果は、いかなる特定の理論に限定されるものではないが、ＡＪＳＺが、分化細胞の細胞運命安定性を制御する、細胞のプロセス（例えば、細胞運命特定、プロテオームリモデリング、プロテオグリカン硫酸化）の調節に特化した保存されたバリアネットワークの発現を近接的に調整することを実証する（図４ｊ）。
上記の実施例は、系統および細胞型に依存せずに胞運命リプログラミングに対抗する４つのＴＦ（ＡＪＳＺ）が同定されたことを実証する。
材料と方法
ｉＭＧＴ－Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ－ＭＥＦおよびスクリーニングアッセイ
ｉＭＧＴ－Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ－ＭＥＦおよびスクリーニングアッセイ
不死化Ｄｏｘ誘導可能ｉＭＧＴ－Ｍｙｈ６－ｅＧＦＰ－ＭＥＦが以前に記載されている。細胞を、０．１％ゼラチン（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、７９０３）で予め被覆したプレート中で培養し、ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＶＷＲ、８９５１０－１８６）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１０，０００Ｕ／ｍＬ）（カタログ番号：１５１４０１２２）からなる線維芽細胞培地（ＦＣＭ）中で５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で維持した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの１日前（－１日目）に、細胞を３７℃で３分間、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、２５２０００５６）の添加によって剥離し、次いでＦＣＭで洗浄し、遠心分離機にかけ、ＤＭＥＭ、２０％Ｍｅｄｉｕｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ、１１１５０－０５９）、１０％ＦＢＳ、および１％Ｐ／Ｓからなる誘導ＣＭリプログラミング培地（ｉＣＲＭ）中で再懸濁した。細胞を１０３細胞／ウェルで３８４ウェルプレート中でプレーティングし、１４３５個のマウスＴＦ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ－Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；ｓｉＧｅｎｏｍｅ－ｓｉＲＮＡライブラリー、ｇ－０１５８００）に対するｓｉＲＮＡライブラリーをトランスフェクトした。翌日（０日目）、ｉＣＲＭで希釈した１μｇ／ｍＬの塩酸ドキシサイクリン（Ｄｏｘ；Ｓｉｇｍａ、Ｄ３０７２）を細胞に添加し、ＭＧＴ発現を誘導した。３日目に、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて細胞を固定し、免疫染色、顕微鏡検査法、およびＭｙｈ６－ｅＧＦＰ定量化のために処理した。独立したｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ－Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；ＯＮ－Ｔａｒｇｅｔ ｐｌｕｓでプールされたｓｉＲＮＡ）を使用して、上位２０個のｓｉＲＮＡヒットを検証した。Ｅｃｈｏ ５５０リキッドハンドラー（Ｌａｂｃｙｔｅ）を使用したエコースポッティングにより上位８つのｓｉＲＮＡのあらゆる可能な組合せ（２５５種類の組合せ）を組み立て、上記のように細胞を処理した。実験すべてを４回繰り返して実行した。追跡分析については、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析のためにＤｏｘ添加後３日目に細胞を収集した。
ヒト初代皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ－２０９７、ＣＣＤ－１０７９Ｓｋ）から新生児のヒト初代***線維芽細胞を入手し、ＦＣＭ中の０．１％ゼラチンで予め被覆されたプレートで培養した。心臓リプログラミングのために、細胞を８０％の密集度に到達させ、上記のようにトリプシン－ＥＤＴＡを使用して収穫し、ｉＣＲＭ中で再懸濁し、１０３細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに添加し、示されたｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。翌日（０日目）、ｉＣＲＭで希釈した１μＬ／ウェルのマウスＭＧＴレトロウイルス１７の添加によって細胞に形質導入した。２日目にＲＮＡ－ｓｅｑおよびｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ実験用の細胞、３日目にｑＲＴ－ＰＣＲ実験用の細胞、および３０日目にカルシウム処理アッセイ用の細胞を収集した。凡例に示される日に、免疫染色を実施した。インキュベーション中、最大８日目まで、ｉＣＲＭ培地の５０％を１日置きに交換し、その後ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１８７５０９３）、１％Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）、および１％Ｐ／Ｓと取り替えた。以前に記載されたように（Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｍａｈｍｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．、２０１９）、神経細胞リプログラミングを誘導した。簡潔に言えば、上記のように、ＨＤＦを培養して回収し、ＦＣＭで再懸濁し、３×１０３細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに添加し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。翌日（－１日目）、０．２５μＬのＦ－ＡＢＭレンチウイルス混合物（１：１：１：１の、Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド＃２７１５０、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷ－Ａｓｃｌ１；＃２７１５１、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷ－Ｂｒｎ２；＃２７１５２、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷ－Ｍｙｔ１ｌ；＃２０３４２、ＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡ）をそれぞれのウェルに添加し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。翌日（０日目）、ＦＣＭで希釈した２μｇ／ｍＬのＤｏｘの添加により、ＡＢＭ発現を誘導した。２日目に、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、１１２２０－０３２）、１％Ｂ２７、１％Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、１７５０２－０４８）、ならびに１％ヒト組換えインスリンおよび亜鉛溶液（Ｇｉｂｃｏ、１２５８５－０１４）からなる最小神経細胞培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）と取り替えた。３日目に、細胞を回収し、免疫染色またはｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために処理した。
ヒト成人大動脈内皮初代細胞（ＨＡＥＣ）
ヒト成人大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）をＡＴＣＣ（ＰＣＳ－１００－０１１）から入手し、血管内皮細胞増殖キット－ＢＢＥ（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ－１００－０４０）および０．１％Ｐ／Ｓを含有している血管細胞基礎培地（ＶＣＢＭ；ＡＴＣＣ、ＰＣＳ－１００－０３０）中の０．１％ゼラチンを予め被覆したプレートで培養した。細胞が８０％の密集度に到達した時、それらを、３７℃で３分間、初代細胞（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ－９９９－００３）用にトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いて回収し、トリプシン中和溶液（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ－９９９－００４）で洗浄し、ＶＣＢＭ／キット－ＢＢＥ培地で再懸濁し、３×１０３細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに添加し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。翌日（０日目）、細胞を１μＬ／ウェルのマウスＭＧＴレトロウイルスの添加によって形質導入した。ｑＲＴ－ＰＣＲ解析のために３日目に、および免疫染色のために２０日目に細胞を収集した。インキュベーション中、ＶＣＢＭ／キット－ＢＢＥ培地の５０％を４日目から１日置きに交換した。
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
マウスｓｉＲＮＡおよびヒトｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎまたはＡｍｂｉｏｎから購入し、２５ｎＭの終濃度で添加した。陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲまたはｓｉＣｏｎｔｒｏｌと称される）をＤｈａｒｍａｃｏｎから入手した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５０７０）およびリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、１３７７８１５０）を使用して、製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクションを実施した。特に明記されない限り、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを－１日目に実施した。
免疫染色および蛍光顕微鏡法
細胞を３０分間でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中の１０％ウマ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２６０５００８８）、０．１％ゼラチン、および０．５％トリトンＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＰ０４８０７４２６）からなるブロッキング緩衝液を用いて３０分間ブロッキングした。細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、次いで二次抗体、さらに４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ、Ｄ９５４２）と共に室温の暗所で１時間インキュベートした。各工程間で、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をＩｍａｇｅ Ｘｐｒｅｓｓ共焦点顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて画像化し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅソフトウェアを用いて蛍光を定量化した。実験を４回繰り返して実行した。
使用した一次抗体は、ウサギ抗ＡＴＦ７ＩＰ（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ０２３５０５、１：２００）、ウサギ抗ＡＴＦ７ＩＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＡ５－５４８１１、１：２００）、ウサギ抗ＪＵＮＢ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ１２８８７８、１：２００）、ウサギ抗ＳＰ７／ＯＳＴＥＲＩＸ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ２２５５２、１：５００）、マウス抗ＺＮＦ２０７（Ｓｉｇｍａ、ＳＡＢ１４１２３９６、１：５００）、ウサギ抗ＴＡＧＬＮ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ１４１０６、１：８００）、マウス抗ＶＩＭＥＮＴＩＮ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－３７３７１７、１：８００）、ヤギポリクローナル抗ＴＡＧＬＮ（ＧｅｎｅＴｅｘ、ＧＴＸ８９７８９、１：８００）、マウス抗ＡＣＴＮ１（Ｓｉｇｍａ、Ａ７８１１、１：８００）、ヤギ抗ＰＥＣＡＭ１（Ｈ３）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｃ１５０６、１：２００）、ウサギ抗ＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ、Ａｂ３２４５４、１：２００）、およびマウス抗ＴＵＪ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１１９５、１：２００）であった。二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１００８、１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０２ １：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１００３７、１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０５７、１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１００３８、１：１０００）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１００４３、１：１０００）であった。
ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ－ＰＣＲ
製造業者の推奨に従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６０２６）およびクロロホルム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃ２９８－５００）を使用して全ＲＮＡを抽出した。水相中のＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、遠心分離機にかけ、７０％エタノールで洗浄し、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリー水で溶出した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。１μｇのＲＮＡのアリコートを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、２０５３１４）を使用して逆転写し、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ｉＴａｑ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｑＰＣＲを実施した。遺伝子発現を、２－ΔΔＣｔ方法を使用して、ヒト試料についてはグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、またはマウス試料についてはβ－アクチン（Ａｃｔｂ）の遺伝子発現に対して正規化した。ｑＲＴ－ＰＣＲ用のヒトおよびマウスのプライマー配列をハーバードプライマーバンクから入手した。プライマーは、ＡＴＦ ７ＩＰ（＃３８２６１９６１ｃ１）、ＪＵＮＢ（＃４４９２１６１１ｃ１）、ＳＰ７（＃２２９０２１３５ｃ２）、ＺＮＦ２０７（＃１４８６１２８３４ｃ１）、ＡＣＴＣ１（＃１１３７２２１２３ｃ１）、ＭＹＬ７（＃５０５９３０１４ｃ１）、ＮＰＰＡ（＃２３５１０３１９ａ１）、ＮＰＰＢ（＃８３７００２３６ｃ１）、ＲＹＲ２（＃１１２７９９８４６ｃ１）、ＳＣＮ５Ａ（＃２３７５１２９８１ｃ１）、ＴＮＮＩ３（＃１５１１０１２６９ｃ１）、ＴＮＮＴ２（＃４８２５５８８０ｃ１）、ＧＡＤ６７（＃５８３３１２４５ｃ２）、ＰＶＡＬＢ（＃５５９２５６５６ｃ２）、ＳＹＮ１（＃９１９８４７８３ｃ１）、ｖＧＬＵＴ２（＃２１５８２０６５４ｃ２）、ＭＹＨ６（＃２８９８０３０１４ｃ３）、ＨＳＰＢ３（＃３０６９６６１７３ｃ２）、ＯＬＦＭＬ３（＃５０５９３０１１ｃ１）、ＴＣＴＡ（＃１４８９２２９７０ｃ１）、ＴＰＰ１（＃１１８５８２２８７ｃ１）、ＥＭＣ１（＃２２０９５３３０ｃ３）、ＩＬ７Ｒ（＃２８６１０１５０ｃ２）、ＥＦＨＤ１（＃２３７６４９０４３ｂ１）、ＰＰＩＣ（＃４５４３９３１９ｃ２）、ＮＣＥＨ１（＃２２６４２３９４９ｃ２）、ＣＨＳＴ２（＃３４４９２５８６５ｃ１）、およびＧＡＰＤＨ（＃３７８４０４９０７ｃ１）であった。
レトロウイルスおよびレンチウイルスの調製
大規模なレトロウイルス産生を、以前に記載されているようなＳＢＰのウイルスベクターコア施設ＳＢＰで実施した。簡潔に言えば、レトロウイルス調製のために、レトロベクター、レトロ－ｇａｇ－ｐｏｌ、およびｐＭＤ２．Ｇプラスミドを、３：２：１の比率でＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。レンチウイルス調製のために、リン酸カルシウム法を使用して、ｓｈＺｆｐ２０７レンチベクタープラスミドＤＮＡを、ｐＣＭＶＤＲ８．７４およびｐＭＤ２．ＧをＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。１ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＵｌｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ無血清培地（Ｌｏｎｚａ）を使用してトランスフェクト細胞を再供給し、上清をトランスフェクション後２日目～４日目まで２４時間毎に収集した。ウイルス上清をプールし、０．２２μｍポアフィルターに通し、濃縮し、２０％ショ糖勾配超遠心分離によって２１，０００ｒｐｍで４℃で２時間精製した。濃縮ウイルス粒子を含有している沈殿物をＰＢＳで再懸濁し、等分し、－８０℃で保持した。
カルシウム処理アッセイ
カルシウムアッセイを、ＭＧＴ過剰発現後３０日目（ＨＤＦ）または２０日目（ＨＡＥＣ）に実施した。以前に記載されているような標識プロトコルを使用して、アッセイを実施した４６。簡潔に言えば、細胞培養上清の５０％を、温かいタイロード液（Ｓｉｇｍａ）で希釈したＦｌｕｏ－４ ＮＷ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆ３６２０６）、１．２５ｍＭプロベネシドＦ－１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１００μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈ３５６９、水中）からなる２×カルシウム色素溶液と取り替え、細胞を３７℃で４５分間インキュベートした。次いで細胞を新たな予熱したタイロード溶液で４回洗浄し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロＸＬＳ顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、励起４８５／２０ｎｍおよび発光５２５／３０ｎｍフィルターを用いて１００Ｈｚの取得周波数で５秒間、自動的に画像化した。ヘキスト蛍光の単一画像を時系列の前に取得した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓおよびＣｏｌａｓの研究所によって開発されたカスタムソフトウェアパッケージを使用して、経時的蛍光定量化および単一細胞痕跡分析を自動的に実施した。
ＲＮＡ－ｓｅｑおよびデータ分析
ＨＤＦを、１０３細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに添加し、ｉＣＲＭ中でｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＴＦ７ＩＰ、ｓｉＪＵＮＢ、ｓｉＳＰ７、ｓｉＺＮＦ２０７を個別に、または組み合わせて）をトランスフェクトした。翌日（０日目）、細胞に、ｉＣＲＭで希釈した１μＬ／ウェルのマウスＭＧＴレトロウイルスを形質導入した。２日目に、細胞を収集し、ＴＲＩｚｏｌを使用してＲＮＡを抽出した。細胞は１つの試料当たり１６ウェルからプールし、１つの条件当たり２つの生物学的複製物を分析した。ライブラリー調製は、Ｎｏｖｏｇｅｎｅにより、その組織内調製プロトコルを使用して実施した。簡潔に言えば、ｍＲＮＡを、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ビーズを使用して濃縮し、フラグメント化緩衝液を使用して無作為にフラグメント化した。ランダムヘキサマープライマーを使用して、ｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成し、次に第２の鎖の合成を行った。次いで、末端修復、Ａライゲーション、および配列決定アダプターライゲーションを実施した。最終ライブラリーはサイズ選択およびＰＣＲ濃縮によって生成し、ＨｉＳｅｑ２５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で２ｘ１５０ｂｐとして配列決定した。試料を、１つの試料当たり３５００～４０００万リードのおよその深度まで配列決定した。生の配列決定リード（ｒａｗ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ）を、３５の最小品質閾値および３６の最小長さでＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（０．３６）を使用してトリミングした。ＨＩＳＡＴ２（２．０．４）を使用して、処理したリードをｈｇ３８参照ゲノムにマッピングした。次いで、ＳｕｂｒｅａｄのｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（１．５．２）を使用してカウントを集めた。ＲでのＤＥＳｅｑ２パッケージ（１．２０）を使用して、差次的遺伝子発現を分析した。調整されたｐ値がＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用した、多重検定の補正後に０．０５未満であった場合、遺伝子は差次的に発現されたと定義した。ＰＡＮＴＨＥＲバージョン１２．０分類を使用して、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を実施した。
単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ（ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ）
ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ実験を、対照（未処理）ＨＤＦ、ＭＧＴ＋ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＨＤＦ、およびＭＧＴ＋ｓｉＡＪＳＺ ＨＤＦを用いて実施した。ＨＤＦを、ｉＣＲＭ中２．５×１０３細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに添加し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。翌日（０日目）、細胞にマウスＭＧＴレトロウイルスを形質導入し、２日後にトリプシン－ＥＤＴＡを使用して収集した。４０ウェルから細胞をプールし、１つの条件当たり２つの生物学的複製物と共に、１つの試料当たり２×１０５以上の細胞を得た。細胞をＦＣＭで洗浄し、円錐管中で遠心分離にかけ、ペレットをＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、１０％ＤＭＳＯ、２０％ＦＢＳ）において凍結させ、クライオチューブに移し、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に－８０℃で配置した。
試料を、ＵＣＳＤ ＣＭＭＥでｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑのために処理した。１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓを使用して、試料をＵＣＳＤ ＣＭＭＥでｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑのために処理し、１つの核当たり２０，０００～２５，０００のリード対の深度でＮｏｖａＳｅｑ ６０００上で配列決定した。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ－ＡＴＡＣ（１．１．０）パイプラインを使用して、リードをフィルタリングおよびアラインし、バーコードをカウントし、トランスポザーゼ切断部位を同定し、クロマチンピークを検出し、ｔ－ＳＮＥ次元低減プロットを調製し、クラスタ間の差次的アクセシビリティーを比較した。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ－ＡＴＡＣパイプラインは、次のツール：ｃｕｔａｄａｐｔ、ＢＷＡ－ＭＥＭ、ＳＡＭｔｏｏｌｓ ｔａｂｉｘ、およびｂｅｄｔｏｏｌｓを使用する。ＤｉｆｆＢｉｎｄ（２．１２．１）およびカスタムＲスクリプトを使用して、さらなる差次的アクセシビリティー分析を実施し、ｇｇｐｌｏｔ２で視覚化した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ ２．８．１２を使用してトラックを視覚化した。この分析のためのスクリプトはすべてＧｉｔＨｕｂ［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｍｕｒｐｈ５０］で入手可能である。
クロマチン免疫沈降－ｓｅｑ（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）
製造業者の指示に従って、ＳｉｍｐｌｅＣｈｉｐ Ｐｌｕｓ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ＩＰキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５６３８３）を使用して、ＨＤＦでＣｈＩＰ－ｓｅｑ実験を実施した。簡潔に言えば、ＨＤＦを８０％の密集度（１０７／試料）に増殖させ、次いでＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、Ｆ８７７５）と、時折撹拌しながら室温で２０分間架橋した。架橋反応を１０分の０．１２５Ｍグリシンの添加によってクエンチし、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ超音波処理器（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用して、クロマチンを２００～５００ｂｐの平均のＤＮＡフラグメント長まで、２５分間フラグメント化させた。ＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３２８５４）を用いて定量化した。１００μｇのＤＮＡに相当する試料を、４μｇのウサギポリクローナル抗ＡＴＦ７ＩＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＡ５－５４８１１）、ウサギモノクローナル抗ＪＵＮＢ（Ｃ３７Ｆ９）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７５３Ｓ）、ウサギ抗ＳＰ７／ＯＳＴＥＲＩＸ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ２２５５２）、またはウサギポリクローナル抗ＺＮＦ２０７（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ３０５－８１４ＡＭ）と共に４℃で一晩インキュベートした。正常なウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７２９）を、陰性対照として使用した。免疫複合体を、４℃で２時間のＧタンパク質結合磁気ビーズ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、９００６）を用いた回転によって捕捉し、免疫沈殿したゲノムＤＮＡは、５０μＬの溶出緩衝液とのインキュベーションによって収集した。免疫沈殿およびインプットしたＤＮＡのライブラリー調製および配列決定は、ＵＣＳＤ ＩＧＭコア施設により実施された。Ｂｏｗｔｉｅ２（２．３．５）を使用して、生のリードをＧＲＣｈ３８にマッピングした。各試料を２つのレーンにわたり実行したため、Ｐｉｃａｒｄ（２．２０．５）を使用してＳＡＭファイルを統合した。ＭＡＣＳ２（２．１．１）を使用して、０．０１のｑ値カットオフの入力に対して狭いピークを呼び出した。ピークはＨｏｍｅｒ（４．１０．４）を用いて注釈を付け、ＭＥＭＥ－ＣｈＩＰ（５．１．１）を使用してモチーフを分析した。Ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ（２．２）ｂａｍＣｏｖｅｒａｇｅを使用して、ＢｉｇＷｉｇファイルを生成した。Ｆｌｕｆｆ（ｂｉｏｆｌｕｆｆ ３．０．３）を用いてトラックを視覚化した。ＰＡＮＴＨＥＲ ＧＯを用いて遺伝子オントロジー生物学的プロセスの用語を見出し、ｖｅｎｎｅｕｌｅｒおよびｇｇｐｌｏｔ２のパッケージを備えたカスタムＲスクリプトを使用して、重複分析を実施した。Ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｖ２．２９．２）を使用して、ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑデータのゲノム比較を行い、それらを組み合わせた。ＨＯＭＥＲを使用して、混ざったバックグラウンドでモチーフを見出した。
統計分析
統計分析はすべて、Ｐｒｉｓｍバージョン８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ ＣＡ、米国）を使用して実施した。特記しない限り、データは平均±ＳＥＭとして提示される。統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定または一元配置分散分析によって分析した。＜０．０５のＰ値を、有意であると考慮した。
Claims (69)
- 異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成するための方法であって、前記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、前記異なる細胞型の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程を含み、ここで、前記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子が含まれる、方法。
- 異なる細胞型の細胞から関心対象の細胞を生成するための方法であって、前記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、前記異なる細胞型の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程を含む、方法。
- 少なくとも１つのバリア遺伝子が、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのバリア遺伝子がＳｐ７をさらに含む、請求項３に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、前記異なる細胞型の細胞において少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子が、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＳＰＢ３、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、ＯＬＦＭＬ３、ＴＣＴＡ、およびＥＦＨＤ１からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
- 少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子の前記発現レベルが、前記少なくとも１つのバリア遺伝子の前記発現レベルの低下後７２時間以内に増加する、請求項７に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子の前記発現レベルが、前記少なくとも１つのバリア遺伝子の前記発現レベルの低下後４８時間以内に増加する、請求項８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子の前記発現レベルが、前記少なくとも１つのバリア遺伝子の前記発現レベルの低下後２４時間以内に増加する、請求項９に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、またはＰＢＭＣである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、前記異なる細胞型の細胞のクロマチン構造を変化させる工程をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞の野生型細胞と比較して、前記異なる細胞型の細胞は、前記少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されたタンパク質に結合されるモチーフの数が減少している、請求項１２に記載の方法。
- 前記モチーフがＡＰ－１モチーフを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記関心対象の細胞が、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子が、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴＬ１、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＭＹＯＤからなる群から選択される、請求項７～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞と比較して、前記関心対象の細胞は、少なくとも１つの心臓マーカーの発現が増加する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの心臓マーカーが、ＡＣＴＣ１、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰＢからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞と比較して、前記関心対象の細胞は、少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現が増加する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの幹細胞マーカーが、ＳＳＥＡ４およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞と比較して、前記関心対象の細胞は、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーの発現が増加する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーが、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
- 少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程が、前記異なる細胞型の細胞を、前記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的化する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞が体細胞である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の細胞が体細胞である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる細胞型の細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態に変換する工程をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の少なくとも１つの阻害剤と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物であって、前記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子の第２の阻害剤が含まれる、医薬組成物。
- ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の少なくとも１つの阻害剤と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 前記少なくとも１つのバリア遺伝子が、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つのバリア遺伝子がＳｐ７をさらに含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの阻害剤が、前記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的化する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 修復または回復を必要とする対象の損傷を受けた組織に対する機能的および構造的な完全性を修復または回復するための方法であって、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物を有効量で前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 少なくとも１つの系統決定因子を投与する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子が、前記医薬組成物の投与後７２時間以内に投与される、請求項３３に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子が、前記医薬組成物の投与後４８時間以内に投与される、請求項３４に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子が、前記医薬組成物の投与後２４時間以内に投与される、請求項３５に記載の方法。
- 前記損傷を受けた組織が心臓組織であり、前記少なくとも１つの系統決定因子が、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、またはＴＢＸ５である、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記損傷を受けた組織が神経組織であり、前記少なくとも１つの系統決定因子が、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、またはＭＹＴＬ１である、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記損傷を受けた組織が骨格筋組織であり、前記少なくとも１つの系統決定因子がＭＹＯＤである、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記損傷を受けた組織が幹細胞系統であり、前記少なくとも１つの系統決定因子が、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはＭＹＣである、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞移植を必要とするレシピエントに細胞移植を実施するための方法であって、
ドナーの第１の細胞から第２の細胞を生成する工程であって、前記ドナーが前記レシピエントと免疫適合性であり、前記第２の細胞が請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法に従って生成される工程、および
前記第２の細胞を前記レシピエントに移植する工程
を含む、方法。 - 前記レシピエントと前記ドナーが同一の個体である、請求項４１に記載の方法。
- 前記第１の細胞が、線維芽細胞または内皮細胞である、請求項４１または４２に記載の方法。
- 前記第２の細胞が、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または幹細胞様細胞である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 第１の細胞型を有する第１の複数の細胞および培地を含む医薬組成物であって、
ｉ）前記第１の細胞型と比較して、異なる細胞型の第２の複数の細胞を得る工程、
ｉｉ）前記第２の複数の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、Ｓｐ７、ＦＯＸＡ１、ＨＥＸＩＭ２、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１５、ＣＨＳＴ２、およびＮＣＥＨ１からなる群から選択される少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程であって、前記少なくとも１つのバリア遺伝子がＡＴＦ７ＩＰまたはＳＯＸ１５であるとき、少なくとも第２のバリア遺伝子が含まれる工程、あるいは
第２の複数の細胞において、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、ＺＮＦ２０７、およびＳｐ７からなる群から選択される少なくとも２つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程
を含むプロセスによって作られる、医薬組成物。 - 前記少なくとも１つのバリア遺伝子が、ＡＴＦ７ＩＰ、ＪＵＮＢ、およびＺＮＦ２０７を含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つのバリア遺伝子がＳｐ７をさらに含む、請求項４６に記載の医薬組成物。
- 前記プロセスが、前記第２の複数の細胞において少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つのリプログラミングアゴニスト遺伝子が、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＳＰＢ３、ＴＰＰ１、ＥＭＣ１、ＰＰＩＣ、ＩＬ７Ｒ、ＯＬＦＭＬ３、ＴＣＴＡ、およびＥＦＨＤ１からなる群から選択される、請求項４８に記載の医薬組成物。
- 前記プロセスが、前記第１の複数の細胞において少なくとも１つの系統決定因子の発現レベルを増加させる工程をさらに含む、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子の前記発現レベルが、前記少なくとも１つのバリア遺伝子の前記発現レベルの低下後７２時間以内に増加する、請求項５０に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子の前記発現レベルが、前記少なくとも１つのバリア遺伝子の前記発現レベルの低下後４８時間以内に増加する、請求項５１に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子の前記発現レベルが、前記少なくとも１つのバリア遺伝子の前記発現レベルの低下後２４時間以内に増加する、請求項５２に記載の医薬組成物。
- 前記第２の複数の細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、またはＰＢＭＣである、請求項４５～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記プロセスが、前記第２の複数の細胞のクロマチン構造を変化させる工程をさらに含む、請求項４５～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記第２の複数の細胞の野生型細胞と比較して、前記第２の複数の細胞は、前記少なくとも１つのバリア遺伝子によって発現されたタンパク質に結合されるモチーフの数が減少している、請求項５５に記載の医薬組成物。
- 前記モチーフがＡＰ－１モチーフを含む、請求項５６に記載の医薬組成物。
- 前記第１の複数の細胞が、心筋細胞様細胞、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項４５～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの系統決定因子が、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴＬ１、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＭＹＯＤからなる群から選択される、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記第２の複数の細胞と比較して、前記第１の複数の細胞は、少なくとも１つの心臓マーカーの発現が増加する、請求項４５～５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの心臓マーカーが、ＡＣＴＣ１、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰＢからなる群から選択される、請求項６０に記載の医薬組成物。
- 前記第２の複数の細胞と比較して、前記第１の複数の細胞は、少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現が増加する、請求項４５～６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの幹細胞マーカーが、ＳＳＥＡ４およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される、請求項６２に記載の医薬組成物。
- 前記第２の複数の細胞と比較して、前記第１の複数の細胞は、少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーの発現が増加する、請求項４５～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つの神経細胞特異的マーカーが、ｖＧＬＵＴ２、ＧＡＤ６７、ＰＶＡＬＢ、およびＳＹＮ１からなる群から選択される、請求項６４に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも１つのバリア遺伝子の発現レベルを低下させる工程は、前記第２の複数の細胞を、前記少なくとも１つのバリア遺伝子を標的化する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む、請求項４５～６５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記第２の複数の細胞が体細胞である、請求項４５～６６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記第１の複数の細胞が体細胞である、請求項４５～６７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記プロセスが、前記第２の複数の細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態に変換する工程をさらに含む、請求項４５～６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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