JP2024520413A - 多能性幹細胞における遺伝子の迅速なサイレンシングを防止するための方法 - Google Patents

多能性幹細胞における遺伝子の迅速なサイレンシングを防止するための方法 Download PDF

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Abstract

ＣｐＧモチーフの除去によって導入遺伝子の安定した発現を有する細胞株を生成する方法が本明細書において提供される。さらなる方法では、新規プロモーターにより発現を駆動することによる又は内因性遺伝子をタグ付けすることによる導入遺伝子の安定した発現を有する細胞株のための方法が提供される。

Description

優先権の主張
本出願は、２０２１年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１９３，４７２号の優先権の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組込み
３４，０００バイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定した場合）であり、２０２２年５月２６日に作成された「ＣＤＩＮＰ０１０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名称のファイルに含まれる配列表は、電子的提出により本明細書とともに提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
１． 分野
本開示は、概して、幹細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子の迅速なサイレンシングを低減するための人工多能性幹細胞における遺伝子のコドン最適化の方法に関する。
２． 関連技術の説明
同一と思われる細胞株でも、その性能には大きな違いがあることが研究で示されている（Ｋｙｔｔａｌａ、２０１６年）。同一のドナーに由来する複数のクローンを比較した場合に検出されるこれらの違いは、「クローン間のばらつき」と呼ばれている。これらのクローンは、同一のＤＮＡ配列を含有すると考えられており、一部の場合には確認されている。同じ細胞株の分化バッチにおいて収率及び純度が一定しないことは、「バッチ間のばらつき」と呼ばれている。多くの場合には、分化性能の違いはエピジェネティックな改変に起因しているが、細胞株のばらつきを防ぐために、特定のエピジェネティックなメカニズム、及びこれらのエピジェネティックなメカニズムを変更する方法を特定する必要性は満たされていない。
第１の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの導入遺伝子を発現するように操作された単離された細胞株であって、少なくとも１つの導入遺伝子が、（ａ）配列番号１～１２若しくは１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターの制御下にある、（ｂ）ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある、及び／又は（ｃ）ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされる、単離された細胞株を提供する。ある特定の態様では、細胞株は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株である。
一部の態様では、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列は、配列番号１４又は配列番号１６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する。ある特定の態様では、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列は、配列番号１４又は配列番号１６である。
一部の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、（ａ）配列番号１～１２若しくは１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターの制御下にある、及び／又は（ｂ）ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある。特定の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされている。
ある特定の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされており、配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターの制御下にある。一部の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされており、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある。特定の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされており、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６からなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある。
さらなる態様では、細胞株は、少なくとも第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子を発現するように操作されている。一部の態様では、第１の導入遺伝子は、配列番号１～１２若しくは１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターの制御下にあり、第２の導入遺伝子は、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある。他の態様では、第１の導入遺伝子は、配列番号１～１２若しくは１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターの制御下にあり、第２の導入遺伝子は、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６からなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある。一部の態様では、第１の導入遺伝子及び／又は第２の導入遺伝子は、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされている。特定の態様では、ＣｐＧモチーフの少なくとも５０パーセント、例えば、少なくとも７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント又は９９パーセントが除去されている。特定の態様では、すべてのＣｐＧモチーフが除去されている。一部の態様では、ＣｐＧモチーフのコドンは、稀ではない及び／又はモノヌクレオチドストレッチを生じないコドンで置き換えられている。特定の態様では、ＣｐＧモチーフのコドンは、表１の対応するコドンで置き換えられている。
一部の態様では、プロモーターは、応答エレメントである。ある特定の態様では、プロモーターは、応答エレメントによって駆動される。
一部の態様では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子又は選択マーカーである。ある特定の態様では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質又は発光タンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のものである。ある特定の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、選択マーカー、例えば、ピューロマイシン、ネオマイシン、又はブラスチシジンである。特定の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、自殺遺伝子である。一部の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、チミジンキナーゼ、ＴＥＴ、又は筋芽細胞決定タンパク質１（ｍｙｏｂｌａｓｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １）（ＭＹＯＤ１）である。
特定の態様では、細胞株は、少なくとも３０日間、例えば、少なくとも２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間又はそれより長期間の導入遺伝子の安定した発現を有する。特定の態様では、細胞株は、６カ月を超えて、例えば、１年を超えて、２年を超えて、又は３年を超えて、導入遺伝子の安定した発現を有する。
一部の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、発現カセットによってコードされている。ある特定の態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、電気穿孔又はリポフェクションによって細胞株に導入されている。特定の態様では、発現カセットは、ゲノムセーフハーバー部位、例えば、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子座又はＲＯＳＡ遺伝子座に挿入されている。
ある特定の態様では、プロモーターは、配列番号２、３、４、６、又は１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する。一部の態様では、プロモーターは、配列番号２、３、４、６、又は１７を含む。
特定の態様では、本方法は遺伝子編集を含み、詳細には、導入遺伝子は、遺伝子編集、例えば、ＴＡＬＥＮ媒介遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集、又はＺＦＮ媒介遺伝子編集を含む。
さらなる実施形態は、操作された細胞における導入遺伝子の発現のサイレンシングを防止するための方法であって、ＣｐＧモチーフを除去するために導入遺伝子配列を最適化することを含む方法を提供する。
一部の態様では、最適化することは、本質的にすべてのＣｐＧモチーフのコドンを置き換えることを含む。ある特定の態様では、最適化することは、ＣｐＧモチーフの少なくとも５０パーセント、例えば、少なくとも７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント又は９９パーセントを置き換えることを含む。特定の態様では、すべてのＣｐＧモチーフが除去される。特定の態様では、ＣｐＧモチーフのコドンは、稀ではない及び／又はモノヌクレオチドストレッチを生じないコドンで置き換えられる。一部の態様では、ＣｐＧモチーフのコドンは、表１の対応するコドンで置き換えられる。特定の態様では、ＣｐＧモチーフを除去するために最適化された導入遺伝子の配列は、野生型導入遺伝子の配列のＧＣ含有量のパーセントと実質的に同様のＧＣ含有量のパーセントを含む。
一部の態様では、導入遺伝子の配列は、レポーター遺伝子、例えば、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ又はＲＦＰのものである。
ある特定の態様では、導入遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にある。一部の態様では、構成的プロモーターは、実質的にすべての細胞型で発現を有する。特定の態様では、構成的プロモーターは、本質的にすべての細胞型で発現を有する。ある特定の態様では、構成的プロモーターは、すべての細胞型で発現を有する。
特定の態様では、導入遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある。一部の態様では、導入遺伝子は、ＥＥＦ１Ａ１プロモーターの制御下にある。
さらなる態様では、本方法は、細胞株を酪酸ナトリウム、ＶＰＡ、又はＴＳＡで処理することをさらに含む。具体的な態様では、酪酸ナトリウムは、０．２５ｍＭ～０．５ｍＭの濃度で添加される。
一部の態様では、細胞株は、ｉＰＳＣ株である。ある特定の態様では、本方法は、ｉＰＳＣ株を分化させることをさらに含む。一部の態様では、ｉＰＳＣ株は、成熟細胞、例えば以下に限定するものではないが、造血前駆細胞、神経前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、マクロファージ、ミクログリア、又は内皮細胞に分化する。
別の実施形態は、配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターを含む発現ベクターを提供する。一部の態様では、プロモーターは、配列番号２、３、４、６、又は１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する。ある特定の態様では、プロモーターは、配列番号２、３、４、６、又は１７を含む。特定の態様では、発現ベクターは、ｐＧＬ３プラスミドベクターである。一部の態様では、ベクターは、プロモーターの制御下で導入遺伝子をコードする。特定の態様では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子、例えば、蛍光タンパク質又は発光タンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のものである。
さらなる実施形態は、安定した導入遺伝子の発現を有する細胞株を生成する方法であって、本発明の実施形態のベクター（例えば、配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターを含む）を発現するように細胞株を操作することを含み、ベクターが前記導入遺伝子をコードする方法を提供する。一部の態様では、細胞株は、多能性細胞株、例えばｉＰＳＣ株である。
一部の態様では、本方法は、ベクターを第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込むことを含む。ある特定の態様では、組み込むことは、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ媒介遺伝子編集、又はＺＦＮ媒介遺伝子編集を含む。
さらなる態様では、本方法は、細胞株を分化させることをさらに含む。一部の態様では、細胞株は、造血前駆細胞、神経前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、マクロファージ、ミクログリア、又は内皮細胞に分化する。特定の態様では、細胞株は、少なくとも３０日間、例えば、少なくとも２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間又はそれより長期間培養される。特定の態様では、細胞株は、６カ月を超えて、例えば、１年を超えて、２年を超えて、又は３年を超えて培養される。特定の態様では、細胞株は、少なくとも３０日間、例えば、少なくとも２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間又はそれより長期間の導入遺伝子の安定した発現を有する。特定の態様では、細胞株は、６カ月を超えて、例えば、１年を超えて、２年を超えて、又は３年を超えて、導入遺伝子の安定した発現を有する。一部の態様では、細胞株は、少なくとも６カ月間培養される。ある特定の態様では、細胞株は、６カ月間、導入遺伝子の安定した発現を有する。
別の実施形態は、本実施形態の発現ベクター（例えば、配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の配列同一性を有するプロモーターを含む）を含む単離された多能性細胞株を提供する。
さらなる実施形態は、外因性導入遺伝子の安定した発現を有する細胞株を生成する方法であって、内因性遺伝子の制御下で導入遺伝子を発現するように細胞株を操作することを含み、内因性遺伝子が、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣ、例えばＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、又はＭＹＬ６である方法を提供する。
一部の態様では、操作することは、遺伝子編集、例えば、ＴＡＬＥＮ媒介遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集、又はＺＦＮ媒介遺伝子編集を含む。一部の態様では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子、選択マーカー、又は自殺遺伝子である。
ある特定の態様では、細胞株は、多能性細胞株、例えばｉＰＳＣ株である。
別の実施形態は、導入遺伝子でタグ付けされた内因性のＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣを含む単離された細胞株を提供する。一部の態様では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子、選択マーカー、又は自殺遺伝子である。ある特定の態様では、細胞株は、多能性細胞株、例えばｉＰＳＣ株である。
細胞を検出するためのアッセイであって、本発明の実施形態の細胞株を培養すること及びレポーター遺伝子の発現を測定することを含むアッセイが本明細書においてさらに提供される。細胞アッセイ、例えば、細胞生存率アッセイ、又は候補薬剤をスクリーニングするためのアッセイに関する本発明の実施形態の細胞株の使用も本明細書において提供される。一部の態様では、アッセイは、ハイスループットアッセイである。ある特定の態様では、細胞アッセイは、レポーター遺伝子の発現を測定することを含む。
別の実施形態は、細胞アッセイにおいて使用するための本発明の実施形態の細胞株を含む組成物を提供する。
本開示の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるであろうから、例示のためにのみ与えられていることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
ＥＥＦ１Ａ１ｐによって駆動されるＺｓＧｒｅｅｎの発現はｉＰＳＣにおいて斑状である。ｉＰＳＣ０１２７８．１０３（図１Ａ、１Ｂ）及び０１２７９．１０７（図１Ｃ、１Ｄ）を、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のＥＥＦ１Ａ１ｐ－ＺｓＧｒｅｅｎを用いて操作した。明視野及び蛍光（ＧＦＰ）顕微鏡を使用して、操作後１１継代（図１Ａ～１Ｂ）又は操作後１８継代（図１Ｃ～１Ｄ）の細胞におけるＧＦＰ発現を捕捉した。
ＡｃＧＦＰ１ ＤＮＡ配列（配列番号１３）のコドン最適化により、ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１ ＤＮＡ配列（配列番号１４）がもたらされた。
ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１の発現は安定しているが、ＡｃＧＦＰ１の発現は経時的に維持されていない。ＥＥＦ１Ａ１ｐ－ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１で標的化した５つのクローン（図３Ａ）及びＡＡＶＳ１遺伝子座のＥＥＦ１Ａ１ｐ－ＡｃＧＦＰ１で標的化した９つのクローン（図３Ｂ）におけるＧＦＰ発現パーセントを経時的にモニターした。
ｉＰＳＣにおけるＡｃＧＦＰ１の迅速なサイレンシング。３つのカセット、ＥＥＦ１Ａ１ｐ－ｍＲＦＰ１＋ＰＧＫｐ－Ｐｕｒｏ、ＥＥＦ１Ａ１ｐ－ＡｃＧＦＰ１又はＥＥＦ１Ａ１ｐ－ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１を含むＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座（ＡＡＶＳ１セーフハーバー）でのｉＰＳＣ操作についての描写。図中に記したのは、細胞株８７１７及び９６５０について操作されたｉＰＳＣのＩＤ番号であり、これらを、本文書全体を通してさらなる実験において使用する（図４Ａ）。ＡｃＧＦＰ１発現クローンを摘出し、拡大したが、一貫した発現を保持しなかった。２カ月の培養後に、ＡｃＧＦＰ１で操作されたｉＰＳＣをＡｃＧＦＰ１の発現についてバルク選別した。明視野顕微鏡及び蛍光（ＧＦＰ）顕微鏡を使用して、選別の１２日後（図４Ｂ）又は選別の２３日後（図４Ｃ）の細胞におけるＧＦＰ発現を捉えた。同様のサイレンシングは、単量体ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ及び四量体ＺｓＧｒｅｅｎを含む他の緑色蛍光タンパク質でも観察された。
サイレンシングされた導入遺伝子はＮａＢｕｔ処理で再活性化される。ＣｐＧを含まないＡｃＧＰＦ１培養では、少数の細胞がサイレンシングされた（細胞の３％未満、図３Ａ）。これらのサイレンシングされた細胞は選別され、拡大された細胞であり、それらのサイレンシングについてさらに調査し、サイレンシングを克服する方法を研究した。ＧＦＰ発現なしについて選別してから２カ月後に、サイレンシングされたＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１クローンを１ｍＭ、０．５ｍＭ、又は１μＭのＮａＢｕｔで処理した。ＮａＢｕｔ処理の９日後に、細胞をフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現％についてアッセイし、ＣｐＧを有さないＡｃＧＦＰ１の用量依存的再活性化が観察された。パイロット実験が成功した後、ＮａＢｕｔ処理用量を０．２５ｍＭ及び０．５ｍＭとしてＮａＢｕｔ処理期間を４６日まで延長し、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現レベルを経時的にモニターした。最初の結果が確認された（図５Ａ及び５Ｂ、紺色のバー：処理８日目）。ＮａＢｕｔ処理の用量依存的な効果は、実験期間を通じて明らかであった（図５Ａ及び５Ｂ）。
ｉＰＳＣ ９６５０（ＡＡＶＳ１のＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１）の分化。ｉＰＳＣ ９６５０は、肝細胞の分化（ＣＸＣＲ４、ＡＡＴ及びＡＬＢ発現によって測定）及び誘導性ニューロン（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎ）（ｉＮ）の分化（ＴＵＪ発現によって測定）を通してＧＦＰ発現を維持した。
１０６９：ＷＴ ＰｕｒｏＲ（図７Ａ）、１３６２：ＣｐＧを含まないＰｕｒｏＲ１（図７Ｂ）及び１３６３：ＣｐＧを含まないＰｕｒｏＲ１（図７Ｃ）のプラスミド。
ＡＡＶＳ１にＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１で操作したｉＰＳＣ ９６５０－ＧＦＰから内皮細胞を生成するためのプロトコールの概略説明。
低酸素順化したｉＰＳＣをＰｕｒｅｃｏａｔ Ａｍｉｎｅプレートに播種して、６日間の血液内皮細胞の生成を開始した。分化６日目のｉＰＳＣ由来血液内皮細胞の代表的な写真から、ＧＦＰの発現を保持する二次元フォーマットの血液内皮コロニーの存在が明らかになった。
４倍の対物レンズを使用してＧＦＰ／ＢＦの重複を明らかにする培養２継代目の９６５０－ＧＦＰ由来内皮細胞の形態。
９６５０－ＧＦＰ ｉＰＳＣ由来の内皮細胞の純度。低酸素順化したｉＰＳＣをＰｕｒｅｃｏａｔ Ａｍｉｎｅプレートに播種して、血液内皮細胞の生成を開始し、その後、再度播種して、複数継代にわたって増殖可能な純粋な内皮細胞を生成した。内皮細胞の純度は、継代時に、フローサイトメトリーによってＣＤ３１、ＣＤ１４４及びＣＤ１０５の同時発現を染色して定量した。
低酸素順化したｉＰＳＣをＰｕｒｅｃｏａｔ Ａｍｉｎｅプレートに播種して、血液内皮細胞の生成を開始し、その後、再度播種して、複数継代にわたって増殖可能な純粋な内皮細胞を生成した。ＧＦＰ発現の強度を複数継代にわたりフローサイトメトリーによって定量した。
ｉＰＳＣから造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生成するためのプロトコールの概略説明。
低酸素順化したｉＰＳＣを採取し、１３～１５日間にわたり３Ｄ凝集フォーマットでＨＰＣに分化させた。ＨＰＣ分化プロセスの最後に細胞を採取し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４１及びＣＤ２３５発現をＧＦＰ（図１４Ａ）又はＲＦＰ（図１４Ｃ）発現とともに染色してＨＰＣの純度を定量して、最終段階のＨＰＣにおける蛍光の保持を示した。ＭＡＣＳ分離後のＧＦＰとＣＤ３４の同時発現は９０％を超えている（図１４Ｂ）。
ＨＰＣの生成効率：１個のインプットｉＰＳＣから、８７１７及び９６５０ではそれぞれ０．７６６個及び０．２２５個のＨＰＣを生じた
ＨＰＣからのミクログリアの生成についての概略図。
９６５０－ＧＦＰ株（図１７Ａ）及び８７１７－ＲＦＰ株（図１７Ｂ）のミクログリア分化の位相画像及び蛍光画像。
造血前駆細胞（ＨＰＣ）の生成効率。ＣＤ３４＋ ＭＡＣで選別した９６５０－ＧＦＰ由来のＨＰＣ及び選別されていない８７１７－ＲＦＰ由来のＨＰＣをミクログリアに分化させた。インプットＨＰＣ及びアウトプットミクログリアの総生存数を定量した。プロセス効率は、ミクログリア分化の２３日目に存在するＣＤ３４＋陽性細胞の純度及び絶対数を、インプットされた生存ＨＰＣの絶対数で割った値に基づいて計算した。
それぞれ８７１７－ＲＦＰ（図１９Ａ）及び９６５０－ＧＦＰ（図１９Ｃ）のｉＰＳＣから生成した２３日目のミクログリアの純度プロファイル。最終段階のミクログリアを採取し、ＰＵ．１、ＩＢＡ、ＣＸ３ＣＲ、ＴＲＥＭ２及びＰ２ＲＹ１２の発現の存在について染色し、フローサイトメトリーによって定量した。マーカーの同時発現は、最終段階の細胞におけるＧＦＰ又はＲＦＰの保持とともに定量した（図１９Ｂ、１９Ｄ）。
ＨＰＣから最終段階のマクロファージの生成についての模式図。
８７１７－ＲＦＰ由来のＨＰＣの分化をさらに進めて、最終段階のマクロファージを生成した。最終段階のマクロファージの純度評価は、分化プロセスの４４日目及び５１日目にＣＤ６８発現の存在を染色することによって定量した。
マクロファージ分化プロセスの異なる日数における８７１７－ＲＦＰ株の位相画像及び蛍光画像。画像は１０倍の倍率で捉えた。
８７１７－ＲＦＰ ｉＰＳＣ由来のＨＰＣを最終段階のマクロファージに分化させた。インプットＨＰＣ及びアウトプットマクロファージの総生存数を定量した。プロセス効率は、マクロファージ分化の５１日目に存在するＣＤ６８＋陽性細胞の純度及び絶対数を、インプットされた生存ＨＰＣの絶対数で割った値に基づいて計算した。
分化プロセスを通して操作された蛍光色素の存在の保持。９６５０－ＧＦＰ及び８７１７－ＲＦＰのｉＰＳＣは、ｉＰＳＣからＨＰＣへの分化、さらに純粋な最終段階のミクログリア及びマクロファージの生成に至るまで、蛍光色素の存在を保持した。
デュアルＳＭＡＤ阻害を使用せずにｉＰＳＣから神経前駆細胞（ＮＰＣ）を生成する方法の概略説明。関与した様々なステップ、及び使用した培地の組成を説明する。
（図２６Ａ）ＮＰＣ分化プロセスの２Ｄプレコンディショニング段階における赤色及び緑色蛍光の可視化。図２６Ｂは、採取前の最終段階の３Ｄ ＮＰＣ培養の蛍光を捉えたものである。すべての画像は４倍の対物レンズで撮影した。
８７１７－ＲＦＰ及び９６５０－ＧＦＰ由来のＮＰＣにおける解凍後の純度の定量。ＮＰＣを解凍し、関連するアイソタイプ対照を使用して、ＳＳＥＡ４、ＣＤ５６及びＣＤ１５発現の存在を染色した。
ＮＰＣからＧＡＢＡ作動性ニューロンへの分化プロトコール。ＮＰＣは３Ｄ分化培養に供し、ＰＬＯ－ラミニンをコーティングしたプレート上で２Ｄ培養に移行した。最終段階のニューロンを１８日目に採取し、フローサイトメトリーによってネスチン及びβ－チューブリン３の純度を定量した。
ＧＡＢＡ作動性ニューロン分化の２日目（３Ｄ）（図２９Ａ）及び１８日目（２Ｄ）（図２９Ｂ）に撮影した明視野画像及び蛍光画像。ＵＬＡ Ｔ２５ Ｆｌａｓｋで３Ｄ培養し、６ウェルのＰＬＯ－ラミニンをコーティングしたプレートで２Ｄ培養する。すべての画像は１０倍の倍率で撮影した。
ＧＡＢＡ作動性ニューロン分化の１３日目及び１８日目における、未分化の操作したｉＰＳＣと最終段階のニューロン培養におけるＧＦＰ及びＲＦＰ発現の保持。１３日目の試料をＰＬＯ－ラミニン上に播種する前に染色し、１８日目の培養物をＧＡＢＡ作動性ニューロン分化終了時に染色した。
分化１８日目の９６５０－ＧＦＰ及び８７１７－ＲＦＰのｉＰＳＣ培養由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンを採取し、フローサイトメトリーによってネスチン及びβ－チューブリンの純度を染色した。最終段階の培養におけるＧＦＰ又はＲＦＰとネスチン及びチューブリンとの同時発現を定量した。
（図３２Ａ）正規化したルシフェラーゼ（ホタル／ウミシイタケ比、ＥＥＦ１Ａ１＝１００％に対して正規化した）を示す（ＨＳＰ９０ＡＢ１ｄｅｌ４００プロモーター及びＨＳＰ９０ＡＢ１プロモーターはＥＥＦ１Ａ１のおよそ６６％及び７５％を発現させた）。（図３２Ｂ）ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質を制御するための一例としてＣＡＧプロモーターを使用し、ヒトｉＰＳＣの第１９染色体上のＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）セーフハーバー遺伝子座を標的とするプラスミド設計。
ＺｓＧｒｅｅｎ（ＺｓＧ）蛍光タンパク質を発現する操作したｉＰＳＣ株を最長７カ月間培養維持し（Ｅ８培地／ビトロネクチンをコーティングしたプレート）、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６機器（ＢＤ）でフローサイトメトリーを使用して緑色発現を定期的にチェックした。８月の時点で多くの細胞で蛍光の低下を示したＲＰＳ１９プロモータークローンの１つ（５３６３）を除けば、ほとんどのクローンは経時的に一貫したフロープロファイルを維持した。グラフは、操作されていないｉＰＳＣ＝１に対して正規化した蛍光レベルの中央値を示す。
（図３４Ａ）ＺｓＧｒｅｅｎ（ＺｓＧ）で操作したｉＰＳＣ株のフローサイトメトリープロット。（図３４Ｂ）分化２１日目に、すべての細胞が目に見えるニューロン表現型を有した。フローサイトメトリーは、多くの細胞で、ＣＡＧ、ＵＢＣ（ｖ１）、及びＨＳＰ９０ＡＢ１ｄｅｌ４００プロモーターの蛍光が減退していることを示す。ＵＢＣｖ２、ＵＢＡ５２、及びＲＰＳ１９プロモーターは、タグ遺伝子ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６と同様に、タイトで安定した発現を示した。
ＤＮＡのメチル化は、転写抑制の誘導、転写因子のＤＮＡへの結合の防止、いくつかの転写因子のＤＮＡへの結合の必要条件、ＨＤＡＣ複合体の動員、Ｘ染色体の不活性化、及びＴＬＲ９などのＣｐＧモチーフの免疫原性を含む遺伝子の発現を調節する上で重要な役割を果たしている。哺乳類におけるＤＮＡメチル化は、メチル基がメチル基転移酵素によってシトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）のシトシンの５番目の炭素（５－ｍＣ）に付加された場合に起こる。ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）は、ｄｅ ｎｏｖｏメチル化（すなわち、以前はメチル化されていなかったＤＮＡをメチル化すること）を担い、ＤＮＭＴ３ＢはｉＰＳＣでオンになることが示されている。ＤＮＭＴ１は、複製後のヘミメチル化ＤＮＡのメチル化を担い、維持メチル基転移酵素として特徴付けられる。脱メチル化の研究はより最近になって浮上し、Ｇａｄｄ４５ａはＤＮＡ修復におけるＤＮＡ脱メチル化の重要な担い手として、ＴＥＴ及びＴＤＧはＤＮＡにおける５－ｍＣの酸化及び切り出しの重要な担い手として同定されている。
ｉＰＳＣへのゲノム操作によって導入遺伝子を加えることで、経時的に及び分化プロセスを介して導入遺伝子の発現をモニターする機会が得られている。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）は、天然のタンパク質のアセンブリー及び機能を著しく妨げることなく融合タンパク質を生成するために広く使用されており、前駆細胞集団をモニターし、出現しつつある細胞系列の動態を決定するためのｉｎ ｖｉｖｏ分析及びバイオマーカーに関する強力なツールとなっている。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するｉＰＳＣ又は分化細胞が市販されていないことから明らかなように、広範な継代及び分化にわたり導入遺伝子の発現を維持する方法が必要とされている。具体的には、図１は、ｉＰＳＣにおけるＧＦＰの斑状発現を示す。
よって、ある特定の実施形態では、本開示は、ＣｐＧモチーフを除去し、よって導入遺伝子の迅速なサイレンシングを防止するために導入遺伝子の配列を最適化することによって、細胞株における導入遺伝子の発現を維持する方法を提供する。メチル化は、ＲＮＡが関連するサイレンシング及びヒストン修飾に加えて、主要なエピジェネティック機構である。本研究では、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）緑色蛍光タンパク質（ＡｃＧＦＰ１）のＤＮＡ配列を図２に示すようにＣｐＧモチーフを除去するように改変した。その結果、ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１の発現は安定であったが、野生型ＡｃＧＦＰ１の発現は安定ではなかった（図３）。したがって、本方法により、グローバルメチル化又は他のエピジェネティックな調節不全による導入遺伝子のサイレンシングの防止が可能になる。
さらなる実施形態では、本明細書において提供される新規プロモーター（例えば、配列番号１～１２又は１７）により導入遺伝子の発現を駆動することによって、又はＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、若しくはＭＹＬ６などの遺伝子にタグ付けすることによって導入遺伝子の発現を駆動することによって、細胞株における導入遺伝子の発現を維持する方法が提供される。
さらに、本発明の細胞株は、特定の細胞型に分化され、導入遺伝子の発現を３カ月間、６カ月間、又はさらには１２カ月よりも長く導入遺伝子の発現を維持し得る。特定の態様では、細胞株は、少なくとも３０日間、例えば、少なくとも２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間又はそれより長期間培養される。特定の態様では、細胞株は、６カ月を超えて、例えば、１年を超えて、２年を超えて、又は３年を超えて培養される。特定の態様では、細胞株は、少なくとも３０日間、例えば、少なくとも２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間又はそれより長期間の導入遺伝子の安定した発現を有する。特定の態様では、細胞株は、６カ月を超えて、例えば、１年を超えて、２年を超えて、又は３年を超えて、導入遺伝子の安定した発現を有する。追加の態様では、細胞生存率アッセイ及びスクリーニングアッセイのために本発明の細胞株を使用する細胞アッセイ方法が提供される。
Ｉ． 定義
「精製された」という用語は、絶対的純度を必要とせず、むしろ相対的な用語として意図される。よって、精製された細胞集団は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の純度を超えるか、又は最も好ましくは、他の細胞型を本質的に含まない。
本明細書で使用される場合、「安定した発現」という用語は、改変されていない配列よりも安定な発現を指す。例えば、安定した発現は、１カ月、６カ月、１年の、又は１年を超える期間にわたり変化がないままである発現を指し得る。
本明細書で使用される場合、特定の構成成分に関して「本質的に含まない」は、特定の構成成分のいずれも組成物に意図的に配合されていないこと、及び／又は夾雑物として若しくは微量で存在するに過ぎないことを意味するために本明細書において使用される。したがって、組成物の意図しない汚染に起因する特定の構成成分の総量は、０．０５％未満、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、標準的な分析方法では特定の構成成分の量が検出できない組成物である。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）を意味し得る。請求項において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と併せて使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ又は１つより多く（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）を意味し得る。
請求項における「又は（ｏｒ）」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物並びに「及び／又は」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目又はそれ以降を意味する場合がある。
「本質的に」という用語は、方法又は組成物が、指定されたステップ又は材料、並びにこれらの方法及び組成物の基本的且つ新規の特性に重大な影響を与えないもののみを含むことを理解されたい。
「実質的に含まない」という用語は、列挙された構成成分の９８％、及び組成物又は粒子が実質的に含まない成分の２％未満に対して使用される。
「実質的に」又は「およそ」という用語は、本明細書で使用される場合、関連する基本的な機能に変化をもたらすことなく、許容される範囲で変化し得る任意の定量的な比較、値、測定、又は他の表現を修正するために適用され得る。
「約」という用語は、一般に、記載された値を測定するための標準的な分析技法を使用して決定された、記載された値の標準偏差の範囲内を意味する。この用語は、記載された値のプラスマイナス５％を指して使用することもできる。
本明細書で使用される場合、野生型配列に「実質的に」類似する配列は、野生型のＧＣ含量パーセントの５％以内のＧＣ含量パーセントを含む。
「細胞集団」という用語は、典型的には共通する型の細胞群を指すために本明細書において使用される。細胞集団は共通の前駆細胞に由来してもよく、２つ以上の型の細胞を含む場合もある。「濃縮された」細胞集団は、出発細胞集団（例えば、未分画の異種細胞集団）に由来する細胞集団であって、出発集団中のその細胞型のパーセンテージよりも高いパーセンテージで特定の細胞型を含有する細胞集団を指す。細胞集団では、１つ以上の細胞型が濃縮されていても、１つ以上の細胞型が枯渇していてもよい。
「幹細胞」という用語は、好適な条件下では、多様な範囲の特殊な細胞型に分化することが可能であるが、他の条件下では、自己再生が可能であり、本質的に未分化の多能性状態のままであることが可能である細胞を指す。「幹細胞」という用語は、多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）、多分化能細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）及び始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）も包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られた造血幹細胞又は間葉系幹細胞、胚組織から得られた胚性幹細胞、又は胎児の生殖器組織から得られた胚性生殖細胞から得ることができる。例示的な多能性幹細胞は、多能性に関連するある特定の転写因子の発現によって、体細胞を多能性状態にリプログラミングすることによって、体細胞から生成することもでき、これらの細胞は「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」と呼ばれる。
「多能性」という用語は、胚外細胞又は胎盤細胞を除いた、生物の他のすべての細胞型に分化する細胞の特性を指す。多能性幹細胞は、長期間培養した後でも、３つすべての生殖細胞層（例えば、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞型に分化することが可能である。多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹細胞であっても、核移植によって生成されたものであってもよい。他の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞のリプログラミングに由来する人工多能性幹細胞である。
「分化」という用語は、特殊化されていない細胞が、構造的及び／又は機能的特性の変化を伴って、より特殊化された型になるプロセスを指す。成熟細胞は、典型的には、細胞構造が変化し、組織特異的なタンパク質を有する。
本明細書で使用される場合、「未分化」は、胚又は成体起源の終末分化細胞と明確に区別できる、未分化細胞の特徴的なマーカー及び形態学的特徴を示す細胞を指す。
「胚様体（ＥＢ）」は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の胚葉の細胞に分化することができる多能性幹細胞の凝集体である。多能性幹細胞を非接着培養条件下で凝集させるとスフェロイド構造が形成され、よって、懸濁液中ではＥＢが形成される。
「単離された」細胞は、生物又は培養物中の他の細胞から実質的に分離又は精製されている。単離された細胞は、例えば、少なくとも９９％、少なくとも９８％純粋、少なくとも９５％純粋、又は少なくとも９０％純粋であり得る。
「細胞株」は、本明細書で使用される場合、１つの細胞を起源とする細胞の集まりを指す。細胞株は、チューブ、フラスコ、又はディッシュ中で増殖培地中に保たれてもよい。細胞株は、単一の細胞からのクローン増殖によって発生し、複数の細胞に拡大させることができる。細胞株は、遺伝学的に同一であり、数カ月又は数年などの経時的に培養を維持できる細胞を含み得る。
「胚」は、人工的にリプログラミングされた核を有する接合体又は活性化卵子の１つ以上の分割によって得られる細胞塊を指す。
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、胚盤胞期の内部細胞塊などの初期段階の胚から得られるか、又は人工的な手段（例えば核移植）によって生成される未分化の多能性細胞であり、胚又は生殖細胞（例えば、***及び卵子）を含む成人のあらゆる分化した細胞型を生じさせることができる。
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子の組合せ（本明細書ではリプログラミング因子と称される）を発現するか又は発現を誘導することによって体細胞をリプログラミングすることによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、幼若、又は成体の体細胞を使用して生成することができる。ある特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用され得る因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ ３／４と称されることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８が挙げられる。一部の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、又は４つのリプログラミング因子を発現させることによって、体細胞がリプログラミングされる。
「フィーダーフリー」又は「フィーダー非依存性」は、フィーダー細胞層の代替としてサイトカイン及び増殖因子（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ）を補充した培養を指す。よって、「フィーダーフリー」又はフィーダー非依存性培養系及び培地は、多能性細胞を未分化の増殖状態で培養し、維持するために使用されてもよい。一部の場合には、フィーダーフリー培養は、動物ベースのマトリックス（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を利用するか、又はフィブロネクチン、コラーゲン、若しくはビトロネクチンなどの基質上で成長させる。これらのアプローチにより、ヒト幹細胞は、マウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とすることなく、本質的に未分化の状態を維持することができる。
「フィーダー層」は、培養皿の底などにある細胞のコーティング層として本明細書において定義される。フィーダー細胞は培養培地中に養分を放出し、多能性幹細胞などの他の細胞が付着できる表面を提供し得る。
「定義された」又は「十分に定義された」という用語は、培地、細胞外マトリックス、又は培養条件に関連して使用される場合、ほぼすべての構成成分の化学組成及び量が知られている培地、細胞外マトリックス、又は培養条件を指す。例えば、定義された培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンのように定義されていない因子を含有しない。一般に、定義された培地は、組換えアルブミン、化学的に定義された脂質、及び組換えインスリンを補充された基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝剤、抗酸化剤、及びエネルギー源を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２、又はロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含む。十分に定義された培地の例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地である。
ヒト細胞で使用される培地、細胞外マトリックス、又は培養系において、「ゼノフリー（ＸＦ）」という用語は、使用される材料が非ヒト動物起源ではない条件を指す。
ＩＩ． 操作された細胞株
一部の実施形態では、安定した発現を伴う導入遺伝子を発現するように操作された細胞株が本明細書において提供される。安定した発現は、ＣｐＧモチーフを除去するように導入遺伝子の配列をコドン最適化し、新規プロモーター（例えば、配列番号１～１２又は１７）によって発現を駆動することによって、又は内因性遺伝子（例えば、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、又はＭＹＬ６）をタグ付けして発現を駆動することによって実現され得る。
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」は、システイン「Ｃ」とそれに続くリン酸結合「ｐ」及びグアニン「Ｇ」を含有するヌクレオチドを指す。「ＣｐＧモチーフの除去」への言及は、Ｃ及び／又はＧヌクレオチドがモチーフを除去するために改変されることを意味する。本明細書で使用される場合、核酸分子に関する「ヒト化」は、核酸分子がヒトの配列に類似するか若しくは酷似している配列若しくは配列の一部を有すること、又は分子がヒト細胞においてより機能的になるように他の方法で作製されることを意味する。例えば、コドンは、ヒト細胞における核酸の発現の有効性を高めるために、例えば、より高速な翻訳速度及び高精度を実現するために、ヒトにおける公知のコドン使用に基づいて、ヒトでの使用のために最適化され得る。
メチル化による遺伝子スイッチオフのプロセスは、最終的にクロマチン構造の変化をもたらし、転写が弱い状態を形成する一連のカスケード事象によって説明される。遺伝子の５’－ＣｐＧ－３’のメチル化により、メチル化されたＤＮＡ配列に結合し、同時にヒストン脱アセチル化酵素（ＭＢＤ－ＨＤＡＣ）及び転写阻害タンパク質（転写リドレッサータンパク質）に結合する。人工遺伝子合成技法は、この可能性から選択される任意のヌクレオチド配列の合成を可能にし、ここで、対応する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは変化しない。改変された標的核酸配列は長いオリゴヌクレオチドから、例えば実施例に記載されているステップワイズＰＣＲによって、又は従来の遺伝子合成の場合には専門の供給業者（例えば、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ、Ｑｉａｇｅｎ ＡＧ）によって生成される。
一部の態様では、遺伝暗号の範囲内で除去され得る導入遺伝子のＣｐＧはすべて除去される。しかしながら、より少ないＣｐＧ、例えば、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が除去されてもよい。本開示によるコドン最適化構築物は、例えば、使用される発現系と同じコドン分布を選択することによって調製することができる。発現系は、哺乳動物の系、例えば、ヒトの系であってもよい。好ましくは、コドン最適化は、ヒト遺伝子のコドン選択に適合する。
ホモサピエンス（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の一部のコドンの存在量は少ないが、他のコドンは中程度又は多い。本明細書で使用される場合、「レアコドン」は、ホモサピエンスにおいて０．２未満の頻度のコドンを指す。ＤＮＡ配列を改変する場合にレアコドンの使用を回避するために、コドン頻度表を使用して、少なくとも０．３、例えば少なくとも０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９の頻度のコドンを選択してもよい。
例えば、Ｌ、すなわちロイシンをコードする配列を改変する場合、評価するコドンは６つ存在する（コドン＋頻度としてここに列挙される）：ＵＵＡ ８％、ＵＵＧ １３％、ＣＵＵ １３％、ＣＵＣ ２０％、ＣＵＡ ７％、又はＣＵＧ ４０％。ロイシンコドンＣＵＣの後にＧで始まるコドンが続く場合、ＣＧモチーフが存在し、ＣＵＧへのロイシンコドンの改変が、ＣＧモチーフを除去し、レアコドンの使用を回避するために、他の４つのコドンよりも好ましい。
ＣＧモチーフを除去するためのプロリンのＣＣＧのようなコドンの改変は、ＣＣＣというコドンを使用して達成することができるが、タンパク質領域がいくつかのプロリンを含有する場合には、この改変はモノヌクレオチドストレッチリピートを生成することになる。よって、ＣＣＵ又はＣＣＡなどの他のコドンをプロリンに使用して、モノヌクレオチドストレッチを回避することができる。本明細書で使用される場合、「モノヌクレオチドストレッチ」は、ＣＣＣＣＣＣのように、同じヌクレオチドが少なくとも６個、一列に並んだ領域を指す。
導入遺伝子の配列は、ＲＮＡ、その誘導体又は模倣体、ペプチド、又はポリペプチド、改変されたペプチド若しくはポリペプチド、タンパク質又は改変されたタンパク質をコードし得る。導入遺伝子は、異なる野生型配列のキメラ及び／又はアセンブル配列であってもよく、例えば、融合タンパク質又はモザイク型アセンブルポリジーン構築物をコードしてもよい。導入遺伝子は、合成配列を含んでもよい。この点に関して、核酸配列は、コンピュータモデルを使用するなどして、合成的にモデル化することができる。
発現される導入遺伝子は、任意のタンパク質、例えば組換えタンパク質、人工ポリペプチド、融合タンパク質及びそれらの等価物の遺伝子の配列であってもよい。一部の態様では、導入遺伝子は診断用及び／又は治療用のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である。一部の態様では、導入遺伝子はレポーター遺伝子であり、以下に限定するものではないが、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである。一部の態様では、導入遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＳＥＡＰ、又はＬｕｃｉａである。ペプチド／タンパク質としては、例えば、ｉ）ヒト酵素（例えば、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インスリン、ｔＰＡ、凝固因子、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ）、ホルモン（例えば、エリスロ）、ポイエチンなどの治療用タンパク質の産生、卵胞刺激ホルモン、エストロゲン）、及び他のヒト由来タンパク質（例えば、骨形成タンパク質、アンチトロンビン）、ｉｉ）ウイルスタンパク質、ワクチンとして使用することができる細菌タンパク質、若しくは寄生虫由来のタンパク質（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、ボレリア、ヘモフィルス、髄膜炎菌、炭疽菌、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素、破傷風毒素、原虫など）、又はｉｉｉ）診断薬が挙げられる。導入遺伝子は、プロモーター又は選択遺伝子、例えばブラストサイジン又はネオマイシンであってもよい。
Ａ． 人工多能性幹細胞
一部の実施形態では、操作された細胞株はｉＰＳＣである。多能性の誘導は、２００６年にマウス細胞を使用して（Ｙａｍａｎａｋａら、２００６年）、２００７年にはヒト細胞を使用して（Ｙｕら、２００７年、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）、多能性に関連する転写因子を導入して体細胞をリプログラミングすることによって元々実現された。多能性幹細胞は未分化の状態で維持することができ、任意の成体細胞型に分化することができる。
生殖細胞を除けば、任意の体細胞をｉＰＳＣの出発点として使用することができる。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉系細胞、肝細胞、又は胃細胞であり得る。Ｔ細胞も、リプログラミングのための体細胞の供給源として使用されてよい（米国特許第８，７４１，６４８号）。細胞分化の程度又は細胞を回収する動物の年齢に制限はなく、未分化の始原細胞（体性幹細胞を含む）及び最終的に分化した成熟細胞であっても、本明細書に開示される方法において体細胞の供給源として使用することができる。ｉＰＳＣは、ヒトＥＳ細胞を特定の細胞型に分化させることが知られている条件下で成長させることができ、以下を含むヒトＥＳ細胞マーカーを発現する：ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、及びＴＲＡ－１－８１。
Ａ． ＨＬＡ適合
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は同種臓器移植の免疫拒絶の主な原因である。３つの主要なクラスＩ ＭＨＣハプロタイプ（Ａ、Ｂ、及びＣ）及び３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰ、及びＤＱ）が存在する。
ドナーとレシピエントの間のＭＨＣ適合性は、ドナーの細胞がＨＬＡホモ接合体である、すなわち各抗原提示タンパク質について同一の対立遺伝子を含有する場合に著しく向上する。ほとんどの個体はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子についてヘテロ接合性であるが、ある特定の個体はこれらの遺伝子についてホモ接合性である。これらのホモ接合性の個体はスーパードナーとしての役割を果たすことができ、それらの細胞から得られた移植片は、そのハプロタイプについてホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかの個体すべてに移植することができる。さらに、ホモ接合性のドナー細胞が集団に高頻度に見られるハプロタイプを有する場合、これらの細胞は多数の個体への移植療法に応用できる可能性がある。
したがって、ｉＰＳＣは、処置される対象、又は患者のＨＬＡ型と同一若しくは実質的に同一のＨＬＡ型を有する別の対象の体細胞から生成することができる。ある場合には、ドナーの主要なＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＤＲの３つの主要な遺伝子座）は、レシピエントの主要なＨＬＡと同一である。一部の場合には、体細胞ドナーはスーパードナーであってもよく、よって、ＭＨＣホモ接合性スーパードナーに由来するｉＰＳＣを使用して分化細胞を生成してもよい。よって、スーパードナーに由来するｉＰＳＣは、そのハプロタイプについてホモ接合性であるか又はヘテロ接合性である対象に移植されてもよい。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂなどの２つのＨＬＡ対立遺伝子でホモ接合体であり得る。このように、スーパードナーから生成されたｉＰＳＣは、本明細書に開示された方法において使用して、多数の潜在的レシピエントに潜在的に「適合」する分化細胞を生成することができる。
Ｂ． リプログラミング因子
体細胞は、当業者に公知の方法を使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するようにリプログラミングされ得る。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に生成することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号、米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号、米国特許出願公開第２０１２０２７６６３６号、米国特許第８，０５８，０６５号、米国特許第８，１２９，１８７号、米国特許第８，２７８，６２０号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０６９６６６ Ａ１号、及び米国特許第８，２６８，６２０号を参照されたい。一般に、核リプログラミング因子は、体細胞から多能性幹細胞を生成するために使用される。一部の実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なｓくとも４つが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４が利用される。一部の態様では、５、６、７、又は８個のリプログラミング因子が使用される。
細胞は核リプログラミング物質で処理され、核リプログラミング物質は一般に、体細胞からｉＰＳＣを誘導することが可能な１つ以上の因子、又はこれらの物質をコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）である。核リプログラミング物質には一般に、少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２、又はこれらの分子をコードする核酸が含まれる。ｐ５３の機能的阻害剤、Ｌ－ｍｙｃ若しくはＬ－ｍｙｃをコードする核酸、及びＬｉｎ２８若しくはＬｉｎ２８ｂ又はＬｉｎ２８若しくはＬｉｎ２８ｂをコードする核酸は、さらなる核リプログラミング物質として利用され得る。Ｎａｎｏｇも核リプログラミングに利用され得る。米国特許出願公開第２０１２０１９６３６０号に開示されているように、ｉＰＳＣの生成のための例示的なリプログラミング因子には、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２は、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘｌ５、Ｓｏｘｌ７又はＳｏｘｌ８で置き換えることができ、Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ５で置き換え可能である）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）、（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）１６ Ｅ６、（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７ （５） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－ Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７； （６） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ； （７） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８； （８） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ； （９） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ； （１０） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ、（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能である）、（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２； （１３） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ； （１４） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰ ＶＩ ６ Ｅ６； （１５） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７； （１６） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７； （１７） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ； （１８） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８ （１９） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ； （２０） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ； （２１） Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ、又は（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能である）が含まれる。非限定的な一例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２が利用され、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６８２，８２８号を参照されたい。これらの因子には、以下に限定するものではないが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２が含まれる。他の例では、因子には、以下に限定するものではないが、Ｏｃｔ ３／４、Ｋｌｆ４及びＭｙｃが含まれる。非限定的な一部の例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２が利用される。非限定的な他の例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２及びＳａｌ４が利用される。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、又はｃ－Ｍｙｃのような因子は、リプログラミング効率を高めることができ、いくつかの異なる発現ベクターから発現させることができる。例えば、ＥＢＶエレメントに基づくシステムなどの組込みベクターを使用することができる（米国特許第８，５４６，１４０号）。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質は、タンパク質導入によって体細胞に直接導入され得る。リプログラミングは、細胞を、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ－３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）受容体阻害剤若しくはシグナル伝達阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ－カッパＢ阻害剤、又はこれらの組合せを含む１つ以上のシグナル伝達受容体と接触させることをさらに含み得る。これらの調節因子には、低分子、阻害性ヌクレオチド、発現カセット、又はタンパク質因子が含まれ得る。事実上、いずれかのｉＰＳ細胞又は細胞株が使用され得ることが予想される。
これらの核リプログラミング物質のマウス及びヒトのｃＤＮＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０６９６６６に記載のＮＣＢＩ受託番号を参照して入手可能である。１つ以上のリプログラミング物質、又はこれらのリプログラミング物質をコードする核酸を導入する方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１９６３６０号及び米国特許第８，０７１，３６９号に開示されている。
誘導されたｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地で培養することができる。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号及び米国特許公報第２００３／０２１１６０３号に記載されている多能性幹細胞、より詳細には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地及び技法を用いて使用され得る。マウス細胞の場合には、通常の培地に分化抑制因子として白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加して培養が行われる。ヒト細胞の場合には、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。当業者に公知であるように、ｉＰＳＣを培養及び維持するための他の方法を使用してもよい。
ある特定の実施形態では、定義されていない条件を使用してもよく、例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞上、又は線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養してもよい。一部の実施形態では、細胞は、フィーダー細胞として、細胞***を終結させるために放射線又は抗生物質で処理したマウス胚線維芽細胞を共存させて培養される。あるいは、多能性細胞は、ＴＥＳＲ（商標）培地（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｂ）又はＥ８（商標）培地（Ｃｈｅｎら、２０１１年）などの定義されたフィーダーに依存しない培養系を使用して、本質的に未分化な状態で培養及び維持され得る。
Ｃ． プラスミド
一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、外因性核酸を発現するように、例えば、プロモーターに作動可能に連結されたエンハンサー及び第１のマーカーをコードする核酸配列を含むように、改変され得る。構築物はまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）、転写／翻訳ターミネーターなどの他の要素を含むことができる。一般に、細胞に構築物をトランスフェクトするのが有利である。安定なトランスフェクションに好適なベクターとしては、以下に限定するものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びセンダイウイルスが挙げられる。
一部の実施形態では、マーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数複製起点、（２）以下に限定するものではないが、カナマイシンによる抗生物質選択のためのネオ遺伝子などの選択可能なマーカー、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列及び（４）様々な核酸カセットを組み込むためのマルチクローニング部位、及び（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するためのプラスミドベクターは、当技術分野で数多く知られている。これらには、以下に限定するものではないが、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１０３，４７０号、米国特許第７，５９８，３６４号、米国特許第７，９８９，４２５号、及び米国特許第６，４１６，９９８号に開示されたベクターが含まれる。一部の態様では、プラスミドは、プロドラッグ又は薬物の投与の際に、遺伝子産物を、宿主細胞を死滅させる化合物に変換する「自殺遺伝子」を含む。使用され得る自殺遺伝子、プロドラッグ又は薬物の組合せの例は、例えば、限定するものではないが、切断型ＥＧＦＲ及びセツキシマブ、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）及びとガンシクロビル、アシクロビル又はＦＩＡＵ；酸化還元酵素及びシクロヘキシミド、シトシンデアミナーゼ及び５－フルオロシトシン、チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）及びＡＺＴ、並びにデオキシシチジンキナーゼ及びシトシンアラビノシドである。
ウイルス遺伝子送達システムは、ＲＮＡベース又はＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達システムは、プラスミド、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクター、又はレンチウイルスベクターであり得る。
マーカーには、以下に限定するものではないが、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ又はホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ又はｎａｎｏｌｕｃ）、又は他のタンパク質が含まれる。マーカーは、タンパク質（分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、又は内部タンパク質を含む；細胞によって合成されるか、又は取り込まれる）、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、又は酵素的に活性な核酸分子）、又は多糖類であってもよい。抗体、レクチン、プローブ又は核酸増幅反応によって検出可能で、目的の細胞型のマーカーに特異的な、このようないずれかの細胞構成成分の決定基も含まれる。マーカーはまた、生化学的アッセイ若しくは酵素アッセイ、又は遺伝子産物の機能に依存する生物学的応答によって同定することもできる。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに作動可能に連結することができる。加えて、幹細胞の分化、又は細胞機能、又は生理学、又は病理学に影響を及ぼし得る遺伝子など、他の遺伝子を含めることもできる。
Ｄ． 送達システム
本開示の操作された細胞株へのＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸の導入には、本明細書に記載されているか又は当業者に公知であるような細胞の形質転換のための核酸送達に関する任意の好適な方法を使用してもよい。このような方法には、以下に限定するものではないが、ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９年、Ｎａｂｅｌら、１９８９年）、マイクロインジェクション（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年；米国特許第５，７８９，２１５号）を含む注射（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号及び同第５，５８０，８５９号）；電気穿孔（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３８４，２５３号；Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａら、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）；ＤＥＡＥ－デキストランを使用し、次いでポリエチレングリコールを使用すること（Ｇｏｐａｌ、１９８５）；直接的な音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）；リポソームに媒介されるトランスフェクション（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）；リポソームに媒介されるトランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年；Ｗｏｎｇら、１９８０年；Ｋａｎｅｄａら、１９８９年；Ｋａｔｏら、１９９１年）及び受容体に媒介されるトランスフェクション（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７年；Ｗｕ及びＷｕ、１９８８年）；微粒子銃（ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９６９９号及び同第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号及び同第５，５３８，８８０号、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）；炭化ケイ素繊維による撹拌（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０年；米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号）；アグロバクテリウムに媒介される形質転換（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６１６号及び同第５，５６３，０５５号）；乾燥／阻害に媒介されるＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５年）、及びこのような方法の任意の組合せによるなど、ＤＮＡの直接的な送達が含まれる。これらのような技法の応用により、オルガネラ、細胞、組織又は生物は、安定的又は一過的に形質転換されてもよい。
１． ウイルスベクター
ウイルスベクターは、本開示のある特定の態様において提供され得る。組換えウイルスベクターの生成において、非必須遺伝子は、典型的には、異種（又は非天然の）タンパク質の遺伝子又はコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、核酸及び場合によってはタンパク質を細胞に導入するためにウイルス配列を利用する一種の発現構築物である。ある特定のウイルスが細胞に感染するか又は受容体に媒介されるエンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的且つ効率的に発現する能力により、これらは、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移入するための魅力的な候補となっている。本開示のある特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込む能力、大量の外来遺伝物質を移入する能力、広範な種及び細胞型に感染する能力、特殊な細胞株にパッケージされる能力により、遺伝子送達ベクターとして有望視されている（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２年）。
レトロウイルスベクターを構築するために、核酸がある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠陥ウイルスが生じる。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲもパッケージング構成成分も含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３年）。レトロウイルスのＬＴＲ及びパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを特殊な細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされ、次いで、それが培養培地中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年；Ｍａｎｎら、１９８３年）。組換えレトロウイルスを含有する培地は、次いで、回収され、場合によって濃縮され、遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは多種多様な細胞型に感染することができる。しかしながら、組込み及び安定した発現には宿主細胞の***が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５年）。
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含有する。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６年；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７年；Ｂｌｏｍｅｒら、１９９７年；米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。
組換えレンチウイルスベクターは非***細胞に感染可能であり、核酸配列のｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子移入と発現の両方に使用され得る。例えば、非***細胞に感染可能な組換えレンチウイルス（好適な宿主細胞は、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びにｒｅｖ及びｔａｔを有する２つ以上のベクターをトランスフェクトされる）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
２． エピソームベクター
プラスミド又はリポソームベースの染色体外（すなわち、エピソーム）ベクターの使用もまた、本開示のある特定の態様において提供され得る。このようなエピソームベクターには、例えば、ｏｒｉＰベースのベクター、及び／又はＥＢＮＡ－１の誘導体をコードするベクターが含まれてもよい。これらのベクターは、ＤＮＡの大きな断片が細胞内に導入され、染色体外に維持され、細胞周期ごとに１回複製され、効率的に娘細胞に分配され、実質的に免疫応答を惹起しないことを可能にし得る。
特に、ｏｒｉＰベースの発現ベクターの複製に必要な唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ－１は、ＭＨＣクラスＩ分子上でのその抗原提示に必要なプロセシングを回避する効率的なメカニズムを発達させたため、細胞性免疫応答を惹起しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７年）。さらに、ＥＢＮＡ－１はトランスで作用してクローン化遺伝子の発現を強化し、いくつかの細胞株ではクローン化遺伝子の発現を１００倍まで誘導することができる（Ｌａｎｇｌｅ－Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８年；Ｅｖａｎｓら、１９９７年）。最後に、このようなｏｒｉＰベースの発現ベクターの製造は安価である。
ある特定の態様では、リプログラミング因子は、１つ以上の外因性エピソーム（ｅｐｉｓｉｏｍａｌ）遺伝要素に含まれる発現カセットから発現される（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公報第２０１０／０００３７５７号を参照されたい）。よって、ｉＰＳＣは、レトロウイルス又はレンチウイルスのベクターエレメントなどに由来する外因性遺伝エレメントを本質的に含まない可能性がある。これらのｉＰＳＣは、染色体外複製ベクター（すなわち、エピソームベクター）の使用によって調製され、染色体外複製ベクターは、外因性のベクター又はウイルスエレメントを本質的に含まないｉＰＳＣを作製するために、エピソームによって複製することが可能なベクターである（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５４６，１４０号；Ｙｕら、２００９年を参照されたい）。アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＢＰＶ）、又は出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）を含有するプラスミドなどの多数のＤＮＡウイルスが哺乳動物細胞内で染色体外複製又はエピソーム複製を行う。これらのエピソームプラスミドは、組込みベクターに関連するこれらの欠点（Ｂｏｄｅら、２００１年）を本質的に有さない。例えば、上記で定義されているリンパ球増殖性ヘルペスウイルス又はエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）をベースとするものは、染色体外で複製し、体細胞にリプログラミング遺伝子を送達するのに役立つ。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰ及びＥＢＮＡ－１、又はそれらのバリアント若しくは機能的等価物である。エピソームベクターのさらなる利点は、外因性エレメントが細胞に導入された後、時間とともに失われ、これらのエレメントを本質的に含まない自続性のｉＰＳＣが得られることである。
他の染色体外ベクターには、他のリンパ増殖性ヘルペスウイルスベースのベクターが含まれる。リンパ増殖性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）において複製し、その自然な生活環の一部においてプラスミドとなるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は「リンパ増殖性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ増殖性ヘルペスウイルスには、以下に限定されるものではないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）及びマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が含まれる。また、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、又はＢＰＶなどのエピソームベースのベクターの他の供給源も考えられる。
当業者であれば、標準的な組換え技法によってベクターを構築することは十分に可能であろう（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８年及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４年を参照されたい）。
ベクターはまた、遺伝子送達及び／若しくは遺伝子発現をさらにモジュレートする、又は標的化細胞に有益な特性を提供する他の構成成分又は機能性を含み得る。このような他の成分には、例えば、細胞への結合又は標的化に影響を及ぼす構成成分（細胞型又は組織特異的結合を媒介する構成成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす構成成分；取り込み後の細胞内でのポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす構成成分（核局在化を媒介する薬剤など）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成成分が含まれる。
このような構成成分はまた、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞を検出又は選択するために使用することができる検出可能なマーカー及び／又は選択マーカーなどのマーカーを含み得る。このような構成成分は、ベクターの天然の特徴として提供することができ（結合及び取り込みを媒介する構成成分又は機能性を有するある特定のウイルスベクターの使用など）、又はベクターはこのような機能性を提供するように改変され得る。非常に様々なこのようなベクターは当技術分野で公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞内に維持される場合、ベクターは有糸***期に細胞によって自律構造として安定的に複製されるか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるか、又は宿主細胞の核若しくは細胞質内に維持されるかのいずれかであり得る。
３． 調節エレメント
本開示において有用なリプログラミングベクターに含まれる発現カセットは、好ましくは、タンパク質コード配列に作動可能に連結した真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列を含有する（５’～３’方向に）。
ａ． プロモーター／エンハンサー
本明細書において提供される発現構築物は、プログラミング遺伝子の発現を駆動するプロモーターを含む。プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成の開始部位を位置決めするために機能する配列を含む。この最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位自体の上にある別個のエレメントが開始場所を固定するのに役立つ。追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流の３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下に」置くために、コード配列を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、その３’側）の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端側に位置させる。「上流」のプロモーターはＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
プロモーターエレメント間の間隔はフレキシブルである場合が多く、その結果、エレメントが互いに対して反転又は移動した場合も、プロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐまで広げることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは転写を活性化するために協働的に又は独立して機能することができるようである。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用型調節配列を指す「エンハンサー」と併せて使用しても使用しなくてもよい。
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得るように、核酸配列に天然に関連するものであってもよい。このようなプロモーターは「内因性」と呼ばれる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列に天然に関連するものであってもよい。あるいは、コード核酸セグメントを組換えプロモーター又は異種プロモーターの制御下に位置させることによって、ある種の利点が得られ、組換えプロモーター又は異種プロモーターはまた、その天然環境において核酸配列と通常関連しないプロモーターを指す。組換えエンハンサー又は異種エンハンサーはまた、その天然環境において核酸配列と通常関連しないエンハンサーを指す。このようなプロモーター又はエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び他の任意のウイルス、又は原核細胞若しくは真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在しない」プロモーター又はエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は発現を変更する変異を含有するプロモーター又はエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるプロモーターには、β－ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示された組成物に関連して、ＰＣＲ（商標）を含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して生成され得る（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号及び同第５，９２８，９０６号を参照されたい）。さらに、非核オルガネラ、例えばミトコンドリア、葉緑体などの内の配列の転写及び／又は発現を指示する制御配列を、同様に用いることができることが企図される。
当然のことながら、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官、又は生物においてＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／又はエンハンサーを用いることが重要であろう。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組合せの使用について知っている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年を参照されたい）。用いられるプロモーターは、組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模産生において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するために適切な条件下で、構成的、組織特異的、誘導性、及び／又は有用であり得る。プロモーターは異種性であっても内因性であってもよい。
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢによる）も発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現系の使用も可能な別の実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として又は追加の遺伝子発現構築物として提供される場合に、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
プロモーターの非限定的な例としては、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９年；Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、１９８９年）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８８年、Ｅｒｃｏｌａｎｉら、１９８８年）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら、１９８９年；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９８４年）；並びに連結応答エレメントプロモーター、例えば最小ＴＡＴＡボックス近傍の環状ＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）及び応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、受託番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１に記載のヒト成長ホルモン最小プロモーター）又はマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ ４５００７から入手可能）を使用することも可能である。
組織特異的な導入遺伝子の発現、特にプログラミングに由来する造血細胞及び造血細胞の前駆体におけるレポーター遺伝子の発現は、由来する造血細胞及び前駆体を同定する方法として望ましい場合がある。特異性と活性の両方を高めるために、シス作用型調節エレメントの使用が企図されている。例えば、造血細胞特異的プロモーターが使用されてもよい。多くのこのような造血細胞特異的プロモーターは当技術分野で公知である。
ある特定の態様では、本開示の方法はまた、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増加させ、比較的長い距離（標的プロモーターから最大数キロ塩基離れている）であっても、シスで、及びその配向に関係なく作用する可能性を有する核酸配列に関係する。しかしながら、エンハンサーの機能は必ずしもこのような長距離に限定されるものではなく、所与のプロモーターに近接して機能する場合もある。
多くの造血細胞プロモーター及びエンハンサーの配列が同定されており、本発明の方法において有用であり得る。例えば、米国特許第５，５５６，９５４号；米国特許出願第２００２００５５１４４号；米国特許出願第２００９０１４８４２５号を参照されたい。
ｂ． 開始シグナル及び関連する発現
特定の開始シグナルも、コード配列の効率的な翻訳のために、本開示において提供される発現構築物において使用され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルは、提供される必要があり得る。当業者であれば、容易にこのことを判断し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって向上させることができる。
ある特定の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントが、多遺伝子、又はポリシストロンメッセージを生成するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）も、哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、１９９１年）と同様に報告されている。ＩＲＥＳエレメントは異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。複数のオープンリーディングフレームが一緒に転写され、それぞれがＩＲＥＳで分離され、ポリシストロンメッセージを生成することができる。ＩＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。単一のメッセージを転写するために、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる（米国特許第５，９２５，５６５号及び第５，９３５，８１９号を参照されたい）。
さらに、ある特定の２Ａ配列エレメントは、本開示で提供される構築物において、プログラミング遺伝子の関連発現又は同時発現を生じるように使用され得る。例えば、切断配列は、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成することによって遺伝子を同時発現させるために使用され得る。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（***ウイルス２Ａ）又は「２Ａ様」配列（例えば、トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）である（Ｍｉｎｓｋａｉａ及びＲｙａｎ、２０１３年）。特定の実施形態では、Ｆ２Ａ切断ペプチドは、多系統構築物における遺伝子の発現を関連付けるために使用される。
ｃ． 複製起点
宿主細胞内でベクターを増殖させるために、ベクターは、１つ以上の複製起点部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）、例えば、上記のようなＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、又はプログラミングにおいて類似の若しくは向上した機能を有する遺伝子操作されたｏｒｉＰ（複製が開始される特定の核酸配列である）を含有し得る。あるいは、上記のような他の染色体外複製ウイルスの複製起点、又は自律複製配列（ＡＲＳ）を用いることができる。
ｄ． 選択マーカー及びスクリーニング可能なマーカー
ある特定の実施形態では、核酸構築物を含有する細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで同定され得る。このようなマーカーは、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を細胞に付与することになる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーは、そのマーカーの存在によって選択が可能になるものであり、負の選択マーカーは、そのマーカーの存在によって選択が妨げられるものである。正の選択マーカーの例は薬剤耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニング及び同定が容易になり、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析を基礎とするスクリーニング可能なマーカー、例えばＧＦＰを含む他の種類のマーカーも企図される。あるいは、負の選択マーカーとしてのスクリーニング可能な酵素、例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が利用されてもよい。当業者であれば、場合によってはＦＡＣＳ分析と併せて、免疫学的マーカーを用いる方法も知っているであろう。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り、使用されるマーカーは重要ではないと考えられる。選択マーカー及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者に周知である。
Ｅ． 遺伝子編集
一部の実施形態では、本方法は、ＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、並びにＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば遺伝子又はその一部の配列に標的化されるように特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）を含む、配列特異的ヌクレアーゼ又は標的化ヌクレアーゼによる遺伝子編集を含む。
一部の実施形態では、遺伝子編集は、遺伝子における１つ以上の二本鎖切断及び／又は１つ以上の一本鎖切断を、典型的には標的化様式で誘導することによって行われる。一部の実施形態では、二本鎖切断又は一本鎖切断は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼ、例えば遺伝子標的化ヌクレアーゼによってなされる。一部の態様では、切断は遺伝子のコード領域、例えばエクソンにおいて誘導される。例えば、一部の実施形態では、誘導は、コード領域のＮ末端部分付近、例えば第１のエクソン、第２のエクソン、又は後続のエクソンにおいて起こる。
一部の態様では、二本鎖又は一本鎖の切断は、細胞修復プロセスにより、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復を受ける。一部の態様では、修復プロセスはエラーを起こしやすく、遺伝子の破壊、例えばフレームシフト変異、例えば２対立遺伝子フレームシフト変異をもたらし、遺伝子の完全なノックアウトをもたらす可能性がある。
一部の実施形態では、遺伝子編集は、ＤＮＡ標的化分子、例えば遺伝子に特異的に結合するか又はハイブリダイズする、ＤＮＡ結合タンパク質若しくはＤＮＡ結合核酸、又はそれらを含有する複合体、化合物若しくは組成物を使用して実現される。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）又はＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＤＮＡ結合ドメイン、又はメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインを含む。ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、及びＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガー又はＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を操作することにより（１つ以上のアミノ酸を変更する）、所定のヌクレオチド配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガー又はＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。合理的な設計基準には、既存のＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥの設計及び結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するための置換規則及びコンピュータ化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい；また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５号；ＷＯ９８／５３０６号；ＷＯ０２／０１６５３号及びＷＯ０３／０１６４９号並びに米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号も参照されたい。
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子、複合体、又は組合せは、ＤＮＡ結合分子及び１つ以上の追加のドメイン、例えば遺伝子の抑制又は破壊を容易にするエフェクタードメインを含有する。例えば、一部の実施形態では、遺伝子編集は、ＤＮＡ結合タンパク質及び異種調節ドメイン又はその機能的断片を含む融合タンパク質によって行われる。一部の態様では、ドメインは、例えば、転写因子ドメイン、例えばアクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、サイレンサー、発癌遺伝子、ＤＮＡ修復酵素並びにそれらの関連因子及び修飾因子、ＤＮＡ再編成酵素並びにその関連因子及び修飾因子、クロマチン関連タンパク質及びその修飾因子、例えばキナーゼ、アセチラーゼ及び脱アセチラーゼ、及びＤＮＡ修飾酵素、例えばメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、並びにそれらの関連因子及び修飾因子を含む。ＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００６／０１８８９８７号及び同第２００７／０２１８５２８号を参照されたい。一部の態様では、追加のドメインはヌクレアーゼドメインである。よって、一部の実施形態では、遺伝子編集は、操作されたタンパク質、例えばヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ含有複合体又は融合タンパク質（非特異的ＤＮＡ切断分子、例えばヌクレアーゼと融合体を形成するか又は複合体を形成する配列特異的ＤＮＡ結合ドメインから構成される）を使用して、遺伝子又はゲノム編集によって容易にされる。
一部の態様では、これらの標的化キメラヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ含有複合体は、標的化二本鎖切断又は一本鎖切断を誘導することによって正確な遺伝子改変を行い、エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を含む細胞ＤＮＡ修復機構を刺激する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、例えばＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、又はメガヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、ドナー核酸、例えば遺伝子操作された抗原受容体をコードするドナープラスミド又は核酸が提供され、ＨＤＲによってＤＳＢの導入後に遺伝子編集部位に挿入される。よって、一部の実施形態では、遺伝子の破壊及び抗原レセプター、例えばＣＡＲの導入は同時に行われ、それによって遺伝子はＣＡＲをコードする核酸のノックイン又は挿入によって部分的に破壊される。
一部の実施形態では、ドナー核酸は提供されない。一部の態様では、ＤＳＢ導入後のＮＨＥＪに媒介される修復は、例えばミスセンス変異又はフレームシフトを生じることによって遺伝子破壊を引き起こし得る挿入変異又は欠失変異をもたらす。
１． ＺＦＰ及びＺＦＮ
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、エフェクタータンパク質、例えばエンドヌクレアーゼに融合したＤＮＡ結合タンパク質、例えば１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）を含む。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、及びＴＡＬＥＮが挙げられる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、配列特異的にＤＮＡと結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又はそのドメインを含む。ＺＦＰ又はそのドメインは、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１以上のジンクフィンガーによって配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質又はより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと略されることが多い。ＺＦＰの中には、個々のフィンガーのアセンブリーによって生成された、特定のＤＮＡ配列、典型的には９～１８ヌクレオチド長を標的とする人工的なＺＦＰドメインがある。
ＺＦＰには、単一のフィンガードメインがおよそ３０アミノ酸長であり、亜鉛を介して１つのベータターンの２つのシステインと配位する２つの変化しないヒスチジン残基を含有し、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのフィンガーを有するアルファヘリックスを含有するものが含まれる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３及び６）でアミノ酸置換を行うことによって変更される場合がある。よって、一部の実施形態では、ＺＦＰ又はＺＦＰ含有分子は天然に存在せず、例えば、選択された標的部位に結合するように操作されている。
一部の態様では、ＭｅＣＰ２の破壊は、遺伝子中の第１の標的部位を第１のＺＦＰと接触させ、それによって遺伝子を破壊することによって起こる。一部の実施形態では、遺伝子中の標的部位は、６つのフィンガー及び調節ドメインを含む融合ＺＦＰと接触し、それによって遺伝子の発現が阻害される。
一部の実施形態では、接触させるステップは、遺伝子中の第２の標的部位を第２のＺＦＰと接触させることをさらに含む。一部の態様では、第１及び第２の標的部位は隣接している。一部の実施形態では、第１及び第２のＺＦＰは、共有結合により連結されている。一部の態様では、第１のＺＦＰは、１つの調節ドメイン又は少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。
一部の実施形態では、第１及び第２のＺＦＰは、それぞれが１つの調節ドメインを含むか又はそれぞれが少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、調節ドメインは、転写リプレッサー、転写アクチベーター、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、又はヒストンデアセチラーゼである。
一部の実施形態では、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されるＺＦＰ核酸によってコードされている。一部の態様では、本方法は、脂質：核酸複合体において又はネイキッド核酸として、核酸を細胞に最初に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されるＺＦＰ核酸を含む発現ベクターによってコードされている。一部の実施形態では、ＺＦＰは、誘導性プロモーターに作動可能に連結される核酸によってコードされている。一部の実施形態では、ＺＦＰは、弱いプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコードされている。
一部の実施形態では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。一部の態様では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位に隣接している。一部の実施形態では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ切断ドメインに融合して、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるか又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのｌｉＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）及び操作されていても操作されていなくてもよい１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。一部の実施形態では、切断ドメインは、ｌｉＳ型制限エンドヌクレアーゼであるＦｏｋ Ｉに由来する。Ｆｏｋ Ｉは、一般に、一方の鎖の認識部位から９ヌクレオチド及び他方の認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。
一部の実施形態では、ＺＦＮは、操作された細胞内に存在する遺伝子を標的とする。一部の態様では、ＺＦＮは、例えば、遺伝子のコード領域内の所定の部位で、二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的に生じる。標的とされる典型的な領域には、エクソン、Ｎ末端領域をコードする領域、第１のエクソン、第２のエクソン、及びプロモーター又はエンハンサー領域が含まれる。一部の実施形態では、ＺＦＮの一過的発現は、操作された細胞の標的遺伝子の高度に効率的且つ永続的破壊を促進する。特に、一部の実施形態では、ＺＦＮの送達によって、５０％を超える効率で遺伝子の永続的破壊がもたらされる。
多くの遺伝子特異的に工学的に作製されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と協力して、ジンクフィンガー構築に関するプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、研究者らがジンクフィンガーの構築及び検証を回避することを可能にし、何千ものタンパク質に関して特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１３年、３１巻（７号）、３９７～４０５頁）。一部の実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるか、又はカスタム仕様にされる。
２． ＴＡＬ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、天然に存在するか又は操作された（天然に存在しない）転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、転写アクチベーター様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質におけるように）を含み、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン又はＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥのその同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、典型的には３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくとも一部の配列相同性を示す。各ＴＡＬＥリピート単位は、一般に、このリピートの１２位及び／又は１３位に、リピート可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を構成する１個又は２個のＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識に関する天然の（カノニカル）コードを、１２位及び１３位のＨＤ配列がシステイン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴ、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧ又はＡに結合し、ＮＧがＴに結合し、非カノニカル（非典型的）ＲＶＤも公知であるように決定した。米国特許公報第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。一部の実施形態では、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に対する特異性を有するＴＡＬアレイの設計によって、いずれかの遺伝子に対して標的化され得る。標的配列は、一般に、チミジンで始まる。
一部の実施形態では、分子は、ＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼ、例えばＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一部の態様では、ＴＡＬＥＮは、核酸標的配列を切断するためのＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、遺伝子内の標的配列を認識及び切断する。一部の態様では、ＤＮＡの切断によって、二本鎖の切断がもたらされる。一部の態様では、この切断は、相同組換え又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般に、ＮＨＥＪは、ＤＮＡ配列の切断部位に変化をもたらすことの多い不完全な修復プロセスである。一部の態様では、修復メカニズムは、直接的な再ライゲーション（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ及びＪａｃｋｓｏｎ、１９９８年）による、又はいわゆるマイクロホモロジーに媒介される末端結合による、２つのＤＮＡ末端の残っている部分の再結合を伴う。一部の実施形態では、ＮＨＥＪによる修復は、小さな挿入又は欠失をもたらし、これを使用して遺伝子を破壊し、それによって抑制することができる。一部の実施形態では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、又は付加であり得る。一部の態様では、切断に誘導される突然変異誘発事象、すなわちＮＨＥＪ事象に連続する突然変異誘発事象が起こった細胞は、当技術分野で周知の方法によって特定及び／又は選択することができる。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥリピートをアセンブルして、遺伝子を特異的に標的とする。ヒトのタンパク質コード遺伝子１８，７４０個を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリーが構築されている。カスタム仕様のＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）から市販されている。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、１つ以上のプラスミドベクターによってコードされたトランス遺伝子として導入される。一部の態様では、プラスミドベクターは、前記ベクターを受容した細胞の特定及び／又は選択をもたらす選択マーカーを含有することができる。
３． ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）
一部の実施形態では、破壊、例えばＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した破壊は、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を使用して行われる。例えば、破壊は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して行われ得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直接的リピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理部分直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも呼ばれる）、及び／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含むＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を指示する転写物及び他のエレメントを総称する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、配列特異的にＤＮＡに結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、及びヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステム、例えば内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物、例えば化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。
一部の態様では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと固定されたｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体を含む）が細胞内に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位は、相補的塩基対合を使用して、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位、例えば遺伝子に標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５’側の位置、例えば典型的にはＮＧＧ又はＮＡＧに基づいて選択することができる。この点で、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１２、１１、又は１０ヌクレオチドを標的ＤＮＡ配列に対応するように改変することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。典型的には、「標的配列」は、一般に、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションはＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではなく、ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があればよい。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することができ、続いて本明細書で議論されるような破壊を誘導することができる。他の実施形態では、「ニッカーゼ」と思われるＣａｓ９バリアントは、標的部位で一本鎖をニックするために使用される。対合したニッカーゼは、例えば、特異性を改善するために使用することができ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入されるように、配列を標的とする異なるｇＲＮＡの対によって指示される。他の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、異種エフェクタードメイン、例えば転写抑制因子又はアクチベーターに融合されて、遺伝子発現に影響を及ぼす。
標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。標的配列は、細胞の核又は細胞質内、例えば細胞のオルガネラ内に位置していてもよい。一般に、標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに使用され得る配列又は鋳型は、「編集鋳型」又は「編集ポリヌクレオチド」又は「編集配列」と呼ばれる。一部の態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドは編集鋳型と呼ばれる場合がある。一部の態様では、組換えは、相同組換えである。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）は、標的配列内又はその付近（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、又はそれより多い塩基対内）に１つ又は両方の鎖の切断をもたらす。ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列のすべて又は一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、若しくはそれより多いヌクレオチド又はそれより多いヌクレオチド）を含むか又はそれからなってもよく、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部とともに、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列のすべて又は一部にハイブリダイズすることによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するために、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性を有し、例えば、最適にアラインした場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列相補性を有する。
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が１つ以上の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように、細胞に導入され得る。構成成分は、タンパク質及び／又はＲＮＡとして細胞に送達することもできる。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別々のベクター上の別々の制御エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じ又は異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上を単一のベクターに組み合わせ、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成成分をもたらしてもよい。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）などの１つ以上の挿入部位を含んでいてもよい。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物は、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために使用され得る。
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含んでもよい。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、そのホモログ、又はその改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり、例えば、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの受託番号Ｑ９９ＺＷ２に見出され得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、化膿性連鎖球菌又は肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素により、標的配列内及び／又は標的配列の相補物内などの標的配列の場所における一方又は両方の鎖の切断が指示され得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、対応する野生型酵素に対して突然変異したものであり、その結果、突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン内のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）により、Ｃａｓ９が、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼを、ガイド配列、例えばそれぞれＤＮＡ標的のセンス鎖及びアンチセンス鎖を標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用することができる。この組合せにより、両方の鎖にニックを入れ、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを誘導するために使用することが可能になる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば真核細胞における発現のためにコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、以下に限定されるものでもないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒト霊長類を含む哺乳類のものであっても、又はそれに由来してもよい。一般に、コドン最適化は、天然の配列の少なくとも１つのコドンを、天然のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が特定のアミノ酸に関してある特定のコドンへの特定の偏りを示す。コドンバイアス（生物体間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、今度は翻訳の効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞において選択されるｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、所与の生物体における最適な遺伝子発現のために、遺伝子をコドン最適化に基づいて調整することができる。
一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有し、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性の度合いは、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合に、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれより高いパーセンテージであるか又はそれを超える。
最適アライメントは、配列をアライメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定されてもよく、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び場合によっては任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、脱メチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、及び核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、以下に限定されるものではないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、以下に限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含むＤＮＡ分子に結合するか、又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合されてもよい。
Ｆ． ｉＰＳＣの分化
一部の実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、例えばヒトのｉＰＳＣの本質的に単一細胞の懸濁液から分化細胞を生成する方法が提供される。一部の実施形態では、ＰＳＣはいずれの細胞凝集も防ぐためにプレコンフルエントに培養される。ある特定の態様では、ＰＳＣは、ＴＲＹＰＳＩＮ（商標）又はＴＲＹＰＬＥ（商標）によって例示されるように、細胞解離酵素とのインキュベーションによって解離する。ＰＳＣは、ピペッティングによって本質的に単一細胞の懸濁液中に解離することもできる。さらに、ブレビスタチン（例えば、約２．５μＭ）を培地に添加して、細胞が培養容器に接着していない状態で、単一細胞への解離後のＰＳＣの生存率を高めることができる。ブレビスタチンの代わりにＲＯＣＫ阻害剤を使用して、単一細胞への解離後のＰＳＣの生存率を高めてもよい。
ＰＳＣの単一細胞懸濁液が既知の細胞密度で得られたら、細胞は一般に、適切な培養容器、例えば組織培養プレート、例えばフラスコ、６ウェル、２４ウェル、９６ウェルプレートに播かれる。細胞を培養するために使用される培養容器としては、以下に限定されるものではないが、その中で幹細胞を培養することが可能である限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、シャーレ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ及びローラーボトルが挙げられる。細胞は、培養の必要性に応じて、少なくとも又は約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ若しくはそこから派生する任意の範囲の容積で培養されてもよい。ある特定の実施形態では、培養容器はバイオリアクターであってもよく、これは細胞を増殖させることができるような生物学的に活性な環境を支持するｅｘ ｖｉｖｏの任意のデバイス又はシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくとも又は約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、又はそこから派生する任意の範囲の容積を有し得る。
ある特定の態様では、ＰＳＣ、例えばｉＰＳＣは、効率的な分化に適した細胞密度で播種される。一般に、細胞は、約１，０００～約７５，０００個の細胞／ｃｍ２の細胞密度、例えば約５，０００～約４０，０００個の細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される。６ウェルプレートでは、細胞はウェル当たり約５０，０００～約４０万個の細胞の細胞密度で播種され得る。例示的な方法では、細胞はウェル当たり約１０万個、約１５万個、約２０万個、約２５万個、約３０万個又は約３５万個、例えばウェル当たり約２０万（２００，００）個の細胞密度で播種される。
ＰＳＣ、例えばｉＰＳＣは、一般に、細胞の生存率を維持しながら細胞接着を促進するために、１つ以上の細胞接着タンパク質でコーティングされた培養プレート上で培養される。例えば、好ましい細胞接着タンパク質には、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、多能性細胞成長のための固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングするために使用され得るビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン及び／又はフィブロネクチンが含まれる。「細胞外マトリックス」という用語は、当技術分野で認識されている。その構成成分としては、以下のタンパク質の１つ以上：フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンドリン、エピリグリン、及びカリニンが挙げられる。例示的な方法では、ＰＳＣはビトロネクチン又はフィブロネクチンでコーティングされた培養プレート上で成長する。一部の実施形態では、細胞接着タンパク質はヒトタンパク質である。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、天然に由来するものであってく、ヒト又は動物の組織から精製されたものであってもよく、あるいはＥＣＭタンパク質は、遺伝子操作された組換えタンパク質又は本来合成タンパク質であってもよい。ＥＣＭタンパク質は、全タンパク質であっても、ペプチド断片の形態であってもよく、天然であっても操作されたものであってもよい。細胞培養のためのマトリックスにおいて有用であり得るＥＣＭタンパク質の例としては、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン及びビトロネクチンが挙げられる。一部の実施形態では、マトリックス組成物は、フィブロネクチンの合成的に生成されたペプチド断片又は組換えフィブロネクチンを含む。一部の実施形態では、マトリックス組成物は、ゼノフリーである。例えば、ヒト細胞を培養するためのゼノフリーマトリックスでは、ヒト起源のマトリックス成分を使用することができ、非ヒト動物の任意の構成成分は除外されてもよい。
一部の態様では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬであり得る。好ましい一部の実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬである。より好ましい実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬである。
細胞は、それぞれの特定の細胞集団の成長を指示するのに必要な栄養素を用いて培養することができる。一般に、細胞は、炭素源、窒素源及びｐＨを維持するための緩衝剤を含む成長培地中で培養される。培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤、及び無機塩類も含有し得る。例示的な成長培地は、様々な栄養素、例えば非必須アミノ酸及びビタミンを補充した最小必須培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地を含有して、幹細胞の成長を強化する。最小必須培地の例としては、以下に限定されるものではないが、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地、及びＦ１２培地が挙げられる。さらに、最小必須培地には、添加剤、例えばウマ、ウシ又はウシ胎仔血清が補充されていてもよい。あるいは、培地は無血清でもよい。他の場合には、成長培地は、本明細書において、未分化細胞、例えば幹細胞を培養して成長させる及び維持するために最適化された無血清製剤と称される「ノックアウト血清代替物」を含有してもよい。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００２／００７６７４７号に開示されている。好ましくは、ＰＳＣは十分に定義されたフィーダーフリー培地で培養される。
したがって、ＰＳＣは一般に、播種後、十分に定義された培養培地で培養される。ある特定の態様では、播種の約１８～２４時間後に培地を吸引し、新鮮な培地、例えばＥ８（商標）培地が培養に添加される。ある特定の態様では、単一細胞のＰＳＣは播種後約１、２又は３日間、十分に定義された培養培地中で培養される。好ましくは、単一細胞のＰＳＣは、分化プロセスを進める前に、十分に定義された培養培地中で約２日間培養される。
一部の実施形態では、培地は、血清に対する任意の代替物を含有してもよく、又は含有しなくてもよい。血清に対する代替物としては、アルブミン（例えば、脂質の豊富なアルブミン、アルブミン代替物、例えば組換えアルブミン、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール（ｔｈｉｏｌｇｉｙｃｅｒｏｌ）、又はこれらの等価物を適切に含有する材料を挙げることができる。血清に対する代替物は、例えば国際公開第ＷＯ９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製することができる。あるいは、より簡便には、市販の任意の材料を使用することができる。市販の材料としては、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＳＲ）、濃縮された化学的に定義された脂質（Ｇｉｂｃｏ）、及びＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
他の培養条件は適宜定義することができる。例えば、培養温度は約３０～４０℃、例えば少なくとも約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃とすることができるが、特にこれらに限定されるものではない。一実施形態では、細胞は３７℃で培養される。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、例えば約２～５％、又はそこから派生する任意の範囲であってもよい。酸素分圧は、少なくとも、最大、若しくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％、又はそこから派生する任意の範囲であってもよい。
Ｇ． ｉＰＳＣ又は分化細胞の凍結保存
本明細書に開示された方法によって生成された細胞は凍結保存することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第２０１２／１４９４８４ Ａ２号を参照されたい。細胞は、基質用いて又は用いないで凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、保存温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃の範囲、及びそれらの重複する範囲である。一部の実施形態では、より低い温度が、凍結保存細胞の保存（例えば、維持）のために使用される。いくつかの実施形態では、細胞を保存するために液体窒素（又は他の類似の液体冷却剤）が使用される。さらなる実施形態では、細胞は約６時間より長く保存される。追加の実施形態では、細胞は約７２時間保存される。いくつかの実施形態では、細胞は４８時間から約１週間保存される。さらに他の実施形態では、細胞は約１、２、３、４、５、６、７、又は８週間保存される。さらなる実施形態では、細胞は１、２、３、４、５、６７、８、９、１０、１１又は１２カ月間保存される。細胞はより長い時間保存することもできる。細胞は別個に、又は基質上、例えば本明細書に開示された基質のいずれかの上で凍結保存することができる。
一部の実施形態では、追加の凍結保護剤を使用することができる。例えば、細胞は、１つ以上の凍結保護剤を含む凍結保存溶液、例えばＤＭ８０、血清アルブミン、例えばヒト又はウシ血清アルブミン中で凍結保存することができる。ある特定の実施形態では、溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％のＤＭＳＯを含む。他の実施形態では、溶液は、約１％～約３％、約２％～約４％、約３％～約５％、約４％～約６％、約５％～約７％、約６％～約８％、約７％～約９％、又は約８％～約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はアルブミンを含む。具体的な実施形態では、溶液は２．５％のＤＭＳＯを含む。別の具体的な実施形態では、溶液は１０％のＤＭＳＯを含む。
細胞は、例えば、凍結保存の間、約１℃／分で分冷されてもよい。一部の実施形態では、凍結保存温度は約－８０℃～約－１８０℃、又は約－１２５℃～約－１４０℃である。一部の実施形態では、細胞は、約１℃／分で冷却される前に４℃まで冷却される。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に液体窒素の気相に移すことができる。一部の実施形態では、例えば、細胞が約－８０℃に達したら、液体窒素の保管場所に移す。凍結保存はまた、速度制御されたフリーザーを使用して行うこともできる。凍結保存された細胞は、例えば、約２５℃～約４０℃の温度で、典型的には約３７℃の温度で解凍されてもよい。
ＩＩＩ． 操作された細胞株の使用
ある特定の態様は、いくつかの重要な研究、開発、及び商業目的に使用することができる、安定した導入遺伝子発現を有する細胞株を生成する方法を提供する。
本明細書に開示された方法によって生成される細胞株は、当技術分野のｉＰＳＣ又は分化細胞で現在知られている任意の方法及び適用において使用することができる。例えば、細胞株で化合物の薬理学的又は毒物学的特性をアッセイすることを含む、化合物の評価方法が提供され得る。細胞培養物への効果について化合物を評価する方法であって、ａ）本明細書において提供される細胞培養物を化合物と接触させることと、ｂ）細胞培養物への化合物の効果をアッセイすることとを含む方法も提供される。
Ａ． 試験化合物のスクリーニング
細胞培養物は、このような細胞及びその様々な子孫の特性に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、低分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）又は環境条件（例えば、培養条件又は操作）をスクリーニングするために商業的に使用することができる。例えば、試験化合物は、化学化合物、低分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、又は他の生物学的薬剤であり得る。
一実施形態では、方法は、細胞培養物を試験薬剤と接触させることと、試験薬剤が集団内の細胞の活性又は機能をモジュレートするかどうかを決定することとを含む。一部の適用では、スクリーニングアッセイは、細胞増殖をモジュレートし、細胞分化を変化させ、又は細胞生存率に影響を及ぼす薬剤の同定に使用される。スクリーニングアッセイはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施され得る。候補薬剤をスクリーニングし同定する方法には、ハイスループットスクリーニングに好適なものが含まれる。例えば、細胞培養物を培養皿、フラスコ、ローラーボトル又はプレート（例えば、単一のマルチウェルディッシュ又はディッシュ、例えば８、１６、３２、６４、９６、３８４及び１５３６マルチウェルプレート又はディッシュ）上に、場合によって規定された位置で、潜在的治療分子の同定のために配置するか又は置くことができる。スクリーニングされ得るライブラリーには、例えば、低分子ライブラリー、ｓｉＲＮＡライブラリー、及びアデノウイルストランスフェクションベクターライブラリーが含まれる。
他のスクリーニング用途は、網膜組織の維持又は修復への医薬化合物の効果に対する試験に関する。スクリーニングは、化合物が細胞への薬理学的効果を有するように設計されているため、又は他の場所で効果を有するように設計された化合物が、この組織タイプの細胞に対して意図しない副作用を有する可能性があるため、行われ得る。
Ｂ． 治療及び移植
他の実施形態は、疾患又は障害の処置のための細胞株の使用も提供し得る。別の態様では、本開示は、それを必要とする個体の処置方法であって、操作された細胞を含む組成物を前記個体に投与することを含む方法を提供する。
治療薬投与のための細胞組成物の適性を決定するために、細胞を最初に好適な動物モデルで試験することができる。一態様では、細胞株はｉｎ ｖｉｖｏで生存し、その表現型を維持する能力について評価される。組成物は免疫不全動物（例えば、ヌードマウス又は化学的若しくは放射線照射により免疫不全にした動物）に移植される。一定期間成長した後に組織を採取し、多能性幹細胞由来の細胞がまだ存在しているかどうかを評価する。
本明細書で使用される場合、疾患又は障害は、例えば感染又は遺伝的欠陥に起因し、同定可能な症状によって特徴付けられる、生物における病理学的状態を指す。本明細書に記載されている例示的な疾患は、新生物疾患、例えばがんである。本明細書で使用される場合、新生物疾患は、腫瘍の発生、成長、転移及び進行を含む、がんに関与する任意の障害を指す。
本明細書で使用される場合、がんは、転移性がん、リンパ系腫瘍、及び血液がんを含む、あらゆる種類の悪性腫瘍によって引き起こされる、又はそれによって特徴付けられる疾患に関する用語である。例示的ながんとしては、以下に限定されるものではないが、白血病、リンパ腫、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、神経膠腫腫瘍、腺癌、肝臓がん及び皮膚がんが挙げられる。ヒトにおける例示的ながんとしては、膀胱腫瘍、***腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳及びＣＮＳがん（例えば、グリオーマ腫瘍）、子宮頸がん、絨毛癌、結腸及び直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん；子宮内膜がん、食道がん；眼のがん；頭頸部のがん；胃癌；上皮内新生物；腎臓がん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞がん及び非小細胞がん）；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫；黒色腫；骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん（例えば、***、舌、口腔、及び喉頭）；卵巣がん、膵臓がん、網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん、腎がん、呼吸器系のがん；肉腫、皮膚がん；胃がん；精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、泌尿器系のがん、並びに他の癌腫及び肉腫が挙げられる。イヌ、ネコ、及び他のペットで通常診断される例示的ながんとしては、以下に限定されるものではないが、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、気管支肺腺癌、線維腫、粘軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、ミクログリオーマ、神経芽細胞腫、破骨細胞腫、口腔新生物、線維肉腫、骨肉腫及び横紋筋肉腫、生殖器扁平上皮癌、伝達性性器腫瘍、精巣腫瘍、セミノーマ、セルトリ細胞腫瘍、血管外皮腫、組織球腫、クロローマ（例えば、顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平上皮癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副腎癌、口腔乳頭腫症、血管内皮腫及び嚢胞腺腫、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫及び肺扁平上皮癌が挙げられる。フェレットなどのげっ歯類で診断される例示的ながんには、以下に限定されるものではないが、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経鞘腫、膵島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫及び胃腺癌が含まれる。農業家畜に影響を及ぼす例示的な新生物としては、以下に限定されるものではないが、白血病、血管外皮細胞腫及びウシ（ｂｏｖｉｎｅ）眼球新生物（ウシ（ｃａｔｔｌｅ）の場合）；前庭線維肉腫、潰瘍性扁平上皮癌、前庭癌、結合組織新生物及び肥満細胞腫（ウマの場合）；肝細胞癌（ブタの場合）；リンパ腫及び肺腺腫症（ヒツジの場合）；肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、網状内皮細胞腫、線維肉腫、腎芽細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ性白血病（鳥類種の場合）；網膜芽細胞腫、肝新生物、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞性白血病及び浮袋の肉腫（ｓｗｉｍｂｌａｄｄｅｒ ｓａｒｃｏｍａ）（魚類の場合）、乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）：ヒツジ偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）という細菌によって引き起こされるヒツジ及びヤギの慢性の感染性の接触伝染病、並びにヤーグジークテによって引き起こされるヒツジの接触伝染性肺腫瘍が挙げられる。
本明細書に開示された方法によって生成される細胞株の医薬組成物も提供される。これらの組成物は、少なくとも約１×１０３個の細胞、約１×１０４個の細胞、約１×１０５個の細胞、約１×１０６個の細胞、約１×１０７個の細胞、約１×１０８個の細胞、又は約１×１０９個の細胞を含み得る。ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書に開示された方法によって生成される分化細胞を含む実質的に精製された調製物である。足場、例えばポリマー担体及び／又は細胞外マトリックス、並びに本明細書に開示された方法によって生成される細胞有効量を含む組成物も提供される。マトリックス材料は一般に生理学的に許容され、ｉｎ ｖｉｖｏ適用での使用に好適である。例えば、生理学的に許容される材料としては、以下に限定されるものではないが、吸収性及び／又は非吸収性の固体マトリックス材料、例えば小腸粘膜下層（ＳＩＳ）、架橋又は非架橋アルギネート、親水コロイド、発泡体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、フリース及び生体接着剤が挙げられる。
好適なポリマー担体には、合成ポリマー又は天然ポリマーから形成される多孔性メッシュ又はスポンジ、及びポリマー溶液も含まれる。例えば、マトリックスはポリマーメッシュ若しくはスポンジ、又はポリマーヒドロゲルである。使用され得る天然ポリマーには、タンパク質、例えばコラーゲン、アルブミン、及びフィブリン；多糖類、例えばアルギネート及びヒアルロン酸が含まれる。合成ポリマーには、生分解性ポリマーと非生分解性ポリマーの両方が含まれる。例えば、生分解性ポリマーには、ヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及びポリ乳酸－グリコール酸（ＰＧＬＡ）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、及びこれらの組合せが含まれる。非生分解性ポリマーには、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレン酢酸ビニル、及びポリビニルアルコールが含まれる。
イオン性又は共有結合で架橋された、可鍛性のヒドロゲルを形成できるポリマーを使用することができる。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然又は合成）が共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋され、水分子を捉えてゲルを形成する三次元の開格子構造を創出する場合に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用され得る材料の例としては、イオン結合で架橋される多糖類、例えばアルギネート、ポリホスファジン、及びポリアクリレート、又はブロックコポリマー、例えばそれぞれ、温度又はＨによって架橋されているＰＬＵＲＯＮ１ＣＳ（商標）又はＴＥＴＲＯＮ１ＣＳ（商標）、ポリエチレンオキシド－ポリプロピレングリコールブロックコポリマーが挙げられる。他の材料としては、タンパク質、例えばフィブリン、ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸及びコラーゲンが挙げられる。
Ｃ． 市販目的、治療目的、及び研究目的の区分
一部の実施形態では、製造、区分又は使用中の任意の時間に存在する細胞のセット若しくは組合せを含む試薬システムが提供される。培養セットは、多くの場合同じゲノムを共有する未分化多能性幹細胞又は他の分化細胞型と組み合わせた、本明細書に記載の細胞集団の任意の組合せを含む。各細胞型は、同一施設内、又は異なる場所、同時期又は異なる時期に、同一事業体又は事業関係を共有する異なる事業体の管理下で、一緒に、又は別々の容器にパッケージングされてもよい。
医薬組成物は、場合によって、所望の目的、例えば、疾患又は組織の傷害を改善するための細胞機能の再構成についての書面の使用説明書とともに好適な容器内にパッケージングされてもよい。
［実施例］
ＩＶ． 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示される技法は、本発明の実践において良好に機能することが本発明者によって発見された技法を表すものであり、したがって、その実践のための好ましい様式を構成するものと考えることができることを、当業者は認識すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態において多くの変更を加えることができ、それでもなお、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
［実施例１］
遺伝子サイレンシングを防止するためのコドン最適化
メチル化が導入遺伝子のサイレンシングの原因であるかどうかを試験するために、サイレンシングされていることが知られている（例えば、ＧＦＰ）又はサイレンシングされていると推測される（例えば、ＰｕｒｏＲ及びＮｅｏＲ）遺伝子のコード領域から、すべてのＣｐＧモチーフを除去した。目視検査が容易なため、ＷＴ ＡｃＧＦＰ１とＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１とを比較して、このコンセプトを厳密に試験した。配列番号１３と配列番号１４の間で、ＣｐＧモチーフ除去後のアミノ酸配列に変化はなかった。
ＡｃＧＦＰ１ ＤＮＡ配列（配列番号１３）：
atggtgagcaagggCGcCGagctgttcacCGgcatCGtgcccatcctgatCGagctgaatggCGatgtgaatggccacaagttcagCGtgagCGgCGagggCGagggCGatgccacctaCGgcaagctgaccctgaagttcatctgcaccacCGgcaagctgcctgtgccctggcccaccctggtgaccaccctgagctaCGgCGtgcagtgcttctcaCGctacccCGatcacatgaagcagcaCGacttcttcaagagCGccatgcctgagggctacatccaggagCGcaccatcttcttCGaggatgaCGgcaactacaagtCGCGCGcCGaggtgaagttCGagggCGataccctggtgaatCGcatCGagctgacCGgcacCGatttcaaggaggatggcaacatcctgggcaataagatggagtacaactacaaCGcccacaatgtgtacatcatgacCGacaaggccaagaatggcatcaaggtgaacttcaagatcCGccacaacatCGaggatggcagCGtgcagctggcCGaccactaccagcagaatacccccatCGgCGatggccctgtgctgctgccCGataaccactacctgtccacccagagCGccctgtccaaggaccccaaCGagaagCGCGatcacatgatctacttCGgcttCGtgacCGcCGcCGccatcacccaCGgcatggatgagctgtacaagTAA
ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１ ＤＮＡ配列（配列番号１４）：
ATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATCGTGCCCATCCTGATCGAGCTGAATGGCGATGTGAATGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCTGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCTCACGCTACCCCGATCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCTGAGGGCTACATCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCGAGGATGACGGCAACTACAAGTCGCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGATACCCTGGTGAATCGCATCGAGCTGACCGGCACCGATTTCAAGGAGGATGGCAACATCCTGGGCAATAAGATGGAGTACAACTACAACGCCCACAATGTGTACATCATGACCGACAAGGCCAAGAATGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGATGGCAGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAATACCCCCATCGGCGATGGCCCTGTGCTGCTGCCCGATAACCACTACCTGTCCACCCAGAGCGCCCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGATCTACTTCGGCTTCGTGACCGCCGCCGCCATCACCCACGGCATGGATGAGCTGTACAAG
目的の遺伝子のＤＮＡ配列は、１）稀ではない、２）モノヌクレオチドストレッチのストレッチを生成しない及び３）遺伝子のＷＴバージョンと類似するＧＣ含量の％を維持するコドンに置き換わるすべてのＣＧモチーフを除去するように細心の注意を払って改変された。例えば、ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１の場合、ＷＴバージョンのＡｃＧＦＰ１（配列番号１３）はＧＣ含量が５９％であり、新しいＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１（配列番号１４）はＧＣ含量が５２％である。
ＥＥＦ１Ａ１プロモーターを、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座におけるｉＰＳＣでのＡｃＧＦＰ１の発現に使用した。ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１をＷＴ ＡｃＧＦＰ１と比較して試験したところ、タンパク質コード配列中のＣｐＧを除去することにより、遺伝子発現のサイレンシングが克服されることが明らかになった（図３）。
しかし５カ月後、ＡｃＧＦＰ１からＣｐＧが除去されているにもかかわらず、ＧＦＰを発現しない細胞がごくわずかのパーセンテージ（３％）検出された。この集団を調査するために、ＧＦＰ発現のないクローンを単一細胞選別によって単離した。この細胞を、クロマチン構造を除去し脱メチル化を誘導することが可能なヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）で処理した。ＮａＢｕｔ処理により、ＧＦＰ発現が用量依存的に再活性化されることが観察された（図５）。
ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１ ｉＰＳＣを肝細胞又はニューロンに分化させたところ、高いパーセンテージでＧＦＰ陽性の分化細胞が観察された（図６）。
結果を検証するために、ｐＵＣ５７－ＫａｎＲ（ｍ）中のＰｕｒｏＲｖ１（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎのアミノ酸配列に基づいて合成した）のコドン最適化を実施した。ＰｕｒｏＲのＣｐＧを含まない配列（配列番号１５）を以下に示す。
プラスミド１３４６のＣｐＧを含まないＰｕｒｏＲ：
ATGACTGAATACAAACCAACTGTTAGACTGGCAACTAGAGATGATGTTCCAAGAGCAGTTAGAACCCTGGCTGCTGCATTTGCTGACTACCCTGCAACCAGACACACTGTGGACCCAGACAGACACATTGAAAGAGTGACTGAACTGCAGGAGCTGTTCCTGACCAGAGTGGGCCTGGACATTGGCAAAGTGTGGGTGGCAGATGATGGTGCTGCTGTGGCAGTGTGGACCACCCCTGAATCTGTTGAAGCTGGTGCAGTGTTTGCTGAGATTGGCCCAAGAATGGCAGAACTGTCTGGCAGCAGACTGGCAGCACAACAGCAGATGGAAGGTCTGCTGGCACCACACAGACCAAAAGAACCTGCTTGGTTCCTGGCAACTGTGGGTGTGAGCCCTGACCACCAGGGTAAGGGCCTGGGCTCTGCAGTGGTGCTGCCTGGTGTGGAAGCAGCTGAAAGAGCAGGTGTGCCTGCTTTCCTGGAGACCTCAGCTCCAAGAAACCTGCCTTTCTATGAAAGACTGGGCTTCACTGTGACTGCTGATGTGGAAGTGCCAGAAGGCCCAAGAACTTGGTGCATGACTAGAAAACCAGGTGCTTGATAATGA（配列番号１５）
プラスミド１３４７及び１３６３におけるＣｐＧを含まないＰｕｒｏＲｖ２：
ATGACTGAATACAAACCAACTGTTAGACTGGCAACTAGAGATGATGTTCCAAGAGCAGTTAGAACCCTGGCTGCTGCATTTGCTGACTACCCTGCAACCAGACACACTGTGGACCCAGACAGACACATTGAAAGAGTGACTGAACTGCAGGAGCTGTTCCTGACCAGAGTGGGCCTGGACATTGGCAAAGTGTGGGTGGCAGATGATGGTGCTGCTGTGGCAGTGTGGACCACCCCTGAATCTGTTGAAGCTGGTGCAGTGTTTGCTGAGATTGGCCCAAGAATGGCAGAACTGTCTGGCAGCAGACTGGCAGCACAACAGCAGATGGAAGGTCTGCTGGCACCACACAGACCAAAAGAACCTGCTTGGTTCCTGGCAACTGTGGGTGTGAGCCCTGACCACCAGGGTAAGGGCCTGGGCTCTGCAGTGGTGCTGCCTGGTGTGGAAGCAGCTGAAAGAGCAGGTGTGCCTGCTTTCCTGGAGACCTCAGCTCCAAGAAACCTGCCTTTCTATGAAAGACTGGGCTTCACTGTGACTGCTGATGTGGAATGCCCAAAGGACAGAGCAACTTGGTGCATGACTAGAAAACCAGGTGCTTGATAATGA（配列番号１６）
ＣｐＧを含まないＰｕｒｏＲカセットを電気穿孔によってｉＰＳＣに導入した。ＣｐＧを含まないＰｕｒｏＲｖ１及びＰｕｒｏＲｖ２を有する細胞が、薬物耐性を付与できることが観察された。
これらの結果は、ＣｐＧがｉＰＳＣ株における導入遺伝子のサイレンシングに重要な役割を果たすことを示唆する。さらに、これらの結果は、全体的なメチル化又は他のエピジェネティックな調節不全が、分化不全を起こしたｉＰＳＣにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。よって、ＣｐＧモチーフの一部又はすべてを除去する最適化の本発明の方法は、導入遺伝子のサイレンシングを防ぐために使用することができる。
［実施例２］
ＣｐＧ最適化ｉＰＳＣの分化
ＣｐＧを含まないＡｃＧＦＰ１及びｍＲＦＰ１をトランスフェクトしたｉＰＳＣは、培養中何継代にもわたって蛍光色素を構成的に発現し続けた。次のステップは、操作したｉＰＳＣから始原細胞及び最終段階の系統にｉＰＳＣが分化する際の蛍光色素の保持を確認することであった。ＣｐＧを含まないプラスミドをトランスフェクトした操作したｉＰＳＣは、内皮細胞、造血細胞、マクロファージ及びミクログリアの純粋な集団をうまく生成することが示された。
９６５０ ＧＦＰ ｉＰＳＣからのｉＰＳＣ由来内皮細胞の生成：未分化の９６５０－ＧＦＰは、Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上で維持し、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応させたｉＰＳＣであった。内皮細胞の分化を開始させるため、サブコンフルエントになったｉＰＳＣを採取し、低酸素条件下で５ｕＭのブレビスタチン又は１ｕＭのＨ１１５２を補充したＳｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ（ＳＦＤ）培地（表５）の存在下、ピュアコートアミン培養皿に２５万個の細胞／ウェルの密度で播種した。播種の２４時間後に、細胞を、ＳＦＤＥＢ＃１培地として知られる（表７）、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ－ｂを補充したＳＦＤ培地中に置いた。細胞を４８時間ごとに４～６日間供給して、血液内皮始原細胞を生成した。これらの始原細胞を凍結保存するか又は組織培養処理したプラスチック表面に、正常酸素条件下で１０ｋ／ｃｍ２の密度で再度播種して、Ｈ１１５２を含むＳＦＤベースの内皮細胞培地（表７）の存在下で内皮細胞分化を開始させることができる。
例示的な方法では、凍結保存した６日目の血液内皮細胞又は生培養物を、１ｕＭのＨ１１５２を含むＳＦＤベースの内皮細胞培地の存在下、正常酸素条件下で、組織培養処理したプラスチック表面に１０ｋ／ｃｍ２で播種した。細胞には、播種の２４時間後に新鮮な内皮細胞培地を供給し、コンフルエントに達するまで４８時間ごとに供給した。細胞がコンフルエントに達するには培養で５～６日かかった。細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して採取し、表面内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１０５及びＣＤ１４４を染色し、内皮細胞培地とともに１０ｋ／ｃｍ２の組織培養処理プラスチック上に再度播種し、正常酸素インキュベーター条件下に置いて、内皮細胞の純粋な集団を拡大し、増殖させた。
ＧＦＰで操作した９６５０及びＲＦＰで操作した８７１７のｉＰＳＣからの造血始原細胞（ＨＰＣ）の生成：Ｅ８の存在下、マトリゲル又はビトロネクチン上で維持したＧＦＰで操作した９６５０及びＲＦＰで操作した８７１７ ｉＰＳＣを、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応させた。サブコンフルエントになったｉＰＳＣから細胞を分割し（ｓｐｌｉｔ）、５ｕＭのブレビスタチン又は１ｕＭのＨ１１５２を補充したＳｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ（ＳＦＤ）培地の存在下で、スピナーフラスコに２５～５０万個の細胞／ｍｌの密度で播種した。播種の２４時間後に、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を交換した。分化プロセスの５日目に、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６と１０Ｕ／ｍｌのヘパリンとを含有する培地中に置いた。細胞は、分化プロセスを通して４８時間ごとに供給した。すべてのプロセスは低酸素条件下で実施した。ＨＰＣの純度は、ＣＤ４及びＣＤ３４の発現の定量によって決定した。プロセスの概要を図１４に示す。ＨＰＣを、ＣＤ３４抗体を使用する磁気選別によってさらに精製した。
ＨＰＣの純度は１２日目から開始して評価し、図１４Ａに概略を示すように、ＣＤ３４発現が２０％を超えるまで続けた。分化ＨＰＣ培養物はＧＦＰの発現を保持した。図１４Ｂ。９６５０株のＣＤ３４＋ ＭＡＣＳ精製を１５日目に実施した。ＲＦＰで操作した８７１７株は、ＨＰＣの生成効率が低いことが明らかになった。それにもかかわらず、培養液は分化プロセスを通してＲＦＰの発現を保持した。１７日目に、培養物の半分を消化し、ミクログリア分化のために播種し、残りの半分はマクロファージ分化のために凝集体として維持した。両株のプロセスの効率は図１５で見ることができる。
ミクログリアの生成：精製したＨＰＣを正常酸素条件下でミクログリア分化培地（ＭＤＭ）中に置いた。培養物を４８時間ごとに２Ｘ ＭＤＭを使用して供給し、分化プロセスは２３日後に終了した。このプロセスの概略を図１６に示す。ミクログリアの分化プロセスにおける細胞の形態及び蛍光は、図１７Ａ及び図１７Ｂで観察することができる。ＨＰＣからミクログリアへのプロセスの効率は図１８で見ることができる。
最終段階のミクログリア培養物の純度を評価した。フローサイトメトリーよるＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２及びＣＤ１１ｂの細胞表面発現、並びにＰＵ．１、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１及びＴＭＥＭ１１９の細胞内発現（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。
マクロファージの生成：マクロファージの分化は、ＨＰＣ分化の１７日目に８７１７－ＲＦＰ株を用いて開始した。ＨＰＣからのマクロファージプロセスの概要を図２０に示す。分化のこの部分の培地の編集物を表１１に記載している。２０日目に、凝集体を消化し、ＣＭＰ培地に播種した。この時点で培養を正常酸素環境に変えた。１週間後に、培養をマクロファージ培地に変え、その後４日ごとに２倍のマクロファージ培地を供給した。ＣＤ６８の純度を４４日目及び５１日目に評価し、図２１に示す。５２日目に細胞を採取し、凍結保存した。細胞の形態及び蛍光は図２２で見ることができる。ＨＰＣからマクロファージへのプロセスの効率は図２３に記載されている。フローサイトメトリーで測定した、ｉＰＳ細胞からＨＰＣ、ミクログリア及びマクロファージへの蛍光強度を図２４で実証する。
８７１７－ＲＦＰ及び９６５０－ＧＦＰで操作したｉＰＳＣからの神経前駆細胞（ＮＰＣ）の生成：神経始原細胞（ＮＰＣ）は、ニューロン及びグリアを生成する能力を有する自己再生始原細胞である（Ｂｒｅｕｎｉｇら、２０１１年）。初代神経細胞及びｉＰＳＣからＮＰＣを生成するプロトコールは数多く確立されており、その効率は様々である（Ｓｈｉら、２０１２ａ、Ｓｈｉら、２０１２ｂ）。最近のプロトコールのほとんどは、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の阻害に依拠している。本発明の方法は、デュアルＳＭＡＤ阻害経路を使用することなく、外胚葉へ向かうｉＰＳＣの自然ドリフトを利用して、異なるｉＰＳＣ株間でＮＰＣを生成する簡単なプロトコールについて説明する。デュアルＳＭＡＤ阻害を使用せずにｉＰＳＣから神経前駆細胞（ＮＰＣ）を生成する方法の概略説明。関与する様々なステップ、及び使用される培地の組成は、図２５に記載されている。簡単に説明すると、エピソームによりリプログラミングしたｉＰＳＣ株、８７１７－ＲＦＰ及び９６５０－ＧＦＰを、マトリゲル／ラミニン／ビトロネクチンをコーティングしたプレート及びＥ８培地上で維持した。ｉＰＳＣを、ＮＰＣを生成するための分化の開始前に、低酸素条件下で維持した。神経前駆体の分化を開始させるために、ｉＰＳＣを採取し、Ｅ８培地を使用して、ロック阻害剤の存在下で、マトリゲル、ラミニン又はビトロネクチンプレート上に１５Ｋ／ｃｍ２で播いた。細胞を、ロック阻害剤の非存在下で、次の４８時間、新鮮なＥ８培地中に置いた。次のステップは、３μＭのＣＨＩＲを補充したＤＭＥＭＦ１２培地中に、７２時間、正常酸素条件下で毎日培地を交換しながらｉＰＳＣ培養物を置くことを含むプレコンディショニングステップを伴った。細胞を、プレコンディショニングステップ終了時に採取し、３０Ｋ／ｃｍ２でマトリゲル、ラミニン、若しくはビトロネクチンプレートに２Ｄフォーマットで再度播種するか、又はＵｌｔｒａ ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（ＵＬＡ）プレート若しくはスピナーフラスコを使用し、ロック阻害剤の存在下で、３０万個の細胞／ｍｌの密度で３Ｄ凝集体を生成した。培養物に１日おきにＮ２を補充したＥ６培地を、その後８日間、正常酸素条件下で供給した。分化プロセスを通したＧＦＰ及びＲＦＰの蛍光の保持が図２６に捉えられている。分化１４日目に培養物を採取し、ＴｒｙｐＬＥを使用して個別化した。細胞を、細胞表面染色により、ＳＳＥＡ４、ＣＤ５６、ＣＤ１５の存在について染色した。ＮＰＣの純度の定量を図２７に示す。ＣＤ５６を、この方法によって得られたＮＰＣのマーカーとして使用した。細胞を、ＣＳ１０を使用して凍結保存し、これらは、解凍後も純度及び増殖能を保持していた。
神経前駆細胞からのＧＡＢＡ作動性ニューロンの生成：ＮＰＣの効力は、ＮＰＣを解凍し、細胞を図２８に概説した分化経路を辿らせることによって試験した。簡単に述べると、ＮＰＣはＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成するための下流分化プロトコールに供した。ＮＰＣを解凍し、Ｎ２とＮＥＡＡを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２に０．３ｅ６個／ｍＬで１０μＭのブレビスタチンの存在下で２４時間播き、凝集体を形成させた。培養物には、Ｎ２とＮＥＡＡとを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２と、ソニックヘッジホッグシグナル伝達分子（ＳＨＨ）及びプルモルファミンをそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬ及び１．５μＭを含む完全培地と、１０日間毎日交換して与えた。ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２、ＮＥＡＡ、及び１０μＭのブレビスタチンを使用してＰＬＯ－ラミニンをコーティングしたプレートに２０万個／ｃｍ２で２４時間播種される前に、次の４８時間培養では、培養物に、Ｎ２、ＮＥＡＡ、及び５μＭのＤＡＰＴを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２を供給した。培養物には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２、ＮＥＡＡ、及び５μＭのＤＡＰＴをその後１日おきに供給し、播種の５日後に採取した。ＧＡＢＡニューロンの出現培養における蛍光の保持を図２９に示す。ｉＰＳＣ段階から１８日目のＧＡＢＡニューロン分化までのＧＦＰ及びＲＦＰの強度の定量化を図３０に捉えている。最後に、ネスチン及びβ－チューブリン３の純度を定量することによって、最終段階のＧＡＢＡニューロンの純度を図３１に示した。これらの細胞分化は、ＣｐＧ最適化ｉＰＳＣが、これらに限定されるものではないが、上記のものを含む複数の細胞型に分化し得ることを示した。
［実施例３］
安定した発現のためのプロモーター
ｉＰＳＣ株における安定した導入遺伝子の発現は、時間及び分化後にわたって実現することが困難であった。多くのプロモーターは、サイレンシング又は可変的な発現を示し、以前の研究では、プロモーター、例えばＰＧＫ及びＥＥＦ１Ａ１でこのことが示されている。以下の研究は、ｉＰＳＣと分化細胞型の両方で安定した発現をもたらすために使用することができるプロモーター又はタグ付け可能な遺伝子の遺伝子座を同定するために行われた。ＤＮＡのメチル化が大きく変化し、発現に影響を及ぼすのは、分化プロセスの間であることが多く、よって、最良のプロモーターは、***している細胞と、細胞***がほとんどない静止細胞（例えば、成熟した、完全に分化した心筋細胞）の両方で活性である必要がある。
クローニングされるプロモーター：以下のプロモーターは、すべての細胞型において構成的発現の候補となりそうなものとして同定された。いくつかは既存のプラスミドからクローニングした（ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＵＢＣ－バージョン１、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ）。その他の領域は、ｉＰＳＣと分化細胞の両方で安定した発現をもたらすプロモーターを同定する目的で、（ゲノムＤＮＡからＰＣＲで、又は合成によって）新たに作製した。新しいプロモーターには、ＲＰＳ１９、ＵＢＡ５２、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＵＢＣの拡大領域（バージョン２）、ＵＢＢ、ＲＰＳＡ、ＮＡＣＡ、及びＣＯＸ８Ａが含まれる。配列はｐＧＬ３プラスミドベクター（ＭｌｕＩとＮｃｏＩの制限部位間でＳＶ４０プロモーターを置き換える）にクローニングして、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する際のプロモーター強度の比較を可能にした。
一過的トランスフェクション中のルシフェラーゼ発現：ｉＰＳＣへのプロモーター－ｐＧＬ３プラスミドの一過的トランスフェクションを実施して、発現の強さを決定した。９６ｗｐフォーマットを使用して、５０ｕＬのＥ８培地＋１０ｕＭのブレビスタチンを各ウェルに添加した。各プラスミドを、１６．５ｕＬの以下の試薬調製物を添加して３連でアッセイした。ｉＰＳＣ株０１２７９．１０７の６ｗｐの１ウェルを、アキュターゼを使用して採取し、３．５ｍＬのＥ８培地＋１０ｕＭのブレビスタチンに再懸濁させ、各ウェルに５０ｕＬを添加した。一日後、細胞をＤｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアッセイした。
正規化したルシフェラーゼ（ホタル／ウミシイタケ比、ＥＥＦ１Ａ１＝１００％に対して正規化した）を以下に示す（ＨＳＰ９０ＡＢ１ｄｅｌ４００プロモーター及びＨＳＰ９０ＡＢ１プロモーターはＥＥＦ１Ａ１のおよそ６６％及び７５％を発現させた）。ＰＧＫプロモーターのレベル以上の発現値が望まれたので、ＲＰＳ１９、ＵＢＡ５２、ＨＳＰ９０ＡＢ１、及びＵＢＣをさらなる研究のために選択した。
ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座に組み込まれたＺｓＧｒｅｅｎ構築物：候補プロモーターよって駆動された長期発現を染色体に関連して調査するために、候補プロモーターを、ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質を制御するプラスミドにクローニングし、ヒトｉＰＳＣの第１９染色体上のＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座に標的化した（プラスミドデザインを、ＣＡＧプロモーターを例として使用して以下に示す）。プラスミドをＣＲＩＳＰＲに媒介される遺伝子編集によりｉＰＳＣ株０１２７９．１０７に組み込み、ピューロマイシン選択を適用し、耐性コロニーを摘出し、ＰＣＲにより遺伝子型を決定した。正しく標的化されたヘテロ接合性クローンを拡大した。
構成的発現をもたらすタグ付けに好適なゲノム遺伝子座：セーフハーバーからのプロモーターに駆動される発現に加えて、ほとんどの細胞型で発現する特定の遺伝子にレポーター遺伝子をタグ付けして、構成的発現を得ることができる。ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６という遺伝子を評価用に選択し、ＴＡＬＥＮに媒介される遺伝子編集によってＺｓＧｒｅｅｎ及びＦ２Ａ切断配列でタグ付けした。正しく標的化されたヘテロ接合性クローンを拡大した。
ｉＰＳＣにおけるＺｓＧｒｅｅｎ発現：ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質を発現する操作したｉＰＳＣ株の培養を最長７カ月間維持し（Ｅ８培地／ビトロネクチンをコーティングしたプレート）、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６機器（ＢＤ）でフローサイトメトリーを使用して緑色発現を定期的にチェックした。８月の時点で多くの細胞で蛍光の低下を示したＲＰＳ１９プロモータークローンの１つ（５３６３）を除けば、ほとんどのクローンは経時的に一貫したフロープロファイルを維持した。
分化：分化後の発現の安定性を決定するために、操作された株を、神経細胞型又は心臓細胞型のいずれかに誘導する分化プロトコールに供した。
分化２１日目に、すべての細胞が目に見えるニューロン表現型を有した。フローサイトメトリーは、多くの細胞で、ＣＡＧ、ＵＢＣ（ｖ１）、及びＨＳＰ９０ＡＢ１ｄｅｌ４００プロモーターの蛍光が減退していることを示した。ＵＢＣｖ２、ＵＢＡ５２、及びＲＰＳ１９プロモーターは、タグ遺伝子ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６と同様に、タイトで安定した発現を示した。
分化２１日目に、ＣＡＧ、ＵＢＣ（ｖ１）、ＲＰＳ１９、及びＨＳＰ９０ＡＢ１ｄｅｌ４００プロモーター株は、様々な量の発現のサイレンシングを示した。ＵＢＣ（ｖ２）及びＵＢＡ５２プロモーターは、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６のタグ付き遺伝子と同様に、タイトで安定した発現を示した。
新たに生成したプロモーター領域ＵＢＣｖ２、ＵＢＡ５２、ＲＰＳ１９、及びＨＳＰ９０ＡＢ１ｄｅｌ４００は、培養４カ月にわたり、７カ月まで安定したｉＰＳＣ発現を示したが、ＲＰＳ１９だけはこの時点で若干のサイレンシングを示した。ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６遺伝子の遺伝子座では、タグ付きＺｓＧｒｅｅｎレポーターの安定した発現が示された。ＵＢＣｖ２及びＵＢＡ５２レポーターは、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６遺伝子から誘導される発現と同様に、２つの分化プロトコール下で安定であることが示された。
本明細書において開示され、特許請求されるすべての方法は、本開示に照らして過度の実験を行うことなく成し遂げられ、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法のステップ又はステップの順序において、本方法に変更を適用し得ることは、当業者には明らかであろう。より詳細には、化学的及び生理学的に関連するある特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えても、同じ又は類似の結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の代替物及び改変はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
参照文献
以下の参照文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Claims (102)

  1. 少なくとも１つの導入遺伝子を発現するように操作された単離された細胞株であって、少なくとも１つの導入遺伝子が、（ａ）配列番号１～１２若しくは１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロモーターの制御下にある、（ｂ）ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある、及び／又は（ｃ）ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされる、細胞株。
  2. 少なくとも１つの導入遺伝子が、（ａ）配列番号１～１２若しくは１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロモーターの制御下にある、及び／又は（ｂ）ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある、請求項１に記載の細胞株。
  3. 少なくとも１つの導入遺伝子が、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされている、請求項２に記載の細胞株。
  4. ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列が、配列番号１４又は配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３に記載の細胞株。
  5. ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列が、配列番号１４又は配列番号１６である、請求項３に記載の細胞株。
  6. 少なくとも１つの導入遺伝子が、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされており、配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも少なくとも９０％の配列同一性を有するプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の細胞株。
  7. 少なくとも１つの導入遺伝子が、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされており、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある、請求項１に記載の細胞株。
  8. 少なくとも１つの導入遺伝子が、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされており、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６からなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある、請求項１に記載の細胞株。
  9. 細胞株が、少なくとも第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子を発現するように操作されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞株。
  10. 第１の導入遺伝子が、配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロモーターの制御下にあり、第２の導入遺伝子が、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、及びＵＢＣからなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある、請求項９に記載の細胞株。
  11. 第１の導入遺伝子が、配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロモーターの制御下にあり、第２の導入遺伝子が、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、及びＭＹＬ６からなる群から選択される内因性遺伝子の制御下にある、請求項９に記載の細胞株。
  12. 第１の導入遺伝子及び／又は第２の導入遺伝子が、ＣｐＧモチーフを除去して安定した発現をもたらすように改変された配列によってコードされている、請求項９又は１１に記載の細胞株。
  13. ＣｐＧモチーフの少なくとも５０パーセントが除去されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞株。
  14. ＣｐＧモチーフの少なくとも７０パーセントが除去されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞株。
  15. ＣｐＧモチーフの少なくとも９０パーセントが除去されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞株。
  16. ＣｐＧモチーフのすべてが除去されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の細胞株。
  17. ＣｐＧモチーフのコドンが、稀ではない及び／又はモノヌクレオチドストレッチを生じないコドンで置き換えられている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞株。
  18. ＣｐＧモチーフのコドンが、表１の対応するコドンで置き換えられている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞株。
  19. 細胞株が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の細胞株。
  20. 導入遺伝子が、レポーター遺伝子又は選択マーカーである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞株。
  21. 少なくとも１つの導入遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞株。
  22. レポーター遺伝子が蛍光タンパク質である、請求項２１に記載の細胞株。
  23. レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項２１に記載の細胞株。
  24. 少なくとも１つの導入遺伝子が選択マーカーである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞株。
  25. 選択マーカーが、ピューロマイシン、ネオマイシン、又はブラスチシジンである、請求項２４に記載の細胞株。
  26. 少なくとも１つの導入遺伝子が自殺遺伝子である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞株。
  27. 少なくとも１つの導入遺伝子が、チミジンキナーゼ、ＴＥＴ、又は筋芽細胞決定タンパク質１（ＭＹＯＤ１）である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の細胞株。
  28. 細胞株が、６カ月を超えて、導入遺伝子の安定した発現を有する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の細胞株。
  29. 少なくとも１つの導入遺伝子が発現カセットによってコードされている、請求項１から２８のいずれか一項に記載の細胞株。
  30. 少なくとも１つの導入遺伝子が、電気穿孔又はリポフェクションによって細胞株に導入されている、請求項１から２９のいずれか一項に記載の細胞株。
  31. 発現カセットが、ゲノムセーフハーバー部位に挿入されている、請求項１から３０のいずれか一項に記載の細胞株。
  32. ゲノムセーフハーバー部位が、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子座又はＲＯＳＡ遺伝子座にある、請求項３１に記載の細胞株。
  33. プロモーターが、配列番号２、３、４、６、又は１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の細胞株。
  34. プロモーターが、配列番号２、３、４、６、又は１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の細胞株。
  35. プロモーターが、配列番号２、３、４、６、又は１７を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の細胞株。
  36. プロモーターが応答エレメントである、請求項１から３５のいずれか一項に記載の細胞株。
  37. プロモーターが応答エレメントによって駆動される、請求項１から３５のいずれか一項に記載の細胞株。
  38. 導入遺伝子が遺伝子編集を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の細胞株。
  39. 遺伝子編集が、ＴＡＬＥＮ媒介遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集、又はＺＦＮ媒介遺伝子編集を含む、請求項３８に記載の細胞株。
  40. 操作された細胞株における導入遺伝子の発現のサイレンシングを防止するための方法であって、ＣｐＧモチーフを除去するために導入遺伝子配列を最適化することを含む方法。
  41. 最適化することが、本質的にすべてのＣｐＧモチーフのコドンを置き換えることを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 最適化することが、ＣｐＧモチーフの少なくとも５０パーセントを置き換えることを含む、請求項４０に記載の方法。
  43. ＣｐＧモチーフの少なくとも７０パーセントが除去される、請求項４０に記載の方法。
  44. ＣｐＧモチーフの少なくとも９０パーセントが除去される、請求項４０に記載の方法。
  45. ＣｐＧモチーフのすべてが除去される、請求項４０に記載の方法。
  46. ＣｐＧモチーフのコドンが、稀ではない及び／又はモノヌクレオチドストレッチを生じないコドンで置き換えられる、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. ＣｐＧモチーフのコドンが、表１の対応するコドンで置き換えられる、請求項４６に記載の方法。
  48. ＣｐＧモチーフを除去するために最適化された導入遺伝子の配列が、野生型導入遺伝子の配列のＧＣ含有量のパーセントと実質的に同様のＧＣ含有量のパーセントを含む、請求項４０から４６のいずれか一項に記載の方法。
  49. 導入遺伝子の配列がレポーター遺伝子である、請求項４０から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. レポーター遺伝子がＧＦＰ又はＲＦＰである、請求項４９に記載の方法。
  51. 導入遺伝子が、構成的プロモーターの制御下にある、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 構成的プロモーターが、実質的にすべての細胞型で発現を有する、請求項５１に記載の方法。
  53. 構成的プロモーターが、本質的にすべての細胞型で発現を有する、請求項５１に記載の方法。
  54. 構成的プロモーターが、すべての細胞型で発現を有する、請求項５１に記載の方法。
  55. 導入遺伝子が、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の方法。
  56. 導入遺伝子が、ＥＥＦ１Ａ１プロモーターの制御下にある、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の方法。
  57. 細胞株を酪酸ナトリウム、ＶＰＡ、又はＴＳＡで処理することをさらに含む、請求項４０から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 細胞株を酪酸ナトリウムで処理することをさらに含む、請求項４０から５６のいずれか一項に記載の方法。
  59. 酪酸ナトリウムが、０．２５ｍＭ～０．５ｍＭの濃度で添加される、請求項５８に記載の方法。
  60. 細胞株が、ｉＰＳＣ株である、請求項４０から５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. ｉＰＳＣ株を分化させることをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  62. ｉＰＳＣ株が分化する、請求項６１に記載の方法。
  63. ｉＰＳＣ株が成熟細胞に分化する、請求項６１に記載の方法。
  64. ｉＰＳＣ株が、造血前駆細胞、神経前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、マクロファージ、ミクログリア、又は内皮細胞に分化する、請求項６１に記載の方法。
  65. 配列番号１～１２又は１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロモーターを含む発現ベクター。
  66. プロモーターが、配列番号２、３、４、６、又は１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６５に記載の発現ベクター。
  67. プロモーターが、配列番号２、３、４、６、又は１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６５又は６６に記載の発現ベクター。
  68. プロモーターが、配列番号２、３、４、６、又は１７を含む、請求項６５から６７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  69. 発現ベクターが、ｐＧＬ３プラスミドベクターである、請求項６５から６８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  70. ベクターが、プロモーターの制御下にある導入遺伝子をコードする、請求項６５から６９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  71. 導入遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項７０に記載の発現ベクター。
  72. レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項７１に記載の発現ベクター。
  73. 安定した導入遺伝子の発現を有する細胞株を生成する方法であって、請求項５５から６５のいずれか一項に記載のベクターを発現するように細胞株を操作することを含み、ベクターが前記導入遺伝子をコードする、方法。
  74. 細胞株が、多能性細胞株である、請求項７３に記載の方法。
  75. 多能性細胞株が、ｉＰＳＣ株である、請求項７３又は７４に記載の方法。
  76. ベクターを第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込むことを含む、請求項７３から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 組み込むことが遺伝子編集を含む、請求項７３から７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 組み込むことが、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ媒介遺伝子編集、又はＺＦＮ媒介編集を含む、請求項７３から７６のいずれか一項に記載の方法。
  79. 細胞株を分化させることをさらに含む、請求項７３から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 細胞株が、ニューロン又は心臓細胞に分化する、請求項７３から７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 細胞株が少なくとも３０日間培養される、請求項７３から８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 細胞株が、少なくとも６カ月間培養される、請求項７３から８０のいずれか一項に記載の方法。
  83. 細胞株が、少なくとも３０日間、導入遺伝子の安定した発現を有する、請求項７３から８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. 細胞株が、６カ月において、導入遺伝子の安定した発現を有する、請求項７３から８２のいずれか一項に記載の方法。
  85. 請求項５５から８４のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む単離された多能性細胞株。
  86. 外因性導入遺伝子の安定した発現を有する細胞株を生成する方法であって、内因性遺伝子の制御下で導入遺伝子を発現するように細胞株を操作することを含み、内因性遺伝子が、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、又はＵＢＣである、方法。
  87. 操作することが遺伝子編集を含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 遺伝子編集が、ＴＡＬＥＮ媒介遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集、又はＺＦＮ媒介遺伝子編集を含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 導入遺伝子が、レポーター遺伝子、選択マーカー、又は自殺遺伝子である、請求項８６から８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 細胞株が、多能性細胞株である、請求項８６から８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 多能性細胞株が、ｉＰＳＣ株である、請求項９０に記載の方法。
  92. 導入遺伝子でタグ付けされた内因性のＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＣＴＢ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＬ６、ＵＢＡ５２、ＣＡＧ、ＲＰＳ、又はＵＢＣを有する単離された細胞株。
  93. 導入遺伝子が、レポーター遺伝子又は選択マーカーである、請求項９２に記載の細胞株。
  94. 細胞株が、多能性細胞株である、請求項９２に記載の細胞株。
  95. 多能性細胞株が、ｉＰＳＣ株である、請求項９４に記載の細胞株。
  96. 請求項１から３９、８５、又は９２から９５のいずれか一項に記載の細胞株を培養すること、及びレポーター遺伝子の発現を測定することを含む、細胞を検出するためのアッセイ。
  97. 細胞アッセイのための請求項１から３９、８５、又は９２から９５のいずれか一項に記載の細胞株の使用。
  98. 細胞アッセイが細胞生存率アッセイである、請求項９７に記載の使用。
  99. 細胞アッセイが、候補薬剤をスクリーニングするためのアッセイである、請求項９７に記載の使用。
  100. アッセイがハイスループットアッセイである、請求項９７から９９のいずれか一項に記載の使用。
  101. 細胞アッセイが、レポーター遺伝子の発現を測定することを含む、請求項９７から１００のいずれか一項に記載の使用。
  102. 細胞アッセイにおいて使用するための請求項１から３９、８５、又は９２から９５のいずれか一項に記載の細胞株を含む組成物。
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