JP2024519600A - 遺伝子のサイレンシング法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、真核細胞における標的遺伝子の発現をサイレンシングするための改善された方法及び生産物に関する。【選択図】図５

Description

本発明は、真核細胞における標的遺伝子の発現をサイレンシングするための改善された方法及び生産物に関する。
特定の遺伝子の発現をサイレンシングする能力は、研究ツール、治療薬、及び農業を含む様々な分野で大きな好機をもたらす。農業に関しては、世界の食糧供給が増え続ける人口についていけるように作物の改良が必要とされている。伝統的な育種を用いて生み出すことができる形質には限界があり、これは特定の作物に特に当てはまるため、遺伝子操作を用いて遺伝子をサイレンシングすることが有望なアプローチとなる。
植物及び他の真核生物における遺伝子のサイレンシングは、トランスジェニックＲＮＡｉを用いて日常的に行われている。ＲＮＡｉサイレンシングコンストラクトの作製には、二本鎖ヘアピンコンストラクト等のサイレンシングＲＮＡをコードしている配列を設計する必要がある。対象となる標的遺伝子に相補的な配列を用いることによって、対象となる標的遺伝子に対する特異性が得られる。その後、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列を、強力な発現を駆動する独立したプロモーター及びターミネーターと組み合わせる。外来性配列を減少させるために、標的生物由来のプロモーターを使用し、シーケンシングコンストラクトに融合させてもよい（例えば、Ｍｉｒｏｓｈｎｉｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＰＣＴＯＣ，１４０：６９１－７０５）。
国際公開第２０１９／０５８２５５号及び同第２０１９／０５８２５３号には、ＤＮＡ編集剤を利用し、インサイチュ及びインビボで内在性遺伝子座を改変することを伴う、真核細胞における遺伝子発現をサイレンシングする方法が記載されている。
標的遺伝子の発現をサイレンシングする改善された方法が求められている。
本発明者らは、真核生物における標的遺伝子の発現をサイレンシングするための改善された系を開発した。本発明の系は効率的であり、最小限の遺伝子改変しか利用せず、様々なサイレンシング効果を実現する。特に、本発明の系では、所望の発現パターンを有し、最小限のヌクレオチド変化で標的遺伝子をサイレンシングするように改変及びリダイレクトすることができる内在性サイレンシング配列が同定される。そのプロモーター及びターミネーターを含む内在性サイレンシング配列を使用して、標的遺伝子に対する特異性を提供するために最小限のヌクレオチド変化しか含まないサイレンシング挿入物を作製する。サイレンシング挿入物を真核細胞のゲノムに挿入して、所望の組織及び条件で標的遺伝子を特異的にサイレンシングする。
サイレンシング挿入物は、そのプロモーター及びターミネーターを含む内在性サイレンシング配列から作製されるため、内在性配列と非常に類似している。従って、有利なことに、サイレンシング挿入物は、挿入物の配列及びその配置が宿主に内在しているため、宿主によって効率的にプロセシングされる。また、サイレンシング挿入物は、プロモーター及びサイレンシングコンストラクトを近位に配置することなく内在性配列を内在性の配置で導入するシスジェニックな改変であり、このことは、消費者にとって魅力的であり、規制当局にとっては潜在的な問題が大幅に軽減される。
サイレンシング挿入物はゲノムにランダムに挿入されるので、非常に効率的である。サイレンシング挿入物にプロモーター及びターミネーターを含めることで、ランダムに挿入されても有効に発現させることができ、ターゲティング配列の必要性を回避することができる。挿入物が選択可能なマーカーを含む場合、配列の挿入によって、成功した形質転換体を選抜することも可能になる。
本発明のサイレンシング挿入物は、最小限のヌクレオチド変化で内在性配列をその内在性配置で導入することから恩恵を受け、また、所望の組織及び条件で標的遺伝子を特異的にサイレンシングすることからも恩恵を受ける。これが達成されるのは、一つには、挿入物が、サイレンシングＲＮＡをコードしている内在性配列とその同種のプロモーター及びターミネーターとの間に加えて５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの配列等の発現を制御する他の配列との間の連結も維持しながら、対象とする標的遺伝子にサイレンシングをリダイレクトするためにターゲティング配列に対する改変も含むためである。
従って、本発明は、サイレンシング挿入物を真核細胞のゲノムに挿入することを含む、第１の標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、
該サイレンシング挿入物が、プロモーター又はその一部、該第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含み、
該サイレンシング挿入物が、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む該真核細胞における内在性サイレンシング配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、該第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもない方法を提供する。
本発明はまた、そのゲノム中に
（ａ）プロモーター又はその一部、該第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含むサイレンシング挿入物と、
（ｂ）該挿入物によって分離された内在性ゲノム配列と、
（ｃ）プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む内在性サイレンシング配列と、
を含み、
該サイレンシング挿入物及び該内在性サイレンシング配列が、該挿入物の長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、該第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもない真核細胞を提供する。
本発明はまた、プロモーター又はその一部と、真核細胞における第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列と、ターミネーター又はその一部とを含むサイレンシング挿入物を含む、単離されたサイレンシングコンストラクトであって、
該サイレンシング挿入物が、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む該真核細胞における内在性サイレンシング配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、該第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもないコンストラクトを提供する。
好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物は、微粒子銃（遺伝子銃）、プロトプラストトランスフェクション、エレクトロポレーション、又はナノ粒子媒介トランスフェクションによって挿入される。このような技術はトランスジェニックＤＮＡを必要としないので、本発明の系によって提供される最小限の遺伝子変化のみを導入する。
好ましい実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。遺伝子変化を最小限に抑えながら標的遺伝子をサイレンシングする方法は植物において特に有用であるが、その理由は、外来性ＤＮＡもその内在性配置ではない内在性ＤＮＡ配列も含まない作物及び植物生産物を作出することができ、このことが消費者や規制当局に好まれるためである。また、植物におけるトランスジェニックＤＮＡを繁殖させて除去すること（breed out）も可能である。
好ましい実施形態では、真核細胞は、バナナ植物細胞、又はコーヒー植物細胞、又はイネ植物細胞である。バナナは無性であり、形質又は表現型を改良するためにバナナを育種することは不可能であるため、本発明の方法及び生産物は、バナナ植物における遺伝子をサイレンシングするために特に有用である。同様に、コーヒー植物の育種には１５～２５年間かかり、不経済であるため、本発明の方法及び生産物は、コーヒー植物における遺伝子をサイレンシングするために特に有用である。同様に、イネ植物の育種には特に時間がかかるため、本発明の方法及び生産物は、イネ植物における遺伝子をサイレンシングするために特に有用である。
別の実施形態では、真核細胞は、動物細胞、好ましくは家畜動物細胞である。家畜動物とは、有用な商業目的のためにヒトに飼育されている動物の任意の品種又は集団であり得る。本発明で使用するための家畜動物の例としては、ウマ、ロバ、ウシ、若しくは任意の他の反芻動物；コブウシ、ヤク、バッファロー、ヒツジ、ヤギ、トナカイ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタ、ウサギ、若しくは任意の他のげっ歯類；イヌ、ネコ、例えばニワトリ、七面鳥、ガチョウ、若しくはアヒル等の家禽類；魚類、甲殻類、及び軟体動物が挙げられる。家畜動物は、ヒトではない。遺伝子変化を最小限に抑えながら標的遺伝子をサイレンシングする方法は、家畜動物において特に有用であるが、その理由は、外来性ＤＮＡもその内在性配置ではない内在性ＤＮＡ配列も含まない動物及び動物生産物を作出することができ、このことが消費者や規制当局に好まれるためである。また、家畜動物におけるトランスジェニックＤＮＡを繁殖させて除去することも可能である。本発明はまた、本発明のサイレンシング挿入物又は動物細胞を投与することを含む家畜動物における疾患を治療又は予防する方法を提供し、疾患の治療又は予防において使用するための本発明のサイレンシング挿入物及び動物細胞を提供する。
別の実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。遺伝子変化を最小限に抑えながら標的遺伝子をサイレンシングする方法はヒトにおいて特に有用であるが、その理由は、有害となる恐れのある他の変化を最小限に抑えながら、治療用配列を導入することができるためである。本発明はまた、本発明のサイレンシング挿入物又はヒト細胞を投与することを含むヒトにおける疾患を治療又は予防する方法を提供し、疾患の治療又は予防において使用するための本発明のサイレンシング挿入物及びヒト細胞を提供する。ヒト細胞を用いる実施形態では、細胞は単離され、インビトロで取り扱われるか、又は方法は治療的である。いくつかの実施形態によれば、真核細胞はヒトの身体から単離されたヒト細胞であり、本発明のサイレンシング挿入物はインビトロで導入され、任意で、本発明のサイレンシング挿入物を有するヒト細胞がヒトに再導入される。いくつかの実施形態によれば、本発明は、（１）ヒトの身体から細胞を単離することと、（２）本発明のサイレンシング挿入物をインビトロで該細胞に導入し、改変細胞を得ることと、（３）該改変細胞をヒト対象、任意で、非改変細胞が由来するヒト対象と同じヒト対象に投与することとを含む、ヒトにおける疾患を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、そのような方法において、本発明のサイレンシング挿入物は、該方法が治療又は予防する疾患に関連する標的遺伝子に対するサイレンシング特異性を導入する。
好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物は、内在性サイレンシング配列に対して１～４０個、例えば５～４０個、５～３０個、５～２０個、３～４０個、３～３０個、３～２０個、５～１５個、３～１０個、１０～３０個、又は１０～２０個のヌクレオチドの付加、欠失、及び置換を含む。このような改変は、内在性配列に最小限の変化しか与えない一方で、対象となる標的遺伝子を標的とするように内在性サイレンシング配列をリダイレクトするのに好適である。従って、好ましくは、これら変化は、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列におけるものであり、そして好ましくは、サイレンシング挿入物中のプロモーター及びターミネーター、並びに５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの配列等の発現を制御する任意の他の配列は、内在性サイレンシング配列における対応する配列と同一である。
好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物は選択可能なマーカーに隣接し、本発明の方法は、隣接する選択可能なマーカーと共にサイレンシング挿入物を真核細胞のゲノムに挿入することを含む。選択可能なマーカーを使用することで、成功した形質転換体を選抜することが可能になり、その作出がはるかにより効率的になる。好ましくは、導入される外来性遺伝物質を最小限にするために、選択可能なマーカーは、真核細胞の内在性遺伝子、例えば真核細胞に内在する遺伝子の変異体バージョンに非常に類似している。選択可能なマーカーは、真核細胞の内在性遺伝子の変異体バージョンであってよく、任意で、変異（好ましくは、優性変異）が導入されるまでマーカーとして機能せず、変異が選択可能なマーカーとして機能することを可能にする遺伝子であってもよい。好ましくは、内在性遺伝子の変異体バージョンである選択可能なマーカーを、内在性遺伝子のプロモーター及びターミネーターと共に使用する。好ましくは、マーカーの変異体バージョンは、同属又は同種の別の真核細胞に天然に存在する変異を含む。選択可能なマーカーの非限定的な例は、クロルスルフロン除草剤抵抗性を付与するＡＬＳ遺伝子の変異バージョンである。本発明の系は、複数のサイレンシング挿入物を一緒に挿入することを可能にし、複数の遺伝子のサイレンシング及び形質の「積み重ね」を提供する。これは、形質を組み合わせるために交配することができないバナナ等の無性作物に使用するのに特に有利である。
本発明はまた、本発明の方法から得られ、本発明のサイレンシング挿入物を有する細胞を含む植物、植物の部分、種子、果実、及び植物生産物を提供する。そのような生産物は、特異的な遺伝子サイレンシングによってもたらされる改良された形質を示すが、シスジェニックであり、任意の外来性ＤＮＡも非内在性配置の内在性ＤＮＡも含有しない。
本発明はまた、本発明の方法から得られ、本発明のサイレンシング挿入物を有する細胞を含む動物及び動物生産物を提供する。このような動物及び生産物は、特異的な遺伝子サイレンシングによってもたらされる改良された形質を示すが、シスジェニックであり、任意のトランスジェニックＤＮＡも非内在性配置の内在性ＤＮＡも含有しない。
プロモーター同定パイプライン：プロセスの概要。 ターミネーター同定パイプライン：プロセスの概要。 ｍｉＲＮＡの一例（ａｔｈ－ｍｉＲ１７３）についてのＷＴ（Ａ）及びＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ（Ｂ）の配列、並びにステムループ構造（Ｃ）。プロモーター、ｎｃＲＮＡ（非コードＲＮＡ）、及びターミネーターの領域を、それぞれ下線、イタリック体、及びイタリック体＋下線で示す。ＷＴ配列からの変化を太字で示す。５’→３’の配向を示す。 ｔａｓｉＲＮＡの一例（ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ）についてのＷＴ（Ａ）及びＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ（Ｂ）の配列。プロモーター、ｎｃＲＮＡ（非コードＲＮＡ）、及びターミネーターの領域を、それぞれ下線、イタリック体、及びイタリック体＋下線で示す。ＷＴ配列からの変化を太字で示す。５’→３’の配向を示す。 ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ改変を導入するための重複ＰＣＲストラテジ。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、それぞれプライマーＡ＋Ｂ（ＰＣＲ１）及びＣ＋Ｄ（ＰＣＲ２）を用いた２回の別々のＰＣＲ反応を行う。プライマーＢ及びＣは、その５’に改変ＧＥｉＧＳ（商標）配列を含有する（点線）。ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット全体を増幅するために、ＰＣＲ１及び２からの産物の改変領域にアニーリングし、プライマーＡ＋Ｄを用いる３回目のＰＣＲ反応（ＰＣＲ３）を行う。 選択図によるＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ。ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットは、ＧＥｉＧＳ（商標）ｎｃＲＮＡ及び変異型Ｐ１９７Ｓ発現カセットが反対方向（Ａ）又は同一方向（Ｂ）を向くように設計することができる。読み過し転写を防ぐために配向Ａが好ましい。ＡＬＳカセットは、相補鎖からネイティブに発現する。ＡＬＳの内在性プロモーター（５’ＵＴＲを含む）及びターミネーター（３’ＵＴＲを含む）の領域を示す。ｎｃＲＮＡの内在性プロモーター及びターミネーターを示す。ＧＥｉＧＳ（商標）ｎｃＲＮＡは、その二次構造に影響を与えない最小限の変異しか含まず、ｓＲＮＡのサイレンシング活性及び特異性を、挿入物のベースとなるサイレンシング遺伝子のサイレンシング活性及び特異性からリダイレクトする。ＡＬＳ Ｐ１９７Ｓ：プロリン１９７をセリンに変異させてクロルスルフロン抵抗性を付与したＡＬＳ一点変異体。ｃＴＰ：ＡＬＳオープンリーディングフレームの一部である葉緑体輸送ペプチド。 選択を伴うＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ。ＡＬＳ／ＡＬＳ Ｐ１９７Ｓの内在性プロモーター（５’ＵＴＲを含む）及びターミネーター（３’ＵＴＲを含む）の領域を示す。ｍｉＲ１７３の内在性プロモーター及びターミネーターを示す。ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）配列における最小限の変異に球で印を付ける。これら変異はｎｃＲＮＡの二次構造に影響を与えず、ｓＲＮＡのサイレンシング活性及び特異性をリダイレクトすることができる。ＡＬＳ Ｐ１９７Ｓ：プロリン１９７をセリンに変異させてクロルスルフロン抵抗性を付与したＡＬＳ一点変異体。ｃＴＰ：ＡＬＳオープンリーディングフレームの一部である葉緑体輸送ペプチド。ＡＬＳ／ＡＬＳ Ｐ１９７Ｓ及びｍｉＲ１７３は、それぞれ相補鎖及びセンス鎖からネイティブに発現する。 ＧＥｉＧＳ（商標）コンボ－１つのＴ－ＤＮＡセグメントにおけるトランスジェネシスベース及びＨＤＲベースのＧＥｉＧＳ（商標）植物系統の作出。ＧＥｉＧＳ（商標）コンボアプローチは、同じＴ－ＤＮＡセグメントを使用して、ＨＤＲベースのＧＥｉＧＳ（商標）植物系統（左）及びシスジェニックベースのＧＥｉＧＳ（商標）系統（右）を作出することを容易にする。このセグメントは、ＤＮＡ切断を行うための発現カセット（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９及びｓｇＲＮＡ）、ＤＮＡドナーテンプレート（ＨＤＲ経路による改変配列の導入を容易にする）、及び形質転換事象の質を高めるために選択又はレポーターマーカーの選択肢を含有する。（Ａ）ドナー配列は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ及びｓｇＲＮＡカセットによって生成されたＤＮＡ切断に続いて、ＨＤＲ経路を介して細胞によって使用されるドナーテンプレートとして機能する。このドナーテンプレートは、ＧＥｉＧＳ（商標）ソリューションの配列を導入するために、内在性スカフォールド遺伝子座に所望のＤＮＡ改変を導入する。その結果、ＧＥｉＧＳ（商標）ソリューション遺伝子がゲノム内のネイティブの位置から発現する。ＧＥｉＧＳ（商標）コンボ法のこの機能は、非ＧＭ的に行うことができ、この場合、遺伝子編集事象はＴ－ＤＮＡカセットの一過性発現を通じて行われる。更に、このプロセスはＧＭ的に実施してもよく（すなわち、Ｔ－ＤＮＡを植物ゲノムに組み込んでもよく）、その結果ＧＭ植物が得られ、次世代でＴ－ＤＮＡを繁殖させて除去することができる。（Ｂ）ＧＥｉＧＳ（商標）コンボ法でＧＥｉＧＳ（商標）ｍｉｍｉｃアプローチを実行するために、ドナー領域は、少なくともＧＥｉＧＳ（商標）ソリューション配列を、該ソリューションのベースとなるスカフォールドのネイティブのプロモーター及びターミネーターと共に含有しなければならないように設計される。より長い配列が必要な場合、ＨＤＲベースの方法の場合、これを更に拡張して、図中では「ゲノム配列」として表され、より長い相同アームを生成することができる。Ｔ－ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれると、この領域は内在性スカフォールドとして活性を有するようになり、ＧＥｉＧＳ（商標）ソリューションが発現し、プロセシングされる。その結果、ＧＥｉＧＳ（商標）ｍｉｍｉｃを介してＧＭ的に関連する要求形質が得られる。言い換えれば、この方法は、組み込まれたＴ－ＤＮＡカセットからの発現により、シスジェニックなアプローチを通じてＧＥｉＧＳ（商標）を導入する。 ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットの例。ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット（ここでは「ＤＯＮＯＲ」と称する）の長さは１．２ｋｂであり、ｍｉＲＮＡのサイレンシング特異性をリダイレクトするのに必要な改変領域（ここでは「ＧＥｉＧＳソリューション」と称する）に加えてこの部位の上流及び下流約５００ｂｐに及んでいる。 ｓＲＮＡ－ｓｅｑに使用したＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ植物のＨＤＲ遺伝子型。各植物から葉組織の小片を採取し、意図するＨＤＲ編集に特異的なフォワードプライマーと、ＨＤＲドナー／ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット外部にある、すなわちネイティブなスカフォールドに特異的なリバースプライマーとを用いてダイレクトＰＣＲを行った。ポジティブコントロールとして、ＨＤＲドナー／ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ配列及び隣接領域配列の両方を含むプラスミドを用いた。ＰＣＲ反応物を、エチジウムブロマイドで染色した０．８％アガロースゲルにロードし、紫外線下で可視化した。 ＴｕＭＶバイオアッセイに用いたＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ植物のＨＤＲ遺伝子型。各植物から葉組織の小片を採取し、意図するＨＤＲ編集に特異的なフォワードプライマーと、ＨＤＲドナー／ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット外部にある、すなわちネイティブなスカフォールドに特異的なリバースプライマーとを用いてダイレクトＰＣＲを行った。ポジティブコントロールとして、ＨＤＲドナー／ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ配列及び隣接領域配列の両方を含むプラスミドを用いた。ＰＣＲ反応物を、エチジウムブロマイドで染色した０．８％アガロースゲルにロードし、紫外線下で可視化した。 ＧＦＰ領域解析。（Ａ）ＴｕＭＶ：ＧＦＰを感染させたシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物を、距離及び設定を固定し、三脚に取り付けたデジタルカメラを用いて紫外線照射下で撮影し、ＧＦＰの広がりについて調べた。（Ｂ）ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ３．１．９でカスタム画像解析パイプラインを開発し、葉の総面積のうちＧＦＰ蛍光が占める割合を求めた。品質管理のために、ＧＦＰ領域を重ねた出力画像を保存した。（Ｃ）品質管理のために保存した画像を手作業で確認し、誤差の大きいものはＩｍａｇｅＪを用いて手作業で総葉面積及びＴｕＭＶ面積を測定した。 葉の総面積に占めるＧＦＰ蛍光の割合。ＴｕＭＶ：ＧＦＰを感染させたシロイヌナズナ植物を、接種後７日目、１１日目、１５日目、及び１７日目（ｄｐｉ）に紫外線照射下で撮影した。ＴｕＭＶ：ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ３．１．９で開発したカスタム画像解析パイプラインを用いて総葉面積及びＧＦＰ面積を測定し、ＩｍａｇｅＪを用いて手作業でキュレーションした。各時点における個々の植物について、全葉面積に対するＴｕＭＶ：ＧＦＰ面積の百分率を算出した。箱ひげ図は、中央値（中央の帯）並びに四分位範囲（ＩＱＲ、箱）±最小値及び最大値（ひげ）を示す。外れ値は、小さな円で示す。ｎ＝５植物／群。
サイレンシング挿入物の設計
本発明は、サイレンシング挿入物を挿入することを含む、標的遺伝子の発現を低下させる方法を提供し、サイレンシング挿入物を保有する真核細胞を提供し、サイレンシング挿入物自体を提供する。本発明のサイレンシング挿入物は、その内在性配置の内在性のＤＮＡのみを導入しつつ、オーダーメイドの柔軟かつ特異的なサイレンシング効果を提供する。
本発明のサイレンシング挿入物は、サイレンシングＲＮＡをコードしている内在性配列を、その同種のプロモーター及びターミネーターと、更に５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの配列等の発現を制御する他の配列とも組み合わせて利用する。本発明のサイレンシング挿入物を設計するために、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列に対して、対象となる標的遺伝子にサイレンシングをリダイレクトするための最小限の配列改変がなされる（そして、サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡがその機能に必須である場合は、恐らくその二次構造を維持する）。
本発明のサイレンシング挿入物の設計には、好適な内在性出発配列を同定することが必要である。出発配列は、プロモーター及びターミネーターと、任意で、例えば発現の強度、発現のタイミング、及び／又は発現の組織の観点で所望の発現パターンを提供する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの配列等の発現を制御する他の配列を含んでいなければならない。出発配列はまた、最小限のヌクレオチド変化で対象となる標的遺伝子にリダイレクトされ得る、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列を含んでいなければならない。いくつかの実施形態によれば、出発配列は、真核細胞内のサイレンシングＲＮＡ配列に類似しているが、サイレンシングＲＮＡとしてプロセシングされることはない非コードＲＮＡをコードしている配列を含み得る。そのような実施形態では、配列に導入された改変は、サイレンシング挿入物の状況において、コードされているＲＮＡのサイレンシング能力を再活性化し、そのサイレンシング特異性を選択された標的配列に対してリダイレクトする。このような出発配列の同定及びサイレンシング活性の再活性化に必要な改変を同定するプロセスは、本質的に国際公開第２０２０／１８３４１９号に記載の通り行うことができる。実施例１及び２は、適切な出発配列（非コードＲＮＡ、ｎｃＲＮＡと称される）を同定するために使用することができる例示的なプロセス及び有用なデータベースを提供している。
従って、内在性サイレンシング配列の標的配列だけでなく、そのプロモーター及びターミネーターの配列並びに発現プロファイルも解析するバイオインフォマティクス検索及び解析によって、出発配列を同定する。検索及び解析は、Ｇ／Ｃ含量、プロモーターの長さ、サイレンシング配列及び／又はターミネーター、並びに二次構造も考慮することができる。好ましい実施形態では、自動化された計算プラットフォームを使用して、出発内在性サイレンシング配列の同定及び／又はサイレンシング挿入物の設計を実施する。自動化された計算プラットフォームは、例えば、必要とされる編集の様々な程度、サイレンシング挿入物の異なる発現プロファイル、及び異なる効力等を有する特定の遺伝子を標的とするための複数の選択肢を提供することができる。
最小限のヌクレオチド変化で標的遺伝子をサイレンシングするために、内在性サイレンシング配列によってサイレンシングされる標的遺伝子は、サイレンシング挿入物によってサイレンシングされる標的遺伝子に対して配列同一性、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を示してもよい。サイレンシング挿入物と内在性サイレンシング配列とは異なる遺伝子を標的とするため、一般的に同一性は１００％にはならない。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物の異なる部分の、内在性配列における対応する配列に対する配列同一性は、独立して定義され得る。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物におけるプロモーター及び内在性サイレンシング配列におけるプロモーターは、プロモーターの長さ全体にわたって少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の配列同一性を有する。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物におけるターミネーター及び内在性サイレンシング配列におけるターミネーターは、ターミネーターの長さ全体にわたって少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の配列同一性を有する。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列及び内在性サイレンシング配列におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列は、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列の長さ全体にわたって、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、又は９９．９％の配列同一性を有する。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物におけるプロモーター及び内在性サイレンシング配列におけるプロモーターは本質的に同一であり（一塩基多型を除く）、サイレンシング挿入物におけるターミネーター及び内在性サイレンシング配列におけるターミネーターは本質的に同一であり（一塩基多型を除く）、かつサイレンシング挿入物におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列及び内在性サイレンシング配列におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列は、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列の長さ全体にわたって少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、又は９９．９％の配列同一性を有する。そのような実施形態では、内在性サイレンシング配列におけるプロモーター、内在性サイレンシング配列におけるターミネーター、及び内在性サイレンシング配列におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列は全て、同じ内在性サイレンシング配列中に存在する。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物の異なる部分の、内在性配列における対応する配列に対する配列同一性は、独立して、異なる尺度で定義され得る。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物におけるプロモーター及び内在性サイレンシング配列におけるプロモーターは、プロモーターの長さ全体にわたって少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の配列同一性を有する。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物におけるターミネーター及び内在性サイレンシング配列におけるターミネーターは、ターミネーターの長さ全体にわたって少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の配列同一性を有する。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列は、内在性サイレンシング配列におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列に対して１～４０個、例えば５～４０個、５～３０個、５～２０個、３～４０個、３～３０個、３～２０個、５～１５個、３～１０個、１０～３０個、又は１０～２０個のヌクレオチドの付加、欠失、及び置換を含む。このような実施形態では、内在性サイレンシング配列におけるプロモーター、内在性サイレンシング配列におけるターミネーター、及び内在性サイレンシング配列におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列は全て、同じ内在性サイレンシング配列中に存在する。
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、サイレンシング挿入物におけるプロモーター及びターミネーターへの言及は、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの配列等の発現を制御する内在性サイレンシング遺伝子座に存在する任意の他の配列を含み得る。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、プロモーター又はその一部、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、ターミネーター又はその一部、並びに５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの配列等の発現を制御する遺伝子座からの他の配列に加えて、追加のヌクレオチド配列を含む。特に、サイレンシング挿入を設計する場合、５’末端及び３’末端を内在性のプロモーター及びターミネーターに正確に限定する必要はない。内在性のプロモーター及びターミネーターの配列の正確な境界が知られていない場合もある。サイレンシング挿入物における任意の付加配列も同じ内在性サイレンシング配列（プロモーター配列の上流及び／又はターミネーター配列の下流）に由来するので、内在性サイレンシング配列に対して高い同一性を有する。従って、特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、プロモーター又はその一部、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、ターミネーター又はその一部、並びにプロモーター及び／又はターミネーターに隣接する付加配列からなり、付加配列を含むサイレンシング挿入物は、内在性サイレンシング配列及び対応するプロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、ターミネーター、並びにプロモーター及び／又はターミネーターに隣接する付加配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有する。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物は、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列と、サイレンシングＲＮＡの５’の少なくとも５０塩基対、１００塩基対、２５０塩基対、５００塩基対、７５０塩基対、１０００塩基対、２０００塩基対、又は５０００塩基対と、サイレンシングＲＮＡの３’の少なくとも２０塩基対、５０塩基対、１００塩基対、２５０塩基対、５００塩基対、７５０塩基対、１０００塩基対、又は２０００塩基対とを含み、一般にプロモーター及びターミネーターを含むであろう。特定のそのような実施形態では、サイレンシング挿入物は、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列と、サイレンシングＲＮＡの５’の５０～５０００塩基対、１００～２５００塩基対、２００～１５００塩基対、又は４００～１０００塩基対と、サイレンシングＲＮＡの３’の２０～２０００塩基対、５０～１０００塩基対、１００～７５０塩基対、又は１５０～５００塩基対とを含み、一般にプロモーター及びターミネーターを含むであろう。
別の実施形態では、サイレンシング挿入物の５’末端はプロモーターの５’末端と連続している、及び／又は３’末端はターミネーターの３’と連続している。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、内在性サイレンシング配列における配列又は内在性サイレンシング配列に隣接する配列と高度に同一ではない付加配列に隣接する。本発明のこのような方法において、サイレンシング挿入物は、隣接する付加配列と共に真核細胞のゲノムに挿入される。例えば、サイレンシング挿入物は、更に後述するように、選択可能なマーカーに連結してもよい。そのような実施形態では、サイレンシング挿入物と内在性配列との間の配列同一性は、隣接する付加配列を除外することによって算出される。特定のそのような実施形態では、隣接する付加配列は、異なる内在性配列に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の配列同一性を有する。例えば、特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、プロモーター又はその一部、選択可能なマーカーをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含み、プロモーター、内在性遺伝子をコードしている配列、及びターミネーターを含む真核細胞内の内在性配列に対して、その長さ全体にわたって少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列に隣接する。特定の実施形態では、内在性遺伝子をコードしている配列は、選択可能なマーカーとして機能しない。
別の実施形態では、本発明の方法は、サイレンシング挿入物の挿入を含み、隣接する付加配列は挿入しない。従って、この方法は、サイレンシング挿入物からなるコンストラクトを挿入することを含む。そのような実施形態では、本発明の真核細胞は、サイレンシング挿入物を含み、該挿入物によって分離された内在性ゲノム配列が該挿入物の５’末端及び３’末端に存在する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、サイレンシング挿入物は、真核細胞のゲノム中にランダムに挿入される。ランダム挿入は、追加の外来性標的配列を必要としないので、より効率的である。従って、特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、ターゲティング配列を含まず、ターゲティング配列を含むベクター中にも組成物中にも存在しない。サイレンシング挿入物がランダムに挿入された結果、本発明の真核細胞は、該挿入物によって分離された内在性ゲノム配列を含む。サイレンシング挿入物（及び選択可能なマーカー等の任意の付加隣接配列）の両端に隣接する配列は、挿入物が存在しない場合よりも更に離れることになる。ランダム挿入では、サイレンシング挿入物（及び選択可能なマーカー等の任意の付加隣接配列）によって分離された配列との間で若干の少量の内在性配列が欠失する可能性がある。従って、本発明の真核細胞は、例えば相同組換え又は相同性指向性修復を利用するゲノム編集技術で改変された細胞とは区別されるが、その理由は、そのような細胞は、挿入物によって分離された内在性のゲノム配列を含まないためである。同様に、本発明の方法は、サイレンシング挿入物を挿入することを含み、この挿入は、この用語の通常の意味と一致して、任意の相同配列の置換を含まない。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物の位置は、挿入物によって分離される内在性配列の観点ではなく、内在性サイレンシング挿入物に対して規定され得る。例えば、サイレンシング挿入物は、挿入物の非存在下ではサイレンシングＲＮＡをコードしないゲノム中の位置に存在し得るか、あるいはサイレンシング挿入物及び内在性サイレンシング配列は、異なる染色体上又は同じ染色体上の少なくとも５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、若しくは１００ｋｂ離れた異なる位置に存在し得る。
特定の実施形態では、本発明のサイレンシング挿入物は、１～１０ｋｂ、例えば２～５ｋｂであり得る。
サイレンシングＲＮＡ
本発明は、内在性サイレンシングＲＮＡのターゲティングを変化させる最小限のヌクレオチド変化を有する、内在性配列をその内在性配置で使用して対象となる特定の遺伝子を標的とするサイレンシング挿入物を提供する。
サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、段階的低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡを形成するインバーテッドリピートＲＮＡ、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、自律性若しくは非自律性の転位若しくはレトロ転位因子由来ＲＮＡ、自律性若しくは非自律性の転位若しくはレトロ転位因子ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ断片（ｔＲＦ）、又は長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であってもよく、これらにプロセシングされてもよい。好ましい実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。更に好ましい実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、段階的低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、又はトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）である。
好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡ及び内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡは、同じ種類のサイレンシングＲＮＡ、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、段階的低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡを形成するインバーテッドリピートＲＮＡ、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、自律性若しくは非自律性の転位若しくはレトロ転位因子由来ＲＮＡ、自律性若しくは非自律性の転位若しくはレトロ転位因子ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ断片（ｔＲＦ）、又は長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。好ましい実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
特定の実施形態では、サイレンシングＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である。
内在性サイレンシング配列をリダイレクトするために、サイレンシング挿入物にヌクレオチド変化を導入する。様々な異なる種類のサイレンシングＲＮＡ分子のターゲティング機序がよく理解されているので、サイレンシングＲＮＡ分子のターゲティングをインシリコでモデル化することができ、これにより本発明のサイレンシング挿入物の設計において適切なヌクレオチド変化を選択することが可能になる。変化は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、及び／又はヌクレオチド挿入であってもよい。
サイレンシングＲＮＡと標的遺伝子配列との特異的な結合は、計算アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって決定し、例えば、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ等を含む方法によって検証することができる。
特定の実施形態では、変化は、サイレンシングＲＮＡのステム領域に存在する。特定の実施形態では、変化は、サイレンシングＲＮＡのループ領域に存在する。特定の実施形態では、変化は、サイレンシングＲＮＡの非構造化領域に存在する。特定の実施形態では、変化は、サイレンシングＲＮＡのステム領域及びループ領域に存在する。特定の実施形態では、変化は、サイレンシングＲＮＡのステム領域、及びループ領域、及び非構造化領域に存在する。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列は、内在性サイレンシング配列におけるサイレンシングＲＮＡをコードしている配列に対して１～４０個、例えば５～４０個、５～３０個、５～２０個、３～４０個、３～３０個、３～２０個、５～１５個、１０～３０個、１０～２０個、３～１０個、又は５～１０個のヌクレオチドの付加、欠失、及び／置換を含む。好ましい実施形態では、ヌクレオチドの変化は連続しないか、又は１０個を超える、８個を超える、６個を超える、４個を超える、若しくは２個を超える連続する変化を含まない。好ましい実施形態では、ヌクレオチドの変化は全て置換である。
いくつかの実施形態によれば、内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡのサイレンシング活性は、サイレンシングＲＮＡの二次構造によって影響を受ける（ｍｉＲＮＡをコードしているサイレンシングＲＮＡの場合等であるが、これに限定されない）。好ましい実施形態では、内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡのサイレンシング活性がサイレンシングＲＮＡの二次構造によって影響を受ける場合、サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡ及び内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡは、同じ二次構造を形成する。このような実施形態では、サイレンシングＲＮＡを変化させてそのターゲティングをリダイレクトする場合、確実に該変化によって二次構造が破壊されないようにするためにモデリングを使用してもよい。二次構造を維持することは、サイレンシング挿入物によってコードされているＲＮＡが、細胞のサイレンシング機構によって適切に認識され、プロセシングされることを保証するのに役立ち得る。二次構造は、塩基対合プロファイルを維持することによって維持できる。
標的遺伝子をサイレンシングするために、サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡは、一般に、標的遺伝子に相補的な配列を含む。これは、サイレンシングＲＮＡ分子（又はプロセシングされたサイレンシングＲＮＡ中に存在するその少なくとも一部、又は二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一本の鎖若しくはその一部、又は一本鎖ポリヌクレオチドの一部）が生理学的条件下で標的ＲＮＡ又はその断片にハイブリダイズして、標的遺伝子を調節する又は機能させる又は抑制することを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、サイレンシングＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡにおける６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドの配列と比較して、１００パーセントの配列同一性、又は少なくとも８０パーセント、８５パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、若しくは９９パーセントの配列同一性を有する。サイレンシングＲＮＡがｍｉＲＮＡである場合、相補性は、シード配列全体にわたってもよく、又は成熟ｍｉＲＮＡの配列全体にわたってもよい。
好ましくは、サイレンシングＲＮＡは、５’→３’方向に読んだ配列の一方の全てのヌクレオチドが、３’→５’方向に読んだときの他方の配列の全てのヌクレオチドと相補的であるように、標的遺伝子に対して完全な相補性を示す配列を含む。参照ヌクレオチド配列に対して完全に相補的なヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補体配列と同一の配列を示す。配列の相補性を判定する方法は、当技術分野において周知であり、当技術分野において周知のバイオインフォマティクスツール（例えば、ＢＬＡＳＴ、多重配列アラインメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「ＲＮＡサイレンシング」又はＲＮＡｉとは、非コードＲＮＡ分子（「ＲＮＡサイレンシング分子」又は「ＲＮＡｉ分子」）が、配列特異的に、遺伝子の発現又は翻訳の同時転写又は転写後の阻害を媒介する細胞調節機序を指す。いくつかの実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、転写中にＲＮＡの抑制を媒介することができる（同時転写遺伝子サイレンシング）。いくつかの実施形態では、同時転写遺伝子サイレンシングは、エピジェネティックサイレンシング（例えば、遺伝子発現を妨げる染色体の状態）を含む。いくつかの実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、転写後のＲＮＡ抑制を媒介することができる（転写後遺伝子サイレンシング）。転写後遺伝子サイレンシングとは、典型的には、翻訳を妨げることによってその活性を低下させるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の分解又は切断のプロセスを指す。例えば、ＲＮＡサイレンシング分子のガイド鎖は、ｍＲＮＡ分子における相補的な配列と対合し、例えば、アルゴノート２（Ａｇｏ２）による切断を誘導する。
同時転写遺伝子サイレンシングは、典型的には、遺伝子活性の不活性化（すなわち、転写抑制）を指し、典型的には細胞核内で起こる。このような遺伝子活性の抑制は、標的ＤＮＡ及びヒストンをメチル化するメチル基転移酵素等のエピジェネティック関連因子によって媒介される。このように、同時転写遺伝子サイレンシングでは、低分子ＲＮＡと標的ＲＮＡとの会合（低分子ＲＮＡ－転写物相互作用）により、標的新生転写物が不安定化し、遺伝子の活性及び転写を抑制する構造へのクロマチンのリモデリングを誘導するＤＮＡ及びヒストン修飾酵素（すなわち、エピジェネティック因子）を動員する。また、同時転写遺伝子サイレンシングでは、クロマチンに会合した長鎖非コードＲＮＡスカフォールドが、低分子ＲＮＡとは独立にクロマチン修飾複合体を動員し得る。これら同時転写サイレンシング機序は、不適切な転写事象を検出し、サイレンシングするＲＮＡ監視系を形成し、自己強化型エピジェネティックループを介してこれら事象の記憶を提供する［Ｄ．Ｈｏｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｍｏａｚｅｄ，ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２０１５）１６（２）：７１－８４に記載の通り］。
いくつかの実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、ＲＮＡｉバイオジェネシス／プロセシング機構によってプロセシングされる。特定の実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる。特定の実施形態では、サイレンシング挿入物が発現するサイレンシングＲＮＡは、より小さなサイレンシングＲＮＡ分子にプロセシングされる前駆体である。特定の実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）前駆体である。特定の実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、二重鎖構造の一本鎖ＲＮＡ前駆体である。特定の実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ前駆体（例えば、完全及び不完全な塩基対合を含む）である。
完全及び不完全に塩基対合したＲＮＡ（すなわち、二本鎖ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡ－細胞内に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサー（エンドリボヌクレアーゼダイサー又はＲｎａｓｅモチーフを有するヘリカーゼとしても知られている）は、植物では典型的にはダイサー様（ＤＣＬ）タンパク質と称される酵素である。植物によってＤＣＬ遺伝子の数が異なるので、例えば、シロイヌナズナゲノムは、典型的には４つのＤＣＬ遺伝子を有し、イネは８つのＤＣＬ遺伝子を有し、トウモロコシゲノムは５つのＤＣＬ遺伝子を有する。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短い片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来するｓｉＲＮＡは、典型的には、約２１～約２４ヌクレオチド長であり、２個の３’ヌクレオチドのオーバーハングを有する約１９塩基対の二重鎖を含む。
従って、本発明のいくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡをコードしている内在性遺伝子を単離し、改変し、そしてサイレンシング活性を新たな遺伝子にリダイレクトするためのサイレンシング挿入物を調製するために使用する。
特定の実施形態では、２１ｂｐよりも長いｄｓＲＮＡ前駆体を使用する。様々な研究により、長鎖ｄｓＲＮＡを用いて、ストレス応答を誘導することも著しいオフターゲット作用を引き起こすこともなく遺伝子発現をサイレンシングできることが実証されている－例えば、［Ｓｔｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３ ３８０３－３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５－１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１－３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３－１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７－１３４］を参照。
用語「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子阻害性ＲＮＡ二重鎖（一般的には１８～３０塩基対）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央に１９ｂｐの二重鎖領域を有し、末端に対称的な２塩基の３’オーバーハングを有する２１ｍｅｒとして化学的に合成されるが、最近、２５～３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖が、同じ位置にある２１ｍｅｒと比較して１００倍も高い効力を有し得ることが報告されている。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを用いて得られる効力の増大が観察されたことは、ダイサーに生成物（２１ｍｅｒ）ではなく基質（２７ｍｅｒ）を与えたことに起因しており、これがｓｉＲＮＡ二重鎖のＲＩＳＣへの侵入の速度又は効率を改善することが示唆される。
３’オーバーハングの組成ではなく位置がｓｉＲＮＡの効力に影響を与え、一般にアンチセンス鎖に３’オーバーハングを有する非対称的な二重鎖はセンス鎖に３’オーバーハングを有するものよりも効力が高いことが判明している（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、接続してヘアピン又はステムループの構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することができる。従って、前述のように、本発明のいくつかの実施形態のサイレンシングＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
ショートヘアピンＲＮＡ、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用するとき、ステムループ構造を有し、相補的配列の第１及び第２の領域を含み、該領域の相補性の程度及び配向が該領域間で塩基対合が生じるのに十分であり、該第１及び第２の領域がループ領域によって接合され、該ループがループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ）間の塩基対合の欠如から生じるＲＮＡ分子を指す。ループにおけるヌクレオチド数は、３以上２３以下、又は５以上１５以下、又は７以上１３以下、又は４以上９以下、又は９以上１１以下の数である。ループにおけるヌクレオチドの一部は、ループにおける他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例は、国際公開第２０１３１２６９６３号及び同第２０１４１０７７６３号に提供されている。当業者であれば、得られた一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループ又はヘアピンの構造を形成することを認識するであろう。
トランス作用型ｓｉＲＮＡ（Ｔａ－ｓｉＲＮＡ又はＴａｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ（Ｒａ－ｓｉＲＮＡ）、及び天然アンチセンス転写物由来のｓｉＲＮＡ（Ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）を含む、様々な種類のｓｉＲＮＡが本発明によって企図される。
一実施形態によれば、サイレンシングＲＮＡは、約２６及び３１ヌクレオチド長のＰｉｗｉ結合ＲＮＡのクラスである「ｐｉＲＮＡ」を含む。ｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質との相互作用を通じてＲＮＡ－タンパク質複合体を形成する、すなわち、アンチセンスｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質（例えば、Ｐｉｗｉ、Ａｇｏ３、及びＡｕｂｅｒｇｉｎｅ（Ａｕｂ））にロードされる。
ｍｉＲＮＡ－別の実施形態によれば、サイレンシングＲＮＡはｍｉＲＮＡであってもよい。
用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」は同義であり、遺伝子発現を調節する約１９～２４ヌクレオチド長の非コード一本鎖ＲＮＡ分子の集合体を指す。ｍｉＲＮＡは、広範な生物（例えば、昆虫、哺乳類、植物、線形動物）にみられ、発生、恒常性、及び疾患の病因において役割を果たすことが示されている。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、当初長い不完全な二本鎖のステムループＲＮＡとして存在し、ダイサーによって、成熟ガイド鎖（ｍｉＲＮＡ）とパッセンジャー鎖として知られている同様のサイズの断片（ｍｉＲＮＡ＊）とを含むｓｉＲＮＡ様二重鎖に更にプロセシングされる。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来し得る。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローニングされたｍｉＲＮＡのライブラリーにみられることもあるが、典型的には、ｍｉＲＮＡよりも低頻度である。
当初はｍｉＲＮＡ＊と共に二本鎖種として存在するが、ｍｉＲＮＡは、最終的には、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体に一本鎖ＲＮＡとして組み込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、これによって、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制又は活性化）、及びｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のどちらの鎖がＲＩＳＣにロードされるかが多様になり得る。
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高いレベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡの２～８番目のヌクレオチド（「シード配列」と称される）によって標的核酸を特定する。
翻訳を効率的に阻害するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対合要件については、多くの研究によって調べられている（Ｂａｒｔｅｌ ２００４，Ｃｅｌｌ １１６－２８１により概説）。ゲノム全体におけるｍｉＲＮＡの結合を解析した計算機による研究では、ｍｉＲＮＡの５’側の２～８番目の塩基（「シード配列」とも称される）が標的結合において特別な役割を果たすことが示唆されているが、通常「Ａ」であることが判明している最初のヌクレオチドの役割も認識されている（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｅｌｌ １２０～１５）。同様に、Ｋｒｅｋら（２００５，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７－４９５）は、１～７番目又は２～８番目のヌクレオチドを用いて標的を同定し、検証した。ｍＲＮＡにおける標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はコード領域に存在し得る。興味深いことに、同じ部位又は複数の部位を認識することによって、複数のｍｉＲＮＡが同じｍＲＮＡ標的を調節することがある。ほとんどの遺伝的に同定された標的に複数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在することは、複数のＲＩＳＣの協同作用が最も効率的に翻訳を阻害することを示している可能性がある。
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断又は翻訳抑制という２つの機序のいずれかによって遺伝子発現をダウンレギュレートするようにＲＩＳＣに指示することができる。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対してある程度の相補性を有している場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を指定することができる。ｍｉＲＮＡが切断を導く場合、典型的には、ｍｉＲＮＡの１０及び１１番目の残基に対するヌクレオチド対合間が切断される。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有しない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制することができる。動物ではｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性の程度が低い場合があるので、動物では翻訳抑制がより一般的である可能性がある。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の任意の対の５’末端及び３’末端は多様である場合があることに留意すべきである。この多様性は、切断部位に対するドローシャ及びダイサーの酵素的プロセシングの多様性に起因している可能性がある。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の５’末端及び３’末端における多様性は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因している可能性もある。ステム鎖のミスマッチにより、様々なヘアピン構造の集団が生じる可能性がある。ステム構造における多様性は、ドローシャ及びダイサーによる切断の生成物の多様性にもつながる可能性がある。
一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ダイサーとは独立に、例えばアルゴノート２によってプロセシングされ得る。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～９０ヌクレオチド、６０～８０ヌクレオチド、６０～７０ヌクレオチド、８０～１２０ヌクレオチド、１００～１２０ヌクレオチド、又は１２０～１５０ヌクレオチドを含み得、一方、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～３０，０００ヌクレオチド、５０～２５，０００ヌクレオチド、１００～２０，０００ヌクレオチド、１，０００～１，５００ヌクレオチド、又は８０～１００ヌクレオチドを含み得ることが理解されるであろう。特定の実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、又は一本鎖成熟ｍｉＲＮＡである。
アンチセンス－アンチセンスは、ある遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることによって該遺伝子の発現を阻止又は阻害するように設計された一本鎖ＲＮＡである。標的ＲＮＡをコードしているｍＲＮＡ転写物に特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いて、標的ＲＮＡのダウンレギュレーションを行うことができる。
転位因子ＲＮＡ
転位性遺伝要素（ＴＥ）は膨大なＤＮＡ配列を含み、その全てが、カットアンドペースト機序によって直接（トランスポゾン）又はＲＮＡ中間体を介して間接的に（レトロトランスポゾン）ゲノム中の新たな部位に移動する能力を有している。ＴＥは、転位に必要なタンパク質をコードしているＯＲＦを有しているかどうかに応じて、自律性クラスと非自律性クラスに分けられる。ＲＮＡが媒介する遺伝子サイレンシングは、ゲノムがＴＥ活性、並びにゲノムの遺伝的な及びエピジェネティックな不安定さに由来する有害な影響を制御する機序のうちの１つである。
内在性サイレンシング配列は、古典的な（固有の）ＲＮＡｉ活性を含まない場合がある、及び／又は活性サイレンシング配列ではない場合がある（例えば、古典的なＲＮＡサイレンシング分子ではない）。このような内在性サイレンシング配列としては、以下が挙げられる。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。用語「ｔＲＮＡ」とは、核酸のヌクレオチド配列とタンパク質のアミノ酸配列とを物理的に連結させる機能を有するＲＮＡ分子を指し、以前は可溶性ＲＮＡ又はｓＲＮＡと称されていた。ｔＲＮＡは、典型的には約７６～９０ヌクレオチド長である。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。用語「ｒＲＮＡ」とは、リボソーム、すなわち、リボソーム小サブユニット又はリボソーム大サブユニットのいずれかのＲＮＡ構成要素を指す。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）である。用語「ｓＲＮＡ」又は「Ｕ－ＲＮＡ」とは、真核細胞における細胞核のスプライシングスペックル及びカハール体内にみられる低分子ＲＮＡ分子を指す。ｓｎＲＮＡは、典型的には約１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）である。用語「ｓｎｏＲＮＡ」とは、他のＲＮＡ、例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｓｎＲＮＡの化学修飾を主に導く低分子ＲＮＡ分子のクラスを指す。ｓｎｏＲＮＡは、典型的には、２つのクラスのうちの１つに分類される：Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡは、典型的には約７０～１２０ヌクレオチド長であり、メチル化に関連しており、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡは、典型的には約１００～２００ヌクレオチド長であり、プソイドウリジン化に関連している。
ＲＮＡ成熟においてｓｎｏＲＮＡと同様の役割を果たすｓｃａＲＮＡ（すなわち、低分子カハール体ＲＮＡ遺伝子）はｓｎｏＲＮＡに類似しているが、その標的はスプライセオソームｓｎＲＮＡであり、（核のカハール体において）スプライセオソームｓｎＲＮＡ前駆体の部位特異的な修飾を行う。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）である。用語「ｅｘＲＮＡ」とは、それが転写された細胞の外側に存在するＲＮＡ種を指す（例えば、エキソソームＲＮＡ）。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。用語「ｌｎｃＲＮＡ」又は「長鎖ｎｃＲＮＡ」とは、典型的には２００ヌクレオチドよりも長い非タンパク質コード転写物を指す。
特定の実施形態によれば、内在性サイレンシング配列としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、段階的低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵＲＮＡ）、転位因子ＲＮＡ（例えば、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ分子（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を挙げることができる。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、非コード遺伝子である。ゲノムの例示的な非コード部分としては、非コードＲＮＡ、エンハンサー及び遺伝子座制御領域、インスレーター、Ｓ／ＭＡＲ配列、非コード偽遺伝子、非自律性のトランスポゾン及びレトロトランスポゾン、並びに染色体のセントロメア及びテロメアの領域の非コード単純反復の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、遺伝子と遺伝子との間、すなわち遺伝子間領域に位置する。一実施形態によれば、内在性サイレンシング配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）である。
本発明のサイレンシング挿入物は、それが由来する内在性サイレンシング配列とは異なる遺伝子を標的とする。言い換えれば、サイレンシング挿入物は、標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列を含み、内在性サイレンシング配列は、第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列を含む。第１及び第２の標的遺伝子は、一般に、異なるタンパク質又はＲＮＡ分子をコードしている。特定の実施形態では、第１及び第２の標的遺伝子は、８０％未満、例えば７０％未満、６０％未満、又は５０％未満の配列同一性を有する。
プロモーター及びターミネーター
本発明のサイレンシング挿入物は、サイレンシングＲＮＡの所望の発現を駆動するためのプロモーター及びターミネーターを含む。上記で詳述した通り、サイレンシング挿入物の設計には、所望の標的遺伝子を標的とするように改変するのに適切な配列を同定するために内在性サイレンシング配列、そのプロモーター、そのターミネーター、及びその発現プロファイルを分析することが含まれる。
真核生物のプロモーターは、典型的には、ＴＡＴＡボックス及び上流のプロモーターエレメントという２種類の認識配列を含有する。転写開始点の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始するように指示することに関与していると考えられている。他の上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
実施例１及び２は、適切なプロモーター及びターミネーターの配列を同定するために有用な例示的なプロセス及びデータベースを提供する。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、プロモーターの一部及び／又はターミネーターの一部を含む。プロモーター及びターミネーター配列の境界を正確に決定することは必須ではなく、プロモーターの一部及び／又はターミネーターの一部を用いてサイレンシングＲＮＡを有効に発現させることができる。
特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、キメラプロモーター、発生的に調節されるプロモーター、生物的条件特異的プロモーター、又は非生物的条件特異的プロモーターである。プロモーターは、強力なプロモーターであっても弱いプロモーターであってもよい。組織特異的プロモーターは、種子、胚乳、胚、花、葯、根、若花、カルス、芽、葉、又は***組織等の任意の適切な組織、又は１つを超える上記組織において発現を駆動することができる。エンハンサーエレメントは、連結された相同又は異種のプロモーターからの転写を刺激して最大１，０００倍にすることができる。エンハンサーは、転写開始点の下流又は上流に配置されたときに活性を有する。特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、内在性サイレンシング配列由来のエンハンサーを含み得る。サイレンシング挿入はまた、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの配列等の発現を制御する他の配列を含んでいてもよい。
標的遺伝子の発現を低下させる方法
本発明は、真核細胞にサイレンシング挿入物を挿入することを含む、標的遺伝子の発現を低下させる方法を提供する。有利なことに、本発明の方法及び本発明のサイレンシング挿入物は、最小限のヌクレオチド改変で内在性配列をその内在性配置で使用しつつ、特異的なサイレンシングを提供する。サイレンシング挿入物は、当業者に利用可能な種々の技術を用いて真核細胞に挿入することができる。
好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物は、１回の送達で再生植物細胞のゲノムに挿入され、それにより、選択されるプロモーター、ターミネーター、又は他の調節配列に応じて、全ての細胞に挿入物を有する植物の作出及び全ての細胞又は選択された細胞における標的遺伝子のサイレンシングを可能にする。
好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物は、微粒子銃、プロトプラストトランスフェクション、エレクトロポレーション、又はナノ粒子媒介トランスフェクションによって挿入される。これら技術は、標的細胞に外来性トランスジェニック（例えば、外来性）配列を導入しないので、効率的である。
好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物発現カセットは、ＤＮＡ銃により線状ＤＮＡとして細胞に導入される。このような実施形態では、サイレンシング挿入物は、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）によって組み込まれ得る。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、平滑末端を有する線状分子として導入される。そのような分子は、標準的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、それ以上処理を行うことなく生成することができる。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、突出末端を有する線状分子として導入される。そのような分子は、５’末端に固有の制限部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行うことで生成することができる。ＰＣＲ産物を対応する高忠実度制限酵素で制限酵素消化すると、突出末端が生じる。
サイレンシング挿入物発現カセットは、好ましくは、化学合成によって作製され、高忠実度ＰＣＲによって全体として増幅される。あるいは、サイレンシング挿入物カセットは、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて挿入物のベースとなる配列に関連する改変を導入するための重複ＰＣＲ反応を行うことによって作製することもできる（図５）。これらアプローチはいずれもプラスミドを使わない方法を構成する。ＰＣＲ増幅の後かつ制限酵素消化の前に、市販のキットとして入手可能な遠心フィルターを用いることによってＤＮＡを濃縮する必要がある場合もある。特定の実施形態では、化学的に安定化された分子が使用され、このようなオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ分解を減少させるために安定化５’－ホスホロチオエート結合を含む。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いてＴ－ＤＮＡカセットにおいて真核細胞に導入されるか、又はサイレンシング挿入物は、挿入されるＴ－ＤＮＡカセット配列内にあるか、又は単離されるサイレンシングコンストラクトが、Ｔ－ＤＮＡカセットである。Ｔ－ＤＮＡカセットを使用すると、植物細胞において高頻度でサイレンシング挿入物が組み込まれ、後述するように、サイレンシング挿入物と並んで選択可能なマーカー、及びエンドヌクレアーゼ、及びガイドＲＮＡ等の追加の配列を組み込むことが可能になる。このようなＴ－ＤＮＡカセットは、完全な形でゲノムに組み込まれてもよく、サイレンシング挿入物のみが組み込まれてもよい。
特定のこのような実施形態では、Ｔ－ＤＮＡカセットは選択可能なマーカーを含み、これは成功した形質転換体の選択を支援することができる。例示的な選択可能なマーカーについては、次の章で論じる。
本発明のサイレンシング挿入物を真核細胞に導入するためには、他の様々な方法を用いることもできる。このような方法は、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）、及びＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に記載されており、例えば、安定的又は一過的トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、組換えウイルスベクターの感染が挙げられる。更に、ポジティブ－ネガティブセレクション法については、米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号を参照。
従って、核酸の送達は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、及び／若しくはタンパク質、又は核酸とペプチドとの組み合わせを細胞に送達する方法において、プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照）；乾燥／阻害が媒介するＤＮＡの取り込みによる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３－８）；エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照）；炭化ケイ素繊維と共に撹拌することによる（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号を参照）；アグロバクテリウムが媒介する形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、同第５，５９１，６１６号、第５，６９３，５１２号、同第５，８２４，８７７号、同第５，９８１，８４０号、及び同第６，３８４，３０１号を参照）；ＤＮＡでコーティングされた粒子の加速による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号、及び同第６，４０３，８６５号を参照）、並びにナノ粒子、ナノキャリア、及び細胞透過性ペプチドによる（国際公開第２０１１２６６４４Ａ２号、同第２００９０４６３８４Ａ１号、同第２００８１４８２２３Ａ１号）方法が挙げられるがこれらに限定されない当業者に公知の任意の方法によって、本発明の実施形態における細胞に導入してもよい。好ましくは、挿入方法は、サイレンシング挿入物（及び任意選択の選択可能なマーカー）に加えていかなる配列も導入しないか、又はいかなる外来性配列も導入しない。
トランスフェクションの他の方法としては、トランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ－Ｌａｔａｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，４８９７－９０２）、細胞透過性ペプチド（Ｍａｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６９（２）：１０１－７）、又はポリアミン（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，２０１０，Ｓｈｏｒｔ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（３）：３５９－３６６）の使用が挙げられる。
特定の実施形態によれば、細胞（例えば植物細胞、例えばプロトプラスト）にＤＮＡを導入するために、方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が媒介するＤＮＡの取り込みを含む。更なる詳細については、Ｋａｒｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．９：５７５－５７８；Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：２２１－２２６；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３－３７３を参照。
ウイルス感染による細胞（例えば、真核細胞）への核酸の導入は、リポフェクション及びエレクトロポレーション等の他の方法に比べていくつかの利点をもたらすが、その理由は、ウイルスの感染性に起因して、より高いトランスフェクション効率を得ることができるためである。
現在、好ましいインビボ核酸移入技術としては、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のウイルス又は非ウイルスコンストラクトによるトランスフェクション、及び脂質ベースの系が挙げられる。脂質が媒介する遺伝子の移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ－Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１４（１）：５４－６５（１９９６）］。遺伝子治療の場合、好ましいコンストラクトはウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルスコンストラクト等のウイルスコンストラクトは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー若しくは遺伝子座を定義するエレメント（複数可）、又はオルタナティブスプライシング、核内ＲＮＡ核外輸送、若しくはメッセンジャーの翻訳後修飾等の他の手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。このようなベクターコンストラクトは、予めウイルスコンストラクト内に存在していない限り、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、及び使用するウイルスに適したプラス鎖及びマイナス鎖のプライマー結合部位も含む。更に、このようなコンストラクトは、典型的には、それが配置される宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。任意で、コンストラクトは、ポリアデニル化を指示するシグナル、並びに１つ以上の制限部位及び翻訳終結配列を含んでいてもよい。一例として、このようなコンストラクトは、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２の鎖のＤＮＡの合成起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。カチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマー等の非ウイルス性の他のベクターを使用してもよい。挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含む以外に、本発明のいくつかの実施形態の発現コンストラクトは、発現したペプチドの安定性、生成、精製、収量、又は毒性を高めるように遺伝子操作された配列を含んでいてもよい。
特定の実施形態によれば、真核細胞にサイレンシング挿入物を導入するために、打ち込み（bombardment）法が用いられる。一実施形態によれば、方法は、一過的である。真核細胞の打ち込みは、参照により本明細書に援用されるＵｃｈｉｄａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．（２００９）１７９０（８）：７５４－６４にも教示されている。
一実施形態によれば、植物細胞は、本発明のいくつかの実施形態の核酸コンストラクトで安定的又は一過的に形質転換され得る。安定的な形質転換では、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子が植物のゲノムに組み込まれるので、安定的かつ遺伝性の形質となる。一過的な形質転換では、核酸分子は、形質転換された細胞によって発現されるがゲノムには組み込まれないので、一過的な形質となる。
単子葉植物及び双子葉植物の両方に外来遺伝子を導入する様々な方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５－２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４－２７６）。
外来性ＤＮＡを植物のゲノムＤＮＡに安定的に組み込むための基本的な方法は、２つの主なアプローチを含む：
（ｉ）アグロバクテリウムが媒介する遺伝子移入：Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７－４８６；Ｋｌｅｅ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．２－２５；Ｇａｔｅｎｂｙ，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｕｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９８９）ｐ．９３－１１２。
（ｉｉ）以下を含む、ＤＮＡの直接取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．５２－６８；ＤＮＡをプロトプラストに直接取り込む方法、Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０７２－１０７４．植物細胞に短時間電気ショックを与えることによって誘導されるＤＮＡ取り込み：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９－３８４．Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１－７９３．微粒子銃による植物の細胞又は組織へのＤＮＡ注入、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９－５６３；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３－９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６－２０９；マイクロピペットシステムの使用による：Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０－３６；Ｎｅｕｈａｕｓ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３－２１７；細胞培養物、胚、又はカルス組織のガラス繊維又は炭化ケイ素ウイスカー形質転換、米国特許第５，４６４，７６５号、又はＤＮＡを出芽花粉と共に直接インキュベーションすることによる、ＤｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ，ｅｄｓ．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｍａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８５）ｐ．１９７－２０９；及びＯｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５－７１９。
アグロバクテリウム系は、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる規定のＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターを使用することを含む。植物組織への接種方法は、植物種及びアグロバクテリウム送達系によって異なる。広く使用されているアプローチは、植物全体の分化を開始させるのに優れた資源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができるリーフディスク手順である。Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）ｐ．１－９．補助的なアプローチでは、真空浸透と組み合わせてアグロバクテリウム送達系を使用する。アグロバクテリウム系は、特にトランスジェニック双子葉植物の創出において実行可能である。
一実施形態によれば、アグロバクテリウムを使用しない発現方法を用いて植物細胞に外来遺伝子を導入する。一実施形態によれば、アグロバクテリウムを使用しない発現方法は一過的である。特定の実施形態によれば、打ち込み法を用いて植物細胞に外来遺伝子を導入する。別の特定の実施形態によれば、植物の根への打ち込みを用いて植物細胞に外来遺伝子を導入する。
本発明の方法は、サイレンシング挿入物のサイレンシング特異性又は効率を測定することを含み得、これらは、標的遺伝子のＲＮＡ若しくはタンパクの質レベルを測定することによって求めることもでき、表現型的に判定することもできる。
表現型的な判定は、細胞サイズ、成長の速度／阻害、細胞形状、細胞膜の完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、腫瘍の血管新生、生物の着色、生物のサイズ、作物の収量、代謝プロファイル、果実の形質、生物的ストレス抵抗性、非生物的ストレス抵抗性、感染パラメータ、及び炎症パラメータからなる群から選択される少なくとも１つの表現型を判定することによって影響を受け得る。
本発明のいくつかの実施形態によれば、サイレンシング挿入物のサイレンシング特異性又は効率は、遺伝子型的に判定される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、遺伝子型の前に表現型を判定する。本発明のいくつかの実施形態によれば、表現型の前に遺伝子型を判定する。
本明細書で使用するとき、標的遺伝子の発現を低下させる及び標的遺伝子の発現をサイレンシングするとは、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物が存在しないか又は観察可能なレベルの低下を指す。従って、本発明の設計されたサイレンシング挿入物が標的としない標的遺伝子と比較して、標的遺伝子は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％サイレンシングされ得る。
表現型レベルで、分子事象の検出によって、蛍光レポーターの検出によって、又は（選択可能なマーカーを使用する場合）選択の存在下で成長させることによって挿入の成功を検出することができ、挿入が成功すると上記によって選抜される改変細胞となり得る。実施例５は、例示的な同定及び選択プロトコールを提供する。
一実施形態によれば、改変細胞の選抜は、新たに編集されたサイレンシングＲＮＡ分子の発現（例えば、新たに編集されたｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ等の存在）を解析することによって行われる。
一実施形態によれば、改変細胞の選抜は、標的遺伝子によって影響を受ける表現型的形質、例えば、細胞サイズ、成長速度／阻害、細胞形状、細胞膜の完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、腫瘍の血管新生、着色、サイズ、生物における感染パラメータ（例えば、ウイルス量又は細菌量）、植物の葉の発色、例えば、葉及び他の器官におけるクロロフィルの部分的又は完全な消失（白化）、壊死パターンの有無、花の発色、果実の形質（例えば、保存期間、硬さ、及び香り）、成長速度、植物サイズ（例えば、矮性）、作物の収量、生物的ストレス抵抗性（例えば、耐病性、線形動物の死亡率、甲虫の産卵率、又は細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、昆虫、雑草、及び栽培植物若しくは在来植物のいずれかに関連する他の抵抗性表現型）、作物の収量、代謝プロファイル、果実の形質、生物的ストレス抵抗性、非生物的ストレス抵抗性（例えば、耐暑性／耐寒性、耐干性、耐塩性、アリルアルコールに対する抵抗性、又は例えばリン（Ｐ）等の栄養素の不足に対する抵抗性等）を解析することによって行われる。
一実施形態によれば、改変細胞の選抜は、標的遺伝子のＲＮＡレベルを測定することにより、サイレンシング挿入物のサイレンシング活性及び／又は特異性を分析することによって行われる。これは、例えばノーザンブロッティング、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、定量ＲＴ－ＰＣＲ、又はイムノブロッティング等の当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。
一実施形態によれば、改変細胞の選抜は、内在性サイレンシング配列とは配列が異なるサイレンシング挿入物の存在について細胞を分析することによって行われる。配列変化を検出する方法は当技術分野において周知であり、ＤＮＡ及びＲＮＡのシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマーエクステンション、サザンブロット、ノーザンブロット、及びドットブロット分析等のハイブリダイゼーションアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。また、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために使用される様々な方法、例えば、ＰＣＲベースのＴ７エンドヌクレアーゼ、ヘテロ二重鎖、及びサンガーシーケンシング、又はＰＣＲに続いて制限酵素で消化して固有の制限部位（複数可）の出現若しくは消失を検出する等を用いてもよい。
インデル等のＤＮＡ編集事象の存在を検証する別の方法は、ミスマッチＤＮＡを認識し、切断する構造選択的酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を利用するミスマッチ切断アッセイを含む。
一実施形態によれば、形質転換細胞の選抜は、蛍光レポーターが発する蛍光を示す形質転換細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で選択することによって行われる。ＦＡＣＳ選別の後、蛍光マーカーを示す形質転換真核細胞の陽性選択されたプールを収集し、上述のようにＤＮＡ編集事象を試験するためにアリコートを使用することができる。
抗生物質選択マーカーを使用した場合、形質転換後に、選択（例えば、抗生物質）の存在下で、例えば細胞培養下で又は植物細胞が発生してコロニー、すなわちクローン及びマイクロカルスになるまで真核細胞を培養する。次いで、細胞培養物の細胞の又はカルスの細胞の一部を、上述のようにＤＮＡ編集事象について分析（検証）する。
陽性の真核細胞クローンを保存してもよい（例えば、凍結保存）。
本発明の方法の好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列とを更に含むコンストラクトにおいて、真核細胞のゲノムに挿入される。同様に、本発明の真核細胞は、好ましくは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と、内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列と、本発明のサイレンシング挿入物とを含むコンストラクトをそのゲノム中に含み得る。同様に、本発明のサイレンシングコンストラクトは、サイレンシング挿入物と、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と、内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列とを含み得る。好ましくは、サイレンシングコンストラクトは、Ｔ－ＤＮＡカセットである。このような本発明の実施形態の利点と以下の段落で述べる利点については、実施例６で更に実証される。
上記の実施形態に記載の通りＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡを使用すると、真核細胞を更に改変することが可能になる。例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、内在性サイレンシング配列に挿入、欠失、又は挿入及び欠失等の改変を導入することができ、これにより、内在性サイレンシング配列の発現又は活性を低下又は消失させる。従って、１回の形質転換で、内在性サイレンシング配列がノックアウトされると同時にサイレンシング挿入物の新たなサイレンシング特異性が提供される。従って、本発明の方法の特定の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、挿入、欠失、又は挿入及び欠失等の改変を内在性サイレンシング配列に導入し、これにより、内在性サイレンシング配列の発現又は活性を低下又は消失させる。また、特定の実施形態では、本発明の真核細胞における内在性サイレンシング配列は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡによって導入された改変、例えば、挿入、欠失、又は挿入及び欠失等を含み、これにより、内在性サイレンシング配列の発現又は活性を低下又は消失させる。特定の実施形態では、細胞、植物、又は動物における全ての内在性サイレンシング配列が、挿入、欠失、又は挿入及び欠失によってノックアウトされる。
更に、上記の実施形態に記載の通りＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡを使用すると、相同性指向性修復（ＨＤＲ）によって内在性サイレンシング配列をサイレンシング挿入物に置換することが可能になる。これにより、内在性遺伝子座において新たなサイレンシング特異性が得られる。次いで、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含むサイレンシング挿入物を繁殖させて除去して、内在性サイレンシング配列の位置に置換されたサイレンシング挿入物を含みかつ真核細胞のゲノムに挿入されたコンストラクトを含まない植物又は家畜動物を提供することができる。このような植物や家畜動物は、最小限の遺伝子変化しか有しないので、例えば消費者及び規制当局にとって非常に望ましい。従って、本発明の方法の特定の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、真核細胞における内在性サイレンシング配列のサイレンシング挿入物による置換を媒介し、任意で、該方法は、植物又は家畜動物を作出し、ゲノムに挿入されたコンストラクトを繁殖させて除去し、それにより、内在性サイレンシング配列の位置に置換されたサイレンシング挿入物を含みかつ真核細胞のゲノムに挿入されたコンストラクトを含まない植物又は家畜動物を作出することを更に含む。特定の実施形態では、細胞、植物、又は動物における全ての内在性サイレンシング配列が置換される。
特定の実施形態では、細胞、植物、又は動物における１つ以上の内在性サイレンシング配列が、挿入、欠失、又は挿入及び欠失によってノックアウトされ、細胞、植物、又は動物における１つ以上のｎｏｕｓサイレンシング配列が、サイレンシング挿入物に置換される。
上記の実施形態と一致して、本明細書に記載の任意の実施形態と組み合わせることができる本発明の別の態様では、そのゲノム中に
（ａ）ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列、内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列、並びにプロモーター又はその一部、第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含むサイレンシング挿入物を含む挿入コンストラクトと、
（ｂ）該挿入コンストラクトによって分離された内在性ゲノム配列と、
（ｃ）該サイレンシング挿入物によって置換された、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む内在性サイレンシング配列と、
を含み、
該サイレンシング挿入物及び該内在性サイレンシング配列が、その置換前に、該挿入物の長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、該第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもない真核細胞が提供される。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物と、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と、内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列とを含むコンストラクトを、内在性サイレンシング配列を改変することなく組み込むことができる。次いで、本発明の方法は、植物又は家畜動物を作出し、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが内在性サイレンシング配列のサイレンシング挿入物による置換を媒介するまで、該植物又は家畜動物を少なくとも１世代繁殖させることを更に含み得る。
上記の実施形態は、サイレンシング挿入物にエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを組み込むことにより、１回の形質転換で、内在性のサイレンシング遺伝子座でサイレンシング挿入物を交換する可能性も提供すると同時にサイレンシング挿入物を発現する植物又は家畜動物を高頻度で作出することができるため、効率的な製品開発アプローチを提供する。エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを有するサイレンシング挿入物は、その後、最小限の遺伝子変化しか有しない植物又は動物を作出するために繁殖させて除去することができる。
本明細書に開示される任意の実施形態と組み合わせることができる本発明の更なる態様では、サイレンシングカセットを真核細胞のゲノムに導入することを含む、第１の標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、
該サイレンシングカセットが、プロモーター又はその一部、該第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含み、
該サイレンシングカセットが、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む該真核細胞における内在性サイレンシング配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、該第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもない方法を提供する。特定の実施形態では、相同性指向性修復経路を介して内在性サイレンシング配列がサイレンシングカセットに置換される。本発明のこの態様の特定の実施形態では、サイレンシングカセットは、相同性指向性修復経路を介した内在性サイレンシング配列の位置におけるサイレンシングカセットの導入を媒介するのに好適なＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードしている配列もコードしている配列に導入される。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物又はサイレンシングカセットは、内在性サイレンシング配列遺伝子座におけるＨＤＲを支援するために、プロモーターの５’及びターミネーターの３’に相同性アームを含む。相同性アームは、１００～２０００ヌクレオチド長、例えば１００～１５００ヌクレオチド長、１００～１０００ヌクレオチド長、２００～１０００ヌクレオチド長、２００～７５０ヌクレオチド長、３００～７５０ヌクレオチド長、３５０～７５０ヌクレオチド長、４００～６００ヌクレオチド長であり得る、特定のこのような実施形態では、Ｔ－ＤＮＡカセットは選択可能なマーカーを含み、これは成功した形質転換体の選抜を支援することができる。例示的な選択可能なマーカーについては、次の章で論じる。
本発明の上記実施形態における使用に適した好適なＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、一般に「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」（又は「Ｃａｓ」）であり、これは、ＲＮＡガイドポリヌクレオチド編集活性を有するエンドヌクレアーゼを指す。このようなエンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの付加的な構成要素である「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）を使用する、ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素の１つである。本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」（又は「Ｃａｓ９」）である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＢｌａｔＣａｓ９（Ｓｈｏｔａ Ｎａｋａｄｅ，Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ＆Ｔｅｔｓｕｓｈｉ Ｓａｋｕｍａ（２０１７），Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ８：３，２６５－２７３、及びその参照文献）等であるがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意のＣａｓ９であってもよい。他の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１（Ｓｈｏｔａ Ｎａｋａｄｅ，Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ＆Ｔｅｔｓｕｓｈｉ Ｓａｋｕｍａ（２０１７），Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，８：３，２６５－２７３、及びその参照文献）等であるがこれらに限定されないＣｐｆ１であってもよい。
いくつかの実施形態によれば、本発明の上記実施形態で使用するのに好適なＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、「改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」（又は「改変型Ｃａｓ」）である。本明細書で使用するとき、改変型Ｃａｓとは、触媒ドメインが変化している及び／又は追加のドメインと融合しているＣａｓを指す。いくつかの実施形態によれば、「改変型Ｃａｓ」とは、不活性触媒ドメイン（ｄｅａｄ Ｃａｓ又はｄＣａｓ）を含有し、ヌクレアーゼ活性を有さないが、依然としてｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに結合することはできるＣａｓを指す。いくつかの実施形態によれば、「改変型Ｃａｓ」とは、ニッカーゼ活性を有する（「ｎＣａｓ９」）ので、一本鎖切断を誘導するＣａｓを指す。いくつかの実施形態では、改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、「改変型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」であり、場合によっては、触媒的に不活性なＣａｓ９（すなわち「ｄＣａｓ９」）又はニッカーゼＣａｓ９（「ｎＣａｓ９」）である。ｄＣａｓは、不活性酵素を既知の調節ドメインに融合させることによって遺伝子発現を活性化又は抑制するためのＤＮＡ転写調節因子用のプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列にｄＣａｓが単独で結合すると、遺伝子の転写に干渉することができる。標的配列の選択及び／又は設計に役立てるのに利用可能なツールに加えて、バイオインフォマティクスで特定された様々な種における様々な遺伝子に固有のｇＲＮＡのリストが多数公に利用可能であり、例えば、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ「Ｅ－ＣＲＩＳＰ」、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：「Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ」、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム中の特定のＣａｓ９標的を同定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、及びＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ等であるが、これらに限定されない。
本発明の文脈において、ｄＣａｓ又はｎＣａｓ９等の改変型Ｃａｓを、塩基編集のために他の酵素と共に（場合によっては融合タンパク質として）いくつかの実施形態に従って使用することもできる。塩基編集は、ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を他の酵素と併用して、二本鎖ＤＮＡを切断することなく細胞のＤＮＡ又はＲＮＡに点変異を直接導入するゲノム編集アプローチである。ＤＮＡ塩基エディターは、核酸塩基デアミナーゼ酵素と融合した触媒作用のないヌクレアーゼと、場合によってはＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含む。ＲＮＡ塩基エディターは、ＲＮＡを標的とする構成要素を用いて同様の変化を実現する。塩基エディターは、ある塩基又は塩基対を別の塩基又は塩基対に直接変換することで、過剰な望ましくない編集副産物を生成することなく、非***細胞に点変異を効率的に導入することを可能にする（Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ（２０１８），“Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１２）：７７０－７８８）。いくつかの実施形態によれば、改変型Ｃａｓ９は、アデノシン又はシチジンデアミナーゼ等の塩基エディター酵素と融合したｎＣａｓである。企図される具体的な塩基エディターとしては、ＡＰＯＢＥＣ、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－ＧＡＭ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、Ｃａｓ１２ａ－ＢＥ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、Ａ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、ＳａＫＫＨ－ＡＢＥが挙げられる（Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ（２０１８），“Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１２）：７７０－７８８、及びその参照文献）。
本明細書で使用するとき、用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、互換的に使用することができ、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの標的配列への特異的ターゲティングを促進するポリヌクレオチドを指す。従って、ガイドＲＮＡは、内在性サイレンシング配列を標的とするのに好適な配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｇＲＮＡは、キメラ／単一分子（単一のＲＮＡ分子を含み、単一ガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡとも称される）であってもよく、又はモジュラー（１つを超える別個のＲＮＡ分子を含み、典型的には、例えば二重鎖形成によって連結され得るｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡである）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ（及び連結ループ）の両方を含むＲＮＡ分子である。ｓｇＲＮＡは、単一のキメラ転写物において標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）とｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結させる内在性細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とをコードしているヌクレオチド配列を含む。可変領域として知られているｃｒＲＮＡのこの領域は、関連するエンドヌクレアーゼの切断特異性を付与し、典型的には２０ヌクレオチド長である。
選択可能なマーカー
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物は、選択可能なマーカー配列である付加配列に隣接する。このような選択可能なマーカーの使用は、成功した形質転換体の同定を支援し、サイレンシングされた遺伝子を有する細胞の作製効率を高める。
一般に、選択可能なマーカーは、内在性サイレンシング配列と同じ内在性配列には由来しないので、内在性サイレンシング配列の配列又は内在性サイレンシング配列に隣接する配列と高度に同一ではない。従って、サイレンシング挿入物と内在性配列との間の配列同一性は、隣接する選択可能なマーカーを除外することによって算出される。特定のそのような実施形態では、選択可能なマーカー配列は、異なる内在性配列に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の配列同一性を有する。
一般に、選択可能なマーカーは、それ自体のプロモーター及びターミネーターを含む。いくつかの実施形態によれば、選択可能なマーカーは、その天然に存在するプロモーター及びターミネーター又はその一部を含む。いくつかの実施形態によれば、選択可能なマーカーは、真核細胞の内在性配列又はその変異バージョン（例えば、優性変異）であり、該選択可能なマーカーは、その天然に存在するプロモーター及びターミネーター又はその一部を含む。特定の実施形態では、選択可能なマーカー及びサイレンシング挿入物は、それらのプロモーターが反対方向に転写される「ヘッド・ツー・ヘッド（head to head）」構成で配置される。別の実施形態では、プロモーターは同方向に転写される。
好ましい実施形態では、選択可能なマーカー配列は、真核細胞に内在する。特に好ましい実施形態では、選択可能なマーカーは、真核細胞に内在する配列の変異体バージョンである。更に特に好ましい実施形態では、マーカーの変異体バージョンは、同じ種の別の真核細胞におけるマーカーと同じである。言い換えれば、変異体バージョンのマーカーは、特定の個体において天然に存在する。このようなマーカーはいずれも、遺伝子サイレンシングを達成するために最小限の外来性遺伝物質しか使用されないことを保証する。
本発明で使用するのに好ましい選択可能なマーカーは、クロルスルフロン等であるがこれに限定されない、ＡＬＳ阻害剤に対する除草剤抵抗性を付与する変異型ＡＬＳ遺伝子である。いくつかの実施形態によれば、変異型ＡＬＳ遺伝子は天然に存在するため、外来性遺伝物質を導入することなく、サイレンシング挿入物と連結した選択可能なマーカーとして導入することができる。そのような方法の例を実施例３に提供する。好ましいＡＬＳ変異は、Ｐ１９７Ｔである。
別の実施形態では、マーカーは、成功した形質転換体を同定した後にゲノムから切除することができる選択可能で切除可能なエレメントである。特定のそのような実施形態では、エレメントは、遺伝子編集剤によって切除可能な抗生物質抵抗性遺伝子等の選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカーカセットは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９又はＴＡＬＥＮ等の遺伝子編集因子によって認識及び切断される内在性標的配列に隣接している。選択可能なマーカーのゲノム切除は、挿入された隣接内在性配列を切断する配列特異的遺伝子編集因子を導入することによって達成される。
別の実施形態では、マーカー、任意で切除可能マーカーは、抗生物質選択マーカーである。使用することができる抗生物質選択マーカーの例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）である。本教示に従って使用することができる追加のマーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｃＣ３）抵抗性並びにブレオマイシン及びフレオマイシン抵抗性の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。更に好ましいマーカーとしては、トリアジン抵抗性を与える変異体ｐｓｂＡ、特にＧ２６４Ｓ及びＩ２１９Ｖ；並びにＥＰＳＰ合成酵素阻害剤に対する抵抗性を付与する変異体エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）、特にトリプトファン１０２変異、アラニン１０３変異、及びプロリン１０６変異が挙げられる。
酵素ＮＰＴＩＩは、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネチン（又はＧ４１８）、及びパロモマイシン等の多数のアミノグリコシド抗生物質をリン酸化によって不活性化することが理解されるであろう。これらのうち、カナマイシン、ネオマイシン、及びパロマイシンは、多様な植物種で使用される。
植物、並びに植物及び植物生産物の生成方法
本発明の方法及び生産物は、植物細胞を含む真核細胞における遺伝子のサイレンシングに有用である。特定の遺伝子の発現がサイレンシングされた植物細胞を使用して、改良された形質を有し得、より効率的に生成され得る改良された植物及び植物生産物を生成することができる。
従って、本発明は、本発明の真核細胞を含む植物又は植物の一部、例えば種子を提供し、本発明の植物細胞を植物に成長させ、任意で該植物を繁殖させる方法を提供する。本発明はまた、果実又は他の植物生産物の収穫方法も提供する。
特定の実施形態では、本発明の方法は、交配又は自殖を含み得る追加の育種を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、本発明の真核細胞は、プロトプラスト、例えば、果実、花、根、葉、胚、胚細胞懸濁液、カルス、又は苗組織等の任意の植物組織に由来するプロトプラストである。特定の実施形態では、植物細胞は、体細胞胚形成細胞等の胚形成細胞である。
本発明のサイレンシング挿入物を用いた安定的な形質転換後に、植物を繁殖させてもよい。植物を繁殖させる最も一般的な方法は、種子によるものである。しかし、種子繁殖による再生では、メンデルの法則に支配される遺伝的分散に従って植物が種子を生成するので、ヘテロ接合性により作物の均一性が失われるという問題がある。基本的に、それぞれの種子は遺伝子的に異なっており、それぞれがその固有の形質を持って成長する。従って、形質転換された植物は、再生された植物が親トランスジェニック植物と同一の形質及び特徴を有するように生成されることが好ましい。従って、形質転換された植物は、遺伝的に同一の形質転換された植物を迅速に一貫して再生させる微細繁殖によって再生されることが好ましい。
微細繁殖とは、選択した親植物又は品種から切除した単一の組織片から新世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスにより、所望の形質を有する植物を大量に再生させることが可能になる。新たに生成された植物は、元の植物と遺伝子的に同一であり、元の植物の特徴を全て有している。微細繁殖（又はクローン化）は、短期間で高品質の植物材料を大量に生産することができ、元のトランスジェニック又は形質転換植物の特徴を保持しつつ、選択した品種を迅速に繁殖させられる。クローン植物の利点は、植物の増殖速度並びに生成される植物の品質及び均一性である。
微細繁殖は、段階間で培養培地又は生育条件を変更する必要のある多段階手順である。従って、微細繁殖プロセスは４つの基本的な段階を含む：段階１、初期組織培養；段階２、組織培養増殖；段階３、分化及び植物形成；並びに段階４、温室栽培及び順化。段階１の初期組織培養中に、組織培養物を確立し、汚染物質のないことを証明する。段階２中に、生産目標を達成するのに十分な数の組織サンプルが生成されるまで、初期組織培養物を増殖させる。段階３中に、段階２で成長させた組織サンプルを分割し、個々の小植物に成長させる。段階４では、形質転換された小植物を順化のために温室に移し、そこで、自然環境で成長することができるように、光に対する植物の耐性を徐々に高める。
現在は安定的な形質転換が好まれているが、本発明のいくつかの実施形態によって、葉の細胞、***組織細胞、又は植物全体の一過的な形質転換も想定される。
本発明の好ましい植物生産物としては、種子、特にコーヒー豆及び米、並びに果実、特にバナナが挙げられる。
本発明の真核細胞を更に培養し、例えば、未分化な状態で長期間維持してもよく、又は必要に応じて他の細胞種、組織、器官、又は生物への分化を誘導してもよい。
まず植物細胞の群に成長させ、カルスに発生させ、次いで、植物組織培養法を用いてカルスからシュートを再生させる（カルス発生（ｃａｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））ことによって、植物細胞（例えば、プロトプラスト又は胚細胞懸濁液（ＥＣＳ）中の細胞）を植物全体に再生させることができる。プロトプラストをカルスに成長させ、シュートを再生させるには、組織培養培地に植物成長調節物質を適切なバランスで配合する必要があり、これは、各植物種ごとにカスタマイズしなければならない。
また、プロトプラスト融合と呼ばれる技術を用いて、プロトプラストを植物の育種に使用することもできる。電界又はポリエチレングリコールの溶液を用いることによって、異なる種由来のプロトプラストの融合を誘導する。この技術を使用して、組織培養で体細胞ハイブリッドを生成することができる。
プロトプラストを再生させる方法は、当技術分野において周知である。いくつかの要因、すなわち、遺伝子型、ドナー組織及びその前処理、プロトプラストを単離するための酵素処理、プロトプラストの培養方法、培養、培養培地、並びに物理的環境が、プロトプラストの分離、培養、及び再生に影響を与える。完全な概説については、Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ：３－３６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照。
再生した植物は、当業者が適切であると考える通り更なる育種及び選抜に供してもよい。
従って、本発明の実施形態は、更に、本発明のサイレンシング挿入物を含む植物、植物細胞、及び植物のプロセシング産物に関する。
本発明の一態様によれば、繁殖を可能にする条件下で植物又は植物細胞を成長させることを含む、本発明のいくつかの実施形態の植物又は植物細胞を作出する方法が提供される。
用語「植物」は、本明細書で使用するとき、植物全体、接ぎ木された植物、植物の祖先及び後代、並びに種子、芽、茎、根（塊茎を含む）、台木、若枝、並びに植物の細胞、組織、及び器官を含む植物の一部を包含する。植物は、懸濁培養物、胚、***組織領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含む任意の形態であってもよい。本発明の方法において有用であり得る植物としては、緑色植物上科に属する全ての植物、具体的には、以下を含むリストから選択される飼料又は飼い葉植物、観賞植物、食用作物、樹木、又は低木を含む単子葉及び双子葉の植物が挙げられる：アカシア属（Ａｃａｃｉａ）の種、カエデ属（Ａｃｅｒ）の種、マタタビ属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）の種、トチノキ属（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）の種、アガティス・オーストラリス（Ａｇａｔｈｉｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリカラー（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）の種、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）の種、ビンロウジュ（Ａｓｅｃａ ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・シサー（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリジュガ（Ｂａｉｋｉａｅａ ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ属（Ｂｅｔｕｉｌａ）の種、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種、オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・アフリカーナ（Ｂｕｒｋｅａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ハナモツヤクノキ（Ｂｕｔｅａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・ファリノーサ（Ｃａｄａｂａ ｆａｒｉｎｏｓａ）、ベニゴウカン属（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ）の種、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、***、工業用***、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種、カシア属（Ｃａｓｓｉａ）の種、セントロエマ・プベスケンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ボケ属（Ｃｈａｃｏｏｍｅｌｅｓ）の種、シナニッケイ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）、コロフォスペルムム・モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｍｏｐａｎｅ）、タマザキクサフジ（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ ｖａｒｉａ）、コトネアスター・セロティナ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ ｓｅｒｏｔｉｎａ）、サンザシ属（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）の種、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）の種、イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）の種、シルバー・ファーン（Ｃｙａｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ ｏｂｌｏｎｇａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、オガルカヤ属（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ）の種、シンシア・ディアルバータ（Ｃｙｎｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ、ヴェロニカ（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・ディバリカータ（Ｄａｖａｌｌｉａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、ヌスビトハギ属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）の種、ディクソニア・スクアローサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ ｓｑｕａｒｏｓａ）、ジベテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄｉｂｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、ジオクレア属（Ｄｉｏｃｌｅａ）の種、フジマメ属（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ）の種、ドリクニウム・レクタム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ ｒｅｃｔｕｍ）、エチノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、エーラフィア属（Ｅｈｒａｆｆｉａ）の種、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）、スズメガヤ属（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ）の種、デイゴ属（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ）の種、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｆｕｓ）の種、ユークレア・シンペリー（Ｅｕｃｌｅａ ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビロサ（Ｅｕｌａｌｉａ ｖｉ／ｌｏｓａ）、ヅパ属（Ｐａｇｏｐｙｒｕｍ）の種、フェイジョア・セロウィアナ（Ｆｅｉｊｏａ ｓｅｌｌｏｗｌａｎａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）の種、フレミンジア（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ）の種、フレイシネチア・バンクシイ（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ ｂａｎｋｓｌｉ）、ゲンノショウコ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、イチョウ（ＧｉｎＡｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、グリシン・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシディア属（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ）の種、アプランドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア属（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ）の種、グイボウルティア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、イワオウギ属（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ）の種、ヘマルチア・アルティッシマ（Ｈｅｍａｆｆｈｉａ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントルツス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ｃｏｎｔｏｆｆｕｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒパーレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ ｒｕｆａ）、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｅｒｅｃｔｕｍ）、ヒペフェリア・ジソルテ（Ｈｙｐｅｆｆｈｅｌｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔｅ）、インジゴ・インカマタ（Ｉｎｄｉｇｏ ｉｎｃａｍａｔａ）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）の種、レプタルレナ・ピロリフォリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、レスペディザ属（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ）の種、レチュカ属（Ｌｅｔｔｕｃａ）の種、ギンネム（Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ロウデチア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネスリ（Ｌｏｔｏｎｕｓ ｂａｉｎｅｓｌｉ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）の種、マクロチローマ・アキシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）の種、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｌｉｖａ）、メタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、ムサ・サピエンツム（Ｍｕｓａ ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、バナナ、ニコチアヌム属（Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ）の種、オノブリョチス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）の種、オルニソプス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ）の種、イネ属（Ｏｒｙｚａ）の種、ペルトフォルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）の種、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）の種、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）の種、カナリーヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、フォルミウム・クッキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、カナメモチ属（Ｐｈｏｔｉｎｉａ）種、ピセア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖａｍ）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ ｔｏｔａｒａ）、ポゴナルスリア・フレッキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナルスリア・セクアルローサ（Ｐｏｇｏｎａｆｆｈｒｉａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）の種、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）の種、リャフィオレプシス・ウンベラータ（Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｓｉｓ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、ロパロスチリス・サピダ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、セイヨウスグリ（Ｒｉｂｅｓ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）の種、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ属（Ｒｏｓａ）の種、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）種、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）の種、スキザクリウム・サングイネウム（Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、シアドピチス・ベフィシラタ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ ｖｅｆｆｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の種、スポロボルス・フィムブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサントス・フミリス（Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ ｈｕｍｉｌｉｓ）、タデハギ属（Ｔａｄｅｈａｇｉ）の種、ラクウショウ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、テメダ・トリアンドラ（Ｔｈｅｍｅｄａ ｔｒｉａｎｄｒａ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）の種、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）の種、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）種、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）の種、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、オランダカイウ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アマランサス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ ｓｐｒｏｕｔｓ）、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの葉（ｃｏｌｌａｒｄ ｇｒｅｅｎｓ）、亜麻、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、チャノキ。あるいは、藻類及び他の非緑色植物を本発明のいくつかの実施形態の方法に使用することもできる。
特定の実施形態によれば、植物は、作物、花卉、又は樹木である。
特定の実施形態によれば、植物は、木本植物種、例えば、オニマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ））、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ））、ユリノキ（Ｆｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｔｕｌｉｐｅｒａ）（モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ））、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）（ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ））、ビャクダン（Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ）（ビャクダン科（Ｓａｎｔａｌａｃｅａｅ））、ニレ（Ｕｌｍｕｓ）（ニレ科（Ｕｌｍａｃｅａｅ））、並びにバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ））及びミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）（柑橘属（Ｃｉｔｒｕｓ）、ミカン属（Ｍｉｃｒｏｃｉｔｒｕｓ））の様々な種、裸子植物、例えば、カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）及びテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、森林樹（例えば、カバノキ科（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）、裸子植物、及び熱帯樹種）、果樹、低木又は草本、例えば、（バナナ、ココア、ココヤシ、コーヒー、ナツメヤシ、ブドウ、及びチャ）、並びにアブラヤシである。
好ましい実施形態によれば、植物は、熱帯作物、例えば、コーヒー、マカダミア、バナナ、パイナップル、タロ、パパイヤ、マンゴー、オオムギ、豆類、キャッサバ、ヒヨコマメ、カカオ（チョコレート）、ササゲ、トウモロコシ（コーン）、キビ、イネ、ソルガム、サトウキビ、サツマイモ、タバコ、タロ、チャ、ヤムである。特に好ましい実施形態では、作物は、コーヒー、米、又はバナナである。
「子実」、「種子」、又は「豆」は、別の顕花植物に成長することができる顕花植物の生殖単位を指す。本明細書で使用するとき、これらの用語は同義的かつ互換的に使用される。
特定の実施形態によれば、植物は、植物細胞、例えば胚細胞懸濁液中の植物細胞である。
特定の実施形態によれば、植物は、本発明のいくつかの実施形態の方法によって作出された植物細胞を含む。
用語「交配」とは、本明細書で使用するとき、雄性植物（又は配偶子）による雌性植物（又は配偶子）の受精を指す。用語「配偶子」とは、配偶体から有糸***によって植物で生成され、異性の２つの配偶子が融合して二倍体の接合体を形成する有性生殖に関与する、半数体生殖細胞（卵又は***）を指す。この用語は、一般に、花粉（精細胞を含む）及び胚珠（卵細胞を含む）への言及を含む。従って、「交配」とは、一般に、ある個体の胚珠と別の個体からの花粉との受精を指し、一方、「自殖」とは、ある個体の胚珠と同じ個体からの花粉との受精を指す。交配は、植物の育種において広く用いられており、母親からの１つの染色体セットと父親からの１つの染色体セットとが交配して２つの植物間でゲノム情報が混合される。これにより、新たな組み合わせの遺伝的に受け継がれる形質が生じる。
上述したように、望ましくない因子、例えばＤＮＡ編集剤（例えば、エンドヌクレアーゼ）を含まない植物を得るために、植物を交配してもよい。
一実施形態によれば、植物は、非遺伝子改変（ｎｏｎ－ＧＭＯ）植物である。
一実施形態によれば、植物は、遺伝子改変（ＧＭＯ）植物である。
一実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って作出された植物の種子が提供される。
家畜動物、並びに動物及び動物生産物の作出方法
本発明の方法及び生産物は、動物細胞、特に家畜動物細胞を含む真核細胞における遺伝子のサイレンシングに有用である。特定の遺伝子の発現がサイレンシングされた動物細胞を使用して、改良された形質を有し得るか又はより効率的に生成され得る改良された動物及び動物生産物を生成することができる。
従って、本発明は、本発明の真核細胞を含む動物又は動物生産物、例えば肉、乳、卵、皮革、又は羊毛を提供し、本発明の動物細胞を動物に成長させ、任意でその動物を繁殖させる方法を提供する。本発明はまた、該動物から動物生産物を作製する方法を提供する。
特定の実施形態では、本発明の方法は、交配又は自殖を含み得る追加の育種を含んでいてもよい。
上述したように、望ましくない因子、例えばＤＮＡ編集剤（例えば、エンドヌクレアーゼ）を含まない動物を得るために、動物を交配してもよい。
一実施形態によれば、動物は、非遺伝子改変（ｎｏｎ－ＧＭＯ）動物である。
一実施形態によれば、動物は、遺伝子改変（ＧＭＯ）動物である。
標的遺伝子及び形質
本発明を用いて多種多様な異なる遺伝子をサイレンシングさせて、様々な効果を実現することができる。本発明は、改善された形質を提供するために、そして例えばがん、ウイルス、昆虫、真菌、線形動物、熱、干ばつ、飢餓等の様々な生物学的及び非生物学的ストレスから生物を保護するために、内在性遺伝子発現を調節するのに特に有用である。この章は、サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡによりサイレンシングされる好ましい標的遺伝子を提供する。
特定の実施形態では、本発明に係る遺伝子をサイレンシングすることにより、ストレス耐性が増大した、収量が増加した、成長速度が増加した、又は収量の質が向上し植物が提供される。
特定の実施形態では、本発明に係る遺伝子のサイレンシングは、収量が増加した、成長速度が増加した、又は品質が向上した動物を提供する。
特定の実施形態では、サイレンシング挿入物によってサイレンシングされた標的遺伝子は、真核細胞に対して外来性である。このような場合、その遺伝子は、天然では真核細胞ゲノム（すなわち、サイレンシングインサートを発現する）の一部ではない。例示的な外来性標的遺伝子としては、本明細書において以下で更に論じる通り、病原体（例えば、昆虫、ウイルス、細菌、真菌、線形動物）の遺伝子等の感染性病因物質に関連する遺伝子が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、サイレンシング挿入物によってサイレンシングされる標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、優性遺伝子、コピー数の多い遺伝子、及び細胞アポトーシスに関連する遺伝子からなる群から選択される。
特定の実施形態では、サイレンシングインサートが標的とする第１の標的遺伝子は、内在性サイレンシング配列が標的とする第２の標的遺伝子のホメオログ（homeolog）である。
語句「ストレス耐性」とは、本明細書で使用するとき、代謝、成長、生産性、及び／又は生存率が実質的な変化を受けることなく、植物が生物的又は非生物的なストレスに耐える能力を指す。
語句「非生物的ストレス」とは、本明細書で使用するとき、植物の代謝、成長、発生、繁殖、又は生存（まとめて「成長」）に悪影響を及ぼす非生存（「非生物的」）環境、物理、又は化学剤に植物、植物細胞等が曝露されることを指す。例えば、水（例えば、洪水、干ばつ、又は脱水）、嫌気状態（例えば、より低濃度の酸素又は高濃度のＣＯ２）、異常な浸透圧状態（例えば、浸透圧ストレス）、塩分、又は温度（例えば、高温／熱、低温、凍結、又は霜）、汚染物質への曝露（例えば、重金属毒性）、嫌気生活、栄養欠乏（例えば、窒素欠乏又は窒素の制限）、大気汚染、又は紫外線照射等の環境要因によって、植物が非生物的ストレスに曝され得る。
語句「生物的ストレス」とは、本明細書で使用するとき、植物の代謝、成長、発生、繁殖、収量、又は生存（まとめて「成長」）に悪影響を及ぼす生存（「生物的」）生物（更にウイルスを含む）に植物、植物細胞等が曝露されることを指す。生物的ストレスは、例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、有益昆虫及び有害昆虫、雑草、並びに栽培植物又は在来植物によって引き起こされ得る。
語句「収量」又は「植物収量」は、本明細書で使用するとき、植物の成長（成長速度）の増加、作物の成長の増加、バイオマスの増加、及び／又は植物生産物の生産（子実、果実、種子等を含む）の増加を指す。
一実施形態によれば、ストレス耐性が増大している、収量が増加している、成長速度が増加している、又は収量の質が向上している植物を作出するために、サイレンシング挿入物は、ストレスに対する感受性、収量の減少、成長速度の低下、又は収量の質の低下をもたらす植物の遺伝子を標的とするように設計される。
一実施形態によれば、標的とされる（例えば、ノックダウンされる）例示的な感受性植物遺伝子としては、ＭＬＯ（べと病遺伝子座Ｏ）として知られている遺伝子座に存在するもの等の感受性Ｓ遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。
一実施形態によれば、本方法によって作出された植物は、本方法によって作出されていない植物と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％のストレス耐性の増大、収量の増加、収量の質の向上、成長速度の増加を含む。
ストレス耐性の増大を評価するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。ストレス耐性の増大を評価する例示的な方法としては、Ｙｏｏｎ，ＳＫ．，Ｂａｅ，ＥＫ．，Ｌｅｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｅｓ（２０１８）３２：８２３．）に記載の塩ストレス耐性を増大させるためのポプラにおけるＰａｇＳＡＰ１のダウンレギュレーション、及びＳｌｂＺＩＰ３８のダウンレギュレーションによるトマトの耐干性の増大（参照により本明細書に援用されるＰａｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ２０１７，８，４０２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｇｅｎｅｓ８１２０４０２）が挙げられるが、これらに限定されない。
収量の増加を評価するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。収量の増加を評価する例示的な方法としては、Ａｒ－Ｒａｆｉ Ｍｄ．Ｆａｉｓａｌ，ｅｔ ａｌ，ＡＪＰＳ＞Ｖｏｌ．８ Ｎｏ．９，Ａｕｇｕｓｔ ２０１７ ＤＯＩ：１０．４２３６／ａｊｐｓ．２０１７．８９１４９に記載のイネにおけるＤＳＴ発現の低下；及びＷａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２００９ Ｊａｎ；２（１）：１９１－２００．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｎ０８８）に記載の収量を増加させるキャノーラにおけるＢｎＦＴＡのダウンレギュレーションが挙げられるが、これらに限定されず、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
成長速度の増加を評価するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。成長速度の増大を評価する例示的な方法としては、参照により本明細書に援用されるＭａｒｃｅｌｏ ｄｅ Ｆｒｅｉｔａｓ Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ（２０１７）１，１４－－－２５に記載の成長及びバイオマスを増大させるシロイヌナズナにおけるＢＩＧ ＢＲＯＴＨＥＲ又はＧＡ２－ＯＸＩＤＡＳＥの発現の低下が挙げられるが、これに限定されない。
収量の質の向上を評価するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。収量の質の向上を評価する例示的な方法としては、Ｙｅｈ Ｓ＿Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｒｉｃｅ（Ｎ Ｙ）．２０１５；８：３６に記載の、より多くの分げつ、より多くの子実が生産されるようになり、子実がより重くなる、イネにおけるＯｓＣＫＸ２のダウンレギュレーション；及びＶｅｒｍａ ＳＲ ａｎｄ Ｄｗｉｖｅｄｉ ＵＮ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ Ｖｏｌｕｍｅ ９１，Ｍａｒｃｈ ２０１４，Ｐａｇｅｓ １０７－１２５に記載の、リグニンの蓄積を変化させ、産業目的のために物質の吸収率を増加させる、多くの植物におけるＯＭＴレベルの低下が挙げられるが、これに限定されず、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
一実施形態によれば、方法は、更に、甘味の増加、糖度の増加、香りの増加、熟成制御の改善、水ストレス耐性の増大、熱ストレス耐性の増大、及び耐塩性の増大を含む植物の作出を可能にする。当業者であれば、本明細書に記載の方法を利用して、サイレンシングするための標的遺伝子配列を選択する方法について理解するであろう。
一実施形態によれば、病原体又は有害生物に耐性又は抵抗性のある植物を作出する方法であって、（ａ）本発明のいくつかの実施形態の植物を繁殖させることと、（ｂ）病原体又は有害生物に耐性又は抵抗性のある後代植物を選抜することとを含む方法が提供される。
一実施形態によれば、標的遺伝子は、病原体又は有害生物に対する感受性を付与する。一実施形態によれば、標的遺伝子は、病原体の遺伝子である。一実施形態によれば、標的遺伝子は、有害生物の遺伝子である。
本明細書で使用するとき、用語「病原体」とは、定着、損傷、攻撃、又は感染することによって植物に悪影響を与える生物を指す。従って、病原体は、植物の成長、発生、生殖、収穫、又は収量に影響を与える可能性がある。これには、疾患を蔓延させる及び／又は宿主に損傷を与える及び／又は宿主と栄養素をめぐって争う生物が含まれる。植物の病原体としては、真菌、卵菌、細菌、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様生物、ファイトプラズマ、原生動物、線形動物、昆虫、及び寄生植物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、サイレンシング挿入が標的とする第１の標的遺伝子は、病原体遺伝子である。
病原体の非限定的な例としては、長い触角を持つカミキリムシ（ｌｏｎｇ ｈｏｒｎｅｄ ｂｏｒｅｒ）等のカミキリムシ（Ｒｏｕｎｄｈｅａｄｅｄ Ｂｏｒｅｒ）；レッドガムラープキジラミ（ｒｅｄ ｇｕｍ ｌｅｒｐ ｐｓｙｌｌｉｄ）（グリカスピス・ブリンブレコンベイ（Ｇｌｙｃａｓｐｉｓ ｂｒｉｍｂｌｅｃｏｍｂｅｉ））、ブルーガムキジラミ（ｂｌｕｅ ｇｕｍ ｐｓｙｌｌｉｄ）、スポッティッドガムラープキジラミ（ｓｐｏｔｔｅｄ ｇｕｍ ｌｅｒｐ ｐｓｙｌｌｉｄ）、レモンガムラープキジラミ（ｌｅｍｏｎ ｇｕｍ ｌｅｐ ｐｓｙｌｌｉｄ）等のキジラミ；カメノコハムシ；ゾウムシ；ハムシ；ナラタケ；トウマストコリス・ペレグリヌス（Ｔｈａｕｍａｓｔｏｃｏｒｉｓ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ）；ユーカリアシブトコバチ（Ｌｅｐｔｏｃｙｂｅ ｉｎｖａｓａ）、オフェリムス・マスケッリ（Ｏｐｈｅｌｉｍｕｓ ｍａｓｋｅｌｌｉ）及びセリトリコデス・グロブレス（Ｓｅｌｉｔｒｉｃｈｏｄｅｓ ｇｌｏｂｕｌｅｓ）等の付着性のタマバチ（タマバチ科（Ｃｙｎｉｐｉｄａｅ））；雑食性シャクトリムシ（Ｏｍｎｉｖｏｒｏｕｓ ｌｏｏｐｅｒ）及びオレンジハマキガ（Ｏｒａｎｇｅ ｔｏｒｔｒｉｘ）等の食葉性毛虫類；ガラスのような羽を持つヨコバイ（Ｇｌａｓｓｙ－ｗｉｎｇｅｄ ｓｈａｒｐｓｈｏｏｔｅｒ）；並びにジャイアント・ホワイトフライ（Ｇｉａｎｔ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）等のコナジラミ類が挙げられるが、これらに限定されない。病原体の他の非限定的な例としては、ケアブラムシ亜科（Ｃｈａｉｔｏｐｈｏｒｕｓ）の種、クラウディーウィングド・コットンウッド（Ｃｌｏｕｄｙｗｉｎｇｅｄ ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ）及びニタイケアブラムシ属（Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌｕｓ）の種等のアブラムシ；リンゴカキカイガラムシ及びサンホセカイガラムシ等のマルカイガラムシ科のカイガラムシ（Ａｒｍｏｒｅｄ ｓｃａｌｅ）；ボクトウガの幼虫（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｗｏｒｍ）；アメリカスズメバチガ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｈｏｒｎｅｔ ｍｏｔｈ）及びウエスタン・ポピュラー・クリアウィング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｏｐｌａｒ ｃｌｅａｒｗｉｎｇ）等のスカシバガ（Ｃｌｅａｒｗｉｎｇ ｍｏｔｈ）穿孔虫；ブロンズバーチボーラー（Ｂｒｏｎｚｅ ｂｉｒｃｈ ｂｏｒｅｒ）及びブロンズポプラボーラー（Ｂｒｏｎｚｅ ｐｏｐｌａｒ ｂｏｒｅｒ）等のタマムシ類（Ｆｌａｔｈｅａｄｅｄ ｂｏｒｅｒ）；アメリカシロヒトリ（Ｆａｌｌ ｗｅｂｗｏｒｍ）、果樹ハマキムシ（Ｆｒｕｉｔ－ｔｒｅｅ ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ）、レッドハンプトキャタピラー（Ｒｅｄｈｕｍｐｅｄ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、ヤナギドクガ、キベリタテハ、テンマクケムシ（Ｔｅｎｔ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、ドクガ類（Ｔｕｓｓｏｃｋ ｍｏｔｈ）及びニシトラフアゲハ等の葉食性毛虫類；ポプラシールドベアラー（Ｐｏｐｌａｒ ｓｈｉｅｌｄ ｂｅａｒｅｒ）等のハモグリバエ；コットンウッドフシダニ（Ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ ｇａｌｌ ｍｉｔｅ）等のフシダニ類並びに水疱ダニ類（ｂｌｉｓｔｅｒ ｍｉｔｅ）；ポプラ虫コブアブラムシ（Ｐｏｐｌａｒ ｐｅｔｉｏｌｅｇａｌｌ ａｐｈｉｄ）等の虫コブアブラムシ（Ｇａｌｌ ａｐｈｉｄ）；ガラスのような羽を持つヨコバイ（Ｇｌａｓｓｙ－ｗｉｎｇｅｄ ｓｈａｒｐｓｈｏｏｔｅｒ）；ハムシ類及びノミトビヨロイムシ類；コナカイガラムシ類；ポプラ及びヤナギの穿孔虫（Ｐｏｐｌａｒ ａｎｄ ｗｉｌｌｏｗ ｂｏｒｅｒ）；カミキリムシ；ハバチ類；オリーブカタカイガラムシ、ヒラタカタカイガラムシ、モミジワタカイガラムシ及びミズキカタカイガラムシ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｆｒｕｉｔ ｌｅｃａｎｉｕｍ）等のカタカイガラムシ類；バッファローツノゼミ（Ｂｕｆｆａｌｏ ｔｒｅｅｈｏｐｐｅｒ）等のツノゼミ；並びにグンバイ及びカスミカメ（Ｌｙｇｕｓ ｂｕｇ）等の半翅類昆虫が挙げられる。
ウイルス性植物病原体の他の非限定的な例としては、種：マメ早期褐変ウイルス（Ｐｅａ ｅａｒｌｙ－ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｖｉｒｕｓ：ＰＥＢＶ）、属：トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、種：トウガラシ輪紋ウイルス（ＰｅｐＲＳＶ）、属：トブラウイルス、種：スイカモザイクウイルス（ＷＭＶ）、属：ポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）、及びポティウイルス属由来の他のウイルス、種：タバコモザイクウイルス属（ＴＭＶ）、トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）及びトバモウイルス属由来の他のウイルス、種：ジャガイモウイルスＸ属（ＰＶＸ）、ポテックスウイルス（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）及びポテックスウイルス属由来の他のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本教示では、ＲＮＡウイルスに加えて、ＤＮＡウイルス（例えば、ジェミニウイルス又はビジェミニウイルス）を標的とすることも想定している。標的とすることができるジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスとしては、アブチロンモザイクビジェミニウイルス、カッコウアザミ葉脈黄化ビジェミニウイルス、インゲンマメカリコモザイクビジェミニウイルス（Ｂｅａｎ ｃａｌｉｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、インゲンマメゴールデンモザイクビジェミニウイルス、ビンディ（Ｂｈｅｎｄｉ）葉脈黄化ビジェミニウイルス、キャッサバアフリカモザイクビジェミニウイルス、キャッサバインドモザイクビジェミニウイルス、チノデルトマトビジェミニウイルス、ワタ縮葉ビジェミニウイルス（Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｒｕｍｐｌｅ ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ワタ葉巻ビジェミニウイルス、クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）葉脈黄化モザイクビジェミニウイルス、フジマメ黄化モザイクビジェミニウイルス、ユーフォルビアモザイクビジェミニウイルス、ホースグラム黄化モザイクビジェミニウイルス、ナンヨウアブラギリモザイクビジェミニウイルス、ライマメゴールデンモザイクビジェミニウイルス、メロン葉巻ビジェミニウイルス、リョクトウ黄化モザイクビジェミニウイルス、オクラ葉巻ビジェミニウイルス、トウガラシワステコビジェミニウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ ｈａｕｓｔｅｃｏ ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、トウガラシテキサスビジェミニウイルス、ジャガイモ黄化モザイクビジェミニウイルス、タンキリマメモザイクビジェミニウイルス、セラーノ（ｓｅｒｒａｎｏ）ゴールデンモザイクビジェミニウイルス、カボチャ葉巻ビジェミニウイルス、タバコ葉巻ビジェミニウイルス、トマトオーストラリア葉巻ビジェミニウイルス、トマトゴールデンモザイクビジェミニウイルス、トマトインド葉巻ビジェミニウイルス、トマト縮葉ビジェミニウイルス、トマト斑紋ビジェミニウイルス、トマト黄化葉巻ビジェミニウイルス、トマト黄化モザイクビジェミニウイルス、スイカ退緑萎縮スタントビジェミニウイルス、及びスイカ葉巻斑紋ビジェミニウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、ウイルス性植物病原体は、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）である。好ましいこのような実施形態では、サイレンシングＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、例えば２２ｎｔ ｍｉＲＮＡである。
本明細書で使用するとき、用語「有害生物」とは、直接的又は間接的に植物に害を与える生物を指す。直接的な影響としては、例えば、植物の葉を食べることが挙げられる。間接的な影響としては、例えば、病因物質（例えば、ウイルス、細菌等）を植物に伝播することが挙げられる。後者の場合、有害生物は、病原体を伝播するためのベクターとして機能する。
一実施形態によれば、有害生物は、無脊椎動物の生物である。
例示的な有害生物としては、昆虫、線形動物、カタツムリ、ナメクジ、クモ、イモムシ、サソリ、ダニ、マダニ、真菌等が挙げられるが、これらに限定されない。
昆虫の有害生物としては、甲虫目（例えば、カブトムシ）、ハエ目（例えば、ハエ、カ）、ハチ目（例えば、ハバチ、スズメバチ、ミツバチ、及びアリ）、チョウ目（例えば、チョウ及びガ）、ハジラミ目（例えば、シラミ、例えば、ハジラミ（ｃｈｅｗｉｎｇ ｌｉｃｅ、ｂｉｔｉｎｇ ｌｉｃｅ、及びｂｉｒｄ ｌｉｃｅ）、カメムシ目（例えば、カメムシ）、腹吻亜目（例えば、アブラムシ、コナジラミ、及びカイガラムシ）、頚吻亜目（例えば、セミ、ヨコバイ、ツノゼミ、ウンカ、及びアワフキムシ）、及び鞘吻亜目（例えば、コケムシ（ｍｏｓｓ ｂｕｇｓ）及びカブトムシ（ｂｅｅｔｌｅ ｂｕｇｓ））を含む同翅目、バッタ目（例えば、バッタ、トノサマバッタ、並びにキリギリス及びウェタを含むコオロギ）、アザミウマ目（例えば、アザミウマ）、ハサミムシ目（例えば、ハサミムシ）、シロアリ目（例えば、シロアリ）、シラミ目（例えば、シラミ）、ノミ目（例えば、ノミ）、トビケラ目（例えば、トビケラ）等から選択される昆虫が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の昆虫の有害生物としては、トウモロコシ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）；アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ジュウイチホシウリハムシ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）；クシコメツキ属（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ）種、コメツキムシの幼虫（ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ）；ノーザンマスクドコガネムシ（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（地虫）；サザンマスクドシェイファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ、ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（地虫）；マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）；ミノハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）；トウモロコシゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）；トウモロコシアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）；コーンルートアフィド（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ、ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）；アカアシトビバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）；ミグラトリーグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；タネバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）；コーンブロットリーフマイナー（Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ、ｃｏｒｎ ｂｌｏｔ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）；クサキイロアザミウマ（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）；シーフアント（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ、ｔｈｉｅｆ ａｎｔ）；ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）；ソルガム：ソルガムボーラー（Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｏｒｅｒ）；ツマジロクサヨトウ；アメリカタバコガ；モロコシマダラメイガ；グラニュレートカットワーム（Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、ｇｒａｎｕｌａｔｅ ｃｕｔｗｏｒｍ）；地虫（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ）；エレオデス（Ｅｌｅｏｄｅｓ）属、コノデルス（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ）属、及びアエオルス（Ａｅｏｌｕｓ）属の種、コメツキムシの幼虫；クビアカクビホソハムシ（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）；ミノハムシ；トウモロコシゾウムシ；トウモロコシアブラムシ；イエローシュガーケーンアフィド（Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ、ｙｅｌｌｏｗ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ）；アメリカコバネナガカメムシ；ソルガムタマバエ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）；ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）；ナミハダニ；コムギ：ヨトウムシ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）；ツマジロクサヨトウ；モロコシマダラメイガ；ウエスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｕｔｗｏｒｍ）；モロコシマダラメイガ；クビアカクビホソハムシ；オオタコゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ）；ジュウイチホシウリハムシ；ロシアコムギアブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ）；ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）；ムギヒゲナガアブラムシ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ）；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；ミグラトリーグラスホッパー；ヘシアンバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）；ムギアカタマバエ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ）；ムギキモグリバエ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）；コムギスイセンハナアブ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ）；ウスグロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）；コムギクキバチ（Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ、ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｓａｗｆｌｙ）；チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ）；ヒマワリ：ヒマワリハマキガ（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）；サンフラワーモス（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ）；サンフラワービートル（ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）；キャロットビートル（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ、ｃａｒｒｏｔ ｂｅｅｔｌｅ）；サンフラワーシードミッジ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｉｄｇｅ）；ワタ：ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）；アメリカタバコガ；シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）；ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）；メキシコワタミゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）；ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）；ワタノミハムシ（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ）；オンシツコナジラミ（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）；ミドリメクラカメムシ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー；ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）；ウスグロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）；ニセナミハダニ；ナミハダニ；イネ：サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ツマジロクサヨトウ；アメリカタバコガ；グレープコラスピス（Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ、ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ）；イネミズゾウムシ（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）；ココクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）；クロスジツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）；アメリカコバネナガカメムシ；アオクサカメムシ；ダイズ：ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）；ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）；グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ、ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）；ヨーロッパアワノメイガ；タマナヤガ；シロイチモジヨトウ；ニセアメリカタバコガ；アメリカタバコガ；インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）；モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）；ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ）；アオクサカメムシ；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー；タネバエ；ダイズアザミウマ（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）；ネギアザミウマ；イチゴハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；ナミハダニ；オオムギ：ヨーロッパアワノメイガ；タマナヤガ；ムギミドリアブラムシ、アメリカコバネナガカメムシ；アオクサカメムシ；チャイロカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ、ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）；タネバエ（Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ）；ヘシアンバエ；ホモノハダニ（Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ）；ナタネ：ダイコンアブラムシ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；フリービートル（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）；ベルタアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）；コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）；デリア（Ｄｅｌｉａ）属の種、根食い虫が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態によれば、病原体は線形動物である。例示的な線形動物としては、ネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、ラドホルス・アラボコフェアエ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ａｒａｂｏｃｏｆｆｅａｅ）、ミナミネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）、ネコブセンチュウ（メロイドギン属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の種）、シストセンチュウ（ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）及びグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）の種）、ネグサレセンチュウ（プラチレンクス属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の種）、クキセンチュウ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、マツノザイセンチュウ（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブドウオオハリセンチュウ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ）、ナコブス・アベルランス（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、及びアフェレンコイデス・ベッセイ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、病原体は、真菌である。例示的な真菌としては、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、レプトスファエリア・マキュランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）（キャベツ根朽病菌（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ））、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、イネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ）、イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ））、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａｌ）、プッチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）の種、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）の種、ウスティラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、メラムプソラ・リニ（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ ｌｉｎｉ）、ファコプソラ・パチリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、有害生物は、アリ、ミツバチ、スズメバチ、イモムシ、カブトムシ、カタツムリ、ナメクジ、線形動物、バグ、ハエ、コナジラミ、蚊、バッタ、ハサミムシ、アブラムシ、カイガラムシ、ツリガネムシ、クモ、ダニ、キジラミ、及びサソリである。
好ましくは、病原体又は有害生物の遺伝子をサイレンシングした結果、病原体又は有害生物が抑制、制御、及び／又は殺傷され、その結果、病原体又は有害生物が植物に与える損傷が制限される。有害生物の制御としては、有害生物を殺傷する、有害生物の発生を阻害する、有害生物が植物に与える損傷が少なくなるように有害生物の繁殖力若しくは成長を変化させる、生まれる子孫の数を減少させる、あまり適合しない有害生物を作出する、捕食者の攻撃をより受けやすい有害生物を作出する、又は有害生物が植物を食べるのを阻止することが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、標的となる例示的な植物遺伝子としては、キュウリにおいてウイルス感染に対する感受性を付与する遺伝子であるｅＩＦ４Ｅが挙げられる。
サイレンシングされる植物又は病原体の標的遺伝子の同定は、ルーチンなバイオインフォマティクス解析等の当技術分野において公知の任意の方法を用いて達成することができる。
一実施形態によれば、サイレンシング挿入物は、線形動物病原体であるバナナネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）の遺伝子であるカルレチキュリン１３（ＣＲＴ）又はコラーゲン５（ｃｏｌ－５）を標的とする。
一実施形態によれば、サイレンシング挿入物は、真菌病原体であるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の遺伝子であるＦＯＷ２、ＦＲＰ１、及びＯＰＲを標的とする。
一実施形態によれば、病原体遺伝子としては、例えば、液胞ＡＴＰａｓｅ（ｖＡＴＰａｓｅ）、ｄｖｓｓｊ１及びｄｖｓｓｊ２、α－チューブリン、又はｓｎｆ７が挙げられる。
特定の実施形態によれば、植物がアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）である場合、標的遺伝子は、レプトスファエリア・マクランス（キャベツ根朽病菌）（例えば、根朽病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＭ９３３６１３．１に記載）；ノミトビヨロイムシ（Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）（フィロトレタ・ビッツラ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｖｉｔｔｕｌａ）又はハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＴ９５９２４５．１に記載）の遺伝子；又は菌核病菌の遺伝子（例えば、菌核病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＷ＿００１８２０８３３．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）である場合、標的遺伝子は、柑橘類潰瘍病（ＣＣＫ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ００８９２５に記載）；カンジダタス・リベリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）種（例えば、カンキツグリーニング病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ００１６７７．５に記載）；又はならたけ病の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＹ３８９２６７．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）である場合、標的遺伝子は、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）の種（例えば、マンネンタケ根株腐朽病としても知られている基部腐朽（ＢＳＲ）を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ５６１２８．１に記載）、ヒロヘリアオイラガ（Ｎｅｔｔｌｅ Ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）の遺伝子、又はフザリウム属の種、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）の種、フハイカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）の種、リゾクトニア・ソラニのいずれか１つの遺伝子（例えば、根腐れを引き起こす）である。
特定の実施形態によれば、植物がワイルドストロベリー（Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ）である場合、標的遺伝子は、バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａ）（例えば、バーティシリウム萎凋病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＳ５７２７１３．１に記載）；又はイチゴ萎黄病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ）の遺伝子（例えば、立ち枯れ病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＲ８５５８６８．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）である場合、標的遺伝子は、ダイズさび病菌（Ｐ．ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）（例えば、アジアさび病（Ａｓｉａｎ ｒｕｓｔ）としても知られているダイズさび病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＱ０２６０６１．１に記載）；ダイズアブラムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＪ４５１４２４．１に記載）；ダイズ矮化病ウイルス（ＳｂＤＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３０５６．１に記載）；又はアオクサカメムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＷ＿０２０１１０７２２．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ）である場合、標的遺伝子は、ワタ萎黄病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）（例えば、立ち枯れ病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＮ４１６６１４．１に記載）；ダイズアブラムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＪ４５１４２４．１に記載）；又はワタアカミムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＵ５５０９６４．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）である場合、標的遺伝子は、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ）（例えば、イネいもち病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０２７９７９．１に記載）；イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ））の遺伝子（例えば、馬鹿苗病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ８６２１９２．１に記載）；又はテッポウムシ（Ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ）、例えば、イッテンオオメイガ（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ Ｗａｌｋｅｒ－Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）、イネシロオオメイガ（Ｓ．ｉｎｎｏｔａ Ｗａｌｋｅｒ－Ｗｈｉｔｅ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）、ニカメイガ（Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ－Ｓｔｒｉｐｅｄ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）、イネヨトウ（Ｓｅｓａｍｉａ ｉｎｆｅｒｅｎｓ Ｗａｌｋｅｒ－Ｐｉｎｋ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＦ２９０７７３．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である場合、標的遺伝子は、疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（例えば、疫病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ８５５２１０．１に記載）；コナジラミ類であるタバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ）の遺伝子（例えば、Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＸ３９０８７０．１に記載）；又はトマト黄化葉巻ジェミニウイルス（ＴＹＬＣＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＮ８４６６１０．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）である場合、標的遺伝子は、疫病菌（例えば、ジャガイモ疫病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ０５０５３８．３に記載）；エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）の種の遺伝子（例えば、黒脚病及び軟腐病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ００１６５４．１に記載）；又はシストセンチュウ（Ｃｙｓｔ Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）の遺伝子（例えば、ジャガイモシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）及びジャガイモシストセンチュウ（Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＦ９６３５１９．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）である場合、標的遺伝子は、担子菌であるカカオ霜白鞘病菌（Ｍｏｎｉｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｒｏｒｅｒｉ）（例えば、霜白鞘病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＡＴＸ０１００１５２１．１に記載）；天狗巣病菌（Ｍｏｎｉｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓａ）（例えば、天狗巣病を引き起こす）の遺伝子；又はメクラカメムシの変種（Ｍｉｒｉｄ）、例えば、ジスタンチエラ・テオブロマ（Ｄｉｓｔａｎｔｉｅｌｌａ ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）及びカカオカスミカメムシ（Ｓａｈｌｂｅｒｇｅｌｌａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、ヘロペルティス（Ｈｅｌｏｐｅｌｔｉｓ）属の種、モナロニオン属（Ｍｏｎａｌｏｎｉｏｎ）の種の遺伝子である。
特定の実施形態によれば、植物がブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）である場合、標的遺伝子は、クロステロウイルスＧＶＡ（例えば、ルゴースウッド病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ００７４１５．２に記載）；ブドウリーフロール病ウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＦＪ４３６２３４．１に記載）；ブドウファンリーフ病ウイルス（ＧＦＬＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３２０３．１に記載）；又はブドウフレック病（ＧＦｋＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３３４７．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がトウモロコシ（コーンとも称される）である場合、標的遺伝子は、ツマジロクサヨトウ（Ｆａｌｌ Ａｒｍｙｗｏｒｍ）（例えば、ツマジロクサヨトウ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ４８８１８１．３に記載）；ヨーロッパアワノメイガの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＧＵ３２９５２４．１に記載）；又は北部及び西部コーンルートワーム（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍｓ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０３９４０３．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、植物がサトウキビである場合、標的遺伝子は、穿孔性節足動物（Ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ Ｂｏｒｅｒ）（例えば、スジツトガ（Ｃｈｉｌｏ Ｓａｃｃｈａｒｉｆａｇｕｓ Ｉｎｄｉｃｕｓ）の遺伝子、サトウキビ白すじ病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ａｌｂｉｌｅｎｅａｎｓ）（例えば、白すじ病を引き起こす）の遺伝子；又はサトウキビ黄葉ウイルス（ＳＣＹＬＶ）の遺伝子である。
特定の実施形態によれば、植物がコムギである場合、標的遺伝子は、コムギ黄さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）の遺伝子（例えば、黄さび病を引き起こす）又はアブラムシの遺伝子である。
特定の実施形態によれば、植物がオオムギである場合、標的遺伝子は、オオムギ小さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｄｅｉ）（例えば、葉さび病を引き起こす）の遺伝子、オオムギ黄さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ．ｓｐ．Ｈｏｒｄｅｉ）（例えば、黄さび病を引き起こす）の遺伝子、又はアブラムシの遺伝子である。
特定の実施形態によれば、植物がヒマワリである場合、標的遺伝子は、ヒマワリさび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｅｌｉａｎｔｈｉ）（例えば、さび病を引き起こす）の遺伝子；ボエレマ・マクドナルディイ（Ｂｏｅｒｅｍａ ｍａｃｄｏｎａｌｄｉｉ）（例えば、フォーマ茎枯病（Ｐｈｏｍａ ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍ）を引き起こす）の遺伝子；ゾウムシ（Ｓｅｅｄ ｗｅｅｉｌ）（例えば、赤及び灰）、例えばスミクロニクス・フルウス（Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ）（赤）；スミクロニクス・ソルディダス（Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｓｏｒｄｉｄｕｓ）（灰）の遺伝子；又は菌核病菌（例えば、茎腐れ病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｔａｌｋ）及び花蕾腐敗病を引き起こす）の遺伝子である。
特定の実施形態によれば、植物がゴムの木である場合、標的遺伝子は、南米葉枯病菌（Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｕｓ ｕｌｅｉ）（例えば、南米葉枯病（ＳＡＬＢ）を引き起こす）の遺伝子；パラゴムノキ根白腐病菌（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ）（例えば、根白腐病を引き起こす）の遺伝子；ガノデルマ・シュードフェレウム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｐｓｅｕｄｏｆｅｒｒｅｕｍ）の遺伝子（例えば、根湿腐病を引き起こす）である。
特定の実施形態によれば、植物がリンゴ植物である場合、標的遺伝子は、ネオネクトリア・ジチシマ（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）（例えば、リンゴ腐爛病を引き起こす）の遺伝子、モモうどんこ病（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）（例えば、リンゴうどんこ病を引き起こす）の遺伝子、又は黒星病菌（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）（例えば、リンゴさびを引き起こす）の遺伝子である。
一実施形態によれば、本方法によって作出された植物は、本方法によって作出されていない植物と比較して（すなわち、野生型の植物と比較して）、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％、病原体に対する耐性又は抵抗性が高い。
植物の病原体に対する耐性又は抵抗性を評価するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。例示的な方法としては、Ｒａｍｉｒｅｚ Ｖ１，Ｇａｒｃｉａ－Ａｎｄｒａｄｅ Ｊ，Ｖｅｒａ Ｐ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｂｅｈａｖ．２０１１ Ｊｕｎ；６（６）：９１１－３．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ １に記載の通り、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）に対する抵抗性を高めるシロイヌナズナにおけるＭＹＢ４６の発現を低下させる；又はＧａｌｌｅｇｏ－Ｇｉｒａｌｄｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１１）１９０：６２７－６３９ ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４６９－８１３７．２０１０．０３６２１．ｘ）に記載の通り、植物における防御応答の活性化を促進するアルファルファにおけるＨＣＴをダウンレギュレーションすることが挙げられるが、これらに限定されず、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
一実施形態によれば、除草剤抵抗性植物を作出する方法であって、（ａ）本発明のいくつかの実施形態の植物を繁殖させることと、（ｂ）除草剤抵抗性である後代植物を選抜することと、を含む方法が提供される。
一実施形態によれば、除草剤は、色素体内（例えば、葉緑体内）に存在する経路を標的とする。
除草剤抵抗性植物を作出するために、サイレンシング挿入物は、葉緑体遺伝子ｐｓｂＡ（除草剤アトラジンの標的である光合成キノン結合膜タンパク質ＱＢをコードしている）又はＥＰＳＰ合成酵素（核タンパク質であるが、それが葉緑体において過剰発現又は蓄積することにより、ＥＰＳＰの転写速度が増加するので、更には酵素のターンオーバーを減少させることによって、除草剤グリホサートに対する植物の抵抗性が得られる）の遺伝子等の遺伝子を標的とするように設計される。
一実施形態によれば、本発明が標的とするウイルスは、アルボウイルス（例えば、水胞性口内炎インディアナウイルス－ＶＳＶ）である。一実施形態によれば、標的遺伝子は、ＶＳＶ遺伝子、例えば、Ｇタンパク質（Ｇ）、巨大タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質、マトリックスタンパク質（Ｍ）、又は核タンパク質である。
一実施形態によれば、真核細胞はヒトであり、標的遺伝子は、ｇａｇ及び／又はｖｉｆ（すなわち、ＨＩＶ－１における保存配列）；Ｐタンパク質（すなわち、ＲＳＶにおけるウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの必須サブユニット）；Ｐ ｍＲＮＡ（すなわち、ＰＩＶにおける）；コア、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５Ｂ（すなわち、ＨＣＶにおける）；ＶＡＭＰ関連タンパク質（ｈＶＡＰ－Ａ）、Ｌａ抗原、及びポリピリミジントラクト結合タンパク質（ＰＴＢ）（すなわち、ＨＣＶの場合）である。
特定の実施形態によれば、真核細胞がヒトである場合、標的遺伝子は、マラリアを引き起こす病原体の遺伝子；ＨＩＶウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８０２．１に記載）；ＨＣＶウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４１０２．１に記載）；又は寄生虫の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００３３７１６０４．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、真核細胞がヒトである場合、標的遺伝子は、がん性疾患に関連する遺伝子（例えば、ｂｃｒ／ａｂｌ ｅ８ａ２融合タンパク質のヒトｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６９６９３．１に記載）、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）若しくは血管疾患に関連する遺伝子（例えば、ヒトヘパリン結合血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３２９７７．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、生物がウシ細胞である場合、標的遺伝子は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ００４８０１．１に記載）、例えばＢＲＤ（ウシ呼吸器病症候群）を引き起こす１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ１）；ブルータング病（ＢＴＶウイルス）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ８２１１７０．１に記載）；ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４６１．１に記載）；例えば***を引き起こすピコルナウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４００４．１に記載）；例えばＢＲＤを引き起こすパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ３）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０２８３６２．１に記載）；又は例えばウシ型結核（ｂＴＢ）を引き起こすウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０３７３４３．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、真核細胞がヒツジ細胞である場合、標的遺伝子は、サナダムシ病を引き起こす病原体（単包条虫生活環、単包条虫、ヒツジ条虫（Ｔａｅｎｉａ ｏｖｉｓ）、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、モニエジア属（Ｍｏｎｉｅｚｉａ）の種）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１２６６３．１に記載）；扁形動物病を引き起こす病原体（肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、巨大肝吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌｏｉｄｅｓ ｍａｇｎａ）、槍形吸虫（Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ）、ボビス住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｂｏｖｉｓ））の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６４４４５９．１に記載）；ブルータング病を引き起こす病原体（ＢＴＶウイルス、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ８２１１７０．１に記載）の遺伝子；又は回虫病を引き起こす病原体（寄生性気管支炎、「フーズ（ｈｏｏｓｅ）」としても知られている、シュナイダー糸状虫（Ｅｌａｅｏｐｈｏｒａ ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、毛様線虫属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）の種、オステルターグ胃虫（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）種、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）種、ディクチョカウルス・フィラリア（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｆｉｌａｒｉａ）、プロトストリンギルス・レフェセンス（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｒｅｆｅｓｃｅｎｓ）、毛細肺虫（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）、腸結節虫属（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）の種、ネオストロンギルス・リネアリス（Ｎｅｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ）、大口腸線虫（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ ｏｖｉｎａ）、ヒツジ鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｏｖｉｓ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３２８３．１１に記載）である。
特定の実施形態によれば、真核細胞がブタ細胞である場合、標的遺伝子は、アフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）（例えば、アフリカブタ熱を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１６５９．２に記載）；ブタコレラウイルス（例えば、ブタコレラを引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２６５７．１に記載）；又はピコルナウイルス（例えば***を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４００４．１に記載）である。
特定の実施形態によれば、真核細胞がニワトリ細胞である場合、標的遺伝子は、トリインフルエンザの遺伝子、トリパラミクソウイルス１（ＡＰＭＶ－１）（例えば、ニューカッスル病を引き起こす）の変種の遺伝子、又はマレック病を引き起こす病原体の遺伝子である。
特定の実施形態によれば、真核細胞がカブトエビ細胞である場合、標的遺伝子は、ホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＳＶ）の遺伝子、イエローヘッドウイルス（ＹＨＶ）の遺伝子、又はタウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）の遺伝子である。
特定の実施形態によれば、真核細胞がサケ細胞である場合、標的遺伝子は、伝染性サケ貧血（ＩＳＡ）の遺伝子、伝染性造血器壊死症（ＩＨＮ）の遺伝子、又はフナムシ（例えば、レペオフテイルス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ）属及びウオジラミ（Ｃａｌｉｇｕｓ）属の外部寄生性カイアシ類）の遺伝子である。
本発明はまた、本発明のサイレンシング挿入物又は細胞を投与することを含む、上記の疾患を治療又は予防する方法を提供する。本発明はまた、上記の疾患の治療又は予防において使用するための本発明のサイレンシング挿入物及び細胞を提供する。
一実施形態によれば、本方法によって作出された動物は、本方法によって作出されていない動物と比較して（すなわち、野生型の動物と比較して）、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％、病原体に対する耐性又は抵抗性が高い。
別の態様
本発明の任意の実施形態の別の態様では、サイレンシング挿入物は、内在性サイレンシング配列と同じ遺伝子でるが、標的遺伝子中の異なる配列位置を標的とする。従って、このような別の態様では、本発明は、サイレンシング挿入物を真核細胞のゲノムに挿入することを含む、標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、
該サイレンシング挿入物が、プロモーター又はその一部、第１の標的遺伝子を標的とすることによって該標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含み、
該サイレンシング挿入物が、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む該真核細胞における内在性サイレンシング配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、該第１の標的配列とは異なる第２の標的配列を標的とすることによって該標的遺伝子の発現をサイレンシングする方法を提供する。
これら別の態様では、本発明はまた、そのゲノム中に、
プロモーター又はその一部、第１の標的遺伝子を標的とすることによって該標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含むサイレンシング挿入物と、
該挿入物によって分離された内在性ゲノム配列と、
プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む内在性サイレンシング配列と、
を含み、
該サイレンシング挿入物及び該内在性サイレンシング配列が、該挿入物の長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、該第１の標的配列とは異なる第２の標的配列を標的とすることによって該標的遺伝子の発現をサイレンシングする真核細胞を提供する。
これら別の態様では、本発明はまた、プロモーター又はその一部と、真核細胞における標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列と、ターミネーター又はその一部とを含むサイレンシング挿入物を含む単離されたサイレンシングコンストラクトであって、
該サイレンシング挿入物が、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む真核細胞における内在性サイレンシング配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
該内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、第１の標的配列とは異なる第２の標的配列を標的とすることによって該標的遺伝子の発現をサイレンシングするコンストラクトを提供する。
概要
開示される生産物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が特に明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」に対する言及は、「複数のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」等を含む。
特に禁止されない限り、本明細書に開示される方法の工程は、任意の適切な順序で実行してよく、工程が列挙される順序は、限定的であるとみなされるべきではない。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１－本発明に係るサイレンシング挿入物の設計上の検討事項
本発明の方法の実施形態に従ってゲノムに導入されるサイレンシング挿入物を設計する際に考慮され得る種々の検討事項について以下に記載する。
本発明のいくつかの実施形態に従って真核細胞に導入されるサイレンシング挿入配列は、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む。このサイレンシングＲＮＡをコードしている配列は、真核細胞に存在する内在性サイレンシング配列（例えば、プロモーター、サイレンシングｎｃＲＮＡをコードしている遺伝子、及びターミネーターを含む）に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有する。サイレンシング挿入物のベースとなる内在性サイレンシング配列（「スカフォールド」）を選択するための様々な検討事項が存在し得、これには以下が含まれるが、これらに限定されない：
１．発現プロファイル－入力基準（例えば、所望の時空間的発現パターン）に一致する関連ｎｃＲＮＡがフィルタリング（すなわち、選出）されるように、公開されているか又は独自のｎｃＲＮＡデータセット（例えば、低分子ＲＮＡシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、ゲノムシーケンス、マイクロアレイ等）を検索する。例えば、サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、遍在的に（例えば、構成的に）発現することを意図しているか又は特異的に発現（例えば、特定の組織、発生段階、ストレス、熱／低温ショック等に特異的に発現）することを意図しているかに基づいて、好適な内在性配列を選択してもよい。これはまた、選択された内在性プロモーターの発現の位置／タイミングによって判定することもできる。可能なデータベースは、以下であり得る：
－ｍｉＲｂａｓｅ（Ｋｏｚｏｍａｒａ，Ａ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｓ ２０１１，’ＭｉＲＢａｓｅ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｅｐ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ’，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．，ｖｏｌ．３９，ｎｏ．１，ｐｐ．Ｄ１５２－Ｄ１５７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ１０２７）
－ｔａｓｉＲＮＡｄｂ（Ｃｈａｎｇｑｉｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｇｕａｎｇｐｉｎｇ Ｌｉ，Ｓｈｉｎｏｎｇ Ｚｈｕ，Ｓｈｕｏ Ｚｈａｎｇ，Ｊｉｎｇｇｕｉ Ｆａｎｇ，ｔａｓｉＲＮＡｄｂ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔａ－ｓｉＲＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ７，１ Ａｐｒｉｌ ２０１４，Ｐａｇｅｓ １０４５－１０４６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｔ７４６）
－ｍｉｒＥｘ ２．０（Ｚｉｅｌｅｚｉｎｓｋｉ，Ａｎｄｒｚｅｊ ｅｔ ａｌ．“ｍｉｒＥＸ ２．０ － ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．” ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５（２０１５）：１４４．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１５ Ｓｅｐｔ．２０１８）．
－Ｐｌａｎｔ Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｘｉｎ Ｙｉ，Ｚｈｅｎｈａｉ Ｚｈａｎｇ，Ｙｉ Ｌｉｎｇ，Ｗｅｎｙｉｎｇ Ｘｕ，Ｚｈｅｎ Ｓｕ，ＰＮＲＤ：ａ ｐｌａｎｔ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４３，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１，２８ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５，Ｐａｇｅｓ Ｄ９８２－Ｄ９８９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１１６２）
サイレンシング挿入物を用いた所望のサイレンシングに応じて、好適なｎｃＲＮＡ発現が選択される（例えば、低構成的発現、高発現、ストレス誘導等）。高いサイレンシング活性を得るためには、高発現ｎｃＲＮＡが望ましい場合があり、これは、ｓＲＮＡ－Ｓｅｑデータベースに存在するリード数の多さから判断することができる。低分子ＲＮＡ発現データをゲノムにアラインして、各ゲノム位置にマッピングされるリードの量を確定することができる（例えば、対応する内在性配列に一致するリードの分布をプロットするためには長さ１９～２４ｂｐのリードが使用される）。
２．サイレンシング効率－サイレンシング挿入物のサイレンシング効率は、そのベースとなる内在性ｎｃＲＮＡの同一性（並びにサイレンシング挿入物が標的とする遺伝子の同一性等の要因）によって影響を受け得る。従って、サイレンシング挿入物の所望のサイレンシングの程度に基づいて、選択される内在性ｎｃＲＮＡは、特定のサイレンシング活性（その標的遺伝子のタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物の不在又は観察可能なレベルの低下を引き起こす）を有する。ｎｃＲＮＡのサイレンシング効率は、上述のもの等のデータベースから抽出してもよく、当技術分野で公知の通り経験的に求めてもよい。
３．選択された標的遺伝子（すなわち、サイレンシング挿入物が標的とする遺伝子）と、挿入物のベースとなる内在性サイレンシング配列によってコードされるｎｃＲＮＡとの間の相同性の程度－サイレンシング挿入物設計の基礎となる内在性配列（「スカフォールド」）を選択するとき、サイレンシング挿入物によってコードされるサイレンシングＲＮＡと高い相同性を有するｎｃＲＮＡをコードしている配列を選択することが好ましい。従って、いくつかの実施形態によれば、サイレンシング挿入物によってコードされるサイレンシングＲＮＡを選択したら、使用する内在性配列、すなわち内在性「ｎｃＲＮＡスカフォールド」を選択する。サイレンシング挿入物によってコードされるサイレンシングＲＮＡは、既知のサイレンシングＲＮＡのデータベースから選択してもよい。好ましくは、サイレンシング挿入物によってコードされるサイレンシングＲＮＡの意図しない標的（すなわち、「オフターゲット」）として作用する可能性のある内在性／外来性標的遺伝子に対して高度に相同な配列が存在しないかどうかについても植物ゲノムをチェックする。
上記の発現基準に基づいてサイレンシング挿入物のベースとなる内在性配列を選択したら、サイレンシング挿入を設計する。サイレンシング挿入物は、プロモーター又はその一部と、第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングする低分子サイレンシングＲＮＡ（成熟ｓＲＮＡ）にプロセシングされるサイレンシングＲＮＡ前駆体をコードしている配列と、ターミネーター又はその一部とを含む。サイレンシング挿入物内の成熟ｓＲＮＡをコードしている配列は、標的遺伝子の配列、及び当技術分野で公知である（例えば、上記のもの等のデータベースに列挙されている）、経験的に同定された、又は当技術分野において公知のバイオインフォマティックツールを使用して同定されたサイレンシングＲＮＡの配列に基づいて選択してもよい。好ましくは、成熟ｓＲＮＡは、標的の配列と完全に一致する。従って、サイレンシング挿入物内の前駆体サイレンシングＲＮＡは、そのベースとなる内在性前駆体サイレンシングＲＮＡと非常に類似しており、選択した標的遺伝子を標的とすることを可能にする最小限の変化しか有しない。任意で、サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡからプロセシングされた成熟サイレンシングｓＲＮＡとそのベースとなる内在性サイレンシングＲＮＡとの間の配列変化は、使用されるサイレンシングＲＮＡの種類が二次構造の影響を受けるかどうかに依存する。例えば、サイレンシング挿入物内のサイレンシングＲＮＡの種類が、二次構造がその適切な生合成及び／又は機能において役割を果たさないようなものである場合（例えば、ｔａｓｉＲＮＡ）、サイレンシング挿入物内のサイレンシングＲＮＡが、その対応する内在性配列とわずか数個の改変（例えば、２０～３０ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、又は５ヌクレオチド）異なるだけで十分であり得る。サイレンシングＲＮＡが必須の二次構造を有するタイプである場合（すなわち、ＲＮＡサイレンシング分子の適切な生合成及び／又は活性がその二次構造に依存する；例えば、ｍｉＲＮＡ）、サイレンシング挿入物内のサイレンシングＲＮＡは、二次構造を維持しながらサイレンシング特異性を実現するために、その対応する内在性配列とより多数のヌクレオチド（例えば、１０～２００ヌクレオチド、５０～１５０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド超、２００ヌクレオチド以下、３０～２００ヌクレオチド、３５～２００ヌクレオチド、３５～１５０ヌクレオチド、又は３５～１００ヌクレオチド）が異なっていてもよい。
サイレンシング挿入物はまた、挿入物のベースとなる内在性配列と同一のプロモーター及びターミネーターの領域を含む。
サイレンシング挿入物に含まれるプロモーター領域は、例えば、以下のような様々な方法で選択することができる：
１．既知のプロモーターの使用－プロモーターデータベースには、実験的に検証された転写開始点（ＴＳＳ）を有するアノテーション付きプロモーターが含まれており、更に実験的証拠は既刊文献に見出すことができる。例えば、シロイヌナズナの平均プロモーター長は約０．５ｋｂである（Ｋｏｒｋｕｃ Ｐ，Ｓｃｈｉｐｐｅｒｓ ＪＨ，Ｗａｌｔｈｅｒ Ｄ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４ Ｊａｎ；１６４（１）：１８１－２００．ｄｏｉ：１０．１１０４／ｐｐ．１１３．２２９７１６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｎｏｖ ７．ＰＭＩＤ：２４２０４０２３；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８７５８００）。
２．バイオインフォマティクスによる予測に基づいたプロモーターの使用－プロモーターが由来する種のゲノムにアノテーションが付いていると考えられる場合、公的に利用可能なデータベースで配列を検索することができ、プロモーターを同定／予測するためにバイオインフォマティックツールを使用することができる。異なる植物種のプロモーターを予測するための公知のツール／データベースとしては、以下が挙げられる：
－ＴＳＳＰ（ＰｌａｎｔＰｒｏｍ ＤＢ及びＰｐｄｂデータベースに基づくツール）
（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ？ｔｏｐｉｃ＝ｔｓｓｐ＆ｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｇｒａｍｓ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｍｏｔｅｒ）
－ＰｌａｎｔＰｒｏｍ ＤＢ（データベース：様々な植物種の実験的に決定された転写開始点（複数可）ＴＳＳを有するＲＮＡポリメラーゼＩＩの近位プロモーター配列のアノテーション付き非冗長コレクション）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ？ｔｏｐｉｃ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍ＆ｇｒｏｕｐ＝ｄａｔａ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍ）
－Ｐｒｏｍｐｒｅｄｉｃｔ（隣接領域間の安定性の差に基づいてゲノムＤＮＡ配列中のプロモーター領域を同定するためのツール）
（ｈｔｔｐ：／／ｎｕｃｌｅｉｘ．ｍｂｕ．ｉｉｓｃ．ｅｒｎｅｔ．ｉｎ／ｐｒｏｍｐｒｅｄｉｃｔ／ｐｒｏｍｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ）．
－Ｐｐｄｂ（データベース）
（ｈｔｔｐ：／／ｐｐｄｂ．ａｇｒ．ｇｉｆｕ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｐｐｄｂ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）
－ＮＳＩＴＥ－ＰＬ（ツール：植物調節配列のコンセンサスパターン検索）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ？ｔｏｐｉｃ＝ｎｓｉｔｅｐ＆ｇｒｏｕｐ＝ｈｅｌｐ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｍｏｔｅｒ）
－ＰＬＡＣＥ（植物のシス作用性調節ＤＮＡエレメントにみられるモチーフのデータベース）
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／？ａｃｔｉｏｎ＝ｎｅｗｐｌａｃｅ）
－ＰｌａｎｔＣＡＲＥ（植物シス作用性調節エレメントのデータベース）
（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ／）
－ＭＢＭＥＤＡ（ツール）
（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＪｍｏｎｋＧ／ＭＢＭＥＤＡ）
－ＣｏＶｏｔｅ（Ｃｏｍｍｏｎ ｑｕｅｒｙ Ｖｏｔｉｎｇ）（ｍｉＲＮＡの未知のコアプロモーターを予測するためのツール）
－マイクロＲＮＡプロモーターを予測する方法及び転写因子が媒介する調節ネットワークＺｈａｏ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｆ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｗａｎ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１７；２０１７：７０４９４０６．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１７／７０４９４０６．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｎ ５．ＰＭＩＤ：２８６５６１４８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５４７４５３５．
－ＡｔｍｉＲＮＥＴ（ＮＧＳデータから構築したデータベース）
（ｈｔｔｐ：／／ＡｔｍｉＲＮＥＴ．ｉｔｐｓ．ｎｃｋｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／）
－ＰｌａｎｔＰＡＮ ３．０（転写因子結合部位及び調節エレメントを検出するためのツール）
（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔｐａｎ．ｉｔｐｓ．ｎｃｋｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／）
－更に、アノテーション付きのゲノムに対してオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及びｎｃＲＮＡ配列を検索することができ、そのようなＯＲＦ又はｎｃＲＮＡの５’領域の配列を検索することができる。
種のゲノムにアノテーションが付いていない場合は、遺伝子発現データを代わりに使用することができる。転写開始点は、完全長ｃＤＮＡ／５；－５’ＥＳＴマッピング、ＣＡＧＥ（Ｃａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、及びＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）アプローチを適用することによって同定することができる。ＴＳＳの選択は、細胞／組織の種類、発生段階、及び環境条件に依存するので、ＮＧＳデータは、様々な状況におけるプロモーター配列を同定することを可能にする。ＲＴ－ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、及びマイクロアレイ解析を用いてプロモーター発現プロファイルを評価することもできる。プロモーター活性及びその発現プロファイルは、レポーター遺伝子（例えば、ｕｉｄＡ、ｇｆｐ、ｌｕｃ）の５’領域で配列を融合させることによって同定することもできる。プロモーターを含む配列が同定されたら、そのような配列に由来する遺伝子断片を次第に小さくしながらレポーター遺伝子の５’領域で融合させて、最小プロモーター領域を同定することができる。
バナナにおけるプロモーター解析は、例えば、Ｓａｎｔｏｓ Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｂａｎａｎａ．Ｉｎ：Ｍｏｈａｎｄａｓ Ｓ．，Ｒａｖｉｓｈａｎｋａｒ Ｋ．（ｅｄｓ）Ｂａｎａｎａ：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－９８１－１０－１５８５－４＿１１に示されている。
３．発現データに基づく十分なプロモーター断片の同定－プロモーター領域を同定するために、図１及び２に概説し、以下に記載する以下のプロセスに従って、シロイヌナズナ及びバナナ（Ｍ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）におけるバイオインフォマティック同定パイプラインを試験した：
ゲノム及びゲノムのアノテーション
シロイヌナズナのゲノム及びゲノムのアノテーションについては、ＴＡＩＲ（バージョン１０）から入手した。更に、シロイヌナズナの公知のｍｉＲＮＡ前駆体及び成熟配列は全て、ｍｉＲＢａｓｅ（バージョン２２）（Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００４ ３２：Ｄ１０９－Ｄ１１１）から入手した。バナナゲノムは、その対応する遺伝子の構造及び機能情報と共にｇｆｆ形式でバナナゲノムハブ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ＤＨ Ｐａｈａｎｇ ｖ２）から入手した。ｐｈａｓｅｄＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを同定するために、２つの社内予測パイプラインを利用した。
低分子ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット
公的に利用可能なリソースから合計３３個のシロイヌナズナ低分子ＲＮＡ－ｓｅｑシーケンシングサンプルを抽出した。データセットは様々な組織からサンプリングする：７個の苗サンプル、５個の根サンプル、２個の芽サンプル、５個の葉サンプル、６個の花序サンプル、３個の花サンプル、及び４個の他の異なる組織。いくつかの発生段階／組織から合計１４個のバナナ低分子ＲＮＡサンプルを得、社内でシーケンシングした－緑色の果肉（２サンプル）、緑色の果皮（２サンプル）、巻葉（２サンプル）、天葉（２サンプル）、根（２サンプル）、黄色の果皮（２サンプル）、及び黄色の果肉から２サンプル。
ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット
公的に利用可能なリソースから合計３５個のシロイヌナズナＲＮＡ－ｓｅｑシーケンシングサンプルを抽出した。データセットは様々な組織からサンプリングする：１０個の葉サンプル、８個の根サンプル、７個の苗サンプル、３個の稚苗サンプル、２個の芽サンプル、３個の胚珠サンプル、及び２個の長角果サンプル。いくつかの発生段階／組織から合計１４個のバナナｍＲＮＡサンプルを得、社内でシーケンシングした－緑色の果肉（２サンプル）、緑色の果皮（２サンプル）、巻葉（２サンプル）、天葉（２サンプル）、根（２サンプル）、黄色の果皮（２サンプル）、及び黄色の果肉から２サンプル。
Ｃｕｔａｄａｐｔを用いてＲＮＡ－ｓｅｑサンプルを品質トリミングに供した。低分子ＲＮＡ－ｓｅｑサンプルにおけるアダプター配列を同定するために、各サンプルごとにＱＣ解析を行い、Ｃｕｔａｄａｐｔを用いてアダプターをトリミングした。次いで、ＳＴＡＲを用いて全てのサンプルを対応する種のゲノムにアラインし、出力されたアラインメントファイルを、Ｓａｍｔｏｏｌｓを用いてソートした。
発現に基づく転写開始点及び切断点の検出
アノテーション付き又は予測された各遺伝子について、ｓＲＮＡ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑ発現データに基づいて、遺伝子の転写開始点及び切断点のゲノム座標を同定した。低分子ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑのデータを用いて、遺伝子のゲノム上の位置と、その遺伝子の上流及び下流２０Ｋｂの位置に一致するリードを記録した。生のリードカウントを、以下の式を用いてＲＰＭに対して正規化した：
（式中、Ｘｉ＝Ｘｉのゲノム座標にマッピングされるリード数、Ｎ＝マッピングされたリードの総数、１０６は、正規化係数である）
正規化されたリードカウント（ＲＰＭ）が所定の閾値以上である位置を、発現しているとみなす。任意の所与の遺伝子について、その発現に基づく転写開始点は、前述の定義に鑑みて発現しているとみなされる最も上流の位置である。遺伝子の開始位置よりも上流で発現が検出されない場合、本質的に、その発現に基づく転写開始点がアノテーション付き遺伝子の開始位置となる。
同様に、発現に基づく切断点及び終結点は、その遺伝子が発現している最も下流の位置であると定義される。遺伝子の終結位置よりも下流で発現が検出されない場合、発現の切断点又は終結点を遺伝子の終結位置と定義する。
プロモーター領域のインシリコ予測
プロモーターを同定するための実験的方法は、コストがかかり、時間がかかり、手間もかかる。従って、インシリコ法が魅力的な選択肢となる。プロモーター配列は、転写の特異的調節に関与する転写因子（ＴＦ）の結合部位として機能する複数の短いＤＮＡモチーフを含んでおり、各プロモーターはＴＦ結合部位の独自の構成を有する。要するに、プロモーター予測アルゴリズムは、プロモーター領域の特徴（例えば、配列、状況、構造等）が他のゲノム領域とは異なるという考えに基づいてプロモーター領域を同定する。プロモーターは、ほとんどの場合、転写開始点（ＴＳＳ）の位置の直上流数百塩基対に及ぶ。対象となる遺伝子のプロモーター領域を予測するために、ＴＳＳＰｌａｎｔ及びＰｒｏｍＰｒｅｄｉｃｔの２つの予測アルゴリズムを採用した。ＴＳＳＰｌａｎｔは、人工ニューラルネットワークベースのモデルを供給する植物のプロモーター配列の組成及びシグナルに関する特徴を利用するが、一方、ＰｒｏｍＰｒｅｄｉｃｔは、実験的に決定されたＴＳＳに対して、隣接する上流及び下流の領域のＤＮＡ安定性の差に基づいている。各プロモーター予測法の出力を、社内のプログラムを用いて解析し、次いで、予測されたプロモーター領域の最も上流の位置を各方法ごとに記録する。最終的なプロモーター領域は、前の工程で記録された２つの位置間の最も上流の位置と発現に基づく転写開始点との間にまたがる領域として定義される。
ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩの植物ターミネーターは、一般に、終結複合体が結合するために終止コドン部位の下流、３’ＵＴＲに２つのエレメントを必要とする。この複合体は、ＡＡＵＡＡＡポリアデニル化（ポリ（Ａ））モチーフ及びＵ又はＧＣリッチ配列に結合する。転写物は、これら２つのエレメント間の部位で切断される。プロセシング部位は、Ｕリッチ領域に含まれるＣＡ又はＵＡ配列からなり、通常シロイヌナズナではＡＡＵＡＡＡ部位の１０～３０ｎｔ下流、イネでは１０～３５ｎｔ下流にある。ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、終結複合体の一部であり、切断された転写物の３’末端にポリＡテールを付加する。３’ＵＴＲの平均長さは、シロイヌナズナでは２４２ｂｐ、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）では４６９ｂｐである。
サイレンシング挿入物に含まれるターミネーター領域は、例えば、以下のような様々な方法で選択することができる：
１．アノテーション付きゲノムにおけるターミネーター－ゲノムにアノテーションが付いている場合、対象となる特定のＯＲＦ又はｎｃＲＮＡ配列の下流の終結シグナルについてスキャンすることができる。認証されたポリ（Ａ）モチーフを含む既存のデータベースに対してＲＮＡ－ｓｅｑを検索することができる。
２．アノテーションが付いていないゲノムにおけるターミネーター－ゲノムにアノテーションが付いていない場合、ターミネーターはＮＧＳによって同定することができる。ＲＮＡサンプルを３’－ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）アッセイに供した後、シーケンシングすることによって、ポリＡテールを同定することができる。ターミネーター領域は、これらポリＡ領域の直上流にみられる。更に、ＲＨＡＰＡ（ＲＮａｓｅ Ｈ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）をポリアデニル化部位の直接検証に使用することもできる。ターミネーター活性は、プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子（例えば、ｕｉｄＡ、ｇｆｐ、ｌｕｃ）の３’領域の配列で融合することによって同定することもできる。ターミネーターを含む配列が同定されたら、そのような配列に由来する遺伝子断片を次第に小さくしながらレポーター遺伝子の３’末端で融合させて、最小ターミネーター領域を同定することができる。
３．ポリアデニル化部位の予測－様々な植物種のポリアデニル化部位を予測するために利用可能なオンラインツール／データベースがいくつか存在する：
－ＳｉｇｎａｌＳｌｅｕｔｈ２
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇ３ｊｏｕｒｎａｌ．ｏｒｇ／ｌｏｏｋｕｐ／ｓｕｐｐｌ／ｄｏｉ：１０．１５３４／ｇ３．１１４．０１０２４９／－／ＤＣ１／ＦｉｌｅＳ２．ｚｉｐ）
－ＰＡＳＳ（ポリ（Ａ）部位探索）（ツール）（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔａｔｉｃ－ｃｏｎｔｅｎｔ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ｅｓｍ／ａｒｔ％３Ａ１０．１１８６％２Ｆ１４７１－２１０５－８－４３／ＭｅｄｉａＯｂｊｅｃｔｓ／１２８５９＿２００６＿１４１５＿ＭＯＥＳＭ１＿ＥＳＭ．ｐｄｆ）
－ＰＡＳＰＡ（植物及び藻類におけるポリ（Ａ）部位予測）（ツール）
（ｈｔｔｐ：／／ｂｍｉ．ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｐａｓｐａ）
－ＰｌａｎｔＡＰＡｄｂ（植物における別のＰｏｌｙ（Ａ）部位のデータベース）（ｈｔｔｐ：／／ｂｍｉ．ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｐｌａｎｔＡＰＡｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｉｂｉｇ．ｃｎ／ｐｌａｎｔＡＰＡｄｂ／）
あるいは、所与の遺伝子のターミネーター領域は、その発現切断点又は終結点（ｓＲＮＡ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析によって決定される転写物の’３末端）の下流に位置する一続きの約５００ｂｐとして定義することもできる。
実施例２－シロイヌナズナ及び線形動物ジャガイモシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）の遺伝子を標的とするサイレンシング挿入物の設計
以下に、設計された２つのサイレンシング挿入物（本明細書では「ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ」とも称される）について説明する。サイレンシング挿入物の一方はシロイヌナズナのフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡをコードしており、他方のサイレンシング挿入物は線形動物ジャガイモシストセンチュウ遺伝子を標的とするｔａｓｉＲＮＡをコードしている。
サイレンシング挿入物の設計を作成するための計算パイプライン
計算パイプラインを用いて、下記のサイレンシング挿入物によってコードされている非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を設計した。このパイプラインは、生物学的メタデータを適用して、サイレンシング挿入物のベースとなる内在性サイレンシング遺伝子を最小限しか変化させることなく、選択した標的遺伝子をサイレンシングすることができるｎｃＲＮＡ設計を見出す。
簡単に説明すると、ａ）サイレンシングされる標的配列、ｂ）サイレンシング挿入物を発現させるための宿主生物、ｃ）サイレンシング挿入物によってコードされているｎｃＲＮＡの種類、及びｄ）サイレンシング挿入物の所望の発現パターンを含み得る入力をパイプラインに供給する。次いで、入力基準に合致し、標的の配列と高い相補性レベルを有するｎｃＲＮＡについて、計算プロセスによってｎｃＲＮＡデータセット（例えば、低分子ＲＮＡシーケンシング、マイクロアレイ等）を検索する。次いで、ｎｃＲＮＡの配列を、標的の配列と完全に一致するように改変し、改変された成熟ｎｃＲＮＡの配列を、サイレンシング効力を予測するアルゴリズムにかける。サイレンシング効力が最も高いと予測されるｎｃＲＮＡの中から、サイレンシング挿入物に含まれるｎｃＲＮＡを選択する。
シロイヌナズナのＰＤＳ３を標的とするサイレンシング挿入物の設計
このサイレンシング挿入物の基礎／スカフォールドとして、シロイヌナズナ由来のｍｉＲ１７３（ａｔｈ－ｍｉＲ１７３）を選択した。Ａｔｈ－ｍｉＲ１７３は、遍在的に高発現する。それは、刊行物及びデータベースに掲載されており、そのステムループ構造について説明されており、成熟ｍｉＲＮＡに関する実験的証拠及び配列が入手可能である。ａｔｈ－ｍｉＲ１７３の配列は、ｍｉＲＢａｓｅデータベース［Ｋｏｚｏｍａｒａ，Ａ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１４）４２：Ｄ６８，ＡｉＤ７３］から入手した。野生型Ａｔｈ－ｍｉＲ１７３の配列は、
５’－ｔａａｇｔａｃｔｔｔｃｇｃｔｔｇｃａｇａｇａｇａａａｔｃａｃａｇｔｇｇｔｃａａａａａａｇｔｔｇｔａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａｇｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇｔｇａｔｔｃｔｃｔｇｔｇｔａａｇｃｇａａａｇａｇｃｔｔｇ－３’（配列番号１）
である。
サイレンシング挿入物内のｎｃＲＮＡの配列（ａｔｈ－ｍｉＲ１７３に基づく）は、
５’－ｔａａｇｔａｃｔｔｔｇａｃａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｃｃａｇｃａｇｔｇｇｔｃａａａａａａｇｔｔｇｔａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａｇｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇｃｔｇａｔｔｇｇｃａｇｇａｔｔｇｔｃａａａｇａｇｃｔｔｇ－３’（配列番号２）
である。
サイレンシング挿入物によってコードされるｓｉＲＮＡの配列は、
５’－ｔｇａｃａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｃｃａｇｃ－３’（２１ｎｔ）（配列番号３）
である。
プロセシングされた成熟低分子ＲＮＡは、５’に標的配列と一致しない追加の「ｔ」を含む。従って、改変型成熟ｓｉＲＮＡは２２ｎｔとなる。
標的遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４２１０．１と命名、Ｔａｉｒアクセッション配列：２１２９５１７及びＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＭ＿１１７４９８を有する）は、色素蓄積に関与しているフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）遺伝子である（従って、それをサイレンシングすると、光退色が引き起こされる）。その配列は、
５’－ＡＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＴＡＡＴＧＧＧＡＣＡＴＡＧＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＴＴＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＴＴＧＴＧＴＧＧＡＴＡＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＧＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴＧＣＴＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＣＣＧＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＧＡＴＣＡＡＴＧＡＴＣＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＧＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＴＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＴＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＧＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＡＣＴＴＴＡＴＡＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＧＡＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＴＧＣＣＡＧＴＡＧＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＡＴＧＡＣＧＡＴＧＧＣＡＣＧＧＴＴＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＡＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＣＴＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＴＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＧＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＡＴＧＣＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＴＡＡＣＴＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＡＣＧＡＴＣＣＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＡＴＴＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＡＧＡＴＧＣＡＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＴＧＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＡＡＧＡＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＴＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡ－３’（配列番号４）
である。
ｓｉＲＮＡ標的部位の配列は、以下の通りである：５’－ＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＣＡ－３’（配列番号５）。
ｍｉＲ１７３のプロモーター、ターミネーター、及び遺伝子領域の推定を以下のように決定し、サイレンシング挿入物の設計に用いた：
－プロモーター－プロモーター領域の推定には、ＮＧＳデータから構築したＡｔｍｉＲＮＥＴデータベースを使用した。２つの転写部位は、ｍｉＲ１７３ ｎｃＲＮＡ転写物配列から６４ｂｐ及び１０４ｂｐ上流であると予測された。ＴＳＳＰツール（ＰｌａｎｔＰｒｏｍ ＤＢ及びＰｐｄｂデータベースに基づく）によって、ｍｉＲ１７３ ｎｃＲＮＡ転写物配列の１００ｎｔ未満上流にプロモーター及びＴＡＴＡボックスが存在すると予測された。これら予測及びシロイヌナズナの平均プロモーター長（５００ｂｐ）を考慮して、ｍｉＲ１７３ ｎｃＲＮＡの直上流５００ｂｐをプロモーター領域として選択した。
－ターミネーター－ターミネーター領域については、シロイヌナズナの平均３’ＵＴＲ長（２４２ｂｐ）を考慮して、ｍｉＲ１７３ ｎｃＲＮＡ転写物配列の直下流４００ｂｐをターミネーターとして作用するように選択した。
－遺伝子－ｍｉＲ１７３の配列は、ｍｉＲＢａｓｅデータベースから入手した。
野生型ｍｉＲ１７３配列に対する完全に設計されたサイレンシング挿入物を図３Ａ～Ｃに示す。
ジャガイモシストセンチュウのリボソームタンパク質３ａを標的とするサイレンシング挿入物の設計
このサイレンシング挿入遺伝子の基礎／スカフォールドとして、トランス作用性－ｓｉＲＮＡ生成（ＴＡＳ）分子をコードしているシロイヌナズナ由来のＴａｓ３ａ（ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ）を選択した。線形動物ジャガイモシストセンチュウの必須遺伝子を標的とし、サイレンシングする長鎖ｄｓＲＮＡ及び低分子二次ｔａｓｉＲＮＡが生じるように、特定のヌクレオチド配列変化を有するＴａｓ３ａ配列を含むように、サイレンシング挿入物の配列を設計した。Ａｔ３ｇ１７１８５は、ｔａ－ｓｉＲＮＡ生成遺伝子座であることが示されている。それは、刊行物及びデータベースに掲載されており、ｓｉＲＮＡに関する実験的証拠及び配列が入手可能である。ｄｓＲＮＡによって引き起こされるサイレンシングに関与する二次構造は存在しない。ｔａｓｉＲＮＡの前駆体及び成熟配列をｔａｓｉＲＮＡｄｂデータベースから入手した［Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４）３０：１０４５，Ａｉ１０４６］。
ＷＴ ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ｎｃＲＮＡ配列：
５’－ＡＴＣＣＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＣＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＧＴＣＴＡＴＣＴＧＴＡＴＡＴＧＴＧＡＴＡＣＧＡＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＣＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＴＴＴＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＴＡＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＡＧＴＡＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＧＴＴＡＴＣＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＣＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＧＴＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＧＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＴＡＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＣＴ－３’（配列番号６）
ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ｎｃＲＮＡ配列：
５’－ＡＴＣＣＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＣＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＧＴＣＴＡＴＣＴＧＴＡＴＡＴＧＴＧＡＴＡＣＧＡＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＣＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＴＴＴＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＴＡＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＡＧＴＡＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＧＴＴＡＴＣＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＧＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＴＡＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＣＴ－３’（配列番号７）
ＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子を標的とした場合の線形動物における悪影響について論じた過去の刊行物に基づいて、ジャガイモシストセンチュウのリボソームタンパク質３ａ標的遺伝子を選択した。この遺伝子は異なる系統の線形動物で同定されたので、選択した遺伝子をクエリとして用いて、ジャガイモシストセンチュウの公に利用可能なデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｐａｒａｓｉｔｅ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ／Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ＿ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ＿ｐｒｊｅｂ１３５０４／Ｉｎｆｏ／Ｉｎｄｅｘ／）におけるＢＬＡＳＴ検索を通してそのホモログを同定した。
線形動物の標的遺伝子配列（標的配列を下線で示す）：
５’－ＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＴＣＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＣＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＡＡＣＧＴＣＧＧＣＡＡＡＡＣＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＧＣＧＣＡＴＴＴＣＧＡＧＣＧＡＣＴＴＴＣＴＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＣＴＴＴＣＧＡＡＡＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＡＣＧＧＡＡＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＡＣＣＧＡＣＧＧＴＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＡＣＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＧＧＡＴＧＡＴＴＣＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＧＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＴＧＣＣＧＧＡＡＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＧＡＧＣＣＧＴＣＣＧＧＡＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＣＣＧＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＧＴＴＴＧＡ－３’（配列番号８）
標的遺伝子内のｓｉＲＮＡ標的部位配列：
５’－ＡＴＴＣＧＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧ－３’（配列番号９）
サイレンシング挿入物設計における相同領域：
５’－ＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＧＡＡＴ－３’（配列番号１０）
以下は、サイレンシング挿入物内にコードされているｓｉＲＮＡ配列であり、標的遺伝子に対して相同な領域を示している。線形動物におけるｓｉＲＮＡの生成を促進するために、設計したｓｉＲＮＡの長さは３０ｎｔである：
５’－ｃｇｇｃｔｔｃｔｔｃａｇｃａｃｃｔｔｃａｃｃｔｔａｃｇａａｔ－３’（配列番号１０）
Ｔａｓ３ａのプロモーター、ターミネーター、及び遺伝子領域の推定を以下のように決定し、サイレンシング挿入物の設計に用いた：
－プロモーター－ここでは、シロイヌナズナの平均プロモーター長（５００ｂｐ）を考慮しただけでなく、Ｐｒｏｍｐｒｅｄｉｃｔツールも適用した。このツールは、隣接する領域間の安定性の差に基づいて、ゲノムＤＮＡ配列におけるプロモーター領域を同定する。次いで、Ｔａｓ３ａ ｎｃＲＮＡ転写物配列の直上流１２００ｂｐをプロモーターとして選択した。
－ターミネーター－ターミネーターの長さの推定にはＰｌａｎｔＡＰＡｄｂデータベースを使用した。このデータベースは、３’－ｓｅｑで得られた大量のデータから作成された。アノテーション付きＴａｓ３ａ ｎｃＲＮＡ転写物配列の約３００ｂｐ下流にポリ（Ａ）部位が存在すると予測された。これを考慮して、ターミネーターとして作用するように５００ｂｐを選択した。
－遺伝子－Ｔａｓ３の配列は、ｔａｓｉＲＮＡｄｂデータベースから入手した。
野生型ｍｉＲ１７３配列に対する完全に設計されたサイレンシング挿入物を図４Ａ～Ｂに示す。
設計された挿入物の合成及び転換
サイレンシング挿入物発現カセットを、ＤＮＡ銃により線状ＤＮＡとして細胞に導入し、ランダムに組み込む。サイレンシング挿入物発現カセットを化学合成によって作製し、高忠実度ＰＣＲによって全体として増幅させる。あるいは、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、挿入物のベースとなる配列に関連する改変を導入するための重複ＰＣＲ反応によって、サイレンシング挿入物カセットを作製する（図５）。組み込みを促進するために突出末端を作製するのに必要な、ＰＣＲ増幅の後かつ制限酵素消化の前に、市販のキットとして入手可能な遠心フィルターを用いることによってＤＮＡを濃縮する必要がある場合もある。
線状ＤＮＡ分子の５’末端及び３’末端に可能な別の構成が存在する：
・平滑末端分子は、標準的なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、それ以上処理を行うことなく生成することができる。ＰＣＲで増幅したら、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを市販のクリーンアップ濃縮キットで精製し、ゲル分析及び蛍光定量を通して収量及び完全性を評価する。
・突出末端分子は、５’末端に異なる制限部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて生成することができる。ＰＣＲ産物を対応する高忠実度制限酵素で制限酵素消化すると、突出末端が生じる。制限酵素処理したら、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを市販のクリーンアップ濃縮キットで精製する。これらキットにより、酵素及びプライマーからＤＮＡをクリーンアップすることが可能になる。ゲル分析及び蛍光定量を通して、収量及び完全性を評価する。
・化学的に安定化された分子は、エキソヌクレアーゼ分解を低減するために安定化５’－ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを用いて生成することができる。ＰＣＲで増幅したら、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを市販のクリーンアップ濃縮キットで精製し、ゲル分析及び蛍光定量を通して収量及び完全性を評価する。
平滑末端ＧＥｉＧＳ（商標）カセット生成用プライマー
ａｔｈ－ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｃａｇａａｇｃｃａａａｔｃｔｔｔｇｇｔａａａｃａａａｇｔａａｔｔｔｔｔｔｔｇ－３’（配列番号１１）
プライマーＲｅｖ：５’－ａａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号１２）
ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ａｔｇａａａｔｔａａｇａｇｃｃｔｔｇｔｃｃｔａｇｔｔｔｔｇｔａｇｔａｇ－３’（配列番号１３）
プライマーＦｗ：５’－ａｇｔａｇａｇａｃａｔａｔａｃｔｔｃｔｇｔｃｔａｃａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｔｔａｔｃ－３’（配列番号１４）
突出末端ＧＥｉＧＳ（商標）カセット生成用プライマー
ａｔｈ－ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘｃａｇａａｇｃｃａａａｔｃｔｔｔｇｇｔａａａｃａａａｇｔａａｔｔｔｔｔｔｔｇ－３’（配列番号１５）
プライマーＲｅｖ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号１６）
ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａｔｇａａａｔｔａａｇａｇｃｃｔｔｇｔｃｃｔａｇｔｔｔｔｇｔａｇｔａｇ－３’（配列番号１７）
プライマーＲｅｖ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａｇｔａｇａｇａｃａｔａｔａｃｔｔｃｔｇｔｃｔａｃａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｔｔａｔｃ－３’（配列番号１８）
（式中、
－ｎ：任意のヌクレオチド
－ｘｘｘｘｘｘ：高忠実度酵素の制限部位）。
化学的に安定化したＧＥｉＧＳ（商標）カセット生成用プライマー
ａｔｈ－ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｃ＊ａｇａａｇｃｃａａａｔｃｔｔｔｇｇｔａａａｃａａａｇｔａａｔｔｔｔｔｔｔｇ－３’（配列番号１９）
プライマーＲｅｖ：５’－ａ＊ａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号２０）
ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ａ＊ｔｇａａａｔｔａａｇａｇｃｃｔｔｇｔｃｃｔａｇｔｔｔｔｇｔａｇｔａｇ－３’（配列番号２１）
プライマーＲｅｖ：５’－ａ＊ｇｔａｇａｇａｃａｔａｔａｃｔｔｃｔｇｔｃｔａｃａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｔｔａｔｃ－３’（配列番号２２）
（式中、＊は、ホスホロチオエート結合を表す）
線状サイレンシング挿入物発現カセットを、微粒子銃プロトコールを用いてシロイヌナズナの根組織に導入する（Ｓａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。簡単に説明すると、シロイヌナズナの根の切片をカルス誘導培地で４８時間培養した後、マイクロカルスにＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを打ち込む。カルス誘導培地上で４８時間回復させた後、マイクロカルスを適切な選択剤を含む芽誘導培地に移す。次いで、形質転換された植物を、以下の実施例に詳述されている通り再生させ、遺伝子型を決定することができる（参照文献：Ｒｕｆ，Ｓ．，Ｆｏｒｎｅｒ，Ｊ．，Ｈａｓｓｅ，Ｃ．，Ｋｒｏｏｐ，Ｘ．，Ｓｅｅｇｅｒ，Ｓ．，Ｓｃｈｏｌｌｂａｃｈ，Ｌ．，Ｂｏｃｋ，Ｒ．（２０１９）．Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｔｉｌｅ ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｌａｎｔｓ，５（３），２８２－２８９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４７７－０１９－０３５９－２；Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｓｅｋｉ，Ｍ．，Ａｎｚａｉ，Ｈ．，Ｉｒｉｆｕｎｅ，Ｋ．，＆ Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｈ．（１９９４）．Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｒ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３，２７９－２８６）。
実施例３－サイレンシング挿入物を含む細胞の選抜方法
以下は、優性シスジェニック選抜を用いた、サイレンシング挿入物を含む細胞の選抜方法について説明する。
優性シスジェニック選抜の根拠
優性対立遺伝子とは、同じ遺伝子に他の劣性対立遺伝子が存在していたとしても、その表現型が優勢になる特定の遺伝子バリアントである。劣性遺伝子の表現型効果はホモ接合体条件下でのみ明らかになるが、優性対立遺伝子の効果はホモ接合体条件下及びヘテロ接合体条件下の両方でみられる。機能獲得型変異によって生じる優性選択マーカーは、植物の形質転換及びゲノム編集に特に有用である。この変異型対立遺伝子は感受性の非変異型対立遺伝子（複数可）に対して優性であり、ヘテロ接合体条件下であっても抵抗性表現型が優勢となる。場合によっては、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子にみられるように、優性除草剤抵抗性表現型を作り出すには特定の単一点変異で十分である。強力な優性マーカーは低コピー数で選択できるため、形質転換効率を高める。
自然発生変異を利用した除草剤選択
そのような選択マーカーの１つは、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子を変化させることによって実現することができる。核内ＡＬＳ遺伝子は、分岐鎖アミノ酸の生合成の第一段階に関与する酵素をコードしている。ＡＬＳ酵素を阻害する除草剤は、分岐アミノ酸の合成に干渉し、植物を枯死させる。そのような除草剤には５つの主なファミリー、すなわち、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、スルホニルウレア（ＳＵ）、ピリミジニルチオベンゾエート（ＰＴＢ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン（ＳＣＴ）がある。
ＡＬＳ酵素を標的とする除草剤が広く採用されるようになって以来、ＡＬＳ阻害型除草剤に抵抗性を示す雑草において、複数の自然発生した非同義ＡＬＳ変異が報告されている。２０２０年現在、少なくとも２２種の単子葉雑草及び４８種の双子葉雑草が、ＡＬＳ阻害型除草剤に対して自然抵抗性を有している。これら場合のほとんどは、ＡＬＳ遺伝子における１つ以上の単一点変異からなる。
最初の変異は、早くも１９９０年には報告されている（Ｐ１９７Ｔであった）。それ以来、広く使用され、選択圧が高く、単一点変異の性質を有することに鑑みて、除草剤抵抗性ＡＬＳ変異体は頻繁に出現している。一例として、シロイヌナズナのＡＬＳ１遺伝子におけるプロリン１９７のセリンへの変異（Ｐ１９７Ｓ）は、クロルスルフロン（ＳＵバリアント）抵抗性を付与する。変異型ＡＬＳ対立遺伝子は、感受性の非変異型対立遺伝子に対して優性である。ヘテロ接合体条件下であっても抵抗性表現型が優勢である（Ｙｕ Ｑ，Ｈａｎ Ｈ，Ｖｉｌａ－Ａｉｕｂ ＭＭ，Ｐｏｗｌｅｓ ＳＢ．ＡＨＡＳ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｎｄｏｗｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＡＨＡＳ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．２０１０；６１（１４）：３９２５－３９３４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｘｂ／ｅｒｑ２０５；Ｔｒａｎｅｌ，Ｐ．，＆ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｔ．（２００２）．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｗｅｅｄｓ ｔｏ ＡＬＳ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ：Ｗｈａｔ ｈａｖｅ ｗｅ ｌｅａｒｎｅｄ？ ＜ｉ＞Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＜／ｉ＞＜ｉ＞５０＜／ｉ＞（６），７００－７１２．ｄｏｉ：１０．１６１４／００４３－１７４５（２００２）０５０［０７００：ＲＲＯＷＴＡ］２．０．ＣＯ；２）。
使用することができる他の可能な遺伝子／変異が他の自然抵抗性雑草で見出されている（Ｇａｉｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄ Ｈｅａｐ，Ｉ．Ｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｗｅｅｄｓ ｔｏ ＥＰＳＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｏｎｌｉｎｅ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｅｄｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ．１２／１／２０２０；Ｔａｋａｎｏ，Ｈｕｄｓｏｎ Ｋａｇｕｅｙａｍａ，Ｏｖｅｊｅｒｏ，Ｒａｍｉｒｏ Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｌｏｐｅｚ，Ｂｅｌｃｈｉｏｒ，Ｇｕｓｔａｖｏ Ｇｒｏｓｓ，Ｍａｙｍｏｎｅ，Ｇｉｚｅｌｌａ Ｐｏｔｒｉｃｈ Ｌｅａｌ，＆ Ｄａｙａｎ，Ｆｒａｎｃｋ Ｅ．．（２０２１）．ＡＣＣａｓｅ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｅｗａｒｄｓｈｉｐ．Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｏｌａ，７８（１），ｅ２０１９０１０２．Ｅｐｕｂ Ｍａｒｃｈ １３，２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５９０／１６７８－９９２ｘ－２０１９－０１０２）：
－ｐｓｂＡのグリシン２６４がセリンに変異（Ｇ２６４Ｓ）した結果、トリアジン抵抗性を付与する改変型Ｄ１タンパク質が得られる
－ｐｓｂＡのイソロイシン２１９がバリンに変異（Ｉ２１９Ｖ）した結果、トリアジン抵抗性を付与する改変型Ｄ１タンパク質が得られる
－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）のトリプトファン１０２の変異は、ＥＰＳＰ合成酵素阻害剤に対する抵抗性を付与する
－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）のアラニン１０３の変異は、ＥＰＳＰ合成酵素阻害剤に対する抵抗性を付与する
－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）のプロリン１０６の変異は、ＥＰＳＰ合成酵素阻害剤に対する抵抗性を付与する
シスジェニックコンストラクト設計の検討事項
サイレンシング－挿入コンストラクトがシスジェニックであるとみなされるためには、通常のセンス配向のネイティブのプロモーター及びターミネーターが含まれていなければならない。ネイティブ配列中に存在する場合は、ｎｃＲＮＡ配列における任意のイントロンを含めなければならない（Ｔｅｌｅｍ ＲＳ，Ｗａｎｉ ＳＨ，Ｓｉｎｇｈ ＮＢ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｓｇｅｎｉｃｓ－ａ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３；１４（７）：４６８－４７６．ｄｏｉ：１０．２１７４／１３８９２０２９１１３１４６６６００１３）。挿入物を構築するための可能な方法を図６に示す。図７は、上記実施例２のシロイヌナズナｍｉＲ１７３に基づくサイレンシング挿入物の可能な設計を示し、これをＡＬＳ１のＰ１７９Ｓ変異型と組み合わせて、除草剤を用いた選抜に好適なＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎコンストラクトを作製した。
変異型ＡＬＳ発現カセットのプロモーター、ターミネーター、及び遺伝子領域の推定
プロモーター：ＴＳＳＰツール（ＰｌａｎｔＰｒｏｍ ＤＢ及びＰｐｄｂデータベースに基づく）によって、ＡＬＳオープンリーディングフレームの１２０ｎｔ上流にプロモーター及びＴＡＴＡボックスが存在すると予測された。これら予測及びシロイヌナズナの平均プロモーター長（５００ｂｐ）を考慮して、予測された転写開始点に隣接する５００ｂｐをプロモーター領域として選択した。
ターミネーター：ターミネーターの長さの推定にはＰｌａｎｔＡＰＡｄｂデータベースを使用した。このデータベースは、３’－ｓｅｑで得られた大量のデータから作成された。終止コドンの３７１ｂｐ下流にポリ（Ａ）部位が存在すると予測された。これを考慮して、ターミネーターとして作用するように終止コドンの直下流５００ｂｐを選択した。ｍｉＲ１７３のプロモーター、ターミネーター、及び遺伝子領域は、実施例２に記載の通り見出された。
遺伝子（アセト乳酸合成酵素スモールサブユニット１、葉緑体）
ＡＬＳ１の配列にはすでにアノテーションが付けられており、オンラインデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＦＦＦ４及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｓｅｒｖｌｅｔｓ／ＴａｉｒＯｂｊｅｃｔ？ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＝ｌｏｃｕｓ：２１１４５２５）から入手可能である。オープンリーディングフレームは２０１３ｎｔ（６７０アミノ酸）からなり、そのうち２９１ｎｔ（９７アミノ酸）には推定葉緑体トランジットペプチド（ｃＴＰ）とアノテーションが付けられている。成熟ＡＬＳタンパク質は、長さ１７１９ｎｔ（５７３アミノ酸）と掲載されている。ＣｈｌｏｒｏＰ １．１ Ｓｅｒｖｅｒ（タンパク質配列におけるｃＴＰの存在及び潜在的なｃＴＰ切断点の位置を予測する）では、１５７ｎｔのｃＴＰが、アノテーションの付いている２９１ｎｔと一部重なっていると予測される。変異の表記については、トランジットペプチドを含む前駆体ＡＬＳタンパク質の先頭からアミノ酸に付番される。除草剤抵抗性ＡＬＳバージョンは、コドンＣＣＴがＴＣＴに変異した単一点変異Ｐ１９７Ｓを含む。
シスジェニック選択によるサイレンシング挿入物コンストラクトの合成
選択用の変異型Ｐ１７９Ｓ ＡＬＳカセットを含むサイレンシング挿入物コンストラクトは、化学合成によって作製し、高忠実度ＰＣＲによって増幅させることができる。あるいは、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット及び変異型Ｐ１７９Ｓ ＡＬＳカセットは、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて関連するＧＥｉＧＳ（商標）改変及び単一点ＡＬＳ変異を導入するために、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いる重複ＰＣＲ反応によって作製することもできる。実施例２に記載した通り、いずれもプラスミドを使わない方法を構成する。
制限ストラテジ
選択カセットを含むＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘｃａｔａｔｃａａｇｃｔａｇａｔｔｔｔｇａａｔｔａｃｃｃｔａｔｔｔｃａｔｃｇｔ－３’（配列番号２３）
プライマーＲｅｖ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号１６）
（式中、
－ｎ：任意のヌクレオチド
－ｘｘｘｘｘｘ：高忠実度酵素のための固有の制限部位。制限部位は、ＧＥｉＧＳ（商標）挿入カセット中にそのような部位が存在しないように、固有でなければならない）。
化学修飾ストラテジ
選択カセットを含むＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｃ＊ａｔａｔｃａａｇｃｔａｇａｔｔｔｔｇａａｔｔａｃｃｃｔａｔｔｔｃａｔｃｇｔ－３’（配列番号２４）
プライマーＲｅｖ：５’－ａ＊ａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号２０）
（式中、
ホスホロチオエート結合が＊によって表される）。
実施例４－サイレンシング挿入物を細胞に導入する方法
設計を終えたら、サイレンシング挿入物カセットを細胞に導入するには複数の方法がある。一般的な方法は、遺伝子銃、アグロバクテリウム媒介形質転換、及びプロトプラストトランスフェクションである。選択される方法は、宿主の種及び規制環境によって異なる。遺伝子銃の利点は、最小限の遺伝子カセット（Ｔ－ＤＮＡボーダーがない）で形質転換が可能であること、及び好適な宿主種がより広範囲であることである。プラスミド骨格配列の挿入を避けるために、ＰＣＲによる線状ＤＮＡの大規模（μｇ－ｍｇ）プラスミドフリー生成を使用することができる。
サイレンシング挿入物コンストラクトのクローニング
サイレンシング挿入物カセット（ネイティブｎｃＲＮＡプロモーター：：改変型ｎｃＲＮＡ転写物：ネイティブｎｃＲＮＡターミネーター）は、クロルスルフロン選択に対する抵抗性を提供するネイティブ（プロモーター及びターミネーターを含む）ＡＬＳ遺伝子カセットの変異型と共に、商業的遺伝子合成によって生成される。転写単位は、ゲノム配列に従って同じ方向であってもよく、分岐していてもよい。プラスミドを含む形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を選抜できるようにするために、コンストラクトは、抗生物質抵抗性を有するプラスミド骨格において提供される。次いで、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎプラスミドを複製し、市販のプラスミド分離キットを用いて精製することができる。以下は、植物細胞にそのようなサイレンシング挿入物を導入する２つの例であり、一方はシロイヌナズナにおいてアグロバクテリウムを用いる例、他方はトマトにおいて遺伝子銃を用いる例である。
シロイヌナズナのアグロバクテリウム媒介形質転換
形質転換されるコンストラクトは、コードされているｍｉＲＮＡの特異性がＰＤＳ３遺伝子に対するものに変化している、シロイヌナズナにおけるｍｉＲ１７３配列に基づくサイレンシング挿入物を含む。形質転換には、開花しているシロイヌナズナ植物及び挿入物プラスミドで形質転換されたアグロバクテリウムが必要である。この形質変換は、本質的には、以下に記載の通り行うことができる：Ｃｌｏｕｇｈ ＳＪ＆Ｂｅｎｔ，ＡＦ（１９９８）Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ：ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １６：７３５－４３。形質転換したシロイヌナズナの種子を、選択剤として１００ｎＭのクロルスルフロンを含む培地で発芽させる。これにより、変異型ＡＬＳ遺伝子を欠く（ひいては、サイレンシング挿入物を欠く）苗の成長が妨げられる。次いで、生育が良好な植物の遺伝子型を同定し、種子生産のために土壌に移植してもよい。
発芽後、形質転換された苗の遺伝子型を同定して、サイレンシング挿入物の存在を確認する。ピンセットで苗から組織を採取し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｉｒｅ希釈バッファ中に保存する。発芽した苗の葉組織を含む希釈バッファを用いて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｉｒｅポリメラーゼを用いたＰＣＲを行う。以下のプライマーを用いてサイレンシング挿入物の存在を確認する：
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｆ１
５’－ａｃａａａｃｔａｃｃｔｇｃａａｇｔｇｇｔｃａ－３’（配列番号２５）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｒ１
５’－ｃａａｇｃｔｃｔｔｔａｔｃｃａｃａｃｔ－３’（配列番号２６）
ジェノタイピングＰＣＲの結果が陽性（８６ｂｐのバンドが生じる）の苗を土壌に移植し、種子を生産するために生育する。シロイヌナズナゲノムにおけるＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎの位置を同定するために、ゲノムＤＮＡに対してＩｌｌｕｍｉｎａ全ゲノムシークエンシングを行う。改良ＣＴＡＢ法を用いてゲノムＤＮＡを抽出する（Ｉｎｇｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡプレップキットを用いてペアエンドショートリードシーケンシング用のライブラリーを調製し、Ｎｅｘｔｓｅｑ ５５０（ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２０６０８５）等のＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーを用いてライブラリーをシーケンシングする。
挿入部位を同定するために、ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，２０１２）を用いてライブラリーをシロイヌナズナゲノム及びサイレンシング挿入物コンストラクトにアラインした。不一致リードペア（１つはシロイヌナズナゲノムに、もう１つはＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎコンストラクトにアラインするリード）を抽出し、プライマーの設計に使用する。次いで、これらプライマーを用いて、元のサンプルのゲノムＤＮＡから増幅させ、挿入部位の正確な位置を特定するためにシーケンシングする（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，３５７－３５９（２０１２）；Ｉｎｇｌｉｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｍａｒｉｌｉａ ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ，Ｒ．Ｐ．，Ｒｅｓｅｎｄｅ，Ｌ．Ｖ．，＆ Ｇｒａｔｔａｐａｇｌｉａ，Ｄ．（２０１８）．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１３（１０），１－１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２０６０８５；Ｌａｍｂｉｒｔｈ，Ｋ．Ｃ．，Ｗｈａｌｅｙ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｂｏｓｔ，Ｋ．Ｌ．，＆ Ｐｉｌｌｅｒ，Ｋ．Ｊ．（２０１５）．ＣＯＮＴＲＡＩＬＳ：Ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｌｏｗ－ｃｏｖｅｒａｇｅ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ，６，１７５－１８１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｇｄａｔａ．２０１５．０９．００１）。
トマトの遺伝子銃媒介形質転換
遺伝子銃により、例えば別の種由来の異種ＤＮＡを含まない非トランスジェニックＤＮＡで細胞を形質転換することが可能になる。形質転換されるコンストラクトは、コードされているｍｉＲＮＡの特異性が線形動物ジャガイモシストセンチュウのリボソームタンパク質３ａ遺伝子に対するものに変化している、トマトにおけるｍｉＲＮＡ遺伝子ｓｌｙ－ＭＩＲ１６４ｂ（ＧＲＯＳ＿ｇ０４６２）に基づくサイレンシング挿入物を含む。ＴＳＳＰツール（ＰｌａｎｔＰｒｏｍ ＤＢ及びＰｐｄｂデータベースに基づく）によって、ｍｉＲ１６４ ｎｃＲＮＡ転写物配列の約１２０ｎｔ上流に転写開始点と共にプロモーター及びＴＡＴＡボックスが存在すると予測された。これを考慮して、ｍｉＲ１６４ ｎｃＲＮＡの直上流５００ｂｐを、サイレンシング挿入に含めるプロモーター領域として選択した。ターミネーター領域については、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の平均３’ＵＴＲ長（２５７ｂｐ）を考慮して、サイレンシング挿入物においてターミネーターとして作用するように、ｍｉＲ１６４ｂ ｎｃＲＮＡ転写物配列の直下流５００ｂｐを選択した。
以下のプライマーを用いて、サイレンシング挿入物プラスミドから、サイレンシング挿入物のみを含む線状ＤＮＡ（ＡＬＳ選択カセットを含む）を増幅させる：
＞ＴｏｍＧＥｉＧＳ（商標）＿ｌｉｎｅａｒ＿Ｆ１
５’－Ａ＊ＡＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴ－３’（配列番号２７）
＞ＴｏｍＧＥｉＧＳ（商標）＿ｌｉｎｅａｒ＿Ｒ１
５’－Ａ＊ＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＡＴＧＣＣ－３’（配列番号２８）
いずれのプライマーも５’－ホスホロチオエート残基を含む（アスタリスクで示す）。製造業者の指示書に従って、ＮＥＢ ＬｏｎｇＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅させる。線状ＤＮＡの予測される長さ及び特異的な生成は、ＰＣＲ反応物の少量のサンプルのゲル電気泳動を用いて目視で確認しなければならない。次いで、残りのＰＣＲ反応物（複数可）から市販のシリカカラムキットを用いて線状ＤＮＡを精製することができる。
次に、線状サイレンシング挿入物ＤＮＡで金ナノ粒子をコーティングし、これを打ち込みに使用する。打ち込み用のトマトの外植片を調製するために、滅菌したトマト種子を４℃で４８時間春化し、２５℃、１６：８時間の明暗サイクルを用いて滅菌培地上で発芽させる。８～１０日後、子葉を無菌条件下で約０．５ｃｍ角に切断し、背軸側を上にして密に並べる。次いで、本質的に以下に記載の通り、これら外植片を打ち込みに使用することができる：Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙ，Ｊ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｌ．，Ｐａｌｍａｔｅｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｆｌａｉｓｈｍａｎ，Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｙ．，Ｅｌａｄ，Ｙ．，Ｐｅｒｌ，Ａ．（２０１１）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏｗａｒｄ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ ｂａｎａｎａ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．ＡＡＡ ｇｒｏｕｐ）ｃｖ．Ｇｒａｎｄ Ｎａｉｎ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１），６１－７２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１２４８－０１０－９３９２－７。
形質転換されたトマト小植物を選抜するために、打ち込みの２週間後に、４０μｇ／Ｌのクロルスルフロンを含む培地に外植片を移植する。更に２週間後、組織培養プレートにおける新鮮培地＋４０μｇ／Ｌクロルスルフロンに外植片を移植する。その後、４週間ごとに、Ｐｈｙｔａｔｒａｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）における培地＋４０μｇ／Ｌクロルスルフロンに外植片を移し替えた。***組織を含む健康な小植物を採取する。挿入を確認するために、ピンセットで小植物の組織を採取し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｉｒｅ希釈バッファ中に保存する。この希釈バッファを用いて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｉｒｅポリメラーゼを用いたＰＣＲを行う。以下のプライマーを用いて挿入物の存在を確認する：
＞Ｓｌ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｆ１
５’－ＧＧＴＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡ－３’（配列番号２９）
＞Ｓｌ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｒ１
５’－ＧＡＡＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣ－３’（配列番号３０）
ジェノタイピングＰＣＲの結果が陽性（１０３ｂｐのバンドが生じる）の小植物を温室条件に順化させ、土壌に移植し、種子を生産するために生育する。トマトゲノムにおける挿入物の位置を同定するために、上記の通りＩｌｌｕｍｉｎａ全ゲノムシークエンシングを行う。
実施例５－インプランタにおけるゲノムに組み込まれたサイレンシング挿入物の確認
ゲノムに組み込まれたサイレンシング挿入物のインプランタにおける効果を確認するために、本実施例では、（１）実施例２のサイレンシング挿入物のゲノム組み込み；及び（２）サイレンシング挿入物から発現したサイレンシングＲＮＡが標的とする遺伝子の発現レベルの低下について試験する。
これを説明するために、実施例２と同様に、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子（ＰＤＳ３）を標的とするように改変したネイティブｍｉＲ１７３遺伝子カセットを含む挿入物コンストラクトでシロイヌナズナを形質転換する。ＰＤＳ３は、カロテノイド生合成に重要な酵素であり、カロテノイドは、葉緑体膜の安定化及びクロロフィルの蓄積に必要である［Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（２００７）１７：４７１］。ＰＤＳ３は、遺伝子サイレンシングについての確立された視覚的レポーターである：ＰＤＳ機能が喪失すると、アルビノの表現型が生じる［Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１５）５：１２２１７］。従って、挿入物コンストラクトによるＰＤＳ３転写物のダウンレギュレーションは、白化表現型によって示される。挿入物の改変バージョンではなく野生型ｍｉＲ１７３を含むか又は（例えば、ＧＦＰを標的とする）シロイヌナズナにおける特異的標的を有しない改変型ｍｉＲ１７３バージョンを含むことを除いて、同一のコントロールプラスミドを使用する。本質的に実施例４に記載の通りアグロバクテリウムを用いてプラスミドを形質転換する（アグロバクテリウム形質転換の前に、挿入物をバイナリーベクターの左端と右端との間に挿入しなければならず、これは当技術分野で公知の任意の方法を用いてクローニングすることができる）。
形質転換されたシロイヌナズナの種子を、選択剤として１００ｎＭのクロルスルフロンを含む培地で発芽させる。これにより、変異型ＡＬＳ遺伝子を欠く（ひいては、挿入物を欠く）苗の成長が妨げられる。次いで、生育が良好な植物の遺伝子型を同定し、種子生産のために土壌に移植してもよい。苗の遺伝子型を同定するために、ピンセットで組織を採取し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｉｒｅ希釈バッファ中に保存する。発芽した苗の葉組織を含む希釈バッファを用いて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｉｒｅポリメラーゼを用いたＰＣＲを行う。以下のプライマーを用いて、実験プラスミドの存在を確認する：
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｆ２
５’－ＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡ－３’（配列番号３１）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｒ２
５’－ＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＣＴ－３’（配列番号３２）
挿入物を含む植物では、上記のプライマー対によって８０ｂｐのバンドが生じる。
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｄｕｍｍｙ＿ｇｅｎｏ＿Ｆ１
５’－ＧＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＡ－３’（配列番号３３）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｄｕｍｍｙ＿ｇｅｎｏ＿Ｒ１
５’－ＴＧＧＴＴＡＣＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＴＧＧＧＧＡ－３’（配列番号３４）
「ダミー」（コントロール）プラスミド及び試験される挿入物プラスミドを含む植物では、上記のプライマー対によって３１２ｂｐのバンドが生じる。ジェノタイピングＰＣＲの結果が陽性の苗を土壌に移植し、種子を生産するために生育させる。
シロイヌナズナゲノムにおける挿入物の位置を同定するために、コンストラクトのゲノム隣接領域をシーケンシングすることによって組み込み部位を同定する。これは、既知のＤＮＡ配列と未知のＤＮＡ配列との間を増幅させる熱非対称インターレース（ＴＡＩＬ）ＰＣＲを用いて達成される。ＴＡＩＬ ＰＣＲでは、比較的低いＴｍ（例えば４５℃）を有する任意の縮重（ＡＤ）プライマー及び既知の配列内の高いＴｍ（例えば６７℃）を有するネステッド特異的プライマーを使用して数回ＰＣＲを行う（表１）。最初のＰＣＲ反応では、ＡＤプライマー及び最も外側の特異的プライマーと、それぞれ特異的増幅又は非特異的増幅に好ましい高Ｔｍ及び低ＴｍのインターリーブＰＣＲサイクルとを使用する。ネステッド特異的プライマー（ＡＤプライマーも含む）を用いた２回の後続ＰＣＲ反応によって、所望の産物（コンストラクトと隣接領域との間の産物）を濃縮することができる。ＰＣＲの開始時における特異的プライマー並びにＡＤプライマー及び特異的プライマーにおける相補的な領域を用いる複数ラウンドの線形増幅によって特異的増幅の効率を高めることができる（これにより、相補的な末端が相互作用してヘアピン構造を形成するため、増幅が短い産物から離れる方向に偏る）（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２００７）。必要なプライマーを以下に示す：
＞ＡＣ１
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧ－３’（配列番号３５）
＞ＬＡＤ１－１
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ａ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ａ）ＮＮＮＧＧＡＡ－３’（配列番号３６）
＞ＬＡＤ１－２
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＮＮＮＧＧＴＴ－３’（配列番号３７）
＞ＬＡＤ１－３
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｇ／Ｃ／Ａ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ａ）ＮＮＮＣＣＡＡ－３’（配列番号３８）
＞ＬＡＤ１－４
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＮＮＮＣＧＧＴ－３’（配列番号３９）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ＴＡＩＬ＿Ｆ１
５’－ＴＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴ－３’（配列番号４０）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ＴＡＩＬ＿Ｆ２
５’－ＧＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＡＧ－３’（配列番号４１）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ＴＡＩＬ＿Ｆ３
５’－ＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣ－３’（配列番号４２）
挿入部位を同定するために、二次ＴＡＩＬ－ＰＣＲからのＰＣＲ産物を市販のキットを用いて平滑末端クローニングし、サンガーシーケンシングする（Ｌｉｕ，Ｙ．Ｇ．，＆Ｃｈｅｎ，Ｙ．（２００７）．Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４３（５），６４９－６５６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１４４／０００１１２６０１）。
サイレンシング挿入物の表現型効果をアッセイするために、挿入物コンストラクトで形質転換したシロイヌナズナ植物をダミーコンストラクトで形質転換した植物と比較した。比較により、サイレンシング挿入物コンストラクトで形質転換された植物だけが白化を示すことが実証される。植物を撮影し、ＩｍａｇｅＪ等のソフトウェアを使用して群間の白化領域の大きさを定量することによって、群間の定量的比較がなされる。ＰＤＳ３の発現レベルを比較するために、両群の植物に対してＲＮＡ－ｓｅｑ又はｑＲＴ－ＰＣＲも実施いた。サイレンシング挿入物コンストラクトで形質転換した植物では、ＰＤＳ３の発現が低下する。
実施例６－ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及び内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列を更に含むコンストラクトの例示的な使用
本発明の好ましい実施形態では、サイレンシング挿入物は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列とを更に含むコンストラクトにおいて、真核細胞に導入される。このようなコンストラクトを用いた形質転換は、後述するように、様々な可能性のあるシナリオを提供することができる。
シナリオ１：コンストラクトが組み込まれ、全ての内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子がＮＨＥＪ編集される
このシナリオでは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及びガイドＲＮＡをコードしている配列を含むトランスジェニックサイレンシング挿入物カセットを、組み込まれたＤＮＡ、好ましくは組み込まれたＴ－ＤＮＡから発現させる。好ましくはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９であるエンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡの発現が、サイレンシング挿入物のベースとなる全ての標的ｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝子編集を駆動し、その結果、インデルが生じる。このシナリオでは、ＨＤＲ事象は存在しない（交換事象は存在しない）。従って、提供されたｓｇＲＮＡが内在性サイレンシング配列遺伝子座を再度標的とすることができないため、該遺伝子座にサイレンシング挿入物を保有する非トランスジェニック植物をこのような植物から作出することはできないが、これら植物を使用して、サイレンシング挿入物活性（Ｔ－ＤＮＡから発現）を研究することはできる。所望の遺伝子座のターゲティングにおいてｓｇＲＮＡは不活性であるので、その後の世代でＨＤＲ事象をスクリーニングし続ける意味はない。注記：編集されたｗｔ遺伝子座（内在性サイレンシング配列）へのサイレンシング挿入物の導入が、将来の世代において相同組換え（ＨＲ）によって実行される可能性もあるが、そのような事象は非常にまれであり、検出が困難である。
シナリオ２：コンストラクトが組み込まれ、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子がＮＨＥＪ編集されない又は部分的に編集される
このシナリオでは、シナリオ１と同様に、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及びガイドＲＮＡをコードしている配列を含むトランスジェニックサイレンシング挿入物カセットを１、組み込まれたＤＮＡ、好ましくは組み込まれたＴ－ＤＮＡから発現させる。しかし、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９であるエンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを発現させても、サイレンシング挿入物のベースとなる標的ｎｃＲＮＡ遺伝子座は全て（すなわち、全く）編集されなかった。従って、遺伝子座のうちの一部はインデルを含まないが、それでも提供されたｓｇＲＮＡの標的となることはできる。このシナリオでは、ＨＤＲ事象は存在しない（交換事象は存在しない）。従って、内在性サイレンシング配列遺伝子座にサイレンシング挿入物を保有する植物を、このような被験植物から作出することはできない。しかし、これら植物を、サイレンシング挿入物の活性（Ｔ－ＤＮＡから発現）を研究するために使用することはできる。内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子のＮＨＥＪ編集が全く又は部分的にしか行われない場合、編集機構が依然として活性を有する次世代でＨＤＲをスクリーニングすることができる。注記：ｗｔ遺伝子座（内在性サイレンシング配列）へのサイレンシング挿入物の導入が、将来の世代において相同組換えによって実行される可能性もあるが、そのような事象は非常にまれであり、検出が困難である。
シナリオ３：コンストラクトが組み込まれ、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子がＨＤＲ編集される
このシナリオでは、シナリオ１及び２と同様に、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及びガイドＲＮＡをコードしている配列を含むトランスジェニックサイレンシング挿入物カセットを、組み込まれたＤＮＡ、好ましくは組み込まれたＴ－ＤＮＡから発現させる。更に、ＤＯＮＯＲテンプレートとしてサイレンシング挿入物の配列が存在すると共に、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９であるエンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを発現させると、サイレンシング挿入物のベースとなるｎｃＲＮＡ遺伝子座の全て（又は一部）でＨＤＲが生じる。従って、Ｔ－ＤＮＡ（元々サイレンシング挿入物が挿入されていた）及び交換されたｎｃＲＮＡ対立遺伝子（非トランスジェニック）からサイレンシングＲＮＡ転写物が発現する。このような被験植物から、内在性サイレンシング配列遺伝子座にのみサイレンシング挿入物を保有する植物（非トランスジェニックである）を作出することはできないが、これら植物を、サイレンシング挿入物の活性（Ｔ－ＤＮＡから発現）を研究するために使用することができる。次世代において、トランスジェニックＴ－ＤＮＡカセット（及び元々挿入されていたサイレンシング挿入物）を交配して除去することができ、その結果、内在性サイレンシング配列遺伝子座からサイレンシング挿入物を発現する非トランスジェニック植物が得られる。注記：ｗｔ遺伝子座（内在性サイレンシング配列）へのサイレンシング挿入物の導入が相同組換えによって実行される可能性もあるが、そのような事象は非常にまれであり、検出が困難である。
シナリオ４：コンストラクトは組み込まれず、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子の全て又は一部がＮＨＥＪ編集される
このシナリオでは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及びガイドＲＮＡをコードしている配列を含むサイレンシング挿入物は組み込まれないので、サイレンシング挿入物カセットは発現しない。好ましくはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９であるエンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡの一過性発現が、サイレンシング挿入物のベースとなるｎｃＲＮＡ遺伝子座の全て又は一部の遺伝子編集を駆動し、その結果、インデルが生じる。遺伝子編集機構及びＤＯＮＯＲテンプレートが欠失しているため、次世代で事象のスクリーニングを続ける意味はない。しかし、これは遺伝子編集機構の活性及び効率についての確実な証拠である。
シナリオ５：コンストラクトは組み込まれず（一過性発現）、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子のＮＨＥＪは観察されない
このシナリオでは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及びガイドＲＮＡをコードしている配列を含むサイレンシング挿入物は組み込まれないので、サイレンシング挿入物カセットは発現しない。更に、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９であるエンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを一過性に発現させても、サイレンシング挿入のベースとなるｎｃＲＮＡ遺伝子座のいずれも遺伝子編集されなかった。従って、サイレンシングＲＮＡ転写物は存在せず、これら植物を更に試験する意味はない。これは、実験デザインを改善する必要があることを示唆している可能性がある（例えば、異なるｓｇＲＮＡ、異なるヌクレアーゼ等）。
シナリオ６：コンストラクトは組み込まれず（一過性発現）、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子がＨＤＲ編集される
このシナリオでは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及びガイドＲＮＡをコードしている配列を含むサイレンシング挿入物は組み込まれないので、サイレンシング挿入物カセットは発現しない。しかし、シナリオ３と同様に、ＤＯＮＯＲテンプレートとしてサイレンシング挿入物の配列が存在すると共に、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９であるエンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを一過的に発現させると、サイレンシング挿入物のベースとなるｎｃＲＮＡ遺伝子座の全て（又は一部）でＨＤＲが生じる。従って、サイレンシングＲＮＡ転写物は、交換されたｎｃＲＮＡ対立遺伝子からのみ発現する。サイレンシング挿入物を発現する非トランスジェニック植物が、このような試験植物から作出される。注記：ｗｔ遺伝子座へのサイレンシング挿入物の導入が、相同組換えによって実行される可能性もあるが、そのような事象は非常にまれであり、検出が困難である。
シナリオ７：ＧＥｉＧＳ挿入物カセットの全部又は一部のみを含むコンストラクトが部分的に組み込まれる
このシナリオでは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及びガイドＲＮＡをコードしている配列を含むサイレンシング挿入物は、全体として組み込まれるのではなく、サイレンシング挿入物カセットの一部のみ又は完全なサイレンシング挿入物カセットとして組み込まれる。従って、サイレンシング挿入物は、ランダム組み込みの位置から表現することができる。ランダムな遺伝子座にサイレンシング挿入物を保有する植物が、このような被験トランスジェニック植物から作出される。将来の世代では、相同組換えによってｗｔ遺伝子座にサイレンシング挿入物が導入される可能性があるが、これはまれであり、その結果、内在性サイレンシング挿入物からサイレンシング挿入物を発現する非トランスジェニック植物が生じる。
シナリオは、異なる遺伝子座における活性を通して、複数の挿入物を通して、又はヘテロ接合的に組み合わせることができる。例えば、以下の通りである：
シナリオ８：コンストラクトが組み込まれ、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子が部分的にＮＨＥＪ編集され、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子がＨＤＲ編集される；
これは、ある遺伝子座における標的遺伝子のインデルを生じさせるシナリオ２（部分的ＮＨＥＪ）と、別の遺伝子座におけるＨＤＲを生じさせるシナリオ３との組み合わせによって生じ得る。この結果、好ましくはＴ－ＤＮＡ断片である、組み込まれたＤＮＡに元々挿入されていたサイレンシング挿入物及び交換されたｎｃＲＮＡ対立遺伝子（内在性サイレンシング配列）からサイレンシングＲＮＡが発現するようになる。シナリオ３に記載の通り、次世代では、トランスジェニックＴ－ＤＮＡカセット（及び元々挿入されていたサイレンシング挿入物）を交配して除去することができ、その結果、内在性サイレンシング配列遺伝子座からサイレンシング挿入物を発現する非トランスジェニック植物が得られる。注記：ｗｔ遺伝子座へのサイレンシング挿入物の導入が、相同組換えによって実行される可能性もあるが、これは非常にまれである。
シナリオ９：コンストラクトは組み込まれず、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子が部分的にＮＨＥＪ編集され、内在性ｎｃＲＮＡ対立遺伝子がＨＤＲ編集される
これは、ある遺伝子座における標的遺伝子の一部のインデルを生じさせるシナリオ４（部分的ＮＨＥＪ）と、別の遺伝子座におけるＨＤＲを生じさせるシナリオ６との組み合わせによって生じ得る。この結果、交換されたｎｃＲＮＡ対立遺伝子からサイレンシング挿入物が発現するようになる。従って、交換されたｎｃＲＮＡ対立遺伝子からのみサイレンシングＲＮＡ転写物が発現する。このような被験植物から非トランスジェニック植物が作出される。注記：ｗｔ（内在性サイレンシング配列）遺伝子座へのサイレンシング挿入物の導入が、相同組換えによって実行される可能性もあるが、そのような事象は非常にまれであり、検出が困難である。
実施例７．ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを保有するシロイヌナズナ植物の作出
ＲＮＡサイレンシングは、長鎖ｄｓＲＮＡ前駆体のプロセシングによって生じる二次低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の生成によって増幅され得る。２２ｎｔ長のｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲ）及びダイサー様（ＤＣＬ）依存的に二次ｓｉＲＮＡの生成を惹起することが示されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；ＭｃＨａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＤＣＬ及びＡＧＯ２等のＲＮＡサイレンシング関連遺伝子における変異は、ウイルスに対する宿主の感受性と関連しており、このことは、ＲＮＡサイレンシングがウイルス感染に対する有効な防御機構であることを示唆している（Ｊａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。本発明者らは、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）ゲノムを標的とするＧＥｉＧＳ（商標）－ｍｉＲＮＡを発現するように改変された２２ｎｔのｍｉＲＮＡスカフォールドを挿入することにより、シロイヌナズナにおいてＴｕＭＶ感染に対する抵抗性が誘導されるという仮説を立てた。
本実施例では、（ｉ）選択カセット、（ｉｉ）遺伝子編集カセット、及び（ｉｉｉ）２２ｎｔ ｍｉＲＮＡ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを含むＴ－ＤＮＡを保有しているシロイヌナズナ系統を作出するプロセスについて説明する。ＨＤＲを介したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが媒介する遺伝子編集のためのドナーテンプレートとして又は発現カセットとして、挿入カセットを使用することができる。この実施例で用いるＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットの長さは１．２ｋｂであり、ｍｉＲＮＡのサイレンシング特異性をリダイレクトするのに必要な改変領域に加えてこの部位の上流及び下流約５００ｂｐにまたがっている（図９）。
ＴｕＭＶ特異的２２ｎｔ ｍｉＲＮＡ ＧＥｉＧＳ（商標）挿入カセットの発現の多面的効果を制御するために、各改変されたスカフォールドごとに「ダミー」コントロールを設計した。「ダミー」コンストラクトでは、ＧＥｉＧＳ（商標）－ｍｉＲＮＡガイド及びパッセンジャー配列が、同一のＲＮＡ二次構造を維持してはいるがＴｕＭＶ又はシロイヌナズナトランスクリプトームと相補的ではないランダムなヌクレオチド配列に置き換えられている。
実施例１に記載の通りバイオインフォマティック解析を用いて、ネイティブの２２ｎｔスカフォールドのプロモーター及びターミネーターを予測し、ＧＥｉＧＳ（商標）－ＩｎｓｅｒｔｉｏｎカセットがＧＥｉＧＳ（商標）－ｍｉＲＮＡの転写を駆動するために必要な配列を含むことを確認した。表３は、この実施例で使用したＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットによって発現されると予想される成熟ｍｉＲＮＡの詳細である（完全な配列は付録に見出すことができる）：
コンストラクトのクローニング
Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを用いて遺伝子編集用のバイナリープラスミドを組み立て、次いで、ＰａｃＩ／ＡｓｃＩによる制限消化及びライゲーションを介してＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを導入した。最終プラスミドをサンガーシーケンシングによって検証した。
アグロバクテリウムの調製
エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０、ｐＳｏｕｐ）をプラスミドで形質転換し、カナマイシン抵抗性コロニーを、コロニーＰＣＲ、サンガーシーケンシング、及び鑑別消化（differential digestion）によって検証した後、グリセロールストックとして保存した。グリセロールストックを、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン５０ｍｇ／Ｌ、及びテトラサイクリン５ｍｇ／Ｌを補給した固形ＬＢ培地に画線し、プレートを２８℃で２日間インキュベートした。コロニー１０個を、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン５０ｍｇ／Ｌ、及びテトラサイクリン５ｍｇ／Ｌを補給したＬＢ１０ｍＬに接種し、２８℃、２００ｒｐｍで一晩培養物をインキュベートした。翌日、培養液１０ｍＬを用いて、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン５０ｍｇ／Ｌ、及びテトラサイクリン５ｍｇ／Ｌを補給したＬＢ培地１Ｌに接種した。培養物を２８℃、２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００を用いて細菌のＯＤ６００ｎｍを測定し、２０μＭアセトシリンゴンを補給した５％スクロース中で１．０に対して正規化した。培養物を室温、暗所で３時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。
花浸漬によるシロイヌナズナの形質転換
シロイヌナズナ生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａ－０（Ｃｏｌ－０）の植物を播種し、短日条件（８時間明期及び１６時間暗期）で６週間生育させた。開花を誘導するために、植物を１０日間長日条件（１６時間明期及び８時間暗期）に移した。浸漬の直前に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞懸濁液に０．０５％ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７を補給し、よく混合した。植物の花序を細胞懸濁液に浸漬し、１分間真空に供した。真空を直ちに解除し、植物を２４時間の回復のため水分を保持するために袋の中で水平に保管した。植物を更に６週間長日条件（１６時間明期及び８時間暗期）で維持した。植物が開花し、最初の長角果が乾燥し始めたら、植物を袋に入れ、Ｔ１種子を収穫した。
Ｔ１植物の選抜
２０ｍＬの非滅菌二酸化ケイ素（Ｓｉｇｍａ ８４８８０）及び１０ｍＬの１／４ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地（１．１ｇ／Ｌ ＭＳ、ビタミンを含む－Ｄｕｃｈｅｆａ Ｍ０２２２、ｐＨ５．８）にハイグロマイシンＢ４０ｍｇ／Ｌを補給したもの又は補給していないものをペトリ皿上で混合することによって選抜プレートを調製した。余分な液体をティッシュペーパー片で吸い取った。シロイヌナズナの種子を塩素ガスに２時間曝露することによって表面殺菌した。種子を湿潤培地に低密度で散布し、プレートをマイクロポアテープで密封し、４℃、暗所で２～３日間インキュベートした。層形成後、プレートを長日条件下において２２℃で維持した。３日後、ハイグロマイシンＢ ４０ｍｇ／Ｌを補給した又は補給していない１／４ＭＳ培地で、表面が湿って見えるようになるまでプレートに給水した。この時点から、３～４日ごとにハイグロマイシンＢを含まない１／４ＭＳ培地でプレートに給水した。発芽及び選抜効率を確認するためにコントロールとしてＣｏｌ－０種子を用いた。層形成の１５日後には、抵抗性植物が容易に目視できた（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）
Ｔ１植物のジェノタイピング
選抜下で２週間後、植物１体ごとに小さな葉を採取し、２０μＬの希釈バッファ（Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に保存した。以下のプライマー及び条件（表４～５）を用いて、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを含むＴ－ＤＮＡ領域を増幅するために、製造業者の指示書に従ってＰＣＲ反応を行った：
＞Ｇ１１７７：５’－ＴＣＡＣＡＴＧＴＧＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡ－３’（配列番号５０）
＞Ｇ１１７８：５’－ＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡ－３’（配列番号５１）
ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、製造者の指示書に従ってＰＣＲ産物をクリーンアップし、選択した植物内のＴ－ＤＮＡ挿入物の同一性を確認するためにサンガーシーケンシングに送った。
Ｔ２種子の収穫
遺伝子型の同定に成功した植物を土壌に移植し、開花を誘導するために長日条件（１６時間明期及び８時間暗期）で維持した。最初の長角果が乾燥し始めたら、植物を袋に入れ、Ｔ２種子を収穫した。
実施例８．ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを保有する植物はＧＥｉＧＳ（商標）－ｍｉＲＮＡの発現を示す。
この実施例は、ＧＥｉＧＳ（商標）－ＩｎｓｅｒｔｉｏｎカセットがＧＥｉＧＳ（商標）－ｍｉＲＮＡの発現を駆動できることを実証する。
シロイヌナズナの培養
Ｔ２シロイヌナズナ植物を発芽させ、ハイグロマイシンで選抜し、実施例７に記載の通り遺伝子型を同定した。更に、ＧＥｉＧＳ（商標）ｍｉＲＮＡを発現させる可能性のあるＨＤＲ媒介編集がネイティブなスカフォールドには存在しないことを保証するために植物の遺伝子型を同定した（図１０）。意図するＨＤＲ編集に特異的なフォワードプライマーと、ＨＤＲドナー／ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット外部にあるリバースプライマー、すなわちネイティブなスカフォールドに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。以下のプライマー及び条件（表６～７）を用いて、製造業者の指示書に従って反応を行った：
＞ＴｕＭＶ１０ＨＤＲ特異的Ｆｗｄ：ＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡ（配列番号５２）
＞ｍｉｒ１６２ａ外部Ｒｅｖ：ＴＡＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣＡＧＡＧＡ（配列番号５３）
遺伝子型の確認後、植物を土壌に移植し、２８日間長日条件（１６時間明期及び８時間暗期）で維持した。各植物の葉４枚を収穫し、液体窒素で瞬間冷凍した。サンプルをＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。
ＲＮＡの抽出
サンプルを、組織溶解器（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ，Ｑｉａｇｅｎ、２４Ｈｚ、３０秒）内で５ｍｍステンレス鋼製ビーズを用いて２回粉砕し、溶解バッファ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ Ｓａｒｋｏｓｙｌ、１％β－メルカプトエタノール）に再懸濁させた。サンプルを室温で５分間撹拌しながらインキュベートし、１５，０００ｇで５分間スピンダウンし、回収した上清をクロロホルムと混合した（１：１）。チューブを２分間ボルテックスし、水飽和フェノールを添加し（１：１：１）、続いて２分間ボルテックスした。サンプルを１５，０００ｇで１５分間スピンダウンし、水相を回収し、上記の通り２回目の洗浄工程のために等体積のクロロホルムと混合した。水相を回収し、１１００μＬのイソプロパノール及び９０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）とよく混合した。穏やかに反転させることによってサンプルを混合し、ＲＮＡを沈殿させるために－２０℃で一晩保存した。翌日、サンプルを１５，０００ｇで２０分間スピンダウンし、上清を廃棄した。ＲＮＡペレットを１ｍＬの７５％エタノールで２回洗浄し、続いて、１５，０００ｇで５分間遠心分離した。エタノールを完全に除去し、ペレットを７～１０分間風乾した。サンプルを５０μＬのヌクレアーゼフリー水に再懸濁させた。ＲＮＡペレットが完全に溶解したら、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、サンプルを室温で１５分間撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション後、各サンプルに２００μＬのクロロホルムを添加した。サンプルを２分間ボルテックスし、１５，０００ｇで１５分間スピンダウンした。上清を回収し、等体積の絶対エタノール（１：１）と混合し、６５０μＬをＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のカラムにロードした。サンプルを製造業者の指示書に従って処理し、３５μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出した。バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＲＮＡの完全性を判定し、サンプルを－８０℃で保存した。
ｓＲＮＡシーケンシング（ｓＲＮＡ－ｓｅｑ）
ＮＥＢ Ｎｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）を用い、製造業者のプロトコールに従って、低分子ＲＮＡライブラリー（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）を作製した。サンプルを多重化するために指標を含めた。低分子ＲＮＡは５’末端にリン酸基、３’末端に水酸基を有するので、アダプターを低分子ＲＮＡ断片に直接ライゲーションした。アダプターライゲーション、逆転写、及びＰＣＲ濃縮を介してライブラリーを構築した。１８～４０ｂｐの挿入物のサイズ選択を行った後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００ ＳＰフローセルを用いて５０ｂｐのリード（ＳＥ５０）を生成するためにシングルエンドシーケンシングを行った。
ｓＲＮＡ－ｓｅｑ解析
以下のこれら手順に従って生のシーケンスデータを処理してクリーンデータにした：（１）５０％を超える塩基が５未満の塩基品質スコアを有するリードの排除、（２）１０％を超えるＮを含有するリードの排除、（３）５’プライマーが夾雑しているリードの排除、（４）３’プライマーを有しないリード及び挿入タグを有しないリードの排除、（５）３’プライマー配列のトリミング、（６）ポリＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃを含むリードの排除。低分子ＲＮＡアダプターの配列は以下の通りである：ＲＮＡ５’アダプター（ＲＡ５）：５’－ＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＧＡＣＧＡＴＣ－３’（配列番号５４）及びＲＮＡ３’アダプター（ＲＡ３）：５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴ－３’（配列番号５５）。
まず、パラメータがエンド・ツー・エンドで１００％配列が一致するように設定され、最大１０００のマルチマップが許容されるＳＴＡＲアライメントツールを用いて、クリーンシーケンスデータをＴＡＩＲ１０参照ゲノム配列にマッピングした（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。同じ方法を用いて、全てのクリーンリードをＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ転写物配列にもマッピングした。最後に、同じ方法を用いて、最初のランでマッピングされなかったリードを全てＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ転写物配列にマッピングした。
植物では、ウイルス感染によって、優先的に２１～２２ヌクレオチド長であるウイルス由来のｓｉＲＮＡ（ｖｓｉＲＮＡ）が蓄積する（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットの転写活性に由来するＴｕＭＶ特異的ｍｉＲＮＡの発現を明確に検出するために、感染していないＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ植物においてｓＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。ＴｕＭＶ由来のｓｉＲＮＡを検出するためのコントロールとして、感染した野生型植物についてもシーケンシングを行った。表８に示すように、感染した野生型植物及び感染していないＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ＴｕＭＶ１０植物から抽出したＲＮＡにおいて、ＴｕＭＶ特異的ｓＲＮＡの発現が検出された。予想通り、感染していないＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎダミー植物ではＴｕＭＶ特異的ｓＲＮＡの発現は検出されなかった。このことは、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットは転写的に活性であり、ＴｕＭＶ感染に対する抵抗性を生じさせる可能性があることを示唆している。追加のＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット（ＴｕＭＶ１２）の転写活性も同様に確認された（データは示さない）。
実施例９．ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットを保有するシロイヌナズナ植物は、ＴｕＭＶ感染に対して抵抗性を示す。
ＴｕＭＶ１０及びダミーＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎから転写活性を確認した後、これらカセットをそのゲノム中に保有する植物をＴｕＭＶに曝露した。この実施例は、シロイヌナズナに転写的に活性のあるＴｕＭＶ特異的ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットが存在すると、ＴｕＭＶに対する抵抗性が生じることを実証する。
この実施例で用いたＴｕＭＶの感染性クローンは、そのＴ－ＤＮＡ領域にウイルスゲノムの完全長ｃＤＮＡ形態を含むバイナリープラスミドであり、送達方法としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いた。好適なプロモーター下では、ウイルスゲノムのＤＮＡ形態がウイルスＲＮＡに転写され、感染成立のトリガーとして作用することができる（Ｂｏｙｅｒ＆Ｈａｅｎｎｉ，１９９４）。使用したＴｕＭＶ単離株は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターでタグ付けされているので、シロイヌナズナ植物に紫外線を照射した際に、ウイルスの拡散を迅速に可視化することができた。
ＴｕＭＶ－ＧＦＰコンストラクトのクローニング
ＮＩｂとカプシドタンパク質との間に挿入されたＧＦＰ遺伝子を保有するＴｕＭＶ、単離株ＵＫ１のＣＤＳ（Ｔｏｕｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）をＳｍａＩ／ＡｐａＩ消化によって線状化した。以下のプライマー及び条件（表９～１０）を用いて、ｐＩＣＳＬ４７２３ベクターを増幅させた：
＞１４０１：５’－ＡＴＧＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴＣＧＧＧＣＣＣａａｇｇｇａｃａｃｇａａｇｔｇａｔｃｃｇ－３’（配列番号５６）
＞１４０２：５’－ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧｇｇｃａｃａｇａｇｔｇｔｔｃａａｃｃｃｃ－３’（配列番号５７）
Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を用い、製造業者の指示書に従って、ｐＩＣＳＬ４７２３バイナリーベクターのＴ－ＤＮＡ領域にＴｕＭＶ ＣＤＳをクローニングした。最終プラスミドをサンガーシーケンシングによって確認した。
アグロバクテリウムの調製
プラスミドを、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ－１に形質転換し、カナマイシン抵抗性コロニーを、コロニーＰＣＲ、サンガーシーケンシング、及び鑑別消化によって検証した後、グリセロールストックとして保存した。グリセロールストックを、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ、及びカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを補給した固形ＬＢ培地に画線し、プレートを２８℃で２日間インキュベートした。コロニー１０個を、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ、及びカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを補給したＬＢ５ｍＬに接種し、培養物を２８℃、２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、培養液１５０μＬを用いて、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ、及びカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを補給したＬＢ培地１０ｍＬに接種した。培養物を２８℃、２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００を用いて細菌のＯＤ６００ｎｍを測定し、浸潤培地（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭアセトシリンゴン）中で０．５に対して正規化した。培養液を浸潤培地で１：１００希釈し、２８℃、２００ｒｐｍ、暗所で３時間インキュベートした。
ＴｕＭＶバイオアッセイ
Ｔ２シロイヌナズナ植物を発芽させ、ハイグロマイシンで選抜し、実施例７に記載の通り遺伝子型を同定した。更に、ＧＥｉＧＳ（商標）ｍｉＲＮＡを発現させる可能性のあるＨＤＲ媒介編集がネイティブなスカフォールドには存在しないことを保証するために植物の遺伝子型を同定した（図１１）。意図するＨＤＲ編集に特異的なフォワードプライマーと、ＨＤＲドナー／ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセット外部にあるリバースプライマー、すなわちネイティブなスカフォールドに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。以下のプライマー及び条件（表１１～１２）を用いて、製造業者の指示書に従って反応を行った：
＞ＴｕＭＶ１０ＨＤＲ特異的Ｆｗｄ：ＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡ（配列番号５２）
＞ダミーＨＤＲ特異的Ｆｗｄ：ＧＡＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＣＣＡＣＧＡＡ（配列番号５８）
＞ｍｉｒ１６２ａ外部Ｒｅｖ：ＴＡＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣＡＧＡＧＡ（配列番号５３）
遺伝子型の同定後、植物を土壌に移植し、合計４週間長日条件（１６時間明期及び８時間暗期）で維持した（プレ抽薹段階）。葉３枚の背軸面をＰ１０ピペットチップで軽く刺し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液の液滴２μＬを傷口の上に置いた。葉の液滴が置かれた箇所を再び軽く刺した。バイナリーベクターを含まないＡＧＬ－１アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液で擬接種を行った。接種した植物を、封じ込めレベル２の生育施設において長日条件（１６時間明期及び８時間暗期）で維持した。ＧＦＰの広がりを調べるために、接種後７日目、１１日目、１５日目、及び１７日目（ｄｐｉ）に紫外線照射下で、固定の距離及び設定（ＩＳＯ４００、絞りｆ／８、露出３．２秒）の、三脚に載せたデジタルカメラ（Ｌｕｍｉｘ，Ｌｅｉｃａ Ｌｅｎｓ－ＤＣ Ｖａｒｉｏ－ＥＬＭＡＲ１：３．３－６．４／４．３－１２９ ＡＳＰＨ，Ｐａｎａｓｏｎｉｃ）で植物を撮影した。
ＧＦＰ領域解析
写真を解析して、葉の総面積のＧＦＰ蛍光が占める割合、すなわちＴｕＭＶがコロニー形成した地上部の植物組織の割合を求めた。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ ３．１．９（Ｍｃｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１８）で、カスタム画像解析パイプラインを開発した。簡単に説明すると、青色成分のグレースケール画像を閾値処理（最小クロスエントロピー）し、オブジェクトを特定し、小さなオブジェクトをフィルタリングし、残りのオブジェクトを手動でキュレーションすることによって、葉の総面積を特定した。この時点で、特定されたオブジェクトは葉の総面積の近似値となり、パイプラインによってこの面積を測定した。品質管理のために、葉の総面積を重ねた出力画像を保存した。ＴｕＭＶ：ＧＦＰによってコロニー形成された総面積（ＴｕＭＶ面積）を特定するために、総葉面積オブジェクトを使用して入力画像をマスクした、すなわち、葉として特定された領域のみを分析した。次に、赤色成分のグレースケール画像を緑色成分のグレースケール画像から差し引き（アーティファクトを除去）、得られた画像を閾値処理し（Ｏｔｓｕ、２クラス）、オブジェクトを特定し、手作業でキュレーションを行い、次いで測定し、ＴｕＭＶ：ＧＦＰ面積を記録した。品質管理のために、ＴｕＭＶ：ＧＦＰ面積を重ねた出力画像を保存した。品質管理のために保存した画像を手作業で再確認し、誤差の大きいものはＩｍａｇｅＪを用いて手作業で葉の総面積及びＴｕＭＶ：ＧＦＰ面積を測定した（図１２）。異なるＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎコンストラクトで形質転換した個体及びその対応する「ダミー」コントロール及び野生型シロイヌナズナの間で、葉の総面積に占めるＴｕＭＶ：ＧＦＰ面積の割合を比較した。
感染植物の葉におけるＴｕＭＶ：ＧＦＰ面積の定量は、ダミー及び野生型（Ｃｏｌ－０）コントロールと比較して、ＴｕＭＶ特異的ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎカセットの存在がウイルス拡散の減少につながることを実証する（図１３）。
配列
全てのヌクレオチド配列を５’－３’配向で記載する。全てのタンパク質配列をＮ末端→Ｃ末端で記載する。
実施例２の配列：
ｍｉＲ１７３ ＷＴ
シロイヌナズナ染色体３配列（配列番号５９）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００２６８６．１（５８６０２９１－５８６２９３７）
ｍｉＲ１７３プロモーター領域（配列番号６０）
ｍｉＲ１７３（ＷＴ）ｎｃＲＮＡ（配列番号１）
ｍｉＲ１７３ターミネーター領域（配列番号６１）
ｍｉＲ１７３（ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）（配列番号６２）
Figure 2024519600000019
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：３１（３．０９％）
ｍｉＲ１７３（ＧＥｉＧＳ（商標））プロモーター領域（配列番号６０）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
ｍｉＲ１７３（ＧＥｉＧＳ（商標））ｎｃＲＮＡ（配列番号２）：
Figure 2024519600000020
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：３１（３０．３９％）
ｍｉＲ１７３（ＧＥｉＧＳ（商標））ターミネーター領域（配列番号６１）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
Ｔａｓ３ａ（ＷＴ）
シロイヌナズナ染色体３配列（配列番号６３）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００２６８６．１（８２３５６５３－８２３６６５４）
Ｔａｓ３ａプロモーター領域（配列番号６４）：
Ｔａｓ３ａ（ＷＴ）ｎｃＲＮＡ（配列番号６）
Ｔａｓ３ａターミネーター領域（配列番号６５）
Ｔａｓ３ａ（ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）（配列番号６６）
Figure 2024519600000021
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：１８（０．６８％）
Ｔａｓ３ａ（ＧＥｉＧＳ（商標））プロモーター領域（配列番号６４）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
Ｔａｓ３ａ（ＧＥｉＧＳ（商標））ｎｃＲＮＡ（配列番号７）：
Figure 2024519600000022
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：１８（１．９０％）
Ｔａｓ３ａ（ＧＥｉＧＳ（商標））ターミネーター領域（配列番号６５）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
線状ＤＮＡ調製用プライマー
平滑末端ＧＥｉＧＳ（商標）カセットの生成用プライマー
ａｔｈ－ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｃａｇａａｇｃｃａａａｔｃｔｔｔｇｇｔａａａｃａａａｇｔａａｔｔｔｔｔｔｔｇ－３’（配列番号１１）
プライマーＲｅｖ：５’－ａａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号１２）
ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ａｔｇａａａｔｔａａｇａｇｃｃｔｔｇｔｃｃｔａｇｔｔｔｔｇｔａｇｔａｇ－３’（配列番号１３）
プライマーＦｗ：５’－ａｇｔａｇａｇａｃａｔａｔａｃｔｔｃｔｇｔｃｔａｃａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｔｔａｔｃ－３’（配列番号１４）
突出末端ＧＥｉＧＳ（商標）カセットの生成用プライマー
ａｔｈ－ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘｃａｇａａｇｃｃａａａｔｃｔｔｔｇｇｔａａａｃａａａｇｔａａｔｔｔｔｔｔｔｇ－３’（配列番号１５）
プライマーＲｅｖ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号１６）
ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａｔｇａａａｔｔａａｇａｇｃｃｔｔｇｔｃｃｔａｇｔｔｔｔｇｔａｇｔａｇ－３’（配列番号１７）
プライマーＲｅｖ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａｇｔａｇａｇａｃａｔａｔａｃｔｔｃｔｇｔｃｔａｃａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｔｔａｔｃ－３’（配列番号１８）
（式中、
－ｎ：任意のヌクレオチド
－ｘｘｘｘｘｘ：高忠実度酵素の制限部位）。
化学的に安定化したＧＥｉＧＳ（商標）カセット生成用プライマー
ａｔｈ－ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｃ＊ａｇａａｇｃｃａａａｔｃｔｔｔｇｇｔａａａｃａａａｇｔａａｔｔｔｔｔｔｔｇ－３’（配列番号１９）
プライマーＲｅｖ：５’－ａ＊ａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号２０）
ａｔｈ－Ｔａｓ３ａ ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ例カセット全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ａ＊ｔｇａａａｔｔａａｇａｇｃｃｔｔｇｔｃｃｔａｇｔｔｔｔｇｔａｇｔａｇ－３’（配列番号２１）
プライマーＲｅｖ：５’－ａ＊ｇｔａｇａｇａｃａｔａｔａｃｔｔｃｔｇｔｃｔａｃａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｔｔａｔｃ－３’（配列番号２２）
（式中、＊は、ホスホロチオエート結合を表す）
実施例３の配列：
ｍｉＲ１７３（ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）（配列番号６２）
Figure 2024519600000023
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：３１（３．０９％）
ｍｉＲ１７３プロモーター領域（配列番号６０）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
ｍｉＲ１７３（ＧＥｉＧＳ（商標））ｎｃＲＮＡ（配列番号２）：
Figure 2024519600000024
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：３１（３０．３９％）
ｍｉＲ１７３ターミネーター領域（配列番号６１）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
変異型ＡＬＳカセット
ＡＬＳ前駆体配列（ＷＴ、ヌクレオチド）（配列番号６７）
ＡＬＳ前駆体配列（Ｐ１９７Ｓ変異体、ヌクレオチド）（配列番号６８）：
Figure 2024519600000025
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：１（０．０５０％）
推定葉緑体トランジットペプチド（ＷＴ及びＰ１９７Ｓ変異体、ヌクレオチド）（配列番号６９）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
ＡＬＳ成熟タンパク質（ＷＴ、ヌクレオチド）（配列番号７０）
ＡＬＳ成熟タンパク質（Ｐ１９７Ｓ変異体、ヌクレオチド）（配列番号７１）：
Figure 2024519600000026
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０．０５８％）
ＡＬＳ前駆体タンパク質（ＷＴ、アミノ酸）（配列番号７２）
ＡＬＳ前駆体タンパク質（Ｐ１９７Ｓ変異体、アミノ酸）（配列番号７３）：
Figure 2024519600000027
ＷＴ配列から変化したアミノ酸の数：１（０．１４９％）
推定葉緑体トランジットペプチド（ＷＴ及びＰ１９７Ｓ変異体、アミノ酸）（配列番号７４）
ＷＴ配列から変化したアミノ酸の数：０（０％）
成熟ＡＬＳタンパク質（ＷＴ、アミノ酸）（配列番号７５）
５７３ａａ
成熟ＡＬＳタンパク質（Ｐ１９７Ｓ変異体、アミノ酸）（配列番号７６）：
Figure 2024519600000028
ＷＴ配列から変化したアミノ酸の数：０（０．１７４％）
ＡＬＳプロモーター領域（５’ＵＴＲを含む）（配列番号７７）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
ＡＬＳターミネーター領域（３’ＵＴＲを含む）（配列番号７８）
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：０（０％）
ＡＬＳ選択を伴うＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ配列（ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）＋Ｐ１７９ＳＡＬＳ）（配列番号７９）
Figure 2024519600000029
Figure 2024519600000030
ＷＴ配列から変化したヌクレオチドの数：３２（０．７７４％）
ｍｉＲ１７３ ＧＥｉＧＳ（商標）発現カセットを小文字で示し（センス鎖から転写）、変異型ＡＬＳ Ｐ１９７Ｓカセットを大文字で示す（相補鎖から転写）。両カセットが反対方向を向くように、ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ配列全体を設計した。
ＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎシスジェニック選択コンストラクト合成用プライマー
制限ストラテジ
選択カセットを含むＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘｃａｔａｔｃａａｇｃｔａｇａｔｔｔｔｇａａｔｔａｃｃｃｔａｔｔｔｃａｔｃｇｔ－３’（配列番号２３）
プライマーＲｅｖ：５’－ｎｎｘｘｘｘｘｘａａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号１６）
（式中、
－ｎ：任意のヌクレオチド
－ｘｘｘｘｘｘ：高忠実度制限酵素の制限部位）。
化学修飾ストラテジ
選択カセットを含むＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ全体のＰＣＲ増幅用プライマー：
プライマーＦｗ：５’－ｃ＊ａｔａｔｃａａｇｃｔａｇａｔｔｔｔｇａａｔｔａｃｃｃｔａｔｔｔｃａｔｃｇｔ－３’（配列番号２４）
プライマーＲｅｖ：５’－ａ＊ａｃｔｔｃａａｔａｔｔａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｃ－３’（配列番号２０）
（式中、
ホスホロチオエート結合は、＊によって表される）。
実施例４の配列：
＞ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ＿Ａｔ＿ｍｉＲ１７３＿ｔｏ＿ＰＤＳ３＿ＡＬＳ１（配列番号７９）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｆ１（配列番号２５）
５’－ａｃａａａｃｔａｃｃｔｇｃａａｇｔｇｇｔｃａ－３’
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｒ１（配列番号２６）
５’－ｃａａｇｃｔｃｔｔｔａｔｃｃａｃａｃｔ－３’
＞トマトＧＥｉＧＳ（商標）－Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎコンストラクト（配列番号８０）
＞ＴｏｍＧＥｉＧＳ（商標）＿ｌｉｎｅａｒ＿Ｆ１（配列番号２７）
５’－Ａ＊ＡＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴ－３’
注記－アスタリスクはホスホロチオエート結合を示す
＞ＴｏｍＧＥｉＧＳ（商標）＿ｌｉｎｅａｒ＿Ｆ１（配列番号２８）
５’－Ａ＊ＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＡＴＧＣＣ－３’
注記－アスタリスクはホスホロチオエート結合を示す
＞Ｓｌ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｆ１（配列番号２９）
５’－ＧＧＴＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡ－３’
＞Ｓｌ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｒ１（配列番号３０）
５’－ＧＡＡＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣ－３’
実施例５の配列：
＞野生型シロイヌナズナｍｉＲ１７３（配列番号１）
５’－ｔａａｇｔａｃｔｔｔｃｇｃｔｔｇｃａｇａｇａｇａａａｔｃａｃａｇｔｇｇｔｃａａａａａａｇｔｔｇｔａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａｇｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇｔｇａｔｔｃｔｃｔｇｔｇｔａａｇｃｇａａａｇａｇｃｔｔｇ－３’
＞ＰＤＳ３を標的とするように改変されたシロイヌナズナｍｉＲ１７３（配列番号２）
５’－ｔａａｇｔａｃｔｔｔｇａｃａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｃｃａｇｃａｇｔｇｇｔｃａａａａａａｇｔｔｇｔａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａｇｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇｃｔｇａｔｔｇｇｃａｇｇａｔｔｇｔｃａａａｇａｇｃｔｔｇ－３’
＞改変型ＡｔｍｉＲ１７３からの成熟ｓｉＲＮＡ（配列番号３）
５’－ｔｇａｃａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｃｃａｇｃ－３’
＞シロイヌナズナフィトエンデサチュラーゼ３＿（ＰＤＳ３）転写物（配列番号８１）
＞ＧＥｉＧＳ（商標）＿Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ＿Ａｔ＿ＭｉＲ１７３＿ｔｏ＿ＰＤＳ３＿ＡＬＳ１（配列番号７９）
＞ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｄｕｍｍｙ＿Ａｔ＿ｍｉＲ１７３＿ｗｔ＿ＡＬＳ１（配列番号８２）
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｆ２（配列番号３１）
５’－ＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡ－３’
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｇｅｎｏ＿Ｒ２（配列番号３２）
５’－ＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＣＴ－３’
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｄｕｍｍｙ＿ｇｅｎｏ＿Ｆ１（配列番号３３）
５’－ＧＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＡ－３’
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ｄｕｍｍｙ＿ｇｅｎｏ＿Ｒ１（配列番号３４）
５’－ＴＧＧＴＴＡＣＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＴＧＧＧＧＡ－３’
＞ＡＣ１（配列番号３５）
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧ－３’
＞ＬＡＤ１－１（配列番号３６）
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ａ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ａ）ＮＮＮＧＧＡＡ－３’
＞ＬＡＤ１－２（配列番号３７）
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＮＮＮＧＧＴＴ－３’
＞ＬＡＤ１－３（配列番号３８）
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｇ／Ｃ／Ａ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ａ）ＮＮＮＣＣＡＡ－３’
＞ＬＡＤ１－４（配列番号３９）
５’－ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＮＮＮＣＧＧＴ－３’
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ＴＡＩＬ＿Ｆ１（配列番号４０）
ＴＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴ
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ＴＡＩＬ＿Ｆ２（配列番号４１）
ＧＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＡＧ
＞Ａｔ＿ＧＥｉＧＳ（商標）＿ＴＡＩＬ＿Ｆ３（配列番号４２）
ＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣ
実施例６の配列：
＞ＴｕＭＶ８（１．２ｋｂ）（配列番号８３）
ＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＴＣＴＡＧＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＡＴＡＴＧＴＧＡＴＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＡＣＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＡＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＴＡＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＣＴＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＣＧＴＡＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＧａａｔｃａｇａｔｇｇｔｇｔｔａａｇｔａｔｃａａｃｔｔｃｇｃａｃｃａａｇａｇａｇｇｃｃａｇｃｃｔｔｃｔＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧｃａｃｇｔａｔａｃｔｃｃａｃｇａｇａｔｇｃｔｇｔｔｔｃｇａａａａａｃａａｔａｇａｇａｃｃｔｃｔａａｃｔｔｃｇｇａａｃｇｇｃａｇａｃａａａｇｇａｇｔａｇａｃａｃａｃｇｇａｇｇｃｔａｇｔｔｔａｃａｔａｇｔｔｇａａｇｇｇａａｇｃｃｔｃｔｃａａａｇｇｃａｃａｃｔｇａａｇｇｔａｃｔｔａａａａｃｃａｔａｔｇａｔＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＡＣＴＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＡＴＧＣＧＡＧＧＴＡＡＧＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧＣＴＡＣＴＴＧＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＴＡＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡＣＴ
＞ダミー１７（１．２ｋｂ）（配列番号８４）
ＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＴＣＴＡＧＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＡＴＡＴＧＴＧＡＴＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＡＣＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＡＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＴＡＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＣＴＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＣＧＴＡＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＧａａｔｔｇｇｇａｇｇｃｇｇｔａｇｇｔａｃｇｇａｔｔｔｃｔｃａｃｃｇａｔｇｇｔａａｃｃａｇａｃａｇｃＴＴＴＣＧＴＧＧＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＴＣＴｇｃａｃｇｔａｃａｃｔｃｔａｃｇａａａｔｔｃｔｔｔｔｇｃｇｇｔａａｇｃａａｃａｇｇｇａｃａｃｃｔｇａｃａｃｃｇｃａａａｇｇａａｇａｃａａａａｇａｇｔｇｇａｃａｔａｃｇｇｔｔｔａｇｔｃｇｇｃｇｇａｔｇａｇｔｇｔｔｇｔｇａａｇｔｔｇｃｃａａａａｇｇｃａｃａａａｇａａａｇｔａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｃｇａｔＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＡＣＴＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＡＴＧＣＧＡＧＧＴＡＡＧＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧＣＴＡＣＴＴＧＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＴＡＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡＣＴ
＞ＴｕＭＶ１０（１．２ｋｂ）（配列番号８５）
ＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＧＧＣＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＴＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＡＧＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＧＡＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＡＡＧＧＣＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＴＴＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＡＴＴＣｃａｇａａａｃｔｇａｇａａｃｇａｔａｃｃｃｇｇｇｇｔｃｇｔｃｇｃｔｔｃａｇｃｇｃｔａａｔａｔｔｇｔａｇａｃｃｔｔｔｔｃｔｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｔｃｔｔｔｇａａｇｔｇｔｔｃａｃａｇｇａａｇａＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡａｇｃｇｇｃｃｃａａｃｃｔｃｔｔｃｔｃｇｃｔｔｃｔｔＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＧＡＡＴＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＡＣＣＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＴＡＡＡＡＧＴＣＴＣＡＴＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡ
＞ダミー１９（１．２ｋｂ）（配列番号８６）
ＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＧＧＣＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＴＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＡＧＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＧＡＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＡＡＧＧＣＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＴＴＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＡＴＴＣｃａｇａａａａｔａｃｇｔｃａｇａｔａｃｇｃｇａｇｇｃｔｔａｃｇｃｔｔｃｃｔｔｇｇｇｃｃｃｃａｔｔａａｃｃｔｃａｇｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｔａｃａａｔｔｔｔａｔｔｇｔｇｔｔｃｇｃａｇｇａｇｇｃｇＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＣＣＡＣＧＡＡＡｇｃｇａｃｔｃａｃｔｃｔｃａａｃｇｔｃｃｔｔｃｔｔＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＧＡＡＴＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＡＣＣＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＴＡＡＡＡＧＴＣＴＣＡＴＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡ
＞ＴｕＭＶ１２（１．２ｋｂ）（配列番号８７）
ＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＧＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＧＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＧＴＣＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＡＴＣＡＡＴＣＴＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴａａａｇｃａｃｔｔＴＡＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧａｇｃｇｇｔｃａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｔａｔｃｔｃａａｇｃａａｇｇｔｔｃｃａｃｔｔａｇｇｇｇｔｔｃａｇｃｇｇｔａｔｇｔａａａｇａｇｃｔｔｔＣＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＡＡＡＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＴＡＡＣＧＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＡＴＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴＴＡＧＡＧＡＣ
＞ＴｕＭＶ１４（１．２ｋｂ）（配列番号８８）
ＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＧＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＧＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＧＴＣＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＡＴＣＡＡＴＣＴＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴａａｇｇａａｃａｔＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＧＴＡＧＴＡＧＧＣＴｃｇｇｇｇｔｃａａａａａａｇｔｃｇｇａｇｇａｔｇｃｔｔｇａａｇｔｃｇｃａａｔｃｃｇｃｇｇｇｃｃａｃｔａｃａｇｇｇａｔａｇｔｇａａｔｇａｔｃｃｔｔＣＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＡＡＡＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＴＡＡＣＧＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＡＴＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴＴＡＧＡＧＡＣ
＞ダミー２１（配列番号８９）
ＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＧＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＧＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＧＴＣＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＡＴＣＡＡＴＣＴＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴａａａｇｃａｃｔＴＴＴＣＧＴＧＧＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＴＣＴｃｔｇｃｇｇａｃａａａａａａｇａｔｔｃａｃａｔｃｇｇｔａａｔａｃｃｃａｃａａｇｃｃｃｃａｇａｇａｔａｇｔｇｇｔｔｔｃｃａｃｇｇａａａｇａｇｃｔｔｔＣＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＡＡＡＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＴＡＡＣＧＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＡＴＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴＴＡＧＡＧＡＣ

Claims (51)

  1. サイレンシング挿入物を真核細胞のゲノムに挿入することを含む、第１の標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、
    前記サイレンシング挿入物が、プロモーター又はその一部、前記第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含み、
    前記サイレンシング挿入物が、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む前記真核細胞における内在性サイレンシング配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
    前記内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、前記第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもない方法。
  2. 前記サイレンシング挿入物が、微粒子銃、プロトプラストトランスフェクション、エレクトロポレーション、ナノ粒子媒介トランスフェクション、又はアグロバクテリウム媒介形質転換によって挿入される、請求項１に記載の方法。
  3. そのゲノム中に、
    （ａ）プロモーター又はその一部、第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーター又はその一部を含むサイレンシング挿入物と、
    （ｂ）前記挿入物によって分離された内在性ゲノム配列と、
    （ｃ）プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む内在性サイレンシング配列と、
    を含み、
    前記サイレンシング挿入物及び前記内在性サイレンシング配列が、前記挿入物の長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
    前記内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、前記第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもない真核細胞。
  4. 分離された前記内在性ゲノム配列の間から前記内在性ゲノム配列が欠失している、請求項３に記載の真核細胞。
  5. プロモーター又はその一部と、真核細胞における第１の標的遺伝子の発現をサイレンシングするサイレンシングＲＮＡをコードしている配列と、ターミネーター又はその一部とを含むサイレンシング挿入物を含む単離されたサイレンシングコンストラクトであって、
    前記サイレンシング挿入物が、プロモーター、サイレンシングＲＮＡをコードしている配列、及びターミネーターを含む前記真核細胞における内在性サイレンシング配列に対して、その長さ全体にわたって９５％を超える配列同一性を有し、
    前記内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、活性を有さず、前記第１の標的遺伝子とは異なる第２の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることもないコンストラクト。
  6. 前記真核細胞が、バナナ植物細胞、コーヒー植物細胞、又はイネ植物細胞等の植物細胞である、請求項１～５のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  7. 前記真核細胞が、植物プロトプラストである、請求項６に記載の方法又は真核細胞。
  8. 前記真核細胞が、ヒト細胞又は動物細胞、好ましくは家畜動物細胞、例えばウマ、ロバ、ウシ、若しくは任意の他の反芻動物；コブウシ、ヤク、バッファロー、ヒツジ、ヤギ、トナカイ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタ、ウサギ、若しくは任意の他のげっ歯類；イヌ、ネコ、例えばニワトリ、七面鳥、ガチョウ、若しくはアヒル等の家禽類；魚類、甲殻類、又は軟体動物の細胞である、請求項１～５のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  9. 前記サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、段階的低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡを形成するインバーテッドリピートＲＮＡ、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、自律性若しくは非自律性の転位若しくはレトロ転位因子由来ＲＮＡ、自律性若しくは非自律性の転位若しくはレトロ転位因子ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ断片（ｔＲＦ）、又は長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である、請求項１～８のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  10. 前記サイレンシング挿入物が、前記内在性サイレンシング配列に対して１～４０個、例えば５～４０個、５～３０個、５～２０個、３～４０個、３～３０個、３～２０個、５～１５個、３～１０個、１０～３０個、又は１０～２０個のヌクレオチドの置換、付加、及び／又は欠失を含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  11. 前記置換が連続していない、請求項１０に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  12. 前記ヌクレオチドの置換が全て、前記サイレンシングＲＮＡをコードしている配列中に存在する、請求項１０又は請求項１１に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  13. 前記ヌクレオチドの置換が全て、転写された配列中に存在する、請求項１０又は請求項１１に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  14. 前記サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡ及び前記内在性サイレンシング配列によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、同じ二次構造を形成する、請求項１～１３のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  15. 前記サイレンシング挿入物中のプロモーター及びターミネーターが、前記内在性サイレンシング配列中のプロモーター及びターミネーターと同一であるか又は部分的に同一である、請求項１～１４のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  16. 前記サイレンシング挿入物及び前記内在性サイレンシング配列が、前記挿入物の長さ全体にわたって９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、又は９９．９％を超える配列同一性を有する、請求項１～１５のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  17. 前記サイレンシング挿入物が、隣接する選択可能なマーカーと共に挿入される、請求項１～１６のいずれかに記載の方法、又は前記サイレンシング挿入物が、選択可能なマーカーに隣接する、請求項１～１６のいずれかに記載の真核細胞又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  18. 前記選択可能なマーカーが、前記真核細胞に内在する、請求項１７に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  19. 前記選択可能なマーカーが、前記真核細胞に内在するマーカーの変異体バージョンであるか、又は前記選択可能なマーカーが、選択可能なマーカーとして機能しない前記真核細胞に内在する遺伝子の変異体バージョンである、請求項１８に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  20. 前記変異体バージョンにおける変異が、同属の、任意で同種の別の真核細胞において天然に存在する変異と同じである、請求項１９に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  21. 前記選択可能なマーカーが、クロルスルフロン除草剤抵抗性等の除草剤抵抗性を付与するＡＬＳ遺伝子の変異バージョンである、請求項１９又は２０に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  22. 前記サイレンシング挿入物が、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と、前記内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列とを更に含むコンストラクトにおいて、前記真核細胞のゲノムに挿入される、請求項１、２、及び６～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが、前記内在性サイレンシング配列に挿入、欠失、又は挿入及び欠失等の改変を導入し、これにより、前記内在性サイレンシング配列の発現又は活性を低下又は消失させる、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが、前記真核細胞において前記内在性サイレンシング配列の前記サイレンシング挿入物による置換を媒介する、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記真核細胞が、植物細胞又は家畜動物細胞であり、前記方法が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが前記内在性サイレンシング配列の前記サイレンシング挿入物による置換を媒介するまで、植物又は家畜動物を作出し、前記植物又は家畜動物を少なくとも１世代繁殖させることを更に含む、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記真核細胞が、植物細胞又は家畜動物細胞であり、前記方法が、植物又は家畜動物を作出し、ゲノムに挿入された前記コンストラクトを繁殖させて除去し（breeding out）、それにより、前記内在性サイレンシング配列の位置に置換された前記サイレンシング挿入物を含みかつ前記真核細胞のゲノムに挿入された前記コンストラクトを含まない植物又は家畜動物を作出することを更に含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記真核細胞が、そのゲノム中に、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と、前記内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列と、請求項１～２６のいずれかに記載のサイレンシング挿入物とを含むコンストラクトを含む、請求項３、４、及び６～２１のいずれかに記載の真核細胞。
  28. 前記内在性サイレンシング配列が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡによって導入された改変、例えば、挿入、欠失、又は挿入及び欠失等を含み、これにより、前記内在性サイレンシング配列の発現又は活性を低下又は消失させる、請求項２７に記載の真核細胞。
  29. ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列と、前記内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列とを更に含む、請求項５～２１のいずれかに記載のサイレンシングコンストラクト。
  30. 前記サイレンシング挿入物が、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いてＴ－ＤＮＡカセットにおいて真核細胞に導入される、請求項１及び６～２６のいずれかに記載の方法、又は前記サイレンシング挿入物が、挿入されたＴ－ＤＮＡカセット配列内にある、請求項３、４、６～２１、２７、及び２８のいずれかに記載の真核細胞、又はＴ－ＤＮＡカセットである、請求項５～２１及び２９のいずれかに記載の単離されたサイレンシングコンストラクト。
  31. 前記Ｔ－ＤＮＡカセットが、選択可能なマーカー並びに／又はＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードしている配列及び前記内在性サイレンシング配列を標的とするガイドＲＮＡをコードしている配列を含む、請求項３０に記載の方法、真核細胞、又はサイレンシング挿入物。
  32. 前記方法が、複数のサイレンシング挿入物を挿入することを含む、前記真核細胞が、複数のサイレンシング挿入物を含む、又は前記単離されたサイレンシングコンストラクトが、複数のサイレンシング挿入物を含む、請求項１～３１のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  33. 各サイレンシング挿入物によってコードされているサイレンシングＲＮＡが、異なる遺伝子を標的とする、請求項３２に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  34. 前記標的遺伝子が、前記真核細胞に内在する、請求項１～３３のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  35. 前記標的遺伝子のサイレンシングによって、形質又は表現型が改善される、請求項３４に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  36. 前記標的遺伝子が、有害生物遺伝子等の真核細胞に対して外来性である、請求項１～３３のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  37. 前記標的遺伝子のサイレンシングによって、有害生物抵抗性、疾患耐性又は抵抗性が提供される、請求項３６に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  38. 前記標的遺伝子が、前記真核細胞に対して外来性であるが、前記真核細胞内に存在する、請求項３６又は請求項３７に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  39. 前記標的遺伝子が、前記真核細胞に対して外来性であり、前記真核細胞内には存在しない、請求項３６又は請求項３７に記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  40. 前記第１の標的遺伝子が、前記第２の標的遺伝子のホメオログである、請求項１～３９のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  41. 前記サイレンシング挿入物中のプロモーター、ターミネーター、及び／又は他の調節配列が、組織特異的、生物学的条件特異的、非生物学的条件特異的、誘導性、発生的に調節される、又は構成的である、請求項１～４０のいずれかに記載の方法、真核細胞、又は単離されたサイレンシングコンストラクト。
  42. 請求項３、４、又は６～４１のいずれか一項に記載の真核細胞を含む、植物又は植物の部分。
  43. 前記真核細胞が植物細胞であり、前記方法が、前記細胞から植物を成長させ、前記植物を繁殖させることを更に含む、請求項１、２、６～４１のいずれかに記載の方法。
  44. 果実又は他の植物の部分若しくは生産物を収穫することを更に含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 請求項４３に記載の方法によって作出される植物。
  46. 請求項４２又は４３に記載の植物の種子。
  47. 請求項３、４、又は６～４１のいずれか一項に記載の真核細胞を含む動物又は動物生産物。
  48. 前記真核細胞が動物細胞であり、前記方法が、前記細胞から動物を発生させ、前記動物を繁殖させることを更に含む、請求項１、２、６～４１のいずれかに記載の方法。
  49. 動物生産物を生産させることが更に含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 請求項４８に記載の方法によって作出された動物。
  51. 請求項３、４、６～４１のいずれかに記載のヒト若しくは家畜動物の細胞、又は請求項５～４１のいずれかに記載のサイレンシング挿入物を投与することを含む、ヒト患者又は家畜動物の疾患を治療又は予防する方法。
JP2023555762A 2021-03-09 2022-03-08 遺伝子のサイレンシング法 Pending JP2024519600A (ja)

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