JP2024517229A - インフルエンザに対する免疫原性組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヘマグルチニン抗原などの１つまたは複数のインフルエンザ抗原をコードするポリヌクレオチド分子を含むリボ核酸ワクチンの調製、製造および治療的使用のための組成物および方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、以下の出願のそれぞれに対する優先権を主張し、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：２０２１年５月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１８３，６２４号；２０２１年５月４日に出願された米国仮特許出願６３／１８４，２０１号；２０２１年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７，３２５号；および２０２１年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／２６１，７８４号。
本発明は、ヘマグルチニン抗原などの１つまたは複数のインフルエンザ抗原をコードするポリヌクレオチド分子を含むリボ核酸ワクチンの調製、製造および治療的使用のための組成物および方法に関する。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のメンバーであり、その核タンパク質（ＮＰ）とマトリックス（Ｍ）タンパク質との間の抗原性の相違に基づいて、３つの型（Ａ、Ｂ、およびＣ）に分類されている。
インフルエンザＡウイルスのゲノムは、ヌクレオカプシドを形成する、ＲＮＡにより導かれるＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ）および核タンパク質（ＮＰ）；マトリックスタンパク質（ウイルス膜中に埋め込まれた表面露出タンパク質でもある、Ｍ１、Ｍ２）；リポタンパク質エンベロープから突出する、２つの表面糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ならびに非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）を含むいくつかのポリペプチドをコードする、線状、負極性の一本鎖ＲＮＡの８つの分子（インフルエンザＣウイルスについては７つ）を含む。
ヘマグルチニンは、インフルエンザＡおよびＢウイルスの主要なエンベロープ糖タンパク質であり、インフルエンザＣウイルスのヘマグルチニン－エステラーゼ（ＨＥ）は、ＨＡと相同なタンパク質である。
伝統的なワクチンを使用したインフルエンザおよび他の感染に対する療法および予防に関する課題は、範囲におけるワクチンの制約であり、密接に関連するサブタイプのみに対する防御をもたらすことである。さらに、現在の標準的なインフルエンザウイルスワクチン生産プロセスを完了するのに必要とされる時間の長さは、パンデミック状況における適合ワクチンの迅速な開発および生産を阻害する。
インフルエンザに対する改良された免疫原性組成物が必要である。
特に、インフルエンザに対する改良された免疫原性組成物の満たされていない必要性が、本明細書に提供される。一態様では、本開示は、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第１のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド、および（ｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第２の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化されている、免疫原性組成物に関する。一部の実施形態では、第１および第２の抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、またはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、第１の抗原は、第２の抗原のインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片とは異なるサブタイプのインフルエンザウイルスに由来するＨＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、（ｉｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第３の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１および第２の抗原の両方とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第３の抗原をさらに含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子中で製剤化されている。
一部の実施形態では、組成物は、（ｉｖ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第４の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２および第３の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第４の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第４のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子中で製剤化されている。
一部の実施形態では、それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドは、５’末端キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および３’ポリアデニル化尾部を含む。一部の実施形態では、５’末端キャップは、
Figure 2024517229000001
 を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号１を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号２を含む。一部の実施形態では、３’ポリアデニル化尾部は、配列番号３を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、８５％より高い完全性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、８５％より高い純度を有する。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５ｍｏｌ％の中性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のコレステロール、および０．５～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、
Figure 2024517229000002
 を含む。
一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、
Figure 2024517229000003
 を含む。
一部の実施形態では、第１の抗原は、インフルエンザＡサブタイプＨ１に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第２の抗原は、第１の抗原とは異なるＨ１株に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、第１および第２の抗原は、インフルエンザＡサブタイプＨ３に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、両抗原は、Ｈ３インフルエンザウイルスの異なる株に由来する。
一部の実施形態では、第１および第２の抗原は、インフルエンザＡサブタイプＨ１に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第３および第４の抗原は、インフルエンザＡサブタイプＨ３またはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第１および第２の抗原は、Ｈ１ウイルスの異なる株に由来し、第３および第４の抗原は、Ｈ３インフルエンザウイルスの異なる株に由来する。
一部の実施形態では、少なくとも第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２、および第３のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のＬＮＰ中で製剤化されている。
一部の実施形態では、それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のＬＮＰ中で製剤化され、それぞれの単一のＬＮＰは、１つの抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドを封入する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドは、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドは、第２のＬＮＰ中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドは、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドは、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドは、第３のＬＮＰ中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドは、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドは、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドは、第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドは、第４のＬＮＰ中で製剤化されている。
別の態様では、本開示は、インフルエンザに対する免疫応答を引き出すのに使用するための、本明細書に記載の任意の免疫原性組成物に関する。
別の態様では、本開示は、インフルエンザ疾患に対する免疫応答を引き出す方法であって、有効量の本明細書に記載の任意の免疫原性組成物を投与することを含む方法に関する。
別の態様では、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって合成されたＲＮＡポリヌクレオチドを精製する方法に関する。方法は、限外濾過および透析濾過を含む。一部の実施形態では、方法は、クロマトグラフィーステップを含まない。一部の実施形態では、精製されたＲＮＡポリヌクレオチドは、短いアボーティブＲＮＡ種、長いアボーティブＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、残留プラスミドＤＮＡは、５００ｎｇ以下のＤＮＡ／ｍｇ ＲＮＡである。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの収率は、約７０％～約９９％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は、約６０％～約１００%である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は、約８５％～９５%である。
本開示の実施形態は、インフルエンザウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。本明細書に提供されるインフルエンザウイルスＲＮＡワクチンを使用して、ＤＮＡワクチン接種と関連する多くのリスクなしに、細胞性免疫と体液性免疫との両方を含む、バランスの取れた免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、ウイルスは、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの株またはその組合せである。
一態様では、本開示は、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第１のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド、および（ｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第２の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化されている、免疫原性組成物に関する。一部の実施形態では、第１および第２の抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、またはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、第１の抗原は、第２の抗原のインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片とは異なるサブタイプのインフルエンザウイルスに由来するＨＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、（ｉｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第３の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１および第２の抗原の両方とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第３の抗原をさらに含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子中で製剤化されている。
一部の実施形態では、組成物は、（ｉｖ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第４の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２および第３の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第４の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第４のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子中で製剤化されている。
一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単一の容器中で所望の比率で混合され、続いて、脂質ナノ粒子中で製剤化されている。本発明者らは驚くべきことに、単一のＬＮＰプロセスにおいて製剤化されている既知の比率の異なるＲＮＡポリヌクレオチドの初期インプットが、驚くべきことに、インプット比とほぼ同じ比率で異なるＲＮＡポリヌクレオチドを封入するＬＮＰをもたらすことを発見した。この結果は、ＲＮＡポリヌクレオチドをＬＮＰ中に封入する場合、別のものよりも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを選択する製造プロセスの可能性を考慮すると驚くべきことであった。そのような実施形態を、本明細書では「事前混合」と称してもよい。したがって、一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のＬＮＰ中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２、第３、第４、および第５のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のＬＮＰ中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、および第６のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のＬＮＰ中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のＬＮＰ中で製剤化されている。一部の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および第８のＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のＬＮＰ中で製剤化されている。
一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＲＮＡポリヌクレオチドのミックス中の第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第２のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第２のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、１：１より大きい。
一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＲＮＡポリヌクレオチドのミックス中の第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第３のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第３のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、１：１より大きい。
一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＲＮＡポリヌクレオチドのミックス中の第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第４のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第４のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＲＮＡポリヌクレオチドのミックス中の第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第５のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第５のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＲＮＡポリヌクレオチドのミックス中の第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第６のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第６のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＲＮＡポリヌクレオチドのミックス中の第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第７のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第７のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＲＮＡポリヌクレオチドのミックス中の第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第８のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドの第８のＲＮＡポリヌクレオチドに対するモル比は、１：１より大きい。
代替的な実施形態では、特定の抗原をコードするそれぞれのＲＮＡポリヌクレオチドは、それぞれのＬＮＰが同一の抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドを封入するように、個々のＬＮＰ中で製剤化されている。そのような実施形態を、本明細書では「事後混合」と称してもよい。したがって、一部の実施形態では、第１のＲＮＡポリヌクレオチドは第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドは第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドは第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドは第４のＬＮＰ中で製剤化され、第５のＲＮＡポリヌクレオチドは第５のＬＮＰ中で製剤化され、第６のＲＮＡポリヌクレオチドは第６のＬＮＰ中で製剤化され、第７のＲＮＡポリヌクレオチドは第７のＬＮＰ中で製剤化され、第８のＲＮＡポリヌクレオチドは第８のＬＮＰ中で製剤化されている。
一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＬＮＰのミックス中の第１のＬＮＰの第２のＬＮＰに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＬＮＰの第２のＬＮＰに対するモル比は、１：１より大きい。
一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＬＮＰのミックス中の第１のＬＮＰの第３のＬＮＰに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＬＮＰの第３のＬＮＰに対するモル比は、１：１より大きい。
一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＬＮＰのミックス中の第１のＬＮＰの第４のＬＮＰに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＬＮＰの第４のＬＮＰに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＬＮＰのミックス中の第１のＬＮＰの第５のＬＮＰに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＬＮＰの第５のＬＮＰに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＬＮＰのミックス中の第１のＬＮＰの第６のＬＮＰに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＬＮＰの第６のＬＮＰに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＬＮＰのミックス中の第１のＬＮＰの第７のＬＮＰに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＬＮＰの第７のＬＮＰに対するモル比は、１：１より大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中での製剤化の前のＬＮＰのミックス中の第１のＬＮＰの第８のＬＮＰに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。一部の実施形態では、第１のＬＮＰの第８のＬＮＰに対するモル比は、１：１より大きい。
驚くべきことに、本発明者らは、複数のＲＮＡポリヌクレオチドをＬＮＰ中での製剤化の前に混合しようと（事前混合）、特定の抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドを個々のＬＮＰ中で製剤化し、異なる抗原に対する複数のＬＮＰを混合しようと（事後混合）、プロセスに関係なく、ＲＮＡポリヌクレオチドの得られる比が同等であることを発見した。この発見の結果として、特に、個々のＬＮＰが単一の抗原のためのＲＮＡを封入する場合、インフルエンザの季節に応じて、異なる比の抗原を混合し、投与する医療専門家の選択肢があり得る。
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ヘマグルチニンタンパク質またはその免疫原性断片をコードする。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、またはその免疫原性断片である。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、頭部ドメインを含まない。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、頭部ドメインの一部を含む。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインを含まない。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインの一部を含む。一部の実施形態では、トランケートされたヘマグルチニンタンパク質は、膜貫通ドメインの一部を含む。
一部の実施形態は、カチオン性脂質ナノ粒子内で製剤化された、ヘマグルチニンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容できる担体または賦形剤とを含むインフルエンザワクチンを提供する。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ７およびＨ１０から選択される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質をさらにコードする。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、インフルエンザＡウイルスもしくはインフルエンザＢウイルスの株またはその組合せに由来する。一部の実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、およびＨ１０Ｎ８から選択される。
一部の実施形態では、ウイルスは、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの株またはその組合せである。一部の実施形態では、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢの株は、鳥、ブタ、ウマ、イヌ、ヒト、または非ヒト霊長類と関連する。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片をコードする。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ７もしくはＨ１０またはその断片である。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、頭部ドメインの一部を含む（ＨＡ１）。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインの一部を含む。一部の実施形態では、トランケートされたヘマグルチニンタンパク質。一部の実施形態では、タンパク質は、膜貫通ドメインの一部を含む、トランケートされたヘマグルチニンタンパク質である。一部の実施形態では、ウイルスは、Ｈ７Ｎ９およびＨ１０Ｎ８からなる群から選択される。タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、目的のポリペプチドの範囲内にあると考えられる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸長の、または１００アミノ酸長よりも長い参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列よりも少なくとも１アミノ酸残基短いが、その他は同一であるポリペプチド配列を意味する）。
一部の実施形態では、インフルエンザＲＮＡ組成物は、抗原性融合タンパク質をコードするＲＮＡを含む。かくして、コードされた抗原または複数の抗原は、一緒に連結された２つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質および／またはタンパク質断片）を含んでもよい。あるいは、タンパク質抗原が融合されたタンパク質は、それ自身に対する強力な免疫応答を促進しないが、むしろインフルエンザ抗原に対する強力な免疫応答を促進する。抗原性融合タンパク質は、一部の実施形態では、それぞれの元のタンパク質に由来する機能的特性を保持する。
一部の実施形態は、インフルエンザウイルス感染を防止または処置する方法であって、本明細書に記載の任意のワクチンを対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｂ細胞応答を含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答とＢ細胞応答との両方を含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答を生じさせる方法は、ワクチンの単回投与を含む。一部の実施形態では、ワクチンは、皮内、筋肉内注射、皮下注射、鼻内接種、または経口投与によって対象に投与される。
一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドまたはその一部は、抗原としてインフルエンザ株の１つもしくは複数のポリペプチドまたはその断片をコードしてもよい。
１．本開示のｍＲＮＡワクチン
本開示は、一般に、ｍＲＮＡワクチンに関する。いくつかのｍＲＮＡワクチンプラットフォームが、先行技術において利用可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡの基本構造は、「成熟」真核ｍＲＮＡと非常に似ており、（ｉ）タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、（ｉｉ）それを挟む５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびに末端側に、（ｉｉｉ）７－メチルグアノシン５’キャップ構造および（ｉｖ）３’ポリ（Ａ）尾部を含む。非コード構造特色は、ｍＲＮＡの薬理作用に重要な役割を果たすものであり、それを個別に最適化して、ｍＲＮＡ安定性、翻訳効率（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、および免疫原性をモジュレートすることができる。修飾ヌクレオシドを組み入れることにより、「ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ」と称される、免疫賦活活性が低減したｍＲＮＡ転写物を作製することができ、したがって、改善された安全性プロファイルを得ることができる。さらに、修飾ヌクレオシドは、ＩＦＮ型によって誘導され、侵入するｍＲＮＡを分解するおよび阻害するようにプログラムされている直接抗ウイルス経路を回避することができるので、安定性および翻訳能が強力に増強されたｍＲＮＡワクチンを設計することが可能になる。例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡにおけるウリジンをシュードウリジンで置き換えることにより、ＲＮａｓｅ ＬによるｍＲＮＡ切断を調節する２’－５’オリゴアデニル酸シンテターゼの活性が低下する。さらに、ｍＲＮＡ翻訳プロセスの阻害に関連する酵素プロテインキナーゼＲの活性の低下が測定される。
修飾ヌクレオチドの組み入れに加えて、他の手法でも、ｍＲＮＡの翻訳能および安定性が増大することが検証されている。１つの例は、「配列が工学的に操作されたｍＲＮＡ」の開発である。その場合、ｍＲＮＡのＯＲＦおよびＵＴＲの配列最適化を、例えば、ＧＣ含量を富化させることによってまたは天然の長寿命ｍＲＮＡ分子のＵＴＲを選択することによって行うことにより、ｍＲＮＡ発現を強力に増大させることができる。別の手法は、「自己増幅性ｍＲＮＡ」構築物の設計である。これらは、大部分がアルファウイルスに由来するものであり、ウイルスレプリカーゼをコードする追加的なＯＲＦと共に目的の抗原によって置き換えられたＯＲＦを含有する。後者は、ｍＲＮＡの細胞内増幅を駆動するものであり、したがって、抗原発現能を有意に増大させることができる。
また、ｍＲＮＡの末端構造におけるいくつかの修飾が行われている。アンチリバースキャップ（ＡＲＣＡ）修飾は、５’末端における正しいキャップ方向性を確実にすることができ、これにより、ｍＲＮＡのほぼ全ての画分がリボソームに効率的に結合することができるようになる。他のキャップ修飾、例えば、ホスホロチオエートキャップアナログにより、真核生物翻訳開始因子４Ｅに対する親和性をさらに改善し、ＲＮＡキャップ除去複合体に対する抵抗性を増大させることができる。
逆に、ｍＲＮＡの構造を修飾することによって自然免疫応答を誘発するｍＲＮＡの効力をさらに改善することができるが、翻訳能を損ねることになる。ホスホロチオエート骨格を用いて、またはカチオン性タンパク質プロタミンを用いて沈降させることによってのいずれかでｍＲＮＡを安定化することにより、抗原発現は減弱される可能性があるが、より強力な免疫賦活能を得ることができる。
一態様では、本発明は、抗原としてインフルエンザ株の１つもしくは複数のポリペプチドまたはその断片をコードするｍＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物に関する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを含む。本開示において有用なｍＲＮＡは、典型的には、目的のポリペプチド（例えば、コード領域）をコードする連結されたヌクレオシドの第１の領域、第１の領域の５’末端に位置する第１のフランキング領域（例えば、５－ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域（例えば、３－ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’キャップ領域、および３’安定化領域を含む。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ポリＡ領域またはＫｏｚａｋ配列（例えば、５’－ＵＴＲ中の）をさらに含む。一部の場合、本開示のｍＲＮＡは、ポリヌクレオチドから切り出され得る１つまたは複数のイントロンヌクレオチド配列を含有してもよい。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。核酸の領域の任意の１つは、１つまたは複数の代替構成成分（例えば、代替ヌクレオシド）を含み得る。例えば、３’安定化領域が、Ｌ－ヌクレオシド、逆向きチミジン、もしくは２’－０－メチルヌクレオシドなどの代替ヌクレオシドを含み得る、ならびに／またはコード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、もしくはキャップ領域が、５置換ウリジン（例えば、５－メトキシウリジン）、１置換シュードウリジン（例えば、１－メチル－シュードウリジン）、および／もしくは５置換シチジン（例えば、５－メチル－シチジン）などの代替ヌクレオシドを含み得る。
本明細書に記載の組成物は、ｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）などの、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡは、例えば、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型」と称される、鋳型ＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３’ＵＴＲおよびポリＡ尾部をコードする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の特定の核酸配列組成および長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存するであろう。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない、開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち、５’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
好ましい実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号１を含む。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない、停止コドン（すなわち、翻訳の終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）からすぐ下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
好ましい実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号２を含む。
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））から始まり、停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続伸長物であり、ポリペプチドをコードする。
「ポリＡ尾部」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲから下流にある、例えば、すぐ下流にある（すなわち、３’側）ｍＲＮＡの領域である。ポリＡ尾部は、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含有してもよい。例えば、ポリＡ尾部は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００個のアデノシン一リン酸を含有してもよい。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的設定（例えば、細胞中、ｉｎ ｖｉｖｏ）では、ポリ（Ａ）尾部は、例えば、細胞質中での酵素的分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終結、ｍＲＮＡの核からの輸出および翻訳を補助する。
好ましい実施形態では、３’ポリアデニル化尾部は、配列番号３を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２００～３，０００個のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００個のヌクレオチドを含んでもよい。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、１つまたは複数のＲＮＡを含んでよく、１つまたは複数のＲＮＡ、脂質、およびその量は、特定のＮ：Ｐ比がもたらされるように選択することができる。組成物のＮ：Ｐ比は、１つまたは複数の脂質の窒素原子とＲＮＡのリン酸基の数のモル比を指す。一般に、低Ｎ：Ｐ比が好ましい。１つまたは複数のＲＮＡ、脂質、およびその量は、約２：１～約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比がもたらされるように選択することができる。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１から約８：１であり得る。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１から約８：１までである。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、または約７．０：１であってよい。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１であり得る。
本開示のｍＲＮＡは、標準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）のいずれかを含めた天然に存在する構成成分を１つまたは複数含み得る。一実施形態では、（ａ）５’ＵＴＲ、（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、（ｃ）３’ＵＴＲ、（ｄ）ポリＡ尾部、および（上記のａ、ｂ、ｃ、またはｄ）の任意の組合せを含むヌクレオチドの全てまたは実質的に全てが、天然に存在する標準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）を含む。
本開示のｍＲＮＡは、安定性の増大、および／またはポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含めた有用な特性を付与する本明細書に記載の代替構成成分を１つまたは複数含み得る。例えば、ｍｏｄＲＮＡは、ｍｏｄＲＮＡが導入される細胞において、対応する変更されていないｍＲＮＡと比べて分解の低減を示し得る。これらの代替種は、タンパク質産生の効率、ポリヌクレオチドの細胞内保持、および／または接触した細胞の生存率を増強し得る、ならびに低減した免疫原性を有し得る。
本開示のｍＲＮＡは、修飾された（例えば、変更されたまたは代替）核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはこれらの組合せを１つまたは複数含み得る。ＬＮＰに有用なｍＲＮＡは、例えば、核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間連結に対する（例えば、連結しているリン酸に対する／リン酸ジエステル連結に対する／リン酸ジエステル骨格に対する）任意の有用な修飾または変更を含み得る。ある特定の実施形態では、変更（例えば、１つまたは複数の変更）は、核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間連結のそれぞれに存在する。本開示による変更は、リボ核酸（ＲＮＡ）の変更、例えば、リボフラノシル環の２’－ＯＨの２’－Ｈへの置換、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッドであってよい。追加的な変更が本明細書に記載されている。
本開示のｍＲＮＡは、分子の全長に沿って均等に変更されていてもそうでなくてもよい。例えば、１つまたは複数または全ての型のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つもしくは複数もしくは全て）がｍＲＮＡにおいてまたはその所与の所定の配列領域において均等に変更されていてもそうでなくてもよい。一部の場合では、ｍＲＮＡ内（またはその所与の配列領域内）の全てのヌクレオチドＸが変更されており、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つであってよい、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃの組合せのいずれか１つであってよい。
種々の糖の変更および／またはヌクレオシド間連結（例えば、骨格構造）がポリヌクレオチド内の種々の位置に存在し得る。ヌクレオチドアナログまたは他の変更（複数可）は、ポリヌクレオチドの機能が実質的に低下しないポリヌクレオチドの任意の位置（複数可）に位置してよいことが当業者には理解されよう。変更は、５’末端または３’末端における変更であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’末端における変更を含む。ポリヌクレオチドは、約１％から約１００％まで（全体的なヌクレオチド含有量との関連で、またはヌクレオチドの１つもしくは複数の型、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵもしくはＣのいずれか１つもしくは複数との関連で）または間に入る任意のパーセンテージ（例えば、１％から２０％まで、１％から２５％まで、１％から５０％まで、１％から６０％まで、１％から７０％まで、１％から８０％まで、１％から９０％まで、１％から９５％まで、１０％から２０％まで、１０％から２５％まで、１０％から５０％まで、１０％から６０％まで、１０％から７０％まで、１０％から８０％まで、１０％から９０％まで、１０％から９５％まで、１０％から１００％まで、２０％から２５％まで、２０％から５０％まで、２０％から６０％まで、２０％から７０％まで、２０％から８０％まで、２０％から９０％まで、２０％から９５％まで、２０％から１００％まで、５０％から６０％まで、５０％から７０％まで、５０％から８０％まで、５０％から９０％まで、５０％から９５％まで、５０％から１００％まで、７０％から８０％まで、７０％から９０％まで、７０％から９５％まで、７０％から１００％まで、８０％から９０％まで、８０％から９５％まで、８０％から１００％まで、９０％から９５％まで、９０％から１００％まで、および９５％から１００％まで）の代替ヌクレオチドを含有し得る。標準ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣ）の存在が任意の残りのパーセンテージを占めることが理解されよう。
ポリヌクレオチドは、最低でゼロ、最大で１００％の代替ヌクレオチド、または間に入る任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の代替ヌクレオチド、少なくとも１０％の代替ヌクレオチド、少なくとも２５％の代替ヌクレオチド、少なくとも５０％の代替ヌクレオチド、少なくとも８０％の代替ヌクレオチド、または少なくとも９０％の代替ヌクレオチドを含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、代替ウラシルまたはシトシンなどの代替ピリミジンを含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド内のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が代替ウラシル（例えば、５置換ウラシル）で置き換えられている。代替ウラシルを単一の独特の構造を有する化合物で置き換えることができる、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つもしくはそれよりも多くの独特の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。一部の場合では、ポリヌクレオチド内のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が代替シトシン（例えば、５置換シトシン）で置き換えられている。代替シトシンを単一の独特の構造を有する化合物で置き換えることができる、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くの独特の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。
一部の場合では、核酸は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しないものである。誘導される自然免疫応答の特色としては、１）炎症促進性サイトカイン発現の増大、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終止または低減が挙げられる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１つまたは複数の代替ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。代替ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、代替核酸塩基を含み得る。核酸の核酸塩基は、プリンまたはピリミジンまたはその誘導体などの有機塩基である。核酸塩基は、標準塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）であってよい。これらの核酸塩基を変更するかまたは完全に置き換えて、特性が増強された、例えば、ヌクレアーゼに対する抵抗性などの安定性が増大したポリヌクレオチド分子をもたらすことができる。非標準または修飾塩基には、例えば、これだけに限定されないが、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、および／もしくはチオ置換を含めた１つもしくは複数の置換もしくは修飾、１つもしくは複数の縮合環もしくは開環、酸化、ならびに／または還元が含まれ得る。
一部の実施形態では、核酸塩基は代替ウラシルである。代替ウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、シュードウリジン（ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウラシル、６－アザ－ウラシル、２－チオ－５－アザ－ウラシル、２－チオ－ウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウラシル（ｓ４Ｕ）、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウラシル（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウラシル、５－ハロ－ウラシル（例えば、５－ヨード－ウラシルまたは５－ブロモ－ウラシル）、３－メチル－ウラシル（ｍＵ）、５－メトキシ－ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、ウラシル５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウラシル５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウラシル（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウラシル（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウラシルメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウラシル（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウラシル（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｎｍＶｕ）、５－メチルアミノメチル－ウラシル（ｍｎｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｍｎｍＶｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウラシル（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウラシル（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｃｍｎｍＶｕ）、５－プロピニル－ウラシル、１－プロピニル－シュードウラシル、５－タウリノメチル－ウラシル（ｘｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウラシル（ｘｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、５－メチル－ウラシル（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１－メチル－シュードウリジン（ｍＶ）、５－メチル－２－チオ－ウラシル（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ ｘｊ／）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ ＼｜／）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウラシル（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチル－ジヒドロウラシル（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウラシル、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウラシル、２－メトキシ－４－チオ－ウラシル、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐ Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウラシル（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウラシル（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’－０－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２－チオ－２’－０＿メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－０－メチル－ウリジン（ｍｅｍ Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－０－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－０－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－０－ジメチル－ウリジン（ｍ Ｕｍ）、および５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－０－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウラシル、デオキシチミジン、５－（２－カルボメトキシビニル）－ウラシル、５－（カルバモイルヒドロキシメチル）－ウラシル、５－カルバモイルメチル－２－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチル－２－チオ－ウラシル、５－シアノメチル－ウラシル、５－メトキシ－２－チオ－ウラシル、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）］ウラシルが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸塩基は、代替シトシンである。代替シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、５－アザ－シトシン、６－アザ－シトシン、シュードイソシチジン、３－メチル－シトシン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチル－シトシン（ａｃ４Ｃ）、５－ホルミル－シトシン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シトシン（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シトシン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シトシン（例えば、５－ヨード－シトシン）、５－ヒドロキシメチル－シトシン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シトシン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シトシン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シトシン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル１－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル１－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シトシン、２－メトキシ－５－メチル－シトシン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、５，２’－０－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－０－メチル－シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－０－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－０－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－０－トリメチル－シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１－チオ－シトシン、５－ヒドロキシ－シトシン、５－（３－アジドプロピル）－シトシン、および５－（２－アジドエチル）－シトシンが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸塩基は代替アデニンである。代替アデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデニン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル１－アデニン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデニン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデニン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデニン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－アセチル－アデニン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、Ｎ６，２’－０－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－０－トリメチル－アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’－０－ジメチル－アデノシン（ｍｌ Ａｍ）、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデニン、８－アジド－アデニン、Ｎ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデニン、２，８－ジメチル－アデニン、Ｎ６－ホルミル－アデニン、およびＮ６－ヒドロキシメチル－アデニンが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸塩基は代替グアニンである。代替グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍｉｌ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチル－ワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７－デアザ－グアニン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル－キューオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱＯ）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱｌ）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザ－グアニン、６－チオ－グアニン、６－チオ－７－デアザ－グアニン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアニン、７－メチル－グアニン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアニン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアニン、１－メチル－グアニン（ｍｌＧ）、Ｎ２－メチル－グアニン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアニン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアニン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアニン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソ－グアニン、７－メチル－８－オキソ－グアニン、１－メチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２－メチル－２’－０－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－０－メチル－グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１－メチル－２’－０－メチル－グアノシン（ｍｌＧｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－０－メチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－０－メチル－イノシン（Ｉｍ）、１，２’－０－ジメチル－イノシン（ｍｌｌｍ）、１－チオ－グアニン、およびＯ－６－メチル－グアニンが挙げられる。
ヌクレオチドの代替核酸塩基は、独立に、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログであってよい。例えば、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンの代替物であってよい。別の実施形態では、核酸塩基には、例えば、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ（例えば、８－ブロモ）、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、デアザグアニン、７－デアザグアニン、３－デアザグアニン、デアザアデニン、７－デアザアデニン、３－デアザアデニン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５－ａ］１，３，５トリアジノン、９－デアザプリン、イミダゾ［４，５－ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン、ピラジン－２－オン、１，２，４－トリアジン、ピリダジン；または１，３，５トリアジンを含めた、塩基の天然に存在するおよび合成の誘導体も含めることができる。ヌクレオチドが省略形Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを使用して示されている場合、各文字は、代表的な塩基および／またはその誘導体を指し、例えば、Ａは、アデニンまたはアデニンアナログ、例えば、７－デアザアデニンを含む。
ｍＲＮＡに５’キャップ構造を含めることができる。ポリヌクレオチドの５’キャップ構造は、核外移行およびポリヌクレオチド安定性の増大に関与し、ｍＲＮＡのキャップ結合性タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、それにより、ＣＢＰとポリＡ結合性タンパク質が会合して成熟環状ｍＲＮＡ種を形成することを通じて細胞におけるポリヌクレオチド安定性および翻訳コンピテンシーを担う。キャップは、さらに、ｍＲＮＡスプライシングの間の５’近位イントロンの除去を補助する。
内因性ポリヌクレオチド分子に、５’末端キャップ付加し、それにより、ポリヌクレオチドの末端グアノシンキャップ残基と５’末端の転写されたセンスヌクレオチドとの間に５’ｐｐｐ－５’三リン酸連結を生成することができる。次いで、この５’グアニル酸キャップをメチル化して、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成することができる。ポリヌクレオチドの５’末端の末端および／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）の転写されたヌクレオチドのリボース糖を２’－０－メチル化することもできる。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断によって５’キャップを除去することにより、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド分子を分解の標的とすることができる。
ポリヌクレオチドに対する変更により、キャップ除去を防止し、したがってポリヌクレオチド半減期を増大させる非加水分解性キャップ構造を生成することができる。キャップ構造の加水分解には５’－ｐｐｐ－５’ホスホジエステル連結の切断が必要であるので、キャップ付加反応の間に代替ヌクレオチドを使用することができる。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のＶａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅを、ａ－チオ－グアノシンヌクレオチドと共に製造者の指示に従って使用して、５’－ｐｐｐ－５’キャップにホスホロチオエート連結を創出することができる。
α－メチル－ホスホネートおよびセレノ－ホスフェートヌクレオチドなどの追加的な代替グアノシンヌクレオチドを使用することができる。追加的な変更として、これだけに限定されないが、ポリヌクレオチド（上記の通り）の５’末端および／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の、糖の２’－ヒドロキシ基における２’－０－メチル化が挙げられる。ｍＲＮＡ分子の５’キャップを生成するために複数の別個の５’キャップ構造を使用することができる。
キャップアナログは、本明細書では合成キャップアナログ、化学的キャップ、化学的キャップアナログ、または構造もしくは機能的キャップアナログとも称され、天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理的）５’キャップとは化学構造が異なるが、一方でキャップ機能は保持する。キャップアナログは、化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成する、および／ポリヌクレオチドに連結することができる。例えば、アンチリバースキャップアナログ（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結した２つのグアノシンを含有し、ここで、一方のグアノシンはＮ７－メチル基ならびに３’－０－メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７、３’－０－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ、これは３’０－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと同等に示され得る）。他方の変更されていないグアノシンの３’－０原子は、キャップ付加されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結するようになる。Ｎ７－および３’－０がメチル化されたグアノシンにより、キャップ付加されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分がもたらされる。別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシンに２’－０－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－０－ジメチル－グアノシン－５’三リン酸－５’グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログであってよい。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップアナログは、異なるリン酸位置においてボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基で修飾されたもの、例えば、そのキャップ構造が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５１９，１１０号に記載されているジヌクレオチドキャップアナログなどであってよい。
あるいは、キャップアナログは、当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換されたジヌクレオチドキャップアナログであってよい。Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換されたジヌクレオチドキャップアナログの非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログが挙げられる（例えば、そのキャップ構造が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｒｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０～４５７４に記載されている種々のキャップアナログおよびキャップアナログの合成方法を参照されたい）。他の場合では、本開示のポリヌクレオチドに有用なキャップアナログは、４－クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。
キャップアナログにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応において同時にポリヌクレオチドにキャップ付加することが可能になるが、転写物の２０％に至るまでがキャップ付加されないままになる。このこと、ならびにキャップアナログと内因性の細胞の転写機構によって産生されたポリヌクレオチドの内因性５’キャップ構造の構造的差異により、翻訳コンピテンシーの低下および細胞における安定性の低下が導かれる。
より真正に近い５’キャップ構造を生成するために、代替ポリヌクレオチドに、転写後に酵素を使用してキャップ付加することもできる。本明細書で使用される場合、「より真正に近い」という句は、内因性または野生型特色を、構造的にまたは機能的にのいずれかで密接に反映するまたは模倣する特色を指す。すなわち、「より真正に近い」特色は、内因性、野生型、天然のもしくは生理的な細胞機能および／もしくは構造を、合成特色もしくは先行技術のアナログと比較してより良好に表す、または１つもしくは複数の観点で、対応する内因性、野生型、天然の、もしくは生理的な特色を凌ぐものである。本開示のポリヌクレオチドに有用なより真正に近い５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野で公知の合成５’キャップ構造と比較して（または野生型、天然のもしくは生理的な５’キャップ構造と比較して）キャップ結合性タンパク質の結合性の増強、半減期の増大、５’エンドヌクレアーゼの影響の受けやすさの低減、および／または５’キャップ除去の低減を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’－０－メチルトランスフェラーゼ酵素により、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアノシンキャップヌクレオチドの間に標準５’－５’－三リン酸連結を創出することができ、ここで、キャップグアノシンはＮ７－メチル化を含有し、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは２’－０－メチルを含有する。そのような構造はキャップ１構造と称される。このキャップにより、例えば、当技術分野で公知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、高い翻訳コンピテンシー、細胞における安定性、および細胞における炎症促進性サイトカインの活性化の低下がもたらされる。他の例示的なキャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）、およびｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（キャップ４）が挙げられる。
代替ポリヌクレオチドに転写後にキャップ付加することができ、このプロセスはより効率的であるので、ｍＲＮＡのほぼ１００％にキャップ付加することができる。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の過程中にキャップアナログをポリヌクレオチドに連結すると－８０％になるのとは対照的である。５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップアナログを包含し得る。５’末端キャップは、グアノシンアナログを包含し得る。有用なグアノシンアナログとしては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンが挙げられる。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、修飾された５’キャップを含有する。５’キャップに対する修飾により、ポリヌクレオチドの安定性を増大させることができ、ポリヌクレオチドの半減期を増大させることができ、ポリヌクレオチド翻訳効率（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を上昇させることができる。修飾された５’キャップとしては、これだけに限定されないが、以下の修飾のうちの１つまたは複数を挙げることができる：キャップ付加されたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’および／または３’位における修飾、糖環酸素（炭素環式環を生じる）のメチレン部分（ＣＨ２）での置換え、キャップ構造の三リン酸橋部分における修飾、または核酸塩基（Ｇ）部分における修飾。
５’ＵＴＲをｍＲＮＡに隣接領域として提供することができる。５’ＵＴＲは、ポリヌクレオチドに見いだされるコード領域と相同であっても異種であってもよい。複数の５’ＵＴＲを隣接領域に含めることができ、それらの配列は同じであっても異なってもよい。いずれの部分にも行わないことを含め、隣接領域の任意の部分をコドン最適化することができ、いずれの部分も、独立に、コドン最適化の前および／または後に１種または複数種の異なる構造的または化学的変質を含有してよい。
一実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化法は、当業界で公知である。例えば、本明細書に提供されるいずれか１つまたは複数の配列のＯＲＦを、コドン最適化することができる。一部の実施形態では、コドン最適化を使用して、標的および宿主生物におけるコドン頻度を一致させて適切なフォールディングを確保する；ＧＣ含量を偏らせてｍＲＮＡの安定性を増大させるか、もしくは二次構造を減少させる；遺伝子構築もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンもしくはベースラン（ｂａｓｅ ｒｕｎ）を最小化する；転写および翻訳制御領域をカスタマイズする；タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去する；コードされたタンパク質中の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加する；タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフルする；制限部位を挿入するか、もしくは欠失させる；リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾する；タンパク質の種々のドメインを適切にフォールディングさせるために翻訳速度を調整する；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を減少させる、もしくは除去することができる。コドン最適化のツール、アルゴリズムおよびサービスは、当業界で公知である。非限定例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ Ｃａｌｉｆ．）からのサービスおよび／または特許で保護された方法が挙げられる。一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を、最適化アルゴリズムを使用して最適化する。ｍＲＮＡの１つまたは複数の特性を変更するために、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種である５’ＵＴＲを工学的に作製することができる。次いで、ｍＲＮＡを細胞、組織または生物体に投与することができ、タンパク質レベル、局在、および／または半減期などのアウトカムを測定して、異種５’ＵＴＲによりｍＲＮＡに対してもたらされた可能性がある有益な影響を評価することができる。Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含めた１つまたは複数のヌクレオチドが末端に対して付加または除去された５’ＵＴＲのバリアントを利用することができる。５’ＵＴＲも本明細書に記載の任意の様式でコドン最適化または変更することができる。
ｍＲＮＡは、例えば、これだけに限定されないが、ヒストンステムループなどのステムループを含み得る。ステムループは、約２５または約２６ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列であってよい。ヒストンステムループは、コード領域に対して３’側（例えば、コード領域の３’末端）に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの３’末端に位置し得る。一部の場合では、ｍＲＮＡは、１つよりも多くのステムループ（例えば、２つのステムループ）を含む。ステムループは、ポリヌクレオチドの第２の末端領域に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは、第２の末端領域の非翻訳領域（例えば、３’ＵＴＲ）内に位置し得る。一部の場合では、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡを、３’安定化領域（例えば、少なくとも１つの連鎖停止ヌクレオシド（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）を含む３’安定化領域）を付加することによって安定化することができる。理論に制約されることを望むものではなく、少なくとも１つの連鎖停止ヌクレオシドの付加により、ポリヌクレオチドの分解を緩徐化することができ、したがって、ポリヌクレオチドの半減期を増大させることができる。他の場合では、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡを、ポリヌクレオチドの３’領域に、オリゴ（Ｕ）の付加を防止および／または阻害することができる変更を加えることによって安定化することができる。さらに別の場合には、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡを、３’－デオキシヌクレオシド、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、３’－０－メチルヌクレオシド、３－０－エチルヌクレオシド、３’－アラビノシド、および他の当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載の代替ヌクレオシドで終止するオリゴヌクレオチドを付加することによって安定化することができる。一部の場合では、本開示のｍＲＮＡは、ヒストンステムループ、ポリＡ領域、および／または５’キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループは、ポリＡ領域の前および／または後にあってよい。ヒストンステムループおよびポリＡ領域配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載の連鎖終止ヌクレオシドを含み得る。他の場合では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループおよび５’キャップ構造を含み得る。５’キャップ構造としては、これだけに限定されないが、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知のものを挙げることができる。一部の場合では、保存されたステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列を含み得る。非限定的な例として、ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定的な例では、ステムループ領域は、ｍｉＲ－１２２シード配列を含み得る。
ｍＲＮＡは、少なくとも１つのヒストンステムループおよびポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ある特定の場合では、ヒストンステムループおよびポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、病原体抗原またはその断片をコードし得る。他の場合では、ヒストンステムループおよびポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードし得る。一部の場合では、ヒストンステムループおよびポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、腫瘍抗原またはその断片をコードし得る。他の場合では、ヒストンステムループおよびポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、アレルゲン抗原または自己免疫性自己抗原をコードし得る。
ｍＲＮＡは、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリＡ配列は、アデニンヌクレオチドまたはそのアナログもしくは誘導体の全体または大部分から構成され得る。ポリＡ配列は、核酸の３’非翻訳領域の隣に位置する尾部であり得る。ＲＮＡプロセシングの間に、アデノシンヌクレオチド（ポリＡ領域）の長鎖が通常はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加されて、分子の安定性が増大する。転写の直後に、転写物の３’末端が切断されて、３’－ヒドロキシが遊離する。次いで、ポリＡポリメラーゼによってアデノシンヌクレオチドの鎖がＲＮＡに付加される。ポリアデニル化と称されるこのプロセスでは、１００から２５０残基長の間のポリＡ領域が付加される。独特のポリＡ領域の長さにより、本開示の代替ポリヌクレオチドにある特定の利点をもたらすことができる。一般に、本開示のポリＡ領域の長さは、少なくとも３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、ポリＡ領域は、少なくとも３５ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。一部の場合では、ポリＡ領域は、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子上の８０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチドの長さであってよい。他の場合では、ポリＡ領域は、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子上の２０、４０、８０、１００、１２０、１４０または１６０ヌクレオチドの長さであってよい。一部の場合では、ポリＡ領域は、代替ポリヌクレオチド全体の長さと相対させて設計される。この設計は、代替ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなど）の特定の特色もしくは領域の長さに基づき得る、または代替ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づき得る。代替ポリヌクレオチドの任意の特色（例えば、ポリＡ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）と相対させる場合、ポリＡ領域は、追加的な特色よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長くてよい。ポリＡ領域を、それが属する代替ポリヌクレオチドに対する分率として設計することもできる。これに関連して、ポリＡ領域は、構築物の総長または構築物の総長からポリＡ領域を差し引いた長さの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。
ある特定の場合では、工学的に操作された結合性部位、および／またはポリＡ結合性タンパク質へのｍＲＮＡのコンジュゲーションを使用して、発現を増強することができる。工学的に操作された結合性部位は、ｍＲＮＡの局所的な微小環境のリガンドの結合性部位として作動し得るセンサー配列であってよい。非限定的な例として、ｍＲＮＡは、ポリＡ結合性タンパク質（ＰＡＢＰ）およびそのアナログの結合親和性を変更するために少なくとも１つの工学的に操作された結合性部位を含み得る。少なくとも１つの工学的に操作された結合性部位を組み入れることにより、ＰＡＢＰおよびそのアナログの結合親和性を増大させることができる。
さらに、ポリＡ領域の３’末端に代替ヌクレオチドを使用し、３’末端を通じて、複数の別個のｍＲＮＡをＰＡＢＰ（ポリＡ結合性タンパク質）に連結することができる。トランスフェクション実験を関連性のある細胞株において行うことができ、トランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日目の時点でタンパク質産生をＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。非限定的な例として、トランスフェクション実験を使用して、少なくとも１つの工学的に操作された結合性部位の付加の結果として、ＰＡＢＰまたはそのアナログの結合親和性に対する効果を評価することができる。ある特定の場合では、ポリＡ領域を使用して、翻訳開始をモジュレートすることができる。理論に制約されることを望むものではないが、ポリＡ領域によりＰＡＢＰが動員され、それが今度は翻訳開始複合体と相互作用し得、したがって、ポリＡ領域はタンパク質合成のために必須であり得る。一部の場合では、本開示において、ポリＡ領域を３’－５’エキソヌクレアーゼ消化からの保護のために使用することもできる。一部の場合では、ｍＲＮＡは、ポリＡ－Ｇ四重鎖を含み得る。Ｇ四重鎖は、４本のグアノシンヌクレオチドが環状水素結合したアレイであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方でＧリッチ配列によって形成され得る。この実施形態では、Ｇ四重鎖をポリＡ領域の最後に組み入れる。得られたｍＲＮＡを、安定性、タンパク質産生、および半減期を含めた他のパラメータについて様々な時点でアッセイすることができる。ポリＡ－Ｇ四重鎖により、１２０ヌクレオチドのポリＡ領域を単独で使用した場合に見られるタンパク質産生の少なくとも７５％と等価のタンパク質産生がもたらされることが発見されている。一部の場合では、ｍＲＮＡにポリＡ領域を含めることができ、また、３’安定化領域を付加することによって安定化することができる。ポリＡ領域を有するｍＲＮＡは、５’キャップ構造をさらに含み得る。他の場合では、ｍＲＮＡは、ポリＡ－Ｇ四重鎖を含み得る。ポリＡ－Ｇ四重鎖を有するｍＲＮＡは、５’キャップ構造をさらに含み得る。一部の場合では、ｍＲＮＡを安定化するために使用することができる３’安定化領域として、ポリＡ領域またはポリＡ－Ｇ四重鎖が挙げられる。他の場合では、本開示で使用することができる３’安定化領域として、連鎖停止ヌクレオシド（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）、例えば、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－デオキシウリジン、３’－デオキシシトシン、３’－デオキシグアノシン、３’－デオキシチミン、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’－ジデオキシアデノシン、２’，３’－ジデオキシウリジン、２’，３’－ジデオキシシトシン、２’、３’－ジデオキシグアノシン、２’，３’－ジデオキシチミンなど、２’－デオキシヌクレオシド、またはＯ－メチルヌクレオシドなどが挙げられる。他の場合では、ポリＡ領域またはポリＡ－Ｇ四重鎖を含むｍＲＮＡを、ポリヌクレオチドの３’領域に対する、オリゴ（Ｕ）の付加を防止および／または阻害することができる変更によって安定化することができる。さらに他の場合では、ポリＡ領域またはポリＡ－Ｇ四重鎖を含むｍＲＮＡを、３’－デオキシヌクレオシド、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド
３－Ｏ－メチルヌクレオシド、３’－Ｏ－エチルヌクレオシド、３’－アラビノシド、および他の当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載の代替ヌクレオシドで終止するオリゴヌクレオチドを付加することによって安定化することができる。
ある実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、脂質を含む。脂質とｍｏｄＲＮＡは、一緒になってナノ粒子を形成し得る。脂質にｍＲＮＡを封入して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態にし、ＲＮＡ／脂質ナノ粒子の細胞への進入および安定性を補助することができる。
脂質ナノ粒子は、脂質構成成分ならびに治療薬および／または予防薬などの１種または複数種の追加的な構成成分を含み得る。ＬＮＰを１つまたは複数の特定の適用または標的のために設計することができる。ＬＮＰの要素を、特定の適用もしくは標的に基づいて、および／または１つもしくは複数の要素の有効性、毒性、費用、使いやすさ、利用可能性、もしくは他の特色に基づいて選択することができる。同様に、特定の適用または標的のために、例えば、要素の特定の組合せの有効性および毒性に応じて、ＬＮＰの特定の製剤を選択することができる。ＬＮＰ製剤の有効性および忍容性は、製剤の安定性の影響を受ける可能性がある。
脂質ナノ粒子を１つまたは複数の特定の適用または標的のために設計することができる。例えば、ＬＮＰを、ＲＮＡなどの治療薬および／または予防薬を哺乳動物の体内の特定の細胞、組織、器官、または系またはこれらの群に送達されるように設計することができる。
特定の体の標的に対する選択性を増大させるために、脂質ナノ粒子の生理化学的特性を変更することができる。例えば、粒子サイズを異なる器官の開窓サイズに基づいて調整することができる。ＬＮＰに含まれる治療薬および／または予防薬はまた、所望の送達標的（１つまたは複数）に基づいて選択することもできる。例えば、治療薬および／または予防薬を、特定の適応症、状態、疾患、もしくは障害のために、および／または特定の細胞、組織、器官、もしくは系もしくはこれらの群への送達（例えば、限局的または特異的送達）のために選択することができる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することが可能な、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み得る。そのような組成物を、特定の器官に特異的に送達されるように設計することができる。一部の実施形態では、組成物を、哺乳動物の肝臓に特異的に送達されるように設計することができる。一部の実施形態では、組成物を、リンパ節に特異的に送達されるように設計することができる。一部の実施形態では、組成物を、哺乳動物の脾臓に特異的に送達されるように設計することができる。
ＬＮＰは、本明細書に記載の１種または複数種の構成成分を含み得る。一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ製剤は、少なくとも１種の脂質ナノ粒子構成成分を含む。脂質ナノ粒子は、脂質構成成分ならびに核酸などの治療薬および／または予防薬などの１種または複数種の追加的な構成成分を含み得る。ＬＮＰを１つまたは複数の特定の適用または標的のために設計することができる。ＬＮＰの要素を、特定の適用もしくは標的に基づいて、および／または１つもしくは複数の要素の有効性、毒性、費用、使いやすさ、利用可能性、もしくは他の特色に基づいて選択することができる。同様に、例えば、要素の特定の組合せの有効性および毒性に応じて、特定の適用または標的のために、ＬＮＰの特定の製剤を選択することができる。ＬＮＰ製剤の有効性および忍容性は、製剤の安定性の影響を受ける可能性がある。
一部の実施形態では、ＬＮＰの封入または部分的な封入のために、例えば、ポリマーを含めるおよび／または使用することができる。ポリマーは、生分解性かつ／または生体適合性のものであってよい。ポリマーは、これだけに限定されないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートから選択することができる。例えば、ポリマーとして、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＥＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＰＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステル
アミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などのポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）およびそれらの共重合体および混合物などのアクリル酸のポリマー、ポリジオキサノンおよびその共重合体、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、炭酸トリメチレン、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、およびポリグリセリンを挙げることができる。
表面改質剤としては、これだけに限定されないが、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性物質（例えば、ジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性物質）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、およびエルドステイン）、ならびにＤＮＡ分解酵素（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）を挙げることができる。表面改質剤をナノ粒子内および／またはＬＮＰの表面上（例えば、コーティング、吸着、共有結合性の連結、または他のプロセスによって）に配置することができる。
ＬＮＰは、１つまたは複数の官能化された脂質を含んでもよい。例えば、脂質を、適当な反応条件下でアジドに曝露すると、環化付加反応を受け得るアルキン基で官能化することができる。特に、脂質二重層を、膜透過、細胞認識、またはイメージングを容易にすることに関して有用な１種または複数種の基を使用し、この様式で官能化することができる。ＬＮＰの表面に１種または複数種の有用な抗体をコンジュゲートすることもできる。標的化細胞送達、イメージング、および膜透過に有用な官能基およびコンジュゲートは当技術分野で周知である。
これらの構成成分に加えて、脂質ナノ粒子は、医薬組成物に有用な任意の物質を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、例えば、これだけに限定されないが、１種または複数種の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、表面活性剤、緩衝剤、保存剤、および他の種などの１種または複数種の薬学的に許容できる賦形剤または副成分を含み得る。
表面活性剤および／または乳化剤としては、これだけに限定されないが、天然の乳化剤（例えば、アラビアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コレステロール、およびレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミタート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム、および／またはこれらの組合せを挙げることができる。
保存剤の例としては、これだけに限定されないが、抗酸化剤、キレート剤、遊離基スカベンジャー、抗菌性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール性保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤を挙げることができる。抗酸化剤の例としては、これだけに限定されないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが挙げられる。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌性保存剤の例としては、これだけに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられる。抗真菌性保存剤の例としては、これだけに限定されないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられる。アルコール性保存剤の例としては、これだけに限定されないが、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。酸性保存剤の例としては、これだけに限定されないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられる。他の保存剤としては、これだけに限定されないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられる。例示的なフリーラジカルスカベンジャーとしては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴもしくはブチルヒドロキシトルエン）またはデフェロキサミンが挙げられる。
緩衝剤の例としては、これだけに限定されないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水酸化カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウムの混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウムの混合物、トロメタミン、アミノ－スルホン酸緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張性生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、および／またはこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、ＬＮＰを含む製剤は、塩化物塩などの塩をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰを含む製剤は、二糖などの糖をさらに含み得る。一部の実施形態では、製剤は、糖をさらに含むが、塩化物塩などの塩は含まない。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ビタミン（例えば、ビタミンＡもしくはビタミンＥ）またはステロールなどの１種または複数種の小さな疎水性分子をさらに含み得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）ならびに多糖（例えば、グリコーゲンおよび誘導体およびそのアナログ）を含み得る。
ＬＮＰの特徴は、その構成成分に依存し得る。例えば、構造脂質としてコレステロールを含むＬＮＰは、異なる構造脂質を含むＬＮＰとは異なる特徴を有し得る。本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、ステロール部分を含有する脂質も指す。本明細書で定義される「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。一部の実施形態では、構造脂質はステロイドである。一部の実施形態では、構造脂質はコレステロールである。一部の実施形態では、構造脂質はコレステロールのアナログである。一部の実施形態では、構造脂質はアルファトコフェロールである。
一部の実施形態では、ＬＮＰの特徴は、その構成成分の絶対量または相対量に依存し得る。例えば、リン脂質を高モル濃度分率で含むＬＮＰは、リン脂質を低モル濃度分率で含むＬＮＰとは異なる特徴を有し得る。特性はまた、脂質ナノ粒子を調製する方法および条件に応じても変動し得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分および１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。特定のリン脂質により、膜との融合を容易にすることができる。一部の実施形態では、カチオン性リン脂質を膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負に荷電したリン脂質と相互作用させることができる。リン脂質の膜との融合により、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）を膜透過によって通過させること、例えば、１つまたは複数の要素を標的組織に送達することが可能になる。分枝、酸化、環化、およびアルキンを含めた修飾および置換を有する天然の種を含めた非天然リン脂質種も意図されている。一部の実施形態では、リン脂質を、１種または複数種のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能化するまたはそれと架橋させることができる。適当な反応条件下でアルキン基をアジドに曝露させると、銅により触媒される環化付加を受け得る。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を容易にするためにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化することに関して、またはナノ粒子組成物を標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）などの有用な構成成分とコンジュゲートすることに関して有用であり得る。リン脂質としては、これだけに限定されないが、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジル－エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジン酸などが挙げられる。リン脂質として、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質も挙げられる。一部の実施形態では、本発明において有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。
脂質ナノ粒子は、種々の方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡（例えば、透過型電子顕微鏡または走査電子顕微鏡）を使用して、ＬＮＰの形態およびサイズ分布を調査することができる。動的光散乱または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用してゼータ電位を測定することができる。動的光散乱を利用して粒子サイズを決定することもできる。複数のＬＮＰの特徴、例えば、粒子サイズ、多分散指数、およびゼータ電位などを測定するためにＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの機器を使用することもできる。
ＬＮＰの平均サイズは、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定して、数十ｎｍから数百ｎｍの間であり得る。例えば、平均サイズは、約４０ｎｍから約１５０ｎｍまで、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰの平均サイズは、約５０ｎｍから約１００ｎｍまで、約５０ｎｍから約９０ｎｍまで、約５０ｎｍから約８０ｎｍまで、約５０ｎｍから約７０ｎｍまで、約５０ｎｍから約６０ｎｍまで、約６０ｎｍから約１００ｎｍまで、約６０ｎｍから約９０ｎｍまで、約６０ｎｍから約８０ｎｍまで、約６０ｎｍから約７０ｎｍまで、約７０ｎｍから約１００ｎｍまで、約７０ｎｍから約９０ｎｍまで、約７０ｎｍから約８０ｎｍまで、約８０ｎｍから約１００ｎｍまで、約８０ｎｍから約９０ｎｍまで、または約９０ｎｍから約１００ｎｍまでであり得る。ある特定の実施形態では、ＬＮＰの平均サイズは、約７０ｎｍから約１００ｎｍまでであり得る。特定の実施形態では、平均サイズは、約８０ｎｍであり得る。他の実施形態では、平均サイズは、約１００ｎｍであり得る。
ＬＮＰは、比較的均一であり得る。多分散指数を使用して、ＬＮＰの均一性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すことができる。多分散指数が小さい（例えば、０．３未満である）ことにより、一般に、粒度分布が狭いことが示される。ＬＮＰの多分散指数は、約０から約０．２５まで、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５などであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０から約０．２０までであり得る。
ＬＮＰのゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位により、ＬＮＰの表面電荷を記述することができる。高度に荷電した種は体内の細胞、組織、および他の要素と望ましくなく相互作用する恐れがあるので、正または負の比較的低い電荷を有する脂質ナノ粒子が一般に望ましい。一部の実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶから約＋２０ｍＶまで、約－１０ｍＶから約＋１５ｍＶまで、約－１０ｍＶから約＋１０ｍＶまで、約－１０ｍＶから約＋５ｍＶまで、約－１０ｍＶから約０ｍＶまで、約－１０ｍＶから約－５ｍＶまで、約－５ｍＶから約＋２０ｍＶまで、約－５ｍＶから約＋１５ｍＶまで、約－５ｍＶから約＋１０ｍＶまで、約－５ｍＶから約＋５ｍＶまで、約－５ｍＶから約０ｍＶまで、約０ｍＶから約＋２０ｍＶまで、約０ｍＶから約＋１５ｍＶまで、約０ｍＶから約＋１０ｍＶまで、約０ｍＶから約＋５ｍＶまで、約＋５ｍＶから約＋２０ｍＶまで、約＋５ｍＶから約＋１５ｍＶまで、または約＋５ｍＶから約＋１０ｍＶまでであり得る。
治療薬および／または予防薬の封入の効率により、調製後にＬＮＰに封入されているまたは他のやり方で付随している治療薬および／または予防薬の量が記述される。封入効率は高い（例えば、１００％に近い）ことが望ましい。封入効率は、例えば、脂質ナノ粒子を含有する溶液中の治療薬および／または予防薬の量を脂質ナノ粒子を１種または複数種の有機溶媒または界面活性剤を用いて崩壊させる前と崩壊させた後で比較することによって測定することができる。蛍光を使用して、溶液中の遊離の治療薬および／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）を量することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子に関しては、治療薬および／または予防薬の封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
ＬＮＰは、任意選択により１つまたは複数のコーティングを含んでもよい。例えば、ＬＮＰを、コーティングを伴うカプセル剤、フィルム剤、または錠剤に製剤化することができる。本明細書に記載の組成物を含むカプセル剤、フィルム剤、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引っ張り強さ、硬度、または密度を有してよい。
両親媒性ポリマーおよび脂質ナノ粒子を含む製剤を全体的にまたは部分的に医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、１種または複数種の両親媒性ポリマーおよび１種または複数種の脂質ナノ粒子を含み得る。例えば、医薬組成物は、１種または複数種の両親媒性ポリマーならびに１種または複数種の異なる治療薬および／または予防薬を含む１種または複数種の脂質ナノ粒子を含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載のものなどの１種または複数種の薬学的に許容できる賦形剤または副成分をさらに含み得る。医薬組成物および薬剤の製剤および製造のための一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６において入手可能である。いずれかの従来の賦形剤または副成分が本開示の製剤中のＬＮＰの１種もしくは複数種の構成成分または１種もしくは複数種の両親媒性ポリマーと適合しない可能性がある場合を除く限りでは、従来の賦形剤および副成分を任意の医薬組成物に使用することができる。賦形剤または副成分と製剤のＬＮＰの構成成分または両親媒性ポリマーの組合せにより、何らかの望ましくない生物学的影響または他の有害作用がもたらされる恐れがある場合、その賦形剤または副成分は、製剤のＬＮＰの構成成分または両親媒性ポリマーと適合しない可能性がある。
一部の実施形態では、１種または複数種の賦形剤または副成分は、ＬＮＰを含む医薬組成物の総質量または体積の５０％よりも多くを構成し得る。例えば、１種または複数種の賦形剤または副成分は、医薬組成物の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも多くを構成し得る。一部の実施形態では、薬学的に許容できる賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトにおける使用および動物への使用について承認されたものである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されたものである。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際的薬局方の基準を満たすものである。本開示による医薬組成物中の１種または複数種の両親媒性ポリマー、１種または複数種の脂質ナノ粒子、１種または複数種の薬学的に許容できる賦形剤、および／または任意の追加的な成分の相対量は、治療を受ける対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて、また、組成物を投与する経路にさらに応じて、変動する。例として、医薬組成物は、０．１％から１００％（ｗｔ／ｗｔ）の間の１種または複数種の脂質ナノ粒子を含み得る。別の例として、医薬組成物は、０．１％から１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の間の１種または複数種の両親媒性ポリマー（例えば、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、または１２．５％ｗ／ｖ）を含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子および／または医薬組成物を貯蔵および／または輸送のために冷却または凍結させる（例えば、４℃以下の温度、例えば、約－１５０℃から約０℃の間の温度または約－８０℃から約－２０℃の間の温度（例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃で貯蔵する）。例えば、１種または複数種の両親媒性ポリマーおよび１種または複数種の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、貯蔵および／または輸送のために、例えば、約－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、または－８０℃に冷却される溶液または固体（例えば、凍結乾燥によるもの）である。ある特定の実施形態では、本開示は、有効量の両親媒性ポリマーを添加することによって、ならびに脂質ナノ粒子および／またはその医薬組成物を４℃以下の温度、例えば、約－１５０℃から約０℃の間の温度または約－８０℃から約－２０℃の間の温度、例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）で貯蔵することによって、脂質ナノ粒子の安定性を増大させる方法にも関する。
本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の化学的特性を種々の方法によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、逆相液体クロマトグラフィー）を使用してｍＲＮＡ完全性を調査することができる。
生成物の効能は、十分に無傷のＲＮＡ分子を必要とする、送達されるＲＮＡの発現に依存する。ＲＮＡの完全性は、無傷のＲＮＡを定量するＲＮＡの品質の尺度である。方法は、潜在的な分解産物を検出することもできる。ＲＮＡの完全性は、好ましくは、キャピラリーゲル電気泳動によって決定される。初期仕様は、製剤調製における十分なＲＮＡの完全性を確保するように設定される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の完全性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、約９５％の、またはそれより高い完全性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、約９８％の、またはそれより高い完全性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、約９９％の、またはそれより高い完全性を有する。
好ましい実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、臨床等級の純度を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの純度は、約６０％～約１００％である。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの純度は、約８０％～９９％である。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの純度は、約９０％～約９９％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、さらに精製することなく臨床等級の純度を有する。一部の実施形態では、臨床等級の純度は、接線流濾過（ＴＦＦ）精製を含む方法によって達成される。一部の実施形態では、臨床等級の純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、リガンドもしくは結合に基づく精製、および／またはイオン交換クロマトグラフィーから選択されるさらなる精製なしに達成される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを生産する方法は、長いアボーティブＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留溶媒および／または残留塩を除去する。一部の実施形態では、短いアボーティブ転写夾雑物は、１５塩基未満を含む。一部の実施形態では、短いアボーティブ転写夾雑物は、約８～１２塩基を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＲＮＡｓｅ阻害剤も除去する。
一部の実施形態では、精製されたＲＮＡポリヌクレオチドは、キャピラリー電気泳動によって決定した場合、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下のタンパク質夾雑物を含むか、またはタンパク質夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、精製されたＲＮＡポリヌクレオチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した場合、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の塩夾雑物を含むか、または塩夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、精製されたＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの公知の方法によって決定した場合、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下の短いアボーティブ転写夾雑物を含むか、または短いアボーティブ転写夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、精製されたＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、キャピラリー電気泳動などの公知の方法によって決定した場合、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の完全性を有する。
一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上である。
一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い。
一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴｘｏ％は、約１２カ月以上、約１５カ月以上、約１８カ月以上、約２１カ月以上、約２４カ月以上、約２７カ月以上、約３０カ月以上、約３３カ月以上、約３６カ月以上、約４８カ月以上、約６０カ月以上、約７２カ月以上、約８４カ月以上、約９６カ月以上、約１０８カ月以上、約１２０カ月以上である。
一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴｘｏ％は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴｘｏ％よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上長い。
一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、約１２カ月以上、約１５カ月以上、約１８カ月以上、約２１カ月以上、約２４カ月以上、約２７カ月以上、約３０カ月以上、約３３カ月以上、約３６カ月以上、約４８カ月以上、約６０カ月以上、約７２カ月以上、約８４カ月以上、約９６カ月以上、約１０８カ月以上、約１２０カ月以上である。
一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上長い。
本明細書で使用される場合、「Ｔｘ」は、ＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）がＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製のために使用された核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の最初の完全性の約Ｘまで低下するまでに続いた時間の量を指す。例えば、「Ｔ８ｏ％」は、ＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）がＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製のために使用された核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の最初の完全性の約８０％に低下するまでに続いた時間の量を指す。別の例として、「Ｔ１／２」は、ＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）がＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製のために使用された核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の最初の完全性の約１／２に低下するまでに続いた時間の量を指す。
脂質ナノ粒子は、脂質構成成分ならびに核酸などの治療薬および／または予防薬などの１種または複数種の追加的な構成成分を含み得る。ＬＮＰを１つまたは複数の特定の適用または標的のために設計することができる。ＬＮＰの要素を、特定の適用もしくは標的に基づいて、および／または１つもしくは複数の要素の有効性、毒性、費用、使いやすさ、利用可能性、もしくは他の特色に基づいて選択することができる。同様に、例えば、要素の特定の組合せの有効性および毒性に応じて、特定の適用または標的のために、ＬＮＰの特定の製剤を選択することができる。ＬＮＰ製剤の有効性および忍容性は、製剤の安定性の影響を受ける可能性がある。
ＬＮＰの脂質構成成分は、例えば、カチオン性脂質、リン脂質（例えば、不飽和脂質、例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなど）、ＰＥＧ脂質、および構造脂質を含み得る。脂質構成成分の要素を特定の分率で提供することができる。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、またはこれらの任意の組合せをさらに含む。本開示の方法に適したリン脂質、ＰＥＧ脂質、および構造脂質は本明細書にさらに開示される。
一部の実施形態では、ＬＮＰの脂質構成成分は、カチオン性脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質、および構造脂質を含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質構成成分は、ｍｏｌ％の総計が１００％を超えないという条件で、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％のリン脂質、約１８．５ｍｏｌ％～約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質構成成分は、約３５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％のカチオン性脂質の化合物、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の構造脂質、および約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、脂質構成成分は、約５０ｍｏｌ％の前記カチオン性脂質、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。別の実施形態では、脂質構成成分は、約４０ｍｏｌ％の前記カチオン性脂質、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態では、リン脂質は、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣであってよい。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－ＤＭＧであってよく、かつ／または構造脂質はコレステロールであってよい。
ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬の量は、脂質ナノ粒子のサイズ、組成物、所望の標的および／もしくは適用、または他の特性、ならびに治療薬および／または予防薬の特性に依存し得る。例えば、ＬＮＰに有用なＲＮＡの量は、ＲＮＡのサイズ、配列、および他の特徴に依存し得る。ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬（すなわち、医薬物質）および他の要素（例えば、脂質）の相対量も変動し得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ中の脂質構成成分と治療薬および／または予防薬のｗｔ／ｗｔ比は、約５：１から約６０：１まで、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、および６０：１であり得る。例えば、脂質構成成分と治療薬および／または予防薬のｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１から約４０：１までであり得る。ある特定の実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１である。ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬の量は、例えば、吸収分光分析（例えば、紫外線可視分光分析）を使用して測定することができる。
一部の実施形態では、イオン化脂質は、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2024517229000004
 またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”、またはＲ２およびＲ３からなる群から選択され、それらが付着している原子と一緒になって、複素環または炭素環式化合物を形成しており、Ｒ４は、水素、Ｃ３～６炭素環式化合物、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環式化合物、複素環、－ＯＲ、－０（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（０）０Ｒ、－０Ｃ（０）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（０）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（０）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒｅ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（０）２Ｒ８、－０（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－０Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）２Ｊ－Ｎ（Ｒ）Ｃ（０）０Ｒ、－Ｎ（０Ｒ）Ｃ（０）Ｒ、－Ｎ（０Ｒ）Ｓ（０）２Ｒ、－Ｎ（０Ｒ）Ｃ（０）０Ｒ、－Ｎ（０Ｒ）Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）０Ｒ、および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（０）０Ｒから選択され、各ｎは、独立に、１、２、３、４、および５から選択され、各Ｒ５は、独立に、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ６は、独立に、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、ＭおよびＭ’は、独立に、－Ｃ（０）０－、－ＯＣ（Ｏ）－、－０Ｃ（０）－Ｍ”－Ｃ（０）０－、－Ｃ（０）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（０）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（０）（０Ｒ’）０－、－Ｓ（０）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１～１３アルキルまたはＣ２～１３アルケニルであり、Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環式化合物および複素環からなる群から選択され、Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（０）２Ｒ、－Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環式化合物および複素環からなる群から選択され、各Ｒは、独立に、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ’は、独立に、Ｃ１～１２アルキル、Ｃ２～１２アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ”は、独立に、Ｃ３～１５アルキルおよびＣ３～１５アルケニルからなる群から選択され、各Ｒ＊は、独立に、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、各Ｙは、独立に、Ｃ３～６炭素環式化合物；各Ｘは、独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２の場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４もしくは５の場合にはＱは－Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２の場合にはＱは５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない。一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、
Figure 2024517229000005
 である。
一部の実施形態では、化合物は、以下の構造（Ｉ）：
Figure 2024517229000006
 またはその薬学的に許容できる塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体（式中、Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり、Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立に非置換Ｃ１～Ｃ１２アルキレンまたはＣ１～Ｃ１２アルケニレンであり、Ｇ３は、Ｃ１～Ｃ２４アルキレン、Ｃ１～Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルケニレンであり、Ｒａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立にＣ６～Ｃ２４アルキルまたはＣ６～Ｃ２４アルケニルであり、Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ５は、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、ｘは、０、１または２である）を有する。好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は、
Figure 2024517229000007
 である。
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などのポリエチレングリコールを含む１つまたは複数の分子を含み得る。そのような種は、その代わりに、ＰＥＧ化脂質とも称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物を含む非限定的な群から選択することができる。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、式（ＩＶ）：
Figure 2024517229000008
 （式中、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、１０個から３０個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖は、１つまたは複数のエステル結合によって中断されていてもよく、ｗは、３０から６０までにわたる平均値を有する）
を有するＰＥＧ脂質である。
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを、感染の有病率または満たされていない医学的必要性の程度もしくはレベルに応じて様々な設定で使用することができる。ＲＮＡワクチンを使用して、様々な遺伝子型、株、および単離物のインフルエンザウイルスを処置および／または防止することができる。ＲＮＡワクチンは、典型的には、それらが商業的に入手可能な抗ウイルス治療処置よりもはるかに大きい抗体価をもたらし、それよりも早く応答をもたらすという点で優れた特性を有する。理論によって束縛されることを望むものではないが、ｍＲＮＡポリヌクレオチドとしてのＲＮＡワクチンは、ＲＮＡワクチンが天然の細胞機構を取り入れているので、翻訳時に適切なタンパク質コンフォメーションをもたらすようにより良好に設計されると考えられる。ｅｘ ｖｉｖｏで製造され、望ましくない細胞応答を誘発し得る伝統的なワクチンと違って、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、より自然な様式で細胞系に提示される。
人々が１つより多い株のインフルエンザウイルスによる感染のリスクがある状況があり得る。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）治療ワクチンは、限定されるものではないが、製造の速度、認識された地理的脅威に適応させるためにワクチンを迅速に調整する能力などを含むいくつかの因子に起因して、混合ワクチン接種手法に特に適している。さらに、ワクチンはヒトの身体を利用して抗原性タンパク質を生産するため、ワクチンは、より大きく、より複雑な抗原性タンパク質の生産に適しており、ヒト対象における、適切なフォールディング、表面発現、抗原提示などを可能にする。１つより多い株のインフルエンザに対して保護するために、第１のインフルエンザウイルスまたは生物の少なくとも１つの抗原性ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含み、第２のインフルエンザウイルスまたは生物の少なくとも１つの抗原性ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡをさらに含む混合ワクチンを投与することができる。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を、例えば、単一の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で同時製剤化するか、または同時投与のために別々のＬＮＰ中で製剤化することができる。
本開示の一部の実施形態は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、インフルエンザに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルス（インフルエンザ）ワクチン（または組成物もしくは免疫原性組成物）を提供する。
一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＡ１、ＨＡ２と呼ばれる、ＨＡの規定の抗原性サブドメインの１つ、またはＨＡ１とＨＡ２との組合せ、ならびにノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチドである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＡ１および／またはＨＡ２に由来する抗原性配列を含むＨＡまたはその誘導体、ならびにＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチドである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＡ１および／またはＨＡ２に由来する抗原性配列を含むＨＡまたはその誘導体、ならびにＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２から選択される少なくとも２つの抗原性ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ワクチンは、インフルエンザウイルスタンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、複数のインフルエンザウイルスタンパク質、またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質、またはその免疫原性断片（例えば、少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、または両方の組合せ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質、またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、および／またはＨ１８のいずれか１つまたは任意のもしくは全部の組合せの、少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、または両方の組合せ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドならびにインフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択されるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質、またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、および／またはＨ１８の、少なくともいずれか１つまたは任意もしくは全部の組合せ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドならびにインフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される２つのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも２つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質、またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、および／またはＨ１８の、少なくともいずれか１つまたは任意もしくは全部の組合せ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドならびにインフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される３つのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも３つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質、またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、および／またはＨ１８の、少なくともいずれか１つまたは任意もしくは全部の組合せ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドならびにインフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される４つのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも４つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質、またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、および／またはＨ１８の、少なくともいずれか１つまたは任意もしくは全部の組合せ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドならびにインフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される５つのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも５つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、および／またはＨ１８の、少なくともいずれか１つまたは任意もしくは全部の組合せ）、インフルエンザウイルスから得られるＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片およびＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
本開示の一部の実施形態は、以下の新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列：Ｈ１ＨＡ１０－Ｆｏｌｄｏｎ＿ΔＮｇｌｙ１；Ｈ１ＨＡ１０ＴＭ－ＰＲ８（Ｈ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ ＨＡ）；Ｈ１ＨＡ１０－ＰＲ８－ＤＳ（Ｈ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ ＨＡ；ｐＨ１ＨＡ１０－Ｃａｌ０４－ＤＳ（Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ ＨＡ）；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４に由来するパンデミックＨ１ＨＡ１０；ｐＨ１ＨＡ１０－フェリチン；ＨＡ１０；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４に由来するパンデミックＨ１ＨＡ１０；フォールドンを有せず、三量体化のためのＫ６８Ｃ／Ｒ７６Ｃ突然変異を有するＣａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４株に由来するパンデミックＨ１ＨＡ１０；フォールドンを有せず、三量体化のためのＹ９４Ｄ／Ｎ９５Ｌ突然変異を有するＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株に由来するＨ１ＨＡ１０；フォールドンを有せず、三量体化のためのＫ６８Ｃ／Ｒ７６Ｃ突然変異を有するＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株に由来するＨ１ＨＡ１０；Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／８５０／２００９；Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５；Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）；Ｈ９Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９；Ｈ１０Ｎ８ Ａ／ＪＸ３４６／２０１３を提供する。
本開示の一部の実施形態は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドまたは上記の新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列の免疫原性断片（例えば、インフルエンザに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルス（インフルエンザ）ワクチンを提供する。一部の実施形態では、インフルエンザワクチンは、上記の新規インフルエンザウイルス配列のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を含む、７５％～１００％の任意の数）同一である改変された配列を含む少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。改変された配列は、上記の新規インフルエンザウイルス配列のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を含む、７５％～１００％の任意の数）同一であってもよい。
本開示の一部の実施形態は、上記の新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列をコードする配列を含む単離された核酸；該核酸を含む発現ベクター；および該核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示はまた、上記の新規インフルエンザウイルス配列のいずれかのポリペプチドを生産する方法も提供する。方法は、上記の新規インフルエンザウイルス配列の核酸発現を可能にする条件下、培地中で宿主細胞を培養すること、および培養された細胞または細胞の培地から、新規インフルエンザウイルスポリペプチドを精製することを含んでもよい。本開示はまた、新規インフルエンザウイルス配列に対する、完全長抗体および抗体誘導体を含む抗体分子も提供する。
一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのオープンリーディングフレームは、コドン最適化されている。一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドまたはその断片がコードされるオープンリーディングフレームは、コドン最適化されている。一部の実施形態は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むインフルエンザワクチンの使用であって、オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）が化学的修飾を有し、必要に応じて、ワクチンが脂質ナノ粒子中で製剤化されている、インフルエンザワクチンの使用を提供する。一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、化学的修飾を有する。一部の実施形態では、化学的修飾は、ウラシルの５位にある。一部の好ましい実施形態では、化学的修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。
一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、アジュバントをさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、細胞受容体に結合する少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス膜と細胞膜との融合を引き起こす少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染される細胞へのウイルスの結合を担う少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。
本開示の一部の実施形態は、脂質ナノ粒子内で製剤化された、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、少なくとも１つの５’末端キャップおよび少なくとも１つの化学的修飾を有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むワクチンを提供する。
一部の実施形態では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。一部の好ましい実施形態では、５’キャップは、
Figure 2024517229000009
 を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、５－メチルウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。一部の実施形態では、化学的修飾は、ウラシルの５位にある。一部の実施形態では、化学的修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。一部の実施形態では、化学的修飾は、Ｎ１－エチルシュードウリジンである。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質はイオン化可能カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノ酪酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、およびＮ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される。
本開示の一部の実施形態は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むワクチンであって、オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）が化学的修飾を有し、必要に応じて、ワクチンが脂質ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子はカチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む）中で製剤化されている、ワクチンを提供する。
一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、化学的修飾を有する。一部の実施形態では、化学的修飾は、ウラシルの５位にある。一部の実施形態では、化学的修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、ウラシルの５位にＮ１－メチルシュードウリジンを有する。
一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、少なくとも２つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０の抗原性ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、少なくとも１００の抗原性ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、１～１００の抗原性ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する、少なくとも２つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその抗原性断片をコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する、少なくとも５つまたは少なくとも１０のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する、少なくとも１００のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する、２～１００のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
また、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中で製剤化された前記段落のいずれか１つのインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンも、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、５０～２００ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２０～６０％のカチオン性脂質、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、２５～５５％のステロールおよび２５％の非カチオン性脂質のモル比を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質はイオン化可能カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、０．４未満（例えば、０．３、０．２または０．１未満）の多分散性値を有する。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する。
一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、多価である。
本開示の一部の実施形態は、対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、対象に、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量の本明細書に提供されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのいずれかを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、インフルエンザワクチンである。一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、インフルエンザワクチンの組合せを含む混合ワクチン（広域スペクトルインフルエンザワクチン）である。
一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。
一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答を生じさせる方法は、対象に、単回用量（ブースター用量なし）の本開示のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与することを含む。
一部の実施形態では、方法は、対象に、第２の（ブースター）用量のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与することをさらに含む。インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のさらなる用量を投与してもよい。
一部の実施形態では、対象は、第１の用量または第２の（ブースター）用量のワクチン後に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）の血清変換率を示す。血清変換は、特定の抗体が生じ、血液中で検出可能となる期間である。血清変換が起こった後、ウイルスを、抗体に関する血液検査において検出することができる。感染または免疫化の間に、抗原は血液に進入し、免疫系が応答して抗体を産生し始める。血清変換の前は、抗原自体は検出可能であっても、なくてもよいが、抗体は存在しないと考えられる。血清変換の間は、抗体は存在するが、まだ検出可能ではない。血清変換後はいつでも、抗体は血液中で検出可能であり、以前の、または現在の感染を示す。
一部の実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、皮内注射、筋肉内注射、または鼻内投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、筋肉内注射によって対象に投与される。
本開示の一部の実施形態は、対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、対象に、対象における抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示のいずれかのインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの対象への投与後に、抗体価（インフルエンザ抗原性ポリペプチドに結合する抗体の力価）についてアッセイすることによって、対象における抗原特異的免疫応答を決定することができる。一部の実施形態では、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ増加する。一部の実施形態では、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対照と比較して１～３ｌｏｇ増加する。
一部の実施形態では、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対象と比較して少なくとも２倍増加する。一部の実施形態では、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも５倍増加する。一部の実施形態では、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも１０倍増加する。一部の実施形態では、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対照と比較して２～１０倍増加する。
一部の実施形態では、対照は、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与されたことがない対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価である。一部の実施形態では、対照は、弱毒化生または不活化インフルエンザを投与された対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価であるか、または対照は、組換えもしくは精製インフルエンザタンパク質ワクチンを投与された対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価である。一部の実施形態では、対照は、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンを投与された対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価である。
本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、有効量（免疫応答を誘導するのに有効な量）で対象に投与される。一部の実施形態では、有効量は、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準治療用量の２分の１以下、４分の１以下、１０分の１以下、１００分の１以下、１０００分の１以下への減少と同等の用量であり、その場合、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、標準治療用量の組換えインフルエンザタンパク質ワクチン、精製インフルエンザタンパク質ワクチン、弱毒化生インフルエンザワクチン、不活化インフルエンザワクチン、またはインフルエンザＶＬＰワクチンを投与された対照となる対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価と同等である。一部の実施形態では、有効量は、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準治療用量の２～１０００分の１への減少と同等の用量であり、その場合、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、標準治療用量の組換えインフルエンザタンパク質ワクチン、精製インフルエンザタンパク質ワクチン、弱毒化生インフルエンザワクチン、不活化インフルエンザワクチン、またはインフルエンザＶＬＰワクチンを投与された対照となる対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価と同等である。
一部の実施形態では、対照は、インフルエンザの構造タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンを投与された対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価である。
一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、対象における抗原特異的免疫応答を生じさせるための有効量で製剤化されている。
一部の実施形態では、有効量は、２５μｇ～１０００μｇ、または５０μｇ～１０００μｇの合計用量である。一部の実施形態では、有効量は、１００μｇの合計用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計２回、対象に投与される２５μｇの用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計２回、対象に投与される１００μｇの用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計２回、対象に投与される４００μｇの用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計２回、対象に投与される５００μｇの用量である。
一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの効能（または有効性）は、６０％よりも高い。一部の実施形態では、ワクチンのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチド。
ワクチン効能を、標準的な分析を使用して評価することができる。例えば、ワクチン効能を、二重盲検、無作為化、臨床対照治験によって測定することができる。ワクチン効能を、ワクチン非接種（ＡＲＵ）試験コホートと、ワクチン接種（ＡＲＶ）試験コホートとの間の疾患発生率（ＡＲ）の比例的減少として表すことができ、以下の式を使用してワクチン接種群内の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出することができる：
効能＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵｘ１００；および効能＝（１－ＲＲ）ｘ１００。
同様に、ワクチン有効性を、標準的な分析を使用して評価することができる。ワクチン有効性は、ワクチン（高いワクチン効能を有することが既に証明されていてもよい）が集団中の疾患をどれぐらい低減させるかの評価である。この尺度は、対照臨床治験よりも自然界の条件下で、ワクチン自体だけでなく、ワクチン接種プログラムの利益と有害効果との正味のバランスを評価することができる。ワクチン有効性は、ワクチン効能（効力）と比例するが、集団中の標的群がどれぐらいよく免疫されているか、ならびに入院、外来訪問、または費用の「現実世界」の結果に影響する他のワクチンとは関連しない因子によっても影響される。例えば、感染症例のセットと、適切な対照との間のワクチン接種率を比較する後ろ向き症例対照分析を使用することができる。ワクチン有効性を、ワクチン接種にも拘わらず感染を発症することに関するオッズ比（ＯＲ）を使用して、率差として表すことができる：有効性＝（１－ＯＲ）ｘ１００。一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの効能（または有効性）は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％である。
一部の実施形態では、ワクチンは、最大で２年間にわたってインフルエンザに対して対象を免疫する。一部の実施形態では、ワクチンは、２年を超えて、３年を超えて、４年を超えて、または５～１０年にわたって、インフルエンザに対して対象を免疫する。
一部の実施形態では、対象は、約５歳以下である。例えば、対象は、約１歳～約５歳（例えば、約１、２、３、５もしくは５歳）、または約６カ月齢～約１歳（例えば、約６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月齢）であってもよい。一部の実施形態では、対象は、約１２カ月齢以下（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２カ月齢または１カ月齢）である。一部の実施形態では、対象は、約６カ月齢以下である。
一部の実施形態では、対象は、正期（例えば、約３７～４２週）で産まれた。一部の実施形態では、対象は、未熟児として、例えば、妊娠約３６週以前（例えば、約３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６または２５週）で産まれた。例えば、対象は、妊娠約３２週以前に産まれていてもよい。一部の実施形態では、対象は、妊娠約３２週～約３６週で未熟児として産まれた。そのような対象では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを、人生のより後で、例えば、約６カ月齢～約５歳以上で投与してもよい。
一部の実施形態では、対象は、約２０歳～約５０歳（例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０歳）の若年成人である。
一部の実施形態では、対象は、約６０歳、約７０歳以上（例えば、約６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０歳）の高齢対象である。
一部の実施形態では、対象は、インフルエンザ（例えば、クラミジア・トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））に曝露されたことがある；対象は、インフルエンザ（例えば、クラミジア・トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））に感染している；または対象は、インフルエンザ（例えば、クラミジア・トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））による感染のリスクがある。
一部の実施形態では、対象は、ベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に曝露されたことがある；対象は、ベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染している；または対象は、ベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染のリスクがある。
一部の実施形態では、対象は、例えば、ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、ＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡ－１２７３ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、およびＪａｎｓｓｅｎのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのいずれか１つから選択されるベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する少なくとも１用量の免疫原性組成物を受けたことがある；対象は、ベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する少なくとも２用量の免疫原性組成物を受けたことがある；対象は、例えば、ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、ＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡ－１２７３ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、およびＪａｎｓｓｅｎのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのいずれか１つから選択されるベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する少なくとも１用量の免疫原性組成物を受けている；またはベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染のリスクがある対象は、本明細書に開示されるインフルエンザに対する免疫原性組成物のいずれか１つに付随して、同時に、またはその１２～４８時間以内に、例えば、ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、ＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡ－１２７３ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、およびＪａｎｓｓｅｎのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのいずれか１つから選択されるベータコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物を投与されている。
一部の実施形態では、対象は、免疫無防備状態である（損傷した免疫系を有する、例えば、免疫障害または自己免疫障害を有する）。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸ワクチンは、化学的に修飾されている。他の実施形態では、核酸ワクチンは、修飾されていない。
さらに他の態様は、対象にワクチン接種するための組成物および方法であって、対象に、第１のウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを投与することを含み、ＲＮＡポリヌクレオチドが安定化エレメントを含まず、アジュバントがワクチンと共に同時製剤化または同時投与されない、組成物および方法を提供する。
他の態様では、本発明は、対象にワクチン接種するための組成物または方法であって、対象に、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを投与することを含み、１０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの投与量の核酸ワクチンが対象に投与される、組成物または方法である。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの投与量は、用量あたり、１～５μｇ、５～１０μｇ、１０～１５μｇ、１５～２０μｇ、１０～２５μg、２０～２５μｇ、２０～５０μｇ、３０～５０μｇ、４０～５０μｇ、４０～６０μｇ、６０～８０μｇ、６０～１００μｇ、５０～１００μｇ、８０～１２０μｇ、４０～１２０μｇ、４０～１５０μｇ、５０～１５０μｇ、５０～２００μｇ、８０～２００μｇ、１００～２００μｇ、１２０～２５０μｇ、１５０～２５０μｇ、１８０～２８０μｇ、２００～３００μｇ、５０～３００μｇ、８０～３００μｇ、１００～３００μｇ、４０～３００μｇ、５０～３５０μｇ、１００～３５０μｇ、２００～３５０μｇ、３００～３５０μｇ、３２０～４００μｇ、４０～３８０μｇ、４０～１００μｇ、１００～４００μｇ、２００～４００μｇ、または３００～４００μｇである。一部の実施形態では、核酸ワクチンは、皮内または筋肉内注射によって対象に投与される。一部の実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。一部の実施形態では、第２の用量の核酸ワクチンは、２１日目に対象に投与される。
一部の実施形態では、２５マイクログラムの投与量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。一部の実施形態では、１００マイクログラムの投与量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。一部の実施形態では、５０マイクログラムの投与量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。一部の実施形態では、７５マイクログラムの投与量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。一部の実施形態では、１５０マイクログラムの投与量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。一部の実施形態では、４００マイクログラムの投与量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。一部の実施形態では、２００マイクログラムの投与量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節に１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されており、他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されていない。
本開示の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドであって、安定化エレメントを含まないＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む核酸ワクチンであって、アジュバントがワクチンに含まれない、核酸ワクチンを提供する。一部の実施形態では、安定化エレメントは、ヒストンステムループである。一部の実施形態では、安定化エレメントは、野生型配列と比較してＧＣ含量が増加した核酸配列である。
本開示の態様は、許容されるパーセンテージのヒト対象について第１の抗原に対するセロプロテクションの基準より優れた抗体価を付与する、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが宿主へのｉｎ ｖｉｖｏでの投与のための製剤中に存在する、核酸ワクチンを提供する。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンによってもたらされる抗体価は、中和抗体価である。一部の実施形態では、中和抗体価は、タンパク質ワクチンよりも高い。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンによってもたらされる中和抗体価は、アジュバント化タンパク質ワクチンよりも高い。さらに他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンによってもたらされる中和抗体価は、１，０００～１０，０００、１，２００～１０，０００、１，４００～１０，０００、１，５００～１０，０００、１，０００～５，０００、１，０００～４，０００、１，８００～１０，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～５，０００、２，０００～３，０００、２，０００～４，０００、３，０００～５，０００、３，０００～４，０００、または２，０００～２，５００である。中和力価は、一般には、プラーク数の５０％減少を実現するために必要な最も高い血清希釈度として表される。
また、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、安定化エレメントを有するか、またはアジュバントと共に製剤化され、第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって引き出される抗体価よりも長く続く高い抗体価を引き出すために、ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏでの投与のための製剤中に存在する、核酸ワクチンも提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単回投与の１週間以内に中和抗体を産生するように製剤化されている。一部の実施形態では、アジュバントは、カチオン性ペプチドおよび免疫刺激性核酸から選択される。一部の実施形態では、カチオン性ペプチドは、プロタミンである。
態様は、少なくとも１つの化学的修飾を含むか、または修飾ヌクレオチドを含まなくてもよく、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、宿主中での抗原発現のレベルが、安定化エレメントを有するか、またはアジュバントと共に製剤化され、第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによってもたらされる抗原発現のレベルを大きく超えるように、ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏでの投与のための製剤中に存在する、核酸ワクチンを提供する。
他の態様は、少なくとも１つの化学的修飾を含むか、または修飾ヌクレオチドを含まなくてもよく、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、ワクチンが、同等の抗体価をもたらすために非修飾ｍＲＮＡワクチンにとって必要とされるものの１０分の１以下のＲＮＡポリヌクレオチドを有する、核酸ワクチンを提供する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの投与量中に存在する。
本開示の態様はまた、ヒト対象への送達のために製剤化された、少なくとも１つの化学的修飾を含むか、または修飾ヌクレオチドを含まなくてもよく、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する、１０μｇ～４００μｇの１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、使用ワクチンのユニットも提供する。一部の実施形態では、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
本開示の態様は、個体または個体の集団におけるウイルス株に対する抗原記憶を作出する、維持する、または回復させる方法であって、前記個体または集団に、（ａ）少なくとも１つの化学的修飾を含むか、または修飾ヌクレオチドを含まなくてもよく、参照抗原性ポリペプチドのセットをコードする、２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｂ）場合により、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与、および皮下投与からなる群から選択される経路によって個体に投与される。一部の実施形態では、投与ステップは、対象の筋肉組織と、組成物の注射にとって好適なデバイスとを接触させることを含む。一部の実施形態では、投与ステップは、電気穿孔と共に、対象の筋肉組織と、組成物の注射にとって好適なデバイスとを接触させることを含む。
一部の態様では、対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法が提供される。方法は、対象に、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量のインフルエンザＲＮＡ組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答を生じさせる方法は、ワクチンの単回投与を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、ブースター用量のワクチンを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ワクチンは、皮内または筋肉内注射によって対象に投与される。
本開示の態様は、対象にワクチン接種する方法であって、対象にワクチン接種するのに有効な量の第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの２５μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの単回投与量を対象に投与することを含む方法を提供する。
他の態様は、少なくとも１つの化学的修飾を含み、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、ワクチンが、同等の抗体価をもたらすために非修飾ｍＲＮＡワクチンにとって必要とされるものの１０分の１以下のＲＮＡポリヌクレオチドを有する、核酸ワクチンを提供する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの投与量中に存在する。
他の態様は、ヌクレオチド修飾を含まず（非修飾）、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＬＮＰ製剤化されたＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、ワクチンが、同等の抗体価をもたらすためにＬＮＰ中で製剤化されていない非修飾ｍＲＮＡワクチンにとって必要とされるものの１０分の１以下のＲＮＡポリヌクレオチドを有する、核酸ワクチンを提供する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの投与量中に存在する。
実施例に提示されるデータは、本開示の製剤を使用した免疫応答の有意な増強を示す。化学的に修飾されたＲＮＡワクチンと非修飾ＲＮＡワクチンとの両方が、本発明に従って有用である。驚くべきことに、ワクチンを生産するために担体中で製剤化された化学的に修飾されていないｍＲＮＡを使用することが好ましいという先行技術の報告とは対照的に、化学的に修飾されたｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンが非修飾ｍＲＮＡよりもはるかに少ない有効ｍＲＮＡ用量、すなわち、ＬＮＰ以外の担体中で製剤化された場合の非修飾ｍＲＮＡの１０分の１を必要としたことが本明細書に記載される。本開示の化学的に修飾されたＲＮＡワクチンと非修飾ＲＮＡワクチンとは両方とも、異なる脂質担体中で製剤化されたｍＲＮＡワクチンよりも良好な免疫応答をもたらす。
他の態様では、本発明は、６０歳以上の高齢対象を処置する方法であって、対象にワクチン接種するのに有効な量のウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含む方法を包含する。
他の態様では、本発明は、１７歳以下の若年対象を処置する方法であって、対象にワクチン接種するのに有効な量のウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含む方法を包含する。
他の態様では、本発明は、成人対象を処置する方法であって、対象にワクチン接種するのに有効な量のウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含む方法を包含する。
一部の態様では、本発明は、抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む混合ワクチンを対象にワクチン接種する方法であって、ワクチンの投与量が、抗原をコードするそれぞれ個々の核酸の投与量が治療投与量未満である混合治療投与量である方法である。一部の実施形態では、混合投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、混合投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、混合投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、混合投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、混合投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、混合投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。
好ましい態様では、本開示のワクチン（例えば、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡワクチン）は、ワクチン接種された対象の血液または血清中で、予防および／または治療有効レベル、濃度および／または力価の抗原特異的抗体を産生する。本明細書で定義される場合、抗体価という用語は、対象、例えば、ヒト対象中で産生される抗原特異的抗体の量を指す。例示的な実施形態では、抗体価は、依然として陽性の結果を与える最大希釈率（連続希釈液中の）の逆数として表される。例示的な実施形態では、抗体価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体価を中和アッセイによって、例えばマイクロ中和アッセイによって決定または測定する。ある特定の態様では、抗体価測定値を、例えば１：４０、１：１００など、比として表す。
本開示の例示的な実施形態では、効果的なワクチンでは、１：４０を超える、１：１００を超える、１：４００を超える、１：１０００を超える、１：２０００を超える、１：３０００を超える、１：４０００を超える、１：５００を超える、１：６０００を超える、１：７５００を超える、１：１００００を超える抗体価が生じる。例示的な実施形態では、ワクチン接種の１０日後までに、ワクチン接種の２０日後までに、ワクチン接種の３０日後までに、ワクチン接種の４０日後までに、またはワクチン接種の５０日後またはそれ以後までに当該抗体価が生じるまたはそれに達する。例示的な実施形態では、対象にワクチンの単回投薬を施行後に当該力価が生じるまたはそれに達する。他の実施形態では、複数回投薬後、例えば、１回目および２回目の投薬（例えば、ブースター投薬）後に当該力価が生じるまたはそれに達する。本開示の例示的な態様では、抗原特異的抗体は、μｇ／ｍｌの単位で測定されるか、またはＩＵ／Ｌ（１リットルあたりの国際単位）もしくはｍＩＵ／ｍｌ（１ｍｌあたりのミリ国際単位）の単位で測定される。本開示の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌを超えて産生する。本開示の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、１０ｍＩＵ／ｍｌ、２０ｍＩＵ／ｍｌ、５０ｍＩＵ／ｍｌ、１００ｍＩＵ／ｍｌ、２００ｍＩＵ／ｍｌ、５００ｍＩＵ／ｍｌまたは１０００ｍＩＵ／ｍｌを超えて産生する。例示的な実施形態では、ワクチン接種の１０日後までに、ワクチン接種の２０日後までに、ワクチン接種の３０日後までに、ワクチン接種の４０日後までに、またはワクチン接種の５０日後またはそれ以後までに抗体レベルまたは濃度が生じる、またはそれに達する。例示的な実施形態では、対象にワクチンの単回投薬を施行後に当該レベルまたは濃度が産生されるまたはそれに達する。他の実施形態では、複数回投薬後、例えば、１回目の投薬および２回目の投薬（例えば、ブースター投薬）後に当該レベルまたは濃度が産生されるまたはそれに達する。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは濃度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定する。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは濃度を中和アッセイによって、例えばマイクロ中和アッセイによって決定または測定する。
（実施例１）
製剤組成物
製剤組成物は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ２０２１／２０２２ヘマグルチニンを標的とするインフルエンザｍｏｄＲＮＡ製剤原料である。
Figure 2024517229000010
一部の実施形態では、１つの脂質ナノ粒子に封入された、ＨＡをコードするｍＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物は、一価であり、１μｇのｍＲＮＡ、２μｇのＲＮＡ、５μｇのＲＮＡ、および２０μｇのＲＮＡのうちのいずれか１つから選択される用量を有する。
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、１つの脂質ナノ粒子に封入された、ＨＡをコードするｍＲＮＡ分子、第２の脂質ナノ粒子に封入された、ＨＡをコードするｍＲＮＡ分子、第３の脂質ナノ粒子に封入された、ＮＡをコードするｍＲＮＡ分子、および第４の脂質ナノ粒子に封入された、ＮＡをコードするｍＲＮＡ分子を含み、合計用量は最大で２０μｇのＲＮＡである。
一部の実施形態では、対象は、３０～５０歳の年齢である。
（実施例２）
出荷および容器閉鎖情報
製剤は、ドライアイス上で凍結されて出荷される。一次容器閉鎖は、１３ｍｍのストッパーを有する２ｍＬのガラス製１型バイアルである。製剤は、－６０～－９０℃で保存するべきである。
（実施例３）
剤形
ＰＦ－０７２５２２２０インフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物候補は、それぞれ、ｍＲＮＡの異なる構築物を組み込む、２つの一価型および１つの四価型から選択される、３つの異なる剤形の１つを含む。
ｍｏｄＲＮＡの４つの構築物：
・ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｍｏｄＲＮＡ（Ｗｉｓｃ２０１９ ＨＡ）
・ Ｐｈｕｋｅｔ ｍｏｄＲＮＡ（Ｐｈｕｋ２０１３ ＨＡ）
・ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｍｏｄＲＮＡ（Ｗａｓｈ２０１９ ＨＡ）
・ Ｃａｍｂｏｄｉａ ｍｏｄＲＮＡ（Ｃａｍｂ２０２０ ＨＡ）
したがって、２つの一価免疫原性組成物（製剤（ＤＰ）とも本明細書では称される）および１つの四価免疫原性組成物が存在する。
１．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｍｏｄＲＮＡを含む一価
２．Ｐｈｕｋｅｔ ｍｏｄＲＮＡを含む一価
３．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｍｏｄＲＮＡ、Ｐｈｕｋｅｔ ｍｏｄＲＮＡ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｍｏｄＲＮＡ、およびＣａｍｂｏｄｉａ ｍｏｄＲＮＡを含む四価
免疫原性組成物は、クロロブチルゴムストッパーおよびフリップオフプラスチックキャップを有するアルミニウムシールで密閉された２ｍＬのガラスバイアル（名目体積０．３ｍＬ）中で供給される。
４．２．免疫原性組成物の成分
免疫原性組成物は、標的細胞へのウイルス結合および細胞進入を媒介するのを担う、株特異的な完全長のコドン最適化されたＨＡエンベロープをコードするｍｏｄＲＮＡを含む。
免疫原性組成物は、ＩＭ投与のための水性凍結保護緩衝剤中の、ＬＮＰの保存剤を含まない、滅菌分散体である。免疫原性組成物は、０．５ｍＬ／バイアル充填体積、および０．３ｍＬの名目体積を有する単回投与バイアルとして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝剤、３００ｍＭショ糖、ｐＨ７．４中の０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡで製剤化されている。
４．２．１．製剤原料
製剤原料中の、特定の構築物（すなわち、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｍｏｄＲＮＡ［Ｗｉｓｃ２０１９ ＨＡ］およびＰｈｕｋｅｔ ｍｏｄＲＮＡ［Ｐｈｕｋ２０１３ ＨＡ］）または構築物（４価：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｍｏｄＲＮＡ、Ｐｈｕｋｅｔ ｍｏｄＲＮＡ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｍｏｄＲＮＡ、およびＣａｍｂｏｄｉａ ｍｏｄＲＮＡ）（ｍｏｄＲＮＡ）が、ＤＰ中の唯一の活性成分である。製剤原料は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中で製剤化され、ＨＤＰＥボトルＥＶＡ可撓性容器中で２０±５℃で保存される。
抗原をコードするコドン最適化された配列に加えて、ＲＮＡは、高いＲＮＡ安定性および翻訳効率を媒介するために最適化された共通の構造エレメント（５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部；以下の表および配列を参照されたい）を含有する。さらに、内在性シグナルペプチド（ｓｅｃ）は、オープンリーディングフレームの一部であり、Ｎ末端ペプチドとして翻訳される。ＲＮＡは、ウリジンを含有しない；ウリジンの代わりに、修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンがＲＮＡ合成において使用される。
特定の構築物は、それぞれ、以下のエレメントを含む：
キャップ１構造を含有するＲＮＡの生産のための５’キャップアナログ（ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧ）が以下に示される。
Figure 2024517229000011
キャップ１構造（すなわち、ＲＮＡ鎖の５’末端の最後から２番目のヌクレオシド上に２’－Ｏ－メチル基を含有する）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写の間にそれぞれのキャップアナログを使用することによって製剤原料中に組み込まれる。キャップ１はＩＦＩＴ１などの細胞因子によって認識されず、かくして、キャップ１依存的翻訳は真核翻訳開始因子４Ｅとの競合によって阻害されないため、修飾ウリジンヌクレオチドを有するＲＮＡについては、キャップ１構造は、他のキャップ構造よりも優れている。ＩＦＩＴ１発現の状況では、キャップ１構造を有するｍＲＮＡは、より高いタンパク質発現レベルを与える。
Figure 2024517229000012
配列
ＧＡ
GAAΨAAAC ΨAGΨAΨΨCΨΨ CΨGGΨCCCCA CAGACΨCAGA GAGAACCCGC 50
CACC 54（配列番号１）

C ΨCGAGCΨGGΨ ACΨGCAΨGCA 3900
CGCAAΨGCΨA GCΨGCCCCΨΨ ΨCCCGΨCCΨG GGΨACCCCGA GΨCΨCCCCCG 3950
ACCΨCGGGΨC CCAGGΨAΨGC ΨCCCACCΨCC ACCΨGCCCCA
CΨCACCACCΨ 4000
CΨGCΨAGΨΨC CAGACACCΨC CCAAGCACGC AGCAAΨGCAG CΨCAAAACGC 4050
ΨΨAGCCΨAGC
CACACCCCCA CGGGAAACAG CAGΨGAΨΨAA
CCΨΨΨAGCAA 4100
ΨAAACGAAAG ΨΨΨAACΨAAG CΨAΨACΨAAC CCCAGGGΨΨG GΨCAAΨΨΨCG 4150
ΨGCCAGCCAC ACCCΨGGAGC
ΨAGC（配列番号２）

AAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 4200
AAAAGCAΨAΨ GACΨAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
4250
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAA
4284 （配列番号３）
Ψ＝１－メチル－３’－シュードウリジリル
製造プロセスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写（ＩＶＴ）ステップによるＲＮＡ合成、次いで、ＤＮａｓｅＩおよびプロテイナーゼＫ消化ステップ、限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）による精製、ならびに最終濾過および分注を含む。ＩＶＴ、消化、および精製プロセスステップに対するプラットフォーム手法を、４つのｍｏｄＲＮＡ製剤原料の生産において使用した。
ｍＲＮＡ製剤原料の臨床バッチを、ＩＶＴのために３７．６Ｌの出発体積の規模で調製した。ＤＮａｓｅＩ消化ステップの主目的は、線状ＤＮＡ鋳型のサイズを低減させて、限外濾過／透析濾過ステップにわたるその後の除去を可能にすることである。最終ＩＶＴインキュベーションの終わりに、ＤＮａｓｅＩ溶液を添加する。ＩＶＴステップからの温度および撹拌速度は、このステップの間に維持される。プロテイナーゼＫ消化ステップの主目的は、限外濾過／透析濾過ステップにわたるその後の除去のために反応混合物中のタンパク質のサイズを低減させることである。プロテイナーゼＫ溶液を反応容器に添加し、所定量の時間にわたってインキュベートする。ＩＶＴおよびＤＮａｓｅ消化ステップ中に実行される温度および撹拌速度は、このステップの間に維持される。全ての材料を、１回の２段階限外濾過（ＵＦ）および透析濾過（ＤＦ）（ＵＦＤＦ）によって精製して、ＲＮＡ製剤原料を生産する。ＵＦＤＦステップは、小さいプロセス関連不純物および濃縮物を除去し、最終ＤＳ製剤へとＲＮＡを緩衝剤交換する。
次いで、必要に応じて、透析濾過２の後に決定される保持液のＲＮＡ濃度に基づいて、透析濾過された保持液を濃縮し、二重層フィルターを介して可撓性容器中に回収する。続いて、ＵＦＤＦ系をリンスし、同じ二重層フィルターを介して保持液プールに添加する。製剤緩衝剤を添加することができる。次いで、最終プールを、第２の二重層フィルターを介してＨＤＰＥボトル中に濾過する。
Figure 2024517229000013
Figure 2024517229000014
Figure 2024517229000015
Figure 2024517229000016
Figure 2024517229000017
Figure 2024517229000018
脂質ナノ粒子の形成および安定化のためのプロセスパラメータは、表１０にまとめられる。
表１０：ＬＮＰの形成および安定化のためのプロセスパラメータ
プロセスパラメータの許容範囲
水性相の温度：１５～２５℃
有機相の温度：１５～２５℃
クエン酸緩衝液の、水性相の調製のための希釈された製剤原料に対する流量比：４：１ａ
ＬＮＰ懸濁液の、安定化のためのクエン酸緩衝液に対する流量比：２：１ａ
ＬＮＰ収集溶液の温度：２～２５℃
ａＬＮＰ形成中の標的設定点。比は、インプット流量から算出することができる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形成および安定化
ＬＮＰを形成させるために、クエン酸緩衝剤を、４：１の流量比で希釈された製剤原料と直列に混合し、水性相を創出する。有機相および水性相を、１つまたは複数のＴミキサー中に供給して、ＬＮＰを形成させる。ＬＮＰ懸濁液の形成後、ＬＮＰを、ＬＮＰ懸濁液のクエン酸緩衝剤に対する２：１の比でクエン酸緩衝剤と直列希釈によって安定化した後、２～２５℃に維持された容器中に収集する。
緩衝剤交換および濃縮
緩衝剤交換および濃縮操作のために調製するために、接線流濾過（ＴＦＦ）膜を、平衡化のためのＴｒｉｓ緩衝剤で洗い流す。ＬＮＰを接線流濾過（ＴＦＦ）単位操作によってプロセシングし、それらを濃縮した後、２倍透析容量のトリス緩衝剤で緩衝剤交換して、懸濁液からエタノールを除去する。次いで、ＬＮＰをさらに濃縮し、８倍以上の追加の透析容量のＴｒｉｓ緩衝剤で緩衝剤交換する。
Figure 2024517229000019
４．２．２．賦形剤
ＬＮＰ製剤中に存在する賦形剤トロメタミン（Ｔｒｉｓ塩基）およびＴｒｉｓ塩酸（ＨＣｌ）は、医薬品において使用される緩衝剤構成成分であり、所望の製品ｐＨを達成するのに好適である。ショ糖も含まれ、使用時点での分配および冷蔵の前に凍結組成物としての保存を可能にするためにその安定化効果について選択した。免疫原性組成物中の４つの脂質賦形剤は、ｍｏｄＲＮＡプラットフォームの一部として使用される機能的脂質と構造的脂質との両方である。
４．３．投与量および投与
免疫原性組成物は、一価組成物または二価組成物については組合せの投与の前に、バイアル中での希釈またはシリンジ間混合のいずれかによって、必要に応じて生理食塩水で希釈される。
一価投薬については、免疫原性組成物は、０．３ｍＬの注射体積で、用量あたり３．７５～３０μｇの範囲で投与される。３０μｇ用量を除いて、滅菌０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水）による希釈が、投薬のために必要である。４つの用量レベルは、
・ ３．７５μｇのｍＲＮＡ
・ ７．５μｇのｍＲＮＡ
・ １５μｇのｍＲＮＡ
・ ３０μｇのｍＲＮＡ
である。
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ免疫原性組成物も、０．３ｍＬの合計送達体積中、Ｐｈｕｋｅｔ免疫原性組成物と共に二価ワクチンとして投与される。提唱される投薬範囲（全ＲＮＡ）および二価免疫原性組成物中のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｗ）免疫原性組成物のＰｈｕｋｅｔ（Ｐ）免疫原性組成物に対する比は、
・ １Ｗ：１Ｐで１５μｇ（７．５μｇのＡ＋７．５μｇのＢ）
・ １Ｗ：１Ｐで３０μｇ（１５μｇのＡ＋１５μｇのＢ）
・ １Ｗ：２Ｐで２２．５μｇ（７．５μｇのＡ＋１５μｇのＢ）
・ １Ｗ：４Ｐで１８．７５μｇ（３．７５μｇのＡ＋１５μｇのＢ）
である。
四価投薬については、免疫原性組成物は、最大で３０μｇの合計用量に関して４つのｍｏｄＲＮＡ配列のそれぞれを含有する０．３ｍＬの注射体積で投与される。四価免疫原性組成物容器閉鎖システムの投与のために希釈は必要ない。
Ｉ型ホウケイ酸ガラスバイアルは、Ｉ型ガラス容器の加水分解耐性に関するＵＳＰ＜６６０＞、Ｐｈ．Ｅｕｒ．３．２．１およびＪＰ７．０１公定書の要件を満たす。クロロブチル弾性ストッパーは、弾性閉鎖のＵＳＰ＜３８１＞、Ｐｈ．Ｅｕｒ．３．２．９およびＪＰ７．０３公定書の化学試験要件を満たす。
４．４．製剤の保存および輸送、ラベルおよび包装
免疫原性組成物は、長期保存のために極低温（ＵＬＴ）（－９０℃～６０℃）で凍結および保存される。
インフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物は、季節性ヒトインフルエンザ株に由来する完全長ＨＡ糖タンパク質をコードする１つまたは複数のヌクレオシド修飾されたｍＲＮＡを含む。ｍｏｄＲＮＡは、ＩＭ注射後にｍｏｄＲＮＡを分解から保護し、ｍｏｄＲＮＡの宿主細胞中へのトランスフェクションを可能にする、２つの機能性および２つの構造性脂質と共に製剤化されている。インフルエンザＨＡは、インフルエンザＡおよびＢビリオンの表面上で最も豊富なエンベロープ糖タンパク質である。
インフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物の主な薬理を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの非臨床試験において評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験により、強力な機能的抗体応答と、Ｔｈ１型ＣＤ４＋およびＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞応答との両方を特徴とする免疫応答を誘導するインフルエンザＨＡをコードすることである、インフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物の作用機構が示された。インフルエンザｍｏｄＲＮＡワクチンからのＨＡ糖タンパク質の効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ発現が、培養細胞中で示された。マウスおよびラットの免疫原性試験により、インフルエンザｍｏｄＲＮＡワクチンが強力な機能的および中和抗体応答ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すことが示された。ライセンス供与された、アジュバント化不活化インフルエンザワクチンに対してベンチマークされた、マウスにおける免疫原性試験も、４つの異なるインフルエンザウイルス株を標的とするための多価インフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物製剤の潜在的な使用を支持する。
ワクチン抗原としてインフルエンザＨＡをコードする脂質ナノ粒子に封入されたＲＮＡ免疫原性組成物
インフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物は、ｍｏｄＲＮＡプラットフォーム技術に基づくものである。一本鎖の５’キャップ付ｍｏｄＲＮＡは、ＨＡワクチン抗原をコードするオープンリーディングフレームを含有し、高い効能のＲＮＡのために最適化された構造エレメントを特徴とする。ｍｏｄＲＮＡはまた、自然免疫活性化の低下およびタンパク質翻訳の増加をもたらす、ＴＬＲ７および８などの、自然免疫センサーによるワクチンＲＮＡの認識を低下させるための１－メチル－シュードウリジンの各ウリジンへの置換を含有する。ｍｏｄＲＮＡは、標的細胞への送達のためにＬＮＰ中に封入される。製剤は、２つの機能性脂質、ＡＬＣ－０３１５およびＡＬＣ－０１５９、ならびに２つの構造性脂質、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）およびコレステロールを含有する。４つの脂質の物理化学的特性および構造は、以下の表に示される。
Figure 2024517229000020
初期臨床試験のために選択されるインフルエンザｍｏｄＲＮＡワクチン候補は、２０２１～２０２２年の北半球のインフルエンザ流行期における使用のために推奨される４つの細胞ベースのウイルス株に由来するＨＡ糖タンパク質の完全長のコドン最適化されたコード配列を含有する。
・ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９（Ｈ１Ｎ１）
・ Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／ｅ０８２６３６０／２０２０（Ｈ３Ｎ２）
・ Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｂ Ｙａｍａｇａｔａ）
・ Ｂ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／０２／２０１９（Ｂ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）。
別の実施形態では、注射用懸濁液のためのＰＦ－０７２５２２２０（ＩＲＶ）ワクチンは、ゴムストッパー、アルミニウムオーバーシールおよびフリップオフキャップを有する２ｍＬの透明ガラスバイアル中に包装された、白色からオフホワイトの滅菌凍結液体として供給される。溶液は、白色からオフホワイトの不透明な、不定形の粒子を含有してもよい白色からオフホワイトの乳白色の液体である。バイアルは、シリンジ混合によるさらなる希釈のために０．３ｍＬの抽出可能体積を有する０．５ｍＬを含有する。バイアル中での希釈のために、バイアル内容物（０．５ｍＬ）は、最終投薬溶液を構成するべきである。各バイアルは、３００ｍＭのショ糖および１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４中の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）構築物中、０．１ｍｇ／ｍＬのＰＦ－０７２５２２２０を含む。製剤中に微生物増殖阻害剤は存在しない。
ＰＦ－０７２５２２２０は、５つのバリエーション；４つの一価株提示物および１つの四価株提示物からなる。一価提示物を、使用時点で二価および四価投薬溶液とさらに混合してもよい。以下に提示される安定性データは、全ての提示物および混合物に適用される。
・ ＰＦ－０７８３６２５９（Ｐｈｕｋｅｔ）インフルエンザｍｏｄＲＮＡ注射用懸濁液、０．１ｍｇ／ｍＬ
・ ＰＦ－０７８２９８５５（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）インフルエンザｍｏｄＲＮＡ注射用懸濁液、０．１ｍｇ／ｍＬ
・ ＰＦ－０７８３６２６１（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）インフルエンザｍｏｄＲＮＡ注射用懸濁液、０．１ｍｇ／ｍｌ
・ ＰＦ－０７８３６２５８（Ｃａｍｂｏｄｉａ）インフルエンザｍｏｄＲＮＡ注射用懸濁液、０．１ｍｇ／ｍｌ
・ ＰＦ－０７８４１６９７四価インフルエンザｍｏｄＲＮＡ注射用懸濁液、０．１ｍｇ／ｍＬ。
活性治験薬は、使用前に－９０～－６０℃（－１３０～－７６°Ｆ）で保存しなければならない。バイアルを、およそ３０分かけて室温（３０℃／８６°Ｆ以下）で解凍した後、バイアルを１０回穏やかに反転させることによって混合するべきである。治験薬を、筋肉内投与する。
Figure 2024517229000021
Figure 2024517229000022
Figure 2024517229000023
Figure 2024517229000024
Figure 2024517229000025
（実施例４）
非臨床試験
初期マウス免疫原性試験を、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）に由来するＨＡ配列をコードするインフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物を使用して行った。このＨＡ配列は、株の違いのため臨床試験において使用されるＨ１Ｎ１ ＨＡ抗原とは異なるが、ｍｏｄＲＮＡを、同じ臨床ＬＮＰ組成物と共に製剤化したところ、プラットフォームに関して支持的なデータを提供する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０および２８日目に１μｇのＬＮＰ製剤化インフルエンザｍｏｄＲＮＡワクチンを用いてＩＭで免疫した。２８および４９日目に得られた血清のＥＬＩＳＡは、高レベルのＨＡ結合性ＩｇＧを示した。第１の用量の早くも１４日後に得られた血清は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９インフルエンザウイルスに対する高い中和価を有し、４９日目（第２の用量の２１日後）までに、血清インフルエンザ中和価は１ｘ１０４を超えた。４９日目に採取された血清中で測定されたＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９に対するＨＡＩ力価は、ヒトにおいてインフルエンザに対して保護的と一般に受け入れられている４０の力価を大きく超えていた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇのワクチン候補を用いてＩＭで２回免疫した。ＨＡ特異的ＩｇＧを、ＥＬＩＳＡによって測定した。抗体の機能を、インフルエンザウイルスマイクロ中和によって測定した。４９日目に回収し、抗原特異的ペプチドで刺激した脾臓細胞を使用するＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔは、強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した。これらのデータにより、ＬＮＰと共に製剤化されたｍｏｄＲＮＡは、Ｔｈ１表現型Ｔ細胞応答を引き出すことが確認された。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、インフルエンザＨＡをコードする１μｇのｍｏｄＲＮＡを用いた２回のＩＭ免疫を受けた。Ｔ細胞応答を、脾臓から回収したＴ細胞を刺激する抗原特異的ペプチドを使用して分析した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用するペプチド刺激後に、ＩＦＮγの放出を測定した。
インフルエンザに対するワクチン誘導性免疫応答を測定するために使用される一次血清学的アッセイは、ヘマグルチニン阻害アッセイ、またはＨＡＩである。ＨＡＩは、受容体破壊酵素で予備処理された血清試料、インフルエンザウイルスおよびシチメンチョウまたはモルモットに由来する赤血球を含有する反応液中での赤血球のＨＡ媒介性凝集を防止する血清中で機能性抗体を定量的に測定する。ＨＡＩ力価は、マイクロタイタープレートを傾けた時に涙滴型として見えるＨＡ活性の喪失をもたらす最も高い血清希釈率の逆数である。試料あたりの複数の決定に由来する力価を、幾何平均力価（ＧＭＴ）として報告する。１：４０以上のＨＡＩ力価は、ヒトにおいて保護的であるとして一般的に受け入れられている。ＨＡＩアッセイは、４つのインフルエンザ株、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／ｅ０８２６３６０／２０２０（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｂ Ｙａｍａｇａｔａ）およびＢ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／０２／２０１９（Ｂ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）のそれぞれについて開発された。
インフルエンザウイルスマイクロ中和アッセイ、またはＭＮＴは、インフルエンザウイルス活性を中和し、宿主細胞単層の増殖感染を防止する、血清中の機能的抗体を定量的に測定する。中和反応は、インフルエンザウイルスが血清試料と共にインキュベートされた時に生じる；次いで、この反応混合物をＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の単層に適用して、中和の程度を測定する。ＭＮＴ力価は、血清なしの対照と比較した場合の感染の５０％の低減をもたらす希釈率の逆数として報告される。
ＬＮＰおよび事後混合されたＬＮＰアームを形成するために事前混合された製剤原料（ＲＮＡ）を用いて二価ｍｏｄＲＮＡ ＨＡ ｆｌｕワクチンの実現可能性を評価するための試験
別途記述しない限り、本明細書で使用される場合、「事前混合された」製剤原料とは、ＨＡまたはＮＡのいずれかを発現するＲＮＡを所望の比で混合した後、ＬＮＰ中で単一製剤とする組成物を指す。「事後混合された」製剤とは、ＨＡまたはＮＡのいずれかを発現するそれぞれのＲＮＡをＬＮＰ中に封入した後、得られたＲＮＡを封入したＬＮＰを所望の比で混合した組成物を指す。
ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）抗体価を、以下の表に記載される製剤と共に投与されたマウスにおいて検査した。
試験設計表：
Figure 2024517229000026
高いＨＡＩ力価は、用量１の３週後にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ ＨＡ ｍｏｄＲＮＡによって誘導された。
二価群においてはＨＡＩはわずかにより高かった。
０．２ｕｇ用量の二価について、事前混合製剤においてＨＡＩはより高かった。以下の表１７～１８を参照されたい。
Figure 2024517229000027
Figure 2024517229000028
また、事前混合製剤と事後混合製剤との間で、５０％中和Ａｂ価が同等であることも観察された。以下の表１９～２２を参照されたい。
Figure 2024517229000029
Figure 2024517229000030
Figure 2024517229000031
Figure 2024517229000032
ＨＡＩ力価は、事前混合製剤と事後混合製剤との間で同等であった。以下の表２３～２６を参照されたい。
Figure 2024517229000033
Figure 2024517229000034
Figure 2024517229000035
Figure 2024517229000036
（実施例５）
四価製剤の説明
四価製剤は、筋肉内投与のための水性凍結保護緩衝剤中の、液体ナノ粒子（ＬＮＰ）の保存剤を含まない、滅菌分散体である。製剤は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝剤、３００ｍＭショ糖、ｐＨ７．４中、０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡで製剤化される。
製剤は、クロロブチルゴムストッパーおよびフリップオフプラスチックキャップを有するアルミニウムシールで密閉された２ｍＬのガラスバイアル（最大名目体積０．３ｍＬ）中で供給される。
Figure 2024517229000037
ＦＩＨ製剤原料の推奨保存温度は、－２０±５℃である。
ＦＩＨ製剤の推奨長期保存温度は、－６０～－９０℃である。
製剤は、使用時に２～８℃で保存してもよい。
Figure 2024517229000038
Figure 2024517229000039
（実施例６）
ＬＮＰ Ｆｌｕ ＨＡ ｍｏｄＲＮＡ四価試験
以下の実施例は、マウスに、以下の表に詳述される様々なＬＮＰ＿Ｆｌｕ ＨＡｍｏｄＲＮＡ材料を投与した、ＬＮＰ Ｆｌｕ ＨＡ ｍｏｄＲＮＡ四価の試験を記載する。初回免疫後、２１日目および４２日目（ブーストの１４日後）に収集した血清を、血清試験（ＨＡＩおよび中和）によって評価した。
Figure 2024517229000040
ＨＡＩ力価は、Ｄ２１で事前混合製剤と事後混合製剤との間で同等であった。以下の表３１～３５を参照されたい。
Figure 2024517229000041
Figure 2024517229000042
Figure 2024517229000043
Figure 2024517229000044
Figure 2024517229000045
Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ：事前混合と事後混合との間で同等の５０％中和価が観察された。Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ：事前混合と事後混合との間で同等の５０％中和価が観察された。Ｂｙ／Ｐｈｕｋｅｔ：事前混合と事後混合との間で同等の５０％中和価が観察された。Ｂｖ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：また、事前混合と事後混合との間で同等の５０％中和価が観察された。
（実施例７）
多価インフルエンザｍｏｄＲＮＡワクチンのマウスにおける免疫原性データ、続き
ｍｏｄＲＮＡインフルエンザワクチンの多価製剤の実現可能性を評価するために、４つの異なるＨＡタンパク質および４つの異なるノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質をコードするｍｏｄＲＮＡを生成した。単一株特異的ＨＡまたはＮＡをコードするＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡをワクチン接種したマウスによって引き出される免疫応答を、８価ＨＡ／ＮＡ ｍｏｄＲＮＡ製剤をワクチン接種した群と比較した。８価製剤法を、ＬＮＰ中でＨＡまたはＮＡを発現するそれぞれのｍｏｄＲＮＡを別々に製剤化した後、８つのＬＮＰを等比で一緒に混合することによって、または８つのｍｏｄＲＮＡを事前混合した後、ＬＮＰ中で１回の同時製剤化を行うことによって比較した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０および２８日目に、ＬＮＰ中の１価または８価ワクチン製剤として、それぞれ２μｇの、ＨＡおよびＮＡを発現するｍｏｄＲＮＡを用いてＩＭで免疫した。ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡによって、ライセンス供与されたワクチン比較基準と同様の、またはそれより高いレベルの、全てのＨＡおよびＮＡ成分に対するロバストな抗体およびＴ細胞応答が引き出された。個々のＨＡおよびインフルエンザＡ株に対する８価製剤について、４９日目（２回目のブーストの２１日後）に、同様のＨＡＩおよび中和応答が観察された。ＮＡに対して測定された抗体は、ＨＡと同様の傾向を示した（データは示さない）。ライセンス供与された、アジュバント化不活化インフルエンザワクチンに対してベンチマークされた、マウスにおける免疫原性試験は、少なくとも４つの異なるインフルエンザウイルス株を標的とするための多価インフルエンザｍｏｄＲＮＡワクチン製剤の潜在的な使用を支持する。８価ＨＡ／ＮＡ ｍｏｄＲＮＡワクチンのマウスにおける初期免疫原性試験は、インフルエンザＡ株に対する干渉を示さず、一価対照ワクチンと比較してインフルエンザＢ株に対する抗体応答を示した。これらの初期マウス免疫原性データは、多価ｍｏｄＲＮＡ製剤の使用を支持する。
条項
１．脂質ナノ粒子中で製剤化された、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルスワクチン。
２．ＲＮＡが５’キャップアナログをさらに含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
３．５’キャップアナログがｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む、条項２に記載のインフルエンザワクチン。
４．ＲＮＡが修飾ヌクレオチドをさらに含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
５．修飾ヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸（ｍ１ΨＴＰ）を含む、条項４に記載のインフルエンザワクチン。
６．少なくとも１つの抗原性ポリペプチドが、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、ＨＡ１もしくはＨＡ２の免疫原性断片、または前記のいずれか２つ以上の組合せである、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
７．少なくとも１つの抗原性ポリペプチドが、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１とＨＡ２との組合せであり、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドが、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
８．少なくとも１つの抗原性ポリペプチドが、ＨＡ、ＨＡ２、またはＨＡ１とＨＡ２との組合せであり、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドが、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）である、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
９．組成物が、ａ）インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド；ｂ）ヘマグルチニン２（ＨＡ２）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド；ｃ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド；ならびにｄ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
１０．オープンリーディングフレームがコドン最適化されている、条項５に記載のインフルエンザワクチン。
１１．組成物がカチオン性脂質をさらに含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
１２．組成物がｍＲＮＡ分子を包含する脂質ナノ粒子を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
１３．組成物が、ａ）インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包含する脂質ナノ粒子；ｂ）ヘマグルチニン２（ＨＡ２）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包含する脂質ナノ粒子；ｃ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包含する脂質ナノ粒子；ならびにｄ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包含する脂質ナノ粒子を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
１４．脂質ナノ粒子のサイズが、少なくとも４０ｎｍである、条項１３に記載のインフルエンザワクチン。
１５．脂質ナノ粒子のサイズが、最大でも１８０ｎｍである、条項１３に記載のインフルエンザワクチン。
１６．組成物中の全ＲＮＡの少なくとも８０％が封入されている、条項１３に記載のインフルエンザワクチン。
１７．組成物が、を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
１８．組成物が、ＡＬＣ－０３１５（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
１９．組成物が、ＡＬＣ－０１５９（２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド）を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２０．組成物が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２１．組成物が、コレステロールを含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２２．組成物が、０．９～１．８５ｍｇ／ｍＬのＡＬＣ－０３１５；０．１１～０．２４ｍｇ／ｍＬのＡＬＣ－０１５９；０．１８～０．４１ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ；および０．３６～０．７８ｍｇ／ｍＬのコレステロールを含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２３．組成物がＴｒｉｓを含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２４．組成物がショ糖を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２５．組成物が、塩化ナトリウムをさらに含まない、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２６．組成物が、１０ｍＭのＴｒｉｓを含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２７．組成物が、３００ｍＭのショ糖を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２８．組成物が、ｐＨ７．４を有する、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
２９．組成物が、１２．５ＥＵ／ｍＬ以下の細菌内毒素を有する、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
３０．ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ヒストンステムループおよびポリＡ尾部を含む、条項１に記載のインフルエンザワクチン。
３１．５’ＵＴＲが、配列ＡＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣ（５’ＷＨＯ ＵＴＲ１）（配列番号４）を含む、条項３０に記載のインフルエンザワクチン。
３２．５’ＵＴＲが、配列ＧＡＧＡＡΨＡＡＡＣΨＡＧΨＡΨΨＣΨΨ ＣΨＧＧΨＣＣＣＣＡ ＣＡＧＡＣΨＣＡＧＡ ＧＡＧＡＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号５）を含む、条項３０に記載のインフルエンザワクチン。
３３．５’ＵＴＲが、配列ＡＧＡＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣ（５’ＷＨＯ ＵＴＲ１）（配列番号６）を含む、条項３０に記載のインフルエンザワクチン。
３４．３’ＵＴＲが、配列ＣＵＣＧＡＧＣＵＧＧＵＡＣＵＧＣＡＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＣＧＵＣＣＵＧＧＧＵＡＣＣＣＣＧＡＧＵＣＵＣＣＣＣＣＧＡＣＣＵＣＧＧＧＵＣＣＣＡＧＧＵＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＧＣＣＣＣＡＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＣＡＧＡＣＡＣＣＵＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＣＧＣＵＵＡＧＣＣＵＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＵＧＡＵＵＡＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＡＡＡＣＧＡＡＡＧＵＵＵＡＡＣＵＡＡＧＣＵＡＵＡＣＵＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＵＵＧＧＵＣＡＡＵＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＵＧＧＡＧＣＵＡＧＣ（３’ＷＨＯ ＵＴＲ２）（配列番号７）を含む、条項３０に記載のインフルエンザワクチン。
３５．３’ＵＴＲが、配列ＣΨＣＧＡＧＣΨＧＧΨＡＣΨＧＣＡΨＧＣＡＣＧＣＡＡΨＧＣΨＡＧＣΨＧＣＣＣＣΨΨΨＣＣＣＧΨＣＣΨＧＧＧΨＡＣＣＣＣＧＡＧΨＣΨＣＣＣＣＣＧＡＣＣΨＣＧＧＧΨＣＣＣＡＧＧΨＡΨＧＣΨＣＣＣＡＣＣΨＣＣＡＣＣΨＧＣＣＣＣＡＣΨＣＡＣＣＡＣＣΨＣΨＧＣΨＡＧΨΨＣＣＡＧＡＣＡＣＣΨＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡΨＧＣＡＧＣΨＣＡＡＡＡＣＧＣΨΨＡＧＣＣΨＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧΨＧＡΨΨＡＡＣＣΨΨΨＡＧＣＡＡΨＡＡＡＣＧＡＡＡＧΨΨΨＡＡＣΨＡＡＧＣΨＡΨＡＣΨＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧΨΨＧＧΨＣＡＡΨΨΨＣＧΨＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣΨＧＧＡＧＣΨＡＧＣ（３’ＷＨＯ ΨＴＲ２）（配列番号８）を含む、条項３０に記載のインフルエンザワクチン。
３６．（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第１のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド、および（ｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第２の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化されている、免疫原性組成物。
３７．第１および第２の抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）、またはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む、条項３６に記載の免疫原性組成物。
３８．第１の抗原が、第２の抗原のインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片とは異なるサブタイプのインフルエンザウイルスに由来するＨＡを含む、条項３６または３７に記載の免疫原性組成物。
３９．第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項３６～３８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４０．（ｉｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第３の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１および第２の抗原の両方とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第３の抗原をさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４１．第１、第２および第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項４０に記載の免疫原性組成物。
４２．第１、第２および第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項４１に記載の免疫原性組成物。
４３．（ｉｖ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第４の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２および第３の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第４の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第４のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４４．第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項４３に記載の免疫原性組成物。
４５．第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項４４に記載の免疫原性組成物。
４６．（ｖ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第５の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２、第３、および第４の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第５の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第５のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４７．第１、第２、第３、第４、および第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項４６に記載の免疫原性組成物。
４８．第１、第２、第３、第４、および第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項４７に記載の免疫原性組成物。
４９．（ｖｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第６の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２、第３、第４、および第５の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第６の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第６のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５０．第１、第２、第３、第４、および第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項４９に記載の免疫原性組成物。
５１．第１、第２、第３、第４、および第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項５０に記載の免疫原性組成物。
５２．（ｖｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第７の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２、第３、第４、第５、および第６の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第７の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第７のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５３．第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項５２に記載の免疫原性組成物。
５４．第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項５３に記載の免疫原性組成物。
５５．（ｖｉｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第８の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第８の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第８のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５６．第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項５５に記載の免疫原性組成物。
５７．第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項５６に記載の免疫原性組成物。
５８．（ｖ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第５の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２、第３、および第４の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第５の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する第５のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５９．第１、第２、第３、第４、および第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、条項５８に記載の免疫原性組成物。
６０．ＲＮＡポリヌクレオチドがほぼ等しい比で存在する、条項５９に記載の免疫原性組成物。
６１．それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
６２．修飾ヌクレオチドが、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、条項６１に記載の免疫原性組成物。
６３．それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドが、５’末端キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および３’ポリアデニル化尾部を含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
６４．５’末端キャップが、
Figure 2024517229000046
 を含む、条項６３に記載の免疫原性組成物。
６５．５’ＵＴＲが配列番号１を含む、条項６３に記載の免疫原性組成物。
６６．３’ＵＴＲが配列番号２を含む、条項６３に記載の免疫原性組成物。
６７．３’ポリアデニル化尾部が、配列番号３を含む、条項６３に記載の免疫原性組成物。
６８．ＲＮＡポリヌクレオチドが、８５％より高い完全性を有する、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
６９．ＲＮＡポリヌクレオチドが、８５％より高い純度を有する、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７０．脂質ナノ粒子が、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５ｍｏｌ％の中性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のコレステロール、および０．５～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７１．カチオン性脂質が、
Figure 2024517229000047
 を含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７２．ＰＥＧ修飾脂質が、
Figure 2024517229000048
 を含む、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７３．第１の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ１に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第２の抗原が、第１の抗原とは異なるＨ１株に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントである、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７４．第１および第２の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ３に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、両抗原が、Ｈ３インフルエンザウイルスの異なる株に由来する、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７５．第１および第２の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ１に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第３および第４の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ３またはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第１および第２の抗原が、Ｈ１ウイルスの異なる株に由来し、第３および第４の抗原が、Ｈ３インフルエンザウイルスの異なる株に由来する、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７６．少なくとも第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７７．第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７８．第１、第２および第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、先行する条項に記載の免疫原性組成物。
７９．第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一のＬＮＰ中で製剤化されている、先行する条項に記載の免疫原性組成物。
８０．それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドが、単一のＬＮＰ中で製剤化され、それぞれの単一のＬＮＰが、１つの抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドを封入する、条項３６～７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
８１．第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化されている、条項８０に記載の免疫原性組成物。
８２．第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化されている、条項８０に記載の免疫原性組成物。
８３．第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、第４のＬＮＰ中で製剤化されている、条項８０に記載の免疫原性組成物。
８４．第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、第４のＬＮＰ中で製剤化され、第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、第５のＬＮＰ中で製剤化されている、条項８０に記載の免疫原性組成物。
８５．第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、第４のＬＮＰ中で製剤化され、第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、第５のＬＮＰ中で製剤化され、第６のＲＮＡポリヌクレオチドが、第６のＬＮＰ中で製剤化されている、条項８０に記載の免疫原性組成物。
８６．第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、第４のＬＮＰ中で製剤化され、第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、第５のＬＮＰ中で製剤化され、第６のＲＮＡポリヌクレオチドが、第６のＬＮＰ中で製剤化され、第７のＲＮＡポリヌクレオチドが、第７のＬＮＰ中で製剤化されている、条項８０に記載の免疫原性組成物。
８７．第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、第４のＬＮＰ中で製剤化され、第５のＲＮＡポリヌクレオチドが、第５のＬＮＰ中で製剤化され、第６のＲＮＡポリヌクレオチドが、第６のＬＮＰ中で製剤化され、第７のＲＮＡポリヌクレオチドが、第７のＬＮＰ中で製剤化され、第８のＲＮＡポリヌクレオチドが、第８のＬＮＰ中で製剤化されている、条項８０に記載の免疫原性組成物。
８８．インフルエンザに対する免疫応答を引き出すのに使用するための、先行する条項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
８９．インフルエンザ疾患に対する免疫応答を引き出す方法であって、有効量の条項３６～７９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む方法。
９０．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって合成されたＲＮＡポリヌクレオチドを精製する方法であって、限外濾過および透析濾過を含む方法。
９１．クロマトグラフィーステップを含まない、条項９０に記載の方法。
９２．精製されたＲＮＡポリヌクレオチドが、短いアボーティブＲＮＡ種、長いアボーティブＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む夾雑物を実質的に含まない、条項９０に記載の方法。
９３．残留プラスミドＤＮＡが、５００ｎｇ以下のＤＮＡ／ｍｇ ＲＮＡである、条項９０に記載の方法。
９４．精製されたｍＲＮＡの純度が、約６０％～約１００%である、条項９０に記載の方法。

Claims (36)

  1. （ｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド、および（ｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第２の抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化されている、免疫原性組成物。
  2. 第１および第２の抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）、またはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  3. 第１および第２の抗原がそれぞれ、インフルエンザウイルスの異なるサブタイプに由来するＨＡ、またはその免疫原性断片を含む、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
  4. （ｉｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第３の抗原であって、第１および第２の抗原の両方のインフルエンザウイルスの株とは異なるインフルエンザウイルスに由来する、第３の抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第３のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  5. 第１、第２および第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、請求項４に記載の免疫原性組成物。
  6. （ｉｖ）少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第４の抗原であって、インフルエンザウイルスに由来するが、第１、第２および第３の抗原とは異なる株のインフルエンザウイルスに由来する、第４の抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第４のＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。
  7. 第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子中で製剤化されている、請求項６に記載の免疫原性組成物。
  8. ＲＮＡポリヌクレオチドがほぼ等しい比で存在する、請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  9. それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  10. 修飾ヌクレオチドが、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。
  11. それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドが、５’末端キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および３’ポリアデニル化尾部を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  12. ５’末端キャップが、
    Figure 2024517229000049
     を含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
  13. ５’ＵＴＲが配列番号１を含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
  14. ３’ＵＴＲが配列番号２を含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
  15. ３’ポリアデニル化尾部が、配列番号３を含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
  16. ＲＮＡポリヌクレオチドが、８５％より高い完全性を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  17. ＲＮＡポリヌクレオチドが、８５％より高い純度を有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  18. 脂質ナノ粒子が、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５ｍｏｌ％の中性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のコレステロール、および０．５～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  19. カチオン性脂質が、
    Figure 2024517229000050
     を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  20. ＰＥＧ修飾脂質が、
    Figure 2024517229000051
     を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  21. 第１の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ１に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第２の抗原が、第１の抗原とは異なるＨ１株に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  22. 第１および第２の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ３に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、両抗原が、Ｈ３インフルエンザウイルスの異なる株に由来する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  23. 第１および第２の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ１に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第３および第４の抗原が、インフルエンザＡサブタイプＨ３に由来するＨＡまたはその免疫原性断片もしくはバリアントであり、第１および第２の抗原が、Ｈ１ウイルスの異なる株に由来し、第３および第４の抗原が、Ｈ３インフルエンザウイルスの異なる株に由来する、請求項６から２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  24. 少なくとも第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、請求項１から２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  25. 第１および第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、請求項１から２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  26. 第１、第２および第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一の脂質ナノ粒子中で製剤化されている、請求項４から２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  27. 第１、第２、第３、および第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、単一のＬＮＰ中で製剤化されている、先行する請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
  28. それぞれのＲＮＡポリヌクレオチドが、単一のＬＮＰ中で製剤化され、それぞれの単一のＬＮＰが、１つの抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドを封入する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  29. 第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化されている、請求項２８に記載の免疫原性組成物。
  30. 第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化されている、請求項２８に記載の免疫原性組成物。
  31. 第１のＲＮＡポリヌクレオチドが、第１のＬＮＰ中で製剤化され、第２のＲＮＡポリヌクレオチドが、第２のＬＮＰ中で製剤化され、第３のＲＮＡポリヌクレオチドが、第３のＬＮＰ中で製剤化され、第４のＲＮＡポリヌクレオチドが、第４のＬＮＰ中で製剤化されている、請求項２８に記載の免疫原性組成物。
  32. 対象においてインフルエンザに対する免疫応答を引き出すのに使用するための、請求項１から３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  33. 対象においてインフルエンザ疾患に対する免疫応答を引き出す方法であって、有効量の請求項１から３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む方法。
  34. ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって合成された、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡポリヌクレオチドを精製する方法であって、限外濾過および透析濾過を含む方法。
  35. クロマトグラフィーステップを含まない、請求項３４に記載の方法。
  36. 精製されたＲＮＡポリヌクレオチドが、短いアボーティブＲＮＡ種、長いアボーティブＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む夾雑物を実質的に含まない、請求項３４に記載の方法。
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