JP2024511944A - 細胞を培養するための、および細胞層と臓器モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製のための細胞培養チャンバーおよび方法 - Google Patents
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Abstract
互いに上下に配置され、かつ２つの側面を備える多孔質膜（８）によって互いに隔てられた、貫流可能な２つの第１および第２の流路（３、４）を備える、細胞層および臓器モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製および培養のための細胞培養チャンバー（１）であって、膜（８）の側面によって、細胞基質（９、１０）がそれぞれ形成されている細胞培養チャンバー（１）に関する。細胞培養チャンバー（１）は、第１および第２の流路（３、４）の少なくとも内壁がポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）からなることを特徴とする。さらに本発明は、ヒトまたは動物の細胞、特に肝類洞壁内皮細胞を、単独でも肝実質細胞および免疫細胞との共培養でも培養するための方法を提供する。【選択図】図１
Description
本発明は、細胞を培養するための、および細胞層と臓器モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製のための細胞培養チャンバー、ならびに細胞を培養する方法、および特に肝類洞壁内皮細胞（ＬＳＥＣ）の機能的統合性を、単独でも肝臓特異的な細胞型との共培養でも向上させる方法に関する。
灌流条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ培養や細胞培養物の調査が可能な装置、特に細胞培養チャンバーは、先行技術から知られている。この場合、特定の細胞培養物を、液体、またはガスとエアロゾルの混合物を用いて洗い流す、またはインキュベートすることができ、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏの生理的条件にかなり近い条件を再現することができる。さらに、この種の細胞培養チャンバーは、（例えば、薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）分野、吸収・分布・代謝・***・毒性（ＡＤＭＥＴ）試験、化学物質感受性試験、ならびに化学物質安全性試験において）作用や、１つまたは複数の細胞培養物と１つまたは複数の培地との間で生じる相互作用、および培地に含まれる試験物質を調べるのに適している。
細胞培養チャンバーは、例えば、特許文献１に記載されている。これらは、多孔質膜によって互いに隔てられた２つの流路を含む。このような細胞培養チャンバーの材料として、生体適合性であり、かつ複雑な構造でも容易に製造できるプラスチックが利用されることが多い。特に、そのような材料は、さまざまな射出成形技術を用いて加工するのに適している。そのようなプラスチックの例に、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリイミド、スチレン（ＳＥＢＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、および環状ポリオレフィン（ＣＯＰおよびＣＯＣ）がある。その他に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造された細胞培養チャンバーが、例えば、複雑な細胞／臓器モデルの培養に使用されている（例えば、特許文献２、３）。しかしながら、ＰＤＭＳは、射出成形が可能な生体適合性プラスチックとは異なり、そもそも細胞培養物に使えるようにするには事前に活性化させる必要があるため、ＰＤＭＳベースのチップを複雑な細胞／臓器モデルに使用するのは困難である。この場合、例えば、活性化溶液を使用し、さらにＵＶ照射と数回の洗浄工程を併せて実施する。こうした事前準備は、最終使用者のどの研究所でも簡単に実施できるものではなく、実際の細胞培養を始める前にミスが生じる可能性をはらんでいる。
調査すべき生物学的構造と培地からなるシステムにできるだけ影響が及ばないよう、細胞培養チャンバーの材料は理想的には不活性である必要がある。しかし、例えば高頻度に用いられる材料であるＰＤＭＳは、一部の化合物との結合能力が高いことがわかっている（非特許文献１）。こうした結合能力が、ＰＤＭＳ製の細胞培養チャンバーを用いて実施される実験に及ぼす影響を推定することは困難である。例えば、ｌｏｇＰが１．８超で水素供与体の数が０である物質は、ＰＤＭＳに強力に吸着し、そのため、活性物質の試験や、得られたデータの解釈が非常に難しくなる。例えば、プロピコナゾールという物質は、ｌｏｇＰが３．７２で水素供与体数が０である。プロピコナゾールは極めて疎水性であり、ＰＤＭＳと不可逆的に結合するため、ＰＤＭＳチップでは、２４時間後に培地で検出できるのは、開始濃度のわずか３０％未満となる（非特許文献１）。
Ａｕｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２０１９）：Ｃｈｅｍｉｃａｌ－ＰＤＭＳ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １９：８６４－８７４
本発明の根底には、先行技術で知られている欠点を低減することにより、細胞培養チャンバーおよびその使用を改善するという課題がある。
上記の課題は、独立クレームの主題によって解決される。有利な展開は、従属クレームの対象となる。
上記の課題は、細胞を培養するための、および細胞層と臓器モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製のための細胞培養チャンバーによって解決される。本発明による細胞培養チャンバーは少なくとも２つの流路を有し、これらの流路は互いに上下に配置され、かつ２つの側面を備える多孔質膜によって互いに隔てることができ、貫流可能であり、膜の側面によってそれぞれ細胞基質が形成される。
装置は、第１および第２の流路の少なくとも内壁が、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）からなることを特徴とする。
ＰＢＴは、高い機械的負荷がかかる、および／または温かい培地と繰り返し接触する製品の製造に使用されるポリマーである。ＰＢＴの一般的な用途に、例えば、滑り軸受け、バルブ部品、ネジの他、コーヒーメーカー、エッグクッカー、トースター、またはヘアドライヤーなどの家電製品の部品がある。ＰＢＴは射出成形法に非常に適している。
細胞培養チャンバーでの使用が珍しいこの材料は、使用される培地の一連の成分と比較して、試験では極めて低い結合形成能力を示し、その結果、細胞培養チャンバー、および特に（予備）培養チャンバーが、そのような細胞培養チャンバーで実施される試験に及ぼす影響を有利に低減できる。例えば、発明者らは、特にプロピコナゾールとトログリタゾンとを用いた活性物質の吸着試験において、ＰＢＴが、ｌｏｇＰが３．７２以下の物質（プロピコナゾールのｌｏｇＰ：３．７２；トログリタゾンのｌｏｇＰ：３．６０）の活性成分試験に非常に適していることを見いだした。２４時間のインキュベーション後、プロピコナゾールまたはトログリタゾンの開始濃度の少なくとも８０％が培地で検出できる（図３ａ、図３ｂ参照）。
本発明による細胞培養チャンバーは、細胞培養物および臓器モデルの培養や、これらの試験（例えば、顕微鏡などの視覚的解決策を用いたリアルタイム観察）に使用できる。この場合、同様に既知であり、場合により調整可能な周囲条件（例えば、温度、気圧、流量およびせん断、細胞培養チャンバーの相対方位、酸素、ｐＨ）下で、特定の組成の培地を有する細胞培養物／臓器モデルを供給できる。有利には、細胞培養チャンバーは、少なくとも２つの異なる細胞を培養するのにも使用できる。少なくとも２つの異なる細胞型の培養は、本明細書において、共培養とも呼ばれる。このような共培養により、モデル環境をさらにｉｎ ｖｉｖｏ条件に近づけることができる。細胞培養チャンバーにおける少なくとも２つの異なる細胞型のこのような共培養により、本発明の意味における臓器モデルが構築される。
本発明による細胞培養チャンバーの特定用途は、いわゆる肝類洞壁内皮細胞（ＬＳＥＣ）を培養し、必要に応じてこれを調べることである。有利には、細胞培養チャンバー内のＬＳＥＣは、特に、肝実質細胞、クッパー細胞／マクロファージ、および／または星細胞など他の肝細胞との共培養でも培養できる。ＬＳＥＣは、単独でも他の肝細胞との共培養でも、特に哺乳動物の生体における主要な代謝臓器の１つである肝臓のさまざまな機能と相互作用を調べるための重要な試験系である。しかし、このようなＬＳＥＣの培養は、単独でも他の肝細胞との共培養でも非常に手間がかかる。以下に概要を示す。
肝類洞壁内皮細胞は、肝臓の特殊な内皮細胞であり、目立った基底膜がなく、小孔と呼ばれる小さな開放孔が存在することを特徴とする。ＬＳＥＣの独特な透過性構造により、血漿は、ＬＳＥＣと肝実質細胞の間に位置するディッセ腔に自由に到達できる。これにより、肝実質細胞は、血流と直接接することなく、栄養素のような小分子を交換することができる。それに加え、生体内のＬＳＥＣは、巨大分子のいわゆるクリアランス、凝固因子の産生、例えば肝損傷時の免疫細胞の接着といった特異的機能を果たす。さらに、これらは、第ＶＩＩＩ因子、スタビリン２、ＬＳＥＣｔｉｎ、およびＣＤ３２ｂなどの特異的マーカーを特徴とする（表１参照）。ＬＳＥＣは薬物性肝毒性に直接関与すると考えられており、そのため、より詳細な薬剤試験で関心を集めている。
ＬＳＥＣをモデルシステムとして使用する場合に特定の要件があるのは、概してＬＳＥＣが、単離後数時間から数日でその機能性と特異的マーカー（表１参照）を失うからである。そうするとＬＳＥＣは、例えば肝毒性への免疫細胞の寄与を確認する場合、活性物質の毒性を確認するのにほとんど、またはまったく適さなくなる。本発明は、ＬＳＥＣの機能性を、単独でも他の肝臓特異的細胞型との共培養でも、はるかに長い期間保持できる解決策を提案する。このために、例えばＬＳＥＣを用いて、第１の流路で血管の状態を再現できるよう流路を構成することができる。ＬＳＥＣは、単独で、または他の細胞、特にクッパー細胞との共培養で培養できる。
肝臓の常在性マクロファージであるクッパー細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでは肝類洞に存在し、それにより、肝臓が病原体や損傷に反応できるようにして監視機能を果たす。クッパー細胞は、例えば薬物性の炎症または表現型の変化を正確に制御することができ、その結果、炎症性または抗炎症性メディエーター（例えば、ＩＬ－１β、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０）の差次的な発現と分泌がもたらされる。炎症反応のこうした重要な制御により、クッパー細胞は肝疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルや、薬物代謝酵素および／または薬物輸送体の炎症関連ダウンレギュレーションに起因する薬物毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングモデルの重要な構成要素となっている。それにより、クッパー細胞／マクロファージは、物質／活性成分の副作用の発現において重要な役割を果たす。肝臓では、クッパー細胞／マクロファージはＬＳＥＣと共に免疫応答を調節する。これらは、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）や非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症において重要な役割を果たす。また、クッパー細胞は、ＩＬ－１０およびＩＬ－６などの肝保護的なサイトカインを放出することによって、一部の薬剤による薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）から肝臓を保護することも指摘されている。他の薬剤に関しては、クッパー細胞は、状況に応じて保護作用または損傷作用を持つ可能性があるＴＮＦ、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６などの炎症性サイトカインの放出により、ＤＩＬＩに大いに寄与することが示されている。場合によっては、ＤＩＬＩを誘発する薬剤の傾向は、クッパー細胞が存在し、炎症反応に向けられている場合にのみ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することができる。本発明による細胞培養チャンバーは、クッパー細胞をＬＳＥＣと共に生理的条件下で共培養できるという大きな利点を提供する。したがって、生体に近い条件下での標的化ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＩＬＩ試験が可能となる。
肝臓の状態は第２の流路で再現できる。肝臓状態は、例えば、肝実質細胞を用いて作製できる。ＬＳＥＣと肝実質細胞の共培養で、哺乳動物の肝臓の臓器モデルを形成できる。肝実質細胞は、単独で、または他の細胞、特に星細胞との共培養で培養できる。
「静止」状態の星細胞（ＨＳＣ’ｓ）は、ビタミンＡの貯蔵庫とも、肝臓の抗原提示細胞とも呼ばれる。星細胞の活性化は、肝線維症の発症における重要な段階である。ビタミンＡ貯蔵量の減少を伴い、損傷細胞または炎症細胞からの細胞メディエーター、サイトカインおよびケモカインの刺激下で、分化転換に至る。線維化の初期段階で、ＨＳＣ’ｓは、増殖性で収縮性の筋線維芽細胞に変わる。これにより細胞外基質の分泌が加速し、細胞外基質要素の分解が低減して、最終的に線維化に至る。星細胞は、クッパー細胞と共に、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、および肝線維症の発症に大きく寄与する。本発明による細胞培養チャンバーを用いた星細胞の共培養により、特に、関与している可能性のあるメディエーターやシグナル分子の試験で、例えば線維化の機序の研究が可能となる。
第１の流路と第２の流路の間にある多孔質膜は、有利には、１０～２０μｍの厚さ、特に１０～１３μｍの厚さを有するよう選択される。例えば、膜は１２μｍの厚さを有する。膜厚が２０～５０μｍを超えると、血管チャンバーと肝臓チャンバーの間の物質交換や可溶性因子交換が困難になる。また、膜厚が厚いと、免疫細胞の肝組織への移動も困難となり、活性成分試験の結果に悪影響が及ぶ。膜は、好ましくは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などの剛性材料からなり得る。別法として、膜は、熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）または弾性ポリウレタン（ＴＰＵ）などの可撓性材料からもなり得る。この場合、膜は１０～７５μｍ、好ましくは１０～５０μｍの厚さで設計し得る。膜の孔径は、有利には０．４～８μｍである。孔径が３μｍ超、例えば５μｍ、６μｍ、７μｍ、または８μｍであると、可溶性因子交換、および免疫細胞の肝臓流路への移動が促進されることがわかっている。膜は、例えばレーザー構造化で作製できる追加的な表面構造を有し得る。そのような構造は、有利には、細胞増殖を操作するため、および／または膜の流体力学特性を操作（例えば、所定の流動プロファイルを確立）するために調整し得る。
さらに、膜および／または流路は、例えば酸素プラズマでプラズマ処理できる。場合によっては、長いポリマー鎖を持つプラスチックなどの無極性材料は、表面エネルギーが非常に低く（一般に２０～４０ｍＮ／ｍ、比較として、ＰＤＭＳはわずか２０ｍＮ／ｍ）、細胞培養で通常発生するような水性液体の高い表面張力と合致しない。ＰＥＴ（４４ｍＮ／ｍ）やＰＢＴ（４８ｍＮ／ｍ）のような極性材料はわずかに高い。プラスチックの表面エネルギーは、分散成分および極性成分からなる。特に、表面エネルギーの極性成分は非常に低い。プラズマ処理により、表面エネルギーの、主に極性成分が大幅に増加する（最大８０～９０ｍＮ／ｍ）。さらに、表面は既存の離型剤が不要となり、機能化される。このプロセスでは、酸素プラズマでの処理によって活性酸素種が生成され、これによりポリマー結合が切断され、化学生物学的相互作用に対して脆弱になる、またはＰＢＴポリマーにヒドロキシ基がさらに挿入される。その結果、膜および／または流路表面の親水性が向上し、生体成分（コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど）による被覆性が向上し、細胞接着性が向上し、疎水性物質の吸着が大幅に低減する。
プラズマ処理の前に、例えば細胞培養チャンバーをイソプロパノールまたはエタノール中で１０分間インキュベートする洗浄工程を実施し得る。乾燥したチャンバーの実際のプラズマ処理は、特に低圧プラズマ法で行い得る。このために、（洗浄した）細胞培養チャンバーを、例えばホウケイ酸ガラス製の真空チャンバーに入れ、１００Ｐａ未満（１ｍｂａｒ未満）の低圧で最大２０分間、酸素プラズマで処理する。酸素プラズマは、１３．５６ＭＨｚ、最大電力２００Ｗの高周波発生装置による短波励起で発生させ得る。
第１および第２の流路は、細胞培養チャンバーの有利な作動状態では、互いに上下に配置されている。すなわち、第１の流路は、重力の影響に対して、第２の流路の上方に配置されている。このような配置により、例えば、倒立顕微鏡を用いた細胞の観察が容易になり、その結果、細胞培養チャンバーの上方に、細胞培養チャンバーの操作に必要な空間が保持される。第２の流路に対する重力の作用方向に対して最大６０度の角度で第１の流路が配置されている細胞培養チャンバーの実施形態もこの理解に含まれ、これは、例えば、第１の流路と第２の流路の間にある膜を斜めに配置することによって、また、細胞培養チャンバーの作動位置を、重力の作用方向に対して最大６０度の角度とすることによって達成できる。
本発明は、特定の生体様培養条件下で、特にヒトＬＳＥＣが、単独で、および他の肝臓特異的な細胞型との共培養で、少なくとも４日間、特に最大１４日間、そのマーカーと機能特性の両方を保持するモデルシステムを提供する。したがって、モデルシステムでは、最大１４日間、次のＬＳＥＣマーカーの発現が検出可能である：ＣＤ３１、ＣＤ２０６、ｖＷｆ、第ＶＩＩＩ因子、ＬＳＥＣｔｉｎ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＬＹＶＥ－１、スタビリン２、ＶＡＰ－１、ＦｃＲｎ、ＭＨＣ Ｉ、およびＭＨＣ ＩＩ。
この進歩は、ＰＢＴの材料特性に加えて、さらなる任意の改良によって達成される。したがって、本発明の装置の一実施形態では、膜の少なくとも１つの側面は、フィブロネクチン、および／またはＩ型コラーゲン、および／またはＩＶ型コラーゲンを含有する混合物で被覆し得る。「被覆」という用語は、フィブロネクチン、および／またはＩ型コラーゲン、および／またはＩＶ型コラーゲンが、膜と化学的に（共有または非共有）結合されていることを含む。この場合、フィブロネクチンは０．５～５μｇ／ｍＬの濃度、Ｉ型コラーゲンは１００～３００μｇ／ｍＬの濃度、ＩＶ型コラーゲンは１００～３００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。さらなる実施形態では、被覆は膜の両側面に存在し得る。特定の用途については、例えば、線維症では肝臓でＩ型コラーゲンの産生が増えるため、通常の生理学的状態を呈さないことから、Ｉ型コラーゲンが含有されていないと有利であり得る。
本発明のさらなる実施形態では、膜の側面の少なくとも１つに、フィブロネクチンペプチド、またはＲＧＤペプチド、またはビトロネクチンペプチド、またはＲＧＤ配列（アルギニン・グリシン・アスパラギン酸）を持つ骨シアロタンパク質ペプチドが結合したデキストラン鎖を結合させることが可能である。ＲＧＤ配列は、特に、細胞接着の媒介に役立つ。
膜の側面の少なくとも１つに、フィブロネクチンペプチド、またはＲＧＤ配列を持つＦＧＦペプチド、またはＲＧＤペプチド単独、またはＲＧＤ配列を持つビトロネクチンペプチド、またはＲＧＤ配列を持つ骨シアロタンパク質ペプチドが結合したヘパリン鎖を結合させることも可能である。ＦＧＦペプチドは線維芽細胞増殖因子のペプチドである。
前述した膜の被覆が存在する場合、ＬＳＥＣは、モデルシステムにおいて最大１４日間、次のマーカーを有し得る：ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３１、ｖＷｆ、第ＶＩＩＩ因子、ＬＳＥＣｔｉｎ、Ｌ－ＳＩＧＮ、スタビリン２、ＶＡＰ－１、ＬＹＶＥ－１、ＦｃＲｎ、ＭＨＣ Ｉ、およびＭＨＣ ＩＩ。
本発明による細胞培養チャンバーは、ヒトまたは動物の細胞、例えばマウス、ラット、ブタ、またはイヌなどの細胞を培養する方法に使用し得る。
この方法では、培地は、流路の少なくとも１つを通して永久的または一時的に搬送される。
本発明による方法では、細胞は、好ましくは膜の頂端側で培養する。本明細書の意味における「頂端」は、細胞培養物が、膜に面する側で培地によって洗い流されることを意味する。特にこれは、上向きの、すなわち重力と反対向きの膜側面である。したがって、頂端で培養された細胞は、培地によって洗い流される膜側で増殖する。
しかし、培地は側底で細胞培養物と接触させることもできる。多孔質膜を介して接触する場合、頂端の培養細胞が側底で接触する。
特に好ましくは、本発明による細胞培養チャンバーは、ＬＳＥＣの培養法で使用できる。ＬＳＥＣは、単独で、または他の肝臓特異的細胞型との共培養で培養できる。他の肝臓特異的細胞型との共培養は、本明細書では肝臓モデルと呼ぶ。
ＬＳＥＣの培養では、好ましくは、第１の流路の頂端に塗布した血管培地（ＬＳＥＣ培地、ＥＣＭ）を用いる。これは、Ｍ１９９またはＭＣＤＢなどの基本的な内皮細胞基礎培地を含むことができ、この培地は、０～２０％のヒト血清および／もしくは０～２０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）、０～１０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（肝実質細胞増殖因子）、０～１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（上皮増殖因子）、０～１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、０～２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－Ｉ、０～５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、０～５０μＭのヒドロコルチゾン、０～５ｍＭのアスコルビン酸、ならびに／または０～４％のＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）、ならびにヘパリン（０～５Ｕ／ｍＬ）を含有する。特に肝実質細胞および／または星細胞との共培養には、好ましくは、第２の流路の側底に塗布したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地などの肝臓基礎培地が使用でき、この培地は、０～２０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）および／または０～２０％のヒト血清、０～５ｍＭのグルタミンまたはＧｌｕｔａｍａｘ、０～１０μｇ／ｍＬのインスリン、０～４％のＭＣＢ、０～５μＭのデキサメタゾン、０～５０μＭのヒドロコルチゾン、ならびに０～５％のＤＭＳＯを含有する。肝臓培地は、肝実質細胞および／または星細胞と共に播種できる。培地は、有利には、動物起源の添加剤を用いずに作成できる。当然ながら、逆に実施し、ＬＳＥＣの培養のために血管培地を第２の流路に、肝臓基礎培地を第１の流路に塗布することも同等であり、可能でもある。
ＬＳＥＣ細胞培養物は、他の細胞と共培養で培養されると（この場合も、頂端と側底両方について）、その機能性が拡大し得ることがわかっている。特に、肝実質細胞、星細胞、および免疫細胞、例えば、クッパー細胞／マクロファージなどの細胞と共培養すると、共培養なしの細胞培養物と比較して、機能性の保持に有利な影響がある。この時、肝臓モデルの構築に使用される細胞が同一のＨＬＡ（ヒト白血球抗原）状態を有していると有利である。
有利には、流路の少なくとも１つにおける培地のせん断速度または流量は、体内で生じるせん断速度に相当するように選択される。例えば、（血管の）状態を第１の流路で再現する。肝臓状態は第２の流路で再現できる。これは例えば、＞０．２～１ｄｙｎ／ｃｍ2、好ましくは０．５～０．８ｄｙｎ／ｃｍ2の範囲から選択される、肝類洞に適用されるせん断速度を有する頂端培地が第１の流路を通して搬送され、＞０～０．２ｄｙｎ／ｃｍ2の範囲から選択されるせん断速度を有する側底培地が第２の流路を通して搬送されることによって達成される。特に、ＬＳＥＣを含む細胞培養の場合、第１の流路内のせん断速度は、特に好ましくは、肝臓内の生理的血管状態に対応する約０．７ｄｙｎ／ｃｍ2に調整される。第２の流路でせん断速度を調整することにより、例えば、膜から離れて重力方向へ移動した免疫細胞が意図せず沈降することや、肝実質細胞の代謝最終産物の蓄積が大幅に回避できる。それに応じて流路の寸法も適合させ、それにより異なるものにできる。例えば、第２の流路は、第１の流路よりも幅を狭く、および／または高さを高くできる。当然ながら、逆に実施し、第１の流路で肝臓状態を、第２の流路で血管の状態を再現することも同等であり、可能でもある。
培地、特に頂端培地における酸素含有量は、有利には、流路入口で１５％、かつ流路出口で３～５％の値に調整される。本発明による細胞培養チャンバーの使用および使用する培地、上述のせん断速度、１つまたは複数の細胞培養チャンバーの２つの流路を互いに接続すること、ならびに任意に、例えば細胞培養チャンバー（複数可）を低酸素キャビネット内に配置して低酸素条件に調整することにより、前述の酸素含有量を調整することができる。
本発明による細胞培養チャンバーは、例えば、腸細胞、肺細胞、および／または肺胞細胞の培養、ならびにこれらの細胞型の細胞層または臓器モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製といったさらなる用途に使用できる。
肝臓モデルを構築するために、膜は上流工程において細胞外基質のタンパク質で被覆し、好ましくはクッパー細胞との共培養で、頂端にＬＳＥＣでコロニー形成させ得る。膜は、代替的または追加的に、特に側底に肝実質細胞で、有利には星細胞との共培養でコロニー形成させ得る。さらに、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球などの免疫細胞を１つまたは複数の頂端培地に添加し、細胞培養チャンバーに洗い流すことができる。これにより、規定の免疫細胞集団を頂端側を通して灌流し、肝臓モデルに対するこれらの免疫細胞の影響を確認することが可能となる。「洗い流す」という用語は、洗い流された細胞が血管チャンバーを通って循環し、表面に接着し得ること、すなわち、内皮細胞層または膜、特にＬＳＥＣ細胞またはその近傍に定着し得ることを含む。
腸モデルを構築するために、膜は上流工程において細胞外基質のタンパク質で被覆し、好ましくは免疫細胞との共培養で、好ましくは頂端に腸内皮細胞でコロニー形成させ得る。膜は、代替的または追加的に、特に側底に腸上皮細胞、および／または平滑筋細胞、および／または免疫細胞でコロニー形成させ得る。さらに、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球などの免疫細胞を１つまたは複数の頂端培地に添加し得る。腸モデルは、頂端または側底に、０～３ｄｙｎ／ｃｍ2のせん断速度で培養し得る。また、側底培地に微生物（例えば、マイクロバイオームの一部）を添加し、例えば、腸モデルへのそのような微生物の影響を調べることができる。
肺モデルを構築するために、膜は上流工程において細胞外基質のタンパク質で被覆し、好ましくは免疫細胞との共培養で、好ましくは頂端に肺上皮細胞（例えば、末梢気道上皮細胞および肺胞上皮細胞）でコロニー形成させ得る。膜は、特に側底に肺内皮細胞で、また頂端／側底を逆にした配置でもコロニーを形成させ得る。さらに、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球などの免疫細胞を１つまたは複数の頂端培地に添加し得る。肺モデルは、頂端または側底に、０～２ｄｙｎ／ｃｍ2のせん断速度で培養し得る。さらに、高いコンフルエンスに達した後に、上皮細胞を培地なしで培養し、生体内のように、気液界面を形成することができる。
本発明による細胞培養チャンバーを用いた、培養細胞、細胞層、または臓器モデルへの、活性物質、またはシグナル分子、または微生物などの生理効果を調べるために、活性物質、または分子、または微生物を細胞培養チャンバーに洗い流して、培養細胞、細胞層、または臓器モデルに添加させ得る。例えば、所望のコロニー形成状態に達したら、調査対象の１つまたは複数の活性成分を、培地または別の液体担体培地に、所望の用量で頂端または側底に添加し、それで細胞培養物を洗い流す（灌流する）ことができる。例えば、特定の流路から出てくる培地の特性を測定値として記録し得る。細胞培養チャンバーとその光学特性を適切に設計することで、顕微鏡による調査、例えば、膜上で増殖する接着細胞および／または共培養細胞の直接観察および／または蛍光に基づく観察を実施できる。同様に、シグナル分子または微生物を用いることも可能である。
本発明の大きな利点は、流路中に異なる条件を再構成できることである。特に、２つの流路のうち１つで血管の状態を再現でき、これを血管状態と呼び得る。膜に対して、この流路を血管側と呼び得る。もう一方の流路では、例えば、肝組織の状態をモデル化でき、これは、肝臓状態、または膜に対して肝臓側と呼び得る。特に、下側の流路によって設けられた肝臓側では、培地によって、低いながらも十分に高いせん断速度が発生し、それにより、膜から離れた細胞の望ましくない沈降がかなり低減する。本発明による細胞培養チャンバーの流路は、その材料特性により、培地に含まれる化合物の吸着性も低い。有利には、これは実験結果にほとんど影響を及ぼさない。
以下に、例示的な実施形態、および実施した実験のグラフによって、本発明をさらに説明する。
図１に示す本発明による細胞培養チャンバー１は、少なくとも第１の流路３および第２の流路４の領域において、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）からなる筐体２を含む。流路３、４はいずれも、培地７をそれぞれ特定の流路３、４に流出入させるのに用いられる入口５と出口６とを備える。第１の流路３と第２の流路４は、多孔質膜８によって互いに隔てられている。同時に細胞培養チャンバー１の頂端領域でもある第１の流路３において、例えば肝類洞壁内皮細胞の細胞培養９は、第１の流路３に面した膜８の側面上に配置されている（この側面を膜の頂端側８．１と呼ぶ）。
肝実質細胞を含む、任意に存在する共培養１０は、第２の流路４に面した膜８の側面上に配置されている（この側面を膜の側底側８．２と呼ぶ）。膜８は、例えば厚さが１２μｍで、ＰＥＴからなる。
流路３、４はそれぞれ、幅Ｂ、これに対して横方向の高さＨ、および図面の平面に対して垂直方向の奥行き（図示せず）を有する。
本発明の別の実施形態では、例えば血管状態は、重力作用に対して上方に配置された第１の流路３に再現されており、第２の流路４には肝臓状態が再現されている。
モデルにおけるせん断速度は、血管側および肝臓側について、頂端培地７ａが０．７ｄｙｎ／ｃｍ2のせん断速度で第１の流路３を通して搬送され、側底培地７ｂが＞０～０．２ｄｙｎ／ｃｍ2のせん断速度で第２の流路４を通して搬送されるように調整される。
例示的な実施形態では、膜８の被覆は、フィブロネクチン／Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混合物（フィブロネクチン５μｇ／ｍＬ、Ｉ型コラーゲン０．３ｍｇ／ｍＬ、ＩＶ型コラーゲン１００μｇ／ｍＬ）からなる。細胞培養物９、１０は、特定の配合を有する細胞型特異的かつ種特異的な培地で培養する。第１の流路４の頂端培地７ａ（ＥＣＭ）は、１０％ヒト血清および増殖因子、抗酸化剤、ならびにＩＴＳを、当業者に周知の好適な濃度で含有する。第２の流路４の側底培地７ｂは、増殖因子、ＩＶ／Ｉ型コラーゲン混合物、およびＩＴＳを、当業者に周知の好適な濃度で含有する。
側底側からの特異的培地の添加は、第２の流路４における細胞特異的培地７ｂ中での肝実質細胞、および任意に星細胞の培養によって置き換え得る。それに加えて、マクロファージは頂端側（第１の流路３）の細胞培養９の特性／機能性に良好な影響を与える。
特定の培地７、７ａ、７ｂを制御搬送するための流路３、４のそれぞれのポンプ装置、およびポンプ装置を制御するための制御器の詳細は図示しない。さらに、その測定値で細胞培養物９および１０を調べることができる各種センサー（例えば、酸素、ｐＨ、乳酸、ＴＥＥＲ）も存在し得る。センサーは、例えば、検出測定値に応じて、特定の培地７、７ａ、７ｂの構成および／またはせん断速度もしくは流量を調節するために、制御装置に接続し得る。
２つの第１の流路３と２つの第２の流路４（図示しない）とを備える本発明による細胞培養チャンバー１の第２の例示的な実施形態を、図２の分解図に示す。筐体２は、上部カバー２．１、下部カバー２．２、および射出成形品の形態の中央ピース２．３から形成されている。センターピース２．３は、挿入膜８によって互いに隔てられた流路３および４の構成を含む。
図３ａおよび３ｂは、異なる設計の本発明による２つの細胞培養チャンバーにおけるＰＢＴの吸着効果に関する実験結果を示す。凡例の「チップＰＢＴ－ＢＣ１」は細胞培養チャンバー１の第１の実施形態を、「チップＰＢＴ－ＢＣ２」は第２の実施形態を示す。第１の実施形態は、第１の流路３の幅Ｂが３４．６ｍｍ、奥行きＴが６．５６ｍｍ、高さＨが０．７ｍｍである。第２の流路４の寸法は、４４．８ｍｍ、３．６ｍｍ、および０．８ｍｍ（Ｂ／Ｔ／Ｈ）である。細胞培養チャンバー１の第２の実施形態「Ｃｈｉｐ ＰＢＴ－ＢＣ２」の対応する寸法は、第１の流路３が３４．６ｍｍ、８．０６ｍｍ、および０．７ｍｍ（Ｂ／Ｔ／Ｈ）、第２の流路４が４９．４ｍｍ、５．６１ｍｍ、および１．０ｍｍ（Ｂ／Ｔ／Ｈ）である。
図３ａのグラフは、４時間および２４時間のインキュベーション後に培地７（ｌｏｇＰ：３．７２）に残存する、検出可能なプロピコナゾールの割合（ＲＴＣ：対照に対する比率）を示す。比較として、プロピコナゾールを含む原液（１００μＭ）の形態の対照を用意した。図３ｂのグラフは、培地７（ｌｏｇＰ：３．６０）に残存するトログリタゾンの割合を示す。図３ｂの例でも、４時間および２４時間のインキュベーション後に試料を採取し、トログリタゾン原液（６４μＭ）の形態の対照と比較した。いずれの場合も、２つのグラフから、本発明による細胞培養チャンバー１の両方の実施形態で、２４時間後でさえも、培地７においてプロピコナゾールの８５％超（図３ａ）、およびトログリタゾンの８０％超（図３ｂ）が検出できたことがわかる。
図４および５は、本発明による細胞培養チャンバー１において、１０または１４日間にわたってマクロファージと肝実質細胞との共培養で培養した肝類洞壁内皮細胞のＬＤＨ（乳酸脱水素酵素、図４）またはＡＳＡＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素、図５）の放出について、細胞溶解と比較した時間プロファイルを示す。ＬＤＨおよびＡＳＡＴは、細胞が損傷したときに放出される酵素であり、そのため、臓器または組織および細胞の生命状態を評価するのに適している。１４日後でさえも、細胞溶解と比べて、培養セルによるＬＤＨおよびＡＳＡＴの放出が有意に少ないことがわかる。
図６および７は、本発明による細胞培養チャンバー１において、１０または１４日間にわたってマクロファージと肝実質細胞との共培養で培養した肝類洞壁内皮細胞のアルブミン（図６）および尿素（図７）について、細胞溶解と比較した濃度を示す。アルブミンおよび尿素は、肝組織または肝実質細胞に合成過程が無傷で存在することを表すものとみなし得る。１０日間の培養と１４日間の培養の両方において、１０日後または１４日後に、濃度が１，３００μｇ／Ｌ超のアルブミンまたは０．７ｍｍｏｌ／Ｌ超の尿素が検出されたことがわかる。
図８は、１０または１４日間にわたるインターロイキン１β（ＩＬ－１ｂ）の検出に関する実験結果を示す。さらに、１０日目および１４日目にリポ多糖類（ＬＰＳ）を一部の試料に添加して、肝臓モデルに含まれる免疫細胞（マクロファージ）の活性化を確認し、それぞれの反応を示した。いわゆる発熱物質であるＬＰＳの添加は、当技術分野で通例の、エンドトキシンに関する試験である。マクロファージなどの免疫細胞は、この刺激に反応してサイトカインの放出を増加させる。結果から、ＬＰＳ添加後にＩＬ－１βの濃度が明らかに上昇したことがわかる。このことから、調査した肝類洞壁内皮細胞および肝実質細胞と共培養したマクロファージは、１０日後または１４日後でさえも、エンドトキシンに対する免疫応答で反応できたと推定される。このことは、免疫細胞に起因する薬剤の副作用を検出するために重要である。
インターロイキン１０（ＩＬ－１０、図９）およびインターロイキン６（ＩＬ－６、図１０）についても、原則的に同じ結果が認められる。
１ 細胞培養チャンバー
２ 筐体
２．１ 上部カバー
２．２ 下部カバー
２．３ 中央ピース
３ 第１の流路
４ 第２の流路
５ 流路入口
６ 流路出口
７ 培地
７ａ 頂端培地
７ｂ 側底培地
８ 膜
８．１ 膜の頂端側
８．２ 膜の側底側
９ 細胞培養物
１０ 共培養
Ｂ 幅
Ｈ 高さ
２ 筐体
２．１ 上部カバー
２．２ 下部カバー
２．３ 中央ピース
３ 第１の流路
４ 第２の流路
５ 流路入口
６ 流路出口
７ 培地
７ａ 頂端培地
７ｂ 側底培地
８ 膜
８．１ 膜の頂端側
８．２ 膜の側底側
９ 細胞培養物
１０ 共培養
Ｂ 幅
Ｈ 高さ
Claims (21)
- 細胞を培養するための、および細胞層と臓器モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製のための細胞培養チャンバー（１）であって、
－ 貫流可能な第１の流路（３）、
－ 貫流可能な第２の流路（４）、
－ 多孔質膜（８）
を含み、
－ 前記２つの流路（３、４）が互いに上下に配置され、かつ前記膜（８）によって互いに隔てられており、
－ 前記膜（８）が、前記第１の流路（３）に向いた第１の側面と、前記第２の流路（４）に向いた第２の側面とを有し、
－ 細胞基質（９、１０）が、前記膜（８）の側面のそれぞれによって形成されている
細胞培養チャンバー（１）において、
前記第１の流路（３）および前記第２の流路（４）の少なくとも内壁がポリブチレンテレフタレートからなる
ことを特徴とする細胞培養チャンバー。 - 前記膜（８）が、１０～７５μｍ、好ましくは、１０～５０μｍ、および特に好ましくは１０～１３μｍの範囲から選択される厚さを有する
請求項１に記載の細胞培養チャンバー。 - 前記膜（８）が、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、または熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、または弾性ポリウレタン（ＴＰＵ）からなる
請求項１または２に記載の細胞培養チャンバー。 - 前記膜（８）の少なくとも１つの側面が、追加的な表面構造を有する
請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞培養チャンバー。 - 前記膜（８）の少なくとも１つの側面および／または前記流路（３、４）の少なくとも１つがプラズマ処理されている
請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞培養チャンバー。 - 前記膜（８）の少なくとも１つの側面が混合物で被覆されており、前記混合物が、フィブロネクチン、および／またはＩ型コラーゲン、および／またはＩＶ型コラーゲンを含有し、かつ前記フィブロネクチンが０．５～５μｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記Ｉ型コラーゲンが１００～３００μｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記ＩＶ型コラーゲンが１００～３００μｇ／ｍＬの濃度で存在する
請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞培養チャンバー。 - 前記膜（８）の側面の少なくとも１つが、フィブロネクチンペプチド、またはＲＧＤペプチド、またはビトロネクチンペプチド、またはＲＧＤ配列を持つ骨シアロタンパク質ペプチドが結合したデキストラン鎖に結合している
請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞培養チャンバー。 - 前記膜（８）の側面の少なくとも１つが、フィブロネクチンペプチド、またはＲＧＤ配列を持つＦＧＦペプチド、またはＲＧＤペプチド単独、またはＲＧＤ配列を持つビトロネクチンペプチド、またはＲＧＤ配列を持つ骨シアロタンパク質ペプチドが結合したヘパリン鎖に結合している
請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞培養チャンバー。 - 濃度が１００μｇ／ｍＬ超のヒトＩ型コラーゲンおよび／またはヒトＩＶ型コラーゲンが、前記膜（８）の側面の少なくとも１つに結合している
請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞培養チャンバー。 - 請求項１ないし９のいずれかに記載の細胞培養チャンバー（１）を用いてヒトまたは動物の細胞を培養する
ことを特徴とする方法。 - 前記細胞が、前記膜（８）の頂端側（８．１）で培養され、かつ培地（７）が、前記第１の流路（３）および／または前記第２の流路（４）内を搬送される
請求項１０に記載の方法。 - 前記細胞が、前記膜（８）の側底側（８．２）で培養され、かつ培地（７）が、前記第１の流路（３）および／または前記第２の流路（４）内を搬送される
請求項１０または１１に記載の方法。 - 前記培養細胞が肝類洞壁内皮細胞である
請求項１０ないし１２のいずれかに記載の方法。 - ＞０．２～１ｄｙｎ／ｃｍ2、特に０．５～０．８ｄｙｎ／ｃｍ2の範囲から選択されるせん断速度を有する頂端培地（７ａ）が前記第１の流路（３）を通して搬送され、０よりも大きく０．２ｄｙｎ／ｃｍ2以下の範囲から選択されるせん断速度を有する側底培地（７ｂ）が、前記第２の流路（４）を通して搬送されることによって、血管状態が前記第１の流路（３）で再現され、かつ肝臓状態が前記第２の流路（４）で再現される
請求項１３に記載の方法。 - ＞０．２～１ｄｙｎ／ｃｍ2、特に０．５～０．８ｄｙｎ／ｃｍ2の範囲から選択されるせん断速度を有する頂端培地（７ａ）が前記第２の流路（４）を通して搬送され、０よりも大きく０．２ｄｙｎ／ｃｍ2以下の範囲から選択されるせん断速度を有する側底培地（７ｂ）が、前記第１の流路（３）を通して搬送されることによって、血管状態が前記第２の流路（４）で再現され、かつ肝臓状態が前記第１の流路（３）で再現される
請求項１３に記載の方法。 - 培地（７）が、前記流路（３、４）の少なくとも１つを通して搬送され、前記培地（７）の酸素含有量が、前記流路（３、４）の入口（５）で１５％の値に調整されており、かつ前記流路（３、４）の出口（６）で３～５％の値に調整されている
請求項１３に記載の方法。 - 前記肝類洞壁内皮細胞が、クッパー細胞、および／または肝実質細胞、および／または星細胞と共培養される
請求項１３ないし１６のいずれかに記載の方法。 - 前記培養細胞が、腸内皮細胞、および／または腸上皮細胞、および／または腸平滑筋細胞である
請求項１０ないし１２のいずれかに記載の方法。 - 前記培養細胞が、肺上皮細胞および／または肺内皮細胞である
請求項１０ないし１２のいずれかに記載の方法。 - 活性物質および／またはシグナル分子が、前記細胞培養チャンバーに洗い流される
請求項１０ないし１９のいずれかに記載の方法。 - 免疫細胞および／または微生物が、前記細胞培養チャンバーに洗い流される
請求項１０ないし２０のいずれかに記載の方法。
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