JP2024511729A - ポリマー - Google Patents

Abstract

式（Ｉ）の繰り返し単位を含む共役ポリマーであって、式中、Ｒ１が、各出現時において、置換基であり、Ｒ２が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、Ｘが、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ３から選択され、Ｒ３が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基である、共役ポリマー。本ポリマーは、核酸を配列決定する方法において発光マーカーとして使用され得る。本ポリマーは、試料中の標的分析物を識別する方法として使用され得る。【化１】TIFF2024511729000028.tif38155【選択図】図１

Description

本開示は、共役発光ポリマー、及び発光マーカーとしてのそれらの使用に関する。

ＵＳ９６２３１２３は、式（Ｉ）の蛍光共役ポリマーを開示している。

Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｍａ，Ｄ．，Ｋｉｍ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｉｎｇ Ｂｌｕｅ－Ｅｍｉｔｔｉｎｇ ８－Ａｍｉｎｏ－ＢＯＤＩＰＹ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ ２７，２２３１－２２３８（２０１７）は、タンパク質標識のための８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹ化合物の青色蛍光を開示している。

Ｂａｃａｌｕｍ ｅｔ ａｌ，“Ａ Ｂｌｕｅ－Ｌｉｇｈｔ－Ｅｍｉｔｔｉｎｇ ＢＯＤＩＰＹ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０１６，３２，３４９５－３５０５は、以下の式のＢＯＤＩＰＹ系の膜プローブを開示している。

いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の繰り返し単位を含む共役ポリマーを提供し、

式中、
Ｒ^１が、各出現時において、置換基であり、
Ｒ^２が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ^３から選択され、
Ｒ^３が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基である。

任意選択的に、各Ｒ^３は、独立して、
Ｈ、
Ｃ_１－２０アルキル又はＣ_１－２０アルキレン－Ａｒ^２（Ａｒ^２が、非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換され得る、アリール又はヘテロアリール基であり、末端Ｃ原子若しくはＸに結合したＣ原子以外のＣ_１－２０アルキル又はアルキレンの１つ以上の非隣接Ｃ原子が、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、又はＣＯＯで置き換えられ得、１つ以上のＨ原子が、Ｆで置き換えられ得る）、及び
非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換されている、アリール基又はヘテロアリール基Ａｒ^２、から選択される非イオン性基、
並びに
イオン性基、から選択される。

任意選択的に、各Ｒ^２は、Ｈである。

任意選択的に、各Ｒ^１は、Ｆ、ＣＮ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルキニル、－（ＯＣ２Ｈ_５）ｕ－Ｈ（式中、ｕが、１－５である）、及び非置換若しくは置換の芳香族基又はヘテロ芳香族基から選択される。Ｒ^１は、好ましくはＦである。

任意選択的に、Ｘは、ＮＲ^３である。

任意選択的に、共役ポリマーは、式（Ｉ）の繰り返し単位及び１つ以上の共繰り返し単位を含むコポリマーである。

任意選択的に、共役ポリマーは、非置換であるか、又は１つ以上の置換基で置換されているアリーレン又はヘテロアリーレン共繰り返し単位を含む。

任意選択的に、共役ポリマーは、４００～５００ｎｍの範囲のピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有する。任意選択的に、フォトルミネッセンススペクトルの放出ピークは、７５ｎｍ以下の半値全幅（ＦＷＨＭ）を有する。

任意選択的に、共役ポリマーは、５０ｎｍ未満のストークスシフトを有する。

任意選択的に、共役ポリマーの吸収スペクトルのピークは、５０ｎｍ以下のＦＷＨＭを有する。

任意選択的に、ポリマーは、水及びメタノールのうちの少なくとも１つにおける少なくとも０．１ｍｇ／ｍｇの溶解度を有する。

いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ－Ｍ）のモノマーを提供し、

式中、
Ｒ^１が、各出現時において、置換基であり、
Ｒ^２が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ^３から選択され、
Ｒ^３が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、
各ＬＧが、独立して、ボロン酸、ボロン酸エステル、ハロゲン化物、及び擬ハロゲン化物からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるようなモノマーの重合を含む、本明細書に記載されるような共役ポリマーを形成する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような共役ポリマーを含む発光粒子を提供する。

任意選択的に、粒子は、マトリックス材料を含む。

任意選択的に、マトリックス材料は、シリカである。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような共役ポリマー又は発光粒子と、生体分子を含む結合基と、を含む、発光マーカーを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、結合基に結合することが可能な官能基を含む、本明細書に記載される発光マーカーの前駆体を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような前駆体の官能基に結合基を結合させることを含む、本明細書に記載されるような発光マーカーを形成する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の溶媒中に溶解又は分散されている、本明細書に記載されるような共役ポリマー、発光粒子、又は前駆体を含む、製剤を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、核酸を配列決定する方法を提供し、プライミング鋳型核酸分子を、ポリメラーゼ及び試験ヌクレオチドと接触させることと、
試験ヌクレオチドをプライミング鋳型のプライミング鎖に、試験ヌクレオチドが鋳型鎖の次の塩基に相補的な塩基を含む場合にのみ、組み込むことと、
プライミング鎖を照射することと、
プライミング鎖の輝度から、試験ヌクレオチドがプライミング鎖に組み込まれているかどうかを判定することと、を含み、
照射されたプライミング鎖の試験ヌクレオチドが、試験ヌクレオチドに結合するように構成された、本明細書に記載されるような共役ポリマー、発光粒子、又は発光マーカーに結合する。

いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の標的分析物を識別する方法であって、標的分析物に結合するように構成された、本明細書に記載されるような共役ポリマー、発光粒子、又は発光マーカーが添加された試料を照射することと、共役ポリマーからの放出を検出することと、を含む、方法を提供する。任意選択的に、標的分析物は、細胞であり、本方法は、フローサイトメトリー方法である。

開示される技術及び添付の図面は、開示される技術のいくつかの実装形態を記載する。

いくつかの実施形態による、発光ポリマーについての放出及び吸収スペクトルのグラフである。

別段文脈が明らかに要求しない限り、説明及び特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの単語は、排他的又は網羅的な意味とは対照的に、包括的な意味、すなわち、「含むが、限定されない」という意味で解釈されるものである。追加的に、「ここに」、「上に」、「下に」、及び同様の意味を持つ単語は、本出願で用いる場合、本出願の特定の部分ではなく、本出願全体を指す。文脈が許す場合、単数又は複数を用いる詳細な説明における単語は、複数又は単数をそれぞれ含み得る。２つ以上の項目のリストに関連する「又は」という単語は、次の単語の解釈の全てを網羅する：リスト内の項目のいずれか、リスト内の全ての項目、及びリスト内の項目の任意の組み合わせ。特定の原子への言及は、特に別途記載しない限り、その原子の任意の同位体を含む。

本明細書において提供される技術の教示は、以下に記載されるシステムに限らず、他のシステムに適用することができる。以下に説明する様々な例の要素及び行為を組み合わせて、技術の更なる実装形態を提供することができる。本技術のいくつかの代替的な実装形態は、以下に示す実装形態に追加の要素を含むだけでなく、より少ない要素を含み得る。

以下の詳細な説明に照らし合わせて、これら及び他の変更は、技術に対して行うことができる。説明は技術の特定の例を記載し、考えられる最良のやり方を記載するが、説明がどれほど詳細に見えても、当該技術は多くの方法で実施することができる。上に記述されるように、技術のある特定の特色又は態様を記載する場合に使用される特定の用語は、その用語に関連する技術の任意の特定の特徴、特色、又は態様に制限されるように、その用語が本明細書で再定義されることを意味するものと解釈されるべきではない。一般に、以下の特許請求の範囲で使用される用語は、発明を実施するための形態のセクションでそのような用語を別段明示的に定義しない限り、技術を本明細書に開示の特定の実施例に限定するものと解釈されるべきではない。したがって、当該技術の実際の範囲は、開示された例だけでなく、特許請求の範囲に基づく当該技術を実施又は実装する全ての同等な方法を包含する。

特許請求の範囲の数を低減するために、技術のある特定の態様は、ある特定の特許請求の範囲の形態で以下に提示されるが、出願人は、任意の数の特許請求の範囲の形態における技術の様々な態様を企図している。

以下の説明では、説明の目的として、開示の技術の実施態様の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、当業者にとっては、開示された当該技術の実施形態は、これら特定の詳細のいくつかがなくても実施され得ることは明らかである。

いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の繰り返し単位を含む共役ポリマーを提供し、

Ｒ^１は、各出現時において、置換基、好ましくはＦ、ＣＮ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルキニル、－（ＯＣ２Ｈ_５）ｕ－Ｈ（ｕが、１－５である）、及び芳香族又はヘテロ芳香族基、好ましくはフェニルである。芳香族又は複素芳香族基Ｒ^１は、非置換であるか、又は１つ以上の置換基、任意選択的に、Ｆ、ＣＮ、ＮＯ_２、及びＣ_１－１２アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換され得、Ｃ_２－１２アルキルの１つ以上の非隣接、非末端のＣ原子が、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、又はＣＯＯで置き換えられ得、１つ以上のＨ原子が、Ｆで置き換えられ得る。

Ｒ^２は、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基、好ましくはＨ又はＣ_１－６アルキルである。

Ｘは、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ^３から選択される。

Ｒ^３は、Ｈ又は置換基である。ＸがＮＲ^３である場合、各Ｒ^３は、同じ又は異なり得る。

本発明者らは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含有する共役ポリマーが、電磁スペクトルの青色（＜５００ｎｍ）領域において放出を提供し得ることを見出した。本発明者らは、本明細書に記載されるようなポリマーが、４００ｎｍ超の波長で吸収ピーク波長を有し得ることを更に見出した。したがって、ポリマーは、小さい（例えば、５０ｎｍ未満）ストークスシフトを有し得る。

この小さいストークスシフトは、標的分析物、例えば、標的細胞の検出のためのアッセイ方法において、又は核酸配列決定方法において、有利であり得る。例えば、ＤＮＡ配列決定方法において、本明細書に記載されるようなポリマーをエミッタとして使用することにより、より長いピーク放出波長を有する放出種と比較して、より少ない回折によるウェルサイズの低減を可能にし得る。更に、小さいストークスシフトにより、より大きいストークスシフトを有するエミッタ、例えば、４００ｎｍを下回るＵＶ領域に吸収ピークを有する青色放出材料の使用と比較して、試料中のＤＮＡ鎖又は核酸への損傷を低減しながら試料を照射することが可能になり得る。

本明細書に記載されるような共役ポリマーは、互いに直接共役している繰り返し単位を含有する骨格を有するポリマーである。いくつかの実施形態では、骨格の全体が共役している。いくつかの実施形態では、骨格は、互いに共役した繰り返し単位、及びポリマー骨格に沿った共役を中断する繰り返し単位を含み得る。好ましくは、共役ポリマーは、隣接繰り返し単位に直接共役している式（Ｉ）の繰り返し単位を含む。

好ましくは、Ｒ^３は、
－Ｈ、
－Ｃ_１－２０アルキル又はＣ_１－２０アルキレン－Ａｒ^２（Ａｒ^２が、非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換され得る、アリール又はヘテロアリール基、好ましくはフェニルであり、末端Ｃ原子若しくはＸに結合したＣ原子以外のＣ_１－２０アルキル又はアルキレンの１つ以上の非隣接Ｃ原子が、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、又はＣＯＯで置き換えられ得、１つ以上のＨ原子が、Ｆで置き換えられ得る）、及び
－非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換されている、アリール基又はヘテロアリール基Ａｒ^２、から選択される非イオン性基、
並びに
イオン性置換基、から選択される。

本明細書で使用される場合、アルキル基の「末端Ｃ原子」とは、それぞれ、直鎖状又は分岐状の分岐状アルキルのメチル（－ＣＨ_３）基（ｇｒｏｕｐ）又は基（ｇｒｏｕｐｓ）を意味する。

Ａｒ^２の１つ以上の置換基は、存在する場合、任意選択的にかつ独立して、Ｆ、ＣＮ、ＮＯ_２、及びＣ_１－２０アルキル（１つ以上の非隣接、非末端のＣ原子が、Ｏ、Ｓ、ＣＯＯ、又はＣＯで置き換えられ得、アルキルの１つ以上のＨ原子が、Ｆで置き換えられ得る）から選択される。

好ましい非イオン性置換基Ｒ^３は、式（ＩＩ）の基を含むか、又はそれからなり、
－（ＣＨ_２）_ａ－（ＯＣ_２Ｈ_５）_ｂ－ＯＲ^４（ＩＩ）
式中、
ａが、少なくとも１、任意選択的に１、２、３、又は４であり、
ｂが、少なくとも１、好ましくは１より大きい、例えば２～１２であり、
Ｒ^４が、Ｈ又はＣ_１－５アルキル基である。

好ましくは、Ｒ^３は、Ｈであるか、又は各Ｒ^３がＨである場合と比較して、水中の共役ポリマーの溶解度を増加させる基、例えば、式（ＩＩ）の基又はイオン性置換基である。

好ましくは、本明細書に記載されるようなイオン性置換基は、式（ＩＩＩ）を有し、
－（Ｓｐ^１）_ｍ－（Ｒ^５）_ｎ（ＩＩＩ）
式中、Ｓｐ^１が、スペーサー基であり、ｍが、０又は１であり、Ｒ^５が、独立して、各出現時において、イオン性基であり、ｍが０である場合、ｎが、１であり、ｍが１である場合、ｎが、少なくとも１、任意選択的に１、２、３、又は４である。

好ましくは、Ｓｐ^１は、式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、又は（ＩＶｃ）から選択され、
－Ａｋ^１（ＩＶａ）
－Ａｋ^１－（Ａｒ^１）_ｂ（ＩＶｂ）
－（Ａｒ^１）_ｂ（ＩＶｃ）
式中、Ａｋ^１が、Ｃ_１－２０アルキレンであり、１つ以上の非隣接、非末端Ｃ原子 他のＣ原子結合Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣ＝Ｏ若しくはＣＯＯで置換され得、
Ａｒ^１は、各出現時において、独立して、アリーレン基又はヘテロアリーレン基、好ましくはフェニレンであり、これらは、１つ以上のイオン性基Ｒ^５に加えて、非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換され得、
ｂが、少なくとも１、任意選択的に１～３、好ましくは１である。

Ａｒ^１の非イオン性置換基は、Ｆ、ＣＮ、ＮＯ_２、及びＣ_１－１２アルキル（１つ以上の非隣接、非末端のＣ原子が、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、又はＣＯＯで置き換えられ得、１つ以上のＨ原子が、Ｆで置き換えられ得る）から選択され得る。

より好ましくは、Ｓｐ^１は、
－Ｃ_１－２０アルキレン（Ｘに結合したＣ原子以外の１つ以上の非隣接Ｃ原子が、Ｏで置き換えられている）、
－Ｃ_１－１２アルキレン－Ａｒ^１、より好ましくはＣ_１－１２アルキレン－フェニレン（アルキレンの１つ以上の非隣接Ｃ原子が、Ｏで置き換えられ得、Ａｒ^１基が、１つ以上のイオン性基Ｒ^５に加えて、非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換されている）、及び
－Ｃ_６－２０アリーレン又は５～２０員ヘテロアリーレン、更により好ましくはフェニレン（１つ以上のイオン性基Ｒ^５に加えて、非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換されている）、から選択される。

好ましい実施形態では、Ｓｐ^１は、フェニレン又はＣ_１－１２アルキレン－フェニレンであり、フェニレンが、少なくとも１つのイオン性基Ｒ^５及び式（Ｖ）の少なくとも１つの基で置換されており、
－Ｏ（Ｒ^６Ｏ）_ｖ－Ｒ^７（Ｖ）
式中、Ｒ^６が、各出現時において、Ｃ_１－１０アルキレン基、任意選択的にＣ_１－５アルキレン基であり、Ｒ^７が、Ｈ又はＣ_１－５アルキルであり、ｖが、０又は正の整数、任意選択的に１～１０である。好ましくは、ｖは、少なくとも２である。より好ましくは、ｖは、２～５である。ｖの値は、式（Ｖ）の全ての極性基において同じであり得る。ｖの値は、同じポリマーの式（Ｖ）の異なる基間で異なり得る。

任意選択的に、式（Ｖ）の基は、式－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｖＲ^７を有し、式中、ｖが、少なくとも１、任意選択的に１～１０であり、Ｒ^７が、Ｃ_１－５アルキル基、好ましくはメチルである。好ましくは、ｖは、少なくとも２である。より好ましくは、ｖは、２～１０である。

イオン性基Ｒ^５は、アニオン性又はカチオン性であり得る。

例示的なアニオン性基は、－ＣＯＯ^－、スルホネート基、水酸化物、スルフェート、ホスフェート、ホスフィネート、又はホスホネートである。

例示的なカチオン性基は、－Ｎ（Ｒ^８）_３ ^＋であり、式中、Ｒ^８が、各出現時において、Ｈ又はＣ_１－２０ヒドロカルビルである。好ましくは、各Ｒ^８は、Ｃ_１－２０ヒドロカルビルである。

本明細書の任意の場所に記載されるようなＣ_１－２０ヒドロカルビル基は、直鎖状、分岐状、及び環状のアルキル、任意選択的に、Ｃ_１－２０アルキル、非置換フェニル、及び１つ以上のＣ_１－１２アルキル基で置換されたフェニルから任意選択的に選択される。

カチオン性又はアニオン性基を含む本明細書に記載されるような共役ポリマーは、これらのイオン性基の電荷のバランスを保つために対イオンを含む。アニオン性又はカチオン性基及び対イオンは、各アニオン性基又はカチオン性基の電荷のバランスを保つ対イオンと同じ価数を有し得る。アニオン性又はカチオン性基は、一価又は多価であり得る。好ましくは、アニオン性及びカチオン性基は、一価である。

共役ポリマーは、複数のアニオン性又はカチオン性極性基を含み得、２つ以上のアニオン性又はカチオン性基の電荷は、単一の対イオンによってバランスが保たれる。任意選択的に、極性基は、二価又は三価の対イオンを含むアニオン性又はカチオン性基を含む。

アニオン性基の場合、カチオン対イオンは、任意選択的に金属カチオン、任意選択的にＬｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃｓ^＋、好ましくはＣｓ^＋、又は有機カチオン、任意選択的にテトラアルキルアンモニウムなどのアンモニウム、エチルメチルイミダゾリウム、又はピリジニウムである。

カチオン性基の場合、アニオン対イオンは、任意選択的にハロゲン化物、スルホネート基、任意選択的にメシレート又はトシレート、水酸化物、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ホスフィネート、ホスホネート、又はボレートである。

式（Ｉ）の例示的な繰り返し単位としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。

ポリマーは、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、任意選択的に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの、２０℃での水及びＣ_１－８アルコールのうちの少なくとも１つにおける溶解度を有し得る。

ポリマーは、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、任意選択的に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの、２０℃でのＣ_１－４アルコール、好ましくはメタノールにおける溶解度を有し得る。

溶解度は、以下の方法によって測定され得る。
固体ポリマーを、ガラスバイアルに秤量する。必要量の溶媒を添加し、続いて小さい磁気撹拌機を加える。次いで、バイアルにしっかりとキャップをし、６０℃で予熱したホットプレート上に置き３０分間撹拌する。ポリマー溶液を、使用前に室温に冷却させる。ポリマー溶液は、ポリマー含有バイアルを室温で３０分間超音波処理することによっても調製することができる。ポリマーの溶解度を、白色及び３６５ｎｍ ＵＶ光下で、目視観察により試験した。

共繰り返し単位
本明細書に記載されるポリマーは、全ての繰り返し単位が式（Ｉ）の単位であるホモポリマーであり得る。

好ましくは、本明細書に記載されるポリマーは、式（Ｉ）の繰り返し単位及び１つ以上の共繰り返し単位を含むコポリマーである。繰り返し単位は、ポリマーの繰り返し単位の１～９９ｍｏｌ％、任意選択的にポリマーの繰り返し単位の３～８０ｍｏｌ％又は５～５０ｍｏｌ％を構成し得る。例示的な共繰り返し単位としては、非置換であり得るか、又は１つ以上の置換基で置換され得るアリーレン共繰り返し単位、非置換であり得るか、又は１つ以上の置換基で置換され得るヘテロアリーレン共繰り返し単位、及び共役切断繰り返し単位が挙げられる。

例示的なアリーレン及びヘテロアリーレン共繰り返し単位としては、式（ＶＩ）～（ＸＩＩ）の繰り返し単位が挙げられ、

式中、
Ｒ^１０が、各出現時において、独立して、置換基であり、
Ｒ^１１が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基Ｒ^１０であり、２つのＲ^１１基が、連結されて、環を形成し得、
Ｒ^１２が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、
Ｒ^１３が、各出現時において、独立して、Ｃ_１－２０ヒドロカルビル基であり、
Ｚが、各出現時において、独立して、置換基、好ましくはＦ又はＣ_１－２０ヒドロカルビル基であり、
ｃが、０、１、２、３、又は４、好ましくは１又は２であり、
ｄが、０、１、又は２である。

任意選択的に、各Ｒ^１０が、独立して、
－Ｃ_１－２０アルキル（１つ以上の非隣接、非末端のＣ原子が、Ｏ、Ｓ、ＣＯＯ、又はＣＯで置き換えられ得、アルキルの１つ以上のＨ原子が、Ｆで置き換えられ得る）、
－式－（Ａｒ^３）_ｐの基（Ａｒ^３が、各出現時において、独立して、非置換であるか、又は１つ以上の置換基で置換されているアリール又はヘテロアリール基、好ましくはフェニルであり、ｐが、少なくとも１、任意選択的に１、２、又は３である）、及び
－イオン性置換基Ｒ^５、から選択される。

好ましくは、各Ｒ^１１は、Ｈであるか、又は両方のＲ^１１基が、連結されて、環、任意選択的に６又は７員環を形成する。任意選択的に、２つのＲ^１１基は、連結されて、環を形成し、連結されたＲ^１１基は、Ｃ_２－又はＣ_３－アルキレン鎖を形成し、アルキレン鎖の１つ以上の非隣接Ｃ原子は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^１３、又はＳｉ（Ｒ^１３）_２（Ｒ^１３が、各出現時において、独立して、Ｃ_１－２０ヒドロカルビル基である）で置き換えられ得る。

両方のＲ^１１基が連結されている例示的な繰り返し単位は、式（ＩＸａ）を有する。

各Ｒ^１２は、好ましくはＨ又は置換基Ｒ^１０、より好ましくはＨである。

存在する場合、式（ＶＩ）～（ＸＩＩ）から選択される繰り返し単位は、ポリマーの繰り返し単位の１～９９モル％、好ましくはポリマーの繰り返し単位の少なくとも２５モル％又は少なくとも５０モル％を構成する。

共役切断繰り返し単位は、式（ＸＶ）を有し得、

式中、Ａｒ^４及びＡｒ^５が、各々独立して、非置換であるか、又は１つ以上の置換基で置換されるＣ_６－２０アリーレン基又は５～２０員ヘテロアリーレン基を表し、ＣＢが、Ａｒ^４とＡｒ^５との間の共役経路を提供しない共役切断基を表す。

存在する場合、式（ＸＶ）の繰り返し単位は、ポリマーの繰り返し単位の、１～５０ｍｏｌ％、任意選択的に１～２５ｍｏｌ％を構成する。

Ａｒ^４及びＡｒ^５は、各々独立して、非置換であるか、又は１つ以上の置換基で置換されている。Ａｒ^４及びＡｒ^５の置換基は、存在する場合、任意選択的に、上記のような置換基Ｒ^１０から選択される。

任意選択的に、Ａｒ^４及びＡｒ^５は、各々独立して、非置換又は置換フェニレン、任意選択的に１，３－又は１，４－連結フェニレンである。

ＣＢは、Ａｒ^４とＡｒ^５との間の任意の共役経路を提供しない。任意選択的に、ＣＢは、Ａｒ^４とＡｒ^５との間に、単結合及び二重結合が交互に並ぶ経路を提供しない。

任意選択的に、ＣＢは、Ｃ_１－２０分岐状又は直鎖状のアルキレン基であり、１つ以上のＨ原子は、Ｆで置換され得、アルキレン基の１つ以上の非隣接Ｃ原子は、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、又はＳｉ（Ｒ^１６）^２で置換され得、式中、各出現時において、Ｒ^１６は、独立して、Ｃ_１－２０ヒドロカルビル基である。

任意選択的に、ＣＢは、Ａｒ^４及びＡｒ^５を分離する少なくとも１つのｓｐ^３混成炭素原子を含有する。

共役切断繰り返し単位は、式（ＸＶａ）又は（ＸＶｂ）を有し得、

式中、各ｗが、独立して、０～４、任意選択的に０、１、又は２であり、各Ｒ^１０が、独立して、上記のような置換基であり、各Ｒ^１５が、独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキル基、好ましくはＨであり、ｊが、少なくとも１であり、ｋが、少なくとも１であり、ｌが、少なくとも１である。

いくつかの実施形態では、各ｗは、０である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｗは、１又は２である。

任意選択的に、ｊは、２～２０又は２～１２である。

任意選択的に、ｋは、２～６、好ましくは２である。

任意選択的に、ｌは、１～６である。

好ましい実施形態では、共役ポリマーは、本明細書に記載されるように、少なくとも１つのイオン性置換基、好ましくはイオン性置換基Ｒ^５で置換された共繰り返し単位を含む。より好ましくは、少なくとも１つのイオン性置換基で置換された共繰り返し単位は、式（ＶＩ）～（ＸＩＩ）の共繰り返し単位から選択される。イオン性置換基で置換された例示的な繰り返し単位としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。

ポリマー形成
本明細書に記載される共役発光ポリマーは、当業者に既知の任意の方法によって形成され得る。ポリマー骨格内の繰り返し単位の配置は、例えば、ブロックコポリマーの形成、異なる反応性基を有するモノマーを必要とする重合方法の使用、及びモノマー比の選択によって制御され得る。

本明細書に記載されるような共役ポリマーは、モノマーの重合時に脱離して、共役繰り返し単位を形成する脱離基を含むモノマーを重合することによって形成され得る。例示的な重合方法としては、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，「Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ Ａｎｄ Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ Ｓｔａｂｌｅ ｐｉ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｐｏｌｙ（ａｒｙｌｅｎｅ）ｓ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，１７，１１５３－１２０５に記載されているようなＹａｍａｍｏｔｏ重合、並びに例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ００／５３６５６、ＷＯ２００３／０３５７９６、及びＵＳ５７７７０７０に記載されるようなＳｕｚｕｋｉ重合が挙げられるが、これらに限定されない。

モノマーは、ボロン酸脱離基又はそのエステルと、ハロゲン化物又は擬ハロゲン化物（例えば、スルホネート）脱離基とを含有するモノマーの重合によって形成され得る。任意選択的に、ポリマーは、式（Ｉ－Ｍ）のモノマーの重合によって形成され、

式中、ＬＧが、ボロン酸、ボロン酸エステル、ハロゲン化物、又は疑ハロゲン化物脱離基である。

核酸配列決定
本明細書に記載されるような共役ポリマーを含むか、又はそれからなる発光マーカーは、発光マーカーがヌクレオチドに結合している、好適には共有結合している核酸を分析及び／又は配列決定するための方法において、として使用され得る。

本方法のいくつかの実施形態では、プライミング鋳型核酸分子を、ポリメラーゼ及び試験ヌクレオチドと接触させる。試験ヌクレオチドは、プライミング鋳型のプライミング鎖に、試験ヌクレオチドが鋳型鎖の次の塩基に相補的な塩基を含む場合にのみ、組み込まれる。ヌクレオチドに結合した共役ポリマーからの光の放出は、試験ヌクレオチドのプライミング鎖への組み込みを示す。

いくつかの実施形態では、共役ポリマーは、ポリメラーゼ及びプライミング鋳型核酸分子と接触する前に、試験ヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、発光ポリマーは、試験ヌクレオチドがプライミング鎖に組み込まれた後に、試験ヌクレオチドに結合する。

共役ポリマーは、試験ヌクレオチドに結合する結合基で置換され得る。試験ヌクレオチドは、結合基に結合するための相補基で置換され得る。例えば、試験ヌクレオチド及び共役ポリマーのうちの一方は、ビオチンで官能化され得、試験ヌクレオチド及び共役ポリマーのうちの他方は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、又はそれらの組換え変異体で官能化され得る。

いくつかの実施形態では、共役ポリマーは、切断可能なリンカー、例えば、官能基の結合によって形成された切断可能なリンカーによって、試験ヌクレオチドに結合する。共役ポリマーからの任意の放出の検出に続いて、リンカーは、切断されて、プライミング鎖からポリマーを分離し得、次いで、プライミング鎖は、更なる試験ヌクレオチドと接触させられ得る。切断は、切断剤での処理によるものであり得る。切断は、照射によるものであり得る。例示的な切断可能なリンカーは、Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ，“Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｉｓｓｕｅ ２，２０１２，ｐ．５７１－５８２に開示されており、この内容は、その全体が本明細書に組み込まれ、カルバメート、並びにジスルフィドアルファ置換基を有するエーテル及びアジドアルファ置換基を有するエーテルなどの、遷移金属又はホスフィン触媒によって切断され得る基が挙げられるが、これらに限定されない。

アッセイ方法
任意選択的に、発光マーカーは、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、例えばインビボイメージングにおけるルミネッセントイメージング用途、又は発光マーカーが分析される試料と接触する任意の他の用途に使用するためのものである。分析は、時間分解分光法を使用して実施され得る。本用途は、患者（該当する場合）が関与しているか、又は研究目的であるかにかかわらず、医療、獣医、農業、又は環境用途であり得る。

好ましくは、発光マーカーは、４００ｎｍ超、任意選択的に４００ｎｍ超～４５０ｎｍの波長を有する光による照射によって励起される。好ましくは、発光マーカーからの放出は、５００ｎｍ未満、好ましくは４５０～５００ｎｍの範囲の波長で放出を検出するように構成された光検出器によって検出される。

使用中、発光マーカーの結合基は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質、及びホルモンが挙げられるが、これらに限定されない、標的生体分子に結合し得る。標的生体分子は、細胞の表面における生体分子、例えば、タンパク質である場合、又はタンパク質でない場合がある。

分析される試料は、発光マーカー、例えば、溶液に溶解した発光マーカー、又はコロイド懸濁液中の粒子状発光マーカーと接触され得る。

いくつかの実施形態では、試料は、フローサイトメトリーによって分析される。フローサイトメトリーでは、発光マーカー又はマーカーは、少なくとも１つの光の波長、任意選択的に２つ以上の異なる波長、例えば、約３５５、４０５、４８８、５３０、５６１、及び６４０ｎｍ（これらの各々が±１０ｎｍであり得る）のうちの少なくとも１つを含む、１つ以上の波長によって照射される。発光マーカーによって放出された光は、１つ以上の検出器によって収集され得る。染色指数の計算のためのバックグラウンド信号を提供するために、測定は、発光マーカーに結合しない細胞と混合された発光マーカーで行われ得る。

本明細書に記載されるような共役ポリマーは、標的分析物の検出のための方法において発光マーカーとして使用され得る。

いくつかの実施形態では、標的分析物に対する親和性を有する結合基は、共役発光ポリマーに結合、好ましくは共有結合している。結合基は、発光ポリマーの繰り返し単位の側基として、又は発光ポリマーの末端基として提供され得る。いくつかの実施形態では、例えばフローサイトメトリーにおける、使用中の共役発光ポリマーは、分析される試料中に溶解又は分散され得る。共役発光ポリマーが溶解される場合、共役発光ポリマーは、好ましくは、水に溶解される。

発光粒子
粒子状発光マーカーは、本明細書に記載されるような共役ポリマーを含むか、又はそれからなり得る。

いくつかの実施形態では、発光マーカー粒子は、崩壊形態の共役発光ポリマーを含む。

好ましい実施形態では、発光マーカー粒子は、マトリックス材料及び共役発光ポリマーを含む。マトリックス材料は、好ましくは、無機マトリックス材料、例えばシリカである。これらの実施形態によれば、結合基は、マトリックスに結合、好ましくは共有結合し得る。

マトリックス材料としては、無機マトリックス材料、任意選択的に無機酸化物、任意選択的にシリカが挙げられるが、これらに限定されない。マトリックスは、発光材料を周囲の環境から少なくとも部分的に隔離し得る。これによって、外部環境が発光材料の寿命に及ぼし得る影響が制限され得る。

発光マーカー粒子は、コア、及び任意選択的に、コアを取り囲む１つ以上のシェルを含み得る。

共役発光ポリマーのポリマー鎖は、コア及び／又はシェルの厚さの一部又は全てにわたって延在し得る。ポリマー鎖は、コア及び／若しくはシェル内に含有され得るか、又はコア及び／若しくはシェルの表面を通して突出し得る。

共役発光ポリマーは、マトリックス材料と混合され得る。

共役発光ポリマーは、マトリックス材料に結合、例えば、共有結合し得る。

いくつかの実施形態では、粒子コアは、例えば、この内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／０６０７２２に記載されているように、発光ポリマーの存在下でのシリカモノマーの重合によって形成され得る。

いくつかの実施形態では、粒子コアは、発光ポリマー、及び内側コアを取り囲む少なくとも１つのシェルを含むか、又はそれからなるコアを含む。少なくとも１つのシェルは、シリカであり得る。

任意選択的に、粒子の総重量の少なくとも０．１重量％は、共役発光ポリマーからなる。好ましくは、粒子コアの総重量の少なくとも１、１０、２５重量％は、共役発光ポリマーからなる。

任意選択的に、粒子コアの総重量の少なくとも５０重量％は、マトリックス材料からなる。好ましくは、粒子コアの総重量の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、９９．９重量％は、マトリックス材料からなる。

本明細書に記載されるような粒子コアは、任意の表面基、例えば、表面基上の結合基又は可溶化基を含まない発光粒子である。

本開示の一実施形態では、粒子コアの総重量の少なくとも７０重量％は、共役発光ポリマー及びシリカからなる。好ましくは、粒子コアの総重量の少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、９９．９重量％は、共役発光ポリマー及びシリカからなる。より好ましくは、粒子コアは、共役発光ポリマー及びシリカから本質的になる。

好ましくは、粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用する動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定される場合、５０００ｎｍ以下、より好ましくは、２５００ｎｍ、１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、又は４００ｎｍ以下の数平均直径を有する。好ましくは、粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳによって測定される場合、５～５０００ｎｍ、任意選択的に１０～１０００ｎｍ、好ましくは１０～５００ｎｍ、最も好ましくは１０～１００ｎｍの数平均直径を有する。

表面基は、発光粒子の表面に結合し得る。例示的な表面基としては、エーテル含有基、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖を含有する基、及び生体分子を含む結合基を含有する基が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載されるような発光粒子は、液体中に懸濁されている粒子を含むコロイド懸濁液として提供され得る。好ましくは、液体は、水、Ｃ_１－１０アルコール、及びこれらの混合物から選択される。好ましくは、粒子は、液体中に均一な（凝集していない）コロイドを形成する。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び任意の更なる発光マーカーの各々は、液体中に分散された発光粒子である。いくつかの実施形態では、発光マーカーのうちの１つ以上は、液体中に分散された粒子形態であり、発光マーカーのうちの１つ以上は、液体中に溶解している。

液体は、その中に溶解した塩を含む溶液、任意選択的に緩衝溶液であり得る。

いくつかの実施形態では、粒子は、粉末形態、任意選択的に凍結乾燥又は冷凍の形態で保存され得る。

官能基
例えば標的分析物又は試験ヌクレオチドに結合するための、発光マーカーの結合基は、発光マーカーの前駆体の官能基への結合によって発光マーカーに結合し得る。

いくつかの実施形態では、官能基は、共役発光ポリマーに共有結合している。

いくつかの実施形態では、官能基は、マトリックス材料及び共役発光ポリマーを含む粒子状マーカー前駆体のマトリックス材料に共有結合している。

任意選択的に、官能基は、
アミン基、任意選択的に－ＮＲ^９ _２（Ｒ^９が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基、好ましくはＨ又はＣ_１－５アルキル、より好ましくはＨである）、
カルボン酸又はその誘導体、例えば、無水物、酸塩化物若しくはエステル、酸塩化物、酸無水物、又はアミド基、
－ＯＨ、－ＳＨ、アルケン、アルキン、及びアジド、並びに
ビオチン又はビオチン－タンパク質共役物から選択される。

官能基は、生体分子と反応して、生体分子を発光マーカーの残りの部分と連結する連結基を形成し得、連結基は、エステル、アミド、尿素、チオ尿素、シッフ塩基、一級アミン（Ｃ－Ｎ）結合、マレイミド－チオール付加物、又はアジドとアルキンとの付加環化によって形成されるトリアゾールから選択される。

標的分析物に結合するための例示的な結合基生体分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質、ホルモン、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

官能基がビオチンである場合、それは、タンパク質、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及びこれらの組換え変異体に共役し得、ビオチン化した生体分子は、タンパク質に共役して、発光マーカーを形成し得る。

ビオチン化生体分子は、標的抗原に従って選択され得る抗原結合断片、例えば、抗体を含み得る。

発光粒子の場合、官能基は、発光粒子の表面に結合し得、例えば、発光粒子のマトリックス材料に結合し得る。各官能基は、発光粒子の表面に直接結合し得るか、又は１つ以上の表面結合基によってそれから離間し得る。表面結合基は、極性基を含み得る。任意選択的に、表面結合基は、ポリエーテル鎖を含む。本明細書で使用される場合、「ポリエーテル鎖」とは、２つ以上のエーテル酸素原子を有する鎖を意味する。

発光粒子コアの表面は、反応して、官能基に結合し得る表面に基を形成し得る。任意選択的に、シリカ含有粒子は、シロキサンと反応する。

用途
本明細書に記載されるような発光マーカーは、生体分子又は細胞を検出又は標識するためのルミネッセントプローブとして使用され得る。いくつかの実施形態では、粒子は、ラテラルフロー又は固体イムノアッセイなどのイムノアッセイにおけるルミネッセントプローブとして使用され得る。

測定
別途記載しない限り、放出スペクトルは、溶解したポリマーの場合にはメタノール中で、本明細書に記載されるようなポリマーを含有する粒子の場合には水中で、設定波長３００ｎｍ～９５０ｎｍ、光源１５０Ｗキセノン光及び帯域幅１０ｎｍ以下（ＦＷＨＭ）を有するＨａｍａｍａｔｓｕ Ｃ９９２０－０２機器を使用して測定したものである。最初に、システムは、赤色（３９５ｎｍ）、緑色（３７５ｎｍ）、及び青色（３３５ｎｍ）のガラス標準で較正した。２つの５ｍＬのロングネック型キュベット（１つは、参照溶媒、例えばメタノール又は水で充填されている）、及び１つは、溶解した発光マーカーについては１対１００に希釈された１ｍｇ／ｍＬの試料、又は粒子状発光マーカーについては水で約１対１０に希釈された１ｍｇ／ｍｌの試料で充填されている。試料の最終濃度を変更して、０．２５～０．３５の範囲の透過データを得た。各試料についての３つの測定値の平均を記録する。

別途記載しない限り、本明細書に記載されるようなポリマーの吸収スペクトルは、Ｃａｒｙ ５０００ ＵＶ－ＶＩＳ－ＮＩＲ分光計を使用して、メタノール中で測定する。粒子状発光材料の吸収及び放出スペクトルは、水中の分散液として測定する。測定は、データ分解能を最適に制御するために可変スリット幅（０．０１ｎｍまで）を有する拡張測光範囲用のＰｂＳｍａｒｔ ＮＩＲ検出器を使用して１７５ｎｍ～３３００ｎｍで行った。フロント及びバックの５ｍＬ適合キュベット（６００～２５０ｎｍ）内で、ベースラインを水で実行し、これに続いて、バックキュベットの参照物は、メタノールとして残り、フロントキュベットは、溶解した発光マーカーについては１対１００に希釈された１ｍｇ／ｍｌの試料、又は粒子状発光マーカーについては水で約１対１０に希釈された１ｍｇ／ｍＬの試料に変更した。

反応スキーム１に従って、モノマー実施例１を調製した。

反応は、機械撹拌機、還流凝縮器、窒素入口、及び排出口を備えた１Ｌの４つ口丸底フラスコを使用して実施した。１Ｈ－ピロール（２５ｍＬ）、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５８．３ｍＬ、０．３３４３ｍｏｌ）及び１，２－ジクロロエタン（１５０ｍＬ）を１Ｌの丸底フラスコに添加した。フラスコを０℃に冷却し、１，２－ジクロロエタン（３５０ｍＬ）に溶解したトリホスゲン（３５．３ｇ、０．１１９ｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと添加した。上記反応混合物を０℃で２時間撹拌し、２０％酢酸エチル：ＤＣＭを使用するＴＬＣによってモニタリングし、これによって、極性スポット及び出発物質の非存在（ＫＭｎＯ_４染色を使用することによって可視化する）を観察した。再び、１Ｈ－ピロール（２５ｍＬ）をゆっくりと導入し、８０℃で１時間加熱し、ＴＬＣによる反応モニタリングは、７０％の未反応の出発物質を示した。再度、１Ｈ－ピロール（１８ｍＬ）を８０℃で滴下添加し、８０℃で一晩撹拌を続けた。２つのバッチ反応混合物を室温（２５℃）に冷却し、合わせ、ＭＴＢＥ（３Ｌ）で希釈し、水（３Ｌ）に注いだ。上記混合物を、ブフナー漏斗を通して濾過し、固体を分離した。濾液の層を分離し、有機層を水及び飽和ブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、粗生成物（４７ｇ）を得た。粗生成物を、溶出液としてヘキサン中の３０％酢酸エチルを使用する３ロット（各々１５．６ｇ）のカラムクロマトグラフィーによって精製して、９２％ＬＣＭＳ純度の１０ｇを得た。得られた固体を、石油エーテル（２００ｍＬ）中の２％酢酸エチルで、室温（２５℃）で２時間再結晶させ、ブフナー漏斗を通して濾過して、９９．６８％ＬＣＭＳ純度の７．８９％を得た。収率＝２１％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ［ｐｐｍ］６．３７－６．３８（ｍ，２Ｈ），７．１０－７．１０（ｍ，２Ｈ），７．１７－７．１７（ｍ，２Ｈ），９．６２（ｂｓ，２Ｈ）．

反応には、磁気撹拌機、窒素入口、及び排出口を備えた２５０ｍＬの３つ口丸底フラスコを使用した。中間体３（８ｇ、０．０１８７ｍｏｌ）及びジクロロエタン（１２０ｍＬ）を、窒素下、室温（２５℃）で２５０ｍＬの丸底フラスコに添加した。上記反応混合物に、オキシ塩化リン（９．３２ｍＬ、０．０９９７ｍｏｌ）を、室温（２５℃）でゆっくりと滴下添加し、８０℃に３時間加熱した。次いで反応物を０℃に冷却し、トリエチルアミン（７０ｍＬ、０．５２７１ｍｏｌ）、続いて三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（６７．５ｍＬ、０．５４４ｍｏｌ）を添加し、次いで反応混合物を室温（２５℃）にし、１時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ及びＬＣＭＳによってモニタリングした。ＬＣＭＳが生成物形成の９４％及び出発物質の非存在を示したとき、反応混合物をエーテル（３００ｍＬ）で希釈し、水（５００ｍＬ）及び飽和ブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、９ｇの粗生成物を得た。粗生成物を、ヘキサン中の約３５％ＤＣＭを溶出液として使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、９９．７％ＬＣＭＳ純度の６ｇを得た。収率＝５３％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ［ｐｐｍ］６．６０（ｄ，Ｊ＝４．４０ Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝４．４０ Ｈｚ，２Ｈ），７．９１（ｓ，２Ｈ）．

機械撹拌機、添加漏斗、窒素入口、及び排出口を備えた５００ｍＬの３つ口丸底フラスコを反応に使用した。注記：２つのバッチ（２．５ｇ及び２ｇ）を作製し、カラム精製段階で、画分を合わせて、熱いアセトニトリルによって更に精製した。中間体５（２．５ｇ、０．０１１ｍｏｌ）を、室温（２５℃）でアセトニトリル（２５０ｍＬ）と合わせた。アセトニトリル（６０ｍＬ）に溶解したＮＢＳ（４．０９ｇ、０．０２２９ｍｏｌ）を、室温（２５℃）で２０分間かけてゆっくりと滴下添加した。反応物を室温（２５℃）で６時間撹拌した。上記反応混合物を酢酸エチルで希釈し、次いで、水、飽和ブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、７０％ＬＣＭＳ純度の粗生成物を得た。粗生成物を、ヘキサン中の溶出液約１０％ＤＣＭを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、２つの画分を単離した。画分１：７５％ＬＣＭＳ純度の１．５ｇ。画分２：９３％ＬＣＭＳ純度の０．７ｇ。これらの画分を、別の２ｇバッチ画分と合わせた。画分１：８５％ＬＣＭＳ純度の１．２ｇ。画分２：７９％ＬＣＭＳ純度の０．５ｇ。全ての上記画分を、化合物をアセトニトリル（６０ｍＬ；）と合わせた熱いアセトニトリルで処理し、６０℃に加熱し、室温にゆっくりと冷却させ、２時間撹拌し、濾過し、真空下で乾燥させて、３．５ｇの生成物を単離した。収率＝４６％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ［ｐｐｍ］７．４５（ｓ，２Ｈ），７．８２（ｓ，２Ｈ）．

磁気撹拌子、凝縮器、及びＮ_２入口、及び排出口、及び油浴を備えた５００ｍＬのマルチネックＲＢＦを反応に使用した。注記：別の１ｇバッチ反応を実施し、バッチ反応の生成物を精製段階で合わせた。中間体５（２．４ｇ、０．００６２ｍｏｌ）をアセトニトリル（２４０ｍＬ）と合わせ、０℃に冷却し、次いで、ＴＨＦ（３６ｍＬ）中の０．５Ｍアンモニア溶液をゆっくりと滴下添加した。反応混合物を０℃～１０℃で２時間撹拌し、この後に、ＬＣＭＳによる反応モニタリングにより、８１．１８％の所望の生成物形成及び出発物質の非存在が示された。反応混合物を、セライトプラグを通して濾過し、ＤＣＭとメタノールの１：１混合剤により洗浄した。濾液を濃縮して、２．５ｇの粗生成物を得た。粗生成物を、３ロットのＧＲＡＣＥ逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム）によって精製した。溶出液：水／アセトニトリル。水中の約５６％のアセトニトリルで、所望の生成物を溶出した。注記：粗材料の２つのバッチを合わせ（２．５ｇ及び０．９ｇ）、逆相カラム精製を使用して精製した。ロット１－粗製物（１．１ｇ）→画分１：モノブロミド不純物とともに、７７％ＬＣＭＳ純度の０．１ｇ。画分２：０．６％のトリブロミド不純物とともに、９９．２４％ＬＣＭＳ純度の０．４７ｇ。ロット２－粗製物（１．１ｇ）→画分１：２５．８２％のモノブロミド不純物とともに、６８．５％ＬＣＭＳ純度の０．０９４ｇ。画分２：５．０４％のトリブロミド不純物とともに、９８．５９％ＬＣＭＳ純度の０．６１２ｇ。画分３：６．１％のトリブロミド不純物とともに、９３．３２％ＬＣＭＳ純度の０．３０１ｇ。ロット３－粗製物（１．２ｇ）→画分１：３．６１％のトリブロミド不純物とともに、９８．１１％のＬＣＭＳ純度の０．７２２ｇ。画分２：４．４％のトリブロミド不純物とともに、９４．６６％ＬＣＭＳ純度の０．０７１ｇ。画分３：６．１％のトリブロミド不純物とともに、９３．３２％ＬＣＭＳ純度の０．３０１ｇ。＜９８％純度の画分を合わせ、逆相カラムクロマトグラフィーによって再精製して、９９．８％ＬＣＭＳ純度の１．３ｇを得た。全ての純粋な画分を合わせ、ｎ－ヘキサン（４０ｍＬ、室温（２５℃））とともに２時間撹拌し、濾過し、真空下で乾燥させて、９９．６５％ＨＰＬＣ純度の１．６９ｇを黄色固体として得た。収率＝５２％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ［ｐｐｍ］７．５７（ｓ，４Ｈ），９．９７（ｓ，２Ｈ）．
スキーム２に従って、実施例モノマー２を合成した。

反応には、添加漏斗、磁気撹拌、凝縮器、油浴Ｎ_２入口、及び排出口を備えた５００ｍＬ×２マルチネック丸底フラスコを使用した。注記：反応を２２．５ｇ×２平行バッチ中で実施した。反応混合物を単離のために合わせた。２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール（１２．１ｍＬ）、Ｎ－エチルジ－イソプロピルアミン（１８．４ｍＬ、１０３ｍｍｏｌ）、及び１，２－ジクロロエタン（１２０ｍＬ）を５００ｍＬの丸底フラスコに入れた。フラスコを０℃に冷却し、１，２－ジクロロエタン（１２０ｍＬ）に溶解したトリホスゲン（１１．１ｇ、３７．７ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと添加した。上記反応混合物を０℃で１時間撹拌した。反応を、１：５の酢酸エチル：ＤＣＭを使用したＴＬＣによってモニタリングし、これによって、極性スポット及び出発物質の非存在（ＫＭｎＯ_４染色を使用することによって可視化）が観察された。再び、２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール（１２．１ｍＬ）をゆっくりと導入し、８０℃で２時間加熱し、反応を、ＴＬＣによって所望の生成物についてモニタリングした。同様に、上記ステップに従うことによって別の反応を実行し、反応混合物を室温（２５℃）に冷却し、合わせ、ＭＴＢＥ（１Ｌ）及び水（５００ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水層を再びＭＴＢＥ（３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水、飽和食塩水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、粗生成物（３７ｇ）を得た。粗生成物を、ヘキサン中の２０～２５％酢酸エチルの溶出液を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製し、２つの画分を単離した。画分１：９４．６３％ＬＣＭＳ純度を有する３．４ｇ。画分２：９６％ＬＣＭＳ純度を有する３．６ｇ。両方の画分を合わせ、室温（２５℃）で２時間石油エーテル（７０ｍＬ）中の１０％酢酸エチルで粉末化し、濾過し、真空下で乾燥させて、９８．４％ＬＣＭＳ純度の５．５ｇを得た。収率＝３４％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ［ｐｐｍ］２．０３（ｓ，６Ｈ），２．１７（ｓ，６Ｈ），５．７５（ｓ，２Ｈ），１０．９１（ｓ，２Ｈ）．

反応には、磁気撹拌機、窒素入口、及び排出口を備えた５００ｍＬの３つ口丸底フラスコを使用した。中間体３（６ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）及びジクロロエタン（１００ｍＬ）を、窒素下、室温（２５℃）で５００ｍＬのＲＢフラスコに入れた。上記反応混合物に、オキシ塩化リン（５．１７ｍＬ、５５．４ｍｍｏｌ）を室温でゆっくりと滴下添加し、８０℃に３時間加熱した。反応物を０℃に冷却し、トリエチルアミン（３８．７ｍＬ、２７６ｍｍｏｌ）を、続いて三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（３７．４ｍＬ、３０４ｍｍｏｌ）を、滴下漏斗を用いてゆっくりと滴下添加し、次いで、反応混合物を室温（２５℃）にした。反応混合物を室温で１時間撹拌し、反応の進行をＴＬＣ及びＬＣＭＳによってモニタリングした。ＬＣＭＳが９５％の生成物形成及び出発物質の非存在を示したとき、反応混合物をＭＴＢＥ（５００ｍＬ）で希釈し、水（５００ｍＬ）を添加した。観察した固体を、ブフナー漏斗を通して濾過し、濾液を飽和ブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、純度９３．８％の５．５ｇの粗生成物を得た。濾過した固体（２ｇ）は、ＬＣＭＳにおいて９９％の所望の質量を示した。両方の材料を合わせ、溶出液として酢酸エチル／ヘキサンを使用するＧｒａｃｅカラムクロマトグラフィーによって精製した。化合物を３０％の酢酸エチル：ヘキサンで溶出して、２つの画分を得た。画分１：９９．２５％ＬＣＭＳ純度の０．２ｇ。画分２：９９．８％ＬＣＭＳ純度の４．５ｇ。収率＝６０％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ［ｐｐｍ］２．４９（ｓ，６Ｈ），２．５４（ｓ，６Ｈ），６．１２（ｓ，２Ｈ）．

磁気撹拌機、添加漏斗、窒素入口、及び排出口を備えた１０００ｍＬの３つ口丸底フラスコを使用して、反応を実施した。中間体５（４．５ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）を、室温（２５℃）でアセトニトリル（４５０ｍＬ）と合わせた。アセトニトリル（６０ｍＬ）に溶解したＮＢＳ（５．９２ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）を、室温（２５℃）で２０分間かけてゆっくりと滴下添加した。反応混合物を室温（２５℃）で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳによる反応モニタリングは、９９％の所望の生成物質量を示した。上記反応混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈し、次いで、水、飽和ブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、９９％の所望の質量を有する７．２ｇの粗生成物を得た。粗生成物を、ヘキサン中の２～１０％ＤＣＭを溶出液として使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、９９．１％純度の所望の生成物５．５ｇを単離した。収率＝７８％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ［ｐｐｍ］２．５２（ｓ，６Ｈ），２．６０（ｓ，６Ｈ）．

磁気撹拌子、添加漏斗、及び窒素入口、及び氷冷水浴を備えた１ＬのマルチネックＲＢＦを使用して、反応を実施した。中間体６（４．１５ｇ）をトルエン（２９０ｍＬ）と合わせた。反応物を０℃に冷却し、次いで、ＴＨＦ中のアンモニア（０．５Ｍ、２９０ｍＬ）を、添加漏斗を使用して３０分間かけてゆっくりと添加した。反応を０℃～１０℃で２時間継続し、次いで、反応物をゆっくりと室温（２５℃）に到達させ、撹拌を１６時間継続した。反応の進行をＬＣＭＳによってモニタリングし、ＬＣＭＳは、１．８％の出発物質とともに９６．７％の所望の質量を示した。反応を停止させ、いくつかの固体形成を観察した。反応混合物を、セライトプラグを通して濾過し、濾液を濃縮して、１ｇの粗生成物（画分１）を得た。セライトプラグをＴＨＦで十分に洗浄し、３．２８ｇの粗生成物を単離した（画分２）。得られた粗生成物（画分１及び画分２）を、アセトニトリル／トルエンを使用して別個に再結晶させて、０．６３ｇの９９．７６％純粋な及び２．４ｇの９８．７７％純粋な生成物を得た。２．４ｇの９８．７７％純粋な生成物を、再び、アセトニトリル（２３０ｍＬ）及びトルエン（５０ｍＬ）の混合物を使用して２回再結晶させて、２．０４ｇの９９．６３％純粋な生成物を得た。両方の画分を合わせ、アセトニトリル（３０ｍＬ）で粉末化して、２．６３ｇの純度９９．８％を有するモノマー２を単離した。収率＝６６％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ［ｐｐｍ］２．３７（ｓ，６Ｈ），２．４２（ｓ，６Ｈ）．

ポリマー
ポリマー１を、以下のモノマーを用いたモノマー１（４０ｍｏｌ％）のＷＯ００／５３６５６に記載されているようなＳｕｚｕｋｉ重合によって形成し、続いて、エステル基Ｒ^１０’を、ＷＯ２０１２／１３３２２９に開示されているようなセシウムカルボキシレート基Ｒ^１０に加水分解した。これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

メタノール溶液中のポリマー１の吸収及び放出スペクトルを、図１に示す。吸収及び放出の極大値を表１に示す。

Claims (22)

1. 式（Ｉ）の繰り返し単位を含む共役ポリマーであって、
   

   

   式中、
   Ｒ^１が、各出現時において、置換基であり、
   Ｒ^２が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、
   Ｘが、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ^３から選択され、
   Ｒ^３が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基である、共役ポリマー。
2. 各Ｒ^３が、独立して、
   Ｈ、
   Ｃ_１－２０アルキル又はＣ_１－２０アルキレン－Ａｒ^２（Ａｒ^２が、非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換され得る、アリール又はヘテロアリール基であり、末端Ｃ原子若しくはＸに結合したＣ原子以外のＣ_１－２０アルキル又はアルキレンの１つ以上の非隣接Ｃ原子が、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、又はＣＯＯで置き換えられ得、１つ以上のＨ原子が、Ｆで置き換えられ得る）、及び
   非置換であるか、又は１つ以上の非イオン性置換基で置換されている、アリール基又はヘテロアリール基Ａｒ^２、から選択される非イオン性基、
   並びに
   イオン性基、から選択される、請求項１に記載の共役ポリマー。
3. 各Ｒ^２が、独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルである、請求項１に記載の共役ポリマー。
4. 各Ｒ^１が、Ｆ、ＣＮ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルキニル、－（ＯＣ２Ｈ_５）ｕ－Ｈ（ｕが、１～５である）、及び非置換若しくは置換の芳香族基又はヘテロ芳香族基から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の共役ポリマー。
5. Ｘが、ＮＲ^３である、先行請求項のいずれか一項に記載の共役ポリマー。
6. 前記共役ポリマーが、式（Ｉ）の繰り返し単位及び１つ以上の共繰り返し単位を含むコポリマーである、先行請求項のいずれか一項に記載の共役ポリマー。
7. 前記共役ポリマーが、非置換であるか、又は１つ以上の置換基で置換されているアリーレン又はヘテロアリーレン共繰り返し単位を含む、請求項６に記載の共役ポリマー。
8. 前記共役ポリマーが、４００～５００ｎｍの範囲のピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の共役ポリマー。
9. 前記共役ポリマーが、５０ｎｍ未満のストークスシフトを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の共役ポリマー。
10. 前記ポリマーが、水及びメタノールのうちの少なくとも１つにおいて少なくとも０．１ｍｇ／ｍｇの溶解度を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の共役ポリマー。
11. 式（Ｉ－Ｍ）のモノマーであって、
    

    

    式中、
    Ｒ^１が、各出現時において、置換基であり、
    Ｒ^２が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、
    Ｘが、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ^３から選択され、
    Ｒ^３が、各出現時において、独立して、Ｈ又は置換基であり、
    各ＬＧが、独立して、ボロン酸、ボロン酸エステル、ハロゲン化物、及び擬ハロゲン化物からなる群から選択される、モノマー。
12. 請求項１１に記載のモノマーの重合を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の共役ポリマーを形成する方法。
13. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の共役ポリマーを含む、発光粒子。
14. 前記粒子が、マトリックス材料を含む、請求項１３に記載の発光粒子。
15. 前記マトリックス材料が、シリカである、請求項１４に記載の発光粒子。
16. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の共役ポリマー又は発光粒子、及び生体分子を含む結合基を含む、発光マーカー。
17. 前記結合基に結合することが可能な官能基を含む、請求項１６に記載の発光マーカーの前駆体。
18. 請求項１３に記載の前駆体の前記官能基に前記結合基を結合させることを含む、請求項１６に記載の発光マーカーを形成する方法。
19. １つ以上の溶媒中に溶解又は分散されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の共役ポリマー、発光粒子、又は前駆体を含む、製剤。
20. 核酸を配列決定する方法であって、プライミング鋳型核酸分子を、ポリメラーゼ及び試験ヌクレオチドと接触させることと、
    前記試験ヌクレオチドを前記プライミング鋳型のプライミング鎖に、前記試験ヌクレオチドが前記鋳型鎖の次の塩基に相補的な塩基を含む場合にのみ、組み込むことと、
    前記プライミング鎖を照射することと、
    前記プライミング鎖の輝度から、前記試験ヌクレオチドが前記プライミング鎖に組み込まれているかどうかを判定することと、を含み、
    前記照射されたプライミング鎖の前記試験ヌクレオチドが、前記試験ヌクレオチドに結合するように構成された、請求項１～１０及び１３～１６のいずれか一項に記載の共役ポリマー、発光粒子、又は発光マーカーに結合する、方法。
21. 試料中の標的分析物を識別する方法であって、前記標的分析物に結合するように構成された、請求項１～１０及び１３～１６のいずれか一項に記載の共役ポリマー、発光粒子、又は発光マーカーが添加された前記試料を照射することと、前記共役ポリマーからの放出を検出することと、を含む、方法。
22. 前記標的分析物が、細胞であり、前記方法が、フローサイトメトリー方法である、請求項１９に記載の方法。

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