JP2024507129A - Ｈｅｒ２陽性がんを治療するための組成物及び方法 - Google Patents

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優太 安藤
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Abstract

本開示は、標的細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する二重受容体系を含む免疫細胞、及びそれを作製し、使用する方法に関する。第１の受容体は、ＨＥＲ２抗原に特異的な活性化受容体を含み、第２の受容体は、第１の受容体による免疫細胞の活性化を抑制する野生型細胞ではなく、がんで失われた抗原に特異的な抑制性受容体を含む。【選択図】図１７

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／１４９，９５２号の優先権及び利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の組み込み
本出願は、電子フォーマットで配列表とともに出願されている。配列表は、２０２２年２月１６日に作成されたＡ２ＢＩ＿０３５＿０１ＷＯ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔというファイルとして提供され、５，４１３，１６４バイトのサイズである。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が組み込まれる。
細胞療法は、様々な疾患、特にがんの治療のための強力なツールである。従来の養子細胞療法において、免疫細胞は、特異的受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作され、これにより、標的細胞によって発現されるリガンドとの受容体の相互作用を介して細胞標的に対する免疫細胞の活性化が誘導される。多くの標的が正常な組織で発現されるため、好適な標的分子の同定は依然として困難である。標的などの１つの例は、多くの固形腫瘍、並びに正常な上皮細胞の表面上で発現される、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２、又はＨＥＲ２）である。この発現は、移植された細胞が、ＨＥＲ２標的分子を発現する正常な組織を標的とするときに傷害性をもたらし得る。ＨＥＲ２ ＣＡＲを用いた臨床試験では深刻な副作用が示されており、ＨＥＲ２を標的とする現在の唯一の抗体治療は、ＨＥＲ２レベルが非常に高い乳がんにのみ効果がある。したがって、養子細胞療法による、疾患、特にがんの治療に有用な組成物及び方法が当該技術分野において必要とされている。
本開示は、がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する免疫細胞であって、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体と、を含む、免疫細胞を提供する。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子又は副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ複合体（ＭＨＣ Ｉ）との複合体におけるＨＥＲ２又はＨＥＲ２のペプチド抗原である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、がん細胞は、ＨＥＲ２を発現する。いくつかの実施形態において、がん細胞は、乳がん細胞、膀胱がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、唾液管がん細胞、非小細胞肺がん細胞、膵がん細胞、又は結腸がん細胞である。いくつかの実施形態において、がん細胞は、乳がん細胞又は胃がん細胞である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原は、対象の健常な細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、対象の健常な細胞は、標的抗原及びＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原の両方を発現する。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体及び抑制性受容体はともに、がん細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＨＥＲ２抗原は、配列番号２～２９のうちのいずれか１つの配列又は部分配列と少なくとも９５％同一の配列又は部分配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、活性化因子受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、配列番号３０～４２からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号３６）、ＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、及びＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤ［Ｙ／Ｖ］（配列番号４０）又は（配列番号４１）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹ（配列番号３２）、及びＱＱＨＹＴＴＰＰ（配列番号３４）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＮＹＧＭＮ（配列番号３７）、ＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧ（配列番号３９）及びＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹ（配列番号４２）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡ（配列番号３１）、ＳＡＳＳＲＹＴ（配列番号３３）、及びＱＱＨＦＲＴＰＦＴ（配列番号３５）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号３６）、ＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、及びＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤ［Ｙ／Ｖ］（配列番号４０）又は（配列番号４１）のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹ（配列番号３２）及びＱＱＨＹＴＴＰＰ（配列番号３４）のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＮＹＧＭＮ（配列番号３７）、ＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧ（配列番号３９）及びＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹ（配列番号４２）のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡ（配列番号３１）、ＳＡＳＳＲＹＴ（配列番号３３）、及びＱＱＨＦＲＴＰＦＴ（配列番号３５）のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号５１、５３、５５、５７．５９及び６１からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、若しくはＩｇＧ４から単離されるか、若しくは派生するヒンジ配列、又は合成ヒンジを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生する膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ若しくはＣＤ３ｚ、又はそれらの組み合わせから単離されるか、又は派生する細胞内ドメインを含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＴＣＲ又はＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、配列番号８７～１０２からなる群から選択されるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＡＳＧＹＴＦＴＳＹＨＩＨ（配列番号９５）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧＫ（配列番号９８）及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含み、ＶＬ領域は、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰ［Ｄ／Ａ］Ｒ（配列番号９０）又は（配列番号９１）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＳＧＹＴＦＴＳＹＨＭＨ（配列番号９７）、ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１００）及びＥＧＴＹＹＡＭＤＹ（配列番号１０２）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含み、ＶＬ領域は、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＤ（配列番号８９）、ＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰ［Ｄ／Ａ］Ｒ（配列番号９０）又は（配列番号９１）及びＭＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９４）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号６３～７４、２０７、２０９及び２１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）のＣＤＲ配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン及び膜貫通ドメイン、又はそれらの機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＹＧＳＱＳＳＫＰＹＬＬＴＨＰＳＤＰＬＥＬＶＶＳＧＰＳＧＧＰＳＳＰＴＴＧＰＴＳＴＳＧＰＥＤＱＰＬＴＰＴＧＳＤＰＱＳＧＬＧＲＨＬＧＶＶＩＧＩＬＶＡＶＩＬＬＬＬＬＬＬＬＬＦＬＩＬＲＨＲＲＱＧＫＨＷＴＳＴＱＲＫＡＤＦＱＨＰＡＧＡＶＧＰＥＰＴＤＲＧＬＱＷＲＳＳＰＡＡＤＡＱＥＥＮＬＹＡＡＶＫＨＴＱＰＥＤＧＶＥＭＤＴＲＳＰＨＤＥＤＰＱＡＶＴＹＡＥＶＫＨＳＲＰＲＲＥＭＡＳＰＰＳＰＬＳＧＥＦＬＤＴＫＤＲＱＡＥＥＤＲＱＭＤＴＥＡＡＡＳＥＡＰＱＤＶＴＹＡＱＬＨＳＬＴＬＲＲＥＡＴＥＰＰＰＳＱＥＧＰＳＰＡＶＰＳＩＹＡＴＬＡＩＨ（配列番号２５４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列を含む。
本開示は、治療有効量の本開示の免疫細胞を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む。
本開示は、がんの治療における医薬として使用するための、本開示の免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。
本開示は、ポリヌクレオチド系であって、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体、及び（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド系を提供する。
本開示は、本開示のポリヌクレオチド系を含む、ベクターを提供する。
本開示は、ＨＥＲ２＋がんにおいて非標的抗原をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するか、又は喪失を有する疑いがあると特定された対象のＨＥＲ２＋がんを治療する方法であって、本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示は、免疫細胞を本開示のポリヌクレオチド系又はベクターで形質転換することを含む、免疫細胞療法を作製する方法を提供する。
本開示は、本開示の免疫細胞又は医薬組成物を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、使用説明書を更に含む。
本開示はまた、ＨＥＲ２陽性がんにおける非標的抗原をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法であって、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を、組成物又は免疫細胞と接触させることを含み、腫瘍細胞が、混合培養物中にある、方法を提供する。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、及びＨＬＡ－Ｃ＊０７からなる群から選択される。
本開示はまた、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域と、（ｉｉ）ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）領域、並びに軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域とを含む、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域と、（ｉｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む、抑制性受容体と、を含む、免疫細胞を提供する。
本開示はまた、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５１の配列を含むｓｃＦｖである、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号２０９の配列を含むｓｃＦｖである、抑制性受容体と、を含む、免疫細胞を提供する。
本開示はまた、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するか、又は喪失を有する疑いがあると特定された対象におけるＨＥＲ２＋がんを治療する方法であって、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域と、（ｉｉ）ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）領域、並びに軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域とを含む、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域と、（ｉｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む、抑制性受容体と、を含む免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するか、又は喪失を有する疑いがあると特定された対象におけるＨＥＲ２＋がんを治療する方法であって、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５１の配列を含むｓｃＦｖである、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号２０９の配列を含むｓｃＦｖである、抑制性受容体と、を含む免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法であって、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域と、（ｉｉ）ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）領域、並びに軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域とを含む、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域と、（ｉｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む、抑制性受容体と、を含む、免疫細胞とＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を接触させることを含む、方法を提供する。
本開示はまた、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法であって、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５１の配列を含むｓｃＦｖである、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号２０９の配列を含むｓｃＦｖである、抑制性受容体と、を含む免疫細胞と接触させることを含む、方法を提供する。
本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び付属の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点のより良好な理解が得られる。
異なるキメラ抗原受容体の活性をその標的ＨＥＲ２と比較した表である。ＦＲＰ５＊及び４Ｄ５＊は各々、それぞれＦＲＰ５及び４Ｄ５と比較して、ＶＨドメインにおいて単一のアミノ酸変化を有する。ＩｇＧ４（ＥＱ）は、Ｆｃ受容体結合を回避するために、変異したＣＨ２領域を有する。リンカー配列：ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１）。 固体基質上の抗原滴定によって測定した、Ｊｕｒｋａｔ細胞中のＨＥＲ２活性化因子ＥＣ５０を示すプロットである。ＨＥＲ２ ＣＡＲ２は、活性を示さなかった。 ＨＣＴ．１１６標的細胞数滴定によって測定した、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＥＲ２活性化因子ＥＣ５０を示すプロットである。ＨＥＲ２ ＣＡＲ２及びＨＥＲ２ ＣＡＲ３は、活性を示さなかった。 標的ＨＥＲ２ ｍＲＮＡの滴定によって測定した、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＥＲ２活性化因子ＥＣ５０を示すプロット及び表である。ＨＥＲ２ ＣＡＲ２（Ｃ２９７）は、固体基質（図２Ａ）又は標的細胞数滴定（図２Ｂ）上で抗原滴定では活性を示さず、異なるヒンジ（ＣＴ１０９４、ＣＴ１０９５）で更に操作した。 ＨＥＲ２（ＣＴ２９２）ＣＡＲ１活性化因子とＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抑制性受容体（ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子）を共発現するＪｕｒｋａｔ細胞の活性化が、活性化因子受容体及び遮断因子受容体の両方についてリガンドを発現する標的細胞によって遮断されることを示す一対のプロットである。標的Ａ：活性化因子リガンド（ＨＥＲ２）、標的Ｂ：抑制因子リガンド（ＨＬＡ－Ａ＊０２）、左パネルはＨＣＴ．１１６標的細胞を示す、右パネル：ＨｅＬａ標的細胞。 ＨＥＲ２（ＣＴ２９９）ＣＡＲ１活性化因子とＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抑制性受容体（ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子）を共発現するＪｕｒｋａｔ細胞の活性化が、活性化因子受容体及び遮断因子受容体の両方についてリガンドを発現するＨＣＴ．１１６標的細胞によって遮断されることを示す一対のプロットである。標的Ａ：活性化因子リガンド（ＨＥＲ２）、標的Ｂ：抑制因子リガンド（ＨＬＡ－Ａ＊０２）。 Ｊｕｒｋａｔ細胞において、単独で、又はＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子と組み合わせて、ＨＥＲ２ ＣＡＲ１又はＨＥＲ２ ＣＡＲ４の発現を示す一連の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）プロットである。 単独で、及びＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子構築物ｍＰＡ２．１（Ｃ１７６５）、ヒト化（ｈｕ）ＰＡ２．１．１４（Ｃ２１６２）及びヒト化ＰＡ２．１．１８（Ｃ２１６３）と組み合わせて、初代Ｔ細胞におけるＨＥＲ２ ＣＡＲ１（ＣＴ２９２）の発現を示す一連のＦＡＣＳプロットである。ＨＥＲ２ ＣＡＲ１及びＰＡ２．１ ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子は、初代Ｔ細胞において発現及び濃縮することができる。 ＨｅＬａ標的細胞のＨＥＲ２ ＣＡＲ１（ＣＴ２９２）媒介性初代Ｔ細胞死滅が、Ｔ細胞が（示されるように）ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現し、ＨｅＬａ標的細胞がＨＥＲ２活性化因子リガンド及びＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子標的リガンドを１：４０の比で共発現するときに抑制されることを示す一連のプロット及び画像である。標的Ａ：活性化因子リガンド（ＨＥＲ２）、標的Ｂ：抑制因子リガンド（ＨＬＡ－Ａ＊０２）、ｈｕ：ヒト化、ＳＷ：選択性ウィンドウ。画像を４０時間で撮影し、活性化因子（各パネルの左の画像）、又は活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドの組み合わせ（各画像の右のパネル）のＨｅＬａ細胞発現を示す。エフェクター及び標的細胞は、１：１の比であった。 ＨＣＴ．１１６標的細胞のＨＥＲ２ ＣＡＲ１（ＣＴ２９２）媒介性初代Ｔ細胞死滅が、Ｔ細胞が（示されるように）ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現し、ＨＣＴ．１１６標的細胞がＨＥＲ２活性化因子リガンド及びＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子標的リガンドを１：４の比で共発現するときに抑制されることを示す一連のプロット及び画像である。標的Ａ：活性化因子リガンド（ＨＥＲ２）、標的Ｂ：抑制因子リガンド（ＨＬＡ－Ａ＊０２）、ｈｕ：ヒト化、ＳＷ：選択性ウィンドウ。画像を４０時間で撮影し、活性化因子（各パネルの左の画像）、又は活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドの組み合わせ（各画像の右のパネル）のＨＣＴ．１１６細胞発現を示す。エフェクター及び標的細胞は、１：１の比であった。 ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体によるＨＥＲ２ ＣＡＲ１（ＣＴ２９２）による初代Ｔ細胞活性化の抑制が可逆的であることを示す一連のプロットである。初代Ｔ細胞の活性化を、ＨＣＴ．１１６標的細胞を使用してアッセイした。標的ＡＢ：活性化因子（ＨＥＲ２）及び抑制因子（ＨＬＡ－Ａ＊０２）リガンドの両方を発現するＨＣＴ．１１６細胞、標的Ａ：ＨＥＲ２を発現するＨＣＴ．１１６細胞、ＲＤ：丸い、Ｅ：Ｔは、エフェクター：標的を表す。ＨＥＲ２ ＣＡＲのみを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現しない初代Ｔ細胞は、ラウンド３によって枯渇したが、ＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の両方を発現した初代Ｔ細胞は、枯渇しなかった。 ＨＬＡ－Ａ＊０２の発現を喪失したＨＥＲ２陽性がんのマウス異種移植片モデルにおいて、ＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現する初代Ｔ細胞が、標的細胞を死滅させる能力をアッセイする実験を示す図である。 ＨＬＡ－Ａ＊０２の発現を喪失したＨＥＲ２陽性がんのマウス異種移植片モデルにおいて、ＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現する初代Ｔ細胞が、正常細胞ではなく腫瘍細胞を選択的に死滅させることを示す一対のプロットである。 ＨｅＬａ、ＨＣＴ．１１６及びＭＳ７５１標的細胞による活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドの発現を示す一連のＦＡＣＳプロットである。細胞表面抗原を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＱＩＦＩキットを使用して定量した。 ＨｅＬａ、ＨＣＴ．１１６及びＭＳ７５１標的細胞上の抗原密度、及び活性化因子対遮断因子抗原の比を要約した表である。細胞表面抗原を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＱＩＦＩキットを使用して定量した。 モジュールなし（ＣＡＲのみ）、マウス遮断因子（Ｃ１７６５）、ヒト化遮断因子１（Ｃ２１６２）、又はヒト化遮断因子２（Ｃ２１６３）と対合したｓｃＦｖ ＣＴ２９２（左カラム）、ＣＴ２９９（中央カラム）、又はＣＴ１０９４（右カラム）を含む９つの受容体対の感受性を示す一連のプロットである。活性化因子（上段）及び遮断因子（下段）。 １：１のＥ：Ｔ比で活性化因子－遮断因子対の６つの候補で形質導入された初代Ｔ細胞によるＨｅＬａ標的細胞の死滅を示す一連のプロットである。活性化因子－遮断因子対は、ＣＴ２９２（左カラム）、ＣＴ２９９（中央カラム）、又はＣＴ１０９４（右カラム）のｓｃＦｖを、マウス形態（Ｃ１７６５、上段）又はヒト化形態（Ｃ２１６２、下段）の遮断因子とともに含む。 ＣＴ１１１８又はＣＴ１１２１構築物による腫瘍（実円）又は正常（中空円）Ａ３７５標的細胞の細胞死滅を示す一対のプロットである。この解析は、２人のＨＬＡ－Ａ＊０２－Ｔ細胞ドナー（左対右）で実施した。 ＨＥＲ２ ＣＡＲ１（ＣＴ２９２）及びＣＡＲ／ヒト遮断因子（ＣＴ２１６２）で１：１のＥ：Ｔ比でトランスフェクトした初代Ｔ細胞によるＨｅＬａ標的細胞（左パネル）又はＡ３７５標的細胞（右パネル）の細胞死滅を示す一対のプロットである。 １：１のＥ：Ｔ比で３回の４８時間ラウンドの腫瘍再チャレンジにおいて、ＨＥＲ２ ＣＡＲ１又はＣＴ２１６２でトランスフェクトした初代Ｔ細胞によるＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＨｅＬａ標的細胞（左パネル）又は正常なＨｅＬａ標的細胞（右パネル）の細胞死滅を示す一対のプロットである。 ＨＥＲ２ ＣＡＲ１及びＣＴ２１６２が、腫瘍（標的Ａ、ＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－）又は正常（標的ＡＢ、ＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）ＨｅＬａ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で４８時間ラウンドで死滅させる能力の可逆性を示す一連のプロットである。矢印は、曝露の順序を示す：腫瘍→正常→腫瘍（上パネル）対正常→上→正常腫瘍（下パネル）。 非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ＨＥＲ２ ＣＡＲ１ Ｔ細胞、又はＣＴ２１６２細胞が、１：１のＥ：Ｔ比でＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＨｅＬａ細胞（「腫瘍」）又はＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＨｅＬａ細胞（「正常」）を死滅させる能力の可逆性を示す一連の画像である。ｔ＝４８時間の標的細胞の画像を各配列について示す。すなわち、左パネル：腫瘍→正常→腫瘍対右パネル：正常→腫瘍→正常腫瘍。スケールバー＝５０μｍ。 ＨＥＲ２ ＣＡＲ１及びＣＴ２１６２細胞による、１：１の比で３回の４８時間ラウンドにわたる腫瘍（標的Ａ、実円）及び正常（標的ＡＢ、中空円）ＨｅＬａ標的細胞の選択的死滅を示すプロットである。 非形質導入（ＵＴＤ、左）、ＣＴ２９２（中央）、又はＣＴ１１８（右）細胞との２０時間の共培養後の混合培養中の、正常なＨｅＬａ標的細胞ではなく腫瘍の選択的死滅を示す一連の画像である。 非形質導入（ＵＴＤ、左）、ＣＴ２９２（中央）、又はＣＴ１１８（右）細胞との２４時間の共培養後の混合培養の再チャレンジ（すなわち、ラウンド２）における、正常なＨｅＬａ標的細胞ではなく腫瘍の選択的死滅を示す一連の画像である。 正常、腫瘍（ＨＬＡ－Ａ２のＬＯＨを想定）、及び細胞株（星）におけるＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ２発現の定量的プロットを示す。ＣＴ１１１８のＥＣ５０及びＩＣ５０を破線でマークする。より明るい破線は、測定されたＥＣ５０及びＩＣ５０の範囲を示す。実施例１２に記載のインビボ研究で使用した細胞株であるＡ３７５は、それぞれ、ＨＥＲ２ ＣＴ１１１８のＥＣ５０及びＩＣ５０と同様のＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ２発現を有する。 非形質導入（「ＵＴＤ」）細胞、ＣＴ２９２細胞、及びＣＴ１１１８細胞で処理した後の腫瘍（左パネル）及び正常（右パネル）Ａ３７５異種移植片を保有するマウスにおける腫瘍体積を示す。 ｍＲＮＡ滴定アッセイで測定した、ＨＬＡ－Ａ＊０３遮断因子、ＨＬＡ－Ａ＊１１遮断因子、又はＨＬＡ－Ｂ＊０７遮断因子のいずれかと対合したＣＴ２９２によるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼ（ＪＮＬ）細胞抑制を示す。 同上。 同上。 ｍＲＮＡトランスフェクション時のＨｅＬａ細胞の表面上の滴定ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１又はＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２タンパク質を示す。ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧタグ付きＨＬＡ－Ａ＊１１：０１又はＦＬＡＧタグ付きＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２のいずれかをコードする２倍段階希釈ｍＲＮＡでトランスフェクトし、最高用量は２０００ｎｇ／２００，０００ＨｅＬａ細胞であった。下部パネルは、０ｎｇのｍＲＮＡを含有する。
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、養子細胞療法、及びそれらの使用方法などの操作された受容体を説明する。操作された受容体は、ＨＥＲ２抗原を標的とし、ＨＥＲ２標的化受容体を発現するように遺伝子改変された免疫細胞を活性化することができる。ＨＥＲ２標的化活性化因子受容体を発現する免疫細胞は、例えば、ＨＥＲ２陽性であるがんの治療における細胞養子療法の一部として、組成物中で使用され得る。ＨＥＲ２標的化活性化受容体を発現する免疫細胞は、第２の抑制性受容体を更に含むことも企図される。第２の抑制性受容体は、活性化因子受容体によって媒介される免疫細胞の活性化を防止又は抑制することができる。例えば、ＨＥＲ２を標的とする活性化受容体及び別個の抗原、例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原に特異的に結合する抑制性受容体を発現する免疫細胞は、ＨＥＲ２を発現する細胞の存在下で活性化されるが、ＨＥＲ２及び抑制性受容体の標的であるＨＬＡクラスＩ抗原の両方を発現する細胞の存在下では活性化されない。活性化受容体及び抑制性受容体の両方を発現する免疫細胞の選択的活性化及び抑制は、養子細胞療法における傷害性を低減するのに有用である。本発明者らは、この戦略が、本明細書に記載のＨＥＲ２標的化活性化因子受容体及び抑制性受容体を使用して用いることができることを見出した。活性化受容体及び抑制性受容体の両方は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体を指し得、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）又はＮＫ細胞などの特定の免疫エフェクター細胞に人工特異性を移植する操作された受容体を包含する。ＣＡＲは、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を付与するために利用されてもよく、それによって、例えば、養子細胞療法での使用のために、多数の特異的Ｔ細胞が生成されることが可能になる。特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＨＥＲ２などの腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を指示する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに融合された、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又はモノクローナル抗体由来のｓｃＦａｂの融合物を含む。融合体はまた、ヒンジを含み得る。重－軽（Ｈ－Ｌ）及び軽－重（Ｌ－Ｈ）ｓｃＦｖのいずれかを使用してもよい。ＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来し得る。細胞内ドメインの種類に応じて、ＣＡＲは活性化因子受容体又は抑制性受容体であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、ＣＡＲが活性化因子受容体である場合、ＣＡＲは、ＣＤ３、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／又は０Ｘ４０などの追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。いくつかの実施形態において、分子は、共刺激分子、イメージングのための（例えば、陽電子放出断層撮影のための）レポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にＴ細胞を条件付きで除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含む、ＣＡＲと同時発現され得る。本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体に起因する特性は、受容体自体又は受容体を含む宿主細胞を指すと理解され得る。
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」又は「ＴＣＲ／ＣＤ３複合体」と呼ばれることもある「ＴＣＲ」は、サブユニットと称されることもある、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、及びインバリアントＣＤ３鎖（ゼータ、ガンマ、デルタ、及びイプシロン）のうちの１つ以上を含むタンパク質複合体を指す。ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するヘテロ二量体として機能するようにジスルフィド結合され得る。ＴＣＲアルファ／ベータヘテロ二量体がペプチド－ＭＨＣに関与すると、関連するインバリアントＣＤ３サブユニット内のＴＣＲ複合体における立体構造変化が誘導され、これが、それらのリン酸化及び下流タンパク質との会合をもたらし、それによって一次刺激シグナルを形質導入する。例示的なＴＣＲ複合体では、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータポリペプチドは、ヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３イプシロン及びＣＤ３デルタは、ヘテロ二量体を形成し、ヘテロ二量体のためのＣＤ３イプシロン及びＣＤ３ガンマ、並びに２つのＣＤ３ゼータは、ホモ二量体を形成する。
「刺激」という用語は、刺激ドメイン又は刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がそのコグネイトリガンドと結合し、それによって、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル形質導入などのシグナル形質導入事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の変化した発現、及び／又は細胞骨格構造の再編成などを媒介することができる。
「刺激分子」又は「刺激ドメイン」という用語は、Ｔ細胞によって天然に発現されると、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様についてＴＣＲ複合体の活性化を刺激的に調節する、初代細胞質シグナル伝達配列を提供する分子又はその一部を指す。野生型ＴＣＲ複合体のＴＣＲアルファ鎖及び／又はＴＣＲベータ鎖は、刺激ドメインを含有せず、シグナル伝達を開始するためにＣＤ３ゼータなどのＣＤ３サブユニットとの会合を必要とする。一態様において、一次刺激シグナルは、例えば、ペプチドに結合した主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始され、これは、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞応答の媒介をもたらす。本明細書に記載の１つ以上の刺激ドメインは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３イプシロンを含む、ＴＣＲ複合体の任意の１つ以上のサブユニットの細胞内部分に融合することができる。
本明細書で使用される場合、「刺激シグナルを提供することができるドメイン」は、直接的又は間接的に、Ｔ細胞シグナル伝達の少なくともいくつかの態様を増強するためにＴＣＲ複合体によって媒介されるシグナル伝達の有効性を増強又は増加させる刺激シグナルを提供することができる、任意のドメインを指す。刺激シグナルを提供することができるドメインは、このシグナルを直接提供することができ、例えば、刺激シグナルを提供することができるドメインは、一次刺激ドメイン又は共刺激ドメインである。代替的に、又は加えて、刺激シグナルを提供することができるドメインは、間接的に作用することができる。例えば、ドメインは、刺激タンパク質をＴＣＲに動員するか、又は刺激シグナルを提供するために下流標的を介して作用するキナーゼ活性などの酵素活性を提供する足場であり得る。
本明細書で使用される場合、「抑制シグナルを提供することができるドメイン」は、直接的又は間接的に、ＴＣＲ複合体によって媒介される有効性シグナル伝達を抑制又は減少させる抑制性シグナルを提供することができる、任意のドメインを指す。抑制シグナルを提供することができるドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達又は機能の少なくともいくつかの態様を完全に又は部分的に低減又は遮断することができる。抑制シグナルを提供することができるドメインは、このシグナルを直接提供することができ、例えば、抑制シグナルを提供することができるドメインは、一次抑制シグナルを提供する。代替的に、又は加えて、刺激シグナルを提供することができるドメインは、間接的に作用することができる。例えば、ドメインは、追加の抑制タンパク質をＴＣＲに動員することができるか、又は下流標的を介して作用して抑制シグナルを提供する酵素活性を提供することができる。
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様を範囲フォーマットで提示することができる。範囲形式の記載は、単に利便性及び簡潔性のためであり、本発明の範囲に関する確固たる限定として解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６などを具体的に開示しているとみなされるべきである。別の例として、９５～９９％同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するものを含み、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％及び９８～９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
一般に、「配列同一性」又は「配列相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること、及び／又はそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、並びにこれらの配列を第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することを含む。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。核酸配列又はアミノ酸配列に関わらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つのアラインメントされた配列間の正確な一致の数を、より短い配列の長さで除算し、１００を乗じたものである。パーセント同一性はまた、例えば、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から入手可能なバージョン２．２．９を含む、高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアラインメント方法に基づき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ Ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に考察されている。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を、同一のアラインメントされた記号（一般に、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を２つの配列のうちの短い方の記号の総数で除算したものとして定義する。プログラムを使用して、比較されるタンパク質の全長にわたるパーセント同一性を決定することができる。デフォルトパラメータは、短いクエリ配列で、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムで検索を最適化するために提供される。所望の配列同一性度の範囲は、およそ８０％～１００％、及びそれらの間の整数値である。典型的には、開示される配列と特許請求される配列との間のパーセント同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である。
本明細書で使用される場合、「部分配列」は、本明細書に記載される配列の一部を形成する連続したアミノ酸又はヌクレオチドの長さを指す。部分配列は、完全長配列にアラインメントした場合、完全長配列の一部と同一であり得るか、又はそれがアラインメントする完全長配列の一部と１００％未満同一であり得る（例えば、完全配列の５０％と９０％同一であり得るなど）。
「外因性」という用語は、生物体外に由来する核酸、タンパク質又はペプチド、低分子化合物などを含む、任意の分子を指すために本明細書で使用される。対照的に、「内因性」という用語は、生物体内に由来する（すなわち、生物によって天然に産生される）任意の分子を指す。
ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドと機能的な関係に置かれるとき、別のポリヌクレオチドに「作動可能に連結」される。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。ペプチドが別のペプチドに「作動可能に連結」されるのは、それらをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されている場合であり、好ましくは、それらが同じオープンリーディングフレーム内にある場合である。
「プロモーター」は、遺伝子をオン又はオフにするために必要なＤＮＡの配列である。プロモーターは、転写開始部位のすぐ上流及び／又は重複して配置され、通常、長さは約１００～数１００塩基対である。
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるあらゆる定義を含む本出願が優先する。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、出版物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成する、又は世界のどの国でも一般的な知識の一部を形成するという認識、又はいかなる形態の示唆ではなく、それらとみなされるべきではない。
本記載では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、又は整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙した範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。「約」という用語は、数字又は数値の直前にある場合、その数字又は数値が、プラス又はマイナス１０％の範囲にあることを意味する。
抗原
開示される活性化因子受容体は、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的に結合することができる。ＨＥＲ２抗原は、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、及び他の呼称としても知られ、受容体チロシンキナーゼであり、活性化時に、ホモ又はヘテロ二量体を他のＥｒｂＢファミリーメンバーと形成して、生存シグナル及び増殖をもたらす細胞内シグナル伝達を促進する。ＨＥＲ２は過剰発現しているか、又はスプライスバリアント及びアイソフォームの差異的な発現を有し、これらは、乳がん、肺がん、及び他のがんなどの様々ながんを駆動する機序に寄与する。
いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性クラスＩ複合体（ＭＨＣ Ｉ）又は主要組織適合性クラスＩＩ複合体（ＭＨＣ ＩＩ）を有する複合体におけるＨＥＲ２のペプチド抗原である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ Ｉに結合したＨＥＲ２ペプチドは、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号３０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ ＩＩに結合したＨＥＲ２ペプチドは、ＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号３１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２抗原は、配列番号２～２９のうちのいずれか１つの配列若しくは部分配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又はそれと同一である配列若しくは部分配列を含む。しかしながら、全てのＨＥＲ２アイソフォーム、並びにＨＥＲ２抗原として作用する配列及びその部分配列は、本開示の範囲内として想定される。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２抗原は、配列番号２～２９のうちのいずれか１つの配列、又は配列番号２～２９のうちのいずれか１つのペプチド断片を含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２抗原は、主要組織適合性クラスＩ複合体（ＭＨＣ－Ｉ）を有する複合体において、配列番号２～２９のうちのいずれか１つのペプチド断片を含む。
ＨＥＲ２抗原を発現するがん細胞を含む任意のがんは、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）がんである。いくつかの実施形態において、がん細胞は、乳がん細胞、膀胱がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、唾液管がん細胞、非小細胞肺がん細胞、膵がん細胞、又は結腸がん細胞である。いくつかの実施形態において、がん細胞は、乳がん細胞又は胃がん細胞である。
操作された受容体
本開示は、細胞外領域を含む活性化因子受容体及び抑制性受容体を提供し、細胞外領域は、受容体を発現するエフェクター細胞の活性化を促進する、受容体を活性化するか、又はその活性化を促進する第１のリガンドに特異的に結合することができる第１のリガンド結合ドメインを含む。本開示は更に、第２のリガンドに結合することができる第２のリガンド結合ドメインを含む抑制性受容体を提供し、第２のリガンド結合ドメインによる第２のリガンドの結合は、第１のリガンドに結合した第１の受容体の存在下でさえ、エフェクター細胞の活性化を抑制、低減、又は防止する。第１のリガンドは、活性化因子リガンドとも称され得る。第２のリガンドは、抑制因子リガンドとも称され得る。これらのリガンドに結合する活性化因子受容体及び抑制性受容体は、本明細書では、一般に、操作された受容体とも称され得る。操作された受容体は、本開示に記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいずれかを指し得る。操作された受容体はまた、本明細書に記載される結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び／又は細胞質ドメインを使用して設計された任意の受容体を指し得る。操作された受容体は、本明細書において融合タンパク質と称されることがある。
活性化因子リガンド
本開示は、第１のリガンド、活性化因子、及び第１の活性化因子リガンドに結合する第１のリガンド結合ドメインを含む第１の操作された受容体を提供する。いくつかの実施形態において、第１の操作された受容体は、活性化因子受容体である。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子リガンドは、ＨＥＲ２抗原である。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２抗原は、配列番号２～２９のうちのいずれか１つの配列若しくは部分配列を少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％共有するか、又はそれと同一である配列若しくは部分配列を含む。例示的なＨＥＲ２配列を表１に示す。
いくつかの実施形態において、活性化因子抗原は、主要組織適合性クラスＩ複合体（ＭＨＣ Ｉ）との複合体におけるＨＥＲ２のペプチド抗原である。いくつかの実施形態において、活性化因子抗原は、主要組織適合性クラスＩ複合体（ＭＨＣ Ｉ）との複合体ではないＨＥＲ２のペプチド抗原である。
本明細書で使用される場合、「活性化因子」又は「活性化因子リガンド」は、ＣＡＲ又はＴＣＲなどの本開示の操作された受容体の第１の活性化因子リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合し、それによって活性化因子受容体を発現するＴ細胞の活性化を媒介する第１のリガンドを指す。活性化因子リガンドは、標的細胞、例えば、がん細胞によって発現され、また、標的細胞だけでなく、より広く発現され得る。例えば、活性化因子は、上皮細胞などのいくつか、又は全てのタイプの正常な非標的細胞上で発現され得る。
いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドは、標的細胞によって発現され、非標的細胞（すなわち、養子細胞療法によって標的化されていない正常細胞）によって発現されない。いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞であり、非標的細胞は、非がん細胞である。
いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドは、標的細胞上で高い細胞表面発現を有する。この高い細胞表面発現は、大きな活性化シグナルを送達する能力を与える。細胞表面発現を測定する方法は、当業者に既知であり、活性化因子リガンドに対する適切な抗体を使用した免疫組織化学、続いて顕微鏡検査又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むが、これらに限定されない。
活性化因子リガンドは、全ての標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、標的細胞は、例えば、ＨＥＲ２＋乳がん中のＨＥＲ２＋がん細胞などのがん細胞である。
いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドは、複数の標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞である。いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドは、標的細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％に存在する。いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドは、少なくとも９５％の標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドは、少なくとも９９％の標的細胞上に存在する。
いくつかの実施形態において、第１の活性化因子リガンドは、複数の標的細胞及び複数の非標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、複数の非標的細胞は、第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドの両方を発現する。
いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：１００～約１００：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：５０～約５０：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：４０～約４０：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：３０～約３０：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：２０～約２：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：１０～約１０：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：５～約５：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：３～約３：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：２～約２：１の第１のリガンド対第２のリガンドの比で複数の非標的標的細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、並びに第１の活性化因子リガンド及び第２の抑制因子リガンドは、約１：１の比で複数の非標的標的細胞上に存在する。
細胞外リガンド結合ドメイン
本開示は、ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗原結合ドメインなどのリガンド結合ドメインを含む。好適な抗原結合ドメインには、抗体由来の抗原結合ドメイン、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｔ細胞受容体由来の抗原結合ドメインなどが含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知の全ての形態の抗原結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
「細胞外ドメイン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質の細胞外部分を指す。例えば、ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖は各々、ペプチド－ＭＨＣ認識に関与する定常領域及び可変領域を含む細胞外ドメインを含む。「細胞外ドメイン」はまた、融合ドメイン、例えば、特定の抗原に結合し、かつそれを標的とすることができる追加のドメインと、ＴＣＲサブユニットの内因性細胞外ドメインとの間の融合を含むことができる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、又はポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリン、又はその断片であり得、天然又は組換え源に由来し得る。
「抗体断片」又は「抗体結合ドメイン」という用語は、抗原結合ドメイン、すなわち、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含有する、抗体又はその組換えバリアントの少なくとも１つの部分を指し、これは、抗原及びその定義されたエピトープなどの標的に対する抗体断片の認識及び特異的結合を付与するのに十分である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略記される）（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して連続して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現することが可能であり、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。
抗体に関して「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」（又は、単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディの場合、「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として知られている隣接ストレッチ間に介在する３つのＣＤＲを含有する重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は、一般に、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを支持するための足場を形成する。
本明細書で使用される場合、指定されない限り、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬ及びＶＨ可変領域を有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
「抗体軽鎖」という用語は、抗体分子中に存在する２つの種類のポリペプチド鎖のうちの、それらの天然に存在する立体配座における、より小さいものを指す。カッパ（「Κ」）及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組換え抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現系によって発現される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、ＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、又は抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能であり、周知である組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を使用して得られている。
いくつかの実施形態において、例えば、受容体が第１及び第２のポリペプチドを含み、抗原結合ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞外ドメイン又は抗体から単離されるか、又は派生するそれらの実施形態。
いくつかの実施形態において、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、表２に開示されるＣＤＲの群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号３６）、ＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、及びＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤ［Ｙ／Ｖ］（配列番号４０）又は（配列番号４１）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹ（配列番号３２）、及びＱＱＨＹＴＴＰＰ（配列番号３４）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＮＹＧＭＮ（配列番号３７）、ＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧ（配列番号３９）及びＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹ（配列番号４２）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡ（配列番号３１）、ＳＡＳＳＲＹＴ（配列番号３３）、及びＱＱＨＦＲＴＰＦＴ（配列番号３５）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号３６）、ＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、及びＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号４０）又はＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号４１）のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹ（配列番号３２）及びＱＱＨＹＴＴＰＰ（配列番号３４）のＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＮＹＧＭＮ（配列番号３７）、ＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧ（配列番号３９）及びＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹ（配列番号４２）のＣＤＲ配列を含み、ＶＬ領域は、ＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡ（配列番号３１）、ＳＡＳＳＲＹＴ（配列番号３３）、及びＱＱＨＦＲＴＰＦＴ（配列番号３５）のＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ＣＤＲ配列ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）を含み、ＶＬ領域は、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、及びＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）のＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、全長ＶＨ及びＶＬ領域は、表３に開示される配列を含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、単一のポリペプチド上の全長ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、全長ＶＨ領域及び全長ＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、全長ＶＬ領域及び全長ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、全長ＶＨ及びＶＬは、表３から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、配列番号４３及び配列番号４４を含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、配列番号４５及び配列番号４６を含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、配列番号４７及び配列番号４８を含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、配列番号４５及び配列番号４９を含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、配列番号５０及び配列番号４９を含む。
いくつかの実施形態において、結合ドメインは、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインである。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、表４に列挙される配列から選択される。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５１を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５２を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５３を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５５を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５６を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５７を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５８を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５９を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号６０を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号６１を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号６２を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号２１８０３を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖドメインは、配列番号５１、５３、５５、５７、５９若しくは６１のうちのいずれか１つの配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％を有するか、若しくはそれと同一である配列を含む。
抑制性受容体
本開示は、第２のリガンド、抑制因子、及び抑制因子リガンドに結合する第２のリガンド結合ドメインを含む第２の抑制性受容体を提供する。いくつかの実施形態において、第２の抑制性リガンドは抗原であり、第２の抑制性受容体は、第２の抑制性抗原を特異的に認識する抗原結合ドメインを含む。
本開示は、細胞外領域を含む第２の抑制性受容体を提供し、細胞外領域は、第１及び第２の受容体を発現するエフェクター細胞の活性化を抑制する第２のリガンドに特異的に結合することができる第２のリガンド結合ドメインを含み、エフェクター細胞は、第１のリガンドの、第１の活性化因子受容体への結合によって活性化される。
本明細書で使用される場合、「抑制因子」又は「抑制因子リガンド」は、本開示の操作された受容体の第２のリガンド結合ドメイン（抑制因子ＬＢＤ）に結合するが、操作された受容体を発現する免疫細胞の活性化を抑制する第２のリガンドを指す。抑制因子は、標的細胞によって発現されない。抑制因子リガンドはまた、活性化因子リガンドを発現する正常な非標的細胞を含む複数の正常な非標的細胞において発現され、それによって、これらの細胞を養子細胞療法の細胞傷害性効果から保護する。理論に拘束されることを望まないが、抑制因子リガンドは、様々な機序を介してエフェクター細胞の活性化を遮断することができる。例えば、抑制因子リガンドの、抑制因子ＬＢＤへの結合は、活性化因子リガンドの、活性化因子ＬＢＤへの結合時に生じるシグナルの伝達を遮断することができ、これは、抑制因子の不在下で、本明細書に記載の操作された受容体を発現する免疫細胞の活性化をもたらす。
代替的に、又は加えて、抑制因子リガンドの、第２の操作された受容体への結合は、本明細書に記載の２つの受容体系を含む免疫細胞の表面からの第１の活性化受容体の細胞表面発現の喪失を引き起こし得る。理論に拘束されることを望まないが、正常細胞に対する活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドの免疫細胞係合により、抑制性受容体は、免疫細胞表面からの近くの活性化因子受容体分子の除去を引き起こすと考えられる。このプロセスは、免疫細胞を局所的に脱感作し、その活性化閾値を可逆的に上昇させる。標的細胞上の活性化因子リガンドのみと係合する免疫細胞は、第２の抑制性受容体からのシグナルによって妨げられない局所活性化シグナルを引き起こす。この局所活性化は、細胞傷害性顆粒の放出が標的細胞選択的細胞死につながるまで増加する。しかしながら、表面受容体発現レベルの調節は、第１の活性化因子受容体による免疫細胞の活性化を抑制する唯一の機序ではない場合がある。理論に拘束されることを望まないが、活性化因子受容体シグナル伝達経路と抑制性受容体シグナル伝達経路との間のクロストークを含むがこれらに限定されない、他の機序が作用し得る。
いくつかの実施形態において、第２のリガンドは、標的細胞によって発現されず、非標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞であり、非標的細胞は、非がん細胞である。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、抗原であり、第２のリガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンド結合ドメインは、Ｖβのみのリガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンド結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるか、又は派生する抗原結合ドメインを含む。例えば、第２の抑制因子リガンド結合ドメインは、ＴＣＲ α及びβ鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインである。好適な抗原結合ドメインには、抗体由来の抗原結合ドメイン、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｔ細胞受容体由来の抗原結合ドメインなどが含まれるが、これらに限定されない。
抑制因子標的
本開示は、抑制性受容体を提供する。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子又は副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原は、対象の健常な細胞によって発現される。
いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む。
代替的に、又は加えて、活性化因子標的及び抑制因子標的の発現は、相関し得、すなわち、２つは、非標的細胞上で同様のレベルで発現される。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ペプチドリガンドである。いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ複合体（ペプチドＭＨＣ、又はｐＭＨＣ）と複合体化されたペプチド抗原である。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅのいずれかを含むｐＭＨＣと複合体化されたペプチド抗原を含む抑制因子リガンドは、本開示の範囲内として想定される。
いくつかの実施形態において、抑制因子リガンドは、多くの腫瘍において不在又は多型である遺伝子によってコードされる。
標的細胞と非標的細胞との間の抑制因子リガンドの差次的な発現を区別する方法は、当業者には容易に明らかであろう。例えば、非標的及び標的細胞における抑制因子リガンドの有無を、抑制因子リガンドに結合する抗体との免疫組織化学によって、続いて顕微鏡検査又はＦＡＣＳ、標的細胞及び非標的細胞のＲＮＡ発現プロファイリング、又は非標的細胞及び標的細胞のＤＮＡ配列決定によってアッセイして、抑制因子リガンドの遺伝子座が標的細胞又は非標的細胞のいずれかの変異を含むかを決定することができる。
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）による対立遺伝子の喪失
原発腫瘍におけるホモ接合性欠失はまれであり小さいため、標的Ｂ候補を生み出す可能性は低い。例えば、２１のヒトがんタイプにわたる２２１８の原発腫瘍の分析において、上位４つの候補は、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、ＲＢ転写コリプレッサー１（ＲＢ１）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、並びにＮ３ＰＢ２であった。しかしながら、ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６）は、全てのがんにわたってわずか５％のホモ接合欠失で欠失された。ホモ接合性ＨＬＡ－Ａ欠失は、がんの０．２％未満で見出された（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．８：１２２１（２０１７））。対照的に、半接合性の喪失による、がん細胞における遺伝子の単一コピーの欠失は、はるかに頻繁に起こる。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ヘテロ接合性の喪失により、標的細胞内で喪失される遺伝子の対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞を含む。がん細胞は、複製及び欠失を含む、頻繁なゲノム再配列を受ける。これらの欠失は、がん細胞内の１つ以上の遺伝子の１つのコピーの欠失につながる可能性がある。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）」は、がんにおいて高頻度で生じる遺伝子変化を指し、それにより、２つの対立遺伝子のうちの１つが欠失し、単一の単一対立遺伝子（半接合性）遺伝子座を残す。
ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を含む。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩは、免疫系の細胞に対する抗原を示し、免疫応答を誘発するタンパク質複合体である。ＭＨＣクラスＩに対応するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－Ｅである。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ＬＯＨを介して標的細胞内で喪失されるＨＬＡクラスＩの対立遺伝子を含む。ＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座によってコードされる主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の群である。ＨＬＡ－Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の３つの主要なタイプのうちの１つである。受容体は、重α鎖及びより小さいβ鎖を含むヘテロ二量体である。α鎖は、ＨＬＡ－Ａのバリアントによってコードされ、一方、β鎖（β２－ミクログロブリン）は、不変である。数千のバリアントＨＬＡ－Ａ遺伝子が存在し、これらの全ては、本開示の範囲内に入る。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子を含む。ＨＬＡ－Ｂ遺伝子は、多くの可能性のある変形（対立遺伝子）を有する。ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の何百ものバージョン（対立遺伝子）が知られており、各々に特定の数（ＨＬＡ－Ｂ２７など）が与えられている。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む。ＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡクラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖及び軽鎖（ベータ－２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。１００以上のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が記載されている。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、広範囲又はユビキタスＲＮＡ発現を有する。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、既知の、又は概して高い副対立遺伝子頻度を有する。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、例えば、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子が汎ＨＬＡリガンド結合ドメインによって認識される場合、ペプチド－ＭＨＣ抗原を必要としない。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む。ＨＬＡ－Ａ＊０２に結合し、それを認識する当該技術分野で知られているか、又は本明細書で開示される様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に好適である。このようなｓｃＦｖとしては、例えば、以下の表５及び表６（相補性決定領域には下線が引かれている）に示されるペプチド非依存的な方式でＨＬＡ－Ａ＊０２に結合する、以下のマウス及びヒト化ｓｃＦｖ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原に結合するｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、配列番号２０７、２０９若しくは２１１の配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％を有するか、若しくはそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、配列番号２０７、２０９又は２１１の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含む。ＨＬＡ－Ｂ＊０７に結合し、それを認識する当該技術分野で知られているか、又は本明細書で開示される様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に好適である。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含む。ＨＬＡ－Ａ＊１１に結合し、それを認識する当該技術分野で知られているか、又は本明細書で開示される様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に好適である。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含む。ＨＬＡ－Ａ＊０１に結合し、それを認識する当該技術分野で知られているか、又は本明細書で開示される様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に好適である。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含む。ＨＬＡ－Ａ＊０３に結合し、それを認識する当該技術分野で知られているか、又は本明細書で開示される様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に好適である。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。ＨＬＡ－Ｃ＊０７に結合し、それを認識する当該技術分野で知られているか、又は本明細書で開示される様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に好適である。
このようなｓｃＦｖには、例えば、限定されないが、非標的抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７）を、以下の表７に示されるペプチド非依存的な方式で結合する以下のマウス及びヒト化ｓｃＦｖ抗体が含まれる（示されている場合、相補性決定領域は下線を引いている）。
ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインについての例示的な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３、又はＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）を以下の表８に示す。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号９５～１０２のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、抗体の軽鎖は、配列番号８７～９４のうちのいずれか１つの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号９５～１０２のうちのいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号８７～９４のうちのいずれか１つの軽鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含む。
ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７及びＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメイン結合ドメインについての追加の例示的な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３、又はＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）を以下の表９に示す。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性リガンドは、ＨＬＡ－Ａ＊０２であり、抑制性リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０２に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号６３～７４、２０７、２０９又は２１１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号６３～７４、２０７、２０９又は２１１のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ｂ＊０７に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、表７に示されるＢ７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、表７表９に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊１１に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０１に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０３に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ｃ＊０７に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
副組織適合性抗原
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）を含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、ＬＯＨを介して標的細胞内で喪失されるＭｉＨＡの対立遺伝子を含む。
ＭｉＨＡは、対立遺伝子間の非同義の差異を含有し、一般的なＨＬＡ対立遺伝子によって示されるタンパク質に由来するペプチドである。非同義の差異は、ＭｉＨＡをコードする遺伝子のコード配列におけるＳＮＰ、欠失、フレームシフト変異又は挿入から生じ得る。例示的なＭｉＨＡは、約９～１２アミノ酸長であってもよく、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩタンパク質に結合することができる。ＭｉＨＡを示すＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞を活性化することができる。ＭｉＨＡの遺伝的及び免疫学的特性は、当業者に既知であろう。候補ＭｉＨＡは、既知のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子によって提示される既知のペプチドであり、臨床において（例えば、移植片対宿主疾患、又は移植拒絶反応において）Ｔ細胞応答を誘発することが知られており、単純なＳＮＰ遺伝子型決定によって患者選択を可能にする。
いくつかの実施形態において、ＭｉＨＡは、広範囲又はユビキタスＲＮＡ発現を有する。
いくつかの実施形態において、ＭｉＨＡは、高い副対立遺伝子頻度を有する。
いくつかの実施形態において、ＭｉＨＡは、Ｙ染色体遺伝子に由来するペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、表１０及び表１１に開示されるＭｉＨＡの群から選択されるＭｉＨＡを含む。
本発明の範囲内として想定される、例示的であるが非限定的なＭｉＨＡの例を以下の表１０に開示する。表１０の列は、左から右に、ＭｉＨＡの名前、それが由来する遺伝子、ＭｉＨＡを表示することができるＭＨＣクラスＩバリアント、及びペプチドバリアント［括弧内に示されるＡ／Ｂバリアント］の配列を示す。
本発明の範囲内として想定される、例示的であるが非限定的なＭｉＨＡの例を以下の表１１に開示する。表１１の列は、左から右に、ＭｉＨＡの名前、それが由来する遺伝子、ＭｉＨＡを表示することができるＭＨＣクラスＩバリアント、及びペプチドバリアント［括弧内に示されるＡ／Ｂバリアント］の配列を示す。
いくつかの実施形態において、ＭｉＨＡは、ＨＡ－１を含む。ＨＡ－１は、ＶＬ［Ｈ／Ｒ］ＤＤＬＬＥＡ（配列番号１０５）の配列を有するペプチド抗原であり、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質４５（ＨＡ－１）遺伝子に由来する。
ＨＡ－１バリアントＨペプチド（ＶＬＨＤＤＬＬＥＡ（配列番号１９５））に選択的に結合する例示的なリガンド結合ドメインを以下の表１２に示す。ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ配列は、Ｎ末端ＧＳＧリンカーを有する配列ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９６）のＰ２Ａ自己切断ポリペプチドによって分離される。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性リガンドは、ＨＡ－１（Ｈ）を含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性リガンド結合は、ＴＣＲから単離されるか、又は派生する。いくつかの実施形態において、第２の抑制性リガンド結合ドメインは、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ可変ドメインは、自己切断ポリペプチド配列によって分離される。いくつかの実施形態において、自己切断ポリペプチド配列によって分離されたＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ可変ドメインは、配列番号１９７を含む。いくつかの実施形態において、自己切断ポリペプチド配列によって分離されたＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ可変ドメインは、配列番号１９７、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ可変ドメインは、配列番号２０２の配列、又はそれに対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ可変ドメインは、配列番号１９８、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ可変ドメインは、配列番号１９９、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
Ｙ染色体抗原の喪失
いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、Ｙ染色体遺伝子、すなわち、Ｙ染色体上の遺伝子によってコードされるペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制因子リガンドは、Ｙ染色体（ＬｏＹ）の喪失によって標的細胞内で失われるＹ染色体遺伝子によってコードされるペプチドを含む。例えば、特徴付けられたＭｉＨＡの約３分の１は、Ｙ染色体由来である。Ｙ染色体は、２００個以上のタンパク質をコードする遺伝子を含有し、これらは全て、本開示の範囲内として想定される。
本明細書で使用される場合、「Ｙの喪失」又は「ＬｏＹ」は、腫瘍において高頻度で発生し、それによってＹ染色体の一部又は全ての１つのコピーが欠失し、Ｙ染色体コード遺伝子の喪失をもたらす、遺伝子変化を指す。
Ｙ染色体の喪失は、ある特定のがんで発生することが知られている。例えば、腎淡明細胞がんにおいてＹ染色体の４０％体細胞喪失が報告されている（Ａｒｓｅｎｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：４４８７６（２０１７））。同様に、Ｙ染色体のクローン性喪失は、男性乳がん対象において３１人中５人で報告された（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６（４２）：４４９２７－４０（２０１５））。男性患者からの腫瘍におけるＹ染色体の喪失は、頭頸部がん患者の「一貫した特徴」として記載されている（ｅｌ－Ｎａｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １０５（１）：１０２－８（１９９６））。更に、Ｙ染色体喪失は、胃がんを有する７人の男性患者のうち４人においてＸ染色体ダイソミーと関連していた（Ｓａａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ（１９９３））。したがって、Ｙ染色体遺伝子は、様々ながんにおいて喪失され得、がん細胞を標的とする本開示の操作された受容体を有する抑制因子リガンドとして使用され得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
いくつかの実施形態において、第１又は第２の操作された受容体のいずれかは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の操作された受容体は、キメラ抗原受容体である。全てのＣＡＲアーキテクチャは、本開示の範囲内として想定される。
細胞外ドメイン
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、上記の抗原結合ドメインを含む。
ヒンジ領域
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲは、細胞外ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域の組み込みは、ＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン産生に影響を及ぼし、インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大を改善することができる。例示的なヒンジは、ＩｇＧ、ＣＤ２８又はＣＤ８、とりわけ例えば、ＩｇＧ１から単離され得るか、又は派生し得る。例示的なヒンジドメインを表１３に提供する。
いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号２１９）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号２１９を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号２１９から本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
ＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴ（配列番号２２０）。
いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号２２０によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、ＣＴＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号２２１）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、配列番号２２１を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
ＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣ（配列番号２２２）。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、配列番号２２２によってコードされる。
いくつかの実施形態において、活性化因子受容体は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、若しくはＩｇＧ４から単離されるか、若しくは派生するヒンジ配列、又は合成ヒンジを含む。
いくつかの実施形態、例えば、ＣＡＲが活性化因子受容体である実施形態において、ヒンジは、配列番号１、２２３、２２５、２２８、若しくは２３０の配列、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％を有するか、若しくはそれと同一の配列を含む。いくつかの実施形態、例えば、ＣＡＲが活性化因子受容体である実施形態において、ヒンジは、配列番号１、２２３、２２５、２２８、又は２３０の配列を含む。
膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと自然に会合する膜貫通ドメインが使用される。例えば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８膜貫通ドメインを使用してもよい。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はＩｇＧ４などの免疫グロブリンから単離されてもよいか、又はそれらに由来してもよい（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
本開示のＣＡＲのいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号２３２）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２３２を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧ（配列番号２３３）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２３３によってコードされる。
本開示のＣＡＲのいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、ＩＰＷＬＧＨＬＬＶＧＬＳＧＡＦＧＦＩＩＬＶＹＬＬＩ（配列番号２３４）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、配列番号２３４を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、ＡＴＴＣＣＧＴＧＧＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＡＧＴＧＴＡＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣ（配列番号２３５）の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、配列番号２３５によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生する膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、表１４における膜貫通ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２３２若しくは配列番号２３６の膜貫通ドメイン配列、又はそれに対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、若しくはそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２３２又は配列番号２３６の膜貫通ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号５６１の膜貫通ドメイン配列を含む。
細胞質ドメイン
本開示は、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、活性化因子受容体を提供する。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ若しくはＣＤ３ｚ、又はそれらの組み合わせから単離されるか、又は派生する細胞内ドメインを含む。
本発明のＣＡＲの細胞質ドメイン、又はそうでなければ、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。調節性Ｔ細胞のエフェクター機能としては、例えば、エフェクターＴ細胞の誘導又は増殖の抑止又は下方制御が挙げられる。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊化された機能を実行させるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を利用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される範囲で、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、インタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。ある場合には、複数の細胞内ドメインを組み合わせて、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞の所望の機能を達成することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
本開示のＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列、及び抗原受容体関与後のシグナル伝達を開始するために協調的に作用する共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
したがって、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞質活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能を活性化するのに必要なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達が存在することを確実にする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞質活性化は、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３ζ）活性化ドメイン、刺激性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ＫＩＲ２ＤＳ２活性化ドメイン、又は１２ｋＤａ（ＤＡＰ１２）活性化ドメインのＤＮＡＸ活性化タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２３８）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号２３８を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ（配列番号２３９）。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号２３９によってコードされる。
ＴＣＲのみを通じて生成されるシグナルは、多くの場合、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次又は共刺激シグナルもまた必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列である、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、及び二次又は共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的な方式、又は抑制的な方式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＡＭは、任意の２つの他のアミノ酸（ＹｘｘＬ）（配列番号２４０）によってロイシン又はイソロイシンから分離されたチロシンを含有する。
いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、１、２、又は３個のＩＴＡＭを含有する。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、１個のＩＴＡＭを含有する。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、２個のＩＴＡＭを含有する。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、３個のＩＴＡＭを含有する。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、４個のＩＴＡＭを含有する。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、５個のＩＴＡＭを含有する。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、単一のＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、２個のＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、３個のＩＴＡＭを含む。
いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２４１）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号２４１を含む。いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２４１）のアミノ酸配列から本質的になる。いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ（配列番号２４２）。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号２４２によってコードされる。
本開示のＣＡＲに使用され得る一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの更なる例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。本発明のＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子が、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
共刺激ドメイン
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体でＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むか、又は本開示のＣＡＲの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせるように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分及び共刺激ドメインを含むことができる。共刺激ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、共刺激ドメインが挙げられ、その共刺激ドメインは、ＩＬ－２Ｒβ、Ｆｃ受容体ガンマ（ＦｃＲγ）、Ｆｃ受容体ベータ（ＦｃＲβ）、ＣＤ３ｇ分子ガンマ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５分子（ＣＤ５）、ＣＤ２２分子（ＣＤ２２）、ＣＤ７９ａ分子（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９ｂ分子（ＣＤ７９ｂ）、がん胎児抗原関連細胞接着分子３（ＣＤ６６ｄ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー８（ＣＤ３０）、ＣＤ４０分子（ＣＤ４０）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２分子（ＣＤ２）、ＣＤ７分子（ＣＤ７）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（ＬＩＧＨＴ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ２（ＮＫＧ２Ｃ）、及びＣＤ２７６分子（Ｂ７－Ｈ３）ｃ－刺激ドメイン、又はそれらの機能的断片からなる群から選択される。
本開示のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質ドメインは、ランダム又は指定された順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば、２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、好適なリンカーの一例を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８から単離されるか、又は派生する。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２４３）。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号２４３を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧＡＧＣ（配列番号２４４）。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４４によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、インターロイキン－２受容体ベータ鎖（ＩＬ－２Ｒベータ又はＩＬ－２Ｒ－ベータ）細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータドメインは、切断される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ細胞質ドメインは、１つ以上のＳＴＡＴ５動員モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒベータ細胞質ドメインの外側に１つ以上のＳＴＡＴ５動員モチーフを含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２－Ｒベータ細胞内ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ（配列番号２４５）。いくつかの実施形態において、ＩＬ２Ｒ－ベータ細胞内ドメインは、配列番号２４５を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒ膜貫通ドメインは、ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＴＣＧＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＣＧＣＣＡＣＴＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＴＴＧＴＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＡＣＴＴＧＧＴＧ（配列番号２４６）の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒ－ベータ細胞内ドメインは、配列番号２４６によってコードされる。
一実施形態において、ＩＬ－２Ｒ－ベータ細胞質ドメインは、１つ以上のＳＴＡＴ５動員モチーフを含む。例示的なＳＴＡＴ５動員モチーフは、Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＳＴＡＴ５－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＯＸＰ３ ｉｎ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３，ｐｐ．４２１－４３１によって、及びＫａｇｏｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４４７８によって提供される。
いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ５動員モチーフは、配列Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ（配列番号２４７）からなる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及び／若しくはＣＤ３ｚ、又はそれらの組み合わせから単離されるか、又は派生する細胞内ドメインを含む。ＣＤ２８、４－１ＢＢ及び／又はＣＤ３ｚに由来する例示的なドメインを以下の表１５に示す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２４８、２５０若しくは２５２の配列、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％を有するか、若しくはそれと同一の配列を含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２４８、２５０又は２５２のヌクレオチド配列を含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内ドメインは、配列番号２４９、２５１、２５３、又は２１８０４のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本開示は、第１の活性化因子受容体、及びそれを含む免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。本開示で使用するための細胞内ドメインを含む例示的なＴＣＲは、２０２０年９月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２５０に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」又は「ＴＣＲ／ＣＤ３複合体」と呼ばれることもある「ＴＣＲ」は、サブユニットと称されることもある、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、及びインバリアントＣＤ３鎖（ゼータ、ガンマ、デルタ、及びイプシロン）のうちの１つ以上を含むタンパク質複合体を指す。ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するヘテロ二量体として機能するようにジスルフィド結合され得る。ＴＣＲアルファ／ベータヘテロ二量体がペプチド－ＭＨＣに関与すると、関連するインバリアントＣＤ３サブユニット内のＴＣＲ複合体における立体構造変化が誘導され、これが、それらのリン酸化及び下流タンパク質との会合をもたらし、それによって一次刺激シグナルを形質導入する。例示的なＴＣＲ複合体では、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータポリペプチドは、ヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３イプシロン及びＣＤ３デルタは、ヘテロ二量体を形成し、ヘテロ二量体のためのＣＤ３イプシロン及びＣＤ３ガンマ、並びに２つのＣＤ３ゼータは、ホモ二量体を形成する。
［２０４］任意の好適なリガンド結合ドメインは、本明細書に記載のＴＣＲの細胞外ドメイン、ヒンジドメイン又は膜貫通に融合され得る。例えば、リガンド結合ドメインは、抗体若しくはＴＣＲの抗原結合ドメインであってもよく、又は抗体断片、Ｖβのみのドメイン、直鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、若しくは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、１つ以上のＴＣＲサブユニットの１つ以上の細胞外ドメイン又は膜貫通ドメインに融合される。ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ又はＣＤ３ゼータであってもよい。例えば、リガンド結合ドメインは、ＴＣＲアルファ、若しくはＴＣＲベータに融合され得るか、又はリガンド結合の部分は、２つのサブユニットに融合され得、例えば、リガンド結合ドメインの部分は、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータの両方に融合され得る。
ＴＣＲサブユニットには、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３イプシロンが含まれる。ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、若しくはＣＤ３ゼータ、又はそれらの断片若しくは誘導体のうちのいずれか１つ以上は、本開示の刺激シグナルを提供することができる１つ以上のドメインに融合され得、それによって、ＴＣＲ機能及び活性が増強される。
任意の供給源から単離されるか又は派生するＴＣＲ膜貫通ドメインは、本開示の範囲内として想定される。膜貫通ドメインは、天然又は組換え源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲ複合体が標的に結合しているときはいつでも、細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本開示における特定の使用の膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖の膜貫通領域を少なくとも含み得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＴＣＲのポリペプチドの細胞外領域、例えば、ＴＣＲアルファ又はベータ鎖の抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＤ８ａヒンジであってもよい。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生する。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＴＣＲの１つ以上の膜貫通ドメインに結合される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメイン、ＴＣＲベータ膜貫通ドメイン、又はその両方を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通は、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域と会合する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は最大１５個のアミノ酸）、及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合する１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は最大１５個のアミノ酸）を含み得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
存在する場合、膜貫通ドメインは、天然ＴＣＲ膜貫通ドメイン、異種膜タンパク質由来の天然膜貫通ドメイン、又は人工膜貫通ドメインであってもよい。膜貫通ドメインは、膜アンカードメインであってもよい。限定されないが、天然又は人工膜貫通ドメインは、多くの場合、膜貫通セグメントに隣接する正電荷を有する、約２０個のアミノ酸の疎水性ａ－ヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、１つの膜貫通セグメント又は１つを超える膜貫通セグメントを有し得る。膜貫通ドメイン／セグメントの予測は、公開されている予測ツールを使用して作製され得る（例えば、ＴＭＨＭＭ，Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１；３０５（３）：５６７－５８０、又はＴＭｐｒｅｄ，Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ １９９３；３４７：１６６）。膜アンカー系の非限定的な例としては、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー（シグナル配列に翻訳後付加される）などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ（配列番号３１６）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、配列番号３１６を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、以下の配列によってコードされる。
ＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号３１７）。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号３１８）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、配列番号３１８を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、以下の配列によってコードされる。
ＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧ（配列番号３１９）。
本開示のＴＣＲは、１つ以上の細胞内ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、膜貫通ドメインに刺激シグナルを提供することができる１つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、刺激シグナルを提供することができる第１の細胞内ドメイン、及び刺激シグナルを提供することができる第２の細胞内ドメインを含む。他の実施形態において、細胞内ドメインは、刺激シグナルを提供することができる第１、第２及び第３の細胞内ドメインを含む。刺激シグナルを提供することができる細胞内ドメインは、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）ドメイン、ＬＣＫがん原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）ドメイン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）ドメイン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＧＩＴＲ）ドメイン、ＣＤ４分子（ＣＤ４）ドメイン、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８ａ）ドメイン、ＦＹＮがん原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｆｙｎ）ドメイン、Ｔ細胞受容体関連タンパク質キナーゼ７０（ＺＡＰ７０）ドメインのゼータ鎖、Ｔ細胞（ＬＡＴ）ドメインの活性化のためのリンカー、リンパ球細胞質タンパク質２（ＳＬＰ７６）ドメイン、（ＴＣＲ）アルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、機能細胞、例えば、ＴＣＲ含有細胞、例えば、ＴＣＲ発現Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。いくつかの実施形態において、本開示の第１の受容体の細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例えば、ＣＤ３ガンマ、デルタ、又はイプシロンの細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、同じタンパク質、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ゼータから単離されるか、又はそれらから派生する。
本開示の活性化因子受容体において使用するための細胞内ドメインの例としては、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３ゼータ、及び４－１ＢＢの細胞質配列、並びに抗原受容体関与後のシグナル伝達を開始するために協調して作用する細胞内シグナル伝達共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、又は抗原依存性刺激を担うタンパク質に由来するものが含まれる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３デルタ細胞内ドメイン、ＣＤ３イプシロン細胞内ドメイン、ＣＤ３ガンマ細胞内ドメイン、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン、ＴＣＲアルファ細胞内ドメイン、又はＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、ＴＣＣＡＧＣの配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲ（配列番号３２０）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、配列番号３２０を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡ（配列番号３２１）の配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの刺激性細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインなどの一次細胞内シグナル伝達ドメイン、並びに１つの追加の刺激性細胞内ドメイン、例えば、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインなどの一次細胞内シグナル伝達ドメイン、並びに２つの追加の刺激性細胞内ドメインを含む。
例示的な共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激性シグナル、又は抗原非依存性刺激を担うタンパク質に由来するものが含まれる。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、並びにＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９）、及びＣＤ２８分子（ＣＤ２８）が含まれるが、これらに限定されない。共刺激タンパク質は、以下のタンパク質ファミリーに表され得る。ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及びＮＫ細胞活性化受容体。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３、ＣＤ４と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。共刺激ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、若しくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はそれらの機能的バリアントを含むことができる。
いくつかの実施形態において、刺激ドメインは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。ＣＤ２８及び４－１ＢＢは、完全なＴ細胞活性化に必要な十分に特徴付けられた共刺激分子であり、Ｔ細胞エフェクター機能を増強することが知られている。例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインのみを含有する第１世代のＣＡＲにわたるサイトカインの放出、細胞溶解機能、及び持続性を強化するために、ＣＤ２８及び４－１ＢＢがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）において利用されている。同様に、ＴＣＲに共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８及び４－１ＢＢドメインを含めることにより、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させることができ、典型的には、腫瘍細胞の表面上で下方制御される共刺激リガンドの不在下での共刺激を特異的に可能にすることができる。いくつかの実施形態において、刺激ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメイン又は４－１ＢＢ細胞内ドメインを含む。
抑制性受容体
本開示は、がん細胞、例えば、遺伝子の対立遺伝子バリアントにおいて喪失している非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体を提供する。非標的対立遺伝子バリアントは、限定されないが、非標的対立遺伝子バリアントの発現に影響を及ぼすエピジェネティック変化、非標的対立遺伝子バリアントをコードする遺伝子に対する変異、非標的対立遺伝子バリアントの発現を調節する細胞シグナル伝達の破壊、染色体消失、ゲノム遺伝子座の部分的若しくは完全な欠失、核酸若しくはヘテロクロマチンの修飾による遺伝子サイレンシング、又は他の機構による発現の喪失などの任意の機構を通してがん細胞内で喪失され得る。本明細書に開示される組成物及び方法の変形形態において、処理された細胞又は対象は、非遺伝的変化のために非標的対立遺伝子バリアントの発現の喪失を示し得る。したがって、本開示は、ヘテロ接合性の喪失を含むが、これに限定されない任意の原因からの非標的抗原の発現を欠く細胞を死滅させる、かつ／又は対象を治療するための組成物及び方法を提供する。
例示的な抑制性受容体は、２０２０年９月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２２８、２０２０年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６０７、２０２１年４月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２９９０７、及び２０２０年１１月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５９８５６に記載されており、これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「抑制性キメラ抗原受容体」又は「抑制性受容体」という用語は、免疫細胞の免疫活性を抑制又は抑止する抑制シグナルを形質導入することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合される抗原結合ドメインを指す。抑制性受容体は、免疫細胞抑制性の潜在能力を有し、免疫細胞活性化の潜在能力を有する受容体であるＣＡＲとは異なり、区別可能である。例えば、ＣＡＲは、細胞内刺激ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含むので、受容体を活性化している。抑制性受容体は、細胞内抑制ドメインを含有する抑制性受容体である。
本明細書で使用される場合、「抑制シグナル」とは、免疫応答の抑止（例えば、サイトカイン産生の減少又は免疫細胞活性化の減少）をもたらす免疫細胞におけるシグナル伝達又はタンパク質発現の変化を指す。免疫細胞の抑制又は抑止は、選択的及び／若しくは可逆的であり得るか、又は選択的及び／若しくは可逆的ではない。抑制性受容体は、非標的抗原に応答する（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）。例えば、非標的抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）が、抑制性受容体に結合又は接触する場合、抑制性受容体は応答性であり、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインによる非標的抗原の結合時に抑制性受容体を発現する免疫細胞における抑制シグナルを活性化する。
非標的抗原は、非標的対立遺伝子バリアントであり得る。本明細書で使用される場合、「非標的対立遺伝子バリアント」とは、ヘテロ接合性の喪失、又は発現喪失の別の機構により、標的細胞（例えば、がん細胞）において発現が低下又は除去されているが、正常細胞又は健常細胞において発現されるか、若しくは検出可能に発現される、対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の対立遺伝子バリアント）を指す。非標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるタンパク質、又はその抗原ペプチドであってもよく、非標的抗原は多型を含む。非標的抗原は多型であるため、がん細胞内のヘテロ接合性の喪失によって生じ得る、非標的抗原をコードする遺伝子の単一コピーの喪失は、遺伝子の他の多型バリアントを保持するが、非標的抗原を喪失したがん細胞を生じる。例えば、ＨＬＡ遺伝子座にＨＬＡ－Ａ＊０２及びＨＬＡ－Ａ＊０１対立遺伝子を有する対象は、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子のみが喪失されるがんを有し得る。このような対象において、ＨＬＡ－Ａ＊０１タンパク質は依然として存在するが、抑制因子受容体が、ＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）に特異的であるように設計されているため、がん細胞に遭遇する免疫細胞の抑制性受容体によって認識されない。正常な非悪性細胞において、ＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）が存在し、操作された免疫細胞の活性化を抑制する。ヘテロ接合性の喪失を有するがん細胞において、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子バリアント（又は他の非標的抗原）が喪失される。抑制性受容体は、がん細胞には存在しないＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）にのみ応答するため、抑制性受容体を発現するように操作された免疫細胞は、抑制性受容体から抑制シグナルを受け取らない。この機序によって、免疫細胞は、選択的に活性化され、ＨＥＲ２を発現するが、ヘテロ接合性の喪失により、ＨＬＡ－Ａ＊０２（又は別の非標的抗原）を喪失しているがん細胞を選択的に死滅させる。本明細書では、ＨＬＡ－Ａを例として使用する。同様の多型変異は、他のＭＨＣ遺伝子の集団においても、また他の非ＭＨＣ遺伝子においても生じる。したがって、いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１若しくはＣＸＣＬ１６、又はＨＬＡ－Ａ＊０２の多型バリアントを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子又は副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原は、対象の健常な細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、非標的対立遺伝子バリアントである。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、対象のがん細胞において発現されない。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、対象における腫瘍中の細胞の一部において発現されない。いくつかの実施形態において、対象におけるがん細胞は、非標的抗原の発現を喪失している。細胞における非標的抗原の発現の喪失又は発現の欠如は、非標的遺伝子発現に影響を及ぼすエピジェネティック変化、非標的抗原をコードする遺伝子に対する変異、又は非標的遺伝子の発現を調節する細胞シグナル伝達の破壊などの任意の機構による可能性があるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、抑制性キメラ抗原受容体（すなわち、抑制性受容体）である。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、抑制性受容体である。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、配列番号３２３、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、配列番号３２４、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
本開示は、非標的抗原の単一アミノ酸バリアント対立遺伝子を区別することができる細胞外リガンド結合を含む、抑制性受容体である、第２の受容体を提供する。非標的抗原の対立遺伝子バリアントを区別するこの能力は、第２の受容体が、リガンド結合ドメインによって認識される対立遺伝子を発現する非標的細胞の存在下で、第２の受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを可能にする。しかしながら、免疫細胞の活性化は、対立遺伝子を喪失した標的細胞、例えば、ヘテロ接合性の喪失により遺伝子の１つの対立遺伝子を喪失したがん細胞の存在下では抑制されない。
本開示は、非標的抗原の異なるレベルの発現を区別することができる細胞外リガンド結合を含む、抑制性受容体である、第２の受容体を提供する。これにより、第２の受容体が、第２の受容体に対するリガンドを発現する非標的細胞の存在下で第２の受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを可能にするが、第２の受容体に対するリガンドの低いレベルを発現するか、又は発現しないがん細胞の存在下での免疫細胞の活性化を可能にする。
抑制因子リガンド
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、標的細胞によって発現されず、非標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、健常な細胞、すなわち、がん細胞ではない細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を通じて非標的抗原の発現を喪失した複数のがん細胞である。いくつかの実施形態において、非標的細胞は、標的及び非標的抗原の両方を発現する、複数の健常な細胞（すなわち、非がん細胞、正常細胞、又は健常な細胞）である。
標的細胞によって発現されない、非標的細胞によって発現される任意の細胞表面分子は、第２の受容体細胞外リガンド結合ドメインに好適な非標的抗原であり得る。例えば、細胞接着分子、細胞間シグナル伝達分子、細胞外ドメイン、走化性に関与する分子、糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、膜貫通、神経伝達物質のための受容体、又は電圧依存性イオンチャネルを、非標的抗原として使用することができる。
いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ヘテロ接合性の喪失に起因してがん細胞内で喪失される。ヘテロ接合性の喪失によりがん細胞内で喪失した例示的な非標的抗原には、ＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１、ＣＸＣＬ１６及びＨＬＡ－Ａ＊０２が含まれる。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１及びＣＸＣＬ１６６の多型バリアント、若しくはそのペプチド抗原主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体、又はＨＬＡ－Ａ＊０２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１、及びＣＸＣＬ１６の多型残基を含む抗原ペプチドである。
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃのいずれかを含む非標的ＭＨＣ－１（ＭＨＣ）抗原は、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ヒト白血球抗原Ａ＊０２対立遺伝子産物（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ヒト白血球抗原Ａ＊６９を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＣＸＣＬ１６前駆体は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００１０９４２８２．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ１６は、以下のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型残基を含むＣＸＣＬ１６に由来するペプチドを含む。ＣＸＣＬ１６の多型残基は、配列番号３２５の１４２位及び２００位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸１４２又は２００を含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸２００におけるＡを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸２００におけるＶを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸１４２におけるＩを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸１４２におけるＴを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸２００におけるＡを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号３２５の２００位におけるＶを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号３２５の２００位におけるＡを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸２００におけるＶを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号３２５の２００位におけるＡを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号３２５の２００位におけるＶを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸１４２におけるＩを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号３２５の１４２位におけるＴを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号３２５の１４２位におけるＩを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２５のアミノ酸１４２におけるＴを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号３２５の１４２位におけるＩを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号３２５の１４２位におけるＴを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてコレクチンサブファミリーメンバー１２（ＣＯＬＥＣ１２）又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＣＯＬＥＣ１２は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿５６９０５７．２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＯＬＥＣ１２は、以下のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＯＬＥＣ１２の多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＣＯＬＥＣ１２の多型残基を含むＣＯＬＥＣ１２に由来するペプチドを含む。ＣＯＬＥＣ１２の多型残基は、配列番号３２６の５２２位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２６のアミノ酸５２２を含む、ＣＯＬＥＣ１２のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２６のアミノ酸５２２におけるＳを含む、ＣＯＬＥＣ１２のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２６のアミノ酸５２２におけるＰを含む、ＣＯＬＥＣ１２のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてＡＰＣ下方制御１（ＡＰＣＤＤ１）又はその抗原ペプチドを含む。例示的なヒトＡＰＣＤＤ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ記録番号Ｑ８Ｊ０２５に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、以下のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＡＰＣＤＤ１の多型を含む。ＡＰＣＤＤ１の例示的な多型には、配列番号３２７の１５０位におけるＶ、Ｉ又はＬであり得る、ｒｓ３７４８４１５が含まれる。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２７のアミノ酸１５０を含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２７のアミノ酸１５０におけるＶを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２７のアミノ酸１５０におけるＩを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２７のアミノ酸１５０におけるＬを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。
更なる例示的なヒトＡＰＣＤＤ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ記録番号Ｖ９ＧＹ８２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、以下のアミノ酸配列を含む。
ＡＰＣＤＤ１の例示的な多型には、ｒｓ１７８６６８３が含まれ、これは、配列番号３２８の１６５位におけるＹ又はＳであり得る。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２８のアミノ酸１６５を含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２８のアミノ酸１６５におけるＹを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２８のアミノ酸１６５におけるＳを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。
更なる例示的なヒトＡＰＣＤＤ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ記録番号Ｊ３ＱＳＥ３に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、以下のアミノ酸配列を含む。
ＡＰＣＤＤ１の例示的な多型には、配列番号３２９の２８位におけるＱ又はＲであり得る、ｒｓ９９５２５９８が含まれる。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２９のアミノ酸２８を含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２９のアミノ酸２８におけるＱを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２９のアミノ酸２８におけるＲを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、配列番号３２７～３２９のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＡＰＣＤＤ１の多型残基は、配列番号３２７～３２９に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む非標的抗原、及び第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０２に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号６３～７４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号６３～７４のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖは、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインの重鎖は、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、抗原結合ドメインの軽鎖は、配列番号８７～１０２のうちのいずれか１つの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号９５～１０２から選択されるＣＤＲを含み、軽鎖は、配列番号８７～９４から選択されるＣＤＲを含む。リガンド結合ドメインのいずれかの更なる実施形態において、各ＣＤＲ配列は、１、２、３個以上の置換、挿入、又は欠失を有し得る。ＣＤＲ配列は、置換、欠失、又は挿入を許容し得る。配列アラインメントツール、日常的な実験、及び既知のアッセイを使用して、当業者は、過度の実験なしに、ＣＤＲ配列において、１、２、３個以上の置換、挿入、又は欠失を有するバリアント配列を生成及び試験することができる。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号６３～７４のうちのいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号６３～７４のうちのいずれか１つの軽鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号６３～７４のうちのいずれか１つの重鎖部分と同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号６３～７４のうちのいずれか１つの軽鎖部分と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ｂ＊０７に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、表７に示されるＢ７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊１１に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０１に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖは、表９において示されるＨＬＡ－Ａ＊０１相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７において示されるＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０３に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ｃ＊０７に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７結合ドメインのうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖは、表９に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、表７に示されるＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖ配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
本開示の抑制性受容体は、細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。リガンド依存的な様式で受容体の活性を調節することができる任意の種類のリガンド結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインである。例示的な抗原結合ドメインには、とりわけ、ｓｃＦｖ、ＳｄＡｂ、Ｖβのみのドメイン、並びにＴＣＲ α及びβ鎖可変ドメインに由来するＴＣＲ抗原結合ドメインが含まれる。
任意の種類の抗原結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）、又はＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体において、ＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１、ＣＸＣＬ１６、又はその抗原ペプチドの多型バリアントに結合し、それを認識する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抑制性受容体の細胞外ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、本開示の抑制性受容体は、細胞外ヒンジ領域を含む。例示的なヒンジは、ＩｇＤ及びＣＤ８ドメイン、例えば、ＩｇＧ１から単離され得るか、又は派生し得る。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生する。
本開示の抑制性受容体は、抑制性受容体の細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はＩｇＧ４などの免疫グロブリンから単離されてもよいか、又はそれらに由来してもよい（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーは、膜貫通ドメインと抑制性受容体の細胞内ドメインとの間の結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
本開示は、細胞内ドメインを含む抑制性受容体を提供する。本開示の抑制性受容体の細胞内ドメインは、他の場合に第１の受容体による活性化シグナルに応答して活性化されるであろう、抑制性受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを担う。いくつかの実施形態において、例えば、抑制シグナルを提供する本開示の第２の抑制性受容体において、抑制シグナルは、受容体の細胞内ドメインを介して伝達される。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、抑制性細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性の操作された受容体は、抑制性細胞内ドメインを含むＣＡＲ（抑制性ＣＡＲ）である。
いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＩＭを含む抑制性細胞内ドメインは、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１などの免疫チェックポイント抑制因子から単離され得るか、又は派生し得る。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１は、Ｔ細胞の表面上に発現する免疫抑制性受容体であり、Ｔ細胞応答の減衰又は終結において重要な役割を果たす。
抑制性ドメインは、ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体及びＣＤ２００受容体１から単離され得る。いくつかの実施形態において、ＴＲＡＩＬ受容体は、ＴＲ１０Ａ、ＴＲ１０Ｂ又はＴＲ１０Ｄを含む。
いくつかの実施形態において、抑制ドメインは、細胞内ドメイン、膜貫通、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、グリコスフィンゴ脂質マイクロドメイン１（ＰＡＧ１）を有するリンタンパク質膜アンカーから単離される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＬＲＢ１）から単離される。いくつかの実施形態において、抑制性ドメインは、ヒトタンパク質、例えば、ヒトＴＲＡＩＬ受容体、ＣＴＬＡ－４、又はＰＤ－１、ＰＡＧ１、又はＬＩＬＲＢ１タンパク質から単離されるか、又は派生する。
いくつかの実施形態において、抑制ドメインは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、抑制性ドメインは、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＩＭを含む抑制性ドメインは、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１などの免疫チェックポイント抑制因子から単離され得るか、又は派生し得る。本明細書に記載の抑制性受容体において使用され得る例示的なヒンジ、膜貫通、及び細胞内ドメインを表１６に示す。
抑制性ドメインは、ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体及びＣＤ２００受容体１から単離され得る。いくつかの実施形態において、抑制性ドメインは、ヒトタンパク質、例えば、ヒトＴＲＡＩＬ受容体、ＣＴＬＡ－４、又はＰＤ－１タンパク質から単離されるか、又は派生する。いくつかの実施形態において、ＴＲＡＩＬ受容体は、ＴＲ１０Ａ、ＴＲ１０Ｂ又はＴＲ１０Ｄを含む。
内因性ＴＲＡＩＬは、２８１－アミノ酸ＩＩ型膜貫通タンパク質として発現され、これは、形質膜に係留され、細胞表面上に提示される。ＴＲＡＩＬは、ナチュラルキラー細胞によって発現され、細胞間接触の確立後、標的細胞においてＴＲＡＩＬ依存性アポトーシスを誘導することができる。生理学的に、ＴＲＡＩＬシグナル伝達系は、免疫監視、Ｔヘルパー細胞１対Ｔヘルパー細胞２、並びに「無力な」ＣＤ８＋Ｔ細胞数の調節による免疫系の形成、並びに自発的な腫瘍形成の抑止に不可欠であることが示された。
いくつかの実施形態において、抑制性ドメインは、ＣＤ２００受容体から単離されるか、又は派生する細胞内ドメインを含む。細胞表面糖タンパク質ＣＤ２００受容体１（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照：Ｑ８ＴＤ４６）は、本発明の抑制性細胞内ドメインの別の例を表す。ＣＤ２００／ＯＸ２細胞表面糖タンパク質のこの抑制性受容体は、選択された刺激に応答して、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン、及び誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を含む炎症誘発性分子の発現を抑制することによって炎症を制限する。
いくつかの実施形態において、操作された受容体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部３（ＫＩＲ３ＤＬ３）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＲ－１及びＬＩＬＲＢ１とも呼ばれる、ＬＩＲ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＦｃｇＲＩＩＢ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｋ１（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＴＬＡ－４、合成コンセンサスＩＴＩＭを含有するドメイン、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメイン（例えば、Ｎ及びＣ末端ＳＨ２ドメインの１つ又は両方）、又はＺＡＰ７０ ＫＩ＿Ｋ３６９Ａ（キナーゼ不活性ＺＡＰ７０）から単離されるか、又は派生する抑制性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、抑制ドメインは、ヒトタンパク質から単離されるか、又は派生する。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制性ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、抑制性受容体の細胞内ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、抑制性受容体の膜貫通ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、同じタンパク質、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質から単離されるか、又は派生する、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、同じタンパク質、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質から単離されるか、又は派生する、単離されるか、又は派生する、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメイン又はそれらの一部分を含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、細胞内ドメイン及び／又は膜貫通ドメインと同じタンパク質、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質から単離されるか、又は派生する、単離されるか、又は派生するヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の操作された受容体は、抑制性ドメインを含むＣＡＲ（抑制性ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ＣＡＲの膜貫通ドメインに融合される。
ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体
本開示は、ＬＩＬＲＢ１抑制性ドメイン、並びに任意選択で、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び／若しくはヒンジドメイン、又はその機能的バリアントを含む、第２の抑制性受容体を提供する。ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び／又はＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインを抑制性受容体に含めることにより、別の膜貫通ドメイン又は別のヒンジドメインを有する参照抑制性受容体と比較して、抑制性受容体によって生成される抑制シグナルが増加し得る。ＬＩＬＲＢ１抑制ドメインを含む第２の抑制性受容体は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ又はＴＣＲであってもよい。本明細書に記載の任意の好適なリガンド結合ドメインは、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１又はＬＩＲ１）からの１つ以上のドメインを有するＬＩＬＲＢ１ベースの第２の抑制性受容体に融合され得る。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む。
白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１としても知られている、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、並びにＩＬＴ２、ＬＩＲ１、ＭＩＲ７、ＰＩＲＢ、ＣＤ８５Ｊ、ＩＬＴ－２ ＬＩＲ－１、ＭＩＲ－７、及びＰＩＲ－Ｂは、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＲ）ファミリーのメンバーである。ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、ＬＩＲ受容体のサブファミリーＢクラスに属する。これらの受容体は、２～４個の細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び２～４個の細胞質免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。ＬＩＬＲＢ１受容体は、免疫細胞上で発現され、それは、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に結合し、免疫応答の刺激を抑制する負のシグナルを形質導入する。ＬＩＬＲＢ１は、炎症反応、及び細胞傷害性を調節し、自己反応性を制限する際に役割を果たすと考えられている。ＬＩＬＲＢ１の異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが存在し、これらの全ては、本開示の範囲内であると企図される。
本明細書に記載される抑制性受容体のいくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生する１つ以上のドメインを含む。ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生する１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号２８０の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号２８０の配列又は部分配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号２８０の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれと同一であるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号２８０の配列又は部分配列と同一であるアミノ酸配列からなる。
ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生する１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５５６の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれと同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５５６の配列又は部分配列と同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。様々な実施形態において、ポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体が提供され、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的断片若しくはバリアント、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、及びＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又は少なくとも１つ、若しくは少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインのうちの１つ以上を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
細胞内ドメイン
本開示は、抑制性受容体を提供し、抑制性受容体は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む。
本明細書で使用される場合、「細胞内ドメイン」は、細胞の内部と相互作用し、細胞質機能を実行する、受容体などのタンパク質の細胞質又は細胞内ドメインを指す。本明細書で使用される場合、「細胞質機能」は、細胞の細胞質中で実行されるタンパク質又はタンパク質複合体の機能を指す。例えば、細胞内シグナル伝達カスケードは、細胞質機能である。
本明細書で使用される場合、「免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ」又は「ＩＴＩＭ」とは、免疫系の多くの抑制性受容体の細胞質尾部に見出される、Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ（配列番号２６０）などのコンセンサス配列を有するアミノ酸の保存配列を指す。ＩＴＩＭ保有抑制性受容体が、それらのリガンドと相互作用した後、ＩＴＩＭモチーフがリン酸化され、抑制性受容体が、他の酵素、例えば、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２、又はＳＨＩＰと呼ばれるイノシトール－ホスファターゼを動員することが可能になる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）、少なくとも２つのＩＴＩＭ、少なくとも３つのＩＴＩＭ、少なくとも４つのＩＴＩＭ、少なくとも５つのＩＴＩＭ、又は少なくとも６つのＩＴＩＭを含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、１、２、３、４、５、又は６つのＩＴＩＭを有する。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）からなるＩＴＩＭの群から選択される少なくとも１つのＩＴＩＭを含む、細胞内ドメインを含む。
更なる特定の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）及びＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６０と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２８１と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）及びＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６１と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６１と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６２と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６２と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、及びＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６３と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６３と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６４と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６４と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）を含む。実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６５と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２６５と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号２６６）と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号２６６）と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
本開示のＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８つのＩＴＩＭを有することができる。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントは、２、３、４、５、又は６つのＩＴＩＭを有する。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、２、３、４、５、又は６つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、３つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、４つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、５つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、６つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも７つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、本明細書に記載のＴＣＲアルファ細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、ＴＣＣＡＧＣの配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、本明細書に記載されるように、ＴＣＲベータ細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲ（配列番号２６７）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲ（配列番号２６７）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡ（配列番号２６８）の配列によってコードされる。
ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４と呼ばれる４つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号２７４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号２７４を含むか、又はそれから本質的になる。
膜貫通ドメイン
本開示は、抑制性受容体を提供し、受容体は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢＩ膜貫通ドメイン、又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン及び膜貫通ドメイン、又はそれらの機能的バリアントを含む。
「膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用される場合、細胞の膜にまたがるタンパク質のドメインを指す。膜貫通ドメインは、典型的には、主に非極性アミノ酸からなり、脂質二重層を１回又は数回横断し得る。膜貫通ドメインは、通常、内部水素結合を最大化する構成である、アルファヘリックスを含む。
任意の供給源から単離されるか又は派生する膜貫通ドメインは、本開示の融合タンパク質の範囲内として想定される。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号２６９と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号２６９と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号２６９と同一の配列を含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号２６９と同一の配列から本質的になる。
本開示のキメラ抗原受容体のいくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインではない。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、融合タンパク質の他のドメインのうちの１つと会合するか、又は融合タンパク質の他のドメインのうちの１つと同じタンパク質から単離されるか若しくは派生する膜貫通ドメインである。
膜貫通ドメインは、天然又は組換え源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。例示的な膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖の膜貫通領域を少なくとも含み得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ（配列番号２７０）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ（配列番号２７０）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、以下の配列によってコードされる。ＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号２７１）。
いくつかの実施形態において、膜貫通は、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、以下の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号：２７２）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号２７２）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧ（配列番号２７３）の配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＴＣＲとＴＣＲ ＣＤ３サブユニットとの相互作用を減衰又は廃止する１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、Ｒ２５３Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、Ｋ２８８Ｌ変異を含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号２３２）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号２３２）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧ（配列番号２３３）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、細胞外領域キメラ抗原受容体、例えば、抗原結合ドメイン又はリガンド結合ドメインに結合することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ、又はＬＩＬＲＢ１ヒンジであり得る。
ヒンジドメイン
本開示は、抑制性受容体を提供し、受容体は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントである。
ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４と呼ばれる４つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号２７４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号２７４を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号２７５、配列番号２７４、又は配列番号２７６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれらと同一である配列を含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号２７５、配列番号２７４、又は配列番号２７６と少なくとも９５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号２７５、配列番号２７４、又は配列番号２７６と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号２７５、配列番号２７４、又は配列番号２７６と同一の配列から本質的になる。
いくつかの実施形態において、本開示のキメラ抗原受容体、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１から単離されないか、又は派生しないヒンジを含む。
いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号２１９）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号２１９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号２１９）から本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇｃｇａｃｃａｃｃａａｃａｃｃｇｇｃｇｃｃｃａｃｃａｔｃｇｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｃａｃａｃｇａｇｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｔｇａｔ（配列番号２２０）の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、ＣＴＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号２２１）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、ＣＴＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号２２１）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、以下の配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
ｔｇｔａｃｃａｔｔｇａａｇｔｔａｔｇｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｃｔａｇａｃａａｔｇａｇａａｇａｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｔｔａｔｃｃａｔｇｔｇａａａｇｇｇａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｃ（配列番号２２２）。
ＬＩＬＲＢ１ドメインの組み合わせ
いくつかの実施形態において、本開示の抑制性受容体は、１つを超えるＬＩＬＲＢ１ドメイン又はその機能的等価物を含むポリペプチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン、又はＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアント、及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７７と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７７と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７７と同一の配列を含む。
更なる実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、ＩＴＩＭは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも２つのＩＴＩＭを含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７８と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７８と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７８と同一の配列を含む。
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアント、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号２５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号２５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号２５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号２５９）から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２５４若しくは配列番号２７９と少なくとも９５％同一、又は配列番号２５４若しくは配列番号２７９と少なくとも９９％同一、又は配列番号２５４若しくは配列番号２７９と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７７と少なくとも９９％同一、又は配列番号２７７と少なくとも９９％同一、又は配列番号２７７と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７８と少なくとも９９％同一、又は配列番号２７８と少なくとも９９％同一、又は配列番号２７８と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＲＬＲＢ１ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＲＬＲＢ１ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、配列番号２５４の配列、又はそれと９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一の配列を含む。
本開示のＬＩＬＲＢ１ベースの抑制性受容体の更なる配列を以下の表１７に示す。
アッセイ
本明細書では、本開示の操作された受容体の活性を測定するために使用することができるアッセイが提供される。
操作された受容体の活性は、ルシフェラーゼレポーターなどの受容体活性のレポーターを発現するように操作された細胞株を使用してアッセイすることができる。例示的な細胞株としては、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞が挙げられるが、当該技術分野で既知の任意の好適な細胞株を使用してもよい。例えば、ＮＦＡＴプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、エフェクター細胞として使用することができる。この細胞株によるルシフェラーゼの発現は、ＴＣＲ媒介性シグナル伝達を反映する。
レポーター細胞は、本明細書に記載の様々な融合タンパク質構築物、融合タンパク質構築物の組み合わせ、又は対照の各々でトランスフェクトすることができる。
レポーター細胞における融合タンパク質の発現は、蛍光標識されたＭＨＣ四量体、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識されたＨＥＲ２－ＭＨＣ四量体を使用して、融合タンパク質の発現を検出することによって確認することができる。
操作された受容体の活性をアッセイするために、標的細胞を、レポーター及び操作された受容体を含むエフェクター細胞への曝露の前に抗原を充填する。例えば、標的細胞は、エフェクター細胞への曝露の少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４時間前に抗原を充填することができる。例示的な標的細胞としては、Ａ３７５細胞が挙げられるが、当該技術分野で既知の任意の好適な細胞が使用され得る。ある場合には、標的細胞は、ＨＥＲ２抗原などの抗原の段階希釈濃度で充填することができる。次いで、エフェクター細胞を、好適な期間、例えば６時間、標的細胞と共培養することができる。次いで、ルシフェラーゼを、共培養後の発光読み取りによって測定する。ルシフェラーゼ発光を、最大及び最小強度に正規化して、各操作された受容体構築物の活性化ペプチド濃度の比較を可能にすることができる。
本明細書では、本開示の操作された受容体の相対ＥＣ５０を決定する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」は、応答（又は結合）が半減する抑制因子又は作用物質の濃度を指す。本開示の操作された受容体のＥＣ５０は、操作された受容体の抗原への結合が半減する抗原の濃度を指す。抗原又はプローブの、操作された受容体への結合は、標識されたペプチド又は標識されたペプチド－ＭＨＣ複合体、例えば、フルオロフォアとコンジュゲートされたＭＨＣ：ＨＥＲ２ ｐＭＨＣ複合体で染色することによって測定することができる。ＥＣ５０は、ペプチド滴定によるレポーターシグナルの非線形回帰曲線適合によって得ることができる。プローブ結合及びＥＣ５０は、融合タンパク質（例えば、ＨＥＲ２）なしでベンチマークＴＣＲのレベルに正規化することができる。
ポリヌクレオチド
本開示は、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体、及びがん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド系を提供する。
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド系を含むベクターを提供する。本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本開示は、本明細書に記載の活性化因子受容体及び抑制性受容体の配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、活性化及び／若しくは抑制性受容体の配列、又は活性化因子及び／若しくは抑制性受容体の融合タンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体、又はそのポリペプチドをコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、抑制性受容体、又はその融合タンパク質をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号５２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号５４、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号５６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号５８、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号６０、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号６２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号２１８０３、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号７５～８６のうちのいずれか、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号７６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号７７、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号７８、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号７９、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号８０、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号８１、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号８２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号８３、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号８４、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号８５、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号８６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号２０８、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号２１０、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号２１２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号２２４、２２６、２２７、２２９、若しくは２３１のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、配列番号２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、若しくは３０８のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
本開示は、本明細書に記載の操作された受容体のうちのいずれかのコード配列又は配列をコードするベクターを提供する。いくつかの実施形態において、活性化及び／又は抑制性受容体の配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、活性化受容体をコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、抑制性受容体をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、活性化受容体は、第１のベクターによってコードされ、抑制性受容体は、第２のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、両方の操作された受容体は、単一のベクターによってコードされる。
いくつかの実施形態において、活性化因子受容体及び抑制性受容体は、単一のベクターによってコードされる。単一のベクターを使用して複数のポリペプチドをコードする方法は、当業者に既知であり、とりわけ、異なるプロモーターの制御下で複数のポリペプチドをコードすること、又は、単一のプロモーターを使用して複数のポリペプチドの転写を制御する場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び／若しくは自己切断ペプチドをコードする配列の使用を含むであろう。例示的な自己切断ペプチドには、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａ自己切断ペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２８８）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９６）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ａ自己切断ペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２８９）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ａ自己切断ペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２９０）の配列を含む。前述のうちのいずれも、Ｎ末端ＧＳＧリンカーを含むこともできる。例えば、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣ（配列番号５５８）の配列によってコードされ得る、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５５７）の配列も含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５４、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５８、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６０、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２１８０３、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７５、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７７、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７８、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７９、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８０、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８１、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８３、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８４、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８５、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２０８、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２１０、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２１２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２２４、２２６、２２７、２２９、若しくは２３１、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、若しくは３０８、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５１を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５３を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５５を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５７を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号５９を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６１を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６３を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６４を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６５を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６６を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６７を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６８を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号６９を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７０を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７２を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７３を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７４を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２０７、２０９、若しくは２１１を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、２１８０５を含むポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列をコードする。
いくつかの実施形態において、本発明で提供されるポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。コドン最適化は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、核酸配列によってコードされるタンパク質の産生を増加させる、サイレントヌクレオチド変化を核酸配列に導入するプロセスである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクター、すなわち、好適な細胞における本開示の操作された受容体の発現のためのものである。
レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込み、及び娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりも追加の利点を有する。これらはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。
操作された受容体をコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、融合タンパク質又はその部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物の複製及び組み込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むが、これらに限定されない、ベクターにクローニングすることができる。特に目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で、免疫細胞などの細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野で既知の技術を使用して、ベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボ又はエクスビボのいずれかで送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが、当該技術分野で既知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の上流の領域３０～１１０塩基対（ｂｐ）に位置するが、多くのプロモーターが、最近、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、その結果、エレメントが互いに対して反転又は移動するときに、プロモーター機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐ離して増加させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協調的又は独立してのいずれかで機能して、転写を活性化することができるように見える。
好適なプロモーターの一例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子－１α（ＥＦ－１α）である。好適なプロモーターの別の例は、Ｕ６プロモーターである。好適なプロモーターの別の例は、Ｈ１プロモーターである。しかしながら、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス***腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バールウイルス最初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、並びに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含む、他の構成的プロモーター配列も使用され得る。更に、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望される場合に、作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又は発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。Ｕ６プロモーターの例示的な配列は、配列番号２１８００に記載されている。Ｈ１プロモーターの例示的な配列は、配列番号２１８０１に記載されている。
ある特定の態様において、ベクターは、終結配列、例えば、Ｔ６又はＴ７終結配列を含む。
操作された受容体の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含有することができる。他の態様において、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片上に担持されてもよく、同時トランスフェクション手順で使用されてもよい。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方に、適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーには、例えば、ネオ（ｎｅｏ）などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクト又は形質導入された細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織内に存在しないか、又はそれによって発現されない遺伝子であり、その発現が、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡがレシピエント細胞内に導入された後の好適な時間に、レポーター遺伝子の発現をアッセイする。好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製することができるか、又は商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されてもよく、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用されてもよい。
遺伝子を細胞内に導入し、発現させる方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞内に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞内に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための１つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、及び特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞内に遺伝子を挿入するために最も広範に使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、並びに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む、脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
宿主細胞内に外因性核酸を導入するために使用される方法に関わらず、又はそうでなければ本発明の抑制因子に細胞を曝露するために使用される方法に関わらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、本発明の範囲内に含まれる作用物質を同定するために免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、又は本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在又は不在を検出することなどの「生化学的」アッセイが含まれる。
免疫細胞
本明細書では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、融合タンパク質及び操作された受容体を含む免疫細胞が提供される。
本開示は、がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する免疫細胞であって、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化受容体と、がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体とを含む、免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子又は副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ又はＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６、ＣＯＬＥＣ１２及びＡＰＣＤＤ１、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、又はその抗原ペプチドから選択される。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、標的抗原は、ＨＥＲ２である。いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性クラスＩ複合体（ＭＨＣ Ｉ）又はＭＨＣ ＩＩを有する複合体におけるＨＥＲ２のペプチド抗原である。いくつかの実施形態において、がん細胞は、ＨＥＲ２を発現する。いくつかの実施形態において、がん細胞は、乳がん細胞、膀胱がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、唾液管がん細胞、非小細胞肺がん細胞、膵がん細胞、又は結腸がん細胞である。いくつかの実施形態において、がん細胞は、乳がん細胞又は胃がん細胞である。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原は、対象の健常な細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、対象の健常な細胞は、標的抗原及びＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原の両方を発現する。いくつかの実施形態において、活性化因子受容体及び抑制性受容体はともに、がん細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種異系である。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、先天性又は適応性（後天性）免疫系に関与する細胞を指す。例示的な先天性免疫細胞には、好中球、単球及びマクロファージなどの食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球 好酸球及び好塩基球などの多形核白血球、並びに単球、マクロファージ及び肥満細胞などの単核細胞が含まれる。後天性免疫において役割を有する免疫細胞には、Ｔ細胞及びＢ細胞などのリンパ球が含まれる。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」とは、胸腺において発生する骨髄前駆体に由来するリンパ球の種類を指す。ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、調節ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び幹記憶Ｔ細胞を含む、胸腺への移行時に発生する、いくつかの異なる種類のＴ細胞が存在する。異なるタイプのＴ細胞は、それらのマーカーの発現に基づいて、当業者によって区別することができる。Ｔ細胞の種類を区別する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、第１及び第２の受容体を、約１００：１～１：１００の第１の受容体対第２の受容体の比で発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、第１及び第２の受容体を、約５０：１～１：５０の第１の受容体対第２の受容体の比で発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、第１及び第２の受容体を、約１０：１～１：１０の第１の受容体対第２の受容体の比で発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、第１及び第２の受容体を、約５：１～１：５の第１の受容体対第２の受容体の比で発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、第１及び第２の受容体を、約３：１～１：３の第１の受容体対第２の受容体の比で発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、第１及び第２の受容体を、約２：１～１：２の第１の受容体対第２の受容体の比で発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、第１及び第２の受容体を約１：１の比で発現する。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９１、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０３、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９１、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９１、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０７、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９１、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号２１８０５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０３、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０７、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号２１８０５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９９、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０３、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９９、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９９、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号３０７、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号２９９、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含み、第２の受容体は、配列番号２１８０５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドを更に含み、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドが、配列番号２８８若しくは５５７、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の操作された受容体を含む操作された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞又は調節性Ｔ細胞である。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」とは、胸腺において発生する骨髄前駆体に由来するリンパ球の種類を指す。ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、調節ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、及び幹記憶Ｔ細胞を含む、胸腺への移行時に発生する、いくつかの異なる種類のＴ細胞が存在する。異なる種類のＴ細胞は、それらのマーカーの発現に基づいて、当業者によって区別することができる。Ｔ細胞の種類を区別する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８－である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４－である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８－／ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、インバリアントＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子又はＢ２Ｍ遺伝子に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、又はその対立遺伝子バリアントである。いくつかの実施形態において、修飾は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子又はＢ２Ｍ遺伝子の発現を低下させるか、又は除去する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、本明細書に記載の第１の受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、本明細書に記載の第２の受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、本明細書に記載のｓｈＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、本明細書に記載の第１の受容体及び本明細書に記載の第２の受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、本明細書に記載の第１の受容体、本明細書に記載の第２の受容体、及び本明細書に記載のｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
本開示のベクターを用いて、Ｔ細胞などの免疫細胞の集団を形質転換する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、製造業者の指示に従って、ＣＤ３＋Ｔ細胞陰性単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから単離することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ３／２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：１の細胞対ビーズ比）及び３００ユニット／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の存在下で、５％のヒトＡ／Ｂ血清及び１％のＰｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＸ－Ｖｉｖｏ １５培地中で１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で培養することができる。２日後、Ｔ細胞を、当該技術分野で既知の方法を使用して、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターで形質導入することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される。次いで、細胞は、濃縮の前に更に５日間、ＩＬ－２又はＩＬ－７／１５／２１の組み合わせなどの他のサイトカイン中で培養することができる。Ｂ細胞などの免疫細胞の他の集団、又はＴ細胞の他の集団を単離及び培養する方法は、当業者には容易に明らかであろう。この方法は、潜在的なアプローチを概説しているが、これらの方法論は、急速に進化していることに留意すべきである。例えば、末梢血単核細胞の優れたウイルス形質導入は、５日間の増殖後に達成して、９９％超のＣＤ３＋が高度に形質導入された細胞集団を生成することができる。
操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、融合タンパク質、又は本開示の融合タンパク質をコードするベクターを含むＴ細胞の集団を活性化及び培養する方法は、当業者には容易に明らかであろう。
操作されたＴＣＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子修飾の前又は後に関わらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、同第１００４０８４６号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に一般的に記載されている方法を使用して活性化及び拡張することができる。
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、インビトロで増殖及び活性化される。一般に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを、それに付着させた表面との接触によってインビトロで増殖される。特に、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体との接触によって本明細書に記載されるように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般的に知られている他の方法として使用することができる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞についての一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあってもよいか、又は表面に結合していてもよい。表面に結合されたとき、作用物質は、同じ表面に結合されてもよく（すなわち、「シス」形成において）、又は別々の表面に結合されてもよい（すなわち、「トランス」形成において）。代替的に、一方の作用物質は表面に結合してもよく、他方の作用物質は溶液中にあってもよい。いくつかの実施形態において、共刺激シグナルを提供する作用物質は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する作用物質は溶液中にあるか、又は表面に結合している。ある特定の実施形態において、両方の作用物質は、溶液中にあってもよい。別の実施形態において、作用物質は、可溶性形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞、又は作用物質に結合する抗体若しくは他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。これに関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化及び拡張に使用するために企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、２つの作用物質は、同じビーズ上に固定化されるか、すなわち「シス」、又は別個のビーズに固定化される、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズ上に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片であり、両方の作用物質は、同等の分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡大及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した各抗体の１：１の比が使用される。いくつかの実施形態において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００及びその間にある全ての整数値の範囲である。本発明の一態様において、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満である。本発明のある特定の実施形態において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１を超える。
Ｔ細胞又は他の標的細胞を刺激するために、１：５００～５００：１及びそれらの間の任意の整数値の粒子対細胞の比が使用され得る。当業者であれば容易に理解することができるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒径に依存し得る。例えば、小さなサイズのビーズは、少しの細胞にのみ結合することができ、一方、より大きなビーズは、多くの細胞に結合することができる。ある特定の実施形態において、細胞対粒子の比は、１：１００～１００：１及びそれらの間の任意の整数値の範囲であり、更なる実施形態において、その比は、１：９～９：１及びそれらの間の任意の整数値を含み、また、Ｔ細胞を刺激するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、１：１の細胞対ビーズの比が使用される。当業者は、様々な他の比が、本発明での使用に好適であり得ることを理解するであろう。特に、比は、粒径、並びに細胞のサイズ及び種類に応じて変動することになる。
本発明の更なる実施形態において、Ｔ細胞などの細胞を、作用物質をコーティングしたビーズと合わせ、続いてビーズ及び細胞を分離し、次いで細胞を培養する。代替的な実施形態において、培養前に、作用物質をコーティングしたビーズ及び細胞を分離しないが、ともに培養する。更なる実施形態において、ビーズ及び細胞を、最初に、磁力などの力を加えることによって濃縮し、その結果、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それによって細胞刺激が誘導される。
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合してＴ細胞に接触する、常磁性ビーズを可能にすることによってライゲーションされ得る。一実施形態において、細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、１：１の比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ）を緩衝液中に合わせる。ここでも、当業者は、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解することができる。ある特定の実施形態において、粒子及び細胞がともに混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及び粒子の最大限の接触を確保することができる。例えば、一実施形態において、約２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。別の実施形態において、１億個を超える細胞／ｍｌが使用される。更なる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、又は５０００万個の細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。更に別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、又は１億個の細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。更なる実施形態において、１億２５００万個又は１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。いくつかの実施形態において、１×１０６細胞／ｍＬの密度で培養される細胞が使用される。
いくつかの実施形態において、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間、又はその間の任意の時間単位の整数値で培養されてもよい。別の実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、２～３日間ともに培養される。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、又は当業者に既知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、並びに還元剤、例えば、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されない。培地には、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれてもよく、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加されており、血清を含まないか、あるいは適切な量の血清（若しくは血漿）若しくは規定のセットのホルモン、並びに／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが補充されている。いくつかの実施形態において、培地は、５％のヒトＡ／Ｂ血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）及び３００ユニット／ｍｌのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ－１５培地を含む。
Ｔ細胞は、増殖を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）で維持される。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、及び／又は抑制性受容体を含むＴ細胞は、自己由来である。拡大及び遺伝子修飾の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から得られる。Ｔ細胞などの免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態において、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。本開示のある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液又は培地中に入れてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な実施形態において、洗浄液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよいか、又は全てではないが多くの二価カチオンを欠いてもよい。当業者であれば容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、製造業者の指示に従って、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することなどによって、当業者に既知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａなど、又は緩衝液を伴うか、若しくは伴わない他の生理食塩水中で再懸濁され得る。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞などの免疫細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、又は向流遠心分離によって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞などの免疫細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択技術によって更に単離され得る。例えば、一実施形態において、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間、抗ＣＤ４コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって単離される。
陰性選択によるＴ細胞集団などの免疫細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを対象とする抗体の組み合わせによって達成され得る。１つの方法は、陰性磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞の選別及び／又は選択であり、これは、陰性に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。
陽性又は陰性選択による免疫細胞の所望の集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態において、ビーズ及び細胞がともに混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及びビーズの最大限の接触を確保することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、２～１０℃又は室温のいずれかで様々な速度で、様々な長さの時間、回転子上でインキュベートされてもよい。
刺激用Ｔ細胞、又はＴ細胞などの免疫細胞が単離されるＰＢＭＣも、洗浄ステップ後に凍結することができる。理論に拘束されることを望まないが、凍結及びその後の解凍ステップは、細胞集団における顆粒球、及びある程度は単球を除去することによって、より均一な生成物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液中に懸濁させることができる。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で既知であり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、あるいは１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン及び７．５％のＤＭＳＯ、若しくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、及び７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、又は例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで、細胞は、毎分１°の速度で－８０℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存される。制御凍結の他の方法、及び－２０℃又は液体窒素中での制御されていない即座の凍結を使用してもよい。
本開示は、本明細書に記載の活性化因子及び／又は抑制性受容体を発現する免疫細胞を提供し、免疫細胞は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ複合体の発現及び／又は機能を低下させる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。例えば、免疫細胞は、治療レジメンの一部として細胞を受容する同じ対象から単離されるか、又は派生する。抑制性受容体によるＭＨＣクラスＩの発現及び／又は機能を低下させるように自己免疫細胞を修飾することは、ＭＨＣクラスＩ抗原に特異的であることが有利であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、ＭＨＣクラスＩの発現及び／又は機能が低下するように自己免疫細胞を修飾することは、シス又はトランスのいずれかにおいて、免疫細胞によって発現されるＭＨＣクラスＩによる抑制性受容体の結合を低減させる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、全て同種異系である。同種免疫細胞は、免疫細胞が投与される対象以外のドナーに由来し得る。同種異系細胞は、様々な遺伝子型の対象に使用するために調製及び貯蔵される可能性があるため、同種免疫細胞は、細胞療法において「既製の」又は「普遍的な」と一般的に称されている。
ＭＨＣクラスＩ複合体の発現及び／又は機能を低下させる任意の好適な方法は、本開示の範囲内であると想定され、とりわけ、ＭＨＣクラスＩ構成要素をコードする１つ以上のＲＮＡをノックダウンする干渉ＲＮＡの発現、又はＭＨＣクラスＩ構成要素をコードする遺伝子の修飾を含む。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、適応免疫系に必要なポリペプチドのセットをコードする脊椎動物ゲノム上の遺伝子座である。これらの中には、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ、並びにそれらの対立遺伝子を含む、ＭＨＣクラスＩポリペプチドがある。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子は、高度に多型であり、全ての有核細胞において発現される。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＣによってコードされるＭＨＣクラスＩポリペプチド及びそれらの対立遺伝子は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とヘテロ二量体を形成し、細胞の表面上の抗原と複合体で存在する。本明細書で言及されるように、ＭＨＣクラスＩ遺伝子又はポリペプチドは、ＭＨＣ又は当該ポリペプチドをコードする対応する遺伝子に見出される任意のポリペプチドを指してもよい。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ、並びにそれらの対立遺伝子を含む、抑制因子リガンドによって不活性化される。ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、例えば、限定されないが、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１、及び／又はＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質と同一若しくは類似のタンパク質をコードする任意の遺伝子であり得る。したがって、本明細書に記載の自己分泌シグナル伝達／結合を防止するために、免疫細胞内のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃによってコードされるポリペプチド、並びにそれらの対立遺伝子の発現を除去又は低下させることが望ましい。
ＭＨＣクラスＩポリペプチド発現が低下した免疫細胞
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、内因性ＭＨＣクラスＩポリペプチドの対立遺伝子をコードする内因性遺伝子の発現又は機能を不活性化するか、又は低下若しくは除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／又はＨＬＡ－Ｃである。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子座によってコードされる。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの各々は、多くのバリアント対立遺伝子を含み、これらの全ては、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａである。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子産物の発現を低下又は除去するように修飾される。ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ、すなわち、ＭＨＣ－Ｉ複合体と会合するタンパク質をコードする。ＭＨＣ－Ｉ複合体は、細胞表面上の抗原の提示に必要とされる。ＭＨＣ－Ｉ複合体は、Ｂ２Ｍが欠失されると破壊され、機能しない（Ｗａｎｇ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．４：１２３４－１２４５（２０１５））。更に、Ｂ２Ｍ遺伝子は、当該技術分野で既知の遺伝子編集技術を使用して、高効率で破壊することができる（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３：２２５５－２２６６（２０１７））。Ｂ２Ｍを低下又は除去することは、免疫細胞の表面上の機能的ＭＨＣ Ｉを低下又は除去することができる。
本開示は、免疫細胞における内因性標的遺伝子を編集するための遺伝子編集システムを提供する。本開示は、標的遺伝子の配列に特異的な干渉ＲＮＡを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ及び亜鉛フィンガーなどの遺伝子編集システムを使用して、二本鎖切断を生成することができ、これは、相同性指向修復又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの遺伝子修復機構を通じて、変異を導入するために使用され得る。破壊した末端の切除後のＮＨＥＪ、又は不適切な末端結合は、欠失を導入するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＭＨＣ－Ｉ複合体のサブユニットをコードする遺伝子を含む。
標的遺伝子配列には、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、イントロン／エクソンジャンクション、転写産物（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びスプライスバリアント）、並びに／又は３’及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれるが、これらに限定されない。任意の遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントの組み合わせは、本明細書に記載される免疫細胞における遺伝子編集の目的のために標的化され得る。標的遺伝子に対する修飾は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、標的遺伝子又は遺伝子産物の発現又は機能の変化又は破壊をもたらす標的遺伝子を編集することによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子を修飾することは、遺伝子の全て又は一部分を欠失させることを含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子を修飾することは、遺伝子に変異を導入することを含む。いくつかの実施形態において、変異は、欠失、挿入、置換、又はフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子を修飾することは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼを使用することを含む。
本明細書に記載される標的遺伝子についての遺伝子配列は、当該技術分野で既知である。配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ又はＮＣＢＩヌクレオチドデータベースなどの公開データベースに見出すことができる。配列は、遺伝子識別子を使用して見出すことができ、例えば、ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０５を有し、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０６を有し、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０７を有し、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６７及びＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１５．１０を有する。遺伝子配列は、キーワードを使用して公開データベースを検索することによっても見出すことができる。例えば、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、キーワード「ＨＬＡ－Ａ＊０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１」、又は「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１」を検索することによって、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース中に見出すことができる。これらの配列は、当該技術分野で既知の様々な遺伝子編集技術における標的化に使用することができる。表１８は、本明細書に記載の修飾のために標的化されたＨＬＡ－Ａ対立遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子配列の非限定的な例示的配列を提供する。
当業者は、ＴがＵに置換されて、ＲＮＡ配列をＤＮＡ配列に変換することができ、逆もまた同様であることを理解し、両方とも本開示の標的遺伝子配列として想定される。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、核酸誘導型エンドヌクレアーゼを使用して、本明細書に記載の免疫細胞内で編集される。例示的な核酸誘導型エンドヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのクラスＩＩエンドヌクレアーゼが含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集」とは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセット、又はそのようなリピートのセットを含むシステムを指す。「Ｃａｓ」は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、標的遺伝子をサイレンシングするか、ノックアウトするか、又は変異させるために使用することができる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓに由来する系を指す。この系は、プラスミド及びファージなどの外来遺伝子エレメントに耐性を付与し、後天性免疫の一形態を提供する原核生物免疫系の一種である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子編集に使用するために修飾されている。これは、真核生物細胞内に、１つ以上の特異的に設計されたガイド核酸（ｇＮＡ）、典型的にはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及びｇＮＡとリボヌクレオタンパク質複合体を形成する適切なＣａｓエンドヌクレアーゼを導入することによって達成される。ｇＮＡは、ｇＮＡ－エンドヌクレアーゼタンパク質複合体を標的ゲノム位置に誘導し、エンドヌクレアーゼは標的ゲノム位置に鎖切断を導入する。この二本鎖切断は、非相同末端結合（欠失につながる）又は相同修復（挿入を生成することができる）などの細胞機構によって修復することができ、それによって宿主細胞ゲノム内に遺伝子修飾を導入することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、クラス別及び種類別に分類される。クラス２系は、現在、３つの異なる種類（ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型）に分類される単一の干渉タンパク質を表す。遺伝子編集に好適な任意のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えば、ＩＩ型、Ｖ型又はＶＩ型系は、本開示の範囲内として想定される。例示的なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系には、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、及びＣａｓ４が含まれる。例示的なクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ系には、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ及びＣａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）が含まれる。例示的なクラス２のＶＩ型系には、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ及びＣａｓ１３ｄが含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と呼ばれることもある、ＣＲＩＳＰＲ配列は、交互にリピート及びスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常、プラスミド又はファージ配列などの細菌に対して外来の配列を含む。本明細書に記載されるように、スペーサー配列はまた、「標的化配列」と称されてもよい。遺伝子操作のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーは、標的遺伝子配列（ｇＮＡ）に由来する。
例示的なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、タンパク質Ｃａｓ９に依存し、これは、二重らせんの各鎖に対して１つである、２つの活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Ｃａｓ９及び修飾ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座ＲＮＡを組み合わせることは、遺伝子編集のための系において使用され得る。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３－８３６。いくつかの実施形態において、免疫細胞を修飾するために使用されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、塩基対を付加若しくは欠失することによって、又は早期停止を導入し、それによって標的の発現を低下させることによって、本明細書に記載の免疫細胞における編集のために標的化された遺伝子などの標的遺伝子を編集するために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、代替的に、可逆的に標的遺伝子をオフにするＲＮＡ干渉のように使用され得る。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的遺伝子プロモーターに誘導し、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断することができる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌又は古細菌Ｃａｓタンパク質に由来し得る。任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、本開示の範囲内として想定される。他の態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、それらのホモログ、又はそれらの修飾型のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、又はこれらの組み合わせ若しくは複合体である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
当該技術分野において既知である技術、例えば、米国公開第２０１４／００６８７９７号及びＣｏｎｇ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３に記載されているものを使用して、標的遺伝子を抑制する、人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を生成することができる。例えば、Ｔｓａｉ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：６ ５６９－５７６、米国特許第８，８７１，４４５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、及び同第８，６９７，３５９号に記載されているものの、標的遺伝子を抑制する、当該技術分野において既知の他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系もまた、生成され得る。特定のＣａｓタンパク質に好適なｇＮＡを設計する方法は、当業者に知られているであろう。
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼ）の活性を、標的核酸ゲノム内の特定の標的遺伝子配列に導くことができる遺伝子標的化ガイド核酸（ｇＮＡ）を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列にハイブリダイズする標的化配列、及びＣＲＩＳＰＲリピート配列を少なくとも含むことができる。いくつかのＩＩ型系において、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含み、本明細書において「足場」配列とも称される。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び足場配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは、二本鎖を形成する。両方の系において、二本鎖は、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。遺伝子標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの関連性により、複合体に標的特異性を提供することができる。したがって、遺伝子標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を導くことができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、標的化配列及びガイドＲＮＡ足場配列を含むガイドＲＮＡを提供し、標的化配列は、標的遺伝子の配列に相補的である。
例示的なガイドＲＮＡには、約１５～２０塩基の標的化配列が含まれる。当業者に理解されるように、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的な標的化配列を含むように設計することができる。例えば、標的化配列、例えば、存在されるＤＮＡ配列のＲＮＡバージョン
表１９（そのＰＡＭ部位を表す３つの３’ヌクレオチドを除く）を、単一のＲＮＡキメラ又はｃｒＲＮＡに入れることができる。
核酸を標的とする遺伝子は、二分子ガイドＲＮＡであってもよい。核酸を標的とする遺伝子は、単一分子ガイドＲＮＡであってもよい。遺伝子標的化核酸は、例えば、対合ｇＲＮＡを含む、当該技術分野で既知のガイドＲＮＡの任意の既知の構成、又は単一のステップで使用される複数のｇＲＮＡであり得る。コード配列及びスプライスジャンクションが存在するゲノム配列から明らかであるが、遺伝子発現に必要な他の特徴は特異的であり、不明確であり得る。
二分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２本鎖を含むことができる。第１の鎖は、５’から３’方向の配列、任意選択のスペーサー伸長配列、標的化配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含むことができる。
ＩＩ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、標的化配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含むことができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡへの追加の機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを含むことができる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成することができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ又は単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、標的化配列及び足場配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、足場配列は、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、足場配列は、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５７５）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、足場配列は、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５７５）を含むＤＮＡ配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃａｓ９系であるそれらの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドの標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満の標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０を超えるヌクレオチド標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０ヌクレオチドを有する可変長標的化配列を含むことができる。
好適な足場配列、及び足場標的配列の配置は、エンドヌクレアーゼの選択に依存し、当業者に知られているであろう。
ＩＩ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、例えば、Ｃａｓ９は、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び標的化配列を含むことができる。
例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、又は他のより小さなＲＮＡは、以下に例示され、当該技術分野で説明されているように、化学的手段によって容易に合成され得る。化学的合成手順が継続的に拡大している一方で、ポリヌクレオチド長が、１００ヌクレオチド程度を超えて著しく増加するにつれて、高速液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避するＨＰＬＣ）などの手順によるこのようなＲＮＡの精製は、より困難になる傾向がある。より長いＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、ともにライゲーションされる２つ以上の分子を産生することである。Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなどの、はるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。様々な種類のＲＮＡ修飾は、ＲＮＡの化学的合成及び／又は酵素的生成の間又は後に導入することができ、例えば、当該技術分野で説明されているように、安定性を向上させ、先天性免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、かつ／又は他の属性を向上させる修飾を導入することができる。
［４２３］ｇＲＮＡの標的化配列は、目的の標的核酸中の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸の標的化配列は、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的な様式で標的核酸と相互作用することができる。標的化配列のヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変化し得る。
本明細書に記載のＣａｓ９系において、標的化配列は、系で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの逆相補体の５’に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計することができる。標的化配列は、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、標的ＤＮＡにおいて認識される、特定の方向及び位置における特定のＰＡＭ配列を有してもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’を含むＰＡＭを認識し、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、標的化配列によって標的とされる標的核酸配列のすぐ３’である。適切なＰＡＭ配列の選択は、当業者には明白であろう。
標的配列は、ｇＲＮＡの標的化配列に相補的であり、それとハイブリダイズする。標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満を含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド超を含むことができる。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃａｓ９系であるそれらの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭ配列の逆相補体の第１のヌクレオチドのすぐ５’の２０ヌクレオチドを含むことができる。この標的核酸配列は、多くの場合、ＰＡＭ鎖又は標的鎖と称され、相補的核酸配列は、多くの場合、非ＰＡＭ鎖又は非標的鎖と称される。当業者は、標的化配列が、標的核酸の非ＰＡＭ鎖にハイブリダイズすることを認識するであろう。例えば、ＵＳ２０１９／０１８５８４９Ａ１を参照されたい。
いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの連続した最も５’側のヌクレオチドにわたって１００％である。標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。標的化配列及び標的核酸の長さは、１つのバルジ又は複数のバルジと考えられ得る、１～６ヌクレオチドによって異なり得る。
標的化配列は、当業者に既知のコンピュータプログラムを使用して設計又は選択することができる。コンピュータプログラムは、予測される融解温度、二次構造形成、予測されるアニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一であるか、又は類似しているが、ミスマッチ、挿入、又は欠失の結果として１つ以上のスポットで変化する配列の）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。利用可能なコンピュータプログラムは、入力として、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ、公式の遺伝子記号、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ、ゲノム座標、又はＤＮＡ配列を取得し、入力として指定された適切なゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを含む出力ファイルを作成することができる。コンピュータプログラムはまた、標的遺伝子についてのｓｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット結合を示す統計及びスコアの要約を提供することができる（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：１８４－１９１（２０１６））。本開示は、標的化配列を含むガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ足場配列を更に含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はそれらの対立遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子の配列に相補的である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、標的化配列は、表１８に開示される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有するか、又はそれと同一である配列を含む。
表１９．
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、内因性ＨＬＡ－Ａの配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とするｇＮＡは、表１９に開示される配列から選択される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とするｇＮＡは、表１９に開示される配列から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とするｇＮＡは、配列番号５７６～８６５０のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。例えば、ｇＲＮＡは、全てのＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子によって共有されるが、ＨＬＡ－Ａ＊０２及びＨＬＡ－Ａ＊０３対立遺伝子によって共有されない配列を特異的に標的とし、それとハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２のコードＤＮＡ配列を特異的に標的とする。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、１０００を超えるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子によって共有されるコードＤＮＡ配列を特異的に標的とする。
表１９に開示される配列は、ＰＡＭ配列を含む、対応するゲノム配列を含む。当業者は、ｇＲＮＡの標的化配列が、ｇＲＮＡについての対応するＰＡＭ部位を表す、表１９の配列の３つの３’末端ヌクレオチドを含まないことを理解するであろう。
本開示は、Ｂ２Ｍ遺伝子に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子プロモーター配列を標的とする配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、標的化配列及びｇＲＮＡ足場配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、表２０に示される配列、又はそれと約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的化配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子の配列に相補的である。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子は、表１８に示されるＢ２Ｍ配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を使用して編集される。
「ＴＡＬＥＮ」又は「ＴＡＬＥＮ遺伝子編集」とは、標的遺伝子を編集するために使用される人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって人工的に産生される。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌に由来する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を操作して、ＴＣＲサブユニット、ＭＨＣクラスＩ複合体成分、又はＣＤ５２などの標的遺伝子の一部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合させることができる。操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ切断ドメインと合わせることにより、標的遺伝子配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を産生することができる。次いで、これらを細胞内に導入することができ、それらをゲノム編集に使用することができる。
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質は、野生型又は変異Ｆｏｌｄエンドヌクレアーゼである、ヌクレアーゼ（Ｎ）に融合される。ＦｏｋＩに対するいくつかの変異は、そのＴＡＬＥＮでの使用のために作製されており、これらは、例えば、切断特異性又は活性を改善する。
ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向及び間隔を有する標的ゲノム内の部位に対して独自のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、ＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数の両方は、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであるように見える。
標的遺伝子内の配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュール成分を使用する様々なスキームを含む、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して構築することができる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＺＦＮ遺伝子編集を使用して、本明細書に記載の免疫細胞において編集される。
「ＺＦＮ」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ遺伝子編集」とは、標的遺伝子を編集するために使用され得る人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｌｄヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。
亜鉛フィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３ｂｐ配列を認識することができる。既知の特異性の様々な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５、又は１８ｂｐ配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを産生することができる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム、並びに哺乳動物細胞を含む、特定の配列を認識する亜鉛フィンガー（及びそれらの組み合わせ）を生成するために、様々な選択及びモジュラーアセンブリ技術が利用可能である。
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡを切断するために二量体化しなければならない。したがって、一対のＺＦＮは、非回文ＤＮＡ部位を標的とするために必要である。２つの個々のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適切に離間した状態で、ＤＮＡの反対側の鎖に結合しなければならない。
また、ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ内に二本鎖切断を作り出すことができ、これは、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を作り出すことができ、細胞における標的遺伝子又は遺伝子産物の発現及び量の減少をもたらす。ＺＦＮは、標的遺伝子内で変異するために相同組換えとともに使用することもできる。
標的遺伝子内の配列に特異的なＺＦＮは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して構築することができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＭＣＨ－Ｉ成分の発現及び機能は、ＲＮＡ干渉を使用して低減される。「ＲＮＡｉ」又は「ＲＮＡ干渉」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）、ｄｄＲＮＡ（ＤＮＡ指向性ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、又はｒａｓｉＲＮＡ（リピート関連ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡ、及びそれらの修飾形態は全て、ＲＮＡ干渉を媒介することができる。これらのｄｓＲＮＡ分子は、商業的に利用可能であり得るか、又は既知の配列情報に基づいて設計及び調製され得る。これらの分子のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドには、標的遺伝子の発現を抑制するＤＮＡ及びＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ｄｓＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、１つ以上の修飾ヌクレオチドも含むことができ、これらは、いずれか又は両方の鎖に組み込むことができる。
ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシング又はノックダウンにおいて、標的遺伝子の一部分に相補的である第１の（アンチセンス）鎖、及び第１のアンチセンス鎖に完全に又は部分的に相補的である第２の（センス）鎖を含むｄｓＲＮＡを生物に導入する。生物に導入した後、標的遺伝子特異的ｄｓＲＮＡは、比較的小さな断片（ｓｉＲＮＡ）に処理され、その後、生物全体に分布し、標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを減少させ、標的遺伝子の完全又は部分的な欠失から生じる表現型に非常に似ているようになり得る表現型をもたらすことができる。
細胞内のある特定のｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素である、Ｄｉｃｅｒ酵素の作用を受けることができる。Ｄｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡのより短い部分、すなわち、ｓｉＲＮＡに処理することができる。ＲＮＡｉはまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体も含む。Ｄｉｃｅｒによる切断後、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ標的のＲＩＳＣ複合体及び直接切断に入る。ｓｉＲＮＡの他方の鎖は、パッセンジャー鎖である。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で行われる。したがって、ｓｉＲＮＡは、配列特異的な様式でＲＮＡ干渉を媒介することによって、遺伝子発現を下方制御又はノックダウンすることができる。
ＲＮＡ干渉に関して本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」又は「標的配列」とは、対応するＲＮＡが、本明細書に記載されるように、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを使用してＲＮＡｉ経路を介して分解するために標的化される遺伝子又は遺伝子配列を指す。例示的な標的遺伝子配列を表１８に示す。例えば、ｓｉＲＮＡを使用して遺伝子を標的化するために、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子又は配列の少なくとも一部分に相補的、又は実質的に相補的なアンチセンス領域、及びアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む。一旦細胞内に導入されると、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体に、標的配列を含むＲＮＡを切断するように指示し、それによってＲＮＡを分解する。本開示は、干渉ＲＮＡを提供する。本開示の二本鎖ＲＮＡ分子は、当該技術分野で既知の任意の種類のＲＮＡ干渉分子の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内で処理されてｓｉＲＮＡを産生するＤｉｃｅｒ基質である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ前駆体分子の一部である。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質として好適な長さであり、ＲＩＳＣ活性ｓｉＲＮＡ分子を産生するように処理され得る。例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２００５／０２４４８５８を参照されたい。
Ｄｉｃｅｒ基質二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、活性ｓｉＲＮＡを産生するためにＤｉｃｅｒによって処理されるのに十分な長さのものであり得、以下の特性のうちの１つ以上を更に含み得る：（ｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｓｈＲＮＡは、例えば、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する非対称であってもよく、（ｉｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｓｈＲＮＡは、活性ｓｉＲＮＡへのＤｉｃｅｒ結合及びｄｓＲＮＡのプロセシングの配向、例えば、１つ以上のＤＮＡヌクレオチドの組み込みを指示するために、センス鎖上に修飾された３’末端を有してもよく、（ｉｉｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡの第１及び第２の鎖は、２１～３０ｂｐの長さであってもよい。。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡに相補的な配列を５’から３’末端に有する第１の配列と、第１の配列に相補的な配列を５’から３’末端に有する第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列は、ｓｈＲＮＡを形成する。
いくつかの実施形態において、第１の配列は、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表２１及び表２２に示される配列から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２５％以上及び６０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表２１及び表２２に示される配列から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、同じ塩基の４つのヌクレオチド、又は７つのＣ若しくはＧヌクレオチド塩基のランを含まない。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２１ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号８７７１～１３３８２から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２５％以上及び６０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号８７７１～１３３８２から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、同じ塩基の４つのヌクレオチド、又は７つのＣ若しくはＧヌクレオチド塩基のランを含まない。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号８７７１～１３３８２から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号８７７１～９３５２から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号８７７１～９０５２から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号８７７１～８９０８から選択される配列に相補的である。第１の配列に相補的な例示的な標的Ｂ２Ｍ配列は、配列番号８７７１～８９０８に示される。
第１の配列に相補的な例示的な標的Ｂ２Ｍ配列を表２１に示す。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍを標的とする第１の配列は、配列番号８７７１～１３３８２のうちのいずれか１つに記載される配列を含む。
ある場合には、第１の配列は、標的核酸配列と１００％の同一性、すなわち、完全な同一性、相同性、相補性を有し得る。他の場合には、第１の配列と標的核酸配列との間に１つ以上のミスマッチが存在し得る。例えば、センス領域と標的核酸配列との間に１、２、３、４、５、６、又は７個のミスマッチがあり得る。
表２１に示す配列をＤＮＡ配列として提示する。表２１に示す全ての配列において、チミン（Ｔ）は、標的ｍＲＮＡ配列の配列に到達するためにウラシル（Ｕ）によって置き換えられ得る。
Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡをコードする例示的な配列は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１３３８３）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡをコードする更なる例示的な配列は、ＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号１３３８４）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡに相補的な配列を５’から３’末端に有する第１の配列と、第１の配列に相補的な配列を５’から３’末端に有する第２の配列と、を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の配列は、ポリヌクレオチド上に存在し、第１の配列及び第２の配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドによって分離され、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ内のループ領域を形成する。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、５’隣接配列及び３’隣接配列を更に含み、５’隣接配列は、第１の配列の５’末端に連結され、３’隣接配列は、第２の配列の３’末端に連結される。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、５’末端～３’末端に、５’隣接配列、第１の配列、ループ配列、第２の配列、３’隣接配列を有する。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、５’末端～３’末端に、５’隣接配列、第２の配列、ループ配列、第１の配列、及び３’隣接配列を有する。
いくつかの実施形態において、第１の配列は、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１３３８５～２１７７９から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２５％以上及び６０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１３３８５～１６９７５から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、同じ塩基の４つのヌクレオチド、又は７つのＣ若しくはＧヌクレオチド塩基のランを含まない。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１３３８５～１６４９３から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１３３８５～１３６６３から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１３３８５～１３４７０から選択される配列に相補的である。
第１の配列に相補的な例示的な標的ＨＬＡ配列を表２２に示す。
いくつかの実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、ループと称されることもある、リンカーによって分離される。いくつかの実施形態において、第１の配列及び第２の配列の両方は、１つの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ループは、第１の配列と第２の配列との間にある。これらの実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、ハイブリダイズして二本鎖領域を形成する。第１の配列及び第２の配列は、リンカー配列によって連結され、「ヘアピン」又は「ステムループ」構造を形成する。ｓｈＲＮＡは、一本鎖分子の対向する末端に相補的な第１の配列及び第２の配列を有することができ、その結果、分子は、相補的な配列部分と二本鎖領域を形成することができ、鎖は、リンカー（すなわちループ配列）によって二本鎖領域の一端で連結される。リンカー、又はループ配列は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかであり得る。リンカーは、共有結合又は非共有結合相互作用を介して、第１の配列、及び任意選択で、第２の配列と相互作用することができる。
任意の好適なヌクレオチドループ配列は、本開示の範囲内として想定される。本開示のｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡの第１の配列を、ｓｈＲＮＡの第２の配列に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含んでもよい。ヌクレオチドループ配列は、長さが、２ヌクレオチド以上、例えば、長さが、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドであり得る。例示的なループ配列は、表２３に開示されている。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、５’隣接配列及び３’隣接配列を更に含む。いくつかの実施形態において、５’隣接配列は、第１の配列の５’末端に連結され、３’隣接配列は、第２の配列の３’末端に連結される。
理論に拘束されることを望まないが、マイクロＲＮＡで見出されるものと同様の５’及び３’配列を有するｓｈＲＮＡステムループ配列を隣接させることで、内因性マイクロＲＮＡプロセシング機構によるプロセシングのためにｓｈＲＮＡを標的とすることができ、ｓｈＲＮＡプロセシングの有効性を高めることができると考えられる。代替的に、又は加えて、隣接配列は、ポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩプロモーターとのｓｈＲＮＡ適合性を増加させ、ｓｈＲＮＡ発現のより効果的な調節をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、５’隣接配列は、表２３に示される配列から選択される。例示的な隣接配列を表２３に示す。
いくつかの実施形態において、第１及び第２の配列は、一本鎖ポリヌクレオチド上に存在し、第１の配列及び第２の配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドによって分離され、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ内のループ領域を形成する。いくつかの実施形態において、ループ領域は、表２４に記載の配列から選択される配列を含む。
本開示のｓｈＲＮＡは、化学合成によって、インビトロ転写によって、又はＤｉｃｅｒ若しくは同様の活性を有する別の適切なヌクレアーゼによる、より長い二本鎖ＲＮＡの切断によって外因的に生成され得る。従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトから産生される化学合成されたｓｉＲＮＡは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、又はＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）などの商業的供給源から得ることができる。ｓｉＲＮＡは、例えば、溶媒若しくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによって精製することができる。代替的に、ｓｉＲＮＡは、試料処理による損失を回避するために、ほとんど精製せずに使用してもよい。いくつかの実施形態において、本開示のｓｈＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡをコードする核酸が、例えば、好適なプロモーターの制御下でクローニングされている発現ベクターを使用して産生され得る。
医薬組成物
本開示は、本開示の操作された受容体を発現する免疫細胞、並びに薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、がんの治療において医薬として使用するためのものである。いくつかの実施形態において、がんは、乳がん、膀胱がん、卵巣がん、胃がん、唾液管がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、又は結腸がんである。いくつかの実施形態において、がんは、乳がんである。いくつかの実施形態において、がんは、胃がんである。
このような組成物は、中性緩衝食塩水、ホスフェート緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、及び防腐剤を含み得る。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞の少なくとも９０％は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。
本開示は、本開示の複数の免疫細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
非経口投与に好適な医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、滅菌水又は滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた免疫細胞からなる。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に好適な形態で調製、包装、又は販売されてもよい。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプル又は防腐剤を含有する複数回用量容器中で調製、包装、又は販売されてもよい。非経口投与用の製剤には、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルション、ペーストなどが含まれるが、これらに限定されない。このような製剤は、限定されないが、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤を含む、１つ以上の追加の成分を更に含んでもよい。非経口製剤には、塩、炭水化物、及び緩衝剤などの賦形剤を含有し得る水溶液も含まれる。例示的な非経口投与形態には、滅菌水溶液、例えば、プロピレングリコール水溶液又はデキストロース溶液中の溶液又は懸濁液が含まれる。このような剤形は、所望の場合、好適には、緩衝され得る。非経口投与のための製剤は、即時及び／又は放出調節であるように製剤化され得る。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出及びプログラム放出が含まれる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞を含む製剤化された組成物は、注射による投与に好適である。いくつかの実施形態において、免疫細胞を含む製剤化された組成物は、注入による投与に好適である。
本開示の医薬組成物は、単位剤形で好都合に提示することができ、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術には、免疫細胞を、薬学的担体又は賦形剤、例えば、液体担体と会合させるステップが含まれる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を更に含有し得る。懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。
本開示の組成物は、追加的に、医薬組成物に従来見出される他の補助成分を含有してもよい。したがって、例えば、組成物は、例えば、かゆみ止め剤、収れん剤、局所麻酔剤若しくは抗炎症剤などの追加の、適合性の薬学的に活性な材料を含有してもよいか、又は染料、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、及び安定剤などの、本開示の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な追加の材料を含有してもよい。しかしながら、このような材料は、添加されるとき、本開示の組成物の免疫細胞の生物学的活性を不当に妨げるべきではない。
製剤又は組成物はまた、免疫細胞で治療されている特定の適応症、疾患、又は状態に有用な１つを超える活性成分を含有してもよく、それぞれの活性は互いに悪影響を及ぼさない。このような活性成分は、好適には、意図する目的に効果的である量で組み合わせて存在する。したがって、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、化学療法剤などの他の薬学的に活性な薬剤又は薬物を更に含む。
いくつかの態様における医薬組成物は、組成物の送達が、治療される部位の感作の前に、かつ治療される部位の感作を引き起こすのに十分な時間で生じるように、時間放出、遅延放出、及び持続放出送達系を用いることができる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、既知である。このような系は、組成物の反復投与を回避することができ、それによって、対象及び医師への利便性を増大させる。
投与は、治療過程を通じて連続的に又は断続的に、１回の用量で行うことができる。単回又は複数回の投与を、治療する医師によって選択される用量レベル及びパターンを用いて実施することができる。
いくつかの実施形態における医薬組成物は、がんを治療又は予防するのに有効な量、例えば、治療有効量又は予防有効量で免疫細胞を含有する。いくつかの実施形態において、治療的又は予防的有効性は、治療された対象の定期的評価によって監視される。数日、数週間又は数ヶ月にわたる反復投与については、状態に応じて、がんの徴候又は症状の所望の抑止が生じるまで治療を繰り返すことができる。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得、決定することができる。所望の用量は、組成物の単回ボーラス投与若しくは注入によって、又は組成物の複数回ボーラス投与若しくは注入によって送達することができる。
使用方法
本明細書では、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を、本開示の操作された受容体を含む免疫細胞と接触させることを含む、ＨＥＲ２陽性がんにおける非標的抗原をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法が提供される。細胞は、例えば、組織中（例えば、インビボ）であってもよく、又は混合培養物中であってもよい。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子又は副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、及びＨＬＡ－Ｃ＊０７からなる群から選択される。
治療を必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量の本開示の操作された受容体を含む免疫細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、方法が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＨＥＲ２＋がんにおいて非標的抗原をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するか、又は喪失を有する疑いがあると特定された対象において、ＨＥＲ２＋がんを治療することを含み、本明細書に記載の免疫細胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種異系である。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子又は副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、及びＨＬＡ－Ｃ＊０７からなる群から選択される。
本開示は、免疫細胞療法を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、免疫細胞を、本明細書に記載のポリヌクレオチド系で形質転換することを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド系は、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体、及びがん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、対象を治療する方法は、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）がんに罹患しているか、又はＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）がんのリスクがある対象からの免疫細胞を提供することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、免疫細胞を本明細書に記載のポリヌクレオチド系で形質導入することを含む。
自己由来の細胞を使用する養子細胞療法の現在の方法は、患者の血液から免疫細胞を単離することと、単離された細胞に一連の修飾を行うことと、その細胞を患者に投与することと、を含む（Ｐａｐａｔｈａｎａｓｉｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２７：７９９－８０９（２０２０））。がん若しくは血液悪性腫瘍に罹患しているか、又はがん若しくは血液悪性腫瘍のリスクがある対象からの免疫細胞を提供することは、患者の血液からの免疫細胞の単離を必要とし、当該技術分野で既知の方法、例えば、白血球除去によって達成することができる。白血球除去中、対象からの血液が抽出され、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が分離され、血液の残りが対象の循環に戻される。ＰＢＭＣは、免疫細胞の試料として凍結、又は凍結保存のいずれかで貯蔵され、例えば、本明細書に記載の修飾などの更なる処理ステップのために提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の対象を治療する方法は、濃縮、活性化、遺伝子修飾、拡大、製剤化、及び凍結保存を含む、一連の修飾を含む、対象からの免疫細胞に対する修飾を含む。
本開示は、例えば、下流の手順、例えば、本明細書に記載の修飾のための対象ＰＢＭＣの調製のための当該技術分野で既知の洗浄及び分画方法であり得る濃縮ステップを提供する。例えば、限定されないが、方法は、総赤血球及び血小板汚染物質を除去するためのデバイス、単球の枯渇及びリンパ球の単離のためのサイズベースの細胞分画のためのシステム、並びに／又は例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、若しくはＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定のサブセットの濃縮を可能にするシステムを含み得る。濃縮ステップに続いて、更なる処理のために、対象のＰＭＢＣから免疫細胞の標的サブ集団を単離する。当業者は、本明細書で提供される濃縮ステップが、任意の新たに発見される方法、デバイス、試薬、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、免疫細胞、例えば、それらのエクスビボ拡大に必要なＴ細胞の活性化を誘導するための当該技術分野で既知の任意の方法であり得る活性化ステップを提供する。免疫細胞活性化は、例えば、対象の免疫細胞を、樹状細胞の存在下で培養すること、対象の免疫細胞を、人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）の存在下で培養すること、又は照射されたＫ５６２由来のＡＡＰＣの存在下で免疫細胞を培養することによって達成することができる。対象免疫細胞を活性化するための他の方法は、例えば、単離された活性化要素及び組成物、例えば、ビーズ、表面、又は活性化要素で官能化された粒子の存在下で免疫細胞を培養することであり得る。活性化要素には、例えば、抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体が含まれ得る。活性化要素はまた、例えば、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２又はＩＬ－２１であってもよい。活性化要素はまた、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＣＤ１３４Ｌなどの共刺激分子であってもよい。当業者は、本明細書に提供される活性化要素が、免疫細胞を活性化することができる任意の新たに発見される活性化要素、試薬、組成物、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、対象の免疫細胞を修飾するための遺伝子修飾ステップを提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、免疫細胞を操作された受容体で形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、免疫細胞を、活性化因子受容体をコードする配列を含む第１のベクター及び抑制性受容体をコードする配列を含む第２のベクターで形質導入することを含み、それによって、活性化因子受容体及び抑制性受容体を発現する免疫細胞を産生する。
本開示は、遺伝子修飾された対象免疫細胞のための拡大ステップを提供する。遺伝子修飾された対象免疫細胞は、投与のための免疫細胞の治療用量を生成するために、当該技術分野で既知の任意の免疫細胞拡大システムで拡大することができる。例えば、コントローラポンプを含むシステムに使用するためのバイオリアクターバッグ、並びに自動供給及び廃棄物除去を可能にするプローブを、免疫細胞拡大に使用することができる。基部にガス透過性膜を有する細胞培養フラスコが、免疫細胞の拡大のために使用され得る。臨床用途のための免疫細胞の拡大を可能にする当該技術分野で既知の任意のそのようなシステムは、本明細書に提供される拡大ステップに包含される。免疫細胞は、拡大のために特異的に製剤化された培地中の培養系において拡大される。拡大はまた、本明細書に記載の活性化要素の存在下で本開示の免疫細胞を培養することによって促進され得る。当業者は、本明細書で提供される拡大ステップが、免疫細胞を拡大するために使用することができる任意の新たに発見される培養系、培地、又は活性化要素も包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、拡大した遺伝子修飾された対象免疫細胞のための製剤化及び凍結保存ステップを提供する。提供される製剤化ステップは、例えば、本明細書に記載の治療方法の免疫細胞の調製及び拡大に使用される過剰な成分を洗い流すことを含む。当該技術分野で既知の免疫細胞と適合する任意の薬学的に許容される製剤培地又は洗浄緩衝液を使用して、免疫細胞を洗浄し、希釈／濃縮し、投与用の用量を調製することができる。製剤培地は、例えば、静脈内注入のための晶質液などの免疫細胞の投与のために許容され得る。任意選択で、凍結保存を使用して、免疫細胞を長期間貯蔵することができる。凍結保存は、例えば、細胞を、凍結保存成分を含有する凍結保存培地中に貯蔵することを含む、当該技術分野で既知の方法を使用して達成することができる。凍結保存成分は、例えば、ジメチルスルホキシド又はグリセロールを含むことができる。凍結保存培地中に貯蔵された免疫細胞は、貯蔵温度を－８０℃～－１８０℃まで低下させることにより凍結保存することができる。
いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載の免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載の免疫細胞を投与する前に、調整レジメンを投与することを含む。いくつかの実施形態において、調整レジメンは、リンパ枯渇である。リンパ枯渇レジメンは、例えば、アレムツズマブ、シクロホスファミド、ベンドゥアムスチン、リツキシマブ、ペントスタチン、及び／又はフルダラビンの投与を含み得る。リンパ枯渇レジメンは、循環免疫細胞の減少の所望の転帰まで、１つ以上のサイクルで投与することができる。
いくつかの実施形態において、調整レジメンは、対象におけるＣＤ５２＋細胞を特異的に標的とし、低減又は除去する薬剤を投与することを含み、免疫細胞は、ＣＤ５２発現を低減又は除去するように修飾される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、対象のＨＬＡ生殖細胞型を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ生殖細胞型を決定することは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ヘテロ接合性の存在を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ生殖細胞型は、骨髄において決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、活性化因子リガンド、例えば、ＨＥＲ２抗原の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドの発現レベルは、対象に由来する腫瘍組織試料中で決定される。いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドの発現レベルは、次世代配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドの発現レベルは、ＲＮＡ配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、活性化因子リガンドのレベルは、免疫組織化学を使用して決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量の免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ヘテロ接合性であり、活性化因子の発現及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の喪失を有する腫瘍組織を有することが決定される。
いくつかの実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の免疫細胞が投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、腹腔内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞、約１×１０６個の細胞、約２×１０６個の細胞、約３×１０６個の細胞、４×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞、約６×１０６個の細胞、約７×１０６個の細胞、約８×１０６個の細胞、約９×１０６個の細胞、約１×１０７個、約２×１０７個、約３×１０７個、約４×１０７個、約５×１０７個、約６×１０７個、約７×１０７個、約８×１０７個、約９×１０７個、１×１０８個の細胞、約２×１０８個の細胞、約３×１０８個の細胞、約４×１０８個の細胞、約５×１０８個の細胞、又は約６×１０８個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約３×１０６個の細胞～約４×１０８個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０８個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０８個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０８個の細胞、約７×１０６個の細胞～約９×１０７個の細胞、約８×１０６個の細胞～約８×１０７個の細胞、約９×１０６個の細胞～約７×１０７個の細胞、約１×１０７個の細胞～約６×１０７個の細胞、又は約２×１０７個の細胞～約５×１０７個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞を含む。治療用量で言及される場合、「約」という用語は、例えば、±０．５×１０６個の細胞、±０．５×１０７個の細胞、又は±０．５×１０８個の細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、それを必要とする対象は、がんを有する。いくつかの実施形態において、がんは、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）がんである。がんは、異常な細胞が制御できずに***し、近くの組織に広がる疾患である。いくつかの実施形態において、がんは、液体腫瘍又は固形腫瘍を含む。例示的な液体腫瘍には、白血病及びリンパ腫が含まれる。固形腫瘍の例としては、肉腫及びがん腫が挙げられる。がんは、血液、骨髄、肺、***、結腸、骨、中枢神経系、膵臓、前立腺及び卵巣を含む、体内の事実上の臓器で発生する可能性がある。固形腫瘍である更なるがんとしては、例えば、前立腺がん、精巣がん、乳がん、脳がん、膵臓がん、結腸がん、甲状腺がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、カポジ肉腫、皮膚がん、扁平細胞皮膚がん、腎臓がん、頭頸部がん、咽頭がん、鼻、口、喉の湿った粘膜内層上に形成される扁平上皮がん、膀胱がん、骨肉腫、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、肝臓がん、及び腎臓がんが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって治療される状態は、黒色腫細胞、前立腺がん細胞、精巣がん細胞、乳がん細胞、脳がん細胞、膵臓がん細胞、結腸がん細胞、甲状腺がん細胞、胃がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞、カポジ肉腫細胞、皮膚がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、咽頭がん細胞、扁平上皮がん細胞、膀胱がん細胞、骨肉腫細胞、子宮頸がん細胞、子宮内膜がん細胞、食道がん細胞、肝臓がん細胞、又は腎臓がん細胞の転移である。
複数のがん細胞が、第１の活性化因子リガンドを発現し、第２の抑制因子リガンドを発現しない、任意のがんは、本開示の範囲内であると想定される。例えば、本明細書に記載の方法を使用して治療することができるＨＥＲ２陽性がんとしては、乳がん細胞、膀胱がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、唾液管がん細胞、非小細胞肺がん細胞、膵臓がん細胞、又は結腸がん細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１、又はＣＸＣＬ１６の多型対立遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、非標的抗原を発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２の対立遺伝子バリアントを発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を発現しない。いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を発現しない。例えば、がん細胞は、その遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を通じて、ＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１若しくはＣＸＣＬ１６、又はＨＬＡ－Ａ＊０２の対立遺伝子を喪失している。
がんの治療は、腫瘍のサイズの縮小をもたらし得る。腫瘍のサイズの縮小は、「腫瘍退縮」と称されることもある。好ましくは、治療後、腫瘍サイズは、治療前のサイズと比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍サイズは、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍のサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍のサイズは、腫瘍の直径として測定され得る。
がんの治療は、腫瘍体積の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍体積は、治療前のサイズと比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍体積は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍体積は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。
がんの治療は、腫瘍の数の減少をもたらす。好ましくは、治療後、腫瘍数は、治療前の数と比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍数は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍の数は、肉眼で見える腫瘍を数えることによって、又は指定された倍率で測定され得る。好ましくは、指定された倍率は、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は５０倍である。
がんの治療は、原発腫瘍部位から離れた他の組織又は臓器における転移性病変の数の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、転移性病変の数は、治療前の数と比較して５％以上減少し、より好ましくは、転移性病変の数は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。転移性病変の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。転移性病変の数は、肉眼で見える転移性病変を数えることによって、又は指定された倍率で測定され得る。好ましくは、指定された倍率は、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は５０倍である。
がんの治療は、担体のみを受容する集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、治療されていない対象の集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、本発明の化合物ではない薬物、又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ若しくは誘導体による単剤療法を受ける集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、担体のみを受容する集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。がんの治療は、未治療の集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。がんの治療は、本発明の化合物ではない薬物、又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ若しくは誘導体による単剤療法を受ける集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。好ましくは、死亡率は、２％超、より好ましくは５％超、より好ましくは１０％超、及び最も好ましくは２５％超低下する。治療対象の集団の死亡率の低下は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の死亡率の低下は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の単位時間当たりの疾患関連死の平均数を計算することによって測定され得る。集団の死亡率の低下は、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の単位時間当たりの疾患関連死の平均数を計算することによっても測定され得る。
がんの治療は、腫瘍増殖速度の低下をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍増殖速度は、治療前の数値と比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは、腫瘍増殖速度は、少なくとも１０％減少し、より好ましくは、少なくとも２０％減少し、より好ましくは、少なくとも３０％減少し、より好ましくは、少なくとも４０％減少し、より好ましくは、少なくとも５０％減少し、更により好ましくは、少なくとも５０％減少し、及び最も好ましくは、少なくとも７５％減少する。腫瘍増殖速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍増殖速度は、単位時間当たりの腫瘍直径の変化に応じて測定され得る。
がんの治療は、腫瘍再増殖の低下をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍再増殖は、５％未満であり、より好ましくは、腫瘍再増殖は、１０％未満であり、より好ましくは、２０％未満であり、より好ましくは、３０％未満であり、より好ましくは、４０％未満であり、より好ましくは、５０％未満であり、更により好ましくは、５０％未満であり、及び最も好ましくは、７５％未満である。腫瘍再増殖は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍再増殖は、例えば、治療後の以前の腫瘍縮小後の腫瘍の直径の増加を測定することによって測定される。腫瘍再増殖の減少は、治療が停止した後に腫瘍が再発しないことによって示される。
細胞増殖異常症の治療又は予防は、細胞増殖速度の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、細胞増殖速度は、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。細胞増殖の速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖速度は、例えば、単位時間当たりの組織試料中の***細胞の数を測定することによって測定される。
細胞増殖異常症の治療又は予防は、増殖細胞の割合の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、増殖細胞の割合は、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。増殖細胞の割合は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。好ましくは、増殖細胞の割合は、例えば、組織試料中の非***細胞の数に対する***細胞の数を定量化することによって測定される。増殖細胞の割合は、***指数と同等であり得る。
細胞増殖異常症の治療又は予防は、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズの減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、治療前のサイズと比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは少なくとも１０％減少し、より好ましくは少なくとも２０％減少し、より好ましくは少なくとも３０％減少し、より好ましくは少なくとも４０％減少し、より好ましくは少なくとも５０％減少し、更により好ましくは少なくとも５０％減少し、最も好ましくは少なくとも７５％減少する。細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、細胞増殖の領域又はゾーンの直径又は幅として測定され得る。
細胞増殖異常症の治療又は予防は、異常な外観又は形態を有する細胞の数又は割合の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、異常な形態を有する細胞の数は、治療前のサイズと比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは少なくとも１０％減少し、より好ましくは少なくとも２０％減少し、より好ましくは少なくとも３０％減少し、より好ましくは少なくとも４０％減少し、より好ましくは少なくとも５０％減少し、更により好ましくは少なくとも５０％減少し、最も好ましくは少なくとも７５％減少する。異常な細胞の外観又は形態は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。異常な細胞の形態は、例えば、倒立組織培養顕微鏡を使用して、顕微鏡法によって測定され得る。異常な細胞の形態は、核多型の形態をとり得る。
本開示は、対象においてがんを治療する方法であって、（ａ）ＣＯＬＥＣ１２の多型遺伝子座、ＡＰＣＤＤ１の多型遺伝子座、及びＣＸＣＬ１６の多型遺伝子座、又はＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子座からなる群から選択される多型遺伝子座において、対象の正常細胞及び複数のがん細胞の遺伝子型を決定することと、（ｂ）複数のがん細胞におけるＨＥＲ２の発現を決定することと、（ｃ）正常細胞が多型遺伝子座に対してヘテロ接合性であり、複数のがん細胞が多型遺伝子座に対して半接合性であるか、又はＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失し、複数のがん細胞がＨＥＲ２陽性である場合に、複数の免疫細胞を対象に投与することと、を含み、複数の免疫細胞が、（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体においてＨＥＲ２、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、並びに（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）、又はＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体においてＣＯＬＥＣ１２、ＡＰＣＤＤ１、及びＣＸＣＬ１６から選択される非標的抗原、又はその抗原ペプチドに特異的な細胞外リガンド結合を含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体（すなわち、抑制性受容体）を含み、非標的抗原が、多型を含む、方法を提供する。
ＳＮＰの存在又は不在のために、対象に由来するがん細胞及び正常細胞の遺伝子型を決定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。ＳＮＰ遺伝子型決定方法には、とりわけ、デュアルプローブＴａｑＭａｎアッセイなどのＰＣＲベースの方法、アレイベースのハイブリダイゼーション方法、及び配列決定が含まれる。
対象に由来するがん又は正常細胞における標的抗原の発現を測定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。これらには、とりわけ、ＲＮＡ配列決定及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）などのＲＮＡ発現を測定する方法、並びに免疫組織化学に基づく方法などのタンパク質発現を測定する方法が含まれる。複数のがん細胞におけるヘテロ接合性の喪失を測定する方法には、とりわけ、当該技術分野で既知の方法を使用してがん細胞から抽出されるゲノムＤＮＡのハイスループット配列決定が含まれる。
対象に由来するがん又は正常細胞における標的抗原の発現を測定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。これらには、とりわけ、ＲＮＡ配列決定及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）などのＲＮＡ発現を測定する方法、並びに免疫組織化学に基づく方法などのタンパク質発現を測定する方法が含まれる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種異系又は自己由来である。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、第１の受容体を発現するが、第２の受容体を発現しない免疫細胞と比較して、ＨＥＲ２陽性がん細胞に対する免疫細胞の特異性を増加させる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、第１の受容体を発現するが、第２の受容体を発現しない免疫細胞と比較して、減少した副作用を有する。
投与量及び投与
本開示の免疫細胞及びは、局所治療又は全身治療が所望されるかどうかに応じて、いくつかの方式で投与され得る。
一般に、投与は非経口であってもよい。
養子細胞療法のための細胞の投与方法は既知であり、提供される方法及び組成物に関連して使用することができる。例えば、養子Ｔ細胞療法の方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号、及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号に記載されている。
本開示の組成物は、非経口投与に好適である。本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的破壊を特徴とする任意の投与経路、及び組織内の破壊を通じた医薬組成物の投与を含み、したがって、一般に、血流内、筋肉内、又は内臓内への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与には、組成物の注射による医薬組成物の投与、外科的切開による組成物の適用、組織透過性非外科的創傷による組成物の適用などが含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、滑液内注射又は注入、及び腎臓透析的注入技術が含まれることが企図されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の組成物の非経口投与は、静脈内又は動脈内投与を含む。
細胞又は細胞集団は、１回以上の用量で投与することができる。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、単回用量として投与され得る。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、ある期間にわたって１回を超える用量として投与され得る。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。
細胞又は細胞集団は、血液バンク若しくはドナー、又は患者自身などの任意の供給源から得られてもよい。
有効量とは、治療的又は予防的利益をもたらす量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康及び体重、同時治療の種類（もしあれば）、治療の頻度及び所望の効果の性質に依存するであろう。いくつかの実施形態において、有効量の細胞又はそれらの細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、投与は、静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍内への注射によって直接行うことができる。
本開示の目的のために、例えば、所与の用量のこのような免疫細胞を哺乳動物に投与する際に、各々が異なる用量の免疫細胞を与えられる一組の哺乳動物の間で、標的細胞が溶解されるか、又は１つ以上のサイトカインが受容体を発現する免疫細胞によって分泌される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳動物に投与される開始用量を決定することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、抗体又は操作された細胞又は受容体又は薬剤、例えば、細胞傷害性剤若しくは治療剤などの別の治療介入と同時に、又は任意の順序で連続的になどで、併用療法の一部として投与される。本開示の免疫細胞は、いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤とともに、又は別の治療介入に関連して、同時に若しくは任意の順序で連続的に、のいずれかで同時投与される。いくつかの文脈では、免疫細胞集団が１つ以上の追加の治療剤の効果を増強するように、又はその逆であるように、免疫細胞が、十分に時間的に近い別の治療法とともに同時投与される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、１つ以上の追加の治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、１つ以上の追加の治療剤の後に投与される。
実施形態において、リンパ枯渇化学療法は、養子免疫細胞の投与（例えば、注入）の前に、同時に、又はその後に、対象に投与される。一例において、リンパ枯渇化学療法は、免疫細胞の投与前に対象に投与される。例えば、リンパ枯渇化学療法は、養子細胞注入の１～４日前（例えば、１、２、３、又は４日）に終了する。実施形態において、複数回用量の養子細胞は、例えば、本明細書に記載されるように投与される。実施形態において、リンパ枯渇化学療法は、本明細書に記載の免疫細胞の投与（例えば、注入）の前に、同時に、又は後に、対象に投与される。リンパ枯渇の例としては、非骨髄性リンパ枯渇化学療法、骨髄性リンパ枯渇化学療法、全身照射などが挙げられるが、これらに限定され得ない。リンパ枯渇剤の例としては、抗胸腺細胞グロブリン、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２抗体、ＴＣＲαβ遮断因子、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、ボルテゾミブ、リツキシマブ、抗ＣＤ１５４抗体、ラパマイシン、ＣＤ３免疫毒素、フルダラビン、シクロホスファミド、ブスルファン、メルファラン、マブセラ、タクロリムス、アレファセプト、アレムツズマブ、ＯＫＴ３、ＯＫＴ４、ＯＫＴ８、ＯＫＴ１１、フィンゴリモド、抗ＣＤ４０抗体、抗ＢＲ３抗体、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ、抗ＣＤ２５抗体、カルシニューリン抑制剤、ミコフェノール酸、及びステロイドが挙げられるが、これらに限定されず、これらは単独で、又は組み合わせて使用され得る。更なる例として、リンパ枯渇レジメンは、アレムツズマブ、シクロホスファミド、ベンドゥアムスチン（ｂｅｎｄｕａｍｕｓｔｉｎ）、リツキシマブ、ペントスタチン、及び／又はフルダラビンの投与を含むことができる。リンパ枯渇レジメンは、循環免疫細胞の減少の所望の転帰まで、１つ以上のサイクルで投与することができる。いくつかの実施形態において、リンパ枯渇は、対象におけるＣＤ５２＋細胞を特異的に標的とし、低減又は除去する薬剤を投与することを含み、免疫細胞は、ＣＤ５２発現を低減又は除去するように修飾される。
いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、養子免疫細胞の投与前、投与と同時に、又は投与後（例えば、注入）に対象に投与される。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、恒常性サイトカインを含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、免疫刺激分子を含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－９、又はそれらの機能的断片を含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－９、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、又はその機能的断片を含む。
自己細胞を使用する養子細胞療法のための方法は、免疫細胞を患者の血液から単離することと、細胞を、本明細書に記載の二重受容体系をコードする１つ以上のベクターで形質導入することを含む、単離された細胞に対して一連の修飾を実施することと、細胞を患者に投与することと、を含む。がん若しくは血液悪性腫瘍に罹患しているか、又はがん若しくは血液悪性腫瘍のリスクがある対象からの免疫細胞を提供することは、患者の血液からの免疫細胞の単離を必要とし、当該技術分野で既知の方法、例えば、白血球除去によって達成することができる。白血球除去中、対象からの血液が抽出され、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が分離され、血液の残りが対象の循環に戻される。ＰＢＭＣは、免疫細胞の試料として凍結、又は凍結保存のいずれかで貯蔵され、例えば、本明細書に記載の修飾などの更なる処理ステップのために提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の対象を治療する方法は、濃縮及び／又は枯渇、活性化、遺伝子修飾、拡大、製剤化、並びに凍結保存を含む、一連の修飾を含む、対象からの免疫細胞に対する修飾を含む。
本開示は、例えば、下流の手順、例えば、本明細書に記載の修飾のための対象ＰＢＭＣの調製のための当該技術分野で既知の洗浄及び分画方法であり得る濃縮及び／又は枯渇ステップを提供する。例えば、限定されないが、方法は、総赤血球及び血小板汚染物質を除去するためのデバイス、単球の枯渇及びリンパ球の単離のためのサイズベースの細胞分画のためのシステム、並びに／又は例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、若しくはＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定のサブセットの濃縮若しくは枯渇を可能にするシステムを含み得る。濃縮ステップに続いて、更なる処理のために、対象のＰＭＢＣから免疫細胞の標的サブ集団を単離する。当業者は、本明細書で提供される濃縮ステップが、任意の新たに発見される方法、デバイス、試薬、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、免疫細胞、例えば、それらのエクスビボ拡大に必要なＴ細胞の活性化を誘導するための当該技術分野で既知の任意の方法であり得る活性化ステップを提供する。免疫細胞活性化は、例えば、対象の免疫細胞を、樹状細胞の存在下で培養すること、対象の免疫細胞を、人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）の存在下で培養すること、又は照射されたＫ５６２由来のＡＡＰＣの存在下で免疫細胞を培養することによって達成することができる。対象免疫細胞を活性化するための他の方法は、例えば、単離された活性化要素及び組成物、例えば、ビーズ、表面、又は活性化要素で官能化された粒子の存在下で免疫細胞を培養することであり得る。活性化要素には、例えば、抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体が含まれ得る。活性化要素はまた、例えば、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２又はＩＬ－２１であってもよい。活性化要素はまた、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＣＤ１３４Ｌなどの共刺激分子であってもよい。当業者は、本明細書に提供される活性化要素が、免疫細胞を活性化することができる任意の新たに発見される活性化要素、試薬、組成物、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、対象の免疫細胞を修飾するための遺伝子修飾ステップを提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、Ｂ２Ｍ又はＨＬＡ－Ａに相補的な本明細書に記載されるｓｈＲＮＡを含むベクターを用いて免疫細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム操作を使用してＢ２Ｍ又はＨＬＡ－Ａにおける変異を誘導するように免疫細胞のゲノムを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、免疫細胞を、活性化因子及び抑制性受容体をコードする１つ以上のベクターで形質導入することを含み、それによって活性化因子及び抑制性受容体を発現する免疫細胞を産生する。
本開示は、遺伝子修飾された対象免疫細胞のための拡大ステップを提供する。遺伝子修飾された対象免疫細胞は、投与のための免疫細胞の治療用量を生成するために、当該技術分野で既知の任意の免疫細胞拡大システムで拡大することができる。例えば、コントローラポンプを含むシステムに使用するためのバイオリアクターバッグ、並びに自動供給及び廃棄物除去を可能にするプローブを、免疫細胞拡大に使用することができる。基部にガス透過性膜を有する細胞培養フラスコが、免疫細胞の拡大のために使用され得る。臨床用途のための免疫細胞の拡大を可能にする当該技術分野で既知の任意のそのようなシステムは、本明細書に提供される拡大ステップに包含される。免疫細胞は、拡大のために特異的に製剤化された培地中の培養系において拡大される。拡大はまた、本明細書に記載の活性化要素の存在下で本開示の免疫細胞を培養することによって促進され得る。当業者は、本明細書で提供される拡大ステップが、免疫細胞を拡大するために使用することができる任意の新たに発見される培養系、培地、又は活性化要素も包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、拡大した遺伝子修飾された対象免疫細胞のための製剤化及び凍結保存ステップを提供する。提供される製剤化ステップは、例えば、本明細書に記載の治療方法の免疫細胞の調製及び拡大に使用される過剰な成分を洗い流すことを含む。当該技術分野で既知の免疫細胞と適合する任意の薬学的に許容される製剤培地又は洗浄緩衝液を使用して、免疫細胞を洗浄し、希釈／濃縮し、投与用の用量を調製することができる。製剤培地は、例えば、静脈内注入のための晶質液などの免疫細胞の投与のために許容され得る。
任意選択で、凍結保存を使用して、免疫細胞を長期間貯蔵することができる。凍結保存は、例えば、細胞を、凍結保存成分を含有する凍結保存培地中に貯蔵することを含む、当該技術分野で既知の方法を使用して達成することができる。凍結保存成分は、例えば、ジメチルスルホキシド又はグリセロールを含むことができる。凍結保存培地中に貯蔵された免疫細胞は、貯蔵温度を－８０℃～－１９６℃まで低下させることにより凍結保存することができる。
いくつかの実施形態において、治療方法は、対象のＨＬＡ生殖細胞型を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ生殖細胞型は、骨髄において決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、ＨＥＲ２の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２の発現レベルは、対象に由来する腫瘍組織試料中で決定される。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２の発現レベルは、次世代配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２の発現レベルは、ＲＮＡ配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２のレベルは、免疫組織化学を使用して決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０２ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０１抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０１ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０１を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０３を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０３ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ｃ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ｃ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ｂ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ｂ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。
様々な実施形態において、本開示は、ＨＥＲ２を発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した悪性腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者の治療方法、及び／又はＨＥＲ２を発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した再発性切除不能若しくは転移性固形腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２成人患者の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の免疫細胞が投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、腹腔内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞、約１×１０６個の細胞、約２×１０６個の細胞、約３×１０６個の細胞、４×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞、約６×１０６個の細胞、約７×１０６個の細胞、約８×１０６個の細胞、約９×１０６個の細胞、約１×１０７個、約２×１０７個、約３×１０７個、約４×１０７個、約５×１０７個、約６×１０７個、約７×１０７個、約８×１０７個、約９×１０７個、約１×１０８個の細胞、約２×１０８個の細胞、約３×１０８個の細胞、約４×１０８個の細胞、約５×１０８個の細胞、約６×１０８個の細胞、約７×１０８個の細胞、約８×１０８個の細胞、約９×１０８個の細胞、約１×１０９個の細胞、約２×１０９個の細胞、約３×１０９個の細胞、約３×１０９個の細胞、約４×１０９個の細胞、約５×１０９個の細胞、約５×１０９個の細胞、約６×１０９個の細胞、約７×１０９個の細胞、約８×１０９個の細胞、約９×１０９個の細胞、約１×１０１０個の細胞、約２×１０１０個の細胞、約３×１０１０個の細胞、約４×１０１０個の細胞、約５×１０１０個の細胞、約６×１０１０個の細胞、約７×１０１０個の細胞、約８×１０１０個の細胞、又は約９×１０１０個の細胞を含む。
いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約９×１０１０個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０１０個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約３×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０９個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０９個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞、０．５×１０６個の細胞～約６×１０９個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約３×１０６個の細胞～約４×１０９個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０９個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０９個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞、０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約３×１０６個の細胞～約４×１０８個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０８個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０８個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０８個の細胞、約７×１０６個の細胞～約９×１０８個の細胞、約８×１０６個の細胞～約８×１０８個の細胞、約９×１０６個の細胞～約７×１０８個の細胞、約１×１０７個の細胞～約６×１０８個の細胞、約２×１０７個の細胞～約５×１０８個の細胞、約７×１０６個の細胞～約９×１０７個の細胞、約８×１０６個の細胞～約８×１０７個の細胞、約９×１０６個の細胞～約７×１０７個の細胞、約１×１０７個の細胞～約６×１０７個の細胞、又は約２×１０７個の細胞～約５×１０７個の細胞を含む。
いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０５個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約６×１０８個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。治療用量で言及される場合、「約」という用語は、例えば、±０．５×１０６個の細胞、±０．５×１０７個の細胞、又は±０．５×１０８個の細胞であり得る。
キット及び製品
本開示は、本明細書に記載の操作された受容体をコードするポリヌクレオチド及びベクターと、本明細書に記載の遺伝子編集系を使用して編集され、本明細書に記載の操作された受容体を含む免疫細胞とを含む、キット及び製品を提供する。いくつかの実施形態において、キットは、バイアル、シリンジ、及び使用説明書などの物品を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本開示の１つ以上の操作された受容体をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド又はベクターを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の操作された受容体を含む、複数の免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、複数の免疫細胞は、複数のＴ細胞を含む。
実施例１：Ｊｕｒｋａｔ細胞及び初代Ｔ細胞におけるＨＥＲ２ ＣＡＲ活性をアッセイする方法
細胞培養
ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターをコードするＪｕｒｋａｔ細胞を、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。培養において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネテシンを補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。ＨＣＴ．１１６及びＨｅＬａ細胞を、ＡＴＣＣによって示唆されるように維持した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞トランスフェクション
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、製造業者のプロトコルに従って、１００ｕＬ又は２０ｕｌフォーマットの４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を介して一過性にトランスフェクトした。同時トランスフェクションを、１ｅ６細胞当たり１～３ｕｇの活性化因子受容体構築物、及び１～３ｕｇの抑制性受容体構築物又は空のベクターで実施し、２０％の熱不活性化ＦＢＳ及び０．１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で回収した。抑制性受容体表面発現を確認するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で４℃で６０分間の、１０ｕｇ／ｍＬのストレプトアビジン－ＰＥ－ＨＬＡ－Ａ＊０２－ｐＭＨＣ四量体でのトランスフェクションの１８～２４時間後に染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）によって特徴付けた。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性化研究
簡潔に述べると、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ホタル－ルシフェラーゼ細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＡＡＦ－１００２Ｂ）又はＮｅｏｎ（商標）トランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＭＰＫ５０００）を使用して、活性化因子及び抑制性（遮断因子）受容体構築物でトランスフェクションした。異なる密度での活性化因子のみ又は活性化因子／遮断因子発現標的細胞であるｍＲＮＡトランスフェクトした標的細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ホタル－ルシフェラーゼ細胞（１２，０００細胞／ウェル）に、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５７０）中に最終体積２０ｍＬまで添加した。３７℃で６時間のインキュベーション後、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼホタルアッセイシステム（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６０６９０）を使用して、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ１０００上の発光強度を決定した。
固体基質抗原滴定
ビオチン化ｐＭＨＣを、ビオチン化組換えＣＤ２８アゴニスト、ビオチン化組換えＰＤ－Ｌ１、又はその両方の有無に関わらず、ストレプトアビジン被覆プレートに、等モル～最高ｐＭＨＣモル濃度の濃度で添加した。マウスＩｇＧ１を対照として使用して、ウェルの結合能力を超えないようにした。非結合分子を洗い流し、形質導入Ｔ細胞を添加した。Ｔ細胞の半分を回収し、２４時間で抗ＣＤ６９で染色し、残りを４８時間で抗ＣＤ２５で染色した。
活性化因子ｍＲＮＡ滴定
ＨＥＲ２又はＨＬＡ－Ａ２ ｍＲＮＡを以下に記載されるように合成し、２倍に１２回希釈した。ｍＲＮＡの各希釈を、２００万個のＨｅｒ２ノックアウトＨｅＬａ細胞（Ｈｅｒ２－／ＨＬＡ－Ａ２－）と混合し、４Ｄヌクレオファクターを使用してエレクトロポレーションした。次いで、ｍＲＮＡトランスフェクトした標的細胞を、ＨＥＲ２ ＣＡＲ又は遮断因子受容体でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞と６時間共培養した後、上記のように活性化度を測定した。
ｍＲＮＡのインビトロ転写
ＨＥＲ２配列を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって、５’末端のＴ７プロモーターとともに、５’及び３’合成ＵＴＲ配列とともに合成した。インビトロ転写を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２５１Ｓ）、無機ピロホスファターゼ（ＮＥＢ、Ｍ２４０３Ｓ）及びマウスＲＮａｓｅ抑制剤（ＮＥＢ、Ｍ０３１４Ｓ）を含む１Ｘ ＩＶＴ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、０．００２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、及び２７ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で行った。更に、５００ｎｇのＰＣＲ精製テンプレート、５ｍＭのＣｌｅａｎＣａｐ Ｃａｐ１ ＡＧ三量体、各々５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及び疑似ウリジン三リン酸（疑似ＵＴＰ）を添加し、転写反応を３７℃で２時間インキュベートし、続いてＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ Ｍ０３０３Ｓ）を添加して３７℃で更に１５分間インキュベートした。
インビトロ転写反応を、ポリＡ酵素（ＮＥＢ、Ｍ０２７６Ｓ）とともにポリＡテーリングを添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって完成させた。次いで、ＮＥＢ Ｍｏｎａｒｃｈキットを使用してｍＲＮＡを洗浄した。精製したｍＲＮＡをＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２８９Ｓ）で３７℃で１時間、１×Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で処理した。次いで、ｍＲＮＡをＮＥＢ Ｍｏｎａｒｃｈキットを使用して再度精製した。ｍＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐによって測定した。ｍＲＮＡの品質を、ゲル電気泳動によってアクセスした。最終のインビトロ転写ｍＲＮＡをアリコートし、使用直前まで－８０℃で保管した。
初代Ｔ細胞形質導入、拡大、及び濃縮
ヒトＰＢＭＣを、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（登録商標）から購入したＬｅｕｋｏｐａｋｓから、前述の方法（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）に従って精製した。収集プロトコル及びドナーのインフォームドコンセントは、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（登録商標）において施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。Ａｌｌｃｅｌｌｓ（登録商標）はまた、ＨＩＰＡＡコンプライアンス及び厳格な監督の下で承認されたプロトコルに従った（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｃｅｌｌｓ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌ－ｔｉｓｓｕｅ－ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ／ｄｏｎｏｒ－ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ／）。別段の記載がない限り、全てのＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）培地（Ｔａｋａｒａ ＷＫ５５２）に、１％のヒトＡＢ血清（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ １００－５１２）を補充した。ヒトＰＢＭＣを、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥプラスＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－１１１－１６０）内で、製造業者のガイドライン（１：１００希釈）に従って２４時間増殖させた後、活性化因子（ＣＡＲ）及び／又は遮断因子をコードするレンチウイルスで形質導入した。形質導入の２４時間後に、追加のＬｙｍｐｈｏＯＮＥプラスＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）を形質導入した細胞に添加し、これを３日間増殖させた後、２４ウェルのＧ－Ｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ８０１９２Ｍ）に移した。新鮮なＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）を、４８時間ごとに添加し、細胞をＧ－Ｒｅｘプレート中で拡張したときに７日ごとに培地を交換した。初代Ｔ細胞における形質導入された活性化因子又は活性化因子及び遮断因子の発現及び抗原結合を、活性化因子のプロテインＬ及び遮断因子のＨＬＡ－Ａ２ ｐＭＨＣ又はＬＩＬ－ＲＢ１抗体を使用したフローサイトメトリーによって確認した。必要な場合、ＣＡＲ又は遮断因子を発現する細胞を、製造業者の指示に従って、細胞を、プロテインＬ－ビオチン／ストレプトアビジン－ＰＥ、又はｐＭＨＣ／ストレプトアビジン－ＰＥ、続いて抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０４８－８０１）で標識し、その後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して濃縮した。濃縮した細胞を、Ｇ－Ｒｅｘプレート中で使用まで増殖させた。
初代Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性研究
細胞傷害性研究のために、濃縮された初代Ｔ細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を発現するＨｅＬａ及びＨＣＴ．１１６細胞とインキュベートした。生きたルシフェラーゼ発現標的細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量化した。ＧＦＰ及びウミシイタケルシフェラーゼを安定して発現する標的細胞（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）又はＲＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現する標的細胞（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージャーを使用して、標識されていない初代Ｔ細胞とともに撮像した。経時的な生きた標的細胞の蛍光強度を、４０時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅイメージングソフトウェアを使用して定量化した。可逆性研究のために、濃縮初代Ｔ細胞を、同様に「正常」又は「腫瘍」標的細胞と３日間共培養し、撮像した。３日後、Ｔ細胞を、ピペッティング、ＦＡＣＳ又は磁気ビーズによって残りの標的細胞から分離した。別々のウェルにおいて、生きたルシフェラーゼ発現標的細胞を、７２時間のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量化した。
マウス異種移植片研究
Ｔ細胞を発現する活性化因子及び遮断因子を、上記のように生成した。
５～６週齢の雌のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＪＡＸストック番号００５５５７マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。研究開始前に、動物を、少なくとも３日間住居環境に順応させた。一方の脇腹でＨＬＡ－Ａ＊０２陽性、他方の脇腹でＨＬＡ－Ａ＊０２陰性細胞であった５ｅ６ ＨＥＲ２＋ＨＣＴ．１１６細胞を動物に注射した。両脇腹の腫瘍の総体積が平均１００ｍｍ３（Ｖ＝Ｌ×Ｗ×Ｗ／２）に達したとき、動物を群にランダム化し、２ｅ６、５ｅ６、又は１０ｅ６の総Ｔ細胞を尾静脈を介して投与した。Ｔ細胞注射後、両脇腹の腫瘍測定を週３回、４週間行った。
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計分析を行った。全てのペプチド及び細胞滴定研究は、別段の記載がない限り、平均±標準偏差（ＳＤ）として示され、一方、初代Ｔ細胞を使用するインビトロ及びインビボ研究は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。ペプチド及び細胞滴定曲線を、４パラメータの非線形回帰分析を使用して適合させた。ＥＣ５０値は、曲線から直接計算した。他の全てのデータ群を、別段の記載がない限り、通常の双方向ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して解析した。
実施例２：Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＥＲ２キメラ抗原受容体の活性
異なるＨＥＲ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の感受性を、Ｊｕｒｋａｔ細胞において決定し、順序付けた。アッセイした異なるＨＥＲ２ ＣＡＲのフォーマット、及びこれらのＣＡＲのＨＥＲ２抗原結合ドメインを図１に示す。アッセイしたＨＥＲ２ ＣＡＲの配列を以下の表２５に示す。
ＨＥＲ２ ＣＡＲＳ１～４（それぞれ、ＣＴ２９２、ＣＴ２９７、ＣＴ２９８、及びＣＴ２９９）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の活性を、固体基質上のＨＥＲ２抗原の滴定を使用してアッセイし（図２Ａ）、ＨＣＴ．１１６ ＨＥＲ２陽性標的細胞の数を滴定することによってアッセイした（図２Ｂ）。どちらの場合も、ＦＲＰ５抗原結合ドメインを有するＨＥＲ２ ＣＡＲ２は、ほとんど又はまったく活性を示さなかった。ＦＲＰ５抗原結合ドメイン、及びＦＲＰ５のバリアントは、ＩｇＧ１ヒンジドメイン（ＣＴ１０９４及びＣＴ１０９５）を使用した異なるＣＡＲフォーマットでアッセイした。図２Ｃに示されるように、ＩｇＧ１ヒンジと組み合わせたＦＲＰ５抗原結合ドメインは、検出可能な活性を示す。
実施例３：ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体は、ＨＥＲ２ ＣＡＲ媒介性Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化を抑制することができる
ＨＥＲ２ ＣＡＲ及びベース抑制性受容体の両方を発現するＪｕｒｋａｔ細胞のＨＥＲ２媒介性活性化を抑制するＨＬＡ－Ａ＊－０２ ＬＩＲ１ベースの抑制性受容体の能力をアッセイした。
単独で、又はＣＴ１７６５ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体と組み合わせて、ＨＥＲ２ ＣＡＲ１（図３）又はＨＥＲ２ ＣＡＲ４（図４）のいずれかを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、ＨＣＴ．１１６又はＨｅＬａ細胞と共培養した。ＨＣＴ．１１６ Ｈｅｌａ細胞は、ＨＥＲ２（標的Ａ）、又はＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ＊０２（標的ＡＢ）を発現した。図３から見ることができるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体及びＨＥＲ２ ＣＡＲ１を発現する活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を発現するＨＣＴ．１１６又はＨｅＬａ標的細胞によって抑制された。対照的に、ＨＥＲ２ ＣＡＲ１のみを発現する活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を発現する標的細胞の存在下では抑制されなかった。図４に示されるように、ＨＥＲ２ ＣＡＲ４について同様の結果が観察された。
Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の両方の表面発現を、図５に示されるように、活性化因子受容体についてはプロテインＬを使用し、遮断因子受容体についてはｐＭＨＣ又は抗ＬＩＬＲＢ１抗体を使用してＪｕｒｋａｔ細胞を染色することによって検証した。
実施例４：ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体は、初代Ｔ細胞のＨＥＲ２ ＣＡＲ媒介活性化を抑制することができる
ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体と組み合わせたＨＥＲ２ ＣＡＲ１（ＣＴ２９２）の有効性、選択性、及び可逆性が、初代Ｔ細胞において実証された。マウスバージョンのＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体（Ｃ１７６５）、並びに２つのヒト化バージョン（Ｃ２１６２及びＣ２１６３）を、ＨＥＲ２ ＣＡＲと組み合わせてアッセイした。ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の配列を以下の表２６に提供する。
図６で見ることができるように、ＨＥＲ２ ＣＡＲ１及び３つの抑制性受容体構築物の全ては、レンチウイルス形質導入及び濃縮後の初代Ｔ細胞によって発現された。３つの抑制性受容体の各々をＨＥＲ２ ＣＡＲ１と組み合わせて発現する初代Ｔ細胞の活性を、活性化因子リガンドを発現するＨｅＬａ標的細胞対抑制因子リガンドを１：４０の比で使用してアッセイした（ＨＥＲ：ＨＬＡ－Ａ＊－０２）。図７に示されるように、全ての抑制性受容体は、ＨＥＲ２媒介性初代Ｔ細胞活性化を抑制することができた。約１：４の比で活性化因子対遮断因子抗原を発現したＨＣＴ．１１６標的細胞を使用して、同様の結果を得た（図８）。ＨｅＬａ及びＨＣＴ．１１６標的細胞の抗原発現及び抗原密度を図１２及び１３に示す。
実施例５：ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体によるＨＥＲ ＣＡＲ媒介性初代Ｔ細胞活性化の抑制は可逆的である
ＨＥＲ２ ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞のＨＥＲ２媒介性活性化を抑制するＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体の能力は可逆的であった。単独で又はＣＴ１７６５ ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体と組み合わせてＨＥＲ２ ＣＡＲ１（ＣＴ２９２）を発現する初代Ｔ細胞を、ＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を発現するＨＣＴ．１１６細胞（図９、ＲＤ１又はラウンド１）と１：１の比で共培養した。次いで、ＨＣＴ．１１６標的細胞を除去し、初代Ｔ細胞を、ＨＥＲ２のみを発現するＨＣＴ．１１６標的細胞（図９、ＲＤ２、又はラウンド２）と１：１の比で共培養した。最後に、初代Ｔ細胞を、ＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を発現するＨＣＴ．１１６細胞、又は対照としてＨＥＲ２単独（図９、ＲＤ３、又はラウンド３）と１：１の比で再び共培養した。図９で見ることができるように、Ｔ細胞の活性化及び不活性化は可逆的であった。加えて、ＨＥＲ２ ＣＡＲのみを発現するＴ細胞は、共培養のラウンド３によって枯渇したが、ＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体の両方を発現したＴ細胞は、枯渇しなかった。
実施例６：マウス異種移植片モデルにおけるＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現する初代Ｔ細胞の活性
インビボ治療及び研究に使用されるＴ細胞の最適用量を、マウス異種移植片モデルを使用してアッセイした。マウスの各脇腹に５ｅ６標的細胞を移植した。標的細胞は、ＨＥＲ２＋及びＨＬＡ－Ａ＊０２陽性であるＨＣＴ．１１６野生型細胞（「正常」細胞）、又はＨＬＡ－Ａ＊０２がノックアウトされたＨＣＴ．１１６（「腫瘍」細胞）であった。正常な標的細胞を一方の脇腹に移植し、腫瘍細胞を他方の脇腹に移植した。マウスを、形質導入されなかったか、又はＣ２１６２ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体と組み合わせたＨＥＲ２ ＣＡＲ１活性化受容体（ＣＴ２９２）で形質導入されたＨＬＡ－Ａ＊０２陰性ドナーからのＴ細胞で治療した。異種移植片モデルマウスに、２ｅ６、５ｅ６、又は１０ｅ６の総Ｔ細胞を注射し、腫瘍体積をＴ細胞注射後数日でモニタリングした。この実験の図を図１０に示す。図１１に見られるように、ＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ抑制性受容体の組み合わせを発現するＴ細胞は、異種移植片インビボモデルにおいて細胞傷害性及び遮断効果を示し、１マウス当たりの総Ｔ細胞の用量は１ｅ７であった。
実施例７：Ｊｕｒｋａｔ細胞において発現されたＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の活性
９つの受容体対の候補を試験した。ｓｃＦｖ ＣＴ２９２、ＣＴ２９９、又はＣＴ１０９４を、モジュールなし（ＣＡＲのみ）、マウス遮断因子（Ｃ１７６５）、ヒト化遮断因子１（Ｃ２１６２）、又はヒト化遮断因子２（Ｃ２１６３）と対合した。遮断因子及び抑制因子の様々な組み合わせを表２７に示す。
活性化因子及び遮断因子の感受性を、ｍＲＮＡ滴定アッセイを使用して測定した。ｍＲＮＡを滴定し、それを使用してＨＥＲ２－ＨｅＬａ標的細胞をトランスフェクトし、次いで、適切なＨＥＲ２構築物及びＮＦＡＴルシフェラーゼを発現するＪｕｒｋａｔ細胞と共培養した。６時間の共培養後、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化を発光強度によって測定した。結果を図１４に示し、表２７に要約する。遮断因子Ｃ２１６３は、活性化レベルが低いＣ２１６２と同様の遮断活性を示し、更なる研究は行わなかった。
実施例８：ＨＥＲ２ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現する初代Ｔ細胞による選択的細胞死滅
初代Ｔ細胞を、６つの活性化因子－遮断因子受容体対で形質導入し、ＨｅＬａ標的細胞上の急性細胞傷害性機能を１：１のＥ：Ｔ比で測定した。細胞を、ＨＥＲ２ ＣＡＲ（ＣＴ２９２、ＣＴ２９９、又はＣＴ１０９４）のみで、又はマウス形態（Ｃ１７６５）若しくはヒト化形態（Ｃ２１６２）のＨＥＲ２ ＣＡＲ及び遮断因子でトランスフェクトした。結果を図１５に示す。試験した受容体対のうちのいずれか１つでトランスフェクトした細胞は、腫瘍細胞を選択的に死滅させ、正常細胞を保存した一方で、ＣＡＲのみでトランスフェクトした細胞は、両方の細胞型を死滅させた。
初代Ｔ細胞を、ＨＥＲ２ ＣＡＲ ＣＴ２９２及びヒト遮断因子１（ＣＴ１１１８細胞）、又はＨＥＲ２ ＣＡＲ ＣＴ１０９４及びヒト遮断因子１（ＣＴ１１２１細胞）で形質導入し、Ａ３７５正常（ＨＬＡ－Ａ＊０２－親和性）又は腫瘍（ＨＬＡ－Ａ＊０２－欠損性）標的細胞と広範囲のＥ：Ｔ比にわたって４８時間共培養し、各Ｅ：Ｔ比での最大特異的死滅を記録した。データを非線形回帰を使用して適合させて、５０％最大細胞傷害性（ＥＣ５０）をもたらすＥ：Ｔ比を導出した。結果を図１６に示し、ここで、腫瘍から正常な標的細胞へのＥＣ５０の倍率変化が選択性の比として示される。この解析は、２人の個々のＨＬＡ－Ａ＊０２－Ｔ細胞ドナー（左対右）で実施した。全体的に、ＣＴ１２１１受容体の組み合わせは、ＣＴ１１１８よりも強力である。どちらの構築物も選択的であるが、ＣＴ１１１８受容体の組み合わせは、試験したＥ：Ｔ比の範囲よりも正常なＡ３７５標的細胞をよりよく保護するようである。
実施例９：ＣＴ１１１８受容体の組み合わせの更なる特徴付け
ＣＴ１１１８受容体の組み合わせ（ＣＴ２９２ ＣＡＲ及びヒト遮断因子ＣＴ２１６２）を、ＣＴ２９２ ＣＡＲ単独に対してベンチマークした。初代Ｔ細胞を、ＣＴ２９２単独で、又はＣＴ２１６２と組み合わせて形質導入し、ＨｅＬａ標的細胞又はＡ３７５標的細胞上で１：１のＥ：Ｔ比での急性細胞傷害性を評価した。結果を図１７に示す。ＣＴ２９２細胞は、ＣＴ１１１８細胞よりも腫瘍細胞と正常細胞の両方を死滅させた。ＣＴ１１１８細胞は、正常細胞を保存しながら、ＣＴ２９２細胞と同様の効率で腫瘍細胞を死滅させ、したがって、ＣＡＲ単独での受容体組み合わせの改善された選択性を実証した。
次に、再チャレンジ後にＣＴ１１１８細胞の活性及び選択性を評価した。結果を図１８に示す。初代ＣＴ２９２ Ｔ細胞及びＣＴ１１１８ Ｔ細胞は、１：１のＥ：Ｔ比でＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＨｅＬａ標的細胞上で最大３回の４８時間ラウンドの腫瘍再チャレンジに対して同様の効力を維持した。しかしながら、ＣＴ１１１８細胞は、ＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＨｅＬａ標的細胞を継続的に保存したが、ＣＴ２９２細胞はそうではなかった。
実施例１０：ＣＴ１１１８機能の可逆性
ＣＴ２９２及びＣＴ１１１８細胞の機能の可逆性を、ＣＴ２９２細胞及びＣＴ１１１８細胞を、腫瘍（標的Ａ、ＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－）又は正常（標的ＡＢ、ＨＥＲ２＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）のＨｅＬａアイソタイプとともに、１：１のＥ：Ｔ比でラウンド当たり４８時間共培養することによって評価した。結果を図１９に示す。ＣＴ２９２ Ｔ細胞は、両方の細胞型を死滅させ、ＣＴ１１１８細胞は、可逆的活性化を示した。更に、ＣＴ１１１８細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２状態に依存する細胞傷害性の不活性化を示した。この機能の可逆性は、曝露の順序、腫瘍→正常→腫瘍又は正常→上位→正常に関わらず観察された。図２０は、各順序についてｔ＝４８時間の標的細胞の画像を示す（左パネル：腫瘍→正常→腫瘍、右パネル：正常→腫瘍→正常）。順序に関わらず、ＣＴ１１１８細胞は、可逆的機能を示した。ＵＴＤ処理により、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現に関わらず、健康で接着性の標的細胞が得られたが、ＣＴ２９２細胞は、腫瘍細胞及び正常な標的細胞の両方を死滅させた。ＣＴ１１１８細胞は、腫瘍細胞を選択的に死滅させたが、正常細胞を保存した
実施例１１：混合培養におけるＣＴ１１１８の選択的傷害性
選択的細胞傷害性は、腫瘍細胞及び正常なＨｅＬａ標的細胞を１：１の比で混合したＣＴ２９２細胞又はＣＴ１１１８細胞を、３回の４８時間ラウンドで共培養することによって評価した。結果を図２１に示す。ＣＴ１１１８細胞は、腫瘍細胞の連続的な選択的死滅を示したが、ＣＴ２９２細胞は、両方の細胞型を死滅させた。図２２は、非形質導入Ｔ細胞、ＣＴ２９２細胞、又はＣＴ１１１８細胞との２０時間の共培養後の混合培養中の、腫瘍細胞及び正常なＨｅＬａ標的細胞の画像を示す。ＣＴ２９２細胞は、正常細胞と腫瘍細胞の両方を死滅させたが、ＣＴ１１１８細胞は、腫瘍細胞を選択的に死滅させた。図２３は、ＣＴ１１１８の選択性が、再チャレンジ後２４時間維持されることを示す。
実施例１２：インビボでのＣＴ２９２の効果
１Ｅ６ Ａ３７５ Ａ２＋（正常）及びＡ２－（腫瘍）を、０日目にＮＳＧマウスの各脇腹に移植した。Ａ３７５細胞は、それぞれ、ＣＴ１１１８のＥＣ５０及びＩＣ５０と同様のＨＥＲ２及びＨＬＡ－Ａ２発現を有する（図２４）。８日目に、非形質導入細胞（「ＵＴＤ」）、ＣＴ２９２細胞、及びＣＴ１１１８細胞を、マウス当たり２０００万個の細胞で注射した。腫瘍体積を、注射後２～３日毎にキャリパーによって測定した。
結果を図２５に示す。ＣＴ２９２細胞は、腫瘍及び正常な異種移植片の両方を減少させたが、ＣＴ１１１８細胞は、腫瘍異種移植片を選択的に減少させたが、正常な異種移植片は減少させなかった。
実施例１３：ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１又はＨＬＡ－Ｂ８０７遮断因子と対合したＣＴ２９２のインビトロでの有効性
ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１遮断因子２６（配列番号４０５のｓｃＦｖを含む）、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１遮断因子４（配列番号３４５のｓｃＦｖを含む）、又はＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２遮断因子ＢＢ７．１（配列番号２１８０６のｓｃＦｖを含む）のいずれかと対合したＣＴ２９２によるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼ（ＪＮＬ）細胞抑制を、ｍＲＮＡ滴定アッセイで測定した。
ＪＮＬ細胞活性化を、ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を使用したｍＲＮＡ滴定アッセイにおいて測定した。ＨｅＬａ細胞を、Ａ＊０３：０１、Ａ＊１１：０１、又はＢ＊０７：０２遮断因子のいずれかをコードする段階希釈ｍＲＮＡでトランスフェクトした。ＪＮＬ細胞を、ＣＴ２９２及び陰性対照ベクター（白丸）、又はＣＴ２９２、並びにＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、又はＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２遮断因子（黒丸）のいずれかで一過性にトランスフェクトした。機能的応答を、５，０００個のＪＮＬ細胞と５，０００個のＨｅＬａ細胞を６時間共培養した後に評価した。データを図２６Ａ～２６Ｃに示す。結果は、全ての遮断因子が、対応する滴定ＨＬＡ ｍＲＮＡの存在下でＨＥＲ２ ＣＡＲの活性化を遮断することを示す。
ｍＲＮＡトランスフェクション時のＨｅＬａ細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ＊１１：０１又はＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２タンパク質を、フローサイトマーターによって評価した。ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧタグ付きＨＬＡ－Ａ＊１１：０１又はＦＬＡＧタグ付きＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２のいずれかをコードする２倍段階希釈ｍＲＮＡでトランスフェクトし、最高用量は２０００ｎｇ／２００，０００ＨｅＬａ細胞であった。細胞を、製造業者の指示に従って、４ＤヌクレオフェクターＸ－ユニット（Ｌｏｎｚａ）を２０ｕＬのフォーマットで使用してトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、１０％ ＦＢＳ及び０．１％のペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＭＥＭ培地に移し、３７℃、５％ ＣＯ２で１６～２４時間インキュベートした。翌日、細胞を機械的に分離し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ）で２回洗浄し、次いで、氷上で３０分間、抗ＨＬＡ＊Ａ１１：０１（１ラムダ０２８４ＨＡ）又は抗Ｂ＊０７：０２ ｍＲＮＡ（ＢＢ７．１）抗体のいずれかで染色した。１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、氷上で３０分間、抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ又はＡＰＣ二次抗体のいずれかで染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、蛍光を測定した。結果を図２７に示し、下部パネルは、０ｎｇのｍＲＮＡを含有する。

Claims (60)

  1. がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する免疫細胞であって、
    ａ．ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体と、
    ｂ．前記がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体と、を含む、免疫細胞。
  2. 前記非標的抗原が、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子又は副組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）である、請求項１に記載の免疫細胞。
  3. 前記ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ又はＨＬＡ－Ｅを含む、請求項２に記載の免疫細胞。
  4. 前記ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２である、請求項２に記載の免疫細胞。
  5. 標的抗原が、主要組織適合性複合体クラスＩ複合体（ＭＨＣ Ｉ）との複合体におけるＨＥＲ２又はＨＥＲ２のペプチド抗原である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  6. 前記がん細胞が、ＨＥＲ２を発現する、請求項５に記載の免疫細胞。
  7. 前記がん細胞が、乳がん細胞、膀胱がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、唾液管がん細胞、非小細胞肺がん細胞、膵がん細胞、又は結腸がん細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  8. 前記がん細胞が、乳がん細胞又は胃がん細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  9. ＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原が、対象の健常な細胞によって発現される、請求項４～８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  10. 前記対象の健常な細胞が、前記標的抗原及び前記ＨＬＡ－Ａ＊０２非標的抗原の両方を発現する、請求項４～９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  11. 前記活性化因子受容体及び前記抑制性受容体がともに、前記がん細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  12. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  13. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である、請求項１２に記載の免疫細胞。
  14. 前記ＨＥＲ２抗原が、配列番号２～２９のうちのいずれか１つの配列又は部分配列と少なくとも９５％同一の配列又は部分配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  15. 前記活性化因子受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  16. 前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む、請求項１５に記載の免疫細胞。
  17. 前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、請求項１５又は１６に記載の免疫細胞。
  18. 前記ＶＨ及びＶＬ領域が、配列番号３０～４２からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  19. 前記ＶＨ領域が、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号３６）、ＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、及びＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤ［Ｙ／Ｖ］（配列番号４０）又は（配列番号４１）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含み、前記ＶＬ領域が、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹ（配列番号３２）、及びＱＱＨＹＴＴＰＰ（配列番号３４）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  20. 前記ＶＨ領域が、ＮＹＧＭＮ（配列番号３７）、ＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧ（配列番号３９）及びＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹ（配列番号４２）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含み、前記ＶＬ領域が、ＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡ（配列番号３１）、ＳＡＳＳＲＹＴ（配列番号３３）、及びＱＱＨＦＲＴＰＦＴ（配列番号３５）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  21. 前記ＶＨ領域が、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号３６）、ＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、及びＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤ［Ｙ／Ｖ］（配列番号４０）又は（配列番号４１）のＣＤＲ配列を含み、前記ＶＬ領域が、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹ（配列番号３２）及びＱＱＨＹＴＴＰＰ（配列番号３４）のＣＤＲ配列を含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  22. 前記ＶＨ領域が、ＮＹＧＭＮ（配列番号３７）、ＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧ（配列番号３９）及びＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹ（配列番号４２）のＣＤＲ配列を含み、前記ＶＬ領域が、ＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡ（配列番号３１）、ＳＡＳＳＲＹＴ（配列番号３３）、及びＱＱＨＦＲＴＰＦＴ（配列番号３５）のＣＤＲ配列を含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  23. 前記ＶＨ領域が、ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含み、前記ＶＬ領域が、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）のＣＤＲ配列を含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  24. 前記ｓｃＦｖが、配列番号５１、５３、５５、５７．５９及び６１からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列を含む、請求項１６又は１７に記載の免疫細胞。
  25. 前記ＣＡＲが、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、若しくはＩｇＧ４から単離されるか、若しくは派生するヒンジ配列、又は合成ヒンジを含む、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  26. 前記ＣＡＲが、ＣＤ８又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生する膜貫通ドメインを含む、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  27. 前記ＣＡＲが、ＣＤ２８、４－１ＢＢ若しくはＣＤ３ｚ、又はそれらの組み合わせから単離されるか、又は派生する細胞内ドメインを含む、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  28. 前記抑制性受容体が、ＴＣＲ又はＣＡＲを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  29. 前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む、請求項２８に記載の免疫細胞。
  30. 前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、請求項２８又は２９に記載の免疫細胞。
  31. 前記ＶＨ及びＶＬ領域が、配列番号８７～１０２からなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項３０に記載の免疫細胞。
  32. 前記ＶＨ領域が、ＡＳＧＹＴＦＴＳＹＨＩＨ（配列番号９５）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧＫ（配列番号９８）及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含み、前記ＶＬ領域が、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰ［Ｄ／Ａ］Ｒ（配列番号９０）又は（配列番号９１）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、請求項２９又は３０に記載の免疫細胞。
  33. 前記ＶＨ領域が、ＳＧＹＴＦＴＳＹＨＭＨ（配列番号９７）、ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１００）及びＥＧＴＹＹＡＭＤＹ（配列番号１０２）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含み、前記ＶＬ領域が、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＤ（配列番号８９）、ＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰ［Ｄ／Ａ］Ｒ（配列番号９０）又は（配列番号９１）及びＭＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９４）からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、請求項２９又は３０に記載の免疫細胞。
  34. 前記ＶＨ領域が、ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含み、前記ＶＬ領域が、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）のＣＤＲ配列を含む、請求項２９又は３０に記載の免疫細胞。
  35. 前記ｓｃＦｖが、配列番号６３～７４、２０７、２０９及び２１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一の配列を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  36. 前記抑制性受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  37. 前記抑制性受容体が、ＬＩＬＲＢ１ヒンジ及び膜貫通ドメイン、又はそれらの機能的バリアントを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  38. 前記抑制性受容体が、ＹＧＳＱＳＳＫＰＹＬＬＴＨＰＳＤＰＬＥＬＶＶＳＧＰＳＧＧＰＳＳＰＴＴＧＰＴＳＴＳＧＰＥＤＱＰＬＴＰＴＧＳＤＰＱＳＧＬＧＲＨＬＧＶＶＩＧＩＬＶＡＶＩＬＬＬＬＬＬＬＬＬＦＬＩＬＲＨＲＲＱＧＫＨＷＴＳＴＱＲＫＡＤＦＱＨＰＡＧＡＶＧＰＥＰＴＤＲＧＬＱＷＲＳＳＰＡＡＤＡＱＥＥＮＬＹＡＡＶＫＨＴＱＰＥＤＧＶＥＭＤＴＲＳＰＨＤＥＤＰＱＡＶＴＹＡＥＶＫＨＳＲＰＲＲＥＭＡＳＰＰＳＰＬＳＧＥＦＬＤＴＫＤＲＱＡＥＥＤＲＱＭＤＴＥＡＡＡＳＥＡＰＱＤＶＴＹＡＱＬＨＳＬＴＬＲＲＥＡＴＥＰＰＰＳＱＥＧＰＳＰＡＶＰＳＩＹＡＴＬＡＩＨ（配列番号２５４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  39. 前記免疫細胞が、内因性ＭＨＣクラスＩポリペプチドの対立遺伝子をコードする内因性遺伝子の発現又は機能を不活性化するか、又は低減若しくは排除するように修飾される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  40. 前記ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２である、請求項３９に記載の免疫細胞。
  41. 前記免疫細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子産物の発現を低減又は排除するように修飾される、請求項１～４０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  42. 治療有効量の請求項１～４１のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
  43. 薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. がんの治療において医薬として使用するための、請求項４２又は４３に記載の医薬組成物。
  45. ポリヌクレオチド系であって、
    ａ．ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体、及び
    ｂ．前記がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド系。
  46. 請求項４５に記載のポリヌクレオチド系を含む、ベクター。
  47. ＨＥＲ２陽性がんにおいて非標的抗原をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するか、又は喪失を有する疑いがあると特定された対象におけるＨＥＲ２＋がんを治療する方法であって、請求項１～４１のいずれか一項に記載の免疫細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  48. 免疫細胞療法を作製する方法であって、免疫細胞を、請求項４５に記載のポリヌクレオチド系又は請求項４６に記載のベクターで形質転換することを含む、方法。
  49. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の免疫細胞、又は請求項４２～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。
  50. 使用説明書を更に含む、請求項４９に記載のキット。
  51. ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を、請求項１～４１のいずれか一項に記載の免疫細胞と接触させることを含む、前記ＨＥＲ２陽性がんの非標的抗原をコードする対立遺伝子において、ヘテロ接合性の喪失を有する前記ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法。
  52. 前記腫瘍細胞が、組織中にある、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記腫瘍細胞が、混合培養物中にある、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記非標的抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、及びＨＬＡ－Ｃ＊０７からなる群から選択される、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 免疫細胞であって、
    （ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域と、（ｉｉ）ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）領域、並びに軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域とを含む、活性化因子受容体と、
    （ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域、並びに（ｉｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、抑制性受容体と、を含む、免疫細胞。
  56. 免疫細胞であって、
    （ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５１の配列を含むｓｃＦｖである、活性化因子受容体と、
    （ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号２０９の配列を含むｓｃＦｖである、抑制性受容体と、を含む、免疫細胞。
  57. ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するか、又は喪失を有する疑いがあると特定された対象におけるＨＥＲ２＋がんを治療する方法であって、
    （ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域と、（ｉｉ）ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）領域、並びに軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域とを含む、活性化因子受容体と、
    （ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域、並びに（ｉｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、抑制性受容体と、を含む免疫細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  58. ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するか、又は喪失を有する疑いがあると特定された対象におけるＨＥＲ２＋がんを治療する方法であって、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５１の配列を含むｓｃＦｖである、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号２０９の配列を含むｓｃＦｖである、抑制性受容体と、を含む免疫細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  59. ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法であって、前記ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を、
    （ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１４）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶ（配列番号３１５）のＣＤＲ配列を含むＶＨ領域と、（ｉｉ）ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３０）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３１１）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３１２）、及びＤＴＹＩＨ（配列番号３１３）領域、並びに軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ配列を含むＶＬ領域とを含む、活性化因子受容体と、
    （ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、（ｉ）ＳＹＨＩＨ（配列番号５６６）、ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６７）、及びＥＥＩＴＹＡＭＤＹ（配列番号１０１）のＣＤＲ配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域、並びに（ｉｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号８７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５６５）、及びＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９２）を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、抑制性受容体と、を含む免疫細胞と接触させることを含む、方法。
  60. ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする対立遺伝子においてヘテロ接合性の喪失を有するＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法であって、前記ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を、（ａ）ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＨＥＲ２）抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化因子受容体であって、前記活性化因子受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５１の配列を含むｓｃＦｖである、活性化因子受容体と、（ｂ）がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失により、前記がん細胞によって発現されない非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む抑制性受容体であって、前記抑制性受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号２０９の配列を含むｓｃＦｖである、抑制性受容体と、を含む免疫細胞と接触させることを含む、方法。
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