JP2024506853A - Compositions and methods for making and using hybrid network hydrogels - Google Patents

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Abstract

本開示の実施形態は、ヒドロゲルを生成および使用するための新規組成物、組み合わせ組成物、方法およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有するポリマー主鎖、および少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む第２のポリマー主鎖を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対象の状態を処置する方法であって、１種または複数の治療剤または細胞の非存在下または存在下で対象にヒドロゲルを投与する工程を含む、方法を提供する。Embodiments of the present disclosure relate to novel compositions, combination compositions, methods and systems for producing and using hydrogels. In certain embodiments, the present disclosure provides a polymeric backbone having at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide; A composition is provided that includes a second polymer backbone comprising two eight-arm poly(ethylene glycol) (PEG). In certain embodiments, the present disclosure provides a method of treating a condition in a subject, the method comprising administering a hydrogel to the subject in the absence or presence of one or more therapeutic agents or cells. I will provide a.

Description

本開示の実施形態は、一般に、ヒドロゲルを生成するための組成物、方法、およびシステムに関する。本明細書に開示される他の実施形態は、一般に、健康状態の処置における治療用途のためのヒドロゲルを生成および使用するための組成物、方法、およびシステムに関する。 Embodiments of the present disclosure generally relate to compositions, methods, and systems for producing hydrogels. Other embodiments disclosed herein generally relate to compositions, methods, and systems for producing and using hydrogels for therapeutic use in the treatment of health conditions.

ヒドロゲルの一般的な組成および機械的特性は生体組織のそれらと類似しているため、ヒドロゲルは生体材料として非常に興味深い。ヒドロゲルは再生医療に使用することができ、また、小分子、タンパク質ベース、および細胞ベースの治療薬のための足場材料または送達ビヒクルとしても機能することができる。粘弾性ヒドロゲルにより、注射部位の天然の細胞外マトリックスの機械的特性とより厳密に一致するように、注射およびその機械的特性の調節を行うことができる。粘弾性ヒドロゲルは、適応性の高い化学によって弾性挙動を調整することによって、一部はインビボ環境を再現するように操作することができる。しかし、これまで知られている粘弾性ヒドロゲルでは実質的な劣化および質量損失が発生しており、長期的利用が制限されている。 Hydrogels are of great interest as biomaterials because their general composition and mechanical properties are similar to those of biological tissues. Hydrogels can be used in regenerative medicine and can also serve as scaffolding materials or delivery vehicles for small molecule, protein-based, and cell-based therapeutics. Viscoelastic hydrogels allow for injection and adjustment of its mechanical properties to more closely match the mechanical properties of the natural extracellular matrix at the site of injection. Viscoelastic hydrogels can be engineered to mimic in vivo environments, in part by tuning their elastic behavior through adaptive chemistry. However, previously known viscoelastic hydrogels suffer from substantial degradation and mass loss, limiting their long-term use.

したがって、治療現場で使用するヒドロゲルの適応性の高い化学的利点を維持しながら、粘弾性ヒドロゲルを安定化するための新しい戦略および製剤を開発する必要がある。 Therefore, there is a need to develop new strategies and formulations to stabilize viscoelastic hydrogels while preserving the flexible chemical advantages of hydrogels for use in therapeutic settings.

本開示の実施形態は、ヒドロゲル（例えば、ハイブリッドネットワークヒドロゲル）を生成するための新規組成物、方法、およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、限定されないが、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有する第１のポリマー主鎖、および少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を有する第２のポリマー主鎖を含む組成物であって、２つのポリマー主鎖の組み合わせが、改善された特性を有するハイブリッドネットワークヒドロゲルを生成することができる、組成物を提供する。 Embodiments of the present disclosure relate to novel compositions, methods, and systems for producing hydrogels (e.g., hybrid network hydrogels). In certain embodiments, the present disclosure provides a first hyaluronic acid backbone having at least one hyaluronic acid backbone functionalized with, but not limited to, an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide. A composition comprising a polymer backbone and a second polymer backbone having at least one 8-arm poly(ethylene glycol) (PEG), wherein the combination of the two polymer backbones has a hybrid network having improved properties. Compositions are provided that are capable of producing hydrogels.

一部の実施形態では、第２のポリマー主鎖の８アームＰＥＧは、限定されるものではないが、少なくとも１つのひずみシクロオクチン（ｓｔｒａｉｎｅｄ ｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）で官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２のポリマー主鎖の８アームＰＥＧは、限定されるものではないが、ビシクロノニンまたは類似の官能化剤で官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含むことができる。これらの実施形態によれば、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む第２のポリマー主鎖は、限定されるものではないが、任意選択でベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをさらに含むことができる。一部の実施形態では、ヒアルロン酸主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせを、１つまたは複数のペプチドで修飾することができる。一部の実施形態では、ペプチドは長さ約２～約５０アミノ酸である。 In some embodiments, the 8-arm PEG of the second polymer backbone comprises, but is not limited to, at least one 8-arm PEG functionalized with at least one strained cyclooctyne. be able to. In certain embodiments, the 8-arm PEG of the second polymer backbone can include, but is not limited to, at least one 8-arm PEG functionalized with bicyclononine or a similar functionalizing agent. . According to these embodiments, the second polymeric backbone comprising at least one 8-arm PEG can optionally further comprise, but is not limited to, benzaldehyde-PEG3-azide. In some embodiments, the hyaluronic acid backbone, PEG macromer, or a combination thereof can be modified with one or more peptides. In some embodiments, the peptide is about 2 to about 50 amino acids in length.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、限定されるものではないが、等しい濃度、あるいは等しくない濃度の２つのポリマー主鎖を含むことができる。これらの実施形態によれば、１つのポリマー主鎖は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む第２のポリマー主鎖の濃度と比較して、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された１つのヒアルロン酸主鎖を含むことができ、または少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖の量と比較して、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を有する、より少ないポリマー主鎖を含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、限定されるものではないが、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を含むポリマー主鎖内に約２５重量％の総架橋濃度；および少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖中に約７５重量％の総架橋濃度を含むことができる。 In some embodiments, the compositions disclosed herein can include, but are not limited to, equal or unequal concentrations of two polymer backbones. According to these embodiments, one polymer backbone contains at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde compared to the concentration of a second polymer backbone that includes at least one 8-arm PEG. chain and one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide or functionalized with an aliphatic aldehyde compared to the amount of a second polymer backbone having at least one eight-arm PEG. Fewer polymer backbones can be included, with at least one hyaluronic acid backbone and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with hydrazide. In certain embodiments, the compositions disclosed herein include, but are not limited to, at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide. a total crosslinking concentration of about 25% by weight in a polymer backbone comprising one hyaluronic acid backbone; and a total crosslinking concentration of about 75% by weight in a second polymeric backbone having at least one 8-arm PEG. can.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、対象に送達するための幹細胞または他の治療用細胞などの細胞をさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示される組成物に好適な幹細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、および間葉系幹細胞または間葉系間質細胞を挙げることができる。 In some embodiments, the compositions disclosed herein can further include cells, such as stem cells or other therapeutic cells, for delivery to a subject. According to these embodiments, stem cells suitable for the compositions disclosed herein include embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, epithelial stem cells, dermal stem cells, and mesenchymal stem cells. Mention may be made of stem cells or mesenchymal stromal cells.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる医薬組成物として製剤化することができる。これらの実施形態によれば、本明細書の組成物は、注射に好適な薬学的に許容される担体をさらに含むことができる医薬組成物中に製剤化されたハイブリッドネットワークヒドロゲルであり得る。 In some embodiments, the compositions disclosed herein can be formulated as pharmaceutical compositions that can further include a pharmaceutically acceptable carrier. According to these embodiments, the compositions herein can be hybrid network hydrogels formulated into pharmaceutical compositions that can further include a pharmaceutically acceptable carrier suitable for injection.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種の活性薬剤をさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書の組成物に含まれる活性薬剤は、組成物の分解前、分解後、または分解中にヒドロゲルから放出させることができる。これらの実施形態によれば、組成物は少なくとも１か月後に分解する可能性がある。 In some embodiments, the compositions disclosed herein can further include at least one active agent. According to these embodiments, the active agents included in the compositions herein can be released from the hydrogel before, after, or during degradation of the composition. According to these embodiments, the composition may degrade after at least one month.

一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるヒドロゲルを形成する方法を提供する。これらの実施形態によれば、ヒドロゲルを形成する方法は、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有する１つのポリマー主鎖を、少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を有する第２のポリマー主鎖と組み合わせる工程を含むことができ、この方法はヒドロゲル形成のために外部刺激を必要としない。 In some embodiments, the present disclosure provides methods of forming the hydrogels disclosed herein. According to these embodiments, a method of forming a hydrogel comprises forming a polymer having at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide. The method can include combining the backbone with a second polymer backbone having at least one eight-arm poly(ethylene glycol) (PEG), and the method does not require external stimulation for hydrogel formation.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組み合わせ組成物は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖の濃度の増加と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有するポリマー主鎖の濃度の減少とを組み合わせることによって、ヒドロゲルの応力緩和の増大をもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組み合わせ組成物は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖の濃度の減少と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有するポリマー主鎖の濃度の増加とを組み合わせることによって、ある特定のヒドロゲル製剤の応力緩和の低減をもたらすことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲル製剤の応力緩和を低減させる組み合わせ組成物および方法によって、応力緩和が低減していない組み合わせヒドロゲル製剤と比較して、応力緩和が低減しているまたは低減したヒドロゲル組成物に含まれる少なくとも１つの幹細胞の遊走が増加する可能性がある。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲル製剤の応力緩和の低減を使用する組み合わせ組成物および方法によって、応力緩和が低減していない組み合わせヒドロゲル製剤と比較して、応力緩和が低減しているまたは低減したヒドロゲル組み合わせ組成物に含まれる幹細胞からの少なくとも１つの抗炎症性サイトカインの分泌が増加する可能性がある。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲル製剤の応力緩和の増大を使用する組み合わせ組成物および方法によって、応力緩和が増大していない組み合わせヒドロゲル製剤と比較して、ハイブリッドネットワークヒドロゲル組成物に含まれる幹細胞からの少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの分泌が増加する可能性がある。 In some embodiments, the combination compositions disclosed herein include an increased concentration of a second polymer backbone having at least one 8-arm PEG and at least one polymer chain functionalized with an aliphatic aldehyde. The combination of a hyaluronic acid backbone and a reduced concentration of a polymer backbone having at least one hyaluronic acid backbone functionalized with hydrazide can result in increased stress relaxation of the hydrogel. In some embodiments, the combination compositions disclosed herein include a reduced concentration of a second polymer backbone having at least one 8-arm PEG and at least one polymer chain functionalized with an aliphatic aldehyde. The combination of increased concentrations of hyaluronic acid backbones and polymeric backbones having at least one hyaluronic acid backbone functionalized with hydrazide can result in reduced stress relaxation of certain hydrogel formulations. According to these embodiments, the combination compositions and methods for reducing stress relaxation of hybrid network hydrogel formulations disclosed herein result in increased stress relaxation compared to combination hydrogel formulations that do not have reduced stress relaxation. Migration of at least one stem cell included in the reduced or reduced hydrogel composition may be increased. According to these embodiments, combination compositions and methods using reduced stress relaxation of hybrid network hydrogel formulations disclosed herein reduce stress compared to combination hydrogel formulations without reduced stress relaxation. Secretion of at least one anti-inflammatory cytokine from stem cells included in the hydrogel combination composition having reduced or reduced relaxation may be increased. According to these embodiments, the combination compositions and methods using the increased stress relaxation of the hybrid network hydrogel formulations disclosed herein provide a hybrid network hydrogel formulation that does not have increased stress relaxation. Secretion of at least one pro-inflammatory cytokine from stem cells included in the network hydrogel composition may be increased.

他の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法を使用して生成されるハイブリッドネットワークヒドロゲルは、それを必要とする対象における健康状態もしくは疾患を処置する、進行軽減する、発症軽減する、および／または予防するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される状態を処置および／または予防する方法には、炎症状態、自己免疫状態、血管状態、整形外科状態、がん、またはそれらの組み合わせを含めることができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲルは、対象の罹患組織または領域に対して注射によって直接的にまたは間接的に対象に投与することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲルは、注射器、カテーテル、トロカール、カニューレ、またはそれらの組み合わせを介した注射によって対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、短期または長期の処置のために、本開示のハイブリッドネットワークヒドロゲルを導入するために、大きなゲージの針またはカテーテルを使用することができる。 In other embodiments, the hybrid network hydrogels produced using the compositions, combination compositions and methods disclosed herein are capable of treating, alleviating the progression of, a health condition or disease in a subject in need thereof. It can be used to treat, reduce the onset of, and/or prevent. In certain embodiments, methods of treating and/or preventing conditions disclosed herein include inflammatory conditions, autoimmune conditions, vascular conditions, orthopedic conditions, cancer, or combinations thereof. Can be done. According to these embodiments, the hybrid network hydrogels disclosed herein can be administered to a subject directly or indirectly by injection into an affected tissue or area of the subject. According to these embodiments, the hybrid network hydrogels disclosed herein can be administered to a subject by injection via a syringe, catheter, trocar, cannula, or a combination thereof. In certain embodiments, large gauge needles or catheters can be used to introduce the hybrid network hydrogels of the present disclosure for short-term or long-term treatments.

本開示のある特定の実施形態によるヒドロゲルの形成に使用されるマクロマーを示す概略図。FIG. 2 is a schematic diagram illustrating macromers used to form hydrogels according to certain embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による粘弾性ＨＡ－ヒドラゾンゲル系を示す概略図。FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a viscoelastic HA-hydrazone gel system according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾンゲル系と混合したＰＥＧ－トリアゾールゲル系を示す概略図。FIG. 2 is a schematic diagram showing a PEG-triazole gel system mixed with an HA-hydrazone gel system, according to certain embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ＨＡ－ＨｙｄおよびＨＡ－Ａｌｄのヒアルロン酸主鎖上で官能化されたヒドラジド基とアルデヒド基との間に形成されたヒドラゾン結合、ならびに（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ）基とベンズアルデヒド－Ｐｅｇ３－アジド（アジド）基との間に形成された結合を示す概略図。Hydrazone bonds formed between functionalized hydrazide and aldehyde groups on the hyaluronic acid backbone of HA-Hyd and HA-Ald and (1R,8S,9s )-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl (BCN) group and a benzaldehyde-Peg3-azido (azido) group. 本開示の一部の実施形態による、ＨＡヒドラジド、ＰＥＧ－ＢＣＮ、およびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを有し、安定なヒドラゾン結合およびトリアゾール結合を形成する弾性ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルを示す概略図。FIG. 3 is a schematic diagram showing an elastic PEG-HA dual network gel with HA hydrazide, PEG-BCN, and benzaldehyde-PEG3-azide to form stable hydrazone and triazole bonds, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示のある特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応およびゲル形成の時間経過の例を示すグラフ。ヒドロゲルのインサイチュでの形成を示す。2 is a graph showing examples of dose response and time course of gel formation for PEG-HA dual network gels with different ratios of HA-hydrazone to PEG-triazole, according to certain embodiments of the present disclosure. Figure 3 shows the in situ formation of hydrogels. 本開示のある特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応およびゲル形成の時間経過の例を示すグラフ。ヒドロゲルの膨潤弾性率を示す。2 is a graph showing examples of dose response and time course of gel formation for PEG-HA dual network gels with different ratios of HA-hydrazone to PEG-triazole, according to certain embodiments of the present disclosure. The swelling modulus of the hydrogel is shown. 本開示のある特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応およびゲル形成の時間経過の例を示すグラフ。ヒドロゲルのインサイチュでの弾性率の概要を示すグラフ。2 is a graph showing examples of dose response and time course of gel formation for PEG-HA dual network gels with different ratios of HA-hydrazone to PEG-triazole, according to certain embodiments of the present disclosure. Graph summarizing the in situ elastic modulus of the hydrogel. 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ヒドロゲルの応力緩和挙動を示す。2 is a graph illustrating the effect of viscoelastic properties on stress relaxation of hydrogels, according to certain embodiments of the present disclosure. The stress relaxation behavior of the hydrogel is shown. 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ヒドロゲル中のヒドラゾン架橋のパーセンテージ（粘弾性）の関数として計算された平均緩和時間を示す。2 is a graph illustrating the effect of viscoelastic properties on stress relaxation of hydrogels, according to certain embodiments of the present disclosure. Figure 3 shows the average relaxation time calculated as a function of the percentage of hydrazone crosslinks (viscoelasticity) in the hydrogel. 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ヒドロゲル中で緩和された応力のパーセンテージを示す。2 is a graph illustrating the effect of viscoelastic properties on stress relaxation of hydrogels, according to certain embodiments of the present disclosure. The percentage of stress relaxed in the hydrogel is shown. 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ＨＡ：ＰＥＧおよびＨａ－ａｌｄ：ＰＥＧ－ｐＨＡｌｄのモル比を示す。2 is a graph illustrating the effect of viscoelastic properties on stress relaxation of hydrogels, according to certain embodiments of the present disclosure. The molar ratios of HA:PEG and Ha-ald:PEG-pHAld are shown. 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。適合伸長パラメータ（β）を示す。2 is a graph illustrating the effect of viscoelastic properties on stress relaxation of hydrogels, according to certain embodiments of the present disclosure. The fitted extension parameter (β) is shown. 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。応力緩和の平均時定数＜τ＞を示す。2 is a graph illustrating the effect of viscoelastic properties on stress relaxation of hydrogels, according to certain embodiments of the present disclosure. The average time constant of stress relaxation <τ> is shown. 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ＰＢＳ中で膨潤させた２４時間後のヒドロゲルの最終弾性率を示す。2 is a graph illustrating the effect of viscoelastic properties on stress relaxation of hydrogels, according to certain embodiments of the present disclosure. The final elastic modulus of the hydrogel after 24 hours of swelling in PBS is shown. 本開示の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応および応力緩和の時間経過の例を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing examples of dose response and stress relaxation time courses for PEG-HA dual network gels with different ratios of HA-hydrazone to PEG-triazole, according to embodiments of the present disclosure. 本開示の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応および応力緩和の時間経過の例を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing examples of dose response and stress relaxation time courses for PEG-HA dual network gels with different ratios of HA-hydrazone to PEG-triazole, according to embodiments of the present disclosure. 本開示の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応および応力緩和の時間経過の例を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing examples of dose response and stress relaxation time courses for PEG-HA dual network gels with different ratios of HA-hydrazone to PEG-triazole, according to embodiments of the present disclosure. 図４Ａ～４Ｆは、本開示のある特定の実施形態による、注射器から排出された、７５％の弾性（７５％のＰＥＧ－トリアゾールおよび２５％のＨＡ－ヒドラゾン）を有する代表的なＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルのタイムラプス画像の例を示す図。4A-4F depict representative PEG-HA duals with 75% elasticity (75% PEG-triazole and 25% HA-hydrazone) expelled from a syringe, according to certain embodiments of the present disclosure. A diagram showing an example of a time-lapse image of a network gel. 図５Ａ～図５Ｄは、本開示の一部の実施形態による、封入の０日後または４日後に、１００％弾性または１２％弾性を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内に封入された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の代表的な画像の例を示す図。図５Ｅは、本開示のある特定の実施形態による、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内への封入から４日後の、応力緩和の関数として特徴付けられる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）形態の例を示すグラフ。5A-5D depict mesenchymal stem cells encapsulated within PEG-HA dual network gels with 100% elasticity or 12% elasticity after 0 or 4 days of encapsulation, according to some embodiments of the present disclosure. (MSC) is a diagram showing an example of a typical image. FIG. 5E is a graph showing an example of mesenchymal stem cell (MSC) morphology characterized as a function of stress relaxation four days after encapsulation within a PEG-HA dual network gel, according to certain embodiments of the present disclosure. . 本開示の一部の実施形態による、粘弾性が増加しているヒドロゲル内に封入されたＭＳＣの応力緩和の関数としての形態学的変化の例を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing examples of morphological changes as a function of stress relaxation of MSCs encapsulated within hydrogels with increasing viscoelasticity, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、粘弾性が増加しているヒドロゲル内に封入されたＭＳＣの応力緩和の関数としての形態学的変化の例を示す図。FIG. 4 illustrates an example of morphological changes as a function of stress relaxation of MSCs encapsulated within a hydrogel with increased viscoelasticity, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、粘弾性が増加しているヒドロゲル内に封入されたＭＳＣの応力緩和の関数としての形態学的変化の例を示す図。FIG. 4 illustrates an example of morphological changes as a function of stress relaxation of MSCs encapsulated within a hydrogel with increased viscoelasticity, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、８８％適応性ヒドラゾン結合条件における小さなクラスターの形成を示す代表的な画像を示す図。FIG. 7 shows representative images showing the formation of small clusters in 88% adaptive hydrazone binding conditions, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲルにおける応力緩和の関数としての形態学的変化を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing morphological changes as a function of stress relaxation in a hydrogel, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲルにおける応力緩和の関数としての形態学的変化を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing morphological changes as a function of stress relaxation in a hydrogel, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル内への封入から４日後の間葉系幹細胞のＹａｐ／Ｔａｚ分析を示すグラフ。細胞におけるＹａｐ／Ｔａｚの核形成を示す図。FIG. 4 is a graph showing Yap/Taz analysis of mesenchymal stem cells 4 days after encapsulation within a hydrogel, according to some embodiments of the present disclosure. A diagram showing nucleation of Yap/Taz in cells. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル内への封入から４日後の間葉系幹細胞のＹａｐ／Ｔａｚ分析を示す図。（上）陰性対照、０％粘弾性条件における封入後０日目の細胞形状の代表的な画像、および（下）陰性対照における４日目の細胞形状の代表的な画像を示す図。FIG. 4 shows Yap/Taz analysis of mesenchymal stem cells 4 days after encapsulation within a hydrogel, according to some embodiments of the present disclosure. (Top) Negative control, representative image of cell shape on day 0 after encapsulation in 0% viscoelastic conditions, and (bottom) Representative image of cell shape on day 4 in negative control. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル内への封入から４日後の間葉系幹細胞のＹａｐ／Ｔａｚ分析を示す図。（左）封入後４日目の小クラスターのＹａｐ／Ｔａｚ細胞シグナルの代表的な画像、および（右）顕著な細胞広がりを示す小クラスターの４日目の細胞形状の代表的な画像を示す図。FIG. 4 shows Yap/Taz analysis of mesenchymal stem cells 4 days after encapsulation within a hydrogel, according to some embodiments of the present disclosure. (Left) Representative image of Yap/Taz cell signal in a small cluster on day 4 after encapsulation, and (right) Representative image of cell shape on day 4 in a small cluster showing significant cell spreading. . 本開示の一部の実施形態による、適応性ヒドラゾン結合条件下で４日後のｒＭＳＣの平均細胞体積を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing the average cell volume of rMSCs after 4 days under adaptive hydrazone binding conditions, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、適応性ヒドラゾン結合条件下で４日後のｒＭＳＣの平均核体積を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing the average nuclear volume of rMSCs after 4 days under adaptive hydrazone binding conditions, according to some embodiments of the present disclosure. 図７Ａ～図７Ｅは、本開示の一部の実施形態による、デュアルネットワークゲル内への封入から数日後のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果の例を示す図。7A-7E illustrate examples of the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs several days after encapsulation within a dual network gel, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、高い粘弾性を有するヒドロゲル内に多核構造を形成するためのＭＳＣ細胞の誘導遊走の例を示す図。FIG. 3 illustrates an example of guided migration of MSC cells to form multinucleated structures within hydrogels with high viscoelasticity, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、高い粘弾性を有するヒドロゲル内に多核構造を形成するためのＭＳＣ細胞の誘導遊走の例を示す図。FIG. 3 illustrates an example of guided migration of MSC cells to form multinucleated structures within hydrogels with high viscoelasticity, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、高い粘弾性を有するヒドロゲル内に多核構造を形成するためのＭＳＣ細胞の誘導遊走の例を示す図。FIG. 3 illustrates an example of guided migration of MSC cells to form multinucleated structures within hydrogels with high viscoelasticity, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示す図。いくつかの粘弾性条件からの単一細胞およびクラスター化された新生タンパク質沈着の代表的な画像を示す図。FIG. 7 illustrates the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. Figure showing representative images of single cells and clustered nascent protein deposits from several viscoelastic conditions. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。平均分泌タンパク質厚さのグラフ表示を示す。FIG. 7 is a graph showing the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. Figure 3 shows a graphical representation of average secreted protein thickness. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。最大分泌タンパク質を示す。FIG. 7 is a graph showing the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. Maximum secreted proteins are shown. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。各条件におけるｒＭＳＣの周囲に沈着したタンパク質の平均面積を示す。FIG. 7 is a graph showing the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. The average area of protein deposited around rMSCs in each condition is shown. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。８８％粘弾性条件におけるクラスター化ｒＭＳＣ対単一細胞ｒＭＳＣ間の沈着タンパク質の平均面積を示す。FIG. 7 is a graph showing the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. The average area of deposited proteins between clustered rMSCs versus single cell rMSCs in 88% viscoelastic conditions is shown. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示す図。０％粘弾性条件におけるフィブロネクチンの沈着を示す代表的な画像を示す図。FIG. 7 illustrates the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. Figure 3 shows representative images showing fibronectin deposition under 0% viscoelastic conditions. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示す図。８８％粘弾性条件（図９Ｇ）におけるフィブロネクチンの沈着を示す代表的な画像を示す図。FIG. 7 illustrates the effect of stress relaxation on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. Figure 9 shows representative images showing fibronectin deposition under 88% viscoelastic conditions (Figure 9G). 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対するＥｘｏ－１阻害の効果を示すグラフ。Graph showing the effect of Exo-1 inhibition on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対するＥｘｏ－１阻害の効果を示すグラフ。Graph showing the effect of Exo-1 inhibition on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対するＥｘｏ－１阻害の効果を示すグラフ。Graph showing the effect of Exo-1 inhibition on nascent protein deposition by rMSCs in hydrogels, according to some embodiments of the present disclosure. 本開示の一部の実施形態による、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルへの封入から４日後のヒドロゲル応力緩和の関数としての、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのサイトカイン分泌のサイトカインアレイアッセイの例を示す図。An example of a cytokine array assay of cytokine secretion of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines as a function of hydrogel stress relaxation 4 days after encapsulation in a PEG-HA dual network gel, according to some embodiments of the present disclosure. Figure shown. 本開示の一部の実施形態による、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルへの封入から４日後のヒドロゲル応力緩和の関数としての、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのサイトカイン分泌のサイトカインアレイアッセイの例を示す図。An example of a cytokine array assay of cytokine secretion of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines as a function of hydrogel stress relaxation 4 days after encapsulation in a PEG-HA dual network gel, according to some embodiments of the present disclosure. Figure shown.

定義
本明細書で特に定義しない限り、用語は、本明細書に開示されるある特定の実施形態に関連する、当業者によって一般的に理解される、または適用可能な意味を有する。 DEFINITIONS Unless otherwise defined herein, terms have meanings that are commonly understood or applicable by those of ordinary skill in the art in relation to certain embodiments disclosed herein.

特に指示がない限り、薬剤および／または化合物の量、分子量などの特性、反応条件を表すすべての数値は、本明細書に開示されるとおり、すべての場合において「約」という用語によって改変されるものと考えられる。したがって、特に異議を唱えない限り、明細書および特許請求の範囲における数値パラメータは、本明細書に開示されるように求められる所望の特性に応じて、約１０％～約１５％プラスおよび／またはマイナスで変動し得る近似値である。本明細書で表される数値には本質的に標準偏差が含まれており、これは数値の試験測定で見出された誤差から必然的に生じる。 Unless otherwise indicated, all numerical values expressing amounts of drugs and/or compounds, properties such as molecular weight, reaction conditions, as disclosed herein, are modified in all cases by the term "about." considered to be a thing. Accordingly, unless otherwise objected to, the numerical parameters in the specification and claims may vary from about 10% to about 15% plus and/or depending on the desired properties sought to be disclosed herein. This is an approximate value that can vary negatively. The numerical values expressed herein inherently include a standard deviation, which necessarily results from the errors found in test measurements of the numerical values.

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例として非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。一部の実施形態では、対象はヒトを含む。他の実施形態では、対象は、骨修復または骨形成を必要とするヒトを含む。 As used herein, the terms "subject" and "patient" are used interchangeably herein and refer to both human and non-human animals. The term "non-human animal" in this disclosure includes all vertebrates, including mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, horses, cows, chickens, amphibians, reptiles, etc. include. In some embodiments, the subject includes a human. In other embodiments, the subject includes a human in need of bone repair or bone formation.

本明細書で使用される場合、「処置」、「治療」および／または「治療レジメン」は、患者が発現する、または患者がかかりやすい可能性がある疾患、障害または生理学的状態に応じて行われる臨床介入を指す。処置の目的には、症状の緩和または予防、疾患、障害もしくは状態の進行または悪化の遅延もしくは停止、および／または疾患、障害もしくは状態の寛解が含まれる。 As used herein, "treatment," "therapy," and/or "therapeutic regimen" is carried out in response to a disease, disorder, or physiological condition that a patient develops or to which the patient may be susceptible. refers to clinical interventions that are performed. Objectives of treatment include alleviating or preventing symptoms, slowing or halting the progression or worsening of a disease, disorder or condition, and/or ameliorating a disease, disorder or condition.

本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」は、介入がない場合の発症または重症度の時間および／または程度と比較して、特定の疾患、障害もしくは生理学的状態の発症を除去もしくは遅延させること、または特定の疾患、障害もしくは生理学的状態の重症度の程度を軽減することを指す。 As used herein, "prevent" or "prophylaxis" refers to the onset of a particular disease, disorder or physiological condition compared to the time and/or degree of onset or severity in the absence of intervention. or to reduce the severity of a particular disease, disorder, or physiological condition.

「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは望ましい生物学的結果および／または臨床結果をもたらすのに十分な量を指す。
「ヒドロゲル」は、高い吸水性を特徴とする少なくとも部分的に親水性の物質を指すことができる。一部の実施形態では、ヒドロゲルは、例えばネットワーク構造で、少なくとも部分的に親水性のポリマー、超吸収性ポリマー、または生体高分子を有することができる。一部の実施形態では、例えば、ヒドロゲルは、ヒドロゲル重量の約１０倍以上、ヒドロゲル重量の約５０倍以上、またはヒドロゲル重量の約１００倍以上の水を吸収することができる。「ヒドロゲル形成剤」という用語は、本明細書では「ヒドロゲル前駆体」とも呼ばれ、本明細書に開示されるヒドロゲルを作製するために使用することができる任意の化合物を指すことができる。 The term "effective amount" or "therapeutically effective amount" refers to an amount sufficient to produce a beneficial or desired biological and/or clinical result.
"Hydrogel" can refer to an at least partially hydrophilic material characterized by high water absorption. In some embodiments, the hydrogel can have at least partially hydrophilic polymers, superabsorbent polymers, or biopolymers, eg, in a network structure. In some embodiments, for example, the hydrogel can absorb about 10 times the weight of the hydrogel or more, about 50 times the weight of the hydrogel or more, or about 100 times the weight of the hydrogel or more. The term "hydrogel former," also referred to herein as a "hydrogel precursor," can refer to any compound that can be used to make the hydrogels disclosed herein.

ある特定の実施形態では、「弾性」、「粘弾性」、「応力緩和度」、「応力緩和」、および／または「緩和」という用語は、本明細書に開示される組成物および／または組成物の特徴もしくは状態を説明するために交換可能に使用することができる。 In certain embodiments, the terms "elastic," "viscoelastic," "stress relaxivity," "stress relaxation," and/or "relaxation" refer to the compositions and/or compositions disclosed herein. Can be used interchangeably to describe a characteristic or condition of something.

ある特定の実施形態では、「第１のポリマーネットワーク」は、「第１のポリマー主鎖」と呼ぶことができる。ある特定の実施形態では、「第２のポリマーネットワーク」は、「第２のポリマー主鎖」と呼ぶことができる。ある特定の実施形態では、「ヒドロゲル」は「ハイブリッドネットワークヒドロゲル」と呼ぶことができ、その逆も同様である。 In certain embodiments, the "first polymer network" can be referred to as the "first polymer backbone." In certain embodiments, the "second polymer network" can be referred to as the "second polymer backbone." In certain embodiments, a "hydrogel" can be referred to as a "hybrid network hydrogel" and vice versa.

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
（発明の詳細な説明）
以下のセクションでは、本発明の特定の実施形態を詳述するために、ある特定の例示的な組成物および方法について説明する。ある特定の実施形態を実施するのに、本明細書に概説した特定の詳細の全部あるいは一部を採用する必要はなく、濃度、時間、および他の特定の詳細は定型的実験を通じて改変することができることが当業者には明らかであろう。場合によっては、周知の方法、または構成成分が説明に含まれていないことがある。 Unless otherwise defined, all technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs.
(Detailed description of the invention)
The following sections describe certain exemplary compositions and methods to detail certain embodiments of the invention. It is not necessary to employ all or some of the specific details outlined herein to practice a particular embodiment, and concentrations, times, and other specific details may be modified through routine experimentation. It will be obvious to those skilled in the art that this can be done. In some cases, well-known methods or components may not be included in the description.

本開示の実施形態は、本明細書に開示される健康状態の処置においてヒドロゲル（例えば、ハイブリッドネットワークヒドロゲル）を生成および使用するための新規組成物、方法、およびシステムに関する。一部の実施形態では、ヒドロゲルは、少なくとも１種または２種以上のヒドロゲル形成剤を使用して；１種または複数のタイプのヒドロゲル形成剤を水性媒体中で硬化または固化させて、三次元ネットワークを形成することによって形成することができる。ある特定の実施形態では、三次元ネットワークの形成により、１種または複数のタイプのヒドロゲル形成剤によって、本明細書に開示される組成物および方法で使用されるヒドロゲル複合体をゲル形成させることができる。 Embodiments of the present disclosure relate to novel compositions, methods, and systems for producing and using hydrogels (e.g., hybrid network hydrogels) in the treatment of the health conditions disclosed herein. In some embodiments, hydrogels are formed using at least one or more hydrogel formers; the one or more types of hydrogel formers are cured or solidified in an aqueous medium to create a three-dimensional network. It can be formed by forming. In certain embodiments, one or more types of hydrogel forming agents can cause hydrogel composites used in the compositions and methods disclosed herein to gel due to the formation of a three-dimensional network. can.

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも１種のポリマー材料を含むことができる。これらの実施形態によれば、ポリマー材料は、天然ポリマー材料、合成ポリマー材料、およびそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法での使用に好適なポリマーは、ホモポリマーおよび／またはヘテロポリマーであり得る。これらの実施形態によれば、ポリマーは、限定されるものではないが、任意のコモノマー分布のクロスポリマーまたはコポリマーを含むことができ、直鎖状、分岐鎖状、超分岐鎖状、デンドリマー状、または任意の程度に架橋されたものであり得る。 In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can include at least one polymeric material. According to these embodiments, the polymeric material can be a natural polymeric material, a synthetic polymeric material, and combinations thereof. In other embodiments, polymers suitable for use in the compositions, combination compositions and methods disclosed herein can be homopolymers and/or heteropolymers. According to these embodiments, the polymer can include, but is not limited to, crosspolymers or copolymers of any comonomer distribution, including linear, branched, hyperbranched, dendrimeric, or may be crosslinked to any degree.

ある特定の実施形態では、好適なポリマーとしては、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸の塩、ポリメタクリル酸の塩、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、例としてポリ（メタクリル酸）無水物、ポリ（アクリル）無水物、ポリセバシン酸無水物（ｐｏｌｙｓｅｂａｓｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、コラーゲン、ポリ（ヒアルロン酸）、ヒアルロン酸含有ポリマーおよびコポリマー、ポリペプチド、デキストラン、硫酸デキストラン、キトサン、キチン、アガロースゲル、フィブリンゲル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法での使用に好適なポリマーは、親水性ポリマーであり得る。ある特定の実施形態では、親水性ポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキサゾリン、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリプロピレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはそれらの混合物もしくはコポリマー、が挙げられるが、これらに限定されない。 In certain embodiments, suitable polymers include gelatin, methylcellulose, hydroxymethylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyethylene oxide, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, salts of polyacrylic acid, salts of polymethacrylic acid. , poly(2-hydroxyethyl methacrylate), polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinyl alcohol, polyanhydride, such as poly(methacrylic acid) anhydride, poly(acrylic) anhydride, polysebasic anhydride, Examples include, but are not limited to, collagen, poly(hyaluronic acid), hyaluronic acid-containing polymers and copolymers, polypeptides, dextran, dextran sulfate, chitosan, chitin, agarose gels, fibrin gels, and combinations thereof. In other embodiments, polymers suitable for use in the compositions, combination compositions and methods disclosed herein can be hydrophilic polymers. In certain embodiments, the hydrophilic polymers include poly(ethylene glycol), polyoxazoline, polyaliphatic polyurethane, polyether polyurethane, polyester polyurethane, polyethylene copolymer, polyamide, polyvinyl alcohol, poly(ethylene oxide), polypropylene oxide, Examples include, but are not limited to, polypropylene glycol, polytetramethylene oxide, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, poly(hydroxyethyl acrylate), poly(hydroxyethyl methacrylate), or mixtures or copolymers thereof.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、上記で参照したポリマーに加えて、合成ポリマーポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含有することができる、またはさらに含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法で使用するためのＰＥＧは、ＰＥＧコアデンドリマー、ＰＥＧブロックコポリマー、またはマルチアームＰＥＧであり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法で使用するためのマルチアームＰＥＧは、３アームＰＥＧ、４アームＰＥＧ、６アームＰＥＧ、または８アームＰＥＧであり得る。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、官能化マルチアームＰＥＧを含有することができる。一部の実施形態では、官能化マルチアームＰＥＧは、分子内に１つまたは複数のペンダント官能基を導入するために化学的に修飾されたマルチアームＰＥＧを含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ひずみシクロオクチンで官能化されたマルチアームＰＥＧを含有することができる。これらの実施形態によれば、ひずみシクロオクチンの非限定的な例としては、アザ－ジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）、ビシクロノニン（ＢＣＮ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、（ＯＣＴ）、アリールレスオクチン（ＡＬＯ）、モノフッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、またはジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）部分、が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ビシクロノニン（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ））で官能化されたマルチアームＰＥＧを含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲル組成物または組み合わせ組成物は、ビシクロノニンで官能化された８アームＰＥＧを含むことができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain, or can further contain, in addition to the polymers referenced above, the synthetic polymer poly(ethylene glycol) (PEG). . In some embodiments, PEG for use in the compositions, combination compositions and methods disclosed herein can be a PEG core dendrimer, a PEG block copolymer, or a multi-arm PEG. In certain embodiments, the multi-arm PEG for use in the compositions, combination compositions and methods disclosed herein is a 3-arm PEG, a 4-arm PEG, a 6-arm PEG, or an 8-arm PEG. obtain. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain functionalized multi-arm PEGs. In some embodiments, a functionalized multi-arm PEG can include a multi-arm PEG that is chemically modified to introduce one or more pendant functional groups within the molecule. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain multi-arm PEG functionalized with strained cyclooctyne. According to these embodiments, non-limiting examples of strained cyclooctynes include aza-dibenzocyclooctyne (ADIBO), bicyclononine (BCN), dibenzocyclooctyne (DIBO), (OCT), aryllessoctyne (ALO). ), monofluorinated cyclooctyne (MOFO), difluorinated cyclooctyne (DIFO), biarylazacycloocthinone (BARAC), or dimethoxyazacyclooctyne (DIMAC) moieties. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein are functionalized with bicyclononine ((1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl (BCN)). It can contain conjugated multi-arm PEGs. In some embodiments, the hydrogel compositions or combination compositions disclosed herein can include an 8-arm PEG functionalized with bicyclononine.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ヒアルロン酸（ＨＡ）を含有することができる。ＨＡは、多くの軟結合組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内の非硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの交互単位で構成され、分子量（ＭＷ）が最大約６ＭＤａであり、交互のβ－１，４およびβ－１，３グリコシド結合を介して連結されている。一部の実施形態では、ＨＡは、限定されるものではないが脊椎動物の結合組織を含む天然組織、ヒト臍帯および鶏のとさかから抽出することができる。他の実施形態では、ＨＡは、例えば、感染性病原体を対象に移す潜在的なリスクを最小限に抑え、製品の均一性、品質、および／または入手可能性を増大させるために、微生物学的方法によって調製することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、官能化ＨＡを含有することができる。官能化ＨＡには、化学的に修飾された官能化ＨＡを含めることができる。ある特定の実施形態では、官能化ＨＡは、分子内に１つまたは複数のペンダント官能基を導入するために化学的に修飾された官能化ＨＡを含むことができる。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される官能化ＨＡは、ＨＡ主鎖上に官能化された少なくとも１つのアルデヒド基を有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示される官能化ＨＡは、ＨＡ主鎖上に官能化された少なくとも１つのヒドラジド基を有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示される官能化ＨＡは、ＨＡ主鎖上に２種以上の薬剤群を有することができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain hyaluronic acid (HA). HA is a non-sulfated glycosaminoglycan (GAG) within the extracellular matrix (ECM) of many soft connective tissues and is composed of alternating units of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, with a molecular weight of (MW) up to approximately 6 MDa and are linked via alternating β-1,4 and β-1,3 glycosidic bonds. In some embodiments, HA can be extracted from natural tissue including, but not limited to, vertebrate connective tissue, human umbilical cord, and chicken comb. In other embodiments, the HA is applied to microbiologically It can be prepared by a method. In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain functionalized HA. Functionalized HA can include chemically modified functionalized HA. In certain embodiments, the functionalized HA can include functionalized HA that has been chemically modified to introduce one or more pendant functional groups within the molecule. In yet other embodiments, the functionalized HA disclosed herein can have at least one aldehyde group functionalized on the HA backbone. In other embodiments, the functionalized HA disclosed herein can have at least one hydrazide group functionalized on the HA backbone. In other embodiments, the functionalized HA disclosed herein can have more than one drug group on the HA backbone.

一部の実施形態では、本明細書に開示されるＨＡ主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせは、少なくとも１種のペプチドでさらに修飾することができる。これらの実施形態によれば、ペプチドは、約２アミノ酸～約５０アミノ酸；約２アミノ酸～約４０アミノ酸、または約２アミノ酸～約３０アミノ酸、または１０アミノ酸未満のペプチド長を含むことができる。他の実施形態では、ＨＡ主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせを修飾して、細胞接着ペプチドをさらに含むことができる。本明細書で使用される場合、「細胞接着ペプチド」は、受容体－リガンド相互作用を介して細胞が結合する接着タンパク質から得られるアミノ酸配列を指すことができる。これらの実施形態によれば、溶液中の細胞接着ペプチドおよびその濃度を変化させることにより、得られるヒドロゲル組成物への細胞付着の安定性を制御する可能性を考慮に入れることができる。一部の実施形態では、細胞接着ペプチドは、約１μＭ～約１０ｍＭの最終ヒドロゲル濃度を有することができる。一部の実施形態では、細胞接着ペプチドは、約１μＭ、または約５０μＭ、または約１００μＭ、または約５００μＭ、または約１ｍＭ、または約２ｍＭ、または約５ｍＭ、または最大約１０ｍＭ、または本明細書に開示される範囲内の任意の濃度の最終ヒドロゲル濃度を有することができる。 In some embodiments, the HA backbone, PEG macromer, or combination thereof disclosed herein can be further modified with at least one peptide. According to these embodiments, the peptide can include a peptide length of about 2 amino acids to about 50 amino acids; about 2 amino acids to about 40 amino acids, or about 2 amino acids to about 30 amino acids, or less than 10 amino acids. In other embodiments, the HA backbone, PEG macromer, or a combination thereof can be modified to further include a cell adhesion peptide. As used herein, "cell adhesion peptide" can refer to amino acid sequences derived from adhesion proteins to which cells bind via receptor-ligand interactions. According to these embodiments, by varying the cell adhesion peptide in solution and its concentration, one can take into account the possibility of controlling the stability of cell attachment to the resulting hydrogel composition. In some embodiments, the cell adhesion peptide can have a final hydrogel concentration of about 1 μM to about 10 mM. In some embodiments, the cell adhesion peptide is about 1 μM, or about 50 μM, or about 100 μM, or about 500 μM, or about 1 mM, or about 2 mM, or about 5 mM, or up to about 10 mM, or as disclosed herein. The final hydrogel concentration can be any concentration within the range specified.

一部の実施形態では、「細胞接着ペプチド」は、インテグリン結合のためのペプチドリガンドを含むことができる。インテグリン結合に好適なペプチドリガンドとしては、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＣＲＧＤＳ（配列番号２）、ＣＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ＰＨＳＲＮ（配列番号４）、ＧＷＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号５）、ＲＧＤＳＰＧＥＲＣＧ（配列番号６）、ＫＲＧＤＳ（配列番号８）、が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で使用されるインテグリン結合のためのペプチドリガンドは、ベンズアルデヒド官能化ＲＧＤペプチドであり得る。一部の実施形態では、本明細書で使用するために開示されるインテグリン結合のためのペプチドリガンドは、ベンズアルデヒド－ＫＧＲＧＤＳ（配列番号７）であり得る。一部の実施形態では、インテグリン結合のためのペプチドリガンドは、約１μＭ～約１０ｍＭ、または約５００μＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭ～約２ｍＭの最終ヒドロゲル濃度を有することができる。 In some embodiments, a "cell adhesion peptide" can include a peptide ligand for integrin binding. Peptide ligands suitable for integrin binding include, for example, RGD, RGDS (SEQ ID NO: 1), CRGDS (SEQ ID NO: 2), CRGDSP (SEQ ID NO: 3), PHSRN (SEQ ID NO: 4), GWGGRGDSP (SEQ ID NO: 5), RGDSPGERCG (SEQ ID NO: 6) and KRGDS (SEQ ID NO: 8). In some embodiments, the peptide ligand for integrin binding used herein can be a benzaldehyde-functionalized RGD peptide. In some embodiments, a peptide ligand for integrin binding disclosed for use herein can be benzaldehyde-KGRGDS (SEQ ID NO: 7). In some embodiments, the peptide ligand for integrin binding can have a final hydrogel concentration of about 1 μM to about 10 mM, or about 500 μM to about 5 mM, or about 1 mM to about 2 mM.

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ハイブリッドネットワークヒドロゲルを含むことができる。これらの実施形態によれば、ハイブリッドネットワークヒドロゲルは、例えば、単一のヒドロゲル複合体を形成する２つのポリマー主鎖から形成されたヒドロゲルを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含むことができる。これらの実施形態によれば、２つのポリマー主鎖は、各ポリマー主鎖が固有のポリマー構成成分、特性、特徴を有し、および／または反対の機械的特性を有するヒドロゲルを含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、剛直で脆弱なネットワークをもたらすポリマー主鎖、または柔軟で延性のあるネットワークをもたらすポリマー主鎖を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖は、本明細書に開示される組み合わせポリマー含有ヒドロゲルを生成するために使用するために、本明細書に記載される化合物およびポリマーのいずれかを使用することができる。 In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can include hybrid network hydrogels. According to these embodiments, hybrid network hydrogels include, for example, hydrogels formed from two polymer backbones forming a single hydrogel complex. In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can include at least two polymer backbones. According to these embodiments, the two polymer backbones may include hydrogels in which each polymer backbone has unique polymer constituents, properties, characteristics, and/or opposite mechanical properties. , but not limited to. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain polymeric backbones that provide a rigid and brittle network, or polymeric backbones that provide a flexible and ductile network. In some embodiments, the two polymer backbones disclosed herein are combined with a compound described herein for use in producing a combined polymer-containing hydrogel disclosed herein. and polymers can be used.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および使用のポリマー主鎖は、少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を含むことができる。これらの実施形態によれば、ポリマー主鎖は、少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）主鎖を含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、ＨＡ主鎖上で官能化されたヒドラジド基を含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、ＨＡ主鎖上で官能化されたアルデヒド基を含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、アルデヒド基を有する少なくとも１つの官能化ＨＡ主鎖およびヒドラジド基を有する少なくとも１つの官能化ＨＡ主鎖を含むことができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、ヒドラジド基とアルデヒド基との間に少なくとも１つのヒドラゾン結合が形成される、アルデヒド基を有する官能化ＨＡ主鎖とヒドラジド基を有する官能化ＨＡ主鎖との組み合わせを含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、ポリマー主鎖は、粘弾性ＨＡゲルを形成する官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間のヒドラゾン結合を含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書で言及される「粘弾性」は、変形を受けるときに粘性性質と弾性性質の両方を示す材料の特性を指すことができる。一部の実施形態では、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間にヒドラゾン結合を有する本明細書に開示されるポリマー主鎖は、柔軟で延性のあるネットワークをもたらすポリマー主鎖であり得る。 In some embodiments, the polymeric backbones of the compositions, combination compositions and uses disclosed herein can include at least one hyaluronic acid backbone. According to these embodiments, the polymer backbone can include, but is not limited to, at least one functionalized hyaluronic acid (HA) backbone. In certain embodiments, the polymer backbones disclosed herein can include, but are not limited to, hydrazide groups functionalized on the HA backbone. In some embodiments, the polymer backbones disclosed herein can include, but are not limited to, functionalized aldehyde groups on the HA backbone. In certain embodiments, the polymer backbones disclosed herein can include at least one functionalized HA backbone having an aldehyde group and at least one functionalized HA backbone having a hydrazide group. , but not limited to. In certain embodiments, the polymer backbone disclosed herein comprises a functionalized HA backbone with an aldehyde group and a hydrazide group, such that at least one hydrazone bond is formed between the hydrazide group and the aldehyde group. can include, but are not limited to, combinations with functionalized HA backbones having . In some embodiments, the polymer backbone can include, but is not limited to, hydrazone linkages between hydrazide and aldehyde groups of the functionalized HA backbone to form a viscoelastic HA gel. In certain embodiments, "viscoelastic" as referred to herein can refer to the property of a material exhibiting both viscous and elastic properties when subjected to deformation. In some embodiments, the polymer backbone disclosed herein having hydrazone linkages between the hydrazide and aldehyde groups of the functionalized HA backbone is a polymer backbone that provides a flexible and ductile network. could be.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、少なくとも１つの官能化８アームＰＥＧを含むことができるが、これに限定されない。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、ビシクロノニンで官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧ（ＰＥＧ－ＢＣＮ）を含むことができるが、これに限定されない。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法における本明細書のポリマー主鎖は、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された少なくとも１つの結合を有する、ビシクロノニン（ＢＣＮ）で官能化された８アームＰＥＧと、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドとの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖としては、ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された結合を有し、剛直で脆弱なネットワーを有するポリマー主鎖を生じるポリマー主鎖が挙げられるが、これに限定されない。 In some embodiments, the polymer backbone in the compositions and methods of use disclosed herein can include, but are not limited to, at least one 8-arm PEG. In certain non-limiting embodiments, the polymer backbone in the compositions and methods of use disclosed herein can include at least one functionalized 8-arm PEG. In other embodiments, the polymer backbone in the compositions and methods of use disclosed herein can include at least one 8-arm PEG functionalized with bicyclononine (PEG-BCN); Not limited. In other embodiments, the polymer backbone herein in the compositions and methods of use disclosed herein can include, but are not limited to, benzaldehyde-PEG3-azide. In some embodiments, the polymer backbone in the compositions and methods of use disclosed herein is a bicyclononine having at least one bond formed between BCN and the azide group of benzaldehyde-PEG3-azide. (BCN) functionalized 8-arm PEG in combination with benzaldehyde-PEG3-azide. In certain embodiments, the polymer backbone in the compositions and methods of use disclosed herein has a bond formed between BCN and the azide group of benzaldehyde-PEG3-azide, and is rigid. Examples include, but are not limited to, polymer backbones that result in polymer backbones with weak networks.

ある特定の実施形態では、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを最初にＨＡ－ヒドラジドにコンジュゲートさせることができる。これらの実施形態によれば、ＨＡ－アルデヒドとＨＡ－ヒドラジド（ここでベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを含有する）を組み合わせることができる。一部の実施形態では、次に、ＰＥＧ－ＢＣＮを、ＨＡ－アルデヒドとＨＡ－ヒドラジドとの組み合わせに加えることができ、ここで、ＨＡ－ヒドラジドは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを含有する。 In certain embodiments, benzaldehyde-PEG3-azide can be first conjugated to HA-hydrazide. According to these embodiments, HA-aldehyde and HA-hydrazide (here containing benzaldehyde-PEG3-azide) can be combined. In some embodiments, PEG-BCN can then be added to the combination of HA-aldehyde and HA-hydrazide, where the HA-hydrazide contains benzaldehyde-PEG3-azide.

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間にヒドラゾン結合を有するポリマー主鎖；およびＰＥＧ－ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された結合を有するポリマー主鎖を含有することができる。ある特定の実施形態では、これらの参照された組み合わせポリマー主鎖を有する本明細書に開示されるヒドロゲルによって、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドがＨＡ主鎖上でヒドラジドと反応する場合に、ヒドラジドとベンズアルデヒドとの間にほぼ、または本質的に不可逆的な結合の形成が生じ得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖（例えば、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間にヒドラゾン結合を有する本明細書のポリマー主鎖、およびＰＥＧ－ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された結合を有する本明細書に記載のポリマー主鎖）を使用して形成することができ、ここで、ゲルの形成にはゲルの安定化のための外部刺激は必要ではない。一部の実施形態では、開示された２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約２～約１０分でゲル化するかまたはゲルを形成することができる。これらの実施形態によれば、開示された２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約２分以下、約３分以下、約４分以下、約５分以下、約６分以下、約７分以下、約８分以下、約９分以下、または約１０分以下、または最長約３０分以下で、ゲル化するか、またはゲルを形成することができる。 In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain at least two polymer backbones. According to these embodiments, the hydrogels disclosed herein have at least two polymer backbones, a polymer backbone having hydrazone linkages between the hydrazide and aldehyde groups of the functionalized HA backbone; and PEG -BCN and the azide group of benzaldehyde-PEG3-azide. In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein having these referenced combination polymer backbones allow the combination of hydrazide and benzaldehyde when benzaldehyde-PEG3-azide is reacted with hydrazide on the HA backbone. Formation of a nearly or essentially irreversible bond may occur between the two. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein include at least two polymer backbones (e.g., polymers herein having hydrazone linkages between the hydrazide and aldehyde groups of the functionalized HA backbone). The polymer backbone described herein with a backbone and a bond formed between the azide group of PEG-BCN and benzaldehyde-PEG3-azide) can be used to form a gel. Formation does not require external stimulation for gel stabilization. In some embodiments, the disclosed hydrogels having two polymer backbones can gel or form a gel in about 2 to about 10 minutes. According to these embodiments, the disclosed hydrogels having two polymer backbones can be manufactured for less than or equal to about 2 minutes, less than or equal to about 3 minutes, less than or equal to about 4 minutes, less than or equal to about 5 minutes, less than or equal to about 6 minutes, less than or equal to about 7 minutes. , about 8 minutes or less, about 9 minutes or less, or about 10 minutes or less, or up to about 30 minutes or less.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有する本明細書に開示される任意のヒドロゲルまたはヒドロゲルの組み合わせは、約１０日間以上、約１５日間以上、約１か月間以上、約２か月間以上、約３か月間以上、約４か月間以上、約５か月間以上、または約６か月間安定であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有する本明細書に開示される任意のヒドロゲルまたはヒドロゲルの組み合わせは、約１５日間～約６か月間以上安定であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、時間の経過とともに分解する可能性がある。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約１５日～約６か月にわたって分解する可能性がある。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約１０日以上、約１５日以上、約１か月以上、約２か月以上、約３か月以上、約４か月以上、約５か月以上、または約６か月にわたって分解する可能性がある。 In certain embodiments, any hydrogel or combination of hydrogels disclosed herein having two polymer backbones disclosed herein can be used for about 10 days or more, about 15 days or more, about 1 or more days. It may be stable for more than 1 month, about 2 months or more, about 3 months or more, about 4 months or more, about 5 months or more, or about 6 months. In certain embodiments, any hydrogel or combination of hydrogels disclosed herein having two polymer backbones disclosed herein can be stable for about 15 days to about 6 months or more. . In some embodiments, the hydrogels with two polymer backbones disclosed herein can degrade over time. In certain embodiments, the hydrogels with two polymer backbones disclosed herein can degrade over a period of about 15 days to about 6 months. In certain embodiments, the hydrogels having two polymer backbones disclosed herein can be used for at least about 10 days, at least about 15 days, at least about 1 month, at least about 2 months, at least about 3 months. In other words, it may decompose over a period of about 4 months or more, about 5 months or more, or about 6 months.

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、異なる比率で少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、約１：２、または約１：３、または約１：４、または他の所定の比率の異なる比率で少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができ、約３００～約５００Ｐａ；約３５０～約５００Ｐａ；約３５０～約４７５Ｐａ；または約３５０～約４５０Ｐａの剪断貯蔵弾性率を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができ、約４００Ｐａの剪断貯蔵弾性率を有することができる。 In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain at least two polymer backbones in different ratios. According to these embodiments, the hydrogels disclosed herein include at least two polymeric bases in different ratios of about 1:2, or about 1:3, or about 1:4, or other predetermined ratios. can contain chains. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain at least two polymer backbones and have about 300 to about 500 Pa; about 350 to about 500 Pa; about 350 to about 475 Pa; or about 350 Pa to about 500 Pa; It can have a shear storage modulus of ˜450 Pa. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain at least two polymer backbones and can have a shear storage modulus of about 400 Pa.

他の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、剛直で脆弱なネットワークを生成することができる一方、本明細書に開示される別のポリマー主鎖は、柔軟で延性のあるネットワークを生成することができ、２つのポリマー主鎖の比率は、所望の剛性、柔らかいまたは柔軟なネットワークのためのゲルの特性に影響を与える場合がある。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を、本明細書で選択され開示されるポリマーの約１：１の比、約１：２の比、約１：３の比、約１：４の比、または約１：５の比で含有することができる。 In other embodiments, the polymer backbones disclosed herein can produce a rigid, brittle network, while other polymer backbones disclosed herein can be flexible and ductile. The ratio of the two polymer backbones can influence the properties of the gel for the desired stiffness, soft or flexible network. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein combine two polymer backbones of the polymers selected and disclosed herein in a ratio of about 1:1, a ratio of about 1:2, a ratio of about They can be included in a 1:3 ratio, about a 1:4 ratio, or about a 1:5 ratio.

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ここで、１つのポリマー主鎖は、ヒドロゲル内の総架橋濃度の約１％～約９９％または約１％～約５０％で存在し得る、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間の粘弾性ヒドラゾン結合を含む。他の実施形態では、他のポリマー主鎖または第２のポリマー主鎖は、総架橋濃度の約１％～約９９％、または約１％～約５０％で存在することができる、ＢＣＮとＰＥＧ－ＢＣＮおよびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された弾性結合を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ここで、１つのポリマー主鎖は、総架橋濃度の約１０％～約２５％で存在することができる、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間の粘弾性ヒドラゾン結合を含有する。一部の実施形態では、本明細書の他のポリマー主鎖または第２のポリマー主鎖は、総架橋濃度の約７５％～約９０％で存在することができる、ＢＣＮとＰＥＧ－ＢＣＮおよびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された弾性結合を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ここで、１つのポリマー主鎖は、総架橋濃度の約２５％で存在することができる、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間の粘弾性ヒドラゾン結合を含有する。一部の実施形態では、本明細書で開示される他のポリマー主鎖または第２のポリマー主鎖は、総架橋濃度の約７５％で存在することができる、ＢＣＮとＰＥＧ－ＢＣＮおよびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された弾性結合を含有することができる。 In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can include two polymer backbones, where one polymer backbone is about 1% to about 1% of the total crosslinking concentration within the hydrogel. 99% or about 1% to about 50% of viscoelastic hydrazone linkages between the hydrazide and aldehyde groups of the functionalized HA backbone. In other embodiments, the other polymer backbone or second polymer backbone can be present from about 1% to about 99%, or from about 1% to about 50% of the total crosslinking concentration, such as BCN and PEG. -BCN and the azide group of benzaldehyde-PEG3-azide. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can have two polymer backbones, where one polymer backbone accounts for about 10% to about 25% of the total crosslinking concentration. Contains viscoelastic hydrazone bonds between the hydrazide and aldehyde groups of the functionalized HA backbone, which may be present. In some embodiments, the other polymer backbone or second polymer backbone herein can be BCN and PEG-BCN and benzaldehyde, which can be present at about 75% to about 90% of the total crosslinking concentration. -PEG3-can contain an elastic bond formed between the azide group of azide. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can have two polymer backbones, where one polymer backbone can be present at about 25% of the total crosslink concentration. The functionalized HA contains viscoelastic hydrazone bonds between the hydrazide and aldehyde groups of the backbone. In some embodiments, the other polymer backbone or second polymer backbone disclosed herein can be present at about 75% of the total crosslinking concentration, BCN and PEG-BCN and benzaldehyde- It can contain an elastic bond formed between the azide group of PEG3-azide.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも５％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができ、官能化ＨＡヒドラジドアームの少なくとも約９５％をベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、約５％～約１００％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができ、官能化ＨＡ－ヒドラジドアームの約９５％～約０％をベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、約５％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または１００％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、官能化ＨＡ－ヒドラジドアームを含有することができ、官能化ＨＡ－ヒドラジドアームの１００％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または０％を、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、１００％、約８８％、約７５％、約５０％、約２５％、約１５％、約５％、または０％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain at least 5% alkylhydrazone linkages, and at least about 95% of the functionalized HA hydrazide arms are functionalized with benzaldehyde-PEG-azide. can do. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain about 5% to about 100% alkylhydrazone linkages, with about 95% to about 0% of the functionalized HA-hydrazide arms It can be functionalized with benzaldehyde-PEG-azide. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein are about 5%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 99%, or 100% alkylhydrazone linkage can contain. According to these embodiments, the hydrogels disclosed herein can contain functionalized HA-hydrazide arms, including 100%, about 1%, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70% , about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, or 0% can be functionalized with benzaldehyde-PEG-azide. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein contain 100%, about 88%, about 75%, about 50%, about 25%, about 15%, about 5%, or 0% alkyl hydrazone. It can contain bonds.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、用量依存的にヒドロゲルの応力緩和が増大し得る、２つのポリマー主鎖を含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、用量依存的にゲルの応力緩和が低減し得る、２つのポリマー主鎖を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、用量依存的にゲルの応力緩和の時定数が増大し得る、２つのポリマー主鎖を有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、ヒドロゲル形成が起こるまでの時間を延長することができる、２つのポリマー主鎖を含むことができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can include two polymeric backbones such that increasing the concentration of benzaldehyde-PEG3-azide can increase the stress relaxation of the hydrogel in a dose-dependent manner. can. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can have two polymer backbones such that increasing the concentration of benzaldehyde-PEG3-azide can reduce stress relaxation of the gel in a dose-dependent manner. . In some embodiments, the hydrogels disclosed herein have two polymer backbones that can increase the stress relaxation time constant of the gel in a dose-dependent manner as the concentration of benzaldehyde-PEG3-azide increases. can have In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can include two polymer backbones that can extend the time for hydrogel formation to occur as the concentration of benzaldehyde-PEG3-azide increases. can.

他の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖から生成されるヒドロゲルは、約０．５～約２０００Ｐａのヤング率を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖から生成されるヒドロゲルは、約０．５Ｐａ～約２０００Ｐａ、または約０．５Ｐａ、約１０Ｐａ、約５０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１２５０Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１７５０Ｐａ、または約２０００Ｐａのヤング率を含むことができる。 In other embodiments, hydrogels produced from two polymer backbones disclosed herein can include a Young's modulus of about 0.5 to about 2000 Pa. In some embodiments, the hydrogels produced from two polymer backbones disclosed herein have a pressure of about 0.5 Pa to about 2000 Pa, or about 0.5 Pa, about 10 Pa, about 50 Pa, about 100 Pa, about It can include a Young's modulus of 200 Pa, about 300 Pa, about 400 Pa, about 500 Pa, about 600 Pa, about 700 Pa, about 800 Pa, about 900 Pa, about 1000 Pa, about 1250 Pa, about 1500 Pa, about 1750 Pa, or about 2000 Pa.

一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは多孔質であり得る。他の実施形態では、細孔はヒドロゲル全体に均質に分散させることができる。一部の実施形態では、細孔はヒドロゲル全体に不均質に分散させることができる。さらに他の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、ミクロンサイズの細孔を含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に記載されるヒドロゲルは、約０．１μｍ～約９００μｍ、約１μｍ～約５００μｍ、または約１０μｍ～約２５０μｍ、または約１００μｍ～約２００μｍのおよその直径を有する細孔を含むことができる。 In some embodiments, the hydrogels described herein can be porous. In other embodiments, the pores can be homogeneously distributed throughout the hydrogel. In some embodiments, the pores can be distributed heterogeneously throughout the hydrogel. In yet other embodiments, the hydrogels described herein can include micron-sized pores. According to these embodiments, the hydrogels described herein have an approximate diameter of about 0.1 μm to about 900 μm, about 1 μm to about 500 μm, or about 10 μm to about 250 μm, or about 100 μm to about 200 μm. It can include pores having pores.

ある特定の実施形態では、限定されるものではないが、本明細書に開示される複合ヒドロゲルまたは組み合わせヒドロゲルを含むヒドロゲルを医薬組成物に製剤化することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示される１種または複数のヒドロゲルまたはヒドロゲル複合体を含有する医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことができる。本発明の方法で使用される医薬組成物のいずれも、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。 In certain embodiments, hydrogels, including but not limited to the composite or combination hydrogels disclosed herein, can be formulated into pharmaceutical compositions. According to these embodiments, the pharmaceutical composition containing one or more hydrogels or hydrogel complexes disclosed herein further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient. be able to. Any of the pharmaceutical compositions used in the methods of the invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution.

医薬組成物中の担体は、組成物の活性成分と適合し、好ましくは活性成分を安定化することができ、処置される対象に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。例えば、「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容可能であり、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に通常好ましくない反応を生じないものを含む、組成物の分子実体および他の構成成分を指すことができる。いくつかの例では、本明細書に開示される医薬組成物で使用される「薬学的に許容される」担体は、哺乳動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦または州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方または一般に認められている他の薬局方に列挙されているものであり得ることを意味する。 A carrier in a pharmaceutical composition must be "acceptable" in the sense of being compatible with the active ingredient of the composition, preferably capable of stabilizing the active ingredient, and not deleterious to the subject being treated. . For example, "pharmaceutically acceptable" refers to molecular entities of the composition, including those that are physiologically acceptable and do not normally produce undesirable reactions when administered to a mammal (e.g., a human). and other components. In some instances, a "pharmaceutically acceptable" carrier used in the pharmaceutical compositions disclosed herein is a carrier that is approved by the federal or state government for use in mammals, more specifically humans. or may be listed in the United States Pharmacopeia or other generally accepted pharmacopoeia.

緩衝液を含む薬学的に許容される担体は当技術分野で周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；および他の炭水化物；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤、を含むことができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈＥｄ．（２０００）リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ社）編Ｋ．Ｅ．フーバー（Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）を参照のこと。 Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art, including buffers, phosphates, citrates, and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid and methionine; preservatives; Proteins such as serum albumin, gelatin, immunoglobulins; amino acids; hydrophobic polymers; monosaccharides; disaccharides; and other carbohydrates; metal complexes; and/or nonionic surfactants. For example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20 th Ed. (2000) edited by Lippincott Williams and Wilkins K. E. See K. E. Hoover.

一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物または製剤は、静脈内、関節内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、またはそれらの組み合わせなどの非経口投与用であり得る。そのような薬学的に許容される担体は、減菌液体、例として、水、および石油、動物、植物または合成油由来のものを含む油、例として、ピーナッツ油、大豆油、鉱油など、であり得る。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、特に注射液のために、液体担体として使用することができる。本明細書に開示される医薬組成物は、追加の構成成分、例えば、防腐剤、緩衝液、等張剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤または清澄剤、増粘剤をさらに含むことができる。本明細書に開示される医薬組成物は、単一の単位投薬量または複数投薬量形態でパッケージングすることができる。 In some embodiments, the pharmaceutical compositions or formulations disclosed herein are administered parenterally, such as by intravenous, intraarticular, intraventricular, intracisternal, intraparenchymal, or combinations thereof. It can be used for Such pharmaceutically acceptable carriers include sterile liquids, such as water, and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, and the like. could be. Saline solutions and aqueous dextrose, polyethylene glycol (PEG) and glycerol solutions can also be used as liquid carriers, particularly for injectable solutions. The pharmaceutical compositions disclosed herein further include additional components such as preservatives, buffers, isotonic agents, antioxidants and stabilizers, nonionic wetting or clarifying agents, thickening agents. be able to. The pharmaceutical compositions disclosed herein can be packaged in single unit dosage or multi-dose form.

本明細書に開示される非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を挙げることができる。水溶液は、好適に緩衝化することができる（好ましくは、ｐＨ３～９に）。減菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準製薬技術によって容易に達成される。 Formulations suitable for parenteral administration disclosed herein include aqueous and non-aqueous formulations that may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, and solutes that render the formulation isotonic with the blood of the intended recipient. sterile injectable solutions; and sterile aqueous and non-aqueous suspensions which may contain suspending agents and thickening agents. The aqueous solution can be suitably buffered (preferably to pH 3-9). The preparation of suitable parenteral formulations under sterile conditions is readily accomplished by standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art.

インビボ投与に使用される医薬組成物は、減菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。滅菌注射液は、一般に、必要に応じて、上記に列挙した他の種々の成分とともに適切な溶媒に、必要な量のヒドロゲルを組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製する。一般に、分散液は、減菌活性成分を、基礎的な分散媒体および上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技術であり、これにより、活性成分と任意の追加的な所望の成分を添加した粉末が、その事前に滅菌濾過された溶液から得られる。 Pharmaceutical compositions used for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished, for example, by filtration through a sterile filter membrane. Sterile injectable solutions are generally prepared by incorporating the hydrogel in the required amount in the appropriate solvent with various other ingredients enumerated above, as required, followed by filtered sterilization. Generally, dispersions are prepared by incorporating the sterilized active ingredient into a sterile vehicle that contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred preparation methods are vacuum drying and freeze-drying techniques, whereby the powder, to which the active ingredient and any additional desired ingredients have been added, is Obtained from a sterile filtered solution.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分も含むことができる。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して無毒であり、好ましくは不活性であり、許容される担体、希釈剤、およびアジュバントとしては、緩衝液、例としてリン酸塩、クエン酸塩、またはその他の有機酸塩；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例としてグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖、二糖、および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース、またはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／または非イオン性界面活性剤、例としてＴｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）またはポリエチレングリコール、が挙げられる。 In certain embodiments, the pharmaceutical compositions disclosed herein can also include other ingredients such as diluents and adjuvants. Acceptable carriers, diluents, and adjuvants are non-toxic to recipients at the doses and concentrations employed, and are preferably inert; , such as phosphates, citrates, or other organic acid salts; antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin, immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; Amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, such as glucose, mannose, or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; sodium and/or non-ionic surfactants, such as Tween®, Pluronic® or polyethylene glycol.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ヒドロゲルおよびハイブリッドネットワークヒドロゲル）のいずれかは、小分子、タンパク質ベース、抗体ベース、抗菌ベース、および細胞ベースの治療薬の足場材料または送達ビヒクルとして使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは幹細胞を含むことができる。本明細書での使用に好適な幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、および間葉系幹細胞または間葉系間質細胞を挙げることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むことができる。他の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、脂肪組織幹細胞、軟骨細胞組織幹細胞、骨細胞組織幹細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。本明細書での使用に好適な幹細胞は、当技術分野で知られている任意の供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、限定されないが、臍帯静脈からの内皮組織、***からの内皮組織、子宮内膜組織、ヒト胚性幹細胞、歯、皮膚および脂肪組織、または他の組織を含む、胚組織または成体組織から得ることができる。多能性細胞はまた、多能性を誘導することによって人工的に生成することができる。 In certain embodiments, any of the compositions described herein (e.g., hydrogels and hybrid network hydrogels) can be used as scaffolds for small molecule, protein-based, antibody-based, antimicrobial-based, and cell-based therapeutics. or can be used as a delivery vehicle. In certain embodiments, the hydrogels described herein can include stem cells. Non-limiting examples of stem cells suitable for use herein include embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, epithelial stem cells, skin stem cells, and mesenchymal or mesenchymal stem cells. Mention may be made of interstitial cells. In certain embodiments, the hydrogels described herein can include mesenchymal stem cells (MSCs). In other embodiments, the hydrogels described herein can include adipose tissue stem cells, chondrocyte tissue stem cells, bone tissue stem cells, or combinations thereof. Stem cells suitable for use herein can be obtained from any source known in the art. In certain embodiments, the stem cells include, but are not limited to, endothelial tissue from the umbilical vein, endothelial tissue from the foreskin, endometrial tissue, human embryonic stem cells, teeth, skin and adipose tissue, or other tissues. , can be obtained from embryonic or adult tissue. Pluripotent cells can also be generated artificially by inducing pluripotency.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞が集中したポケットを伴って、または所望のように、均質または不均質にヒドロゲル全体に分散した幹細胞を含むことができる。他の実施形態では、幹細胞は、本明細書に記載のヒドロゲルによって封入することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、約１０万幹細胞／ｍＬ～約４０００万幹細胞／ｍＬ、約５０万幹細胞／ｍＬ～約３０００万幹細胞／ｍＬ、約１００万幹細胞／ｍＬ～約２０００万幹細胞／ｍＬ、約１５０万幹細胞／ｍＬ～約１０００万幹細胞／ｍＬ、または約２００万幹細胞／ｍＬ～約２００万幹細胞／ｍＬを含むことができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can include stem cells with concentrated pockets of cells or distributed homogeneously or heterogeneously throughout the hydrogel, as desired. In other embodiments, stem cells can be encapsulated by the hydrogels described herein. In some embodiments, the hydrogels described herein contain about 100,000 stem cells/mL to about 40 million stem cells/mL, about 500,000 stem cells/mL to about 30 million stem cells/mL, about 1 million stem cells/mL It can include from about 20 million stem cells/mL, from about 1.5 million stem cells/mL to about 10 million stem cells/mL, or from about 2 million stem cells/mL to about 2 million stem cells/mL.

一部の実施形態では、２つのポリマー主鎖の比率は、限定されるものではないが、移動、広がり、増殖、および分化を含む、１つまたは複数の細胞機能に影響を与えるように調節することができる、本明細書に開示されるヒドロゲルを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度の減少により、用量依存的に幹細胞広がりを増大させることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を収容する、または有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つ以上のポリマー主鎖を含むことができ、２つ以上のポリマー主鎖の比率は、少なくとも１つの幹細胞の遊走を誘導または刺激して少なくとも１つの多核構造を形成するように調節または調整することができる。 In some embodiments, the ratio of the two polymer backbones is modulated to affect one or more cellular functions, including but not limited to migration, spreading, proliferation, and differentiation. including the hydrogels disclosed herein. In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein having at least one stem cell can have two polymer backbones, and decreasing the concentration of benzaldehyde-PEG3-azide increases the ability of the stem cells in a dose-dependent manner. Spread can be increased. In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein containing or having at least one stem cell can include two or more polymer backbones, and the ratio of the two or more polymer backbones is , can be modulated or conditioned to induce or stimulate the migration of at least one stem cell to form at least one multinucleated structure.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、それを必要とする対象に送達するための追加の成分を含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞をさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、処置される対象と同じまたは異なる起源の細胞をさらに含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、処置される、関連するまたは無関係の対象に由来する細胞をさらに含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞外マトリックスを沈着させる細胞をさらに含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、新生タンパク質沈着を有する細胞を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞の広がり、増殖、および／または生存に寄与し得る新生タンパク質沈着を有する細胞を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルはエキソソームを含むことができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can include additional components for delivery to a subject in need thereof. According to these embodiments, the hydrogels disclosed herein can further include cells. According to these embodiments, the hydrogels disclosed herein can further include cells of the same or different origin as the subject being treated. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can further include cells derived from a related or unrelated subject being treated. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can further include cells that deposit an extracellular matrix. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can include cells with nascent protein deposits. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can include cells with nascent protein deposits that can contribute to cell spreading, proliferation, and/or survival. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can include exosomes.

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、例えば、健康状態を処置するために対象に送達するために、１つまたは複数の健康状態に使用される幹細胞を含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書で使用する幹細胞としては、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、またはそれらの任意の組み合わせとを挙げることができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、骨髄から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、末梢血から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、臍帯血から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、羊膜組織から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、末梢血から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、脂肪組織から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、自己由来末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、歯、および／または骨髄から単離することができる。本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、本明細書に開示されるヒドロゲルで処置される同じ対象から得られる末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、および／または骨髄を指す。一部の他の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、同種異系末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、および／または骨髄から単離することができる。本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、本明細書に開示されるヒドロゲルで処置される対象と同じ種の異なる対象から得られる末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、および／または骨髄を指す。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein can include stem cells used for one or more health conditions, e.g., for delivery to a subject to treat the health condition. . According to these embodiments, stem cells as used herein can include hematopoietic stem cells (HSCs), mesenchymal stem cells (MSCs), endothelial progenitor cells (EPCs), or any combination thereof. . In some embodiments, stem cells used herein can be isolated from bone marrow. In some embodiments, stem cells used herein can be isolated from peripheral blood. In some embodiments, stem cells used herein can be isolated from umbilical cord blood. In some embodiments, stem cells used herein can be isolated from amniotic tissue. In some embodiments, stem cells used herein can be isolated from peripheral blood. In some embodiments, stem cells used herein can be isolated from adipose tissue. In some embodiments, stem cells used herein can be isolated from autologous peripheral blood, umbilical cord blood, amniotic tissue, adipose tissue, teeth, and/or bone marrow. As used herein, the term "autologous" refers to peripheral blood, umbilical cord blood, amniotic tissue, adipose tissue, and/or bone marrow obtained from the same subject being treated with the hydrogels disclosed herein. refers to In some other embodiments, the stem cells used herein can be isolated from allogeneic peripheral blood, umbilical cord blood, amniotic tissue, adipose tissue, and/or bone marrow. As used herein, the term "allogeneic" refers to peripheral blood, umbilical cord blood, amniotic tissue, fat, etc. obtained from a different subject of the same species as the subject to be treated with the hydrogels disclosed herein. Refers to tissue and/or bone marrow.

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞のタンパク質分泌に寄与し得る新生タンパク質沈着を有する細胞を含むことができる。これらの実施形態によれば、封入された細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ～約５．０μｍのタンパク質を分泌することができる。一部の実施形態では、内部に封入された細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ～約５．０μｍ、または０．５μｍ、約１．０μｍ、約１．５μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ、約３．０μｍ、約３．５μｍ、約４．０μｍ、約４．５μｍ、または約５．０μｍのタンパク質を分泌することができる。ある特定の実施形態では、タンパク質は、フィブロネクチンまたは他のＥＣＭ関連タンパク質を含むことができる。 In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can include cells with nascent protein deposits that can contribute to cellular protein secretion. According to these embodiments, the hydrogels disclosed herein with encapsulated cells can secrete proteins from about 0.5 μm to about 5.0 μm. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein having cells encapsulated therein are about 0.5 μm to about 5.0 μm, or 0.5 μm, about 1.0 μm, about 1.5 μm, Proteins about 2.0 μm, about 2.5 μm, about 3.0 μm, about 3.5 μm, about 4.0 μm, about 4.5 μm, or about 5.0 μm can be secreted. In certain embodiments, the protein can include fibronectin or other ECM-related proteins.

ある特定の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ～約５．０μｍのタンパク質厚さを含むことができる。一部の実施形態では、内部に封入された細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ、約１．０μｍ、約１．５μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ、約３．０μｍ、約３．５μｍ、約４．０μｍ、約４．５μｍ、または約５．０μｍのタンパク質厚さを有することができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein with cells encapsulated therein can include a protein thickness of about 0.5 μm to about 5.0 μm. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein having cells encapsulated therein are about 0.5 μm, about 1.0 μm, about 1.5 μm, about 2.0 μm, about 2.5 μm, The protein thickness can be about 3.0 μm, about 3.5 μm, about 4.0 μm, about 4.5 μm, or about 5.0 μm.

ある特定の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞内にタンパク質の不均質な分布を含むことができる。一部の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞の１つまたは複数の広がりアームに局在するタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つの細胞がクラスター化する接合部に局在するタンパク質を有することができる。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein that have cells encapsulated therein can include a heterogeneous distribution of proteins within the cells. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein that have cells encapsulated therein can include proteins localized in one or more extended arms of the cells. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein that have cells encapsulated therein can have proteins localized at the junction where two cells cluster.

ある特定の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、例えば、封入された細胞を取り囲んでいる、タンパク質を沈着させることができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルに封入された細胞を取り囲んでいる沈着タンパク質の平均面積は、約０．５μｍ２～約１５０μｍ２であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルに封入された細胞を取り囲む沈着タンパク質の平均面積は、約０．５μｍ２、約１．０μｍ２、約２．５μｍ２、約５．０μｍ２、約７．５μｍ２、約１０μｍ２、約１２．５μｍ２、約１５．０μｍ２、約１７．５μｍ２、約２０μｍ２、約２５μｍ２、約３０μｍ２、約３５μｍ２、約４０μｍ２、約４５μｍ２、約５０μｍ２、約５５μｍ２、約６０μｍ２、約６５μｍ２、約７０μｍ２、約７５μｍ２、約８０μｍ２、約８５μｍ２、約９０μｍ２、約９５μｍ２、約１００μｍ２、約１１０μｍ２、約１２０μｍ２、約１３０μｍ２、約１４０μｍ２、または約１５０μｍ２であり得る。 In certain embodiments, the hydrogels disclosed herein that have cells encapsulated therein can deposit proteins, for example, surrounding the encapsulated cells. According to these embodiments, the average area of deposited proteins surrounding cells encapsulated in the hydrogels disclosed herein can be from about 0.5 μm 2 to about 150 μm 2 . In some embodiments, the average area of deposited proteins surrounding cells encapsulated in the hydrogels disclosed herein is about 0.5 μm 2 , about 1.0 μm 2 , about 2.5 μm 2 , about 5. 0 μm 2 , approximately 7.5 μm 2 , approximately 10 μm 2 , approximately 12.5 μm 2 , approximately 15.0 μm 2 , approximately 17.5 μm 2 , approximately 20 μm 2 , approximately 25 μm 2 , approximately 30 μm 2 , approximately 35 μm 2 , approximately 40 μm 2 , approximately 45 μm 2 , approximately 50 μm 2 , approximately 55 μm 2 , approximately 60 μm 2 , approximately 65 μm 2 , approximately 70 μm 2 , approximately 75 μm 2 , approximately 80 μm 2 , approximately 85 μm 2 , approximately 90 μm 2 , approximately 95 μm 2 , approximately 100 μm 2 , approximately It can be 110 μm 2 , about 120 μm 2 , about 130 μm 2 , about 140 μm 2 , or about 150 μm 2 .

一部の実施形態では、２つのポリマー主鎖のヒドロゲルは、少なくとも１つの幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）を有するヒドロゲルをさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、少なくとも１つの幹細胞を有するヒドロゲルをさらに含む２つのポリマー主鎖のヒドロゲルは、幹細胞の分泌プロファイルに影響を与えるように調節することができ、例えば、幹細胞によって放出されるサイトカインまたは他の薬剤の送達を調節することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの幹細胞を有するヒドロゲルの応力緩和を低減させることにより、幹細胞からのサイトカインの分泌を上方制御することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示される少なくとも１つの幹細胞を有するヒドロゲルの応力緩和を低減させることによって調節されるサイトカインとしては、アクチビンＡ、アグリン、ＣＩＮＣ（サイトカイン誘導性好中球化学誘引物質）－１、ＭＣＰ－１（単球化学誘引物質タンパク質－１）、ＴＩＭＰ－１（組織阻害剤マトリックスメタロプロテイナーゼ１）、ＶＥＧＦ－Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＣＤ８６（分化クラスター８６）、β－ＮＧＦ（神経成長因子）、ＣＩＮＣ－２、ＣＩＮＣ－３、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＴＮＦＳｆ６（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー６）、ＣＸ３ＣＬ１（Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカインリガンド１）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）、ＩＮＦ（インターフェロン）－γ、ＩＬ（インターロイキン）－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒ６、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、レプチン、ＬＩＸ（ＬＰＳ誘導性ＣＸＣケモカイン）、Ｌ－セレクチン、ＭＩＰ－３α（マクロファージ炎症性タンパク質３α）、ＭＭＰ－８（マトリックスメタロプロテイナーゼ８）、ＰＤＧＦ－ＡＡ（血小板由来成長因子ＡＡ）、プロラクチンＲ、ＲＡＧＥ（終末糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ））、ＴＣＫ－１（胸腺ケモカイン－１）およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子）－α、を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度を減少させると、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式で少なくとも１種の抗炎症性サイトカインの分泌を増加させることができる。他の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度の減少により、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式でＩＬ－１０、ＩＬ－６、またはそれらの組み合わせを増加させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度を増加させると、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式で少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの分泌を増加させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１種の幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度を増加させると、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式でＴＮＦ－αを増加させることができる。 In some embodiments, the two polymer backbone hydrogel can further include a hydrogel having at least one stem cell (eg, a mesenchymal stem cell). According to these embodiments, the two polymer backbone hydrogel, further comprising a hydrogel with at least one stem cell, can be modulated to affect the secretory profile of the stem cell, e.g. released by the stem cell. Delivery of cytokines or other agents can be modulated. In certain embodiments, reducing the stress relaxation of a hydrogel having at least one stem cell disclosed herein can upregulate cytokine secretion from the stem cell. According to these embodiments, the cytokines that are regulated by reducing stress relaxation of hydrogels having at least one stem cell disclosed herein include activin A, agrin, CINC (cytokine-induced neutrophils). chemoattractant)-1, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), TIMP-1 (tissue inhibitor matrix metalloproteinase 1), VEGF-A (vascular endothelial growth factor A), CD86 (cluster of differentiation 86) ), β-NGF (nerve growth factor), CINC-2, CINC-3, CNTF (ciliary neurotrophic factor), TNFSf6 (tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 6), CX3CL1 (C-X3- C-motif chemokine ligand 1), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), INF (interferon)-γ, IL (interleukin)-1α, IL-1β, IL -1R6, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, leptin, LIX (LPS-induced CXC chemokine), L-selectin, MIP-3α (macrophage inflammatory protein 3α), MMP-8 (matrix metalloproteinase 8), PDGF-AA (platelet-derived growth factor AA), prolactin R, RAGE (receptor for advanced glycosylation end products), TCK-1 (thymic chemokine-1) and TNF (tumor necrosis) factor)-α, but is not limited to these. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein having at least one stem cell can include two polymer backbones in which decreasing concentrations of benzaldehyde-PEG3-azide are embedded. The secretion of at least one anti-inflammatory cytokine can be increased in a dose-dependent manner from the derived stem cells. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein having at least one stem cell can have two polymer backbones embedded therein by decreasing the concentration of benzaldehyde-PEG3-azide. IL-10, IL-6, or a combination thereof can be increased from stem cells in a dose-dependent manner. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein having at least one stem cell can include two polymer backbones in which increasing concentrations of benzaldehyde-PEG3-azide are embedded. The secretion of at least one pro-inflammatory cytokine can be increased in a dose-dependent manner from the derived stem cells. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein having at least one stem cell can include two polymer backbones, in which increasing concentrations of benzaldehyde-PEG3-azide TNF-α can be increased in a dose-dependent manner from implanted stem cells.

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法において使用されるヒドロゲルは、少なくとも１種の活性薬剤をさらに含むことができる。一部の実施形態では、活性薬剤としては、生物学的活性を提供すること、または別様に疾患の診断、治療、緩和、処置、進行軽減、または予防に直接的な効果をもたらすこと、または対象の生理学的機能の回復、修正もしくは改変に直接的な効果をもたらすことを目的としている、あらゆる物質または物質の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される使用のための活性薬剤は、小分子、ペプチド、ポリヌクレオチド、遺伝子改変細胞、または抗体、抗体断片、またはそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、活性薬剤を含むことができ、または注射時、注射直後に、局所的な投与領域に、状態を処置するために対象の標的領域に、注射後のヒドロゲルの分解期間中一定の速度で、注射後にヒドロゲルが完全に分解した直後、またはそれらの組み合わせで、活性薬剤を放出することができる。 In some embodiments, the hydrogels used in the compositions, combination compositions and methods disclosed herein can further include at least one active agent. In some embodiments, the active agent provides a biological activity or otherwise has a direct effect on the diagnosis, treatment, mitigation, treatment, mitigation of progression, or prevention of a disease; It includes, but is not limited to, any substance or combination of substances that is intended to have a direct effect on restoring, modifying or altering the physiological function of a subject. In certain embodiments, active agents for use disclosed herein can be small molecules, peptides, polynucleotides, genetically modified cells, or antibodies, antibody fragments, or combinations thereof. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can include an active agent or at the time of injection, immediately after injection, into a localized area of administration, into a target area of a subject to treat a condition. The active agent can be released at a constant rate during the period of degradation of the hydrogel after injection, immediately after complete degradation of the hydrogel after injection, or a combination thereof.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれかは、健康状態を処置する、発症軽減する、進行軽減する、もしくは予防するために、または健康状態の処置と予防の両方のために、あるいは対象における待機的手術もしくは処置のために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、限定されるものではないが、炎症性の状態または疾患、自己免疫の状態または疾患、血管の状態または疾患、整形外科的状態、がん、脊椎または脳の損傷（外傷性脳損傷）、組織または器官の修復または再生に使用されるもの、美容外科、インプラント、もしく形成外科、またはその他の該当する状態、またはそれらの組み合わせを含む、状態を処置する、発症軽減する、進行軽減する、または予防することができる。 In certain embodiments, any of the compositions described herein (e.g., hydrogels) are used to treat, lessen the onset, lessen the progression, or prevent a health condition, or for the prevention of a health condition. It can be used for both treatment and prophylaxis, or for elective surgery or treatment in a subject. In some embodiments, the hydrogels disclosed herein can be used to treat, but are not limited to, inflammatory conditions or diseases, autoimmune conditions or diseases, vascular conditions or diseases, orthopedic conditions, cancer, spinal or brain injuries (traumatic brain injury), those used for tissue or organ repair or regeneration, cosmetic surgery, implants, or plastic surgery, or other applicable conditions, or a combination thereof. including, can treat, reduce the onset, reduce the progression of, or prevent the condition.

ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において、１つまたは複数の症状を緩和するための方法、および／または炎症性疾患を処置するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に記載のヒドロゲルを、それを必要とする対象に投与することによって、炎症性疾患、障害、または状態を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、１種または複数の追加の活性薬剤をさらに有することができる。このような追加の活性薬剤は、小分子または生物製剤であり得、例えば、アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、例としてアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、エトドラク、およびセレコキシブ、コルヒチン、コルチコステロイド、例としてプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンなど、プロベネシド、アロプリノール、フェブキソスタット、およびスルファサラジンを含むことができる。他の例としては、タネズマブなどのモノクローナル抗体、ヘパリンおよびワルファリンなどの抗凝固薬、ジサイクロミンなどの抗コリン作用薬または鎮痙薬、アルブテロールおよびレバルブテロールなどのβ－２アゴニスト、臭化イプラトロピウムおよびチオトロピウムなどの抗コリン剤を挙げることができる。 In certain embodiments, the present disclosure provides methods for alleviating one or more symptoms and/or treating an inflammatory disease in a subject in need thereof. In some embodiments, the present disclosure provides a method of treating an inflammatory disease, disorder, or condition by administering a hydrogel described herein having at least one stem cell to a subject in need thereof. I will provide a. In certain embodiments, the hydrogel can further have one or more additional active agents. Such additional active agents may be small molecules or biologics, such as acetaminophen, nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDS), such as aspirin, ibuprofen, naproxen, etodolac, and celecoxib, colchicine, corticosteroids, etc. Costosteroids can include, for example, prednisone, prednisolone, methylprednisolone, hydrocortisone, etc., probenecid, allopurinol, febuxostat, and sulfasalazine. Other examples include monoclonal antibodies such as tanezumab, anticoagulants such as heparin and warfarin, anticholinergics or antispasmodics such as dicyclomine, beta-2 agonists such as albuterol and levalbuterol, ipratropium bromide and tiotropium, etc. anticholinergic agents.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれも、関節痛または組織損傷を軽減および／または処置するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される処置ヒドロゲルを必要とする対象における、１つまたは複数の症状を緩和するための方法、および／または関節痛もしくは組織損傷を処置するための方法、ならびにそのようなものを含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、皮膚、骨、筋肉、または他の組織などの対象の構造成分を修復するために使用することができる。 In certain embodiments, any of the compositions described herein (eg, hydrogels) can be used to reduce and/or treat joint pain or tissue damage. In certain embodiments, the present disclosure provides methods for alleviating one or more symptoms and/or treating joint pain or tissue damage in a subject in need of a treatment hydrogel disclosed herein. Methods for, as well as pharmaceutical compositions containing, are provided. In other embodiments, the hydrogels disclosed herein can be used to repair structural components of a subject, such as skin, bone, muscle, or other tissue.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれかを、他の用途の中でも、動静脈瘻および形成異常、例えば、動脈瘤、例として神経血管および大動脈瘤、肺動脈偽動脈瘤、脳内動静脈瘻、海綿静脈洞部硬膜動静脈瘻および動脈門脈瘻、慢性静脈不全、精索静脈瘤、骨盤うっ血症候群、胃腸出血、腎出血、尿出血、静脈瘤性出血、子宮出血、鼻からの重度の出血（鼻血）、ならびに術前塞栓術（外科手術中の出血量を低減するため）、および伏在バイパス移植術における伏在静脈側枝の閉塞、を含む他の種々の疾患、症状および障害を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、がんを処置するために使用することができる。他の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、固形腫瘍を有するがんを処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、腫瘍への血液供給の遮断または本明細書に開示のヒドロゲルによって運ばれる細胞の産物による送達によって固形腫瘍を処置するために使用することができる。 In certain embodiments, any of the compositions (e.g., hydrogels) described herein are used to treat arteriovenous fistulas and dysplasias, such as aneurysms, such as neurovascular and aortic aneurysms, among other uses. , pulmonary artery pseudoaneurysm, intracerebral arteriovenous fistula, cavernous dural arteriovenous fistula and arterioportal fistula, chronic venous insufficiency, varicocele, pelvic congestion syndrome, gastrointestinal bleeding, renal bleeding, urinary bleeding, veins. Aneurysmal bleeding, uterine bleeding, severe bleeding from the nose (epistaxis), as well as preoperative embolization (to reduce blood loss during surgery) and occlusion of saphenous vein side branches during saphenous bypass grafting. can be used to treat a variety of other diseases, conditions and disorders, including: In some embodiments, the hydrogels described herein can be used to treat cancer. In other embodiments, the hydrogels described herein can be used to treat cancer with solid tumors. In some embodiments, the hydrogels described herein can be used to treat solid tumors by blocking the blood supply to the tumor or by delivery by the products of cells carried by the hydrogels disclosed herein. Can be done.

ある特定の実施形態では、組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれかは、注射用組成物であり得、本明細書のヒドロゲルは、局所薬物送達によって処置可能な任意の数の疾患、障害、および症状を処置するために、１種または複数の治療剤（例えば、活性薬剤）を局所的に送達するために使用することができる。 In certain embodiments, any of the compositions (e.g., hydrogels) can be injectable compositions, and the hydrogels herein can be used to treat any number of diseases, disorders, and It can be used to locally deliver one or more therapeutic agents (eg, active agents) to treat a condition.

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を実行するために、治療有効量のヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物を、処置を必要とする対象に、好適な経路（例えば、実質注射、関節内注射）を介して、本明細書に開示される好適な量で投与することができる。一部の実施形態では、ヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物は、注射器、カテーテル、トロカール、カニューレなどを介した注射によって対象に投与することができる。 In some embodiments, to carry out the methods disclosed herein, a therapeutically effective amount of a hydrogel or a pharmaceutical composition comprising the same is administered to a subject in need of treatment by a suitable route (e.g., injection, intra-articular injection) in any suitable amount disclosed herein. In some embodiments, a hydrogel or a pharmaceutical composition comprising the same can be administered to a subject by injection via a syringe, catheter, trocar, cannula, or the like.

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を実行するために、治療有効量のヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物を、炎症性疾患の少なくとも１つの部位に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を実行するために、治療有効量のヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物を、関節痛の少なくとも１つの部位に投与することができる。 In some embodiments, a therapeutically effective amount of a hydrogel or a pharmaceutical composition comprising the same can be administered to at least one site of an inflammatory disease to carry out the methods disclosed herein. In some embodiments, to carry out the methods disclosed herein, a therapeutically effective amount of a hydrogel or a pharmaceutical composition comprising the same can be administered to at least one site of joint pain.

他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルを生成、輸送、保存、および使用するためのキットを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療使用のためのキットは、医薬組成物中に製剤化された、本明細書に記載されるように本明細書に企図される組成物（例えば、ヒドロゲル）またはヒドロゲルを作製するための薬剤をさらに含む１つまたは複数の容器を含むことができる。 In other embodiments, kits for producing, transporting, storing, and using the hydrogels disclosed herein are provided. In some embodiments, a kit for therapeutic use as described herein comprises a composition contemplated herein as described herein, formulated in a pharmaceutical composition. (eg, a hydrogel) or an agent for making a hydrogel.

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおいてヒドロゲルを作製、保存、または使用するための説明書をさらに含むことができる。説明書は、対象において目的の活性を達成するための、ヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物の対象への投与の説明を含むことができる。キットは、対象が処置を必要としているかどうかの識別に基づいて、処置に好適な対象を選択することの説明をさらに含むことができる。本明細書に記載のヒドロゲルの使用に関する説明書は、一般に、目的の処置のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。 In some embodiments, the kit can further include instructions for making, storing, or using the hydrogel in any of the methods described herein. The instructions can include instructions for administering the hydrogel or pharmaceutical composition comprising the same to a subject to achieve the desired activity in the subject. The kit can further include instructions for selecting a suitable subject for treatment based on the identification of whether the subject is in need of treatment. Instructions for use of the hydrogels described herein generally include information regarding dosages, dosing schedules, and routes of administration for the intended treatment.

一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルのいずれかを生成するためのキットを提供する。他の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるポリマー主鎖のうちの少なくとも２つを含むことができる。一部の実施形態では、キットは、２つのポリマー主鎖を組み合わせてヒドロゲルを形成する方法、ヒドロゲルの粘度を増加させる方法、ヒドロゲルの応力緩和を増大させる方法、またはそれらの組み合わせに関する説明書を含むことができる。 In some embodiments, kits are provided for producing any of the hydrogels described herein. In other embodiments, the kit can include at least two of the polymer backbones described herein. In some embodiments, the kit includes instructions on how to combine two polymer backbones to form a hydrogel, increase the viscosity of a hydrogel, increase stress relaxation of a hydrogel, or combinations thereof. be able to.

特定の実施形態では、容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、またはサブユニット用量であり得る。本開示のキットで提供される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書に書かれた説明書である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が対象における疾患または障害を処置する、発症を遅延させる、および／または疾患または障害を軽減するために使用されることを示す。 In certain embodiments, the container can be a unit dose, a bulk package (eg, a multi-dose package), or a subunit dose. The instructions provided with the kits of the present disclosure are typically written instructions on the label or package insert. The label or package insert indicates that the pharmaceutical composition is used to treat, delay the onset of, and/or alleviate the disease or disorder in a subject.

本明細書で提供されるキットは、好適なパッケージングに入っている。好適なパッケージングには、バイアル、ボトル、瓶、可撓性パッケージングなどが含まれるが、これらに限定されない。特定のデバイス、注入デバイスと組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有するバイアルであり得る）。容器は滅菌アクセスポートを有することもできる。キットは、緩衝液および解釈のための情報などの追加的構成成分を任意選択で提供することができる。一部の実施形態では、キットは、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを有することができる。一部の実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。 The kits provided herein are in suitable packaging. Suitable packaging includes, but is not limited to, vials, bottles, jars, flexible packaging, and the like. Packages for use in conjunction with certain devices, injection devices, are also contemplated. The kit can have a sterile access port (eg, the container can be an intravenous solution bag or a vial with a stopper that can be pierced by a hypodermic needle). The container can also have a sterile access port. Kits can optionally provide additional components such as buffers and information for interpretation. In some embodiments, a kit can have a container and a label or insert on or associated with the container. In some embodiments, the present disclosure provides a product comprising the contents of the kit described above.

以下の実施例は、ある特定の実施形態を説明するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、特許請求の範囲に記載の方法、組成物および装置の実施において良好に機能することが発見された技術を表すことを、当業者は理解すべきである。しかし、当業者であれば、本開示の見地から、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された一部の実施形態において変更がなされ、依然として同様のまたは類似の結果が得られることを認識すべきである。 The following examples are included to illustrate certain specific embodiments. It should be understood by those skilled in the art that the techniques disclosed in the following examples represent techniques that have been found to work well in practicing the claimed methods, compositions, and apparatus. . However, those skilled in the art will appreciate that, in view of this disclosure, changes may be made in some of the disclosed embodiments and still achieve the same or similar results without departing from the spirit and scope of the invention. should be recognized.

（実施例１）
１つの例示的な方法では、ヒドロゲル組成物を操作し、特徴付けた。本実施例では、（アルデヒド基とヒドラジド基の間で形成される）共有結合による適応性ヒドラゾン結合で架橋されたヒドロゲルを形成させ、得られたゲルを、ビシクロノニンで官能化された８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とヒアルロン酸（ＨＡ）上のペンダントアジドの間のアジドアルキン付加環化を促進する遅い反応性のひずみで安定化させた。 (Example 1)
In one exemplary method, hydrogel compositions were manipulated and characterized. In this example, we formed a hydrogel crosslinked with covalently adaptive hydrazone bonds (formed between aldehyde and hydrazide groups) and used the resulting gel to form a bicyclononine-functionalized 8-arm poly(ethylene (PEG) and the pendant azide on hyaluronic acid (HA) with a slow reactive strain that promotes the cycloaddition of the azide alkyne.

Ａ．マクロマーの形成
ある特定の例示的な方法では、ヒアルロン酸（ＨＡ）を、脂肪族アルデヒド（ＨＡ－Ａｌｄ）またはヒドラジド（ＨＡ－Ｈｙｄ）のいずれかで官能化した。簡単に説明すると、ＨＡ－Ａｌｄを、２００ｍｇのＨＡと過ヨウ素酸ナトリウム（１０３ｍｇ、過ヨウ素酸塩／ＨＡモル比１：１）を２０ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解したヒアルロン酸（ＨＡ、ＭＷ＝４００ｋＤａ、７４ｋＤａ）から合成した。反応物を暗所で２時間撹拌し、続いて２ｍＬのエチレングリコール中でクエンチした。次いで、溶液をｄＨ２Ｏ（カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）１４０００）に対して５日間透析し、凍結乾燥させた。ＨＡ－Ａｌｄは、使用するまで窒素下にて、－２０℃で保存した。官能化は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸アッセイを使用して決定した。要約すると、ＨＡ－Ａｌｄを２ｗｔ％で溶解し、続いてｄＨ２Ｏ中でカルバジン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｃ、１％トリクロロ酢酸中）と一晩反応させた。翌日、ＨＡ－ＡＬＤ／ｔ－ＢＣおよびｔ－ＢＣ標準を、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム中６ｍＭ、ｐＨ８）と１時間反応させた。次いで、試料を０．５Ｎ塩酸と反応させ、マイクロプレートリーダー（テカン社（Ｔｅｃｏｎ））で３４０ｎｍにおいて吸光度を測定した。分子量（Ｍｎ）は、以下のようにゲル浸透クロマトグラフィーを使用して定量化した。１０ｍＬの超純水中の３％（ｗ／ｗ）ＨＡ－Ａｌｄ溶液を、サイズ５００Åおよび２５０～２０００Åのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）／サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに通して、屈折率検出器を使用してその分子量を測定した（図１Ａ）。 A. Macromer Formation In certain exemplary methods, hyaluronic acid (HA) was functionalized with either an aliphatic aldehyde (HA-Ald) or a hydrazide (HA-Hyd). Briefly, HA-Ald was prepared using hyaluronic acid (HA, MW = 400 kDa) prepared by dissolving 200 mg of HA and sodium periodate (103 mg, periodate/HA molar ratio 1:1) in 20 mL of dH 2 O. , 74kDa). The reaction was stirred in the dark for 2 hours, then quenched in 2 mL of ethylene glycol. The solution was then dialyzed against dH 2 O (molecular weight cutoff (MWCO) 14000) for 5 days and lyophilized. HA-Ald was stored at −20° C. under nitrogen until use. Functionalization was determined using the 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid assay. Briefly, HA-Ald was dissolved at 2 wt% and subsequently reacted with tert-butyl carbazate (t-Bc, in 1% trichloroacetic acid) in dH 2 O overnight. The next day, HA-ALD/t-BC and t-BC standards were reacted with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS, 6 mM in 0.1 M sodium tetraborate, pH 8) for 1 hour. The sample was then reacted with 0.5N hydrochloric acid, and the absorbance was measured at 340 nm with a microplate reader (Tecon). Molecular weight (Mn) was quantified using gel permeation chromatography as follows. A 3% (w/w) HA-Ald solution in 10 mL of ultrapure water was passed through gel permeation chromatography (GPC)/size exclusion chromatography (SEC) columns of size 500 Å and 250-2000 Å for refractive index detection. The molecular weight was measured using an instrument (FIG. 1A).

ＨＡ－Ｈｙｄは、１グラムのＨＡおよびアジピン酸ジヒドラジド（約１３ｇ、＞６０×モル過剰）を２００ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解したＨＡ（ＭＷ＝４００ｋＤａ、７４ｋＤａ）から合成した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、１．５５ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１．５３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を別々にＤＭＳＯ／ｄＨ２Ｏ混合物（１：１）に溶解し、ＨＡ溶液に滴加した。４時間にわたって３０分ごとにｐＨを６．８に調整し、２４時間反応させた。溶液をｄＨ２Ｏ（３５００ＭＷＣＯ）に対して３日間透析し、その後生成物を冷アセトン中で沈殿させ、再度１週間透析した。生成物を凍結乾燥させ、使用のために窒素下にて、－２０℃で保存した。プロトン核磁気共鳴分光法（１ＨＮＭＲ、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ３６０ＭＨｚ）を使用して、最終生成物を特徴付けた。分子量（Ｍｎ）は、上記の方法を使用するゲル浸透クロマトグラフィーを使用して定量化した。（図１Ａ）。 HA-Hyd was synthesized from HA (MW = 400 kDa, 74 kDa) in 200 mL of dH 2 O with 1 gram of HA and adipic acid dihydrazide (approximately 13 g, >60× molar excess). 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, 1.55 g, 10 mmol) and hydroxybenzotriazole (HOBt, 1.53 g, 10 mmol) were separately dissolved in a DMSO/dH 2 O mixture (1:1). and added dropwise to the HA solution. The pH was adjusted to 6.8 every 30 minutes for 4 hours and the reaction was allowed to proceed for 24 hours. The solution was dialyzed against dH 2 O (3500 MWCO) for 3 days, after which the product was precipitated in cold acetone and dialyzed again for 1 week. The product was lyophilized and stored at −20° C. under nitrogen for use. The final product was characterized using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 HNMR, Bruker DMX 360MHz). Molecular weight (Mn) was quantified using gel permeation chromatography using the method described above. (Figure 1A).

次に、８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、４０ｋＤａ）をビシクロノニン（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ））で官能化した（ＰＥＧ－ＢＣＮ）。簡単に説明すると、８アームＰＥＧ（約１ｇ）と（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）カーボネート（ＢＣＮ－ＯＳｕ；１７５ｍｇ）を、ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２７７μＬ、２０７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、４ｘ）を混合物に加え、反応物を一晩撹拌し、濃縮し、水に溶解し、透析し（分子量カットオフ約２ｋＤａ）、凍結乾燥させた。官能化は、１Ｈ－ＮＭＲにより、特徴的なＢＣＮピーク（δ２．２４、１．５７、１．３４、０．９２）の積分値をＰＥＧ主鎖からの積分値（δ３．６３）と比較することにより、９５％超であることが確認された。（図１Ａ）。 Eight-arm poly(ethylene glycol) (PEG, 40 kDa) was then functionalized with bicyclononine ((1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl (BCN)). (PEG-BCN). Briefly, 8-arm PEG (approximately 1 g) and (1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) ) Carbonate (BCN-OSu; 175 mg) was dissolved in dimethylformamide (5 mL). N,N-diisopropylethylamine (277 μL, 207 mg, 1.6 mmol, 4x) was added to the mixture and the reaction was stirred overnight, concentrated, dissolved in water, dialyzed (molecular weight cutoff ~2 kDa), and lyophilized. I let it happen. Functionalization was performed by 1 H-NMR, comparing the integral values of the characteristic BCN peaks (δ2.24, 1.57, 1.34, 0.92) with the integral values from the PEG backbone (δ3.63). By doing so, it was confirmed that it was over 95%. (Figure 1A).

ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドは、アジド基とベンズアルデヒド基を含有する架橋剤である。（図１Ａ）。
デュアルゲルネットワークの形成
他の例示的な方法では、マクロマーを化学量論比でＰＢＳに溶解した。第１のゲルネットワーク系であるＨＡ－ヒドラゾンゲル系を、ＨＡ－ＡｌｄマクロマーとＨＡ－Ｈｙｄマクロマーを混合することによって形成した。これらのマクロマーを組み合わせると、ヒアルロン酸主鎖上で官能化されたヒドラジド基とアルデヒド基がヒドラゾン結合を形成する（図１Ｂおよび１Ｄ）。 Benzaldehyde-PEG3-azide is a crosslinking agent containing an azide group and a benzaldehyde group. (Figure 1A).
Formation of Dual Gel Network In another exemplary method, macromers were dissolved in PBS in stoichiometric ratios. The first gel network system, the HA-hydrazone gel system, was formed by mixing HA-Ald and HA-Hyd macromers. When these macromers are combined, the hydrazide and aldehyde groups functionalized on the hyaluronic acid backbone form hydrazone bonds (FIGS. 1B and 1D).

第２のゲルネットワーク系であるＰＥＧ－トリアゾールゲル系を、ＰＥＧ－ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドマクロマーを混合することによって形成した。ＢＣＮは、８アームＰＥＧ上で官能化されているため、独自の主鎖を導入した。（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ）基とベンズアルデヒド－Ｐｅｇ３－アジド（アジド）基との間に形成されたネットワークは、不可逆的な結合を形成し、安定性をもたらした。（図１Ｃおよび１Ｄ）。 A second gel network system, a PEG-triazole gel system, was formed by mixing PEG-BCN and benzaldehyde-PEG3-azide macromer. BCN was functionalized on an 8-arm PEG, thus introducing a unique backbone. The network formed between the (1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl (BCN) group and the benzaldehyde-Peg3-azido (azido) group is irreversible. formed a bond and provided stability. (Figures 1C and 1D).

ＨＡ－ヒドラゾンゲル系によって、粘弾性ゲルが得られたが、ＰＥＧ－トリアゾールゲル系は、より弾性のあるゲルに寄与する。高弾性ゲルは、安定性は高いが注入性が不十分であり、一方、高粘弾性ゲルは注射しやすいが、注射後の溶液中での安定性が不十分である。どちらのデュアルゲルネットワークも、結合形成に外部活性化因子（すなわち、温度、ＵＶ光曝露、化学反応、光反応開始、酵素反応など）を必要としなかった。 The HA-hydrazone gel system resulted in a viscoelastic gel, while the PEG-triazole gel system contributes to a more elastic gel. Highly elastic gels have high stability but insufficient injectability, while highly viscoelastic gels are easy to inject but have insufficient stability in solution after injection. Neither dual gel network required external activators (i.e., temperature, UV light exposure, chemical reactions, photoinitiation, enzymatic reactions, etc.) for bond formation.

ヒドロゲルの形成および特徴付け
ある特定の例示的な方法では、デュアルゲルネットワークについて、各ポリマー、ＨＡ－ヒドラジド、ＨＡ－アルデヒド、ＰＥＧ－ＢＣＮ、およびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをＰＢＳに溶解した。最初にＨＡ－ヒドラジド（官能性アームの１２％～１００％の範囲）とベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを組み合わせ、その後ＨＡ－アルデヒドとＰＥＧ－ＢＣＮを組み合わせることにより、化学量論比でヒドロゲルが形成され、一緒に組み合わせるとヒドロゲルが形成された。組み合わせると、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドはヒドラジドとヒアルロン酸主鎖上で反応し、ヒドラジドとベンズアルデヒドが反応してほぼ不可逆的な結合を形成した（図１Ｄおよび１Ｅ）。結合を元に戻すことはできるが、この結合が分解するまでの時間スケールは数か月程度であった。 Hydrogel Formation and Characterization In one particular exemplary method, for the dual gel network, each polymer, HA-hydrazide, HA-aldehyde, PEG-BCN, and benzaldehyde-PEG3-azide, was dissolved in PBS. Hydrogels are formed in stoichiometric ratios by first combining HA-hydrazide (ranging from 12% to 100% of functional arms) and benzaldehyde-PEG3-azide, followed by combining HA-aldehyde and PEG-BCN; When combined together, a hydrogel was formed. When combined, benzaldehyde-PEG3-azide reacted with hydrazide on the hyaluronic acid backbone, and hydrazide and benzaldehyde reacted to form an almost irreversible bond (Figures 1D and 1E). Although the bond could be reversed, the time scale for the bond to break down was on the order of several months.

この反応により、ＨＡ主鎖に沿ったヒドラジド官能基がアジド部分に効果的に変換され、その後のビシクロノニン（ＢＣＮ）官能化８アームＰＥＧマクロマーとのひずみ促進アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）反応への関与が起こった（図１Ｄ）。このＳＰＡＡＣ反応により安定なトリアゾール結合が形成され、これが得られたヒドロゲルの全体的な粘弾性特性に影響を与え、製剤の安定性を大幅に向上させた。このより安定な架橋を組み込むことにより、１．２６％（等式１）： This reaction effectively converts the hydrazide functional groups along the HA backbone into azide moieties for subsequent strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) reactions with bicyclononine (BCN)-functionalized 8-arm PEG macromers. involvement occurred (Fig. 1D). This SPAAC reaction resulted in the formation of stable triazole bonds, which influenced the overall viscoelastic properties of the resulting hydrogel and significantly improved the stability of the formulation. By incorporating this more stable crosslink, 1.26% (Equation 1):

と計算されたヒドロゲルの予測フローリー・ストックマイヤー（Ｆｌｏｒｙ－Ｓｔｏｃｋｍａｙｅｒ）パーコレーション閾値で、８１アームＨＡ－ヒドラジドと８８アームＨＡ－アルデヒドに基づいて、安定な材料が達成された。アルキルヒドラゾン結合とベンジルヒドラゾン結合の比率を変更することで、実験者は組成的に規定された粘弾性応答の範囲に合わせて材料を調整することができた。 A stable material was achieved based on an 81-arm HA-hydrazide and an 88-arm HA-aldehyde, with the predicted Flory-Stockmayer percolation threshold of the hydrogel calculated as . By changing the ratio of alkylhydrazone bonds to benzylhydrazone bonds, the experimenters were able to tune the material to a compositionally defined range of viscoelastic responses.

ＨＡ－ＡｌｄおよびＨＡ－Ｈｙｄマクロマーを単独で反応させる場合に形成される粘弾性ヒドロゲル；しかし、さらなる安定化を行わない場合、これらの材料はＭＳＣの封入および培養に必要なより長い時間スケールでは安定ではなかった（図１Ｂ）。ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド架橋剤を添加すると、ヒドラジド官能基は、ＳＰＡＡＣ反応に関与できるアジド官能基に効果的に変換され、前述の粘弾性ヒドロゲルを安定化させ、これにより応力緩和挙動が劇的に変化した（図１Ｃ）。したがって、架橋剤の組成を変更することにより、ヒドロゲル内で広範囲の粘弾性特性が達成され、応力緩和を特徴付けた。比較のために、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド架橋剤で官能化したＨＡ－ＨｙｄとＰＥＧ－ＢＣＮを反応させてＳＰＡＡＣネットワークを形成することにより、より弾性が高く安定なヒドロゲルを合成した（図１Ｅ）。 Viscoelastic hydrogels formed when HA-Ald and HA-Hyd macromers are reacted alone; however, without further stabilization, these materials are not stable over the longer time scales required for MSC encapsulation and culture. It was not (Fig. 1B). Upon addition of the benzaldehyde-PEG-azide crosslinker, the hydrazide functional groups are effectively converted to azide functional groups that can participate in the SPAAC reaction, stabilizing the aforementioned viscoelastic hydrogels, which dramatically improves the stress relaxation behavior. (Fig. 1C). Therefore, by changing the composition of the crosslinker, a wide range of viscoelastic properties was achieved within the hydrogel and the stress relaxation was characterized. For comparison, a more elastic and stable hydrogel was synthesized by reacting HA-Hyd and PEG-BCN functionalized with a benzaldehyde-PEG-azide crosslinker to form a SPAAC network (Figure 1E).

デュアルゲルネットワークの組み合わせから形成されたヒドロゲルは、結合形成に外部活性化因子（すなわち、温度、ＵＶ光曝露、化学反応、光反応開始、酵素反応など）を必要としなかった。 Hydrogels formed from the combination of dual gel networks did not require external activators (i.e., temperature, UV light exposure, chemical reactions, photoinitiation, enzymatic reactions, etc.) for bond formation.

粘弾性ヒドラゾン結合対弾性トリアゾール結合の比を使用して、経時的にさまざまな程度の粘弾性および応力緩和（ＳＲ）を有するヒドロゲルを得た。具体的には、１００％、８８％、７５％、５０％、２５％、および０％の架橋が高速緩和アルキルヒドラゾン結合で構成されるヒドロゲルを製造した。ヒドロゲルのゲル化時間、最終貯蔵弾性率、粘弾性、および応力緩和時間を、平行平板レオメーター（ＤＨＲ－３）を使用してインサイチュで特徴付けた。平衡化後に測定されたデュアルゲルネットワーク（ＨＡ－ヒドラゾン：ＰＥＧ－トリアゾール）の剪断貯蔵弾性率は、すべての条件にわたって約４００Ｐａであった。 The ratio of viscoelastic hydrazone bonds to elastic triazole bonds was used to obtain hydrogels with varying degrees of viscoelasticity and stress relaxation (SR) over time. Specifically, hydrogels were prepared in which 100%, 88%, 75%, 50%, 25%, and 0% of the crosslinks were composed of fast-relaxing alkylhydrazone bonds. The gelation time, final storage modulus, viscoelasticity, and stress relaxation time of the hydrogels were characterized in situ using a parallel plate rheometer (DHR-3). The shear storage modulus of the dual gel network (HA-hydrazone:PEG-triazole) measured after equilibration was approximately 400 Pa across all conditions.

ヒドラゾン結合を、生理学的ｐＨで急速に形成させ、マクロマーを含有する足場を作製して、時間の経過とともにネットワークを安定化し、これにより注射が可能になった。ヒドラゾン結合は、初期粘弾性条件（ＨＡ－ＡｌｄおよびＨＡ－Ｈｙｄのみ）でのヒドロゲルの即時ゲル化（Ｇ’＞Ｇ”）によって観察されるように、試料を充填するときに捕捉できるよりも速く生理学的ｐＨで形成された。 Hydrazone bonds were formed rapidly at physiological pH to create macromer-containing scaffolds that stabilized the network over time, allowing injection. Hydrazone binding occurs faster than it can be captured when loading the sample, as observed by the immediate gelation (G′>G”) of the hydrogels at initial viscoelastic conditions (HA-Ald and HA-Hyd only). Formed at physiological pH.

よりゆっくりとゲル化するＳＰＡＡＣ架橋を追加しても、Ｇ’とＧ’’の交差点は依然として比較的急速に発生し、約５分後に弾性ゲル（デュアルゲルネットワークＨＡ－ヒドラゾンと濃度が増加しているＰＥＧ－ＢＣＮの組み合わせ）が形成され始め、一方、粘弾性ゲル（ＨＡ－ｈｙｄおよびＨＡ－ａｌｄ）はほぼ瞬時に形成され（図２Ａ）、約９０００秒（２．５時間）後に定常状態のネットワーク形成に達する。種々のヒドロゲル製剤の最終剪断貯蔵弾性率は１６００Ｐａ～２４００Ｐａの範囲であった（図２Ａ）。 Even with the addition of the more slowly gelling SPAAC cross-link, the intersection of G' and G'' still occurs relatively rapidly, forming an elastic gel (dual gel network HA-hydrazone and increasing concentration) after about 5 min. (PEG-BCN combination) started to form, while viscoelastic gels (HA-hyd and HA-ald) formed almost instantly (Fig. 2A) and reached steady state after about 9000 seconds (2.5 hours). Reach network formation. The final shear storage modulus of the various hydrogel formulations ranged from 1600 Pa to 2400 Pa (Figure 2A).

２４時間後、異なるゲル条件間で弾性率に有意差は観察されなかった（図２Ｂ）。すべてのゲルは、約１０，０００Ｐａ未満のインサイチュ弾性率を有し、２５％および７５％の粘弾性組成を有するゲルは、調べた他のゲルと比較して、著しく高いインサイチュ弾性率を有していた（図２Ｃ）。ＨＡ－ヒドラゾンゲル系内のヒドラゾン結合は急速に形成されるため、ＨＡ－ヒドラゾン－アジドおよびＰＥＧ－ＢＣＮゲル系の成分が時間の経過とともにネットワークを安定させ、注射を可能にする足場が作製される。 After 24 hours, no significant difference in elastic modulus was observed between the different gel conditions (Figure 2B). All gels had an in situ modulus of less than about 10,000 Pa, and gels with viscoelastic compositions of 25% and 75% had significantly higher in situ moduli compared to other gels examined. (Figure 2C). Because the hydrazone bonds within the HA-hydrazone gel system form rapidly, the components of the HA-hydrazone-azide and PEG-BCN gel systems stabilize the network over time, creating a scaffold that allows for injection. .

完全なネットワーク形成後、ヒドロゲルの応力緩和特性を試験した。１０％のひずみを１秒間かけて加え、６時間一定に保ち、加えられた剪断応力の緩和を各ヒドロゲル条件について監視した（図２Ｄ）。応力緩和の量は、ヒドロゲル内に存在するアルキルヒドラゾン結合のパーセントに応じて変化し、１００％対０％のアルキルヒドラゾン製剤の応力緩和がそれぞれ、約９０％からわずか２％までの範囲であった（図２Ｄ～２Ｅ）。アジド架橋剤によるＨＡ－Ｈｙｄの官能化が０～１００％に増加すると、存在するアルキルヒドラゾン架橋が減少し、ヒドロゲルの粘弾性特性が変化した。応力緩和データをさらに分析すると、１００％と８８％のアルキルヒドラゾン結合条件では応力緩和のパーセントに有意差はなく、どちらも加えられた応力の８０％超で緩和することが示された（図２Ｆ）。アルキルヒドラゾン架橋含有量がさらに減少すると、応力緩和特性に大きな差異が観察された。具体的には、すべての試料は、加えられた応力の５０％未満を緩和し、５０％、２５％、および０％の製剤では加えられた応力の１０％以下を緩和した（図２Ｅ）。これらの結果は、ネットワーク内に存在する動的結合が少なく、ＰＥＧ対ＨＡのモル比が１を大幅に超えているため、ヒドロゲルの応力緩和能力が急激に低下していることを示唆している（図２Ｇ）。 After complete network formation, the stress relaxation properties of the hydrogels were tested. A 10% strain was applied over 1 second and held constant for 6 hours, and relaxation of the applied shear stress was monitored for each hydrogel condition (Figure 2D). The amount of stress relaxation varied depending on the percentage of alkylhydrazone bonds present within the hydrogel, ranging from about 90% to only 2% stress relaxation for 100% vs. 0% alkylhydrazone formulations, respectively. (Figures 2D-2E). As the functionalization of HA-Hyd with azide crosslinkers increased from 0 to 100%, the alkylhydrazone crosslinks present decreased and the viscoelastic properties of the hydrogels changed. Further analysis of the stress relaxation data showed that there was no significant difference in the percent stress relaxation between the 100% and 88% alkylhydrazone binding conditions, with both relaxing at >80% of the applied stress (Fig. 2F ). As the alkylhydrazone crosslinking content was further reduced, significant differences in stress relaxation properties were observed. Specifically, all samples relaxed less than 50% of the applied stress, with the 50%, 25%, and 0% formulations relaxing less than 10% of the applied stress (Figure 2E). These results suggest that the stress relaxation ability of the hydrogel decreases rapidly due to fewer dynamic bonds existing in the network and the molar ratio of PEG to HA significantly exceeding 1. (Figure 2G).

すべての応力緩和曲線を初期値に正規化し、データをコールラウシュ・ウィリアムズ・ワッツ（Ｋｏｈｌｒａｕｓｃｈ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｗａｔｔｓ）関数（等式２）： Normalize all stress relaxation curves to their initial values and convert the data to the Kohlrausch-Williams-Watts function (Equation 2):

に適合させた。
この等式では、正規化応力σ／σ０は、伸長パラメータ、βによって記述される分布に存在する時定数τｋを有する指数関数的減衰としてモデル化された。ヒドロゲルの応力緩和は、ヒドロゲルネットワーク内に存在する組成的およびトポロジカルな不均質性（すなわち、共有結合的に適応性の高い複数の化学、ポリマー鎖のもつれとループ、および異なるポリマーネットワーク主鎖）に起因する広範囲の緩和時定数を包含する。コールラウシュ・ウィリアムズ・ワッツ（Ｋｏｈｌｒａｕｓｃｈ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｗａｔｔｓ）関数を、広範に不均質な緩和時間スケールを示す試料の緩和挙動を記述するための経験的関係として使用した。緩和時定数の不均質性は、βによって定性的に理解され、値１は特異緩和時定数を表し、０への偏差はこの分布の広がりを表す（０＜β＜１）。モデルパラメータは、例示的な方法の各ヒドロゲル組成物の伸長パラメータを示す図２Ｈにまとめられている。伸長パラメータには、ほとんどの条件でβ＞０．５という中程度の不均質性があった。 adapted to.
In this equation, the normalized stress σ/σ 0 was modeled as an exponential decay with a time constant τ k that resides in a distribution described by the elongation parameter, β. Stress relaxation in hydrogels is due to the compositional and topological heterogeneity present within the hydrogel network (i.e., multiple covalently adaptable chemistries, polymer chain entanglements and loops, and different polymer network backbones). It encompasses a wide range of relaxation time constants. The Kohlrausch-Williams-Watts function was used as an empirical relationship to describe the relaxation behavior of samples exhibiting widely heterogeneous relaxation time scales. The heterogeneity of the relaxation time constant is understood qualitatively by β, where the value 1 represents the singular relaxation time constant and the deviation towards 0 represents the broadening of this distribution (0<β<1). The model parameters are summarized in Figure 2H, which shows the elongation parameters for each hydrogel composition of the exemplary method. There was moderate heterogeneity in the extension parameters with β > 0.5 for most conditions.

時定数および伸長パラメータがわかったら、時間領域全体（ｔ＝０～ｔ＝∞）にわたってモデルを積分することによって、平均緩和時定数（〈τ〉）を計算した（等式３）： Once the time constant and stretching parameters were known, the average relaxation time constant (〈τ〉) was calculated by integrating the model over the entire time domain (t=0 to t=∞) (Equation 3):

各ヒドロゲル組成物の特徴的な緩和時間を、等式３および応力緩和データに適合するパラメータを使用して計算した。これらの特徴的な緩和時間は、４桁の大きさ（〈τ８８％〉＝４．２×１０３ｓ～〈τ０％〉＝１．４×１０７ｓ）に及ぶことが見出され、およそ１時間半から６か月の範囲であり得るヒドロゲル内の緩和の時間スケールを正確に制御できることを示している（図２Ｉ）。 The characteristic relaxation time for each hydrogel composition was calculated using Equation 3 and parameters fitted to the stress relaxation data. These characteristic relaxation times were found to span four orders of magnitude (〈τ 88% 〉 = 4.2 × 10 3 s to 〈τ 0% 〉 = 1.4 × 10 7 s). , demonstrating that the time scale of relaxation within the hydrogel can be precisely controlled, which can range from approximately 1.5 hours to 6 months (Figure 2I).

ある特定の例示的な方法では、各ヒドロゲル製剤の平衡膨潤剪断貯蔵弾性率を決定するために、試料をＰＢＳ中で２４時間膨潤させ、その後、本明細書に詳述する方法に従ってレオロジーについて分析した。最終的な平衡貯蔵弾性率（Ｇ’）は、すべての条件にわたって約４００±１５０Ｐａであることが見出され、どの条件間でも有意差はなかった（図２Ｊ）。したがって、これらの製剤を使用した細胞培養実験では、ヒドロゲルの特性間の主な差異は応力緩和挙動であった。 In one particular exemplary method, to determine the equilibrium swelling shear storage modulus of each hydrogel formulation, samples were swollen in PBS for 24 hours and then analyzed for rheology according to the methods detailed herein. . The final equilibrium storage modulus (G') was found to be approximately 400 ± 150 Pa across all conditions, with no significant difference between any conditions (Fig. 2J). Therefore, in cell culture experiments using these formulations, the main difference between the hydrogel properties was the stress relaxation behavior.

剪断レオロジーを使用して、ヒドロゲルの粘弾性特性を測定するために使用される１つの試験は、応力緩和試験であった。この試験では、一定のひずみを加え、応答する応力を経時的に測定した。弾性材料は一定の応力を維持するが、粘弾性材料は応力緩和を示す。経時的な応力緩和のパーセントを測定し、これは、ＰＥＧ－トリアゾール含有量１００％から０％までに応じて、それぞれ９２％～２％の範囲であった（図３Ａおよび３Ｂ）。具体的には、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が０％の場合は応力の９２％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が１２％の場合は応力の８４％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が２５％の場合は応力の３９％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が５０％の場合は応力の９％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が７５％の場合は応力の３％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が１００％の場合は応力の２％が緩和された。ゲルの応力を、経時的に正規化した（図３Ｃ）。 One test used to measure the viscoelastic properties of hydrogels using shear rheology was the stress relaxation test. In this test, a constant strain was applied and the response stress was measured over time. Elastic materials maintain constant stress, whereas viscoelastic materials exhibit stress relaxation. The percent stress relaxation over time was measured and ranged from 92% to 2% depending on the PEG-triazole content from 100% to 0%, respectively (Figures 3A and 3B). Specifically, when the PEG-triazole content is 0%, 92% of the stress is relaxed, when the PEG-triazole content is 12%, 84% of the stress is relaxed, and when the PEG-triazole content is 25%. %, 39% of the stress is relaxed, 50% PEG-triazole content, 9% of the stress, 75% PEG-triazole content, 3% of the stress is relaxed, When the PEG-triazole content was 100%, 2% of the stress was relieved. Gel stress was normalized over time (Figure 3C).

これらのデータは、ゲルに投入されるＰＥＧ－トリアゾールの量が増加する（弾性が増加する）とゲルの応力緩和が著しく低減するのに対し、ゲルの弾性が増大するにつれて応力緩和の時定数が増加することを示している。すべてのゲル製剤は、２４時間後に類似の膨潤剪断貯蔵弾性率値を示した。これにより、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの比を調整して、ゲルのバルク剪断貯蔵弾性率を変化させないままで、経時的にゲル内の粘弾性および応力緩和を制御することができることが示された。 These data indicate that as the amount of PEG-triazole loaded into the gel increases (increasing its elasticity), the stress relaxation of the gel decreases significantly, whereas as the elasticity of the gel increases, the time constant of stress relaxation decreases. It shows that it will increase. All gel formulations exhibited similar swelling shear storage modulus values after 24 hours. This shows that the ratio of HA-hydrazone to PEG-triazole can be adjusted to control viscoelasticity and stress relaxation within the gel over time while leaving the bulk shear storage modulus of the gel unchanged. Ta.

別の例示的な方法では、この実施例で開示される固有のデュアルゲルネットワークにより高弾性ゲルが注射可能になることができるかどうかを決定するために、標準注射器から排出される濃度が増加しているＰＥＧ－トリアゾール含有量を有する（したがって選択可能性が増加する）ゲルのタイムラプスビデオを撮影した。１００％ＰＥＧ－トリアゾール弾性ゲル対照は、注射器から排出させることができなかった。しかし、７５％のＰＥＧ－トリアゾールおよび２５％のＨＡ－ヒドラゾンを有するゲルは、注射器から排出することができ、排出後にゲルの形態を維持することができた（図４Ａ～４Ｆ）。 In another exemplary method, the concentration expelled from a standard syringe is increased to determine whether the unique dual gel network disclosed in this example allows a highly elastic gel to become injectable. A time-lapse video was taken of a gel with a PEG-triazole content of 50% (thus increasing selectivity). The 100% PEG-triazole elastomer gel control could not be expelled from the syringe. However, the gel with 75% PEG-triazole and 25% HA-hydrazone could be expelled from the syringe and maintained the gel morphology after expulsion (Figures 4A-4F).

（実施例２）
別の例示的な方法では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を異なる適応性を有するゲルに封入し、ＭＳＣセクレトームプロファイルを材料特性の関数として測定した。まず、ラットＭＳＣを、ペニシリン・ストレプトマイシン、ファンギゾンおよび１０％ＦＢＳを補充した低グルコースダルベッコ改変イーグル中で培養した。開示された例示的な方法では、継代５～６の間のＭＳＣを使用した。次に、ゲルネットワークＨＡ－ヒドラゾンとＰＥＧ－トリアゾールの組み合わせを有するヒドロゲルを実施例１に記載のように調製し、この実施例では「ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワーク」と呼んだ。ＭＳＣは、１００万細胞／ｍＬ～５００万細胞／ｍＬの間の密度でＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークに封入した。ＭＳＣの形態を、核（ＤＡＰＩ）およびアクチン細胞骨格を免疫染色する（ローダミンファロイジン）ことによって定量化し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像化した。 (Example 2)
In another exemplary method, mesenchymal stem cells (MSCs) were encapsulated in gels with different properties and MSC secretome profiles were measured as a function of material properties. First, rat MSCs were cultured in low glucose Dulbecco's modified Eagle supplemented with penicillin-streptomycin, fungizone and 10% FBS. The exemplary methods disclosed used MSCs between passages 5-6. Next, a hydrogel with a combination of gel network HA-hydrazone and PEG-triazole was prepared as described in Example 1 and was referred to in this example as "PEG-HA dual network." MSCs were encapsulated in the PEG-HA dual network at a density between 1 million cells/mL and 5 million cells/mL. MSC morphology was quantified by immunostaining the nucleus (DAPI) and actin cytoskeleton (rhodamine phalloidin) and imaged using laser scanning confocal microscopy.

培養０日および４日後、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークに封入されたＭＳＣの形態を、核（ＤＡＰＩ）およびアクチン細胞骨格を免疫染色する（ローダミンファロイジン）ことによって定量化し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像化した。図５Ａおよび５Ｂは、０％粘弾性組成物（１００％ＰＥＧ－トリアゾールおよび０％ＨＡ－ヒドラゾン）を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内に封入されたＭＳＣの０日後（図５Ａ）および４日後（図５Ｂ）の形態を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、８８％粘弾性組成物（１２％ＰＥＧ－トリアゾールおよび８８％ＨＡ－ヒドラゾン）を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内に封入されたＭＳＣの０日後（図５Ｃ）および４日後（図５Ｄ）の形態を示す。図５Ｅは、応力緩和の関数として特徴付けしたＭＳＣの形態を示す。９２％ＳＲ条件は４日目までに完全に分解したが、８４％および３９％ＳＲ条件は両方とも顕著な細胞広がりを示し、それぞれ具現化率は１．２５および１．２０であった。９％～２％ＳＲ製剤中のＭＳＣは球形のままであり、具現化率は１．２０未満であった。 After 0 and 4 days of culture, the morphology of MSCs encapsulated in the PEG-HA dual network was quantified by immunostaining the nucleus (DAPI) and actin cytoskeleton (rhodamine phalloidin) using laser scanning confocal microscopy. and imaged it. Figures 5A and 5B show MSCs encapsulated within PEG-HA dual network gels with 0% viscoelastic composition (100% PEG-triazole and 0% HA-hydrazone) after 0 days (Figure 5A) and 4 days ( Figure 5B) is shown. Figures 5C and 5D show MSCs encapsulated within a PEG-HA dual network gel with an 88% viscoelastic composition (12% PEG-triazole and 88% HA-hydrazone) after 0 days (Figure 5C) and 4 days ( Figure 5D) is shown. Figure 5E shows the morphology of MSCs characterized as a function of stress relaxation. The 92% SR condition completely degraded by day 4, whereas the 84% and 39% SR conditions both showed significant cell spreading, with realization rates of 1.25 and 1.20, respectively. MSCs in the 9% to 2% SR formulations remained spherical with an embedding ratio of less than 1.20.

（実施例３）
別の例示的な方法では、ラット間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）を、ここで１ｍＭのＲＤＧペプチドリガンドＫＲＧＤＳ（配列番号８）を含有する同じＨＡ－ＰＥＧヒドロゲル製剤に１００万細胞／ｍｌの密度で封入した。ＲＧＤは、ベンズアルデヒド基で官能化されているためＨＡ－Ｈｙｄに結合しており、したがってｒＭＳＣと相互作用することができる。まず、ｒＭＳＣの生存率を、カルセインＡＭおよびエチジウムホモ二量体のｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色を使用して測定した。２４時間後、すべての試料で８５％超の生存率が測定された（図６Ａ）。次に、ｒＭＳＣの形態を、マトリックス応力緩和の関数として調査した（図６Ｂ）。４日間の培養後、ｒＭＳＣを含むヒドロゲルを固定および染色して、共焦点顕微鏡で細胞骨格形態（Ｆ－アクチン、緑色）および核形状（Ｄａｐｉ、青色）を視覚化した（図６Ｈ）。実験の過程で、１００％粘弾性製剤は完全に分解され、これはおそらく、ｒＭＳＣ分泌プロテアーゼと、培地中のアルデヒドと血清タンパク質の潜在的な反応との組み合わせによるものであり、これらの両方によって効果的に架橋が破壊された。この観察によって、長期の細胞研究のために純粋なヒドラゾン材料を安定化する必要性がさらに強調された。１００％ＳＰＡＡＣ（弾性）ヒドロゲルでは、ｒＭＳＣは比較的球形のままであり、具現化率はほぼ１．０のままで、０日目から４日目まで有意差はなかった（図６Ｃ）。対照的に、粘弾性が最も高い状態、すなわち８８％にあるｒＭＳＣは、４日目までに大幅に大きくなり、より広がり、伸長した。０日目から４日目までの培養の時間経過にわたって、８８％粘弾性ヒドロゲルにおける周囲のネットワークの物理的リモデリングにより、細胞具現化率は１．２０を超えるまで増加した。興味深いことに、２５、５０、および７５％の粘弾性条件におけるｒＭＳＣは、ほぼ球形のままであり、４日目までに顕著な広がりを示さなかった（図６Ｃ～６Ｇ）。これにより、形態に影響を与えるために臨界量の粘弾性、つまり再配置に必要な細胞周囲架橋の量が生じた。これは、おそらく、他の条件では４日後に１．２０未満の具現化率が示されたため、ｒＭＳＣがより長い緩和時間と比較して２時間程度のより速い応力緩和でネットワークに応答したためであると考えられる（図６Ｈ）。 (Example 3)
In another exemplary method, rat mesenchymal stem cells (rMSCs) are encapsulated at a density of 1 million cells/ml in the same HA-PEG hydrogel formulation, now containing 1 mM of the RDG peptide ligand KRGDS (SEQ ID NO: 8). did. RGD is bound to HA-Hyd because it is functionalized with benzaldehyde groups and is therefore able to interact with rMSCs. First, rMSC viability was measured using calcein AM and ethidium homodimer live/dead staining. After 24 hours, >85% viability was measured in all samples (Figure 6A). Next, the morphology of rMSCs was investigated as a function of matrix stress relaxation (Figure 6B). After 4 days of culture, hydrogels containing rMSCs were fixed and stained to visualize cytoskeletal morphology (F-actin, green) and nuclear shape (Dapi, blue) with confocal microscopy (Figure 6H). During the course of the experiment, the 100% viscoelastic formulation was completely degraded, likely due to a combination of rMSC-secreted proteases and the potential reaction of aldehydes and serum proteins in the medium, both of which contributed to the effect. The bridge was destroyed. This observation further emphasizes the need to stabilize pure hydrazone materials for long-term cellular studies. In the 100% SPAAC (elastic) hydrogel, rMSCs remained relatively spherical and the embodyment ratio remained approximately 1.0 with no significant difference from day 0 to day 4 (Figure 6C). In contrast, rMSCs in the highest viscoelastic state, 88%, were significantly larger, more spread out, and elongated by day 4. Over the time course of culture from day 0 to day 4, the cell embodiment ratio increased to over 1.20 due to physical remodeling of the surrounding network in the 88% viscoelastic hydrogel. Interestingly, rMSCs at 25, 50, and 75% viscoelastic conditions remained nearly spherical and did not exhibit significant spreading by day 4 (Figures 6C-6G). This created a critical amount of viscoelasticity, the amount of pericellular cross-linking required for rearrangement, to affect morphology. This is probably because rMSCs responded to the network with a faster stress relaxation on the order of 2 hours compared to a longer relaxation time, as other conditions showed an realization ratio of less than 1.20 after 4 days. It is considered that (Fig. 6H).

これらの例示的な方法では、すべての条件にわたって、約８８％のアルキルヒドラゾン架橋で封入されたｒＭＳＣ（例えば、適応性が高いが、長期培養に安定である）を使用すると、ある特定の他の条件と比較して、４日目までに顕著な広がりが実証された。（図６Ｊ）。０日目から４日目までの培養の時間経過にわたって、細胞のアスペクト比はおよそ１．０から１．６０±０．１８を超えるまで増加し、これは周囲ネットワークの物理的リモデリングを示していた。０、２５、５０、および７５％のアルキルヒドラゾン含有ヒドロゲルに封入されたｒＭＳＣは、アスペクト比１．２０±０．０３８以下でほぼ球形のままであり、４日目までに顕著な広がりを示さなかった（図６Ｃ～６Ｇおよび６Ｊ）。対照的に、８８％アルキルヒドラゾンの小さなクラスター内のｒＭＳＣが観察され；この表現型は、他の条件では見られなかった（図６Ｈ）。 In these exemplary methods, the use of rMSCs encapsulated with approximately 88% alkylhydrazone cross-links (e.g., highly adaptable but stable to long-term culture) allows certain other Significant spread was demonstrated by day 4 compared to conditions. (Figure 6J). Over the time course of culture from day 0 to day 4, the cell aspect ratio increased from approximately 1.0 to over 1.60 ± 0.18, indicating physical remodeling of the surrounding network. Ta. rMSCs encapsulated in 0, 25, 50, and 75% alkylhydrazone-containing hydrogels remained nearly spherical with aspect ratios below 1.20 ± 0.038 and did not exhibit significant spreading by day 4. (Figures 6C-6G and 6J). In contrast, rMSCs in small clusters at 88% alkylhydrazone were observed; this phenotype was not seen in other conditions (Fig. 6H).

ネットワーク適応性の関数としての機械的感受性を、核対細胞質のＹＡＰ比の分析によって測定した。４日目までに、８８％粘弾性条件では、それぞれ２．８±１．２および２．８±１．３である平均の核対細胞質比を有する７５％および０％のより遅い応力緩和条件と比較して、平均の核対細胞質比が６．５±１．３で、ＹＡＰのより大きな核局在が実証された。（図６Ｋ～６Ｌ）。これとともに、８８％粘弾性条件下で４日目までに小さな細胞クラスターが再び観察され、ＹＡＰについて染色された（図６Ｍ）。さらに、ＹＡＰ局在化の影響をよりよく理解するために、８８％、７５％、０％の粘弾性条件について細胞および核体積を、４日目に分析した。７５％および０％アルキルヒドラゾン条件と比較して、８８％アルキルヒドラゾン条件では細胞体積が著しく増加し、平均細胞体積はそれぞれ約３２００±１７００μｍ３および３５００±１６００μｍ３であったのに対し、約６１００±４５００μｍ３であった（図６Ｎ）。しかし、核体積はすべての条件にわたって一貫しており、平均体積は約１２００μｍ３であった（図６Ｏ）。 Mechanosensitivity as a function of network fitness was measured by analysis of the nuclear to cytoplasmic YAP ratio. By day 4, 88% viscoelastic conditions, 75% and 0% slower stress relaxation conditions with mean nuclear-to-cytoplasmic ratios of 2.8 ± 1.2 and 2.8 ± 1.3, respectively. A greater nuclear localization of YAP was demonstrated, with an average nuclear-to-cytoplasmic ratio of 6.5±1.3 compared to . (Figures 6K-6L). Along with this, small cell clusters were again observed by day 4 under 88% viscoelastic conditions and stained for YAP (Fig. 6M). Furthermore, to better understand the influence of YAP localization, cell and nuclear volumes were analyzed on day 4 for 88%, 75%, and 0% viscoelastic conditions. Compared to the 75% and 0% alkylhydrazone conditions, the cell volume was significantly increased in the 88% alkylhydrazone condition, with mean cell volumes of approximately 3200 ± 1700 μm and 3500 ± 1600 μm , respectively , whereas approximately 6100 It was ±4500 μm3 (Fig. 6N). However, nuclear volume was consistent across all conditions, with an average volume of approximately 1200 μm (Fig. 6O).

細胞体積の劇的な増加により、ＹＡＰの核対細胞質の比率がよりよく理解された。核体積はすべての条件にわたって比較的同じままでありながら、ＹＡＰシグナルが核内でより多くなるにつれて、ＹＡＰの核内の強度が増大した；対照的に、細胞質内の強度は、（アルキルヒドラゾン結合およびＨＡ含有量の増加に伴い）細胞質体積が増加するにつれて低下した。８８％アルキルヒドラゾン条件における細胞形態およびＹＡＰの変化によって、粘弾性による細胞の広がりおよび形態変化が可能になる、細胞周囲領域の適応性架橋の臨界割合が示唆された。具体的には、ｒＭＳＣは高速応力緩和時間スケール（約２時間）を有するネットワークに応答し、これにより微小環境の再配置が可能になり、形態およびクラスター化の変化が起こった。８８％アルキルヒドラゾン結合条件では、顕著な細胞の広がりおよびＹＡＰ核局在化が実証された。これは、ＨＡ対ＰＥＧのモル比によって説明され、８８％適応性ヒドラゾン結合条件ではＨＡ対ＰＥＧ比が１を超えていたのに対し、その後のすべての条件ではＰＥＧ対ＨＡ比が１を超えていたことが想起される。（ＹＡＰ／ＴＡＺは、細胞の構造、形状、および極性によって定義される細胞の物理的性質の主要なセンサーである。ＹＡＰ／ＴＡＺ活性化は、細胞接着、および細胞が組織足場および周囲のＥＣＭから受ける機械的シグナルなど、細胞の「社会的」挙動も反映する。）
（実施例４）
別の例示的な方法では、ラット間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）の広がりおよび形態を評価した。共有結合による適応性ネットワークにおける細胞の広がりおよび形態には、ミクロンのサイズスケールにわたる複数の結合の緩和の調整が必要である。ｒＭＳＣは代謝的に活性であり、短い培養期間の後でも高濃度のマトリックス分子を沈着させることができる。したがって、本明細書では、マトリックス沈着をヒドロゲルの応力緩和特性の関数として特徴付けた。これは、ｒＭＳＣを含むゲルにおけるｒＭＳＣの新生タンパク質沈着を測定することによって行った。簡単に説明すると、ｒＭＳＣを、細胞密度３００万細胞／ｍｌでＲＧＤを含有するＨＡ－ＰＥＧヒドロゲル製剤に封入した。封入の際、非標準アミノ酸Ｌ－ホモプロピルアルギルグリシン（ＨＰＧ）を、０日目と２日目に１００μＭの濃度で培地に加えた。４日後、ヒドロゲルを固定し、免疫染色した。その後、ＨＰＧを新たに合成されたタンパク質に組み込み、ＨＰＧ上でアジド官能化蛍光色素分子の銅触媒クリック反応を介して沈着したタンパク質の視覚化が可能になり、細胞膜を、共焦点顕微鏡でＨＣＳ ｃｅｌｌ ｍａｓｋ ｂｌｕｅ染色を使用して視覚化した（図７Ａおよび７Ｂ）。ｒＭＳＣは、弾性対照製剤および８８％粘弾性条件で封入した。８８％粘弾性条件では、特にはるかにまばらであった弾性対照と比較して、細胞周囲領域全体にわたって広範なタンパク質沈着を実証した（図７Ｃ）。データを、共焦点顕微鏡によって定量化し、ＩｍａｇｅＪの「ＢｏｎｅＪ」プラグインを使用して分析した。８８％粘弾性条件では、平均タンパク質厚さが１．５±０．３４μｍ、平均最大タンパク質厚さが２．５±０．６２μｍであった。対照的に、１００％ＳＰＡＡＣヒドロゲルは、平均タンパク質厚さが１±０．３６μｍ、平均最大タンパク質厚さが約１．７±０．９２μｍであった（図７Ｄ）。図７Ｅは、約２．５ミクロンおよび１．８ミクロンの２つの極限条件における最大分泌タンパク質厚さを示す。このデータを総合して、ｒＭＳＣが高速応力緩和ヒドロゲル内に、細胞全体を包含する重要な細胞周囲マトリックスを構築する能力を実証した。 The dramatic increase in cell volume allowed a better understanding of the nuclear-to-cytoplasmic ratio of YAP. While the nuclear volume remained relatively the same across all conditions, the intranuclear intensity of YAP increased as the YAP signal became more abundant in the nucleus; in contrast, the intracytoplasmic intensity (alkyl hydrazone binding and with increasing HA content) decreased as cytoplasmic volume increased. Changes in cell morphology and YAP in the 88% alkylhydrazone condition suggested a critical proportion of adaptive cross-linking in the pericellular region that allows viscoelastic cell spreading and morphological changes. Specifically, rMSCs responded to networks with fast stress relaxation time scales (approximately 2 hours), which allowed microenvironment rearrangement and resulted in changes in morphology and clustering. The 88% alkylhydrazone binding condition demonstrated significant cell spreading and YAP nuclear localization. This is explained by the molar ratio of HA to PEG, where the 88% adaptive hydrazone binding condition had an HA to PEG ratio greater than 1, whereas all subsequent conditions had a PEG to HA ratio greater than 1. It reminds me of something. (YAP/TAZ is a major sensor of cell physical properties defined by cell structure, shape, and polarity. It also reflects the “social” behavior of cells, such as the mechanical signals they receive.)
(Example 4)
In another exemplary method, the spread and morphology of rat mesenchymal stem cells (rMSCs) was assessed. Cell spreading and morphology in covalently bonded adaptive networks requires coordination of relaxation of multiple bonds over micron size scales. rMSCs are metabolically active and can deposit high concentrations of matrix molecules even after short culture periods. Therefore, herein we characterized matrix deposition as a function of the stress relaxation properties of the hydrogel. This was done by measuring rMSC nascent protein deposition in gels containing rMSCs. Briefly, rMSCs were encapsulated in an HA-PEG hydrogel formulation containing RGD at a cell density of 3 million cells/ml. During encapsulation, the non-standard amino acid L-homopropylargylglycine (HPG) was added to the medium at a concentration of 100 μM on days 0 and 2. After 4 days, the hydrogels were fixed and immunostained. HPG was then incorporated into newly synthesized proteins, allowing visualization of the deposited proteins via copper-catalyzed click reaction of azide-functionalized fluorophores on HPG, and cell membranes were observed in HCS cells with confocal microscopy. Visualization was performed using mask blue staining (Figures 7A and 7B). rMSCs were encapsulated in an elastic control formulation and 88% viscoelastic conditions. The 88% viscoelastic condition demonstrated extensive protein deposition throughout the pericellular region (Fig. 7C), especially compared to the elastic control, which was much sparser. Data were quantified by confocal microscopy and analyzed using the "BoneJ" plugin for ImageJ. Under 88% viscoelastic conditions, the average protein thickness was 1.5±0.34 μm and the average maximum protein thickness was 2.5±0.62 μm. In contrast, the 100% SPAAC hydrogel had an average protein thickness of 1 ± 0.36 μm and an average maximum protein thickness of approximately 1.7 ± 0.92 μm (Figure 7D). Figure 7E shows the maximum secreted protein thickness at the two extreme conditions of approximately 2.5 microns and 1.8 microns. Together, this data demonstrated the ability of rMSCs to build a significant pericellular matrix that encompasses the entire cell within a fast stress-relaxing hydrogel.

一方法では、７日間の培養後にヒドロゲルを固定し、免疫染色したこと以外は上記と同じ条件下で、弾性対照製剤および８８％粘弾性条件でｒＭＳＣを封入した。図８Ａ～８Ｃは、高粘弾性ヒドロゲル中で多核構造を形成した封入ｒＭＳＣを示す。 In one method, rMSCs were encapsulated in an elastic control formulation and 88% viscoelastic conditions under the same conditions as above, except that the hydrogels were fixed and immunostained after 7 days of culture. Figures 8A-8C show encapsulated rMSCs that formed multinucleated structures in high viscoelastic hydrogels.

次に、ｒＭＳＣを含むゲルにおける新生タンパク質沈着を測定することによって、マトリックス沈着をヒドロゲルの応力緩和特性の関数として特徴付けた。非標準アミノ酸Ｌ－ホモプロピルアルギルグリシン（ＨＰＧ）の組み込みにより、ヒドロゲル内で新生タンパク質を視覚化した。ｒＭＳＣを、すべてのヒドロゲル条件：ヒドロゲルあたり０％、２５％、５０％、７５％、および８８％適応性ヒドラゾン結合、で封入した。図９Ａは、８８％、７５％、および０％粘弾性のタンパク質沈着について有意差のある集団における分泌タンパク質の視覚化の代表的な画像を示し、８８％粘弾性条件からの単一細胞およびクラスター化新生タンパク質沈着の両方を含む。 We next characterized matrix deposition as a function of the stress relaxation properties of the hydrogel by measuring nascent protein deposition in gels containing rMSCs. Nascent proteins were visualized within the hydrogel by incorporation of the non-standard amino acid L-homopropylargylglycine (HPG). rMSCs were encapsulated in all hydrogel conditions: 0%, 25%, 50%, 75%, and 88% adaptive hydrazone binding per hydrogel. Figure 9A shows representative images of visualization of secreted proteins in populations with significant differences for protein deposition at 88%, 75%, and 0% viscoelasticity, with single cells and clusters from the 88% viscoelastic condition. Contains both metaplastic protein deposits.

８８％アルキルヒドラゾン条件では、特に弾性対照と比較して、細胞周囲領域全体にわたって広範なタンパク質沈着を実証した。８８％アルキルヒドラゾン条件では、平均タンパク質厚さが１．４５±０．３８μｍ、および平均最大タンパク質厚さが２．３１±０．７７μｍであった（図９Ｂ～９Ｃ）。７５％アルキルヒドラゾン条件では、平均タンパク質厚さが１．２１±０．３０μｍ、および平均最大タンパク質厚さが約１．８８±０．５９μｍであり、５０、２５、および１００％ＳＰＡＡＣヒドロゲルの平均タンパク質厚さが１．０５±０．２５μｍ以下、および平均最大タンパク質厚さが約１．７±０．５７μｍ以下であった（図９Ｂ～９Ｃ）。沈着新生タンパク質の総面積により、最高速緩和ヒドロゲル（８８％アルキルヒドラゾン）が最大の総新生タンパク質沈着量を有することが示された（図９Ｄ）。 The 88% alkylhydrazone condition demonstrated extensive protein deposition throughout the pericellular region, especially compared to the elastic control. In the 88% alkylhydrazone condition, the average protein thickness was 1.45±0.38 μm and the average maximum protein thickness was 2.31±0.77 μm (FIGS. 9B-9C). In the 75% alkylhydrazone condition, the average protein thickness was 1.21 ± 0.30 μm, and the average maximum protein thickness was approximately 1.88 ± 0.59 μm, with the average protein thickness of 50, 25, and 100% SPAAC hydrogels The thickness was 1.05±0.25 μm or less, and the average maximum protein thickness was about 1.7±0.57 μm or less (FIGS. 9B-9C). The total area of nascent protein deposited showed that the fastest relaxing hydrogel (88% alkylhydrazone) had the greatest amount of total nascent protein deposition (Figure 9D).

８８％アルキルヒドラゾン中のｒＭＳＣを、２つの異なる表現型、すなわち一緒にクラスター化したものと単一細胞として残ったものに分離した。これら２つの群内の細胞を新生タンパク質沈着の総量について分析すると、クラスター内に存在するｒＭＳＣは、単一細胞と比較して高濃度の新生タンパク質を分泌した（図９Ｅ）。この分析をさらに進めるために、沈着した新生タンパク質内のフィブロネクチンおよびコラーゲン含有量の組成を定量化した。封入細胞によって最小限のコラーゲンが沈着したが（データは示さず）、フィブロネクチンは高度に分泌され、８８％アルキルヒドラゾン条件ではｒＭＳＣから伸長する分岐鎖に局在することが示された。０％アルキルヒドラゾン条件では、フィブロネクチン沈着が細胞の周囲に均一に見られた（図９Ｆ～９Ｇ）。総合すると、このデータは、ｒＭＳＣが高速緩和ヒドロゲル内の細胞ニッチの周囲に、高濃度のフィブロネクチンで構成される大きな細胞周囲マトリックスを構築していることを示唆している。 rMSCs in 88% alkylhydrazone were separated into two different phenotypes: those clustered together and those that remained as single cells. When cells within these two groups were analyzed for total amount of nascent protein deposition, rMSCs present in clusters secreted higher concentrations of nascent protein compared to single cells (Fig. 9E). To further this analysis, we quantified the composition of fibronectin and collagen content within the deposited nascent proteins. Although minimal collagen was deposited by the encapsulated cells (data not shown), fibronectin was shown to be highly secreted and localized to branches extending from rMSCs in 88% alkylhydrazone conditions. Under 0% alkylhydrazone conditions, fibronectin deposition was seen uniformly around the cells (FIGS. 9F-9G). Taken together, this data suggests that rMSCs build a large pericellular matrix composed of high concentrations of fibronectin around the cellular niche within the fast-relaxing hydrogel.

本明細書に開示されるこれらのデータは、Ｅｘｏ－１阻害研究を通じて見られるように、細胞周囲マトリックスの形成および組成に対する組成的に規定された応力緩和の影響についてのより深い理解を提供し、これは細胞の機械感知能力にさらに寄与する場合がある。これらの研究は、Ｅｘｏ－１の阻害により、８８％および７５％適応性結合条件の両方で、新生タンパク質沈着がそれぞれ０．９１±０．１１μｍおよび０．９１±０．１４μｍ減少し、０．９４±０．１６μｍの０％適応性結合条件の対照レベルまで減少することを実証した（図１０Ａ～１０Ｂ）。Ｅｘｏ－１阻害細胞のアスペクト比をさらに分析すると、ｒＭＳＣの広がり形態の減少が実証され、８８％および７５％適応性結合条件のアスペクト比はここではそれぞれ１．２７±０．０８１μｍおよび１．２２±０．０７２μｍとなり、これは、１．２６±０．０３４μｍの０％適応性結合対照のものと同様である（図１０Ｃ）。これは、細胞の広がりにつながる機械感知に必要であるため、沈着新生タンパク質の役割の１つの可能性を示した。 These data disclosed herein provide a deeper understanding of the effects of compositionally defined stress relaxation on pericellular matrix formation and composition, as seen through Exo-1 inhibition studies; This may further contribute to the cell's mechanosensing ability. These studies showed that inhibition of Exo-1 reduced nascent protein deposition by 0.91 ± 0.11 μm and 0.91 ± 0.14 μm in both 88% and 75% adaptive binding conditions, respectively; demonstrated a decrease to control levels for 0% adaptive binding conditions of 94±0.16 μm (FIGS. 10A-10B). Further analysis of the aspect ratio of Exo-1 inhibited cells demonstrated a reduction in the spreading morphology of rMSCs, with aspect ratios of 88% and 75% adaptive binding conditions here being 1.27 ± 0.081 μm and 1.22 μm, respectively. ±0.072 μm, which is similar to that of the 0% adaptive binding control of 1.26 ±0.034 μm (FIG. 10C). This pointed to one possible role for deposition nascent proteins, as they are required for mechanosensing leading to cell spreading.

（実施例５）
別の例示的な方法では、材料特性の関数としてＭＳＣセクレトームプロファイルを評価するために、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルへの封入後４日目のＭＳＣの分泌プロファイルを、ラットサイトカインアレイＣ２キットを使用して測定した。すべてのデータを、対照培地を参照アレイとして使用し、ＤＮＡ濃度に対して正規化し、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインのサイトカイン分泌をヒドロゲルの応力緩和の関数として特徴付けた。図１１Ａは、ラットサイトカインアレイＣ２キットで試験されたすべてのサイトカインのヒートマップを示し、図１１Ｂは、アレイアッセイによって検出された炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン分泌の詳しい検証を示す。 (Example 5)
In another exemplary method, to evaluate the secretome profile of MSCs as a function of material properties, the secretion profile of MSCs 4 days after encapsulation in a PEG-HA dual network gel was measured using the Rat Cytokine Array C2 kit. It was measured by All data were normalized to DNA concentration using control medium as a reference array to characterize cytokine secretion of pro- and anti-inflammatory cytokines as a function of hydrogel stress relaxation. FIG. 11A shows a heat map of all cytokines tested with the Rat Cytokine Array C2 kit, and FIG. 11B shows detailed validation of pro- and anti-inflammatory cytokine secretion detected by the array assay.

これらのデータは、より高いレベルの応力緩和を有するヒドロゲルにおいてＭＳＣ分泌プロファイルが増加したことを実証し、粘弾性によって４日後にサイトカイン分泌が調節されたことを示している。４日目では、３９％ＳＲ条件のＭＳＣのサイトカイン分泌レベルが最も高かったが、２％ＳＲ条件のＭＳＣの分泌レベルは最も低かった。特に、ゲルの応力緩和が低減すると抗炎症性サイトカインであるインターロイキン１０（ＩＬ－１０）が減少し、一方、応力緩和が低減すると炎症誘発性サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）が増加した。２５％弾性（７５％粘弾性）条件のＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルは、サイトカインの最大の分泌を実証した。抗炎症性環境の特徴的なサイトカインであるＩＬ－１０は、２５％弾性条件から最も多く分泌され、炎症誘発性環境の特徴的なサイトカインであるＴＮＦ－αは７５％弾性条件から最も多く分泌された。ＩＬ－１０およびＩＬ－６は、より粘弾性のネットワークでは上方制御され、より剛直なネットワークでは減少した。炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－αは、より剛直なネットワーク内でより上方制御された。 These data demonstrate that the MSC secretion profile was increased in hydrogels with higher levels of stress relaxation, indicating that viscoelasticity modulated cytokine secretion after 4 days. On day 4, the cytokine secretion level of MSCs under the 39% SR condition was the highest, but the secretion level of MSCs under the 2% SR condition was the lowest. Specifically, reduced stress relaxation in the gel decreased the anti-inflammatory cytokine interleukin-10 (IL-10), whereas reduced stress relaxation increased the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNFa). . PEG-HA dual network gels at 25% elastic (75% viscoelastic) conditions demonstrated maximum secretion of cytokines. IL-10, a cytokine characteristic of an anti-inflammatory environment, was secreted the most from the 25% elasticity condition, and TNF-α, a cytokine characteristic of the proinflammatory environment, was secreted the most from the 75% elasticity condition. Ta. IL-10 and IL-6 were upregulated in more viscoelastic networks and decreased in more rigid networks. The pro-inflammatory cytokine TNF-α was more upregulated within the more rigid network.

本明細書に開示されるように、これらのデータは、新規なＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークヒドロゲルを、投与によりＭＳＣ細胞の送達、広がり、および／またはＭＳＣサイトカイン分泌を促進するように調整することができることを実証する。例えば、ヒドロゲルの応力緩和（ＰＥＧ－トリアゾール）をもたらすための投与。ＭＳＣ細胞広がりを促進すると、損傷した組織領域への注射後の回復努力が増大することができる。注射部位の炎症環境に対するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルの寄与は、注射部位に局所的な抗炎症緩和をもたらすだけでなく、組織の回復を高めることもできる。 As disclosed herein, these data demonstrate that novel PEG-HA dual network hydrogels can be tailored to enhance MSC cell delivery, spreading, and/or MSC cytokine secretion upon administration. Demonstrate. For example, administration to effect stress relaxation of hydrogels (PEG-triazoles). Promoting MSC cell spread can increase recovery efforts after injection into the injured tissue area. The contribution of the PEG-HA dual network gel to the inflammatory environment at the injection site can not only provide local anti-inflammatory relief at the injection site but also enhance tissue recovery.

実施例１～５で使用した方法
以下の方法論は、本明細書に提供される実施例１～５に開示される例示的な方法において実行した。 Methods Used in Examples 1-5 The following methodology was carried out in the exemplary methods disclosed in Examples 1-5 provided herein.

ＨＡ－アルデヒドの合成および特徴付け。要約すると、Ｈａ（５００ｋＤａ、５００ｍｇ）を５０ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解し、次いで過ヨウ素酸ナトリウム（２６７．５ｍｇ、過ヨウ素酸塩／ＨＡモル比１：１）を反応混合物に加えた。反応物を暗所で２時間撹拌し、続いて７０μＬのエチレングリコール中でクエンチした。次いで、反応物をｄＨ２Ｏ（カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）８０００）に対して３日間透析し、凍結乾燥させた。ＨＡ－Ａｌｄを液体窒素中で急速冷凍させ、さらに使用するまで－２０℃で保存した。ＨＡ－Ａｌｄマクロマーの官能化は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを使用して定量化した。要約すると、ＨＡ－Ａｌｄを２ｗｔ％で溶解し、次いでｄＨ２Ｏ中でカルバジン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ ｃａｒｂａｚｔｅ）（ｔ－Ｂｃ、１％トリクロロ酢酸中）と反応させた。２４時間後、ＨＡ－ＡＬＤ／ｔ－ＢＣおよびｔ－ＢＣ標準を、０．５ｍｌのＴＮＢＳ（０．１四ホウ酸ナトリウム中６ｍＭ、ｐＨ８）と１時間反応させた。次いで、試料を０．５Ｎ塩酸と反応させ、マイクロプレートリーダーで３４０ｎｍにおいて吸光度を測定した（官能化約３５％）。 Synthesis and characterization of HA-aldehydes. Briefly, Ha (500 kDa, 500 mg) was dissolved in 50 mL of dH2O , then sodium periodate (267.5 mg, periodate/HA molar ratio 1:1) was added to the reaction mixture. The reaction was stirred in the dark for 2 hours and then quenched in 70 μL of ethylene glycol. The reaction was then dialyzed against dH 2 O (8000 molecular weight cutoff (MWCO)) for 3 days and lyophilized. HA-Ald was snap frozen in liquid nitrogen and stored at -20°C until further use. Functionalization of the HA-Ald macromer was quantified using a 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) assay. Briefly, HA-Ald was dissolved at 2 wt% and then reacted with tert-Butyl carbazte (t-Bc, in 1% trichloroacetic acid) in dH 2 O. After 24 hours, HA-ALD/t-BC and t-BC standards were reacted with 0.5 ml of TNBS (6 mM in 0.1 sodium tetraborate, pH 8) for 1 hour. The samples were then reacted with 0.5N hydrochloric acid and the absorbance was measured at 340 nm in a microplate reader (approximately 35% functionalization).

ＨＡ－ヒドラジドの合成および特徴付け。要約すると、Ｈａ（６０ｋＤａ、５００ｍｇ）を１００ｍｌ ｄＨ２Ｏに溶解した後、アジピン酸ジヒドラジド（約６．５ｍｇ、＞６０×モル過剰）を反応物に大過剰モルで加え、ｐＨを６．８に調整した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、７７６ｍｇ、４ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、７６５ｍｇ、約６ｍｍｏｌ）を別々にＤＭＳＯ／ｄＨ２Ｏ混合物（１：１）に溶解し、反応物に滴加した。４時間にわたって３０分ごとにｐＨを６．８に調整し、その後２４時間反応させた。溶液をｄＨ２Ｏ（８０００ＭＷＣＯ）に対して３日間透析し、その後凍結乾燥させた。乾燥したら、生成物を秤量し、５ｗｔ％ＮａＣｌ／ｄＨ２Ｏ溶液に溶解し、純粋なエタノール中に沈殿させ、さらに３日間透析した。次に、生成物を液体窒素中で凍結乾燥させ、急速冷凍させ、さらに使用するまで－２０℃で保存した。ＨＡ－Ｈｙｄは。１ＨＮＭＲを使用して特徴付けた（官能化約４０％）。 Synthesis and characterization of HA-hydrazide. Briefly, after dissolving Ha (60 kDa, 500 mg) in 100 ml dH2O , adipic acid dihydrazide (approximately 6.5 mg, >60x molar excess) was added to the reaction in large molar excess to bring the pH to 6.8. It was adjusted. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, 776 mg, 4 mmol) and hydroxybenzotriazole (HOBt, 765 mg, ca. 6 mmol) were separately dissolved in a DMSO/dH 2 O mixture (1:1). , added dropwise to the reaction. The pH was adjusted to 6.8 every 30 minutes for 4 hours, followed by 24 hours of reaction. The solution was dialyzed against dH 2 O (8000 MWCO) for 3 days and then lyophilized. Once dry, the product was weighed, dissolved in 5 wt% NaCl/dH 2 O solution, precipitated into pure ethanol and dialyzed for an additional 3 days. The product was then lyophilized in liquid nitrogen, flash frozen, and stored at -20°C until further use. HA-Hyd. Characterized using 1 H NMR (functionalization approximately 40%).

ＰＥＧ－ＢＣＮの合成および特徴付け。要約すると、８アーム４０ｋＤａ ＰＥＧ－アミン（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌアミン）およびＢＣＮ－ｏＳｕ（０．１ｇ、０．３４３ｍｍｏｌ、１．７ｘ）を５０ｍｌ丸底（ＲＢ）フラスコに加え、８０℃で一晩乾燥させた。最小量の乾燥ＤＭＦをＲＢフラスコに加えて内容物（１０ｍｌ）を溶解させた。次いで、フラスコをアルゴンガス雰囲気下に置き、室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍｍｏｌ、４ｘ）を溶液に加え、反応を一晩放置して進行させた。翌日、反応混合物をｄＨ２Ｏで希釈し、３日間透析した（８０００ＭＷＣＯ）。透析した溶液を３日間凍結乾燥させ、乾燥白色粉末をＰＥＧ－ＢＣＮ生成物として得た（０．９８５ｇ、収率９８％）。末端基の官能化は、１ＨＮＭＲを使用して確認した（官能化＞９５％）。 Synthesis and characterization of PEG-BCN. Briefly, 8-arm 40 kDa PEG-amine (1.0 g, 0.2 mmol amine) and BCN-oSu (0.1 g, 0.343 mmol, 1.7x) were added to a 50 ml round bottom (RB) flask and incubated at 80 °C. Let dry overnight. A minimum amount of dry DMF was added to the RB flask to dissolve the contents (10 ml). The flask was then placed under an argon gas atmosphere and stirred at room temperature. N,N-diisopropylethylamine (0.8 mmol, 4x) was added to the solution and the reaction was allowed to proceed overnight. The next day, the reaction mixture was diluted with dH 2 O and dialyzed for 3 days (8000 MWCO). The dialyzed solution was lyophilized for 3 days to obtain a dry white powder as the PEG-BCN product (0.985 g, 98% yield). Functionalization of end groups was confirmed using 1 H NMR (functionalization >95%).

ペプチド合成。ベンズアルデヒド－ＫＧＲＧＤＳ（配列番号７）は、標準Ｆｍｏｃ化学およびリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｔｒｉｂｕｔｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。要約すると、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）とフェノール（１：１）を９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、および２．５％脱イオン水の溶液に溶解することによって、ペプチド切断溶液を形成した。合成ペプチドを２時間かけて切断した。切断されたペプチドを冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離によって回収し、一晩乾燥させた。次いで、切断されたペプチドを、アセトニトリル：水の直線勾配を使用するＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣ（ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ）Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００）精製によって精製した。精製ペプチドの収集された画分は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法によって同定した。 Peptide synthesis. Benzaldehyde-KGRGDS (SEQ ID NO: 7) was synthesized on a Protein Technologies Tribute Peptide Synthesizer using standard Fmoc chemistry and Linkamide MBHA resin. Briefly, dithiothreitol (DTT) and phenol (1:1) are dissolved in a solution of 95% trifluoroacetic acid (TFA), 2.5% triisopropylsilane (TIPS), and 2.5% deionized water. A peptide cleavage solution was thereby formed. The synthetic peptide was cleaved over a period of 2 hours. The cleaved peptide was precipitated in cold diethyl ether, collected by centrifugation, and dried overnight. The cleaved peptide was then purified by reverse phase HPLC (Waters Delta Prep 4000) purification on a C 18 column using a linear gradient of acetonitrile:water. The collected fractions of purified peptides were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.

ヒドロゲル形成およびレオロジー特徴付け。官能化ＨＡを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に３ｗｔ％で溶解した。官能化ＰＥＧ－ＢＣＮを１０ｗｔ％でＰＢＳに溶解し、アジド－ＰＥＧ３－フェノールアルデヒド（ブロードファーム（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ））架橋剤を、２０ｍＭの濃度で溶解した。ヒドロゲルは、化学量論に基づいて最終ポリマー含有量が３ｗ／ｖ％となるように形成した。インサイチュでのレオロジー測定は、８ｍｍの平行プレート形状を備えたＴＡインスツルメント（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ＤＨＲ－３レオメーターを使用して実行した。ヒドロゲルの形成は、時間掃引（１．０Ｈｚ；０．５％ひずみ）によって評価した。応力緩和実験では、加えられた応力の大部分（＞９０％）を緩和する１００％粘弾性条件の時間によって決まるように、１秒間かけて１０％ひずみを加えた後、６時間の測定を行った。製剤は、ＨＡ－ヒドラジドを効果的にアジドに変換する小分子ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドでＨＡ－ヒドラジドを修飾することにより、ヒドロゲル内に存在するアルキルヒドラゾン結合の割合を変えることによって定義した。製剤は、１００％（純粋なアルキルヒドラゾン）、８８％アルキルヒドラゾン（すなわち、官能性ＨＡ－ヒドラジドアームの１２％がベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化されている）、７５％、５０％、２５％、および０％（純粋なＳＰＡＡＣ、すなわち官能性ＨＡ－ヒドラジドアームの１００％がベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化されている）から構成されており、これらの官能性を達成するために必要な割合のＰＥＧ－ＢＣＮとＨＡが組み込まれている。実験中の蒸発を防ぐために、ヒドロゲルの周囲に鉱油を塗布した。理論モデルは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）の曲線近似アプリケーションを使用して適合させた。 Hydrogel formation and rheological characterization. Functionalized HA was dissolved in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) at 3 wt%. Functionalized PEG-BCN was dissolved in PBS at 10 wt% and azide-PEG3-phenolaldehyde (BroadPharm) crosslinker was dissolved at a concentration of 20 mM. The hydrogel was formed with a final polymer content of 3% w/v based on stoichiometry. In situ rheology measurements were performed using a TA Instruments DHR-3 rheometer with an 8 mm parallel plate geometry. Hydrogel formation was assessed by time sweep (1.0 Hz; 0.5% strain). For stress relaxation experiments, measurements were taken for 6 hours after applying a 10% strain over 1 second, as determined by the time for 100% viscoelastic conditions to relax the majority (>90%) of the applied stress. Ta. The formulation was defined by changing the proportion of alkylhydrazone linkages present within the hydrogel by modifying HA-hydrazide with the small molecule benzaldehyde-PEG-azide, which effectively converts HA-hydrazide to an azide. The formulations are 100% (pure alkylhydrazone), 88% alkylhydrazone (i.e. 12% of the functional HA-hydrazide arms are functionalized with benzaldehyde-PEG-azide), 75%, 50%, 25% , and 0% (pure SPAAC, i.e. 100% of the functionalized HA-hydrazide arms are functionalized with benzaldehyde-PEG-azide) and the proportions necessary to achieve these functionalities. PEG-BCN and HA are incorporated. Mineral oil was applied around the hydrogel to prevent evaporation during the experiment. The theoretical model was fitted using MATLAB®'s curve fitting application.

細胞培養および封入。Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）を増殖させ、培養した。要約すると、継代２で細胞を取得し、成長培地、具体的には１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補充した低グルコース（１ｎｇ／ｍｌグルコース）のダルベッコ改変イーグル培地で継代５まで増殖させた。培地を２４時間後に交換し、その後８０～９０％の細胞コンフルエンシーに達するまで３日ごとに交換した。所望の細胞コンフルエンシーに達したら、細胞を液体窒素中にて継代５で保存した。ヒドロゲルは、１００％（純粋にアルキルヒドラゾン）、８８％、７５％、５０％、２５％、および０％（純粋にＳＰＡＡＣ）の、所望の３ｗｔ％ヒドロゲル製剤の化学量論に基づいて、ＨＡ－Ｈｙｄを、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド架橋剤、およびＫＧＲＧＤＳ（配列番号７）と事前反応させ、それらを一晩反応させることによって製造した。翌日、ＨＡ－Ａｌｄ、ＰＥＧ－ＢＣＮ、およびＰＢＳを、改変注射器バレル内で、化学量論比で混合した。継代５のｒＭＳＣを解凍し、成長培地内に置いた。ｒＭＳＣ懸濁液を遠心分離し（２００ｒｃｆ、５分間）、得られたペレットをＨＡ－Ｈｙｄ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド、ＫＲＧＤＳ混合物中に細胞密度１～５００万細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、ＨＡ－Ａｌｄ、ＰＥＧ－ＢＣＮおよびＰＢＳとともに注射器バレル内で混合した。ヒドロゲルを、柔軟なゲルが形成されるまで（５分以下）反応させた後、ベンズアルデヒド官能化カバースリップ（１００、８８、および７５％条件で）またはアジド官能化カバースリップ（５０、２５、および０％条件で）のいずれかに置き、さらに２分間反応させた後、１ｍｌの成長培地を加えた。 Cell culture and encapsulation. Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells (rMSCs) were expanded and cultured. In summary, cells were obtained at passage 2 and grown in growth medium, specifically Dulbecco's modified low glucose (1 ng/ml glucose) supplemented with 10% FBS, 50 μg/ml streptomycin, and 0.5 μg/ml amphotericin B. The cells were grown in Eagle's medium until passage 5. The medium was changed after 24 hours and then every 3 days until reaching 80-90% cell confluency. Once the desired cell confluency was reached, cells were stored at passage 5 in liquid nitrogen. The hydrogels were HA-based on the desired 3 wt% hydrogel formulation stoichiometry of 100% (purely alkyl hydrazone), 88%, 75%, 50%, 25%, and 0% (purely SPAAC). Hyd was prepared by pre-reacting with benzaldehyde-PEG-azide crosslinker and KGRGDS (SEQ ID NO: 7) and allowing them to react overnight. The next day, HA-Ald, PEG-BCN, and PBS were mixed in stoichiometric ratios in a modified syringe barrel. Passage 5 rMSCs were thawed and placed in growth medium. The rMSC suspension was centrifuged (200 rcf, 5 min) and the resulting pellet was resuspended in a HA-Hyd, benzaldehyde-PEG-azide, KRGDS mixture to a cell density of 1-5 million cells/ml. did. The cell suspension was then mixed with HA-Ald, PEG-BCN and PBS in a syringe barrel. The hydrogels were allowed to react until a flexible gel was formed (5 min or less) and then incubated with benzaldehyde-functionalized coverslips (at 100, 88, and 75% conditions) or azide-functionalized coverslips (at 50, 25, and 0%). % conditions) and allowed to react for an additional 2 minutes, after which 1 ml of growth medium was added.

細胞生存率、形態、およびＹＡＰ。生存率アッセイでは、細胞を、カルセインＡＭ／エチジウムホモ二量体Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ溶液で染色した。形態学的変化およびＹＡＰ（Ｙｅｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ１）を分析するために、ＨＡ－ＰＥＧヒドロゲル中で成長させたｒＭＳＣを、４日間の成長後にホルマリンで固定し（３０分、室温）、その後ＰＢＳですすいだ。固定後、ヒドロゲルを、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し（１時間、室温）、５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中（１時間、室温））を使用して遮断した。試料を、ブロッキング緩衝液中で、ＤＡＰＩ（１：１０００）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７ファロイジン（１：３００）とインキュベート（一晩、４℃）（形態）、またはブロッキング緩衝液中でＤＡＰＩ（１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７ファロイジン（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１：３００）、およびＹＡＰ（１：５００）（ＹＡＰ核：細胞質比）とインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄して過剰な汚れを除去した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０）を使用して蛍光標識ｒＭＳＣを画像化した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して、粒子分析プラグインを使用して形態学的変化を視覚化し、定量化した。Ｉｍａｒｉｓを使用して、ＹＡＰの変化を視覚化し、定量化した。 Cell viability, morphology, and YAP. For viability assays, cells were stained with calcein AM/ethidium homodimer Live/Dead solution. To analyze morphological changes and YAP (Yes-associated Protein 1), rMSCs grown in HA-PEG hydrogels were fixed in formalin (30 min, room temperature) after 4 days of growth and then rinsed with PBS. is. After fixation, the hydrogels were permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS (1 hour, room temperature) and blocked using 5% BSA in PBS (1 hour, room temperature). Samples were incubated (overnight, 4°C) with DAPI (1:1000) and Alexa Flour647 phalloidin (1:300) in blocking buffer (form), or DAPI (1:1000) in blocking buffer; Alexa Flour647 phalloidin (Invitrogen, 1:300) and YAP (1:500) (YAP nuclear:cytoplasmic ratio) were incubated. After washing three times with PBS containing 0.05% Tween 20 (PBST) to remove excess stain, fluorescently labeled rMSCs were imaged using a confocal microscope (Zeiss LSM710). ImageJ (NIH) was used to visualize and quantify morphological changes using the particle analysis plugin. Changes in YAP were visualized and quantified using Imaris.

新生タンパク質沈着。細胞を、３００万細胞／ｍｌの濃度で封入し、０．２０１ｍＭ シスチン、１００μｇ／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、１０％ ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢおよび０．１ｍＭ Ｌ－ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）、を含むグルタミン、メチオニン、シスチン非含有高グルコースＤＭＥＭで培養した。培地を２日ごとに交換した。４日後、ヒドロゲルをホルマリンで固定し（３０分、室温）、その後ＰＢＳで３回（５分、室温）洗浄した。次に、細胞を、ＰＢＳ中のＨＣＳ Ｃｅｌｌ Ｍａｓｋ Ｂｌｕｅ染色（１：１０００、３０分、室温）で染色した。次いで、ヒドロゲルを、１％ＢＳＡで３回さらに洗浄した（１０分間、室温）。洗浄が完了したら、単官能性アジドをＰＢＳに１：５００の希釈率で加えた（４５分、室温）。再度、ヒドロゲルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、硫酸銅溶液中のＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７アジド染料をヒドロゲルに加えた（一晩、４℃）。翌日、ヒドロゲルをＰＢＳで３回洗浄し（１０分間、室温）、次いで画像化した。沈着タンパク質を、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０）を使用して画像化し、沈着タンパク質厚さを定量化した。要約すると、１μｍの細胞切片を包含するＺスライスの最大強度投影を、各チャネルに対して投影し、得られた投影を、Ｏｔｓｕの閾値処理を利用して二値化した。ＨＣＳ Ｃｅｌｌ Ｍａｓｋチャネルを新生タンパク質チャネルから差し引いて、分析される細胞の所定の１μｍ切片の細胞外側に分泌された新生タンパク質のみを示すマスクを得た。分泌されたタンパク質の厚さは、「ＢｏｎｅＪ」プラグイン（ＩｍａｇｅＪ）を使用して定量化し、各スライスの平均厚さならびに最大厚さを報告した。有意性を得るために、細胞ごとに合計５つのスライスを分析し、条件ごとに合計３０個の細胞を分析した。 Nascent protein deposition. Cells were mounted at a concentration of 3 million cells/ml, 0.201 mM cystine, 100 μg/ml sodium pyruvate, 50 μg/ml 2-phospho-L-ascorbic acid trisodium salt, 10% FBS, 50 μg/ml streptomycin, Cultured in glutamine-, methionine-, cystine-free high glucose DMEM containing 0.5 μg/ml amphotericin B and 0.1 mM L-homopropargylglycine (HPG). The medium was changed every two days. After 4 days, the hydrogels were fixed in formalin (30 minutes, room temperature) and then washed three times with PBS (5 minutes, room temperature). Cells were then stained with HCS Cell Mask Blue stain (1:1000, 30 min, room temperature) in PBS. The hydrogel was then further washed three times with 1% BSA (10 minutes, room temperature). Once the washing was complete, the monofunctional azide was added at a dilution of 1:500 in PBS (45 min, room temperature). Again, the hydrogel was washed three times with PBS containing 1% BSA and Alexa Flour 647 azide dye in copper sulfate solution was added to the hydrogel (overnight at 4°C). The next day, the hydrogels were washed three times with PBS (10 min, room temperature) and then imaged. Deposited proteins were imaged using a confocal microscope (Zeiss LSM710) and deposited protein thickness was quantified. Briefly, the maximum intensity projection of a Z slice encompassing a 1 μm cell section was projected for each channel, and the resulting projections were binarized using Otsu thresholding. The HCS Cell Mask channel was subtracted from the nascent protein channel to obtain a mask showing only nascent proteins secreted to the extracellular side of a given 1 μm section of the cell being analyzed. Secreted protein thickness was quantified using the 'BoneJ' plugin (ImageJ) and the average thickness as well as the maximum thickness of each slice was reported. A total of 5 slices per cell were analyzed for significance, and a total of 30 cells per condition.

統計分析。すべてのデータは、条件ごとに３つのヒドロゲルの複製を使用して収集した。各ヒドロゲルについて、少なくとも３０個の細胞を分析した。新生タンパク質沈着では、ヒドロゲルあたり３０個の細胞を分析し、細胞あたり５つのＺスライスを分析した。データは、一元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキー事後比較またはスチューデントのｔ検定を使用して比較した。データは、平均値±標準偏差として提示する。 Statistical analysis. All data were collected using three hydrogel replicates per condition. At least 30 cells were analyzed for each hydrogel. For nascent protein deposition, 30 cells were analyzed per hydrogel and 5 Z slices per cell. Data were compared using one-way ANOVA and Tukey post hoc comparisons or Student's t-test. Data are presented as mean ± standard deviation.

本明細書に開示され特許請求される組成物および方法はすべて、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製し、実行することができる。組成物および方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法および方法の工程または工程の順序に変形形態を適用し得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも、どちらにも関連するある特定の薬剤が、同じかまたは類似の結果を達成する限り、本明細書に記載の薬剤の代わりになり得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。 All compositions and methods disclosed and claimed herein can be made and practiced without undue experimentation in light of this disclosure. Although the compositions and methods have been described with respect to preferred embodiments, variations may be made in the compositions and methods and steps or order of steps of the methods described herein without departing from the concept, spirit and scope of the invention. It will be clear to those skilled in the art that the following can be applied. More specifically, certain agents, both chemically and physiologically related, may be substituted for the agents described herein, so long as they achieve the same or similar results. should be obvious. All such similar substitutes and modifications apparent to those skilled in the art are deemed to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.

Claims (29)

脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む第１のポリマー主鎖；および
少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む第２のポリマー主鎖
を含む、組成物であって、
前記第１および第２のポリマー主鎖の組み合わせが、ハイブリッドネットワークヒドロゲルを生成する、組成物。 a first polymeric backbone comprising at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide; and at least one 8-arm poly(ethylene glycol) ( a second polymer backbone comprising PEG), the composition comprising:
The composition, wherein the combination of the first and second polymer backbones produces a hybrid network hydrogel. 前記少なくとも１つの８アームＰＥＧが、少なくとも１つのひずみシクロオクチンで官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the at least one 8-arm PEG comprises at least one 8-arm PEG functionalized with at least one strained cyclooctyne. 前記少なくとも１つのひずみシクロオクチンがビシクロノニンを含む、請求項２に記載の組成物。 3. The composition of claim 2, wherein the at least one strain of cyclooctyne comprises bicyclononine. 前記第２のポリマー主鎖が、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含み；任意選択でベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。 Composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the second polymer backbone comprises at least one 8-arm PEG; optionally further comprising benzaldehyde-PEG3-azide. 前記少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせが、少なくとも１つのペプチドで修飾されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。 5. The composition of any one of claims 1-4, wherein the at least one hyaluronic acid backbone, PEG macromer, or a combination thereof is modified with at least one peptide. 前記組成物が、前記第１のポリマー主鎖中において、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を含む前記ポリマー主鎖中に２５重量％の総架橋濃度；ならびに、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖中に７５重量％の総架橋濃度を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition comprises, in the first polymer backbone, at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide. 25. The composition of claim 1, comprising a total crosslinking concentration of 25% by weight in the composition; and a total crosslinking concentration of 75% by weight in the second polymer backbone comprising at least one 8-arm PEG. 前記組成物が、幹細胞をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 6, wherein the composition further comprises stem cells. 前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、および間葉系幹細胞のうちの１種または複数を含む、請求項７に記載の組成物。 8. The composition of claim 7, wherein the stem cells include one or more of embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, epithelial stem cells, skin stem cells, and mesenchymal stem cells. 前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物に製剤化されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。 A composition according to any one of claims 1 to 8, wherein the composition is formulated into a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. 前記組成物が、対象への注射または注入用に製剤化される薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物に製剤化される、請求項９に記載の組成物。 10. The composition of claim 9, wherein the composition is formulated into a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier formulated for injection or infusion into a subject. 前記組成物が、健康状態を処置するために使用される少なくとも１種の活性薬剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。 A composition according to any preceding claim, wherein the composition further comprises at least one active agent used to treat a health condition. 対象において少なくとも１か月後に分解する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。 Composition according to any one of claims 1 to 11, which degrades in a subject after at least one month. 前記少なくとも１種の活性薬剤が、前記組成物の分解前、分解後、または分解中に前記組成物から放出可能な活性薬剤を含む、請求項１１に記載の組成物。 12. The composition of claim 11, wherein the at least one active agent comprises an active agent releasable from the composition before, after, or during degradation of the composition. ハイブリッドネットワークヒドロゲルを生成する方法であって、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む１つのポリマー主鎖を、少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む第２のポリマー主鎖と組み合わせる工程を含み、ヒドロゲル形成のために外部刺激を必要としない、方法。 1. A method of producing a hybrid network hydrogel, comprising: a polymer backbone comprising at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide; A method comprising combining with a second polymer backbone comprising at least one 8-arm poly(ethylene glycol) (PEG) and requiring no external stimulus for hydrogel formation. 少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖が、ビシクロノニンで官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む、請求項１４に記載の方法。 15. The method of claim 14, wherein the second polymer backbone comprising at least one 8-arm PEG comprises at least one 8-arm PEG functionalized with bicyclononine. 少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖が、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。 16. The method of claim 14 or 15, wherein the second polymer backbone comprising at least one 8-arm PEG further comprises benzaldehyde-PEG3-azide. 前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和が、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖の濃度の増加と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む前記ポリマー主鎖の濃度の減少とを組み合わせることによって増大する、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。 Stress relaxation of the hybrid network hydrogel comprises increasing the concentration of the second polymer backbone comprising at least one 8-arm PEG and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and functionalized with a hydrazide. 17. A method according to any one of claims 14 to 16, in which the concentration of the polymer backbone comprising at least one hyaluronic acid backbone is increased in combination with a decrease in the concentration of the polymer backbone comprising at least one hyaluronic acid backbone. 前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和が、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖の濃度の減少と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む前記ポリマー主鎖の濃度の増加とを組み合わせることによって低減する、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。 Stress relaxation of the hybrid network hydrogel comprises reducing the concentration of the second polymer backbone comprising at least one 8-arm PEG and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and functionalized with a hydrazide. 17. A method according to any one of claims 14 to 16, wherein the method comprises increasing the concentration of the polymer backbone comprising at least one hyaluronic acid backbone. 前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルが、少なくとも１つの幹細胞をさらに含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。 19. The method of any one of claims 14-18, wherein the hybrid network hydrogel further comprises at least one stem cell. 少なくとも１つの幹細胞が前記ハイブリッドネットワークヒドロゲル中に存在する場合、前記少なくとも１つの幹細胞の遊走を増大させるために、前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を低減させる工程をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。 20. When at least one stem cell is present in the hybrid network hydrogel, further comprising reducing stress relaxation of the hybrid network hydrogel to increase migration of the at least one stem cell. the method of. 少なくとも１つの幹細胞が前記ハイブリッドネットワークヒドロゲル中に存在する場合、前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を低減させる工程、および前記少なくとも１つの幹細胞からの少なくとも１種の抗炎症性サイトカインの分泌を増加させる工程をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。 when at least one stem cell is present in the hybrid network hydrogel, reducing stress relaxation of the hybrid network hydrogel; and increasing secretion of at least one anti-inflammatory cytokine from the at least one stem cell. 20. The method of claim 18 or 19, further comprising. 少なくとも１つの幹細胞が前記ハイブリッドネットワークヒドロゲル中に存在する場合、前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を増大させる工程、および前記少なくとも１つの幹細胞からの少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの分泌を増加させる工程をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。 when at least one stem cell is present in the hybrid network hydrogel, increasing the stress relaxation of the hybrid network hydrogel; and increasing the secretion of at least one pro-inflammatory cytokine from the at least one stem cell. 20. The method of claim 18 or 19, further comprising. 少なくとも１つの幹細胞を含む前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を低減させる工程、および前記少なくとも１つの幹細胞の少なくとも１つの多核構造の形成を増大させる工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。 20. The method of claim 19, further comprising reducing stress relaxation of the hybrid network hydrogel comprising at least one stem cell and increasing formation of at least one multinucleated structure of the at least one stem cell. 対象における健康状態を処置する、発症軽減する、進行軽減する、または予防する方法であって、請求項９～１３のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 A method of treating, reducing the onset, reducing the progression of, or preventing a health condition in a subject, the method comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a composition according to any one of claims 9 to 13. including methods. 前記健康状態が、炎症状態、自己免疫状態、血管状態、整形外科状態、がん、形成手術、組織もしくは器官の外傷、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the health condition comprises an inflammatory condition, an autoimmune condition, a vascular condition, an orthopedic condition, cancer, plastic surgery, tissue or organ trauma, or a combination thereof. 前記組成物を投与する工程が、注射により投与する工程を含む、請求項２４または２５に記載の方法。 26. The method of claim 24 or 25, wherein administering the composition comprises administering by injection. 投与する工程が、前記健康状態を有する前記対象の患部に直接投与する工程を含む、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein administering comprises administering directly to an affected area of the subject having the health condition. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物と、少なくとも１つの容器とを含む、キット。 A kit comprising a composition according to any one of claims 1 to 13 and at least one container. 脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含むポリマー主鎖；および少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む少なくとも１つの第２のポリマー主鎖を含む、請求項２８に記載のキット。 a polymer backbone comprising at least one hyaluronic acid backbone functionalized with an aliphatic aldehyde and at least one hyaluronic acid backbone functionalized with a hydrazide; and at least one 8-arm poly(ethylene glycol) (PEG). 29. The kit of claim 28, comprising at least one second polymer backbone comprising:
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