JP2024505885A

JP2024505885A - リソソーム酸リパーゼ欠損症（ｌａｌ－ｄ）の治療のための材料及び方法

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Publication number: JP2024505885A
Application number: JP2023545272A
Authority: JP
Inventors: ポールテイラーマーティン，
Original assignee: リサーチインスティチュートアットネイションワイドチルドレンズホスピタル
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2022-01-26
Publication date: 2024-02-08
Also published as: US20240115735A1; WO2022164860A1; AU2022212922A1; EP4284413A1; CA3209471A1; IL304677A

Abstract

本開示は、ウォルマン病及びコレステロールエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）などのリソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）障害の治療のために設計された、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの、遺伝子療法ベクターを提供する。開示されるｒＡＡＶは、必要とする対象に野生型リパーゼＡ（ＬＩＰＡ）ｃＤＮＡを提供し、これは野生型タンパク質の発現をもたらす。

Description

この出願は、本開示の別個の部分として、参照によってその全体が組み込まれ、以下のように特定されるコンピュータ可読形態での配列表を含む：５４７４３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１４，２６６バイト、作成日：２０２２年１月２１日。

本開示は、ウォルマン病及びコレステロールエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）などのリソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）障害の治療のために設計された、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの、遺伝子療法ベクターを提供する。開示されるｒＡＡＶは、必要とする対象に野生型ヒトリパーゼＡ（ＬＩＰＡ）ｃＤＮＡを提供し、これは野生型ヒトＬＡＬタンパク質の発現をもたらす。

リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）は、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質が、リソソームにおいてコレステロールエステルを遊離コレステロールに、及びトリグリセリドを遊離脂肪酸に十分に加水分解させることを失敗することをもたらす、リパーゼＡ（ＬＩＰＡ）遺伝子における劣性変異によって引き起こされるリソソーム貯蔵障害である。ＬＡＬは、特に肝臓及び脾臓における、血漿リポタンパク質レベルの制御において、及び細胞脂質過負荷の防止において、重要かつ不可欠な位置を占める（Ｌｉｅｔａｌ．，ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂＶａｓｃＢｉｏｌ３９：８５０－８５６，２０１９、Ａｇｕｉｓａｎｄａｅｔａｌ．ＣｕｒｒＣｈｅｍＧｅｎｏｍＴｒａｎｓｌＭｅｄ１１：１－１８，２０１７）。ＬＩＰＡ遺伝子は、ヒトゲノムにおいてこのリソソーム機能を有する唯一の遺伝子である。ＬＡＬ－Ｄは、稀な遺伝性疾患であり、有病率は、４０，０００分の１～３００，０００分の１の範囲であるが、疾患発生率は、いくつかの事例では、診断の失敗を通して過小評価され得る（Ｐａｓｔｏｒｅｓｅｔａｌ．，ＬｙｓｏｓｏｍａｌＡｃｉｄＬｉｐａｓｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＯｐｔｉｏｎｓ．ＤｒｕｇＤｅｓＤｅｖｅｌＴｈｅｒ１４：５９１－６０１，２０２０）。

ヌルＬＩＰＡ遺伝子変異は、最初の症例のうちの１つを報告した、ＭｏｓｈｅＷｏｌｍａｎにちなんで命名された乳児の致命的な疾患である、ウォルマン病（ＷＤ）を引き起こす（Ａｂｒｏｍｏｖｅｔａｌ．，ＡＭＡＪＤｉｓＣｈｉｌｄ９１：２８２－２８６，１９５６）。ＷＤは、肝臓機能障害、脂質異常症（低減したＨＤＬ－コレステロールで上昇した血清トリグリセリド及びＬＤＬ－コレステロール）、肝脾腫大症、肺線維症、並びに副腎石灰化及び機能不全を伴う肝腫大症を特徴とする。乳児は、生後１ヶ月で疾患を発症し、発育不良となり、肝臓疾患と腸内膜を通して栄養素を吸収することができないこととの組み合わせに起因する可能性が高い。未治療ＷＤ乳児の寿命中央値は、３．７ヶ月である。機能の部分的な喪失、通常は正常活性の１～１２％でのＬＩＰＡ変異は、後期発症の、それほど重篤ではない疾患形態である、コレステロール－エステル蓄積症（ＣＥＳＤ）を引き起こす。ＣＥＳＤは、早期死亡をもたらさずに済むが、肝線維症及び肝硬変（並びにまた肝不全）を含む、著しい罹患率と関連している。ＬＡＬ－Ｄにおける慢性脂質異常症はまた、進行性アテローム性動脈硬化、心筋梗塞を含む、心疾患、及び脳卒中を含む脳血管合併症の高リスクを引き起こし得る。ＬＡＬ－Ｄ患者における肝生検は、典型的には、疾患が進行するにつれて線維症及び肝硬変を伴う、クッパー細胞及び肝細胞が関与する微小血管及び大血管脂肪変性を実証する。ゴーシェ病及びニーマン－ピック病などの他のリソソーム貯蔵障害とは異なり、主要なＣＮＳ関与はないように思われる（ただし、組織学的研究は欠如している）。
ＬＡＬ－Ｄは、稀な遺伝性障害であるが、ＬＡＬ－Ｄにおける病理所見は、一般集団において見られるよりも大きく、はるかにより一般的な重要な健康問題に言及する。例えば、低減したＬＡＬ－Ｄ活性は、非アルコール性脂肪性肝疾患、何百万人もの米国の成人及び小児に影響を及ぼす疾患のバイオマーカーである。ＬＡＬ活性におけるそのような低減は、肝疾患の重症度が増加するのに伴って進行性であり、ＬＩＰＡ酵素活性は、単純脂肪肝から非アルコール性脂肪性肝炎から特発性肝硬変まで減少する。加えて、冠動脈疾患に強く関連するＬＩＰＡハプロタイプがある［１０、１１］。ＬＡＬ－Ｄにおける脂肪酸の蓄積は、病的肥満及びＩＩ型糖尿病に関連する肥満などのヒト状態を模倣する。ＡＡＶがいかに容易に肝臓を形質導入するか、及び肝臓がリポタンパク質ベースの代謝を制御していることがいかに重要であるかを考慮すると、ＬＩＰＡ遺伝子療法は、これらの他の障害における脂肪吸収とのＬＡＬ－Ｄの関係に基づいて、肥満に関連するこれらの他の遺伝的、及び更には非遺伝的ヒト疾患に適用され得ると考えられる。

Ｌｉｅｔａｌ．，ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂＶａｓｃＢｉｏｌ３９：８５０－８５６，２０１９Ａｇｕｉｓａｎｄａｅｔａｌ．ＣｕｒｒＣｈｅｍＧｅｎｏｍＴｒａｎｓｌＭｅｄ１１：１－１８，２０１７Ｐａｓｔｏｒｅｓｅｔａｌ．，ＬｙｓｏｓｏｍａｌＡｃｉｄＬｉｐａｓｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＯｐｔｉｏｎｓ．ＤｒｕｇＤｅｓＤｅｖｅｌＴｈｅｒ１４：５９１－６０１，２０２０Ａｂｒｏｍｏｖｅｔａｌ．，ＡＭＡＪＤｉｓＣｈｉｌｄ９１：２８２－２８６，１９５６

本開示は、ＬＩＰＡ遺伝子における変異によって引き起こされる障害及び脂質蓄積及び貯蔵に関連する非遺伝性障害を含む、ＬＡＬ－Ｄのための遺伝子置換療法において使用される臨床ＡＡＶベクターを提供する。

一態様では、本明細書において、（ａ）１つ以上の調節制御要素及び（ｂ）ＬＩＰＡｃＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドが記載される。いくつかの実施形態では、調節制御要素は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又は調節制御若しくはプロモーター活性を保持するその断片を含む、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５のヌクレオチド配列を有する後期ＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＰＡｃＤＮＡは、ＬＩＰＡバリアント１ｃＤＮＡであり、ＬＩＰＡｃＤＮＡは、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、本開示は、機能的リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供し、ヌクレオチドは、配列番号１に対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、更により典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し、タンパク質は、リソソームにおいてコレステロールエステルを遊離コレステロールに、及びトリグリセリドを遊離酸に加水分解する活性などの、ＬＡＬ活性を保持する。例えば、機能的ＬＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＬＩＰＡタンパク質の機能に影響を及ぼす１つ以上の塩基対置換、欠失、又は挿入を含み得る。更に、機能的ＬＩＰＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１つ以上の塩基対置換、欠失、又は挿入を含み得、ＬＡＬタンパク質の発現を増加又は低減し得、発現パターンにおけるこの変化は、ＬＡＬ－Ｄ又は脂質貯蔵及び蓄積に関連する障害の治療のために所望され得る。

別の実施形態では、本開示は、機能的ＬＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供し、タンパク質は、配列番号２に対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、更により典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、タンパク質は、リソソームにおいてコレステロールエステルを遊離コレステロールに、及びトリグリセリドを遊離酸に加水分解する活性などの、ＬＡＬ活性を保持する。例えば、機能的ＬＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＬＡＬタンパク質の機能に影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含み得る。

核酸又はアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一パーセント」という用語は、最大限の対応のためにアラインされるときに同じである２つの配列における残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長であり得るか、又は少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドなど、より小さい断片間の同一性もまた所望され得る。配列の同一性パーセントは、当該技術分野で知られている技法によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、及びＢＬＡＳＴなどの容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。一実施形態では、ＢＬＡＳＴがアラインメントツールとして使用される場合、次のデフォルトパラメータ、遺伝暗号＝標準；ｆｉｌｔｅｒ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリクッス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０個の配列；並べ替え＝高得点；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳＋スイスプロテイン＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。

別の態様では、本開示は、配列番号４のヌクレオチド配列を含むプラスミドに含有されるｒＡＡＶ構築物を提供する。例えば、ｒｓｃｒＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡベクターは、配列番号４のＩＴＲ内にあり、かつそれを含む、ヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ヒトＬＩＰＡ遺伝子のコード配列、ＳＶ４０後期ポリＡ、及び３’ＩＴＲを含む。この実施形態では、３’ＩＴＲは、一本鎖ウイルスゲノムのＲｅｐタンパク質ニッキングを阻害する末端分解部位（ｄＴＲ）の欠失を含有する。３’ＩＴＲにおけるｄＴＲの存在は、ウイルスゲノムのそれ自体への自己相補的結合を増加させ、これは、二本鎖ウイルスゲノムがウイルスカプシド内にパッケージングされることを可能にするその小さい（２．２ｋＢ）サイズのためであり得る。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡの自己相補的性質は、一本鎖ウイルスゲノムとして残る構築物と比較して、遺伝子発現の速度及び程度の両方を促進する。一実施形態では、ベクターは、配列番号４のヌクレオチド１８５３－３９０６を含む。ＩＴＲ内のヌクレオチドは、順方向又は逆方向の配位であり得る。例えば、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列、ヒトＬＩＰＡ遺伝子配列、及びＳＶ４０後期ポリＡ配列は、順方向又は逆方向の配位であり得る。別の実施形態では、ベクターは、配列番号４の１－４３９７のヌクレオチドに対して、約少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。配列番号４に示されるプラスミドは、カナマイシン耐性及び複製起点を更に含む。

別の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、若しくはＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、又はそれらの誘導体のものである。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター及びＬＩＰＡｃＤＮＡを含む。例示的なゲノムは、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、及びＬＩＰＡｃＤＮＡ、例えば、ｒｓｃｒＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ、配列番号４のヌクレオチド１８５３－３９０６として示されるｒＡＡＶを含む。小型化ＣＭＶプロモーターは、より大きなサイズを有するプロモーターで可能ではない、自己相補的二本鎖ウイルスゲノムのＡＡＶパッケージングを可能にする。

別の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む、ｒＡＡＶ粒子が本明細書に記載される。

組成物は、本明細書に記載されるｒＡＡＶのいずれか又は本明細書に記載されるウイルス粒子のいずれかを含む。開示される組成物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、くも膜下送達、腹腔内送達、動脈内送達、又は静脈内送達などの、任意の送達手段のために製剤化され得る。

加えて、開示される組成物は、静脈内送達又は腹腔内送達のために製剤化され、約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、例えば、８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ又はｒＡＡＶ粒子の用量を含む。

本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子を投与することを含む、ＬＡＬ－Ｄ又は脂質貯蔵若しくは蓄積に関連した障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法が具体的に企図される。いくつかの実施形態では、方法は、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子の前、後、又はそれと同時に免疫抑制剤を投与することを更に含む。ＬＡＬ－Ｄは、ウォルマン病又はコレステロールエステル蓄積症などの、ＬＩＰＡ遺伝子における変異によって引き起こされる障害又は疾患を含む。脂質貯蔵又は蓄積に関連する障害としては、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患が挙げられる。

本開示はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子を投与することを含む、脂質異常症又は高コレステロール血症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子の前、後、又はそれと同時に免疫抑制剤を投与することを更に含む。

本開示はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子を投与することを含む、トリグリセリド、コレステロール、及び／又は脂肪酸の減少を必要とする対象においてそれを減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子の前、後、又はそれと同時に免疫抑制剤を投与することを更に含む。

開示される方法のいずれにおいても、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子、又は組成物は、対象に静脈内送達される。いくつかの実施形態では、方法は、免疫抑制剤を投与するステップを更に含む。例えば、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子、又は組成物は、プレドニゾン、プレドニゾロン、ラパマイシン、メトトレキサート、ミオフェノレートモフェチル、タクロリムス、ミコフェノレート、又はリツキシマブなどの、免疫抑制剤の投与と同時に、その前に、又はその後に投与される。方法のうちのいずれにおいても、対象は、ＬＩＰＡ遺伝子における変異を有する。これらの変異は、本明細書における表１に示されるものなどの、現在知られているもの、又はＬＡＬ－Ｄに関連する将来特定されるＬＩＰＡ遺伝子における変異を含む。

本明細書で使用される、「対象」は、任意の動物であり得、患者と称されてもよい。好ましくは、対象は、脊椎動物であり、より好ましくは、対象は、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）又はペット（例えば、イヌ、ネコ）などの、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、１～１０歳の年齢の範囲の対象であり、対象は、１ヶ月～１２ヶ月の年齢の範囲の乳児である。いくつかの実施形態では、対象は、４～１５歳である。対象は、一実施形態では、青年期対象であり、例えば、１０～１９歳の範囲の対象である。他の実施形態では、対象は、成人（１８歳以上）である。

別の態様では、ＬＡＬ－Ｄ又は脂質貯蔵若しくは蓄積に関連する障害の治療のための医薬品の調製における、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子の使用が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＬＡＬ－Ｄは、ウォルマン病又はコレステロールエステル蓄積症である。追加の実施形態では、脂質貯蔵又は蓄積に関連する障害は、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患である。

加えて、脂質異常症又は高コレステロール血症の治療を必要とする対象におけるそれを行うための医薬品の調製における、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子の使用が本明細書に記載される。

本開示はまた、トリグリセリド、コレステロール、及び／又は脂肪酸の減少を必要とする対象におけるそれを減少させるための医薬品の調製における、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、又はｒＡＡＶ粒子の使用を提供する。

例えば、開示される医薬品のいずれかは、静脈内又は腹腔内送達のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬品は、プレドニゾン、プレドニゾロン、ラパマイシン、メトトレキサート、ミオフェノレートモフェチル、タクロリムス、ミコフェノレート、又はリツキシマブなどの、免疫抑制剤の投与と同時に、その前に、又はその後に投与される。

別の態様では、ＬＡＬ－Ｄ又は脂質貯蔵若しくは蓄積に関連する障害の治療のための、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子、又は本明細書に記載される組成物を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＬＡＬ－Ｄは、ウォルマン病又はコレステロールエステル蓄積症である。追加の実施形態では、脂質貯蔵又は蓄積に関連する障害は、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患である。

加えて、脂質異常症又は高コレステロール血症の治療を必要とする対象においてそれを行うための、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子、又は本明細書に記載される組成物を含む、組成物が本明細書に記載される。

更なる態様では、トリグリセリド、コレステロール、及び／又は脂肪酸の減少を必要とする対象においてそれを減少させるための、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子、又は本明細書に記載される組成物を含む、組成物が本明細書に記載される。

例えば、開示される組成物のいずれかは、静脈内又は腹腔内送達のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫抑制剤の投与と同時に、その前に、又はその後に投与される。別の実施形態では、組成物は、免疫抑制剤を更に含む。例示的な免疫抑制剤としては、プレドニゾン、プレドニゾロン、ラパマイシン、メトトレキサート、ミオフェノレートモフェチル、タクロリムス、ミコフェノレート、又はリツキシマブが挙げられる。

ｒｓｃｒＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡの概略図を提供する。血清が４ヶ月齢の治療済及び未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける肝臓酵素を測定することを実証する。野生型（ＷＴ）、模擬治療済Ｌｉｐａ^－／－、及びｒＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡ治療済Ｌｉｐａ^－／－マウス（出生後１日目に８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＩＶで治療され、４ｍｏで分析された）由来の血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性。誤差は、ほぼ均等な雄及び雌の表示を有する、ｎ＝６（ＷＴ）、７（Ｌｉｐａ^－／－）、又は８（Ｌｉｐａ^－／－治療済）マウス／ｇｒｐのＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。４ヶ月齢での血清ＬＤＬ－コレステロールレベルを実証する。野生型（ＷＴ）、模擬治療済Ｌｉｐａ^－／－、及びｒＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡ治療済Ｌｉｐａ^－／－マウス（出生後１日目に８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＩＶで治療され、４ｍｏで分析された）由来の血清中のＬＤＬ－コレステロールレベル。誤差は、ｎ＝６（ＷＴ）、７（Ｌｉｐａ^－／－）、又は８（Ｌｉｐａ^－／－治療済）マウス／ｇｒｐのＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１野生型と比較した治療済及び未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける体重及び臓器重量の比較を提供する。（Ａ）総体重、（Ｂ）肝臓重量、（Ｃ）脾臓重量、（Ｄ）腸重量、（Ｅ）心臓重量、（Ｆ）腎臓重量、（Ｇ）脳重量、及び（Ｈ）筋肉重量を比較した。治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスに、出生後１日目（Ｐ１）にＩＶ用量の８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡを与え、６ヶ月齢で分析した。誤差は、ｎ＝４～５／ｇｒｐのＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｌｉｐａ^－／－マウスは体重が増加するが、これはある特定の臓器（肝臓及び脾臓）の臓器重量における劇的な増加と比較して薄くなることに留意されたい。他の臓器（腎臓及び心臓）では軽度の体重増加があるが、他（例えば、筋肉、腸における脂肪沈着による栄養欠損に起因する可能性が高い）では体重増加がないか（脳）、又は低減している。野生型と比較した治療済及び未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける体重及び臓器重量の比較を提供する。（Ａ）総体重、（Ｂ）肝臓重量、（Ｃ）脾臓重量、（Ｄ）腸重量、（Ｅ）心臓重量、（Ｆ）腎臓重量、（Ｇ）脳重量、及び（Ｈ）筋肉重量を比較した。治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスに、出生後１日目（Ｐ１）にＩＶ用量の８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡを与え、６ヶ月齢で分析した。誤差は、ｎ＝４～５／ｇｒｐのＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｌｉｐａ^－／－マウスは体重が増加するが、これはある特定の臓器（肝臓及び脾臓）の臓器重量における劇的な増加と比較して薄くなることに留意されたい。他の臓器（腎臓及び心臓）では軽度の体重増加があるが、他（例えば、筋肉、腸における脂肪沈着による栄養欠損に起因する可能性が高い）では体重増加がないか（脳）、又は低減している。野生型と比較した治療済及び未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける体重及び臓器重量の比較を提供する。（Ａ）総体重、（Ｂ）肝臓重量、（Ｃ）脾臓重量、（Ｄ）腸重量、（Ｅ）心臓重量、（Ｆ）腎臓重量、（Ｇ）脳重量、及び（Ｈ）筋肉重量を比較した。治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスに、出生後１日目（Ｐ１）にＩＶ用量の８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡを与え、６ヶ月齢で分析した。誤差は、ｎ＝４～５／ｇｒｐのＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｌｉｐａ^－／－マウスは体重が増加するが、これはある特定の臓器（肝臓及び脾臓）の臓器重量における劇的な増加と比較して薄くなることに留意されたい。他の臓器（腎臓及び心臓）では軽度の体重増加があるが、他（例えば、筋肉、腸における脂肪沈着による栄養欠損に起因する可能性が高い）では体重増加がないか（脳）、又は低減している。野生型と比較した治療済及び未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける体重及び臓器重量の比較を提供する。（Ａ）総体重、（Ｂ）肝臓重量、（Ｃ）脾臓重量、（Ｄ）腸重量、（Ｅ）心臓重量、（Ｆ）腎臓重量、（Ｇ）脳重量、及び（Ｈ）筋肉重量を比較した。治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスに、出生後１日目（Ｐ１）にＩＶ用量の８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡを与え、６ヶ月齢で分析した。誤差は、ｎ＝４～５／ｇｒｐのＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｌｉｐａ^－／－マウスは体重が増加するが、これはある特定の臓器（肝臓及び脾臓）の臓器重量における劇的な増加と比較して薄くなることに留意されたい。他の臓器（腎臓及び心臓）では軽度の体重増加があるが、他（例えば、筋肉、腸における脂肪沈着による栄養欠損に起因する可能性が高い）では体重増加がないか（脳）、又は低減している。模擬治療済及びＡＡＶ治療済Ｌｉｐａ^－／－マウス並びに野生型対照からの臓器の代表的なオイルレッド／ヘマトキシリン染色を提供する。Ｌｉｐａ^－／－治療済マウスに、出生後１日目で８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡ遺伝子療法ＩＶを与え、６ヶ月齢で、疾患由来の脂質過負荷を特定するために、組織をオイルレッドＯで染色した。全ての事例において、オイルレッドＯ染色は、治療によって非常に低減したが、不在ではなかった。バーは、２００μｍである。Ｌｉｐａ－／－マウスのＡＡＶ治療後の肝臓及び脾臓における細胞トリグリセリドレベルを提供する。６ヶ月齢の野生型（ＷＴ）、Ｌｉｐａ^－／－、及びＬｉｐａ^－／－治療済マウス（出生後１日目に８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡでＩＶ治療された）由来の（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脾臓。誤差は、ｎ＝４～５／ｇｒｐのＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１核当たりのＡＡＶベクターゲノム生体内分布を提供する。２ヶ月でのＬｉｐａ^－／－マウス（ＬＩＰＡＫＯ）が、４ヶ月齢でアッセイされるときＰ１での注射と比較して、肝臓リンパ節、脾臓、及び腸の増加した形質導入もたらした場合の注射。誤差は、ｎ＝３／群についてＳＤである。ＶｇをゲノムＤＮＡの１ｕｇ当たりで測定し、次いでｖｇ／核（又は細胞当たり）に変換した。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡによって誘導されるＬＩＰＡ遺伝子発現を実証する。２ヶ月でのＬｉｐａ^－／－マウス（ＬＩＰＡＫＯ）が、４ヶ月齢でアッセイされるときＰ１での注射と比較して、肝臓リンパ節、脾臓、及び腸における増加した遺伝子発現をもたらした場合の注射。誤差は、ｎ＝３／群についてＳＤである。治療済ＬＩＰＡＫＯマウスにおける遺伝子発現を、野生型マウス組織における正常な遺伝子発現と比較する。４ヶ月齢のマウスにおける肝臓全体の画像を提供する。未治療の、ＬＩＰＡＫＯマウスは、野生型（ＦＶＢｎ）と比較して高い脂肪含有量及び増加したサイズを示した。Ｐ１での治療は低減したサイズをもたらしたが、いくらかの脂肪含有量が残り、２ｍｏでの治療は、全ての脂肪含有量を除去した。野生型（ＦＶＢｎ）と比較した、４ｍｏＬＩＰＡＫＯマウスにおけるｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療後の肝臓コレステロール及びトリグリセリド含有量を提供する。誤差はＳＤである。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡ遺伝子療法での治療後４ヶ月で臓器重量を提供する。誤差は、ｎ＝２～５／ｇｒｐについてＳＤである。４ヶ月でのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡ遺伝子療法治療後の血清ＬＩＰＡ酵素活性レベルを提供する。誤差はＳＤである４ヶ月齢でのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡでの治療後の肝臓ＬＩＰＡ酵素活性を提供する。誤差はＳＤである。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療がＬｉｐａ^－／－マウスにおける肝脾腫大症及び上昇した血清肝臓酵素を回復させることを実証するデータを提供する。（Ａ）Ｌｉｐａ^－／－マウスの治療計画の概略図。（Ｂ）野生型、未治療Ｌｉｐａ^－／－、及び治療済Ｌｉｐａ^－／－マウス由来の肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｃ～Ｆ）肝臓、脾臓、腸、及び腸間膜リンパ節の相対重量。（Ｇ～Ｈ）血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍで作成された概略図。ＩＴＲ＝逆位末端反復、ｐＡ＝ＳＶ４０ポリＡ、ｄＴＩＲ＝変異ＩＴＲ。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療がＬｉｐａ^－／－マウスにおける肝脾腫大症及び上昇した血清肝臓酵素を回復させることを実証するデータを提供する。（Ａ）Ｌｉｐａ^－／－マウスの治療計画の概略図。（Ｂ）野生型、未治療Ｌｉｐａ^－／－、及び治療済Ｌｉｐａ^－／－マウス由来の肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｃ～Ｆ）肝臓、脾臓、腸、及び腸間膜リンパ節の相対重量。（Ｇ～Ｈ）血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍで作成された概略図。ＩＴＲ＝逆位末端反復、ｐＡ＝ＳＶ４０ポリＡ、ｄＴＩＲ＝変異ＩＴＲ。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療がＬｉｐａ^－／－マウスにおける肝脾腫大症及び上昇した血清肝臓酵素を回復させることを実証するデータを提供する。（Ａ）Ｌｉｐａ^－／－マウスの治療計画の概略図。（Ｂ）野生型、未治療Ｌｉｐａ^－／－、及び治療済Ｌｉｐａ^－／－マウス由来の肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｃ～Ｆ）肝臓、脾臓、腸、及び腸間膜リンパ節の相対重量。（Ｇ～Ｈ）血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍで作成された概略図。ＩＴＲ＝逆位末端反復、ｐＡ＝ＳＶ４０ポリＡ、ｄＴＩＲ＝変異ＩＴＲ。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療がＬｉｐａ^－／－マウスにおける肝脾腫大症及び上昇した血清肝臓酵素を回復させることを実証するデータを提供する。（Ａ）Ｌｉｐａ^－／－マウスの治療計画の概略図。（Ｂ）野生型、未治療Ｌｉｐａ^－／－、及び治療済Ｌｉｐａ^－／－マウス由来の肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｃ～Ｆ）肝臓、脾臓、腸、及び腸間膜リンパ節の相対重量。（Ｇ～Ｈ）血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍで作成された概略図。ＩＴＲ＝逆位末端反復、ｐＡ＝ＳＶ４０ポリＡ、ｄＴＩＲ＝変異ＩＴＲ。未治療Ｌｉｐａ^－／－対Ｐ２で治療されたＬｉｐａ^－／－のカプラン－マイヤー生存曲線を提供する。遺伝子療法での治療は、２２４日の生存期間中央値を超えて寿命を延ばす。筋萎縮がＬｉｐａ^－／－マウスにおける歩行差に寄与し得ることを実証する。（Ａ）２、４、６ヶ月でのマウスの体重。（Ｂ～Ｃ）６ヶ月での腓腹筋及び四頭筋の相対重量。（Ｄ～Ｈ）６ヶ月でのオープンフィールド分析。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。筋萎縮がＬｉｐａ^－／－マウスにおける歩行差に寄与し得ることを実証する。（Ａ）２、４、６ヶ月でのマウスの体重。（Ｂ～Ｃ）６ヶ月での腓腹筋及び四頭筋の相対重量。（Ｄ～Ｈ）６ヶ月でのオープンフィールド分析。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。筋萎縮がＬｉｐａ^－／－マウスにおける歩行差に寄与し得ることを実証する。（Ａ）２、４、６ヶ月でのマウスの体重。（Ｂ～Ｃ）６ヶ月での腓腹筋及び四頭筋の相対重量。（Ｄ～Ｈ）６ヶ月でのオープンフィールド分析。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。筋萎縮がＬｉｐａ^－／－マウスにおける歩行差に寄与し得ることを実証する。（Ａ）２、４、６ヶ月でのマウスの体重。（Ｂ～Ｃ）６ヶ月での腓腹筋及び四頭筋の相対重量。（Ｄ～Ｈ）６ヶ月でのオープンフィールド分析。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療後のＬＩＰＡ発現が増加したリソソーム酸リパーゼ酵素活性をもたらすことを実証する。（Ａ）様々な臓器及び組織におけるＡＡＶの生体内分布。定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、核当たりのベクターゲノム（ｖｇ）を定量化した。（Ｂ）１８ＳｍＲＮＡに正規化された、内因性マウスＬｉｐａと比較した、ＡＡＶ導入ヒトＬＩＰＡの相対発現。（Ｃ～Ｅ）肝臓、脾臓、及び血清におけるリソソーム酸リパーゼ酵素活性。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療後のＬＩＰＡ発現が増加したリソソーム酸リパーゼ酵素活性をもたらすことを実証する。（Ａ）様々な臓器及び組織におけるＡＡＶの生体内分布。定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、核当たりのベクターゲノム（ｖｇ）を定量化した。（Ｂ）１８ＳｍＲＮＡに正規化された、内因性マウスＬｉｐａと比較した、ＡＡＶ導入ヒトＬＩＰＡの相対発現。（Ｃ～Ｅ）肝臓、脾臓、及び血清におけるリソソーム酸リパーゼ酵素活性。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。コレステロール及びトリグリセリド含有量が治療で低減することを実証する。（Ａ～Ｂ）（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脾臓におけるコレステロール含有量。（Ｃ～Ｄ）（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）脾臓におけるトリグリセリド制御。（Ｅ～Ｉ）血清脂質パネル。（Ｊ）肝臓、脾臓、及び腸組織切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色。中性脂質をＯＲＯで赤色に染色する。組織切片をヘマトキシリン（紫色）で対比染色した。スケールバー＝２５μｍ。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。コレステロール及びトリグリセリド含有量が治療で低減することを実証する。（Ａ～Ｂ）（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脾臓におけるコレステロール含有量。（Ｃ～Ｄ）（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）脾臓におけるトリグリセリド制御。（Ｅ～Ｉ）血清脂質パネル。（Ｊ）肝臓、脾臓、及び腸組織切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色。中性脂質をＯＲＯで赤色に染色する。組織切片をヘマトキシリン（紫色）で対比染色した。スケールバー＝２５μｍ。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。コレステロール及びトリグリセリド含有量が治療で低減することを実証する。（Ａ～Ｂ）（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脾臓におけるコレステロール含有量。（Ｃ～Ｄ）（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）脾臓におけるトリグリセリド制御。（Ｅ～Ｉ）血清脂質パネル。（Ｊ）肝臓、脾臓、及び腸組織切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色。中性脂質をＯＲＯで赤色に染色する。組織切片をヘマトキシリン（紫色）で対比染色した。スケールバー＝２５μｍ。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。コレステロール及びトリグリセリド含有量が治療で低減することを実証する。（Ａ～Ｂ）（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脾臓におけるコレステロール含有量。（Ｃ～Ｄ）（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）脾臓におけるトリグリセリド制御。（Ｅ～Ｉ）血清脂質パネル。（Ｊ）肝臓、脾臓、及び腸組織切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色。中性脂質をＯＲＯで赤色に染色する。組織切片をヘマトキシリン（紫色）で対比染色した。スケールバー＝２５μｍ。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。コレステロール及びトリグリセリド含有量が治療で低減することを実証する。（Ａ～Ｂ）（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脾臓におけるコレステロール含有量。（Ｃ～Ｄ）（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）脾臓におけるトリグリセリド制御。（Ｅ～Ｉ）血清脂質パネル。（Ｊ）肝臓、脾臓、及び腸組織切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色。中性脂質をＯＲＯで赤色に染色する。組織切片をヘマトキシリン（紫色）で対比染色した。スケールバー＝２５μｍ。全てのデータは、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。肝臓切片におけるＬＩＰＡ及びＣＤ６８の免疫組織化学染色を提供する。治療された肝臓（褐色）におけるＬＩＰＡ免疫染色。マクロファージを抗ＣＤ６８（褐色）で染色する。組織切片をヘマトキシリン（紫色）で対比染色した。スケールバー＝１００μｍ。より低用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡが依然として治療上の利益を示すことを実証する。（Ａ）ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡでの異なる用量の未治療ＷＴ及びＬｉｐａ^－／－並びに治療済Ｌｉｐａ^－／－における肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｂ～Ｅ）異なる用量での治療後の肝臓（Ｂ）、脾臓（Ｃ）、腸（Ｄ）、及びリンパ節（Ｅ）の相対重量。（Ｆ～Ｇ）異なる用量での血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベル。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。より低用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡが依然として治療上の利益を示すことを実証する。（Ａ）ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡでの異なる用量の未治療ＷＴ及びＬｉｐａ^－／－並びに治療済Ｌｉｐａ^－／－における肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｂ～Ｅ）異なる用量での治療後の肝臓（Ｂ）、脾臓（Ｃ）、腸（Ｄ）、及びリンパ節（Ｅ）の相対重量。（Ｆ～Ｇ）異なる用量での血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベル。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。より低用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡが依然として治療上の利益を示すことを実証する。（Ａ）ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡでの異なる用量の未治療ＷＴ及びＬｉｐａ^－／－並びに治療済Ｌｉｐａ^－／－における肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｂ～Ｅ）異なる用量での治療後の肝臓（Ｂ）、脾臓（Ｃ）、腸（Ｄ）、及びリンパ節（Ｅ）の相対重量。（Ｆ～Ｇ）異なる用量での血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベル。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。より低用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡが依然として治療上の利益を示すことを実証する。（Ａ）ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡでの異なる用量の未治療ＷＴ及びＬｉｐａ^－／－並びに治療済Ｌｉｐａ^－／－における肝臓及び脾臓の肉眼的病理。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｂ～Ｅ）異なる用量での治療後の肝臓（Ｂ）、脾臓（Ｃ）、腸（Ｄ）、及びリンパ節（Ｅ）の相対重量。（Ｆ～Ｇ）異なる用量での血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベル。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。全ての用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療が回復したＬＩＰＡ発現及びリソソーム酸リパーゼ酵素活性をもたらすことを実証する。（Ａ）ＡＡＶの生体内分布は、肝臓、脾臓、腸、リンパ節、心臓、及び肺において減少する用量で減少する。（Ｂ）ＬＩＰＡ発現はまた、肝臓、脾臓、腸、リンパ節、心臓、及び肺において用量とともに減少する。（Ｃ～Ｅ）肝臓、脾臓、及び血清におけるリソソーム酸リパーゼ活性。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。全ての用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療が回復したＬＩＰＡ発現及びリソソーム酸リパーゼ酵素活性をもたらすことを実証する。（Ａ）ＡＡＶの生体内分布は、肝臓、脾臓、腸、リンパ節、心臓、及び肺において減少する用量で減少する。（Ｂ）ＬＩＰＡ発現はまた、肝臓、脾臓、腸、リンパ節、心臓、及び肺において用量とともに減少する。（Ｃ～Ｅ）肝臓、脾臓、及び血清におけるリソソーム酸リパーゼ活性。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。リポイド含有量が全ての用量での治療で低減することを実証する。（Ａ）肝臓におけるコレステロールレベル。（Ｂ）脾臓におけるコレステロール含有量。（Ｃ）肝臓におけるトリグリセリド含有量。（Ｄ）脾臓におけるトリグリセリド含有量。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。リポイド含有量が全ての用量での治療で低減することを実証する。（Ａ）肝臓におけるコレステロールレベル。（Ｂ）脾臓におけるコレステロール含有量。（Ｃ）肝臓におけるトリグリセリド含有量。（Ｄ）脾臓におけるトリグリセリド含有量。全てのデータは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３～８）。群間の統計的有意性は、テューキーの事後検定での一元配置分散分析を使用して、異なる文字、Ｐ＜０．０５によって示される。ｐｔｒｓ－ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ．ＫａｎＲ（５６２６ｂｐ）のアノテーション付き配列を提供する。ｐｔｒｓ－ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ．ＫａｎＲ（５６２６ｂｐ）のアノテーション付き配列を提供する。ｐｔｒｓ－ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ．ＫａｎＲ（５６２６ｂｐ）のアノテーション付き配列を提供する。ｐｔｒｓ－ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ．ＫａｎＲ（５６２６ｂｐ）のアノテーション付き配列を提供する。ｐｔｒｓ－ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ．ＫａｎＲ（５６２６ｂｐ）のアノテーション付き配列を提供する。ｐｔｒｓ－ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ．ＫａｎＲ（５６２６ｂｐ）のアノテーション付き配列を提供する。

酵素置換タンパク質療法は、ＷＤ及びＣＥＳＤ患者において臨床的有効性を示し、ＦＤＡによって承認されているが、そのような治療は、２週間毎にタンパク質注入を必要とし、部分的な臨床的補正のみをもたらす（Ｂｕｒｔｏｎｅｔａｌ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３７３：１０１０－１０２０，２０１５）。セベリパーゼアルファ（Ｋａｎｕｍａとも呼ばれる）の第３相酵素置換臨床試験では、例えば、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総ビリルビン、及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）－コレステロールの上昇は、平均で、５０％のみ低減し、最高でも、肝臓脂肪含有量における３２％の全体的な低減、及び脾臓体積における６．８％の低減を有した（Ｂｕｒｔｏｎｅｔａｌ．上記）。本明細書において実証されるように、ＬＩＰＡ遺伝子のＡＡＶ送達は、ＬＡＬ－Ｄマウスモデルにおけるこれらの指標に対してはるかに大きな影響を有し得る。

本開示は、ＷＤ及びＣＥＳＤ患者を治療する際の使用のための組換え（ｒ）自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクター、ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡを提供する。元々アカゲザルの脾臓から単離された、ＡＡＶのアカゲザル７４（ｒｈ７４）血清型は、小児患者での臨床試験において、高い静脈内用量（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）で安全性を示した。ｒＡＡＶｒｈ７４は、血液への静脈内（ＩＶ）送達後に組織に入る高い傾向を示し、単回用量スキームを使用した設計された遺伝子療法の全身多臓器灌流を可能にするという点で、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、及びｒＡＡＶｒｈ．１０と類似している（Ｚｙｇｍｕｎｔｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎＤｅｖ１５：３０５－３１９，２０１９）。この投与は、理論上、少なくとも有糸***後細胞において、動物の生涯にわたって持続することができる（Ｃｈｉｃｏｉｎｅｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ２２：７１３－７２４，２０１４、Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ２９６：Ｃ４７６－４８８，２００９）。ＡＡＶは、その安全性プロファイルにおいて独特であり、ウイルスゲノムとして、そのキャリア細胞に形質導入されると、エピソームＤＮＡとして安定して発現したままであり、ごく稀にしか宿主ゲノムに組み込まれない（Ｇｒｉｅｇｅｒｅｔａｌ．，ＡｄｖＢｉｏｃｈｅｍＥｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ９９：１１９－１４５，２００５、Ｘｉａｏｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ７２：２２２４－２２３２，１９９８）。ほぼ全てのＡＡＶ血清型と同様に、肝臓及び脾臓は、ｒＡＡＶｒｈ７４が静脈内送達されるとき、最も高度に灌流された臓器である（Ｂｉｓｈｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ１９：１３５９－１３６８，２００８）肝臓及び脾臓は、典型的には、成体動物に投与されるときに他の臓器よりも対数的に高い数のＡＡＶＤＮＡベクターゲノム（ｖｇ）を受け、これは、ヒト、アカゲザル、イヌ、及びマウスを含む、げっ歯類を含む、複数の哺乳動物種において真である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｔａｌ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ１９３７：２１３－２１９．，２０１９，Ｐａｌａｓｃｈａｋｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ１９５０：３３３－３６０，２０１９）。そのような特徴は、ＡＡＶを、肝臓及び脾臓が最も影響を受けた臓器である、ＬＡＬ－Ｄなどの遺伝性障害の治療のための理想的な遺伝子送達方法とする（Ａｇｕｉｓａｎｄａｅｔａｌ．、上記、Ｂｕｒｔｏｎｅｔａｌ．上記）。

開示されるＡＡＶベクターは、ＬＡＬ－Ｄにおける治療上の有用性のために最適化される。自己相補的（ｓｃ）技術は、一本鎖ウイルスＤＮＡゲノムのそれ自体への結合を可能にし、それによって第２鎖ＤＮＡ合成をプライミングする。この自己相補的要素は、自己相補的要素を欠く構築物と比較して、遺伝子発現を高速化及び強化する。自己相補的技術の使用は、完全欠損を有する小児が出生後１週間又は２週間以内に重症になるため、ＬＡＬ－Ｄの効果的な治療のために重要である。よって、遺伝子発現の最大発生に３～４週間かかるであろう、一本鎖ｒＡＡＶベクターの使用は、そのような早期かつ重度の発生を伴う疾患を予防するのに理想的ではないであろう。一本鎖ベクターに通常パッケージングすることができるものの半分よりも少し小さい（４．７ｋＢ）、約２．２ｋＢのＤＮＡのみを自己相補的ＡＡＶベクターにパッケージングすることができるので、小型化されたサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）プロモーターを使用して、必要なＤＮＡ要素のうちの全てが全長ヒトＬＩＰＡ導入遺伝子とともに含まれることを可能にした。この小型化されたｍＣＭＶプロモーターは、Ｆｕ及びＭｃＣａｒｔｙによって、ｓｃＡＡＶベクターを駆動して、ムコ多糖症などの他のリソソーム貯蔵障害を治療するために使用されており、ｍＣＭＶプロモーターは、広スペクトルの細胞及び組織ＩＩにわたって遺伝子発現を誘導する能力を示す（Ｆｕｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎＤｅｖ１０：３２７－３４０，２００８）。自己相補的形態のＡＡＶのサイズ制限は、ＬＩＰＡ遺伝子自体のサイズと相まって、ＬＩＰＡ遺伝子を含有する自己相補的ＡＡＶ形態を生成するために全長形態のＣＭＶプロモーターを使用することを不可能にする。ＡＡＶ収率は、全長ＣＭＶプロモーターが使用されるとき１９倍低減し、ＡＡＶゲノムの増加したサイズのためにウイルスカプシドへの低減したゲノムパッケージングに起因する可能性が高い。標準的な小規模ＡＡＶ調製からのパッケージング収率は、ｍｉｎｉＣＭＶが使用されるとき平均１．１５±０．１５×１０^１３ｖｇであり、全長ＣＭＶプロモーターが使用されるとき平均６．０±１．１×１０^１１ｖｇのみである（ｎ＝２／群）。よって、ｍｉｎｉＣＭＶは、このＡＡＶベクターの重要な設計要素である。

ＬＩＰＡ変異
ＬＩＰＡ遺伝子は、ヒト染色体１０ｑ２３．２～２３．３に位置し、約３８ｋｂにわたって広がる１０個のエクソンからなる。ＬＩＰＡは、３つの転写産物バリアントを有する：バリアント２（ＮＭ＿０００２３５）は、バリアント１（ＮＭ＿００１１２７６０５）と比較して、５’ＵＴＲにおける内部セグメントを欠いている。２つのバリアントは、ｃＤＮＡクローニングによって実験的に検証されている、３９９のアミノ酸（ＡＡ）のサイズで同じタンパク質アイソフォームをコードする（Ｂａｒａｔｔａｅｔａｌ．，ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ２５：４１７２－４１８０）。アノテーション付きバリアント３（ＮＭ＿００１２８８９７９）は、５’領域における２つの連続したエクソンを欠いており、これは、下流ＡＵＧでの翻訳開始をもたらし、おそらくより短いタンパク質アイソフォームは、２８３ＡＡからなる。（ＬｉａｎｄＺｈａｎｇ，ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂＶａｓｃＢｉｏｌ．３９（５）：８５０－８５６，２０１９）。

ＬＩＰＡ遺伝子には少なくとも５９の既知の変異がある。これらの変異の例を、以下の表１に提供する。

ＡＡＶ遺伝子療法
本開示は、遺伝子療法ベクター、例えば、ＬＩＰＡｃＤＮＡを発現するｒＡＡＶベクター、並びにウォルマン病及びコレステロールエステル蓄積症を含む、リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）を治療する方法を提供する。開示される遺伝子療法ベクターは、脂質貯蔵及び蓄積に関連する障害、例えば、冠動脈疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、及び非アルコール性脂肪性肝疾患を治療するのに有用である。加えて、開示される遺伝子療法ベクターは、トリグリセリド、コレステロール、及び／又は脂肪酸の減少を必要とする対象においてそれを減少させるため、かつ脂質異常血症又は高コレステロール血症の治療を必要とする対象においてそれを行うために有用である。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴分析されているＡＡＶの血清型は少なくとも１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，（ＮｅｗＹｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＶｉｒｏｌｏｇｙ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたものなどの３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする、ヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。類似感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が類似調節制御下にあることも示唆する。

本明細書で使用される場合の「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（又は導入遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染性ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。

「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシドに包まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。例示的なＩＴＲ配列は、配列番号６及び７に示されるＩＴＲ配列など、１３０塩基対長、又は１４１塩基対長であり得る。ヌクレオチド配列番号６は、例示的な５’ＩＴＲであり、配列番号７のヌクレオチド配列は、末端分解部位（「ｄＴＲ」と称される）の欠失を含有する、例示的な３’ＩＴＲである。末端分解部位の欠失は、一本鎖ウイルスゲノムのＲｅｐタンパク質ニッキングを阻害する。３’ＩＴＲにおけるｄＴＲの存在は、ウイルスゲノムのそれ自体への自己相補的結合を増加させ、これは、二本鎖ウイルスゲノムがウイルスカプシド内にパッケージングされることを可能にするその小さい（２．２ｋＢ）サイズのためであり得る。

ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇｅｔａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって補正されるＳｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提示されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提示されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提示されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提示されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提示されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提示されており（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号もまた参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提示されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提示されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提示されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２のヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞傷害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと***する細胞及び非***細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の生涯にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつか又は全ては、プロモーター、目的のＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットなどの外来ＤＮＡと置換され得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性がない。

複数の研究は、筋肉における長期（＞１．５年）組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ．ＡｃａｄＳｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。また、Ｃｈａｏｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）、及びＣｈａｏｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。更に、筋肉は高度に血管形成されているため、Ｈｅｒｚｏｇｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入が、筋肉内注射に続いて体循環において導入遺伝子産物の出現をもたらした。また、Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌のための必要な細胞因子を保有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬の安定した発現が可能であることを示した。

本開示の組換えＡＡＶゲノムは、本開示の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶＤＮＡは、ＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、又はＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、及びそれらの誘導体）を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示される。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶ、も企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。

提供された組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。「ｒＡＡＶゲノム」という用語は、修飾された天然ＡＡＶゲノムに由来するポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、天然ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を除去するように修飾されている。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、内因性５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムが由来したＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型由来のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’及び３’末端に隣接する目的の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、「遺伝子カセット」を含む。例示的な実施形態では、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＤＮＡを欠いており、すなわち、ゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐのＤＮＡが存在しない。

本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態では、導入遺伝子ポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶＩＴＲを含む。導入遺伝子ポリヌクレオチド配列は、遺伝子カセットを形成する標的細胞において機能的である転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリアデニル化シグナル配列を含むが、これらに限定されない）に作動可能に結合している。プロモーターの例は、配列番号３のヌクレオチド配列を有するｍｉｎｉＣＭＶプロモーターである。追加のプロモーターとしては、ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、Ｐ５４６プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

加えて、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列、及び転写促進活性を示すｍｉｎｉＣＭＶ（配列番号３）配列のヌクレオチド配列に対して少なくとも：６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なプロモーター配列が、本明細書に提供される。

転写制御要素の他の例は、組織特異的制御要素、例えば、特異的にニューロン内又は特異的にアストロサイト内での発現を可能にするプロモーターである。例としては、ニューロン特異的エノラーゼ及びグリア線維酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターも企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞において発現されるときに導入遺伝子ＲＮＡ転写産物のプロセシングを促進するイントロン配列を含み得る。そのようなイントロンの一例は、ＳＶ４０イントロンである。

本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＬＩＰＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＬＩＰＡｃＤＮＡ（配列番号１）によってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも：９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、配列番号４のヌクレオチド１８５３～３９０６を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、配列番号４のヌクレオチド１８５３～３９０６に対して、少なくとも：９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。

本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態では、ＬＡＬタンパク質をコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列又はその補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。

本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３を含むがこれらに限定されない血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが以下に記載されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）。Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、並びに対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎｅｔａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、具体的には、ｒＡＡＶ産生に関する文書のセクションに重点を置く。

したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代数の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって（例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などによって）精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、ＳｃｈｅｎｐｐａｎｄＣｌａｒｋ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．，６９４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている。

本明細書で提供される組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される賦形剤を含む。許容される賦形剤は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］、クエン酸、若しくは他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギニン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、並びに／又はＴｗｅｅｎ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤、ポロキサマー１８８、プルロニック（登録商標）（例えば、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのコポリマーを含むが、これらに限定されない。

本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの投与量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方式、治療時間、治療目標、個体、及び標的化される細胞型に応じて変動し、当該技術分野における標準的な方法によって決定され得る。投与量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。本明細書で企図される投与量は、約１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１．１×１０^１３、約１．２×１０^１３、約１．３×１０^１３、約１．５×１０^１３、約２×１０^１３、約２．５×１０^１３、約３×１０^１３、約３．５×１０^１３、約４×１０^１３、約４．５×１０^１３、約５×１０^１３、約６×１０^１３、約７×１０^１３、約８×１０^１３、約９×１０^１３、約１×１０^１４、約２×１０^１４、約３×１０^１４、約４×１０^１４、約５×１０^１４、約１×１０^１５～約１×１０^１６、又はそれ以上の全ウイルスゲノムを含む。

約１×１０^９～約１×１０^１０、約５×１０^９～約５×１０^１０、約１×１０_１０～約１×１０^１１、約１×１０^１１～約１×１０^１５ｖｇ、約１×１０^１２～約１×１０^１５ｖｇ、約１×１０^１２～約１×１０^１４ｖｇ、約１×１０^１３～約６×１０^１４ｖｇ、約１×１０^１３～約１×１０^１５ｖｇ、及び約６×１０^１３～約１．０×１０^１４ｖｇの投与量も企図される。本明細書に例示される１つの用量は、静脈内又は腹腔内送達を介して投与される１×１０^１３ｖｇである。

投与量はまた、ｖｇ／ｋｇの単位で表されてもよい。本明細書に企図される投与量は、約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、５×１０^９ｖｇ／ｋｇ、６×１０^９ｖｇ／ｋｇ、７×１０^９ｖｇ／ｋｇ、８×１０^９ｖｇ／ｋｇ、９×１０^９ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１０ｖｇ／ｋｇ^１０、３×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約２×０^１３ｖｇ／ｋｇ、約２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約４．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３、約８×１０^１３、約９×１０^１３、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇを含む。

約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^９ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、及び約６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの投与量も企図される。本明細書に例示される１つの用量は、静脈内又は腹腔内送達を介して投与される１×１０^１３ｖｇ／ｇである。

インビボ又はインビトロで、ｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本開示によって企図される。インビボ方法は、有効用量又は有効複数回用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（人間を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態と関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）し、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは予防し、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。本開示の方法による予防又は治療のために企図されるＬＡＬ－Ｄの例は、ウォルマン病及びコレステロールエステル蓄積症、又は冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪性肝疾患、脂質異常症、若しくは高コレステロール血症などの脂質貯蔵若しくは蓄積に関連する障害である。

併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次治療の両方を含む。新規の療法との併用など、本開示の方法と標準の医学的治療との併用が特に企図される。いくつかの実施形態では、併用療法は、本明細書に開示される遺伝子療法と組み合わせて免疫抑制剤を投与することを含む。

有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与の経路及び血清型は、治療される感染及び／又は疾患状態、並びに野生型ＬＡＬタンパク質を発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。

本開示は、有効用量の本開示のｒＡＡＶ及び組成物の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、消化管を通した吸収などの経腸投与、及び注射、注入、又は移植を通した非経口投与が含まれる。

本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＬＡＬタンパク質の持続的発現をもたらす。よって、本開示は、ＬＡＬタンパク質を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくは、ヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、本開示の１つ以上のｒＡＡＶで細胞を形質導入することが含まれる。

「形質導入」という用語は、ＬＡＬレシピエント細胞の発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞へのＬＩＰＡ遺伝子のコード領域の投与／送達を指すために使用される。

免疫抑制剤
免疫抑制剤は、遺伝子療法の投与後の対象におけるｒＡＡＶに対する免疫応答の開始前又は後に投与され得る。加えて、免疫抑制剤は、遺伝子療法又はタンパク質補充療法と同時に投与され得る。対象における免疫応答には、対象へのｒＡＡＶの投与に続くか、又はそれによって引き起こされる、有害な免疫応答又は炎症反応が含まれる。免疫応答は、投与されたｒＡＡＶに応答する対象における抗体の産生であってもよい。

例示的な免疫抑制剤には、グルココルチコステロイド、ヤヌスキナーゼ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、細胞増殖抑制剤、例えば、プリン類似体、メトトレキサート、及びシクロホスファミド、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＤＨ）阻害剤、生物製剤、例えば、モノクローナル抗体又は融合タンパク質及びポリペプチド、並びにジペプチドボロン酸分子、例えば、ボルテゾミブが含まれる。

免疫抑制剤は、炎症を減少させ、対象の免疫系を抑制又は調節するステロイドである、抗炎症ステロイドであってもよい。例示的な抗炎症ステロイドは、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メトトレキサート、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ブデソニド、又はプレドニゾンなどのグルココルチコイドである。

ヤヌスキナーゼ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素のうちの１つ以上を標的とすることによる、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害剤である。例示的なヤヌスキナーゼ阻害剤には、トファシチニブ、バリシチニブ、ウパダシチニブ、ペフィシチニブ、及びオクラシチニブが含まれる。

カルシニューリン阻害剤は、シクロフィリンに結合し、カルシニューリンの活性を阻害する。例示的なカルシニューリン阻害剤には、シクロスポリン、タクロリムス、及びピセクロリムスが含まれる。

ｍＴＯＲ阻害剤は、セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼｍＴＯＲを低減又は阻害する。例示的なｍＴＯＲ阻害剤には、ラパマイシン（シロリムスとしても知られる）、エベロリムス、及びテムシロリムスが含まれる。

免疫抑制剤には、免疫抑制マクロライドが含まれる。「免疫抑制マクロライド」という用語は、対象の免疫系を抑制又は調節するマクロライド剤を指す。マクロライドは、クラジノース又はデソアミンなどの１つ以上のデオキシ糖が付着した大きな大環状ラクトン環を含む薬剤のクラスである。ラクトン環は通常、１４、１５、又は１６員である。マクロライドは、ポリケチドクラスの薬剤に属し、天然産物であり得る。免疫抑制マクロライドの例には、タクロリムス、ピメクロリムス、及びラパマイシン（シロリムスとしても知られる）が含まれる。

プリン類似体は、ヌクレオチド合成を阻止し、ＩＭＤＨ阻害剤を含む。例示的なプリン類似体には、アザチオプリン、ミコフェノレート酸又はミコフェノレートモフェチルなどのミコフェノレート、及びレフノミドが含まれる。

例示的な免疫抑制生物製剤には、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキネヌマブ、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ベラタセプト、及びダクリズマブが含まれる。

具体的には、免疫抑制剤は、抗ＣＤ２０抗体である。抗ＣＤ２０特異的抗体という用語は、ＣＤ２０に特異的に結合するか、又はＣＤ２０の発現若しくは活性を阻害若しくは低減する抗体を指す。例示的な抗ＣＤ２０抗体には、リツキシマブ、オクレリズマブ、又はオファツムマブが含まれる。

免疫抑制抗体の追加の例には、バシリキシマブ及びダクリズマブなどの抗ＣＤ２５抗体（又は抗ＩＬ２抗体若しくは抗ＴＡＣ抗体）、並びにムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビシリズマブなどの抗ＣＤ３抗体、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体が含まれる。

以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。記載された数値範囲には、各範囲内の各整数値が含まれ、記述される整数の最小及び最大が含まれる。

実施例１
遺伝子療法ＬＩＰＡをコードする構築物
ＬＩＰＡをコードするＡＡＶゲノム構築物を、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター（配列番号３）の制御下でのＬＩＰＡｃＤＮＡの全長転写産物を有するＡＡＶｒｈ７４ベクター設計を示す、図１に示されるように生成した。

ヒトＧＦＰｃＤＮＡクローンを、Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手した。ＬＩＰＡｃＤＮＡ単独を、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターの制御下で、自己相補的ＡＡＶｒｈ７４ゲノムに更にサブクローニングした。プラスミド構築物はまた、サルウイルス４０（ＳＶ４０）キメライントロンなどのイントロン、及びポリアデニル化シグナル（ＰｏｌｙＡ）を含んだ。構築物を、いずれかのＡＡＶｒｈ７４ゲノムにパッケージングした。

ＬＩＰＡｃＤＮＡ発現カセットは、カナマイシン耐性遺伝子、及びより堅牢な転写を可能にする最適化されたＫｏｚａｋ配列を有した。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ７４ベクターゲノムを複数のＡＡＶカプシド血清型にパッケージングすることができる修飾されたクロスパッケージングアプローチによって産生された［Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ．７６（２）：７９１－８０１（２００２）］。産生は、ＨＥＫ２９３細胞を使用した標準的な３プラスミドＤＮＡ／ＣａＰＯ４沈殿法を使用して達成した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、並びにペニシリン及びストレプトマイシンで補足されたＤＭＥＭ中で維持した。産生プラスミドは、（ｉ）治療用タンパク質をコードするプラスミド、（ｉｉ）ｃａｐ血清型ＡＡＶｒｈ７４単離物をコードするｒｅｐ２－ｃａｐＸ修飾ＡＡＶヘルパープラスミド、並びに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡＩ／ＩＩＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）であった。定量的ＰＣＲベースの滴定法を使用して、Ｐｒｉｓｍ７５００Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してカプシド化されたベクターゲノム（ｖｇ）力価を決定した。［Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）］。最終力価（ｖｇｍｌ－１）を、Ｐｒｉｓｍ７５００リアルタイム検出器システム（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を利用して、特異的プライマー及びプローブを使用して定量的逆転写酵素ＰＣＲによって決定した。アリコートされたウイルスを－８０℃で保持した。

パッケージングされるＡＡＶゲノムを作製するために使用される全てのプラスミドはまた、ゲノムのパッケージングに使用されるＩＴＲ配列の外側にカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を含有する。これは、ＡＡＶゲノムをコードするＤＮＡを細菌に形質転換して、カナマイシンの存在下で多量のＤＮＡを産生することを可能にし、これは、全ての形質転換されていない細菌を殺滅するであろう。ＫａｎＲは、患者を治療するために使用されるＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶカプシドにパッケージングされていないが、その存在は、細菌におけるＤＮＡ産生を可能にする。

プラスミドｒ（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡのマップは、図２において示され、プラスミド全体の配列は、配列番号４において提供される。ベクターｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡは、配列番号４のＩＴＲ内にあり、かつそれを含む、ヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶベクターは、５’ ＡＡＶ２ＩＴＲ、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＬＩＰＡ遺伝子のコード配列、ＳＶ４０後期ポリＡ、及び３’ ＡＡＶ２ＩＴＲを含む。配列番号４に示されるプラスミドは、カナマイシン耐性をｐＵＣ複製起点とともに更に含む。

表２は、プラスミド（配列番号４）の分子的特徴を示し、範囲は、配列番号４におけるヌクレオチドを指し、
カナマイシン遺伝子がフォワード配向であることを示す。

実施例２
ＬＩＰＡ欠損マウスにおけるＬＩＰＡ遺伝子置換
以下の研究は、純血種Ｌｉｐａ欠損（Ｌｉｐａ^－／－）マウスにおけるＡＡＶベースのＬＩＰＡ（ヒト）遺伝子置換療法を試験した。Ｌｉｐａ^－／－マウスは、ＷＤ及びＣＥＳＤ患者のように、この臓器へのコレステロールエステル及びトリグリセリドの大きな負荷の結果として、重度の肝臓機能障害及び損傷を発症する（Ｄｕｅｔａｌ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ７：１３４７－１３５４，１９９８、Ｄｕｅｔａｌ．ＪＬｉｐｉｄＲｅｓ４２：４８９－５００，２００１）。例えば、マウスは、肝脾腫大症、上昇した血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、並びに上昇した肝臓及び脾臓コレステロール及びトリグリセリドを発症する。疾患は、生後３週間以内に明らかであり、Ｌｉｐａ^－／－マウスは、４ヶ月までに深刻な疾患を有し、肝臓及び脾臓のサイズにおける３倍～６倍の増加を示している。マウスは、その後数ヶ月で疾患に罹患し、６ヶ月齢で始まる。

マウス：ｌａｌ^－／－マウスは、１９９８年にＤｕｅｔａｌによって最初に生成された。マウスモデルは、多臓器系におけるＬａｌの役割を研究するために広く使用されている。１２９Ｓｖ及びＣＦ－１の混合した遺伝的背景でのｌａｌ^－／－マウスは、成体まで生存し、繁殖力があるが、７～８ヶ月齢で死ぬ。ｌａｌ^－／－マウスは、肝臓、脾臓、及び小腸におけるＴＧ及びＣＥの大きな蓄積を示す。これらのマウスは、ヒトにおけるＷＤ及びＣＥＳＤの主要な臨床症状である、肝脾腫大症に類似する。ｌａｌ^－／－マウスは、ヒトＷＤ及びＣＥＳＤを研究するためのモデルを提供するが、より重要なことには、代謝及び免疫ホメオスタシスに対するリソソーム脂肪分解の全身的影響を調査するための強力なツールとして機能する。

１日齢（Ｐ１）Ｌｉｐａ^－／－マウスに、単回注射ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡを静脈内投与した。８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡを、後眼窩静脈を介して静脈内投与した。使用されたＬｉｐａ^－／－マウスは、純粋なＦｖＢ^／ＮＪ背景で繁殖させたが、これは、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ繁殖マウスと比較してほぼ２倍の産子数であったが、疾患表現型を著しく変化させなかった。４ヶ月齢までの治療なしでは、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける肝臓は、重度に肥大し、損傷している。

４ヶ月齢の模擬治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルは、野生型マウスと比較して１０倍上昇し、これらの上昇は、ＡＡＶ治療によって９０％低減した（図２）。ＡＳＴ及びＡＬＴ指標の両方について、これは非常に有意な変化であった（両方の比較でｐ＜０．０００１）。ＡＳＴ及びＡＬＴは、肝臓損傷のマーカーであり、患者におけるＬＡＬ－Ｄ疾患を追跡するために使用される主要な臨床バイオマーカーである。

ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡでの治療はまた、血清ＬＤＬ－コレステロールの完全な正常化をもたらし、これは、肝臓からの上昇したコレステロールの増加した輸出に起因してＬｉｐａ^－／－マウスにおいて増加した（図３）。疾患によって影響を受ける他の血清指標、例えば、低減した血清ＨＤＬ－コレステロール（肝臓へのコレステロール流入を媒介する）及び低減した血清グルコース（腸への低減した栄養素取り込みを反映する可能性が高い）は、両方とも、４ｍｏＬｉｐａ^－／－マウスにおいて半分を超えて低減し、ＡＡＶ治療によってベースライン野生型レベルへ向かって有意に増加した（図示せず）。異常な肝臓機能の他の指標、例えば、上昇した血清総ビリルビン及び総タンパク質もまた、ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡでの治療によって完全に補正されたが、これらの変化は、総タンパク質についてのみ統計的に有意であった（例えば、総ビリルビン：ＷＴ０．３８±０．０２ｍｇ／ｄＬ、Ｌｉｐａ^－／－０．５４±．０１３ｍｇ／ｄＬ、Ｌｉｐａ^－／－治療済０．３１±０．０４ｍｇ／ｄＬ、総タンパク質：ＷＴ５．５５±０．０７ｇ／ｄＬ、Ｌｉｐａ^－／－６．８２±０．１０ｇ／ｄＬ（ｐ＜０．００００１対ＷＴ）、Ｌｉｐａ^－／－治療済５．７８±０．１８（ｐ＜０．００１対未治療Ｌｉｐａ^－／－）。

４ヶ月齢までに、Ｌｉｐａ^－／－マウスは、ヒト疾患の症状でもある、肝臓及び脾臓のサイズの劇的な増加に起因した肥大及び膨張した腹部を有するため、視覚によって容易に認識される（Ｂｕｒｔｏｎｅｔａｌ．ＪＰｅｄｉａｔｒＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＮｕｔｒ６１：６１９－６２５，２０１５）。６ヶ月エンドポイントまでに、脾臓及び肝臓の両方は、合計サイズで５倍超増加していた（図４）。これは、主にこれらの臓器へのトリグリセリドの重大な負荷によるものであるが、他の臓器も影響を受け、例えば、腸、心臓、及び腎臓は、脂肪負荷によって増加したサイズを示す（図４）。対照的に、脳サイズは増加せず、筋肉サイズは減少し、損なわれた栄養素吸収に起因する可能性が高い（図４）。８×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＶＭ．ＬＩＰＡでの治療は、全ての試験された臓器において６ヶ月齢での臓器サイズの増加を少なくとも７０％低減し、全てのそのような臓器は、それらのベースライン野生型指標へ向けた有意な改善を示した（図４）。

臓器サイズにおけるこれらの改善は、オイルレッドＯを使用した染色の有意な低減によって一致した（青色でのヘマトキシリン対比染色、図５）。オイルレッドＯ染色は、腸、脾臓、肝臓、及び腎臓における脂質負荷を特定するために、６ヶ月齢の模擬治療済Ｌｉｐａ^－／－対照と比較して、ＡＡＶ治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて非常に有意な染色の減少を示した。そのような減少した染色は、低減した脂肪含有量を強く示した。これは、肝臓及び脾臓におけるトリグリセリド含有量の生化学的指標で確認された。ここで、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおけるトリグリセリド含有量の５倍超の増加は、ＡＡＶ治療によって有意に低減し、両方の事例においてベースライン野生型レベルに近づいた（図６）。ＡＡＶ治療はまた、オープンフィールド試験でのマウスの全体的な活動レベルの改善をもたらし、マウスは、野生型マウスと同じか又はそれを超える歩行活動を示した。例えば、６ヶ月で、５分間隔当たりの平均総歩行事象が、野生型ＦＶＢ／ＮＪ対照と比較して、模擬治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて３５％減少したが、この指標は、ＡＡＶ治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスでは野生型活動の１．３５倍に増加した（ＷＴ：４４７７±３８１事象／５分、Ｌｉｐａ^－／－：２９２５±７７１事象／５分、Ｌｉｐａ^－／－治療済：６０６９±７２事象／５分、治療済対未治療Ｌｉｐａ^－／－比較についてｐ＜０．０５）。

驚くべきことに、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて肝臓がＡＡＶで容易に形質導入されることが予想されたが、肝臓は、８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＩＶ用量（ｎ＝４）で１．７±０．４ｖｇ／核でのみ形質導入され、同じマウスにおいて骨格筋と比較して形質導入はたった２倍の上昇であった（０．９±０．１ｖｇ／核、ｎ＝４）。このレベルの形質導入は、肝臓における細胞の飽和（＞１ｖｇ／核）を示すが、この用量の他のＡＡＶベクターで１０～１００ｖｇ／核を生成することは珍しくない［２２］。このより低いレベルの形質導入は、肝臓が成長するにつれて、マウスにおいて生後１ヶ月で肝臓における肝細胞が***するという事実に起因する可能性があり、そのような肝臓細胞の生成の前の時点、生後２日目にそのような細胞を治療で形質導入することを不可能にする。

実施例３
若齢成体マウスの遺伝子療法
肝細胞は、約１ヶ月齢まで成長するにつれて肝臓において***するため、若齢成体（２ヶ月齢）マウスの治療を調査した。２ヶ月齢Ｌｉｐａ^－／－マウスに、単回注射ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡを静脈内投与した。後眼窩静脈を介した８×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡ。成体Ｌｉｐａ^－／－マウスのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡでの治療は、肝臓へのウイルスゲノムの形質導入の対数的増加をもたらし、２～５０ｖｇ／核に増加させた（図７）。

この形質導入レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されるように、野生型組織において見られる正常なマウスＬＩＰＡ遺伝子発現を超えて増加したヒトＬＩＰＡ導入遺伝子発現をもたらした（図８）。２ヶ月齢で治療された４ヶ月齢Ｌｉｐａ^－／－マウスからの肝臓の全体的な外観は、野生型（ＦＶＢｎ）と変わらず、全く脂肪を示さなかったが、Ｐ１で治療されたマウスからの４ヶ月齢Ｌｉｐａ^－／－マウスは、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウス程ではないが、依然としていくらかの脂肪を含有し、これもまたサイズが大幅に増加した（図９）。

視覚的に見られる低減した脂肪含有量は、肝臓及び脾臓の両方における治療済Ｌｉｐａ^－／－（ＬＩＰＡＫＯ）マウスにおけるコレステロール及びトリグリセリドの測定された低減によって確認され、これは２ｍｏ条件では野生型とは有意に変わらなかった（図１０）。

肝臓、脾臓、及び腸の重量は全て、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスではこれらの臓器が既にこの時点までに脂肪負荷によってサイズが倍増していたという事実にもかかわらず、２ヶ月でほぼ正常レベルまで低減した（図１１）。よって、ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡは、ＬＡＬ－Ｄモデルにおける疾患症状を予防及び回復させることができる。リンパ節における血液細胞は、２日と比較して２ｍｏでの治療では脂肪負荷のより大きな予防を示した（図１１）。マウス血液細胞は、数ヶ月の間でターンオーバーするので、血液細胞が、４ヶ月齢までにターンオーバーによってＡＡＶ発現を損失したであろうから、これは成体マウスにおけるｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療のトランス効果を示す。この所見は、ＬＩＰＡ酵素活性が、成体としてｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡで治療されたＬｉｐａ^－／－マウスの血清中で実際に上昇した（図１２）という事実と、肝臓組織におけるその上昇（図１３）とともに、相関した。

このデータは、ＬＩＰＡ酵素が、肝臓から放出され、成体動物における遺伝子療法治療の結果として血液中で全身的に発現され、血液などの細胞が常にターンオーバーする組織にトランスで治療用タンパク質を提供することを示す。これは、ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍＣＭＶ．ＬＩＰＡ遺伝子療法が、適切な用量及び療法のタイミングが与えられるときに形質導入された細胞及び組織だけでなく、遺伝子療法によって形質導入されない細胞にも酵素置換療法も提供することを可能にする。そのような療法は、患者の生涯の間に継続的に全身を通して疾患の不断の予防を可能にするであろう。

実施例３
ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療は、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける肝脾腫大症及び上昇した血清肝臓酵素を阻害し、回復させることができる
実施例２において記載される実験の延長として、ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡを様々な年齢で投与した。これらの実験は、滴定法における違いを考慮するとき、遺伝子療法臨床試験において現在使用されている最も高い用量と同等であった、ＡＡＶ用量を試験した（３６、３７）。ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡＡＡＶ遺伝子療法の１キログラム当たり８．４×１０^１３のベクターゲノム（ｖｇ）の用量（ｖｇ／ｋｇ）を、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて早期（Ｐ２、出生後２日目）では顔面静脈を介して、又は中期（Ｐ６０、出生後６０日目）若しくは進行した（Ｐ１２０、出生後１２０日目）病期では尾静脈を介して静脈内注射した。マウスを、Ｐ６０（２ヶ月齢）、Ｐ１２０（４ヶ月齢）、及びＰ１８０（６ヶ月齢）のエンドポイントまで追跡した。（図１４Ａ）これらの時点で、マウスを剖検し、臓器（肝臓、脾臓、腎臓、腸、腸間膜リンパ節、心臓、肺、胸腺、脳）及び筋肉（左右腓腹筋及び四頭筋）を生体内分布及び遺伝子発現のために採取した。採取された非筋肉臓器を計量し、次いでＯＣＴ中に浸漬した後、ドライアイスで冷却されたイソペンタン中で凍結した。筋肉を計量し、次いで液体窒素で冷却されたイソペンタン中で瞬間凍結した。

肝脾腫大症、又は肝臓及び脾臓の肥大、並びに増加した脂肪沈着による臓器の黄変は、両方とも、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおけるＬＡＬ－Ｄの及び疾患の特徴を定義している。両方の表現型は、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて存在し、年齢とともに進行した（図１４Ｂ－Ｄ）。野生型（ＷＴ）マウス（図１４Ｃ）において全ての３つの年齢で体重の５％のみであるのとは対照的に、肝臓重量は、時間とともに増加して、６ヶ月齢までに総体重の２５％程を含んだ。同様に、脾臓重量は、平均して、ＷＴにおける０．３％と比較して、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて６ヶ月齢で総体重の２％まで増加した（図１４Ｄ）。Ｐ２、Ｐ６０、及びＰ１２０でのＬｉｐａ^－／－マウスの治療は、低減した肝臓重量及び正常化した肝臓の色をもたらしたが、早期治療（Ｐ２）は、Ｐ６０又はＰ１２０での治療よりもはるかに効果が低かった。Ｐ２注射は、２ヶ月及び４ヶ月で肝臓サイズを野生型レベルに低減し、疾患阻害を示したが、肝臓重量を、６ヶ月で、約５０％、部分的に低減したのみであった。対照的に、Ｐ６０及びＰ１２０注射は、これらの年齢で既に存在する肝脾腫大症の証拠にもかかわらず、より効果的であり、肝臓重量を、６ヶ月で、それぞれ、総体重の８％及び１０％に低減し、疾患回復を示した。Ｐ２注射は、６ヶ月エンドポイントで肝臓についてよりも脾臓サイズを低減するのに効果的であり（図１４Ｄ）、３つの時点全てでの治療は、脾臓重量を野生型レベル付近まで低減した。腸及び腸間膜リンパ節はまた、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて増加した重量を示した（図１４Ｅ、Ｆ）。腸における重量は、ＷＴにおける３％と比較して、６ヶ月齢で総体重の４．５％に増加し（図１４Ｅ）、一方で腸間膜リンパ節の重量は、ＷＴにおける０．１％と比較して、体重の０．６％に増加した（図１４Ｆ）。ここでも、ＡＡＶ治療は、肝臓で見られる応答と同様の方法で腸及び腸間膜リンパ節の重量を低減し、Ｐ２注射は、６ヶ月までに損失された２ヶ月又は４ヶ月で野生型レベル付近への改善を示し、一方でＰ６０又はＰ１２０での注射は、６ヶ月エンドポイントでの重量の低減を示した。肝臓、脾臓、及び腸とは異なり、試験された治療時間のいずれかで、任意の時点でのリンパ節重量の完全な正常化を示したデータはなかった。代わりに、最高でも、６ヶ月までに体重の平均５０％低減しか達成されなかった（図１４Ｆ）。

血清ＡＬＴ及びＡＳＴ活性も測定され、これらの酵素は、上昇したとき、肝臓損傷を示す（図１４Ｇ、Ｈ）。血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの両方は、６ヶ月までにＷＴと比較してＬｉｐａ^－／－マウスにおいて２０倍上昇した。ここで、全ての時点での治療は、減少した血清ＡＬＴ／ＡＳＴレベルをもたらし、Ｐ６０及びＰ１２０での注射による効果は、Ｐ２でよりも顕著であった。肝臓重量と同様に、Ｐ２での注射は、２ヶ月及び４ヶ月時点で血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを、野生型レベル付近まで低減したが、６ヶ月では約５０％の低減しか示さなかった。ＷＴマウスにおけるこの用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡの注射は、試験された時点のいずれにおいても血清トランスアミナーゼレベルを有意に上昇させなかった。Ｐ２注射についての６ヶ月での増加した体重及び血清肝臓酵素レベルにもかかわらず、６ヶ月エンドポイントを超えて生存した数匹のＰ２治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスは、未治療Ｌｉｐａ^－／－対照と比較して、全体的な寿命の有意な増加を示した（図１５）。未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスは、２２４日の生存期間中央値を示したのに対し、Ｐ２治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスは、５０６日の生存期間中央値を有し、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスの寿命中央値の２倍超であった。

Ｌｉｐａ^－／－マウスの体重は、任意の研究時点でＷＴマウスの体重と変わらなかった（図１６Ａ）。加えて、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて、約２５％の、筋肉量の有意な低減が観察された（図１５Ｂ、Ｃ）。肝腫大のために、Ｌｉｐａ^－／－マウスは、膨満した腹部を呈した。微細、歩行、中央、周辺、及び養育運動事象を決定したオープンフィールド研究を前述（４９）のように実施して、可動性が影響を受けたかを決定した（図１６Ｄ～Ｈ）。微細運動（スニッフィング及びグルーミングなど）及び周辺運動（オープンフィールド領域の周辺での運動）は、ＷＴと比較してＬｉｐａ^－／－マウスでは影響されなかったが、中央ケージベースの歩行及び養育は有意に減少した。全てのそのような措置は、全ての時点で治療によって改善された。そのような筋萎縮はまた、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける腹部膨満に加えて、歩行差に寄与し得、これらの筋肉重量は、Ｐ６０及びＰ１２０注射で増加してＷＴレベルに戻ったが、Ｐ２についてはわずかに増加したのみであった（補足図１６Ｂ、Ｃ）。

実施例４
臓器におけるＡＡＶ形質導入は、ＬＩＰＡ発現及び回復したリソソーム酸リパーゼ酵素活性をもたらす
（５０）に記載されるように、定量的リアルタイムＰＣＲ（図１７Ａ）を使用して、全ての注射時点からの様々な臓器及び組織におけるＡＡＶｖｇの生体内分布を評価した。６ヶ月エンドポイントで、Ｐ２で注射されたマウスとＰ６０又はＰ１２０で注射されたマウスとの間では臓器生体内分布に差があり、Ｐ２での注射は、心臓及び肺においてより大きなＡＡＶ形質導入を示したが（それぞれ、２１．８２±８．４１ｖｇ／核、及び７．８７±１．１６ｖｇ／核、表３、Ｐ６０又はＰ１２０での注射は、肝臓においてより大きな形質導入（それぞれ、４０６．１３±１１７．５９ｖｇ／核、及び９０．６９±２１．４８ｖｇ／核）、腎臓、肺、脾臓、及び胸腺においてもより高いレベル（２０～５０ｖｇ／核）を示した（図１７Ａ、表４）。ボディプランの左右からの腎臓及び筋肉の比較は、均等なＡＡＶ分布を示した。Ｐ２での注射では、心臓及び肝臓において４ヶ月～６ヶ月に形質導入の急激な低下があったが、形質導入レベルは、ほとんどの臓器において研究の経過にわたって比較的に安定であった（以下、表３及び４）。Ｐ６０での注射では、形質導入レベルはまた、注射後２ヶ月及び４ヶ月で測定されるとき安定であった。

次に、定量的逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲを使用して、野生型組織における内因性マウスＬｉｐａ遺伝子の正常な発現と比較して、治療されたマウスにおけるヒトＬＩＰＡ導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した。６ヶ月研究エンドポイントで、Ｐ２での注射で、それぞれ、肺及び心臓において３倍及び１５倍のＬＩＰＡ発現があり（図１７Ｂ）、この時点でのこれらの臓器における７及び２０ｖｇ／核のＡＡＶｖｇの所見と一致した。Ｐ２注射は、０．８に等しいヒトＬＩＰＡ／マウスＷＴＬｉｐａで、肝臓における正常に近いレベルの遺伝子発現を達成した。興味深いことに、平均で、それぞれ、この時点で肝臓において９０又は４００ｖｇ／核が存在したという事実にもかかわらず、６ヶ月でＰ６０又はＰ１２０注射について同じ比で、肝臓において１．５倍のみの増加があり、ＡＡＶ媒介ＬＩＰＡ導入遺伝子発現に対するフィードバック阻害を示した。同様に、Ｐ６０及びＰ１２０時点でそれらの組織に５～３０ｖｇ／核が存在するにもかかわらず、腎臓及びリンパ節におけるＡＡＶ形質導入は、増加した発現ＬＩＰＡ／Ｌｉｐａ比をもたらさなかった。また興味深いのは、Ｐ２が注射された骨格筋（腓腹筋及び大腿四頭筋）が、Ｐ２について６ヶ月時点で２０倍のＬＩＰＡ／Ｌｉｐａ比を示したのに対し、Ｐ６０及びＰ１２０が注射された筋肉が、より高いＡＡＶｖｇを有するにもかかわらず、より低い比を示したという事実であった。任意の時点でのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡ治療は、内因性マウスＬｉｐａ発現を改変しなかったが（図示せず）、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける組織は、野生型と比較して内因性Ｌｉｐａ遺伝子発現のいくらかの低減を示した（図示せず）。

治療済マウス及び対照マウス由来の肝臓、脾臓、及び血清におけるリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）酵素活性も測定した（図１７Ｃ～Ｅ）。全体的なＬＡＬ酵素活性は、ＷＴと比較してＬｉｐａ^－／－肝臓において９０％低減した（図１７Ｃ）。６ヶ月エンドポイントで、肝臓酵素活性は、全ての調査された時点で、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスとＰ２で治療されたマウスとの間で有意に変わらなかった（図１７Ｃ）。しかしながら、Ｐ６０及びＰ１２０で注射されるとき、ＡＡＶ治療は、ＷＴ活性を、それぞれ、４倍及び２．５倍超える酵素活性の有意な増加をもたらした。脾臓では、全体的なＬＡＬ活性は、６ヶ月でＷＴと比較して約８０％低減した。肝臓と同様に、Ｐ２注射された脾臓は、６ヶ月で活性の改善を示さなかった。しかしながら、肝臓とは異なり、脾臓におけるＰ６０治療時点はまた、改善を示さず、一方でＰ１２０は、増加を示したが、ＷＴレベルには到達しなかった（図１７Ｄ）。

血清ＬＡＬ酵素活性もアッセイして、外因性ＬＡＬが、他の組織によってトランスで利用され得る方法での治療の結果として細胞から分泌されているかを決定した。凍結された肝臓及び脾臓試料を、ＬＡＬ組織抽出緩衝剤（０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ６．８、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５％ＮＰ－４０）中でホモジナイズした。ＢＳＡを標準として使用して、タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で決定した。ＬＡＬ活性を、前述のように、基質としてパルミチン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ、ＧｏｌｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して決定した（５１、５２）。簡潔には、１μμｇのタンパク質を、０．３４５ｍＭの基質溶液（０．３４５ｍＭの４－ＭＵＰ、９０．９ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及び０．０３２５％（ｗ／ｖ）カルジオリピン）に添加し、酵素反応を、ＬＡＬ阻害剤Ｌａｌｉｓｔａｔ２（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）の存在下又は不在下で３通りに行った。反応物を、暗所で３時間３７℃でインキュベートした。２００μｌの１５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１１．５）を添加することによって、反応を停止した。０～３３．３μＭの範囲の４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ、ＧｏｌｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の標準曲線を調製した。蛍光を、３５５ｎｍ励起フィルター及び４６０ｎｍ発光フィルターを使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ２プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）で測定した。ＬＡＬ活性（ｐｍｏｌ／分／μμｇ）は、阻害された反応の酵素活性を阻害されていない反応の酵素活性から差し引くことによって計算した。

Ｐ２治療済マウスからの血液化学分析後に十分な血清が残っていなかったため、血清酵素活性は、Ｐ６０及びＰ１２０で治療されたマウスでのみ実施した。未治療ＬＩＰＡ^－／－マウスにおける全体的なＬＡＬ活性は、ＷＴの約３分の１であった（１１．８０±２．８９対２９．４３±２．９１ｐｍｏｌ／分／μμｌ血清）。Ｐ６０及びＰ１２０での治療では、血清ＬＡＬ酵素活性は、ＷＴレベルに回復した（図１７Ｅ）。

実施例５
ｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡで治療されたＬｉｐａ^－／－マウスでは、トリグリセリド及びコレステロールレベルが低減する
脂質抽出キット（クロロホルムフリー）（ａｂｃａｍ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、総脂質を瞬間凍結された組織から抽出した。トリグリセリドを、Ｉｎｆｉｎｉｔｙトリグリセリド試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定し、総コレステロールを、Ｉｎｆｉｎｉｔｙコレステロール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。脂質濃度を、トリグリセリド又はコレステロール標準の標準曲線（ＰｏｉｎｔｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に対して決定した。測定を３通り行い、５００ｎｍでの吸光度値をＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。

２ヶ月、４ヶ月、及び６ヶ月時点でアッセイされるとき、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスの肝臓における総コレステロールは、平均１９．９６±３．９７μｇ／ｍｇ肝臓、ＷＴよりも約１２倍高い値で絶えず上昇した（図１８）。脾臓中のコレステロール含有量は、２ヶ月で２．６５±０．６６μｇ／ｍｇから、６ヶ月で５．５１±０．９１μｇ／ｍｇまで、よりゆっくりと増加した。ＷＴ脾臓におけるコレステロール含有量はまた、年齢とともに増加した（２ヶ月で１．４４±０．７０μｇ／ｍｇから６ヶ月で２．２３±０．３６μｇ／ｍｇまで）。Ｐ２での治療は、注射後２ヶ月及び４ヶ月で、肝臓及び脾臓におけるコレステロールレベルを有意に減少させた。６ヶ月で、Ｐ２治療についての総コレステロールレベルは、肝臓及び脾臓の両方において未治療Ｌｉｐａ^－／－レベルまで回復し（図１８Ｂ）、一方でコレステロール含有量は、Ｐ６０及びＰ１２０注射についてＷＴレベル付近まで低減したままであった。

未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスの肝臓におけるトリグリセリドレベルは、２ヶ月～４ヶ月齢で倍増し（１４．０４±４．１５μｇ／ｍｇ～２９．３２±３．７０μｇ／ｍｇ）、次いで６ヶ月で一定のままであった（３０．６６±１０．４５μｇ／ｍｇ）（図１８Ｃ）。よって、６ヶ月で、これらの値は、平均して、ＷＴと比較して６倍上昇した（平均４．７０±０．３４μｇ／ｍｇ）。全ての時点で、治療は、肝臓トリグリセリドを有意に低減し、ＷＴレベルに近づくか、又は到達した（図１８Ｃ）。脾臓では、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおけるトリグリセリド含有量は、２ヶ月齢～６ヶ月齢でより徐々に増加し（２．２７±１．３２μｇ／ｍｇ～４．３１±２．８２μｇ／ｍｇ）、６ヶ月齢まではＬｉｐａ^－／－脾臓トリグリセリド含有量がＷＴよりも有意に高くなかった。肝臓とは異なり、Ｐ２及びＰ６０での治療は、２ヶ月、４ヶ月、又は６ヶ月エンドポイントで脾臓におけるトリグリセリド含有量を有意に改変しなかった（図１８Ｄ）。代わりに、Ｐ１２０での治療のみが有意な減少を示した。

Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける血清変化は、上昇したＬＤＬコレステロールとともに、低減した総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び遊離脂肪酸を含んだ（図１８Ｅ－Ｉ）。肝臓及び脾臓における脂質レベルで見られるように、Ｐ２治療は、２、４、又は６ヶ月エンドポイントでこれらの変化した血清脂質レベルのいずれも有意に改善しなかったが、多くの場合、改善に向かう傾向があった。対照的に、Ｐ６０及びＰ１２０での治療は、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおける総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、及び遊離脂肪酸の低減を相殺し、６ヶ月エンドポイントでＷＴマウスにおいて見られるものに近いレベルを生成する。同様に、治療は、トリグリセリド及びＬＤＬコレステロールを部分的に補正した。

組織切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色を使用して、肝臓、脾臓、及び腸における中性脂質を視覚化した（図１８Ｊ）。ＷＴと比較して、未治療Ｌｉｐａ^－／－肝臓、脾臓、及び腸においてＯＲＯで染色された脂質の大きな蓄積があり、肝臓においてほぼ偏在的な強い染色が存在していた。全ての時点での治療では、全体的なＯＲＯ染色の減少があったが、これはＰ６０及びＰ１２０での治療について最も顕著であった。治療後、ＯＲＯ染色は、主に組織内の脂質島として現れ、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて見られるより拡散した染色は、切片の残部において不在であった。

実施例６
ＬＩＰＡ発現は肝臓におけるマクロファージを低減する
ＬＩＰＡ及びＣＤ６８免疫染色を実施することによって、治療された肝臓における肝細胞発現の程度及びマクロファージ占有率の程度を決定するために。１０μｍの凍結組織切片を肝臓試料から調製した。スライドをアセトン中で１０分間－２０℃で固定し、空気乾燥させて過剰なアセトンを蒸発させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。スライドをＢＬＯＸＡＬＬ内因性ブロッキング溶液（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で１０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで２．５％正常血清中で３０分間ブロックした。スライドを、ＬＩＰＡ（１：１０００、ＨＰＡ０５７０５２、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、又はＣＤ６８（１：５００、ＭＣＡ１９５７ＧＡ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、スライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＩｍｍＰＲＥＳＳＨＲＰ試薬（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と３０分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＩｍｍＰＡＣＴＤＡＢ染色溶液（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で５分間染色した。次いで、それらをヘマトキシリンＱＳ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対比染色し、脱水し、分化させ、ガラスカバースリップを用いてＣｙｔｏｓｅａｌＸＹＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でマウントした。

図１９に示されるように、６ヶ月のエンドポイントで、Ｐ２治療済Ｌｉｐａ^－／－マウスは、肝臓細胞において非常に拡散した弱い染色のみを示し、タンパク質のリソソームへの局在化について予想されるであろう点状染色はほとんど又は全くなかった。対照的に、Ｐ６０及びＰ１２０で注射されたマウスは、肝臓切片全体を通して明らかであった点状免疫染色の増加を示した。抗ＣＤ６８染色、マクロファージ及びＫｕｐｆｆｅｒ細胞を検出するために使用されるマーカーは、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて高度に上昇した染色を示した。全ての時点での治療では、ＣＤ６８陽性マクロファージの減少があったが、染色は肝臓に存在する脂質島内に残った。よって、ＬＩＰＡ及びＣＤ６８免疫染色は、Ｐ６０及びＰ１２０治療が肝臓における高レベルのＬＩＰＡ発現及びマクロファージ占有率の低下をもたらしたという概念を支持した。

実施例７
より低用量のｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡは依然として治療上の利点を示す
８．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量を投与して、遺伝子療法がＬＡＬ－Ｄについて実行可能であるかを決定する飽和を確実にした。この投与からの有望なデータを考慮して、より低い用量の遺伝子療法ベクターが依然として効力を証明するかを決定するように実験を設計した。Ｐ６０（中期）疾患での注射は、高用量で最も肯定的な結果をもたらしたため、この注射プロトコルを４．２×１０^１３、２．１×１０^１３、及び１．０５×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡで繰り返し、最終的には用量を出発用量と比較して８倍低下させた。これらのマウスを、６ヶ月齢（注射の４ヶ月後）まで追跡した。

肝臓及び脾臓の肉眼的病理をまず調べた。用量の減少に伴い、肝臓は、徐々により大きく、より黄変して見え、脂肪沈着の増加を示した（図２０Ａ）。それにもかかわらず、４つの用量全てでの治療は、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスと比較されるとき、より正常な肝臓外観を示し（図２０Ａ）、２つのより高い用量（８．４×１０^１３及び４．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）は、２つのより低い用量よりもわずかに高い効果を有する。脾臓はまた、用量が減少するにつれてより長く、より厚く見えたが、同様に、治療なしで生じるであろうよりもはるかに小さく、あまり肥大化しないままであった（図２０Ａ）。肝脾腫大症は、４つの用量全てで低減され、４つの用量全てでの肝臓及び脾臓についての体重のパーセントは、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスと比較して有意に低減された（図２０Ｂ、Ｃ）。しかしながら、使用された２つの最も低い用量（１．０５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ及び２．１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）で、４．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇと比較して、相対重量の明らかな増加があった。同様に、４つの用量全てが腸の重量の低減を示したが（図２０Ｄ）、２つの最も高い用量のみが腸間膜リンパ節の重量の低減を示した（図２０Ｅ）。血清ＡＬＴ及びＡＳＴ値は、４つの用量全てで有意に減少し、同様に、より低い用量でより高いレベルに向かうわずかな傾向があった（図２０Ｆ及びＧ）。

ＡＡＶの生体内分布を、投与実験のための全ての臓器及び組織において調べた（図２１Ａ、表５）。用量８．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ対４．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、及び２．１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ対１．０５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ間ではＡＡＶの２倍の減少があり、全ての臓器において４．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ及び２．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量間にはＡＡＶｖｇ／核の２倍を超える急激な減少があった。最も重要なことに、１．０５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの最も低い用量で、肝臓には依然として約２０ｖｇ／核があり、脾臓には２ｖｇ／核があった。興味深いことに、これは、あまり予想されていなかったヒトＬＩＰＡ転写産物発現に翻訳され（図２１Ｂ）、肝臓では、最も高い用量（８．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）で、２００ｖｇ／核よりも多いにもかかわらず、内因性マウス野生型Ｌｉｐａ発現に正規化された、ＬＩＰＡ発現の約２倍の増加のみがあった。最も低い用量（１．０５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）を使用して、ＬＩＰＡ転写産物レベルを依然としてＷＴレベルに回復させ（図２１Ｂ）、肝臓におけるＷＴレベルの酵素活性をもたらした（図２１Ｃ）。脾臓における全ての用量でのＡＡＶ及びＬＩＰＡ転写産物の低い発現は、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスと比較して有意に増加した酵素活性をもたらさなかった（図２１Ｄ）。血清中のＬＡＬ酵素活性は、使用された４つの用量全てで未治療Ｌｉｐａ^－／－と比較して上昇した（図２１Ｅ）。

４つの用量全てはまた、未治療Ｌｉｐａ^－／－マウスと比較して、肝臓におけるコレステロール（図２２Ａ、Ｂ）及びトリグリセリド（図２２Ｃ、Ｄ）含有量を有意に低減した。肝臓及び脾臓の両方のコレステロール及びトリグリセリド含有量は、使用された４つの用量全てでＷＴレベルと同等又はほぼ同等であるように低減された。脾臓トリグリセリドレベルは、肝臓におけるトリグリセリドレベルよりも低減されたが、全ての指標は、顕著に異なっていた。よって、肝臓及び脾臓の脂質含有量の低減は、Ｌｉｐａ^－／－マウスにおいて１．０５×１０^１３ｖｇ／ｋｇほどの低いｒｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡの用量で達成することができる。

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３７．ＭｅｎｄｅｌｌＪＲ，ＳａｈｅｎｋＺ，ＬｅｈｍａｎＫ，ＮｅａｓｅＣ，ＬｏｗｅｓＬＰ，ＭｉｌｌｅｒＮＦ，ｅｔａｌ．ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＳｙｓｔｅｍｉｃＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｉｎＣｈｉｌｄｒｅｎＷｉｔｈＤｕｃｈｅｎｎｅＭｕｓｃｕｌａｒＤｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＡＮｏｎｒａｎｄｏｍｉｚｅｄＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＴｒｉａｌ．ＪＡＭＡＮｅｕｒｏｌｏｇｙ．

配列番号１：ＬＩＰＡ遺伝子バリアント１
ＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣＴＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＡＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＡＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＧＴＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＡＣＴＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＧＧＡＣＧＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＴＧＡ
配列番号３
ＴＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧ
ｐｔｒｓ．ｍｉｎｉＣＭＶ．ＬＩＰＡＡＡＶベクタープラスミド配列（配列番号４）
ＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧｔＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧｃｇａＴＴＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＴＡＡＡＧＣＴＡＡＡＴＣＧＧＴＴＧＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＡＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＡＣＧＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＣＴＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡＴＧＡＡＣＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴＧＴＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡｇＣＧＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＣＴＡＴＣＡＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＧＴＡＡＡｇＣＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＴＡＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＧＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＡＧＡＣＡＧＧＡＡＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡＣＣＧＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＴＡＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧｃｃＣＧｇｇＣＡＡＡＧｃｃＣＧｇｇＣＧｔＣＧｇｇＣＧａｃＣＴＴＴＧｇｔＣＧｃｃＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃｃａｔｃａｃｔａｇｇｇｇｔｔｃｃｔＡＧＧａａｇｃｔｔＴＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧｃｔｃｇａＣＣＧＧｇｇｔａｃｃｃｇｇｃｃｇｇｃｔａｇｃｃｇｃｃａｃｃＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣＴＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＡＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＡＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＧＴＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＡＣＴＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＧＧＡＣＧＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＴＧＡｇｃａｔｇｃａｃｔａｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇａｔｃｔＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴＣＣＧ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Claims

（ａ）１つ以上の調節制御要素と、
（ｂ）リパーゼＡ（ＬＩＰＡ）ｃＤＮＡ配列と、を含む、ポリヌクレオチド。
前記調節制御要素が、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター又はその断片である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記ＬＩＰＡｃＤＮＡが、（ａ）配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
配列番号３のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
配列番号４のヌクレオチド１８５３～３９０６を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、又はＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、及びそれらの誘導体のものである、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
請求項７又は８に記載のｒＡＡＶを含む、ｒＡＡＶ粒子。
請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、又は請求項９に記載のウイルス粒子を含む、組成物。
前記組成物が、静脈内送達のために製剤化される、請求項１０に記載の組成物。
請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を投与することを含む、リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）の治療を必要とする対象においてそれを行う方法。
前記ＬＡＬ－Ｄが、ウォルマン病又はコレステロールエステル蓄積症である、請求項１２に記載の方法。
前記対象が、ＬＡＬ－Ｄ遺伝子における変異を有する、請求項１２又は１３に記載の方法。
請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を投与することを含む、脂質貯蔵又は蓄積に関連する障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法。
前記障害が、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患である、請求項１４に記載の方法。
請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を投与することを含む、脂質異常症又は高コレステロール血症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法。
請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を投与することを含む、トリグリセリド、コレステロール、及び／又は脂肪酸の減少を必要とする対象においてそれを減少させる方法。
免疫抑制剤を投与するステップを更に含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子、又は組成物が、静脈内若しくは腹腔内送達によって投与されるか、又は腹腔内投与される、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬品の調製のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物の、使用。
前記ＬＡＬ－Ｄが、ウォルマン病又はコレステロールエステル蓄積症である、請求項２１に記載の使用。
前記対象が、ＬＡＬ－Ｄ遺伝子における変異を有する、請求項２１又は２２に記載の使用。
脂質貯蔵又は蓄積に関連する障害の治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬品の調製のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物の、使用。
前記障害が、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患である、請求項２４に記載の使用。
脂質異常症又は高コレステロール血症の治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬品の調製のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物の、使用。
トリグリセリド、コレステロール、及び／又は脂肪酸の減少を必要とする対象においてそれを減少させるための医薬品の調製のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物の、使用。
前記医薬品が、免疫抑制剤とともに投与される、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の使用。
前記医薬品が、静脈内又は腹腔内送達のために製剤化される、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の使用。
リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を含む、組成物。
前記ＬＡＬ－Ｄが、ウォルマン病又はコレステロールエステル蓄積症である、請求項３０に記載の組成物。
前記対象が、ＬＡＬ－Ｄ遺伝子における変異を有する、請求項３０又は３１に記載の組成物。
脂質貯蔵又は蓄積に関連する障害の治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を含む、組成物。
前記障害が、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患である、請求項３３に記載の組成物。
脂質異常症又は高コレステロール血症の治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を含む、組成物。
トリグリセリド、コレステロール、及び／又は脂肪酸の減少を必要とする対象においてそれを減少させるための組成物であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のｒＡＡＶ、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子、又は請求項１０若しくは１１に記載の組成物を含む、組成物。
前記組成物が、免疫抑制剤とともに投与される、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の組成物。
前記組成物が、静脈内送達のために製剤化される、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の組成物。