JP2024503700A - 多様な抗原に対する広範かつ持続的な自然免疫を刺激するアジュバント - Google Patents

多様な抗原に対する広範かつ持続的な自然免疫を刺激するアジュバント Download PDF

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Abstract

本明細書では、アジュバント、例えば、ワクチンアジュバントを含む免疫刺激組成物を投与して、組成物中に存在する抗原とは無関係の病原体に対する広範かつ持続的な自然免疫を刺激することによって、免疫細胞のエピゲノムを調節するための方法が提供される。

Description

最近の研究では、基本的な生物学的プロセスの制御におけるエピゲノムの中心的な役割が目立っている。エピゲノムは、細胞の世代を超えて長期間にわたって特定のクロマチン状態を維持することができ、したがって、遺伝子発現情報の永続的保管が可能になる。
免疫系の文脈において、エピゲノムイベントは、造血、Ｔリンパ球における免疫学的記憶及び疲弊の生成、並びにＢ細胞及び形質細胞の発生中に記述されている。最近の研究ではまた、単球及びＮＫ細胞におけるエピゲノム変化が、自然免疫系における免疫学的記憶の形態をインプリントすることが明らかになっている。
自然免疫系へのエピジェネティックインプリンティングの概念は、ワクチン接種の文脈において特に重要性を獲得している。ＢＣＧによるワクチン接種は、単球にエピゲノム変化を誘発することが示されており、かかる変化が、自然活性化の永続的な状態をもたらすことが示唆されている。しかしながら、ＢＣＧワクチン接種で観察されたかかるエピゲノムインプリンティングが、他のワクチン接種でより一般的な現象をどの程度反映しているかは、未解決の問題である。更に、ワクチン接種により誘発されたエピゲノムインプリンティングを決定する重要なパラメータ、例えば、使用されるワクチン若しくはアジュバントのタイプ、又はマイクロバイオームの影響は知られていない。重要なことに、ヒトにおけるワクチン又は任意の刺激に対する免疫応答中のエピゲノムランドスケープの包括的な単一細胞解析は欠如している。
最近、研究者らは、システム生物学的アプローチを使用して、ヒトにおけるワクチン接種に応答する転写、代謝、プロテオーム及び細胞ランドスケープを包括的に解析し、ワクチン免疫の新規の相関因子（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ）及びメカニズムを特定した。これらの進歩にもかかわらず、ヒトにおける免疫応答中のエピゲノムランドスケープの包括的なシステム生物学的評価は欠如している。
本明細書では、アジュバント、例えば、ワクチンアジュバントを含む免疫刺激組成物を投与することによって、免疫細胞のエピゲノムを調節し、組成物中に存在する抗原とは無関係の病原体、例えば、ウイルスに対する広範かつ持続的な自然免疫を刺激する方法が提供される。具体的には、自然免疫細胞、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞（ＰＭＮ）、好中球などを含む骨髄系細胞は、アジュバントに応答してエピジェネティックに変化し、それによって病原体に対する応答を行う能力が増大する。
いくつかの実施形態では、個体に投与するための免疫刺激組成物は、アジュバントを含むが、追加の抗原、例えば、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリペプチドをコードするＤＮＡ、複合糖類、低分子、ｓｉＲＮＡなどを欠いている。いくつかの実施形態では、個体に投与するための免疫刺激組成物は、アジュバントと、非病原体抗原、例えば、非病原性源に由来するポリペプチド、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリペプチドをコードするＤＮＡ、複合体糖類などとを含む。いくつかの実施形態では、個体に投与するための免疫刺激組成物は、アジュバントと、インフルエンザの抗原物質、例えば、インフルエンザウイルスに由来するポリペプチド、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリペプチドをコードするＤＮＡなどとを含み、抗原の用量は、治療量又は治療量未満であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫刺激組成物中のアジュバントは、油中水型エマルションである。いくつかの実施形態では、エマルションは、スクワレンを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＡＳ０３及び／又はＭＦ５９、又はＴＬＲ７／８若しくはＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４リガンドを含むがこれらに限定されないＴＬＲリガンドである。いくつかの実施形態では、免疫刺激組成物は、ウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、投与は、感染の流行率及びパンデミック率を含むがこれらに限定されないウイルス感染に対して予防的である。投与は、免疫応答状態が弱まるにつれて、好適な間隔で繰り返され得る。
いくつかの実施形態では、免疫刺激組成物は、入院、収監、旅行、共同生活などを含むがこれらに限定されない、個体が病原体曝露の増加したリスクにある期間の前に予防的に投与される。病原体は、ウイルス、例えば、呼吸器ウイルスであり得る。本明細書では、アジュバントは、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間の期間にわたって、増強された免疫応答性の広範な状態を生じさせる広範な免疫増強剤として作用することができ、場合によっては、約２ヶ月以上後に検出され得ることが示されている。予防的投与は、病原体曝露の増加したリスクの期間中に、増加した免疫応答性のこれらの期間を提供するために行うことができる。
個体が病原体チャレンジに応答する能力は、骨髄系細胞、例えば、単球、マクロファージ及び樹状細胞のエピジェネティック状態と高い相関関係がある。この状態は、静的ではなく、むしろ、免疫刺激組成物の投与を含む以前の免疫応答によって大きく影響され得る。特に、古典的単球及び骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）は、免疫刺激組成物投与によって変化することが示される。
本開示の方法による治療のために選択される個体には、特に自然免疫の増強の恩恵を受ける、適応免疫応答が低下した個体が含まれ得る。かかる個体としては、新生児、高齢者、免疫抑制剤で治療を受けている個体、例えば、移植レシピエント、自己免疫患者など、がん患者、例えば、化学療法薬又は放射線療法で治療を受けているがん患者などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、ワクチン接種又は曝露に応答して抗体又は他の適応免疫応答を産生する能力の低下は、適応免疫応答の低下の指標となり得る。
自然免疫を増強するエピジェネティック変化は、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの増加、抗ウイルス遺伝子発現の増強、及びインターフェロン産生の上昇によって特徴付けられた、ウイルス感染に対する抵抗性の増強に現れ得る。加えて、単球及びｍＤＣは、免疫不応性の状態（炎症性サイトカインの産生低下によって判断される）を呈し、この免疫不応性の状態は、ＡＰ－１遺伝子座におけるヒストンアセチル化の減少及びクロマチンアクセシビリティの減少によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態では、免疫刺激組成物の投与の有効性は、個体由来の免疫細胞のエピジェネティック状態の解析によって評価される。かかる解析は、好適な細胞サンプル、例えば、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）に対して行われ得る。特に関心のある細胞、例えば、ＣＤ１４＋単球及びｍＤＣは、例えば、ＣＤ１４＋細胞を選択することによって、単一細胞として若しくはバルクで解析することで精製され得るか、又は精製せずに解析中に単一細胞レベルで表現型化され得る。この目的のために、例えば、ＥｐｉＴＯＦ（Ｔｉｍｅ－Ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔによるサイトメトリーを使用するエピジェネティックランドスケーププロファイリング）、単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、及び単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを含む単一細胞技術を含む様々な方法が当該技術分野で知られている。ヒストン修飾情報を決定するための任意の好適な方法、例えば、ＣＨＩＰ－Ｓｅｑ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑなどが使用され得る。マスサイトメトリーのためのＥｐｉＴＯＦパネルには、免疫細胞同一性を決定するためのマーカー、総ヒストンレベルを推定するためのマーカー、並びにアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、シトルリン化、及びクロトニル化を含む異なるヒストン修飾を評価するためのマーカーが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、自然免疫応答性の増強における候補アジュバント、免疫刺激組成物又は投与レジメンの有効性は、ＩＲＦ遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの増加、抗ウイルス遺伝子発現の増強、及びインターフェロン産生の上昇のうちの１つ以上の存在を、対象となる骨髄系細胞集団において検出することによって監視され、クロマチンアクセシビリティの増加は、継続的な免疫応答性を示す。
他の実施形態では、候補アジュバントを、個体又は動物モデルに投与し、骨髄系細胞のエピジェネティック状態への影響を決定することによって、免疫応答性を増強する際の有効性についてスクリーニングする。本明細書に記載される目的に好適なアジュバントは、関連する骨髄系細胞において応答性状態を誘発することができ、投与のために選択され得る。
本発明は、添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明から最もよく理解される。慣例に従って、図面の様々な特徴は、縮尺通りではないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大又は縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。
３価不活化季節性インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）は、免疫細胞のグローバルなヒストン修飾プロファイルを変化させる。研究の概要を示す。健常な対象（ｎ＝２１）を０日目にＴＩＶでワクチン接種した。１１人の対象のサブグループは、ネオマイシン、バンコマイシン、及びメトロニダゾールからなる経口抗生物質レジメンを－３日目～１日目に追加投与された。次いで、これらの対象におけるＰＢＭＣのグローバルなヒストン修飾プロファイルを、ＥｐｉＴＯＦを使用して決定した。 ＵＭＡＰを使用して、全ての免疫細胞サブセットのグローバルヒストンマークプロファイルの次元を削減した表現を作成した。 ＵＭＡＰを使用して、サンプルレベルでエピゲノム類似性を可視化した。 ワクチン接種前０日目と比較したワクチン接種後３０日目のグローバルなヒストン修飾プロファイルに対するワクチン誘発性変化の効果量を計算した。上位１０の最も有意に増加及び減少したヒストン修飾。 自然免疫細胞におけるヒストン修飾変化を示すヒートマップ。ＦＤＲ≦０．２の変化のみが示される。 Ｃ単球（ｍｏｎｏ）及びｍＤＣにおける一セットの高度に減少したヒストン修飾についてのワクチン接種前０日目に対するヒストン修飾レベルの変化。点と線は平均を示し、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。 Ｈ２ＢＫ５ａｃ、Ｈ３Ｋ３７ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ、及びＰＡＤＩ４のヒストン修飾レベルを使用して、全ての時点で単一単球及びｍＤＣのＵＭＡＰ表現を生成した。 左パネル：各時点での細胞密度、右パネル：各単一細胞におけるＨ３Ｋ２７ａｃレベル。 ＴＩＶ誘発性ヒストン修飾変化は、サイトカイン産生と相関関係がある。実験の概略図。ＥｐｉＴＯＦ実験の対象からのＰＢＭＣを、細菌（１０μｇ／ｍＬ Ｐａｍ３、２５ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ、３００ｎｇ／ｍＬフラジェリン）及びウイルス（２５μｇ／ｍＬ ｐＩ：Ｃ、４μｇ／ｍＬ Ｒ８４８）病原体関連分子パターンを模倣した合成ＴＬＲリガンドの３つのカクテルで刺激した。２４時間後、Ｌｕｍｉｎｅｘを使用して、上清中のサイトカイン濃度を測定した。 示した時点での０日目と比較したサイトカイン濃度の相対的変化を示すヒートマップ。 各調査対象のワクチン接種前０日目及びワクチン接種後３０日目のサイトカイン濃度。ウィルコクソンの符号付き順位検定を仮説検定に使用した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。 図２Ｃのサイトカインについての０日目と比較したサイトカイン濃度の変化。点と線は平均を示す。 ピアソン相関係数を使用して、図２Ｃにおける１０個のサイトカインのサイトカイン濃度を、Ｃ単球におけるヒストン修飾レベル並びにＥｐｉＴＯＦ及びサンプル生存率によって決定されるＰＢＭＣにおけるＣ単球頻度と相関させた。ボックスプロットは、ウイルス又は細菌カクテルのいずれかによる刺激後の各サイトカインの相関係数を示す。 示したヒストン修飾及びサイトカインの散布プロット。 健常なドナーからのＰＢＭＣを、薬理学的阻害剤Ａ－４８５（Ｐ３００／ＣＢＰ）及びＣｌ－アミジン（ＰＡＤＩ４）で２時間前処理し、その後ＬＰＳ（２５ｎｇ／ｍＬ）又はＲ８４８（４μｇ／ｍＬ）のいずれかで６時間刺激した。最後の４時間の刺激にはＢｒｅｆＡを添加した。Ｈ３Ｋ２７ａｃ、全Ｈ３、ＩＬ－１ｂ、及びＴＮＦαレベルを、細胞内フローサイトメトリーを使用して測定した。示した処理後のＣ単球におけるＩＬ－１ｂ及びＴＮＦａの産生を示すゲーティングスキーム。 ）複数のドナーにおけるＩＬ－１ｂ＋又はＴＮＦａ＋細胞分画のボックスプロットサマリー。ウィルコクソン順位和検定、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎ＝４～１１。 ＴＩＶは、免疫応答遺伝子及びＡＰ－１制御領域においてクロマチンアクセシビリティの低下を誘発する。実験の概略図。Ｃ単球、ｍＤＣ、及びｐＤＣを、ＦＡＣＳを使用して、ワクチン接種を受けた対象（ｎ＝８）のＰＢＭＣから－２１日目（ＢＬ）、０日目、及び３０日目に単離した。ＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑを使用して、これらの細胞におけるクロマチンアクセシビリティランドスケープ及び転写ランドスケープを解析した。 ＤＥＳｅｑ２を使用して、ワクチン接種前０日目と比較してワクチン接種後３０日目のアクセシビリティ変動クロマチン領域（ＤＡＲ）を同定した。Ｐｖａｌ≦０．０５。 （Ｃ）各解析サンプルのＣ単球における上位２００及びサイトカイン関連ＤＡＲにおける正規化されたアクセシビリティのヒートマップ表現。ｐ：プロモーター－２０００ｂｐ～＋５００ｂｐ；ｄ：遠位－１０ｋｂｐ～＋１０ｋｂｐ－プロモーター；ｔ：トランス＜１０ｋｂｐ又は＞＋１０ｋｂｐ。 Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用したＣ単球におけるＤＡＲの遺伝子セットエンリッチメント解析のネットワーク表現。ｐ≦０．０５で有意にエンリッチされたタームが示される。 色は、エンリッチ領域の大部分がアクセシビリティの向上（赤色）又は低下（青色）を示したかどうかを示す。ヒートマップは、強調表示されたクラスターで優位にエンリッチされたタームの符号付き－ｌｏｇ１０（ｐｖａｌ）を示す。 ０日目と比較した３０日目のＤＡＲにおける転写因子結合部位のモチーフベースの過剰発現解析。 Ｅｎｃｏｄｅデータベース内の選択した転写因子のＤＡＲにおけるエンリッチメントに対してプロットされたＴＦ遺伝子発現の変化（ｘ軸）を示す散布プロット。青色は、発現が有意に低下したＡＰ－１メンバーを示す。 ＡＰ－１ファミリーメンバーの遺伝子発現の変化は、以前に行われた３～９回の独立したインフルエンザワクチン試験からのバルクトランスクリプトミクスデータを使用して計算した。ヒートマップは、全試験にわたる遺伝子発現の平均ｌｏｇ２倍率変化を示す。Ｎは、各時点での対象数及び研究数を示す。ウィルコクソンの符号付き順位検定、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。 示した細胞型のＤＡＲを、ＥｐｉＴＯＦによって測定したＨ３Ｋ２７ａｃレベルと相関させ、相関係数＞５のＤＡＲは、Ｅｎｃｏｄｅデータベースを使用して転写因子標的遺伝子エンリッチメントについて解析した。青色は、ＡＰ－１メンバーが有意に変化したことを示す。 健常なドナー由来のＰＢＭＣを、薬理学的阻害剤Ａ－４８５（Ｐ３００／ＣＢＰ）、及びＣｌ－アミジン（ＰＡＤＩ４）で２時間前処理し、その後ＬＰＳ（２５ｎｇ／ｍＬ）又はＲ８４８（４μｇ／ｍＬ）のいずれかで６時間刺激した。最後の４時間の刺激にはＢｒｅｆＡを添加した。ホスホ－ｃ－Ｊｕｎレベルを、細胞内フローサイトメトリーを使用して測定した。示した条件でのＣ単球におけるホスホ－ｃ－Ｊｕｎのレベルを示すヒストグラム。 Ｃ単球におけるホスホ－ｃ－Ｊｕｎ陽性細胞分画のボックスプロットサマリー。ウィルコクソン順位和検定、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎ＝４～１１。 単球集団内の不均一性がＴＩＶ誘発エピゲノム変化を引き起こす。実験の概略図。自然免疫細胞を、３人のワクチン接種を受けた対象のＰＢＭＣから０日目、１日目、及び３０日目に単離し、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用して解析した。 前処理及びＱＣフィルタリング後のｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑランドスケープのＵＭＡＰ表現。 サブセットごとの上位５の転写因子について、示した時点でのクロマチンアクセシビリティの差を示すヒートマップ。 古典的単球集団内のエピゲノムサブクラスターのＵＭＡＰ表現。 所与のワクチン時点での全単球集団に対する異なるエピゲノムサブクラスターの相対的寄与を示す密度プロット。 単球集団内のＴＦアクセシビリティの変動。値は、全ての単一単球におけるアクセシビリティ値の範囲を示す。 単球サブクラスターサブセット間のクロマチンアクセシビリティの差を示すヒートマップ。 ＡＰ－１のアクセシビリティの差を示す単球サブクラスターのＵＭＡＰ表現。 ホットスポットモジュール２，３遺伝子座におけるアクセシビリティの差を示す単球サブクラスターのＵＭＡＰ表現。 ホットスポットモジュール２，３の遺伝子座と関連する遺伝子のエンリッチメント解析。 単一単球の転写ランドスケープのＵＭＡＰ表現。色は、ホットスポットモジュール２，３と関連する遺伝子の発現を示す。 Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３は、ＴＩＶに類似する抑制エピゲノム状態を誘発する。実験の概略図。健常な対象を、０日目及び２１日目にＨ５Ｎ１又はアジュバントシステム０３（Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３）を加えたＨ５Ｎ１でワクチン接種した。自然免疫細胞を、０日目、２１日目、及び４２日目にＰＢＭＣから単離し、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２／２）を使用して解析した。エクスビボＴＬＲ刺激及びＥｐｉＴＯＦ解析を、０、７、２１、２８、４２日目にＰＢＭＣに対して行った。（ｎ＝９～１３／９～１３） ＥｐｉＴＯＦランドスケープのＵＭＡＰ表現。 ＥｐｉＴＯＦによって測定した、０日目及び４２日目の古典的単球におけるヒストン修飾レベル。ウィルコクソン符号付き順位検定、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、ＥｐｉＴＯＦ：ｎ＝９／９、Ｌｕｍｉｎｅｘ：ｎ＝１３／１３。 Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３でのワクチン接種後０日目及び４２日目のＴＬＲ刺激ＰＢＭＣの上清中のサイトカイン濃度。ウィルコクソン符号付き順位検定、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、ＥｐｉＴＯＦ：ｎ＝９／９、Ｌｕｍｉｎｅｘ：ｎ＝１３／１３。 前処理及びＱＣフィルタリング後のｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ（左）及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（右）ランドスケープのＵＭＡＰ表現。 古典的単球における検出されたＡＰ－１ファミリーＴＦのアクセシビリティの変化。色は、細胞が、Ｈ５Ｎ１（緑）又はＨ５Ｎ１＋ＡＳ０３（オレンジ）でワクチン接種を受けた対象に由来するかどうかを示す。 Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用した、古典的単球における有意に異なるＤＡＲの過剰表現解析。色は、エンリッチされた遺伝子が主に上方制御又は下方制御されたかどうかを示す。 Ｄ０と比較した、Ｄ４２での古典的単球におけるＡＰ－１ＴＦ遺伝子の発現の変化を示すＶｏｌｃａｎｏプロット。 Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３は、増強された抗ウイルス免疫のエピゲノム状態を誘発する。サブセットごとの上位５の転写因子について、４２日目のクロマチンアクセシビリティ対０日目のクロマチンアクセシビリティの変化を示すヒートマップ。色は、アクセシビリティの差を示し、灰色のフィールドは、有意でない変化を示す（ｆｄｒ＞０．０５）。 ワクチン投与期間中の転写因子（ＴＦ）アクセシビリティの差を示す折れ線グラフ。 ＩＲＦ／ＳＴＡＴＴＦ遺伝子の遺伝子発現の変化を示すＶｏｌｃａｎｏプロット。 ＩＲＦ／ＳＴＡＴＴＦ遺伝子の遺伝子発現の変化を示すＶｏｌｃａｎｏプロット。 ＩＲＦ１結合モチーフを含有するゲノム領域の平均アクセシビリティ及びｌｏｇ２（ＦＣ）アクセシビリティを示すＭＡプロット。赤色は、アクセシビリティが有意に変化した領域を示す（Ｐ≦０．０５）。 Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用した、Ｃ単球の少なくとも５％で発生するＥ）における有意に変化した領域の遺伝子セットエンリッチメント解析。 インターフェロンα、ガンマ及びＩＰ１０レベルを、示した時点でワクチン接種を受けた対象の血漿中で測定した。点と線は平均を示し、リボンは平均値の標準誤差を示す。（Ｈ５Ｎ１／Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３：ＩＦＮＡ、ｎ＝５／１１；ＩＦＮＧ、ｎ＝７／１４；ＩＰ１０、ｎ＝１６／３４） （Ｈ）Ｃ単球について、２１日目のクロマチンアクセシビリティの変化（ｘ軸）及び遺伝子発現の変化（ｙ軸）を示す散布プロット（ｓｃＡＴＡＣ Ｐ≦０．０５かつ細胞の少なくとも５％で発生する）。示した統計は、ピアソン相関解析及びカイ二乗検定に基づいている。 示した時点でＨ１Ｎ１（緑色）及びＨ１Ｎ１＋ＡＳ０３（オレンジ色）でワクチン接種を受けた対象のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ解析における、選択した抗ウイルス及びインターフェロン関連ＢＴＭの遺伝子発現の変化。（Ｈ１Ｎ１：ｎ＝１６、Ｈ１Ｎ１＋ＡＳ０３：ｎ＝３４。 Ｃ単球における２１日目のクロマチンアクセシビリティ対０日目のクロマチンアクセシビリティの変化（ｘ軸）、及びプライムワクチン接種と比較したブースターワクチン接種におけるワクチン誘発性遺伝子発現の有意な変化（ｐ≦０．０５、ｌｏｇ２（ＦＣ）＞＋／－０．０３）（ｙ軸、２２日目２１日目対１日目０日目）を示す散布プロット。カイ二乗検定を使用して、両変数が関連しているかどうかを決定した。 エンコードＴＦ標的遺伝子データベースを使用したエンリッチメント結果を示すバブルプロット。色は、図６Ｊ）における解析された遺伝子のオリジナルを示す。 Ｈ１Ｎ１＋ＡＳ０３は、異種ウイルスによるインビトロ感染に対する増強された耐性を誘発する。実験の概略図。Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３によるワクチン接種後の０日目、２１日目、及び４２日目の１０人の健常な対象からのＰＢＭＣを、１のＭＯＩでデングウイルス又はジカウイルスに感染させ、０時間、２４時間及び４８時間培養した。培養後、細胞ペレット中のウイルスコピー数をｑＰＣＲを介して決定した。 デングウイルス、ジカウイルス、及びモック感染サンプルにおけるウイルス力価を示すボックスプロット。ウィルコクソン順位和検定を使用して群を比較した。 デングウイルス（赤色）及びジカウイルス（青色）のウイルス増殖曲線を示す折れ線グラフ。点及び線は平均を示し、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。 ｎ＞２１個のサンプルでワクチン接種前０日目と比較したウイルス力価のＬｏｇ２倍率変化。ウィルコクソン符号付き順位検定を使用して、群内変化を比較した。＊＊ｐ≦０．０１、＊ｐ≦０．０５、ｎ＝８～９。 インキュベーション後２４時間でのデングウイルス、ジカウイルス、及びモック感染培養物におけるＩＦＮａ、ＩＦＮｇ、及びＩＰ１０の濃度を示すボックスプロット。ウィルコクソン順位和検定を使用して群を比較した。ウィルコクソン順位和検定を使用して群を比較した。 ウイルス力価の変化（ｄ０対ｄ２１）と、プライム時（ｄ０対ｄ１）及びブースト時（ｄ２１対ｄ２２）の増強されたワクチン誘発性抗ウイルス遺伝子のインビボ発現の変化とのピアソン相関解析（赤色遺伝子図６ｇ）。ウイルス条件ごとの相関係数を示すボックスプロット。 ＩＲＦ１（ｘ軸）及びウイルス力価（ｙ軸）のワクチン誘発性発現の変化を示す散布プロット。 図１に関連する、ＥｐｉＴＯＦによる細胞型存在量及びワクチン誘発性エピゲノム変化。ワクチン接種時点別の解凍後のＰＢＭＣ生存率。 対象１人当たりの細胞型存在量の変化。ウィルコクソン符号付き順位検定を使用して、ワクチン接種後の時点での変化をｄ０と比較し、ＦＤＲアプローチを使用してｐ値を補正した。ｆｄｒ≦０．０５の閾値を満たす比較はなかった。 検出された全ての免疫細胞サブセットにおける、０日目と比較した３０日目のヒストン修飾変化を示すヒートマップ。効果量アプローチを使用して変化を計算した。ＦＤＲ≦０．２の変化のみが示される。 対照（ｘ軸）及び抗生物質群（ｙ軸）で対象について個別に計算された０日目と比較した３０日目のヒストン修飾変化の相関。単球及びｍＤＣについては、有意に変化したヒストン修飾のみが示される（ＦＤＲ≦０．２）。 古典的単球における全てのヒストン修飾間のペアワイズ相関係数を示す相関行列。 古典的単球における全てのヒストン修飾間のペアワイズ相関係数を示す相関行列。 古典的単球における全てのヒストン修飾間のペアワイズ相関係数を示す相関行列。 古典的単球における全てのヒストン修飾間のペアワイズ相関係数を示す相関行列。 古典的単球における全てのヒストン修飾間のペアワイズ相関係数を示す相関行列。 図１に関連する、バルクトランスクリプトミクスによるヒストン修飾酵素の遺伝子発現のワクチン誘発性変化の解析。ワクチン接種前０日目と比較した遺伝子発現のｌｏｇ２倍率変化を示すヒートマップ。Ｔ検定を統計的検定用に使用した。＊ｐ≦０．０５。 図１に関連する、ＥｐｉＴＯＦによるＣＤ３４＋前駆細胞のヒストン修飾プロファイル距離。解析アプローチの略画。各単一のＣＤ３４＋前駆細胞のヒストン修飾プロファイルと平均リンパ球系又は骨髄系プロファイルとの間のユークリッド距離を計算した。 ＥｐｉＴＯＦパネル２を使用して、示した時点での共通のリンパ球系（紫色）又は骨髄系（ターコイズ色）プロファイルに対する単一のＣＤ３４＋前駆細胞のヒストン修飾プロファイル距離を示すバイオリンプロット。 経時的なヒストン修飾プロファイル距離の中央値変化。 ０日目と比較したワクチン接種後３０日目における、ＣＤ３４＋前駆細胞の示された細胞型に対するヒストン修飾プロファイル距離の変化。 図２に関連する、ＴＬＲ刺激時のサイトカイン産生。刺激条件による、各ＴＬＲ刺激ＰＢＭＣ培養物中のｌｏｇ２サイトカイン濃度を示すドットプロット。 抗生物質対象及び対照対象の０日目に対するサイトカイン濃度の変化を別々に示すヒートマップ。 抗生物質対象及び対照対象の０日目に対するサイトカイン濃度の変化を別々に示すヒートマップ。 図３に関連する、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑによるワクチン誘発性エピゲノム変化。抗生物質処理前のベースラインに対する０日目（左）及び０日目と比較した３０日目のＤＡＲ（右、抗生物質対象のみ）。 ０日目と比較した３０日目のＤＡＲを、対照対象及び抗生物質対象について別々に計算した。併用解析で有意に変化したピークからのＬｏｇ２ＦＣ値（図３ｂ）を、ピアソンを使用して各々と相関させた。 図５に関連する、ＴＬＲ刺激時の細胞存在量及びサイトカイン産生の変化。ワクチン接種時点による解凍後のＥｐｉＴＯＦ／Ｌｕｍｉｎｅｘ ＰＢＭＣ生存率。 ＥＰＩＴＯＦによって測定される、対象１人当たりの細胞型存在量の変化。ウィルコクソン符号付き順位検定を使用して、ワクチン接種後の時点での変化をｄ０と比較し、ｐ値をＦＤＲアプローチを使用して修正した。ｆｄｒ≦０．０５の閾値を満たす比較はなかった。 刺激条件による、各ＴＬＲ刺激ＰＢＭＣ培養物中のｌｏｇ２サイトカイン濃度を示すドットプロット。 双方向エピゲノムリプログラミングのモデル。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－ＮＰ免疫は、堅牢な抗体応答を誘発する。研究デザインの概略図。 ＥＬＩＳＡによって測定された２１日目及び４２日目に採取された血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ特異的ＩｇＧ力価（ＥＣ５０の逆数としてプロットされる）。ボックスは、中央値並びに２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、エラーバーは範囲を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ偽ウイルス侵入アッセイを使用して－７日目、２１日目及び４２日目に決定された血清ｎＡｂ力価（ＩＣ５０の逆数としてプロットされる）。黒い線は全てのデータポイントの幾何平均を表す。数字は、４２日目の幾何平均力価を表す。アスタリスクは、両側マン・ホイットニー順位和検定（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）によって解析された２つの群間の統計的に有意な差を表す。ｅ、Ｘ軸に示される時点で測定された真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＮＡｂ力価。数字はＧＭＴを表す。時点間の統計的な差は、両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定によって解析した。 真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｄ）侵入アッセイを使用して－７日目、２１日目及び４２日目に決定された血清ｎＡｂ力価（ＩＣ５０の逆数としてプロットされる）。黒い線は全てのデータポイントの幾何平均を表す。数字は、４２日目の幾何平均力価を表す。アスタリスクは、両側マン・ホイットニー順位和検定（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）によって解析された２つの群間の統計的に有意な差を表す。 Ｘ軸に示される時点で測定された真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＮＡｂ力価。数字はＧＭＴを表す。時点間の統計的な差は、両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定によって解析した。 アジュバント化ＲＢＤ－ＮＰ免疫は、新興ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対するｎＡｂ応答を惹起する。二次免疫の３週間後の４２日目に採取された血清中で測定された野生型（丸印）又はＢ．１．１．７若しくはＢ．１．３５１（正方形）バリアント生ウイルスに対する血清ｎＡｂ力価。プロット内の括弧内の矢印及び数字は、それぞれ、バリアントに対するｎＡｂ力価の大きさの変化の方向及び倍率の変化を示す。 Ｘ軸に示される群からの動物におけるＷＴ（武漢）及びＳＡ（Ｂ．１．３５１）株に対して測定されたｎＡｂ力価の倍率の変化。２つの群間の統計的な差は、両側マン・ホイットニー順位和検定によって決定した。 ４２日目又は１５４日目に測定された野生型（丸印）又はＢ．１．３５１（正方形）バリアント生ウイルスに対する血清ｎＡｂ力価。時点間の統計的な差は、両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定によって決定した。プロット内の数字はＧＭＴを示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－ＮＰ免疫に対する細胞媒介性免疫応答。ｘ軸に示される時点で血液中で測定されたＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、又はＴＮＦ－αを分泌するＣＤ４ Ｔ細胞を、Ｔｈ１型応答（ａ）としてプロットした。各ボックス内の数は、各群における動物の総数当たりの感染動物の数を示す。ＰＥＴ信号は、０～１５ ＳＵＶにスケーリングされている。両側マン・ホイットニー順位和検定を使用して、群間の統計的な差を測定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－ＮＰ免疫に対する細胞媒介性免疫応答。ｘ軸に示される時点で血液中で測定されたＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。Ｔｈ２型応答は、ＩＬ－４産生ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を示す。各ボックス内の数は、各群における動物の総数当たりの感染動物の数を示す。ＰＥＴ信号は、０～１５ ＳＵＶにスケーリングされている。両側マン・ホイットニー順位和検定を使用して、群間の統計的な差を測定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 凡例に示されるように、１つ、２つ、又は３つのサイトカインを発現するＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を表す円グラフ。 ＤＭＳＯ（ペプチドなし、上）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤにまたがるオーバーラップしたペプチドプール（下）によるＩＬ－２１及びＣＤ１５４の発現を示すフローサイトメトリープロット。 ２８日目の血液中で測定されたＲＢＤ特異的ＣＤ１５４＋±ＩＬ－２１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞応答。アスタリスクは、統計的に有意な差を表す。群間の差を、両側マン・ホイットニー順位和検定によって解析し、群内の時点間の差を、両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）によって解析した。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する防御。サブゲノムＥ遺伝子ＰＣＲ法を使用して測定されたワクチン接種マカク及び対照マカクの咽頭におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量。 サブゲノムＥ遺伝子ＰＣＲ法を使用して測定されたワクチン接種マカク及び対照マカクの鼻腔におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量。 各群の咽頭及び鼻腔区画におけるピーク（２日目）ウイルス量。 サブゲノムＮ遺伝子ＰＣＲを使用して測定されたＢＡＬ流体中のウイルス量。各ボックス内の数は、各群における動物の総数当たりの感染動物の数を示す。ＰＥＴ信号は、０～１５ ＳＵＶにスケーリングされている。両側マン・ホイットニー順位和検定を使用して、群間の統計的な差を測定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 ＰＥＴ－ＣＴスキャンを使用して測定した、プレチャレンジ（０日目）及びチャレンジ後（感染後４日目又は５日目）の、凡例に示された各群の２匹の動物の肺の炎症。 各群の１匹の動物からの肺の代表的なＰＥＴ－ＣＴ画像。 防御の免疫相関因子。鼻腔のピークウイルス量（２日目）と様々な免疫解析の読み出しとの間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。全ての測定は、ピーク時点からのものであった（抗体については４２日目、形質芽細胞については２５日目、及びＴ細胞応答については２８日目）。ｐ値は、スピアマンの相関について計算し、多重試験のために補正した。アスタリスクは統計的有意性を表す。 鼻腔のピークウイルス量とａに示される上位３の免疫パラメータとの間のスピアマンの相関プロット。 システム血清学による機能的抗体プロファイリング。２１日目及び４２日目に採取された血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的結合ＩｇＭ応答。ボックスは、中央値並びに２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、エラーバーは範囲を示す。２つの群間の統計的に有意な差は、両側マン・ホイットニー順位和検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 システム血清学による機能的抗体プロファイリング。２１日目及び４２日目に採取された血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的結合、ＩｇＧ１応答。ボックスは、中央値並びに２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、エラーバーは範囲を示す。２つの群間の統計的に有意な差は、両側マン・ホイットニー順位和検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 システム血清学による機能的抗体プロファイリング。２１日目及び４２日目に採取された血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的結合ＩｇＡ応答。ボックスは、中央値並びに２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、エラーバーは範囲を示す。２つの群間の統計的に有意な差は、両側マン・ホイットニー順位和検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ＦｃＲ結合抗体応答、２１日目及び４２日目に採取された血清中で測定されたＦｃＲ２Ａ－２。２つの群間の統計的に有意な差は、両側マン・ホイットニー順位和検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ＦｃＲ結合抗体応答、２１日目及び４２日目に採取された血清中で測定されたＦｃＲ３Ａ。２つの群間の統計的に有意な差は、両側マン・ホイットニー順位和検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 システム血清学を使用して測定された全ての抗体特徴のＰＬＳＤＡ解析。 上位３の抗体は、ＰＬＳＤＡ解析で４２日目に防御された動物と感染された動物とを区別することを特徴とする。 Ｙ軸に示されている、鼻腔のピークウイルス量（左）又は咽頭のピークバイアル量（右）と抗体応答（４２日目）との間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。ｐ値は、スピアマンの相関について計算し、多重試験のために補正した。 ＡＳ０３によるＲＢＤ－ＮＰ又はＨｅｘａＰｒｏの免疫は、同等のｎＡｂ応答を惹起する。研究デザインの概略図。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ偽ウイルス（ｂ）アッセイを使用して、２１日目及び４２日目に決定された血清ｎＡｂ力価（ＩＣ５０の逆数としてプロットされる）。ボックスは、中央値並びに２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、エラーバーは範囲を示す。アスタリスクは、両側マン・ホイットニー順位和検定（＊ｐ＜０．０５）によって解析された２つの群間の統計的に有意な差を表す。白丸は、図１に示される以前の研究からの動物を示す。 真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｃ）アッセイを使用して、２１日目及び４２日目に決定された血清ｎＡｂ力価（ＩＣ５０の逆数としてプロットされる）。ボックスは、中央値並びに２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、エラーバーは範囲を示す。アスタリスクは、両側マン・ホイットニー順位和検定（＊ｐ＜０．０５）によって解析された２つの群間の統計的に有意な差を表す。白丸は、図１に示される以前の研究からの動物を示す。 ｄ、可溶性ＨｅｘａＰｒｏを投与した動物から４２日目に採取した血清中で、生きたＷＴ（丸印）又はＢ．１．１．７．若しくはＢ．１．３５１バリアント（四角）に対して測定された中和抗体価。 ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０（ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０（ＲＢＤ－ＮＰ）免疫原の構造モデル。ＲＢＤ抗原をＩ５３－５０Ａ三量体に接続する遺伝子リンカーは、可撓性であることが予想され、したがって、ＲＢＤは、示したものと交互の配向を採り得る。 ＲＢＤ－ＮＰの陰性染色電子顕微鏡法。スケールバー、１００ｎｍ。サンプルを、単一の凍結／解凍サイクルに続いて解析した。 ＲＢＤ－ＮＰの動的光散乱（ＤＬＳ）及び表示された抗原を欠く未修飾Ｉ５３－５０。データは、ＲＢＤ－ＮＰについては約３６ｎｍ、Ｉ５３－５０については３０ｎｍを中心とするサイズ分布を有する単分散ナノ粒子の存在を示す。サンプルを、単一の凍結／解凍サイクルに続いて解析した。 バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による抗原特性決定。ＲＢＤ－ＮＰを、１回の凍結／解凍サイクルの前及び後の両方で、固定化されたＣＲ３０２２ｍＡｂ及びｍａＡＣＥ２－Ｆｃ受容体に結合させた。単量体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤを参照抗原として使用した。 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク対抗Ｉ５３－５０ナノ粒子足場抗体応答の比較。４２日目にＥＬＩＳＡによって検出された個々のＮＨＰにおける抗スパイクＩｇＧ及び抗Ｉ５３－５０ナノ粒子ＩｇＧ（抗Ｉ５３－５０）の血清濃度。ボックスは、中央値並びに２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、エラーバーは範囲を示す。抗スパイクＩｇＧ応答と抗Ｉ５３－５０ＩｇＧ応答との間の統計的な差は、両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定（＊Ｐ＜０．０５）を使用して決定した。 ｄ－ｙ４２における抗スパイクＩｇＧ応答（図１に記載）と抗Ｉ５３－５０ＩｇＧ応答との間のスピアマンの相関。 ７日目、２１日目及び４２日目のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ偽ウイルス（侵入アッセイを使用して決定された血清ｎＡｂ力価（ＩＣ５０の逆数としてプロットされる）。Ｒの「サンプル」関数を使用して、ＡＳ０３群から５匹の動物をランダムに選択した。黒い線は、全てのデータ点の幾何平均を表す。数値は、幾何平均力価を表す。アスタリスクは、両側マン・ホイットニー順位和検定によって解析された２つの群間の統計的に有意な差を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 ７日目、２１日目及び４２日目の真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｄ）侵入アッセイを使用して決定された血清ｎＡｂ力価（ＩＣ５０の逆数としてプロットされる）。Ｒの「サンプル」関数を使用して、ＡＳ０３群から５匹の動物をランダムに選択した。黒い線は、全てのデータ点の幾何平均を表す。数値は、幾何平均力価を表す。アスタリスクは、両側マン・ホイットニー順位和検定によって解析された２つの群間の統計的に有意な差を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 体液性免疫応答。ａ、４人のＣＯＶＩＤ－１９患者からのヒト回復期血清に対するシュードウイルスｎＡｂ応答。 ４２日目に測定されたシュードウイルスと真正ウイルスｎＡｂ力価との間のスピアマンの相関。 ＥＬＩＳＰＯＴを使用して４日目に測定されたＲＢＤ－ＮＰ特異的ＩｇＧ分泌形質芽細胞応答。群間の差を、両側マン・ホイットニー順位和検定（＊＊ｐ＜０．０１）を使用して解析した。 ２５日目の形質芽細胞応答と４２日目で測定した偽ウイルスｎＡｂ力価との間のスピアマンの相関。 耐久性及び交差中和。Ｘ軸に示される時点でＡＳ０３耐久性群において測定された偽ウイルスｎＡｂ応答。 Ｘ軸に示される時点で採取された血清中で測定されたＡＣＥ－２ブロッキング。 ４２日目の血清中で測定された武漢－１スパイクのＤ６４１Ｇ突然変異を含む偽ウイルス野生型（丸印）又はＢ．１．１．７バリアント（正方形）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｎＡｂ力価。 ＲＢＤ－ＮＰ免疫に対する細胞媒介性免疫応答。ｘ軸に示される時点で血液中で測定されたＲＢＤ－及びＮＰ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。 ｘ軸に示される時点で血液中で測定されたＲＢＤ－及びＮＰ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。 、凡例に示されるように、１つ、２つ、又は３つのサイトカインを発現するＮＰ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を表す円グラフ。 各ボックス内に示されるサイトカインを発現するＮＰ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞に対するＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度の比率。アスタリスクは、統計的に有意な差を表す。群内の時点間の差を、両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定によって解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの前後の臨床パラメータ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ当日、チャレンジの２日後、１、２及び３週間後に測定された臨床パラメータ。体重（ｋｇ）、体温（°Ｆ）、酸素飽和度（ＳｐＯ２）及び呼吸数（ＢＰＭ）を、それぞれ第１、第２、第３、及び第４の列に示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの前後の臨床パラメータ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ当日、チャレンジの２日後、１、２及び３週間後に測定された臨床パラメータ。体重（ｋｇ）、体温（°Ｆ）、酸素飽和度（ＳｐＯ２）及び呼吸数（ＢＰＭ）を、それぞれ第１、第２、第３、及び第４の列に示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後の中和抗体応答。チャレンジ当日、チャレンジの１、２及び３週間後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ偽ウイルス侵入アッセイを使用して決定された血清ｎＡｂ力価（ＩＣ５０の逆数としてプロットされる）。黒い線は、全てのデータポイントの幾何平均を表す。点の丸印及び三角形は、それぞれ、防御された動物又は感染した動物（任意の区画、すなわち、鼻腔、咽頭又はＢＡＬ）を表す。 肺内の炎症。チャレンジ前（０日目）及びチャレンジ後（４日目又は５日目）の、ワクチンなし、ＡＳ０３、又はＣｐＧ－ミョウバンの群からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染動物の肺から得られたＰＥＴ－ＣＴ画像。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後のＢＡＬ流体中のサイトカイン解析。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの１週間後に採取されたＢＡＬ流体中で測定された２４のサイトカインの発現を示すヒートマップ。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの１週間後に採取されたＢＡＬ流体中での、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ－１３、及びＴｈ２サイトカインであるＩＬ－５によって誘発されることが知られている好酸球リクルートケモカインであるＥｏｔｘｉｎ－３（ＣＣＬ２６）の発現は、ワクチンなし対照と比較して、ワクチン接種動物では有意な増加を示さない。 チャレンジの１週間後に採取されたＢＡＬ中でのＩＬ－８、ＭＣＰ－４、ＩＬ－６及びＩＦＮ－γなどのヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって誘発されることが知られているサイトカインの存在量。 防御の免疫相関因子。ピーク咽頭ウイルス量（２日目）と様々な免疫パラメータとの間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。全ての測定は、ピーク時点からのものであった（抗体については４２日目、形質芽細胞については２５日目、及びＴ細胞応答については２８日目）。ｐ値を、スピアマンの相関について計算し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して多重試験のために補正した。 二次免疫の１週間後の２８日目に測定されたＮＰ特異的ＩＬ－２＋ＴＮＦ－α＋ＣＤ４ Ｔ細胞の鼻腔（左）又は咽頭（右）のピークウイルス量と頻度との間のスピアマンの相関プロット。 ２８日目に測定されたＮＰ特異的ＩＬ－２＋ＴＮＦ－α＋ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度と４２日目に測定されたｎＡｂ応答との間のスピアマンの相関。 抗体と防御の相関因子。ＲＢＤ－ＮＰ＋Ｏ／Ｗで免疫した動物群において、Ｙ軸に示される、鼻腔のピークウイルス量（２日目）と抗体応答との間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。ｐ値は、スピアマンの相関について計算し、多重試験のために補正した。 抗体と防御の相関因子。ＡＳ０３で免疫した動物群において、Ｙ軸に示される、鼻腔のピークウイルス量（２日目）と抗体応答との間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。ｐ値は、スピアマンの相関について計算し、多重試験のために補正した。 抗体と防御の相関因子。ＡＳ３７で免疫した動物群において、Ｙ軸に示される、鼻腔のピークウイルス量（２日目）と抗体応答との間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。ｐ値は、スピアマンの相関について計算し、多重試験のために補正した。 抗体と防御の相関因子。ＣｐＧ－ミョウバンで免疫した動物群において、Ｙ軸に示される、鼻腔のピークウイルス量（２日目）と抗体応答との間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。ｐ値は、スピアマンの相関について計算し、多重試験のために補正した。 抗体と防御の相関因子。Ｉ ミョウバンで免疫した動物群において、Ｙ軸に示される、鼻腔のピークウイルス量（２日目）と抗体応答との間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。ｐ値は、スピアマンの相関について計算し、多重試験のために補正した。
本発明の方法及び組成物を説明する前に、本発明は記載された特定の方法又は組成物に限定されるものではなく、それ自体がもちろん変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することが意図されるものではないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈上別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在値も、下限の単位の１０分の１まで具体的に開示されていることを理解されたい。規定範囲における任意の規定値又は介在値と、その規定範囲における任意の他の規定値又は介在値との間のより小さい各範囲が、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してその範囲に含まれても又は除外されてもよく、より小さい範囲に限度のいずれかが含まれる範囲、どちらも含まれない範囲、又は両方の限度が含まれる各範囲も、規定範囲内の任意の具体的に除外されている限度に従って本発明に包含される。規定範囲が限度の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、いくつかの可能性のある好ましい方法及び材料を次に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連する方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある場合、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先することが理解される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、複数のかかる細胞を含み、「ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ペプチド）」への言及は、当業者に既知の１つ以上のペプチド及びその均等物、例えば、ポリペプチドなどへの言及を含む。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のために、かかる刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。更に、提供された公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認される必要がある場合がある。
「アジュバント」という用語は、個体の体液性又は細胞性免疫応答を増加させる組成物を指す。対象となるアジュバントは、免疫系を刺激し、本明細書に示されるように、自然免疫細胞のエピゲノミクスを変化させて応答性を高める。
「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、治療のために評価される及び／又は治療される哺乳動物を指すために本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、限定されないが、疾患を有する個体を包含する。対象はヒトであってもよいが、他の哺乳動物、特にヒト疾患の実験室モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラットなども含む。
患者に関する「サンプル」という用語は、生体起源の血液及び他の液体、固体組織サンプル、例えば生検標本若しくは組織培養物又はそれに由来する細胞及びその子孫を包含する。この用語はまた、試薬での処理、洗浄、又は特定の疾患細胞などの特定の細胞集団の濃縮など、それらの調達後に任意の方式で操作されているサンプルも包含する。この定義はまた、特定のタイプの分子、例えば、核酸、ポリペプチドなどについてエンリッチされているサンプルも含む。「生体サンプル」という用語は、臨床サンプルを包含し、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織サンプル、臓器、骨髄、血液、血漿、血清なども含む。
「診断」という用語は、本明細書では、対象、個体、若しくは患者における分子又は病理学的状態、疾患又は症状を同定することを指すために使用される。
「予後」という用語は、本明細書では、対象、個体、若しくは患者における、再発、転移、及び薬物耐性を含む、死亡又は疾患進行の可能性の予測を指すために使用される。「予測」という用語は、本明細書では、観察、経験、又は科学的推論に基づいて、対象、個体、若しくは患者が特定の事象又は臨床転帰を経験する可能性を予告又は推定する行為を指すために使用される。一例では、医師は、患者が生存する可能性、又は感染の重症度を予測しようと試みることがある。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、対象、個体、若しくは患者に対する、又は対象、個体、若しくは患者における効果を得る目的で、薬剤を投与すること、又は処理を実施することを指す。この効果は、疾患、例えば病原体による感染若しくはその症候を完全に若しくは部分的に防止するという点で予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患の症候に対する部分的若しくは完全な治癒をもたらすという点で治療的であり得る。
治療するとは、疾患の治療若しくは改善若しくは予防の成功のあらゆる兆候を指し得、これには、症候の軽減、寛解、縮小、あるいは患者に対して疾患状態をより許容可能にすること、変性若しくは減少の速度の遅延、又は変性の最終点を衰弱しにくくすることなどの任意の客観的若しくは主観的パラメータが含まれる。症候の治療又は改善は、医師による検査の結果を含む、客観的又は主観的なパラメータに基づき得る。したがって、「治療する」という用語は、疾患又は他の疾患と関連する症候又は症状の発症を予防若しくは遅延させるか、緩和するか、又は阻止若しくは阻害するために、薬剤を投与することを含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、又は疾患の副作用の低減、排除、又は予防を指す。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、増強された免疫応答を誘発するのに十分な免疫刺激組成物のその量を指す。治療有効量とは、病原体曝露時の感染を低減するのに十分な免疫刺激組成物の量、例えば、感染を遅延又は最小限に抑えるのに十分な免疫刺激組成物の量を指す場合がある。治療有効量はまた、疾患の治療又は管理において治療的利益を提供する治療剤の量を指す場合がある。更に、治療有効量は、疾患の治療若しくは管理において治療的利益を提供する治療剤単独の、又は他の療法と組み合わせた量を意味する。
本明細書で使用される場合、「投与レジメン」という用語は、対象に個別に、典型的には、期間で区切られて投与される一セットの単位用量（典型的には、２つ以上）を指す。いくつかの実施形態では、所与の治療剤は、１回以上の用量を含み得る、推奨される投与レジメンを有する。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数回の用量を含み、各用量は、同じ長さの期間によって互いに分離され、いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数回の用量を含み、少なくとも２つの異なる期間が個々の用量を分離する。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の全ての用量は、同じ単位用量の量である。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の異なる用量は、異なる量である。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第１の投薬量の第１の用量、続いて、第１の投薬量とは異なる第２の投薬量の１回以上の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第１の投薬量の第１の用量、続いて、第１の投薬量と同じ第２の投薬量の１回以上の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、関連集団にわたって投与されるときに、所望の又は有益な転帰と相関する（すなわち、治療的投与レジメンである）。
いくつかの実施形態では、例えば、臨床的に承認されたアジュバントでは、単位用量は、臨床的に承認された用量と同じ又は同等である。例えば、本明細書に開示される予防目的のための用量は、ワクチン投与のためのアジュバントの臨床的に承認された用量の約１０％～約５００％であり得、約２５％～約２５０％、約５０％～約１５０％であり得、用量は実質的に同様であり得る。
「との組み合わせ」、「併用療法」、及び「併用産物」は、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫刺激組成物を、追加の療法、例えば、抗原物質の包含などと組み合わせて患者に同時投与することを指す。組み合わせて投与する場合、各成分は、同時に、又は異なる時点で任意の順序で順次投与することができる。したがって、各成分は、所望の治療効果を提供するために、別々に、しかし時間内に十分に近い間隔で投与することができる。
「併用投与」とは、組み合わせが治療効果を有するような時間で、免疫刺激組成物、既知の治療剤などの１つ以上の成分の投与を意味する。かかる併用投与は、成分の同時投与（すなわち、同時に）、事前投与、又は後続投与を伴い得る。当業者であれば、投与の適切なタイミング、順番、及び投与量を決定することに困難はないであろう。
「組み合わせて」という用語の使用は、対象に予防剤及び／又は治療剤を投与する順序を限定するものではない。第１の予防剤又は治療剤は、障害を有する対象への第２の予防剤又は治療剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）に、それと同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与され得る。
「単離された」という用語は、その自然環境から実質的に遊離した分子を指す。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞又は組織源からの細胞物質又は他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離されたタンパク質が、治療用組成物として投与されるのに十分な純度、又は少なくとも７０％～８０％（ｗ／ｗ）の純度、より好ましくは、少なくとも８０％～９０％（ｗ／ｗ）の純度、更により好ましくは、９０～９５％の純度、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（ｗ／ｗ）の純度である調製物を指す。「分離された」化合物は、化合物が得られたサンプルの少なくとも１つの成分の少なくとも９０％から除去されている化合物を指す。本明細書に記載される任意の化合物は、単離された又は分離された化合物として提供することができる。
「抗体」は、その抗原に対する免疫応答の結果として特定の抗原に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンは、「定常」及び「可変」領域を有する「軽い」及び「重い」ポリペプチド鎖で構成される血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいて分類（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）される。
「抗原」又は「免疫原」は、免疫応答を刺激する任意の物質を指す。この用語は、死んだ、不活化した、弱毒化した、又は改変された生存細菌、ウイルス、又は寄生虫を含む。抗原という用語はまた、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（細菌細胞を含む）、組織、多糖類、若しくは脂質、又はそれらの断片を個別に又はそれらの任意の組み合わせで含む。抗原という用語はまた、抗イディオタイプ抗体又はその断片などの抗体、及び抗原又は抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープを含む。
対象における「免疫応答」とは、抗原に対する適応免疫応答、例えば、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は体液性及び細胞性免疫応答の発現を指す。免疫応答はまた、自然免疫応答を指す。免疫応答は、当該技術分野において既知の標準的な免疫アッセイ及び中和アッセイを使用して決定され得る。
「自然免疫」。「自然免疫」という用語は、Ｂ又はＴリンパ球ではなく、主に骨髄系の細胞に依存し、記憶応答を生成しない免疫応答を指す。自然免疫応答は、適応免疫応答のように特定の病原体に特異的ではなく、むしろ病原体関連免疫刺激剤の保存された特徴を利用して応答を開始する。
病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、炎症応答と、好中球及びマクロファージなどの細胞による食作用という２タイプの自然免疫応答を刺激する。これらの応答の両方は、たとえ宿主が特定の病原体に以前に曝露されたことがない場合でも、すぐに発生する可能性がある。ＰＡＭＰには様々なタイプがあり、例えば、ホルミルメチオニン含有ペプチド、ペプチドグリカン細胞壁、細菌の鞭毛、並びにグラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、及びグラム陽性細菌のタイコ酸を含む。それらはまた、酵素、グルカン、及びキチンなどの真菌の細胞壁内の分子を含む。多くの寄生虫はまた、グリコシルホスファチジルイノシトールを含む、免疫刺激剤として働く独自の膜成分を含有する。細菌ＤＮＡにおける短い配列もまた、ＣｐＧモチーフなどの免疫刺激剤として作用することができる。
ＰＡＭＰは、血液中の可溶性受容体（補体）及び細胞表面のＴＬＲ受容体を含む、パターン認識受容体と総称される、宿主の数タイプの専用受容体によって認識される。ＴＬＲ受容体は、食作用を開始し、自然免疫応答を刺激する遺伝子発現を刺激する。ヒトは、少なくとも１０個のＴＬＲを有し、そのうちのいくつかは、リポ多糖、ペプチドグリカン、ザイモサン、細菌鞭毛、及びＣｐＧ ＤＮＡを含む、病原体関連免疫刺激剤の自然免疫認識において重要な役割を果たすことが示されている。異なるヒトＴＬＲは、異なるリガンドに応答して活性化される。
微生物の侵入を認識すると、通常、速やかに、食細胞、例えば、マクロファージ及び好中球によってそれは貪食される。マクロファージ及び好中球は、それらが病原体を認識し貪食することを可能にする様々な細胞表面受容体を示す。これらには、ＴＬＲなどのパターン認識受容体が含まれる。加えて、それらは、適応免疫系によって産生される抗体のＦｃ部分、並びに補体のＣ３ｂ成分に対する細胞表面受容体を有する。
病原体は、様々なシグナル伝達分子によって媒介される炎症応答を頻繁に惹起する。ＴＬＲが活性化されると、プロスタグランジンなどの脂質シグナル伝達分子と、サイトカインなどのタンパク質（又はペプチド）シグナル伝達分子の両方が産生され、これらは全て炎症応答に寄与する。活性化マクロファージによって産生されるサイトカインのいくつかは、化学誘引物質（ケモカイン）である。これらのうちのいくつかは好中球を引き寄せ、他のものは単球及び樹状細胞を引き寄せる樹状細胞は、侵入した病原体から抗原を拾い上げ、それらを近くのリンパ節に運び、そこでリンパ球に抗原を提示する。
「細胞性免疫応答」又は「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔリンパ球若しくは他の白血球、又はその両方によって媒介されるものであり、リンパ球、白血球、又はその両方によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び同様の分子の産生を含む。
「免疫原性」とは、免疫応答又は抗原応答を誘発することを意味する。したがって、免疫原性組成物とは、免疫応答を誘発する任意の組成物のことである。
「エマルション」とは、乳剤をより安定させるために使用される物質を意味する。「エマルション」とは、一方の液体の小滴が他方の液体の連続相に懸濁している２つの非混和性液体の組成物を意味する。
「薬学的に許容され得る」とは、健全な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などを伴わず、対象の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当な利益対リスク比に見合い、かつそれらの意図される使用に有効な物質を指す。
「反応原性」とは、アジュバント、免疫原、ワクチン組成物などの投与に応答して対象において惹起される副作用を指す。それは投与部位で起こり得、通常、いくつかの症候の発症の観点から評価される。これらの症候には、炎症、発赤、及び膿瘍が含まれ得る。また、発生、持続時間、及び重症度の観点からも評価される。「低い」反応とは、例えば、動悸によってのみ検出可能であり、目によって検出されない腫れ、又は持続時間の短いものである。より重度の反応は、例えば、目に見える反応、又は持続時間のより長いものである。
「免疫刺激組成物」は、本明細書で定義されるアジュバントを含み、任意選択で抗原を更に含み得る組成物を指し、その場合、より慣用的にはワクチンと称され得る。対象への組成物の投与は、骨髄系免疫細胞の応答状態の増加をもたらす。治療上有効な組成物の量は、抗原の存在、アジュバント、及び対象の症状に応じて変化し得、当業者によって決定され得る。非抗原性アジュバント組成物は、対象となる疾患の抗原を含まない。
アジュバント組成物
いくつかの実施形態では、免疫刺激組成物において使用するためのアジュバント組成物が提供される。例示的なアジュバントとしては、水中油型エマルションが挙げられるが、これらに限定されず、油相中にスクワレンを含み得る。例えば、ＡＳ０３は、水中油型エマルション中のα－トコフェロール、スクアレン、及びポリソルベート８０で構成されるアジュバント系である。ＭＦ５９は、スクワレンエマルションを含む別の免疫学的アジュバントである。投与されるアジュバントの用量は、抗原の有無、ともに使用される抗原、及び適用される抗原投与量に依存し得る。また、意図される種及び所望の製剤にも依存する。通常、その量は、従来アジュバントに使用される範囲内である。例えば、アジュバントは、典型的には、１ｍＬ用量に対して約１μｇ～約１０００μｇ（１μｇと１０００μｇとを含む）である。
対象となるアジュバントとしては、例えば、以下のような、臨床使用のために承認されたものが挙げられる。
ＴＬＲアゴニストも免疫刺激組成物中のアジュバントとして注目されている。これらの化合物はＴＬＲを活性化する。ＴＬＲアゴニストの例としては、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及びその模倣物が挙げられる。これらの微生物分子マーカーは、当該技術分野で既知のように、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、及び／又はそれらの組み合わせから構成され得、内部又は外部に位置し得る。例としては、リポ多糖（ＬＰＳ）、ザイモサン、ペプチドグリカン、フラジェリン、合成ＴＬＲ２アゴニストＰａｍ３ｃｙｓ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＭＡＬＰ－２、トリアシル化リポタンパク質、リポタイコ酸、ペプチドグリカン、ジアシル化リポペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＬＲ２リガンドとしては、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、合成トリパルミトイル化リポペプチド（ＰＡＭ３ＣＳＫ４）、ザイモサン、リポグリカン、例えばリポアラビノマンナン又はリポマンナン、ペプチドグリカン、ジアシル化リポタンパク質ＭＡＬＰ－２、合成ジアシル化リポタンパク質ＦＳＬ－１、熱ショックタンパク質ＨＳＰ６０、熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９６又は高移動度群タンパク質１（ＨＭＧ－１）のうちの１つ以上を挙げることができる。
ＴＬＲ３、４、７／８及び９アゴニストは、免疫刺激剤として特に注目されている。この群には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：８５２Ａ：ウイルスｓｓＲＮＡを模倣する合成イミダゾキノリン；ＶＴＸ－２３３７：ウイルスｓｓＲＮＡを模倣する低分子選択的ＴＬＲ８アゴニスト；ＢＣＧ：ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｆ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ；ＣｐＧ ＯＤＮ：ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド；イミキモド：ウイルスｓｓＲＮＡを模倣する合成イミダゾキノリン；ＬＰＳ：リポ多糖；ＭＰＬ：モノホスホリル脂質Ａ；ポリＩ：Ｃ：ポリリボイノシン－ポリリボシチジル酸；ポリＩＣＬＣ：ポリＩ：Ｃ－ポリ－ｌ－リジン；レシキモド：ウイルスｓｓＲＮＡを模倣する合成イミダゾキノリン。
イミキモドは、ＴＬＲ７を標的とする合成イミダゾキノリンである。単剤療法として非経口投与される新しいイミダゾキノリンＴＬＲ７アゴニスト８５２Ａは、単剤療法として疾患の安定化を伴う適度な臨床的有効性を示している。レシキモドは、ヒトにおけるイミダゾキノリンＴＬＲ７／８アゴニストである。
ＣｐＧは、シトシン及びグアニンを含有するモチーフによって特徴付けられた一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。それらの免疫学的効果に基づいて、ＣｐＧ ＯＤＮは、３つの異なるクラスに分けられる：ｐＤＣに対するＩＦＮ－α産生作用によるＮＫ細胞の強力な刺激物質であるＣｐＧ－Ａ、中等度のＩＦＮ－α誘発物質であるＣｐＧ－Ｂ、及び抗原特異的免疫応答のエンハンサー（ｐＤＣ及びＢ細胞上の共刺激分子を上方制御し、Ｔｈ１サイトカイン産生を誘発し、ｐＤＣによる抗原提示を刺激する）；並びにＣｐＧ－Ｃ（これは、ＣｐＧ－ＡとＣｐＧ－Ｂとの両方の刺激能力を組み合わせたものである）。ＣｐＧ ７９０９（ＰＦ－３５１２６７６、ＣｐＧ型Ｂ及びＴＬＲ９アゴニスト）は、腎細胞がん腫、膠芽腫、黒色腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含むいくつかの腫瘍タイプで評価されている。ポリリボイノシン－ポリリボシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）はウイルスｄｓＲＮＡの合成アナログであり、これはエンドソーム（ＴＬＲ３）及び／又は細胞質の黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）を刺激し、Ｉ型ＩＦＮの産生の増加をもたらす。ＴＬＲ４複合体を標的とする脂質Ａ分子としては、サルモネラミネソタ由来の脂質Ａの誘導体であるモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）が挙げられる。
免疫刺激組成物として使用するためのアジュバント製剤は、ホモジナイズ又はマイクロフルイダイズすることができる。製剤は、典型的には、１つ以上のホモジナイザーを１回以上通過させることによって、一次ブレンドプロセスに供する。任意の市販のホモジナイザー、例えば、Ｒｏｓｓ乳化剤（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，Ｎ．Ｙ．）、Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー（Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｍａｓｓ．）、又はマイクロフルイディクス（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）を、この目的のために使用することができる。一実施形態は、製剤を３分間、１０，０００ｒｐｍでホモジナイズする。マイクロフルイダイゼーションは、市販のマイクロフルイダイザー、例えばマイクロフルイディクス（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及びＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｗｉｓ．）から入手可能のモデル番号１１０Ｙを使用することにより達成され得る。これらのマイクロフルイダイザーは、２つの流体流が相互作用チャンバ内で高速で相互作用してサブミクロンサイズの液滴を有する組成物を形成するように、高圧下で小さい開口部を介して流体を強制的に送り込むことにより作動する。一実施形態では、製剤は、２００ミクロンの制限寸法チャンバを１０，０００＋／－５００ｐｓｉで通過させることによってマイクロフルイダイズされる。
アジュバント組成物の投与経路としては、非経口、経口、経鼻、鼻腔内、気管内、局所などが挙げられる。注射器、点滴器、無針注射デバイス、パッチなどを含む任意の好適なデバイスを使用して組成物を投与してもよい。使用のために選択される経路及びデバイスは、アジュバントの組成、抗原、及び対象に依存し、そのようなことは当業者に周知である。
アジュバント組成物は、例えば、四級アンモニウム化合物（例えば、ＤＤＡ）、及びインターロイキン、インターフェロン、又は他のサイトカインなどの１つ以上の免疫調節物質を更に含むことができる。これらの材料は、商業的に購入することができる。アジュバント組成物での使用に好適な免疫調節物質の量は、使用される免疫調節物質の性質及び対象に依存する。しかしながら、それらは一般的に、用量当たり約１μｇ～約５，０００μｇの量で使用される。具体例では、ＤＤＡを含有するアジュバント組成物は、抗原溶液を新たに調製したＤＤＡの溶液と単純に混合することによって調製することができる。
アジュバント組成物は、例えば、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレングリコール、並びにポリアクリル酸及びポリメタクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ．ＲＴＭ．）などの１つ以上のポリマーを更に含むことができる。かかる材料は、商業的に購入することができる。アジュバント組成物での使用に好適なポリマーの量は、使用されるポリマーの性質に依存する。しかしながら、それらは一般的に、約０．０００１％体積／体積（ｖ／ｖ）～約７５％ｖ／ｖの量で使用される。他の実施形態では、それらは、約０．００１％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ～約２５％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約０．０５％ｖ／ｖ～約２％ｖ／ｖ、及び約０．１％ｖ／ｖ～約０．７５％ｖ／ｖの量で使用される。別の実施形態では、それらは、約０．０２ｖ／ｖ～約０．４％ｖ／ｖの量で使用される。ＤＥＡＥ－デキストランは、５０，０００Ｄａ～５，００００，０００Ｄａの範囲の分子サイズを有し得、又は５００，０００Ｄａ～２，０００，０００Ｄａの範囲であり得る。かかる材料は、商業的に購入され得るか、又はデキストランから調製され得る。
アジュバント組成物は、例えば、Ｂａｙ Ｒ１００５（商標）及びアルミニウムなどの１つ以上のＴｈ２刺激剤を更に含むことができる。アジュバント組成物での使用に好適なＴｈ２刺激剤の量は、使用されるＴｈ２刺激剤の性質に依存する。しかしながら、それらは一般的に、用量当たり約０．０１ｍｇ～約１０ｍｇの量で使用される。他の実施形態では、それらは、用量当たり約０．０５ｍｇ～約７．５ｍｇ、用量当たり約０．１ｍｇ～約５ｍｇ、用量当たり約０．５ｍｇ～約２．５ｍｇ、及び用量当たり１ｍｇ～約２ｍｇの量で使用される。具体例は、「Ｎ－（２－デオキシ－２－Ｌ－ロイシルアミノ－β－Ｄ－グルコピラノシル）－Ｎ－オクタデシルドデカンアミドアセテート」という化学名の糖脂質であるＢａｙ Ｒ１００５（商標）である。それは水溶液中でミセルを形成する両親媒性分子である。
非特異的免疫応答性を得ることができる疾患を引き起こす細菌のいくつかの例としては、例えば、Ａｃｅｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｅｒｕｉａｎｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ａｒｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉｅａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｉｓ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌｓａ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＬＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ （Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ） ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｖｏｓａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｃ９、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＩＫＷ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ Ｂ１１－１、Ａｌｃａｌｉｇｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｅｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｐｉｒｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｙｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｒｅｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、例えば、既知の病原体であるＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ－ｂｏｖｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ－ｐｒａｊｉｔｎｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
非特異的免疫応答性を得ることができる疾患を引き起こすウイルスの例としては、例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ１、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２、及び他のコロナウイルス、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ウシヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミクソウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ウシパラインフルエンザウイルス３、リンデルペストウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ＢＶＤＶ Ｉ型、ＢＶＤＶ ＩＩ型、古典的ブタ熱ウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ結核、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ニューカッスル病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺がんウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、汎発性ＣＣＶ、イヌ呼吸器コロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ腸管コロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎、ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）Ｉ型、ＰＣＶ ＩＩ型、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、七面鳥コロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、狂犬病、ロトウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レンチウイルス、トリインフルエンザ、ライノウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、及び麻疹ウイルス、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
非特異的免疫応答性を得ることができる疾患を引き起こす寄生虫の例としては、例えば、Ａｎａｐｌａｓｍａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ（肝吸虫）、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ（犬糸状虫）、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ（鉤虫）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｔａｅｎｉａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ、及びＩｓｏｐｓｏｒａ、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。また、Ｉｘｏｄｅｓ、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙａｌｏｍｍａ、及びＨａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ種、並びにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないダニを含む外部寄生虫も企図されている。
油は、アジュバントの成分として添加されると、一般に、長くゆっくりとした放出プロファイルを提供する。本発明において、油は、代謝性又は非代謝性であり得る。油は、水中油型、油中水型、又は水中油中水型エマルションの形態であり得る。
本発明での使用に好適な油としては、アルカン、アルケン、アルキン、並びにそれらに対応する酸及びアルコール、それらのエーテル及びエステル、並びにそれらの混合物が挙げられる。油の個々の化合物は、軽炭化水素化合物であり、すなわち、かかる成分は、６～３０個の炭素原子を有する。油は、石油製品から合成的に調製又は精製することができる。成分は、直鎖又は分岐鎖構造を有し得る。完全に飽和しているか、又は１つ以上の二重結合若しくは三重結合を有し得る。本発明で使用する非代謝性油としては、例えば、鉱油、パラフィン油、及びシクロパラフィンが挙げられる。
「油」という用語はまた、「軽鉱油」、すなわち、ペトロラタムの蒸留によって同様に得られるが、白色鉱油よりも比重がわずかに小さい油を含むことが意図されている。
代謝可能な油としては、代謝可能で非毒性の油が挙げられる。油は、アジュバントが投与される対象の体内によって代謝され得、対象に毒性でない任意の植物油、魚油、動物油又は合成的に調製された油であり得る。植物油の供給源としては、ナッツ類、種子類、穀物類が挙げられる。
組成物の他の成分としては、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば、担体、溶媒、及び希釈剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、血管収縮剤、抗菌剤、抗真菌剤などを挙げることができる。典型的な担体、溶媒、及び希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、油などが挙げられる。代表的な等張化剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。有用な安定化剤としては、ゼラチン、アルブミンなどが挙げられる。
界面活性剤は、アジュバント及び抗原の担体として機能するように選択されたエマルションの安定化を補助するために使用される。本発明での使用に好適な界面活性剤としては、天然の生物学的に適合性のある界面活性剤及び非天然の合成界面活性剤が挙げられる。生物学的に適合性のある界面活性剤としては、リン脂質化合物又はリン脂質の混合物が挙げられる。好ましいリン脂質は、大豆又は卵レシチンなどのホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗製植物油を水洗し、得られた水和されたゴムを分離・乾燥させることによって、ホスファチドとトリグリセリドの混合物として得ることができる。精製製品は、アセトン洗浄によってトリグリセリド及び植物油を除去した後に残ったアセトン不溶性のリン脂質と糖脂質との混合物を分画することによって得ることができる。代替的に、レシチンは、様々な商業的供給源から得ることができる。他の好適なリン脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は、天然源から単離され得るか、又は従来の方法で合成され得る。
本発明での使用に好適な非天然合成界面活性剤としては、ソルビタン系非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤、ポリエトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（商標））、ヒマシ油などの供給源からの脂肪酸のポリエチレングリコールエステル、ポリエトキシル化脂肪酸、ポリエトキシル化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒドポリマー、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（商標））、ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標））、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、吸着遅延剤などを含む。担体は、組成物の他の成分と適合性があり、対象にとって有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。典型的には、担体は、無菌でパイロジェンフリーであり、使用される投与様式に基づいて選択される。組成物を含む薬学的に許容され得る担体のための好ましい製剤は、米国（ＵＳ）農務省若しくは米国食品医薬品局、又は米国以外の国における同等の政府機関によって公布された適用可能な規則で承認された医薬担体であることは、当業者に周知である。したがって、組成物の商業生産のための薬学的に許容され得る担体は、米国若しくは外国の適切な政府機関によって既に承認されているか、又は承認される予定の担体である。
組成物は、任意選択で、医薬ビヒクル、賦形剤、又は媒体として機能する、適合性のある薬学的に許容され得る（すなわち、無菌又は非毒性の）液体、半固体、又は固体希釈剤を含み得る。希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられる。安定化剤としては、とりわけ、アルブミンが挙げられる。
組成物はまた、例えば、ゲンタマイシン、メルチオレート、若しくはクロロクレゾールを含む抗生物質又は保存剤を含有し得る。様々なクラスの抗生物質又は保存剤を選択することは、当業者に周知である。
使用方法
いくつかの実施形態では、上記のようなアジュバントを含み得るか、それからなり得るか、又は本質的にそれからなり得る免疫刺激組成物を個体に投与して自然免疫応答性を増強させる。個体は、例えば、パンデミックにおいて、又は他の状況において病原体に曝露されるリスクがあり得る。
個体は、入院、収監、旅行、共同生活への参加などを含むがこれらに限定されない、個体が病原体曝露の増加したリスクにある期間の前に免疫刺激組成物が投与され得る。リスク増加の病原体は、細菌、ウイルス、寄生虫など、例えば、呼吸器ウイルスであり得る。
本明細書では、アジュバントは、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間の期間にわたって、増強された免疫応答性の広範な状態を生じさせる広範な免疫増強剤として作用することができ、場合によっては、約２ヶ月以上後に検出され得ることが示されている。予防的投与は、病原体曝露の増加したリスクの期間中に、免疫応答性の増加を提供するために行うことができる。
投与は、必要に応じて１回、２回、３回以上行うことができる。複数回の投与は、最初に約２、３、４、５、６、７、８週間以上の間隔を空けることができ、その後の投与のために、更に２、３、４、５、６ヶ月以上の間隔を空けることができる。
必須ではないが、本開示の方法による治療のために選択される個体には、特に自然免疫の増強の恩恵を受ける、適応免疫応答が低下した個体が含まれ得る。かかる個体としては、新生児、高齢者、免疫抑制剤で治療を受けている個体、例えば、移植レシピエント、自己免疫患者など、がん患者、例えば、化学療法薬又は放射線療法で治療を受けているがん患者などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、ワクチン接種又は曝露に応答して抗体又は他の適応免疫応答を産生する能力の低下は、適応免疫応答の低下の指標となり得る。
いくつかの実施形態では、免疫刺激組成物の投与の有効性は、個体由来の免疫細胞のエピジェネティック状態の解析によって評価される。かかる解析は、好適な細胞サンプル、例えば、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）に対して行われ得る。特に関心のある細胞、例えば、ＣＤ１４＋単球及びｍＤＣは、例えば、ＣＤ１４＋細胞を選択することによって、単一細胞として若しくはバルクで解析することで精製され得るか、又は精製せずに解析中に単一細胞レベルで表現型化され得る。この目的のために、例えば、ＥｐｉＴＯＦ（Ｔｉｍｅ－Ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔによるサイトメトリーを使用するエピジェネティックランドスケーププロファイリング）、単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、及び単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを含む単一細胞技術を含む様々な方法が当該技術分野で知られている。ヒストン修飾情報を決定するための任意の好適な方法、例えば、ＣＨＩＰ－Ｓｅｑ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑなどが使用され得る。マスサイトメトリーのためのＥｐｉＴＯＦパネルには、免疫細胞同一性を決定するためのマーカー、総ヒストンレベルを推定するためのマーカー、並びにアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、シトルリン化、及びクロトニル化を含む異なるヒストン修飾を評価するためのマーカーが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、自然免疫応答性の増強における候補アジュバント、免疫刺激組成物又は投与レジメンの有効性は、ＩＲＦ遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの増加、抗ウイルス遺伝子発現の増強、及びインターフェロン産生の上昇のうちの１つ以上の存在を、対象となる骨髄系細胞集団において検出することによって監視され、クロマチンアクセシビリティの増加は、継続的な免疫応答性を示す。
スクリーニング方法
他の実施形態では、候補アジュバントを、個体又は動物モデルに投与し、骨髄系細胞のエピジェネティック状態への影響を決定することによって、免疫応答性を増強する際の有効性についてスクリーニングする。本明細書に記載される目的に好適なアジュバントは、関連する骨髄系細胞において応答性状態を誘発することができ、投与のために選択され得る。
対象となる候補薬剤は、ＴＬＲアゴニスト、スクアレンエマルションなどを含む、有機金属分子、無機分子などを含み得る、多数の化学クラス、主に有機分子を包含する生物学的に活性な薬剤である。候補薬剤を含む化合物は、合成又は天然化合物のライブラリを含む多種多様な供給源から得られる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、生体分子を含む多種多様な有機化合物の無作為かつ指向性合成のために、多数の手段が利用可能である。代替的に、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが利用可能であるか、又は容易に産生される。加えて、天然又は合成的に産生されたライブラリ及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を通じて容易に修飾され、組み合わせライブラリを産生するために使用され得る。既知の薬理学的薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの直接的又はランダムな化学修飾を受けて、構造的類似体を産生し得る。
薬剤を、少なくとも１つ、通常は複数の細胞、例えば、骨髄系細胞に添加することによって、又は通常は、薬剤を欠くアッセイの組み合わせと併せて、試験動物に投与することによって、生物学的活性についてスクリーニングする。薬剤に応答して読み出される骨髄系細胞のエピジェネティクスの変化を測定し、所望により正規化する。培養物では、薬剤を、溶液、又は容易に可溶性の形態で、培養物中の細胞の培地に適宜添加する。薬剤は、フロースルーシステムで、流れとして、間欠的若しくは連続的に、又は代替的に、化合物を、単回若しくは増分的に、他の静置した溶液にボーラス添加することができる。フロースルーシステムでは、２つの流体が使用され、一方は生理学的に中性の溶液であり、もう一方は試験化合物を添加した同じ溶液である。第１の流体が細胞の上を通過し、続いて第２の流体が通過する。単一の溶液法では、試験化合物を、細胞を取り囲む培地の体積にボーラス添加する。培養培地の成分の全体的な濃度は、ボーラス添加、又はフロースルー法における２つの溶液間で大きく変化してはならない。
複数のアッセイを、異なる薬剤濃度を用いて並行して実行して、様々な濃度に対する応答差を得てもよい。当該技術分野で既知であるように、薬剤の有効濃度を決定することは、典型的には、１：１０、又は他の対数スケールの希釈から生じる濃度の範囲を使用する。濃度は、必要に応じて、第２の系列の希釈で更に精密化され得る。典型的には、これらの濃度のうちの１つは、陰性対照として機能する、すなわち、ゼロ濃度で、又は薬剤の検出レベル未満で、又は表現型に検出可能な変化を与えない薬剤の濃度未満である。
自然免疫を増強するエピジェネティック変化は、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの増加、抗ウイルス遺伝子発現の増強、及びインターフェロン産生の上昇によって特徴付けられた、ウイルス感染に対する抵抗性の増強に現れ得る。加えて、単球及びｍＤＣは、免疫不応性の状態（炎症性サイトカインの産生低下によって判断される）を呈し、この免疫不応性の状態は、ＡＰ－１遺伝子座におけるヒストンアセチル化の減少及びクロマチンアクセシビリティの減少によって特徴付けられる。
キットが提供され得る。キットは、変換の準備のために細胞を単離・培養するのに好適な細胞又は試薬、Ｔ細胞を培養するのに好適な試薬、並びにワクチンアジュバントのエピゲノム効果を決定するのに有用な試薬を更に含み得る。キットはまた、チューブ、緩衝液など、及び使用説明書を含み得る。
実験
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らが発明とみなす範囲を限定することを意図したものではなく、また以下の実験が行われる全て又は唯一の実験であることを表すことを意図したものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、若干の実験誤差及び逸脱が考慮されるべきである。特に断りのない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
実施例１
ヒトにおける季節性及びアジュバント併用パンデミックインフルエンザワクチンに対する自然免疫のエピゲノム及び転写ランドスケープの単一細胞解析
エピゲノムが免疫において基本的な役割を果たすという新たな証拠が示されている。ここでは、システム生物学的アプローチを使用して、ヒトにおけるインフルエンザワクチン接種に対する免疫のエピゲノム及び転写ランドスケープを単一細胞レベルでマッピングした。季節性インフルエンザに対するワクチン接種の結果、単球及び骨髄系樹状細胞においてＨ３Ｋ２７ａｃの発現が持続的に減少し、これはＴＬＲ刺激に対するサイトカイン応答の障害と関連していた。１２０，３０５個の単一細胞の単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析から、ワクチン接種後のＡＰ－１標的遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの低下を伴うエピゲノム的に異なる単球のサブクラスターが明らかになった。同様の効果は、ＡＳ０３アジュバント併用Ｈ５Ｎ１パンデミックインフルエンザワクチンによるワクチン接種に応答しても観察された。しかしながら、このワクチンはまた、インターフェロン応答因子（ＩＲＦ）が標的とする遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの持続的な増加も刺激した。これは、抗ウイルス遺伝子の発現及び１型ＩＦＮの産生の上昇、並びに異種ウイルスのジカ及びデングへの感染抵抗性の増加と関連していた。これらの結果は、インフルエンザワクチンが自然免疫系の持続的なエピゲノムリモデリングを刺激することを実証している。注目すべきことに、ＡＳ０３アジュバントワクチン接種が、骨髄系細胞のエピゲノムをリモデリングして、異種ウイルスに対する抵抗性を高め、「エピジェネティックアジュバント」としてのその認識されていなかった役割を明らかにした。
本研究では、ＥｐｉＴＯＦ（Ｔｉｍｅ－Ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔによるサイトメトリーを使用するエピジェネティックランドスケーププロファイリング）、単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、及び単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを含む単一細胞技術を含む単一細胞技術を使用して、ヒトにおけるインフルエンザワクチンに対する免疫のエピゲノム及び転写ランドスケープについて研究した。３価不活化季節性インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）によるワクチン接種が、ワクチン接種後最大６ヶ月間持続した複数の免疫細胞サブセットにおけるクロマチン状態へのグローバルな変化を誘発したことを見出している。これらの変化は、骨髄系細胞において最も顕著であり、ＡＰ－１転写因子が標的とする遺伝子座におけるアクセス不能なクロマチンへの移行、及びＴＬＲ刺激に応答してサイトカイン産生の低下を示した。単一細胞解析により、単球集団内に複数のエピゲノム基質が存在することが明らかになり、ワクチン接種に応答してそれらの相対的な存在量を変化させることによって、観察された変化が引き起こされた。ＡＳ０３アジュバント併用Ｈ５Ｎ１パンデミックインフルエンザワクチンによるワクチン接種はまた、自然免疫系において同様のエピゲノム的及び機能的変化を誘発した。しかしながら、顕著なことに、ＡＳ０３アジュバント併用ワクチンはまた、ＩＲＦ及びＳＴＡＴ遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの増加、並びに異種ウイルス感染に対する抵抗性の増加を特徴とする抗ウイルス警戒状態も同時に誘発した。
ＴＩＶワクチン接種後の免疫細胞サブセットのグローバルなエピゲノムリプログラミング。ＴＩＶが単一細胞レベルで免疫系のエピゲノムランドスケープをどのようにリプログラムするかを決定するために、１８～４５歳の２１人の健常な個体のコホートにＥｐｉＴＯＦ技術を適用した。全ての対象が０日目にＴＩＶを受けた。エピゲノム免疫細胞ランドスケープに対する腸内細菌叢の影響を決定するために、１１人の対象のサブグループが、－３日目～１日目の間に、ネオマイシン、バンコマイシン、及びメトロニダゾールからなる追加の経口抗生物質レジメンを受けた（図１ａ）。このコホートに対する我々の以前の研究は、抗生物質の投与が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の転写及び代謝プロファイルの有意な変化を誘発したことを実証していた。したがって、抗生物質の投与がＰＢＭＣのエピゲノムリプログラミングを誘発すると仮説を立てた。この仮説を検証するために、免疫細胞同一性を決定するための１９個のマーカー、総ヒストンレベルを推定するための２個のマーカー、並びにアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、シトルリン化、及びクロトニル化を含む異なるヒストン修飾を評価するための３８個のマーカーからなる金属標識抗体の２つのＥｐｉＴＯＦパネルを開発した。これらのパネルを使用して、ワクチン接種前の－２１日目及び０日目並びにワクチン接種後の１日目、７日目、３０日目、及び１８０日目に単離されたＰＢＭＣ（図８ａ）を解析した。手動ゲーティングアプローチを使用して、全ての主要な免疫細胞集団を検出した。ほとんどの免疫細胞集団の頻度は、ワクチン接種の過程で変化しなかったが、抗生物質処理（ｄ０、ｄ１）中のｐＤＣの一時的な増加と、後の時点で一部の対象において骨髄系細胞の分画が減少する傾向とを観察した（図８ｂ）。次に、各サブセットのヒストン修飾情報を抽出し、正規化し、次いで、この情報を使用してエピゲノム免疫細胞ランドスケープのＵＭＡＰ表現を生成した（図１ｂ）。ヒストン修飾情報だけで免疫細胞サブセットを分離するのに十分であり、リンパ球系細胞（ＮＫ、Ｂ、Ｔ細胞）、骨髄系細胞（単球、樹状細胞）、及び造血前駆細胞（ＣＤ３４＋）を含むクラスターが出現した。
全ての免疫細胞サブセットからのグローバルヒストン修飾データを組み合わせて、ワクチン接種後、特に３０日目に採取されたサンプルが、ワクチン接種前に採取されたサンプルとは異なっており、ＴＩＶがエピゲノム免疫細胞ランドスケープへの変化を誘発していることを示すことを観察した（図１ｃ）。驚くべきことに、抗生物質の状態は、ヒストン修飾レベルに測定可能な影響を有さず、抗生物質対象及び対照対象からのサンプルが混在していた（図１ｃ）。これらの対象において以前に観察された血液トランスクリプトーム及びメタボロームに対する抗生物質処理の顕著な影響を考慮すると、この観察は驚くべきものであった。むしろ、抗生物質の状態に関係なく、ワクチン接種に応答して、いくつかのヒストンマークのアセチル化、メチル化、及びリン酸化状態の変化を観察した（図８ｃ、ｄ）。特に、ＣＤ３４＋細胞におけるいくつかのヒストンメチル化マークの増加、及び骨髄系細胞における複数のアセチル化及びリン酸化マークの減少を検出した（図１ｄ）。加えて、ワクチン接種後３０日目に、全ての免疫細胞サブセットにおいてＨ２ＢＳ１４ｐｈレベルの増加を観察した（図８ｃ）。Ｈ２ＢＳ１４ｐｈは、別のヒストン修飾であるγＨ２ＡＸとともに、タンパク質キナーゼＭｓｔ１（ＳＴＫ４）によって触媒され、両方のタンパク質とも以前にアポトーシスと関連付けられている。しかしながら、我々のデータでは、いかなる時点でも、ＰＢＭＣの生存率の低下もγＨ２ＡＸのレベルの上昇も観察されなかった（図８ａ）。総合すると、これは、我々の場合において、Ｈ２ＢＳ１４ｐｈにおけるアポトーシス誘発性の増加が起こりそうにないことを示唆している。代わりに、Ｍｓｔ１／ＳＴＫ４が免疫細胞活性の調節に関与していることが示されているため、Ｈ２ＢＳ１４ｐｈの観察された増加は、ワクチン応答の一部である可能性がある。
骨髄系細胞における持続的なエピゲノムリプログラミング。興味深いことに、３０日目に樹状細胞及び古典的単球において、全て減少したＨ２ＢＫ５ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、及びＨ３Ｋ２７ａｃを含むヒストンアセチル化マークの群におけるヒストン修飾レベルの最も強い変化を観察した（図１ｄ、ｅ）。ペアワイズ相関解析は、これらのマークと２つの付加的なヒストン修飾、Ｈ４Ｋ５ａｃとＰＡＤＩ４との間に高い相関係数を示した（図Ｓ１ｅ）。これらの５つのヒストン修飾の縦断的解析は、ワクチン接種後１日目～７日目頃から低下し始め、３０日目に最低点に達し、１８０日目にほぼベースラインレベルに戻るという同様の動態を示し（図１ｆ）、ワクチン接種後１ヶ月超持続した骨髄系細胞におけるエピゲノムリプログラミングを示している。非古典的単球は、これらのマークに変化を示さなかった。重要なことに、これらの変化は、抗生物質対象及び対照対象の両方で観察された（図Ｓ１ｄ）。
同じ対象からのワクチン接種前及びワクチン接種後の０日目のＰＢＭＣから得られた血液トランスクリプトミクスデータ（Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）は、ヒストン修飾酵素の発現における対応する変化を明らかにした：ヒストンアセチル化ライター、特にＣＲＥＢＢＰ／ＣＢＰ（Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ２ＢＫ５ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ）及びＫＡＴ６Ａ（Ｈ３Ｋ９ａｃ）は、ワクチン接種後に有意に減少したが、アセチル化消去酵素（様々なＨＤＡＣ）は増加傾向を示した（図９ａ）。ヒストンアセチル化は、活発な遺伝子発現と関連しており、特にＨ２ＢＫ５ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ａｃは、グローバルな遺伝子発現活性を強く予測することが示された。注目すべきことに、Ｈ３Ｋ２７ａｃのアンタゴニストでもある抑制性ヒストンマークＨ３Ｋ２７ｍｅ３は、古典的単球及び骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）において有意に増加し（図１ｅ）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ライターのＥＺＨ２がＲＮＡ－ｓｅｑで発現増加を示した（図９ａ）。最後に、ＰＡＤＩ４は以前に骨髄系細胞に特有のＥｐｉＴＯＦマークであることが示されており、単球及びマクロファージの分化、活性化、及び炎症への関与を示す報告がいくつかある。
次に、単一細胞分解能で骨髄系細胞において観察されたエピゲノムリプログラミングを調べた（図１ｇ）。Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ２ＢＫ５ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、及びＰＡＤＩ４マークを使用して、ｍＤＣ及び古典的単球のサブクラスタリング及びＵＭＡＰベースの次元削減解析を行うことによって、単一細胞のヒストン修飾ランドスケープを構築した。重要なことに、両方の細胞タイプにおいて、単一細胞がワクチン接種時点に従って分離され、０日目及び１日目の細胞は、２ｄ空間の一方の側で一緒にクラスタリングされ、３０日目の細胞は反対側を占めた（図１ｇ）。７日目の細胞は中間的な位置を占め、０日目～３０日目のクラスター間に広がった。我々のこれまでの知見と同様に、３０日目の単一細胞は、ほとんどが低レベルのＨ３Ｋ２７ａｃを有し、０日目の細胞は高いレベルを有した。興味深いことに、バルク動態解析によって検出されず（図１ｆ）、１８０日目の細胞は０日目の細胞が占有していたベースライン位置に戻らなかったが、完全に回復されていないＨ３Ｋ２７ａｃレベルを有する中間状態になった（図１ｇ）。総合すると、これらの結果は、単一細胞レベルでの変化によって引き起こされる骨髄系エピゲノムランドスケープが協調的かつ潜在的に抑制的にリプログラミングされたことを指し示している。
これらの観察から、最大６ヶ月間持続する持続的なエピジェネティック変化が、単球においてどのように維持され得るか、及びｍＤＣが比較的短いターンオーバーを有することが知られているかという疑問が生じる。最近の研究では、循環骨髄系細胞におけるかかる続的な変化が、骨髄中の造血幹細胞及び前駆細胞区画における持続的なエピジェネティック変化と関連していることが示されている。このことが本研究においても明らかであったかどうかを決定するために、分化したリンパ球系又は骨髄系細胞のコンセンサスプロファイルに対するエピゲノム距離を計算した（図１０ａ）。興味深いことに、それらのエピゲノム距離に基づいて、ＣＤ３４＋細胞の複数の集団を検出し、分化した免疫細胞との距離が比較的小さい集団は、おそらく事前にコミットされたクローンに似ていた（図１０ｂ）。ワクチン接種後、ＣＤ３４＋細胞とリンパ球系細胞又は骨髄系細胞との距離は全体的に増加し、潜在的に前駆細胞の割合は大幅に減少し（図１０ｂ～ｄ）、これは、ワクチン接種後に幹細胞プールが未成熟な表現型にシフトする可能性を示している。１８０日目に、距離はワクチン接種前の状態に戻った。
総合すると、我々の結果は、ＴＩＶによるワクチン接種が、様々な免疫細胞サブセットのグローバルなエピゲノムリプログラミングをもたらすことを実証している。特に、古典的単球及び樹状細胞は、複数のヒストンアセチル化マークとＰＡＤＩ４との協調的な減少によって特徴付けられ、これは最長１８０日間持続することから、これらの細胞では抑制されたエピゲノム状態が潜在的に示される。
ＴＩＶは、自然免疫細胞における持続的な機能的変化を誘発する。ヒストンアセチル化とＰＡＤＩ４活性との両方が遺伝子発現及び単球機能と関連しているとすれば、ＴＩＶ後３０日目に観察されたこれらのマークの減少が骨髄系細胞機能に何らかの影響を及ぼしているかどうか検討した。この疑問に答えるために、ワクチン接種前、又は接種後の様々な時点で、細菌（ＬＰＳ、フラジェリン、Ｐａｍ－３－Ｃｙｓ）又はウイルス（ｐＩ：Ｃ、Ｒ８４８）病原体関連分子パターンを模倣する合成ＴＬＲリガンドのカクテルでワクチン接種された個体からＰＢＭＣを刺激した（図２ａ）。２４時間の刺激後、Ｌｕｍｉｎｅｘを使用して、培養上清中の６２個の分泌サイトカインの濃度を測定した。ワクチン接種後の時点からのＰＢＭＣがサイトカイン産生に任意の変化を示したかどうかを決定するために、Ｄ０と比較したサイトカイン濃度の相対的変化を計算した（図２ｂ）。実際、階層的クラスタリングを使用して、ワクチン接種後３０日目に有意な低下を示したサイトカインのサブセットを同定した（図２ｂの赤いボックス、ｃ）。これらのサイトカインとしては、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１０、単球性ケモカインＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＥＮＡ７８（ＣＸＣＬ５）、及びＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）、並びに単球成長因子ＧＣＳＦが挙げられる。エピゲノム変化と同様に、サイトカインレベルは、ワクチン接種後１～７日目頃から低下し始め、３０日目に最低点に達し、１８０日目にほぼベースラインレベルに戻る（図２ｄ）。これらのサイトカインは全て、ＴＬＲカクテルの両方によって強く誘発され（図１１ａ）、抗生物質対象及び対照対象の両方でＤ０に対する低下が観察された（図１１ｂ）。
次に、グローバルなヒストン修飾レベルとＴＬＲ誘発性サイトカイン産生との間に直接的な関係があるかどうかを調べた。ペアワイズ相関解析を使用して、サンプル中のサイトカイン濃度と、古典的単球におけるＥｐｉＴＯＦヒストン修飾レベル、並びにＰＢＭＣサンプル中の単球頻度及び細胞生存率とを相関させた（図２ｅ）。顕著なことに、図１ｃで以前に同定されたヒストンアセチル化マーク、特にＨ３Ｋ２７ａｃ及びＰＡＤＩ４は、サイトカイン産生と強い正の相関を示した（図２ｅ、ｆ）。対照的に、Ｈ２ＢＳ１４ｐｈ及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３及びＨ４Ｋ２０ｍｅ３を含むいくつかの抑制的メチル化マークは、サイトカイン産生と負の相関を示した（図２ｅ）。
次に、Ｈ３Ｋ２７ａｃヒストンアセチル化及びＰＡＤＩ４レベルの観察された低下と、サイトカイン産生の低下との間に因果関係があるかどうかを決定した。ヒストンアセチルトランスフェラーゼＣＢＰ／ｐ３００の特異的阻害剤（Ａ－４８５、Ｈ３Ｋ２７、Ｈ２ＢＫ５、及びＨ４Ｋ５でのアセチル化を阻害、並びにＰＡＤＩ４（Ｃｌ－アミジン）を使用したエクスビボ刺激実験を行い、続いて合成ＴＬＲリガンドを用いた刺激を行った。また、ヒストンアセチル化を検出するための陽性対照として、ＨＤＡＣの阻害を介してヒストンアセチル化を増強するトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を使用した。フローサイトメトリーを使用して、Ｈ３Ｋ２７ａｃの発現及びＩＬ－１β及びＴＮＦαの細胞内蓄積を評価した。予想されるように、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤Ａ－４８５で処理すると、古典的単球におけるグローバルなヒストンＨ３Ｋ２７ａｃレベルが濃度依存的に減少し、一方、ＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡで処理すると、濃度依存的に増加した。更に、ＰＡＤＩ４阻害剤Ｃｌ－アミジンで処理すると、ＥｐｉＴＯＦにおけるＰＡＤＩ４及びＨ３Ｋ２７ａｃレベルの密接な相関、並びに以前に観察されたＰＡＤＩ４のＣＢＰ／Ｐ３００を調節する能力と一致して、Ｈ３Ｋ２７ａｃが同様に減少した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。注目すべきことに、これらの阻害剤のいずれも細胞生存率に影響を及ぼさなかった（データは図示せず）。次に、ＣＢＰ／Ｐ３００及びＰＡＤＩ４の阻害がサイトカイン産生に影響を及ぼすかどうかを検討した。実際、Ａ－４８５で処理すると、ＬＰＳ又はＲ８４８で刺激後した後のＩＬ－１ｂ及びＴＮＦａ陽性単球の頻度が大幅に低下した（図２ｇ、ｈ）。Ｃｌ－アミジン処理は、顕著なことに、これらの細胞におけるサイトカイン産生を完全に消失させた（図２ｈ）。
総合すると、これらの結果は、ＴＩＶワクチン接種が自然免疫細胞の機能性の低下を誘発することを実証し、この低下は、古典的単球のエピゲノムランドスケープの変化と相関し、因果関係があることを示した。
季節性インフルエンザに対するワクチン接種は、骨髄系細胞におけるＡＰ－１標的遺伝子座のクロマチンアクセシビリティの低下を誘発する。ワクチン接種によって誘発されたエピゲノム変化をより深く理解するために、ワクチン接種前後のＦＡＣＳ精製された自然免疫細胞サブセットのＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析を行った（図３ａ）。前処理後、５７個のユニークなサンプルの高品質のデータセットを保持した。ＴＩＶ誘発性エピゲノム変化の分子標的を同定するために、ワクチン接種後３０日目に、接種前０日目と比較して有意に変化したクロマチンアクセシビリティを有するゲノム領域を決定した。全体として、ＣＤ１４＋単球中に１０，０００超のアクセシビリティ変動クロマチン領域（ＤＡＲ）、及びｍＤＣ中に約４，５００のＤＡＲを検出したが、ｐＤＣではわずかな変化のみが示された（図３ｂ）。ＥｐｉＴＯＦによって検出されたヒストンアセチル化レベルの低下と一致して、単球及びｍＤＣ中のＤＡＲの大部分は、遺伝子活性の低下を示すクロマチンアクセシビリティの低下を示した（図３ｂ）。対照的に、抗生物質処理前の－２１日目と抗生物質処理中の０日目からのサンプルを比較したところ、クロマチンアクセシビリティに大きな変化は示されず（図１２ａ）、Ｄ０ｖＤ３０ ＤＡＲは、抗生物質対象と対照対象との間で良好に相関していた（図１２ｂ）。ＣＤ１４＋単球における上位２００のＤＡＲのうち、いくつかのサイトカイン及びケモカイン並びにそれらの関連する受容体（ＩＬ１８、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ３、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ－ＡＳ１）、病原体認識受容体（ＣＬＥＣ５Ａ、ＣＬＥＣ１７Ａ）、並びに接着分子（ＣＤ４４、ＣＤ３８）を含む、アクセシビリティが低下した多くの免疫関連遺伝子を同定した（図３ｃ）。また、Ｒａｓ－ＭＡＰＫ－ＡＰ－１シグナル伝達（ＲＡＰ２Ｂ、ＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ８、ＤＵＳＰ５）と関連する分子をコードする領域において、アクセシビリティの低下を観察した（図３ｃ）。重要なことに、エクスビボ再刺激中に低下した濃度を有する１０個のサイトカインのうち７個と関連するゲノム遺伝子座が、アクセシビリティの低下を示した（図２、図３ｃ、右パネル）。興味深いことに、これらの減少したＤＡＲは主に非プロモーター領域に位置しており（図３ｃ）、エンハンサーなどの遠位調節エレメントの関与を示唆していた。ＣＤ１４＋単球におけるＤＡＲのパスウェイ解析とそれに続くネットワーク解析とは、２つの支配的な生物学的テーマを決定した：ＴＬＲ及びサイトカインシグナル伝達、並びにゲノム再編成（図３ｄ）。ＴＬＲ及びサイトカインのクラスターは、クロマチンアクセシビリティがほとんど低下した経路で占められていたが、ゲノム再編成クラスターのタームが混在していた。注目すべきことに、Ｒａｓ及びＭＡＰＫシグナル伝達を中心としたシグナル伝達経路と関連するＤＡＲもまたエンリッチされた。
次に、調節パターンを同定するために、各細胞型で同定されたＤＡＲが転写因子（ＴＦ）結合モチーフについてエンリッチされているかどうかを決定した。実際、単球及びｍＤＣのＤＡＲにおいてｃ－Ｊｕｎ及びｃ－Ｆｏｓを含むＡＰ－１ファミリーのｂＺＩＰ ＴＦのエンリッチメントを観察し、かかるモチーフを持つＤＡＲは、特に非プロモーター領域で、ワクチン接種後のクロマチンアクセシビリティの平均的な低下を示した（図３ｅ）。古典的単球におけるＤＡＲの遺伝子セット解析はこの知見を更に確認し、３０日目にアクセシビリティが低下したＤＡＲにおいてｃ－Ｊｕｎの標的遺伝子の強力なエンリッチメントを示した（図３ｆ）。加えて、ワクチン接種後３０日目に、ｃ－Ｊｕｎを含むいくつかのＡＰ－１ファミリーメンバーの発現の低下を観察した（図３ｆ）。これまでのシステムワクチノロジー研究からのバルクトランスクリプトミクスを使用して、最大９つの独立したインフルエンザワクチン研究において低下したｃ－Ｊｕｎの発現を確認し、加えて、ＡＰ－１メンバーであるＪＵＮＤ、ＡＴＦ３、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ２、及びＦＯＳＢの発現低下も同定した（図３ｇ）。ヒストンアセチル化変化と同様に、ＡＰ－１ＴＦ発現の低下は、ワクチン接種後７日目に初めて検出され、２８日目に最も顕著であった（図３ｇ）。
この観察に基づいて、観察されたＡＰ－１アクセシビリティの低下が、ヒストンアセチル化の低下レベルに関連しているかどうかを検討した。これを試験するために、全てのサンプル中の全てのゲノム領域の正規化されたアクセシビリティレベルを、同じサンプルの古典的単球又はｍＤＣ中のヒストンマークレベルと相関させた。高度に相関するピーク（ｃｏｒｃｏｅｆ＞０．５）のエンリッチメント解析を使用して、ｃ－Ｆｏｓ及びｃ－Ｊｕｎを含む複数のＡＰ－１ファミリーメンバーの標的遺伝子の有意なエンリッチメントを同定した（図３ｈ）。
総合すると、これらの知見は、ヒストンアセチル化／ＰＡＤＩ４の減少とＡＰ－１のアクセシビリティの減少との間に因果関係がある可能性を示唆している。実際、以前の研究では、ＡＰ－１とヒストンアセチルトランスフェラーゼＣＢＰ／Ｐ３００との間の直接的な物理的相互作用と機能的共依存性とが記載されていた。ＡＰ－１活性とヒストンアセチル化が古典的単球においても機能的に関連しているかどうかを調べるために、図２と同じヒストンアセチル化とＰＡＤＩ活性の特異的阻害剤を使用してエクスビボ刺激実験を行った。ＡＰ－１活性を測定するために、活性化されたリン酸化形態のｃ－Ｊｕｎを検出することができる細胞内抗体染色を使用した。ＬＰＳ又はＲ８４８単独で処理すると、フローサイトメトリーによって容易に検出することができるｐ－ｃ－Ｊｕｎの堅牢な上方調節を誘発したが（図３ｉ、ｊ）、ヒストンアセチル化の低下をもたらすＡ－４８５又はＣｌ－アミジンで前処理すると、ｃ－Ｊｕｎの活性化は完全に消失した（図３ｉ、ｊ）。
総合すると、これらの結果は、ＴＩＶがまた、古典的単球及びｍＤＣにおけるクロマチンアクセシビリティの低下をもたらすことを実証する。アクセシビリティの低下は、主にＴＬＲ及びサイトカイン関連遺伝子と関連する領域と、ＡＰ－１ＴＦ結合モチーフを持つ領域とに見出される。更に、ＨＡＴ／ＰＡＤＩ活性はＡＰ－１活性化と因果関係がある。
季節性インフルエンザワクチン接種に対する自然応答の単一細胞エピゲノム及び転写ランドスケープ。トランスクリプトミクス及びプロテオミクスのアプローチを使用した以前の研究では、定常状態で単球及び樹状細胞集団内に十分な不均一性が検出された。しかしながら、この不均一性が、これらの細胞におけるエピゲノムランドスケープ及びワクチン接種に対するそれらの応答にどのように影響を与えるかは不明である。この疑問に答えるために、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用し、エピゲノム及び転写レベルでＴＩＶに対する自然免疫応答の単一細胞ランドスケープを構築した。ワクチン接種された個体からのＰＢＭＣを０日目、１日目、及び３０日目に単離し、フローサイトメトリーを使用してＤＣサブセットをエンリッチし、液滴ベースの単一細胞遺伝子発現及びクロマチンアクセシビリティプロファイリングを使用して解析した（図４ａ）。最初の前処理後、平均４，１２６個の一意にアクセス可能な断片を有する６２，１０１個の細胞からクロマチンアクセシビリティデータを得た。これらの細胞は、標準的な断片サイズ分布を示し、転写開始部位で高いシグナル対ノイズ比を示した。ＵＭＡＰ表現及びｃｈｒｏｍＶＡＲ ＴＦ逸脱パターンを使用して、自然免疫系のエピゲノムマップを生成し、古典的及び非古典的単球、ｍＤＣ、及びｐＤＣを含む、全ての主要な自然免疫細胞サブセットについてクラスターを同定した（図４ｂ）。これと並行して、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して遺伝子発現マップを構築した。前処理後、細胞当たり平均２，４７７個の遺伝子と８，９５１個のユニークな転写産物が検出された３４，３６８個の高品質トランスクリプトームを保持した。クラスタリングと組み合わせたＵＭＡＰ表現により、全ての主要な自然免疫細胞サブセットを同定することができた。全ての免疫細胞サブセットが、全てのワクチン条件及び対象において検出された。
まず、ｃｈｒｏｍＶＡＲを使用して、ＴＦクロマチンアクセシビリティのＴＩＶ誘発性変化を決定した。ＡＰ－１のアクセシビリティは、古典的単球及びｍＤＣ（ｃＤＣ１及びｃＤＣ２の両方）において、ワクチン接種後３０日目に強く低下し（図４ｃ）、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ（図３）で我々の知見を確認した。加えて、単一細胞データセットを使用して、ＡＰ－１のアクセシビリティの低下がワクチン接種後１日目という早期に始まることを観察し（図４ｃ）、ＴＩＶ誘発性エピゲノムリプログラミングがワクチン応答の急性期中にインプリントされることを示唆している。遺伝子レベルでは、ＡＴＦ３、ＪＵＮＤ、ＪＵＮＢ、ＦＯＳ、及びＦＯＳＬ２を含む複数のＡＰ－１メンバーの発現低下が観察された。
次に、ＴＩＶ誘発性エピゲノム変化に及ぼす細胞不均一性の影響を決定した。古典的単球のサブクラスタリング解析から、クロマチンアクセシビリティに基づく４つの異なる集団の存在が明らかになり（図４ｄ）、時間的パターンも異なっていた（図４ｅ）。クラスター６及び８は０日目に古典的単球プールを支配していたが、３０日目のほとんどの細胞はクラスター５に属していた（図４ｄ、ｅ）。注目すべきことに、古典的単球集団間で観察された不均一性は、ＡＰ－１、及びより低い程度ではあるがＣＥＢＰアクセシビリティの差によって引き起こされた（図４ｆ）。０日目に支配的であったクラスター（クラスター６及び８）は、ＡＰ－１のアクセシビリティが高かったが、３０日目に主に見出されたクラスター５の細胞はＡＰ－１で低かった（図４ｇ、ｈ）。クラスター３内の細胞は、中間ＡＰ－１及びＣＥＢＰアクセシビリティを呈し（図４ｇ）、それらの相対的な存在量はワクチン接種を通して安定していた（図４ｅ）。ホットスポットアルゴリズム（ＤｅＴｏｍａｓｏ ａｎｄ Ｙｏｓｅｆ，２０２０）を使用して、観察された不均一性の根底にあるゲノム領域のセットを決定した（図４ｉ）。このセットは、炎症誘発性サイトカイン及びＴＬＲシグナル伝達の産生と関連する領域についてエンリッチされており（図４ｊ）、ＡＰ－１メンバーであるＦＯＳ及びＪＵＮ、複数のＭＡＰキナーゼ、並びにＮＦＫＢと関連する領域を含んでいた。重要なことに、モチーフベースのｃｈｒｏｍＶＡＲ解析を使用した高いＡＰ－１アクセシビリティを有する細胞も、これらの炎症性ゲノム領域でも高いアクセシビリティを示した（図４ｈ、ｉ）。最後に、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを使用して、転写レベルで細胞の不均一性を決定した。ホットスポットモジュールの遺伝子は、単一の古典的単球間で発現にばらつきがあったが、この不均一性はエピゲノムランドスケープと比較してあまり明確ではなかった（図４ｋ）。
総合して、これらの知見は、ＡＰ－１アクセシビリティが古典的単球のプール内のエピゲノム不均一性を引き起こし、エピゲノムサブクラスターを規定していることを実証している。重要なことに、これらのエピゲノムサブクラスターの相対的な存在量の変化は、ワクチン接種後に観察されたＡＰ－１アクセシビリティのグローバルな低下と、ＡＰ－１が低く、炎症が少ないように見える細胞集団が３０日目に単球プールを支配していたこととが根底にある。
ＡＳ０３アジュバント併用Ｈ５Ｎ１インフルエンザワクチンは、骨髄系細胞におけるＡＰ－１遺伝子座のクロマチンアクセシビリティの低下を誘発する。不活化季節性インフルエンザワクチン接種が、ＡＰ－１遺伝子座のクロマチンアクセシビリティの低下、及びＨ３Ｋ２７ａｃの低下、及び骨髄系細胞によるＴＬＲ刺激に対する不応性を誘発する効果は予想外のことであり、「訓練された免疫」と称される、ワクチン接種に対する増強された持続的な先天性応答を示した弱毒化ＢＣＧ生ワクチン接種を用いた以前の研究とは矛盾するように見える。これにより、ＢＣＧ生ワクチンが骨髄系細胞の持続的なエピゲノム変化を刺激する強力なアジュバントシグナルを送達したのに対して、本研究で使用された季節性インフルエンザワクチンは、アジュバントを含まない不活化ワクチンであり、訓練された免疫を刺激することはできず、むしろ訓練された寛容の形態を誘発した可能性が生じた。したがって、不活化インフルエンザワクチンへのアジュバントの添加が、エピゲノム免疫細胞のランドスケープにどのような影響を与えるのかを検討した。アジュバントは、ワクチン接種中に自然免疫系を強く活性化するようにデザインされた刺激剤である。ＡＳ０３は、スクアレン系アジュバントであり、強い自然免疫応答及び適応免疫応答を誘発し、認可されたＨ５Ｎ１トリインフルエンザワクチンに含まれる。ここで、ＡＳ０３の有無にかかわらず投与された不活化Ｈ５Ｎ１インフルエンザワクチンでワクチン接種された健常な個体のコホートにおけるエピゲノム免疫細胞ランドスケープに対するＡＳ０３の効果を調べた（図５ａ）。ワクチンをプライムブースト方式で投与し、個体は０日目及び２１日目に注射を受けた。
まず、ＡＳ０３の存在が、ＴＩＶでのワクチン接種後に観察されたワクチン誘発性クロマチンマーク変化にどのような影響を及ぼすかを検討した。ＥｐｉＴＯＦを使用して、１８人のワクチン接種された対象（９Ｈ５Ｎ１、９Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３）からの０、７、２１、２８、及び４２日目のＰＢＭＣサンプルを解析し、ヒストン修飾プロファイルのランドスケープを構築した（図５ｂ、図１３ａ）。予想外なことに、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３のワクチン接種により、ＴＩＶ後の骨髄系リプログラミングと関連する５つの高相関マークのうちの４つである、古典的単球におけるＨ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、及びＰＡＤＩ４の有意な低下が誘発されたことを観察した（図５ｃ）。対照的に、Ｈ５Ｎ１単独でのワクチン接種では、これらのクロマチンマークに有意な変化を誘発しなかった。これらの知見と一致して、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３群ではＨ５Ｎ１群とは異なり、ＴＩＶワクチン接種後に減少した自然免疫性サイトカイン及びケモカインのほとんどの産生が有意に減少していることも観察した（図５ｄ）。注目すべきことに、ＰＢＭＣ混合物内の古典的単球の頻度又は生存率の変化は検出せず、これらのサイトカインの全てはＴＬＲ刺激によって強く誘発された（図１３ａ、ｂ）。
次に、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用して、このコホートからの対象を解析した。４人のワクチン接種された個体（２Ｈ５Ｎ１、２Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３）からの０日目、２１日目、及び４２日目のＰＢＭＣサンプルを、フローサイトメトリーを使用してＤＣサブセットをエンリッチし、液滴ベースの単一細胞遺伝子発現及びクロマチンアクセシビリティプロファイリングを使用して解析した（図５ａ）。最初の前処理後、平均２，７４５個の一意にアクセス可能な断片を有する５８，２０４個の細胞から高品質のクロマチンアクセシビリティデータを得て、これを使用してＨ５Ｎ１ワクチン接種中の単一免疫細胞ランドスケープのエピゲノムマップを生成した（図５ｅ）。並行して、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、単一の免疫細胞ランドスケープの遺伝子発現マップを構築した。細胞当たり平均２，４６２個の遺伝子と９，５６９個のユニークな転写産物が検出された１１，２１３個の高品質トランスクリプトームを保持し、全ての主要な自然免疫細胞サブセットを同定した（図５ｃ）。異なる免疫細胞サブセットが、全てのワクチン条件及び時点にわたって均等に分布していた。
注目すべきことに、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑデータを使用して、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３ではＡＰ－１アクセシビリティの有意な低下が観察されたが、Ｈ５Ｎ１単独では観察されなかった（図５ｆ）。ライブラリサイズの差を補正するロジスティック回帰モデルを使用して、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３後のエピゲノム変化の性質を更に調べるために、ワクチン接種後４２日目に、０日目と比較したアクセシビリティ変動クロマチン領域を決定した。過剰表現解析を使用して、ＴＩＶと同様に、主に陰性ＤＡＲが、ＴＬＲ－、及びサイトカインシグナル伝達経路、並びに自然免疫活性についてエンリッチされていることを見出した（図５ｇ）。加えて、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、ＴＩＶでのワクチン接種後に観察されたように、ｃ－Ｆｏｓ及びｃ－Ｊｕｎを含む複数のＡＰ－１ファミリーメンバーの発現低下を観察した（図５ｈ）。総合すると、これらの知見は、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３でのワクチン接種が、ＴＩＶでのワクチン接種後に観察されたものと非常によく似たエピゲノム変化を誘発する一方で、Ｈ５Ｎ１単独でのワクチン接種は、エピゲノムランドスケープにわずかな変化しか引き起こさないことが示唆される。
ＡＳ０３アジュバント併用Ｈ５Ｎ１インフルエンザワクチンは、抗ウイルス応答遺伝子座のクロマチンアクセシビリティの増加を誘発する。ＡＰ－１アクセシビリティの低下にもかかわらず、インターフェロン応答因子（ＩＲＦ）及びＳＴＡＴファミリーのいくつかのＴＦについては、０日目と比較して４２日目でクロマチンアクセシビリティの増加を観察した（図６ａ）。これらの変化は、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３でワクチン接種された対象の自然細胞集団において観察されたが、Ｈ５Ｎ１単独では観察されなかった。動態の更なる解析により、これらのＩＲＦ及びＳＴＡＴに関連した変化が、２１日目の最初のワクチンの投与後に既に存在していることが明らかになった（図６ｂ）。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを使用して、プライム（２１日目）又はブースト（４２日目）ワクチン接種前後の発現又はＩＲＦ及びＳＴＡＴファミリーＴＦを比較した。Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３ワクチン接種後、複数の自然免疫細胞サブセットにおいてＩＲＦ１及びＳＴＡＴ１の発現の有意な増加を観察したが、Ｈ５Ｎ１単独では観察されなかった（図６ｃ）。注目すべきことに、単一細胞レベルでは、ＩＲＦアクセシビリティは、特に樹状細胞において、ＡＰ－１アクセシビリティと概して負の相関があった（図６ｄ）。次に、ＩＲＦ１結合モチーフを含有するピークのクロマチンアクセシビリティの対数倍率変化を決定した（図６ｅ）。実際、多くのピークでアクセシビリティの有意な変化が観察され、そのほとんどがアクセシビリティの増加を示した（図６ｅ）。重要なことに、アクセシビリティが増加した遺伝子の中で、ＤＤＸ５８（ウイルス検出器ＲＩＧ－Ｉをコードする）、いくつかのインターフェロン応答遺伝子（ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩ３０、ＩＳＧ２０、ＯＡＳＬ）、並びに転写因子ＩＲＦ１及びＩＲＦ８を含む、多くのインターフェロン及び抗ウイルス関連遺伝子を同定した。エンリッチメント解析は、抗ウイルス免疫に関連する遺伝子のエンリッチメントを更に実証した（図６ｄ）。ＩＲＦ１は、ＳＴＡＴ１及びＩＲＦ８とともに、インターフェロンγ曝露に応答した単球の分極化を調整し（Ｌａｎｇｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ＪＡＫ／ＴＹＫを介したＩＦＮシグナル伝達は、ＩＲＦ及びＳＴＡＴＴＦのリン酸化をもたらす（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。実際、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３のプライム及びブーストワクチン接種の直後、ワクチン接種された対象の血漿中のＩＦＮガンマレベルの増加が観察されたが、Ｈ５Ｎ１単独では観察されなかった（図６ｇ）。ＩＦＮシグナル伝達に応答して単球によって産生されるサイトカインであるＩＰ１０のレベルも上昇した（図６ｇ）。これは、ＩＦＮシグナル伝達がＩＲＦアクセシビリティの増加を誘発した可能性を示唆し得る。
次に、観察されたエピゲノム変化が遺伝子発現の変化に変換されたかどうかを決定した。ＩＲＦ１モチーフを有する有意に変化したピークのアクセシビリティの変化を、同じ遺伝子の遺伝子発現の変化と相関させた（図６ｈ）。注目すべきことに、アクセシビリティの変化と遺伝子発現との間には、有意ではあるが弱い正の関連が検出され（Ｒ＝０．０８２、ｐ＝０１７）、これは、アクセシビリティの増加が、これらの細胞における恒常的な遺伝子発現には限定的な影響しか与えないことを示す。代わりに、クロマチンアクセシビリティの変化が、ウイルス刺激に対する誘発応答を増強している可能性がある。この仮説を検証するために、５０人（１６人のＨ５Ｎ１、３４人のＨ５Ｎ１＋ＡＳ０３）のワクチン接種された対象から、プライムワクチン接種（０日目、１日目、３日目、７日目）及びブースターワクチン接種（２１日目、２２日目、２４日目、２８日目）の前後の時点におけるバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータを解析した。予想されるように、各ワクチン接種後１日目に、特にＨ５Ｎ１＋ＡＳ０３を投与された群において、抗ウイルス及びインターフェロン関連遺伝子が上方制御された（図６ｉ）。重要なことに、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３ブースターワクチン接種を受けた対象（２２日目対２１日目）は、プライムワクチンに対する応答（１日目対０日目）と比較して更に高いレベルの抗ウイルス遺伝子発現を示した（図６ｉ）。ブースターワクチンは、自然免疫系のクロマチンアクセシビリティのランドスケープが変化したときに接種されたことから、ＩＲＦ遺伝子座におけるアクセシビリティの増加が、ブースターワクチンに対する増強された応答を可能にし得ることを示唆した。この仮説を更に検証するために、プライムと比較したブースター中の抗ウイルス及びインターフェロン関連遺伝子の遺伝子発現の増加を、０日目と比較した２１日目のクロマチンアクセシビリティの変化と比較した（図６ｊ）。実際、両方の変数の間に非常に有意な関連性が観察され（カイ二乗ｐ値＝０．０１）、ブースターワクチン接種後に発現が増加した遺伝子のほとんどは、ブースターワクチン投与時にクロマチンアクセシビリティの増加も示した。アクセシビリティが増加し発現が増強した遺伝子は、ＩＲＦ１転写因子標的遺伝子がエンリッチされていた（図６ｋ）これらの観察と一致して、また、プライムワクチン接種と比較してブースター後の個体の血漿中のＩＰ－１０及びＩＦＮγのレベルの上昇を観察した（図６ｇ）。
観察されたエピゲノム変化がウイルス感染に対する抵抗性の増強をもたらしたかどうかを決定するために、０日目、２１日目及び４２日目にデング又はジカウイルスでＰＢＭＣを感染させた（図７ａ）。感染後、細胞を０、２４、及び４８時間培養し、ｑＰＣＲを使用してウイルスコピー数を決定した（図７ｂ）。ジカ及びデングウイルスのコピー数は、宿主細胞の感染、複製、及び最終的には死滅という予想されるサイクルに従って、２４時間後には増加し、４８時間には減少することが観察された（図７ｃ）。次に、ワクチン接種後２１日目及び４２日目のウイルス力価を、各対象についてワクチン接種前０日目の力価と比較した。顕著なことに、ワクチン接種後２１日目に、デング及びジカウイルスの両方でウイルス力価の有意な低下が観察された（図７ｄ）。重要なことに、多くの対象において、最初のワクチン接種後４２日目までにウイルス力価の低下が観察された（図７ｄ）。次に、ＥＬＩＳＡを使用して、感染後２４時間の感染ＰＢＭＣ培養物のサイトカイン産生を決定した（図７ｅ）。デング及びジカウイルスは、ＩＦＮａとＩＦＮｇとの両方の産生を誘発したが、デングウイルスはＩＰ１０の産生を抑制することを観察した（図７ｅ）。最後に、ｄ２１と比較したｄ０のウイルス力価の変化を、オープンクロマチンと関連する抗ウイルス遺伝子のワクチン誘発発現の変化と相関させた（図６ｊの赤色の象限）。これらの遺伝子の大部分は、ウイルス力価と負の相関を示した（図７ｆ）。顕著なことに、ＩＲＦ１は、デング及びジカの両方の力価と負の相関を有する（ｒ＜－０．８）上位遺伝子の１つであり（図７ｆ）、２１日目にＩＲＦ１発現が増強された対象は、同じ時点でウイルス力価が低下していたことを示した（図７ｇ）。加えて、デング及びチクングニア感染症の両方に対する免疫に関与する抗ウイルス遺伝子ＡＮＫＲＤ２２（Ｓｏａｒｅｓ－Ｓｃｈａｎｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９）は、ジカ及びデングの力価とも非常に負の相関があった。
総合すると、これらのデータは、ＡＰ－１ベースの抑制が存在するにもかかわらず、ＡＳ０３が抗ウイルス免疫の増強というエピゲノム状態を誘発し、インターフェロンの産生を増加させ、異種ウイルス感染の制御を高めることができる。
ここで、ヒトにおける３つの異なるインフルエンザワクチンに対する免疫の単一細胞エピゲノムランドスケープを構築するために、いくつかのバルク及び単一細胞アプローチを使用した。我々の結果は、季節性インフルエンザワクチンＴＩＶ及びパンデミックインフルエンザワクチンＨ５Ｎ１＋ＡＳ０３の２つのワクチンが、末梢性免疫系、特に骨髄系区画において大きなかつ持続的なグローバルエピゲノム変化を誘発し、これらのエピゲノム変化が、インビトロ及びインビボでの再刺激時に免疫細胞の機能を変化させることを実証している。観察された変化は、ワクチン接種後３～４週間で最も顕著であったが、変化したエピゲノムランドスケープの痕跡は、最初のワクチン接種から１８０日後でも依然として検出された。注目すべきことに、単一細胞解析により、これらの変化が、単球集団内のこれまでに認識されていなかったエピゲノム基質によって引き起こされていることが明らかになった。
それらの分子的及び機能的特徴に基づいて、観察されるエピゲノム変化は、２つの異なるタイプに大別することができる：１）ヒストンアセチル化の低減、ＰＡＤＩ４レベルの低減、ＡＰ－１アクセシビリティの低減、及び自然免疫サイトカインの産生の低減によって特徴付けられる自然免疫不応性の状態；２）ＩＲＦアクセシビリティの増加、抗ウイルス遺伝子発現の増加、インターフェロン産生の増加、及び最も重要なこととして異種ウイルス感染の制御強化によって定義される抗ウイルス警戒の高まった状態。重要なことに、両方の状態は同時に同じ単一細胞内で生じる。一見逆説的ではあるが、この重ね合わせは、ウイルス感染に対する免疫学的警戒状態を維持しながら、感染後期における過剰な炎症性宿主損傷を回避するための進化的適応を表している可能性がある。
研究者らは、結核に対する弱毒化ＢＣＧ生ワクチンが、これらの細胞におけるサイトカイン産生の強化と一致するＣＤ１４＋単球におけるＨ３Ｋ２７ａｃレベルの上昇を誘発することを以前に観察していたため、我々の知見は予想外であった。対照的に、我々の結果は、免疫細胞のワクチン誘発性エピゲノムリプログラミングがより複雑であることを示唆している。この研究では、免疫不応性に関連してＨ３Ｋ２７ａｃレベルの低下が観察されたことを考慮すると、ヒストンアセチル化が、単一細胞レベルでエピゲノム基質を動力源として、サーモスタットダイヤルと同様に、単球のサイトカイン産生を適宜操作するために上げ下げすることができる双方向の調節因子を表す可能性がある。加えて、我々のデータは、抗ウイルス警戒及び免疫不応性などの複数の異なるエピゲノム状態が同じ細胞内で重ね合わせられることを実証している。これは、異なるクロマチン遺伝子座の独立した調整が、異なる免疫学的プロセスを並行して媒介することを可能にする、微細で区画化されたリプログラミングプロセスを示唆している。重要なことに、この重ね合わせは、単一の単球及び樹状細胞がＩＲＦの上昇とＡＰ－１アクセシビリティの減少とを同時に示したことから、単一細胞レベルでコードされている。
単一細胞解析では、クロマチンアクセシビリティの差に基づいて、古典的単球集団内の複数のクラスターが更に明らかになった。注目すべきことに、これらのエピゲノムサブクラスターは全てワクチン接種前から存在し、ワクチン接種の過程で循環細胞のプール内のそれらの存在量が変化し、観察されたバルクレベルの変化を引き起こした。観察された不均一性の根底にある転写因子ファミリー、ＡＰ－１及びＣＥＢＰは、それぞれ、単球からマクロファージへの分化と、古典的単球から非古典単球への分化における主要な担い手であることが以前に記載されていた。ＡＰ－１は炎症の中心的な調節因子でもあり、我々のホットスポット解析は、エピゲノムサブクラスター間で炎症遺伝子座におけるアクセシビリティに差があることを明らかにした。これは、異なる機能的及び個体発生的運命が、単一の単球のエピゲノム内にインプリントされている可能性を示唆し得る。実際、古典的単球は、組織浸潤及びマクロファージ分化に事前にコミットした細胞もあれば、非古典的単球への分化をプライミングする細胞もある、異種の細胞集団を表すという仮説が立てられた。
我々のシステム生物学的解析はまた、ワクチン誘発性エピゲノムリプログラミングのＣＤ１４＋単球に焦点を当てた現在の理解を、自然免疫系の他の循環細胞への洞察を伴って拡張するものである。以前は、ＣＤ１４－単球又は樹状細胞がヒトのワクチン接種後にエピゲノム変化を呈するかどうかは知られていなかった。ここで、インフルエンザワクチン接種が、古典的単球と多くの分子的特徴を共有するｍＤＣにおいても持続的なエピゲノム変化を誘発することを示す。対照的に、非古典的ＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球及びｐＤＣは、それらのエピゲノム状態について、それほど顕著ではなく、より短命な変化を示した。
エピゲノム変化を引き起こす分子メカニズムに関して、抗ウイルス警戒状態が、ＩＲＦ１及びＳＴＡＴ１活性の増強と関連していることが観察された。ＩＲＦ及びＳＴＡＴシグナル伝達が抗ウイルス免疫を促進し、ＩＲＦ１又はＳＴＡＴ１を欠くＫＯモデルはウイルス感染に対してより感受性があることが確立されている。対照的に、免疫不応性の状態は、ヒストンアセチル化及びクロマチンアクセシビリティのグローバルな低下と関連していた。観察された変化の大きさは、クロマチンが広範囲に制限された状態へと包括的に切り替わることを示唆している。我々のＴＦモチーフベースの解析から、特にＡＰ－１遺伝子座がこのプロセスの影響を受けていることが明らかになった。ＡＰ－１は、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＡＴＦ、及びＪＤＰファミリーの異なるメンバーで構成される二量体ＴＦであり、我々の遺伝子発現解析では、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、及びＡＴＦ３を含む複数のメンバーが関与していることを示唆している。骨髄系細胞における分化、炎症、及び分極化の主要な調節因子であるＡＰ－１の役割はよく説明されているが、最近の研究でも中心的なエピゲノム調節因子として位置付けられている。
生物学的観点から、エピゲノム状態と免疫防御との間の直接的な関連を示す複数の観察結果が得られた。Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３ワクチンからの我々の結果は、ワクチン接種された個体からのＰＢＭＣが、ワクチン接種前のＰＢＭＣよりも異種のデング及びジカウイルスの感染をより効率的に制御することを明らかにした。これらの結果は、抗ウイルス遺伝子の発現の増強、並びにインビボでのＩＰ－１０及びＩＦＮγ産生のレベルの増加と組み合わせて、抗ウイルス警戒のエピゲノム状態が、ワクチンウイルスとは無関係のウイルス感染に対する非特異的な防御を提供することができることを示している。対照的に、ＴＩＶはワクチン接種後４週間で免疫不応性の深刻な状態を誘発した。これは、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３とは対照的に、ＴＩＶによるワクチン接種がワクチン接種後の感染に対する感受性を潜在的に増加させる可能性があることを示唆している。ＴＩＶがインフルエンザを予防しているという十分なエビデンスがあり、我々の研究では堅牢な抗インフルエンザ抗体価の誘発が見出されたことを強調することが重要である。観察された免疫不応性を考慮すると、ＡＳ０３などのアジュバントとともにＴＩＶを投与することが有益であり得る。このアジュバント併用ＴＩＶは、エピゲノミクス主導の抗ウイルス警戒状態により、誘発された免疫不応性を克服するであろう。実際、４３，０００人超の高齢者個体におけるＴＩＶ対ＴＩＶ＋ＡＳ０３の応答を比較した第３相臨床試験では、ＴＩＶ＋ＡＳ０３がＴＩＶ単独と比較して全死因死亡及び肺炎の大幅な減少をもたらしたが、インフルエンザ特異的免疫はわずかに増加しただけであることが実証された。その後のプラセボ対照二重盲検試験が、臨床的利益を確実に証明するために必要であるが、我々の結果は、エピゲノムリプログラミングによって非特異的防御を提供するアジュバントのこれまで知られていなかった作用機序を実証している。
結論として、３つの異なるインフルエンザワクチンによるワクチン接種が、エピゲノム免疫細胞ランドスケープを単一細胞レベルでどのように変化させるかを調べた。我々の結果は、インフルエンザワクチンが持続的なエピゲノム変化を誘発し、単一細胞レベルでの機能的免疫細胞プロファイルの変化を引き起こし、非ワクチンウイルスに対する異種防御を可能にすることを実証している。我々の知見は、将来のワクチンのデザインに重要な示唆を与えるとともに、エピゲノムランドスケープを操作することによって広範に特異的な防御を提供する「エピゲノム」アジュバントの開発を提供する。
実験対象の詳細
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ＴＩＶ．研究デザインは、原著（Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）の第１相に記載されているとおりであり、研究はジョージア州アトランタで行われた。簡潔に言うと、２０１４～２０１５年のシーズン中に、合計２１人の健常な成人を登録し、抗生物質治療群（ｎ＝１０）と対照群（ｎ＝１１）に無作為に割り付けた。対象は、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０２１５４０６１）に記載されている適格性基準を満たした１８～４０歳の男性及び妊娠していない女性であった。対象の属性をリストアップしている。抗生物質治療は、ネオマイシン、バンコマイシン、及びメトロニダゾールのカクテルからなり、全て５日間経口投与した。抗生物質治療は、ワクチン接種日の３日前から開始し、抗生物質治療群についてはその翌日まで継続した。研究参加者は全員、２０１４～２０１５シーズンの間にＦｌｕｚｏｎｅでワクチン接種された。各対象から書面によるインフォームドコンセントを得て、エモリー大学の施設内倫理審査委員会によってプロトコルが承認された。
Ｈ５Ｎ１／Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３。この研究は、ジョージア州アトランタで行われた。対象は、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ ０１９１０５１９）に記載されている適格性基準を満たした男性及び妊娠していない女性であった。合計５０人の健常な成人を登録し、アジュバント併用（Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３、ｎ＝３４）又はアジュバント非併用（Ｈ５Ｎ１、ｎ＝１６）のＧＳＫトリインフルエンザワクチンのいずれかを受けている２つの群に無作為に割り付けた。対象の属性をリストアップしている。各対象から書面によるインフォームドコンセントを得て、エモリー大学の施設内倫理審査委員会によってプロトコルが承認された。
インビトロ刺激及び細胞内フローサイトメトリー実験。健常な対象からのサンプルは、スタンフォード血液センターで採取されたか、又は以前のワクチン接種試験のワクチン接種前時点に由来した（Ｎａｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。全ての対象は、機密の病歴カードを提供し、臨床用又は研究目的で血液を提供するインフォームドコンセントを完了した。ＨＩＶ、及び肝炎感染を含むがこれらに限定されない、既知の疾患を有する対象は除外する。全血からのバフィーコート又はＬＲＳ室の精製をスタンフォード血液センターで行い、ＰＢＭＣ単離前に白血球をエンリッチした。
本論文では、ワクチン接種試験（Ｎａｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）より、２６～４１歳の対象からのサンプルのみを選択した。サンプルは、０日目のワクチン接種前の時点からのみ選択した。エモリー大学施設内倫理審査委員会の施設内倫理審査と承認とを得て、各対象から書面によるインフォームドコンセントを得た。
方法の詳細
細胞、血漿及びＲＮＡ単離。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び血漿を、製造元のプロトコルに従って、新鮮な血液（ＣＰＴ；クエン酸ナトリウムを含むＶａｃｕｔａｉｎｅｒ；ＢＤ）から単離した。スタンフォード血液センターからのサンプルについては、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７－１４４０－０２）を使用したＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により、全血、バフィーコート又はＬＲＳ室からＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＳＯ中で凍結し、－８０℃で保存し、次いで翌日に液体窒素凍結装置（－１９６℃）に移した。ＣＰＴからの血漿サンプルを－８０℃で保存した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、新鮮なＰＢＭＣを溶解し（１ｍＬのＴｒｉｚｏｌで約１．５×１０６個の細胞）、ＲＮＡを分解から保護した。Ｔｒｉｚｏｌサンプルを－８０℃で保存した。
マスサイトメトリーサンプル処理、染色、バーコード化、及びデータ取得。凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で処理前に３７℃で１時間インキュベートした。シスプラチン（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１０μＭの最終濃度になるように添加し、ＣｙＴＯＦ緩衝液（１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）、０．０５％アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））でクエンチする前に５分間生存率染色を行った。細胞を４００ｇで８分間遠心分離し、Ｆｃ受容体遮断薬（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有するＣｙＴＯＦ緩衝液中で３０分間、室温（ＲＴ）にて免疫表現型マーカーに対するランタニド標識抗体で染色した。細胞外マーカー染色後、細胞をＣｙＴＯＦ緩衝液で３回洗浄し、室温で１５分間、１．６％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１０６細胞／ｍｌで固定した。細胞を固定後５分間６００ｇで遠心分離し、４℃で２０分間、１ｍｌの氷冷メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で透過処理した。４ｍｌのＣｙＴＯＦ緩衝液を添加して透過処理を停止し、続いて２回のＰＢＳ洗浄を行った。Ｍａｓｓ－ｔａｇサンプルバーコーディングを、製造元のプロトコル（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に従って行った。次いで、個々のサンプルを組み合わせ、Ｆｃ受容体遮断薬（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有するＣｙＴＯＦ緩衝液中、細胞内抗体で４℃にて一晩染色した。翌日、細胞をＣｙＴＯＦ緩衝液で２回洗浄し、室温で３０分間、１．６％ＰＦＡを含むＰＢＳ中２５０ｎＭ １９１／１９３Ｉｒ ＤＮＡインターカレーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で染色した。細胞をＣｙＴＯＦ緩衝液で２回、二重脱イオン水（ｄｄＨ２Ｏ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で１回洗浄し、続いて３５μｍストレーナーで濾過して除去した。
バルク刺激実験。上記のＥｐｉＴＯＦ実験からの解凍したＰＢＭＣのアリコートを洗浄し、１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５－０１１－ＣＶ）及び１×抗生物質／抗真菌剤（Ｌｏｎｚａ、１７－６０２Ｅ）￥［完全培地ａｂｘ］を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０４０－ＣＶ）中に４×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。１００μＬの細胞溶液を９６ウェルの丸底組織培養プレートの各ウェルに添加し、１００μＬの完全培地ａｂｘ（無刺激）、細菌性病原体を模倣する合成ＴＬＲリガンドのカクテル（ｂａｃ：０．０２５μｇ／ｍＬのＬＰＳ、０．３μｇ／ｍＬのフラジェリン、１０μｇ／ｍＬのＰａｍ３ＣＳＫ４）、又はウイルス病原体を模倣する合成ＴＬＲリガンドのカクテル（ｖｉｒ：４μｇ／ｍＬのＲ８４８、２５μｇ／ｍＬのｐＩ：Ｃ）のいずれかと混合した。細胞数に応じて、各サンプルからのＰＢＭＣを、３つの条件全てで二重に刺激した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、細胞をスピンダウンし、上清を新しいプレートに慎重に移し、Ｌｕｍｉｎｅｘを使用して更に解析するまで、直ちに－８０℃で凍結した。
Ｌｕｍｉｎｅｘ ＴＩＶ。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイは、スタンフォード大学のヒト免疫モニタリングセンターによって行われた。ヒト６２－プレックスカスタムＰｒｏｃａｒｔａプレックスキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造元の推奨に従って、以下のように変更して使用した：簡潔に述べると、抗体結合磁性マイクロビーズを、Ｒａｄｉｘ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓによって、カスタムアッセイコントロールマイクロビーズ（Ａｓｓａｙ Ｃｈｅｘ）とともに９６ウェルプレートに添加した。プレートをＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５磁気洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で洗浄した。純粋な細胞培養上清（２５μｌ）及びアッセイ緩衝液（２５μｌ）を、抗体結合磁性マイクロビーズを含有する９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて４℃で一晩インキュベートした。室温及び４℃のインキュベーションステップを、５００～６００ｒｐｍのオービタルシェーカーで行った。一晩インキュベーションした後、プレートをＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で洗浄し、次いでキット付属のビオチン化検出Ａｂミックスを添加し、室温で６０分間インキュベートした。各プレートを上記のように洗浄し、キット付属のストレプトアビジン－ＰＥを添加した。室温で３０分間インキュベートした後、上記のように洗浄を行い、キットリーディング緩衝液をウェルに添加した。各サンプルを、細胞数が許容される２つのテクニカルレプリケートで測定した。プレートを、ＦｌｅｘＭａｐ ３Ｄ機器（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して読み取った。ビーズカウント＜５０のウェルにフラグを付け、ビーズカウント＜２０のデータを除外した。
Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｈ５Ｎ１／Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３。このアッセイは、スタンフォード大学のヒト免疫モニタリングセンターによって行われた。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅキットのカスタム４１プレックスが組み立てられ、以下のものが含まれていた：１．予め混合された３８プレックスＭｉｌｌｉｐｌｅｘヒトサイトカイン／ケモカインキット（カタログ番号ＨＣＹＴＭＡＧ－６０Ｋ－ＰＸ３８）２。ＥＮＡ７８／ＣＸＣＬ５（カタログ番号ＨＣＹＰ２ＭＡＧ－６２Ｋ－０１）３。ＩＬ－２２（カタログ番号ＨＴＨ１７ＭＡＧ－１４Ｋ－０１）。４．ＩＬ－１８（ＨＩＬ１８ＭＡＧ－６６Ｋ）。製造元の推奨に従い、記載された修正を行った。簡潔に述べると、純粋な上清サンプル（２５ｕｌ）を、アッセイ緩衝液を含有する９６ウェルプレート中で、抗体結合磁気ビーズと混合し、４℃で一晩インキュベーションした。冷温及び室温インキュベーションステップを、５００～６００ｒｐｍのオービタルシェーカーで行った。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５磁気洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で洗浄緩衝液により２回洗浄した。ビオチン化検出抗体と室温で１時間インキュベートした後、ストレプトアビジン－ＰＥを３０分間添加した。プレートを上記のように洗浄し、ＰＢＳをウェルに添加し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭａｐ３Ｄ機器でサイトカイン当たり１サンプル当たり５０ビーズを下限として読み取った。各サンプルを、細胞数が許容される二重ウェルで測定した。カスタムアッセイＣｈｅｘ対照ビーズを全てのウェル（Ｒａｄｉｘ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に添加した。ビーズカウント＜５０のウェルにフラグを付け、ビーズカウント＜２０のデータを除外した。
Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体コンジュゲーション。α－Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体を、製造元の指示（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、３２２－００１０）に従って、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ Ｒａｐｉｄ ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８抗体標識キットを使用して標識した。簡潔に言うと、１００μｇの抗体を１０μＬのＬＬ－Ｒａｐｉｄ修飾剤試薬と混合し、凍結乾燥した色素に添加した。混合後、溶液を暗所で一晩室温にてインキュベートした。翌朝、１０μＬのＬＬ－Ｒａｐｉｄクエンチャー試薬を添加した。
インビトロ刺激及び細胞内フローサイトメトリー実験。凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、カウントし、４×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５－０１１－ＣＶ）￥［完全培地］を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０４０－ＣＶ）に再懸濁した。次に、１５０μＬの細胞懸濁液（６×１０５個の細胞）を９６ウェルの丸底組織培養プレートの各ウェルに添加し、完全培地中のトリコスタチンＡ（ＴＳＡ；ＣＳＴ、９９５０Ｓ）、Ａ－４８５（Ｔｏｃｒｉｓ、６３８７）、又はＣｌ－アミジン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５０６２８２）のいずれかを含有する５０μＬの阻害剤溶液と混合した。３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベーションした後、ＬＰＳ（０．０２５μｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｔｌｒｌ－ｐｂ５ｌｐｓ）又はＲ８４８（４μｇ／ｍＬ；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡＬＸ－４２０－０３８－Ｍ００５）のいずれかを培養物に添加することによって、細胞を刺激した。更に２時間インキュベーションした後、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ７６５１－５Ｍｇ）を全ての培養物に添加し、細胞を最終的に４時間インキュベーションした。合計８時間インキュベーションした後、細胞を１５０μＬのＰＢＳ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＨ３０２５６．ＬＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ ＵＶ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（１：１０００；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１０８）１００μＬ使用して生存率のために染色した。暗所で４℃にて３０分間インキュベーションした後、細胞を１５０μＬのＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳ、ＥＤＴＡ（２ｍＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、４６－０３４－ｃｌ）、及びヒトＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ４３８６－５Ｇ）￥［完全培地］を補充した１００μＬのＰＢＳにより、暗所で１５分間ブロックした。インキュベーション後、細胞を、α－ＣＤ１４ ＢＵＶ８０５、α－ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０ ＢＵＶ７３７、α－ＣＤ１２３ ＢＵＶ３９５、α－ＨＬＡ－ＤＲ ＢＶ７８５、α－ＣＤ１６ ＢＶ６０５、α－ＣＤ５６ ＰＥ－ＣＹ７、α－ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０を含有する１００μＬの抗体カクテルにより、暗所で４℃にて２０分間ブロッキング緩衝液中で表面マーカーのために染色した。次に、細胞を１５０μＬのＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３固定／透過処理溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、００－５５２３－００）中、暗所で４℃にて３０分間固定した。その後、細胞を１００μＬのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３透過処理緩衝液で２回洗浄し、ヒトＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬの透過処理緩衝液により暗所で４℃にて一晩ブロックした。細胞を洗浄し、α－ＩＬ－１ｂ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、α－Ｈ３Ｋ２７ａｃ ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、α－ＴＮＦａ ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ、α－ｐ－ｃ－Ｊｕｎ ＰＥ、及びα－Ｈ３ ＡＦ６４７を含有する抗体カクテル２５μＬにより、ヒトＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を含有する透過処理緩衝液中、暗所で４℃にて６０分間、細胞内マーカーのために染色した。最後に、細胞を１５０μＬの透過処理緩衝液で２回洗浄し、０．５％ＦＢＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡ￥［ＦＡＣＳ緩衝液］を含有する１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターを使用してデータ取得した。Ｆｌｏｗｊｏ Ｘソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。簡潔に述べると、細胞はＦＳＣ／ＳＳＣで同定され、タブレットはＳＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ｈ及びＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈゲートで廃棄され、死細胞はＺｏｍｂｉｅ ＵＶ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｈｉｇｈとして廃棄された。次いで、単球をＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ２０－及びＣＤ１４＋として同定した。
ＦＡＣＳソーティング－バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ／ＲＮＡ－ｓｅｑ。凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、カウントし、ＰＢＳ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＨ３０２５６．ＬＳ）に再懸濁した。５～１０×１０６個の細胞を２ｍＬのＰＢＳで再度洗浄し、ＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ ＵＶ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（１：１０００；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１０８）５００μＬを使用して生存率のために染色した。暗所で４℃にて３０分間インキュベートした後、細胞を２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５００μＬのブロッキング緩衝液に再懸濁した。細胞をスピンダウンした後、上清を廃棄し、細胞を、ブロッキング緩衝液中のα－ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０ ＢＵＶ７３７、α－ＣＤ１２３ ＢＵＶ３９５、α－ＨＬＡ－ＤＲ ＢＶ７８５、α－ＣＤ１４ ＢＶ６０５、α－ＣＤ５６ ＢＶ５１０、α－ＣＤ１ｃ ＢＶ４２１、α－ＣＤ３２７ ＡＦ４８８、α－ＣＤ３７０ ＰＥ、α－ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０、α－ＣＤ１５ ＡＦ７００、及びα－Ａｘｌ ＡＰＣを含有する５０μＬの抗体カクテルに再懸濁した。細胞を暗所で４℃にて１５分間染色した。最後に、細胞を２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１０～２０×１０６個の細胞／ｍＬで５％ＦＢＳを含有するＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（ＢＤ）でソーティングする前に４℃で保存した。ソート中、生きた自然細胞を、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ－ ＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ２０－細胞のゲーティングによって同定した。この集団内で、ＣＤ１４＋単球は、ＣＤ１４＋として同定され、ｍＤＣは、ＣＤ１４－ＣＤ５６－ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１６－ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１２３－として同定され、ｐＤＣは、ＣＤ１４－ＣＤ５６－ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１６－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１２３＋として同定された。
精製された免疫細胞のＯｍｎｉ ＡＴＡＣ－ｓｅｑ。Ａｔａｃを、以前に記載された低インプットのＯｍｎｉ－Ａｔａｃプロトコル（Ｃｏｒｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）に基づいてソーティング直後に精製された自然免疫細胞サブセットに対して行った。簡単に言うと、１，５００～５，５００個の細胞を、ＡＴＡＣ再懸濁緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５￥［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５６７０２７］、１０ｍＭのＮａＣｌ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ９７６０Ｇ］、３ｍＭのＭｇＣｌ２［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ９５３０Ｇ］、水中￥［ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０９７７０１５］）で洗浄し、上清をまずＰ１０００、次にＰ２００ピペットを使用して慎重に吸引した。次に、１０μＬのトランスポジションミックス（０．５μＬのＴｎ５、０．１μＬの１０％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１μＬの１％ジギトニン、３．３μＬのＰＢＳ、１μＬの水、及び５μＬのタグメンテーション緩衝液）をペレットに添加し、上下に６回ピペッティングすることによって細胞を再懸濁した。タグメンテーション緩衝液を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２０％ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ４５５１－２５０ＭＬ）を水に再懸濁させることによって局所的に調製した。細胞を３７℃で３０分間、一定の混合下でインキュベートした。タグメンテーション後、製造元の指示に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、２８００６）を使用して、反応をクリーンアップした。洗浄したＤＮＡを２１μＬの溶出緩衝液で溶出し、－２０℃で保存し、シーケンシングライブラリ調製のためにＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆに送った。Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆでは、タグメンテーションされたＤＮＡを、カスタマイズしたＮｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマー１及び２を使用して１０サイクルのＰＣＲで増幅し（Ｋｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｔａｂｌｅを参照）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを使用して精製した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８２）。得られた材料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用ＫＡＰＡライブラリ定量化キット（Ｒｏｃｈｅ、０７９６０２５５００１）を使用して定量化し、ＮｅｘｔＳｅｑ５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でＰＥ４２シーケンシングにより配列決定した。
精製された免疫細胞のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ。バルクＲＮＡ－ｓｅｑを、ソーティング後に精製されたＣＤ１４＋単球に対して行った。簡潔に言うと、ソーティング後、５，５００個の細胞を洗浄し、１％β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ３１４８－２５ＭＬ）を添加した３５０μＬの冷却緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ、７９２１６）に再懸濁し、１分間ボルテックスし、直ちに－８０℃で凍結した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４００４）を使用して、オンカラムＤＮａｓｅ消化により単離した。ＲＮＡの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザを使用して評価し、全ＲＮＡを、製造元の指示に従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、６３４８９４）を使用してｃＤＮＡ合成のためのインプットとして使用した。増幅されたｃＤＮＡを断片化し、ＮｅｘｔｅｒａＸＴ ＤＮＡライブラリ調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＦＣ－１３１－１０９６）を使用して、二重インデックスバーコードを付加した。ライブラリを、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎのキャピラリー電気泳動によってバリデーションし、等モル濃度でプールし、１００ＳＲでＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ６０００で配列決定し、１サンプル当たり２０～２５００万リードを得た。
ＦＡＣＳソーティング－ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ／ＲＮＡ－ｓｅｑ。凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、自然免疫細胞サブセットを、上記のようにＦＡＣＳを使用して単離した（ＦＡＣＳソーティングーバルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ／ＲＮＡ－ｓｅｑ）。ゲートされた生細胞内では、ＣＤ１４＋単球はＣＤ１４＋（分画Ａ）として同定され、一方で、残りの単球及び樹状細胞サブセットの混合物はＣＤ１４－ＣＤ５６－ＨＬＡ－ＤＲ＋（分画Ｂ）として同定された。ソーティング後、単離された細胞の数に応じて、分画Ａ及びＢを２：１の比で混合して、ＣＤ１４－細胞がエンリッチされた単球及び樹状細胞の溶液を得た。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ。ＦＡＣＳ精製細胞を、１％ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及び０．５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＰＢＳに再懸濁した。各実験について、約９，０００個の細胞を標的とした。細胞を逆転写ミックスと混合し、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍを使用してＣｈｒｏｍｉｕｍゲルビーズとともにパーティショニングに供し、３’ Ｖ３ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してＧｅｌ－Ｂｅａｄ ｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ（ＧＥＭ）を生成した。ＲＴ反応をＣ１０００ ｔｏｕｃｈ ＰＣＲ機器（ＢｉｏＲａｄ）で行った。バーコード化されたｃＤＮＡをＰｏｓｔ－ＧＥＭ ＲＴ－クリーンアップによってＧＥＭから抽出し、１２サイクル増幅した。増幅されたｃＤＮＡを０．６ｘＳＰＲＩビーズクリーンアップ（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｂ２３３１８）に供した。増幅されたｃＤＮＡの２５％を、製造元のプロトコルに従って、酵素断片化、末端修復、Ａテーリング、アダプターライゲーション、及び１０倍の特異的サンプルインデクシングに供した。バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）解析を使用して、ライブラリを定量化した。ライブラリをプールし、２８ｂｐ（Ｒｅａｄ １）、８ｂｐ（ｉ７ Ｉｎｄｅｘ Ｒｅａｄ）、及び９１ｂｐ（Ｒｅａｄ ２）の推奨されるシーケンシングリード長を使用して、ＮｏｖａＳｅｑ６０００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。
ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ。ＦＡＣＳ精製細胞を、製造元の指示（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＣＧ０００１６８ Ｒｅｖ Ｄ）に従って、単核ＡＴＡＣ－ｓｅｑについて処理した。簡潔に述べると、低細胞インプット核単離（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＣＧ０００１６９ Ｒｅｖ Ｃ）についての製造元の指示に従って、調製したばかりの溶解緩衝液中でＰＢＭＣを３．２０分間インキュベートすることにより核を得た。核を洗浄し、冷却した希釈核緩衝液に再懸濁した（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０００１５３）。次に、核をＣ１０００ ｔｏｕｃｈ ＰＣＲ機器（ＢｉｏＲａｄ）で３７℃にて１時間トランスポジションに供した後、１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ機器で単一核を捕捉した。サンプルを、ｐｏｓｔ ＧＥＭクリーンアップ、サンプルインデックスＰＣＲ、クリーンアップ、及びライブラリＱＣに供した後、プロトコルに従って配列決定した。サンプルをプールし、定量化し、少なくとも最小推奨リード深さ（２５０００リードペア／核）でＮｏｖａＳｅｑ６０００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により配列決定した。
ＩＦＮαＳＩＭＯＡ。凍結血漿をＱｕｎａｔｅｒｉｘに送り、製造元の指示に従って、Ｓｉｍｏａ（登録商標）ＩＦＮ－α Ａｄｖａｎｔａｇｅキット（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、１００８６０）を使用して解析した。簡潔に言うと、血漿及び試薬を室温で解凍した。キャリブレータ、対照、及び血漿をアッセイプレートに移した。ビーズを３０秒間ボルテックスし、調製した試薬及びサンプルをＨＤ－１／ＨＤ－Ｘ機器にロードし、標準設定で解析した。全てのサンプルを二重測定した。
血漿及び細胞培養上清中のＩＦＮα及びＩＦＮγの検出。凍結血漿又は上清を室温で解凍し、製造元の指示に従って、ＩＦＮα及びＩＦＮγヒトＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ免疫測定キットを使用して解析した。簡潔に言うと、サンプルを１：５又は１：２の比でアッセイ希釈緩衝液と混合し、タンパク質標準物をアッセイ希釈緩衝液中で連続的に希釈した。次に、抗体コンジュゲートＡ及びＢを、抗体コンジュゲート希釈緩衝液と混合し、９６ウェルｑＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃ＨＳＰ９６０１）の各ウェルに添加した。次に、希釈したサンプル又は標準品を各ウェルに添加し、混合物を暗所で室温にて１時間インキュベートした。最後に、Ｍａｓｔｅｒ ｍａｘ及びリガーゼを混合し、各ウェルに添加した。ＱＰＣＲは、推奨される機器設定を使用して、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈリアルタイム検出システム（Ｂｉｏｒａｄ）で行った。測定が完了した後、回帰モデルを使用してＣＴ値を計算し、キットに付属のＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ Ｃｌｏｕｄアプリ（ａｐｐｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ａｐｐｓ／ｐｒｏｑｕａｎｔｕｍ）にエクスポートした。次いで、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ Ｃｌｏｕｄアプリを使用して標準曲線を構築し、ＣＴ値からタンパク質濃度を計算した。
ＩＰ－１０血漿中Ｌｕｍｉｎｅｘ。血漿中バイオマーカー濃度を、製造元の推奨プロトコルに従って調製した１０の解析物マルチプレックスビーズアレイ（フラクタルカイン、ＩＬ－１２Ｐ４０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦβ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してアッセイし、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ２００懸濁型アレイリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して読み取った。データは、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘマネージャーソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して解析した。
ウイルス感染アッセイ。デングウイルス（ＤＥＮＶ－２、タイ株／１６６８１／８４）及びジカウイルス（ＰＲＶＡＢＣ５９）をＶｅｒｏ細胞上で増殖させ、力価測定し、感染するまで－８０℃で保存した。凍結保存したヒトＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、カウントし、１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５－０１１－ＣＶ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｏｎｚａ、１３－１１５Ｅ）、及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１７－６０２Ｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、７２４００－０４７）に１５×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。２００μＬの細胞溶液（３×１０５個の細胞）を９６ウェルの丸底組織培養プレートの各ウェルに添加し、細胞をプレート内で３７℃及び５％ＣＯ２で４時間静置させた。静置後、ＰＢＭＣをＭＯＩ １でＤＥＮＶ－２又はＺＩＫＶで感染させた。感染後０時間、２４時間、４８時間で、ＰＢＭＣ及び上清を、それぞれ、ＲＮＡ精製及びサイトカイン解析のために採取した。上清を直ちに－２０℃で凍結し、解析まで保存した。細胞をＲＮＡ溶解緩衝液に懸濁し、解析まで－２０℃で維持した。ＲＮＡを、製造元の推奨に従って、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ ＲＮＡキットを使用して精製した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１２１８３０５２）。ウイルス量の検出のために、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を、９６ウェルプレート付きＣＦＸ９６ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈアルタイム検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃ＨＳＰ９６０１）でＬｕｎａユニバーサルプローブワンステップＲＴ－ＰＣＲキット（ＮＥＢ、＃Ｅ３００６）を使用して行った。ＲＮＡ標準品（ＡＴＣＣ、＃ＶＲ－３２２９ＳＤ、ＶＲ－１８４３ＤＱ）を使用して標準曲線を生成した。ウイルスＲＮＡコピーを細胞数によって正規化した。利用したプライマー及びプローブをＫｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｔａｂｌｅにリストアップしている。
培養上清中のＩＰ－１０の検出。培養上清を室温で解凍し、製造元の指示に従って、ＩＰ－１０酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＩＰ１００）を使用して解析した。簡潔に言うと、サンプルを室温で解凍し、１：２の比でアッセイ希釈緩衝液と混合した。タンパク質標準品をアッセイ希釈緩衝液中で連続希釈した。サンプル及び標準品をプレート内で室温にて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、室温で２時間、ヒトＩＰ－１０コンジュゲートとインキュベートした。洗浄後、基質溶液を３０分間添加した。最後に、停止溶液を添加し、Ａ４５０及びＡ５９５をプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ｉＭＡＲＫ）で読み取った。ＩＰ－１０の濃度は、標準曲線に基づいてＡ４５０－Ａ５９５の数によって決定した。
定量化及び統計解析
免疫細胞集団の定義及びＥｐｉＴＯＦデータ前処理。生データを、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して前処理して、パラジウムベースのマスタグによって個々のサンプルからの細胞イベントを同定し、免疫表現型マーカーによって特定の免疫細胞集団を分離した。（ＴＩＶ＆Ｈ５Ｎ１／Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３）。個々の対象からの様々な免疫細胞サブタイプの単一細胞データを、下流のコンピュータ解析のためにＦｌｏｗＪｏからエクスポートした。
ＥｐｉＴＯＦ解析。次に、エクスポートされたＦｌｏｗｊｏデータを、（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に記載されているアプローチに従って正規化した。簡潔に言うと、各ヒストンマークの値を、Ｈ３及びＨ４の測定値によって表されるヒストンの総量に対して回帰させた。サンプルレベル解析では、各ヒストンマークの値を、各サンプル中の各細胞型について平均化した。リンパ球系及び骨髄系エピジェネティックプロファイルからのＨＳＣの距離は、まず２つの系統のエピジェネティックプロファイルの中心を計算し、次いで各個々のＨＳＣの中心からのユークリッド距離を計算することによって得た。特定の細胞型のエピジェネティックプロファイルからのＨＳＣの距離も同様に、各細胞型のエピジェネティックプロファイルの中心からのユークリッド距離を計算することによって得た。サンプルレベルでの群間の差の統計的有意性は、Ｈｅｄｇｅｓ’ｇ式（Ｈｅｄｇｅｓ ａｎｄ Ｏｌｋｉｎ，２０１４）を用いて効果量を計算することによって評価した。全てのｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法での多重比較のために補正した。次元削減は、ＵＭＡＰを適用して行った。単一細胞解析では、正規化された値を入力として使用した。変数間の相関は、ピアソンの相関係数を使用して計算した。全ての解析は、統計計算のためのＲフレームワーク（バージョン３．６．３）（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０２０）を使用して行った。
ＴＩＶバルク遺伝子発現解析。処理されたデータはＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒでＲＭＡによって正規化されこれにはグローバルバックグラウンド調整と分位正規化とが含まれる。本研究の抗生物質及び対照アームの第１相対象からのサンプルを選択し、ＭＡＴＬＡＢを使用して統計的検定及び相関解析を行った。検定の詳細と有意性のカットオフとは、図の凡例で報告される。
Ｌｕｍｉｎｅｘ解析。統計解析はＲ（ｖ４．０．２）（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０２０）で行った。まずＭＦＩデータをｌｏｇ２変換し、利用可能な場合、重複培養物から平均ＭＦＩ及びＣＶを計算した。ＣＶ＞０．２５のサンプルについては、その対象の全サンプルの平均値に近い方の複製を保持し、他の複製を廃棄した。他のサンプルが利用できず、ＣＶ＞０．２５の場合、サンプルを廃棄した。サイトカイン産生の適応を示さないウェルを除外した。Ｒパッケージのｓｔａｔｓ（ｖ４．０．２）、ｇｇｐｕｂｒ（ｖ０．４．０）及びｐｈｅａｔｍａｐ（ｖ１．０．１２）を使用して、統計的検定、相関解析、及び階層的クラスタリングを行った。検定の詳細と統計的カットオフとは、図の凡例で報告されている。
バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ前処理。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータの解析は、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータの解析と非常によく似ていた。リードをＢＷＡアルゴリズム（ｍｅｍモード；デフォルト設定；ｖ０．７．１２）を使用してアラインメントした。重複リードを除去し、マッチドペアとしてのリードマッピングのみ、及び一意にマッピングされたリード（マッピング品質≧１）のみを更なる解析に使用した。アラインメントを、インシリコで３’末端を２００ｂｐの長さまで拡張し、ゲノムに沿って３２ｎｔのビンに割り当てた。得られたヒストグラム（ゲノム「シグナルマップ」）をｂｉｇＷｉｇファイルに保存した。ピークは、ＭＡＣＳアルゴリズム（ｖ．２．１．０）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用して、ｐ値１ｅ－７のカットオフで、対照ファイルなしで、及び－ｎｏｍｏｄｅｌオプションを付けて同定した。既知の偽ＣｈＩＰ－ＳｅｑピークのＥＮＣＯＤＥブラックリストにあったピークは削除した。シグナルマップ及びピーク位置は、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ独自の解析プログラムの入力データとして使用され、サンプル比較、ピークメトリクス、ピーク位置、及び遺伝子アノテーションに関する詳細情報を含むＥｘｃｅｌテーブルを作成した。差異解析のために、全てのマージされたピーク領域でリードをカウントし（Ｓｕｂｒｅａｄを使用して）、ＤＥＳｅｑ２（ｖ．１．２４．０）を使用して各条件の複製を比較した（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータの品質管理解析は、Ｒ及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおけるＡＴＡＣ－ｓｅｑデータの解析に関するロックフェラー大学ワークショップを使用して行った。処理された５７個のユニークなサンプルのうち、５２個がＱＣ基準に合格し、平均して１サンプル当たり４２，０００個超のゲノム領域及び１５×１０６個超のユニークなＡＴＡＣタグが検出され、一方で、ピーク中のリードの平均割合は３５％よりも大きい。合格したサンプルは、特徴的な断片長及びＴＳＳエンリッチメント分布を示した。ＤＡＲは、Ｒ（ｖ．３．２４．１）のＣｈＩＰｐｅａｋＡｎｎｏパッケージを使用して、ピークの中央から最も近い転写開始部位（ＴＳＳ）までの距離に基づいて、特定の遺伝子のプロモーターピーク、遠位ピーク及びトランス調節ピークとしてアノテーションされた。プロモーターピーク、遠位ピーク及びトランス調節ピークは、それぞれ、－２０００ｂｐ～＋５００ｂｐ、－１０Ｋｂｐ～＋１０Ｋｂｐ－プロモーター、及びＴＳＳから＜－１０Ｋｂｐ＞又は＋１０Ｋｂｐとして定義した。超幾何学的分布ベースのエンリッチメント解析を行って、ＤＡＲの有意性を特定した。ＥＮＣＯＤＥからのＣｈｉｐ－ｓｅｑデータを使用したＲｅａｃｔｏｍｅパスウェイ及びＴＦ－ターゲット関係（両方ともｈｔｔｐｓ：／／ｍａａｙａｎｌａｂ．ｃｌｏｕｄ／ｃｈｅａ３／からダウンロード）を使用して、過剰に表されたパスウェイ及びＴＦを同定した。
ＣｙｔｏＳｃａｐｅ（ｖ３．８．２） （Ｓｈａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）のＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＭａｐ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｖ１．１．０）（Ｍｅｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）を使用して、パスウェイネットワークを作成した。各ゲノム領域について、有意にエンリッチされたＲｅａｃｔｏｍｅパスウェイ（ｐ≦０．０５）を入力として使用した。パスウェイは、パイプライン内のＡｕｔｏＡｎｎｏｔａｔｅ機能を使用してクラスタリング及びアノテーションされた。ＤＡＲにおけるＴＦモチーフのエンリッチメントを試験するために、ｃｈｒｏｍＶＡＲ（ｖ１．８．０）（Ｓｃｈｅｐ ｅｔ ａｌ．，２０１７）及びｍｏｔｉｆｍａｔｃｈｒ（ｖ１．８．０）パッケージをＲ（ｖ３．６．０）（ＲＣｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０２０）で使用した。簡潔に言うと、ＴＦモチーフは、ＪＡＳＰＡＲ２０１６コアホモサピエンスデータベース（Ｍａｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）からダウンロードされ、マージされた領域は、標準的な設定でｍａｔｃｈＭｏｔｉｆｓ（ｍｏｔｉｆｍａｔｃｈｒ）機能を使用して、全てのＴＦ結合モチーフの存在についてアノテーションされた。次いで、超幾何学的分布ベースのエンリッチメント解析を行って、ＤＡＲにおけるＴＦモチーフのエンリッチメントを同定した。ＥｐｉＴＯＦとＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ間の関係を決定するために、ＥｐｉＴＯＦ Ｈ３Ｋ２７ａｃレベルと、各マージされたピーク領域における正規化されたリードカウントとの間のピアソン相関を計算した。ｐ値≦０．０５の正の相関を持つマージされたピーク領域が、機能的アノテーションのために選択された。エンリッチメント解析は上記のように行った。
精製された免疫細胞のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ。アラインメントは、ＳＴＡＲバージョン２．７．３ａ（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を使用して行い、転写産物は、ＧＲＣｈ３８アンサンブルリリース１００を使用してアノテーションした転写産物の存在量推定は、ｈｔｓｅｑ－カウント（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）のアルゴリズムを使用して、ＳＴＡＲアライナーの内部で計算した。ＤＥＳｅｑ２バージョン１．２６．０（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）は、ペアデザイン式でＷａｌｄ検定を使用し、その標準ライブラリサイズ正規化を使用して、発現差異解析のために使用した。
以前のＴＩＶ研究からのバルクトランスクリプトミクスデータの解析。２００７年～２０１２年にかけて行われたた９つの独立したＴＩＶ研究からの処理されたバルクトランスクリプトミクスデータをＧＥＯから得た（受託：ＧＳＥ４７３５３、ＧＳＥ５９６３５、ＧＳＥ２９６１９、ＧＳＥ７４８１３、ＧＳＥ５９６５４、ＧＳＥ５９７４３、ＧＳＥ７４８１１、ＧＳＥ２９６１７、ＧＳＥ７４８１６）。欠損値のあるサンプル及び遺伝子並びに特別なワクチン時点を除去した後、本研究と同じ年齢範囲：１８～４５歳に一致する対象からのサンプルのみ選択した。残りのサンプルは、Ｒのｓｖａパッケージ（ｖ３．３６．０）からのＣｏｍＢａｔを使用して、バッチ、共変量なし、及びそれ以外は標準設定としての研究によりバッチ補正した。Ｒベース及びＣｏｍｐｌｅｘＨｅａｔｍａｐ（ｖ２．４．３）パッケージを使用して統計的検定を行った。検定の詳細と統計的カットオフとは、図の凡例で報告されている。
ｓｃＡＴＡＣ解析。１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓによるＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ－ａｔａｃパイプライン（ｖ１．１．０）を使用して、各サンプルのアラインメント（ＧＲＣｈ３８参照ゲノム）、重複除去、及び切断部位の同定を行った。次いで、深さ方向正規化を行わずに（－－ｎｏｒｍａｌｉｚｅ＝ｎｏｎｅ）、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ－ａｔａｃ集計手順を使用してサンプルを組み合わせた。得られた断片ファイルをＳｎａｐＡＴＡＣに読み込んだ（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ＳｎａｐＡＴＡＣを使用して、ゲノム（５Ｋのビンサイズ）を結合し、細胞ごとのビンカウントマトリックスを作成した。少なくとも１０００個のＵＭＩ、及び少なくとも０．１のプロモーター比（（プロモーター領域内の断片＋１）／（総断片＋１）として定義される）を有するバーコードとして細胞を呼び出し、結果のセクションに記載されているように、￥［各実験における細胞の総数を記載］の合計がもたらされた。ｃｈｒＹ、ミトコンドリアＤＮＡにマッピングされたビン、及びＥＮＣＯＤＥブラックリスト領域（Ａｍｅｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）とオーバーラップするビンを除去した。残りのビンは、ｉｒｌｂａ Ｒパッケージ（Ｂａｇｌａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）を用いた切り捨てＳＶＤを使用して次元削減のために使用され、次いで最初の５０次元がクラスタリングのために使用された。次に、ＭＡＣＳ２（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用して、ＡＴＡＣｓｅｑデータ（－－ｎｏｍｏｄｅｌ－－ｓｈｉｆｔ１００－－ｅｘｔ２００－－ｑｖａｌ５ｅ－２－Ｂ－－ＳＰＭＲ）の推奨パラメータを使用して各クラスター内のピークを呼び出し、得られたピークを単一の組み合わせセットにマージした。次に、ＳｎａｐＡＴＡＣを使用して、断片を組み合わせたピークセットにマッピングし、ピークごとの細胞バイナリマトリックスを作成した。Ｈ５Ｎ１／Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３データセットでは、ディープシーケンスされたライブラリをダウンサンプリングし、確率ｐ＝１５００／（サンプル中の細胞当たりの平均断片）でこれらのサンプルからカウントをランダムに除去することによって、バーコード当たり平均１５００断片にした。次に、ピークごとの細胞マトリックスに対して次元削減とクラスタリングの手順とを繰り返した。ＣｈｒｏｍＶＡＲ（Ｓｃｈｅｐ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を、デフォルトパラメータ及びＪＡＳＰＡＲ２０１６（Ｍａｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）モチーフデータベースとともに使用して、モチーフアクセシビリティスコアを計算し、データ内のアクセシビリティ変動モチーフを計算した。ホットスポットを使用して、単球集団内の不均一性を説明する有益な遺伝子モジュールを同定した（ＤｅＴｏｍａｓｏ ａｎｄ Ｙｏｓｅｆ、２０２０）。Ｒのｇｌｍ関数を用いたロジスティック回帰を使用して、ドナー及びライブラリサイズ効果をコントロールするために、ｙ～時点＋ドナー＋ｌｏｇ＿断片のデザインで、アクセシビリティ変動クロマチン領域を同定した。次いで、時点に対応する係数をｌｏｇＦＣ値として使用し、Ｗａｌｄ検定を計算してｐ値を得た。数値的な安定性のために、各比較に含まれる細胞の少なくとも５％で検出されたピークのみを含めた。前処理、相関解析、及び差分変動解析のための全てのカスタムスクリプトはｚｅｎｏｄｏに掲載されている。超幾何学的分布ベースのエンリッチメント解析を行って、ＤＡＲの有意性を特定した（ｐ≦０．０５であり、少なくとも５％の細胞で検出された）。Ｒｅａｃｔｏｍｅ経路データベース（両方ともｈｔｔｐｓ：／／ｍａａｙａｎｌａｂ．ｃｌｏｕｄ／ｃｈｅａ３／からダウンロード）を使用して、過剰に表された経路を特定した。Ｅｎｒｉｃｈｒ（Ｋｕｌｅｓｈｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を使用して、ホットスポットモジュール２、３内のゲノム領域のエンリッチメント解析を行った。Ｅｎｒｉｃｈｒはまた、ＩＲＦ１モチーフを含有するＤＡＲのエンリッチメント解析を行うために使用した。簡潔に述べると、ｃｈｒｏｍＶＡＲによって決定されるように、ＩＲＦ１モチーフを持つ有意なＤＡＲ（ｐ≦０．０５であり、細胞の少なくとも５％で検出された）を選択した。次に、全てのＤＡＲが同じ方向に変化した場合、又はそうでなければ廃棄された場合に、複数の関連するＤＡＲを持つ遺伝子名を折りたたんだ。その後、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿２０１６データベースを使用して、エンリッチメントのために遺伝子リストをＥｎｒｉｃｈｒに提出した。同様に、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３によるブースターワクチン接種後に増強され、プロモーター領域におけるアクセシビリティの変化とオーバーラップした遺伝子にエンリッチされたＴＦ標的遺伝子を同定するために、ＥｎｒｉｃｈｒをＣｈＥＡ＿２０１６データベースと併用した。
ｓｃＲＮＡ解析。１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓによるＣｅｌｌＲａｎｇｅｒパイプライン（ｖ３．１．０）を、アラインメント（ＧＲＣｈ３８参照ゲノム）、脱多重化、細胞呼び出し、及びフィルタリングのために使用した。次いで、各サンプルからのフィルタリングされたカウントマトリクスを、深さ方向正規化を行わずにＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ集計手順を使用して集計した（－－ｎｏｒｍａｌｉｚｅ＝ｎｏｎｅ）。得られたカウントマトリックスを、バッチ補正のためのバッチラベルとして各サンプルの実験アノテーションを使用して、低次元潜在空間に適合するように、ｓｃＶＩ（ｓｃｖｉ－ｔｏｏｌｓ ｖ０．７．１）（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を用いてデフォルトのハイパーパラメータで解析した。視覚化、クラスタリング、及び探索的解析をＶＩＳＩＯＮ（ｖ２．１．０）で行った。各ペアワイズ解析のためのｅｘａｃｔＴｅｓｔ仮説検定を使用して、パッケージ文書に記載されているように、ｅｄｇｅＲで時点間の発現差異解析を行った。
バルクトランスクリプトミクスｖａｘ０１０。初期データ品質を、バックグラウンドレベル、３’標識バイアス、及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのａｒｒａｙＱｕａｌｉｔｙＭｅｔｒｉｃｓパッケージを介したサンプル間のペアワイズ相関によって評価した（Ｋａｕｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＥＬファイルは、ＲＭＡ（Ｉｒｉｚａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）を介して正規化され、これにはグローバルなバックグラウンド調整及び分位正規化が含まれる。複数の遺伝子にマッピングするプローブを廃棄し、残りのプローブを、全ての対象にわたって平均発現量が最も高い各遺伝子のプローブを選択することによって、遺伝子レベルに折りたたまれた。統計的検定は、ＭＡＴＬＡＢ及びＲで行った。
実施例２
サブユニットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナノ粒子ワクチンのアジュバント化による非ヒト霊長類における防御免疫の誘発
世界中の人々にワクチン接種するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンのポートフォリオの開発は、依然として公衆衛生上の緊急課題である。ここで、２成分タンパク質ナノ粒子（ＲＢＤ－ＮＰ）上に表示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む、臨床開発中のサブユニットワクチンが、非ヒト霊長類において堅牢で持続的な中和抗体（ｎＡｂ）応答を刺激し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して防御する能力が実証される。水中スクワレンエマルションであるＥｓｓａｉ Ｏ／Ｗ１８４９１０１、パンデミックインフルエンザワクチンで使用されるα－トコフェロール含有スクワレンベースの水中油型エマルションであるＡＳ０３、ミョウバンに吸着されたＴＬＲ－７アゴニストであるＡＳ３７、ミョウバンに配合されたＴＬＲ－９アゴニストであるＣｐＧ１０１８－ミョウバン（ＣｐＧ－ミョウバン）、又は最も広く使用されているアジュバントであるミョウバンを含む、ＲＢＤ－ＮＰと組み合わせた５つの異なるアジュバントを評価した。５つのアジュバント全てが、２回の連続免疫後に実質的なｎＡｂ及びＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発した。持続的なｎＡｂ応答を、ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３免疫に関して評価し、生ウイルスｎＡｂ応答を、ワクチン接種後１５４日まで持続的に維持した。ＡＳ０３群、ＣｐＧ－ミョウバン群、ＡＳ３７群及びミョウバン群は、咽頭、鼻腔及び気管支肺胞洗浄においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する有意な防御を与えた。ｎＡｂ力価は、感染に対する防御と高度に相関していた。ＡＳ０３、ＡＳ３７及びＣｐＧ－ミョウバン基によるＲＢＤ－ＮＰ免疫は、Ｂ．１．１．７ＵＫバリアントを効率的に交差中和したが、Ｂ．１．３５１（ＳＡバリアント）に対する応答の低下を示した。注目すべきことに、ＡＳ０３群は、Ｂ．１．３５１株の交差中和における４．５倍の減少のみを示したが、ＡＳ３７群は、１６倍の減少を示し、異なるアジュバントが、より広範な中和を提供するｎＡｂを誘発する能力が異なることを示唆していた。更に、ＲＢＤ－ＮＰをＡＳ０３と併用した場合、プレフュージョン安定化スパイク免疫原であるＨｅｘａＰｒｏと同等の効力を示した。総合すると、これらのデータは、臨床的に意義のあるアジュバントを用いて製剤化されたＲＢＤ－ＮＰが、非霊長類においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する堅牢な免疫を促進するという効力を強調している。
サブユニットワクチンは、これまでに開発された最も安全で最も広く使用されているワクチンの１つである。サブユニットワクチンは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、百日咳、破傷風、帯状疱疹などの多くの感染症に対して、幼児から高齢者まで幅広い年齢層で高い有効性を示している。サブユニットワクチンの必須成分は、低用量の抗原であってもワクチン接種によって誘発された免疫応答の大きさ、質、及び耐久性を高める免疫刺激剤であるアジュバントである。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する安全で効果的なサブユニットワクチンの開発は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを制御する上で重要なステップとなるであろう。最も広く使用されているアジュバント、アルミニウム塩（ミョウバン）は、過去１世紀にわたって数十億回もののワクチンに使用されてきた。過去１０年間で、α－トコフェロールを含有するスクアレン系の水中油型アジュバントＡＳ０３、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）－９リガンドＣｐＧ １０１８を含むいくつかの新規のアジュバントが開発されており、これらは、それぞれ、パンデミックインフルエンザ及びＢ型肝炎に対する認可ワクチンに含まれている。ミョウバンは免疫応答をＴｈ２型に偏らせることが知られており、マウスではより顕著であり、このことは、多くのワクチンメーカーがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンにミョウバンを含める潜在的な懸念となっていた。一方、ＡＳ０３などの水中油型エマルションは、よりバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２型応答を惹起し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンをアジュバントとしてより魅力的なターゲットとする高い大きさの抗体応答を誘発することが知られている。ＡＳ３７（ＴＬＲ－７アゴニスト）及びＣｐＧ１０１８（ＴＬＲ－９アゴニスト）などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストは、効率的なＴｈ１型免疫応答及び強力な抗体応答を誘発することが知られているが、ミョウバンで製剤化された場合のそれらの効果は十分に確立されていない。特に、ＧＳＫ及びＤｙｎａｖａｘのコミットメントの下で、ＡＳ０３及びＣｐＧ１０１８は、現在、候補サブユニットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンで使用するためのアジュバントとして開発されているが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御免疫を刺激するそれらの能力は未知のままである。
最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０（ＲＢＤ－ＮＰ）を記載したが、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤの６０コピーを、計算上デザインされた自己組織化タンパク質ナノ粒子（以下、ＲＢＤ－ＮＰと称する）を使用して高免疫原性アレイで表示したサブユニットワクチンである。マウスにおける前臨床評価では、ワクチンは５倍低用量で２－プロリン（２Ｐ）事前注入安定化スパイク（開発中のほとんどのワクチンで使用されている）よりも１０倍高いｎＡｂ力価を惹起し、マウス適応ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジからマウスを防御することが示された。本研究では、ＡＳ０３、ミョウバンに配合されたＣｐＧ １０１８、並びに水中スクワレンエマルション（Ｏ／Ｗ）、ミョウバンに吸着されたＴＬＲ－７アゴニスト（ＡＳ３７）及びミョウバンの能力を評価して、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御免疫を促進した。
結果
異なるアジュバントで製剤化されたＲＢＤ－ＮＰに対する堅牢な抗体応答。異なるアジュバントを用いたＲＢＤ－ＮＰワクチン接種の免疫原性及び防御効果を評価するために、２９匹の雄アカゲザル（ＲＭ）を、以下の５つのアジュバント：Ｏ／Ｗ、ＡＳ０３、ＡＳ３７、ＣｐＧ １０１８－ミョウバン（ＣｐＧ－ミョウバン）又はミョウバン（図１６ａ）うちの１つを用いて製剤化された２５μｇのＲＢＤ抗原（ＲＢＤ－ＮＰ免疫原の総量７１μｇ；図２３）で免疫した。４匹の追加の動物に、対照として生理食塩水を投与した。全ての免疫は、０日目及び２１日目に前肢に筋肉内経路を介して投与した。ブースター免疫の４週間後、気管内／鼻腔内（ＩＴ／ＩＮ）経路を介してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で動物にチャレンジした。ＡＳ０３アジュバント併用ＲＢＤ－ＮＰで免疫された１０匹の動物のうちの５匹は、ワクチン惹起性免疫応答の耐久性の評価を可能にするようにチャレンジされず、より遠方の時点でチャレンジされる。
ワクチン接種に対する結合抗体応答の評価は、Ｓ特異的ＩｇＧが、全てのワクチン接種群において一次免疫の２１日後に検出され、ブースティング後にその大きさが増加したことを示した（図１６ｂ）。ＡＳ０３は、４２日目に最も高い結合ＩｇＧ（ＧＭＴ ＥＣ５０１：８，５５１）を誘発し、Ｏ／Ｗは、最も低い（ＧＭＴ ＥＣ５０１：１，３０８）応答を誘発した。ＡＳ３７群、ＣｐＧ－ミョウバン群、及びミョウバン群における結合抗体は、ＡＳ０３と同程度の大きさであった。Ｓ特異的ＩｇＧに加えて、Ｉ５３－５０タンパク質ナノ粒子（ＮＰ）足場に対する抗体応答も測定した。抗ＮＰ抗体価は、４２日目の異なるアジュバント群の間の抗スパイク抗体価と比較して、より低い大きさ（平均して１．７倍低い）ではあるが、全ての群で惹起された（図２３ａ）。抗ＮＰ抗体応答はＳ特異的結合抗体応答と強い相関があった（図２３ｂ）。
ＲＢＤ－ＮＰ免疫により、一次免疫後のＯ／Ｗ群を除くほとんどの動物においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ偽型ウイルスに対する検出可能なｎＡｂ応答が誘発され、これはブースター免疫後の全群において有意に増加した（図１６ｃ及び図２３ｃ）。特に、ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３免疫により、２１日目（一次免疫の３週間後）に１：６３の幾何平均力価（ＧＭＴ）が誘発され、これは４２日目には１：２，７０４（４３倍）に増加した。他の群、Ｏ／Ｗ群、ＡＳ３７群、ＣｐＧ－ミョウバン群、及びミョウバン群は、４２日目に、それぞれ、１：２３２、１：６４０、１：２，１６４、及び１：９５１のＧＭＴを誘発した。これらの応答は、４つの回復期ヒトサンプルのｎＡｂ力価（ＧＭＴ１：７６）及び同時にアッセイされたＮＩＢＳＣ対照試薬（ＮＩＢＳＣコード２０／１３０、ｎＡｂ力価１：２４１）（図２４ａ）よりも著しく高かった。次に、真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するｎＡｂ応答を、最近確立されたフォーカス低減中和力価（ＦＲＮＴ）アッセイを使用して測定し、これはモデルナｍＲＮＡワクチンの最近の臨床試験を解析するために使用された。偽ウイルス中和アッセイと一致して、全てのアジュバントは、二次免疫後に堅牢な生ウイルスｎＡｂ力価を誘発した（図１６ｄ及び図２３ｄ）。ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３群は、最も高いｎＡｂ力価（ＧＭＴ１：４，１４５）を示し、残りのアジュバントがそれに続いた。更に、他の研究で見られたように、偽ウイルスと生ウイルスｎＡｂ力価との間には強い相関があった（図２４ｂ）。最後に、二次免疫の４日後にＥＬＩＳＰＯＴを使用して、ＲＢＤ－ＮＰ特異的形質芽細胞応答を測定した（図２４ｃ）。血液中の抗原特異的ＩｇＧ分泌細胞の大きさは、観察された抗体応答と相関した（図２４ｄ）。
ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３免疫は、持続的な生ウイルスｎＡｂ応答を誘発する。強力で持続的な免疫を誘発することは、ワクチンの成功にとって重要であり、ブースター免疫が投与される必要がある頻度を決定する。ｎＡｂ応答の耐久性を決定するために、５ヶ月間チャレンジすることなく、ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３で免疫した５匹の動物を追跡した。１２６日目まで測定した偽ウイルスｎＡｂ力価は、適度に低下したが、４２日目と１２６日目との間で有意差はなかった（図２５ａ）。顕著なことに、ＦＲＮＴアッセイを使用して真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して測定されたｎＡｂ応答は、１５４日目まで持続的に維持された（図１６ｅ）。注目すべきことに、ＦＲＮＴアッセイは、モデルナワクチン研究で耐久性を測定したのと同じ研究室で行われた。ＧＭＴ力価は、４２日目（追跡した５匹の動物ではＧＭＴ ５．６３８）と１５４日目（ＧＭＴ １，１０８）との間で５倍減少したが、これは統計的に有意ではなかった（図１６ｅ）。更に、これらの時点で採取された血清によるＲＢＤへのＡＣＥ－２結合のブロッキングの効率の低下はほとんど又はまったく観察されなかった（図２５ｂ）。これらの結果は、ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３免疫が、強力で持続性のｎＡｂ応答を誘発することを実証している。
アジュバント併用ＲＢＤ－ＮＰ免疫は、新興バリアントに対するｎＡｂ応答を惹起する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントが最近出現しており、ワクチン誘発性免疫がバリアントを中和する能力を欠く可能性があると懸念されている。Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１の２つのバリアントは、それぞれ、英国及び南アフリカで最初に同定され、それ以来、世界的に循環していることが判明した。ＲＢＤ－ＮＰ＋ＡＳ０３、ＡＳ３７、又はＣｐＧ－ミョウバンで免疫された動物由来の血清が、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１バリアントを中和するかどうかを評価した。生ウイルス中和並びに偽ウイルス中和アッセイを使用して、３つの群全てが、バリアントに対するｎＡｂ力価を誘発したと決定した。Ｂ．１．１．７バリアントに対するｎＡｂ力価は、野生型（ＷＴ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（図１６ａ、左パネル及び図２５ｃ）の力価と同等であったが、ワクチン接種されたヒトで見られるように、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアントに対するｎＡｂ力価は、ＷＴ（図１７ａ、右パネル、表１）の力価と比較して有意に減少した。注目すべきことに、この減少は、ＡＳ０３群（４．５倍）及びＣｐＧ－ミョウバン（８．３倍）群と比較して、ＡＳ３７群（中央値１６倍）で高かった。これらのデータは、アジュバントが免疫原性を高めるだけでなく、アジュバントが異なれば、より広範な中和を提供するｎＡｂを惹起する可能性も異なり得ることを示唆している。更に、Ｂ．１．３５１バリアントに対するｎＡｂ応答は、ＷＴ応答のそれと同様に持続性があった（図１７ｃ）。
アジュバント併用ＲＢＤ－ＮＰ免疫は、堅牢なＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発する。２１パラメータフローサイトメトリーパネルを使用した細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイにより、抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した（補足表２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤにまたがるペプチドプール（１１ｍｅｒがオーバーラップした１５ｍｅｒペプチド）でエクスビボ刺激した後に、ＲＢＤ特異的Ｔ細胞を最初に測定した。ＲＢＤ－ＮＰ免疫は、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発したが、ＣＤ８Ｔ細胞応答を制限した。ＲＢＤ特異的ＣＤ４応答は、ＡＳ０３群及びＣｐＧ－ミョウバン群で最も高く（図１８ａ、ｂ）、二次免疫後化に有意に増強された。これらの応答は、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α分泌ＣＤ４ Ｔ細胞（図２６ａ）が支配的であり、これは４２日目（二次免疫後３週間）でも検出可能であった。ＡＳ０３群におけるＩＬ－２＋及びＴＮＦ－α＋ＣＤ４ Ｔ細胞応答の頻度の中央値は、２８日目にそれぞれ０．１％及び０．０８％であり、４２日目には約０．０７％に減少した。また、ＡＳ０３群及びＣｐＧ－ミョウバン群の両方で、低いながらも検出可能なＩＬ－４応答が見られ、２８日目にピークに達したが、４２日目までにほぼベースラインレベルまで低下した（図１８ｂ）。ＡＳ０３群及びＣｐＧ－ミョウバン群の次に、ミョウバンも強力なＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発した。ミョウバン群とＯ／Ｗ群とでは、それぞれ７５％と５０％との動物がＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の誘発を示したが、ＴＬＲ－７アゴニストＡＳ３７は、全ての動物において強力な抗体応答を誘発したにもかかわらず、弱いＴ細胞応答を誘発した。
ＩＬ－２、ＩＦＮ－γＩＬ－４、及びＴＮＦ－αを発現する抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の多機能性プロファイルを評価した（図１８ｃ）。ＩＬ－２＋、ＴＮＦ－α＋、及びＩＬ－２＋ＴＮＦ－α＋二重陽性細胞が、全てのアジュバント群において大多数（約７０％）を形成したが、群間の差は明らかであった。特に、ＡＳ０３は、Ｔｈ１型及びＴｈ２型の多機能性ＣＤ４ Ｔ細胞を同程度の割合で惹起し、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロファイルのバランスがとれていたが、ＣｐＧ－ミョウバンはＴｈ１型応答がわずかに高く、ミョウバンはＴｈ２型応答がより高かった。更に、胚中心形成及び持続性のあるＢ細胞応答の生成におけるそれらの重要な役割について、循環ＴＦＨ様細胞のマーカーであるＩＬ－２１及びＣＤ１５４を測定するための解析を拡張した。ＡＳ０３群及びＣｐＧ－ミョウバン群では、検出可能なＩＬ－２１応答が観察された（図１８ｄ）。ＩＬ－２１を分泌する全ての細胞はＣＤ１５４＋であった。ＩＬ－２１＋ＣＤ１５４＋二重陽性細胞は、ＡＳ３７群と比較して、ＡＳ０３群及びＣｐＧ－ミョウバン群で有意に高かった（図１８ｅ）。
また、Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂナノ粒子成分配列にまたがるペプチドプールで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激して、ＲＢＤ－ＮＰ免疫がナノ粒子足場を標的とするＴ細胞を誘発するかどうかを決定した。かなりの割合のＣＤ４ Ｔ細胞がＩ５３－５０サブユニットを標的とし、ＲＢＤ特異的Ｔ細胞と同様の多機能性プロファイルを含む応答パターンを示すことが観察された（図２６ｂ、ｃ）。ＮＰ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度は、ＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度の約３倍であった（図２６ｄ）。この観察は、ＲＢＤが免疫原の総ペプチド質量の約３分の１を構成していることと一致している。まとめるとと、アジュバントによるＲＢＤ－ＮＰ免疫は、様々な大きさのワクチン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を誘発した。ＩＬ－２及びＴＮＦ－αは、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞によって誘発された主要なサイトカインであったが、ＩＬ－２１及びＣＤ１５４応答も観察された。
異なるアジュバントによるＲＢＤ－ＮＰ免疫は、ＮＨＰをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから防御する。本研究の主要評価項目は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染に対する防御であり、上気道及び下気道におけるウイルス量の減少として測定した。この目的のために、二次免疫から４週間後に３．２×１０６個のＰＦＵ単位を気管内及び鼻腔内（ＩＴ／ＩＮ）経路を介して動物にチャレンジした。ウイルス複製は、チャレンジ当日及びチャレンジ後２、７、及び１４日目に、鼻腔、咽頭、及びＢＡＬ液中のＥ遺伝子ＲＮＡ産物を定量化するサブゲノムＰＣＲ法によって測定した。
チャレンジの２日後、４匹の対照動物のうち４匹が、咽頭及び鼻腔区画において検出可能なサブゲノムウイルスＲＮＡ（Ｅ遺伝子、範囲３．１×１０５個～３．５×１０８個のウイルスコピー）を有していた。７日目までに、ウイルスＲＮＡ量はベースラインまで減少し、以前の研究と一致した。Ｏ／Ｗを除く全てのアジュバント群は、感染からの防御を提供した（図１９ａ、ｂ）。特に、ＡＳ０３群でチャレンジした５匹の動物のいずれも、咽頭ぬぐい液から検出可能なウイルスＲＮＡを常に有しておらず、１匹だけが対照動物の中央値（２．２×１０４個対２．５×１０７個のウイルスコピー）の約１，０００分の１のレベルで、鼻腔ぬぐい液で検出可能なウイルスＲＮＡを有していた。対照的に、ウイルスＲＮＡは、対照群よりも低いレベルではあるが、Ｏ／Ｗ群の４匹全ての動物の咽頭ぬぐい液から検出可能であり、４匹の動物のうち３匹は、鼻ぬぐい液で検出可能なウイルスＲＮＡを有していた。ＣｐＧ－ミョウバン群では、咽頭又は鼻腔ぬぐい液から検出可能なウイルスＲＮＡが検出されたのは５匹の動物のうち１匹のみであった。ＡＳ３７群と、かつ驚くべきことにミョウバン群では、両方の区画で５匹の動物のうち３匹で検出できないウイルスＲＮＡを示した（図１９ｃ）。
肺における防御を評価するために、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）液中のサブゲノムウイルスＲＮＡを測定した。ＥサブゲノムＲＮＡを使用してＢＡＬ中のウイルス量が陽性であった対照動物は２匹のみであることを見出したので、Ｎ遺伝子産物を測定するより感度の高いＰＣＲアッセイを使用した。チャレンジの２日後、４匹の対照動物のうち４匹全てが１０４～１０６個のウイルスコピーの範囲のウイルス量を示した。対照的に、ワクチン接種群のいずれの動物もＯ／Ｗ群の１匹の動物を除いて検出可能なウイルスを示さず（図１９ｄ）、Ｏ／Ｗ群を含む全てのワクチン接種群のＬＲＴにおける有効な防御を示唆した。疾患へのワクチン接種の有無にかかわらず、いずれの動物にも臨床的疾患の兆候はなかった（図２７）。しかしながら、対照動物はｎＡｂ力価の増加で応答したが、ワクチン接種動物は応答しなかったことから（図２８）、アカゲザルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は軽症になるという考えと一致している。全体として、アジュバントを用いたＲＢＤ－ＮＰワクチン接種は、上気道及び下気道におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する様々な程度の防御を提供した。
ワクチン関連増強呼吸器疾患（ＶＡＥＲＤ）は、呼吸器合胞体ウイルス及びＳＡＲＳ－ＣｏＶによる呼吸器感染症について以前に記載されている。チャレンジ当日及びチャレンジの４～５日後にＰＥＴ－ＣＴを使用して、動物のサブセットの肺組織における炎症を評価した。評価した６匹の動物（ワクチンなしの群から２匹、ＡＳ０３群から２匹、及びＣｐＧ－ミョウバン群から２匹を無作為に選択した）のうち、２－デオキシ－２－￥［１８Ｆ］フルオログルコース（ＦＤＧ）の取り込みの強化によって測定したところ、ベースラインと比較して４日目に両方の対照動物で炎症が見出された。対照的に、４匹のワクチン接種された動物のうちの１匹のみが、対照動物よりもはるかに少ない程度でＦＤＧ取り込みを示した（図１９ｅ及び図２９）。加えて、チャレンジ後１週間の全ての動物におけるＴｈ２偏光性及び好酸球性サイトカイン、例えばＩＬ－５及びＥｏｔａｘｉｎを含む２４個のサイトカインを測定し、サイトカイン応答の包括的な解析を行うことによって、肺における炎症を評価した。データは、任意のワクチン接種された動物の肺に増強された炎症がなかったことを実証している（図３０ａ及びｂ）。また、ヒトのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって誘発されることが知られているＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＦＮ－γ及びＭＣＰ－４などのサイトカインの存在量が、対照動物の肺では増加していたが、ワクチン接種された動物の肺では増加していなかった（図３０ｃ）。これらのデータは、これらの動物にＶＡＥＲＤがないことと一致している。
防御の免疫相関因子。次に、防御の免疫相関因子を同定することに着手した。５つの異なるアジュバント群があり、各群で異なる防御レベルを示したので、全群の動物を組み合わせて相関を解析した。ピーク時点（抗体応答の場合は４２日目、Ｔ細胞応答の場合は２８日目）で測定された体液性及び細胞性免疫応答を、ウイルス量（鼻腔又は咽頭）と相関させて、偏りのないアプローチで防御の推定相関因子を決定した。生ウイルス及び偽ウイルスの両方の中和力価は、鼻腔及び咽頭区画の両方で、防御の統計的に有意な相関因子の上位として浮上した（図２０ａ、ｂ、及び図３１ａ）。興味深いことに、ＮＰ特異的ＩＬ－２＋ＴＮＦ＋ＣＤ４ Ｔ細胞応答は、両区画における防御の統計的に有意な相関としても出現し（図２０ａ及び図３１ｂ）、その頻度はｎＡｂ力価と正の相関を示した（図３１ｃ）。これは、ＮＰ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞がＲＢＤ特異的Ｂ細胞にＴ細胞の助けを提供することができる可能性と一致している。
システム血清学的プロファイリングにより、ＲＢＤ－ＮＰワクチン接種に対する機能的抗体応答を明らかになる。ワクチン接種に対するｎＡｂ及びＴ細胞応答を特徴付けることに加えて、各アジュバントによって惹起される体液性機能プロファイルを理解しようと努めた。ワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに対する体液性免疫応答を速やかに誘発し、２１日目及び４２日目に、異なる抗スパイク抗体アイソタイプ（図２１ａ～ｃ）及びＦｃＲ結合（図２１ｄ）及びＡＤＮＰ（図２１ｅ）が大幅に増加した。ＩｇＭ応答は、ＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプと同じパターンに従い、一次免疫後に検出可能な応答が見られたが、全群で２回目の投与後に有意に増強された（図２１ａ）。ＡＳ０３が最も高い応答を有し、それに残りのアジュバントが続いた。体液性応答の差がウイルスのブレークスルーにどのようにつながるかを理解するために、４２日目に測定した抗体の特徴について、最小絶対収縮選択演算子（ＬＡＳＳＯ）を使用して部分最小二乗判別解析（ＰＬＳＤＡ）を行い、オーバーフィッティングを防ぐために特徴を選択した（図２１ｆ）。ＰＬＳＤＡ解析は、鼻腔及び咽頭においてウイルスのブレークスルーを有した動物と、ウイルスのブレークスルーを示さなかった動物との間の分離を示し（図２１ｆ）、防御された動物ではスパイクに対するＩｇＡ、ＦｃＲ３Ａ、及び抗体依存性好中球貪食（ＡＤＮＰ）のエンリッチメントが際立っていた（図２１ｇ）。
各測定された抗体特徴と鼻腔及び咽頭のピークウイルス量との相関を決定して、ウイルスのブレークスルーに対する防御を提供する抗体特徴を更に詳細に分析した。中和Ａｂ応答が依然として防御の最も強い相関を表す一方で、ＦｃＲ結合（ＲＢＤ ＦｃＲ２Ａ－２及びＳ１ ＦｃＲ２Ａ－２）、及び抗体依存性好中球貪食（ＡＤＮＰ）を含む追加の機能的特徴が観察され、これらは鼻腔又は咽頭ウイルス量と負の相関があった（図２１ｈ）。これらのデータは、防御における機能的抗体応答の相加的役割を実証した。更に、各アジュバント群では、ウイルスに対する防御と相関する抗体応答の異なるプロファイルが得られた（図３２）。群間のこれらの差異は、異なるアジュバントが独自の機能的抗体応答を誘発し、防御的抗ウイルス応答を調整することができることを強調している。
異なるスパイクベースの免疫原とＡＳ０３との比較。これまでに記載されたデータは、ＲＢＤ－ＮＰ免疫原にＡＳ０３、ＡＳ３７、ＣｐＧ－ミョウバン及びミョウバンをアジュバントすると、堅牢な防御免疫が誘発されることを実証している。次のステップとして、可溶性又はナノ粒子形態で、ＲＢＤ－ＮＰ免疫原の免疫原性を、プレフュージョンスパイク三量体の非常に安定したバリアントであるＨｅｘａＰｒｏの免疫原性と比較した。この目的のために、更に１５匹の雄性ＲＭを３群に分け、ＲＢＤ－ＮＰ、可溶性ＨｅｘａＰｒｏ、又はＩ５３－５０ナノ粒子上に表示された２０個のＨｅｘａｐｒｏ三量体（Ｈｅｘａｐｒｏ－ＮＰ）で免疫する第２の研究をデザインした（図２２ａ）。３つの群全てに、以前の実験で全ての動物において上気道及び下気道で最も高いｎＡｂ応答及び防御を提供したアジュバントであるＡＳ０３をアジュバントした。ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３免疫は、以前の研究と同等のｎＡｂ力価を誘発し、２１日目に検出可能な力価を示し、４２日目に堅牢にブーストした。ＲＢＤ－ＮＰと比較して、可溶性Ｈｅｘａｐｒｏ又はＨｅｘａｐｒｏ－ＮＰの免疫は、１回の免疫後に、マッチした偽ウイルス又は真正ウイルスに対して顕著に高いｎＡｂ力価を誘発した（図２２ｂ、ｃ）。しかしながら、ＲＢＤ－ＮＰは、４２日目に３つの群間でｎＡｂ力価の大きさに統計的な差がないほど強くブーストした（図２２ｂ、ｃ）。更に、ＡＳ０３による可溶性Ｈｅｘａｐｒｏ免疫はまた、ＲＢＤ－ＮＰの場合のように、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１バリアントに対する交差反応性ｎＡｂ応答を惹起した（図２２ｄ）（図１７ａ）。総合すると、これらのデータは、ＲＢＤ－ＮＰは、プレフュージョンスパイク三量体の高度に安定なバージョンと同程度に強力な免疫原であり、三量体スパイクの感染又は免疫によって惹起される中和抗体応答の大部分がＲＢＤを標的としているという以前の観察と一致している。更に、これらのデータは、ＡＳ０３が様々な形態のスパイクタンパク質との臨床使用のための好適なアジュバントとして考慮され得ることを示唆している。
最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する２つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチンが緊急使用承認されたことは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックとの闘いにおける大きなマイルストーンとなる。しかしながら、世界の全人口にワクチンを接種するために数十億回分のワクチンを製造するには、様々なワクチン候補のポートフォリオが必要になる。特に、乳幼児及び高齢者などの特別な集団にワクチン接種することは、そのような集団における安全性及び有効性の実証可能な記録を有するサブユニット・アジュバンテッド・ワクチン・プラットフォームの使用が有益であり得る。本研究の主な目的は、新規ＲＢＤ－ＮＰサブユニットワクチン候補の臨床開発のためのアジュバントを選択することであった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－ＮＰ免疫原による増強された応答を惹起する能力について、数百万回の用量の認可済みワクチンで使用されているミョウバン及びＡＳ０３の２つを含む５つの異なるアジュバントを評価した。試験した全てのアジュバントは、相当なｎＡｂ力価を誘発した（図１６ｃ、ｄ）。驚くべきことに、Ｏ／Ｗは、他のアジュバントと比較して相対的に低いｎＡｂ力価を誘発した。Ｏ／Ｗは、ＡＳ０３と同様の水中油型エマルションであるが、高い規模の抗体応答を達成するために必要とされることが示されている強力な免疫調節物質であるα－トコフェロールを含有しない。α－トコフェロールの不在は、Ｏ／Ｗ群において一次免疫後の応答が欠如し、ブースティング後に誘発された力価が比較的低かったことの説明となり得るが、マウスにおける並行研究は、Ｏ／ＷがＡＳ０３と同様に免疫原性であることを実証した。一方、ミョウバンは、ＡＳ０３のｎＡｂ応答と統計的に同等のｎＡｂ応答を誘発した。ピーク免疫応答は同等であったが、今後の研究では、ミョウバンを用いたワクチン接種による長期持続免疫の特徴を明らかにすることを目指すべきである。一般に、全てのアジュバントが検出可能な抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発し、ＡＳ０３及びＣｐＧ－ミョウバンは最も高い頻度を誘発した。注目すべき知見は、ＮＰ－骨格（ＮＰ－ｓｃａｆｆｏｌｄ）に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞応答が高い規模で誘発されることであった。これらのＮＰ－骨格特異的ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＲＢＤ特異的Ｂ細胞にＴ細胞の助けを提供し、Ｂ細胞応答を促進する可能性が高い。
これらの免疫応答とともに、様々なアジュバント群において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるＩＮ／ＩＴチャレンジに対する様々なレベルの防御を観察した。更に、ＶＡＥＲＤの可能性を排除するため、チャレンジから４日後に肺の炎症は観察されなかった。異なる群間で観察された様々な応答から、防御の推定相関因子を解析することが可能になった。偏りのない相関アプローチを使用して、ｎＡｂ応答を防御の一次相関として決定したが、ＮＰ特異的ＩＬ－２＋／ＴＮＦ＋応答も相関を示した。この相関は、図３１Ｃに示されるように、Ｔ細胞とｎＡｂ応答との間の相関の間接的な効果によるものなのか、又はＴ細胞がｎＡｂ応答と相乗作用することによって防御の独立した相関を表すのか、今後の研究で確認される必要がある。最後に、重要なこととして、ＲＢＤ－ＮＰ／ＡＳ０３免疫によって誘発されたｎＡｂ応答は持続性があり、免疫後最大５ヶ月間、ヒトＡＣＥ２へのウイルススパイクＲＢＤ結合を効率的にブロックした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＲＢＤは、宿主の膜受容体に結合することによってウイルス感染を媒介し、ＡＣＥ２はウイルス細胞侵入の主要な受容体として記載されている。スパイクタンパク質の宿主プロテアーゼ活性化、及び膜貫通糖タンパク質ＣＤ１４７（ｂａｓｉｇｉｎ）、及び７８ｋＤａのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）受容体などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入に関与すると考えられ得る他の宿主細胞受容体の存在の文脈において、ワクチン応答が宿主において同様の持続的な遮断活性を提供するかどうかは、まだ調査されていない。全体として、ＡＳ０３及びＣｐＧ－ミョウバン群において誘発されたｎＡｂ応答の大きさは、マカクにおけるモデルナ及びファイザーｍＲＮＡワクチンと同等であった。ミョウバン群とＡＳ３７群もそれほど大きな差はなかったが、Ｏ／Ｗ群では中等度の応答しか惹起されなかった。オーサーがＴｈ２型応答を観察しなかったモデルナ（ｍＲＮＡ１２７３）とは対照的に、ＣＤ４ Ｔ細胞においてＴｈ２（ＩＬ－４）応答を観察した。異なるアジュバントによって誘発されたＴｈ１／Ｔｈ２プロファイルにも差があった。ＡＳ０３はＴｈ１とＴｈ２型の応答のバランスのとれたミックスを誘発したが、ＣｐＧ－ミョウバンはＴｈ１型応答が高く、ミョウバンはＴｈ２型応答に偏った。ファイザーワクチンＢＮＴ１６２ｂ２で免疫されたマカクにおいても適度なＩＬ－４応答が見られ、ヒトにおいて安全であることが実証されている。更に、チャレンジされた動物にＶＡＥＲＤのエビデンスは見られなかったことから、Ｔｈ２型応答はヒトにおいて懸念されない可能性があることが示唆された。アジュバント併用ＲＢＤ－ＮＰ免疫はまた、新興バリアントＢ．１．１．７．及びＳＡ株Ｂ．１．３５１の交差中和も誘発し、これは回復期血清による中和に対してより抵抗性があり、免疫逃避を示すと思われる。３つの群全てにおけるｎＡｂ応答は全体的な低下を示したが、ＡＳ３７群（１６倍）は、ＡＳ０３群（４．５倍）と比較して急激な低下を示し（図１７ｂ及び表１）、これは、異なるアジュバントが、抗体による中和の幅を促進するそれらの能力において変化し得ることを示している。これらの知見を確認し、これらの結果の根底にある機序を明らかにするために、更なる実験が必要であるが、異なるアジュバントが様々な程度の幅のｎＡｂ応答を促進し得るという我々の観察は、一般的にワクチン学に対してより広範な関連性を有し得る。
臨床的に意義のあるアジュバントを評価することに加えて、ＲＢＤ及びプレフュージョン安定化三量体スパイク免疫原の免疫原性も比較した。我々の結果は、ＲＢＤ－ＮＰ免疫原が、プレフュージョンスパイク三量体に基づく免疫原と同様にｎＡｂ力価を誘発する能力があることを実証している。低用量の抗原で免疫原性の差が明らかになるかどうかは、更なる調査が必要である。とはいえ、これらのデータは、両方の抗原フォーマット（すなわち、ＲＢＤ対プレフュージョン安定化三量体スパイク）のワクチン候補がＡＳ０３で高い免疫原性を示し、各々が異なる製造上の考慮事項を伴うことから、臨床への前進を促すものである。この分野にとって特に興味深いのは、ＲＢＤ－ＮＰ又はＨｅｘａＰｒｏベースの免疫原によって惹起されたｎＡｂ応答が、新しいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対してだけでなく、他のコロナウイルスに対しても広範に誘発されるかどうかを評価することである。スパイク免疫原を用いて他のアジュバントは試験していない。異なるアジュバントと組み合わせた場合、免疫原性が免疫原間で異なることが形式的に可能である。
全体として、本研究は、候補サブユニットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンに対する堅牢で非常に有効な免疫応答を促進する臨床的に意義のあるワクチンアジュバント及び抗原のセットの最も包括的な比較免疫学的評価を表す。これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－ＮＰ免疫原と併用した場合、認可済みワクチンで使用されているＡＳ０３及びＣｐＧ１０１８（ミョウバン入り）を含むいくつかのアジュバントの有望な性能を明らかにしている。これらの結果は、これらのアジュバントを有するＲＢＤ－ＮＰ及び他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニットワクチンの臨床開発にとって良い兆候である。
したがって、上記は単に本発明の原理を例示するにすぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載又は示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解されるであろう。更に、本明細書に列挙される全ての例及び条件付き言語は、主に、読者が本発明の原理及び当該技術分野を更に進めるために発明者らが寄与する概念を理解するのを助けることを意図しており、そのような具体的に列挙される例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態を記載する、本明細書の全ての記述、並びにそれらの具体例は、それらの構造的及び機能的均等物の両方を包含することが意図されている。加えて、そのような均等物は、構造に関係なく、現在知られている均等物と、将来開発される均等物との両方、すなわち、同じ機能を実行するように開発された任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、説明された例示的な実施形態に限定されることを意図されていない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１３８，１６３号の利益及び優先権を主張し、その開示全体は本明細書に記載される。

Claims (27)

  1. 自然免疫細胞のエピゲノムを調節するための方法であって、
    アジュバントを含む免疫刺激組成物を個体に投与して、前記組成物中に存在する抗原とは無関係の病原体に対する広範かつ持続的な自然免疫を刺激することを含む、方法。
  2. 前記免疫刺激組成物は、アジュバントを含むが、追加の抗原を欠く、請求項１に記載の方法。
  3. 前記免疫刺激組成物がアジュバントからなる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記免疫刺激組成物が、アジュバントと、非病原体抗原、又は病原体に由来する抗原とを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記免疫刺激組成物が、アジュバントと、季節性又はパンデミックインフルエンザウイルスの抗原物質とを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記アジュバントが油中水型エマルションである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記エマルションがスクアレンを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記アジュバントがＡＳ０３及び／又はＭＦ５９である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記アジュバントが、ＴＬＲ７／８若しくはＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４リガンド、又はこれらの任意の組み合わせを含む、ＴＬＲリガンドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記アジュバントが、ナノ粒子又は他の製剤に封入される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記アジュバントが、単球、ｍＤＣ、又は抗ウイルス抵抗性の増強をインプリントする骨髄系細胞におけるエピジェネティック状態を刺激する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記アジュバントが、単球、ｍＤＣ、又は骨髄系細胞におけるエピジェネティック状態を刺激し、それらを、炎症促進性サイトカイン、例えばＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１ベータの産生を行うことに対して不応性にする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 単球及びｍＤＣにおけるエピジェネティック状態を刺激して感染における過剰な炎症又は敗血症を抑制するのに使用するための請求項１２に記載の方法。
  14. 単球及びｍＤＣにおけるエピジェネティック状態を刺激して自己免疫疾患における過剰な炎症を抑制するのに使用するための請求項１２に記載の方法。
  15. 投与が、ウイルス感染に対して予防的である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記個体が病原体曝露の増加したリスクにある期間の前に投与が行われる、請求項１５に記載の方法。
  17. 投与のために選択した個体が、低下した適応免疫応答を有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 免疫応答状態が弱まるにつれて、好適な間隔で投与が繰り返される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記個体が、骨髄系細胞のエピジェネティック変化について監視される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 古典的単球及び骨髄系樹状細胞が、エピジェネティック変化について監視される、請求項１９に記載の方法。
  21. 応答状態が、ＩＲＦ遺伝子座におけるクロマチンアクセシビリティの増加、抗ウイルス遺伝子発現の増強、及び骨髄系細胞におけるインターフェロン産生の上昇によって特徴付けられる、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. エピジェネティック監視が、単一細胞技術を用いて行われる、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記単一細胞技術が、ＥｐｉＴＯＦ（Ｔｉｍｅ－Ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔによるサイトメトリーを使用するエピジェネティックランドスケーププロファイリング）、単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、又は単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記単一細胞技術がＥｐｉＴＯＦであり、免疫細胞同一性を決定するためのマーカー、総ヒストンレベルを推定するためのマーカー、並びにアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、シトルリン化、及びクロトニル化を含む異なるヒストン修飾を評価するためのマーカーを含む、マスサイトメトリーのための抗体パネルを使用する、請求項２２に記載の方法。
  25. ＥｐｉＴＯＦ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、又は単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑが、自然細胞のエピジェネティック状態を決定するために使用され、ウイルス感染に対する感受性又は抵抗性を評価するためのバイオマーカーとして使用される、請求項２３又は２４に記載の方法。
  26. ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＳＴＡＴ５ｂ、ＵＳＦ１遺伝子座のクロマチンアクセシビリティの増加によって特徴付けられた、単球及びｍＤＣ又は他の細胞におけるエピジェネティックシグネチャーが、ウイルス感染に対する感受性又は抵抗性を予測するためのバイオマーカーとして使用される、請求項２５に記載の方法。
  27. ＡＰ－１、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ遺伝子座のクロマチンアクセシビリティの低下によって特徴付けられた、単球及びｍＤＣ又は他の細胞におけるエピジェネティックシグネチャーが、ウイルス又は細菌感染における感受性又は炎症若しくは敗血症の増強を予測するためのバイオマーカーとして使用される、請求項２６に記載の方法。
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