JP2024503394A - ４－１ｂｂと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント - Google Patents

４－１ｂｂと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント Download PDF

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Abstract

本発明は、４－１ＢＢと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。４－１ＢＢと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントの特異性が強く、前記抗体及びその抗原結合フラグメントと抗原とが結合した後、Ｔ細胞の免疫殺傷機能を増強させると同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともにサイトカインの分泌を促進させ、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。

Description

本発明は、抗体及び抗体ヒト化改変研究分野に関し、特に、本発明は、４－１ＢＢと特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
モノクローナル抗体は、単一の抗原のエピトープにのみ作用する高度な標的特異的抗体であり、例えば癌、炎症、自己免疫疾患、感染症などの多くの疾患の治療に広く用いられており、特に癌の化学療法が無効になった後、このような標的特異的薬剤は特に重要である。
４－１ＢＢは、共刺激分子であり、ＴＮＦＲＳＦに属する。それは、８０年代末にＴサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞をコンカナバリンＡで刺激して発見したものである。ヒト４－１ＢＢＬは、１９９４に初めて直接発現クローンによって活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球から単離された。４－１ＢＢＬは、主に樹状細胞、Ｂ細胞又はマクロファージに発現している。既存の研究の結果から明らかなように、ＴＮＦＳＦ－ＴＮＦＲＳＦのリガンド－受容体（例えばＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７－ＣＤ７０又はＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ）シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育及び死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、ＴＮＦＲＳＦ及びＴＮＦＳＦメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、Ｔ細胞及び他の免疫細胞を十分に活性化するために２種類のシグナルが必要である。第１種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第２種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このタイプのシグナルは、Ｔ細胞とＡＰＣｓ上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されるものである。
このため、ＴＮＦＳＦ及びＴＮＦＲＳＦリガンド－受容体相互作用に対する免疫治療技術は、癌の治療において高い潜在力を持っている。この分野では、依然として、より効果的な４－１ＢＢと特異的に結合する抗体を開発する必要がある。
本発明の第１の態様は、単離された抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体に関し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示す重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲを含む。
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む。ここで、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すＬＣＤＲ１のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示すＬＣＤＲ２のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示すＬＣＤＲ３のようなアミノ酸配列を含み、及び／又は、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示すＨＣＤＲ１のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示すＨＣＤＲ２のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示すＨＣＤＲ３のようなアミノ酸配列を含む。
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－３又は４－６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－３又は４－６に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体から選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる。好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、４－１ＢＢキメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記４－１ＢＢキメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域であって、ここで、
（ａ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する；及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１のアミノ酸配列から選ばれるものを有する；
（ｂ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すアミノ酸配列を有する；及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１のアミノ酸配列から選ばれるものを有する；
（ｃ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する；及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示すアミノ酸配列を有する。
好ましくは、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すアミノ酸配列を有する；及び／又は、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである。
本発明の第２の態様は、以下のものから選ばれる単離された核酸分子に関する：
（１）第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義されたＤＮＡ又はＲＮＡと完全に相補的な核酸。
本発明の第３の態様は、効果的にライゲーションした第２の態様に係る核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
本発明の第４の態様は、第２の態様に係る核酸分子又は第３の態様に係るベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明の第５の態様は、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞、及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に関する。
本発明の第６の態様は、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体を生産する方法に関し、前記方法は、第４の態様に係る宿主細胞を前記抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させるステップを含み、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含み、任意選択的に、得られた産物を前述したような診断剤及び／又は治療剤に結合させるステップを含む。
本発明の第７の態様は、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞の使用に関する。
本発明の第８の態様は、４－１ＢＢを介した疾患又は病症を予防及び／又は治療するための薬剤における、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞の使用に関し、ここで、前記疾患又は病症は、好ましくは、腫瘍である。より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
本発明の第９の態様は、必要とする被験者に、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞を投与するステップを含む、腫瘍を予防及び／又は治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、宮頸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記被験者は、哺乳動物から選ばれ、ヒト及び／又は他の霊長類動物を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、核酸分子、ベクター又は宿主細胞は、当分野の通常の施用方法、例えば非経口経路、静脈内投与により使用される。
本発明の抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、特異性が強く、安定性がよく、強いＴ細胞機能への調節活性と良好な薬物動態特性を有し、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。また、本発明の抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬへのブロッキング活性がＵｒｅｌｕｍａｂモノクローナル抗体より強い。
以下、本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記載に使用する必要がある図面に対して簡単に紹介する。なお、以下の記載における図面は、ただ本発明の一部の実施形態に過ぎない。当業者は、創造的な労働を付与しない前提で、これらの図面によって他の図面を得ることもできる。
図１のＡは、４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体配列の結合活性を示し、図１のＢは、４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体配列のアゴニスト活性を示す。 ４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の結合活性を示す。 図３のＡは、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の種特異性を示し、図３のＢは、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の結合特異性を示す。 抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ結合へのブロッキング活性を示す。 遺伝子ノックインマウス相同腫瘍モデルにおける抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の抗腫瘍効果を示す。 ４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの結合活性を示す。 抗ヒト４－１ＢＢヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ結合へのブロッキング活性を示す。
定義
用語であるヒト「４－１ＢＢ」、即ちＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー（ＴＮＦＲＳＦ９）に属し、主に活性化されたＴ細胞に発現し、Ｔ細胞共刺激分子であり、そのリガンドは、４－１ＢＢＬである。
本明細書で使用される用語である「抗４－１ＢＢ抗体」、「抗４－１ＢＢ」、「４－１ＢＢ抗体」、「抗４－１ＢＢモノクローナル抗体」又は「４－１ＢＢと結合する抗体」とは、４－１ＢＢタンパク質又はそのフラグメントと十分な親和性で結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体は、異種の４－１ＢＢにおける保存された４－１ＢＢのエピトープと結合する。
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又は抗原のエピトープと結合する能力を持つ免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含み、通常、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び少なくとも２本の軽（Ｌ）鎖から構成される。免疫グロブリンは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブクラス）、ＩｇＭ及びＩｇＥのアイソタイプを含み、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。軽鎖は、定常領域によってκ鎖とλ鎖に分けられる。
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のうち、抗体とその抗原との結合に関与するドメインを指す。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略記する）から構成され、重鎖定常領域は、通常、三つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略記する）から構成される。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には抗原認識を担当するが、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体及び古典補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）との結合を媒介することができる。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる超可変領域（ＨＶＲ）に細かく分けられ、それらの間にはより保存的な「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域が介在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲドメイン及び４つのＦＲドメインから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で配列される。
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」とは互換的に使用されてもよい）とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する領域を指す。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖の３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のＣＤＲ配列を含むが、異なるスキーム（例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ）を適用することによって、いわゆるＣＤＲの境界が、本発明で定義される特定のＣＤＲの境界と異なる抗体をさらに含む。
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単分子組成物の抗体分子製剤としての、基本的に同質の抗体群から得られた抗体を指し、即ち、個体抗体を含む群は、わずかに存在する天然に発生する可能性がある突然変異以外は同じである。一般的なモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、２種以上のＦａｂドメインから構成されてもよく、これにより、２種以上のターゲットに対する特異性を向上させる。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、任意の具体的な産生方法（例えば、組換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど）に限定されるものではない。
用語「二重抗体」、「二重機能的抗体」、「二重特異性抗体」、「ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ」又は「ＢｓＡｂ」とは、２個の異なる抗原結合部位を有することにより、２つのターゲット抗原と同時に結合することができ、抗体の標的性を発揮すると同時に別の特殊な機能エフェクター分子を媒介する作用を持つものである。媒介された特殊な機能エフェクター分子は、毒素、酵素、サイトカイン、放射線核種などであってもよく、抗原と結合する、二重特異性抗体の２つのアームは、それぞれＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ又はｄＳＦｖなどに由来してもよい。
用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる抗原決定基（「エピトープ」）に対する異なる抗体の調製物を指す。
用語「抗体の抗原結合フラグメント」とは、エピトープと結合できる抗体のフラグメント、部分、領域又はドメインを指す（例えば切断、組換え、合成などによって得られてもよい）。抗原結合フラグメントは、このような抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はすべての６つのＣＤＲドメインを含むことができ、また、前記エピトープと結合できるにもかかわらず、異なる特異性、親和性又は選択性を示すことができる。好ましくは、抗原結合フラグメントは、前記抗体のすべての６つのＣＤＲドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、１本のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）の一部であってもよく、又は、１本のポリペプチド鎖を含むものであるか、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖（それぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する）（例えば、二重抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなど）の一部であってもよく、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。
本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例として、（ａ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂ’又はＦａｂフラグメント；（ｂ）ジスルフィド結合によってヒンジドメインで連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｃ）ＶＨ領域及びＣＨｌドメインからなるＦｄフラグメント；（ｄ）抗体の１つのアームのＶＬ領域及びＶＨ領域からなるＦｖフラグメント；（ｅ）遺伝工学的手法により抗体ＶＨ及びＶＬを結合ペプチドセグメントで連結した組換えタンパク質である単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ，ｓｃＦｖ）；（ｆ）基本的にＶＨ領域からなり且つドメイン抗体（Ｈｏｌｔなど，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２ｉ（ｌｌ）： ４８４－９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｇ）ラクダ又はナノ抗体（Ｒｅｖｅｔｓなど，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，５（ｌ）： １１１－２４）及び（ｈ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
用語「キメラ抗体」とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来し又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は同種であるが、鎖の残りの部分が他の種に由来し又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は同種であることを指す。本発明は、ヒト抗体由来の可変領域抗原結合配列を提供する。このため、本明細書で主に注目したキメラ抗体は、１つ又は複数のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し且つ１つ又は複数の非ヒト抗体由来配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含有する抗体を含む。なお、本明細書で記載されるキメラ抗体は、１種の抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列及び他の抗体クラス又はサブクラスに由来する他の配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含む抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」とは、他の哺乳動物種、例えばマウス種に由来するＣＤＲ配列がヒトフレーム配列に移植された抗体を指す。ヒトフレーム配列において別途のフレーム領域修飾を行うことができる。
用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」（「ｈｕｍＡｂ）又は「ＨｕＭａｂ」）とは、ヒト種系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト種系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発、又は遺伝子再構成中、又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異）。
変異体抗体も本発明の範囲内に含まれる。このため、本願で挙げられた配列の変異体も本発明の範囲内に含まれる。当分野で知られている方法を使用することにより改良された親和性を有する抗体配列の他の変異体を得ることができ、且つ、これらの変異体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換は、さらに改良された親和性を有する抗体を得るために用いることができる。又は、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、抗体の生産における発現系の翻訳効率を改善するために用いることができる。このような変異体抗体の配列は、本願で挙げられた配列と７０％又はそれ以上（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列相同性を有する。このような配列相同性は、参照配列（即ち、本願で挙げられた配列）の全長に対して計算して得られたものである。
ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）又はＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２，アメリカ合衆国保健福祉省；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７に従って、本発明に係る領域におけるアミノ酸残基に番号を割り当てる。特に明記されていない限り、本発明におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
抗体又はその抗原結合フラグメントが他の分子の領域（即ち、エピトープ）と「特異的に」結合することとは、他のエピトープよりも、より頻繁に、より速く且つより長い持続時間及び／又はより大きな親和性で前記エピトープと反応又は結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０－７Ｍ、例えば１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ又はそれ以上の親和性でヒト４－１ＢＢと結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理条件下で（例えば、インビボで）結合する。このため、４－１ＢＢと特異的に結合することは、この抗体又はその抗原結合フラグメントが上記の特異性及び／又はこのような条件で４－１ＢＢに結合する能力を指す。前記結合を決定するのに適した方法は、当分野で知られているものである。
抗体と指定された抗原とが結合するという背景下で、用語「結合」とは、通常、約１０－６Ｍ又はそれ以下のＫＤに対応する親和性で結合することを指し、このＫＤは、指定された抗原又は緊密に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対するこの抗体の結合の親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍低い。
本明細書で使用されるように、用語「ｋｄ」（ｓｅｃ－１又は１／ｓ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
本明細書で使用されるように、用語「ｋａ」（Ｍ－１ ｘ ｓｅｃ－１又は１／Ｍｓｅｃ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を指す。
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」（Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、且つｋｄをｋａで割ることにより得られるものである。
本明細書で使用されるように、用語「ＫＡ」（Ｍ－１又は１／Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合平衡定数を指し、且つｋａをｋｄで割ることにより得られるものである。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲの一部（即ち、結合に必要なＣＤＲ残基サブグループ、ＳＤＲと呼ばれる）のみがヒト化抗体で結合していればよい。分子モデリング及び／又は経験に応じて、又はＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．など，（２００４），ＳＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｏｆ Ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈｕｍａｎ ＧｅｒｍＬｉｎｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ Ｔｏ Ｍｉｎｉｍｉｚｅ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４１：８６３－８７２に記載されるように、先行研究に基づいて（例えばＣＤＲ Ｈ２における残基Ｈ６０－Ｈ６５が、通常、不要である）Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ以外に位置するＫａｂａｔ ＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔなど，（１９９２），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，公開番号９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．など，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７を参照されたい）から関連するエピトープと接触しなく且つＳＤＲに位置しないＣＤＲ残基を同定することができる。このようなヒト化抗体において、１つ又は複数のドナーであるＣＤＲ残基が存在しなく又はドナーであるＣＤＲ全体が省略される位置で、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において対応する位置（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）を占めるアミノ酸であってもよい。このような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減らし、これにより、潜在的な免疫原性を低下させる点で潜在的に有利である。しかし、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性もあり、且つ親和性が著しく低下することを避けることが望ましい。経験に応じてＣＤＲ内の置換位置及び置換されるアミノ酸を選択することもできる。
ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸を変えて機能的結合が失われるという事実を利用して（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．など，（１９８２），Ｓｉｎｇｌｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｌｔｅｒｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ））７９（６）：１９７９－１９８３）、代替可能な機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定することができる。このような変異体ＣＤＲを得るための好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの変異を誘発して（例えばランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により）置換されたアミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列における関連する残基の身元と置換された（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の身元とを比較することにより、この置換されたＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊの置換スコアを同定することができる。ＢＬＯＳＵＭシステムは、配列データベースを分析して作成されたアミノ酸置換行列を提供して、信頼性の比較に用いられる（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，（２００４），Ｗｈｅｒｅ Ｄｉｄ Ｔｈｅ ＢＬＯＳＵＭ６２ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｏｍｅ Ｆｒｏｍ？，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（８）：１０３５－１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，（１９９２），Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８９：１０９１５－１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．など，（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅｓ），ＰＮＡＳ，８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１），Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｃｅｓ Ｆｒｏｍ Ａｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９、５５５－５６５。現在、最も先進的なＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高いほど、置換が保存的であるので、この置換は、機能に影響を与えない可能性が高くなる）。例えば、得られたＣＤＲを含む抗原結合フラグメントが４－１ＢＢに結合できない場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、十分に保存的ではないと考えられ、より高い置換スコアを持つ新たな候補置換を選択して生成する。このため、例えば、元の残基がグルタミン酸（Ｅ）であり且つ非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、０であり、且つ、より保存的な変化（例えばアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリジン）は、好ましいものである。
そこで、本発明は、改良されたＣＤＲの同定におけるランダム変異誘発の使用を考慮した。本発明の背景下で、保存的置換は、以下の３つの表における１つ又は複数のアミノ酸のカテゴリ内の置換により定義されてもよい。
保存的置換を行うアミノ酸残基の種類：
代替の保存的アミノ酸残基置換の種類：
アミノ酸残基の物理的及び機能的代替の分類：
より保存的な置換グループには、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン及びアスパラギン－グルタミンが含まれる。
いくつかの実施形態において、親水性アミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ及びＬｙｓから選ばれる。
さらに、例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，（１９８４），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている原理を用いて別のアミノ酸グループを作成することもできる。
このため、含まれる抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配列は、置換によって親抗体のＣＤＲの配列と異なることができる。例えば４、３、２又は１個のアミノ酸残基の置換が挙げられる。本発明の実施形態によれば、ＣＤＲ領域におけるアミノ酸は、以上の３つの表で定義されるように、保存的置換で置換されてもよい。
「相同性」又は「配列同一性」とは、配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。
このような変異体ポリペプチド配列は、本願で挙げられる配列と、７０％又はそれ以上（即ち８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の様々な長さの連続した延出セグメントを含むポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、適用可能な場合、本発明に提供されるペプチド配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０又はそれ以上の本発明で開示される１つ又は複数の配列の連続したペプチド、及びそれらの間の中間程度の長さを有するすべてのペプチドを含む。
用語「治療」とは、疾患又は病状の進展又は重症度を改善、緩和、減弱又は逆転させたり、このような疾患又は病状の１種又は複数種の症状又は副作用を改善、緩和、減弱又は逆転させたりすることを指す。本発明において、「治療」はまた、有益又は有望な臨床結果を得るための方法を指し、ここで、「有益又は有望な臨床結果」は、部分的又は全部的なものや、検出可能又は検出不可能なものにもかかわらず、症状の緩和、病状又は疾患程度の減少、安定化した（即ち悪化していない）疾患又は病状の状態、疾患又は病状の状態の進展の遅延又は緩和、疾患又は病状の状態の改善又は軽減及び疾患又は病状の緩和を含むが、これらに限定されない。
用語「予防」とは、本発明の抗体及びその機能的フラグメントを投与することにより、疾患又は病况の少なくとも１種の症状の進展を阻止又は阻害することを指す。この用語は、緩和中の被験者を治療して再発を予防又は阻害することをさらに含む。
本発明の抗体は、組換えＤＮＡにより産生されたモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有してもよい。アイソタイプの選択は、通常、所望のエフェクター機能（例えばＡＤＣＣ誘導）により決定される。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれか一方を用いることができる。必要であれば、公知の方法により本発明の抗４－１ＢＢの抗体のクラスを変換することができる。例えば、本発明の最初のＩｇＧ抗体は、クラスを本発明のＩｇＭ抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧｌをＩｇＧ２に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプ切り替えにより例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ２抗体、例えばＩｇＧ２ａである。抗体のアミノ酸配列が他のアイソタイプに対してこのアイソタイプとほとんど同じである場合、この抗体は、特定のアイソタイプに属する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体であり、好ましくはＩｇＧ抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体－抗原結合フラグメント又は単鎖抗体である。
いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体は、一価抗体であり、好ましくは、ＷＯ２００７０５９７８２（その全体が引用により本明細書に援用される）に記載されたようなヒンジ領域に欠失を有する一価抗体である。このため、いくつかの実施形態において、抗体は、一価抗体であり、ここで、前記抗４－１ＢＢ抗体は、以下の方法により構築される：ｉ）一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗４－１ＢＢ抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及びＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されており、また、ＩｇＧ１サブクラスの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、このＣＬ領域は、このＣＬ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合又は共有結合を形成できる任意のアミノ酸を含まない；ｉｉ）一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、ヒンジ領域及び（例えばＩｇサブクラスに要求される）ＣＨ領域の他の領域（例えばＣＨ３領域）に対応する領域には、ヒトＩｇのＣＨ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドと、ジスルフィド結合又は共有結合若しくは安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することに関与する任意のアミノ酸残基が含まれておらず、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されている；ｉｉｉ）一価抗体を産生するための細胞発現系を提供する；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞で（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸構築物を共発現させて前記一価抗体を産生する。
同様に、いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体は、一価抗体であり、
（ｉ）本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域又はそのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このＣＨ領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び（この免疫グロブリンがＩｇＧ４サブクラスではない場合）ＣＨ領域の他のドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じＣＨ領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で同じＣＨ領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
他のいくつかの実施形態において、一価抗体の重鎖は修飾されることにより、ヒンジ領域全体が欠失している。
他の実施形態において、一価抗体の配列は修飾されることにより、Ｎ－結合型グリコシル化のための任意の受容体サイトが含まない。
本発明は、「二重特異性抗体」をさらに含み、ここで、抗４－１ＢＢ結合領域（例えば、抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢ結合領域）は、１種以上のエピトープを標的とする二価又は多価二重特異性フレームワークの一部である（例えば、第２のエピトープは、アクティブトランスポート受容体のエピトープを含むことができ、これにより、この二重特異性抗体は、生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えた、改善された細胞転移作用を示し、又は、第２のエピトープは、他の目的タンパク質を標的とするエピトープである）。このため、他の実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体の一価Ｆａｂは、他の異なるタンパク質を標的とするＦａｂ又はｓｃｆｖに連結されることにより、二重特異性抗体を産生することができる。二重特異性抗体は、例えば抗４－１ＢＢ結合領域から付与される治療機能及び受容体分子に結合されて生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えて転移するトランスポート機能を増強させることができるという二重機能を有することができる。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体をさらに含む。単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖のＦｖドメインが連結されたペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供し、ここで、本発明の抗４－１ＢＢ抗体のＦｖ中の重鎖及び軽鎖は、フレキシブルペプチド（典型的には、約１０、１２、１５又はそれ以上のアミノ酸残基）で連結されて１本のペプチド鎖を形成する。このような抗体を産生する方法は、例えばＵＳ ４，９４６，７７８；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ： ２６９－３１５（１９９４）；Ｂｉｒｄなど，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎなど，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８）及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２－５５４（１９９０）に記載されている。単一のＶＨ及びＶＬだけを使用する場合、単鎖抗体は、一価のものであり、２つのＶＨ及びＶＬを使用する場合、二価のものであり、又は、２つ以上のＶＨ及びＶＬを使用する場合、多価のものである。
当分野で知られている任意の技術により本発明の抗体を産生し、例えば任意の化学的や生物学的や遺伝学的又は酵素学的な技術に限定されなく、単独で又は組み合わせて使用することができる。通常、所望の配列のアミノ酸配列が知られており、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術により前記抗体を容易に産生することができる。例えば、公知の固相方法によりこれらの抗体を合成することができ、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで製造された装置）を用いてメーカーの説明書に従ってこれらの抗体を合成する。又は、当分野における公知の組換えＤＮＡ技術により本発明の抗体を合成することができる。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んでこれらのベクターを所要の抗体の発現に好適な真核又は原核宿主に導入した後、ＤＮＡ発現産物としての抗体が得られ、その後、既知の技術を用いて宿主から抗体を単離することができる。
任意の「好適な」数の修飾されたアミノ酸を含み、及び／又はカップリング置換基と結合することにより、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを修飾することができる。このような場合に、「好適」は、通常、非誘導体化親抗４－１ＢＢ抗体に関連する４－１ＢＢ選択性及び／又は４－１ＢＢ特異性を少なくとも基本的に保持する能力によって決定される。１つ又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことは、例えばポリペプチド血清半減期の増加、ポリペプチド抗原性の低減又はポリペプチド貯蔵安定性の向上に寄与することができる。１種又は複数種のアミノ酸に対する修飾は、例えば、組換え生産の過程において翻訳と同時に行われ、又は、翻訳後に行われ（例えば、哺乳動物の細胞での発現過程においてＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列におけるＮ－結合型グリコシル化作用）、又は合成手段によって行われる。修飾されたアミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、イソプレン化（例えば、ファルネシル化、ゲラニル－ゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などを含む。アミノ酸修飾を行う参考文献は、本分野ではよく知られており、例えばＷａｌｋｅｒ，（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｏｎ ＣＤ－Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照する。修飾されたアミノ酸は、例えばグリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸から選ばれてもよい。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、共価結合によりポリマーに結合して化学修飾を行うことにより、循環半減期を増加させることもできる。例示的なポリマー及びそれをペプチドに連結する方法は、例えばＵＳ ４，７６６，１０６；ＵＳ ４，１７９，３３７；ＵＳ ４，４９５，２８５及びＵＳ ４，６０９，５４６を参照する。また、例示的なポリマーとして、ポリオキシエチル化されたポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量が約１，０００～４０，０００Ｄの間、例えば約２，０００～２０，０００Ｄの間、例えば約３，０００～１２，０００ＤのＰＥＧ）を含む。
本発明はさらに、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を含む融合タンパク質に関する。
用語「被験者」とは、温血動物を指し、好ましくは哺乳動物（ヒト、家畜及び農場での動物、動物園での動物、運動動物又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）であり、より好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、「患者」、即ち、温血動物であってもよく、より好ましくは、受け入れを待っているか、又は医療看護を受けているか、又は医療プログラムあるいは疾患進展モニタリングの対象となる、ヒトである。一実施形態において、被験者は、成人（例えば１８歳以上の被験者）である。他の実施形態において、被験者は、子供（例えば、１８歳以下の被験者）である。一実施形態において、被験者は、男性である。他の実施形態において、被験者は、女性である。
本発明の一実施形態において、サンプルは、生体サンプルである。生体サンプルの例として、疾患組織、体液を含むが、これらに限らなく、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢水及び肺胞マクロファージから製造された組織分解物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、用語「サンプル」は、任意の分析の前に個体から採取したサンプルを意味する。
このため、いくつかの実施形態において、本発明の抗４－１ＢＢ抗体及びその抗原結合フラグメントは、完全抗体、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラス）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラス）、ＩｇＤ、ＩｇＭ及びＩｇＥ；抗原結合フラグメント、例えばＳＤＲ、ＣＤＲ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ラクダ抗体又はナノ抗体；抗体又はその抗原結合フラグメントの変異体配列、例えば上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、抗４－１ＢＢ又はその抗原結合フラグメントを含む誘導体、例えば完全抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、修飾されたアミノ酸を含む産物、ポリマーに結合した産物、放射性標識を含む産物、蛍光標識を含む産物、酵素標識物質を含む産物、化学発光物を含む産物、常磁性標識を含む産物をさらに含む。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、組換えにより本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを産生するために用いることができる。
本発明において、発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（１組の適切な発現制御要素の核酸配列を含む）を含む任意の適切なＤＮＡ又はＲＮＡベクターであってもよい。このようなベクターの例として、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されたベクター及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターを含む。いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体をコードする核酸は、裸のＤＮＡ又はＲＮＡベクターに含まれ、例えば線形発現要素（例えばＳｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２，３５５－５９（１９９７）に記載されている）、小型核酸ベクター（例えばＵＳ ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載されている）、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８又はｐＵＣ１１８／１１９）、最小サイズの核酸ベクター（例えばＳｃｈａｋｏｗｓｋｉなど，ＭｏＩ Ｔｈｅｒ，３，７９３－８００（２００１）に記載されている）を含み、又は沈殿型核酸ベクター構築物、例えばＣａＰＯ４沈殿型構築物（例えばＷＯ００／４６１４７；Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３、９５５１－５５（１９８６）；Ｗｉｇｌｅｒなど，Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）及びＣｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２，６０３（１９８１）に記載されている）としている。このような核酸ベクター及びその使用は、本分野でよく知られているものである（例えばＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、Ｘ０ＧＣ（特許ＷＯ２００８／０４８０３７に由来する）、ｐＣＤＮＡ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｖ７９５２０）、ｐＣＨＯ１．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｒ８０００７）である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の細胞で抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適している。このようなベクターの例として、例えばＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４，５５０３－５５０９（１９８９））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などを含む。
発現ベクターは、酵母系で発現するのに適したベクターであってもよい。酵母系で発現するのに適した任意のベクターを採用することができる。適切なベクターは、例えば構成型又は誘導性プロモーター（例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ）を含むベクターを含む（レビューとして、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌなど，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｇｒａｎｔなど，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５３，５１６－５４４（１９８７）；Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．など，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８２４，３２９－３５８（２０１２）；Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．など，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，３０（５），１１０８－１１１８（２０１２）；Ｌｉ，Ｐ．など，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４２（２），１０５－１２４（２００７）；Ｂｏｅｒ，Ｅ．など，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７（３），５１３－５２３（２００７）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３５９－３６６（２００２）及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３４９－３５７（２００２）を参照されたい）。
本発明の発現ベクターにおいて、抗４－１ＢＢ抗体をコードする核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及びその他の発現に寄与する要素又はそれとの組み合わせを含むことができる。このような要素の例として、強発現型プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー及びＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）ターミネーター配列、大腸菌でプラスミドを産生するための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。核酸は、構成型プロモーター（例えばＣＭＶ ＩＥ）に対する誘導性プロモーターを含むこともできる。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の二重特異性分子を産生する組換え真核又は原核宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ）に関する。宿主細胞の例として、酵母、細菌及び哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供し、このゲノムは、本発明の抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明は、非組み込み型の核酸（例えばプラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現要素）を含む細胞を提供し、この核酸は、本発明の抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、異なる細胞系、例えばヒト細胞系、非ヒト哺乳動物細胞系及び昆虫細胞系、例えばＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ細胞系、ＢＨＫ－２１細胞系、マウス細胞系（例えば骨髄腫細胞系）、繊維肉腫細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６細胞系、ＨＫＢ－１１細胞系、ＣＡＰ細胞系及びＨｕＨ－７ヒト細胞系で産生することができる（Ｄｕｍｏｎｔなど，２０１５，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｓｅｐ．１８，１－１３．，その内容が引用により本明細書に援用される）。
一般的な免疫グロブリンの精製方法により本発明の抗体と培地とを適切に単離し、前記方法は、プロテインＡ－セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーである。
本発明は、さらに、組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
本明細書で使用されるように、組成物について、「基本的に．．．からなる」ことは、少なくとも１種の前述したような本発明の抗体が前記組成物において生物学的活性を有する唯一の治療剤又は試薬であることを意味する。
一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物であり、且つ、薬学的に許容される担体をさらに含む。
用語「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトに投与した際に、不利なもの、アレルギー又は他の不良反応を起こさない賦形剤を指す。それは、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング層、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。ヒトに投与する場合、製剤は、監督機関（例えばＦＤＡオフィスやＥＭＡ）に要求される無菌、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準を満たすべきである。
本発明は、さらに、薬剤に関し、前記薬剤は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化の抗体（即ち、抗体がグリコシル化されていない）を製造することができる。グリコシル化を変えることにより、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めたり、抗体のＡＤＣＣ活性を変化させたりすることができる。このような炭水化物に対する修飾は、例えば抗体配列内の１つ又は複数のグリコシル化サイトを変えることにより実現されてもよい。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことにより、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化サイトを解消し、これにより、このサイトでのグリコシル化を解消することができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。Ｃｏなどの米国特許Ｎｏ．５，７１４，３５０及びＮｏ．６，３５０，８６１（引用により本明細書に援用される）には、このような方法がさらに詳しく記載されている。また、代替として、改変されたグリコシル化のタイプを有する抗体、例えば減少量を有し又はフコシル残基を有しない低フコシル化又は非フコシル化抗体又は付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたフコシル化モードにより抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが既に証明された。このような炭水化物に対する修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることで実現されてもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本分野で記載されており、且つ、宿主細胞として使用されてもよく、この宿主細胞で本発明の組換え抗体を発現させることにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する。例えば、ＨａｎｇなどのＥＰ１１７６１９５（引用により本明細書に援用される）には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を持つ細胞系が記載されており、このＦＵＴ８遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系で発現した抗体は、低フコシル化又はフコシル残基の欠如を示す。このため、いくつかの実施形態において、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、低フコシル化又は非フコシル化モードが示された細胞系、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子発現が欠如している哺乳動物細胞系で組換え発現を行うことにより産生されてもよい。ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ開示ＷＯ０３／０３５８３５（引用により本明細書に援用される）には、変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、それらは、フコースをＡｓｎ（２９７）が連結した炭水化物に付着させる能力が低下しているので、この宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．など，２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。ＵｍａｎａなどのＰＣＴ開示ＷＯ９９／５４３４２（引用により本明細書に援用される）には、工学的細胞系により糖タンパク質で修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させることにより、工学的細胞系で発現する抗体は、付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の向上をもたらす（Ｕｍａｎａなど，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照されたい）。Ｅｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、さらに、フコース残基が欠如している改変された哺乳動物グリコシル化モードを有する抗体を産生できる遺伝子工学的ＣＨＯ哺乳動物細胞を説明した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。又は、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、酵母又は糸状菌で産生することができ、前記酵母又は糸状菌は、哺乳動物様グリコシル化モードに用いられ、且つグリコシル化モードとしてフコースが欠如した抗体を産生することができる（例えばＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照されたい）。
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９）は、抗原によって作動されるＴ細胞で発現するが、静止しているＴ細胞で発現しない。また、それが樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫｓ）、活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球、好酸球、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）及び肥満細胞で発現するが、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）の表面でこの分子が発現しないことが知られている。抗４－１ＢＢ抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するとともにγインターフェロン（ＩＦＮ－γ）の生成を向上させる能力を有し、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、２９個のメンバーからなるタンパク質スーパーファミリーであり、ヒト免疫システムにおいて重要な役割を果たしている。この分子ファミリーは、細胞死受容体（８個のメンバー）と活性化受容体の２種類に分類される。それらはいずれも１つの細胞内シグナル経路の活性化ドメイン及び１つの細胞外受容体サイトを含む。これらの受容体サイトは、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の対応するリガンドと結合することで活性化されてもよい。
ＴＮＦＳＦ－ＴＮＦＲＳＦのリガンド－受容体（例えばＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７－ＣＤ７０又はＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ）シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育と死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、ＴＮＦＲＳＦ及びＴＮＦＳＦメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、Ｔ細胞と他の免疫細胞を十分に活性化するために２種類のシグナルが必要である。第１種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第２種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このようなシグナルは、Ｔ細胞とＡＰＣｓ上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されたものである。４－１ＢＢは、共刺激分子であり、ＴＮＦＲＳＦに属する。それは、８０年代末にＴサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞をコンカナバリンＡで刺激して発見されたものである。ヒト４－１ＢＢＬは、１９９４に初めて直接発現クローンによって活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球から単離された。４－１ＢＢＬは、主に樹状細胞、Ｂ細胞又はマクロファージに発現している。
本発明の抗体は、４－１ＢＢに作用し、４－１ＢＢは、強力なＴ細胞特異的共刺激分子とし、例えばＤＣ細胞、単球、Ｂ細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞及び好中球などの多くの非Ｔ細胞にも発現する。抗４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢＬトランスフェクションにより４－１ＢＢ共刺激シグナルを活性化することで、細胞増殖、サイトカイン発現、殺菌活性及びＴ細胞のエフェクター機能へのサポートを誘導することができる。アゴニスト抗体が４－１ＢＢと結合すると、Ｔ細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともにサイトカイン（例えばＩＬ－８）の分泌を促進することができる。
本発明に提供される抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体は、ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢと結合することができ、且つ親和性が類似しているが、マウス４－１ＢＢと結合せず、種特異性を有する。抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体は、強い結合特異性を持ち、４－１ＢＢのみと結合し、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ２８ファミリーメンバー及びＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＯＸ４０及びＣＤ２７タンパク質と結合しなく、結果を図３に示す。
範囲の値が提供される場合、本明細書において特に明記されていない限り、各挿入値、下限までの単位の１０分の１、この範囲の上限と下限との間及び任意の前記範囲内の他の前記値又は挿入値は、いずれも本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。特に除外された限界を除き、前記範囲内で特定的に除外された境界を除く限り、独立して小さな範囲に含まれてもよいこれらの小さな範囲の上限及び下限も本発明に含まれる。前記範囲が１つ又は２つの限界を含む場合、１つ又は２つの含まれる境界を除外する範囲も本発明に含まれる。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される通常の意義を意味すべきである。本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の任意のものは、本発明の実施又は試験でも使用ことができるが、現在、好ましい方法及び材料が開示されている。本明細書で言及されているすべての出版物は、その全体が引用により本明細書に援用される。
以下、実施例を併せて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解することができる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の製造過程を説明するためのものであり、この製造過程は、関連する方法を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではなく、本発明の精神から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の特徴及びメリットを示すためのものであるが、本発明は、これらの特徴及びメリットに限定されない。
以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法であり、具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又はメーカーにより推奨される条件に従って行い、使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。
実施例１ マウス由来抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の製造
１．１、動物の免疫
実験動物は、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（北京維通利華社から購入）を使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、５０μｇの組換えヒト４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０３Ｈ）及びフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８８１）を使用し、両者を十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、２５μｇの組換えヒト４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質とフロインド不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８０６）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計３回であった。最終免疫を行ってから１０日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離した。組換えヒト４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）について、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の３日前に、アジュバントを含まない組換えヒト４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質を５０μｇ腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９６５）で単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、融合を準備した。
１．２、ハイブリドーマ細胞の製造
対数増殖期にある骨髄腫細胞ＳＰ２／０（中国科学院から購入）を採取し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てて、不完全ＤＭＥＭ培養液で細胞を懸濁してからカウントした。必要な数の細胞と脾臓細胞を所定の割合で５０ｍＬの遠心管に混合して、５分間遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。１分間かけて１ｍＬのＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７１８１）を徐々に加え、９０秒間静置した。不完全ＤＭＥＭ培地を５０ｍＬとなるまで加えて融合を中止し、５分間静置し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てた。２０ｍＬのＨＡＴ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０２６２－１０ＶＬ）を加えて融合細胞を柔らかく吹き散らし、細胞数１×１０５個／ウェルでＨＡＴ培地に撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いてインキュベートした。７～１０日後にＨＴ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０１３７－１０ＶＬ）でＨＡＴ培地と交換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の１／１０以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
１．３、クローンのスクリーニング及び同定
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりハイブリドーマの培養上清での抗ヒト４－１ＢＢ抗体をスクリーニングした。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレートに組換えヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって抗ヒト４－１ＢＢ選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
アゴニスト抗体と４－１ＢＢとが結合した後、Ｔ細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともに、サイトカイン（例えばＩＬ－８）の分泌を促進することができる。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞実験に基づいてアゴニスト抗ヒト４－１ＢＢ抗体をスクリーニングした。陽性クローンのハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔内に接種し、１週後に腹水を抽出し、精製して抗体タンパク質を得た。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞をインキュベートした。スクリーニングの当日に、トリプシンでＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を消化し、完全培地で消化を中止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てて、２％血清を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７０－０２１）で細胞を１×１０５個／ｍＬの細胞密度で再懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いて２時間インキュベートした。ビオチンで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（中杉金橋、カタログ番号ＺＢ－２０２０）及びＤｙｎａｂｅａｄｓストレプトアビジン磁気ビーズＭ－２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１２－０５Ｄ）を室温で３０分間インキュベートし、磁石で磁気ビーズを２～３分間単離し、ＰＢＳで磁気ビーズを４～５回洗浄した。２時間インキュベートした後、細胞プレートの各ウェルに最終濃度１０μｇ／ｍＬの被験抗体５０μＬ及び最終濃度１００μｇ／ｍＬのインキュベートされた磁気ビーズ５０μＬを加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで２４時間インキュベートした。ＩＬ－８検出キット（達科為社、カタログ番号１１１０８０２）を用いて説明書に従ってＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞上清中のＩＬ－８の発現量を検出し、ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって抗ヒト４－１ＢＢアゴニスト抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
結果を表１及び図１のＡに示し、複数の抗ヒト４－１ＢＢクローンから分泌された抗体は、４－１ＢＢ結合活性を有した。結果を図１のＢに示し、複数の抗ヒト４－１ＢＢクローンから分泌された抗体は、４－１ＢＢアゴニスト活性を有した。
１．４、モノクローナル抗体配列の測定
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及びアゴニスト活性を同時に有するクローンに対して抗体ＤＮＡ配列の測定を行った。まず、細胞ｍＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４１９）を使用した。次いで、ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３４８４９）を使用して、ハイブリドーマから抽出したトータルＲＮＡを逆転写してヒト４－１ＢＢのｃＤＮＡの第１鎖を合成し、ＰＣＲ増幅可変領域のプライマーＶＨＧＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２）及びＶＬＧＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）をそれぞれ設計した。ＰＣＲ増幅で得られた目的のバンドをｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ方式により線形化されたｐＲＡＣＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号：６３４８５９）にクローニングし、モノクローナルを選んでＤＮＡシーケンシングを行った。
実施例２ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の製造
４－１ＢＢ－２４６－８－３３－８３クローンをＰＣＲで増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、５及び６に示される。４－１ＢＢ－２４６－８－３３－８３クローンから構築されたキメラ４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ｍＡｂ－３３－８３と命名され、キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の軽鎖は、４－１ＢＢ－２４６－８－３３－８３クローンの軽鎖可変領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示される）と軽鎖定常領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示される）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－３３－８３抗体の重鎖は、重鎖可変領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される）と重鎖定常領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される）とが連結されたものである。上記の抗体の軽・重鎖のコードされたアミノ酸配列に対して遺伝子合成（蘇州金唯智バイオテクノロジー社により完了した）を行うことにより、対応するヌクレオチド配列を得るとともに、真核細胞の発現ベクターＸ０ＧＣにクローニングし、次いで、組換え発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞系（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ、カタログ番号Ａ２９１３３、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号Ａ２９１００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３５×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁させ、トランスフェクションの当日にカウントし、細胞密度は、（７０－２００）×１０５細胞／ｍＬの範囲内にあり、生存率は、９５％超えであるべきであり、予備加熱を行ったＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地で細胞を希釈し、最終密度は、６０×１０５細胞／ｍＬであった。トランスフェクション体積に従ってＯｐｔｉＰＲＯＴＭ培地（カタログ番号１２３０９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプラスミド及びトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯ試薬（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は、０．５μｇ／ｍＬであった。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、１～５ｍｉｎ静置し、その後、プラスミドトランスフェクション試薬コンパウンドを細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯエンハンサー（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｆｅｅｄ（カタログ番号Ａ２９１０１－０２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給し、細胞インキュベータを１２５ｒｐｍシェーカー、３２℃、５％ＣＯ２に調整し、遠心により１０日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
実施例３ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりキメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒト４－１ＢＢ抗体サンプル及び対照Ｕｒｅｌｕｍａｂ（特許配列ＷＯ２００４０１０９４７に由来する）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図２に示し、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、優れたヒト４－１ＢＢ結合親和性を有し、対照であるＵｒｅｌｕｍａｂの結合活性と同等であった。
実施例４ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりキメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の種特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒト４－１ＢＢ、カニクイザル４－１ＢＢ及びマウス４－１ＢＢ（いずれも北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体サンプルを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ＥＬＩＳＡによりキメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢ、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＩＣＯＳをコーティングした。ＣＤ２８タンパク質は、株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入され、残りのタンパク質は、いずれも北京シノバイオロジカル社から購入され、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体サンプル及び対照Ｕｒｅｌｕｍａｂ、アイソタイプコントロールを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図３のＡに示すように、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢと結合することができ、且つ親和性が類似したが、マウス４－１ＢＢと結合しなく、種特異性を有する。図３のＢに示すように、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、強い結合特異性を有し、４－１ＢＢのみと結合し、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ２８ファミリーメンバー及びＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＯＸ４０及びＣＤ２７タンパク質と結合しない。
実施例５ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりキメラ抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒト４－１ＢＢ抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識した４－１ＢＢＬ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号４１Ｌ－Ｈ８２Ｆ９）を５０μＬ／ウェルで添加し、濃度を２００ｎｇ／ｍＬ（最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ）とし、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）（ＢＤ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図４に示し、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体の４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬへのブロッキング活性は、対照Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れた。
実施例６ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
６～８週齢の雌ｈ４－１ＢＢ／ｈ４－１ＢＢ二重ヒト化マウス（マウス由来の４－１ＢＢ及び４－１ＢＢがノックアウトされ、ヒト由来の４－１ＢＢ及び４－１ＢＢが過剰発現した。江蘇バイオサイトジェン社）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１頭につき、１×１０６個のＭＣ３８／ｈ４－１ＢＢマウス結腸腫瘍細胞（ＭＣ３８は上海舜冉から購入される）を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを６匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ、ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）、３５ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３及び３５ｎｍｏｌ／ｋｇの対照Ｕｒｅｌｕｍａｂを週２回、２週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。腫瘍体積の測量の持続時間は２週間であり、即ち、投与を中止した後、２週間観察した。
結果を図５に示し、相同腫瘍モデルにおいて、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、抗腫瘍活性を有し、腫瘍の成長を著しく阻害し、効果は対照Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れた。
実施例７ ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の製造
ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇなど（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１４１３－２７）の方法により得られたものである。ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、ｈＩＧＫＶ１－２７＊０１＋ｈＩＧＫＪ４である。重鎖可変領域のテンプレートは、ｈＩＧＨＶ１－６９＊０２＋ｈＩＧＨＪ６＊０１である。マウス由来抗体の軽鎖ＣＤＲ領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域を得て、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示される。移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２においてサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示され、得られた重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１に示される。軽鎖可変領域を軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）にそれぞれ連結させて、対応する軽鎖全長配列を得た。重鎖可変領域を重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）にそれぞれ連結させて、対応する重鎖全長配列を得た。親和性と安定性のスクリーニングを通じて利用可能なヒト化配列を得て、得られたヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列情報は、表２に示し、ここで、ＩＤ列は、それぞれ得られたキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体の略称である。
実施例８ ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の抗原結合活性
実施例７で得られたＩＤがｚ０のヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ＢＨ３１４５ｂ（配列情報：ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２；ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）と命名される。ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの抗原結合活性を検出し、試験手順は、実施例４と同様である。実験結果を図６に示す。図６から分かるように、ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂは、優れたヒト４－１ＢＢ結合親和性を有し、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３及び対照Ｕｒｅｌｕｍａｂの結合活性と同等であった。
実施例９ ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性
実施例７で記載されるヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ＢＨ３１４５ｂと命名される。ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。試験手順は、実施例５と同様であり、結果を図７に示す。図７から分かるように、ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬへのブロッキング活性は、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３よりもやや劣ったが、ブロッキング活性は、対照であるＵｒｅｌｕｍａｂよりも優れた。
最後に、以上の各実施例は、本発明の技術案を説明するためのものであり、それを限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、前述した各実施例に記載される技術案を修正したり、その技術的特徴の一部又は全部を同等に置き換えることは依然として可能であり、これらの修正又は置き換えは、対応する技術案の本質を本発明の各実施例に係る技術案の範囲から逸脱させるものではないことを理解すべきである。
本発明は、抗体及び抗体ヒト化改変研究分野に関し、特に、本発明は、４－１ＢＢと特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
モノクローナル抗体は、単一の抗原のエピトープにのみ作用する高度な標的特異的抗体であり、例えば癌、炎症、自己免疫疾患、感染症などの多くの疾患の治療に広く用いられており、特に癌の化学療法が無効になった後、このような標的特異的薬剤は特に重要である。
４－１ＢＢは、共刺激分子であり、ＴＮＦＲＳＦに属する。それは、８０年代末にＴサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞をコンカナバリンＡで刺激して発見したものである。ヒト４－１ＢＢＬは、１９９４に初めて直接発現クローンによって活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球から単離された。４－１ＢＢＬは、主に樹状細胞、Ｂ細胞又はマクロファージに発現している。既存の研究の結果から明らかなように、ＴＮＦＳＦ－ＴＮＦＲＳＦのリガンド－受容体（例えばＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７－ＣＤ７０又はＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ）シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育及び死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、ＴＮＦＲＳＦ及びＴＮＦＳＦメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、Ｔ細胞及び他の免疫細胞を十分に活性化するために２種類のシグナルが必要である。第１種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第２種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このタイプのシグナルは、Ｔ細胞とＡＰＣｓ上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されるものである。
このため、ＴＮＦＳＦ及びＴＮＦＲＳＦリガンド－受容体相互作用に対する免疫治療技術は、癌の治療において高い潜在力を持っている。この分野では、依然として、より効果的な４－１ＢＢと特異的に結合する抗体を開発する必要がある。
本発明の第１の態様は、単離された抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体に関し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示す重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲを含む。
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む。ここで、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すＬＣＤＲ１のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示すＬＣＤＲ２のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示すＬＣＤＲ３のようなアミノ酸配列を含み、及び／又は、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示すＨＣＤＲ１のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示すＨＣＤＲ２のようなアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示すＨＣＤＲ３のようなアミノ酸配列を含む。
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－３又は４－６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－３又は４－６に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体から選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる。好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、４－１ＢＢキメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記４－１ＢＢキメラ抗体及びその機能的フラグメントは軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する；及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１のアミノ酸配列から選ばれるものを有する；
（ｂ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すアミノ酸配列を有する；及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１のアミノ酸配列から選ばれるものを有する；
（ｃ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する；及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示すアミノ酸配列を有する。
好ましくは、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すアミノ酸配列を有する；及び／又は、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである。
本発明の第２の態様は、以下のものから選ばれる単離された核酸分子に関する：
（１）第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義されたＤＮＡ又はＲＮＡと完全に相補的な核酸。
本発明の第３の態様は、効果的にライゲーションした第２の態様に係る核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
本発明の第４の態様は、第２の態様に係る核酸分子又は第３の態様に係るベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明の第５の態様は、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞、及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に関する。
本発明の第６の態様は、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体を生産する方法に関し、前記方法は、第４の態様に係る宿主細胞を前記抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させるステップを含み、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含み、任意選択的に、得られた産物を前述したような診断剤及び／又は治療剤に結合させるステップを含む。
本発明の第７の態様は、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞の使用に関する。
本発明の第８の態様は、４－１ＢＢを介した疾患又は病症を予防及び／又は治療するための薬剤における、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞の使用に関し、ここで、前記疾患又は病症は、好ましくは、腫瘍である。より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
本発明の第９の態様は、必要とする被験者に、第１の態様に係る抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞を投与するステップを含む、腫瘍を予防及び／又は治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、宮頸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記被験者は、哺乳動物から選ばれ、ヒト及び／又は他の霊長類動物を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、核酸分子、ベクター又は宿主細胞は、当分野の通常の施用方法、例えば非経口経路、静脈内投与により使用される。
本発明の抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、特異性が強く、安定性がよく、強いＴ細胞機能への調節活性と良好な薬物動態特性を有し、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。また、本発明の抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬへのブロッキング活性がＵｒｅｌｕｍａｂモノクローナル抗体より強い。
以下、本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記載に使用する必要がある図面に対して簡単に紹介する。なお、以下の記載における図面は、ただ本発明の一部の実施形態に過ぎない。当業者は、創造的な労働を付与しない前提で、これらの図面によって他の図面を得ることもできる。
図１のＡは、４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体配列の結合活性を示し、図１のＢは、４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体配列のアゴニスト活性を示す。 ４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の結合活性を示す。 図３のＡは、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の種特異性を示し、図３のＢは、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の結合特異性を示す。 抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ結合へのブロッキング活性を示す。 遺伝子ノックインマウス相同腫瘍モデルにおける抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の抗腫瘍効果を示す。 ４－１ＢＢに対する抗ヒト４－１ＢＢヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの結合活性を示す。 抗ヒト４－１ＢＢヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ結合へのブロッキング活性を示す。
定義
用語であるヒト「４－１ＢＢ」、即ちＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー（ＴＮＦＲＳＦ９）に属し、主に活性化されたＴ細胞に発現し、Ｔ細胞共刺激分子であり、そのリガンドは、４－１ＢＢＬである。
本明細書で使用される用語である「抗４－１ＢＢ抗体」、「抗４－１ＢＢ」、「４－１ＢＢ抗体」、「抗４－１ＢＢモノクローナル抗体」又は「４－１ＢＢと結合する抗体」とは、４－１ＢＢタンパク質又はそのフラグメントと十分な親和性で結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体は、異種の４－１ＢＢにおける保存された４－１ＢＢのエピトープと結合する。
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又は抗原のエピトープと結合する能力を持つ免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含み、通常、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び少なくとも２本の軽（Ｌ）鎖から構成される。免疫グロブリンは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブクラス）、ＩｇＭ及びＩｇＥのアイソタイプを含み、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。軽鎖は、定常領域によってκ鎖とλ鎖に分けられる。
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のうち、抗体とその抗原との結合に関与するドメインを指す。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略記する）から構成され、重鎖定常領域は、通常、三つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略記する）から構成される。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には抗原認識を担当するが、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体及び古典補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）との結合を媒介することができる。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる超可変領域（ＨＶＲ）に細かく分けられ、それらの間にはより保存的な「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域が介在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲドメイン及び４つのＦＲドメインから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で配列される。
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」とは互換的に使用されてもよい）とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する領域を指す。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖の３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のＣＤＲ配列を含むが、異なるスキーム（例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ）を適用することによって、いわゆるＣＤＲの境界が、本発明で定義される特定のＣＤＲの境界と異なる抗体をさらに含む。
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単分子組成物の抗体分子製剤としての、基本的に同質の抗体群から得られた抗体を指し、即ち、個体抗体を含む群は、わずかに存在する天然に発生する可能性がある突然変異以外は同じである。一般的なモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、２種以上のＦａｂドメインから構成されてもよく、これにより、２種以上のターゲットに対する特異性を向上させる。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、任意の具体的な産生方法（例えば、組換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど）に限定されるものではない。
用語「二重抗体」、「二重機能的抗体」、「二重特異性抗体」、「ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ」又は「ＢｓＡｂ」とは、２個の異なる抗原結合部位を有することにより、２つのターゲット抗原と同時に結合することができ、抗体の標的性を発揮すると同時に別の特殊な機能エフェクター分子を媒介する作用を持つものである。媒介された特殊な機能エフェクター分子は、毒素、酵素、サイトカイン、放射線核種などであってもよく、抗原と結合する、二重特異性抗体の２つのアームは、それぞれＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ又はｄＳＦｖなどに由来してもよい。
用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる抗原決定基（「エピトープ」）に対する異なる抗体の調製物を指す。
用語「抗体の抗原結合フラグメント」とは、エピトープと結合できる抗体のフラグメント、部分、領域又はドメインを指す（例えば切断、組換え、合成などによって得られてもよい）。抗原結合フラグメントは、このような抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はすべての６つのＣＤＲドメインを含むことができ、また、前記エピトープと結合できるにもかかわらず、異なる特異性、親和性又は選択性を示すことができる。好ましくは、抗原結合フラグメントは、前記抗体のすべての６つのＣＤＲドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、１本のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）の一部であってもよく、又は、１本のポリペプチド鎖を含むものであるか、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖（それぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する）（例えば、二重抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなど）の一部であってもよく、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。
本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例として、（ａ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂ’又はＦａｂフラグメント；（ｂ）ジスルフィド結合によってヒンジドメインで連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｃ）ＶＨ領域及びＣＨｌドメインからなるＦｄフラグメント；（ｄ）抗体の１つのアームのＶＬ領域及びＶＨ領域からなるＦｖフラグメント；（ｅ）遺伝工学的手法により抗体ＶＨ及びＶＬを結合ペプチドセグメントで連結した組換えタンパク質である単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ，ｓｃＦｖ）；（ｆ）基本的にＶＨ領域からなり且つドメイン抗体（Ｈｏｌｔなど，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２ｉ（ｌｌ）： ４８４－９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｇ）ラクダ又はナノ抗体（Ｒｅｖｅｔｓなど，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，５（ｌ）： １１１－２４）及び（ｈ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
用語「キメラ抗体」とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来し又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は同種であるが、鎖の残りの部分が他の種に由来し又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は同種であることを指す。本発明は、ヒト抗体由来の可変領域抗原結合配列を提供する。このため、本明細書で主に注目したキメラ抗体は、１つ又は複数のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し且つ１つ又は複数の非ヒト抗体由来配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含有する抗体を含む。なお、本明細書で記載されるキメラ抗体は、１種の抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列及び他の抗体クラス又はサブクラスに由来する他の配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含む抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」とは、他の哺乳動物種、例えばマウス種に由来するＣＤＲ配列がヒトフレーム配列に移植された抗体を指す。ヒトフレーム配列において別途のフレーム領域修飾を行うことができる。
用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」（「ｈｕｍＡｂ）又は「ＨｕＭａｂ」）とは、ヒト種系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト種系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発、又は遺伝子再構成中、又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異）。
変異体抗体も本発明の範囲内に含まれる。このため、本願で挙げられた配列の変異体も本発明の範囲内に含まれる。当分野で知られている方法を使用することにより改良された親和性を有する抗体配列の他の変異体を得ることができ、且つ、これらの変異体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換は、さらに改良された親和性を有する抗体を得るために用いることができる。又は、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、抗体の生産における発現系の翻訳効率を改善するために用いることができる。このような変異体抗体の配列は、本願で挙げられた配列と７０％又はそれ以上（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列相同性を有する。このような配列相同性は、参照配列（即ち、本願で挙げられた配列）の全長に対して計算して得られたものである。
ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）又はＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２，アメリカ合衆国保健福祉省；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７に従って、本発明に係る領域におけるアミノ酸残基に番号を割り当てる。特に明記されていない限り、本発明におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
抗体又はその抗原結合フラグメントが他の分子の領域（即ち、エピトープ）と「特異的に」結合することとは、他のエピトープよりも、より頻繁に、より速く且つより長い持続時間及び／又はより大きな親和性で前記エピトープと反応又は結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０－７Ｍ、例えば１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ又はそれ以上の親和性でヒト４－１ＢＢと結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理条件下で（例えば、インビボで）結合する。このため、４－１ＢＢと特異的に結合することは、この抗体又はその抗原結合フラグメントが上記の特異性及び／又はこのような条件で４－１ＢＢに結合する能力を指す。前記結合を決定するのに適した方法は、当分野で知られているものである。
抗体と指定された抗原とが結合するという背景下で、用語「結合」とは、通常、約１０－６Ｍ又はそれ以下のＫＤに対応する親和性で結合することを指し、このＫＤは、指定された抗原又は緊密に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対するこの抗体の結合の親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍低い。
本明細書で使用されるように、用語「ｋｄ」（ｓｅｃ－１又は１／ｓ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
本明細書で使用されるように、用語「ｋａ」（Ｍ－１ ｘ ｓｅｃ－１又は１／Ｍｓｅｃ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を指す。
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」（Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、且つｋｄをｋａで割ることにより得られるものである。
本明細書で使用されるように、用語「ＫＡ」（Ｍ－１又は１／Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合平衡定数を指し、且つｋａをｋｄで割ることにより得られるものである。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲの一部（即ち、結合に必要なＣＤＲ残基サブグループ、ＳＤＲと呼ばれる）のみがヒト化抗体で結合していればよい。分子モデリング及び／又は経験に応じて、又はＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．など，（２００４），ＳＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｏｆ Ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈｕｍａｎ ＧｅｒｍＬｉｎｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ Ｔｏ Ｍｉｎｉｍｉｚｅ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４１：８６３－８７２に記載されるように、先行研究に基づいて（例えばＣＤＲ Ｈ２における残基Ｈ６０－Ｈ６５が、通常、不要である）Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ以外に位置するＫａｂａｔ ＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔなど，（１９９２），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，公開番号９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．など，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７を参照されたい）から関連するエピトープと接触しなく且つＳＤＲに位置しないＣＤＲ残基を同定することができる。このようなヒト化抗体において、１つ又は複数のドナーであるＣＤＲ残基が存在しなく又はドナーであるＣＤＲ全体が省略される位置で、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において対応する位置（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）を占めるアミノ酸であってもよい。このような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減らし、これにより、潜在的な免疫原性を低下させる点で潜在的に有利である。しかし、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性もあり、且つ親和性が著しく低下することを避けることが望ましい。経験に応じてＣＤＲ内の置換位置及び置換されるアミノ酸を選択することもできる。
ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸を変えて機能的結合が失われるという事実を利用して（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．など，（１９８２），Ｓｉｎｇｌｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｌｔｅｒｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ））７９（６）：１９７９－１９８３）、代替可能な機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定することができる。このような変異体ＣＤＲを得るための好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの変異を誘発して（例えばランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により）置換されたアミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列における関連する残基の身元と置換された（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の身元とを比較することにより、この置換されたＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊの置換スコアを同定することができる。ＢＬＯＳＵＭシステムは、配列データベースを分析して作成されたアミノ酸置換行列を提供して、信頼性の比較に用いられる（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，（２００４），Ｗｈｅｒｅ Ｄｉｄ Ｔｈｅ ＢＬＯＳＵＭ６２ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｏｍｅ Ｆｒｏｍ？，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（８）：１０３５－１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，（１９９２），Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８９：１０９１５－１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．など，（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅｓ），ＰＮＡＳ，８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１），Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｃｅｓ Ｆｒｏｍ Ａｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９、５５５－５６５。現在、最も先進的なＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高いほど、置換が保存的であるので、この置換は、機能に影響を与えない可能性が高くなる）。例えば、得られたＣＤＲを含む抗原結合フラグメントが４－１ＢＢに結合できない場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、十分に保存的ではないと考えられ、より高い置換スコアを持つ新たな候補置換を選択して生成する。このため、例えば、元の残基がグルタミン酸（Ｅ）であり且つ非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、０であり、且つ、より保存的な変化（例えばアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリジン）は、好ましいものである。
そこで、本発明は、改良されたＣＤＲの同定におけるランダム変異誘発の使用を考慮した。本発明の背景下で、保存的置換は、以下の３つの表における１つ又は複数のアミノ酸のカテゴリ内の置換により定義されてもよい。
保存的置換を行うアミノ酸残基の種類：
代替の保存的アミノ酸残基置換の種類：
アミノ酸残基の物理的及び機能的代替の分類：
より保存的な置換グループには、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン及びアスパラギン－グルタミンが含まれる。
いくつかの実施形態において、親水性アミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ及びＬｙｓから選ばれる。
さらに、例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，（１９８４），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている原理を用いて別のアミノ酸グループを作成することもできる。
このため、含まれる抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配列は、置換によって親抗体のＣＤＲの配列と異なることができる。例えば４、３、２又は１個のアミノ酸残基の置換が挙げられる。本発明の実施形態によれば、ＣＤＲ領域におけるアミノ酸は、以上の３つの表で定義されるように、保存的置換で置換されてもよい。
「相同性」又は「配列同一性」とは、配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。
このような変異体ポリペプチド配列は、本願で挙げられる配列と、７０％又はそれ以上（即ち８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の様々な長さの連続した延出セグメントを含むポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、適用可能な場合、本発明に提供されるペプチド配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０又はそれ以上の本発明で開示される１つ又は複数の配列の連続したペプチド、及びそれらの間の中間程度の長さを有するすべてのペプチドを含む。
用語「治療」とは、疾患又は病状の進展又は重症度を改善、緩和、減弱又は逆転させたり、このような疾患又は病状の１種又は複数種の症状又は副作用を改善、緩和、減弱又は逆転させたりすることを指す。本発明において、「治療」はまた、有益又は有望な臨床結果を得るための方法を指し、ここで、「有益又は有望な臨床結果」は、部分的又は全部的なものや、検出可能又は検出不可能なものにもかかわらず、症状の緩和、病状又は疾患程度の減少、安定化した（即ち悪化していない）疾患又は病状の状態、疾患又は病状の状態の進展の遅延又は緩和、疾患又は病状の状態の改善又は軽減及び疾患又は病状の緩和を含むが、これらに限定されない。
用語「予防」とは、本発明の抗体及びその機能的フラグメントを投与することにより、疾患又は病况の少なくとも１種の症状の進展を阻止又は阻害することを指す。この用語は、緩和中の被験者を治療して再発を予防又は阻害することをさらに含む。
本発明の抗体は、組換えＤＮＡにより産生されたモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有してもよい。アイソタイプの選択は、通常、所望のエフェクター機能（例えばＡＤＣＣ誘導）により決定される。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれか一方を用いることができる。必要であれば、公知の方法により本発明の抗４－１ＢＢの抗体のクラスを変換することができる。例えば、本発明の最初のＩｇＧ抗体は、クラスを本発明のＩｇＭ抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧｌをＩｇＧ２に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプ切り替えにより例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ４抗体である。抗体のアミノ酸配列が他のアイソタイプに対してこのアイソタイプとほとんど同じである場合、この抗体は、特定のアイソタイプに属する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体であり、好ましくはＩｇＧ抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体－抗原結合フラグメント又は単鎖抗体である。
いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体は、一価抗体であり、好ましくは、ＷＯ２００７０５９７８２（その全体が引用により本明細書に援用される）に記載されたようなヒンジ領域に欠失を有する一価抗体である。このため、いくつかの実施形態において、抗体は、一価抗体であり、ここで、前記抗４－１ＢＢ抗体は、以下の方法により構築される：ｉ）一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗４－１ＢＢ抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及びＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されており、また、ＩｇＧ１サブクラスの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、このＣＬ領域は、このＣＬ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合又は共有結合を形成できる任意のアミノ酸を含まない；ｉｉ）一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、ヒンジ領域及び（例えばＩｇサブクラスに要求される）ＣＨ領域の他の領域（例えばＣＨ３領域）に対応する領域には、ヒトＩｇのＣＨ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドと、ジスルフィド結合又は共有結合若しくは安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することに関与する任意のアミノ酸残基が含まれておらず、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されている；ｉｉｉ）一価抗体を産生するための細胞発現系を提供する；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞で（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸構築物を共発現させて前記一価抗体を産生する。
同様に、いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体は、一価抗体であり、
（ｉ）本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域又はそのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このＣＨ領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び（この免疫グロブリンがＩｇＧ４サブクラスではない場合）ＣＨ領域の他のドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じＣＨ領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で同じＣＨ領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
他のいくつかの実施形態において、一価抗体の重鎖は修飾されることにより、ヒンジ領域全体が欠失している。
他の実施形態において、一価抗体の配列は修飾されることにより、Ｎ－結合型グリコシル化のための任意の受容体サイトが含まない。
本発明は、「二重特異性抗体」をさらに含み、ここで、抗４－１ＢＢ結合領域（例えば、抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢ結合領域）は、１種以上のエピトープを標的とする二価又は多価二重特異性フレームワークの一部である（例えば、第２のエピトープは、アクティブトランスポート受容体のエピトープを含むことができ、これにより、この二重特異性抗体は、生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えた、改善された細胞転移作用を示し、又は、第２のエピトープは、他の目的タンパク質を標的とするエピトープである）。このため、他の実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体の一価Ｆａｂは、他の異なるタンパク質を標的とするＦａｂ又はｓｃｆｖに連結されることにより、二重特異性抗体を産生することができる。二重特異性抗体は、例えば抗４－１ＢＢ結合領域から付与される治療機能及び受容体分子に結合されて生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えて転移するトランスポート機能を増強させることができるという二重機能を有することができる。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体をさらに含む。単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖のＦｖドメインが連結されたペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供し、ここで、本発明の抗４－１ＢＢ抗体のＦｖ中の重鎖及び軽鎖は、フレキシブルペプチド（典型的には、約１０、１２、１５又はそれ以上のアミノ酸残基）で連結されて１本のペプチド鎖を形成する。このような抗体を産生する方法は、例えばＵＳ ４，９４６，７７８；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ： ２６９－３１５（１９９４）；Ｂｉｒｄなど，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎなど，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８）及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２－５５４（１９９０）に記載されている。単一のＶＨ及びＶＬだけを使用する場合、単鎖抗体は、一価のものであり、２つのＶＨ及びＶＬを使用する場合、二価のものであり、又は、２つ以上のＶＨ及びＶＬを使用する場合、多価のものである。
当分野で知られている任意の技術により本発明の抗体を産生し、例えば任意の化学的や生物学的や遺伝学的又は酵素学的な技術に限定されなく、単独で又は組み合わせて使用することができる。通常、所望の配列のアミノ酸配列が知られており、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術により前記抗体を容易に産生することができる。例えば、公知の固相方法によりこれらの抗体を合成することができ、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで製造された装置）を用いてメーカーの説明書に従ってこれらの抗体を合成する。又は、当分野における公知の組換えＤＮＡ技術により本発明の抗体を合成することができる。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んでこれらのベクターを所要の抗体の発現に好適な真核又は原核宿主に導入した後、ＤＮＡ発現産物としての抗体が得られ、その後、既知の技術を用いて宿主から抗体を単離することができる。
任意の「好適な」数の修飾されたアミノ酸を含み、及び／又はカップリング置換基と結合することにより、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを修飾することができる。このような場合に、「好適」は、通常、非誘導体化親抗４－１ＢＢ抗体に関連する４－１ＢＢ選択性及び／又は４－１ＢＢ特異性を少なくとも基本的に保持する能力によって決定される。１つ又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことは、例えばポリペプチド血清半減期の増加、ポリペプチド抗原性の低減又はポリペプチド貯蔵安定性の向上に寄与することができる。１種又は複数種のアミノ酸に対する修飾は、例えば、組換え生産の過程において翻訳と同時に行われ、又は、翻訳後に行われ（例えば、哺乳動物の細胞での発現過程においてＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列におけるＮ－結合型グリコシル化作用）、又は合成手段によって行われる。修飾されたアミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、イソプレン化（例えば、ファルネシル化、ゲラニル－ゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などを含む。アミノ酸修飾を行う参考文献は、本分野ではよく知られており、例えばＷａｌｋｅｒ，（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｏｎ ＣＤ－Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照する。修飾されたアミノ酸は、例えばグリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸から選ばれてもよい。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、共価結合によりポリマーに結合して化学修飾を行うことにより、循環半減期を増加させることもできる。例示的なポリマー及びそれをペプチドに連結する方法は、例えばＵＳ ４，７６６，１０６；ＵＳ ４，１７９，３３７；ＵＳ ４，４９５，２８５及びＵＳ ４，６０９，５４６を参照する。また、例示的なポリマーとして、ポリオキシエチル化されたポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量が約１，０００～４０，０００Ｄの間、例えば約２，０００～２０，０００Ｄの間、例えば約３，０００～１２，０００ＤのＰＥＧ）を含む。
本発明はさらに、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を含む融合タンパク質に関する。
用語「被験者」とは、温血動物を指し、好ましくは哺乳動物（ヒト、家畜及び農場での動物、動物園での動物、運動動物又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）であり、より好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、「患者」、即ち、温血動物であってもよく、より好ましくは、受け入れを待っているか、又は医療看護を受けているか、又は医療プログラムあるいは疾患進展モニタリングの対象となる、ヒトである。一実施形態において、被験者は、成人（例えば１８歳以上の被験者）である。他の実施形態において、被験者は、子供（例えば、１８歳以下の被験者）である。一実施形態において、被験者は、男性である。他の実施形態において、被験者は、女性である。
本発明の一実施形態において、サンプルは、生体サンプルである。生体サンプルの例として、疾患組織、体液を含むが、これらに限らなく、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢水及び肺胞マクロファージから製造された組織分解物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、用語「サンプル」は、任意の分析の前に個体から採取したサンプルを意味する。
このため、いくつかの実施形態において、本発明の抗４－１ＢＢ抗体及びその抗原結合フラグメントは、完全抗体、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラス）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラス）、ＩｇＤ、ＩｇＭ及びＩｇＥ；抗原結合フラグメント、例えばＳＤＲ、ＣＤＲ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ラクダ抗体又はナノ抗体；抗体又はその抗原結合フラグメントの変異体配列、例えば上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、抗４－１ＢＢ又はその抗原結合フラグメントを含む誘導体、例えば完全抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、修飾されたアミノ酸を含む産物、ポリマーに結合した産物、放射性標識を含む産物、蛍光標識を含む産物、酵素標識物質を含む産物、化学発光物を含む産物、常磁性標識を含む産物をさらに含む。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、組換えにより本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを産生するために用いることができる。
本発明において、発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（１組の適切な発現制御要素の核酸配列を含む）を含む任意の適切なＤＮＡ又はＲＮＡベクターであってもよい。このようなベクターの例として、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されたベクター及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターを含む。いくつかの実施形態において、抗４－１ＢＢ抗体をコードする核酸は、裸のＤＮＡ又はＲＮＡベクターに含まれ、例えば線形発現要素（例えばＳｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２，３５５－５９（１９９７）に記載されている）、小型核酸ベクター（例えばＵＳ ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載されている）、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８又はｐＵＣ１１８／１１９）、最小サイズの核酸ベクター（例えばＳｃｈａｋｏｗｓｋｉなど，ＭｏＩ Ｔｈｅｒ，３，７９３－８００（２００１）に記載されている）を含み、又は沈殿型核酸ベクター構築物、例えばＣａＰＯ４沈殿型構築物（例えばＷＯ００／４６１４７；Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３、９５５１－５５（１９８６）；Ｗｉｇｌｅｒなど，Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）及びＣｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２，６０３（１９８１）に記載されている）としている。このような核酸ベクター及びその使用は、本分野でよく知られているものである（例えばＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、Ｘ０ＧＣ（特許ＷＯ２００８／０４８０３７に由来する）、ｐＣＤＮＡ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｖ７９５２０）、ｐＣＨＯ１．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｒ８０００７）である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の細胞で抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適している。このようなベクターの例として、例えばＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４，５５０３－５５０９（１９８９））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などを含む。
発現ベクターは、酵母系で発現するのに適したベクターであってもよい。酵母系で発現するのに適した任意のベクターを採用することができる。適切なベクターは、例えば構成型又は誘導性プロモーター（例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ）を含むベクターを含む（レビューとして、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌなど，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｇｒａｎｔなど，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５３，５１６－５４４（１９８７）；Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．など，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８２４，３２９－３５８（２０１２）；Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．など，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，３０（５），１１０８－１１１８（２０１２）；Ｌｉ，Ｐ．など，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４２（２），１０５－１２４（２００７）；Ｂｏｅｒ，Ｅ．など，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７（３），５１３－５２３（２００７）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３５９－３６６（２００２）及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３４９－３５７（２００２）を参照されたい）。
本発明の発現ベクターにおいて、抗４－１ＢＢ抗体をコードする核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及びその他の発現に寄与する要素又はそれとの組み合わせを含むことができる。このような要素の例として、強発現型プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー及びＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）ターミネーター配列、大腸菌でプラスミドを産生するための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。核酸は、構成型プロモーター（例えばＣＭＶ ＩＥ）に対する誘導性プロモーターを含むこともできる。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の二重特異性分子を産生する組換え真核又は原核宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ）に関する。宿主細胞の例として、酵母、細菌及び哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供し、このゲノムは、本発明の抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明は、非組み込み型の核酸（例えばプラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現要素）を含む細胞を提供し、この核酸は、本発明の抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、異なる細胞系、例えばヒト細胞系、非ヒト哺乳動物細胞系及び昆虫細胞系、例えばＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ細胞系、ＢＨＫ－２１細胞系、マウス細胞系（例えば骨髄腫細胞系）、繊維肉腫細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６細胞系、ＨＫＢ－１１細胞系、ＣＡＰ細胞系及びＨｕＨ－７ヒト細胞系で産生することができる（Ｄｕｍｏｎｔなど，２０１５，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｓｅｐ．１８，１－１３．，その内容が引用により本明細書に援用される）。
一般的な免疫グロブリンの精製方法により本発明の抗体と培地とを適切に単離し、前記方法は、プロテインＡ－セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーである。
本発明は、さらに、組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
本明細書で使用されるように、組成物について、「基本的に．．．からなる」ことは、少なくとも１種の前述したような本発明の抗体が前記組成物において生物学的活性を有する唯一の治療剤又は試薬であることを意味する。
一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物であり、且つ、薬学的に許容される担体をさらに含む。
用語「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトに投与した際に、不利なもの、アレルギー又は他の不良反応を起こさない賦形剤を指す。それは、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング層、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。ヒトに投与する場合、製剤は、監督機関（例えばＦＤＡオフィスやＥＭＡ）に要求される無菌、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準を満たすべきである。
本発明は、さらに、薬剤に関し、前記薬剤は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化の抗体（即ち、抗体がグリコシル化されていない）を製造することができる。グリコシル化を変えることにより、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めたり、抗体のＡＤＣＣ活性を変化させたりすることができる。このような炭水化物に対する修飾は、例えば抗体配列内の１つ又は複数のグリコシル化サイトを変えることにより実現されてもよい。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことにより、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化サイトを解消し、これにより、このサイトでのグリコシル化を解消することができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。Ｃｏなどの米国特許Ｎｏ．５，７１４，３５０及びＮｏ．６，３５０，８６１（引用により本明細書に援用される）には、このような方法がさらに詳しく記載されている。また、代替として、改変されたグリコシル化のタイプを有する抗体、例えば減少量を有し又はフコシル残基を有しない低フコシル化又は非フコシル化抗体又は付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたフコシル化モードにより抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが既に証明された。このような炭水化物に対する修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることで実現されてもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本分野で記載されており、且つ、宿主細胞として使用されてもよく、この宿主細胞で本発明の組換え抗体を発現させることにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する。例えば、ＨａｎｇなどのＥＰ１１７６１９５（引用により本明細書に援用される）には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を持つ細胞系が記載されており、このＦＵＴ８遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系で発現した抗体は、低フコシル化又はフコシル残基の欠如を示す。このため、いくつかの実施形態において、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、低フコシル化又は非フコシル化モードが示された細胞系、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子発現が欠如している哺乳動物細胞系で組換え発現を行うことにより産生されてもよい。ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ開示ＷＯ０３／０３５８３５（引用により本明細書に援用される）には、変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、それらは、フコースをＡｓｎ（２９７）が連結した炭水化物に付着させる能力が低下しているので、この宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．など，２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。ＵｍａｎａなどのＰＣＴ開示ＷＯ９９／５４３４２（引用により本明細書に援用される）には、工学的細胞系により糖タンパク質で修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させることにより、工学的細胞系で発現する抗体は、付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の向上をもたらす（Ｕｍａｎａなど，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照されたい）。Ｅｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、さらに、フコース残基が欠如している改変された哺乳動物グリコシル化モードを有する抗体を産生できる遺伝子工学的ＣＨＯ哺乳動物細胞を説明した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。又は、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、酵母又は糸状菌で産生することができ、前記酵母又は糸状菌は、哺乳動物様グリコシル化モードに用いられ、且つグリコシル化モードとしてフコースが欠如した抗体を産生することができる（例えばＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照されたい）。
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９）は、抗原によって作動されるＴ細胞で発現するが、静止しているＴ細胞で発現しない。また、それが樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫｓ）、活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球、好酸球、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）及び肥満細胞で発現するが、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）の表面でこの分子が発現しないことが知られている。抗４－１ＢＢ抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するとともにγインターフェロン（ＩＦＮ－γ）の生成を向上させる能力を有し、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、２９個のメンバーからなるタンパク質スーパーファミリーであり、ヒト免疫システムにおいて重要な役割を果たしている。この分子ファミリーは、細胞死受容体（８個のメンバー）と活性化受容体の２種類に分類される。それらはいずれも１つの細胞内シグナル経路の活性化ドメイン及び１つの細胞外受容体サイトを含む。これらの受容体サイトは、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の対応するリガンドと結合することで活性化されてもよい。
ＴＮＦＳＦ－ＴＮＦＲＳＦのリガンド－受容体（例えばＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７－ＣＤ７０又はＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ）シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育と死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、ＴＮＦＲＳＦ及びＴＮＦＳＦメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、Ｔ細胞と他の免疫細胞を十分に活性化するために２種類のシグナルが必要である。第１種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第２種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このようなシグナルは、Ｔ細胞とＡＰＣｓ上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されたものである。４－１ＢＢは、共刺激分子であり、ＴＮＦＲＳＦに属する。それは、８０年代末にＴサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞をコンカナバリンＡで刺激して発見されたものである。ヒト４－１ＢＢＬは、１９９４に初めて直接発現クローンによって活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球から単離された。４－１ＢＢＬは、主に樹状細胞、Ｂ細胞又はマクロファージに発現している。
本発明の抗体は、４－１ＢＢに作用し、４－１ＢＢは、強力なＴ細胞特異的共刺激分子とし、例えばＤＣ細胞、単球、Ｂ細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞及び好中球などの多くの非Ｔ細胞にも発現する。抗４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢＬトランスフェクションにより４－１ＢＢ共刺激シグナルを活性化することで、細胞増殖、サイトカイン発現、殺菌活性及びＴ細胞のエフェクター機能へのサポートを誘導することができる。アゴニスト抗体が４－１ＢＢと結合すると、Ｔ細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともにサイトカイン（例えばＩＬ－８）の分泌を促進することができる。
本発明に提供される抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体は、ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢと結合することができ、且つ親和性が類似しているが、マウス４－１ＢＢと結合せず、種特異性を有する。抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体は、強い結合特異性を持ち、４－１ＢＢのみと結合し、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ２８ファミリーメンバー及びＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＯＸ４０及びＣＤ２７タンパク質と結合しなく、結果を図３に示す。
範囲の値が提供される場合、本明細書において特に明記されていない限り、各挿入値、下限までの単位の１０分の１、この範囲の上限と下限との間及び任意の前記範囲内の他の前記値又は挿入値は、いずれも本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。特に除外された限界を除き、前記範囲内で特定的に除外された境界を除く限り、独立して小さな範囲に含まれてもよいこれらの小さな範囲の上限及び下限も本発明に含まれる。前記範囲が１つ又は２つの限界を含む場合、１つ又は２つの含まれる境界を除外する範囲も本発明に含まれる。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される通常の意義を意味すべきである。本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の任意のものは、本発明の実施又は試験でも使用ことができるが、現在、好ましい方法及び材料が開示されている。本明細書で言及されているすべての出版物は、その全体が引用により本明細書に援用される。
以下、実施例を併せて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解することができる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の製造過程を説明するためのものであり、この製造過程は、関連する方法を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではなく、本発明の精神から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の特徴及びメリットを示すためのものであるが、本発明は、これらの特徴及びメリットに限定されない。
以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法であり、具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又はメーカーにより推奨される条件に従って行い、使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。
実施例１ マウス由来抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の製造
１．１、動物の免疫
実験動物は、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（北京維通利華社から購入）を使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、５０μｇの組換えヒト４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０３Ｈ）及びフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８８１）を使用し、両者を十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、２５μｇの組換えヒト４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質とフロインド不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８０６）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計３回であった。最終免疫を行ってから１０日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離した。組換えヒト４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）について、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の３日前に、アジュバントを含まない組換えヒト４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質を５０μｇ腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９６５）で単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、融合を準備した。
１．２、ハイブリドーマ細胞の製造
対数増殖期にある骨髄腫細胞ＳＰ２／０（中国科学院から購入）を採取し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てて、不完全ＤＭＥＭ培養液で細胞を懸濁してからカウントした。必要な数の細胞と脾臓細胞を所定の割合で５０ｍＬの遠心管に混合して、５分間遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。１分間かけて１ｍＬのＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７１８１）を徐々に加え、９０秒間静置した。不完全ＤＭＥＭ培地を５０ｍＬとなるまで加えて融合を中止し、５分間静置し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てた。２０ｍＬのＨＡＴ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０２６２－１０ＶＬ）を加えて融合細胞を柔らかく吹き散らし、細胞数１×１０５個／ウェルでＨＡＴ培地に撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いてインキュベートした。７～１０日後にＨＴ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０１３７－１０ＶＬ）でＨＡＴ培地と交換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の１／１０以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
１．３、クローンのスクリーニング及び同定
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりハイブリドーマの培養上清での抗ヒト４－１ＢＢ抗体をスクリーニングした。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレートに組換えヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって抗ヒト４－１ＢＢ選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
アゴニスト抗体と４－１ＢＢとが結合した後、Ｔ細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともに、サイトカイン（例えばＩＬ－８）の分泌を促進することができる。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞実験に基づいてアゴニスト抗ヒト４－１ＢＢ抗体をスクリーニングした。陽性クローンのハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔内に接種し、１週後に腹水を抽出し、精製して抗体タンパク質を得た。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞をインキュベートした。スクリーニングの当日に、トリプシンでＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を消化し、完全培地で消化を中止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てて、２％血清を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７０－０２１）で細胞を１×１０５個／ｍＬの細胞密度で再懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いて２時間インキュベートした。ビオチンで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（中杉金橋、カタログ番号ＺＢ－２０２０）及びＤｙｎａｂｅａｄｓストレプトアビジン磁気ビーズＭ－２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１２－０５Ｄ）を室温で３０分間インキュベートし、磁石で磁気ビーズを２～３分間単離し、ＰＢＳで磁気ビーズを４～５回洗浄した。２時間インキュベートした後、細胞プレートの各ウェルに最終濃度１０μｇ／ｍＬの被験抗体５０μＬ及び最終濃度１００μｇ／ｍＬのインキュベートされた磁気ビーズ５０μＬを加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで２４時間インキュベートした。ＩＬ－８検出キット（達科為社、カタログ番号１１１０８０２）を用いて説明書に従ってＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞上清中のＩＬ－８の発現量を検出し、ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって抗ヒト４－１ＢＢアゴニスト抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
結果を表１及び図１のＡに示し、複数の抗ヒト４－１ＢＢクローンから分泌された抗体は、４－１ＢＢ結合活性を有した。結果を図１のＢに示し、複数の抗ヒト４－１ＢＢクローンから分泌された抗体は、４－１ＢＢアゴニスト活性を有した。
１．４、モノクローナル抗体配列の測定
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及びアゴニスト活性を同時に有するクローンに対して抗体ＤＮＡ配列の測定を行った。まず、細胞ｍＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４１９）を使用した。次いで、ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３４８４９）を使用して、ハイブリドーマから抽出したトータルＲＮＡを逆転写してヒト４－１ＢＢのｃＤＮＡの第１鎖を合成し、ＰＣＲ増幅可変領域のプライマーＶＨＧＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２）及びＶＬＧＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）をそれぞれ設計した。ＰＣＲ増幅で得られた目的のバンドをｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ方式により線形化されたｐＲＡＣＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号：６３４８５９）にクローニングし、モノクローナルを選んでＤＮＡシーケンシングを行った。
実施例２ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の製造
４－１ＢＢ－２４６－８－３３－８３クローンをＰＣＲで増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、５及び６に示される。４－１ＢＢ－２４６－８－３３－８３クローンから構築されたキメラ４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ｍＡｂ－３３－８３と命名され、キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の軽鎖は、４－１ＢＢ－２４６－８－３３－８３クローンの軽鎖可変領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示される）と軽鎖定常領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示される）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－３３－８３抗体の重鎖は、重鎖可変領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される）と重鎖定常領域（配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される）とが連結されたものである。上記の抗体の軽・重鎖のコードされたアミノ酸配列に対して遺伝子合成（蘇州金唯智バイオテクノロジー社により完了した）を行うことにより、対応するヌクレオチド配列を得るとともに、真核細胞の発現ベクターＸ０ＧＣにクローニングし、次いで、組換え発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞系（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ、カタログ番号Ａ２９１３３、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号Ａ２９１００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３５×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁させ、トランスフェクションの当日にカウントし、細胞密度は、（７０－２００）×１０５細胞／ｍＬの範囲内にあり、生存率は、９５％超えであるべきであり、予備加熱を行ったＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地で細胞を希釈し、最終密度は、６０×１０５細胞／ｍＬであった。トランスフェクション体積に従ってＯｐｔｉＰＲＯＴＭ培地（カタログ番号１２３０９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプラスミド及びトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯ試薬（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は、０．５μｇ／ｍＬであった。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、１～５ｍｉｎ静置し、その後、プラスミドトランスフェクション試薬コンパウンドを細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯエンハンサー（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｆｅｅｄ（カタログ番号Ａ２９１０１－０２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給し、細胞インキュベータを１２５ｒｐｍシェーカー、３２℃、５％ＣＯ２に調整し、遠心により１０日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
実施例３ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりキメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒト４－１ＢＢ抗体サンプル及び対照Ｕｒｅｌｕｍａｂ（特許配列ＷＯ２００４０１０９４７に由来する）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図２に示し、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、優れたヒト４－１ＢＢ結合親和性を有し、対照であるＵｒｅｌｕｍａｂの結合活性と同等であった。
実施例４ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりキメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の種特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒト４－１ＢＢ、カニクイザル４－１ＢＢ及びマウス４－１ＢＢ（いずれも北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体サンプルを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ＥＬＩＳＡによりキメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢ、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＩＣＯＳをコーティングした。ＣＤ２８タンパク質は、株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入され、残りのタンパク質は、いずれも北京シノバイオロジカル社から購入され、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体サンプル及び対照Ｕｒｅｌｕｍａｂ、アイソタイプコントロールを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図３のＡに示すように、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢと結合することができ、且つ親和性が類似したが、マウス４－１ＢＢと結合しなく、種特異性を有する。図３のＢに示すように、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、強い結合特異性を有し、４－１ＢＢのみと結合し、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ２８ファミリーメンバー及びＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＯＸ４０及びＣＤ２７タンパク質と結合しない。
実施例５ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりキメラ抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒト４－１ＢＢ抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識した４－１ＢＢＬ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号４１Ｌ－Ｈ８２Ｆ９）を５０μＬ／ウェルで添加し、濃度を２００ｎｇ／ｍＬ（最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ）とし、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）（ＢＤ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図４に示し、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体の４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬへのブロッキング活性は、対照Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れた。
実施例６ キメラ抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
６～８週齢の雌ｈ４－１ＢＢ／ｈ４－１ＢＢ二重ヒト化マウス（マウス由来の４－１ＢＢ及び４－１ＢＢがノックアウトされ、ヒト由来の４－１ＢＢ及び４－１ＢＢが過剰発現した。江蘇バイオサイトジェン社）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１頭につき、１×１０６個のＭＣ３８／ｈ４－１ＢＢマウス結腸腫瘍細胞（ＭＣ３８は上海舜冉から購入される）を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを６匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ、ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）、３５ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３及び３５ｎｍｏｌ／ｋｇの対照Ｕｒｅｌｕｍａｂを週２回、２週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。腫瘍体積の測量の持続時間は２週間であり、即ち、投与を中止した後、２週間観察した。
結果を図５に示し、相同腫瘍モデルにおいて、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３は、抗腫瘍活性を有し、腫瘍の成長を著しく阻害し、効果は対照Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れた。
実施例７ ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の製造
ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇなど（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１４１３－２７）の方法により得られたものである。ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、ｈＩＧＫＶ１－２７＊０１＋ｈＩＧＫＪ４である。重鎖可変領域のテンプレートは、ｈＩＧＨＶ１－６９＊０２＋ｈＩＧＨＪ６＊０１である。マウス由来抗体の軽鎖ＣＤＲ領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域を得て、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示される。移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２においてサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示され、得られた重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１に示される。軽鎖可変領域を軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）にそれぞれ連結させて、対応する軽鎖全長配列を得た。重鎖可変領域を重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）にそれぞれ連結させて、対応する重鎖全長配列を得た。親和性と安定性のスクリーニングを通じて利用可能なヒト化配列を得て、得られたヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列情報は、表２に示し、ここで、ＩＤ列は、それぞれ得られたキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体の略称である。
実施例８ ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の抗原結合活性
実施例７で得られたＩＤがｚ０のヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ＢＨ３１４５ｂ（配列情報：ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２；ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）と命名される。ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの抗原結合活性を検出し、試験手順は、実施例４と同様である。実験結果を図６に示す。図６から分かるように、ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂは、優れたヒト４－１ＢＢ結合親和性を有し、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３及び対照Ｕｒｅｌｕｍａｂの結合活性と同等であった。
実施例９ ヒト化抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性
実施例７で記載されるヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ＢＨ３１４５ｂと命名される。ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の４－１ＢＢと受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。試験手順は、実施例５と同様であり、結果を図７に示す。図７から分かるように、ヒト化抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ＢＨ３１４５ｂの４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬへのブロッキング活性は、抗ヒト４－１ＢＢキメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－３３－８３よりもやや劣ったが、ブロッキング活性は、対照であるＵｒｅｌｕｍａｂよりも優れた。
最後に、以上の各実施例は、本発明の技術案を説明するためのものであり、それを限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、前述した各実施例に記載される技術案を修正したり、その技術的特徴の一部又は全部を同等に置き換えることは依然として可能であり、これらの修正又は置き換えは、対応する技術案の本質を本発明の各実施例に係る技術案の範囲から逸脱させるものではないことを理解すべきである。

Claims (14)

  1. 単離された抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示す重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲを含む、
    抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む、単離された抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すＬＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示すＬＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示すＬＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含み、及び／又は、
    重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示すＨＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示すＨＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示すＨＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含む、抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれ、
    好ましくは、前記重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、
    前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示すアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその機能的フラグメント。
  6. （ａ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有し、及び／又は
    重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１から選ばれるアミノ酸配列を有する；
    （ｂ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
    重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－３１から選ばれるアミノ酸配列を有する；
    （ｃ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３－２０に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有し、及び／又は
    重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示すアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその機能的フラグメント。
  7. 軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、
    重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示すアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその機能的フラグメント。
  8. 前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. （１）請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
    （２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸；から選ばれる、単離された核酸分子。
  10. 効果的にライゲーションした請求項９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  11. 請求項９に記載の核酸分子又は請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  12. 請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞、及び一種或いは複数種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、組成物。
  13. 請求項１１に記載の宿主細胞を、前記抗ヒト４－１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で培養させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む、
    請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
  14. ４－１ＢＢを介した疾患又は病症を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞の使用であって、
    前記疾患又は病症は、好ましくは、腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である、使用。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117736330B (zh) * 2024-01-24 2024-05-17 上海沙砾生物科技有限公司 肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
EP2180007B2 (en) 1998-04-20 2017-08-30 Roche Glycart AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
CA2412701A1 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
JP2005532253A (ja) 2001-10-25 2005-10-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 糖タンパク質組成物
US6887673B2 (en) 2002-07-30 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1BB
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
KR100880509B1 (ko) 2006-10-16 2009-01-28 한미약품 주식회사 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
GB201619648D0 (en) * 2016-11-21 2017-01-04 Alligator Bioscience Ab Novel antibodies and uses thereof
TW201932491A (zh) * 2018-01-22 2019-08-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗４－１ｂｂ抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CN110357961B (zh) * 2018-04-10 2022-08-23 无锡智康弘义生物科技有限公司 抗人4-1bb单克隆抗体及其制备方法和用途

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