JP2024503394A - 4-1bbと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント - Google Patents
4-1bbと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024503394A JP2024503394A JP2023541807A JP2023541807A JP2024503394A JP 2024503394 A JP2024503394 A JP 2024503394A JP 2023541807 A JP2023541807 A JP 2023541807A JP 2023541807 A JP2023541807 A JP 2023541807A JP 2024503394 A JP2024503394 A JP 2024503394A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- human
- antigen
- seq
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 title claims abstract description 262
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 title claims abstract description 262
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 213
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 172
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 170
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 170
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 136
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 82
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 59
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 59
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 59
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 44
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 38
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 11
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 9
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 9
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims description 7
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 136
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 35
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 11
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 description 70
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 66
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 66
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 64
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 64
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 44
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 32
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 30
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 28
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 28
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 26
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 22
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 22
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 20
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 16
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 16
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 16
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 16
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 241000894007 species Species 0.000 description 16
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000011161 development Methods 0.000 description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 14
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- -1 His Chemical compound 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 8
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 8
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 8
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 8
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 6
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 description 6
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 6
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 6
- 208000002030 Merkel cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 206010029266 Neuroendocrine carcinoma of the skin Diseases 0.000 description 6
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 description 6
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 6
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 208000017763 cutaneous neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 6
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 4
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 4
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 4
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 125000002446 fucosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O1)C)* 0.000 description 4
- 101150023212 fut8 gene Proteins 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 2
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 description 2
- 101710093458 ICOS ligand Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 241000283162 Inia geoffrensis Species 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 208000005228 Pericardial Effusion Diseases 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010090473 UDP-N-acetylglucosamine-peptide beta-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 2
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000386 athletic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 210000001142 back Anatomy 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000000692 cap cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 102000054189 human CD80 Human genes 0.000 description 2
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 210000004912 pericardial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 2
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 208000023747 urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、4-1BBと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。4-1BBと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントの特異性が強く、前記抗体及びその抗原結合フラグメントと抗原とが結合した後、T細胞の免疫殺傷機能を増強させると同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともにサイトカインの分泌を促進させ、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。
Description
本発明は、抗体及び抗体ヒト化改変研究分野に関し、特に、本発明は、4-1BBと特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
モノクローナル抗体は、単一の抗原のエピトープにのみ作用する高度な標的特異的抗体であり、例えば癌、炎症、自己免疫疾患、感染症などの多くの疾患の治療に広く用いられており、特に癌の化学療法が無効になった後、このような標的特異的薬剤は特に重要である。
4-1BBは、共刺激分子であり、TNFRSFに属する。それは、80年代末にTサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーT細胞及び細胞傷害性T細胞をコンカナバリンAで刺激して発見したものである。ヒト4-1BBLは、1994に初めて直接発現クローンによって活性化されたCD4+Tリンパ球から単離された。4-1BBLは、主に樹状細胞、B細胞又はマクロファージに発現している。既存の研究の結果から明らかなように、TNFSF-TNFRSFのリガンド-受容体(例えばCD40-CD40L、CD27-CD70又はOX40-OX40L)シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育及び死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、TNFRSF及びTNFSFメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、T細胞及び他の免疫細胞を十分に活性化するために2種類のシグナルが必要である。第1種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞(APCs)上の主要組織適合性複合体(MHC)分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第2種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このタイプのシグナルは、T細胞とAPCs上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されるものである。
このため、TNFSF及びTNFRSFリガンド-受容体相互作用に対する免疫治療技術は、癌の治療において高い潜在力を持っている。この分野では、依然として、より効果的な4-1BBと特異的に結合する抗体を開発する必要がある。
本発明の第1の態様は、単離された抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体に関し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO.7に示す軽鎖可変領域の3つの相補性決定領域LCDR及びSEQ ID NO.8に示す重鎖可変領域の3つの相補性決定領域HCDRを含む。
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び/又は重鎖可変領域を含む。ここで、軽鎖可変領域は、SEQ ID No.1に示すLCDR1のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.2に示すLCDR2のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.3に示すLCDR3のようなアミノ酸配列を含み、及び/又は、重鎖可変領域は、SEQ ID No.4に示すHCDR1のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.5に示すHCDR2のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.6に示すHCDR3のようなアミノ酸配列を含む。
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID No.1-3又は4-6に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID No.1-3又は4-6に示す配列に対して1つ又は複数、例えば1個、2個、3個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体から選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgDのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び/又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる。好ましくは、重鎖定常領域配列は、IgG1又はIgG4の定常領域配列から選ばれ、及び/又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、4-1BBキメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.7に示されるものであるか、又は、SEQ ID No.7に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.7に示す配列に対して1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び/又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.8に示されるものであるか、又は、SEQ ID No.8に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.8に示す配列に対して1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記4-1BBキメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域であって、ここで、
(a)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(b)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(c)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する。
(a)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(b)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(c)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する。
好ましくは、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有する;及び/又は、重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fd、Fv、scFv、二重特異性抗体、ラクダ抗体、CDR及び抗体認識の最小単位(dAb)から選ばれる1種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Fab、F(ab’)2又はscFvである。
本発明の第2の態様は、以下のものから選ばれる単離された核酸分子に関する:
(1)第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体をコードするDNA又はRNA;
(2)(1)で定義されたDNA又はRNAと完全に相補的な核酸。
(1)第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体をコードするDNA又はRNA;
(2)(1)で定義されたDNA又はRNAと完全に相補的な核酸。
本発明の第3の態様は、効果的にライゲーションした第2の態様に係る核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
本発明の第4の態様は、第2の態様に係る核酸分子又は第3の態様に係るベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明の第5の態様は、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞、及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に関する。
本発明の第6の態様は、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体を生産する方法に関し、前記方法は、第4の態様に係る宿主細胞を前記抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させるステップを含み、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含み、任意選択的に、得られた産物を前述したような診断剤及び/又は治療剤に結合させるステップを含む。
本発明の第7の態様は、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び/又は治療するための薬剤の製造における、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞の使用に関する。
本発明の第8の態様は、4-1BBを介した疾患又は病症を予防及び/又は治療するための薬剤における、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞の使用に関し、ここで、前記疾患又は病症は、好ましくは、腫瘍である。より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる1種又は複数種である。
本発明の第9の態様は、必要とする被験者に、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞を投与するステップを含む、腫瘍を予防及び/又は治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる1種又は複数種である。好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる1種又は複数種である。より好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、宮頸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる1種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記被験者は、哺乳動物から選ばれ、ヒト及び/又は他の霊長類動物を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス及び/又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、核酸分子、ベクター又は宿主細胞は、当分野の通常の施用方法、例えば非経口経路、静脈内投与により使用される。
本発明の抗4-1BBモノクローナル抗体は、特異性が強く、安定性がよく、強いT細胞機能への調節活性と良好な薬物動態特性を有し、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。また、本発明の抗4-1BBモノクローナル抗体は、4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性がUrelumabモノクローナル抗体より強い。
以下、本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記載に使用する必要がある図面に対して簡単に紹介する。なお、以下の記載における図面は、ただ本発明の一部の実施形態に過ぎない。当業者は、創造的な労働を付与しない前提で、これらの図面によって他の図面を得ることもできる。
定義
用語であるヒト「4-1BB」、即ちCD137は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー(TNFRSF9)に属し、主に活性化されたT細胞に発現し、T細胞共刺激分子であり、そのリガンドは、4-1BBLである。
用語であるヒト「4-1BB」、即ちCD137は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー(TNFRSF9)に属し、主に活性化されたT細胞に発現し、T細胞共刺激分子であり、そのリガンドは、4-1BBLである。
本明細書で使用される用語である「抗4-1BB抗体」、「抗4-1BB」、「4-1BB抗体」、「抗4-1BBモノクローナル抗体」又は「4-1BBと結合する抗体」とは、4-1BBタンパク質又はそのフラグメントと十分な親和性で結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体は、異種の4-1BBにおける保存された4-1BBのエピトープと結合する。
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又は抗原のエピトープと結合する能力を持つ免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含み、通常、少なくとも2本の重(H)鎖及び少なくとも2本の軽(L)鎖から構成される。免疫グロブリンは、IgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4サブクラス)、IgA(IgA1及びIgA2サブクラス)、IgM及びIgEのアイソタイプを含み、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。軽鎖は、定常領域によってκ鎖とλ鎖に分けられる。
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のうち、抗体とその抗原との結合に関与するドメインを指す。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略記する)及び重鎖定常領域(本明細書においてCHと略記する)から構成され、重鎖定常領域は、通常、三つのドメイン(CH1、CH2及びCH3)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略記する)及び軽鎖定常領域(本明細書においてCLと略記する)から構成される。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には抗原認識を担当するが、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織又は因子(免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)、Fc受容体及び古典補体システムの第1成分(C1q)を含む)との結合を媒介することができる。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。VH及びVL領域は、さらに、「相補性決定領域(CDR)」と呼ばれる超可変領域(HVR)に細かく分けられ、それらの間にはより保存的な「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる領域が介在している。各VH及びVLは、3つのCDRドメイン及び4つのFRドメインから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順で配列される。
用語「相補性決定領域」又は「CDR領域」又は「CDR」(本明細書において超可変領域「HVR」とは互換的に使用されてもよい)とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ(「超可変ループ」)を形成し、及び/又は抗原接触残基(「抗原接触点」)を含有する領域を指す。CDRは、主に抗原のエピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の3つのCDRは、HCDR1、HCDR2及びHCDR3と呼ばれ、軽鎖の3つのCDRは、LCDR1、LCDR2及びLCDR3と呼ばれる。
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のCDRの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のCDR配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のCDR配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のCDR配列を含むが、異なるスキーム(例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ)を適用することによって、いわゆるCDRの境界が、本発明で定義される特定のCDRの境界と異なる抗体をさらに含む。
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単分子組成物の抗体分子製剤としての、基本的に同質の抗体群から得られた抗体を指し、即ち、個体抗体を含む群は、わずかに存在する天然に発生する可能性がある突然変異以外は同じである。一般的なモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、2種以上のFabドメインから構成されてもよく、これにより、2種以上のターゲットに対する特異性を向上させる。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、任意の具体的な産生方法(例えば、組換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど)に限定されるものではない。
用語「二重抗体」、「二重機能的抗体」、「二重特異性抗体」、「bispecific antibody」又は「BsAb」とは、2個の異なる抗原結合部位を有することにより、2つのターゲット抗原と同時に結合することができ、抗体の標的性を発揮すると同時に別の特殊な機能エフェクター分子を媒介する作用を持つものである。媒介された特殊な機能エフェクター分子は、毒素、酵素、サイトカイン、放射線核種などであってもよく、抗原と結合する、二重特異性抗体の2つのアームは、それぞれFab、Fv、ScFv又はdSFvなどに由来してもよい。
用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる抗原決定基(「エピトープ」)に対する異なる抗体の調製物を指す。
用語「抗体の抗原結合フラグメント」とは、エピトープと結合できる抗体のフラグメント、部分、領域又はドメインを指す(例えば切断、組換え、合成などによって得られてもよい)。抗原結合フラグメントは、このような抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はすべての6つのCDRドメインを含むことができ、また、前記エピトープと結合できるにもかかわらず、異なる特異性、親和性又は選択性を示すことができる。好ましくは、抗原結合フラグメントは、前記抗体のすべての6つのCDRドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、1本のポリペプチド鎖(例えば、scFv)の一部であってもよく、又は、1本のポリペプチド鎖を含むものであるか、又は、2本又はそれ以上のポリペプチド鎖(それぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する)(例えば、二重抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメントなど)の一部であってもよく、又は、2本又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。
本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例として、(a)VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価のフラグメントであるFab’又はFabフラグメント;(b)ジスルフィド結合によってヒンジドメインで連結された2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(c)VH領域及びCHlドメインからなるFdフラグメント;(d)抗体の1つのアームのVL領域及びVH領域からなるFvフラグメント;(e)遺伝工学的手法により抗体VH及びVLを結合ペプチドセグメントで連結した組換えタンパク質である単鎖抗体(single chain Fv,scFv);(f)基本的にVH領域からなり且つドメイン抗体(Holtなど,Trends Biotechnol.,2i(ll): 484-90)とも呼ばれるdAbフラグメント(Wardなど,Nature,341,544-546(1989));(g)ラクダ又はナノ抗体(Revetsなど,Expert Opin Biol Ther.,5(l): 111-24)及び(h)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。
用語「キメラ抗体」とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種に由来し又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は同種であるが、鎖の残りの部分が他の種に由来し又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は同種であることを指す。本発明は、ヒト抗体由来の可変領域抗原結合配列を提供する。このため、本明細書で主に注目したキメラ抗体は、1つ又は複数のヒト抗原結合配列(例えばCDR)を有し且つ1つ又は複数の非ヒト抗体由来配列、例えばFR又はC領域の配列を含有する抗体を含む。なお、本明細書で記載されるキメラ抗体は、1種の抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列及び他の抗体クラス又はサブクラスに由来する他の配列、例えばFR又はC領域の配列を含む抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」とは、他の哺乳動物種、例えばマウス種に由来するCDR配列がヒトフレーム配列に移植された抗体を指す。ヒトフレーム配列において別途のフレーム領域修飾を行うことができる。
用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」(「humAb)又は「HuMab」)とは、ヒト種系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト種系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる(例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発、又は遺伝子再構成中、又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異)。
変異体抗体も本発明の範囲内に含まれる。このため、本願で挙げられた配列の変異体も本発明の範囲内に含まれる。当分野で知られている方法を使用することにより改良された親和性を有する抗体配列の他の変異体を得ることができ、且つ、これらの変異体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換は、さらに改良された親和性を有する抗体を得るために用いることができる。又は、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、抗体の生産における発現系の翻訳効率を改善するために用いることができる。このような変異体抗体の配列は、本願で挙げられた配列と70%又はそれ以上(例えば80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれ以上)の配列相同性を有する。このような配列相同性は、参照配列(即ち、本願で挙げられた配列)の全長に対して計算して得られたものである。
IMGT(登録商標)、the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)又はKabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesmann,K.S.& Foeller,C.,(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH公開番号91-3242,アメリカ合衆国保健福祉省;Chothia,C.& Lesk,A.M.,(1987),Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins.,J.Mol.Biol.,196,901-917に従って、本発明に係る領域におけるアミノ酸残基に番号を割り当てる。特に明記されていない限り、本発明におけるアミノ酸残基は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
抗体又はその抗原結合フラグメントが他の分子の領域(即ち、エピトープ)と「特異的に」結合することとは、他のエピトープよりも、より頻繁に、より速く且つより長い持続時間及び/又はより大きな親和性で前記エピトープと反応又は結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも10-7M、例えば10-8M、10-9M、10-10M、10-11M又はそれ以上の親和性でヒト4-1BBと結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理条件下で(例えば、インビボで)結合する。このため、4-1BBと特異的に結合することは、この抗体又はその抗原結合フラグメントが上記の特異性及び/又はこのような条件で4-1BBに結合する能力を指す。前記結合を決定するのに適した方法は、当分野で知られているものである。
抗体と指定された抗原とが結合するという背景下で、用語「結合」とは、通常、約10-6M又はそれ以下のKDに対応する親和性で結合することを指し、このKDは、指定された抗原又は緊密に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)に対するこの抗体の結合の親和性よりも、少なくとも10倍、例えば少なくとも100倍、少なくとも1,000倍低い。
本明細書で使用されるように、用語「kd」(sec-1又は1/s)とは、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、koff値とも呼ばれる。
本明細書で使用されるように、用語「ka」(M-1 x sec-1又は1/Msec)とは、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度定数を指す。
本明細書で使用されるように、用語「KD」(M)とは、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指し、且つkdをkaで割ることにより得られるものである。
本明細書で使用されるように、用語「KA」(M-1又は1/M)とは、特定の抗体-抗原相互作用の結合平衡定数を指し、且つkaをkdで割ることにより得られるものである。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、CDRの一部(即ち、結合に必要なCDR残基サブグループ、SDRと呼ばれる)のみがヒト化抗体で結合していればよい。分子モデリング及び/又は経験に応じて、又はGonzales,N.R.など,(2004),SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human GermLine Templates To Minimize Its Immunogenicity,Mol.Immunol.,41:863-872に記載されるように、先行研究に基づいて(例えばCDR H2における残基H60-H65が、通常、不要である)Chothia超可変ループ以外に位置するKabat CDR領域(Kabatなど,(1992),Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,公開番号91-3242;Chothia,C.など,(1987),Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,J.Mol.Biol.,196:901-917を参照されたい)から関連するエピトープと接触しなく且つSDRに位置しないCDR残基を同定することができる。このようなヒト化抗体において、1つ又は複数のドナーであるCDR残基が存在しなく又はドナーであるCDR全体が省略される位置で、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において対応する位置(Kabatに従って番号付けされる)を占めるアミノ酸であってもよい。このような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減らし、これにより、潜在的な免疫原性を低下させる点で潜在的に有利である。しかし、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性もあり、且つ親和性が著しく低下することを避けることが望ましい。経験に応じてCDR内の置換位置及び置換されるアミノ酸を選択することもできる。
CDR残基の単一のアミノ酸を変えて機能的結合が失われるという事実を利用して(Rudikoff,S.など,(1982),Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-binding Specificity,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79(6):1979-1983)、代替可能な機能的CDR配列を系統的に同定することができる。このような変異体CDRを得るための好ましい方法において、CDRをコードするポリヌクレオチドの変異を誘発して(例えばランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により)置換されたアミノ酸残基を有するCDRを生成する。元の(機能的)CDR配列における関連する残基の身元と置換された(非機能的)変異体CDR配列の身元とを比較することにより、この置換されたBLOSUM62.iijの置換スコアを同定することができる。BLOSUMシステムは、配列データベースを分析して作成されたアミノ酸置換行列を提供して、信頼性の比較に用いられる(Eddy,S.R.,(2004),Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?,Nature Biotech.,22(8):1035-1036;Henikoff,J.G.,(1992),Amino acid substitution matrices from protein blocks),Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),89:10915-10919;Karlin,S.など,(1990),Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes),PNAS,87:2264-2268;Altschul,S.F.,(1991),Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective,J.Mol.Biol.,219、555-565。現在、最も先進的なBLOSUMデータベースは、BLOSUM62データベース(BLOSUM62.iij)である。表1は、BLOSUM62.iij置換スコアを示す(スコアが高いほど、置換が保存的であるので、この置換は、機能に影響を与えない可能性が高くなる)。例えば、得られたCDRを含む抗原結合フラグメントが4-1BBに結合できない場合、BLOSUM62.iij置換スコアは、十分に保存的ではないと考えられ、より高い置換スコアを持つ新たな候補置換を選択して生成する。このため、例えば、元の残基がグルタミン酸(E)であり且つ非機能的置換残基がヒスチジン(H)である場合、BLOSUM62.iij置換スコアは、0であり、且つ、より保存的な変化(例えばアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリジン)は、好ましいものである。
そこで、本発明は、改良されたCDRの同定におけるランダム変異誘発の使用を考慮した。本発明の背景下で、保存的置換は、以下の3つの表における1つ又は複数のアミノ酸のカテゴリ内の置換により定義されてもよい。
保存的置換を行うアミノ酸残基の種類:
代替の保存的アミノ酸残基置換の種類:
アミノ酸残基の物理的及び機能的代替の分類:
より保存的な置換グループには、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン及びアスパラギン-グルタミンが含まれる。
いくつかの実施形態において、親水性アミノ酸は、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Tyr及びLysから選ばれる。
さらに、例えばCreighton,(1984),Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman and Company)に記載されている原理を用いて別のアミノ酸グループを作成することもできる。
このため、含まれる抗体又はその抗原結合フラグメントのCDR変異体の配列は、置換によって親抗体のCDRの配列と異なることができる。例えば4、3、2又は1個のアミノ酸残基の置換が挙げられる。本発明の実施形態によれば、CDR領域におけるアミノ酸は、以上の3つの表で定義されるように、保存的置換で置換されてもよい。
「相同性」又は「配列同一性」とは、配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。
このような変異体ポリペプチド配列は、本願で挙げられる配列と、70%又はそれ以上(即ち80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれ以上)の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の様々な長さの連続した延出セグメントを含むポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、適用可能な場合、本発明に提供されるペプチド配列は、少なくとも約5、10、15、20、30、40、50、75、100、150又はそれ以上の本発明で開示される1つ又は複数の配列の連続したペプチド、及びそれらの間の中間程度の長さを有するすべてのペプチドを含む。
用語「治療」とは、疾患又は病状の進展又は重症度を改善、緩和、減弱又は逆転させたり、このような疾患又は病状の1種又は複数種の症状又は副作用を改善、緩和、減弱又は逆転させたりすることを指す。本発明において、「治療」はまた、有益又は有望な臨床結果を得るための方法を指し、ここで、「有益又は有望な臨床結果」は、部分的又は全部的なものや、検出可能又は検出不可能なものにもかかわらず、症状の緩和、病状又は疾患程度の減少、安定化した(即ち悪化していない)疾患又は病状の状態、疾患又は病状の状態の進展の遅延又は緩和、疾患又は病状の状態の改善又は軽減及び疾患又は病状の緩和を含むが、これらに限定されない。
用語「予防」とは、本発明の抗体及びその機能的フラグメントを投与することにより、疾患又は病况の少なくとも1種の症状の進展を阻止又は阻害することを指す。この用語は、緩和中の被験者を治療して再発を予防又は阻害することをさらに含む。
本発明の抗体は、組換えDNAにより産生されたモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有してもよい。アイソタイプの選択は、通常、所望のエフェクター機能(例えばADCC誘導)により決定される。例示的なアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれか一方を用いることができる。必要であれば、公知の方法により本発明の抗4-1BBの抗体のクラスを変換することができる。例えば、本発明の最初のIgG抗体は、クラスを本発明のIgM抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりIgGサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、IgGlをIgG2に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプ切り替えにより例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE又はIgM抗体に変換することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、IgG2抗体、例えばIgG2aである。抗体のアミノ酸配列が他のアイソタイプに対してこのアイソタイプとほとんど同じである場合、この抗体は、特定のアイソタイプに属する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体であり、好ましくはIgG抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体-抗原結合フラグメント又は単鎖抗体である。
いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体は、一価抗体であり、好ましくは、WO2007059782(その全体が引用により本明細書に援用される)に記載されたようなヒンジ領域に欠失を有する一価抗体である。このため、いくつかの実施形態において、抗体は、一価抗体であり、ここで、前記抗4-1BB抗体は、以下の方法により構築される:i)一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗4-1BB抗体のVL領域をコードするヌクレオチド配列及びIgの定常CL領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のVL領域をコードする前記ヌクレオチド配列及びIgのCL領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されており、また、IgG1サブクラスの場合、CL領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトIgGの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、このCL領域は、このCL領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合又は共有結合を形成できる任意のアミノ酸を含まない;ii)一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗体のVH領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトIgの定常CH領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、CH領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトIgGの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、ヒンジ領域及び(例えばIgサブクラスに要求される)CH領域の他の領域(例えばCH3領域)に対応する領域には、ヒトIgのCH領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドと、ジスルフィド結合又は共有結合若しくは安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することに関与する任意のアミノ酸残基が含まれておらず、ここで、選択された抗原特異的抗体のVH領域をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記IgのCH領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されている;iii)一価抗体を産生するための細胞発現系を提供する;iv)(iii)の細胞発現系の細胞で(i)及び(ii)の核酸構築物を共発現させて前記一価抗体を産生する。
同様に、いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体は、一価抗体であり、
(i)本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
(ii)免疫グロブリンのCH領域又はそのCH2及びCH3ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このCH領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び(この免疫グロブリンがIgG4サブクラスではない場合)CH領域の他のドメイン(例えばCH3ドメイン)に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じCH領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトIgGの存在下で同じCH領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
(i)本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
(ii)免疫グロブリンのCH領域又はそのCH2及びCH3ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このCH領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び(この免疫グロブリンがIgG4サブクラスではない場合)CH領域の他のドメイン(例えばCH3ドメイン)に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じCH領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトIgGの存在下で同じCH領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
他のいくつかの実施形態において、一価抗体の重鎖は修飾されることにより、ヒンジ領域全体が欠失している。
他の実施形態において、一価抗体の配列は修飾されることにより、N-結合型グリコシル化のための任意の受容体サイトが含まない。
本発明は、「二重特異性抗体」をさらに含み、ここで、抗4-1BB結合領域(例えば、抗4-1BBモノクローナル抗体の4-1BB結合領域)は、1種以上のエピトープを標的とする二価又は多価二重特異性フレームワークの一部である(例えば、第2のエピトープは、アクティブトランスポート受容体のエピトープを含むことができ、これにより、この二重特異性抗体は、生物学的障壁(例えば血液脳関門)を越えた、改善された細胞転移作用を示し、又は、第2のエピトープは、他の目的タンパク質を標的とするエピトープである)。このため、他の実施形態において、抗4-1BB抗体の一価Fabは、他の異なるタンパク質を標的とするFab又はscfvに連結されることにより、二重特異性抗体を産生することができる。二重特異性抗体は、例えば抗4-1BB結合領域から付与される治療機能及び受容体分子に結合されて生物学的障壁(例えば血液脳関門)を越えて転移するトランスポート機能を増強させることができるという二重機能を有することができる。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体をさらに含む。単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖のFvドメインが連結されたペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、単鎖Fv(scFv)を提供し、ここで、本発明の抗4-1BB抗体のFv中の重鎖及び軽鎖は、フレキシブルペプチド(典型的には、約10、12、15又はそれ以上のアミノ酸残基)で連結されて1本のペプチド鎖を形成する。このような抗体を産生する方法は、例えばUS 4,946,778;Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore ed.,Springer-Verlag,New York,pages: 269-315(1994);Birdなど,Science,242,423-426(1988);Hustonなど,PNAS USA 85,5879-5883(1988)及びMcCaffertyなど,Nature,348,552-554(1990)に記載されている。単一のVH及びVLだけを使用する場合、単鎖抗体は、一価のものであり、2つのVH及びVLを使用する場合、二価のものであり、又は、2つ以上のVH及びVLを使用する場合、多価のものである。
当分野で知られている任意の技術により本発明の抗体を産生し、例えば任意の化学的や生物学的や遺伝学的又は酵素学的な技術に限定されなく、単独で又は組み合わせて使用することができる。通常、所望の配列のアミノ酸配列が知られており、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術により前記抗体を容易に産生することができる。例えば、公知の固相方法によりこれらの抗体を合成することができ、好ましくは、市販のペプチド合成装置(例えばApplied Biosystems、Foster City、Californiaで製造された装置)を用いてメーカーの説明書に従ってこれらの抗体を合成する。又は、当分野における公知の組換えDNA技術により本発明の抗体を合成することができる。例えば、抗体をコードするDNA配列を発現ベクターに組み込んでこれらのベクターを所要の抗体の発現に好適な真核又は原核宿主に導入した後、DNA発現産物としての抗体が得られ、その後、既知の技術を用いて宿主から抗体を単離することができる。
任意の「好適な」数の修飾されたアミノ酸を含み、及び/又はカップリング置換基と結合することにより、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを修飾することができる。このような場合に、「好適」は、通常、非誘導体化親抗4-1BB抗体に関連する4-1BB選択性及び/又は4-1BB特異性を少なくとも基本的に保持する能力によって決定される。1つ又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことは、例えばポリペプチド血清半減期の増加、ポリペプチド抗原性の低減又はポリペプチド貯蔵安定性の向上に寄与することができる。1種又は複数種のアミノ酸に対する修飾は、例えば、組換え生産の過程において翻訳と同時に行われ、又は、翻訳後に行われ(例えば、哺乳動物の細胞での発現過程においてN-X-S/T配列におけるN-結合型グリコシル化作用)、又は合成手段によって行われる。修飾されたアミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、イソプレン化(例えば、ファルネシル化、ゲラニル-ゲラニル化)アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などを含む。アミノ酸修飾を行う参考文献は、本分野ではよく知られており、例えばWalker,(1998),Protein Protocols On CD-Rom,Humana Press,Totowa,New Jerseyを参照する。修飾されたアミノ酸は、例えばグリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸から選ばれてもよい。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、共価結合によりポリマーに結合して化学修飾を行うことにより、循環半減期を増加させることもできる。例示的なポリマー及びそれをペプチドに連結する方法は、例えばUS 4,766,106;US 4,179,337;US 4,495,285及びUS 4,609,546を参照する。また、例示的なポリマーとして、ポリオキシエチル化されたポリオール及びポリエチレングリコール(PEG)(例えば、分子量が約1,000~40,000Dの間、例えば約2,000~20,000Dの間、例えば約3,000~12,000DのPEG)を含む。
本発明はさらに、本発明の抗体(好ましくはモノクローナル抗体)を含む融合タンパク質に関する。
用語「被験者」とは、温血動物を指し、好ましくは哺乳動物(ヒト、家畜及び農場での動物、動物園での動物、運動動物又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど)であり、より好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、「患者」、即ち、温血動物であってもよく、より好ましくは、受け入れを待っているか、又は医療看護を受けているか、又は医療プログラムあるいは疾患進展モニタリングの対象となる、ヒトである。一実施形態において、被験者は、成人(例えば18歳以上の被験者)である。他の実施形態において、被験者は、子供(例えば、18歳以下の被験者)である。一実施形態において、被験者は、男性である。他の実施形態において、被験者は、女性である。
本発明の一実施形態において、サンプルは、生体サンプルである。生体サンプルの例として、疾患組織、体液を含むが、これらに限らなく、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢水及び肺胞マクロファージから製造された組織分解物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、用語「サンプル」は、任意の分析の前に個体から採取したサンプルを意味する。
このため、いくつかの実施形態において、本発明の抗4-1BB抗体及びその抗原結合フラグメントは、完全抗体、例えばIgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4のサブクラス)、IgA(IgA1及びIgA2のサブクラス)、IgD、IgM及びIgE;抗原結合フラグメント、例えばSDR、CDR、Fv、dAb、Fab、Fab2、Fab’、F(ab’)2、Fd、scFv、ラクダ抗体又はナノ抗体;抗体又はその抗原結合フラグメントの変異体配列、例えば上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する変異体配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、抗4-1BB又はその抗原結合フラグメントを含む誘導体、例えば完全抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、修飾されたアミノ酸を含む産物、ポリマーに結合した産物、放射性標識を含む産物、蛍光標識を含む産物、酵素標識物質を含む産物、化学発光物を含む産物、常磁性標識を含む産物をさらに含む。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの1本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、組換えにより本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを産生するために用いることができる。
本発明において、発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター(1組の適切な発現制御要素の核酸配列を含む)を含む任意の適切なDNA又はRNAベクターであってもよい。このようなベクターの例として、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAとの組み合わせから誘導されたベクター及びウイルス核酸(RNA又はDNA)ベクターを含む。いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体をコードする核酸は、裸のDNA又はRNAベクターに含まれ、例えば線形発現要素(例えばSykes and Johnston,Nat Biotech,12,355-59(1997)に記載されている)、小型核酸ベクター(例えばUS 6,077,835及び/又はWO00/70087に記載されている)、プラスミドベクター(例えばpBR322、pUC19/18又はpUC118/119)、最小サイズの核酸ベクター(例えばSchakowskiなど,MoI Ther,3,793-800(2001)に記載されている)を含み、又は沈殿型核酸ベクター構築物、例えばCaPO4沈殿型構築物(例えばWO00/46147;Benvenisty and Reshef,PNAS USA 83、9551-55(1986);Wiglerなど,Cell,14,725(1978)及びCoraro and Pearson,Somatic Cell Genetics,2,603(1981)に記載されている)としている。このような核酸ベクター及びその使用は、本分野でよく知られているものである(例えばUS5,589,466及びUS5,973,972を参照されたい)。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、X0GC(特許WO2008/048037に由来する)、pCDNA3.1(ThermoFisher、カタログ番号V79520)、pCHO1.0(ThermoFisher、カタログ番号R80007)である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の細胞で抗4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適している。このようなベクターの例として、例えばBlueScript(Stratagene)、pINベクター(Van Heeke & Schuster,J Biol Chem,264,5503-5509(1989))、pETベクター(Novagen,Madison,Wisconsin)などを含む。
発現ベクターは、酵母系で発現するのに適したベクターであってもよい。酵母系で発現するのに適した任意のベクターを採用することができる。適切なベクターは、例えば構成型又は誘導性プロモーター(例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びPGH)を含むベクターを含む(レビューとして、F.Ausubelなど,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience,New York(1987);Grantなど,Methods in Enzymol,153,516-544(1987);Mattanovich,D.など,Methods Mol.Biol.,824,329-358(2012);Celik,E.など,Biotechnol.Adv.,30(5),1108-1118(2012);Li,P.など,Appl.Biochem.Biotechnol.,142(2),105-124(2007);Boer,E.など,Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(3),513-523(2007);van der Vaart,J.M.,Methods Mol.Biol.,178,359-366(2002)及びHolliger,P.,Methods Mol.Biol.,178,349-357(2002)を参照されたい)。
本発明の発現ベクターにおいて、抗4-1BB抗体をコードする核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及びその他の発現に寄与する要素又はそれとの組み合わせを含むことができる。このような要素の例として、強発現型プロモーター(例えば、ヒトCMV IEプロモーター/エンハンサー及びRSV、SV40、SL3-3、MMTV及びHIV LTRプロモーター)、有効なポリ(A)ターミネーター配列、大腸菌でプラスミドを産生するための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び/又は便利なクローニング部位(例えば、ポリリンカー)を含む。核酸は、構成型プロモーター(例えばCMV IE)に対する誘導性プロモーターを含むこともできる。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の二重特異性分子を産生する組換え真核又は原核宿主細胞(例えばトランスフェクトーマ)に関する。宿主細胞の例として、酵母、細菌及び哺乳動物細胞(例えばCHO又はHEK細胞)を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供し、このゲノムは、本発明の抗4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明は、非組み込み型の核酸(例えばプラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現要素)を含む細胞を提供し、この核酸は、本発明の抗4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、異なる細胞系、例えばヒト細胞系、非ヒト哺乳動物細胞系及び昆虫細胞系、例えばCHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、マウス細胞系(例えば骨髄腫細胞系)、繊維肉腫細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系及びHuH-7ヒト細胞系で産生することができる(Dumontなど,2015,Crit Rev Biotechnol.,Sep.18,1-13.,その内容が引用により本明細書に援用される)。
一般的な免疫グロブリンの精製方法により本発明の抗体と培地とを適切に単離し、前記方法は、プロテインA-セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーである。
本発明は、さらに、組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
本明細書で使用されるように、組成物について、「基本的に...からなる」ことは、少なくとも1種の前述したような本発明の抗体が前記組成物において生物学的活性を有する唯一の治療剤又は試薬であることを意味する。
一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物であり、且つ、薬学的に許容される担体をさらに含む。
用語「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトに投与した際に、不利なもの、アレルギー又は他の不良反応を起こさない賦形剤を指す。それは、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング層、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。ヒトに投与する場合、製剤は、監督機関(例えばFDAオフィスやEMA)に要求される無菌、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準を満たすべきである。
本発明は、さらに、薬剤に関し、前記薬剤は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化の抗体(即ち、抗体がグリコシル化されていない)を製造することができる。グリコシル化を変えることにより、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めたり、抗体のADCC活性を変化させたりすることができる。このような炭水化物に対する修飾は、例えば抗体配列内の1つ又は複数のグリコシル化サイトを変えることにより実現されてもよい。例えば、1つ又は複数のアミノ酸置換を行うことにより、1つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化サイトを解消し、これにより、このサイトでのグリコシル化を解消することができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。Coなどの米国特許No.5,714,350及びNo.6,350,861(引用により本明細書に援用される)には、このような方法がさらに詳しく記載されている。また、代替として、改変されたグリコシル化のタイプを有する抗体、例えば減少量を有し又はフコシル残基を有しない低フコシル化又は非フコシル化抗体又は付加した二等分GlcNac構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたフコシル化モードにより抗体のADCC能力を向上させることが既に証明された。このような炭水化物に対する修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることで実現されてもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本分野で記載されており、且つ、宿主細胞として使用されてもよく、この宿主細胞で本発明の組換え抗体を発現させることにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する。例えば、HangなどのEP1176195(引用により本明細書に援用される)には、機能的に破壊されたFUT8遺伝子を持つ細胞系が記載されており、このFUT8遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系で発現した抗体は、低フコシル化又はフコシル残基の欠如を示す。このため、いくつかの実施形態において、本発明のヒト抗体(好ましくはモノクローナル抗体)は、低フコシル化又は非フコシル化モードが示された細胞系、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子発現が欠如している哺乳動物細胞系で組換え発現を行うことにより産生されてもよい。PrestaのPCT開示WO03/035835(引用により本明細書に援用される)には、変異体CHO細胞系、Lecl3細胞が記載されており、それらは、フコースをAsn(297)が連結した炭水化物に付着させる能力が低下しているので、この宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす(Shields,R.L.など,2002 J.Biol.Chem.277:26733-26740も参照されたい)。UmanaなどのPCT開示WO99/54342(引用により本明細書に援用される)には、工学的細胞系により糖タンパク質で修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)-NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現させることにより、工学的細胞系で発現する抗体は、付加した二等分GlcNac構造を示し、抗体のADCC活性の向上をもたらす(Umanaなど,1999 Nat.Biotech.17:176-180も参照されたい)。Eureka Therapeuticsは、さらに、フコース残基が欠如している改変された哺乳動物グリコシル化モードを有する抗体を産生できる遺伝子工学的CHO哺乳動物細胞を説明した(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。又は、本発明のヒト抗体(好ましくはモノクローナル抗体)は、酵母又は糸状菌で産生することができ、前記酵母又は糸状菌は、哺乳動物様グリコシル化モードに用いられ、且つグリコシル化モードとしてフコースが欠如した抗体を産生することができる(例えばEP1297172B1を参照されたい)。
4-1BB(CD137/TNFRSF9)は、抗原によって作動されるT細胞で発現するが、静止しているT細胞で発現しない。また、それが樹状細胞(DC)、ナチュラルキラー細胞(NKs)、活性化されたCD4+及びCD8+Tリンパ球、好酸球、ナチュラルキラーT細胞(NKT)及び肥満細胞で発現するが、骨髄由来免疫抑制細胞(MDSCs)の表面でこの分子が発現しないことが知られている。抗4-1BB抗体は、細胞傷害性T細胞を活性化するとともにγインターフェロン(IFN-γ)の生成を向上させる能力を有し、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)は、29個のメンバーからなるタンパク質スーパーファミリーであり、ヒト免疫システムにおいて重要な役割を果たしている。この分子ファミリーは、細胞死受容体(8個のメンバー)と活性化受容体の2種類に分類される。それらはいずれも1つの細胞内シグナル経路の活性化ドメイン及び1つの細胞外受容体サイトを含む。これらの受容体サイトは、腫瘍壊死因子スーパーファミリー(TNFSF)の対応するリガンドと結合することで活性化されてもよい。
TNFSF-TNFRSFのリガンド-受容体(例えばCD40-CD40L、CD27-CD70又はOX40-OX40L)シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育と死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、TNFRSF及びTNFSFメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、T細胞と他の免疫細胞を十分に活性化するために2種類のシグナルが必要である。第1種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞(APCs)上の主要組織適合性複合体(MHC)分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第2種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このようなシグナルは、T細胞とAPCs上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されたものである。4-1BBは、共刺激分子であり、TNFRSFに属する。それは、80年代末にTサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーT細胞及び細胞傷害性T細胞をコンカナバリンAで刺激して発見されたものである。ヒト4-1BBLは、1994に初めて直接発現クローンによって活性化されたCD4+Tリンパ球から単離された。4-1BBLは、主に樹状細胞、B細胞又はマクロファージに発現している。
本発明の抗体は、4-1BBに作用し、4-1BBは、強力なT細胞特異的共刺激分子とし、例えばDC細胞、単球、B細胞、肥満細胞、NK細胞及び好中球などの多くの非T細胞にも発現する。抗4-1BBアゴニスト又は4-1BBLトランスフェクションにより4-1BB共刺激シグナルを活性化することで、細胞増殖、サイトカイン発現、殺菌活性及びT細胞のエフェクター機能へのサポートを誘導することができる。アゴニスト抗体が4-1BBと結合すると、T細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともにサイトカイン(例えばIL-8)の分泌を促進することができる。
本発明に提供される抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体は、ヒト4-1BB及びカニクイザル4-1BBと結合することができ、且つ親和性が類似しているが、マウス4-1BBと結合せず、種特異性を有する。抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体は、強い結合特異性を持ち、4-1BBのみと結合し、B7ファミリーメンバー、CD28ファミリーメンバー及びCTLA-4、LAG-3、TIM-3、OX40及びCD27タンパク質と結合しなく、結果を図3に示す。
範囲の値が提供される場合、本明細書において特に明記されていない限り、各挿入値、下限までの単位の10分の1、この範囲の上限と下限との間及び任意の前記範囲内の他の前記値又は挿入値は、いずれも本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。特に除外された限界を除き、前記範囲内で特定的に除外された境界を除く限り、独立して小さな範囲に含まれてもよいこれらの小さな範囲の上限及び下限も本発明に含まれる。前記範囲が1つ又は2つの限界を含む場合、1つ又は2つの含まれる境界を除外する範囲も本発明に含まれる。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される通常の意義を意味すべきである。本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の任意のものは、本発明の実施又は試験でも使用ことができるが、現在、好ましい方法及び材料が開示されている。本明細書で言及されているすべての出版物は、その全体が引用により本明細書に援用される。
以下、実施例を併せて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解することができる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の製造過程を説明するためのものであり、この製造過程は、関連する方法を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではなく、本発明の精神から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の特徴及びメリットを示すためのものであるが、本発明は、これらの特徴及びメリットに限定されない。
以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法であり、具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又はメーカーにより推奨される条件に従って行い、使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。
実施例1 マウス由来抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の製造
1.1、動物の免疫
実験動物は、6~8週齢の雌BALB/cマウス(北京維通利華社から購入)を使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、50μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H03H)及びフロインド完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5881)を使用し、両者を十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、25μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質とフロインド不完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5806)を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計3回であった。最終免疫を行ってから10日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離した。組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)について、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の3日前に、アジュバントを含まない組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質を50μg腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、DMEM培地(Gibco、カタログ番号11965)で単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、融合を準備した。
1.1、動物の免疫
実験動物は、6~8週齢の雌BALB/cマウス(北京維通利華社から購入)を使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、50μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H03H)及びフロインド完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5881)を使用し、両者を十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、25μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質とフロインド不完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5806)を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計3回であった。最終免疫を行ってから10日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離した。組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)について、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の3日前に、アジュバントを含まない組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質を50μg腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、DMEM培地(Gibco、カタログ番号11965)で単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、融合を準備した。
1.2、ハイブリドーマ細胞の製造
対数増殖期にある骨髄腫細胞SP2/0(中国科学院から購入)を採取し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てて、不完全DMEM培養液で細胞を懸濁してからカウントした。必要な数の細胞と脾臓細胞を所定の割合で50mLの遠心管に混合して、5分間遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。1分間かけて1mLのPEG(Sigma、カタログ番号P7181)を徐々に加え、90秒間静置した。不完全DMEM培地を50mLとなるまで加えて融合を中止し、5分間静置し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てた。20mLのHAT培地(Sigma、カタログ番号H0262-10VL)を加えて融合細胞を柔らかく吹き散らし、細胞数1×105個/ウェルでHAT培地に撒き、37℃、5%CO2インキュベータに置いてインキュベートした。7~10日後にHT培地(Sigma、カタログ番号H0137-10VL)でHAT培地と交換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の1/10以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
対数増殖期にある骨髄腫細胞SP2/0(中国科学院から購入)を採取し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てて、不完全DMEM培養液で細胞を懸濁してからカウントした。必要な数の細胞と脾臓細胞を所定の割合で50mLの遠心管に混合して、5分間遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。1分間かけて1mLのPEG(Sigma、カタログ番号P7181)を徐々に加え、90秒間静置した。不完全DMEM培地を50mLとなるまで加えて融合を中止し、5分間静置し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てた。20mLのHAT培地(Sigma、カタログ番号H0262-10VL)を加えて融合細胞を柔らかく吹き散らし、細胞数1×105個/ウェルでHAT培地に撒き、37℃、5%CO2インキュベータに置いてインキュベートした。7~10日後にHT培地(Sigma、カタログ番号H0137-10VL)でHAT培地と交換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の1/10以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
1.3、クローンのスクリーニング及び同定
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりハイブリドーマの培養上清での抗ヒト4-1BB抗体をスクリーニングした。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレートに組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。OD450nmの強弱によって抗ヒト4-1BB選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりハイブリドーマの培養上清での抗ヒト4-1BB抗体をスクリーニングした。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレートに組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。OD450nmの強弱によって抗ヒト4-1BB選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
アゴニスト抗体と4-1BBとが結合した後、T細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともに、サイトカイン(例えばIL-8)の分泌を促進することができる。GS-H2/4-1BB細胞実験に基づいてアゴニスト抗ヒト4-1BB抗体をスクリーニングした。陽性クローンのハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔内に接種し、1週後に腹水を抽出し、精製して抗体タンパク質を得た。GS-H2/4-1BB細胞をインキュベートした。スクリーニングの当日に、トリプシンでGS-H2/4-1BB細胞を消化し、完全培地で消化を中止し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てて、2%血清を含むMEM培地(Gibco、カタログ番号10370-021)で細胞を1×105個/mLの細胞密度で再懸濁させ、100μL/ウェルで96ウェルプレートに撒き、37℃、5%CO2インキュベータに置いて2時間インキュベートした。ビオチンで標識した抗マウスIgG抗体(中杉金橋、カタログ番号ZB-2020)及びDynabeadsストレプトアビジン磁気ビーズM-280(Invitrogen、カタログ番号112-05D)を室温で30分間インキュベートし、磁石で磁気ビーズを2~3分間単離し、PBSで磁気ビーズを4~5回洗浄した。2時間インキュベートした後、細胞プレートの各ウェルに最終濃度10μg/mLの被験抗体50μL及び最終濃度100μg/mLのインキュベートされた磁気ビーズ50μLを加えた。37℃、5%CO2インキュベータで24時間インキュベートした。IL-8検出キット(達科為社、カタログ番号1110802)を用いて説明書に従ってGS-H2/4-1BB細胞上清中のIL-8の発現量を検出し、OD450nmの強弱によって抗ヒト4-1BBアゴニスト抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
結果を表1及び図1のAに示し、複数の抗ヒト4-1BBクローンから分泌された抗体は、4-1BB結合活性を有した。結果を図1のBに示し、複数の抗ヒト4-1BBクローンから分泌された抗体は、4-1BBアゴニスト活性を有した。
1.4、モノクローナル抗体配列の測定
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及びアゴニスト活性を同時に有するクローンに対して抗体DNA配列の測定を行った。まず、細胞mRNAを抽出し、RNAprep Pureキット(Tiangen、DP419)を使用した。次いで、SMART 5’RACEキット(Clontech、カタログ番号634849)を使用して、ハイブリドーマから抽出したトータルRNAを逆転写してヒト4-1BBのcDNAの第1鎖を合成し、PCR増幅可変領域のプライマーVHGSP(SEQ ID NO.32)及びVLGSP(SEQ ID NO.33)をそれぞれ設計した。PCR増幅で得られた目的のバンドをin-fusion方式により線形化されたpRACEベクター(Clontech、カタログ番号:634859)にクローニングし、モノクローナルを選んでDNAシーケンシングを行った。
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及びアゴニスト活性を同時に有するクローンに対して抗体DNA配列の測定を行った。まず、細胞mRNAを抽出し、RNAprep Pureキット(Tiangen、DP419)を使用した。次いで、SMART 5’RACEキット(Clontech、カタログ番号634849)を使用して、ハイブリドーマから抽出したトータルRNAを逆転写してヒト4-1BBのcDNAの第1鎖を合成し、PCR増幅可変領域のプライマーVHGSP(SEQ ID NO.32)及びVLGSP(SEQ ID NO.33)をそれぞれ設計した。PCR増幅で得られた目的のバンドをin-fusion方式により線形化されたpRACEベクター(Clontech、カタログ番号:634859)にクローニングし、モノクローナルを選んでDNAシーケンシングを行った。
実施例2 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の製造
4-1BB-246-8-33-83クローンをPCRで増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.7に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.8に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.1、2及び3に示される。重鎖の3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.4、5及び6に示される。4-1BB-246-8-33-83クローンから構築されたキメラ4-1BBモノクローナル抗体は、mAb-33-83と命名され、キメラモノクローナル抗体mAb-33-83の軽鎖は、4-1BB-246-8-33-83クローンの軽鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.7に示される)と軽鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.9に示される)とが連結されたものであり、mAb-33-83抗体の重鎖は、重鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.8に示される)と重鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.10に示される)とが連結されたものである。上記の抗体の軽・重鎖のコードされたアミノ酸配列に対して遺伝子合成(蘇州金唯智バイオテクノロジー社により完了した)を行うことにより、対応するヌクレオチド配列を得るとともに、真核細胞の発現ベクターX0GCにクローニングし、次いで、組換え発現ベクターをExpiCHO細胞系(ExpiCHOTM、カタログ番号A29133、invitrogen)にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なExpiCHOTM発現培地(ExpiCHOTM Expression Medium、カタログ番号A29100、invitrogen)に35×105細胞/mLの細胞密度で再懸濁させ、トランスフェクションの当日にカウントし、細胞密度は、(70-200)×105細胞/mLの範囲内にあり、生存率は、95%超えであるべきであり、予備加熱を行ったExpiCHOTM発現培地で細胞を希釈し、最終密度は、60×105細胞/mLであった。トランスフェクション体積に従ってOptiPROTM培地(カタログ番号12309、invitrogen)でプラスミド及びトランスフェクション試薬ExpiFectamineTMCHO試薬(カタログ番号A29131、invitrogen)をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は、0.5μg/mLであった。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、1~5min静置し、その後、プラスミドトランスフェクション試薬コンパウンドを細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで125rpm、37℃、8%CO2にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ExpiFectamine(登録商標)CHOエンハンサー(カタログ番号A29131、invitrogen)及びExpiCHO(登録商標)Feed(カタログ番号A29101-02、invitrogen)を補給し、細胞インキュベータを125rpmシェーカー、32℃、5%CO2に調整し、遠心により10日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
4-1BB-246-8-33-83クローンをPCRで増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.7に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.8に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.1、2及び3に示される。重鎖の3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.4、5及び6に示される。4-1BB-246-8-33-83クローンから構築されたキメラ4-1BBモノクローナル抗体は、mAb-33-83と命名され、キメラモノクローナル抗体mAb-33-83の軽鎖は、4-1BB-246-8-33-83クローンの軽鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.7に示される)と軽鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.9に示される)とが連結されたものであり、mAb-33-83抗体の重鎖は、重鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.8に示される)と重鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.10に示される)とが連結されたものである。上記の抗体の軽・重鎖のコードされたアミノ酸配列に対して遺伝子合成(蘇州金唯智バイオテクノロジー社により完了した)を行うことにより、対応するヌクレオチド配列を得るとともに、真核細胞の発現ベクターX0GCにクローニングし、次いで、組換え発現ベクターをExpiCHO細胞系(ExpiCHOTM、カタログ番号A29133、invitrogen)にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なExpiCHOTM発現培地(ExpiCHOTM Expression Medium、カタログ番号A29100、invitrogen)に35×105細胞/mLの細胞密度で再懸濁させ、トランスフェクションの当日にカウントし、細胞密度は、(70-200)×105細胞/mLの範囲内にあり、生存率は、95%超えであるべきであり、予備加熱を行ったExpiCHOTM発現培地で細胞を希釈し、最終密度は、60×105細胞/mLであった。トランスフェクション体積に従ってOptiPROTM培地(カタログ番号12309、invitrogen)でプラスミド及びトランスフェクション試薬ExpiFectamineTMCHO試薬(カタログ番号A29131、invitrogen)をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は、0.5μg/mLであった。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、1~5min静置し、その後、プラスミドトランスフェクション試薬コンパウンドを細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで125rpm、37℃、8%CO2にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ExpiFectamine(登録商標)CHOエンハンサー(カタログ番号A29131、invitrogen)及びExpiCHO(登録商標)Feed(カタログ番号A29101-02、invitrogen)を補給し、細胞インキュベータを125rpmシェーカー、32℃、5%CO2に調整し、遠心により10日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
実施例3 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合活性
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプル及び対照Urelumab(特許配列WO2004010947に由来する)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプル及び対照Urelumab(特許配列WO2004010947に由来する)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図2に示し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、優れたヒト4-1BB結合親和性を有し、対照であるUrelumabの結合活性と同等であった。
実施例4 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の種特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB、カニクイザル4-1BB及びマウス4-1BB(いずれも北京シノバイオロジカル社から購入)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で段階希釈した抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体サンプルを100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の種特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB、カニクイザル4-1BB及びマウス4-1BB(いずれも北京シノバイオロジカル社から購入)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で段階希釈した抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体サンプルを100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ELISAによりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒトCD80、CD86、4-1BB、PD-L2、B7-H2、CTLA4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、CD28、4-1BB、OX40、CD27、ICOSをコーティングした。CD28タンパク質は、株式会社アクロバイオシステムズ(北京)から購入され、残りのタンパク質は、いずれも北京シノバイオロジカル社から購入され、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で段階希釈した抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体サンプル及び対照Urelumab、アイソタイプコントロールを100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図3のAに示すように、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、ヒト4-1BB及びカニクイザル4-1BBと結合することができ、且つ親和性が類似したが、マウス4-1BBと結合しなく、種特異性を有する。図3のBに示すように、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、強い結合特異性を有し、4-1BBのみと結合し、B7ファミリーメンバー、CD28ファミリーメンバー及びCTLA-4、LAG-3、TIM-3、OX40及びCD27タンパク質と結合しない。
実施例5 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプルを50μL/ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識した4-1BBL(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号41L-H82F9)を50μL/ウェルで添加し、濃度を200ng/mL(最終濃度は100ng/mL)とし、25℃で90分間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:1000にて希釈した、ストレプトアビジン-HRP(Streptavidin-HRP)(BD、カタログ番号554066)を100μL/ウェルで加え、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプルを50μL/ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識した4-1BBL(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号41L-H82F9)を50μL/ウェルで添加し、濃度を200ng/mL(最終濃度は100ng/mL)とし、25℃で90分間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:1000にて希釈した、ストレプトアビジン-HRP(Streptavidin-HRP)(BD、カタログ番号554066)を100μL/ウェルで加え、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図4に示し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体の4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性は、対照Urelumabよりも優れた。
実施例6 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
6~8週齢の雌h4-1BB/h4-1BB二重ヒト化マウス(マウス由来の4-1BB及び4-1BBがノックアウトされ、ヒト由来の4-1BB及び4-1BBが過剰発現した。江蘇バイオサイトジェン社)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1頭につき、1×106個のMC38/h4-1BBマウス結腸腫瘍細胞(MC38は上海舜冉から購入される)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(DPBS、GIBCO、カタログ番号14190-136)、35nmol/kgの抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び35nmol/kgの対照Urelumabを週2回、2週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に2回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は2週間であり、即ち、投与を中止した後、2週間観察した。
6~8週齢の雌h4-1BB/h4-1BB二重ヒト化マウス(マウス由来の4-1BB及び4-1BBがノックアウトされ、ヒト由来の4-1BB及び4-1BBが過剰発現した。江蘇バイオサイトジェン社)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1頭につき、1×106個のMC38/h4-1BBマウス結腸腫瘍細胞(MC38は上海舜冉から購入される)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(DPBS、GIBCO、カタログ番号14190-136)、35nmol/kgの抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び35nmol/kgの対照Urelumabを週2回、2週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に2回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は2週間であり、即ち、投与を中止した後、2週間観察した。
結果を図5に示し、相同腫瘍モデルにおいて、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、抗腫瘍活性を有し、腫瘍の成長を著しく阻害し、効果は対照Urelumabよりも優れた。
実施例7 ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の製造
ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体は、Leungなど(1995、Molecule Immunol 32:1413-27)の方法により得られたものである。GermLineデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、hIGKV1-27*01+hIGKJ4である。重鎖可変領域のテンプレートは、hIGHV1-69*02+hIGHJ6*01である。マウス由来抗体の軽鎖CDR領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのCDR領域を置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域を得て、配列は、SEQ ID NO.11に示される。移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、SEQ ID NO.12に示される。SEQ ID NO.11とSEQ ID NO.12においてサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.13-20に示され、得られた重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.21-31に示される。軽鎖可変領域を軽鎖定常領域(配列SEQ ID NO.9)にそれぞれ連結させて、対応する軽鎖全長配列を得た。重鎖可変領域を重鎖定常領域(配列SEQ ID NO.10)にそれぞれ連結させて、対応する重鎖全長配列を得た。親和性と安定性のスクリーニングを通じて利用可能なヒト化配列を得て、得られたヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列情報は、表2に示し、ここで、ID列は、それぞれ得られたキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体の略称である。
ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体は、Leungなど(1995、Molecule Immunol 32:1413-27)の方法により得られたものである。GermLineデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、hIGKV1-27*01+hIGKJ4である。重鎖可変領域のテンプレートは、hIGHV1-69*02+hIGHJ6*01である。マウス由来抗体の軽鎖CDR領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのCDR領域を置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域を得て、配列は、SEQ ID NO.11に示される。移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、SEQ ID NO.12に示される。SEQ ID NO.11とSEQ ID NO.12においてサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.13-20に示され、得られた重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.21-31に示される。軽鎖可変領域を軽鎖定常領域(配列SEQ ID NO.9)にそれぞれ連結させて、対応する軽鎖全長配列を得た。重鎖可変領域を重鎖定常領域(配列SEQ ID NO.10)にそれぞれ連結させて、対応する重鎖全長配列を得た。親和性と安定性のスクリーニングを通じて利用可能なヒト化配列を得て、得られたヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列情報は、表2に示し、ここで、ID列は、それぞれ得られたキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体の略称である。
実施例8 ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の抗原結合活性
実施例7で得られたIDがz0のヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145b(配列情報:VH SEQ ID NO.12;VL SEQ ID NO.11)と命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの抗原結合活性を検出し、試験手順は、実施例4と同様である。実験結果を図6に示す。図6から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bは、優れたヒト4-1BB結合親和性を有し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び対照Urelumabの結合活性と同等であった。
実施例7で得られたIDがz0のヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145b(配列情報:VH SEQ ID NO.12;VL SEQ ID NO.11)と命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの抗原結合活性を検出し、試験手順は、実施例4と同様である。実験結果を図6に示す。図6から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bは、優れたヒト4-1BB結合親和性を有し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び対照Urelumabの結合活性と同等であった。
実施例9 ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性
実施例7で記載されるヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145bと命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。試験手順は、実施例5と同様であり、結果を図7に示す。図7から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性は、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83よりもやや劣ったが、ブロッキング活性は、対照であるUrelumabよりも優れた。
実施例7で記載されるヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145bと命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。試験手順は、実施例5と同様であり、結果を図7に示す。図7から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性は、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83よりもやや劣ったが、ブロッキング活性は、対照であるUrelumabよりも優れた。
最後に、以上の各実施例は、本発明の技術案を説明するためのものであり、それを限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、前述した各実施例に記載される技術案を修正したり、その技術的特徴の一部又は全部を同等に置き換えることは依然として可能であり、これらの修正又は置き換えは、対応する技術案の本質を本発明の各実施例に係る技術案の範囲から逸脱させるものではないことを理解すべきである。
本発明は、抗体及び抗体ヒト化改変研究分野に関し、特に、本発明は、4-1BBと特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
モノクローナル抗体は、単一の抗原のエピトープにのみ作用する高度な標的特異的抗体であり、例えば癌、炎症、自己免疫疾患、感染症などの多くの疾患の治療に広く用いられており、特に癌の化学療法が無効になった後、このような標的特異的薬剤は特に重要である。
4-1BBは、共刺激分子であり、TNFRSFに属する。それは、80年代末にTサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーT細胞及び細胞傷害性T細胞をコンカナバリンAで刺激して発見したものである。ヒト4-1BBLは、1994に初めて直接発現クローンによって活性化されたCD4+Tリンパ球から単離された。4-1BBLは、主に樹状細胞、B細胞又はマクロファージに発現している。既存の研究の結果から明らかなように、TNFSF-TNFRSFのリガンド-受容体(例えばCD40-CD40L、CD27-CD70又はOX40-OX40L)シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育及び死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、TNFRSF及びTNFSFメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、T細胞及び他の免疫細胞を十分に活性化するために2種類のシグナルが必要である。第1種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞(APCs)上の主要組織適合性複合体(MHC)分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第2種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このタイプのシグナルは、T細胞とAPCs上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されるものである。
このため、TNFSF及びTNFRSFリガンド-受容体相互作用に対する免疫治療技術は、癌の治療において高い潜在力を持っている。この分野では、依然として、より効果的な4-1BBと特異的に結合する抗体を開発する必要がある。
本発明の第1の態様は、単離された抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体に関し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO.7に示す軽鎖可変領域の3つの相補性決定領域LCDR及びSEQ ID NO.8に示す重鎖可変領域の3つの相補性決定領域HCDRを含む。
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び/又は重鎖可変領域を含む。ここで、軽鎖可変領域は、SEQ ID No.1に示すLCDR1のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.2に示すLCDR2のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.3に示すLCDR3のようなアミノ酸配列を含み、及び/又は、重鎖可変領域は、SEQ ID No.4に示すHCDR1のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.5に示すHCDR2のようなアミノ酸配列、SEQ ID No.6に示すHCDR3のようなアミノ酸配列を含む。
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID No.1-3又は4-6に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID No.1-3又は4-6に示す配列に対して1つ又は複数、例えば1個、2個、3個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体から選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgDのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び/又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる。好ましくは、重鎖定常領域配列は、IgG1又はIgG4の定常領域配列から選ばれ、及び/又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、4-1BBキメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.7に示されるものであるか、又は、SEQ ID No.7に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.7に示す配列に対して1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び/又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.8に示されるものであるか、又は、SEQ ID No.8に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.8に示す配列に対して1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記4-1BBキメラ抗体及びその機能的フラグメントは軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、ここで、
(a)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(b)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(c)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する。
(a)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(b)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31のアミノ酸配列から選ばれるものを有する;
(c)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有する;及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する。
好ましくは、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有する;及び/又は、重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fd、Fv、scFv、二重特異性抗体、ラクダ抗体、CDR及び抗体認識の最小単位(dAb)から選ばれる1種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Fab、F(ab’)2又はscFvである。
本発明の第2の態様は、以下のものから選ばれる単離された核酸分子に関する:
(1)第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体をコードするDNA又はRNA;
(2)(1)で定義されたDNA又はRNAと完全に相補的な核酸。
(1)第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体をコードするDNA又はRNA;
(2)(1)で定義されたDNA又はRNAと完全に相補的な核酸。
本発明の第3の態様は、効果的にライゲーションした第2の態様に係る核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
本発明の第4の態様は、第2の態様に係る核酸分子又は第3の態様に係るベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明の第5の態様は、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞、及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に関する。
本発明の第6の態様は、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体を生産する方法に関し、前記方法は、第4の態様に係る宿主細胞を前記抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させるステップを含み、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含み、任意選択的に、得られた産物を前述したような診断剤及び/又は治療剤に結合させるステップを含む。
本発明の第7の態様は、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び/又は治療するための薬剤の製造における、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞の使用に関する。
本発明の第8の態様は、4-1BBを介した疾患又は病症を予防及び/又は治療するための薬剤における、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞の使用に関し、ここで、前記疾患又は病症は、好ましくは、腫瘍である。より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる1種又は複数種である。
本発明の第9の態様は、必要とする被験者に、第1の態様に係る抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、第2の態様に係る核酸分子、第3の態様に係るベクター又は第4の態様に係る宿主細胞を投与するステップを含む、腫瘍を予防及び/又は治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる1種又は複数種である。好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる1種又は複数種である。より好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、宮頸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる1種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記被験者は、哺乳動物から選ばれ、ヒト及び/又は他の霊長類動物を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス及び/又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、核酸分子、ベクター又は宿主細胞は、当分野の通常の施用方法、例えば非経口経路、静脈内投与により使用される。
本発明の抗4-1BBモノクローナル抗体は、特異性が強く、安定性がよく、強いT細胞機能への調節活性と良好な薬物動態特性を有し、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。また、本発明の抗4-1BBモノクローナル抗体は、4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性がUrelumabモノクローナル抗体より強い。
以下、本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記載に使用する必要がある図面に対して簡単に紹介する。なお、以下の記載における図面は、ただ本発明の一部の実施形態に過ぎない。当業者は、創造的な労働を付与しない前提で、これらの図面によって他の図面を得ることもできる。
定義
用語であるヒト「4-1BB」、即ちCD137は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー(TNFRSF9)に属し、主に活性化されたT細胞に発現し、T細胞共刺激分子であり、そのリガンドは、4-1BBLである。
用語であるヒト「4-1BB」、即ちCD137は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー(TNFRSF9)に属し、主に活性化されたT細胞に発現し、T細胞共刺激分子であり、そのリガンドは、4-1BBLである。
本明細書で使用される用語である「抗4-1BB抗体」、「抗4-1BB」、「4-1BB抗体」、「抗4-1BBモノクローナル抗体」又は「4-1BBと結合する抗体」とは、4-1BBタンパク質又はそのフラグメントと十分な親和性で結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体は、異種の4-1BBにおける保存された4-1BBのエピトープと結合する。
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又は抗原のエピトープと結合する能力を持つ免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含み、通常、少なくとも2本の重(H)鎖及び少なくとも2本の軽(L)鎖から構成される。免疫グロブリンは、IgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4サブクラス)、IgA(IgA1及びIgA2サブクラス)、IgM及びIgEのアイソタイプを含み、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。軽鎖は、定常領域によってκ鎖とλ鎖に分けられる。
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のうち、抗体とその抗原との結合に関与するドメインを指す。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略記する)及び重鎖定常領域(本明細書においてCHと略記する)から構成され、重鎖定常領域は、通常、三つのドメイン(CH1、CH2及びCH3)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略記する)及び軽鎖定常領域(本明細書においてCLと略記する)から構成される。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には抗原認識を担当するが、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織又は因子(免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)、Fc受容体及び古典補体システムの第1成分(C1q)を含む)との結合を媒介することができる。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。VH及びVL領域は、さらに、「相補性決定領域(CDR)」と呼ばれる超可変領域(HVR)に細かく分けられ、それらの間にはより保存的な「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる領域が介在している。各VH及びVLは、3つのCDRドメイン及び4つのFRドメインから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順で配列される。
用語「相補性決定領域」又は「CDR領域」又は「CDR」(本明細書において超可変領域「HVR」とは互換的に使用されてもよい)とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ(「超可変ループ」)を形成し、及び/又は抗原接触残基(「抗原接触点」)を含有する領域を指す。CDRは、主に抗原のエピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の3つのCDRは、HCDR1、HCDR2及びHCDR3と呼ばれ、軽鎖の3つのCDRは、LCDR1、LCDR2及びLCDR3と呼ばれる。
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のCDRの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のCDR配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のCDR配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のCDR配列を含むが、異なるスキーム(例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ)を適用することによって、いわゆるCDRの境界が、本発明で定義される特定のCDRの境界と異なる抗体をさらに含む。
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単分子組成物の抗体分子製剤としての、基本的に同質の抗体群から得られた抗体を指し、即ち、個体抗体を含む群は、わずかに存在する天然に発生する可能性がある突然変異以外は同じである。一般的なモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、2種以上のFabドメインから構成されてもよく、これにより、2種以上のターゲットに対する特異性を向上させる。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、任意の具体的な産生方法(例えば、組換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど)に限定されるものではない。
用語「二重抗体」、「二重機能的抗体」、「二重特異性抗体」、「bispecific antibody」又は「BsAb」とは、2個の異なる抗原結合部位を有することにより、2つのターゲット抗原と同時に結合することができ、抗体の標的性を発揮すると同時に別の特殊な機能エフェクター分子を媒介する作用を持つものである。媒介された特殊な機能エフェクター分子は、毒素、酵素、サイトカイン、放射線核種などであってもよく、抗原と結合する、二重特異性抗体の2つのアームは、それぞれFab、Fv、ScFv又はdSFvなどに由来してもよい。
用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる抗原決定基(「エピトープ」)に対する異なる抗体の調製物を指す。
用語「抗体の抗原結合フラグメント」とは、エピトープと結合できる抗体のフラグメント、部分、領域又はドメインを指す(例えば切断、組換え、合成などによって得られてもよい)。抗原結合フラグメントは、このような抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はすべての6つのCDRドメインを含むことができ、また、前記エピトープと結合できるにもかかわらず、異なる特異性、親和性又は選択性を示すことができる。好ましくは、抗原結合フラグメントは、前記抗体のすべての6つのCDRドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、1本のポリペプチド鎖(例えば、scFv)の一部であってもよく、又は、1本のポリペプチド鎖を含むものであるか、又は、2本又はそれ以上のポリペプチド鎖(それぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する)(例えば、二重抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメントなど)の一部であってもよく、又は、2本又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。
本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例として、(a)VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価のフラグメントであるFab’又はFabフラグメント;(b)ジスルフィド結合によってヒンジドメインで連結された2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(c)VH領域及びCHlドメインからなるFdフラグメント;(d)抗体の1つのアームのVL領域及びVH領域からなるFvフラグメント;(e)遺伝工学的手法により抗体VH及びVLを結合ペプチドセグメントで連結した組換えタンパク質である単鎖抗体(single chain Fv,scFv);(f)基本的にVH領域からなり且つドメイン抗体(Holtなど,Trends Biotechnol.,2i(ll): 484-90)とも呼ばれるdAbフラグメント(Wardなど,Nature,341,544-546(1989));(g)ラクダ又はナノ抗体(Revetsなど,Expert Opin Biol Ther.,5(l): 111-24)及び(h)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。
用語「キメラ抗体」とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種に由来し又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は同種であるが、鎖の残りの部分が他の種に由来し又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は同種であることを指す。本発明は、ヒト抗体由来の可変領域抗原結合配列を提供する。このため、本明細書で主に注目したキメラ抗体は、1つ又は複数のヒト抗原結合配列(例えばCDR)を有し且つ1つ又は複数の非ヒト抗体由来配列、例えばFR又はC領域の配列を含有する抗体を含む。なお、本明細書で記載されるキメラ抗体は、1種の抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列及び他の抗体クラス又はサブクラスに由来する他の配列、例えばFR又はC領域の配列を含む抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」とは、他の哺乳動物種、例えばマウス種に由来するCDR配列がヒトフレーム配列に移植された抗体を指す。ヒトフレーム配列において別途のフレーム領域修飾を行うことができる。
用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」(「humAb)又は「HuMab」)とは、ヒト種系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト種系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる(例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発、又は遺伝子再構成中、又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異)。
変異体抗体も本発明の範囲内に含まれる。このため、本願で挙げられた配列の変異体も本発明の範囲内に含まれる。当分野で知られている方法を使用することにより改良された親和性を有する抗体配列の他の変異体を得ることができ、且つ、これらの変異体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換は、さらに改良された親和性を有する抗体を得るために用いることができる。又は、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、抗体の生産における発現系の翻訳効率を改善するために用いることができる。このような変異体抗体の配列は、本願で挙げられた配列と70%又はそれ以上(例えば80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれ以上)の配列相同性を有する。このような配列相同性は、参照配列(即ち、本願で挙げられた配列)の全長に対して計算して得られたものである。
IMGT(登録商標)、the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)又はKabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesmann,K.S.& Foeller,C.,(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH公開番号91-3242,アメリカ合衆国保健福祉省;Chothia,C.& Lesk,A.M.,(1987),Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins.,J.Mol.Biol.,196,901-917に従って、本発明に係る領域におけるアミノ酸残基に番号を割り当てる。特に明記されていない限り、本発明におけるアミノ酸残基は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
抗体又はその抗原結合フラグメントが他の分子の領域(即ち、エピトープ)と「特異的に」結合することとは、他のエピトープよりも、より頻繁に、より速く且つより長い持続時間及び/又はより大きな親和性で前記エピトープと反応又は結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも10-7M、例えば10-8M、10-9M、10-10M、10-11M又はそれ以上の親和性でヒト4-1BBと結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理条件下で(例えば、インビボで)結合する。このため、4-1BBと特異的に結合することは、この抗体又はその抗原結合フラグメントが上記の特異性及び/又はこのような条件で4-1BBに結合する能力を指す。前記結合を決定するのに適した方法は、当分野で知られているものである。
抗体と指定された抗原とが結合するという背景下で、用語「結合」とは、通常、約10-6M又はそれ以下のKDに対応する親和性で結合することを指し、このKDは、指定された抗原又は緊密に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)に対するこの抗体の結合の親和性よりも、少なくとも10倍、例えば少なくとも100倍、少なくとも1,000倍低い。
本明細書で使用されるように、用語「kd」(sec-1又は1/s)とは、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、koff値とも呼ばれる。
本明細書で使用されるように、用語「ka」(M-1 x sec-1又は1/Msec)とは、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度定数を指す。
本明細書で使用されるように、用語「KD」(M)とは、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指し、且つkdをkaで割ることにより得られるものである。
本明細書で使用されるように、用語「KA」(M-1又は1/M)とは、特定の抗体-抗原相互作用の結合平衡定数を指し、且つkaをkdで割ることにより得られるものである。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、CDRの一部(即ち、結合に必要なCDR残基サブグループ、SDRと呼ばれる)のみがヒト化抗体で結合していればよい。分子モデリング及び/又は経験に応じて、又はGonzales,N.R.など,(2004),SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human GermLine Templates To Minimize Its Immunogenicity,Mol.Immunol.,41:863-872に記載されるように、先行研究に基づいて(例えばCDR H2における残基H60-H65が、通常、不要である)Chothia超可変ループ以外に位置するKabat CDR領域(Kabatなど,(1992),Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,公開番号91-3242;Chothia,C.など,(1987),Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,J.Mol.Biol.,196:901-917を参照されたい)から関連するエピトープと接触しなく且つSDRに位置しないCDR残基を同定することができる。このようなヒト化抗体において、1つ又は複数のドナーであるCDR残基が存在しなく又はドナーであるCDR全体が省略される位置で、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において対応する位置(Kabatに従って番号付けされる)を占めるアミノ酸であってもよい。このような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減らし、これにより、潜在的な免疫原性を低下させる点で潜在的に有利である。しかし、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性もあり、且つ親和性が著しく低下することを避けることが望ましい。経験に応じてCDR内の置換位置及び置換されるアミノ酸を選択することもできる。
CDR残基の単一のアミノ酸を変えて機能的結合が失われるという事実を利用して(Rudikoff,S.など,(1982),Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-binding Specificity,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79(6):1979-1983)、代替可能な機能的CDR配列を系統的に同定することができる。このような変異体CDRを得るための好ましい方法において、CDRをコードするポリヌクレオチドの変異を誘発して(例えばランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により)置換されたアミノ酸残基を有するCDRを生成する。元の(機能的)CDR配列における関連する残基の身元と置換された(非機能的)変異体CDR配列の身元とを比較することにより、この置換されたBLOSUM62.iijの置換スコアを同定することができる。BLOSUMシステムは、配列データベースを分析して作成されたアミノ酸置換行列を提供して、信頼性の比較に用いられる(Eddy,S.R.,(2004),Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?,Nature Biotech.,22(8):1035-1036;Henikoff,J.G.,(1992),Amino acid substitution matrices from protein blocks),Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),89:10915-10919;Karlin,S.など,(1990),Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes),PNAS,87:2264-2268;Altschul,S.F.,(1991),Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective,J.Mol.Biol.,219、555-565。現在、最も先進的なBLOSUMデータベースは、BLOSUM62データベース(BLOSUM62.iij)である。表1は、BLOSUM62.iij置換スコアを示す(スコアが高いほど、置換が保存的であるので、この置換は、機能に影響を与えない可能性が高くなる)。例えば、得られたCDRを含む抗原結合フラグメントが4-1BBに結合できない場合、BLOSUM62.iij置換スコアは、十分に保存的ではないと考えられ、より高い置換スコアを持つ新たな候補置換を選択して生成する。このため、例えば、元の残基がグルタミン酸(E)であり且つ非機能的置換残基がヒスチジン(H)である場合、BLOSUM62.iij置換スコアは、0であり、且つ、より保存的な変化(例えばアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリジン)は、好ましいものである。
そこで、本発明は、改良されたCDRの同定におけるランダム変異誘発の使用を考慮した。本発明の背景下で、保存的置換は、以下の3つの表における1つ又は複数のアミノ酸のカテゴリ内の置換により定義されてもよい。
保存的置換を行うアミノ酸残基の種類:
代替の保存的アミノ酸残基置換の種類:
アミノ酸残基の物理的及び機能的代替の分類:
より保存的な置換グループには、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン及びアスパラギン-グルタミンが含まれる。
いくつかの実施形態において、親水性アミノ酸は、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Tyr及びLysから選ばれる。
さらに、例えばCreighton,(1984),Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman and Company)に記載されている原理を用いて別のアミノ酸グループを作成することもできる。
このため、含まれる抗体又はその抗原結合フラグメントのCDR変異体の配列は、置換によって親抗体のCDRの配列と異なることができる。例えば4、3、2又は1個のアミノ酸残基の置換が挙げられる。本発明の実施形態によれば、CDR領域におけるアミノ酸は、以上の3つの表で定義されるように、保存的置換で置換されてもよい。
「相同性」又は「配列同一性」とは、配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。
このような変異体ポリペプチド配列は、本願で挙げられる配列と、70%又はそれ以上(即ち80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれ以上)の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の様々な長さの連続した延出セグメントを含むポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、適用可能な場合、本発明に提供されるペプチド配列は、少なくとも約5、10、15、20、30、40、50、75、100、150又はそれ以上の本発明で開示される1つ又は複数の配列の連続したペプチド、及びそれらの間の中間程度の長さを有するすべてのペプチドを含む。
用語「治療」とは、疾患又は病状の進展又は重症度を改善、緩和、減弱又は逆転させたり、このような疾患又は病状の1種又は複数種の症状又は副作用を改善、緩和、減弱又は逆転させたりすることを指す。本発明において、「治療」はまた、有益又は有望な臨床結果を得るための方法を指し、ここで、「有益又は有望な臨床結果」は、部分的又は全部的なものや、検出可能又は検出不可能なものにもかかわらず、症状の緩和、病状又は疾患程度の減少、安定化した(即ち悪化していない)疾患又は病状の状態、疾患又は病状の状態の進展の遅延又は緩和、疾患又は病状の状態の改善又は軽減及び疾患又は病状の緩和を含むが、これらに限定されない。
用語「予防」とは、本発明の抗体及びその機能的フラグメントを投与することにより、疾患又は病况の少なくとも1種の症状の進展を阻止又は阻害することを指す。この用語は、緩和中の被験者を治療して再発を予防又は阻害することをさらに含む。
本発明の抗体は、組換えDNAにより産生されたモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有してもよい。アイソタイプの選択は、通常、所望のエフェクター機能(例えばADCC誘導)により決定される。例示的なアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれか一方を用いることができる。必要であれば、公知の方法により本発明の抗4-1BBの抗体のクラスを変換することができる。例えば、本発明の最初のIgG抗体は、クラスを本発明のIgM抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりIgGサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、IgGlをIgG2に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプ切り替えにより例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE又はIgM抗体に変換することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、IgG4抗体である。抗体のアミノ酸配列が他のアイソタイプに対してこのアイソタイプとほとんど同じである場合、この抗体は、特定のアイソタイプに属する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体であり、好ましくはIgG抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体-抗原結合フラグメント又は単鎖抗体である。
いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体は、一価抗体であり、好ましくは、WO2007059782(その全体が引用により本明細書に援用される)に記載されたようなヒンジ領域に欠失を有する一価抗体である。このため、いくつかの実施形態において、抗体は、一価抗体であり、ここで、前記抗4-1BB抗体は、以下の方法により構築される:i)一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗4-1BB抗体のVL領域をコードするヌクレオチド配列及びIgの定常CL領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のVL領域をコードする前記ヌクレオチド配列及びIgのCL領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されており、また、IgG1サブクラスの場合、CL領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトIgGの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、このCL領域は、このCL領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合又は共有結合を形成できる任意のアミノ酸を含まない;ii)一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗体のVH領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトIgの定常CH領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、CH領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトIgGの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、ヒンジ領域及び(例えばIgサブクラスに要求される)CH領域の他の領域(例えばCH3領域)に対応する領域には、ヒトIgのCH領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドと、ジスルフィド結合又は共有結合若しくは安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することに関与する任意のアミノ酸残基が含まれておらず、ここで、選択された抗原特異的抗体のVH領域をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記IgのCH領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されている;iii)一価抗体を産生するための細胞発現系を提供する;iv)(iii)の細胞発現系の細胞で(i)及び(ii)の核酸構築物を共発現させて前記一価抗体を産生する。
同様に、いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体は、一価抗体であり、
(i)本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
(ii)免疫グロブリンのCH領域又はそのCH2及びCH3ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このCH領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び(この免疫グロブリンがIgG4サブクラスではない場合)CH領域の他のドメイン(例えばCH3ドメイン)に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じCH領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトIgGの存在下で同じCH領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
(i)本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
(ii)免疫グロブリンのCH領域又はそのCH2及びCH3ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このCH領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び(この免疫グロブリンがIgG4サブクラスではない場合)CH領域の他のドメイン(例えばCH3ドメイン)に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じCH領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトIgGの存在下で同じCH領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
他のいくつかの実施形態において、一価抗体の重鎖は修飾されることにより、ヒンジ領域全体が欠失している。
他の実施形態において、一価抗体の配列は修飾されることにより、N-結合型グリコシル化のための任意の受容体サイトが含まない。
本発明は、「二重特異性抗体」をさらに含み、ここで、抗4-1BB結合領域(例えば、抗4-1BBモノクローナル抗体の4-1BB結合領域)は、1種以上のエピトープを標的とする二価又は多価二重特異性フレームワークの一部である(例えば、第2のエピトープは、アクティブトランスポート受容体のエピトープを含むことができ、これにより、この二重特異性抗体は、生物学的障壁(例えば血液脳関門)を越えた、改善された細胞転移作用を示し、又は、第2のエピトープは、他の目的タンパク質を標的とするエピトープである)。このため、他の実施形態において、抗4-1BB抗体の一価Fabは、他の異なるタンパク質を標的とするFab又はscfvに連結されることにより、二重特異性抗体を産生することができる。二重特異性抗体は、例えば抗4-1BB結合領域から付与される治療機能及び受容体分子に結合されて生物学的障壁(例えば血液脳関門)を越えて転移するトランスポート機能を増強させることができるという二重機能を有することができる。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体をさらに含む。単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖のFvドメインが連結されたペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、単鎖Fv(scFv)を提供し、ここで、本発明の抗4-1BB抗体のFv中の重鎖及び軽鎖は、フレキシブルペプチド(典型的には、約10、12、15又はそれ以上のアミノ酸残基)で連結されて1本のペプチド鎖を形成する。このような抗体を産生する方法は、例えばUS 4,946,778;Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore ed.,Springer-Verlag,New York,pages: 269-315(1994);Birdなど,Science,242,423-426(1988);Hustonなど,PNAS USA 85,5879-5883(1988)及びMcCaffertyなど,Nature,348,552-554(1990)に記載されている。単一のVH及びVLだけを使用する場合、単鎖抗体は、一価のものであり、2つのVH及びVLを使用する場合、二価のものであり、又は、2つ以上のVH及びVLを使用する場合、多価のものである。
当分野で知られている任意の技術により本発明の抗体を産生し、例えば任意の化学的や生物学的や遺伝学的又は酵素学的な技術に限定されなく、単独で又は組み合わせて使用することができる。通常、所望の配列のアミノ酸配列が知られており、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術により前記抗体を容易に産生することができる。例えば、公知の固相方法によりこれらの抗体を合成することができ、好ましくは、市販のペプチド合成装置(例えばApplied Biosystems、Foster City、Californiaで製造された装置)を用いてメーカーの説明書に従ってこれらの抗体を合成する。又は、当分野における公知の組換えDNA技術により本発明の抗体を合成することができる。例えば、抗体をコードするDNA配列を発現ベクターに組み込んでこれらのベクターを所要の抗体の発現に好適な真核又は原核宿主に導入した後、DNA発現産物としての抗体が得られ、その後、既知の技術を用いて宿主から抗体を単離することができる。
任意の「好適な」数の修飾されたアミノ酸を含み、及び/又はカップリング置換基と結合することにより、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを修飾することができる。このような場合に、「好適」は、通常、非誘導体化親抗4-1BB抗体に関連する4-1BB選択性及び/又は4-1BB特異性を少なくとも基本的に保持する能力によって決定される。1つ又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことは、例えばポリペプチド血清半減期の増加、ポリペプチド抗原性の低減又はポリペプチド貯蔵安定性の向上に寄与することができる。1種又は複数種のアミノ酸に対する修飾は、例えば、組換え生産の過程において翻訳と同時に行われ、又は、翻訳後に行われ(例えば、哺乳動物の細胞での発現過程においてN-X-S/T配列におけるN-結合型グリコシル化作用)、又は合成手段によって行われる。修飾されたアミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、イソプレン化(例えば、ファルネシル化、ゲラニル-ゲラニル化)アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などを含む。アミノ酸修飾を行う参考文献は、本分野ではよく知られており、例えばWalker,(1998),Protein Protocols On CD-Rom,Humana Press,Totowa,New Jerseyを参照する。修飾されたアミノ酸は、例えばグリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸から選ばれてもよい。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、共価結合によりポリマーに結合して化学修飾を行うことにより、循環半減期を増加させることもできる。例示的なポリマー及びそれをペプチドに連結する方法は、例えばUS 4,766,106;US 4,179,337;US 4,495,285及びUS 4,609,546を参照する。また、例示的なポリマーとして、ポリオキシエチル化されたポリオール及びポリエチレングリコール(PEG)(例えば、分子量が約1,000~40,000Dの間、例えば約2,000~20,000Dの間、例えば約3,000~12,000DのPEG)を含む。
本発明はさらに、本発明の抗体(好ましくはモノクローナル抗体)を含む融合タンパク質に関する。
用語「被験者」とは、温血動物を指し、好ましくは哺乳動物(ヒト、家畜及び農場での動物、動物園での動物、運動動物又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど)であり、より好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、「患者」、即ち、温血動物であってもよく、より好ましくは、受け入れを待っているか、又は医療看護を受けているか、又は医療プログラムあるいは疾患進展モニタリングの対象となる、ヒトである。一実施形態において、被験者は、成人(例えば18歳以上の被験者)である。他の実施形態において、被験者は、子供(例えば、18歳以下の被験者)である。一実施形態において、被験者は、男性である。他の実施形態において、被験者は、女性である。
本発明の一実施形態において、サンプルは、生体サンプルである。生体サンプルの例として、疾患組織、体液を含むが、これらに限らなく、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢水及び肺胞マクロファージから製造された組織分解物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、用語「サンプル」は、任意の分析の前に個体から採取したサンプルを意味する。
このため、いくつかの実施形態において、本発明の抗4-1BB抗体及びその抗原結合フラグメントは、完全抗体、例えばIgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4のサブクラス)、IgA(IgA1及びIgA2のサブクラス)、IgD、IgM及びIgE;抗原結合フラグメント、例えばSDR、CDR、Fv、dAb、Fab、Fab2、Fab’、F(ab’)2、Fd、scFv、ラクダ抗体又はナノ抗体;抗体又はその抗原結合フラグメントの変異体配列、例えば上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する変異体配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、抗4-1BB又はその抗原結合フラグメントを含む誘導体、例えば完全抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、修飾されたアミノ酸を含む産物、ポリマーに結合した産物、放射性標識を含む産物、蛍光標識を含む産物、酵素標識物質を含む産物、化学発光物を含む産物、常磁性標識を含む産物をさらに含む。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの1本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、組換えにより本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを産生するために用いることができる。
本発明において、発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター(1組の適切な発現制御要素の核酸配列を含む)を含む任意の適切なDNA又はRNAベクターであってもよい。このようなベクターの例として、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAとの組み合わせから誘導されたベクター及びウイルス核酸(RNA又はDNA)ベクターを含む。いくつかの実施形態において、抗4-1BB抗体をコードする核酸は、裸のDNA又はRNAベクターに含まれ、例えば線形発現要素(例えばSykes and Johnston,Nat Biotech,12,355-59(1997)に記載されている)、小型核酸ベクター(例えばUS 6,077,835及び/又はWO00/70087に記載されている)、プラスミドベクター(例えばpBR322、pUC19/18又はpUC118/119)、最小サイズの核酸ベクター(例えばSchakowskiなど,MoI Ther,3,793-800(2001)に記載されている)を含み、又は沈殿型核酸ベクター構築物、例えばCaPO4沈殿型構築物(例えばWO00/46147;Benvenisty and Reshef,PNAS USA 83、9551-55(1986);Wiglerなど,Cell,14,725(1978)及びCoraro and Pearson,Somatic Cell Genetics,2,603(1981)に記載されている)としている。このような核酸ベクター及びその使用は、本分野でよく知られているものである(例えばUS5,589,466及びUS5,973,972を参照されたい)。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、X0GC(特許WO2008/048037に由来する)、pCDNA3.1(ThermoFisher、カタログ番号V79520)、pCHO1.0(ThermoFisher、カタログ番号R80007)である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の細胞で抗4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適している。このようなベクターの例として、例えばBlueScript(Stratagene)、pINベクター(Van Heeke & Schuster,J Biol Chem,264,5503-5509(1989))、pETベクター(Novagen,Madison,Wisconsin)などを含む。
発現ベクターは、酵母系で発現するのに適したベクターであってもよい。酵母系で発現するのに適した任意のベクターを採用することができる。適切なベクターは、例えば構成型又は誘導性プロモーター(例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びPGH)を含むベクターを含む(レビューとして、F.Ausubelなど,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience,New York(1987);Grantなど,Methods in Enzymol,153,516-544(1987);Mattanovich,D.など,Methods Mol.Biol.,824,329-358(2012);Celik,E.など,Biotechnol.Adv.,30(5),1108-1118(2012);Li,P.など,Appl.Biochem.Biotechnol.,142(2),105-124(2007);Boer,E.など,Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(3),513-523(2007);van der Vaart,J.M.,Methods Mol.Biol.,178,359-366(2002)及びHolliger,P.,Methods Mol.Biol.,178,349-357(2002)を参照されたい)。
本発明の発現ベクターにおいて、抗4-1BB抗体をコードする核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及びその他の発現に寄与する要素又はそれとの組み合わせを含むことができる。このような要素の例として、強発現型プロモーター(例えば、ヒトCMV IEプロモーター/エンハンサー及びRSV、SV40、SL3-3、MMTV及びHIV LTRプロモーター)、有効なポリ(A)ターミネーター配列、大腸菌でプラスミドを産生するための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び/又は便利なクローニング部位(例えば、ポリリンカー)を含む。核酸は、構成型プロモーター(例えばCMV IE)に対する誘導性プロモーターを含むこともできる。
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の二重特異性分子を産生する組換え真核又は原核宿主細胞(例えばトランスフェクトーマ)に関する。宿主細胞の例として、酵母、細菌及び哺乳動物細胞(例えばCHO又はHEK細胞)を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供し、このゲノムは、本発明の抗4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明は、非組み込み型の核酸(例えばプラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現要素)を含む細胞を提供し、この核酸は、本発明の抗4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、異なる細胞系、例えばヒト細胞系、非ヒト哺乳動物細胞系及び昆虫細胞系、例えばCHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、マウス細胞系(例えば骨髄腫細胞系)、繊維肉腫細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系及びHuH-7ヒト細胞系で産生することができる(Dumontなど,2015,Crit Rev Biotechnol.,Sep.18,1-13.,その内容が引用により本明細書に援用される)。
一般的な免疫グロブリンの精製方法により本発明の抗体と培地とを適切に単離し、前記方法は、プロテインA-セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーである。
本発明は、さらに、組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
本明細書で使用されるように、組成物について、「基本的に...からなる」ことは、少なくとも1種の前述したような本発明の抗体が前記組成物において生物学的活性を有する唯一の治療剤又は試薬であることを意味する。
一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物であり、且つ、薬学的に許容される担体をさらに含む。
用語「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトに投与した際に、不利なもの、アレルギー又は他の不良反応を起こさない賦形剤を指す。それは、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング層、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。ヒトに投与する場合、製剤は、監督機関(例えばFDAオフィスやEMA)に要求される無菌、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準を満たすべきである。
本発明は、さらに、薬剤に関し、前記薬剤は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化の抗体(即ち、抗体がグリコシル化されていない)を製造することができる。グリコシル化を変えることにより、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めたり、抗体のADCC活性を変化させたりすることができる。このような炭水化物に対する修飾は、例えば抗体配列内の1つ又は複数のグリコシル化サイトを変えることにより実現されてもよい。例えば、1つ又は複数のアミノ酸置換を行うことにより、1つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化サイトを解消し、これにより、このサイトでのグリコシル化を解消することができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。Coなどの米国特許No.5,714,350及びNo.6,350,861(引用により本明細書に援用される)には、このような方法がさらに詳しく記載されている。また、代替として、改変されたグリコシル化のタイプを有する抗体、例えば減少量を有し又はフコシル残基を有しない低フコシル化又は非フコシル化抗体又は付加した二等分GlcNac構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたフコシル化モードにより抗体のADCC能力を向上させることが既に証明された。このような炭水化物に対する修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることで実現されてもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本分野で記載されており、且つ、宿主細胞として使用されてもよく、この宿主細胞で本発明の組換え抗体を発現させることにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する。例えば、HangなどのEP1176195(引用により本明細書に援用される)には、機能的に破壊されたFUT8遺伝子を持つ細胞系が記載されており、このFUT8遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系で発現した抗体は、低フコシル化又はフコシル残基の欠如を示す。このため、いくつかの実施形態において、本発明のヒト抗体(好ましくはモノクローナル抗体)は、低フコシル化又は非フコシル化モードが示された細胞系、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子発現が欠如している哺乳動物細胞系で組換え発現を行うことにより産生されてもよい。PrestaのPCT開示WO03/035835(引用により本明細書に援用される)には、変異体CHO細胞系、Lecl3細胞が記載されており、それらは、フコースをAsn(297)が連結した炭水化物に付着させる能力が低下しているので、この宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす(Shields,R.L.など,2002 J.Biol.Chem.277:26733-26740も参照されたい)。UmanaなどのPCT開示WO99/54342(引用により本明細書に援用される)には、工学的細胞系により糖タンパク質で修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)-NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現させることにより、工学的細胞系で発現する抗体は、付加した二等分GlcNac構造を示し、抗体のADCC活性の向上をもたらす(Umanaなど,1999 Nat.Biotech.17:176-180も参照されたい)。Eureka Therapeuticsは、さらに、フコース残基が欠如している改変された哺乳動物グリコシル化モードを有する抗体を産生できる遺伝子工学的CHO哺乳動物細胞を説明した(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。又は、本発明のヒト抗体(好ましくはモノクローナル抗体)は、酵母又は糸状菌で産生することができ、前記酵母又は糸状菌は、哺乳動物様グリコシル化モードに用いられ、且つグリコシル化モードとしてフコースが欠如した抗体を産生することができる(例えばEP1297172B1を参照されたい)。
4-1BB(CD137/TNFRSF9)は、抗原によって作動されるT細胞で発現するが、静止しているT細胞で発現しない。また、それが樹状細胞(DC)、ナチュラルキラー細胞(NKs)、活性化されたCD4+及びCD8+Tリンパ球、好酸球、ナチュラルキラーT細胞(NKT)及び肥満細胞で発現するが、骨髄由来免疫抑制細胞(MDSCs)の表面でこの分子が発現しないことが知られている。抗4-1BB抗体は、細胞傷害性T細胞を活性化するとともにγインターフェロン(IFN-γ)の生成を向上させる能力を有し、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)は、29個のメンバーからなるタンパク質スーパーファミリーであり、ヒト免疫システムにおいて重要な役割を果たしている。この分子ファミリーは、細胞死受容体(8個のメンバー)と活性化受容体の2種類に分類される。それらはいずれも1つの細胞内シグナル経路の活性化ドメイン及び1つの細胞外受容体サイトを含む。これらの受容体サイトは、腫瘍壊死因子スーパーファミリー(TNFSF)の対応するリガンドと結合することで活性化されてもよい。
TNFSF-TNFRSFのリガンド-受容体(例えばCD40-CD40L、CD27-CD70又はOX40-OX40L)シグナル経路は、インビボでの多くの重要な過程、例えば細胞の発育と死亡、サイトカイン及びケモカインの誘導を調節することができる。ますます多くの証拠によって、TNFRSF及びTNFSFメンバーが、癌を含む多種の疾患の炎症及び病理学に関与することが示された。免疫治療において、有効な免疫反応には、T細胞と他の免疫細胞を十分に活性化するために2種類のシグナルが必要である。第1種のシグナル、即ち抗原特異的なシグナルは、リンパ球受容体と、抗原提示細胞(APCs)上の主要組織適合性複合体(MHC)分子が結合した特異的なペプチドとの相互作用によって生じたものである。第2種は、抗原非特異的な共刺激シグナルである。このようなシグナルは、T細胞とAPCs上に発現する共刺激分子との間の相互作用によって提供されたものである。4-1BBは、共刺激分子であり、TNFRSFに属する。それは、80年代末にTサイトカインのスクリーニングを行った際に、マウスヘルパーT細胞及び細胞傷害性T細胞をコンカナバリンAで刺激して発見されたものである。ヒト4-1BBLは、1994に初めて直接発現クローンによって活性化されたCD4+Tリンパ球から単離された。4-1BBLは、主に樹状細胞、B細胞又はマクロファージに発現している。
本発明の抗体は、4-1BBに作用し、4-1BBは、強力なT細胞特異的共刺激分子とし、例えばDC細胞、単球、B細胞、肥満細胞、NK細胞及び好中球などの多くの非T細胞にも発現する。抗4-1BBアゴニスト又は4-1BBLトランスフェクションにより4-1BB共刺激シグナルを活性化することで、細胞増殖、サイトカイン発現、殺菌活性及びT細胞のエフェクター機能へのサポートを誘導することができる。アゴニスト抗体が4-1BBと結合すると、T細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともにサイトカイン(例えばIL-8)の分泌を促進することができる。
本発明に提供される抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体は、ヒト4-1BB及びカニクイザル4-1BBと結合することができ、且つ親和性が類似しているが、マウス4-1BBと結合せず、種特異性を有する。抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体は、強い結合特異性を持ち、4-1BBのみと結合し、B7ファミリーメンバー、CD28ファミリーメンバー及びCTLA-4、LAG-3、TIM-3、OX40及びCD27タンパク質と結合しなく、結果を図3に示す。
範囲の値が提供される場合、本明細書において特に明記されていない限り、各挿入値、下限までの単位の10分の1、この範囲の上限と下限との間及び任意の前記範囲内の他の前記値又は挿入値は、いずれも本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。特に除外された限界を除き、前記範囲内で特定的に除外された境界を除く限り、独立して小さな範囲に含まれてもよいこれらの小さな範囲の上限及び下限も本発明に含まれる。前記範囲が1つ又は2つの限界を含む場合、1つ又は2つの含まれる境界を除外する範囲も本発明に含まれる。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される通常の意義を意味すべきである。本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の任意のものは、本発明の実施又は試験でも使用ことができるが、現在、好ましい方法及び材料が開示されている。本明細書で言及されているすべての出版物は、その全体が引用により本明細書に援用される。
以下、実施例を併せて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解することができる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の製造過程を説明するためのものであり、この製造過程は、関連する方法を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではなく、本発明の精神から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の特徴及びメリットを示すためのものであるが、本発明は、これらの特徴及びメリットに限定されない。
以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法であり、具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又はメーカーにより推奨される条件に従って行い、使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。
実施例1 マウス由来抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の製造
1.1、動物の免疫
実験動物は、6~8週齢の雌BALB/cマウス(北京維通利華社から購入)を使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、50μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H03H)及びフロインド完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5881)を使用し、両者を十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、25μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質とフロインド不完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5806)を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計3回であった。最終免疫を行ってから10日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離した。組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)について、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の3日前に、アジュバントを含まない組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質を50μg腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、DMEM培地(Gibco、カタログ番号11965)で単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、融合を準備した。
1.1、動物の免疫
実験動物は、6~8週齢の雌BALB/cマウス(北京維通利華社から購入)を使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、50μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H03H)及びフロインド完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5881)を使用し、両者を十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、25μgの組換えヒト4-1BB-Fcタンパク質とフロインド不完全アジュバント(Sigma-Aldrich、カタログ番号F5806)を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。2週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計3回であった。最終免疫を行ってから10日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離した。組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)について、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の3日前に、アジュバントを含まない組換えヒト4-1BB-Hisタンパク質を50μg腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、DMEM培地(Gibco、カタログ番号11965)で単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、融合を準備した。
1.2、ハイブリドーマ細胞の製造
対数増殖期にある骨髄腫細胞SP2/0(中国科学院から購入)を採取し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てて、不完全DMEM培養液で細胞を懸濁してからカウントした。必要な数の細胞と脾臓細胞を所定の割合で50mLの遠心管に混合して、5分間遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。1分間かけて1mLのPEG(Sigma、カタログ番号P7181)を徐々に加え、90秒間静置した。不完全DMEM培地を50mLとなるまで加えて融合を中止し、5分間静置し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てた。20mLのHAT培地(Sigma、カタログ番号H0262-10VL)を加えて融合細胞を柔らかく吹き散らし、細胞数1×105個/ウェルでHAT培地に撒き、37℃、5%CO2インキュベータに置いてインキュベートした。7~10日後にHT培地(Sigma、カタログ番号H0137-10VL)でHAT培地と交換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の1/10以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
対数増殖期にある骨髄腫細胞SP2/0(中国科学院から購入)を採取し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てて、不完全DMEM培養液で細胞を懸濁してからカウントした。必要な数の細胞と脾臓細胞を所定の割合で50mLの遠心管に混合して、5分間遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。1分間かけて1mLのPEG(Sigma、カタログ番号P7181)を徐々に加え、90秒間静置した。不完全DMEM培地を50mLとなるまで加えて融合を中止し、5分間静置し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てた。20mLのHAT培地(Sigma、カタログ番号H0262-10VL)を加えて融合細胞を柔らかく吹き散らし、細胞数1×105個/ウェルでHAT培地に撒き、37℃、5%CO2インキュベータに置いてインキュベートした。7~10日後にHT培地(Sigma、カタログ番号H0137-10VL)でHAT培地と交換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の1/10以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
1.3、クローンのスクリーニング及び同定
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりハイブリドーマの培養上清での抗ヒト4-1BB抗体をスクリーニングした。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレートに組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。OD450nmの強弱によって抗ヒト4-1BB選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりハイブリドーマの培養上清での抗ヒト4-1BB抗体をスクリーニングした。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレートに組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。OD450nmの強弱によって抗ヒト4-1BB選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
アゴニスト抗体と4-1BBとが結合した後、T細胞の免疫殺傷機能を増強させることができる。同時に、免疫細胞の活性化を誘導するとともに、サイトカイン(例えばIL-8)の分泌を促進することができる。GS-H2/4-1BB細胞実験に基づいてアゴニスト抗ヒト4-1BB抗体をスクリーニングした。陽性クローンのハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔内に接種し、1週後に腹水を抽出し、精製して抗体タンパク質を得た。GS-H2/4-1BB細胞をインキュベートした。スクリーニングの当日に、トリプシンでGS-H2/4-1BB細胞を消化し、完全培地で消化を中止し、1000rpmで5分間遠心し、上澄みを捨てて、2%血清を含むMEM培地(Gibco、カタログ番号10370-021)で細胞を1×105個/mLの細胞密度で再懸濁させ、100μL/ウェルで96ウェルプレートに撒き、37℃、5%CO2インキュベータに置いて2時間インキュベートした。ビオチンで標識した抗マウスIgG抗体(中杉金橋、カタログ番号ZB-2020)及びDynabeadsストレプトアビジン磁気ビーズM-280(Invitrogen、カタログ番号112-05D)を室温で30分間インキュベートし、磁石で磁気ビーズを2~3分間単離し、PBSで磁気ビーズを4~5回洗浄した。2時間インキュベートした後、細胞プレートの各ウェルに最終濃度10μg/mLの被験抗体50μL及び最終濃度100μg/mLのインキュベートされた磁気ビーズ50μLを加えた。37℃、5%CO2インキュベータで24時間インキュベートした。IL-8検出キット(達科為社、カタログ番号1110802)を用いて説明書に従ってGS-H2/4-1BB細胞上清中のIL-8の発現量を検出し、OD450nmの強弱によって抗ヒト4-1BBアゴニスト抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
結果を表1及び図1のAに示し、複数の抗ヒト4-1BBクローンから分泌された抗体は、4-1BB結合活性を有した。結果を図1のBに示し、複数の抗ヒト4-1BBクローンから分泌された抗体は、4-1BBアゴニスト活性を有した。
1.4、モノクローナル抗体配列の測定
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及びアゴニスト活性を同時に有するクローンに対して抗体DNA配列の測定を行った。まず、細胞mRNAを抽出し、RNAprep Pureキット(Tiangen、DP419)を使用した。次いで、SMART 5’RACEキット(Clontech、カタログ番号634849)を使用して、ハイブリドーマから抽出したトータルRNAを逆転写してヒト4-1BBのcDNAの第1鎖を合成し、PCR増幅可変領域のプライマーVHGSP(SEQ ID NO.32)及びVLGSP(SEQ ID NO.33)をそれぞれ設計した。PCR増幅で得られた目的のバンドをin-fusion方式により線形化されたpRACEベクター(Clontech、カタログ番号:634859)にクローニングし、モノクローナルを選んでDNAシーケンシングを行った。
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及びアゴニスト活性を同時に有するクローンに対して抗体DNA配列の測定を行った。まず、細胞mRNAを抽出し、RNAprep Pureキット(Tiangen、DP419)を使用した。次いで、SMART 5’RACEキット(Clontech、カタログ番号634849)を使用して、ハイブリドーマから抽出したトータルRNAを逆転写してヒト4-1BBのcDNAの第1鎖を合成し、PCR増幅可変領域のプライマーVHGSP(SEQ ID NO.32)及びVLGSP(SEQ ID NO.33)をそれぞれ設計した。PCR増幅で得られた目的のバンドをin-fusion方式により線形化されたpRACEベクター(Clontech、カタログ番号:634859)にクローニングし、モノクローナルを選んでDNAシーケンシングを行った。
実施例2 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の製造
4-1BB-246-8-33-83クローンをPCRで増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.7に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.8に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.1、2及び3に示される。重鎖の3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.4、5及び6に示される。4-1BB-246-8-33-83クローンから構築されたキメラ4-1BBモノクローナル抗体は、mAb-33-83と命名され、キメラモノクローナル抗体mAb-33-83の軽鎖は、4-1BB-246-8-33-83クローンの軽鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.7に示される)と軽鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.9に示される)とが連結されたものであり、mAb-33-83抗体の重鎖は、重鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.8に示される)と重鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.10に示される)とが連結されたものである。上記の抗体の軽・重鎖のコードされたアミノ酸配列に対して遺伝子合成(蘇州金唯智バイオテクノロジー社により完了した)を行うことにより、対応するヌクレオチド配列を得るとともに、真核細胞の発現ベクターX0GCにクローニングし、次いで、組換え発現ベクターをExpiCHO細胞系(ExpiCHOTM、カタログ番号A29133、invitrogen)にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なExpiCHOTM発現培地(ExpiCHOTM Expression Medium、カタログ番号A29100、invitrogen)に35×105細胞/mLの細胞密度で再懸濁させ、トランスフェクションの当日にカウントし、細胞密度は、(70-200)×105細胞/mLの範囲内にあり、生存率は、95%超えであるべきであり、予備加熱を行ったExpiCHOTM発現培地で細胞を希釈し、最終密度は、60×105細胞/mLであった。トランスフェクション体積に従ってOptiPROTM培地(カタログ番号12309、invitrogen)でプラスミド及びトランスフェクション試薬ExpiFectamineTMCHO試薬(カタログ番号A29131、invitrogen)をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は、0.5μg/mLであった。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、1~5min静置し、その後、プラスミドトランスフェクション試薬コンパウンドを細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで125rpm、37℃、8%CO2にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ExpiFectamine(登録商標)CHOエンハンサー(カタログ番号A29131、invitrogen)及びExpiCHO(登録商標)Feed(カタログ番号A29101-02、invitrogen)を補給し、細胞インキュベータを125rpmシェーカー、32℃、5%CO2に調整し、遠心により10日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
4-1BB-246-8-33-83クローンをPCRで増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.7に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.8に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.1、2及び3に示される。重鎖の3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.4、5及び6に示される。4-1BB-246-8-33-83クローンから構築されたキメラ4-1BBモノクローナル抗体は、mAb-33-83と命名され、キメラモノクローナル抗体mAb-33-83の軽鎖は、4-1BB-246-8-33-83クローンの軽鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.7に示される)と軽鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.9に示される)とが連結されたものであり、mAb-33-83抗体の重鎖は、重鎖可変領域(配列はSEQ ID NO.8に示される)と重鎖定常領域(配列はSEQ ID NO.10に示される)とが連結されたものである。上記の抗体の軽・重鎖のコードされたアミノ酸配列に対して遺伝子合成(蘇州金唯智バイオテクノロジー社により完了した)を行うことにより、対応するヌクレオチド配列を得るとともに、真核細胞の発現ベクターX0GCにクローニングし、次いで、組換え発現ベクターをExpiCHO細胞系(ExpiCHOTM、カタログ番号A29133、invitrogen)にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なExpiCHOTM発現培地(ExpiCHOTM Expression Medium、カタログ番号A29100、invitrogen)に35×105細胞/mLの細胞密度で再懸濁させ、トランスフェクションの当日にカウントし、細胞密度は、(70-200)×105細胞/mLの範囲内にあり、生存率は、95%超えであるべきであり、予備加熱を行ったExpiCHOTM発現培地で細胞を希釈し、最終密度は、60×105細胞/mLであった。トランスフェクション体積に従ってOptiPROTM培地(カタログ番号12309、invitrogen)でプラスミド及びトランスフェクション試薬ExpiFectamineTMCHO試薬(カタログ番号A29131、invitrogen)をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は、0.5μg/mLであった。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、1~5min静置し、その後、プラスミドトランスフェクション試薬コンパウンドを細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで125rpm、37℃、8%CO2にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ExpiFectamine(登録商標)CHOエンハンサー(カタログ番号A29131、invitrogen)及びExpiCHO(登録商標)Feed(カタログ番号A29101-02、invitrogen)を補給し、細胞インキュベータを125rpmシェーカー、32℃、5%CO2に調整し、遠心により10日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
実施例3 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合活性
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプル及び対照Urelumab(特許配列WO2004010947に由来する)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプル及び対照Urelumab(特許配列WO2004010947に由来する)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgG抗体(Abcam、カタログ番号Ab7068)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図2に示し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、優れたヒト4-1BB結合親和性を有し、対照であるUrelumabの結合活性と同等であった。
実施例4 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の種特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB、カニクイザル4-1BB及びマウス4-1BB(いずれも北京シノバイオロジカル社から購入)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で段階希釈した抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体サンプルを100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の種特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB、カニクイザル4-1BB及びマウス4-1BB(いずれも北京シノバイオロジカル社から購入)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で段階希釈した抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体サンプルを100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ELISAによりキメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒトCD80、CD86、4-1BB、PD-L2、B7-H2、CTLA4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、CD28、4-1BB、OX40、CD27、ICOSをコーティングした。CD28タンパク質は、株式会社アクロバイオシステムズ(北京)から購入され、残りのタンパク質は、いずれも北京シノバイオロジカル社から購入され、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で段階希釈した抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体サンプル及び対照Urelumab、アイソタイプコントロールを100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図3のAに示すように、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、ヒト4-1BB及びカニクイザル4-1BBと結合することができ、且つ親和性が類似したが、マウス4-1BBと結合しなく、種特異性を有する。図3のBに示すように、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、強い結合特異性を有し、4-1BBのみと結合し、B7ファミリーメンバー、CD28ファミリーメンバー及びCTLA-4、LAG-3、TIM-3、OX40及びCD27タンパク質と結合しない。
実施例5 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプルを50μL/ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識した4-1BBL(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号41L-H82F9)を50μL/ウェルで添加し、濃度を200ng/mL(最終濃度は100ng/mL)とし、25℃で90分間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:1000にて希釈した、ストレプトアビジン-HRP(Streptavidin-HRP)(BD、カタログ番号554066)を100μL/ウェルで加え、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりキメラ抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒト4-1BB(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10041-H08H)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBST緩衝液で5回洗浄した。1%のBSAを含むPBST緩衝液で300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。抗ヒト4-1BB抗体サンプルを50μL/ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識した4-1BBL(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号41L-H82F9)を50μL/ウェルで添加し、濃度を200ng/mL(最終濃度は100ng/mL)とし、25℃で90分間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBST緩衝液で1:1000にて希釈した、ストレプトアビジン-HRP(Streptavidin-HRP)(BD、カタログ番号554066)を100μL/ウェルで加え、25℃で1時間インキュベートした。PBST緩衝液で5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図4に示し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体の4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性は、対照Urelumabよりも優れた。
実施例6 キメラ抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
6~8週齢の雌h4-1BB/h4-1BB二重ヒト化マウス(マウス由来の4-1BB及び4-1BBがノックアウトされ、ヒト由来の4-1BB及び4-1BBが過剰発現した。江蘇バイオサイトジェン社)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1頭につき、1×106個のMC38/h4-1BBマウス結腸腫瘍細胞(MC38は上海舜冉から購入される)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(DPBS、GIBCO、カタログ番号14190-136)、35nmol/kgの抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び35nmol/kgの対照Urelumabを週2回、2週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に2回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は2週間であり、即ち、投与を中止した後、2週間観察した。
6~8週齢の雌h4-1BB/h4-1BB二重ヒト化マウス(マウス由来の4-1BB及び4-1BBがノックアウトされ、ヒト由来の4-1BB及び4-1BBが過剰発現した。江蘇バイオサイトジェン社)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1頭につき、1×106個のMC38/h4-1BBマウス結腸腫瘍細胞(MC38は上海舜冉から購入される)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(DPBS、GIBCO、カタログ番号14190-136)、35nmol/kgの抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び35nmol/kgの対照Urelumabを週2回、2週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に2回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は2週間であり、即ち、投与を中止した後、2週間観察した。
結果を図5に示し、相同腫瘍モデルにおいて、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83は、抗腫瘍活性を有し、腫瘍の成長を著しく阻害し、効果は対照Urelumabよりも優れた。
実施例7 ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の製造
ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体は、Leungなど(1995、Molecule Immunol 32:1413-27)の方法により得られたものである。GermLineデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、hIGKV1-27*01+hIGKJ4である。重鎖可変領域のテンプレートは、hIGHV1-69*02+hIGHJ6*01である。マウス由来抗体の軽鎖CDR領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのCDR領域を置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域を得て、配列は、SEQ ID NO.11に示される。移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、SEQ ID NO.12に示される。SEQ ID NO.11とSEQ ID NO.12においてサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.13-20に示され、得られた重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.21-31に示される。軽鎖可変領域を軽鎖定常領域(配列SEQ ID NO.9)にそれぞれ連結させて、対応する軽鎖全長配列を得た。重鎖可変領域を重鎖定常領域(配列SEQ ID NO.10)にそれぞれ連結させて、対応する重鎖全長配列を得た。親和性と安定性のスクリーニングを通じて利用可能なヒト化配列を得て、得られたヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列情報は、表2に示し、ここで、ID列は、それぞれ得られたキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体の略称である。
ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体は、Leungなど(1995、Molecule Immunol 32:1413-27)の方法により得られたものである。GermLineデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、hIGKV1-27*01+hIGKJ4である。重鎖可変領域のテンプレートは、hIGHV1-69*02+hIGHJ6*01である。マウス由来抗体の軽鎖CDR領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのCDR領域を置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域を得て、配列は、SEQ ID NO.11に示される。移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、SEQ ID NO.12に示される。SEQ ID NO.11とSEQ ID NO.12においてサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.13-20に示され、得られた重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO.21-31に示される。軽鎖可変領域を軽鎖定常領域(配列SEQ ID NO.9)にそれぞれ連結させて、対応する軽鎖全長配列を得た。重鎖可変領域を重鎖定常領域(配列SEQ ID NO.10)にそれぞれ連結させて、対応する重鎖全長配列を得た。親和性と安定性のスクリーニングを通じて利用可能なヒト化配列を得て、得られたヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列情報は、表2に示し、ここで、ID列は、それぞれ得られたキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体の略称である。
実施例8 ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の抗原結合活性
実施例7で得られたIDがz0のヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145b(配列情報:VH SEQ ID NO.12;VL SEQ ID NO.11)と命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの抗原結合活性を検出し、試験手順は、実施例4と同様である。実験結果を図6に示す。図6から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bは、優れたヒト4-1BB結合親和性を有し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び対照Urelumabの結合活性と同等であった。
実施例7で得られたIDがz0のヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145b(配列情報:VH SEQ ID NO.12;VL SEQ ID NO.11)と命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの抗原結合活性を検出し、試験手順は、実施例4と同様である。実験結果を図6に示す。図6から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bは、優れたヒト4-1BB結合親和性を有し、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83及び対照Urelumabの結合活性と同等であった。
実施例9 ヒト化抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性
実施例7で記載されるヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145bと命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。試験手順は、実施例5と同様であり、結果を図7に示す。図7から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性は、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83よりもやや劣ったが、ブロッキング活性は、対照であるUrelumabよりも優れた。
実施例7で記載されるヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体は、BH3145bと命名される。ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体の4-1BBと受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。試験手順は、実施例5と同様であり、結果を図7に示す。図7から分かるように、ヒト化抗4-1BBモノクローナル抗体BH3145bの4-1BB/4-1BBLへのブロッキング活性は、抗ヒト4-1BBキメラモノクローナル抗体mAb-33-83よりもやや劣ったが、ブロッキング活性は、対照であるUrelumabよりも優れた。
最後に、以上の各実施例は、本発明の技術案を説明するためのものであり、それを限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、前述した各実施例に記載される技術案を修正したり、その技術的特徴の一部又は全部を同等に置き換えることは依然として可能であり、これらの修正又は置き換えは、対応する技術案の本質を本発明の各実施例に係る技術案の範囲から逸脱させるものではないことを理解すべきである。
Claims (14)
- 単離された抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
SEQ ID NO.7に示す軽鎖可変領域の3つの相補性決定領域LCDR及びSEQ ID NO.8に示す重鎖可変領域の3つの相補性決定領域HCDRを含む、
抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 軽鎖可変領域及び/又は重鎖可変領域を含む、単離された抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
軽鎖可変領域は、SEQ ID No.1に示すLCDR1であるアミノ酸配列と、SEQ ID No.2に示すLCDR2であるアミノ酸配列と、SEQ ID No.3に示すLCDR3であるアミノ酸配列とを含み、及び/又は、
重鎖可変領域は、SEQ ID No.4に示すHCDR1であるアミノ酸配列と、SEQ ID No.5に示すHCDR2であるアミノ酸配列と、SEQ ID No.6に示すHCDR3であるアミノ酸配列とを含む、抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体である、請求項1又は2に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgDのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び/又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれ、
好ましくは、前記重鎖定常領域配列は、IgG1又はIgG4の定常領域配列から選ばれ、及び/又は、前記軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる、請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.7に示すアミノ酸配列を有し、及び/又は、
前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO.8に示すアミノ酸配列を有する、請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその機能的フラグメント。 - (a)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有し、及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31から選ばれるアミノ酸配列を有する;
(b)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有し、及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.21-31から選ばれるアミノ酸配列を有する;
(c)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.13-20に示すアミノ酸配列から選ばれるものを有し、及び/又は
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する、請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその機能的フラグメント。 - 軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.11に示すアミノ酸配列を有し、及び/又は、
重鎖可変領域は、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を有する、請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその機能的フラグメント。 - 前記抗原結合フラグメントは、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fd、Fv、scFv、二重特異性抗体、ラクダ抗体、CDR及び抗体認識の最小単位(dAb)から選ばれる1種又は複数種であり、
好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Fab、F(ab’)2又はscFvである、請求項1から請求項7のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント。 - (1)請求項1から請求項8のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするDNA又はRNA;
(2)(1)で定義された核酸と完全に相補的な核酸;から選ばれる、単離された核酸分子。 - 効果的にライゲーションした請求項9に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項9に記載の核酸分子又は請求項10に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から請求項8のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント、その変異体又はその誘導体、請求項9に記載の核酸分子、請求項10に記載のベクター又は請求項11に記載の宿主細胞、及び一種或いは複数種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、組成物。
- 請求項11に記載の宿主細胞を、前記抗ヒト4-1BB抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で培養させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む、
請求項1から請求項8のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。 - 4-1BBを介した疾患又は病症を予防及び/又は治療するための薬剤の製造における、請求項1から請求項8のいずれか1項に記載の抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項9に記載の核酸分子、請求項10に記載のベクター又は請求項11に記載の宿主細胞の使用であって、
前記疾患又は病症は、好ましくは、腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる1種又は複数種である、使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110025248 | 2021-01-08 | ||
CN202110025248.3 | 2021-01-08 | ||
PCT/CN2022/070627 WO2022148413A1 (zh) | 2021-01-08 | 2022-01-07 | 特异性结合4-1bb的抗体及其抗原结合片段 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024503394A true JP2024503394A (ja) | 2024-01-25 |
Family
ID=82357923
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023541807A Pending JP2024503394A (ja) | 2021-01-08 | 2022-01-07 | 4-1bbと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4276111A1 (ja) |
JP (1) | JP2024503394A (ja) |
KR (1) | KR20230129484A (ja) |
CN (1) | CN116710482A (ja) |
WO (1) | WO2022148413A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117736330B (zh) * | 2024-01-24 | 2024-05-17 | 上海沙砾生物科技有限公司 | 肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白及其应用 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
JPS5896026A (ja) | 1981-10-30 | 1983-06-07 | Nippon Chemiphar Co Ltd | 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤 |
DE3380726D1 (en) | 1982-06-24 | 1989-11-23 | Japan Chem Res | Long-acting composition |
US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5714350A (en) | 1992-03-09 | 1998-02-03 | Protein Design Labs, Inc. | Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region |
US6077835A (en) | 1994-03-23 | 2000-06-20 | Case Western Reserve University | Delivery of compacted nucleic acid to cells |
KR970029803A (ko) | 1995-11-03 | 1997-06-26 | 김광호 | 반도체 메모리장치의 프리차지 회로 |
EP2180007B2 (en) | 1998-04-20 | 2017-08-30 | Roche Glycart AG | Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity |
CA2361421A1 (en) | 1999-02-03 | 2000-08-10 | Biosante Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use |
EP2275540B1 (en) | 1999-04-09 | 2016-03-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
US6281005B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-08-28 | Copernicus Therapeutics, Inc. | Automated nucleic acid compaction device |
CA2412701A1 (en) | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Glycofi, Inc. | Methods for producing modified glycoproteins |
JP2005532253A (ja) | 2001-10-25 | 2005-10-27 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 糖タンパク質組成物 |
US6887673B2 (en) | 2002-07-30 | 2005-05-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Humanized antibodies against human 4-1BB |
US10155816B2 (en) | 2005-11-28 | 2018-12-18 | Genmab A/S | Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof |
KR100880509B1 (ko) | 2006-10-16 | 2009-01-28 | 한미약품 주식회사 | 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 |
GB201619648D0 (en) * | 2016-11-21 | 2017-01-04 | Alligator Bioscience Ab | Novel antibodies and uses thereof |
TW201932491A (zh) * | 2018-01-22 | 2019-08-16 | 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 | 抗4-1bb抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 |
CN110357961B (zh) * | 2018-04-10 | 2022-08-23 | 无锡智康弘义生物科技有限公司 | 抗人4-1bb单克隆抗体及其制备方法和用途 |
-
2022
- 2022-01-07 EP EP22736575.6A patent/EP4276111A1/en active Pending
- 2022-01-07 CN CN202280009369.1A patent/CN116710482A/zh active Pending
- 2022-01-07 KR KR1020237026769A patent/KR20230129484A/ko active Search and Examination
- 2022-01-07 WO PCT/CN2022/070627 patent/WO2022148413A1/zh active Application Filing
- 2022-01-07 JP JP2023541807A patent/JP2024503394A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20230129484A (ko) | 2023-09-08 |
CN116710482A (zh) | 2023-09-05 |
EP4276111A1 (en) | 2023-11-15 |
WO2022148413A1 (zh) | 2022-07-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11365255B2 (en) | PD-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof | |
TWI830761B (zh) | 針對cldn18.2和cd3之抗體構建體 | |
US10233258B2 (en) | Bispecific binding proteins that bind CD40 and mesothelin | |
JP6983371B2 (ja) | 抗pd−l1抗体、その抗原結合フラグメントおよびその医療用途 | |
JP6702893B2 (ja) | 多重特異的抗原結合タンパク質 | |
AU2014268298B2 (en) | Anti-B7-H5 antibodies and their uses | |
US11472882B2 (en) | Anti-B7-H4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof | |
JP2021524249A (ja) | 抗cd3抗体及びその使用 | |
US11525005B2 (en) | Anti-CD40 antibody, antigen binding fragment thereof and medical use thereof | |
AU2020405036A1 (en) | ILT3-binding agents and methods of use thereof | |
JP2022504826A (ja) | 4-1bb及び腫瘍関連抗原に結合する抗体構築物ならびにその使用 | |
WO2022135469A1 (zh) | 白细胞介素21突变体以及其用途 | |
CN113906052A (zh) | 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
WO2023131328A1 (zh) | 一种抗体及其用途 | |
US20210139589A1 (en) | Anti-vista antibodies and methods of use | |
TW202304997A (zh) | 新型抗cd4抗體 | |
US20230340112A1 (en) | Anti-sirpa antibodies and methods of use | |
CN116368154A (zh) | 三特异性结合剂 | |
JP2024503394A (ja) | 4-1bbと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント | |
JP2022538461A (ja) | Cd38およびcd3に結合するヘテロ二量体抗体 | |
WO2022247826A1 (zh) | 靶向pd-l1和cd73的特异性结合蛋白 | |
WO2022148412A1 (zh) | 特异性结合cd47的抗体及其抗原结合片段 | |
KR20230074192A (ko) | 인간 cd3 엡실론에 결합하는 신규의 인간 항체 | |
WO2024094159A1 (zh) | 靶向人源ror1的单域抗体 | |
RU2779128C2 (ru) | Антитело к cd40, его антигенсвязывающий фрагмент и его медицинское применение |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230710 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230710 |