JP2024086170A - Analytical method, kit and detection device - Google Patents
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Abstract
【課題】 分析対象について、乳がんの罹患の有無を簡便に判定することができる分析方法、キット及び検出用デバイスを提供する。
【解決手段】 実施形態によれば、分析対象由来の試料中の、標的ｍｉＲＮＡ群から選択された標的ｍｉＲＮＡを定量することを含む、対象の乳がんの罹患の有無を判定する分析方法、キット及び検出用デバイスが提供される。
【選択図】 図１
The present invention provides an analytical method, a kit, and a detection device that can simply determine whether or not a subject is afflicted with breast cancer.
[Solution] According to an embodiment, there is provided an analytical method, kit, and detection device for determining whether or not a subject is affected with breast cancer, which includes quantifying a target miRNA selected from a group of target miRNAs in a sample derived from the subject.
[Selected Figure] Figure 1
Description
本発明の実施形態は、分析方法、キット及び検出用デバイスに関する。 Embodiments of the present invention relate to analytical methods, kits, and detection devices.
近年、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と疾患との関係が注目されている。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を調節する機能を持ち、種々の疾患でその種類や発現量が初期の段階から変化していることが報告されている。即ち、ある疾患を持つ患者では、特定のｍｉＲＮＡ量が健常者と比較して増加又は減少している。そのため、被検者から採取された試料中の該ｍｉＲＮＡの量を調べることは、患者がその疾患に罹患しているか否かを知る手段となる。 In recent years, the relationship between microRNA (miRNA) and disease has been attracting attention. miRNA has the function of regulating gene expression, and it has been reported that the type and expression level of miRNA changes from the early stages of various diseases. That is, in patients with a certain disease, the amount of a specific miRNA is increased or decreased compared to healthy individuals. Therefore, examining the amount of the miRNA in a sample collected from a subject is a means of knowing whether the patient is suffering from the disease.
本発明が解決しようとする課題は、分析対象について、乳がんの罹患の有無を簡便に判定することができる分析方法、キット及び検出用デバイスを提供することである。 The problem that the present invention aims to solve is to provide an analytical method, kit, and detection device that can easily determine whether or not an analysis subject has breast cancer.
実施形態によれば、対象由来の試料中のｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２３８－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｍｉＲ－３９３７、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－４６７４、ｍｉＲ－４７０７－３ｐ、ｍｉＲ－５６４、ｍｉＲ－６１５－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－７１０８－５ｐ、ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｍｉＲ－１２６９ｂ、ｍｉＲ－１２７６、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－２４６７－３ｐ、ｍｉＲ－２９７、ｍｉＲ－３１２６－３ｐ、ｍｉＲ－３１５０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－３１７５、ｍｉＲ－３１７７－３ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１７－３ｐ、ｍｉＲ－３６４９、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－４３０５、ｍｉＲ－４４４０、ｍｉＲ－４４５６、ｍｉＲ－４４９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－４７０３－３ｐ、ｍｉＲ－４７３６、ｍｉＲ－５７９－３ｐ、ｍｉＲ－６０８３、ｍｉＲ－６８２５－３ｐ、ｍｉＲ－６８４５－５ｐ、ｍｉＲ－６８７１－５ｐ、及びｍｉＲ－７９７６のうちの１つを定量することを含む、乳がんの罹患の有無の判定する分析方法が提供される。 According to an embodiment, let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR -208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5 p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692 a, miR-5694, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, mi R-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, miR-1246, miR-1238-5p, miR-1307-3p, miR-3937, miR-4449, miR-4674, miR-4707-3p, miR-564, miR-615-5p, miR-6510-5p, miR-7108-5p, miR-1225-5p, miR-1269b, miR-1276, miR-139-3p, miR-2467-3p, miR-297, miR-3126-3p, miR-3150b-3p, miR-31-5p, miR-3175, miR-3177-3p, miR-3609, miR-3617-3p, miR-3649, miR-3666, miR-4305, miR The present invention provides an analytical method for determining the presence or absence of breast cancer, which includes quantifying one of miR-4440, miR-4456, miR-449c-3p, miR-4703-3p, miR-4736, miR-579-3p, miR-6083, miR-6825-3p, miR-6845-5p, miR-6871-5p, and miR-7976.
以下に、図面を参照しながら実施形態の分析方法、キット及び検出用デバイスについて説明する。 The analytical method, kit, and detection device of the embodiment will be described below with reference to the drawings.
・第１実施形態
（分析方法）
第１実施形態に従う分析方法は、対象由来の試料中の、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２３８－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｍｉＲ－３９３７、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－４６７４、ｍｉＲ－４７０７－３ｐ、ｍｉＲ－５６４、ｍｉＲ－６１５－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－７１０８－５ｐ、ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｍｉＲ－１２６９ｂ、ｍｉＲ－１２７６、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－２４６７－３ｐ、ｍｉＲ－２９７、ｍｉＲ－３１２６－３ｐ、ｍｉＲ－３１５０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－３１７５、ｍｉＲ－３１７７－３ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１７－３ｐ、ｍｉＲ－３６４９、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－４３０５、ｍｉＲ－４４４０、ｍｉＲ－４４５６、ｍｉＲ－４４９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－４７０３－３ｐ、ｍｉＲ－４７３６、ｍｉＲ－５７９－３ｐ、ｍｉＲ－６０８３、ｍｉＲ－６８２５－３ｐ、ｍｉＲ－６８４５－５ｐ、ｍｉＲ－６８７１－５ｐ、及びｍｉＲ－７９７６のうちの何れか１種類を定量すること（定量工程（Ｓ１２））を含む、対象における乳がんの罹患の有無を判定する方法である。
First embodiment (analysis method)
The analysis method according to the first embodiment is for detecting let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p in a sample derived from a subject. , miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910 , miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p , miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, mi R-5694, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3 p, miR-942-5p, miR-98-3p, miR-1246, miR-1238-5p, miR-1307-3p, miR-3937, miR-4449, miR-4674, miR-4707-3p, miR-564, miR-615-5p, miR-6510-5p, miR-7108-5p, miR-1225-5p, miR-1269b, miR-1276, miR-139-3p, miR-2467-3p, miR-297, miR-3126-3p, miR-3150b-3p, miR-31-5p, miR-3175, miR-3177-3p, miR-3609, miR-3617-3p, miR-3649, miR-3666, miR-4305, miR-4440, miR-44 56, miR-449c-3p, miR-4703-3p, miR-4736, miR-579-3p, miR-6083, miR-6825-3p, miR-6845-5p, miR-6871-5p, and miR-7976 (quantification step (S12)).
上述のｍｉＲＮＡは、以下の説明において「標的ｍｉＲＮＡ群」とも称する。また、標的ｍｉＲＮＡ群を構成する個々のｍｉＲＮＡを「標的ｍｉＲＮＡ」とも称する。 The above-mentioned miRNAs are also referred to as "target miRNA group" in the following description. In addition, each miRNA constituting the target miRNA group is also referred to as "target miRNA."
定量される標的ｍｉＲＮＡは、上記標的ｍｉＲＮＡ群から選択される何れか１種類のｍｉＲＮＡであればよい。例えばｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、及びｍｉＲ－１２４６から選択される何れか１つのｍｉＲＮＡである。又はｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｍｉＲ－１２６９ｂ、ｍｉＲ－１２７６、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－２４６７－３ｐ、ｍｉＲ－２９７、ｍｉＲ－３１２６－３ｐ、ｍｉＲ－３１５０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－３１７５、ｍｉＲ－３１７７－３ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１７－３ｐ、ｍｉＲ－３６４９、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－４３０５、ｍｉＲ－４４４０、ｍｉＲ－４４５６、ｍｉＲ－４４９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－４７０３－３ｐ、ｍｉＲ－４７３６、ｍｉＲ－５７９－３ｐ、ｍｉＲ－６０８３、ｍｉＲ－６８２５－３ｐ、ｍｉＲ－６８４５－５ｐ、ｍｉＲ－６８７１－５ｐ、及びｍｉＲ－７９７６から選択される何れか１つのｍｉＲＮＡを用いることも好ましい。 The target miRNA to be quantified may be any one of the miRNAs selected from the above target miRNA group. For example, let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-31 52-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR -4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5694 , miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, and miR-1246. or let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, m iR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b- 3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-4 733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-54 8w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5694, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-67 33-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, miR-1225-5p, miR-1269b, miR-1276, miR-1 39-3p, miR-2467-3p, miR-297, miR-3126-3p, miR-3150b-3p, miR-31-5p, miR-3175, miR-3177-3p, miR-3609, miR-3617-3p, miR-3649, miR-3666, miR-4305, miR-4440, It is also preferable to use any one of miRNAs selected from miR-4456, miR-449c-3p, miR-4703-3p, miR-4736, miR-579-3p, miR-6083, miR-6825-3p, miR-6845-5p, miR-6871-5p, and miR-7976.
ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、及びｍｉＲ－９８－３ｐから選択される何れか１つのｍｉＲＮＡを用いることもまた好ましい。 let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR- 18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152- 5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913- 3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-4 733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR- 523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5694, m iR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784- Any one selected from miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, and miR-98-3p. It is also preferable to use miRNA.
対象は、本方法において分析に供される動物、即ち、試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、がんに罹患している可能性がある動物、或いは過去にがんに罹患したことのある動物等であってもよく、特に、乳がんに罹患している可能性がある動物、或いは過去に乳がんに罹患したことのある動物等であってもよい。対象はヒトであることが好ましい。 The subject is an animal that is subjected to analysis in this method, i.e., an animal that provides a sample. The subject may be an animal with some disease, or may be a healthy animal. For example, the subject may be an animal that may have cancer or has had cancer in the past, and in particular, an animal that may have breast cancer or has had breast cancer in the past. The subject is preferably a human.
例えば、上述の標的ｍｉＲＮＡはそれぞれ下記の表１－１～表１－５に示される配列で表せられる。 For example, the above-mentioned target miRNAs are represented by the sequences shown in Tables 1-1 to 1-5 below.
或いは、対象は他の動物であってもよい。他の動物は、例えば哺乳動物であり、例えば、サル等の霊長類、マウス、ラット又はモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ又はウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ又はブタ等の家畜動物、或いは展示動物等に属する動物を含む。ヒト以外の動物である場合は、標的ｍｉＲＮＡは、その動物に存在する、上記ｍｉＲＮＡに対応したｍｉＲＮＡである。 Alternatively, the subject may be another animal. Other animals are, for example, mammals, including, for example, animals belonging to primates such as monkeys, rodents such as mice, rats, or guinea pigs, companion animals such as dogs, cats, or rabbits, livestock animals such as horses, cows, or pigs, or exhibition animals. In the case of an animal other than a human, the target miRNA is a miRNA present in that animal that corresponds to the above-mentioned miRNA.
対象由来の試料とは、対象から採取された試料又はそれを適切に処理した試料等を含む。試料は、好ましくは、血清又は血漿である。試料は、その他の体液、例えば、血液、白血球間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、鼻腔内粘膜、鼻水、咽頭粘膜、喀痰、消化液、胃液、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、***又は膣液等であってもよい。或いは試料は、組織又は細胞等であってもよく、対象から採取され、培養された組織又は細胞、或いはその上清であってもよい。 Samples derived from a subject include samples collected from a subject or samples that have been appropriately treated therefrom. The sample is preferably serum or plasma. The sample may be other body fluids, such as blood, leukocyte interstitial fluid, urine, stool, sweat, saliva, oral mucosa, nasal mucosa, nasal discharge, pharyngeal mucosa, sputum, digestive fluid, gastric juice, lymphatic fluid, cerebrospinal fluid, tears, breast milk, amniotic fluid, semen, or vaginal fluid. Alternatively, the sample may be tissue or cells, etc., and may be tissue or cells collected from a subject and cultured, or the supernatant thereof.
本明細書においてがんは、何れの病期のものも含み、例えば、発生母地の臓器内にがんが留まった状態、更に周辺の組織までがんが及んだ状態、更にリンパ節へがんが転移した状態、及び更に離れた臓器へのがんの転移がある状態等を含む。また本明細書において乳がんは、乳腺組織に形成される悪性腫瘍（新生物）をいう。乳がんは、一般に「乳癌」又は「乳がん」と称されるものも含む。また、実施形態に従う乳がんは、何れの種類の乳がんも含み、例えば乳腺小葉がん又は乳管がんを含む。また、実施形態に従う乳がんは、例えば上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、並びに上皮性及び非上皮性の両方からなる悪性葉状腫瘍を含む。 In this specification, cancer includes any stage of the disease, for example, a state in which the cancer remains in the organ where it originated, a state in which the cancer has spread to surrounding tissues, a state in which the cancer has spread to lymph nodes, and a state in which the cancer has spread to more distant organs. In this specification, breast cancer refers to a malignant tumor (neoplasm) formed in mammary gland tissue. Breast cancer also includes what is generally called "breast cancer" or "breast cancer". In addition, breast cancer according to the embodiment includes any type of breast cancer, for example, breast lobular carcinoma or ductal carcinoma. In addition, breast cancer according to the embodiment includes, for example, epithelial tumors, non-epithelial tumors, and malignant phyllodes tumors consisting of both epithelial and non-epithelial tumors.
以下、第１実施形態の方法の手順の一例について、図１の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を参照して説明する。 An example of the procedure of the method of the first embodiment will be described below with reference to (a), (b), and (c) of FIG. 1.
図１の（ａ）に示す通り、分析方法は、例えば
対象由来の試料を用意すること（用意工程（Ｓ１１））と、
対象由来の試料中の何れか１種の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ１２））と
を含む。
As shown in FIG. 1A, the analysis method includes, for example, preparing a sample derived from a subject (preparation step (S11));
and quantifying any one of the target miRNAs in a sample derived from a subject (quantification step (S12)).
まず、対象由来の試料を用意する（用意工程（Ｓ１１））。試料は、その種類に従う一般的な方法を用いて採取することができる。試料は、採取後そのまま使ってもよいし、核酸の定量のための反応を阻害しない状態又は反応により適した状態となるように処理してもよい。処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出及び／又は分離等であり、公知の何れかの手段により行うことができる。 First, a sample derived from a subject is prepared (preparation step (S11)). The sample can be collected using a general method according to the type of sample. The sample may be used as is after collection, or may be processed so as to be in a state that does not inhibit the reaction for quantifying nucleic acids or to be in a state that is more suitable for the reaction. Processing may be performed by any known means, such as chopping, homogenization, centrifugation, precipitation, extraction and/or separation.
例えば、抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて行ってもよい。核酸抽出キットとして、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａ（タカラバイオ製）、Ｑｕｉｃｋ－ｃｆＲＮＡ Ｓｅｒｕｍ ＆ Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（ザイモリサーチ製）、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ キット（キアゲン製）、ｍｉＲＶａｎａ ＰＡＲＩＳ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ製） 、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標） ＳＰ Ｋｉｔ（和光純薬製）、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）等を用いることができる。或いは、市販のキットを使用せずに、例えば、試料を緩衝液で希釈し、８０～１００℃の加熱処理を行い、遠心分離し、その上清を採取することによって抽出を行ってもよい。 For example, extraction may be performed using a commercially available nucleic acid extraction kit. Examples of nucleic acid extraction kits include NucleoSpin (registered trademark) miRNA Plasma (manufactured by Takara Bio), Quick-cfRNA Serum & Plasma Kit (manufactured by Zymo Research), miRNeasy Serum/Plasma Kit (manufactured by Qiagen), miRVana PARIS isolation kit (manufactured by Thermo Fisher), PureLinkTM Total RNA Blood Kit (manufactured by Thermo Fisher), Plasma/Serum RNA Purification Kit (manufactured by Norgen Biotech), microRNA Extractor (registered trademark) SP Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and High Pure miRNA Isolation Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A commercially available kit (Sigma-Aldrich) or the like can be used. Alternatively, without using a commercially available kit, extraction can be performed, for example, by diluting the sample with a buffer solution, heating it at 80 to 100°C, centrifuging it, and collecting the supernatant.
次に、試料中の何れか１種の標的ｍｉＲＮＡを定量する（定量工程（Ｓ１２））。定量工程（Ｓ１２）は、ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ等の短鎖のＲＮＡを定量するための一般的な方法を用いて行うことができる。その方法は限定されるものではないが、例えば、標的ｍｉＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成し、得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出及び定量する方法が挙げられる。ＲＮＡが短鎖である場合、増幅を容易にするため、逆転写して得たｃＤＮＡの末端に人工配列を付加するように伸長することも一般的に実施されている。また、逆転写を経ず、試料中のＲＮＡを直接増幅し、増幅産物を検出及び定量する技術としてローリングサークル増幅法が知られている。増幅には、例えば、ＰＣＲ法、ｑＰＣＲ法、又はＬＡＭＰ法を用いることができる。検出及び定量は、増幅の後に行われてもよいし、増幅中に経時的に行われてもよい。検出及び定量には、例えば、濁度若しくは吸光度に基づく信号を用いる測定法、光学的信号を用いる測定法又は電気化学的信号を用いる測定法、或いはこれらの組み合わせ等を用いることができる。例えば、増幅産物量に応じて得られる上記信号の強度又は変化量、或いは信号が閾値に達するまでの時間（立ち上がり時間）又はＰＣＲ法を用いる場合はサイクル数（立ち上がりサイクル数）から標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことができる。さらに、試料中の標的ｍｉＲＮＡの濃度が比較的高い場合や高感度測定が可能な装置を使用できる場合は、標的ｍｉＲＮＡを増幅することを経ずに、標的ｍｉＲＮＡ（又は、そのｃＤＮＡ）を直接検出することも一般的な方法の一つである。直接検出が可能な装置として、例えば標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合する核酸プローブを備えたマイクロアレイ等が挙げられる。 Next, any one of the target miRNAs in the sample is quantified (quantification step (S12)). The quantification step (S12) can be performed using a general method for quantifying RNA, particularly short-chain RNA such as miRNA. The method is not limited, but examples include a method in which the target miRNA is reverse transcribed to generate cDNA, the obtained cDNA is amplified, and the amplified product is detected and quantified. When the RNA is short-chain, it is generally practiced to extend the cDNA obtained by reverse transcription so as to add an artificial sequence to the end in order to facilitate amplification. In addition, rolling circle amplification is known as a technique for directly amplifying RNA in a sample and detecting and quantifying the amplified product without going through reverse transcription. For amplification, for example, PCR, qPCR, or LAMP can be used. Detection and quantification may be performed after amplification or over time during amplification. For detection and quantification, for example, a measurement method using a signal based on turbidity or absorbance, a measurement method using an optical signal, or a measurement method using an electrochemical signal, or a combination thereof, can be used. For example, the target miRNA can be quantified from the intensity or change in the signal obtained according to the amount of amplified product, or the time it takes for the signal to reach a threshold (rise time), or the number of cycles (rise cycle number) when using a PCR method. Furthermore, when the concentration of the target miRNA in the sample is relatively high or when a device capable of highly sensitive measurement can be used, it is also a common method to directly detect the target miRNA (or its cDNA) without amplifying the target miRNA. An example of a device capable of direct detection is a microarray equipped with a nucleic acid probe that specifically binds to the target miRNA.
検出及び定量は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を用いることも可能である。この場合は標的ｍｉＲＮＡにアライメントされたリード数等の検出結果から標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことができる。 Detection and quantification can also be performed using next-generation sequencing (NGS). In this case, the target miRNA can be quantified from detection results such as the number of reads aligned to the target miRNA.
標的ｍｉＲＮＡの定量値は、上記信号の検出結果と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて決定してもよい。検量線は、既知の濃度で標的ｍｉＲＮＡを含む複数の標準試料（試料ごとに標的ｍｉＲＮＡ濃度は異なる）を用意し、それら試料について各種信号の検出を行うことによって作成することができる。この検量線と、対象由来の試料について得られた信号の検出結果とを比較することによって、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量が算出され得る。試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量は、例えば、試料の単位量当たりの標的ｍｉＲＮＡのコピー数として算出され得る。 The quantitative value of the target miRNA may be determined using a calibration curve that shows the relationship between the detection result of the above signal and the amount of the target miRNA present. The calibration curve can be created by preparing multiple standard samples (each sample has a different target miRNA concentration) containing the target miRNA at a known concentration and detecting various signals for these samples. By comparing this calibration curve with the detection result of the signal obtained for a sample derived from a subject, the amount of the target miRNA present in the sample can be calculated. The amount of the target miRNA present in the sample can be calculated, for example, as the number of copies of the target miRNA per unit amount of sample.
定量工程（Ｓ１２）における定量は、例えば、市販のキットを用いて行ってもよい。市販のキットの例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（サーモフィッシャー製、カタログＮｏ．Ａ２５５７６）、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ（登録商標） ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ Ａｓｓａｙｓ（キアゲン製、カタログＮｏ．３３９３０６、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｍｉｃｒｏＲＮＡ検出システム（オリジンテクノロジーズ製）等であり、標的ｍｉＲＮＡを特異的に増幅するプライマーとともに用いられ得る。 Quantification in the quantification step (S12) may be performed, for example, using a commercially available kit. Examples of commercially available kits include TaqMan® Advanced miRNA Assays (manufactured by Thermo Fisher, catalog No. A25576), miRCURY LNA® miRNA PCR Assays (manufactured by Qiagen, catalog No. 339306, SYBR® Green qPCR microRNA Detection System (manufactured by Origin Technologies), etc., and may be used together with primers that specifically amplify the target miRNA.
より好ましい定量工程（Ｓ１２）の例については、第４実施形態または第５実施形態で説明する。 A more preferred example of the quantification step (S12) is described in the fourth or fifth embodiment.
定量工程（Ｓ１２）で得られた、標的ｍｉＲＮＡの検出に係るデータは、対象における乳がんの罹患の有無の判定のために用いることができる。 The data relating to the detection of the target miRNA obtained in the quantification step (S12) can be used to determine whether or not a subject has breast cancer.
例えば、更なる実施形態の第１実施形態の分析方法は、図１の（ｂ）に示す通り、定量工程（Ｓ１２）の後に行われ得る判定工程（Ｓ１３）を更に含み得る。判定工程（Ｓ１３）では、例えば対象の定量値がそれらよりも高い又は低い場合には、対象が乳がんに罹患していると判定の判断を補助する情報を提供し得る。 For example, the analysis method of the first embodiment of the further embodiment may further include a determination step (S13) that may be performed after the quantification step (S12), as shown in FIG. 1(b). In the determination step (S13), for example, if the quantitative value of the subject is higher or lower than these, information that assists in determining that the subject is suffering from breast cancer may be provided.
標的ｍｉＲＮＡ群には、乳がんを罹患した対象で、対照と比較して発現量が多いもの（多発現標的ｍｉＲＮＡ）と少ないもの（少発現標的ｍｉＲＮＡ）とが含まれる。少発現標的ｍｉＲＮＡは、例えばｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２３８－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７６、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－３１２６－３ｐ、ｍｉＲ－３１５０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１７－３ｐ、ｍｉＲ－３６４９、ｍｉＲ－４３０５、ｍｉＲ－４４４０、ｍｉＲ－４４５６、ｍｉＲ－４４９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－４７０３－３ｐ、ｍｉＲ－５７９－３ｐ、ｍｉＲ－６０８３、ｍｉＲ－６８７１－５ｐ、又はｍｉＲ－７９７６であり、これらは定量値が対照よりも低い場合に乳がんと判定される。 The target miRNA group includes miRNAs that are highly expressed (highly expressed target miRNAs) and those that are less expressed (lowly expressed target miRNAs) in subjects with breast cancer compared to controls. Examples of low-expressing target miRNAs include let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-338-3p, and miR-33a-5p. p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-4282, miR-4425, miR-4677-5p, miR-4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5700, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, miR-1246, miR-1238-5p ... iR-1307-3p, miR-1276, miR-139-3p, miR-3126-3p, miR-3150b-3p, miR-31-5p, miR-3609, miR-3617-3p, miR-3649, miR-4305, miR-4440, miR-4456, miR-449c-3p, miR-4703-3p, miR-579-3p, miR-6083, miR-6871-5p, or miR-7976, and when the quantitative value is lower than the control, it is determined to be breast cancer.
多発現標的ｍｉＲＮＡは、例えばｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－３９３７、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－４６７４、ｍｉＲ－４７０７－３ｐ、ｍｉＲ－５６４、ｍｉＲ－６１５－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－７１０８－５ｐ、ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｍｉＲ－１２６９ｂ、ｍｉＲ－２４６７－３ｐ、ｍｉＲ－２９７、ｍｉＲ－３１７５、ｍｉＲ－３１７７－３ｐ、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－４７３６、ｍｉＲ－６８２５－３ｐ、及びｍｉＲ－６８４５－５ｐであり、定量値が対照よりも高い場合に乳がんと判定される。 Examples of the highly expressed target miRNAs include miR-1307-5p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4417, miR-4427, miR-4433b-5p, and miR-452. -5p, miR-4632-3p, miR-548y, miR-5694, miR-571, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-887-5p, miR-3937, miR-444 9, miR-4674, miR-4707-3p, miR-564, miR-615-5p, miR-6510-5p, miR-7108-5p, miR-1225-5p, miR-1269b, miR-2467-3p, miR-297, miR-3175, miR-3177-3p, miR-3666, miR-4736, miR-6825-3p, and miR-6845-5p. When the quantitative value is higher than the control, the patient is judged to have breast cancer.
以下、定量値が「高い又は低い」と記載するとき、それは多発現標的ｍｉＲＮＡにおいては高い、又は少発現標的ｍｉＲＮＡにおいては低いことを意味する。 Hereinafter, when a quantitative value is described as "high or low," it means that it is high for highly expressed target miRNAs or low for low expressed target miRNAs.
例えば判定は、予め得られた、対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値又は閾値等を基準として行われ得る。 For example, the determination can be made based on a previously obtained quantitative value or threshold value of the target miRNA in a control.
対照は、例えば、健常体である。健常体とは、少なくともがんに罹患していない個体をいう。健常体は、疾患や異常を有さない健康な個体であることが好ましい。対照として選択される個体は、本方法で分析される対象とは別の個体であってもよいが、同じ種に属する個体、即ち対象がヒトであればヒトであることが好ましい。また、対照の年齢、性別及び身長体重等の身体的条件又は人数は特に限定されるものではないが、身体的条件は、本分析方法で検査を受ける対象のものと同じ又は類似であることが好ましい。 The control is, for example, a healthy individual. A healthy individual refers to an individual that is at least not afflicted with cancer. A healthy individual is preferably a healthy individual that has no disease or abnormality. The individual selected as the control may be an individual different from the subject analyzed by the present method, but is preferably an individual belonging to the same species, i.e., if the subject is human, it is preferably a human. In addition, the physical conditions, such as age, sex, height, weight, etc., or the number of individuals of the control are not particularly limited, but it is preferable that the physical conditions are the same or similar to those of the subject to be examined by the present analysis method.
対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値は、例えば、対照由来の同じ又は類似の試料を用いて、定量工程（Ｓ１２）で用いられるのと同じ方法を用いて得られた、標的ｍｉＲＮＡの定量値である。ここで、「類似の試料」とは、採取の方法は異なるが、対象由来の試料と実質的に同等である試料のことを指す。例えば対象由来の試料が、ある臓器から分泌された体液である場合、対照由来の類似の試料とは、例えば、対応する臓器から採取し培養した組織又は細胞から分泌された分泌液等である。或いは、体液中には臓器から剥離した組織又は細胞、及び同細胞が破砕され放出された細胞質基質等が含有されうることから、対照由来の類似の試料は、例えば対応する臓器から採取した組織（又は細胞）であってもよい場合がある。 The quantitative value of the target miRNA in the control is, for example, a quantitative value of the target miRNA obtained using the same or similar sample from the control and the same method as that used in the quantification step (S12). Here, the term "similar sample" refers to a sample that is substantially equivalent to the sample from the subject, although the collection method is different. For example, when the sample from the subject is a body fluid secreted from a certain organ, the similar sample from the control is, for example, a secretion secreted from tissue or cells collected and cultured from the corresponding organ. Alternatively, since the body fluid may contain tissue or cells detached from the organ, and the cytoplasmic matrix released by crushing the same cells, the similar sample from the control may be, for example, tissue (or cells) collected from the corresponding organ.
閾値は、例えば、乳がんに罹患している対象における定量値と、乳がんに罹患していない対照における定量値とを切り分けることができる、標的ｍｉＲＮＡの存在度である。乳がんに罹患していない対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値とは、例えば、乳がんに罹患しているか否かが既知である標準対象に由来し、かつ、対象と同じ若しくは類似の試料又は乳がんの株化細胞を含む試料等に対して、対象の定量工程（Ｓ１２）と同様の方法を適用することで得られる。このような、乳がんに罹患していない対照における定量値を、例えば閾値として決定することができる。しかしながら、閾値は限定されるものではなく、用いられる定量方法、試料の種類及び測定条件等に従って決定され得る。 The threshold is, for example, the presence of the target miRNA that can distinguish between a quantitative value in a subject with breast cancer and a quantitative value in a control without breast cancer. The quantitative value of the target miRNA in a control without breast cancer is, for example, derived from a standard subject whose presence or absence of breast cancer is known, and is obtained by applying a method similar to the subject quantification step (S12) to a sample that is the same as or similar to the subject or a sample containing a breast cancer cell line. Such a quantitative value in a control without breast cancer can be determined, for example, as the threshold. However, the threshold is not limited and can be determined according to the quantification method used, the type of sample, the measurement conditions, etc.
或いは、閾値は対象ごとに決定されてもよい。例えば、健康診断等で定期的に測定される対象の健常なときの標的ｍｉＲＮＡ定量値をモニターしていれば、それを閾値として用いることにより、それより定量値が高い又は低いときに乳がんに罹患している可能性ありとしてアラームを出すことができる。閾値は個人ごとに異なり得る。例えば、通常標的ｍｉＲＮＡの定量値が約１０３コピーで推移していた対象Ａにおいて、あるとき１０４コピーとなった場合乳がんの可能性ありとすることができる。一方で、約１０２コピーで推移していた対象Ｂにおいては、あるとき１０３コピーとなった場合に乳がんの可能性ありとすることができる。 Alternatively, the threshold may be determined for each subject. For example, if the target miRNA quantitative value of a healthy subject is monitored periodically during a health checkup or the like, the threshold value can be used to issue an alarm indicating the possibility of breast cancer when the quantitative value is higher or lower than the threshold value. The threshold value may vary from person to person. For example, in subject A, where the quantitative value of the target miRNA usually remains at about 10 3 copies, if it becomes 10 4 copies at some point, it can be determined that there is a possibility of breast cancer. On the other hand, in subject B, where the quantitative value remains at about 10 2 copies, if it becomes 10 3 copies at some point, it can be determined that there is a possibility of breast cancer.
対照における定量値又は閾値は、文献等の過去の知見から決定してもよい。 The quantitative value or threshold value in the control may be determined from previous findings such as those in the literature.
ここで、罹患しているとの判定は、罹患している可能性が高いことも含む。反対に、罹患していないとの判定は、罹患している可能性が低いことも含む。 Here, a determination that a person has the disease includes a high probability of having the disease. Conversely, a determination that a person does not have the disease includes a low probability of having the disease.
更なる実施形態によれば、乳がんに罹患していると判定することは、対象における乳がんの予後又は再発を判定することも含む。例えば、分析方法は、図１の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ１２）の後、定量の結果から対象における乳がんの予後又は再発の有無を判定する予後再発判定工程（Ｓ１４）を含む。予後再発判定工程（Ｓ１４）においては、例えば、定量値が高い又は低い場合には、対象における乳がんの予後が不良である、又は乳がんが再発している、或いはその可能性が高いと判定することが可能である。予後、再発の判定にも上記対照における定量値、閾値を用いることができる。特に対象ごとに決定された閾値を用いることが好ましい場合もあり得る。 According to a further embodiment, determining that the subject is afflicted with breast cancer also includes determining the prognosis or recurrence of breast cancer in the subject. For example, as shown in FIG. 1(c), the analysis method includes a prognosis/recurrence determination step (S14) of determining the prognosis or recurrence of breast cancer in the subject from the results of the quantification after the quantification step (S12). In the prognosis/recurrence determination step (S14), for example, if the quantification value is high or low, it can be determined that the prognosis of breast cancer in the subject is poor, or that breast cancer has recurred, or that there is a high possibility of recurrence. The quantification value and threshold value in the control can also be used to determine the prognosis and recurrence. In particular, it may be preferable to use a threshold value determined for each subject.
また、判定工程（Ｓ１３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ１４）の後、判定結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択、及びその補助を行うことも可能である。例えば、分析方法は、図１の（ｄ）に示すように、判定工程（Ｓ１３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ１４）の後、判定結果から対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ１５）を含む。ここで治療法又は薬剤は、乳がんの治療のためのものである。治療法の種類又は薬剤の種類は、治療法又は薬剤の使用量、タイミング若しくは期間を含む。 In addition, after the determination step (S13) and/or the prognosis recurrence determination step (S14), it is also possible to select and assist in the selection of a type of therapy or a type of drug to be applied to the subject in accordance with the determination results. For example, as shown in FIG. 1(d), the analysis method includes a selection step (S15) of selecting a type of therapy or a type of drug to be applied to the subject from the determination results after the determination step (S13) and/or the prognosis recurrence determination step (S14). Here, the therapy or drug is for the treatment of breast cancer. The type of therapy or type of drug includes the amount, timing, or duration of use of the therapy or drug.
以上に説明した第１実施形態の分析方法によれば、対象由来の試料中の何れか１種の標的ｍｉＲＮＡを定量することにより、簡便に対象における乳がんの罹患の有無を判定することが可能である。言い換えれば、本方法によれば乳がんに罹患した対象と乳がんに罹患していない対象とを簡単に識別することができる。 According to the analysis method of the first embodiment described above, by quantifying any one of the target miRNAs in a sample derived from a subject, it is possible to easily determine whether or not a subject has breast cancer. In other words, this method makes it possible to easily distinguish between subjects with breast cancer and subjects without breast cancer.
本実施形態の方法は、健康診断等で容易に採取できる血清または血漿を用いることが可能であるため、乳がんを早期に発見することができる。血清または血漿等を用いることで、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。また、血清又は血漿は、そこに含まれるｍｉＲＮＡ濃度が安定しているため、より正確な検査を行うことが可能である。 The method of this embodiment can detect breast cancer early because it is possible to use serum or plasma, which can be easily collected during health checkups, etc. By using serum or plasma, etc., the physical and economic burden on the subject can be greatly reduced compared to cytology, etc., and the procedure is simple, so the burden on the examiner is also small. In addition, since the miRNA concentration contained in serum or plasma is stable, more accurate testing can be performed.
更なる実施形態によれば、対象由来の試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ１２））を含む、対象におけるがんの罹患の有無の判定を補助するための分析方法も提供される。「判定を補助する」とは、例えば、対象が乳がんに罹患している可能性に関する情報を取得することを含む。「情報」とは、例えば、試料の分析結果に関する情報であり、例えば定量値であり得る。本方法によれば、対象におけるがんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うためのより精度の高い情報を取得することができる。 According to a further embodiment, there is also provided an analytical method for assisting in determining whether or not a subject has cancer, which includes quantifying target miRNA in a sample derived from a subject (quantification step (S12)). "Assisting in determination" includes, for example, obtaining information regarding the possibility that the subject has breast cancer. "Information" is, for example, information regarding the analysis results of a sample, which may be, for example, a quantitative value. According to this method, it is possible to obtain more accurate information for determining whether or not a subject has cancer, determining the prognosis, determining the presence or absence of recurrence, or selecting a treatment or drug to be applied to the subject.
更なる実施形態によれば、本分析方法は、対象由来でない試料中における乳がん細胞の検出等にも使用することができる。例えば、乳がん細胞を人工的に製造する場合に、製造された細胞含有溶液中に乳がん細胞が存在するか否かを確かめる際等にも使用することができる。 In a further embodiment, the present analytical method can also be used to detect breast cancer cells in samples not derived from a subject. For example, when artificially producing breast cancer cells, the method can be used to determine whether or not breast cancer cells are present in a cell-containing solution produced.
（マーカー）
第１実施形態によれば、何れか１種の標的ｍｉＲＮＡを含む、乳がん検出用マーカーが提供される。
(marker)
According to the first embodiment, a marker for detecting breast cancer is provided, which comprises any one of target miRNAs.
ここで、「マーカー」は、試料中のその有無又は濃度を検出することで、試料及び／又はその由来となる対象が特定の状態であるか否かを判定することのできる物質をいう。 Here, "marker" refers to a substance whose presence or concentration in a sample can be detected to determine whether the sample and/or the subject from which it is derived is in a particular state.
第１実施形態の乳がん検出用マーカーは、例えば、対象由来の試料中のその存在量（定量値）を測定することで、上記したように対象における乳がんの罹患の有無判定、予後又は再発の有無の判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うことができる。 The breast cancer detection marker of the first embodiment can be used to determine the presence or absence of breast cancer in a subject, the prognosis or recurrence, or to select a treatment method or drug to be applied to the subject, for example, by measuring the amount (quantitative value) present in a sample derived from the subject, as described above.
（キット）
第１実施形態によれば、乳がん検出用キットが提供される。
(kit)
According to a first embodiment, a kit for detecting breast cancer is provided.
キットは、ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ等の短鎖のＲＮＡを定量するための一般的な方法に用いられ得る試薬類、及び、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な（すなわち、標的ｍｉＲＮＡとハイブリダイズする）核酸を含む。標的ｍｉＲＮＡの検出にｑＰＣＲ法を用いる場合、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸は、標的ｍｉＲＮＡを逆転写するための逆転写用（ＲＴ）プライマーであってもよいし、標的ｍｉＲＮＡを伸長するための伸長用（ＥＬ）プライマーであってもよいし、標的ｍｉＲＮＡを増幅するための増幅用プライマーセットであってもよい。 The kit includes reagents that can be used in a general method for quantifying RNA, particularly short-stranded RNA such as miRNA, and a nucleic acid capable of specifically binding to a target miRNA (i.e., hybridizing to the target miRNA). When the qPCR method is used to detect the target miRNA, the nucleic acid capable of specifically binding to the target miRNA may be a reverse transcription (RT) primer for reverse transcribing the target miRNA, an extension (EL) primer for extending the target miRNA, or an amplification primer set for amplifying the target miRNA.
ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを得るためのプライマーである。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列を含む。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするためにｃＤＮＡに付加する人工配列を更に含んでもよい。 The RT primer is a primer for obtaining cDNA of a target miRNA. The RT primer contains a sequence complementary to at least a portion of the sequence of the target miRNA. The RT primer may further contain an artificial sequence that is added to the cDNA to facilitate amplification of the cDNA of the target miRNA.
ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするためにｃＤＮＡに人工配列を付加するためのプライマーである。ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列と、各ｃＤＮＡの伸長用に付加する配列とを含み得る。 EL primers are primers for adding artificial sequences to cDNA to facilitate amplification of the cDNA of a target miRNA. EL primers may contain a sequence complementary to at least a portion of the sequence of the cDNA of the target miRNA and a sequence to be added for elongation of each cDNA.
増幅用プライマーセットは、例えばＰＣＲ法用であれば、少なくともフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む。または、増幅用プライマーセットはＬＡＭＰ法用であってもよく、一般的なＬＡＭＰ法で使用される、標的ｍｉＲＮＡの塩基配列に対応する配列のプライマー類を含んでもよい。または、増幅用プライマーセットは例えばＮＧＳ法用であってもよく、人工的なアダプター配列を含むフォワードプライマーとその相補的配列を含むリバースプライマーを含んでもよい。ＮＧＳ法用の増幅用プライマーセットは、複数の検体を同時に解析するために、異なるバーコード配列を含むフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを複数種類含んでもよい。増幅用プライマーセットがローリングサイクル増幅法に用いられる場合、キットは、増幅用プライマーがハイブリダイズして増幅の鋳型となる環状１本鎖ＤＮＡをさらに含む。 For example, if the amplification primer set is for the PCR method, it includes at least a forward primer and a reverse primer. Alternatively, the amplification primer set may be for the LAMP method, and may include primers having a sequence corresponding to the base sequence of the target miRNA, which are used in general LAMP methods. Alternatively, the amplification primer set may be for, for example, the NGS method, and may include a forward primer including an artificial adapter sequence and a reverse primer including its complementary sequence. The amplification primer set for the NGS method may include multiple combinations of forward primers and reverse primers including different barcode sequences in order to analyze multiple samples simultaneously. When the amplification primer set is used for the rolling cycle amplification method, the kit further includes a circular single-stranded DNA to which the amplification primer hybridizes to serve as a template for amplification.
増幅用プライマーセットに含まれる各プライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ又はその相補配列と結合するように設計されてもよいし、ＲＴプライマー及び／又はＥＬプライマーによって付加された人工配列と結合するように設計されてもよい。ＲＴプライマー、ＥＬプライマー及び増幅用プライマーセットの好ましい配列については、第４実施形態で説明する。 Each primer included in the amplification primer set may be designed to bind to the cDNA of the target miRNA or its complementary sequence, or may be designed to bind to an artificial sequence added by the RT primer and/or EL primer. The preferred sequences of the RT primer, EL primer, and amplification primer set will be described in the fourth embodiment.
さらに、試料中の標的ｍｉＲＮＡがマイクロアレイによって直接検出される場合、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸は、マイクロアレイが備える核酸プローブである。核酸プローブは、標的ｍｉＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、或いはその増幅産物の少なくとも１部の配列又はその相補配列を有する。 Furthermore, when the target miRNA in the sample is directly detected by a microarray, the nucleic acid capable of specifically binding to the target miRNA is a nucleic acid probe provided in the microarray. The nucleic acid probe has at least a partial sequence of the target miRNA, its cDNA, or its amplification product, or a complementary sequence thereof.
キットに含まれる上記核酸は、個別に又は何れかが組み合わされて適切な担体とともに容器に収容されて提供されてもよい。適切な担体は、例えば、水、生理的溶液又は緩衝液等である。容器は、例えば、チューブ又はマイクロタイタープレート等である。或いは、これら核酸はマイクロ流体チップ等の固相に固定されて提供されてもよい。 The above nucleic acids included in the kit may be provided individually or in any combination in a container together with a suitable carrier. Suitable carriers include, for example, water, a physiological solution, or a buffer solution. The container may be, for example, a tube or a microtiter plate. Alternatively, these nucleic acids may be provided immobilized on a solid phase such as a microfluidic chip.
キットは、上記核酸の他に、逆転写、伸長及び／又は増幅に用いられる試薬、例えば酵素、基質及び／又は検出に用いられる光学的信号又は電気的化学信号を生じる標識物質等を含んでもよい。標識物質は、例えば、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎやＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標） ８２などの蛍光色素、電流検出する場合はルテニウムヘキサアミンなどの金属錯体等の指示薬である。 In addition to the nucleic acid, the kit may also include reagents for reverse transcription, extension and/or amplification, such as enzymes, substrates and/or labeling substances that generate optical or electrical chemical signals for detection. Labeling substances are, for example, fluorescent dyes such as SYBR Green, EvaGreen (registered trademark), and SYTO (registered trademark) 82, or indicators such as metal complexes such as ruthenium hexaamine in the case of current detection.
キットは、例えば、上記のように対象における乳がんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、治療法の種類又は薬剤の種類の選択等に使用することができる。 The kit can be used, for example, to determine whether a subject has breast cancer, to determine prognosis, to determine whether recurrence has occurred, to select a type of treatment or a type of drug, etc., as described above.
更なる実施形態によれば、乳がん検出用キットは、乳がんの診断用組成物又は診断薬として提供される。また、実施形態によれば、乳がんの診断用組成物又は乳がんの診断薬の製造における上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。 According to further embodiments, a kit for detecting breast cancer is provided as a diagnostic composition or diagnostic agent for breast cancer. Also provided according to embodiments is the use of at least one of the above nucleic acids in the manufacture of a diagnostic composition or diagnostic agent for breast cancer.
・第２実施形態
（分析方法）
第２実施形態の方法は、図２の（ａ）に示すように、例えば
対象由来の試料を用意すること（用意工程（Ｓ２１））と、
対象由来の試料中の複数種類の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ２２））と
を含む。
Second embodiment (analysis method)
As shown in FIG. 2A, the method of the second embodiment includes, for example, preparing a sample derived from a subject (preparation step (S21));
and quantifying multiple types of target miRNA in a sample derived from a subject (quantification step (S22)).
複数種類の標的ｍｉＲＮＡを定量する場合、標的ｍｉＲＮＡの種類ごとに別個の反応系を用意し、それぞれの反応系ごとに例えばＰＣＲ法、ｑＰＣＲ法、マイクロアレイ法又はＬＡＭＰ法による増幅、検出及び定量を行ってもよい。又は複数の核酸を同時に検出可能な流路チップ等を用いて同一の反応系で複数種類の標的ｍｉＲＮＡを検出及び定量してもよい。例えばＮＧＳ法を用いることで、複数種類の標的ｍｉＲＮＡを同一反応系で同時に増幅、検出及び定量を行うことも可能である。 When quantifying multiple types of target miRNA, a separate reaction system may be prepared for each type of target miRNA, and amplification, detection, and quantification may be performed for each reaction system, for example, by PCR, qPCR, microarray, or LAMP. Alternatively, multiple types of target miRNA may be detected and quantified in the same reaction system using a flow channel chip or the like capable of simultaneously detecting multiple nucleic acids. For example, by using the NGS method, it is also possible to simultaneously amplify, detect, and quantitate multiple types of target miRNA in the same reaction system.
各標的ｍｉＲＮＡの定量値は、上記信号の検出結果と各標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて決定され得るが、検量線は標的ｍｉＲＮＡごとに作成することが好ましい。この検量線と、対象由来の試料について得られた信号の検出結果とを比較することによって、試料中の各標的ｍｉＲＮＡの存在量がそれぞれ算出され得る。試料中の各標的ｍｉＲＮＡの存在量は、例えば、試料の単位量当たりのそれぞれの標的ｍｉＲＮＡのコピー数として算出され得る。 The quantitative value of each target miRNA can be determined using a calibration curve that shows the relationship between the detection result of the above signal and the abundance of each target miRNA, but it is preferable to create a calibration curve for each target miRNA. By comparing this calibration curve with the detection result of the signal obtained for a sample derived from a subject, the abundance of each target miRNA in the sample can be calculated. The abundance of each target miRNA in the sample can be calculated, for example, as the number of copies of each target miRNA per unit amount of sample.
定量工程（Ｓ２２）で得られた、複数の標的ｍｉＲＮＡの定量値を含むデータは、対象における乳がんの罹患の有無の判定又はその補助のために用いることができる。例えば、第２実施形態の分析方法は、図２の（ｂ）に示す通り、定量工程（Ｓ２２）の後に行われる判定工程（Ｓ２３）を更に含んでいてもよい。 The data obtained in the quantification step (S22), including the quantitative values of multiple target miRNAs, can be used to determine or assist in determining whether or not a subject has breast cancer. For example, the analysis method of the second embodiment may further include a determination step (S23) performed after the quantification step (S22), as shown in FIG. 2(b).
判定工程（Ｓ２３）では、例えば第１実施形態と同様に基準が設定される。すなわち、定量工程（Ｓ２２）で得られた対象由来の試料の定量値と、基準とを比較することによって、対象の乳がん罹患の有無を判定することができる。各標的ｍｉＲＮＡの基準は、対照の対応する標的ｍｉＲＮＡの定量値又は閾値等であることが好ましい。各閾値は、各標的ｍｉＲＮＡごとに決定されることが好ましい。 In the determination step (S23), a standard is set, for example, in the same manner as in the first embodiment. That is, the presence or absence of breast cancer in a subject can be determined by comparing the quantitative value of the subject-derived sample obtained in the quantification step (S22) with the standard. The standard for each target miRNA is preferably the quantitative value or threshold value of the corresponding target miRNA in a control. Each threshold value is preferably determined for each target miRNA.
定量工程（Ｓ２２）により複数種類の標的ｍｉＲＮＡの定量値のデータを得た場合、そのうちの１種の標的ｍｉＲＮＡの定量値が閾値等の基準と比較して高い又は低い場合に対象が乳がんに罹患していると判定してもよいし、２種類以上の標的ｍｉＲＮＡの定量値が基準と比較して高い又は低い場合に対象が乳がんに罹患していると判定してもよい。また、全ての上記標的ｍｉＲＮＡ、すなわち標的ｍｉＲＮＡ群の定量値が基準と比較して高い又は低い場合に、対象が乳がんに罹患していると判定してもよい。 When data on the quantitative values of multiple types of target miRNAs is obtained by the quantification step (S22), the subject may be determined to have breast cancer if the quantitative value of one of the target miRNAs is higher or lower than a standard such as a threshold value, or the subject may be determined to have breast cancer if the quantitative values of two or more target miRNAs are higher or lower than a standard. Also, the subject may be determined to have breast cancer if the quantitative values of all of the above target miRNAs, i.e., the target miRNA group, are higher or lower than a standard.
更なる実施形態の方法によれば、定量工程（Ｓ２２）の後に、第１実施形態と同様の予後再発判定工程（Ｓ２４）を含む。また、判定工程（Ｓ２３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ２４）の後、判定結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類選択、及び／又はその補助を行うことも可能である。さらに、方法は、判定工程（Ｓ２３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ２４）の後に、第１実施形態と同様の選択工程（Ｓ２５）を含む。ここで治療法又は薬剤は、乳がんの治療のためのものである。治療法の種類又は薬剤の種類は、治療法又は薬剤の使用量、タイミング若しくは期間を含む。 According to a further embodiment of the method, after the quantification step (S22), a prognosis recurrence determination step (S24) similar to that of the first embodiment is included. In addition, after the determination step (S23) and/or the prognosis recurrence determination step (S24), it is also possible to select and/or assist in the selection of a type of therapy or a type of drug to be applied to the subject according to the determination result. Furthermore, the method includes a selection step (S25) similar to that of the first embodiment after the determination step (S23) and/or the prognosis recurrence determination step (S24). Here, the therapy or drug is for the treatment of breast cancer. The type of therapy or drug includes the amount, timing, or duration of use of the therapy or drug.
複数種類の標的ｍｉＲＮＡは、配列番号１～１１２の何れかから選択される。複数種類の標的ｍｉＲＮＡの好ましい組み合わせは、対象の種類、試料の種類、検出及び定量方法の種類等の条件の違いによって異なり得る。特定の対象、試料、検出及び定量方法を用いて検出及び定量感度が良好な標的ｍｉＲＮＡの組み合わせを調査することで、特定の条件で好ましい組み合わせを決定することが可能である。多発現標的ｍｉＲＮＡと少発現標的ｍｉＲＮＡとを組み合わせることも可能である。 The multiple types of target miRNAs are selected from any of SEQ ID NOs: 1 to 112. A preferred combination of multiple types of target miRNAs may vary depending on conditions such as the type of subject, the type of sample, and the type of detection and quantification method. By investigating combinations of target miRNAs with good detection and quantification sensitivity using a specific subject, sample, and detection and quantification method, it is possible to determine a preferred combination under specific conditions. It is also possible to combine a highly expressed target miRNA with a low expressed target miRNA.
定量される標的ｍｉＲＮＡは、上記標的ｍｉＲＮＡ群から選択される、複数種類のｍｉＲＮＡであればよい。定量される複数種類の標的ｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、及びｍｉＲ－１２４６から選択される、何れか複数種類のｍｉＲＮＡである。又はｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｍｉＲ－１２６９ｂ、ｍｉＲ－１２７６、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－２４６７－３ｐ、ｍｉＲ－２９７、ｍｉＲ－３１２６－３ｐ、ｍｉＲ－３１５０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－３１７５、ｍｉＲ－３１７７－３ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１７－３ｐ、ｍｉＲ－３６４９、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－４３０５、ｍｉＲ－４４４０、ｍｉＲ－４４５６、ｍｉＲ－４４９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－４７０３－３ｐ、ｍｉＲ－４７３６、ｍｉＲ－５７９－３ｐ、ｍｉＲ－６０８３、ｍｉＲ－６８２５－３ｐ、ｍｉＲ－６８４５－５ｐ、ｍｉＲ－６８７１－５ｐ、及びｍｉＲ－７９７６から選択される、何れか複数種類のｍｉＲＮＡを用いることも好ましい。 The target miRNA to be quantified may be multiple types of miRNA selected from the above target miRNA group. The multiple types of target miRNA to be quantified include let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR -31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-467 7-5p, miR-4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-56 94, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, and miR-1246. or let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, mi R-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3 p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-47 33-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w , miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5694, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733 -3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, miR-1225-5p, miR-1269b, miR-1276, miR-139 -3p, miR-2467-3p, miR-297, miR-3126-3p, miR-3150b-3p, miR-31-5p, miR-3175, miR-3177-3p, miR-3609, miR-3617-3p, miR-3649, miR-3666, miR-4305, miR-4440, mi It is also preferable to use multiple types of miRNA selected from miR-4456, miR-449c-3p, miR-4703-3p, miR-4736, miR-579-3p, miR-6083, miR-6825-3p, miR-6845-5p, miR-6871-5p, and miR-7976.
ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、及びｍｉＲ－９８－３ｐから選択される、何れか複数種類のｍｉＲＮＡを用いることもまた好ましい。 let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR- 18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152-5 p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913- 3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-473 3-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR- 523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5694, miR- 5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, Any two or more of the following selected from miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, and miR-98-3p: It is also preferable to use miRNA.
（マーカー）
第２実施形態によれば、複数の標的ｍｉＲＮＡを含む、乳がん検出用マーカーが提供される。当該マーカーは、例えば、対象由来の試料中のその存在量を測定し定量値を得ることで、上記したように対象における乳がんの罹患の有無判定、予後又は再発の有無の判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うことができる。
(marker)
According to the second embodiment, a breast cancer detection marker is provided that includes multiple target miRNAs. The amount of the marker present in a sample derived from a subject is measured to obtain a quantitative value, which can be used to determine the presence or absence of breast cancer in the subject, to determine the prognosis or recurrence, or to select a treatment method or drug to be applied to the subject, as described above.
（キット）
第２実施形態によれば、乳がん検出用キットが提供される。当該キットは、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含む。各標的ｍｉＲＮＡをそれぞれ逆転写するための逆転写用（ＲＴ）プライマー、各標的ｍｉＲＮＡをそれぞれ伸長するための伸長用（ＥＬ）プライマー、各標的ｍｉＲＮＡをそれぞれ増幅するための増幅用プライマーセット及び各標的ｍｉＲＮＡをそれぞれ検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む。
(kit)
According to a second embodiment, a kit for detecting breast cancer is provided. The kit includes a nucleic acid capable of specifically binding to a target miRNA. The kit includes at least one nucleic acid selected from the group consisting of a reverse transcription (RT) primer for reverse transcribing each target miRNA, an extension (EL) primer for extending each target miRNA, an amplification primer set for amplifying each target miRNA, and a nucleic acid probe for detecting each target miRNA.
ＲＴプライマーは、各標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを得るためのプライマーである。ＲＴプライマーは、各標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列を含む。ＲＴプライマーは、各標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするためにｃＤＮＡに付加する人工配列を更に含んでもよい。 The RT primer is a primer for obtaining cDNA of each target miRNA. The RT primer contains a sequence complementary to at least a portion of the sequence of each target miRNA. The RT primer may further contain an artificial sequence that is added to the cDNA to facilitate amplification of the cDNA of each target miRNA.
第２実施形態によれば、複数種類のｍｉＲＮＡを検出及び定量することにより、その組み合わせによってはより感度よく乳がんの罹患の有無を判定することが可能であり得る。 According to the second embodiment, by detecting and quantifying multiple types of miRNA, it may be possible to determine the presence or absence of breast cancer with greater sensitivity depending on the combination.
・第３実施形態
（分析方法）
第３実施形態の分析方法は、図３の（ａ）に示すように、例えば
対象由来の試料を用意すること（用意工程（Ｓ３１））と、
対象由来の試料中の、第１実施形態に記載の標的ｍｉＲＮＡ群のうちの何れか１つ（すなわち、何れか１種の標的ｍｉＲＮＡ）を定量すること（定量工程（Ｓ３２））と、
対象が乳がん罹患体であるか、又は乳がん以外のがんの罹患体若しくは健常体であるかを判定すること（判定工程（Ｓ３３））とを含む、
乳がんの有無を判定する方法である。
Third embodiment (analysis method)
As shown in FIG. 3A, the analysis method of the third embodiment includes, for example, preparing a sample derived from a subject (preparation step (S31));
Quantifying any one of the target miRNAs described in the first embodiment (i.e., any one type of target miRNA) in a sample derived from a subject (quantification step (S32));
Determining whether the subject is a breast cancer patient, a cancer patient other than breast cancer, or a healthy subject (determination step (S33));
This is a method for determining whether or not breast cancer is present.
乳がん以外のがんを、以下ではまとめて「他がん」とも称する。例えば、他がんは、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆道がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮がん、腎臓がん、及び子宮頸がん等を含む。 Cancers other than breast cancer are collectively referred to below as "other cancers." For example, other cancers include colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, esophageal cancer, liver cancer, brain tumors, bladder cancer, prostate cancer, sarcoma, uterine cancer, kidney cancer, and cervical cancer.
第３実施形態の定量工程（Ｓ３２）は、第１実施形態の定量工程（Ｓ１２）と同様に行うことができる。対象及び試料は、第１実施形態と同様とすることができるが、対象は乳がん及び他がんの少なくとも１つに罹患している可能性がある動物、或いは過去に乳がん及び他がんの少なくとも１つに罹患したことのある動物等であってもよい。すなわち、健常な個体、乳がんに罹患した個体、及び他がんに罹患した個体を含む集団の中から無作為に選択した個体を対象としてもよい。 The quantification step (S32) of the third embodiment can be performed in the same manner as the quantification step (S12) of the first embodiment. The subject and sample can be the same as those of the first embodiment, but the subject may be an animal that may be afflicted with at least one of breast cancer and other cancers, or an animal that has previously been afflicted with at least one of breast cancer and other cancers. In other words, the subject may be an individual randomly selected from a population that includes healthy individuals, individuals afflicted with breast cancer, and individuals afflicted with other cancers.
第３実施形態の判定工程（Ｓ３３）では、標的ｍｉＲＮＡの定量値が高い又は低い場合、対象は他がんではなく乳がんに罹患していると判定され得る。定量値の高低は、例えば、第１実施形態と同様に予め得られた対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値又は閾値等を基準として判定されてもよい。多発現標的ｍｉＲＮＡの定量値が基準とほぼ同値かそれ未満である場合、又は少発現標的ｍｉＲＮＡの定量値が基準とほぼ同値かそれより高い場合、対象は乳がんに罹患していない健常体であるか、又は乳がんを併発していない他がん罹患体であると判定され得る。 In the determination step (S33) of the third embodiment, if the quantitative value of the target miRNA is high or low, the subject may be determined to be suffering from breast cancer and not from another cancer. The high or low quantitative value may be determined, for example, based on the quantitative value or threshold value of the target miRNA in a control previously obtained as in the first embodiment. If the quantitative value of the highly expressed target miRNA is approximately the same as or lower than the standard, or if the quantitative value of the poorly expressed target miRNA is approximately the same as or higher than the standard, the subject may be determined to be a healthy subject not suffering from breast cancer, or a subject suffering from another cancer without concomitant breast cancer.
第３実施形態における対照は、健常体であるか、又は他がん罹患体であることが好ましい。 In the third embodiment, the control is preferably a healthy subject or a subject suffering from another cancer.
また、第３実施形態における閾値は、例えば、乳がんに罹患しているか否かが既知である標準対象由来の同じ又は類似の試料、若しくは他がんの株化細胞を含む試料等から得られた標的ｍｉＲＮＡの定量値を基に、決定することができる。閾値は、例えば、乳がんに罹患している対象における定量値と、乳がんに罹患していない対照における定量値とを切り分けることができる標的ｍｉＲＮＡの定量値である。又は閾値は、乳がんに罹患している対象における定量値と他がんに罹患している対照における定量値とを切り分けることができる定量値であるとより好ましい。更に、閾値は、乳がんに罹患している対象における定量値と、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆道がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮がん、腎臓がん、及び子宮頸がんの少なくとも１つに罹患している対照における定量値とを切り分けることができる定量値であることが更により好ましい。 In addition, the threshold value in the third embodiment can be determined based on the quantitative value of the target miRNA obtained from, for example, the same or similar sample derived from a standard subject known to be affected by breast cancer, or a sample containing a cell line of another cancer. The threshold value is, for example, a quantitative value of the target miRNA that can distinguish between the quantitative value in a subject affected by breast cancer and the quantitative value in a control not affected by breast cancer. Or, more preferably, the threshold value is a quantitative value that can distinguish between the quantitative value in a subject affected by breast cancer and the quantitative value in a control affected by another cancer. Furthermore, it is even more preferable that the threshold value is a quantitative value that can distinguish between the quantitative value in a subject affected by breast cancer and the quantitative value in a control affected by at least one of colon cancer, stomach cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, esophageal cancer, liver cancer, brain tumor, bladder cancer, prostate cancer, sarcoma, uterine cancer, kidney cancer, and cervical cancer.
以上に説明した第３実施形態の分析方法によれば、対象由来の試料中の１種の標的ｍｉＲＮＡを定量することにより、簡便に対象が乳がん罹患体であるか、又は乳がん以外のがんの罹患体若しくは健常体であるかを判定することが可能である。言い換えれば、本方法によれば、他がんに罹患している又は健常体である検体を含む検体集団から乳がんに罹患した対象を識別することが可能である。 According to the analysis method of the third embodiment described above, by quantifying one type of target miRNA in a sample derived from a subject, it is possible to easily determine whether the subject is a breast cancer patient, a patient with a cancer other than breast cancer, or a healthy subject. In other words, according to this method, it is possible to identify subjects with breast cancer from a sample population that includes samples with other cancers or healthy subjects.
第３実施形態の分析方法は、図３の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ３２）の後、定量結果から対象における乳がんの予後又は再発の有無を判定する予後再発判定工程（Ｓ３４）を含んでもよい。また、図３の（ｄ）に示すように、判定工程（Ｓ３３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ３４）の後に、その結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ３５）を含んでもよい。 As shown in FIG. 3(c), the analysis method of the third embodiment may include a prognosis/recurrence determination step (S34) for determining the prognosis or the presence or absence of recurrence of breast cancer in the subject from the quantification result after the quantification step (S32). Also, as shown in FIG. 3(d), after the determination step (S33) and/or the prognosis/recurrence determination step (S34), a selection step (S35) for selecting a type of therapy or a type of drug to be applied to the subject according to the result may be included.
更なる実施形態によれば、対象由来の試料中の、標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ３２））を含む、対象が乳がん罹患体であるか、又は乳がん以外のがんの罹患体若しくは健常体であるかの判定を補助する方法も提供される。本方法によれば、対象における乳がんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うためのより精度の高い情報を取得することができる。 According to a further embodiment, there is also provided a method for assisting in determining whether a subject is a breast cancer patient, a patient with a cancer other than breast cancer, or a healthy subject, which comprises quantifying target miRNA in a sample derived from a subject (quantification step (S32)). According to this method, it is possible to obtain more accurate information for determining the presence or absence of breast cancer in a subject, determining the prognosis, determining the presence or absence of recurrence, or selecting a treatment method or drug to be applied to the subject.
第３実施形態によれば、乳がん検出用キットが提供される。当該キットは、第１実施形態と同様に、当該キットは、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含む。例えば、上記他のマーカーを検出するためのＲＴプライマー、ＥＬプライマー、増幅用プライマーセット及び／又は核酸プローブを更に含んでもよい。 According to the third embodiment, a kit for detecting breast cancer is provided. As in the first embodiment, the kit includes a nucleic acid capable of specifically binding to a target miRNA. For example, the kit may further include an RT primer, an EL primer, an amplification primer set, and/or a nucleic acid probe for detecting the other markers.
乳がん検出用キットによって定量される標的ｍｉＲＮＡは、上記標的ｍｉＲＮＡ群のうちの何れか１種類であればよい。換言すれば、乳がん検出用キットは、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、及びｍｉＲ－９８－３ｐか、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、及びｍｉＲ－１２４６から選択される何れか１つのｍｉＲＮＡに特異的に結合可能な核酸、並びに核酸を検出するための試薬等を含んでいればよい。 The target miRNA quantified by the breast cancer detection kit may be any one of the above target miRNAs. In other words, the breast cancer detection kit may be any one of let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR- 31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4 677-5p, miR-4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5692b, miR-5692c, miR-5692d, miR-5692e, miR-5692f, miR-5692g, miR-5692h, miR-5692i, miR-5692j ... iR-5694, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, and miR-98-3p, or let-7a-5p, let-7f-5p, let- 7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p ... iR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-548y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5694, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-5 99, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, and miR-1246; and a nucleic acid capable of specifically binding to any one of the miRNAs selected from the group consisting of miR-1246, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, and miR-1246; and a reagent for detecting the nucleic acid.
又は、乳がん検出用キットは、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－３１５２－５ｐ、ｍｉＲ－３１８９－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３８４、ｍｉＲ－３９１０、ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｍｉＲ－３９１５、ｍｉＲ－４２６７、ｍｉＲ－４２８２、ｍｉＲ－４４１７、ｍｉＲ－４４２５、ｍｉＲ－４４２７、ｍｉＲ－４４３３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４５２－５ｐ、ｍｉＲ－４６３２－３ｐ、ｍｉＲ－４６７７－５ｐ、ｍｉＲ－４７３３－３ｐ、ｍｉＲ－４７７５、ｍｉＲ－４７７７－３ｐ、ｍｉＲ－４７８２－５ｐ、ｍｉＲ－４８０３、ｍｉＲ－５００７－３ｐ、ｍｉＲ－５００９－５ｐ、ｍｉＲ－５１９５－５ｐ、ｍｉＲ－５１９ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５２３－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｆ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｗ、ｍｉＲ－５４８ｙ、ｍｉＲ－５５８０－５ｐ、ｍｉＲ－５５８４－５ｐ、ｍｉＲ－５５８６－５ｐ、ｍｉＲ－５６９２ａ、ｍｉＲ－５６９４、ｍｉＲ－５７００、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｍｉＲ－５９９、ｍｉＲ－６０６、ｍｉＲ－６５３－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－６７３３－３ｐ、ｍｉＲ－６７８２－３ｐ、ｍｉＲ－６７８４－３ｐ、ｍｉＲ－７１５１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０８７、ｍｉＲ－８８７－５ｐ、ｍｉＲ－８８９－３ｐ、ｍｉＲ－９４２－５ｐ、ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｍｉＲ－１２６９ｂ、ｍｉＲ－１２７６、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－２４６７－３ｐ、ｍｉＲ－２９７、ｍｉＲ－３１２６－３ｐ、ｍｉＲ－３１５０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－３１７５、ｍｉＲ－３１７７－３ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１７－３ｐ、ｍｉＲ－３６４９、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－４３０５、ｍｉＲ－４４４０、ｍｉＲ－４４５６、ｍｉＲ－４４９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－４７０３－３ｐ、ｍｉＲ－４７３６、ｍｉＲ－５７９－３ｐ、ｍｉＲ－６０８３、ｍｉＲ－６８２５－３ｐ、ｍｉＲ－６８４５－５ｐ、ｍｉＲ－６８７１－５ｐ、及びｍｉＲ－７９７６から選択される何れか１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイズする核酸、並びに核酸を検出するための試薬等を用いることも好ましい。 Or, the breast cancer detection kit is let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-1307-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203 a-3p, miR-208a-3p, miR-25-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-338-3p, miR-33a-5p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b -3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4282, miR-4417, miR-4425, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-4632-3p, miR-4677-5p, miR-4733- 3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao-5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-54 8y, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5694, miR-5700, miR-571, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6733-3p, miR-6782 -3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-887-5p, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, miR-1225-5p, miR-1269b, miR-1276, miR-139-3p, miR-2467-3p, m iR-297, miR-3126-3p, miR-3150b-3p, miR-31-5p, miR-3175, miR-3177-3p, miR-3609, miR-3617-3p, miR-3649, miR-3666, miR-4305, miR-4440, miR-4456, miR-449c-3p, miR It is also preferable to use a nucleic acid that hybridizes to any one of miRNAs selected from miR-4703-3p, miR-4736, miR-579-3p, miR-6083, miR-6825-3p, miR-6845-5p, miR-6871-5p, and miR-7976, as well as a reagent for detecting the nucleic acid.
ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２３８－５ｐ、ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｍｉＲ－３９３７、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－４６７４、ｍｉＲ－４７０７－３ｐ、ｍｉＲ－５６４、ｍｉＲ－６１５－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ及びｍｉＲ－７１０８－５ｐから選択されるｍｉＲＮＡは、乳がん罹患体と、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆道がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮がん、腎臓がん、及び子宮頸がんの罹患体とを識別する際に使用してもよい。 A miRNA selected from miR-1246, miR-1238-5p, miR-1307-3p, miR-3937, miR-4449, miR-4674, miR-4707-3p, miR-564, miR-615-5p, miR-6510-5p and miR-7108-5p may be used to distinguish between breast cancer patients and colorectal cancer, gastric cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, esophageal cancer, liver cancer, brain tumor, bladder cancer, prostate cancer, sarcoma, uterine cancer, kidney cancer and cervical cancer patients.
更なる実施形態によれば、第２実施形態と同様に、対象由来の試料中の複数種類の標的ｍｉＲＮＡを定量する定量工程を含む、対象が乳がん罹患体であるか、又は乳がん以外のがんの罹患体若しくは健常体であるかを判定する方法、及びその判定を補助する方法も提供される。 According to a further embodiment, similar to the second embodiment, there is also provided a method for determining whether a subject is a breast cancer patient, a patient with a cancer other than breast cancer, or a healthy subject, and a method for assisting in said determination, which includes a quantitative step of quantifying multiple types of target miRNA in a sample derived from a subject.
・第４実施形態
第４実施形態では、標的ｍｉＲＮＡを定量する工程の好ましい一例について説明する。この例において、標的ｍｉＲＮＡは第１実施形態に記載のｍｉＲＮＡとする。標的ｍｉＲＮＡを特異的に逆転写し、人工配列を付加して伸長し、伸長産物をＬＡＭＰ法により増幅し、得られた増幅産物を検出する。以下において、標的ｍｉＲＮＡの配列を「第１の配列」とも称する。
Fourth embodiment In the fourth embodiment, a preferred example of the step of quantifying a target miRNA will be described. In this example, the target miRNA is the miRNA described in the first embodiment. The target miRNA is specifically reverse transcribed, an artificial sequence is added and extended, the extension product is amplified by the LAMP method, and the obtained amplified product is detected. Hereinafter, the sequence of the target miRNA is also referred to as the "first sequence".
定量工程（Ｓ１）は、例えば、図４に示す次の工程を含む：
（Ｓ１－１）第１の配列とハイブリダイズする第１プライマー部、及び第１ＬＡＭＰ認識配列を含む逆転写用（ＲＴ）プライマーの、第１プライマー部を第１の配列とハイブリダイズさせ、第１の配列を逆転写し、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ（第１ａの配列）を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
（Ｓ１－２）逆転写産物と標的ｍｉＲＮＡとを解離させる解離工程、
（Ｓ１－３）第１ａの配列とハイブリダイズする第２プライマー部、及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用（ＥＬ）プライマーの第２プライマー部を逆転写産物の第１ａの配列とハイブリダイズさせ、ＥＬプライマー及び逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、第１ａの配列５の相補配列（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物を得る伸長工程、
（Ｓ１－４）伸長産物をＬＡＭＰ反応により増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１－５）得られた増幅産物を検出する検出工程。
The quantification step (S1) includes, for example, the following steps shown in FIG. 4:
(S1-1) a reverse transcription step of hybridizing a first primer portion of a reverse transcription (RT) primer, the first primer portion being hybridized with a first sequence and including a first LAMP recognition sequence, to the first sequence, reverse transcribing the first sequence, and obtaining a reverse transcription product including a cDNA (sequence 1a) of a target miRNA;
(S1-2) a dissociation step of dissociating the reverse transcription product from the target miRNA;
(S1-3) an extension step in which a second primer portion that hybridizes with sequence 1a and a second primer portion of an extension (EL) primer that includes a second LAMP recognition sequence are hybridized with sequence 1a of the reverse transcription product, and the EL primer and the reverse transcription product are extended using each other as a template to obtain an extension product that includes a complementary sequence of
(S1-4) an amplification step of amplifying the extension product by a LAMP reaction to obtain an amplification product; and (S1-5) a detection step of detecting the obtained amplification product.
以下、各工程について、図５を用いて詳細に説明する。 Each step is explained in detail below with reference to Figure 5.
逆転写工程（Ｓ１－１）には、例えば、ＲＴプライマー３、逆転写酵素、塩及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等の基質（必要に応じて反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオン）等を含む逆転写溶液が用いられる。逆転写酵素として、例えば、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、トランスクリプター逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）トランスクリプター逆転写酵素、又はＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素等を用いることができる。
In the reverse transcription step (S1-1), for example, a reverse transcription solution containing
ＲＴプライマー３は、第１プライマー部４ａ及び第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂを含む。第１プライマー部４ａは、第１の配列２とハイブリダイズして、第１の配列２を逆転写してｃＤＮＡ（第１ａの配列５）を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第１プライマー部４ａは、例えば、第１の配列２の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列の相補配列を有する。
The
第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂは、増幅工程（Ｓ１－４）において増幅用プライマーが結合する配列（認識配列）を含む核酸塩基配列である。認識配列は、一般にＬＡＭＰ増幅用のプライマーにおいて用いられるものであってもよい。例えば、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂは、第１プライマー部４ａ側から５’末端に向かう順番で、Ｂ１配列、Ｂ２配列、Ｂ３配列及び／又はＬＢ配列を含んでもよい。
The first
逆転写溶液中におけるＲＴプライマー３の濃度は、５～５０ｎＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。
The concentration of
逆転写工程（Ｓ１－１）においては、逆転写溶液と試料と混合し、例えば約１０℃～５５℃に維持することが好ましい。それによって、第１プライマー部４ａが第１の配列２とハイブリダイズし、第１の配列２を逆転写し、標的ｍｉＲＮＡ１のｃＤＮＡ（第１ａの配列５）を含む逆転写産物６が得られる。
In the reverse transcription step (S1-1), the reverse transcription solution is mixed with the sample and is preferably maintained at, for example, about 10°C to 55°C. As a result, the
解離工程（Ｓ１－２）は、例えば、逆転写後の反応液を８０℃～１００℃に加熱することによって行うことができる。この条件に維持することによって、逆転写産物６と標的ｍｉＲＮＡ１とが解離する。
The dissociation step (S1-2) can be carried out, for example, by heating the reaction solution after reverse transcription to 80°C to 100°C. By maintaining these conditions, the
伸長工程（Ｓ１－３）には、例えば、ＥＬプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を、逆転写産物６を含む伸長溶液が用いられる。
In the extension step (S1-3), for example, an extension solution containing EL primer 7, DNA polymerase, salts, substrates such as dNTPs (and optionally thickeners, pH adjusting buffers, surfactants and ions), and
ＥＬプライマー７は、第２プライマー部８ａ、及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂを含む。第２プライマー部８ａは、第１ａの配列５とハイブリダイズして、その相補配列９を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第２プライマー部８ａは、例えば、第１ａの配列５の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列の相補配列を有する。
The EL primer 7 includes a
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、増幅工程（Ｓ１－４）において増幅用プライマーが結合する配列（認識配列）を含む核酸塩基配列である。例えば、第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、第２プライマー部８ａ側から５’末端に向かう順番で、Ｆ１配列、Ｆ２配列、Ｆ３配列及び／又はＬＦ配列を含んでもよい。
The second
伸長溶液中におけるＥＬプライマー７の濃度は、５～１００ｎＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。 The concentration of EL primer 7 in the extension solution is preferably 5 to 100 nM. This concentration range can further improve the specificity and efficiency of the reaction.
伸長工程（Ｓ１－３）においては、伸長溶液と解離工程後の逆転写産物６を含む反応液とを混合し約１０℃～８０℃に維持することが好ましい。それによって、ＥＬプライマー７の第２プライマー部８ａが逆転写産物６の第１ａの配列５とハイブリダイズし、ＥＬプライマー７及び逆転写産物６が互いを鋳型として伸長し、第１ａの配列５の相補配列９（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物１０が得られる。
In the extension step (S1-3), it is preferable to mix the extension solution with a reaction solution containing the
第１プライマー部４ａ、第２プライマー部８ａは、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。これらを多く含むほどハイブリダイゼーションの結合力を強くすることができる。従って、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡの数は、ハイブリダイゼーションさせる配列との所望のＴｍ値に従って決定されればよい。例えば、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含ませると、より高い温度で逆転写工程（Ｓ１－１）及び伸長工程（Ｓ１－３）を行うことができ、非特異的な結合を抑制することが可能である。その結果より精度よく標的ｍｉＲＮＡを逆転写及び伸長することが可能である。
The
第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、下記の（１）～（７）の組み合わせで認識配列を含むことが好ましい。ここで、下記の各認識配列の順番は、第１プライマー部４ａ又は第２プライマー部８ａ側から５’末端に向かう順番である。「ｃ」は、その直前に記載された配列の相補配列を意味する。例えば、「ＬＢｃ配列」は、ＬＢ配列の相補配列を意味する。「ダミー配列」は、第１ａの配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、ＬＦ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列、ＬＢ配列及びその相補配列とは異なる塩基配列を有する核酸配列である。
（１）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（この場合、第１ａの配列の相補配列９の少なくとも１部をＬＢ配列とする。）
（２）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（３）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはダミー配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（４）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（５）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（６）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列及びＦ２配列を含む。
（７）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
The first
(1) the first
The second
(In this case, at least a part of the complementary sequence 9 of the sequence 1a is the LB sequence.)
(2) the first
The second
(3) the first
The second
(4) The first
The second
(5) the first
The second
(6) The first
The second
(7) The first
The second
ＲＴプライマー３の第１プライマー部４ａと第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂとの間、ＥＬプライマー７の第２プライマー部８ａと第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂとの間、及び／又は各ＬＡＭＰ認識配列に含まれる各認識配列の間には、スペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列は、第１ａの配列、各認識配列及びそれらの相補配列の配列とは異なり、かつ後述する伸長産物の増幅反応に悪影響を与えない核酸配列である。スペーサー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。例えば、スペーサー配列は、１塩基～１６塩基であり、ポリＴ配列又はポリＡ配列等であることが好ましい。
A spacer sequence may be present between the
増幅工程（Ｓ１－４）は、ＬＡＭＰ法を用いて行われる。この工程においては、例えば、増幅用プライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を含む増幅溶液が用いられる。 The amplification step (S1-4) is carried out using the LAMP method. In this step, an amplification solution is used that contains, for example, an amplification primer set, a strand-displacing DNA polymerase, salts, and substrates such as dNTPs (and, if necessary, a thickener, a pH adjusting buffer, a surfactant, and ions).
増幅用プライマーセットの種類及び配列は、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂの配列に従って選択される。例えば、増幅用プライマーセットは、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂの配列に対応するＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを含む。必要であれば、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー及び／又はＬＦプライマー若しくはＬＢプライマー等のループプライマーを更に含んでもよい。
The type and sequence of the amplification primer set are selected according to the sequences of the first
ＲＴプライマー３、及びＥＬプライマー７のＬＡＭＰ認識配列の組み合わせを上記（１）～（７）とする場合、増幅用プライマーセットは、以下の組み合わせとすることが好ましい。なお、下記（１）～（７）は、上記（１）～（７）にそれぞれ対応するものである。
（１）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー、
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
第１ａの配列の相補配列９を含むＬＢプライマー。
（２）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＢ配列を含むＬＢプライマー。
（３）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
第１ａの配列の相補配列９を含むＬＢプライマー。
（４）Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
（５）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及び第１ａの配列の相補配列９を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
（６）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及び第１ａの配列の相補配列９を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＢ配列を含むＬＢプライマー。
（７）Ｆ２配列及び第１ａの配列５を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
When the combination of the LAMP recognition sequences of the
(1) a FIP primer comprising an F2 sequence and an F1c sequence;
BIP primer comprising the B2 and B1c sequences, and LB primer comprising the complementary sequence 9 of sequence 1a.
(2) an FIP primer including an F2 sequence and an F1c sequence, a BIP primer including a B2 sequence and a B1c sequence, and an LB primer including an LB sequence.
(3) A FIP primer including an F2 sequence and an F1c sequence, a BIP primer including a B2 sequence and a B1c sequence, and a LB primer including a complementary sequence 9 of the 1a sequence.
(4) A FIP primer containing a B2 sequence and a B1c sequence, a BIP primer containing an F2 sequence and an F1c sequence, and an LF primer containing an LF sequence.
(5) A FIP primer including an F2 sequence and an F1c sequence; a BIP primer including a B2 sequence and a complementary sequence 9 of the 1a sequence; and a LF primer including an LF sequence.
(6) An FIP primer including an F2 sequence and an F1c sequence; a BIP primer including a B2 sequence and a complementary sequence 9 of the 1a sequence; and an LB primer including an LB sequence.
(7) An FIP primer comprising an F2 sequence and
上記（１）の組み合わせとする場合がより好ましい。 The combination of (1) above is more preferable.
増幅工程（Ｓ１－４）においては、伸長産物１０を含む溶液と、増幅溶液との混合物を等温増幅反応条件下で維持する。例えば、等温増幅条件は、温度５０～７５℃の等温を３０～９０分間などとすればよいが、温度は、６０～７０℃であることが好ましい。それにより伸長産物１０が増幅され、標的ｍｉＲＮＡ１のｃＤＮＡ（第１ａの配列５）及びその相補配列を含む増幅産物が得られる。
In the amplification step (S1-4), a mixture of the solution containing the
検出工程（Ｓ１－５）は、増幅工程（Ｓ１－４）中に経時的に増幅産物の増加に応じて変化する信号を検出し、信号の立ち上がり時間を測定し、その結果標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことが好ましい。経時的とは、連続的であってもよいし、所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。 The detection step (S1-5) preferably involves detecting a signal that changes over time during the amplification step (S1-4) in response to an increase in the amplified product, measuring the rise time of the signal, and quantifying the target miRNA as a result. "Over time" may mean either continuous or detection at multiple points in time at desired time intervals.
信号として、例えば反応液の濁度、又は反応液からの光学的信号若しくは電気化学的信号等を用いることが好ましい。光学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する光学的信号を生ずる標識物質の存在下で増幅反応を行うことが好ましい。この場合、標識物質は、例えば蛍光試薬又はインターカレータ等の指示薬である。電気化学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する電気化学的信号を生ずる標識物質の存在下で増幅反応を行うことが好ましい。この場合、標識物質は、例えばレドックスプローブ等である。 As the signal, it is preferable to use, for example, the turbidity of the reaction solution, or an optical signal or an electrochemical signal from the reaction solution. When an optical signal is used, it is preferable to carry out the amplification reaction in the presence of a labeling substance that generates an optical signal that changes in response to an increase in the amplified product. In this case, the labeling substance is, for example, an indicator such as a fluorescent reagent or an intercalator. When an electrochemical signal is used, it is preferable to carry out the amplification reaction in the presence of a labeling substance that generates an electrochemical signal that changes in response to an increase in the amplified product. In this case, the labeling substance is, for example, a redox probe.
検出は、例えば、検出用デバイスを用いて行うことが好ましい。検出用デバイスは、例えばチップを含む。チップは、標的ｍｉＲＮＡを増幅し、増幅産物を検出する増幅検出部であり、例えば、基板と、基板の１つの面上に備えられた１つ以上の検出領域とを備える。例えば、前記１つの面上で逆転写工程（Ｓ１－１）～増幅工程（Ｓ１－４）を行うことができ、増幅産物が存在すると、検出領域で信号を検出することができる。また、検出デバイスは増幅検出部で得られた検出の結果から標的ｍｉＲＮＡの定量値を算出する算出部を更に備え得る。 Detection is preferably performed using, for example, a detection device. The detection device includes, for example, a chip. The chip is an amplification detection unit that amplifies the target miRNA and detects the amplification product, and includes, for example, a substrate and one or more detection regions provided on one surface of the substrate. For example, the reverse transcription step (S1-1) to the amplification step (S1-4) can be performed on the one surface, and if an amplification product is present, a signal can be detected in the detection region. In addition, the detection device may further include a calculation unit that calculates a quantitative value of the target miRNA from the detection result obtained in the amplification detection unit.
検出領域は、光学的信号を用いる場合、例えば光学センサである。検出領域は、電気化学的信号を用いる場合、例えば電極である。電極は、例えば金であれば感度が良好であるため好ましい。 When an optical signal is used, the detection region is, for example, an optical sensor. When an electrochemical signal is used, the detection region is, for example, an electrode. The electrode is preferably, for example, gold, since it has good sensitivity.
検出領域の付近には標的ｍｉＲＮＡを逆転写するための逆転写用プライマー、標的ｍｉＲＮＡを伸長するための伸長用プライマー及び／又は標的ｍｉＲＮＡを増幅するための増幅用プライマーセットが遊離可能に固定されていてもよい。 A reverse transcription primer for reverse transcribing the target miRNA, an extension primer for extending the target miRNA, and/or an amplification primer set for amplifying the target miRNA may be releasably immobilized near the detection region.
また、検出工程（Ｓ１－５）には、核酸プローブを用いてもよい。核酸プローブは増幅産物とハイブリダイズする配列を有し、核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションを検出することにより、増幅産物を検出することができる。例えば、上記検出用デバイスの検出領域付近に核酸プローブが固定されていてもよい。 A nucleic acid probe may also be used in the detection step (S1-5). The nucleic acid probe has a sequence that hybridizes with the amplified product, and the amplified product can be detected by detecting hybridization between the nucleic acid probe and the amplified product. For example, the nucleic acid probe may be fixed near the detection region of the detection device.
次に、検出工程（Ｓ１－５）で得られた信号の立ち上がり時間から試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量する。例えば、立ち上がり時間が早いほど標的ｍｉＲＮＡの存在量が多いと決定することができる。例えば、立ち上がり時間と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて、試料中の標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことが好ましい。 Next, the target miRNA in the sample is quantified based on the rise time of the signal obtained in the detection step (S1-5). For example, it can be determined that the earlier the rise time, the greater the amount of target miRNA present. For example, it is preferable to quantify the target miRNA in the sample using a calibration curve that shows the relationship between the rise time and the amount of target miRNA present.
以上に説明した第４実施形態の定量工程によれば、標的ｍｉＲＮＡをより特異的かつ効率的に逆転写し、伸長し、増幅し、検出することができる。したがって、第１実施形態の定量工程（Ｓ１２）、第２実施形態の定量工程（Ｓ２２）及び第３実施形態の定量工程（Ｓ３２）を第４実施形態の定量工程で行うことにより、より精度よく乳がんの罹患の有無を判定、又は判定の補助、並びに他がんとの識別を行うことが可能である。 According to the quantification process of the fourth embodiment described above, the target miRNA can be reverse transcribed, extended, amplified, and detected more specifically and efficiently. Therefore, by performing the quantification process (S12) of the first embodiment, the quantification process (S22) of the second embodiment, and the quantification process (S32) of the third embodiment in the quantification process of the fourth embodiment, it is possible to more accurately determine the presence or absence of breast cancer, or to assist in the determination, and to distinguish it from other cancers.
更なる実施形態において、個体毎にｍｉＲＮＡ全体の活動レベルが異なる場合があること、及び、検体の処理において抽出や増幅反応の収率が細胞や検体の種類ごとに異なる場合がある。そのため、定量工程で得られた定量値は判定工程に用いる前に、対象由来の試料及び対照由来の試料に共通して存在するｍｉＲＮＡ（以下、「標準ｍｉＲＮＡ」と称する）の定量値をもって補正することが好ましい。具体的には、乳がん以外の他がん及び健常体において発現量が多いことが知られているｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ（配列番号３２０）の定量値を用いて補正を行うとよい。詳述すると、各標的ｍｉＲＮＡ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐの定量値から両者の濃度を算出し、さらに、各標的ｍｉＲＮＡの濃度からｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐの濃度を除することで正規化した濃度を発現量の指標とするように補正し、乳がん・健常者・乳がん以外他のがんの群間でその発現量比を求めるとよい。 In a further embodiment, the overall activity level of miRNA may differ for each individual, and the yield of extraction and amplification reactions in sample processing may differ for each type of cell or sample. Therefore, it is preferable to correct the quantitative value obtained in the quantification step using the quantitative value of a miRNA (hereinafter referred to as "standard miRNA") that is commonly present in the subject-derived sample and the control-derived sample before using it in the determination step. Specifically, the quantitative value of hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 320), which is known to be highly expressed in cancers other than breast cancer and healthy subjects, may be used for correction. In detail, the concentrations of both are calculated from the quantitative values of each target miRNA and hsa-miR-486-5p, and further, the concentration normalized by subtracting the concentration of hsa-miR-486-5p from the concentration of each target miRNA is corrected to be an index of expression level, and the expression level ratio is obtained between the groups of breast cancer, healthy subjects, and cancers other than breast cancer.
第４実施形態に係る方法において、乳がんの罹患の有無を判定するためのキットが提供される。このキットは、例えば、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含み、例えば上記の何れかのＲＴプライマー３、ＥＬプライマー７、増幅用プライマーセット、及び／又は核酸プローブを含むことが好ましい。
In the method according to the fourth embodiment, a kit for determining the presence or absence of breast cancer is provided. This kit preferably includes, for example, a nucleic acid capable of specifically binding to a target miRNA, and includes, for example, any of the above-mentioned
また、第４実施形態に係るキットは、補正用のｍｉＲＮＡを定量するためのプライマーセット又は核酸プローブを含んでもよい。 The kit according to the fourth embodiment may also include a primer set or a nucleic acid probe for quantifying the correction miRNA.
更なる実施形態によれば、伸長工程（Ｓ１－３）において１つの試料中の、塩基配列の異なる複数種類の標的ｍｉＲＮＡを伸長する。その場合、第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡ用プライマーセットが用いられる。第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡ伸長用プライマーセットはそれぞれ、第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡにそれぞれ含まれる第１１～第１ｎの配列をそれぞれ伸長するための第１１～第１ｎの伸長用プライマーと、第２１～第２ｎの伸長用プライマーを含む。ここで、ｎは２以上の整数である。 According to a further embodiment, in the extension step (S1-3), multiple types of target miRNAs with different base sequences in one sample are extended. In this case, primer sets for 1st to nth target miRNAs are used. The primer sets for 1st to nth target miRNA extension each include extension primers 11 to 1n and extension primers 21 to 2n for extending sequences 11 to 1n contained in the 1st to nth target miRNAs, respectively. Here, n is an integer of 2 or more.
この場合、例えば、前記１つの試料をｎ等分に分注し、そこにそれぞれ第１１～第１ｎの伸長用プライマーを添加して第１１～第１ｎの反応液を調製し、第１の伸長反応を行った後、各反応液において第２１～第２ｎの伸長用プライマーを用いて第２の伸長反応を行ってもよい。又は、試料及び第１１～第１ｎの伸長用プライマーの全てを含む第１の伸長反応液を調製し、第１の伸長反応を行った後、反応液をｎ等分に分注し、それぞれに第２１～第２ｎの伸長用プライマー添加して第２１～第２ｎの反応液を調製し、第２の伸長反応を行ってもよい。或いは、試料及び第１１～第１ｎの伸長用プライマーを含む第１の伸長反応液において第１の伸長反応を行い、反応液を分注せずにその反応液において第２１～第２ｎの伸長用プライマーを用いて第２の伸長反応を行ってもよい。詳しくは後述するが、このように反応液を分注しない場合、伸長産物を増幅する工程において反応液をｎ等分に分注するか又は電気化学検出用デバイスを用いることによって、ｎ種類の標的ｍｉＲＮＡを区別して検出することができる。 In this case, for example, the one sample may be dispensed into n equal portions, extension primers 11 to 1n are added thereto to prepare reaction solutions 11 to 1n , a first extension reaction may be performed, and then extension primers 21 to 2n may be used in each reaction solution to perform a second extension reaction. Alternatively, a first extension reaction solution containing the sample and all of extension primers 11 to 1n may be prepared, and after the first extension reaction is performed, the reaction solution may be dispensed into n equal portions, extension primers 21 to 2n are added thereto to prepare reaction solutions 21 to 2n , and then a second extension reaction may be performed. Alternatively, the first extension reaction may be carried out in a first extension reaction solution containing the sample and extension primers 11 to 1n , and the second extension reaction may be carried out in the reaction solution using extension primers 21 to 2n without dispensing the reaction solution. As will be described in detail later, when the reaction solution is not dispensed in this manner, the n types of target miRNA can be detected in a differentiated manner by dispensing the reaction solution into n equal portions in the step of amplifying the extension product or by using an electrochemical detection device.
更なる実施形態によれば、検出工程（Ｓ１－５）において、１種類の試料に含まれる、塩基配列の異なる複数種類の標的ｍｉＲＮＡを検出する。その場合、第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡ検出用プライマーセットが使用される。第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡ検出用プライマーセットはそれぞれ、第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡにそれぞれ含まれる第１１～第１ｎの配列をそれぞれ伸長するための第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡ伸長用プライマーセットと、第１～第ｎの標的ｍｉＲＮＡ伸長用プライマーセットを用いてそれぞれ得られる第１～第ｎの伸長産物をそれぞれ増幅するための第１～第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットとをそれぞれ含む。ここで、ｎは２以上の整数である。 According to a further embodiment, in the detection step (S1-5), multiple types of target miRNAs having different base sequences contained in one type of sample are detected. In this case, first to nth target miRNA detection primer sets are used. The first to nth target miRNA detection primer sets each include a first to nth target miRNA extension primer set for extending the 1 1 to 1 n sequences contained in the first to nth target miRNAs, respectively, and a first to nth LAMP amplification primer set for amplifying the first to nth extension products obtained, respectively, using the first to nth target miRNA extension primer sets. Here, n is an integer of 2 or more.
例えば、伸長工程（Ｓ１－３）において、ｎ種類の伸長産物をそれぞれ含むｎ種類の反応液を作成した場合には、それぞれにおいて、第１～第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを用いて第１～第ｎの増幅産物を得て、各増幅産物の存在量を検出すればｎ種類の標的配列を区別して検出することができる。 For example, if n types of reaction solutions each containing n types of extension products are prepared in the extension step (S1-3), the first to nth amplification products are obtained using the first to nth LAMP amplification primer sets in each reaction solution, and the amount of each amplification product is detected, allowing the n types of target sequences to be distinguished and detected.
或いは、伸長工程（Ｓ１－３）において、ｎ種類の伸長産物を含む１つの反応液を作成した場合、例えば、電気化学検出用デバイスを用いてｎ種類の伸長産物を区別して検出することができる。電気化学検出用デバイスは、１つの面上に少なくともｎ個の電極を備える基板を備えるチップを含む。各電極の付近の前記１つの面上には、それぞれ第１～第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットが遊離可能に固定されている。前記ｎ種類の伸長産物を含む１つの反応液に、電気化学的信号を生じる標識物質を添加し、この反応液を基板の前記１つの面上に持ち込み、反応液を等温増幅条件で維持することによって、各電極において、それぞれ第１～第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットによる対応した伸長産物の増幅反応が行われる。従って、各電極の電気化学的信号の立ち上がり時間を測定することによって、ｎ種類の標的ｍｉＲＮＡを区別して検出及び定量することができる。 Alternatively, when a single reaction solution containing n types of extension products is prepared in the extension step (S1-3), the n types of extension products can be detected in a differentiated manner, for example, using an electrochemical detection device. The electrochemical detection device includes a chip having a substrate with at least n electrodes on one surface. On the one surface near each electrode, the first to nth LAMP amplification primer sets are releasably fixed. A labeling substance that generates an electrochemical signal is added to a single reaction solution containing the n types of extension products, the reaction solution is brought onto the one surface of the substrate, and the reaction solution is maintained under isothermal amplification conditions, whereby an amplification reaction of the corresponding extension product is carried out at each electrode using the first to nth LAMP amplification primer sets. Therefore, by measuring the rise time of the electrochemical signal at each electrode, the n types of target miRNA can be detected and quantified in a differentiated manner.
・第５実施形態
第５実施形態では、第４実施形態に示した以外の、標的ｍｉＲＮＡを定量する工程の好ましい一例について説明する。この例においては、標的ｍｉＲＮＡを特異的に逆転写し、人工配列を付加して伸長することで得られた伸長産物を、ＮＧＳ法による塩基配列解析により検出する。
Fifth embodiment In the fifth embodiment, a preferred example of a step of quantifying a target miRNA other than that shown in the fourth embodiment will be described. In this example, the target miRNA is specifically reverse transcribed, and an artificial sequence is added to elongate the miRNA to obtain an extension product, which is then detected by analyzing the base sequence using the NGS method.
使用する次世代シーケンサーは、例えば、ＭｉＳｅｑ（登録商標）シリーズ又はＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５５０（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）等のシーケンサー、又は１分子シーケンサー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製等）などを使用できるがこれに限定されるものではない。 The next-generation sequencer used may be, for example, a sequencer such as the MiSeq (registered trademark) series or NextSeq (registered trademark) 550 (manufactured by Illumina), or a single molecule sequencer (manufactured by Pacific Biosciences, etc.), but is not limited to these.
標的ｍｉＲＮＡにアライメントされたリード数を算出することで、ｍｉＲＮＡ量を定量し比較することができる。すなわち、標的ｍｉＲＮＡの配列を持つリードを網羅的に定量し、そのリード数を比較することができる。検体間の比較の際は、リード数をＴＭＭ法やＲＰＫＭ正規化法などで規格化し比較することができる。 By calculating the number of reads aligned to the target miRNA, it is possible to quantify and compare the amount of miRNA. In other words, it is possible to comprehensively quantify reads that have the sequence of the target miRNA and compare the number of reads. When comparing samples, the number of reads can be normalized using the TMM method or RPKM normalization method, etc., and then compared.
解析には単にリード数や規格化値を比較し有意差検定を行う手法や、ＤＥＳｅｑやＥｄｇｅＲなどのトランスクリプトーム解析用プラットフォーム、あるいはＥＺＲ（Ｅａｓｙ Ｒ）やＪＭＰ（登録商標）などの医療統計用ソフトウェア、あるいはフィッシャーの判別分析、マハラノビス距離による非線形判別分析、ニューラルネットワーク、ランダムフォレストなどの機械学習などを用いて判別式を作成する方法が利用できるが、以上の手法に限定されるものではない。 For the analysis, a method of simply comparing the number of reads or normalized values and performing a significance test, a transcriptome analysis platform such as DESeq or EdgeR, medical statistics software such as EZR (Easy R) or JMP (registered trademark), or a method of creating a discriminant equation using Fisher's discriminant analysis, nonlinear discriminant analysis using Mahalanobis distance, neural networks, random forests, or other machine learning can be used, but the methods are not limited to those mentioned above.
次世代シーケンサーで解析する前に、目的のｍｉＲＮＡ配列のみを濃縮するターゲットシーケンス解析を実施することもできる。 Prior to analysis with a next-generation sequencer, targeted sequencing analysis can also be performed to enrich only the desired miRNA sequences.
ＮＧＳ法は、複数の対象からの抽出物を混合した試料中の塩基配列を、超並列的に解析することが可能であり、さらに、その塩基配列がどの検体由来であるかを１回の分析で特定することが可能な塩基配列解析法である。従って、第５実施形態の分析方法によれば、複数の対象中の、１種類又は複数種類の標的ｍｉＲＮＡを定量し判定することができるため、より簡便かつより高速に対象における乳がん罹患の有無を分析することが可能である。 The NGS method is a base sequence analysis method that can analyze the base sequences in a sample that is a mixture of extracts from multiple subjects in a massively parallel manner, and can further identify which specimen the base sequence originates from in a single analysis. Therefore, according to the analysis method of the fifth embodiment, one or more types of target miRNAs in multiple subjects can be quantified and determined, making it possible to more simply and quickly analyze the presence or absence of breast cancer in a subject.
［例］
以下に、本実施形態の分析方法又はキットを用いて行った実験について記載する。
[example]
The following describes experiments carried out using the analysis method or kit of the present embodiment.
例１．乳がん患者と、健常者及びその他がん患者とを識別するｍｉＲＮＡマーカーの包括的な探索
（検体の用意） 試料として、計３７６検体の乳がん患者血清、健常者血清、およびその他がん患者血清を用意した。それぞれの検体数は、乳がん患者血清２４検体、健常者血清３０検体、その他がん患者血清３２２検体であり、その他がん患者血清の内訳は、大腸がん２４、胃がん２４、肺がん１８、卵巣がん２４、膵臓がん２４、胆道がん２４、食道がん２４、肝臓がん３、脳腫瘍２４、膀胱がん２４、前立腺がん２４、肉腫２４、子宮がん２４、腎臓がん２４、子宮頸がん１３であった（表２参照）。
Example 1. Comprehensive search for miRNA markers that distinguish between breast cancer patients, healthy subjects, and other cancer patients (Preparation of samples) A total of 376 samples of serum from breast cancer patients, healthy subjects, and other cancer patients were prepared as samples. The number of samples was 24 serum from breast cancer patients, 30 serum from healthy subjects, and 322 serum from other cancer patients. The breakdown of serum from other cancer patients was 24 colon cancer, 24 stomach cancer, 18 lung cancer, 24 ovarian cancer, 24 pancreatic cancer, 24 biliary tract cancer, 24 esophageal cancer, 3 liver cancer, 24 brain tumor, 24 bladder cancer, 24 prostate cancer, 24 sarcoma, 24 uterine cancer, 24 kidney cancer, and 13 cervical cancer (see Table 2).
（検体の処理）
すべての血清３００μLから、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔを用いてｍｉＲＮＡを抽出した。抽出したｍｉＲＮＡのライブラリー調製はＱＩＡｓｅｑ（登録商標） ｍｉＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（キアゲン製）およびＱＩＡｓｅｑ ｍｉＲＮＡ ＮＧＳ ９６ Ｉｎｄｅｘ ＩＬ（キアゲン製）を用いてプロトコルに従って実施した。
(Sample processing)
miRNA was extracted from 300 μL of all serum samples using the miRNeasy Serum/Plasma Kit. Library preparation of the extracted miRNA was performed using the QIAseq® miRNA Library Kit (Qiagen) and QIAseq miRNA NGS 96 Index IL (Qiagen) according to the protocol.
（ＮＧＳ解析によるｍｉＲＮＡの検出）
ＮＧＳ解析はＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００（シングルエンド、７５ｂｐ）を用いて実施し、全検体について１０００万リード以上のデータを得た。得られたリードデータはＧｅｎｅＧｌｏｂｅ（登録商標）： Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ（キアゲン製）を用いて解析した。具体的には分子バーコードを用いてＰＣＲ Ｄｕｐｌｉｃａｔｅを除いた後、ＵＣＳＣ Ｈｕｍａｎ ｈｇ３８に対してアライメントを実施し、アノテーションはｍｉＲＢａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ２１を元に実施した。計３７６検体のＮＧＳ解析結果からは、２５５８種類のｍｉＲＮＡが同定できた。
(Detection of miRNA by NGS analysis)
NGS analysis was performed using NextSeq® 500 (single-end, 75 bp), and data of more than 10 million reads was obtained for all samples. The obtained read data was analyzed using GeneGlobe®: Data Analysis Center (Qiagen). Specifically, after removing PCR duplicates using molecular barcodes, alignment was performed on UCSC Human hg38, and annotation was performed based on miRBase Release 21. From the NGS analysis results of a total of 376 samples, 2558 types of miRNAs were identified.
（ｍｉＲＮＡマーカーの統計的選別方法）
同定した２５５８種類のｍｉＲＮＡの検体ごとのリードカウントを用いた計算及び統計解析は、Ｒ言語４．０．２（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ （２０１３）．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を用いて実施した。
(Statistical Selection Method for miRNA Markers)
Calculations and statistical analyses using the read counts for each sample of the identified 2558 miRNAs were performed using R language 4.0.2 (R Development Core Team (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, URL http://www.R-project.org/).
まず、乳がん検体と他検体との間で発現量に大きな差異があったｍｉＲＮＡを選別するために、ＤＥＳｅｑ２パイプライン（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ.ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ＤＥＳｅｑ２.ｈｔｍｌ）により標準化したのち二群間比較を行った。二群間比較の結果を図６に示す。発現比の絶対値（Ｌｏｇ２ Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ）が０．５以上を満たすｍｉＲＮＡ（図６中、２群間のｍｉＲＮＡ量比が０．５以上を満たす領域（６ａ）内に位置する各点、及び２群間のｍｉＲＮＡ量比が－０．５以下を満たす領域（６ｂ）内に位置する各点）は、計３１９種類に上った。 First, to select miRNAs whose expression levels differed significantly between breast cancer samples and other samples, the miRNAs were standardized using the DESeq2 pipeline (http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html) and then compared between the two groups. The results of the comparison between the two groups are shown in Figure 6. There were a total of 319 types of miRNAs whose absolute expression ratio (Log2 Fold Change) was 0.5 or more (points located within the region (6a) in Figure 6 where the miRNA quantity ratio between the two groups was 0.5 or more, and points located within the region (6b) where the miRNA quantity ratio between the two groups was -0.5 or less).
これら３１９種類のｍｉＲＮＡについて、その変化率が統計的に有意であるかの基準として下記の２段階の数値基準を設定した。１段階目として、Ｗａｌｄ検定を繰り返し行う多重比較に伴う第一種の過誤の確率の増大を補正したｐａｄｊを用い、ｐ値＜０．０１を満たすｍｉＲＮＡを選別した。各ｍｉＲＮＡにおけるｐ値はＤＥＳｅｑ２パイプラインを用いて算出した。２段階目として、まず、ｐ値＜０．０１を満たすｍｉＲＮＡを用いた乳がんの検出感度及び特異度を算出し、その感度及び特異度に基づいたＲＯＣ（受信者動作特性試験、ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を作成した。続いて、ＲＯＣ曲線のＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）値を算出し、ＡＵＣ＞０．７を満たす遺伝子を乳がん検出用マーカーの候補として選定した。 For these 319 miRNAs, the following two-stage numerical criteria were set as a criterion for whether the change rate was statistically significant. In the first stage, miRNAs that satisfied a p-value of <0.01 were selected using padj, which corrects the increase in the probability of type I error associated with multiple comparisons performed repeatedly using the Wald test. The p-value for each miRNA was calculated using the DESeq2 pipeline. In the second stage, the detection sensitivity and specificity of breast cancer using miRNAs that satisfied a p-value of <0.01 were first calculated, and a ROC (receiver operating characteristic) curve was created based on the sensitivity and specificity. Next, the AUC (area under the curve) value of the ROC curve was calculated, and genes that satisfied an AUC>0.7 were selected as candidates for breast cancer detection markers.
感度、特異度及びＡＵＣ値は、ＥＺＲを使用し、Ｋａｎｄａ．Ｙ（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１３： ４８， ４５２－４５８）に倣って算出した。また、閾値は、（感度＋特異度）を最大にする閾値を選択するＹｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘと、ＲＯＣ曲線の左上隅からの距離（＝｛（１－感度）２＋（１－特異度）２｝）が最小になる閾値を選択する最小距離法との２種類の方法で設定した。 The sensitivity, specificity and AUC values were calculated using EZR following Kanda. Y (Bone Marrow Transplantation 2013: 48, 452-458). The threshold was set using two methods: the Youden Index, which selects the threshold that maximizes (sensitivity + specificity), and the minimum distance method, which selects the threshold that minimizes the distance from the upper left corner of the ROC curve (= {(1-sensitivity) 2 + (1-specificity) 2 }).
（ｍｉＲＮＡマーカーの選別結果） ３１９種類のｍｉＲＮＡについて、それぞれの発現比の絶対値、ｐ値、ＡＵＣ値、閾値、特異度及び感度についての算出結果を表３－１～表３－１２に示す。配列番号１１３～３１９のｍｉＲＮＡは、ｐ値及びＡＵＣ値による選定基準を満たさなかった。一方、配列番号１～１１２のｍｉＲＮＡは、ｐ値及びＡＵＣ値による選定基準を満たしていることから、乳がんに罹患した検体を有意に検出できることが分かった。また、配列番号１～１１２のｍｉＲＮＡのそれぞれの感度は、既存の腫瘍マーカーであるＣＥＡの感度（＝１５．７３％）を超えており、配列番号１～１１２のｍｉＲＮＡの検出感度が優れていることが示された。 (Selection results of miRNA markers) The calculation results of the absolute expression ratio, p-value, AUC value, threshold, specificity, and sensitivity of each of the 319 types of miRNAs are shown in Tables 3-1 to 3-12. The miRNAs of SEQ ID NOs: 113 to 319 did not meet the selection criteria based on p-value and AUC value. On the other hand, the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 112 met the selection criteria based on p-value and AUC value, and therefore were found to be capable of significantly detecting specimens affected by breast cancer. In addition, the sensitivity of each of the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 112 exceeded the sensitivity of CEA, an existing tumor marker (=15.73%), demonstrating that the detection sensitivity of the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 112 is excellent.
例えば、ｈｓｐ－ｍｉＲ－３６０９（配列番号９７）の発現量測定値について、乳がん検体と、健常体及び１５種類の他がん検体とで比較した場合、乳がん患者群の発現量測定値は他方の群よりも有意に（ｐ＝１．２１Ｅ－１６）低いことが分かった（図７参照）。また、このｈｓｐ－ｍｉＲ－３６０９の発現量測定値をもとに作成したＲＯＣ曲線（図８参照）によれば、そのＡＵＣ値は０．９４２であった。Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘにより閾値を決定した場合、その閾値は５．６７であり、感度及び特異度はそれぞれ１００％及び８１．８％であった。また、距離最小法により閾値を決定した場合、その閾値は５．６７であり、感度及び特異度はそれぞれ８７．５％及び８９．２％であった。これらの結果から、ｈｓｐ－ｍｉＲ－３６０９が、乳がん患者群と、健常者および他がん患者群とを識別するためのマーカーとして優れていることが示された。 For example, when comparing the expression level measurements of hsp-miR-3609 (SEQ ID NO: 97) between breast cancer samples, healthy subjects, and 15 other cancer samples, the expression level measurements of the breast cancer patient group were found to be significantly (p = 1.21E-16) lower than the other groups (see Figure 7). In addition, according to the ROC curve (see Figure 8) created based on the expression level measurements of this hsp-miR-3609, the AUC value was 0.942. When the threshold was determined by the Youden Index, the threshold was 5.67, and the sensitivity and specificity were 100% and 81.8%, respectively. When the threshold was determined by the minimum distance method, the threshold was 5.67, and the sensitivity and specificity were 87.5% and 89.2%, respectively. These results indicate that hsp-miR-3609 is an excellent marker for distinguishing breast cancer patients from healthy individuals and patients with other cancers.
以上の結果から、配列番号１～１１２のｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量することで、既存の腫瘍マーカーであるＣＥＡを上回る感度で、かつ健常体及び１５種類の他がん検体を含む検体集団から乳がん検体を識別できることが示された。 These results show that by quantifying at least one miRNA selected from the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 112, breast cancer samples can be distinguished from a sample group containing healthy subjects and 15 types of other cancer samples with a sensitivity higher than that of CEA, an existing tumor marker.
例２．初期段階の乳がんと、他がんの初期段階の患者および健常者の集団を識別するｍｉＲＮＡマーカーの包括的な分析 本例では、例１において乳がん患者群を健常者及び他がん患者の群と識別するためのマーカーとして優れていることが示された、配列番号１～１１２のｍｉＲＮＡが、乳がんの初期段階である臨床病期（ステージ）０又は１であっても識別できるかどうかについて分析した。 Example 2. Comprehensive analysis of miRNA markers for distinguishing early-stage breast cancer from early-stage patients of other cancers and healthy subjects In this example, we analyzed whether the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 112, which were shown in Example 1 to be excellent markers for distinguishing breast cancer patients from healthy subjects and patients with other cancers, can distinguish even early-stage breast cancer, clinical stage 0 or 1.
（検体の用意）
表２に示す検体のうち、ステージ０又は１の乳がん及び他がん検体のデータ、並びに健常者のデータを使用することで、健常者と乳がん以外の他がんの初期段階の患者とを含む集団から乳がんの初期段階の患者を識別可能であるかを、例１と同様の方法で検証した。
(Preparation of specimen)
Among the samples shown in Table 2, data from stage 0 or 1 breast cancer and other cancer samples, as well as data from healthy individuals, were used to verify whether it was possible to distinguish patients in the early stages of breast cancer from a population that included healthy individuals and patients in the early stages of cancers other than breast cancer, in a manner similar to that of Example 1.
検体数の内訳は、乳がん患者血清１１検体、健常者血清３０検体、その他がん患者血清８２検体であり、その他がん患者血清の内訳は、大腸がん２、胃がん５、肺がん７、卵巣がん２、膵臓がん４、胆道がん９、食道がん４、膀胱がん１０、肉腫７、子宮がん１２、腎臓がん１３、子宮頸がん７であった（表２参照）。 The number of samples consisted of 11 serum samples from breast cancer patients, 30 serum samples from healthy subjects, and 82 serum samples from patients with other cancers. The breakdown of the serum samples from patients with other cancers was as follows: 2 colon cancer, 5 gastric cancer, 7 lung cancer, 2 ovarian cancer, 4 pancreatic cancer, 9 biliary tract cancer, 4 esophageal cancer, 10 bladder cancer, 7 sarcoma, 12 uterine cancer, 13 kidney cancer, and 7 cervical cancer (see Table 2).
（ｍｉＲＮＡマーカーの統計的選別方法）
配列番号１～１１２のｍｉＲＮＡをそれぞれ単独でマーカーとして使用した際の感度及び特異度を、例１と同様の方法で算出した結果を表４－１～表４－５に示す。表４－１～表４－５に示すように、その感度は、非特許論文２を参考とした既存の腫瘍マーカーＣＥＡの感度（＝１５．７３％）を上回り、特異度も十分に高かった。
(Statistical Selection Method for miRNA Markers)
The sensitivity and specificity when each of the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 112 was used alone as a marker were calculated in the same manner as in Example 1, and the results are shown in Tables 4-1 to 4-5. As shown in Tables 4-1 to 4-5, the sensitivity exceeded the sensitivity (=15.73%) of the existing tumor marker CEA, which was based on
従って、配列番号１～１１２のｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡを定量することで、既存の腫瘍マーカーＣＥＡを上回る感度で、かつ健常人と他がんの初期段階の患者集団から、乳がん初期段階の患者を判別できることも示された。 Therefore, it was shown that quantifying miRNAs selected from miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 112 can distinguish patients in the early stages of breast cancer from healthy individuals and patients in the early stages of other cancers with a sensitivity higher than that of the existing tumor marker CEA.
本発明の幾つかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。 Although several embodiments of the present invention have been described, these embodiments are presented as examples and are not intended to limit the scope of the invention. These novel embodiments can be embodied in various other forms, and various omissions, substitutions, and modifications can be made without departing from the gist of the invention. These embodiments and their modifications are included in the scope and gist of the invention, and are included in the scope of the invention and its equivalents described in the claims.
Claims (15)
前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較すること；及び
前記対象の定量値が前記対照の定量値よりも少ない場合に前記対象が乳がんに罹患していると判定すること；
を更に含む請求項１又は２に記載の方法。 The target miRNAs are miR-25-3p, let-7a-5p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-135b-5p, miR-140-5p, miR-146a-5p, miR-183-5p, miR-18b-5p, miR-190b-5p, miR-196b-5p, miR-203a-3p, miR-208a-3p, miR-27b-3p, miR-2909, miR-29c-5p, miR-31-3p, miR-338-3p, miR-33a-5 p, miR-361-3p, miR-363-5p, miR-374b-3p, miR-384, miR-3910, miR-3913-3p, miR-4282, miR-4425, miR-4677-5p, miR-4733-3p, miR-4775, miR-4777-3p, miR-4782-5p, miR-4803, miR-5007-3p, miR-5009-5p, miR-5195-5p, miR-519d-5p, miR-523-3p, miR-548ao- 5p, miR-548f-3p, miR-548w, miR-5580-5p, miR-5584-5p, miR-5586-5p, miR-5692a, miR-5700, miR-582-5p, miR-599, miR-606, miR-653-3p, miR-654-3p, miR-6784-3p, miR-7151-5p, miR-7-5p, miR-8087, miR-889-3p, miR-942-5p, miR-98-3p, miR-1246, miR-123 any one of miRNAs selected from miR-8-5p, miR-1307-3p, miR-1276, miR-139-3p, miR-3126-3p, miR-3150b-3p, miR-31-5p, miR-3609, miR-3617-3p, miR-3649, miR-4305, miR-4440, miR-4456, miR-449c-3p, miR-4703-3p, miR-579-3p, miR-6083, miR-6871-5p, and miR-7976;
comparing the quantitative value of the miRNA in the subject with the quantitative value of the miRNA in a control; and determining that the subject is affected with breast cancer if the quantitative value in the subject is less than the quantitative value in the control;
The method of claim 1 or 2, further comprising:
前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較すること；及び
前記対象の定量値が前記対照の定量値よりも多い場合に前記対象が乳がんに罹患していると判定すること；
を更に含む請求項１又は２に記載の方法。 The target miRNAs are miR-4632-3p, miR-1307-5p, miR-3152-5p, miR-3189-3p, miR-3915, miR-4267, miR-4417, miR-4427, miR-4433b-5p, miR-452-5p, miR-548y, miR-5694, miR-571, miR-6733-3p, miR-6782-3p, miR-887-5p, miR-3937, miR-44 49, miR-4674, miR-4707-3p, miR-564, miR-615-5p, miR-6510-5p, miR-7108-5p, miR-1225-5p, miR-1269b, miR-2467-3p, miR-297, miR-3175, miR-3177-3p, miR-3666, miR-4736, miR-6825-3p, and miR-6845-5p;
comparing the quantitative value of the miRNA in the subject with the quantitative value of the miRNA in a control; and determining that the subject is affected with breast cancer if the quantitative value in the subject is greater than the quantitative value in the control;
The method of claim 1 or 2, further comprising:
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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