JP2024071498A - Method for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, and a modularized polyimide porous membrane for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、十分な力学的強度及び厚みを持った軟骨組織体であって、他の動物由来のスキャフォールド成分を含まない、安全性の高い軟骨組織体を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造する方法であって、軟骨細胞が播種されたモジュール化ポリイミド多孔質膜を、浮遊培養用の細胞培養容器内に固定されていない状態で培地中に浮遊させながら、前記モジュール化ポリイミド多孔質膜にシェアストレスを付与しながら培養する工程、を含む、方法を提供する。また、本発明は、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体、及びスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造するためのモジュール化ポリイミド多孔質膜を提供する。【選択図】なし[Problem] The present invention aims to provide a cartilage tissue having sufficient mechanical strength and thickness, which is highly safe and does not contain scaffold components derived from other animals. [Solution] The present invention provides a method for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, which comprises a step of culturing a modularized polyimide porous membrane seeded with chondrocytes while applying shear stress to the modularized polyimide porous membrane, while floating the membrane in a medium in a state not fixed in a cell culture vessel for suspension culture. The present invention also provides a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, and a modularized polyimide porous membrane for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue. [Selected Figures] None
Description
本発明は、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造する方法、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体、及びスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造するためのモジュール化ポリイミド多孔質膜に関する。 The present invention relates to a method for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, and a modularized polyimide porous membrane for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue.
軟骨組織は、神経及び血管のない組織であり、軟骨細胞と細胞外マトリックス（２型コラーゲン、プロテオグリカン、水等）から構成されている。また、損傷すると修復に必要な栄養が供給されにくい為、自然修復が困難と言われている。その為、手術等による高位骨切り術や人工関節への置換等、様々な治療方法が採用されて来た。近年、自家細胞を培養して増殖させた後に損傷患部に包埋して損傷部を治癒させる再生医療法が多く創出された。軟骨細胞は通常の平面培養法ではその特性が喪失されてしまう易脱分化細胞であるが、種々研究の結果様々な特性維持培養法が考案された。また、細胞だけではなく、軟骨細胞特有の細胞外マトリクス（グルコサミノグリカンや２型コラーゲン）を患部に細胞と共に包埋する事が治癒の観点から重要である事も判明しているので、細胞培養時にこれらの細胞外マトリクスが潤沢に産生される点に関しても、多くの研究が展開された。これらの努力を経て、現在は研究開発の成果としていくつかの製品が上市され、医療場面で使用されて来ている。実用法として活用され始める傍ら、各方法論に関して課題が見出され、それら課題の解決が望まれて来た。各種課題の特性を整理すると、以下の様な課題が重要点と言える。 Cartilage tissue is a tissue without nerves or blood vessels, and is composed of chondrocytes and extracellular matrix (type II collagen, proteoglycan, water, etc.). In addition, when damaged, it is difficult to supply the nutrients necessary for repair, so it is said that natural repair is difficult. For this reason, various treatment methods have been adopted, such as high osteotomy by surgery and replacement with artificial joints. In recent years, many regenerative medicine methods have been created in which autologous cells are cultured and proliferated, then embedded in the damaged area to heal the damaged area. Cartilage cells are easily dedifferentiated cells whose characteristics are lost in the usual plate culture method, but as a result of various research, various culture methods that maintain their characteristics have been devised. In addition, it has been found that it is important from the perspective of healing to embed not only cells but also the extracellular matrix specific to chondrocytes (glucosaminoglycan and type II collagen) in the affected area together with the cells, so much research has been carried out on the point of producing these extracellular matrices abundantly during cell culture. Through these efforts, several products have now been released as the result of research and development and are being used in medical settings. As these methods have begun to be used in practical applications, problems have been identified with each methodology, and there has been a desire to resolve these problems. When summarizing the characteristics of each problem, the following issues can be said to be important:
（ｉ）組成（ヒト由来成分以外の混入）：軟骨特性維持や細胞外マトリクスの好適な産生の為には、いくつかの製品に於いては、培養基材を用いる方法論が用いられるが、基本的に培養基材はヒト由来成分ではなく、異物である。 (i) Composition (contamination of substances other than human-derived components): In order to maintain cartilage characteristics and optimally produce extracellular matrix, some products use a methodology that uses a culture substrate, but the culture substrate is basically a foreign substance and not a human-derived component.
（ｉｉ）細胞外マトリクス：軟骨特有の細胞外マトリクスを細胞と共に包埋する事は治療では重要な要素。潤沢にこれらマトリクスに富む状態で移植を実施する必要性が高い。 (ii) Extracellular matrix: Embedding the extracellular matrix specific to cartilage together with the cells is an important element in treatment. There is a high need to perform transplantation in a state where this matrix is abundantly present.
（ｉｉｉ）細胞数：治癒の本体は移植された軟骨細胞である為、大量の細胞を限定的な領域に包埋する事が重要となる。 (iii) Number of cells: Since the main source of healing is the transplanted cartilage cells, it is important to embed a large number of cells in a limited area.
（ｉｖ）強度とサイズ：患部にしっかりと包埋・固定させる為には、患部から容易に喪失されず、かつ、手術過程で容易に取り扱える強度及びサイズが重要となる。 (iv) Strength and size: In order to be firmly embedded and fixed in the affected area, it is important that the strength and size are such that it is not easily lost from the affected area and can be easily handled during surgery.
（ｖ）取り扱い性：生きた細胞を包埋の素材として利用する為、総部包埋の前に、培養デバイスから簡便かつ効率的に、また再現性高く、包埋細胞を取り扱う事が重要となる。 (v) Handling: Since living cells are used as the embedding material, it is important to be able to handle the embedded cells from the culture device easily, efficiently, and reproducibly before total embedding.
（ｖｉ）包埋物健全性：ヒトに包埋する素材である為、十分に生育する事が求められる一方で、異物等を含まず、かつ、ゼノフリーの状態で培養工程が進行する事が重要。 (vi) Integrity of the embedded material: Since the material is to be embedded in humans, it is required that it grows satisfactorily, but it is also important that the culture process is carried out in a xeno-free state, free of foreign matter, etc.
（ｖｉｉ）容易性：包埋組織体の調達は各箇所で容易に実行される事が望ましい為、培養工程で特殊な装置を必要としない事が望ましい。 (vii) Ease of use: It is desirable that the embedded tissues can be easily procured at each site, and therefore it is desirable that no special equipment is required for the culture process.
上記の課題に対し軟骨の再生医療では、軟骨細胞の懸濁液、スフェロイド（細胞同士が集合・凝集化した球状の細胞集合体）、温度応答性ポリマーを使用して作製された軟骨細胞シート、スキャフォールド中で軟骨細胞を培養して作製された培養軟骨等を患部に注入又は移植する方法が提案されている。 In response to the above issues, methods have been proposed for cartilage regenerative medicine, such as injecting or transplanting into the affected area a suspension of chondrocytes, spheroids (spherical cell aggregates in which cells gather and aggregate), chondrocyte sheets made using temperature-responsive polymers, and cultured cartilage made by culturing chondrocytes in a scaffold.
（１）細胞懸濁液及びスフェロイド
細胞懸濁液を使用する方法は、軟骨欠損患者の非荷重部から軟骨組織を少量採取し、酵素処理で軟骨細胞を分離したのち単層培養を行い、約３週間後に細胞を回収して細胞懸濁液の状態で軟骨欠損部に注入するものである。注入した細胞を軟骨欠損部に留めておくため、あらかじめ患者の脛骨から採取した骨膜で欠損部をパッチしてフィブリン糊でシールした後に細胞懸濁液を注入する。この方法は、１９９４年にスウェーデンの整形外科医により発表され、骨欠損治療に再生医療を応用した点で画期的であったが、細胞を懸濁液の状態で注入するため、術後に漏出するリスク、術後に重力で細胞が沈降し、修復組織が不均一になるリスク等がある。また、特許文献１には細胞移植治療用のスフェロイドが提案されているが、直径１ｍｍ以下と小さい為、１ｍｍ以上の患部に適用する場合は細胞懸濁液と同様に漏出等のリスクがある。その為、シート状構造物にスフェロイドを固定してから移植する等の対策がとられている。換言すれば、流動性のある移植材料は、自律性に乏しい為、細胞を漏出するリスクがあり、その対策が必要となる。また、細胞数は確保可能であるが、その一方で、細胞外マトリクスの確保に関しては特別の策がとられておらず、大量の細胞を移送する事に主眼が置かれた方法と言える。
(1) Cell suspension and spheroids The method of using a cell suspension involves collecting a small amount of cartilage tissue from the non-weight bearing part of a patient with a cartilage defect, isolating cartilage cells by enzyme treatment, culturing them in a monolayer, and then collecting the cells about three weeks later and injecting them into the cartilage defect in the form of a cell suspension. In order to keep the injected cells in the cartilage defect, the defect is patched with periosteum taken from the patient's tibia in advance, sealed with fibrin glue, and then the cell suspension is injected. This method was announced by a Swedish orthopedic surgeon in 1994 and was revolutionary in that it applied regenerative medicine to bone defect treatment, but since the cells are injected in the form of a suspension, there is a risk of leakage after surgery, and the cells will settle due to gravity after surgery, resulting in uneven repair tissue. In addition, Patent Document 1 proposes spheroids for cell transplantation therapy, but since they are small, with a diameter of 1 mm or less, there is a risk of leakage, etc., similar to cell suspensions, when applied to affected areas with a diameter of 1 mm or more. For this reason, measures such as fixing the spheroids to a sheet-like structure before transplantation have been taken. In other words, since fluid transplant materials lack autonomy, there is a risk of cells leaking out, and measures to prevent this are necessary. In addition, while it is possible to secure the number of cells, no special measures are taken to secure the extracellular matrix, and it can be said that this method is focused on transferring a large number of cells.
（２）温度応答性ポリマーを使用して作製された軟骨細胞シート
細胞が固定された移植材料として、例えば、特許文献２には、軟骨細胞を温度応答性ポリマーが処理された培養容器で培養することにより作製された細胞シートが提案されている。このシートは、培養時では軟骨特有の２型コラーゲンを産生しないが、動物への移植後に２型コラーゲンを産生する良好な結果が記載されている。しかしながら、温度応答性ポリマーを利用する方法は、特許文献２の表１に記載の通り細胞シートの厚さが数十μｍと薄いため、力学的強度が弱い上、培養容器から細胞シートを剥離する際にシートが収縮することが課題であった。この点に関して、例えば特許文献３では、シートを積層させて厚くすることや、培養シートをキャリアに密着させ剥離しやすくする方法が提案されている。しかしながら、１０回より多く積層化した細胞シートは酸素や栄養分が届きにくくなるため、積層回数は４回以下が好ましいと記載されている。この様に、温度応答性ポリマーを利用して厚みのある組織体を形成することは難しいと言える。
(2) Cartilage cell sheet produced using a temperature-responsive polymer As a transplant material with fixed cells, for example, Patent Document 2 proposes a cell sheet produced by culturing cartilage cells in a culture vessel treated with a temperature-responsive polymer. This sheet does not produce type II collagen specific to cartilage during culture, but has been described as producing good results of type II collagen after transplantation into an animal. However, the method using a temperature-responsive polymer has a problem that the cell sheet is thin, at only several tens of μm, as described in Table 1 of Patent Document 2, so that the mechanical strength is weak and the sheet shrinks when the cell sheet is peeled off from the culture vessel. In this regard, for example, Patent Document 3 proposes a method of laminating the sheet to make it thicker, or of adhering the culture sheet to a carrier to make it easier to peel off. However, it is described that the number of laminations is preferably 4 or less, because oxygen and nutrients are less likely to reach a cell sheet that is laminated more than 10 times. In this way, it can be said that it is difficult to form a thick tissue using a temperature-responsive polymer.
（３）スキャフォールド中で軟骨細胞を培養して作製された培養軟骨
細胞が固定されており、かつ、厚みがある移植材料として、天然または人工の足場材料を用いて作製された移植材料が提案されている。例えば特許文献４や特許文献５では、軟骨細胞をコラーゲンやプロテオグリカンを含むゲル状構造物に播種又は包埋して培養して作製された移植材料が提案されている。この方法では、スキャフォールドの大きさや量に応じて厚みのある移植材料を提供することが出来る。しかしながら、スキャフォールドにはウシやブタのコラーゲン等、他の動物由来のものが使用されているため、ヒトの生体への影響は無視できない。また、用いられているコラーゲン溶液の濃度は高く、粘性が高い上、コラーゲンが３７℃で直ちにゲル化する上、作製された移植材料の均一性等に課題がある。
(3) Cultured cartilage produced by culturing cartilage cells in a scaffold As a transplant material in which cells are fixed and which has a thickness, a transplant material produced using a natural or artificial scaffold material has been proposed. For example, Patent Document 4 and Patent Document 5 propose a transplant material produced by seeding or embedding cartilage cells in a gel-like structure containing collagen and proteoglycan and culturing it. This method can provide a transplant material with a thickness depending on the size and amount of the scaffold. However, since the scaffold uses collagen derived from other animals, such as bovine or porcine collagen, the effect on the human body cannot be ignored. In addition, the collagen solution used has a high concentration and high viscosity, collagen immediately gels at 37°C, and there are problems with the uniformity of the prepared transplant material.
＜ポリイミド多孔質膜＞
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献６）。
<Porous polyimide film>
A method for culturing cells has been reported, which involves applying cells to a polyimide porous membrane and culturing the cells (Patent Document 6).
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称である。芳香族ポリイミドは、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された高分子を意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、且つ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。 Polyimide is a general term for polymers that contain imide bonds in the repeating units. Aromatic polyimide refers to a polymer in which aromatic compounds are directly linked through imide bonds. Aromatic polyimides have a rigid and strong molecular structure because aromatic compounds have a conjugated structure via imide bonds, and because the imide bonds have strong intermolecular forces, they have very high levels of thermal, mechanical, and chemical properties.
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献７～１０は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。 Prior to the filing of this application, polyimide porous films have been used for applications such as filters, low dielectric constant films, and electrolyte membranes for fuel cells, particularly in battery-related applications. Patent documents 7 to 10 describe polyimide porous films that have excellent permeability to substances such as gases, high porosity, excellent smoothness on both surfaces, relatively high strength, and, despite their high porosity, have many macrovoids that provide excellent resistance to compressive stress in the thickness direction of the film. All of these are polyimide porous films created via amic acid.
軟骨の再生医療において、様々な技術が開発され、実用化されているが、上述のような課題を抱えている。従って、本発明は、十分な力学的強度及び厚みを持った軟骨組織体であって、他の動物由来のスキャフォールド成分を含まない、安全性の高い軟骨組織体を提供することを課題とする。 Various technologies have been developed and put to practical use in cartilage regenerative medicine, but they have the problems mentioned above. Therefore, the objective of the present invention is to provide a cartilage tissue structure that has sufficient mechanical strength and thickness, does not contain scaffold components derived from other animals, and is highly safe.
上記課題に鑑み、本発明者らが検討を行った結果、従来よりも簡便な方法により、十分な力学的強度及び厚みを持ち、かつ、他の動物由来のスキャフォールド成分を含まない、安全性の高い軟骨組織体を作製可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。 In view of the above problems, the present inventors conducted research and discovered that a safe cartilage tissue structure that has sufficient mechanical strength and thickness and does not contain scaffold components derived from other animals can be produced by a method simpler than conventional methods, leading to the completion of the present invention. In other words, the present invention encompasses the following inventions:
［１］ スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造する方法であって、
軟骨細胞が播種されたモジュール化ポリイミド多孔質膜を、浮遊培養用の細胞培養容器内に固定されていない状態で培地中に浮遊させながら、前記モジュール化ポリイミド多孔質膜にシェアストレスを付与しながら培養する工程、
を含み、
ここで前記モジュール化ポリイミド多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜と、前記ポリイミド多孔質膜が収容されたケーシングとを備えるものであって、前記ポリイミド多孔質膜は、流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態でケーシングに固定されており、
前記ケーシングが、前記ポリイミド多孔質膜の少なくとも一部の表面に培地を曝露するための１以上の培地流出入口を有し、
ここで前記ポリイミド多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
前記方法。
［２］ 前記モジュール化ポリイミド多孔質膜は、２以上の前記ポリイミド多孔質膜が積層されて収容されている、項目１に記載の方法。
［３］ 前記シェアストレスが、旋回運動、往復運動、上下運動、波動形揺動運動、回転運動又はそれらの運動を組み合わせた状態で振盪及び／又は攪拌することにより、生じさせるシェアストレスである、項目１又は２に記載の方法。
［４］ 前記ポリイミド多孔質膜が、平均孔径０．０１～１００μｍの複数の細孔を有する、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１～５０μｍである、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
［６］ 前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
［７］ 前記ポリイミド多孔質膜の総膜厚が、５～５００μｍである、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
［８］ 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
［９］
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
[1] A method for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue construct, comprising:
a step of culturing the modularized polyimide porous membrane seeded with chondrocytes while applying shear stress to the modularized polyimide porous membrane, while floating the modularized polyimide porous membrane in a medium in a cell culture vessel for suspension culture in an unfixed state;
Including,
The modularized polyimide porous membrane comprises a polyimide porous membrane and a casing in which the polyimide porous membrane is housed, and the polyimide porous membrane is fixed to the casing in a state in which the polyimide porous membrane does not continuously undergo wavy motion due to a fluid,
The casing has one or more medium inlet/outlet ports for exposing a medium to at least a portion of the surface of the polyimide porous membrane;
wherein the polyimide porous film is a three-layered polyimide porous film having surface layers A and B each having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is smaller than the average pore size of the pores in the surface layer B, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, and the pores in the surface layers A and B are connected to the macrovoids.
The method.
[2] The method according to item 1, wherein the modularized polyimide porous film is accommodated in a stack of two or more of the polyimide porous films.
[3] The method according to item 1 or 2, wherein the shear stress is induced by shaking and/or stirring in a state of a swirling motion, a reciprocating motion, an up-and-down motion, a wave-type rocking motion, a rotational motion, or a combination of these motions.
[4] The method according to any one of items 1 to 3, wherein the polyimide porous film has a plurality of pores having an average pore size of 0.01 to 100 μm.
[5] The method according to any one of items 1 to 4, wherein the average pore size of the surface layer A is 0.01 to 50 μm.
[6] The method according to any one of items 1 to 5, wherein the average pore size of the surface layer B is 20 to 100 μm.
[7] The method according to any one of items 1 to 6, wherein the polyimide porous film has a total thickness of 5 to 500 μm.
[8] The method according to any one of items 1 to 7, wherein the polyimide porous film is a polyimide porous film containing a polyimide obtained from a tetracarboxylic dianhydride and a diamine.
[9]
9. The method according to any one of items 1 to 8, wherein the polyimide porous film is a colored polyimide porous film obtained by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic dianhydride and a diamine and a colored precursor, and then heat-treating the resulting product at 250° C. or higher.
［１０］ 項目１～９のいずれか１項に記載の方法によって得られるスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体。 [10] A scaffold-free three-dimensional cartilage tissue obtained by the method according to any one of items 1 to 9.
［１１］ 軟骨細胞を含む、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体であって、
前記軟骨細胞が生成する細胞外マトリックス以外の、外部から添加するスキャフォールド成分は含んでおらず、
前記スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体が平均０．２ｍｍ以上の厚さを有するものであり、
グルコサミノグリカンを湿潤重量１ｍｇあたり５μｇ以上を含んでいることを特徴とする、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体。
［１２］ 前記前記スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体が平均０．５ｍｍ以上の厚さを有するものである、項目１１に記載のスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体。
[11] A scaffold-free three-dimensional cartilage tissue comprising chondrocytes,
The present invention does not include any externally added scaffold components other than the extracellular matrix produced by the chondrocytes,
The scaffold-free three-dimensional cartilage tissue has an average thickness of 0.2 mm or more,
A scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, characterized in that it contains 5 μg or more of glycosaminoglycan per 1 mg of wet weight.
[12] The scaffold-free three-dimensional cartilage tissue according to item 11, wherein the scaffold-free three-dimensional cartilage tissue has an average thickness of 0.5 mm or more.
［１３］ スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造するためのモジュール化ポリイミド多孔質膜であって、
ここで前記モジュール化ポリイミド多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜と、前記ポリイミド多孔質膜が収容されたケーシングとを備えるものであって、前記ポリイミド多孔質膜は、流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態でケーシングに固定されており、
前記ケーシングが、前記ポリイミド多孔質膜の少なくとも一部の表面に培地を曝露するための１以上の培地流出入口を有し、
ここで前記ポリイミド多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記モジュール化ポリイミド多孔質膜が、浮遊培養用の細胞培養容器、細胞培養装置又は細胞培養システム内において用いられるものであって、前記浮遊培養用の細胞培養容器、細胞培養装置又は細胞培養システムの培養部内に固定されていないことを特徴とする、モジュール化ポリイミド多孔質膜。
［１４］ ２以上の前記ポリイミド多孔質膜が積層されて収容されている、項目１３に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜。
［１５］ 前記ポリイミド多孔質膜が、平均孔径０．０１～１００μｍの複数の細孔を有する、項目１３又は１４に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜。
［１６］ 前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１～５０μｍである、項目１３～１５のいずれか１項に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜。
［１７］ 前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、項目１３～１６のいずれか１項に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜。
［１８］ 前記ポリイミド多孔質膜の総膜厚が、５～５００μｍである、項目１３～１７のいずれか１項に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜。
［１９］ 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、項目１３～１８のいずれか１項に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜。
［２０］ 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、項目１３～１９のいずれか１項に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜。
[13] A modularized polyimide porous membrane for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, comprising:
The modularized polyimide porous membrane comprises a polyimide porous membrane and a casing in which the polyimide porous membrane is housed, and the polyimide porous membrane is fixed to the casing in a state in which the polyimide porous membrane does not continuously undergo wavy motion due to a fluid,
The casing has one or more medium inlet/outlet ports for exposing a medium to at least a portion of the surface of the polyimide porous membrane;
wherein the polyimide porous film is a three-layered polyimide porous film having surface layers A and B each having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is smaller than the average pore size of the pores in the surface layer B, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, and the pores in the surface layers A and B communicate with the macrovoids,
The modularized polyimide porous film is used in a cell culture vessel, a cell culture device, or a cell culture system for suspension culture, and is not fixed within a culture section of the cell culture vessel, the cell culture device, or the cell culture system for suspension culture.
[14] The modularized polyimide porous film according to item 13, wherein two or more of the polyimide porous films are stacked and housed.
[15] The modularized polyimide porous film according to item 13 or 14, wherein the polyimide porous film has a plurality of pores having an average pore diameter of 0.01 to 100 μm.
[16] The modularized polyimide porous film according to any one of items 13 to 15, wherein the average pore size of the surface layer A is 0.01 to 50 μm.
[17] The modularized polyimide porous membrane according to any one of items 13 to 16, wherein the average pore size of the surface layer B is 20 to 100 μm.
[18] The modularized polyimide porous film according to any one of items 13 to 17, wherein the polyimide porous film has a total thickness of 5 to 500 μm.
[19] The modularized polyimide porous film according to any one of items 13 to 18, wherein the polyimide porous film is a polyimide porous film containing a polyimide obtained from a tetracarboxylic dianhydride and a diamine.
[20] The modularized polyimide porous film according to any one of Items 13 to 19, wherein the polyimide porous film is a colored polyimide porous film obtained by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic dianhydride and a diamine and a colored precursor, and then heat-treating the resulting product at 250° C. or higher.
本発明によれば、従来の方法により得られる三次元軟骨組織体よりも、十分な力学的強度及び厚みを持った三次元軟骨組織体を提供可能となる。また、本発明において提供される三次元軟骨組織体は、細胞量、細胞外マトリクス量が、従来のものよりも高い上に強度が優れており、なおかつ、それを作製する時においても回収が容易であり、再現性に優れている。また、本発明により得られた三次元軟骨組織体は、主に軟骨細胞とその細胞自身が産生した細胞外マトリックスから構成されており、他の動物由来の成分を含まない為、生体に対しても安全性が高い。 According to the present invention, it is possible to provide a three-dimensional cartilage tissue having sufficient mechanical strength and thickness compared to three-dimensional cartilage tissue obtained by conventional methods. Furthermore, the three-dimensional cartilage tissue provided by the present invention has a higher amount of cells and extracellular matrix than conventional ones, and has excellent strength. Moreover, it is easy to collect when producing it, and has excellent reproducibility. Furthermore, the three-dimensional cartilage tissue obtained by the present invention is mainly composed of chondrocytes and the extracellular matrix produced by the cells themselves, and does not contain any components derived from other animals, so it is highly safe for the living body.
Ｉ．スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造する方法 I. Method for producing scaffold-free three-dimensional cartilage tissue
一実施態様において、本発明は、
スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造する方法であって、
軟骨細胞が播種されたモジュール化ポリイミド多孔質膜を、浮遊培養用の細胞培養容器内に固定されていない状態で培地中に浮遊させながら、前記モジュール化ポリイミド多孔質膜にシェアストレスを付与しながら培養する工程、
を含み、
ここで前記モジュール化ポリイミド多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜と、前記ポリイミド多孔質膜が収容されたケーシングとを備えるものであって、前記ポリイミド多孔質膜は、流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態でケーシングに固定されており、
前記ケーシングが、前記ポリイミド多孔質膜の少なくとも一部の表面に培地を曝露するための１以上の培地流出入口を有し、
ここで前記ポリイミド多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
前記方法、を提供する。
In one embodiment, the present invention provides
A method for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, comprising:
a step of culturing the modularized polyimide porous membrane seeded with chondrocytes while applying shear stress to the modularized polyimide porous membrane, while floating the modularized polyimide porous membrane in a medium in a cell culture vessel for suspension culture in an unfixed state;
Including,
The modularized polyimide porous membrane comprises a polyimide porous membrane and a casing in which the polyimide porous membrane is housed, and the polyimide porous membrane is fixed to the casing in a state in which the polyimide porous membrane does not continuously undergo wavy motion due to a fluid,
The casing has one or more medium inlet/outlet ports for exposing a medium to at least a portion of the surface of the polyimide porous membrane;
wherein the polyimide porous film is a three-layered polyimide porous film having surface layers A and B each having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is smaller than the average pore size of the pores in the surface layer B, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, and the pores in the surface layers A and B are connected to the macrovoids.
The method is provided.
１．軟骨細胞
本明細書において、「軟骨細胞」とは、コラーゲンやプロテオグリカンなど、軟骨組織を構成する細胞外マトリックスを産生する細胞、または、その前駆細胞（例えば、間葉系幹細胞、骨芽細胞、又は軟骨芽細胞など）を意味する。本発明に適用され得る軟骨細胞は、軟骨細胞マーカーを発現する細胞であってもよく、軟骨細胞マーカーとしては、例えばＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）またはＳＯＸ９などが例示されるが、これに限定されない。ＣＯＬ２Ａ１は、例えば、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿００１８４４またはＮＭ＿０３３１５０、マウスの場合、ＮＭ＿００１１１３５１５またはＮＭ＿０３１１６３に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が挙げられるが、これに限定されない。また、ＳＯＸ９は、例えば、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿０００３４６、マウスの場合、ＮＭ＿０１１４４８に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が挙げられるが、これに限定されない。
1. Chondrocytes In this specification, the term "chondrocytes" refers to cells that produce extracellular matrices that constitute cartilage tissue, such as collagen and proteoglycan, or precursor cells thereof (e.g., mesenchymal stem cells, osteoblasts, or chondroblasts). The chondrocytes that can be applied to the present invention may be cells that express a chondrocyte marker, and examples of the chondrocyte marker include, but are not limited to, type II collagen (COL2A1) or SOX9. Examples of COL2A1 include, but are not limited to, genes having nucleotide sequences described in NCBI accession numbers NM_001844 or NM_033150 for humans and NM_001113515 or NM_031163 for mice, proteins encoded by the genes, and naturally occurring mutants having the functions of these genes. Examples of SOX9 include, but are not limited to, a gene having a nucleotide sequence set forth in NCBI accession numbers NM_000346 for humans and NM_011448 for mice, as well as a protein encoded by the gene, and naturally occurring mutants having these functions.
本発明において用いられ得る軟骨細胞は、生体組織、例えば、関節軟骨、耳介軟骨、又は鼻軟骨から単離されるものであってもよく、例えば、多指（趾）症の対象の余剰指から採取されるものであってもよい。また、軟骨細胞は、移植する対象から採取された自家細胞であってもよく、移植する対象以外の対象から採取された他家細胞であってもよい。 The chondrocytes that can be used in the present invention may be isolated from biological tissues, such as articular cartilage, auricular cartilage, or nasal cartilage, or may be harvested, for example, from the extra digits of a subject with polydactyly. In addition, the chondrocytes may be autologous cells harvested from the subject to be transplanted, or allogeneic cells harvested from a subject other than the subject to be transplanted.
本発明において用いられ得る軟骨細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された軟骨細胞が用いられてもよい。多能性幹細胞とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。本発明に適用し得る軟骨細胞を、多能性幹細胞から分化誘導する方法については特に限定されず、公知の方法、例えば国際公開第２０１６／１３３２０８号などを参考にすることができる。 The chondrocytes that can be used in the present invention may be chondrocytes induced to differentiate from pluripotent stem cells. Pluripotent stem cells are intended to be a general term for stem cells that have the ability to differentiate into cells of any tissue (differentiation pluripotency). Pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic germ stem cells (EG cells), germ stem cells (GS cells), and the like. ES cells or iPS cells are preferred. iPS cells are particularly preferred because they have no ethical issues. Any known pluripotent stem cells can be used, but for example, the pluripotent stem cells described in International Publication WO2009/123349 (PCT/JP2009/057041) can be used. There are no particular limitations on the method of inducing differentiation of chondrocytes that can be applied to the present invention from pluripotent stem cells, and known methods, such as International Publication No. WO2016/133208, can be used as a reference.
２．スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体 2. Scaffold-free 3D cartilage tissue structure
本明細書において「スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体」とは、軟骨細胞自身が生成する細胞外マトリックス以外の、外部から添加するスキャフォールド成分（例えば、アテロコラーゲン、マトリゲル、又はゼラチンなど）を含まない、軟骨細胞を含む三次元化組織体をいう。すなわち、本願発明によって提供され得る「スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体」は、軟骨細胞自身が生成する細胞外マトリックスによって、自ら三次元化することにより生成された組織体であり、平均０．２ｍｍ以上、好ましくは平均０．５ｍｍ以上の厚さを有している。また、本願発明によって提供され得る「スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体」は、グルコサミノグリカンを、湿潤重量１ｍｇあたり５μｇ以上を含み得る構造体である。本願発明により提供され得るスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体は、細胞量、細胞外マトリクス量が、従来のものよりも高い上に、強度が優れており、なおかつ、作製した後の回収が容易である。そのため、取り扱いが容易である。また、本願発明により提供され得るスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体は、主に軟骨細胞とその細胞自身が産生した細胞外マトリックスから構成されていることから、例えば、他の動物由来の成分を含まないため、アレルギー反応を引き起こすアレルゲンとなり得る物質をほとんど含まないため、安全性が高い。 In this specification, the term "scaffold-free three-dimensional cartilage tissue" refers to a three-dimensional tissue containing chondrocytes that does not contain any externally added scaffold components (e.g., atelocollagen, matrigel, gelatin, etc.) other than the extracellular matrix generated by the chondrocytes themselves. In other words, the "scaffold-free three-dimensional cartilage tissue" that can be provided by the present invention is a tissue generated by the chondrocytes themselves becoming three-dimensional by the extracellular matrix generated by the chondrocytes themselves, and has an average thickness of 0.2 mm or more, preferably an average thickness of 0.5 mm or more. In addition, the "scaffold-free three-dimensional cartilage tissue" that can be provided by the present invention is a structure that can contain 5 μg or more of glycosaminoglycan per mg of wet weight. The scaffold-free three-dimensional cartilage tissue that can be provided by the present invention has a higher cell amount and extracellular matrix amount than conventional ones, has excellent strength, and is easy to recover after production. Therefore, it is easy to handle. Furthermore, the scaffold-free three-dimensional cartilage tissue provided by the present invention is composed mainly of chondrocytes and the extracellular matrix produced by the cells themselves, and therefore does not contain any components derived from other animals, and therefore contains almost no substances that could become allergens that cause allergic reactions, making it highly safe.
３．モジュール化ポリイミド多孔質膜
本発明に用いられ得る、又は本発明で提供される「モジュール化ポリイミド多孔質膜」は、
ポリイミド多孔質膜と、前記ポリイミド多孔質膜が収容されたケーシングとを備えるものであって、前記ポリイミド多孔質膜は、流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態でケーシングに固定されており、
前記ケーシングが、前記ポリイミド多孔質膜の少なくとも一部の表面に培地を曝露するための１以上の培地流出入口を有し、
ここで前記ポリイミド多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している（例えば、図１参照）。
3. Modularized Polyimide Porous Film The "modularized polyimide porous film" that can be used in the present invention or is provided in the present invention is
The present invention comprises a polyimide porous film and a casing in which the polyimide porous film is housed, the polyimide porous film being fixed to the casing in a state in which the polyimide porous film does not continuously undergo wavy motion due to a fluid,
The casing has one or more medium inlet/outlet ports for exposing a medium to at least a portion of the surface of the polyimide porous membrane;
Here, the polyimide porous film is a three-layer structure polyimide porous film having surface layers A and B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is smaller than the average pore size of the pores in the surface layer B, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, and the pores in the surface layers A and B are connected to the macrovoids (see, for example, Figure 1).
軟骨細胞は、モジュール化ポリイミド多孔質膜の培地流出入口によって開口している部分のポリイミド多孔質膜の表面に生着する。その状態において、モジュール化ポリイミド多孔質膜を培地に浮遊させてシェアストレスを付与しながら培養することにより、軟骨細胞自身による細胞外マトリックスの生成が促進され、かつ、軟骨細胞の増殖が促進され、ポリイミド多孔質膜の平面に対して垂直方向に肥厚化した、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体が形成される。 The chondrocytes are attached to the surface of the modularized polyimide porous membrane at the portion of the membrane that is open to the inlet and outlet of the medium. In this state, by culturing the modularized polyimide porous membrane while suspending it in the medium and applying shear stress, the production of extracellular matrix by the chondrocytes themselves is promoted, and the proliferation of the chondrocytes is promoted, resulting in the formation of a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue that is thickened perpendicularly to the plane of the polyimide porous membrane.
モジュール化ポリイミド多孔質膜の培地流出入口の形状に応じて、得られるスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体の形状が変わる。従って、使用目的、例えば、移植を目的とする場合、移植部位の形状、大きさ等に合わせてモジュール化ポリイミド多孔質膜の培地流出入口の形状を設計すればよく、その形状や大きさは特に限定されないが、例えば、矩形、円形、楕円形、三角形、五角形、六角形など、任意の形状、大きさに培地流出入口の開口部の形状を設計すればよい。 The shape of the resulting scaffold-free three-dimensional cartilage tissue varies depending on the shape of the medium inlet and outlet of the modularized polyimide porous membrane. Therefore, when the intended use is, for example, transplantation, the shape of the medium inlet and outlet of the modularized polyimide porous membrane can be designed to match the shape and size of the transplant site, and the shape and size are not particularly limited. For example, the shape of the opening of the medium inlet and outlet can be designed to any shape and size, such as rectangular, circular, elliptical, triangular, pentagonal, or hexagonal.
一実施態様において、モジュール化ポリイミド多孔質膜の培地流出入口は、２以上設けられていてもよい。例えば、モジュール化ポリイミド多孔質膜のケーシングの同一面において複数の培地流出入口が設けられていてもよく、ケーシングに収容されたポリイミド多孔質膜の両面側のケーシングに複数設けられるものであってもよい（図３参照）。 In one embodiment, the modularized polyimide porous membrane may have two or more medium inlets and inlets. For example, multiple medium inlets and inlets may be provided on the same side of the casing of the modularized polyimide porous membrane, or multiple medium inlets and inlets may be provided on both sides of the polyimide porous membrane housed in the casing (see FIG. 3).
スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体の厚さは、モジュール化ポリイミド多孔質膜の培地流出入口を構成する開口部の厚さ、すなわち、ポリイミド多孔質膜を収容するケーシングの厚さを調整することにより変更することが可能となる。例えば、ケーシングの厚さが０．２ｍｍであれば、培地流出入口は、ケーシングの表面からポリイミド多孔質膜の表面までが０．２ｍｍの深さ（以下、「培地流出入口の厚さ」という。）を有する開口部となる（図３参照）。この凹部となったポリイミド多孔質膜の表面に、軟骨細胞が垂直方向に増殖し、自ら厚さを持ったスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体となる。培地流出入口の厚さを変えることにより、得られるスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体の厚さを調整することが可能となり、例えば０．３ｍｍ以上、０．４ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、０．６ｍｍ以上、０．７ｍｍ以上、０．８ｍｍ以上、０．９ｍｍ以上、１．０ｍｍ以上、又はそれ以上の厚さのケーシングを用いてもよい。 The thickness of the scaffold-free three-dimensional cartilage tissue can be changed by adjusting the thickness of the opening constituting the medium inlet/outlet of the modularized polyimide porous membrane, i.e., the thickness of the casing housing the polyimide porous membrane. For example, if the thickness of the casing is 0.2 mm, the medium inlet/outlet will be an opening having a depth of 0.2 mm from the surface of the casing to the surface of the polyimide porous membrane (hereinafter referred to as the "medium inlet/outlet thickness") (see FIG. 3). On the surface of the polyimide porous membrane that has become a recess, cartilage cells grow vertically, and a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue with its own thickness is formed. By changing the thickness of the medium inlet/outlet, it is possible to adjust the thickness of the obtained scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, and for example, a casing having a thickness of 0.3 mm or more, 0.4 mm or more, 0.5 mm or more, 0.6 mm or more, 0.7 mm or more, 0.8 mm or more, 0.9 mm or more, 1.0 mm or more, or more may be used.
一実施態様のモジュール化ポリイミド多孔質膜において、培地に曝露されるポリイミド多孔質膜の表面は表面層Ｂであることが好ましい。培地流出入口にポリイミド多孔質膜の表面層Ｂが接するよう配置されたモジュール化ポリイミド多孔質膜であれば、培地流出入口に形成されたスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体が容易に剥離することができるため、回収が容易となる。 In one embodiment of the modularized polyimide porous membrane, the surface of the polyimide porous membrane exposed to the culture medium is preferably surface layer B. If the modularized polyimide porous membrane is arranged so that surface layer B of the polyimide porous membrane is in contact with the culture medium inlet/outlet, the scaffold-free three-dimensional cartilage tissue formed at the culture medium inlet/outlet can be easily peeled off, making it easy to recover.
一実施態様において、モジュール化ポリイミド多孔質膜は、分解可能なパーツによって構成されるケーシングを備えてもよい。例えば、図１～３のように、中心部に矩形の培地流出入口を有し、該ポリイミド多孔質膜とほぼ同型の平板状のケーシング部材によって２以上の積層したポリイミド多孔質膜を両側から挟み、それらの両端を２以上のバインダーによって挟むことによって固定されたモジュール化ポリイミド多孔質膜であってもよい。モジュール化ポリイミド多孔質膜のケーシングが分解可能であれば、作製されたスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体が容易に回収可能となる。一実施態様において、複数のポリイミド多孔質膜を積層して用いる場合、最も外側のポリイミド多孔質膜は、表面層Ｂが培地流出入口の接するように配置されるものであってもよい。 In one embodiment, the modularized polyimide porous membrane may have a casing composed of disassembled parts. For example, as shown in Figures 1 to 3, the modularized polyimide porous membrane may have a rectangular medium inlet and outlet in the center, and may be fixed by sandwiching two or more laminated polyimide porous membranes from both sides with a flat casing member of approximately the same shape as the polyimide porous membrane and sandwiching both ends with two or more binders. If the casing of the modularized polyimide porous membrane is disassembled, the scaffold-free three-dimensional cartilage tissue produced can be easily recovered. In one embodiment, when multiple polyimide porous membranes are used in a laminated form, the outermost polyimide porous membrane may be arranged so that the surface layer B is in contact with the medium inlet and outlet.
本明細書において、「モジュール化ポリイミド多孔質膜」との記載は、単に「モジュール」と記載することができ、相互に変更しても同一のことを意味する。 In this specification, the term "modularized polyimide porous film" can simply be written as "module," and even if interchangeable, they mean the same thing.
本明細書において、「モジュール化ポリイミド多孔質膜」とは、細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システム、特に浮遊培養に用いられる細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システムに適用可能な、細胞培養基材である。国際公開ＷＯ２０１８／０２１３６８に記載のモジュール化ポリイミド多孔質膜（細胞培養モジュール）も本発明に適用し得る。本発明のモジュール化ポリイミド多孔質膜は、一例として、ＷＡＶＥリアクターを用いる実施態様によって使用することができる。また、エルレンマイヤーリアクターを用いる態様によっても使用することができる。 In this specification, the term "modularized polyimide porous membrane" refers to a cell culture substrate that is applicable to cell culture vessels, cell culture devices, and cell culture systems, particularly cell culture vessels, cell culture devices, and cell culture systems used for suspension culture. The modularized polyimide porous membrane (cell culture module) described in International Publication WO2018/021368 may also be applied to the present invention. As an example, the modularized polyimide porous membrane of the present invention may be used in an embodiment using a WAVE reactor. It may also be used in an embodiment using an Erlenmeyer reactor.
本発明のモジュール化ポリイミド多孔質膜は、ポリイミド多孔質膜がケーシングに収容されていることによって、膜状のポリイミド多孔質膜がケーシング内で、継続的に形態が変形することが防止される。これによって、ポリイミド多孔質膜の内部で生育する細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的且つ大量の細胞を培養することが可能となる。また、本発明において用いられ得るモジュール化ポリイミド多孔質膜は、浮遊培養において、シェアストレス（せん断応力）が強度に負荷される旋回運動、往復運動、上下運動、波動形揺動運動、又はそれらの運動を組み合わせた状態で培養することにより、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を形成することができる。 The modularized polyimide porous membrane of the present invention is housed in a casing, which prevents the membrane-like polyimide porous membrane from continuously deforming within the casing. This prevents stress from being applied to the cells growing inside the polyimide porous membrane, suppresses apoptosis, etc., and enables stable and large-scale cell culture. In addition, the modularized polyimide porous membrane that can be used in the present invention can form a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue by culturing it in suspension culture under a rotating motion, a reciprocating motion, an up-down motion, a wave-type rocking motion, or a combination of these motions that strongly loads shear stress.
本発明のモジュール化ポリイミド多孔質膜が備えるケーシングは、通常の培養条件、例えば、攪拌培養、振とう培養条件における培地の動きによって変形しない程度に強度を有することが好ましい。また、ケーシングは、細胞培養において、細胞の生育に影響を与えない素材によって形成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等のポリマー、ステンレス綱、チタンなどの金属が挙げられるが、これに限定されない。ケーシングにある程度強度があることにより、ケーシング内部のポリイミド多孔質膜の形状が継続的に変形することが防止され、本発明の効果がより発揮される。本明細書において、「ケーシングが変形しない」とは、通常の培養環境下で受ける負荷において変形しないことを意味するものであり、絶対的に変形しないことを意味するものではない。 The casing of the modularized polyimide porous membrane of the present invention preferably has a strength sufficient to prevent deformation due to the movement of the culture medium under normal culture conditions, such as stirring culture and shaking culture conditions. In addition, the casing is preferably formed of a material that does not affect cell growth in cell culture. Examples of such materials include, but are not limited to, polymers such as polyethylene, polypropylene, nylon, polyester, polystyrene, polycarbonate, polymethyl methacrylate, and polyethylene terephthalate, and metals such as stainless steel and titanium. If the casing has a certain degree of strength, the shape of the polyimide porous membrane inside the casing is prevented from continuously deforming, and the effects of the present invention are more effectively exhibited. In this specification, "the casing does not deform" means that it does not deform under the load received under a normal culture environment, and does not mean that it absolutely does not deform.
一実施態様において、本発明に用いられ得る、または提供されるモジュール化ポリイミド多孔質膜は、２以上の前記ポリイミド多孔質膜が積層されて、ケーシングに収容されている。この場合、ポリイミド多孔質膜とポリイミド多孔質膜の間には中敷が設けられてもよい。中敷が設けられることにより、積層されたポリイミド多孔質膜の間に効率的に培地を供給させることができる。中敷は、積層されたポリイミド多孔質膜の間に任意の空間を形成し、効率的に培地を供給させる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、メッシュ構造を有する平面構造体を用いることができる。中敷の材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。メッシュ構造を有する中敷を有する場合、積層されたポリイミド多孔質膜の間に培地を供給できる程度の目開きを有していればよく、適宜選択することができる。 In one embodiment, the modularized polyimide porous membrane that can be used or provided in the present invention is a laminate of two or more polyimide porous membranes housed in a casing. In this case, an insole may be provided between the polyimide porous membranes. By providing the insole, the culture medium can be efficiently supplied between the laminated polyimide porous membranes. The insole is not particularly limited as long as it forms an arbitrary space between the laminated polyimide porous membranes and has the function of efficiently supplying the culture medium, and for example, a planar structure having a mesh structure can be used. The material of the insole can be, for example, polystyrene, polycarbonate, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, or stainless steel mesh, but is not limited thereto. When the insole has a mesh structure, it is sufficient that the mesh has an opening large enough to supply the culture medium between the laminated polyimide porous membranes, and can be appropriately selected.
本明細書において、「折り畳まれたポリイミド多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリイミド多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリイミド多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。 In this specification, a "folded polyimide porous film" refers to a polyimide porous film that is folded inside the casing and is immobile inside the casing due to friction between each surface of the polyimide porous film and/or the surface inside the casing. In this specification, "folded" may refer to a state in which the polymer porous film has creases or does not have creases.
本明細書において、「該ポリイミド多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、該モジュール化ポリイミド多孔質膜を細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリイミド多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリイミド多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリイミド多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリイミド多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等による細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。 In this specification, "a state in which the polyimide porous membrane does not move within the casing" refers to a state in which the modularized polyimide porous membrane is housed within the casing so that the polyimide porous membrane does not continuously change shape when cultured in a cell culture medium. In other words, the polyimide porous membrane itself is restrained by the fluid so that it does not continuously undulate. Since the polyimide porous membrane remains motionless within the casing, stress is prevented from being applied to the cells growing within the polyimide porous membrane, and cells can be stably cultured without being killed by apoptosis or the like.
一実施態様において、本発明において用いられ得るモジュール化ポリイミド多孔質膜は、浮遊培養用の細胞培養容器内に固定されていない状態で培地中に浮遊させ、モジュール化ポリイミド多孔質膜にシェアストレスを付与する条件で培養される。これにより、モジュール化ポリイミド多孔質膜の培地流出入口に位置するポリイミド多孔質膜に生育している軟骨細胞の増殖が促進され、肥厚化したスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体が得られる。 In one embodiment, the modularized polyimide porous membrane that can be used in the present invention is suspended in a medium without being fixed in a cell culture vessel for suspension culture, and cultured under conditions that impart shear stress to the modularized polyimide porous membrane. This promotes the proliferation of chondrocytes growing in the polyimide porous membrane located at the medium inlet/outlet of the modularized polyimide porous membrane, and a thickened scaffold-free three-dimensional cartilage tissue is obtained.
シェアストレスは、例えば、旋回運動、往復運動、上下運動、波動形揺動運動、又はそれらの運動を組み合わせた状態で攪拌することが可能な市販の培養容器、培養装置及びシステム等にモジュール化ポリイミド多孔質膜を適用することにより付与することができる。例えば、培養容器が可撓性のバッグからなる培養装置にも適用可能であり、当該培養容器内に浮遊させた状態で使用することが可能である。また、本発明のモジュール化ポリイミド多孔質膜は、例えば、スピナーフラスコ等の撹拌式リアクターに適用し、培養することが可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ セルファクトリー等が含まれる。 Shear stress can be imparted by applying a modularized polyimide porous film to commercially available culture vessels, culture devices, and systems that can be stirred, for example, by rotating, reciprocating, up-down, wave-type rocking, or a combination of these motions. For example, the modularized polyimide porous film can be applied to a culture device in which the culture vessel is made of a flexible bag, and can be used in a state where it is suspended in the culture vessel. The modularized polyimide porous film of the present invention can also be applied to a stirring reactor such as a spinner flask for culturing. In addition, the modularized polyimide porous film can be applied to open containers and closed containers. For example, petri dishes, flasks, plastic bags, test tubes for cell culture, and large tanks can be used as appropriate. For example, cell culture dishes manufactured by BD Falcon and Nunc Cell Factory manufactured by Thermo Scientific are included.
４．細胞培養装置へのモジュール化ポリイミド多孔質膜の適用
本明細書において、「細胞培養装置」とは、一般に、細胞培養システム、バイオリアクター、又はリアクターと同義に扱われる用語であって、相互に入れ替えても同一の意味を有する。
4. Application of Modularized Polyimide Porous Membrane to Cell Culture Device In this specification, the term "cell culture device" is generally a term that is treated as synonymous with a cell culture system, a bioreactor, or a reactor, and has the same meaning even when used interchangeably.
５．ポリイミド多孔質膜
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１～１５０μｍ、０．０１～１００μｍ、０．０１～５０μｍ、０．０１μｍ～４０μｍ、０．０１μｍ～３０μｍ、０．０１μｍ～２０μｍ、又は０．０１μｍ～１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ～１５μｍである。
5. Polyimide Porous Film The average pore size of the pores present in the surface layer A (hereinafter also referred to as the "A side" or the "mesh side") in the polyimide porous film used in the present invention is not particularly limited, and is, for example, 0.01 μm or more and less than 200 μm, 0.01 to 150 μm, 0.01 to 100 μm, 0.01 to 50 μm, 0.01 μm to 40 μm, 0.01 μm to 30 μm, 0.01 μm to 20 μm, or 0.01 μm to 15 μm, and preferably 0.01 μm to 15 μm.
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ～１００μｍ、３０μｍ～１００μｍ、４０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～１００μｍ、又は６０μｍ～１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ～１００μｍである。 The average pore size of the pores present in the surface layer B (hereinafter also referred to as the "B surface" or "large hole surface") in the polyimide porous film used in the present invention is not particularly limited as long as it is larger than the average pore size of the pores present in the surface layer A, but is, for example, more than 5 μm and not more than 200 μm, 20 μm to 100 μm, 30 μm to 100 μm, 40 μm to 100 μm, 50 μm to 100 μm, or 60 μm to 100 μm, and preferably 20 μm to 100 μm.
ポリイミド多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは０．０１～２０μｍである。 The thickness of surface layers A and B is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 50 μm, and preferably 0.01 to 20 μm.
ポリイミド多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０～５００μｍであり、好ましくは１０～１００μｍであり、より好ましくは１０～８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは、０．０１～２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。 The average pore size of the macrovoids in the macrovoid layer in the polyimide porous film in the film plane direction is not particularly limited, but is, for example, 10 to 500 μm, preferably 10 to 100 μm, and more preferably 10 to 80 μm. The thickness of the partition walls in the macrovoid layer is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 50 μm, and preferably 0.01 to 20 μm. In one embodiment, at least one partition wall in the macrovoid layer has one or more holes with an average pore size of 0.01 to 100 μm, preferably 0.01 to 50 μm, that connect adjacent macrovoids. In another embodiment, the partition walls in the macrovoid layer have no pores.
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５～５００μｍであり、より好ましくは２５～７５μｍである。 The total thickness of the polyimide porous film surface used in the present invention is not particularly limited, but may be 5 μm or more, 10 μm or more, 20 μm or more, or 25 μm or more, and may be 500 μm or less, 300 μm or less, 100 μm or less, 75 μm or less, or 50 μm or less. It is preferably 5 to 500 μm, and more preferably 25 to 75 μm.
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。 The thickness of the polyimide porous film used in the present invention can be measured using a contact thickness gauge.
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。 The porosity of the polyimide porous film used in the present invention is not particularly limited, but is, for example, 40% or more and less than 95%.
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。 The polyimide porous film used in the present invention is preferably a three-layer polyimide porous film having surface layers A and B each having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is 0.01 μm to 15 μm, and the average pore size of the pores in the surface layer B is 20 μm to 100 μm, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, the partition walls of the macrovoid layer and the surface layers A and B have thicknesses of 0.01 to 20 μm, the pores in the surface layers A and B are connected to the macrovoids, the total film thickness is 5 to 500 μm, and the porosity is 40% or more but less than 95%. In one embodiment, at least one partition wall in the macrovoid layer has one or more holes with an average pore size of 0.01 to 100 μm, preferably 0.01 to 50 μm, that connect adjacent macrovoids. In another embodiment, the partition wall does not have such holes.
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。 The polyimide porous film used in the present invention is preferably sterilized. Sterilization treatments include, but are not limited to, any sterilization treatment such as dry heat sterilization, steam sterilization, sterilization with a disinfectant such as ethanol, and electromagnetic sterilization using ultraviolet rays or gamma rays.
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、且つ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。 Polyimide is a general term for polymers that contain imide bonds in the repeating units, and usually refers to aromatic polyimides in which aromatic compounds are directly linked by imide bonds. Aromatic polyimides have a rigid and strong molecular structure because aromatic compounds have a conjugated structure via imide bonds, and because the imide bonds have strong intermolecular forces, they have very high levels of thermal, mechanical, and chemical properties.
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。 The polyimide porous film that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous film containing (as a main component) a polyimide obtained from a tetracarboxylic dianhydride and a diamine, and more preferably a polyimide porous film consisting of a polyimide obtained from a tetracarboxylic dianhydride and a diamine. "Containing as a main component" means that the polyimide porous film does not essentially contain any components other than the polyimide obtained from the tetracarboxylic dianhydride and the diamine as constituent components, or may contain such components, but they are additional components that do not affect the properties of the polyimide obtained from the tetracarboxylic dianhydride and the diamine.
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。 In one embodiment, the polyimide porous film that can be used in the present invention includes a colored polyimide porous film obtained by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component and a colored precursor, and then heat-treating the polyamic acid solution composition at 250°C or higher.
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。 Polyamic acid is obtained by polymerizing a tetracarboxylic acid component and a diamine component. Polyamic acid is a polyimide precursor that can be converted to a polyimide by thermal imidization or chemical imidization to close the ring.
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。 The polyamic acid may be used even if a part of the amic acid is imidized, as long as it does not affect the present invention. In other words, the polyamic acid may be partially thermally or chemically imidized.
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。 When the polyamic acid is thermally imidized, an imidization catalyst, an organic phosphorus-containing compound, inorganic fine particles, organic fine particles, or other fine particles can be added to the polyamic acid solution as needed. When the polyamic acid is chemically imidized, a chemical imidization agent, a dehydrating agent, inorganic fine particles, organic fine particles, or other fine particles can be added to the polyamic acid solution as needed. It is preferable to carry out the process under conditions in which the color precursor does not precipitate even if the above components are mixed into the polyamic acid solution.
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。 In this specification, "colored precursor" refers to a precursor that is partially or completely carbonized by heat treatment at 250°C or higher to produce a colored product.
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。 The color precursor that can be used in the production of the polyimide porous film is preferably one that is uniformly dissolved or dispersed in a polyamic acid solution or a polyimide solution, and is thermally decomposed by heat treatment at 250°C or higher, preferably 260°C or higher, more preferably 280°C or higher, and more preferably 300°C or higher, preferably in the presence of oxygen such as air, at 250°C or higher, preferably 260°C or higher, more preferably 280°C or higher, and more preferably 300°C or higher, and is carbonized to produce a colored product, more preferably one that produces a black colored product, and more preferably a carbon-based color precursor.
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。 When the colored precursors are heated, they become what at first glance appears to be carbonized, but in terms of their structure they contain elements other than carbon, and include layered structures, aromatic bridged structures, and disordered structures that include tetrahedral carbon.
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。 The carbon-based coloring precursor is not particularly limited, and examples thereof include tar or pitch such as petroleum tar, petroleum pitch, coal tar, and coal pitch, coke, polymers obtained from monomers containing acrylonitrile, ferrocene compounds (ferrocene and ferrocene derivatives), etc. Among these, polymers and/or ferrocene compounds obtained from monomers containing acrylonitrile are preferred, and polyacrylonitrile is preferred as a polymer obtained from a monomer containing acrylonitrile.
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。 In another embodiment, the polyimide porous film that can be used in the present invention includes a polyimide porous film obtained by molding a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component, without using the above-mentioned colored precursor, and then heat-treating the polyimide porous film.
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０～３．０であるポリアミック酸３～６０質量％と有機極性溶媒４０～９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。 A polyimide porous film produced without using a colored precursor may be produced, for example, by casting a polyamic acid solution consisting of 3 to 60% by mass of a polyamic acid having an intrinsic viscosity of 1.0 to 3.0 and 40 to 97% by mass of an organic polar solvent into a film, immersing or contacting the polyamic acid solution with a water-based coagulation solvent to produce a polyamic acid porous film, and then heat-treating the polyamic acid porous film to imidize it. In this method, the water-based coagulation solvent may be water, or a mixture of 5% to less than 100% by mass of water and more than 0% to 95% by mass of an organic polar solvent. After the imidization, at least one side of the obtained porous polyimide film may be subjected to a plasma treatment.
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ－ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ－フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ－ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ｐ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、１，３－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２－ビス〔（３，４－ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’－（２，２－ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’－ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。 Any tetracarboxylic dianhydride can be used in the production of the polyimide porous film, and can be selected appropriately depending on the desired properties, etc. Specific examples of tetracarboxylic dianhydrides include pyromellitic dianhydride, biphenyl tetracarboxylic dianhydrides such as 3,3',4,4'-biphenyl tetracarboxylic dianhydride (s-BPDA) and 2,3,3',4'-biphenyl tetracarboxylic dianhydride (a-BPDA), oxydiphthalic dianhydride, diphenylsulfone-3,4,3',4'-tetracarboxylic dianhydride, bis(3,4-dicarboxyphenyl)sulfide dianhydride, 2,2-bis(3,4-dicarboxyphenyl)-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane dianhydride, 2,3,3',4'-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, 3,3',4,4'-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, bis(3,4-dicarboxyphenyl)methane dianhydride, and 2,2-bis(3,4-dicarboxyphenyl)propane dianhydride. dianhydride, p-phenylene bis(trimellitic acid monoester acid anhydride), p-biphenylene bis(trimellitic acid monoester acid anhydride), m-terphenyl-3,4,3',4'-tetracarboxylic acid dianhydride, p-terphenyl-3,4,3',4'-tetracarboxylic acid dianhydride, 1,3-bis(3,4-dicarboxyphenoxy)benzene dianhydride, 1,4-bis(3,4-dicarboxyphenoxy)benzene dianhydride, 1,4-bis(3,4-dicarboxyphenoxy)biphenyl dianhydride, 2,2-bis[(3,4-dicarboxyphenoxy)phenyl]propane dianhydride, 2,3,6,7-naphthalene tetracarboxylic acid dianhydride, 1,4,5,8-naphthalene tetracarboxylic acid dianhydride, 4,4'-(2,2-hexafluoroisopropylidene)diphthalic dianhydride, and the like. It is also preferable to use aromatic tetracarboxylic acids such as 2,3,3',4'-diphenylsulfonetetracarboxylic acid. These can be used alone or in combination of two or more.
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。 Among these, at least one aromatic tetracarboxylic dianhydride selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic dianhydride and pyromellitic dianhydride is particularly preferred. As the biphenyltetracarboxylic dianhydride, 3,3',4,4'-biphenyltetracarboxylic dianhydride can be suitably used.
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４－ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３－ジアミノベンゼン、２，４－ジアミノトルエン、２，６－ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ビス（トリフルオロメチル）－４，４’－ジアミノビフェニル、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジカルボキシ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’－テトラメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、ビス（４－アミノフェニル）スルフィド、４，４’－ジアミノベンズアニリド、３，３’－ジクロロベンジジン、３，３’－ジメチルベンジジン、２，２’－ジメチルベンジジン、３，３’－ジメトキシベンジジン、２，２’－ジメトキシベンジジン、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，３’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’－ジアミノジフェニルスルホン、３，４’－ジアミノジフェニルスルホン、４，４’－ジアミノジフェニルスルホン、３，３’－ジアミノベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジクロロベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジメトキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノジフェニルメタン、３，４’－ジアミノジフェニルメタン、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、３，３’－ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’－ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’－ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェノキシ）－４－トリフルオロメチルベンゼン、３，３’－ジアミノ－４－（４－フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジ（４－フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（３－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
The diamine that can be used in the production of the polyimide porous film may be any diamine. Specific examples of the diamine include the following:
1) Benzenediamines having one benzene nucleus, such as 1,4-diaminobenzene (paraphenylenediamine), 1,3-diaminobenzene, 2,4-diaminotoluene, and 2,6-diaminotoluene;
2) Diaminodiphenyl ethers such as 4,4'-diaminodiphenyl ether and 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenylmethane, 3,3'-dimethyl-4,4'-diaminobiphenyl, 2,2'-dimethyl-4,4'-diaminobiphenyl, 2,2'-bis(trifluoromethyl)-4,4'-diaminobiphenyl, 3,3'-dimethyl-4,4'-diaminodiphenylmethane, 3,3'-dicarboxy-4,4'-diaminodiphenylmethane, 3 , 3',5,5'-tetramethyl-4,4'-diaminodiphenylmethane, bis(4-aminophenyl)sulfide, 4,4'-diaminobenzanilide, 3,3'-dichlorobenzidine, 3,3'-dimethylbenzidine, 2,2'-dimethylbenzidine, 3,3'-dimethoxybenzidine, 2,2'-dimethoxybenzidine, 3,3'-diaminodiphenyl ether, 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenyl ether, 3,3'-diaminodiphenyl Sulfide, 3,4'-diaminodiphenyl sulfide, 4,4'-diaminodiphenyl sulfide, 3,3'-diaminodiphenyl sulfone, 3,4'-diaminodiphenyl sulfone, 4,4'-diaminodiphenyl sulfone, 3,3'-diaminobenzophenone, 3,3'-diamino-4,4'-dichlorobenzophenone, 3,3'-diamino-4,4'-dimethoxybenzophenone, 3,3'-diaminodiphenylmethane, 3,4'-diaminodiphenylmethane, 4,4'-di diamines having two benzene nuclei, such as aminodiphenylmethane, 2,2-bis(3-aminophenyl)propane, 2,2-bis(4-aminophenyl)propane, 2,2-bis(3-aminophenyl)-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane, 2,2-bis(4-aminophenyl)-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane, 3,3'-diaminodiphenyl sulfoxide, 3,4'-diaminodiphenyl sulfoxide, and 4,4'-diaminodiphenyl sulfoxide;
3) 1,3-bis(3-aminophenyl)benzene, 1,3-bis(4-aminophenyl)benzene, 1,4-bis(3-aminophenyl)benzene, 1,4-bis(4-aminophenyl)benzene, 1,3-bis(4-aminophenoxy)benzene, 1,4-bis(3-aminophenoxy)benzene, 1,4-bis(4-aminophenoxy)benzene, 1,3-bis(3-aminophenoxy)-4-trifluoromethylbenzene, 3,3'-diamino-4-(4-phenyl)phenoxybenzophenone, 3,3'-diamino-4,4'-di(4-phenylphenoxy)benzophenone, 1,3 -Bis(3-aminophenylsulfide)benzene, 1,3-bis(4-aminophenylsulfide)benzene, 1,4-bis(4-aminophenylsulfide)benzene, 1,3-bis(3-aminophenylsulfone)benzene, 1,3-bis(4-aminophenylsulfone)benzene, 1,4-bis(4-aminophenylsulfone)benzene, 1,3-bis[2-(4-aminophenyl)isopropyl]benzene, 1,4-bis[2-(3-aminophenyl)isopropyl]benzene, 1,4-bis[2-(4-aminophenyl)isopropyl]benzene, and other diamines having three benzene nuclei;
4) 3,3'-bis(3-aminophenoxy)biphenyl, 3,3'-bis(4-aminophenoxy)biphenyl, 4,4'-bis(3-aminophenoxy)biphenyl, 4,4'-bis(4-aminophenoxy)biphenyl, bis[3-(3-aminophenoxy)phenyl]ether, bis[3-(4-aminophenoxy)phenyl]ether, bis[4-(3-aminophenoxy)phenyl]ether, bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]ether, bis[3-(3-aminophenoxy)phenyl]ketone, bis[3-(4-aminophenoxy)phenyl]ketone, bis[4-(3-aminophenoxy)phenyl]ketone, bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]ketone, bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]ketone, bis[3-(3-aminophenoxy)phenyl]sulfide, bis[3-(4-aminophenoxy)phenyl]sulfide, bis[4-(3-aminophenoxy)phenyl]sulfide, bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]sulfide, bis[3-(3-aminophenoxy)phenyl]sulfone, bis[3-(4-aminophenoxy)phenyl]sulfone, bis[4-(3-aminophenoxy)phenyl]sulfone bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]sulfone, bis[3-(3-aminophenoxy)phenyl]methane, bis[3-(4-aminophenoxy)phenyl]methane, bis[4-(3-aminophenoxy)phenyl]methane, bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]methane, 2,2-bis[3-(3-aminophenoxy)phenyl]propane, 2,2-bis[3-(4-aminophenoxy)phenyl]propane, 2,2-bis[4-(3-aminophenoxy)phenyl]propane, 2,2- Diamines having four benzene nuclei such as bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]propane, 2,2-bis[3-(3-aminophenoxy)phenyl]-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane, 2,2-bis[3-(4-aminophenoxy)phenyl]-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane, 2,2-bis[4-(3-aminophenoxy)phenyl]-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane, and 2,2-bis[4-(4-aminophenoxy)phenyl]-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane.
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。 These can be used alone or in combination of two or more. The diamine to be used can be selected appropriately depending on the desired properties.
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。 Among these, aromatic diamine compounds are preferred, and 3,3'-diaminodiphenyl ether, 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenyl ether, paraphenylenediamine, 1,3-bis(3-aminophenyl)benzene, 1,3-bis(4-aminophenyl)benzene, 1,4-bis(3-aminophenyl)benzene, 1,4-bis(4-aminophenyl)benzene, 1,3-bis(4-aminophenoxy)benzene, and 1,4-bis(3-aminophenoxy)benzene can be suitably used. In particular, at least one diamine selected from the group consisting of benzenediamine, diaminodiphenyl ether, and bis(aminophenoxy)phenyl is preferred.
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。 From the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperatures, the polyimide porous film that can be used in the present invention is preferably formed from a polyimide obtained by combining a tetracarboxylic dianhydride and a diamine that has a glass transition temperature of 240°C or higher or has no clear transition point at 300°C or higher.
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
The polyimide porous film that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous film made of the following aromatic polyimides, from the viewpoints of heat resistance and dimensional stability at high temperatures.
(i) an aromatic polyimide comprising at least one tetracarboxylic acid unit selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic acid units and pyromellitic acid units, and an aromatic diamine unit;
(ii) an aromatic polyimide comprising a tetracarboxylic acid unit and at least one aromatic diamine unit selected from the group consisting of a benzenediamine unit, a diaminodiphenyl ether unit and a bis(aminophenoxy)phenyl unit;
and/or
(iii) An aromatic polyimide comprising at least one tetracarboxylic acid unit selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic acid units and pyromellitic acid units, and at least one aromatic diamine unit selected from the group consisting of benzenediamine units, diaminodiphenyl ether units, and bis(aminophenoxy)phenyl units.
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。 The polyimide porous film used in the present invention is preferably a three-layer polyimide porous film having surface layers A and B each having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is 0.01 μm to 15 μm, and the average pore size of the pores in the surface layer B is 20 μm to 100 μm, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, the partition walls of the macrovoid layer and the surface layers A and B have thicknesses of 0.01 to 20 μm, the pores in the surface layers A and B are connected to the macrovoids, the total film thickness is 5 to 500 μm, and the porosity is 40% or more but less than 95%. Here, at least one partition in the macrovoid layer has one or more pores with an average pore size of 0.01 to 100 μm, preferably 0.01 to 50 μm, that connect adjacent macrovoids.
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１－２１９５８５号公報、又は特開２０１１－２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。 For example, the polyimide porous films described in International Publication No. 2010/038873, Japanese Patent Application Publication No. 2011-219585, or Japanese Patent Application Publication No. 2011-219586 can also be used in the present invention.
６．モジュール化ポリイミド多孔質膜への軟骨細胞の適用
細胞のモジュール化ポリイミド多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、軟骨細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、モジュール化ポリイミド多孔質膜への軟骨細胞の適用（播種）は、例えば、以下のような態様を含むものであってもよい。
（１）懸濁された軟骨細胞を含む第１培地を、モジュール化ポリイミド多孔質膜に適用する工程、
（２）前記モジュール化ポリイミド多孔質膜を細胞培養可能な温度に維持し、前記モジュール化ポリイミド多孔質膜中のポリイミド多孔質膜に前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記モジュール化ポリイミド多孔質膜を、浮遊培養用の細胞培養容器内に固定されていない状態で培地中に浮遊させ、前記モジュール化ポリイミド多孔質膜を旋回運動、往復運動、上下運動、波動形揺動運動、回転運動又はそれらの運動を組み合わせた状態で振盪及び／又は攪拌しながら第２培地にて培養する工程、
を含む。
6. Application of chondrocytes to modularized polyimide porous membrane The specific steps for applying cells to a modularized polyimide porous membrane are not particularly limited. The steps described herein or any method suitable for applying chondrocytes to a membrane-like carrier can be adopted. Although not limited thereto, in the method of the present invention, application (seeding) of chondrocytes to a modularized polyimide porous membrane may include, for example, the following aspects.
(1) applying a first culture medium containing suspended chondrocytes to a modularized polyimide porous membrane;
(2) maintaining the modularized polyimide porous membrane at a temperature suitable for cell culture, and allowing the cells to be adsorbed to the polyimide porous membrane in the modularized polyimide porous membrane; and
(3) A step of floating the modularized polyimide porous membrane having the cells adsorbed thereon in a medium without being fixed in a cell culture vessel for suspension culture, and culturing the modularized polyimide porous membrane in a second medium while shaking and/or stirring the membrane in a rotating motion, a reciprocating motion, an up-down motion, a wave-type rocking motion, a rotating motion, or a combination of these motions;
including.
モジュール化ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図４に示す。図４は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の細胞の培養方法では、モジュール化ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリイミド多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。 Figure 4 shows a model diagram of cell culture using a modularized polyimide porous membrane. Figure 4 is a diagram to aid understanding, and each element is not drawn to scale. In the cell culture method of the present invention, cells are applied to a modularized polyimide porous membrane and cultured, and a large number of cells grow in the multifaceted connected porous parts and surfaces inside the polyimide porous membrane, making it possible to culture a large number of cells easily. In addition, in the cell culture method of the present invention, it is possible to culture a large number of cells while significantly reducing the amount of medium used for cell culture compared to conventional methods. For example, a large number of cells can be cultured for a long period of time even if a part or the entire polyimide porous membrane is not in contact with the liquid phase of the cell culture medium. In addition, it is also possible to significantly reduce the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel relative to the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area.
本明細書において、細胞を含まないポリイミド多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリイミド多孔質膜体積」と呼称する（図４参照）。そして、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、ポリイミド多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリイミド多孔質膜、細胞、及びポリイミド多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積」と呼称する（図４参照）。膜厚２５μｍのポリイミド多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積は、見かけ上ポリイミド多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリイミド多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリイミド多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和」と記載することがある。 In this specification, the volume occupied by the polyimide porous membrane without cells, including the volume of its internal gaps, is referred to as the "apparent polyimide porous membrane volume" (see FIG. 4). Then, when cells are applied to the polyimide porous membrane and the cells are supported on the surface and inside of the polyimide porous membrane, the volume occupied by the polyimide porous membrane, the cells, and the culture medium infiltrated inside the polyimide porous membrane as a whole in the space is referred to as the "polyimide porous membrane volume including the cell survival area" (see FIG. 4). In the case of a polyimide porous membrane with a thickness of 25 μm, the polyimide porous membrane volume including the cell survival area is a value up to about 50% larger than the apparent polyimide porous membrane volume. In the method of the present invention, multiple polyimide porous membranes can be accommodated and cultured in one cell culture vessel. In this case, the sum of the polyimide porous membrane volumes including the cell survival area for each of the multiple polyimide porous membranes supporting cells may be simply described as the "sum of the polyimide porous membrane volumes including the cell survival area".
前記モジュール化ポリイミド多孔質膜を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。 By using the modularized polyimide porous membrane, it becomes possible to culture cells well for a long period of time even under conditions where the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 10,000 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area. Also, cells can be cultured well for a long period of time even under conditions where the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 1,000 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area. Furthermore, cells can be cultured well for a long period of time even under conditions where the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 100 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area. And, cells can be cultured well for a long period of time even under conditions where the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 10 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area.
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリイミド多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリイミド多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。 In other words, according to the present invention, the space (container) for cell culture can be made as small as possible compared to conventional cell culture devices for two-dimensional culture. In addition, if it is desired to increase the number of cells to be cultured, the volume for cell culture can be flexibly increased by a simple operation such as increasing the number of polyimide porous films to be laminated. With a cell culture device equipped with the polyimide porous film used in the present invention, it is possible to separate the space (container) for culturing cells from the space (container) for storing the cell culture medium, and it is possible to prepare the required amount of cell culture medium according to the number of cells to be cultured. The space (container) for storing the cell culture medium may be enlarged or small depending on the purpose, or may be a replaceable container, and is not particularly limited.
本発明の方法において、例えば、ポリイミド多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０５個以上、１．０×１０６個以上、２．０×１０６個以上、５．０×１０６個以上、１．０×１０７個以上、２．０×１０７個以上、５．０×１０７個以上、１．０×１０８個以上、２．０×１０８個以上、５．０×１０８個以上、１．０×１０９個以上、２．０×１０９個以上、または５．０×１０９個以上となるまで培養され得る。 In the method of the present invention, for example, the number of cells contained in the cell culture vessel after culture using the polyimide porous membrane can be cultured until the number of cells per milliliter of medium is 1.0 x 10 or more, 1.0 x 10 or more, 2.0 x 10 or more, 5.0 x 10 or more, 1.0 x 10 or more, 2.0 x 10 or more, 5.0 x 10 or more, 1.0 x 10 or more, 2.0 x 10 or more, 5.0 x 10 or more, 1.0 x 10 or more, 2.0 x 10 or more, 5.0 x 10 or more, 1.0 x 10 or more, 2.0 x 10 or more, or 5.0 x 10 or more , assuming that all the cells are uniformly dispersed in the cell culture medium contained in the cell culture vessel.
本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。 In this specification, the term "medium" refers to a cell culture medium for culturing cells, particularly animal cells. The term "medium" is used synonymously with the term "cell culture fluid." Therefore, the medium used in the present invention refers to a liquid medium. The type of medium may be any commonly used medium, and is determined appropriately depending on the type of cells to be cultured.
本発明の細胞の培養において、該工程（１）で用いられる第１培地は、細胞を培養できる培地であれば特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞を培養する場合であれば、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＢａｌａｎＣＤ（商標） ＣＨＯ ＧＲＯＷＴＨ Ａを用いることができる。 In the culture of the cells of the present invention, the first medium used in step (1) is not particularly limited as long as it is a medium capable of culturing cells. For example, when culturing CHO cells, BalanCD (trademark) CHO GROWTH A manufactured by Irvine Scientific can be used.
本発明の細胞の培養において、該工程（２）の細胞培養可能な温度とは、細胞がポリイミド多孔質膜に吸着可能な温度であればよく、１０℃～４５℃、好ましくは、１５℃～４２℃、より好ましくは２０℃～４０℃、さらに好ましくは２５℃～３９℃である。また、本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）の細胞を吸着させる時間は、例えば、５分～２４時間、好ましくは１０分～１２時間、より好ましくは１５分～５００分である。 In the cell culture of the present invention, the temperature at which cells can be cultured in step (2) may be any temperature at which cells can be adsorbed to the polyimide porous membrane, and is 10°C to 45°C, preferably 15°C to 42°C, more preferably 20°C to 40°C, and even more preferably 25°C to 39°C. In addition, in the cell culture method of the present invention, the time for adsorbing cells in step (2) is, for example, 5 minutes to 24 hours, preferably 10 minutes to 12 hours, and more preferably 15 minutes to 500 minutes.
本発明の細胞の培養において、該工程（２）は、振とう及び／又は攪拌しながら、該モジュール化ポリイミド多孔質膜の該ポリイミド多孔質膜へ細胞を吸着させてもよく、静置して該モジュール化ポリイミド多孔質膜の該ポリイミド多孔質膜へ細胞を吸着させてもよい。振とうする方法は特に限定されないが、例えば、市販の振とう装置上に、本発明のモジュール化ポリイミド多孔質膜と細胞とを含む培養容器を載置し、振とうしてもよい。振とうは、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、振とうと静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。攪拌する方法は特に限定されないが、例えば、本発明のモジュール化ポリイミド多孔質膜と細胞とを市販のスピナーフラスコ内に入れ、スターラーを回転させることで攪拌してもよい。攪拌は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、攪拌と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。 In the culture of the cells of the present invention, in the step (2), the cells may be adsorbed to the polyimide porous membrane of the modularized polyimide porous membrane while shaking and/or stirring, or may be left to stand to allow the cells to be adsorbed to the polyimide porous membrane of the modularized polyimide porous membrane. The shaking method is not particularly limited, but for example, a culture vessel containing the modularized polyimide porous membrane of the present invention and the cells may be placed on a commercially available shaking device and shaken. The shaking may be performed continuously or intermittently, for example, shaking and standing may be repeated alternately, and may be appropriately adjusted. The stirring method is not particularly limited, but for example, the modularized polyimide porous membrane of the present invention and the cells may be placed in a commercially available spinner flask and stirred by rotating a stirrer. The stirring may be performed continuously or intermittently, for example, stirring and standing may be repeated alternately, and may be appropriately adjusted.
本発明の細胞の培養において、該工程（３）で用いられる第２培地は、接着細胞の培養に用いられる培地が選択され、例えば、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２などを用いることができるが、これに限定されない。第２培地は、細胞が基材へ接着するのを阻害する成分、例えば、界面活性剤が含まれない培地が好ましい。使用される第２培地は、細胞の種類によって適宜選択される。該工程（３）において、第２培地で培養することで、該工程（２）でポリイミド多孔質膜に吸着された細胞が、該ポリマー多孔性膜内に接着することを促進する。これによって、細胞が該ポリイミド多孔質膜から脱落することなく安定的に培養可能である。また、本発明の細胞の培養方法は、前述のポリイミド多孔質膜を備えたモジュール化ポリイミド多孔質膜を使用する。本発明の細胞の培養方法で用いられるモジュール化ポリイミド多孔質膜は、ポリイミド多孔質膜がケーシングに収容されていることによって、膜状のポリイミド多孔質膜がケーシング内で継続的に形態が変形することが防止されている。これによって、ポリイミド多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的且つ大量の細胞を培養することが可能となる。 In the cell culture of the present invention, the second medium used in the step (3) is selected from media used for culturing adherent cells, and may be, for example, D-MEM, E-MEM, IMDM, Ham's F-12, etc., but is not limited thereto. The second medium is preferably a medium that does not contain a component that inhibits adhesion of cells to a substrate, such as a surfactant. The second medium used is appropriately selected depending on the type of cells. In the step (3), culturing in the second medium promotes adhesion of the cells adsorbed to the polyimide porous membrane in the step (2) into the polymer porous membrane. This allows stable culture of cells without falling off the polyimide porous membrane. In addition, the cell culture method of the present invention uses a modularized polyimide porous membrane equipped with the aforementioned polyimide porous membrane. The modularized polyimide porous membrane used in the cell culture method of the present invention is prevented from continuously deforming in shape within the casing by containing the polyimide porous membrane in a casing. This prevents stress from being applied to the cells growing within the polyimide porous film, suppresses apoptosis, etc., and makes it possible to culture large quantities of cells stably.
本発明の細胞の培養において、該工程（３）は、細胞を培養する培養容器、培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性バッグ型培養容器であってもよく、また、撹拌式リアクター、例えばスピナーフラスコ等の培養容器で培養することも可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ セルファクトリー等が含まれる。また、本発明の細胞の培養方法において、モジュール化ポリイミド多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能となる。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコ等の撹拌式リアクターが使用可能である。また、該工程（３）は、本明細書に記載の細胞培養装置で実施してもよい。 In the cell culture of the present invention, the step (3) can be performed using commercially available culture vessels, culture devices, and systems for culturing cells. For example, the culture vessel may be a flexible bag-type culture vessel, and the culture can be performed in a culture vessel such as a stirred reactor, for example, a spinner flask. In addition, the culture vessel can be an open vessel or a closed vessel. For example, a petri dish, flask, plastic bag, test tube, or large tank for cell culture can be appropriately used. For example, cell culture dishes manufactured by BD Falcon and Nunc Cell Factory manufactured by Thermo Scientific are included. In addition, by using a modularized polyimide porous membrane in the cell culture method of the present invention, it is possible to culture cells that were not originally capable of suspension culture in a suspension culture-like state using a suspension culture device. As a suspension culture device, for example, a stirred reactor such as a Corning spinner flask can be used. In addition, the step (3) may be performed using the cell culture device described in this specification.
本発明の細胞の培養において、該工程（３）は、該モジュール化ポリイミド多孔質膜を含む培養容器に連続的に培地を添加し回収するような連続循環型の装置を用いて実行することも可能である。 In the culture of the cells of the present invention, the step (3) can also be carried out using a continuous circulation type device that continuously adds and recovers culture medium to a culture vessel containing the modularized polyimide porous membrane.
本発明の細胞の培養において、該工程（３）は、該モジュール化ポリイミド多孔質膜を含む培養容器の外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系であってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系とすることができる。 In the cell culture of the present invention, the step (3) may be a system in which the cell culture medium is continuously or intermittently supplied into the cell culture vessel from a cell culture medium supplying means installed outside the culture vessel containing the modularized polyimide porous membrane. In this case, the system may be one in which the cell culture medium circulates between the cell culture medium supplying means and the cell culture vessel.
７．軟骨細胞の培養条件
本発明の方法において、モジュール化ポリイミド多孔質膜を浮遊培養用の細胞培養容器内に固定されていない状態で培地中に浮遊させ、前記モジュール化ポリイミド多孔質膜を旋回運動、往復運動、上下運動、波動形揺動運動、回転運動又はそれらの運動を組み合わせた状態で攪拌可能な培養容器、培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性バッグ型培養容器であってもよく、また、撹拌式リアクター、例えばスピナーフラスコ等の培養容器で培養することも可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ セルファクトリー等が含まれる。また、本発明の細胞の培養方法において、モジュール化ポリイミド多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能となる。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコ等の撹拌式リアクターが使用可能である。
7. Culture Conditions for Chondrocytes In the method of the present invention, a commercially available culture vessel, culture device, system, etc. can be used as long as the modularized polyimide porous membrane is suspended in a medium without being fixed in a cell culture vessel for suspension culture, and the modularized polyimide porous membrane can be stirred in a state of rotation, reciprocation, up and down movement, wave-type rocking movement, rotation, or a combination of these movements. For example, the culture vessel may be a flexible bag-type culture vessel, and culture can also be performed in a culture vessel such as a stirring reactor, for example, a spinner flask. In addition, the culture vessel can be applied to an open vessel or a closed vessel. For example, a petri dish, flask, plastic bag, test tube, or large tank for cell culture can be appropriately used. For example, a cell culture dish manufactured by BD Falcon and a Nunc Cell Factory manufactured by Thermo Scientific are included. In addition, by using a modularized polyimide porous membrane in the cell culture method of the present invention, it becomes possible to culture cells that were not originally capable of suspension culture in a state similar to suspension culture in a device for suspension culture. As an apparatus for suspension culture, for example, a stirring reactor such as a spinner flask manufactured by Corning Incorporated can be used.
一実施態様において、本発明で用いられ得る細胞培養容器は、フラスコ、培養ボトル、培養ディッシュ、培養バッグ、撹拌式リアクターからなる群から選択される培養容器であってもよい。 In one embodiment, the cell culture vessel that can be used in the present invention may be a culture vessel selected from the group consisting of a flask, a culture bottle, a culture dish, a culture bag, and a stirred reactor.
本明細書において、「旋回運動」とは、水平面と平行な面において培養容器を旋回させて、培養容器内の液体を攪拌させる運動であり、本発明に旋回運動を適用する場合は、市販の培養シェーカー、例えば旋回振盪シェーカーを用いればよい。本発明において適用される旋回運動は、例えば４０ｒｐｍ～１５０ｒｐｍで実施してもよい。本発明において適用される旋回運動は、例えば、旋回運動の直径が０．５～１０ｃｍにて実施されるものであってもよい。 In this specification, "swirling motion" refers to a motion in which the culture vessel is rotated in a plane parallel to the horizontal plane to stir the liquid in the culture vessel. When applying the swirling motion to the present invention, a commercially available culture shaker, for example, a swirling shaking shaker, may be used. The swirling motion applied in the present invention may be performed, for example, at 40 rpm to 150 rpm. The swirling motion applied in the present invention may be performed, for example, with a swirling motion diameter of 0.5 to 10 cm.
本明細書において、「往復運動」とは、培養容器を左右又は前後に移動させて培養容器内の液体を攪拌させる運動であり、本発明に往復運動を適用する場合は、市販の培養シェーカー、例えば往復振盪シェーカーを用いればよい。本発明において適用される往復運動は、例えば４０往復／分～１５０往復／分で実施されるものであってもよい。本発明において適用される往復運動の移行距離は、例えば、０．５～１０ｃｍにて実施されるものであってもよい。 In this specification, "reciprocating motion" refers to a motion in which the culture vessel is moved left and right or back and forth to stir the liquid in the culture vessel. When reciprocating motion is applied to the present invention, a commercially available culture shaker, for example, a reciprocating shaking shaker, may be used. The reciprocating motion applied to the present invention may be performed at, for example, 40 reciprocations/min to 150 reciprocations/min. The transition distance of the reciprocating motion applied to the present invention may be, for example, 0.5 to 10 cm.
本明細書において、「上下運動」とは、培養容器を垂直方向に上下に移動させて培養容器内の液体を攪拌させる運動であり、上下運動を適用する場合は、市販の培養シェーカー、例えば上下振盪シェーカーを用いればよい。本発明において適用される上下運動は、例えば４０往復／分～１５０往復／分で実施されるものであってもよい。本発明において適用される往復運動の移行距離は、例えば、０．５～１０ｃｍにて実施されるものであってもよい。 In this specification, "up-and-down movement" refers to a movement in which the culture vessel is moved up and down in a vertical direction to agitate the liquid in the culture vessel. When applying up-and-down movement, a commercially available culture shaker, for example, an up-and-down shaking shaker, may be used. The up-and-down movement applied in the present invention may be performed, for example, at 40 reciprocations/min to 150 reciprocations/min. The transition distance of the reciprocating movement applied in the present invention may be, for example, 0.5 to 10 cm.
本明細書において、「波動形揺動運動」とは、前後及び／又は左右のシーソー運動により、培養容器内の液体に波動を生じさせて攪拌する運動である。波動形揺動運動を実施するためには、市販の培養シェーカー、例えばＷＡＶＥリアクターを用いればよい。本発明において適用される波動形揺動運動は、例えば、細胞培養容器の底面を４度～１５度の範囲で傾斜させて揺動するものであってもよい。また、本発明において適用される波動形揺動運動は、例えば、５ｒｐｍ～２５ｒｐｍにて実施されるものであってもよい。 In this specification, "wave-type rocking motion" refers to a motion that generates a wave motion in the liquid in the culture vessel by a seesaw motion back and forth and/or left and right, thereby stirring the liquid. To perform the wave-type rocking motion, a commercially available culture shaker, for example, a WAVE reactor, may be used. The wave-type rocking motion applied in the present invention may be, for example, rocking the bottom surface of the cell culture vessel at an inclination in the range of 4 degrees to 15 degrees. In addition, the wave-type rocking motion applied in the present invention may be, for example, performed at 5 rpm to 25 rpm.
本明細書において、「回転運動」とは、培養容器内の液体を、物理的な攪拌手段を回転させることによって培養容器内の液体を攪拌させる運動である。回転運動を実施するためには、例えば撹拌式リアクター、例えば、スピナーフラスコ、又は攪拌翼を有する据え置き攪拌型リアクターなどを用いればよい。本発明において適用される回転運動は、例えば、１０ｒｐｍ～３００ｒｐｍにて実施されるものであってもよい。 In this specification, "rotational movement" refers to a movement in which the liquid in the culture vessel is stirred by rotating a physical stirring means. In order to perform the rotational movement, for example, a stirred reactor, such as a spinner flask or a stationary stirred reactor having a stirring blade, may be used. The rotational movement applied in the present invention may be performed, for example, at 10 rpm to 300 rpm.
本発明において、細胞が適用されたモジュール化ポリイミド多孔質膜は、旋回運動、往復運動、上下運動、波動形揺動運動、回転運動又はそれらの運動を組み合わせた状態で振盪及び／又は攪拌しながら培養される。一実施態様において、本発明は、培養容器として培養バッグが用いられ、培養シェーカーを用いることにより、モジュール化ポリイミド多孔質膜を旋回運動及び波動形揺動運動させた状態で攪拌しながら、培養する。これにより、安定且つ効率的にスキャフォールドフリー三次元軟骨組織体を製造することが可能となる。 In the present invention, the modularized polyimide porous membrane to which the cells are applied is cultured while being shaken and/or stirred in a state of rotational motion, reciprocating motion, up-down motion, wave-type rocking motion, rotational motion, or a combination of these motions. In one embodiment, the present invention uses a culture bag as the culture vessel, and cultures the modularized polyimide porous membrane while being stirred in a state of rotational motion and wave-type rocking motion by using a culture shaker. This makes it possible to stably and efficiently produce a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue.
一実施態様における本発明では間歇的に培地を交換する事で、長期培養を指向する事も可能である。 In one embodiment of the present invention, it is possible to aim for long-term culture by intermittently changing the culture medium.
本発明において、軟骨細胞を連続的に培養してもよい。例えば、本発明の方法における培養は、モジュール化ポリイミド多孔質膜に連続的に培地を添加し回収するような連続循環もしくは開放型の装置を用いて、空気中にポリイミド多孔質膜を露出させるような型式で実行することも可能である。 In the present invention, chondrocytes may be cultured continuously. For example, the culture in the method of the present invention can be performed in a manner that exposes the polyimide porous membrane to the air using a continuous circulation or open type device that continuously adds and recovers culture medium to the modularized polyimide porous membrane.
本発明において、軟骨細胞の培養は、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行ってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系であることができる。 In the present invention, chondrocytes may be cultured in a system in which the cell culture medium is continuously or intermittently supplied into the cell culture vessel from a cell culture medium supplying means installed outside the cell culture vessel. In this case, the system may be one in which the cell culture medium circulates between the cell culture medium supplying means and the cell culture vessel.
本発明は、細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、軟骨細胞を培養することを含む、態様を含む。また、本発明は、ベンチトップリアクターの様な単独型細胞培養装置中で、細胞を培養することを含む、態様を含む。細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行う場合、その系は、細胞培養容器である培養ユニットと細胞培養培地供給手段である培地供給ユニットとを含む細胞培養装置であってよく、ここで、培養ユニットは細胞を担持するための１又は複数のモジュール化ポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである、細胞培養装置であってよい。 The present invention includes an embodiment including culturing chondrocytes by installing a cell culture device in an incubator. The present invention also includes an embodiment including culturing cells in a standalone cell culture device such as a bench-top reactor. When the cell culture device is used in a system in which cell culture medium is continuously or intermittently supplied to the cell culture container from a cell culture medium supplying means installed outside the cell culture container, the system may be a cell culture device including a culture unit that is a cell culture container and a culture medium supplying unit that is a cell culture medium supplying means, where the culture unit is a culture unit that houses one or more modularized polyimide porous membranes for supporting cells and is equipped with a culture medium supply port and a culture medium discharge port, and the culture medium supplying unit is equipped with a culture medium storage container, a culture medium supplying line, and a liquid delivery pump that delivers the culture medium through the culture medium supplying line, where a first end of the culture medium supplying line contacts the culture medium in the culture medium storage container, and a second end of the culture medium supplying line communicates with the inside of the culture unit through the culture medium supplying port of the culture unit.
また、上記細胞培養装置において、培養ユニットは培地供給ライン、送液ポンプ、空気供給口及び空気排出口を備えない培養ユニットであってよく、また、培地供給ライン、送液ポンプ、空気供給口及び空気排出口を備えた培養ユニットであってよい。培養ユニットは空気供給口及び空気排出口を備えないものであってもよい。さらに、上記細胞培養装置において、培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能であってよい。 In the above cell culture device, the culture unit may be a culture unit that does not have a medium supply line, a liquid delivery pump, an air supply port, and an air exhaust port, or may be a culture unit that has a medium supply line, a liquid delivery pump, an air supply port, and an air exhaust port. The culture unit may not have an air supply port and an air exhaust port. Furthermore, in the above cell culture device, the culture unit may further have a medium discharge line, where a first end of the medium discharge line is connected to a medium storage container and a second end of the medium discharge line is connected to the inside of the culture unit via the medium exhaust port of the culture unit, and the culture medium may be able to circulate between the medium supply unit and the culture unit.
ＩＩ．キット
本発明はさらに、モジュール化ポリイミド多孔質膜を含む、本発明の方法に使用するためのキットに関する。本発明のキットは、モジュール化ポリイミド多孔質膜の他に、軟骨細胞の培養に必要な構成要素を適宜含みうる。例えば、モジュール化ポリイミド多孔質膜に適用する細胞、細胞培養培地、連続的培地供給装置、連続的培地循環装置、細胞培養装置、軟骨組織を確認する為の評価手段、キットの取り扱い説明書などが含まれる。
II. Kit The present invention further relates to a kit for use in the method of the present invention, which includes a modularized polyimide porous membrane. The kit of the present invention may appropriately include components necessary for culturing chondrocytes in addition to the modularized polyimide porous membrane. For example, the kit may include cells to be applied to the modularized polyimide porous membrane, a cell culture medium, a continuous medium supplying device, a continuous medium circulating device, a cell culture device, an evaluation means for confirming cartilage tissue, and an instruction manual for the kit.
ＩＩＩ．使用
本発明はさらに、モジュール化ポリイミド多孔質膜の上述した本発明の方法のための使用、を含む。
III. Use The present invention further includes the use of the modularized polyimide porous membrane for the above-described method of the present invention.
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples. Those skilled in the art can easily modify and alter the present invention based on the description in this specification, and such modifications and alterations are included in the technical scope of the present invention.
以下の実施例で使用されたポリマー多孔質膜は、ポリイミド多孔質膜であり、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’－ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は１９μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４２μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７４％であった。 The polymer porous membrane used in the following examples is a polyimide porous membrane, which was prepared by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from 3,3',4,4'-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA) as a tetracarboxylic acid component and 4,4'-diaminodiphenyl ether (ODA) as a diamine component, and polyacrylamide as a coloring precursor, and then heat treating the polyimide porous membrane at 250°C or higher. The obtained polyimide porous membrane is a three-layered polyimide porous membrane having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B, and the average pore size of the pores present in the surface layer A is 19 μm, the average pore size of the pores present in the surface layer B is 42 μm, the membrane thickness is 25 μm, and the porosity is 74%.
１．実験方法
１－１．培養方法
＜実施例＞
ＩＷＡＫＩ コラーゲンＩコート ディッシュで培養した２継代目の ＡｒｔｉｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製ヒト軟骨細胞（Ｙ３９＿）をＧｉｂｃｏ社製Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．０５％），ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄを使用して剥がし、培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍにグルコースを注加し、３０００ｍｇ/Ｌに調整した培地）で懸濁した（７．５１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。
1. Experimental method 1-1. Cultivation method <Example>
Human chondrocytes (Y39_) at the second passage (Articular Engineering) cultured on IWAKI collagen I-coated dishes were detached using Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red, and suspended in medium (PromoCell Chondrocyte growth medium, adjusted to 3000 mg/L by adding glucose) (7.51 x 105 cells/mL).
コーニング社製１５０ｍＬストレージボトルを４つ用意し、各ボトルに湿潤・滅菌済みモジュール化ポリイミド多孔質膜（図５、以下、本実施例において「デバイス１」という。）を１個と培地（コージンバイオ株式会社製ゼノフリー培地；ＫＢＭ ＡＤＳＣ－４にグルコースを注加し、３０００ｍｇ／Ｌに調整した培地）を２０ｍＬ入れた後、３７℃に設定したＮ－ＢＩＯＴＥＫ社製加湿対応シェーカー搭載ＣＯ２インキュベーター（ａｎｉＣｅｌｌ）内に据え、８０ｒｐｍで１時間振盪し、播種準備を完了した。各ボトルに上記細胞懸濁液（７．５１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を７１９μＬ加えて１日振盪培養を行った（播種数：各ボトル５．４×１０５ｃｅｌｌｓ）。翌日、各ボトルにグルコース調整済みＫＢＭ ＡＤＳＣ－４培地を１０ｍＬ注加した。その後、ボトル２個をそのまま８０ｒｐｍで振盪培養し、残りのボトル２個をアステック社製ＣＯ２インキュベーター（ＡＰＭ－３０Ｄ）に移して静置培養を行った。培地交換は、グルコース調整済みＫＢＭ ＡＤＳＣ－４培地を用いて週２回の頻度で行った。 Four 150 mL storage bottles manufactured by Corning were prepared, and one moistened and sterilized modularized polyimide porous membrane (FIG. 5, hereinafter referred to as "Device 1" in this Example) and 20 mL of medium (Xeno-free medium manufactured by Kohjin Bio Co., Ltd.; medium adjusted to 3000 mg/L by adding glucose to KBM ADSC-4) were placed in each bottle, and the bottles were placed in a CO 2 incubator (aniCell) equipped with a humidified shaker manufactured by N-BIOTEK Co., Ltd. set at 37°C, and shaken at 80 rpm for 1 hour to complete preparation for seeding. 719 μL of the above cell suspension (7.51×10 5 cells/mL) was added to each bottle and shaken culture was performed for 1 day (number of cells seeded: 5.4×10 5 cells per bottle). The next day, 10 mL of glucose-adjusted KBM ADSC-4 medium was poured into each bottle. Thereafter, two of the bottles were cultured with shaking at 80 rpm, and the remaining two bottles were transferred to a CO2 incubator (APM-30D) manufactured by Astec Co., Ltd. for static culture. The medium was replaced twice a week with glucose-adjusted KBM ADSC-4 medium.
＜比較例：アテロコラーゲン包埋＞
上記細胞懸濁液（７．５１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を２２０×ｇ、３分間遠心して細胞ペレット作製した後、培地で懸濁して細胞懸濁液を作製した（４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。氷上にて前記細胞懸濁液と３％アテロコラーゲン溶液（高研）とを１：１で混合した。ＦＡＬＣＯＮ社製ディッシュを２個用意し、各ディッシュの中央に軟骨細胞を含むアテロコラーゲン溶液（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を２７０μＬ滴下した（播種数：各デイッシュ５．４×１０５ｃｅｌｌｓ）。ディッシュをアステック社製ＣＯ２インキュベーター（ＡＰＭ－３０Ｄ）内に据え、１～２時間静置してゲル化させた後、各デイッシュにグルコース調整済みＫＢＭ ＡＤＳＣ－４培地を１２ｍL注加した。培地交換は、グルコース調整済みＫＢＭ ＡＤＳＣ－４培地を用いて週２回の頻度で行った。
Comparative Example: Atelocollagen Embedding
The above cell suspension (7.51 x 105 cells/mL) was centrifuged at 220 x g for 3 minutes to prepare a cell pellet, and then suspended in medium to prepare a cell suspension (4.0 x 106 cells/mL). The cell suspension and 3% atelocollagen solution (Koken) were mixed 1:1 on ice. Two FALCON dishes were prepared, and 270 μL of atelocollagen solution (2.0 x 106 cells/mL) containing chondrocytes was dropped into the center of each dish (seeding number: 5.4 x 105 cells per dish ). The dishes were placed in an Astec CO2 incubator (APM-30D) and left to gel for 1 to 2 hours, after which 12 mL of glucose-adjusted KBM ADSC-4 medium was poured into each dish . The medium was replaced twice a week with glucose-adjusted KBM ADSC-4 medium.
１－２．ＤＮＡの定量
培養５０～５２日目の軟骨自己組織体（実施例）又はアテロコラーゲンゲル（比較例）を回収し、ＰＢＳを４ｍＬ加えて洗浄した後、１５ｍＬのチューブ内に移し、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを８００μＬ加えてホモジナイズした。各チューブにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを８０μＬ加えて混合し、恒温振盪機内に据え５５℃で一晩静置した。翌日、５Ｍ ＮａＣｌを２９３μＬ加えて、１５０００×ｇ、１０分間遠心し、上清を新しいチューブに回収した。上清にＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを５８７μＬ加えて、１５０００×ｇ、３分間遠心して沈殿物を回収した。沈殿物に滅菌水を８８０μＬ加え、３７℃のウォーターバスで２時間保温し、沈殿物を溶解させた。その後、ＲＮａｓｅ （１０ｍｇ／ｍＬ）を８μＬを加えて３７℃で１ｈｒインキュベートした後、５Ｍ ＮａＣｌを２９３μＬ加えて、１５０００×ｇ、１０分遠心し、上清を新しいチューブに回収した。回収した上清にＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを５８７μＬ加えて、１５０００×ｇ、３分遠心して沈殿物を回収し、７０％エタノール１ｍＬで２回洗浄した。沈殿物を風乾後、滅菌水を１００μＬ加えて３７℃で沈殿物を溶解させた。得られた水溶液中のＤＮＡの濃度をｎａｎｏｄｒｏｐで測定した。
1-2. Quantification of DNA The cartilage autologous tissue (Example) or atelocollagen gel (Comparative Example) on the 50th to 52nd day of culture was collected, washed with 4 mL of PBS, transferred to a 15 mL tube, and homogenized with 800 μL of lysis buffer. 80 μL of proteinase K was added to each tube, mixed, and placed in a thermostatic shaker and left to stand overnight at 55°C. The next day, 293 μL of 5M NaCl was added, centrifuged at 15,000×g for 10 minutes, and the supernatant was collected in a new tube. 587 μL of isopropanol was added to the supernatant, and the precipitate was collected by centrifugation at 15,000×g for 3 minutes. 880 μL of sterile water was added to the precipitate, and the precipitate was dissolved by incubating in a 37°C water bath for 2 hours. After that, 8 μL of RNase (10 mg/mL) was added and incubated at 37° C. for 1 hr, after which 293 μL of 5M NaCl was added and centrifuged at 15,000×g for 10 minutes, and the supernatant was collected in a new tube. 587 μL of isopropanol was added to the collected supernatant, and the precipitate was collected by centrifugation at 15,000×g for 3 minutes, and washed twice with 1 mL of 70% ethanol. After air-drying the precipitate, 100 μL of sterilized water was added and the precipitate was dissolved at 37° C. The concentration of DNA in the obtained aqueous solution was measured by nanodrop.
１－３．グルコサミノグリカンの定量
サンプルをＰＢＳで洗浄後、ホモジナイズし、ｐａｐａｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを２ｍＬ加えて、６５℃ ２７ｈｒ反応させた後、１００００×ｇ、１０分遠心し、得られた上清中のＧＡＧをＢｌｙｓｃａｎ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して定量した。
1-3. Quantification of glycosaminoglycan The sample was washed with PBS, homogenized, and 2 mL of papain extraction reagent was added. The mixture was reacted at 65° C. for 27 hours, and then centrifuged at 10,000×g for 10 minutes. The GAG in the resulting supernatant was quantified using the Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit.
２．実験結果
上記の結果、以下の性質を有する軟骨組織体が得られた（図６及び７）。
Claims (20)
軟骨細胞が播種されたモジュール化ポリイミド多孔質膜を、浮遊培養用の細胞培養容器内に固定されていない状態で培地中に浮遊させながら、前記モジュール化ポリイミド多孔質膜にシェアストレスを付与しながら培養する工程、
を含み、
ここで前記モジュール化ポリイミド多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜と、前記ポリイミド多孔質膜が収容されたケーシングとを備えるものであって、前記ポリイミド多孔質膜は、流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態でケーシングに固定されており、
前記ケーシングが、前記ポリイミド多孔質膜の少なくとも一部の表面に培地を曝露するための１以上の培地流出入口を有し、
ここで前記ポリイミド多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
前記方法。 A method for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, comprising:
a step of culturing the modularized polyimide porous membrane seeded with chondrocytes while applying shear stress to the modularized polyimide porous membrane, while floating the modularized polyimide porous membrane in a medium in a cell culture vessel for suspension culture in an unfixed state;
Including,
The modularized polyimide porous membrane comprises a polyimide porous membrane and a casing in which the polyimide porous membrane is housed, and the polyimide porous membrane is fixed to the casing in a state in which the polyimide porous membrane does not continuously undergo wavy motion due to a fluid,
The casing has one or more medium inlet/outlet ports for exposing a medium to at least a portion of the surface of the polyimide porous membrane;
wherein the polyimide porous film is a three-layered polyimide porous film having surface layers A and B each having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is smaller than the average pore size of the pores in the surface layer B, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, and the pores in the surface layers A and B are connected to the macrovoids.
The method.
前記軟骨細胞が生成する細胞外マトリックス以外の、外部から添加するスキャフォールド成分は含んでおらず、
前記スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体が平均０．２ｍｍ以上の厚さを有するものであり、
グルコサミノグリカンを湿潤重量１ｍｇあたり５μｇ以上を含んでいることを特徴とする、スキャフォールドフリー三次元軟骨組織体。 A scaffold-free three-dimensional cartilage tissue comprising chondrocytes,
The present invention does not include any externally added scaffold components other than the extracellular matrix produced by the chondrocytes,
The scaffold-free three-dimensional cartilage tissue has an average thickness of 0.2 mm or more,
A scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, characterized in that it contains 5 μg or more of glycosaminoglycan per 1 mg of wet weight.
ここで前記モジュール化ポリイミド多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜と、前記ポリイミド多孔質膜が収容されたケーシングとを備えるものであって、前記ポリイミド多孔質膜は、流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態でケーシングに固定されており、
前記ケーシングが、前記ポリイミド多孔質膜の少なくとも一部の表面に培地を曝露するための１以上の培地流出入口を有し、
ここで前記ポリイミド多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記モジュール化ポリイミド多孔質膜が、浮遊培養用の細胞培養容器、細胞培養装置又は細胞培養システム内において用いられるものであって、前記浮遊培養用の細胞培養容器、細胞培養装置又は細胞培養システムの培養部内に固定されていないことを特徴とする、モジュール化ポリイミド多孔質膜。 A modularized polyimide porous membrane for producing a scaffold-free three-dimensional cartilage tissue, comprising:
The modularized polyimide porous membrane comprises a polyimide porous membrane and a casing in which the polyimide porous membrane is housed, and the polyimide porous membrane is fixed to the casing in a state in which the polyimide porous membrane does not continuously undergo wavy motion due to a fluid,
The casing has one or more medium inlet/outlet ports for exposing a medium to at least a portion of the surface of the polyimide porous membrane;
wherein the polyimide porous film is a three-layered polyimide porous film having surface layers A and B each having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layers A and B, wherein the average pore size of the pores in the surface layer A is smaller than the average pore size of the pores in the surface layer B, the macrovoid layer has partition walls bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition walls and the surface layers A and B, and the pores in the surface layers A and B are connected to the macrovoids,
The modularized polyimide porous film is used in a cell culture vessel, a cell culture device, or a cell culture system for suspension culture, and is not fixed within a culture section of the cell culture vessel, the cell culture device, or the cell culture system for suspension culture.
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