JP2024069450A - Primer set for determining serotype of bacteria of the genus Salmonella, PCR product, microarray for determining serotype of bacteria of the genus Salmonella, kit for determining serotype of bacteria of the genus Salmonella, and method for determining serotype of bacteria of the genus Salmonella - Google Patents
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Abstract
【課題】サルモネラ属菌におけるサルモネラ・インファンティス（Salmonella Infantis）等を判別することを可能とするプライマーセットを提供する。【解決手段】下記の（１）に示されるプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット:（１）サルモネラ・インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが第一の特定の塩基配列からなり、リバースプライマーが第三の特定の塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、フォワードプライマーが第二の特定の塩基配列からなり、リバースプライマーが第三の特定の塩基配列からなるプライマーセットである。【選択図】図１[Problem] To provide a primer set that enables discrimination of Salmonella genus bacteria such as Salmonella Infantis. [Solution] A primer set for discriminating serotypes of Salmonella genus bacteria, comprising the primer set shown in (1) below: (1) A primer set specific to Salmonella Infantis, the primer set being a primer set in which the forward primer comprises a first specific base sequence and the reverse primer comprises a third specific base sequence, and/or the primer set being a primer set in which the forward primer comprises a second specific base sequence and the reverse primer comprises a third specific base sequence. [Selected Figure] Figure 1
Description
本発明は、畜産物、食品、環境等の衛生管理の分野などにおいて、サルモネラ属菌の血清型を特異的に検出するためのプライマー、及びこれを用いた検査技術に関する。 The present invention relates to primers for specifically detecting the serotype of Salmonella bacteria in fields such as hygiene management of livestock products, food, and the environment, and to testing techniques using the same.
サルモネラ属菌は、種々の動物の消化管に生息する腸内細菌の一種であり、その一部にはヒトや動物に感染して病原性を示すものが存在している。
サルモネラ属菌の血清型は、細胞壁リポ多糖体であるＯ抗原と、鞭毛タンパク質であるＨ抗原の組み合わせにもとづいて、２６００種類以上に分類されており、その同定は、畜産物や食品、環境等の衛生管理において重要となっている。
Salmonella is a type of enterobacteria that inhabit the digestive tracts of various animals, and some of these bacteria are pathogenic to humans and animals.
The serotypes of Salmonella are classified into more than 2,600 types based on the combination of the O antigen, a lipopolysaccharide in the cell wall, and the H antigen, a flagellar protein. Identification of these serotypes is important for the hygiene management of livestock products, food, and the environment.
このうち、サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）、サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）、サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）、サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）、及びサルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）は、ＥＵにおいて規制の対象となっている（REGULATIONS, COMMISSION REGULATION（EU） No 200/2010 of 10 March 2010）。 Of these, Salmonella Infantis, Salmonella Virchow, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, and Salmonella Hadar are subject to regulation in the EU (REGULATIONS, COMMISSION REGULATION (EU) No 200/2010 of 10 March 2010).
このようなサルモネラ属菌における複数血清型を同時に判別することを目的として、血清型に特異的なＤＮＡ領域を対象とするＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）判別法が報告されている（下記の先行技術文献参照）。
しかしながら、既報のプライマーセットを用いた場合、誤判定を生じ得るという問題があった。
For the purpose of simultaneously differentiating between multiple serotypes of Salmonella bacteria, a PCR (Polymerase Chain Reaction) discrimination method targeting serotype-specific DNA regions has been reported (see the prior art documents listed below).
However, when the previously reported primer sets are used, there is a problem that erroneous determination may occur.
例えば、サルモネラ インファンティス検出用のプライマーセットは多数報告されているが、培地中にサルモネラ インファンティスが存在するにもかかわらず、一部の菌株について陰性と誤判定されてしまうという問題があった。
また、サルモネラ ウィルヒョウ検出用のプライマーセットは１件報告されているが（非特許文献３）、培地中にサルモネラ ケンタッキー（Salmonella Kentucky）が存在する場合に、これを偽陽性として誤判定するという問題があった。
For example, although many primer sets for detecting Salmonella infantis have been reported, there was a problem that some strains of Salmonella infantis were erroneously judged as negative even though they were present in the medium.
In addition, one primer set for detecting Salmonella Virchow has been reported (Non-Patent Document 3), but there was a problem that when Salmonella Kentucky was present in the medium, it was erroneously determined as a false positive.
そこで、本発明者らは鋭意研究して、サルモネラ インファンティスの検出における一部の菌株についての誤判定を防止でき、かつ、サルモネラ ウィルヒョウの検出における誤判定を防止可能なプライマーセットを開発した。また、これらの血清型に加えて、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウム、及びサルモネラ ハーダーを同時に判別可能なプライマーセットと、そのＰＣＲ産物に好適にハイブリダイゼーションを行うことが可能なプローブを開発することに成功して、本発明を完成させた。 The inventors have therefore conducted extensive research and developed a primer set that can prevent erroneous determinations for some strains in the detection of Salmonella infantis, and can also prevent erroneous determinations in the detection of Salmonella Virchow. Furthermore, they have succeeded in developing a primer set that can simultaneously distinguish Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, and Salmonella harder in addition to these serotypes, and a probe that can hybridize favorably to the PCR product, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、サルモネラ属菌における複数の血清型を同時に特異的に判別することが可能なサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法の提供を目的とする。 That is, the present invention aims to provide a primer set for serotyping Salmonella bacteria, which is capable of simultaneously and specifically distinguishing multiple serotypes of Salmonella bacteria, a PCR product, a microarray for serotyping Salmonella bacteria, a kit for serotyping Salmonella bacteria, and a method for serotyping Salmonella bacteria.
上記目的を達成するため、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットは、下記の（１）～（２）に示されるプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：（１）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、フォワードプライマーが配列番号２に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセットである；（２）サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号４に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、フォワードプライマーが配列番号５に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセットである構成としてある。 In order to achieve the above object, the primer set for serotyping Salmonella of the present invention is characterized by including the primer sets shown in (1) to (2) below: (1) a primer set specific to Salmonella Infantis, in which the forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and/or the forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3; (2) a primer set specific to Salmonella Virchow, in which the forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and/or the forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを、上記のプライマーセットと共に、下記の（３）～（５）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：（３）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号７に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーセットである；（４）サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号９に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーセットである；（５）サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１１に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーセットである構成とすることも好ましい。 The primer set for serotyping Salmonella spp. of the present invention is also preferably configured as follows: (3) a primer set specific to Salmonella Infantis, in which the forward primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the reverse primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 8; (4) a primer set specific to Salmonella Enteritidis, in which the forward primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the reverse primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 10; (5) a primer set specific to Salmonella Typhimurium, in which the forward primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the reverse primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを、上記のプライマーセットと共に、下記の（６）～（７）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：（６）サルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１３に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセットである構成とすることも好ましい。
The primer set for serotyping Salmonella genus bacteria of the present invention comprises, together with the above primer set, at least one primer set selected from the primer sets shown in (6) to (7) below: (6) A primer set specific to Salmonella Hadar, in which the forward primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the reverse primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14;
(7) It is also preferable that the primer set is for amplifying an invA gene region specific to Salmonella spp., the forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 and the reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16.
また、本発明のＰＣＲ産物は、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られた構成としてある。 The PCR product of the present invention is obtained by amplifying the PCR product using the above primer set.
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、上記のＰＣＲ産物にそれぞれ相補的に結合するプローブが固定化された構成としてある。 The microarray for distinguishing serotypes of Salmonella bacteria of the present invention is configured to have immobilized probes that bind complementarily to the PCR products described above.
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイを、前記プローブに、配列番号１７～２１に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号２２～２３に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが含まれる構成とすることも好ましい。 It is also preferable that the Salmonella serotyping microarray of the present invention is configured such that the probes include at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 21 or their complementary sequences, and at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 23 or their complementary sequences.
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイを、前記プローブに、配列番号２５～２９に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３０～３５に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３６～４０に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４１～４４に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４５～４７に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが含まれる構成とすることも好ましい。 It is also preferable that the Salmonella serotyping microarray of the present invention is configured such that the probes include at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 25 to 29 or their complementary sequences, at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 30 to 35 or their complementary sequences, at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 36 to 40 or their complementary sequences, at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 44 or their complementary sequences, and at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 45 to 47 or their complementary sequences.
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、上記のプライマーセットと、上記のマイクロアレイとを含む構成としてある。 The Salmonella serotyping kit of the present invention includes the above primer set and the above microarray.
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別方法は、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これを上記のマイクロアレイに固定化されたプローブとハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別する方法としてある。 The method for distinguishing the serotype of Salmonella bacteria of the present invention is a method for distinguishing the serotype of Salmonella bacteria by obtaining a PCR product by a PCR method using the above-mentioned primer set and hybridizing this with the probe immobilized on the above-mentioned microarray.
本発明によれば、サルモネラ属菌における複数の血清型を同時に特異的に判別することが可能となる。 The present invention makes it possible to specifically distinguish multiple serotypes of Salmonella bacteria simultaneously.
以下、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。 The following provides a detailed description of an embodiment of the primer set for serotyping Salmonella bacteria, the PCR product, the microarray for serotyping Salmonella bacteria, the kit for serotyping Salmonella bacteria, and the method for serotyping Salmonella bacteria of the present invention. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiment and the examples described later.
まず、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに固定化されたプローブの設計手順について説明する。
上記非特許文献３記載のサルモネラ インファンティス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅される対象領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：CP019202、領域：201330-201604）。同様に、上記非特許文献３記載のサルモネラ ウィルヒョウ検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅される領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：AOXL01000191、領域：67110-67390）。
First, a description will be given of a procedure for designing the primer set for serotyping Salmonella bacteria of this embodiment and the probes immobilized on the microarray for serotyping Salmonella bacteria.
Sequence information of the target region amplified by PCR using the primer set for detecting Salmonella Infantis described in Non-Patent
さらに、上記のサルモネラ インファンティス検出用プライマーの増幅対象領域とは異なる配列を持つサルモネラ インファンティス菌株について、同対象領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：AFYI01000003、領域：255560-255834）。また、上記のサルモネラ ウィルヒョウ検出用プライマーセットを用いた場合に誤検出されるサルモネラ ケンタッキー菌株について、同対象領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：CP026327、領域：241939-242216）。 Furthermore, for Salmonella Infantis strains with sequences different from the amplification target region of the above-mentioned primers for detecting Salmonella Infantis, sequence information of the target region was obtained from Genbank (accession number: AFYI01000003, region: 255560-255834). In addition, for Salmonella Kentucky strains that are falsely detected when using the above-mentioned primer set for detecting Salmonella Virchow, sequence information of the target region was obtained from Genbank (accession number: CP026327, region: 241939-242216).
そして、これら４つの配列を比較することにより、各配列に特徴的な領域を見いだし、サルモネラ インファンティスと、サルモネラ ウィルヒョウとを誤判定なく検出可能なプライマーセットを開発した。また、開発したプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅されるＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行うプローブを、同対象領域から設計した。 By comparing these four sequences, we found characteristic regions in each sequence and developed a primer set that can detect Salmonella infantis and Salmonella Virchow without misjudgment. We also designed a probe from the same target region that hybridizes to the PCR product amplified by PCR using the developed primer set.
また、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウムについて、上記のプライマーセットと同時に用いて、これらの血清型を同時に特異的に判別することが可能なプライマーセットを開発し、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅されるＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行うプローブを設計した。
さらに、サルモネラ ハーダー、及びサルモネラ属菌を検出するための既存のプライマーセットを組み合わせると共に、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅されるＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行うプローブを設計して、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を同時に特異的に判別することを可能にした。
In addition, we developed primer sets that can be used together with the above-mentioned primer sets to specifically distinguish the serotypes of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium simultaneously, and designed probes that hybridize to the PCR products amplified by PCR using these primer sets.
Furthermore, by combining existing primer sets for detecting Salmonella hardylii and Salmonella spp., and designing probes that hybridize to PCR products amplified by PCR using these primer sets, it became possible to simultaneously and specifically distinguish five serotypes and six strains of Salmonella spp.
本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット（第一のプライマーセット）は、下記の（１）～（２）に示されるプライマーセットを含むことを特徴とする。
（１）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号２に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット
（２）サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号４に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット
The primer set (first primer set) for serotyping Salmonella bacteria of this embodiment is characterized by including the primer sets shown in (1) and (2) below.
(1) A primer set specific to Salmonella Infantis,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A primer set in which the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and/or
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(2) a primer set specific to Salmonella Virchow, the reverse primer of which consists of the base sequence shown in SEQ ID NO:3,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
A primer set in which the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and/or
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO:5,
A primer set in which the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO:6
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット（第二のプライマーセット）は、上記のプライマーセットと共に、下記の（３）～（５）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とすることが好ましい。
（３）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号７に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーセット
（４）サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号９に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーセット
（５）サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーセット
In addition, the primer set for serotyping Salmonella bacteria of this embodiment (second primer set) is preferably characterized by including, in addition to the above-mentioned primer set, at least one primer set selected from the primer sets shown in (3) to (5) below.
(3) A primer set specific to Salmonella Infantis,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7,
A primer set in which the reverse primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 8. (4) A primer set specific to Salmonella Enteritidis,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO:9,
A primer set in which the reverse primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. (5) A primer set specific to Salmonella Typhimurium,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11,
A primer set in which the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット（第三のプライマーセット）は、上記のいずれかのプライマーセットと共に、下記の（６）～（７）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とすることが好ましい。
（６）サルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１３に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーセット
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセット
In addition, the primer set for serotyping Salmonella bacteria of this embodiment (third primer set) is preferably characterized by including at least one primer set selected from the primer sets shown in (6) to (7) below, in addition to any one of the primer sets described above.
(6) A primer set specific to Salmonella Hadar,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13,
A primer set in which a reverse primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. (7) A primer set for amplifying an invA gene region specific to Salmonella spp., comprising:
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15,
A primer set in which the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16
また、本実施形態のＰＣＲ産物は、上記の第一から第三のいずれかのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたことを特徴とする。
上記プライマーセットの具体的な塩基配列と、それぞれのＰＣＲ産物の増幅産物長を図１に示す。同図において、「Ｆ／Ｒ」は、Ｆがフォワードプライマーを、Ｒがリバースプライマーを示す。
Furthermore, the PCR product of this embodiment is characterized in that it is obtained by amplification by PCR using any one of the first to third primer sets described above.
Specific base sequences of the above primer sets and the lengths of the amplified PCR products are shown in Figure 1. In the figure, "F/R" indicates that F is the forward primer and R is the reverse primer.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、上記のＰＣＲ産物にそれぞれ相補的に結合するプローブが固定化されたことを特徴とする。
これらのプローブの具体的な塩基配列を図２及び図３に示す。
The microarray for distinguishing the serotype of bacteria of the genus Salmonella in this embodiment is characterized in that probes that bind complementarily to the PCR products are immobilized thereon.
The specific base sequences of these probes are shown in FIG.
本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、配列番号１７～２１に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号２２～２４に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが固定化されたものとすることが好ましい。 The microarray for serotyping Salmonella bacteria of this embodiment preferably has immobilized thereon at least one probe selected from a group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 21 or their complementary sequences, and at least one probe selected from a group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 24 or their complementary sequences.
配列番号１７～２１に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（１）サルモネラ インファンティスに特異的なプライマーセット（配列番号１及び３のプライマーセット、及び／又は、配列番号２及び３のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号１７～２１に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
At least any one of the probes selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 21 can complementarily bind by hybridization to one target strand of the double strand of a PCR product obtained by amplifying by PCR using the above-mentioned (1) primer set specific to Salmonella infantis (the primer set of SEQ ID NOs: 1 and 3, and/or the primer set of SEQ ID NOs: 2 and 3).
Furthermore, at least one probe selected from the group of probes having complementary sequences to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 21 can complementarily bind to the other target strand of the double strand of the PCR product by hybridization.
配列番号２２～２４に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（２）サルモネラ ウィルヒョウに特異的なプライマーセット（配列番号４及び６のプライマーセット、及び／又は、配列番号５及び６のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号２２～２４に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
At least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 24 can complementarily bind by hybridization to one target strand of the double strand of a PCR product obtained by amplifying by PCR using the above-mentioned (2) Salmonella Virchow-specific primer set (the primer set of SEQ ID NOs: 4 and 6, and/or the primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6).
Furthermore, at least one probe selected from the group of probes having complementary sequences to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 24 can complementarily bind to the other target strand of the double strand of the PCR product by hybridization.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、配列番号２５～２９に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３０～３５に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３６～４０に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４１～４４に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４５～４７に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが固定化されたものとすることが好ましい。 The Salmonella serotyping microarray of this embodiment preferably has immobilized thereon at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 25 to 29, at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 30 to 35 or a complementary sequence thereto, at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 36 to 40 or a complementary sequence thereto, at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 44 or a complementary sequence thereto, and at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 45 to 47 or a complementary sequence thereto.
配列番号２５～２９に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（３）サルモネラ インファンティスに特異的なプライマーセット（配列番号７及び８のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号２５～２９に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
At least any one of the probes selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 25 to 29 can complementarily bind by hybridization to one target strand of the double strand of a PCR product obtained by amplifying by PCR using the above-mentioned (3) primer set specific to Salmonella infantis (the primer set of SEQ ID NOs: 7 and 8).
Furthermore, at least one probe selected from the group of probes having complementary sequences to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 25 to 29 can complementarily bind to the other target strand of the double strand of the PCR product by hybridization.
配列番号３０～３５に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（４）サルモネラ エンテリティディスに特異的なプライマーセット（配列番号９及び１０のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号３０～３５に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
At least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 30 to 35 can complementarily bind by hybridization to one target strand of the double strand of a PCR product obtained by amplifying by PCR using the primer set (primer set of SEQ ID NOs: 9 and 10) specific to Salmonella Enteritidis (4).
Furthermore, at least one probe selected from the group of probes having complementary sequences to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 30 to 35 can complementarily bind to the other target strand of the double strand of the PCR product by hybridization.
配列番号３６～４０に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（５）サルモネラ ティフィムリウムに特異的なプライマーセット（配列番号１１及び１２のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号３６～４０に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
At least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 36 to 40 can complementarily bind by hybridization to one target strand of the double strand of a PCR product obtained by amplifying by PCR using the above-mentioned (5) Salmonella typhimurium-specific primer set (the primer set of SEQ ID NOs: 11 and 12).
Furthermore, at least one probe selected from the group of probes having complementary sequences to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 36 to 40 can complementarily bind to the other target strand of the double strand of the PCR product by hybridization.
配列番号４１～４４に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（６）サルモネラ ハーダーに特異的なプライマーセット（配列番号１３及び１４のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号４１～４４に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
At least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 44 can complementarily bind by hybridization to one target strand of the double strand of a PCR product obtained by amplifying by PCR using the primer set (primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14) specific to Salmonella hardylii (6).
Furthermore, at least one probe selected from the group of probes having complementary sequences to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 44 can complementarily bind to the other target strand of the double strand of the PCR product by hybridization.
配列番号４５～４７に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（７）サルモネラ属菌に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセット（配列番号１５及び１６のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号４５～４７に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
At least any one of the probes selected from the group of probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 45 to 47 can complementarily bind by hybridization to one target strand of the double strand of a PCR product obtained by PCR amplification using the primer set (primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16) for amplifying the invA gene region specific to Salmonella genus bacteria (7).
Furthermore, at least one probe selected from the group of probes having complementary sequences to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 45 to 47 can complementarily bind to the other target strand of the double strand of the PCR product by hybridization.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、配列番号１７～４７に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、このマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
Furthermore, the microarray for distinguishing serotypes of bacteria of the genus Salmonella in this embodiment can be produced by an existing general method using probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 47 or complementary sequences thereto.
For example, when a stick-on type DNA chip is to be prepared as the microarray, it can be prepared by immobilizing probes on a glass substrate using a DNA spotter and forming spots corresponding to each probe. When a synthetic type DNA chip is to be prepared, it can be prepared by synthesizing single-stranded oligo DNA having the above sequence on a glass substrate using photolithography technology. Furthermore, the substrate is not limited to being made of glass, and plastic substrates, silicon wafers, etc. can also be used. Furthermore, the shape of the substrate is not limited to being flat, and it can be made into various three-dimensional shapes, and it can also be used to introduce functional groups onto the surface to enable chemical reactions.
本実施形態におけるプローブは、いずれも２０～６０塩基の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で用いた配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットも、１８～３０塩基の長さであり、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１～１６に示す塩基配列からなるプライマーは、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
The probes in this embodiment are all 20 to 60 bases long and can be synthesized by a general DNA synthesizer. The probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 47 used in the examples described later were all synthesized by a DNA synthesizer.
The primer set for distinguishing the serotype of Salmonella in this embodiment also has a length of 18 to 30 bases, and the primers having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 16 used in PCR in the examples were synthesized using a DNA synthesizer.
本実施形態における配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１７～４７に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１７～４７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。 In this embodiment, the probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 to 47 is not limited to the sequence itself, and a probe in which one or several bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 to 47 can be used. Also, a probe that can hybridize under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 to 47 can be used. Also, a probe having a base sequence complementary to these probes can be used.
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるＤＮＡとそれぞれ相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。 Stringent conditions refer to conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, stringent conditions include conditions under which DNA having high homology (homology of 90% or more, preferably 95% or more) to DNA consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 47 hybridizes with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 47. Usually, stringent conditions refer to a condition in which hybridization occurs at a temperature about 5°C to about 30°C, preferably about 10°C to about 25°C, lower than the melting temperature (Tm) of a complete hybrid. For details on stringent conditions, see J. The conditions described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), particularly Section 11.45 "Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes," can be used.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、第一のプライマーセットと、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたＰＣＲ産物に相補的に結合する第一のプローブ群が固定化されたマイクロアレイとを含むことを特徴とする。
第一のプローブ群は、図２に示す配列番号１７～２１に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号２２～２４に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
Furthermore, the Salmonella serotype discrimination kit of this embodiment is characterized by including a first primer set and a microarray on which a first probe group is immobilized that complementarily binds to a PCR product obtained by amplifying the PCR product by using the primer set.
The first probe group consists of at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 21 in FIG. 2 or their complementary sequences, and at least one probe selected from the group of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 24 or their complementary sequences.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、第二のプライマーセットと、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたＰＣＲ産物に相補的に結合する第二のプローブ群が固定化されたマイクロアレイとを含む構成とすることも好ましい。
第二のプローブ群は、第一のプローブ群に加え、図２に示す配列番号２５～２９に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、図３に示す配列番号３０～３５に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、図３に示す配列番号３６～４０に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
In addition, the Salmonella serotype discrimination kit of this embodiment is also preferably configured to include a second primer set and a microarray on which a second probe group is immobilized that complementarily binds to the PCR products obtained by amplifying the PCR products by PCR using the second primer set.
The second probe group comprises, in addition to the first probe group, at least one probe selected from the probe group consisting of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 25 to 29 shown in FIG. 2 or their complementary sequences, at least one probe selected from the probe group consisting of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 30 to 35 shown in FIG. 3 or their complementary sequences, and at least one probe selected from the probe group consisting of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 36 to 40 shown in FIG. 3 or their complementary sequences.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、第三のプライマーセットと、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたＰＣＲ産物に相補的に結合する第三のプローブ群が固定化されたマイクロアレイとを含む構成とすることも好ましい。
第三のプローブ群は、第二のプローブ群に加え、図３に示す配列番号４１～４４に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４５～４７に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
In addition, the Salmonella serotype discrimination kit of this embodiment preferably includes a third primer set and a microarray on which a third probe group is immobilized that complementarily binds to the PCR products obtained by amplifying the PCR products by PCR using the primer set.
The third probe group comprises, in addition to the second probe group, at least one probe selected from the probe group consisting of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 44 in FIG. 3 or their complementary sequences, and at least one probe selected from the probe group consisting of probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 45 to 47 or their complementary sequences.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法は、第一のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これをマイクロアレイに固定化された第一のプローブ群とハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別することを特徴とする。 The method for distinguishing the serotype of Salmonella bacteria of this embodiment is characterized in that a PCR product is obtained by a PCR method using a first primer set, and the PCR product is hybridized with a first probe group immobilized on a microarray, thereby distinguishing the serotype of Salmonella bacteria.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法は、第二のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これをマイクロアレイに固定化された第二のプローブ群とハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別する方法とすることも好ましい。 The method for distinguishing the serotype of Salmonella bacteria of this embodiment is also preferably a method for distinguishing the serotype of Salmonella bacteria by obtaining a PCR product by a PCR method using a second primer set and hybridizing the PCR product with a second group of probes immobilized on a microarray.
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法は、第三のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これをマイクロアレイに固定化された第三のプローブ群とハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別する方法とすることも好ましい。 The method for distinguishing the serotype of Salmonella bacteria of this embodiment is also preferably a method for distinguishing the serotype of Salmonella bacteria by obtaining a PCR product by a PCR method using a third primer set and hybridizing the PCR product with a third probe group immobilized on a microarray.
本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法に先だって行われる、サルモネラ属菌の菌株からのゲノムＤＮＡの抽出は、キットによる方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。 The extraction of genomic DNA from a strain of Salmonella serotype, which is carried out prior to the method for determining the serotype of Salmonella serotype of this embodiment, can be carried out by a general method, such as using a kit or a DNA extraction device.
そして、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域（増幅対象領域）の増幅が行われる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片が増幅される。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。 Then, the target region (region to be amplified) in the extracted genomic DNA is amplified. That is, a DNA fragment containing the target region in the genomic DNA is amplified. The method for amplifying this target region is not particularly limited, but the PCR method can be suitably used. A general thermal cycler or the like can be used as the PCR device.
本実施形態では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃ １５分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程） １分、（ｃ）６０℃（アニーリング工程） １分、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） １分（（ｂ）～（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
In this embodiment, the target region in the genomic DNA can be suitably amplified by carrying out PCR under the following reaction conditions, for example.
(a) 95°C for 15 minutes, (b) 94°C (DNA denaturation step) for 1 minute, (c) 60°C (annealing step) for 1 minute, (d) 72°C (DNA synthesis step) for 1 minute (35 cycles of (b) to (d)), (e) 72°C for 10 minutes.
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。
すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、検体のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として滅菌水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。
As the reaction solution for PCR, it is preferable to use, for example, one having the following composition.
That is, a PCR reaction solution containing a nucleic acid synthesis substrate (dNTP mixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)), a primer set, a nucleic acid synthesis enzyme (HotStart DNA polymerase, etc.), genomic DNA of the sample, a buffer solution, and sterilized water as the remaining component can be preferably used.
本実施形態において、ハイブリダイゼーションは、以下のように行うことができる。
すなわち、ＰＣＲ法などにより得られた増幅産物を本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに滴下し、これに固定化されたプローブにハイブリダイゼーションをした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の畜産物、食品、環境中に存在しているサルモネラ属菌を特定することができる。
In this embodiment, hybridization can be carried out as follows.
That is, the presence or absence of the amplification product is confirmed by dropping an amplification product obtained by a PCR method or the like onto the microarray for serotyping Salmonella of this embodiment and detecting the label of the amplification product that has hybridized to the probe immobilized thereon, thereby making it possible to identify Salmonella present in livestock products, foods, and the environment to be inspected.
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋製罐グループエンジリアリング株式会社のGENOGATE（R） readerを用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal to Noise ratio）として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためである。
後述する実施例で用いたマイクロアレイの場合、Ｓ／Ｎ比値が３．０以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
The detection of the label can be performed using a general label detection device such as a fluorescent scanning device, for example, by measuring the fluorescence intensity of the amplified product using a GENOGATE® reader from Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd. The measurement result is preferably obtained as an S/N ratio value (signal to noise ratio), because whether the measurement result is positive or negative can be determined with high accuracy based on the S/N ratio value.
In the case of the microarray used in the examples described below, a positive determination can be made when the S/N ratio value is 3.0 or more. The S/N ratio value described in this specification is calculated by (median fluorescence intensity value - background value) / background value. Note that the label is not limited to fluorescence, and other labels can also be used.
以上説明した本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法によれば、サルモネラ インファンティスの検出における一部の菌株についての誤判定を防止でき、かつ、サルモネラ ウィルヒョウの検出における誤判定を防止することが可能である。また、これらの血清型に加えて、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウム、及びサルモネラ ハーダーを含む複数の血清型を同時に特異的に判別することが可能である。 The primer set for serotyping Salmonella bacteria, PCR product, microarray for serotyping Salmonella bacteria, kit for serotyping Salmonella bacteria, and method for serotyping Salmonella bacteria of the present embodiment described above can prevent erroneous determination of some strains in the detection of Salmonella infantis, and can prevent erroneous determination in the detection of Salmonella Virchow. In addition to these serotypes, it is possible to simultaneously and specifically determine multiple serotypes including Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, and Salmonella hardyli.
以下、本発明の実施形態に係るサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。 The following provides a detailed explanation of the tests conducted to confirm the effectiveness of the primer set for serotyping Salmonella bacteria, the PCR product, the microarray for serotyping Salmonella bacteria, the kit for serotyping Salmonella bacteria, and the method for serotyping Salmonella bacteria according to the embodiments of the present invention.
［試験１］
本試験では、従来は検出できなかったサルモネラ インファンティスの一部の菌株（Salmonella Infantis ATCC BAA-1675株，以下、サルモネラ インファンティス（Ａ）と称する場合がある。）を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、検出できることの確認を行った。
[Test 1]
In this test, it was confirmed that some strains of Salmonella Infantis that could not be detected in the past (Salmonella Infantis ATCC BAA-1675 strain, hereinafter sometimes referred to as Salmonella Infantis (A)) can be detected by using the primer set for discriminating the serotype of Salmonella of the present embodiment.
具体的には、図４に示すように、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットを用いた実験を実施例１とし、同じくサルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットを用いた実験を実施例２とした。
また、サルモネラ インファンティスに特異的な従来のプライマーセットとして、比較例１～９のものを準備した。
Specifically, as shown in FIG. 4, an experiment using a primer set of SEQ ID NOs: 1 and 3 specific to Salmonella infantis (A) was performed as Example 1, and an experiment using a primer set of SEQ ID NOs: 2 and 3 specific to Salmonella infantis (A) was performed as Example 2.
Furthermore, Comparative Examples 1 to 9 were prepared as conventional primer sets specific to Salmonella infantis.
配列番号４８及び４９のプライマーセットと、配列番号５０及び５１のプライマーセットと、配列番号５２及び５３のプライマーセットは、特許文献１に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例１，２，３とした。
配列番号５４及び５５のプライマーセットは、特許文献２に記載のものであり、これを用いた実験を比較例４とした。
The primer sets of
The primer set of SEQ ID NOs: 54 and 55 is described in
配列番号５６及び５８のプライマーセットと、配列番号５７及び５８のプライマーセットは、非特許文献１に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例５，６とした。
配列番号５９及び６０のプライマーセットは、非特許文献２に記載のものであり、これを用いた実験を比較例７とした。
配列番号６１及び６３のプライマーセットと、配列番号６２及び６３のプライマーセットは、非特許文献３に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例８，９とした。
The primer set of SEQ ID NOs: 56 and 58 and the primer set of SEQ ID NOs: 57 and 58 are those described in
The primer set of SEQ ID NOs: 59 and 60 is described in
The primer set of SEQ ID NOs: 61 and 63 and the primer set of SEQ ID NOs: 62 and 63 are those described in
まず、８０２培地の調製を行った。具体的には、以下の試薬を混合後、試験管に１０ｍＬずつ分注し、１２１℃、１５分間で滅菌した。ｐＨは７．０に調整した。
（１）ハイポリペプトン（日水製薬社製） １０ｇ
（２）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製） ２ｇ
（３）ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ（富士フィルム和光純薬社製） １ｇ
（４）蒸留水 １Ｌ
First, 802 medium was prepared. Specifically, the following reagents were mixed, then 10 mL was dispensed into test tubes and sterilized at 121° C. for 15 minutes. The pH was adjusted to 7.0.
(1) Hypopolypeptone (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 10 g
(2) Yeast extract (Difco) 2 g
(3) MgSO47H2O (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries , Ltd.) 1g
(4) Distilled water, 1 liter
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。菌株は、次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル２：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
Next, genomic DNA was extracted from the Salmonella strains. The following strains were used. The strains were obtained from the following institutions:
ATCC: American Type Culture Collection
Sample 1: Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
Sample 2: Negative control (sterile water was added instead of template)
この菌株を８０２培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
This strain was cultured in 802 medium at 30° C. with shaking at 200 rpm for 24 hours.
Next, genomic DNA was extracted according to the instructions of the DNA extraction kit, RBC Genomic DNA Extraction Kit Mini (manufactured by Cytrop).
ＰＣＲ用反応液としては、サンプルごとに、サルモネラ インファンティス検出用プライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社または株式会社ファスマックにより合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
As a PCR reaction solution, 20 μL of a solution containing a primer set for detecting Salmonella Infantis and having the following composition was prepared for each sample. The primers were synthesized by Sigma-Aldrich Japan LLC or FASMAC Corporation.
(1) PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μL
(2) dNTP mix (Cat BR0600503, Biotechrabbit) 0.4 μL
(3) 10 μM primer, 0.4 μL each
(4) HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μL
(5) Template DNA (10 ng/PCR reaction solution) 2.0 μl each
(6) Sterile water (add water until the total volume is 20.0 μL)
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
Using each of the above PCR reaction solutions, DNA was amplified using a nucleic acid amplifier (Master cycler ep, Eppendorff) under the following conditions.
(a) 95°C for 15 minutes (b) 94°C for 1 minute (c) 60°C for 1 minute (d) 72°C for 1 minute (35 cycles of (b) to (d))
(e) 72°
そして、電気泳動装置（MultiNA、島津製作所）により、電気泳動を行い、増幅産物の有無を確認した。その結果を図５に示す。
同図において、比較例１～３はレーン１、比較例４はレーン２、比較例５はレーン３、比較例６はレーン４、比較例７はレーン５、比較例８はレーン６、比較例９はレーン７、実施例１はレーン８、実施例２はレーン９に示されている。
Then, electrophoresis was performed using an electrophoresis apparatus (MultiNA, Shimadzu Corporation) to confirm the presence or absence of an amplification product. The results are shown in FIG.
In the figure, Comparative Examples 1 to 3 are shown in
この結果から明らかなように、比較例１～９のレーンでは、サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675は、検出されていない。これに対して、実施例１，２では、同菌株を検出できることが確認された。 As is clear from these results, Salmonella Infantis ATCC BAA-1675 was not detected in the lanes of Comparative Examples 1 to 9. In contrast, it was confirmed that the same strain could be detected in Examples 1 and 2.
［試験２］
本試験では、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、サルモネラ ウィルヒョウの検出において、サルモネラ ケンタッキーの偽陽性判定を防止できることの確認を行った。
[Test 2]
In this test, it was confirmed that the use of the primer set for serotyping Salmonella of the present embodiment can prevent false positive determination of Salmonella Kentuckyi in detection of Salmonella Virchow.
具体的には、図６に示すように、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットを用いた実験を実施例３とし、同じくサルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットを用いた実験を実施例４とした。
また、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な従来のプライマーセットとして、配列番号４及び６３のプライマーセットと、配列番号５及び６３のプライマーセットを準備した。
配列番号４及び６３のプライマーセットと、配列番号５及び６３のプライマーセットは、非特許文献３に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例１０，１１とした。
Specifically, as shown in FIG. 6, an experiment using a primer set of SEQ ID NOs: 4 and 6 specific to Salmonella Virchow was performed as Example 3, and an experiment using a primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6 specific to Salmonella Virchow was performed as Example 4.
Furthermore, as conventional primer sets specific to Salmonella Virchow, a primer set of SEQ ID NOs: 4 and 63 and a primer set of SEQ ID NOs: 5 and 63 were prepared.
The primer set of SEQ ID NOs: 4 and 63, and the primer set of SEQ ID NOs: 5 and 63 are those described in
まず、８０２培地の調製を試験１と同様に行った。
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: 岐阜大学
サンプル１：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル２：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル３：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
First, 802 medium was prepared in the same manner as in
Next, genomic DNA was extracted from the Salmonella strains. The following strains were used. These strains were obtained from the following institutions:
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: Gifu University Sample 1: Salmonella Virchow ATCC 51955
Sample 2: Salmonella Kentucky GTC 12786
Sample 3: Negative control (sterile water was added instead of template)
これらの菌株を８０２培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
These strains were cultured in 802 medium at 30° C. with shaking at 200 rpm for 24 hours.
Next, genomic DNA was extracted according to the instructions of the DNA extraction kit, RBC Genomic DNA Extraction Kit Mini (manufactured by Cytrop).
ＰＣＲ用反応液としては、サンプルごとに、サルモネラ ウィルヒョウ検出用プライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
For each sample, 20 μL of a PCR reaction solution containing a primer set for detecting Salmonella Virchow was prepared. The primers were synthesized by Sigma-Aldrich Japan LLC.
(1) PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μL
(2) dNTP mix (Cat BR0600503, Biotechrabbit) 0.4 μL
(3) 10 μM primer, 0.4 μL each
(4) HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μL
(5) Template DNA (10 ng/PCR reaction solution) 2.0 μl each
(6) Sterile water (add water until the total volume is 20.0 μL)
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
Using each of the above PCR reaction solutions, DNA was amplified using a nucleic acid amplifier (Master cycler ep, Eppendorff) under the following conditions.
(a) 95°C for 15 minutes (b) 94°C for 1 minute (c) 60°C for 1 minute (d) 72°C for 1 minute (35 cycles of (b) to (d))
(e) 72°
そして、電気泳動装置（MultiNA、島津製作所）により、電気泳動を行い、増幅産物の有無を確認した。その結果を図７に示す。
同図において、比較例１０はレーン１、比較例１１はレーン２、実施例３はレーン３、実施例４はレーン４に示されている。
Then, electrophoresis was performed using an electrophoresis apparatus (MultiNA, Shimadzu Corporation) to confirm the presence or absence of an amplification product. The results are shown in FIG.
In the figure, Comparative Example 10 is shown in
この結果から明らかなように、比較例１０，１１のレーンでは、サルモネラ ウィルヒョウを検出できているが、サルモネラ ケンタッキーも検出しており、偽陽性が生じていることが分かる。これに対して、実施例３，４のレーンでは、サルモネラ ウィルヒョウを検出でき、かつ、サルモネラ ケンタッキーは検出されていない。このように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットによれば、サルモネラ ウィルヒョウについての誤判定を防止できることが確認された。 As is clear from these results, in the lanes of Comparative Examples 10 and 11, Salmonella Virchow was detected, but Salmonella Kentuckyi was also detected, indicating the occurrence of false positives. In contrast, in the lanes of Examples 3 and 4, Salmonella Virchow was detected, but Salmonella Kentuckyi was not detected. Thus, it was confirmed that the primer set for determining the serotype of Salmonella genus bacteria of this embodiment can prevent erroneous determination of Salmonella Virchow.
［試験３］
本試験では、サルモネラ インファンティスの菌株２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウの菌株１菌株を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、これらを同時に特異的に検出できることの確認を行った。
[Test 3]
In this test, two strains of Salmonella infantis and one strain of Salmonella Virchow were targeted, and it was confirmed that these can be specifically detected simultaneously by using the primer set for distinguishing the serotype of Salmonella of this embodiment.
具体的には、図８に示すように、従来は検出できなかったサルモネラ インファンティスの菌株（サルモネラ インファンティス（Ａ））に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットと、従来から検出できていたサルモネラ インファンティスの菌株（以下、サルモネラ インファンティス（Ｂ）と称する場合がある。）に特異的な配列番号７及び８のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットを実施例用として準備した。
また、サルモネラ インファンティスに特異的な配列番号６１及び６３の従来のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６３の従来のプライマーセットを比較例用として準備した。これらは、非特許文献３に記載のものである。
Specifically, as shown in FIG. 8 , a primer set of
In addition, a conventional primer set of SEQ ID NOs: 61 and 63 specific to Salmonella infantis and a conventional primer set of SEQ ID NOs: 4 and 63 specific to Salmonella Virchow were prepared for comparison. These were described in
まず、８０２培地の調製を試験１と同様に行った。
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: 岐阜大学
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC 51741
サンプル２：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル３：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル４：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル５：サンプル１～３の菌株全て
サンプル６：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
First, 802 medium was prepared in the same manner as in
Next, genomic DNA was extracted from the Salmonella strains. The following strains were used. These strains were obtained from the following institutions:
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: Gifu University Sample 1: Salmonella Infantis ATCC 51741
Sample 2: Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
Sample 3: Salmonella Virchow ATCC 51955
Sample 4: Salmonella Kentucky GTC 12786
Sample 5: All strains from
Sample 6: Negative control (sterile water was added instead of template)
これらの菌株を８０２培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
These strains were cultured in 802 medium at 30° C. with shaking at 200 rpm for 24 hours.
Next, genomic DNA was extracted according to the instructions of the DNA extraction kit, RBC Genomic DNA Extraction Kit Mini (manufactured by Cytrop).
ＰＣＲ用反応液としては、各実施例及び比較例のサンプルごとに、それぞれ上記各プライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
As a PCR reaction solution, 20 μL of the following composition containing each of the above primer sets was prepared for each sample of each Example and Comparative Example. The primers were synthesized by Sigma-Aldrich Japan LLC.
(1) PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μL
(2) dNTP mix (Cat BR0600503, Biotechrabbit) 0.4 μL
(3) 10 μM primer, 0.4 μL each
(4) HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μL
(5) Template DNA (10 ng/PCR reaction solution) 2.0 μl each
(6) Sterile water (add water until the total volume is 20.0 μL)
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
Using each of the above PCR reaction solutions, DNA was amplified using a nucleic acid amplifier (Master cycler ep, Eppendorff) under the following conditions.
(a) 95°C for 15 minutes (b) 94°C for 1 minute (c) 60°C for 1 minute (d) 72°C for 1 minute (35 cycles of (b) to (d))
(e) 72°
そして、電気泳動装置（MultiNA、島津製作所）により、電気泳動を行い、増幅産物の有無を確認した。その結果を図９に示す。
同図において、比較例は左側のレーン１～６（それぞれ比較例１２～１７）に示されており、実施例は右側のレーン１～６（それぞれ実施例５～１０）に示されている。
Then, electrophoresis was performed using an electrophoresis apparatus (MultiNA, Shimadzu Corporation) to confirm the presence or absence of an amplification product. The results are shown in FIG.
In the figure, comparative examples are shown in
比較例では、サンプル２のサルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675を供試菌株とするレーン２において、当該菌株が検出できていないことが分かる。また、サンプル４のサルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786 を供試菌株とするレーン４において、当該菌株が誤検出されていることが分かる。
In the comparative example, it can be seen that in
これに対して、実施例では、サンプル２のサルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675を供試菌株とするレーン２において、当該菌株が検出できていることが分かる。また、サンプル４のサルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786 を供試菌株とするレーン４において、当該菌株が誤検出されていない。
さらに、サンプル５のサンプル１～３の菌株全てを供試菌株とするレーン５において、サルモネラ インファンティス２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウ１菌株をそれぞれ識別することが可能になっている。
In contrast, in the Example, it can be seen that Salmonella Infantis ATCC BAA-1675 in
Furthermore, in
このように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットによれば、サルモネラ インファンティス２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウ１菌株を偽陰性や偽陽性を生じることなく検出することができ、さらにこれらをそれぞれ識別して、特異的に検出することが可能になっている。
As described above, the primer set for distinguishing serotypes of Salmonella bacteria of this embodiment can detect
［試験４］
本試験では、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、これらを同時に特異的に検出できることの確認を行った。
[Test 4]
In this test, five serotypes and six strains of Salmonella were targeted, and it was confirmed that these could be detected simultaneously and specifically by using the primer set for discriminating the serotype of Salmonella of this embodiment.
具体的には、図１０に示すように、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットと、サルモネラ インファンティス（Ｂ）に特異的な配列番号７及び８のプライマーセットと、サルモネラ エンテリティディスに特異的な配列番号９及び１０のプライマーセットと、サルモネラ ティフィムリウムに特異的な配列番号１１及び１２のプライマーセットと、サルモネラ ハーダーに特異的な配列番号１３及び１４のプライマーセットと、サルモネラ属に特異的な配列番号１５及び１６のプライマーセットを準備した。 Specifically, as shown in FIG. 10, a primer set of SEQ ID NOs: 2 and 3 specific to Salmonella infantis (A), a primer set of SEQ ID NOs: 4 and 6 specific to Salmonella Virchow, a primer set of SEQ ID NOs: 7 and 8 specific to Salmonella infantis (B), a primer set of SEQ ID NOs: 9 and 10 specific to Salmonella enteritidis, a primer set of SEQ ID NOs: 11 and 12 specific to Salmonella typhimurium, a primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14 specific to Salmonella harder, and a primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16 specific to the Salmonella genus were prepared.
また、上記のサルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的なプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的なプライマーセットの組み合わせに代えて、その他の組み合わせのプライマーセットを準備した。
具体的には、図１５のプライマーの欄に示すように、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットの組み合わせのもの、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットの組み合わせのもの、並びに、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットの組み合わせのものを準備した。
Moreover, instead of the above combination of the primer set specific to Salmonella infantis (A) and the primer set specific to Salmonella Virchow, other combinations of primer sets were prepared.
Specifically, as shown in the primer column of Figure 15, a combination of a primer set of SEQ ID NOs: 1 and 3 specific to Salmonella infantis (A) and a primer set of SEQ ID NOs: 4 and 6 specific to Salmonella Virchow, a combination of a primer set of SEQ ID NOs: 1 and 3 specific to Salmonella infantis (A) and a primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6 specific to Salmonella Virchow, and a combination of a primer set of SEQ ID NOs: 2 and 3 specific to Salmonella infantis (A) and a primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6 specific to Salmonella Virchow were prepared.
まず、８０２培地の調製を試験１と同様に行った。
また、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を定法に従い作成し、試験管に１０ｍＬずつ分注し、１２１℃、１５分間で滅菌した。
First, 802 medium was prepared in the same manner as in
Brain heart infusion (BHI) medium (Difco) was prepared according to a standard method, dispensed in 10 mL portions into test tubes, and sterilized at 121° C. for 15 minutes.
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
GTC: 岐阜大学
Next, genomic DNA was extracted from the Salmonella strains. The following strains were used. These strains were obtained from the following institutions:
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
GTC: Gifu University
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル２：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル３：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC 51741
サンプル４：サルモネラ エンテリティディス Salmonella Enteritidis GTC 03838
サンプル５～９：サルモネラ ティフィムリウム Salmonella Typhimurium 順にNBRC 13245、GTC 02577、GTC 11393、GTC 11566、GTC 14142
サンプル１０：サルモネラ ハーダー Salmonella Hadar ATCC 51956
サンプル１１：サンプル１～５、１０の菌株全て
Sample 1: Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
Sample 2: Salmonella Virchow ATCC 51955
Sample 3: Salmonella Infantis ATCC 51741
Sample 4: Salmonella Enteritidis GTC 03838
Sample 10: Salmonella Hadar ATCC 51956
Sample 11: All strains from
サンプル１２：サルモネラ アバエテツーバ Salmonella Abaetetuba ATCC 35640
サンプル１３：サルモネラ アゴナ Salmonella Agona ATCC BAA-707
サンプル１４：サルモネラ アルバニー Salmonella Albany ATCC 51960
サンプル１５：サルモネラ アナツム Salmonella Anatum ATCC 9270
サンプル１６：サルモネラ バレリー Salmonella Bareilly ATCC 9115
サンプル１７：サルモネラ ブレデニー Salmonella Bredney ATCC 10728
サンプル１８：サルモネラ セロ Salmonella Cerro GTC 02554
サンプル１９：サルモネラ ダービー Salmonella Derby ATCC 6960
サンプル２０：サルモネラ エッセン Salmonella Essen GTC 12814
サンプル２１：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
Sample 12: Salmonella Abaetetuba ATCC 35640
Sample 13: Salmonella Agona ATCC BAA-707
Sample 14: Salmonella Albany ATCC 51960
Sample 15: Salmonella Anatum ATCC 9270
Sample 16: Salmonella Bareilly ATCC 9115
Sample 17: Salmonella Bredney ATCC 10728
Sample 18: Salmonella Cerro GTC 02554
Sample 19: Salmonella Derby ATCC 6960
Sample 20: Salmonella Essen GTC 12814
Sample 21: Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル２２：サルモネラ ムバンダカ Salmonella Mbandaka ATCC 51958
サンプル２３～２６：サルモネラ モンテビデオ Salmonella Montevideo 順にATCC BAA-710、ATCC BAA-1735、ATCC 8387、GTC 02525
サンプル２７～２８：サルモネラ ニューポート Salmonella Newport 順にATCC 5962、ATCC 27869
サンプル２９：サルモネラ パラティフィC Salmonella Paratyphi C ATCC 9068
サンプル３０：サルモネラ プーナ Salmonella Poona NCTC 4840
サンプル３１：サルモネラ セントポール Salmonella Saintpaul ATCC 9712
Sample 22: Salmonella Mbandaka ATCC 51958
Samples 27-28: Salmonella Newport, ATCC 5962 and ATCC 27869
Sample 29: Salmonella Paratyphi C ATCC 9068
Sample 30: Salmonella Poona NCTC 4840
Sample 31: Salmonella Saintpaul ATCC 9712
サンプル３２：サルモネラ シュワルツェングルント Salmonella Schwarzengrund GTC 12055
サンプル３３：サルモネラ センフテンベルク Salmonella Senftenberg ATCC 8400
サンプル３４：サルモネラ タラハシー Salmonella Tallahassee ATCC 12002
サンプル３５：サルモネラ テネシー Salmonella Tennessee ATCC 10722
サンプル３６～３７：サルモネラ トンプソン Salmonella Thompson 順にATCC BAA-1604、ATCC 8391
サンプル３８：サルモネラ ヴェールール Salmonella Vellore ATCC 15611
サンプル３９：サルモネラ エンテリカ亜種サラマエ Salmonella enterica subsp. Salamae ATCC43972
サンプル４０：サルモネラ ボンゴリ Salmonella bongori ATCC 43975
サンプル４１：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
※３９～４１以外はSalmonalla enterica subsp. enterica
Sample 32: Salmonella Schwarzengrund GTC 12055
Sample 33: Salmonella Senftenberg ATCC 8400
Sample 34: Salmonella Tallahassee ATCC 12002
Sample 35: Salmonella Tennessee ATCC 10722
Samples 36-37: Salmonella Thompson, ATCC BAA-1604, ATCC 8391
Sample 38: Salmonella Vellore ATCC 15611
Sample 39: Salmonella enterica subsp. Salamae ATCC43972
Sample 40: Salmonella bongori ATCC 43975
Sample 41: Negative control (sterile water was added instead of template)
*39 to 41 are all Salmonalla enterica subsp. enterica
これらの菌株を８０２培地又はＢＨＩ培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
These strains were cultured in 802 medium or BHI medium with shaking at 30° C. and 200 rpm for 24 hours.
Next, genomic DNA was extracted according to the instructions of the DNA extraction kit, RBC Genomic DNA Extraction Kit Mini (manufactured by Cytrop).
ＰＣＲ用反応液としては、サンプルごとに、上記のプライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μM インファンティス（Ａ）用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（４）10μM インファンティス（Ａ）用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（５）10μM ウィルヒョウ用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（６）10μM ウィルヒョウ用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（７）10μM インファンティス（Ｂ）用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（８）10μM インファンティス（Ｂ）用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（９）10μM エンテリティディス用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） １．０μＬ
（１０）10μM エンテリティディス用プライマー（Ｒ） ０．２μＬ
（１１）10μM ティフィムリウム用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（１２）10μM ティフィムリウム用プライマー（Ｒ） ０．０４μＬ
（１３）10μM ハーダー用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．５μＬ
（１４）10μM ハーダー用プライマー（Ｒ） ０．１μＬ
（１５）10μM サルモネラ属菌用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（１６）10μM サルモネラ属菌用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（１７）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（１８）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（１９）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
As a PCR reaction solution, 20 μL of the following composition containing the above primer set was prepared for each sample. The primers were synthesized by Sigma-Aldrich Japan LLC.
(1) PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μL
(2) dNTP mix (Cat BR0600503, Biotechrabbit) 0.4 μL
(3) 10 μM Infantis (A) primer (F) 0.04 μL
(4) 10 μM Infantis (A) primer (R) (
(5) 10 μM Virchow primer (F) 0.04 μL
(6) 10 μM Virchow primer (R) (
(7) 10 μM Infantis (B) primer (F) 0.04 μL
(8) 10 μM Infantis (B) primer (R) (
(9) 10 μM Enteritidis primer (F) (
(10) 10 μM Enteritidis primer (R) 0.2 μL
(11) 10 μM Typhimurium primer (F) (
(12) 10 μM Typhimurium primer (R) 0.04 μL
(13) 10 μM Hardener primer (F) (
(14) 10 μM Harder primer (R) 0.1 μL
(15) 10 μM Salmonella primer (F) 0.04 μL
(16) 10 μM Salmonella primer (R) (
(17) HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μL
(18) Template DNA (10 ng/PCR reaction solution) 2.0 μl each
(19) Sterile water (add water until the total volume is 20.0 μL)
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
Using each of the above PCR reaction solutions, DNA was amplified using a nucleic acid amplifier (Master cycler ep, Eppendorff) under the following conditions.
(a) 95°C for 15 minutes (b) 94°C for 1 minute (c) 60°C for 1 minute (d) 72°C for 1 minute (35 cycles of (b) to (d))
(e) 72°
サルモネラ属菌の血清型判別用マイクロアレイとして、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、配列番号１７～４７のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。 A DNA chip (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.) was used as a microarray for serotyping Salmonella bacteria, with probes of SEQ ID NOs: 17 to 47 arranged on it. Each probe was synthesized by Sigma-Aldrich Japan LLC. Each probe was immobilized on the substrate using a DNA spotter.
配列番号１７～２１は、サルモネラ インファンティス（Ａ）を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２２～２４は、サルモネラ ウィルヒョウを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２５～２９は、サルモネラ インファンティス（Ｂ）を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３０～３５は、サルモネラ エンテリティディスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３６～４０は、サルモネラ ティフィムリウムを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４１～４４は、サルモネラ ハーダーを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４５～４７は、サルモネラ属を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。 SEQ ID NOs: 17 to 21 show the base sequences of a probe for detecting Salmonella infantis (A). SEQ ID NOs: 22 to 24 show the base sequences of a probe for detecting Salmonella Virchow. SEQ ID NOs: 25 to 29 show the base sequences of a probe for detecting Salmonella infantis (B). SEQ ID NOs: 30 to 35 show the base sequences of a probe for detecting Salmonella enteritidis. SEQ ID NOs: 36 to 40 show the base sequences of a probe for detecting Salmonella typhimurium. SEQ ID NOs: 41 to 44 show the base sequences of a probe for detecting Salmonella hardyli. SEQ ID NOs: 45 to 47 show the base sequences of a probe for detecting the genus Salmonella.
ハイブリダイゼーション用の反応液は、以下のように調製した。
ＰＣＲ産物を９５℃で５分間処理し、急冷した。また、ハイブリダイゼーション用バッファー２μＬとＰＣＲ産物４μＬをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ社製）内でハイブリダイゼーションを行った。
The reaction solution for hybridization was prepared as follows.
The PCR product was treated at 95°C for 5 minutes and then rapidly cooled. 2 µL of hybridization buffer and 4 µL of the PCR product were mixed on the cover of the DNA chip. The buffer composition was 3 x SSC/0.3
Then, this cover was placed on the DNA chip, and hybridization was carried out in a hybridizer (manufactured by Dako) under hybridization conditions of 45° C./1 hour.
次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
そして、標識検出装置（GENOGATE（R）reader、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社）を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。Ｓ／Ｎ比値が３以上の場合に陽性と判定した。その結果を図１１～図１５に示す。
Next, the DNA chip was washed with a washing solution (0.5×SSC/0.2% SDS, 0.5×SSC) to wash away unhybridized PCR products.
Then, using a label detection device (GENOGATE® reader, Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd.), the fluorescence intensity (fluorescence intensity of the amplified product bound to the probe) of each probe placed on the DNA chip was measured, and the S/N ratio value ((median fluorescence intensity value-background value)÷background value) of each probe was obtained. A S/N ratio value of 3 or more was determined to be positive. The results are shown in Figures 11 to 15.
図１１に示すように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイによれば、サルモネラ インファンティス（Ａ）、サルモネラ ウィルヒョウ、サルモネラ インファンティス（Ｂ）、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウム、サルモネラ ハーダー、及びサルモネラ属の全てについて、偽陰性を生じることなく、同時に特異的に検出できることが確認された。
また、図１２～１４に示すように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイによれば、サルモネラ属のその他の血清型について、偽陽性を生じることがないことが確認された。
As shown in FIG. 11 , it was confirmed that the primer set for serotyping Salmonella and the microarray for serotyping Salmonella of this embodiment can specifically detect Salmonella infantis (A), Salmonella Virchow, Salmonella infantis (B), Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella hardier, and all of the genus Salmonella simultaneously without generating false negatives.
Furthermore, as shown in Figures 12 to 14, it was confirmed that the primer set for serotyping Salmonella bacteria and the microarray for serotyping Salmonella bacteria of this embodiment did not cause false positives for other serotypes of the Salmonella genus.
さらに、図１５に示すように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイによれば、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的なプライマーセット２種類と、サルモネラ ウィルヒョウに特異的なプライマーセット２種類とを全ての組み合わせで用いた場合でも、ほぼ偽陰性を生じることなく、同時に特異的に検出できることが確認された。
具体的には、ウィルヒョウ用プライマーセットとして配列番号５及び６の組み合わせを使用した場合は、配列番号２４のウィルヒョウ用プローブは偽陰性となったが、その他の組み合わせでは、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を同時に特異的に検出することが可能であった。
Furthermore, as shown in FIG. 15 , it was confirmed that the primer set for serotyping Salmonella spp. and the microarray for serotyping Salmonella spp. of this embodiment enable simultaneous and specific detection with almost no false negatives, even when all combinations of two types of primer sets specific to Salmonella infantis (A) and two types of primer sets specific to Salmonella Virchow were used.
Specifically, when the combination of SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO:6 was used as the Virchow primer set, the Virchow probe of SEQ ID NO:24 gave a false negative result, but the other combinations made it possible to specifically detect six strains of five serotypes of Salmonella simultaneously.
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに配置するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ配置しても良い。また、本実施形態の検出対象であるサルモネラ属菌以外の細菌等を検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共にマイクロアレイに配置されていても良く、適宜変更することが可能である。
The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and it goes without saying that various modifications and variations are possible within the scope of the present invention.
For example, the number of probes arranged on the microarray for serotyping Salmonella of this embodiment is not limited to one spot per type, and each probe may be arranged on multiple spots. In addition, other probes for detecting bacteria other than the Salmonella bacteria to be detected in this embodiment may be arranged on the microarray together with the probe of this embodiment, and appropriate changes can be made.
本発明は、畜産物、食品、環境等の衛生管理の分野などにおいて、サルモネラ属菌の血清型を特異的に検出する場合に好適に利用することが可能である。 The present invention can be suitably used to specifically detect the serotype of Salmonella in fields such as hygiene management of livestock products, food, and the environment.
Claims (3)
（１）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号２に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセットである。 A primer set for distinguishing a serotype of Salmonella spp., comprising the primer set shown in (1) below:
(1) A primer set specific to Salmonella Infantis,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A primer set in which the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and/or
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
The reverse primer is a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO:3.
（３）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号７に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（４）サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号９に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（５）サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーセットである。 A primer set for distinguishing the serotype of Salmonella spp., comprising the primer set according to claim 1 and at least one primer set selected from the primer sets shown in (3) to (5) below:
(3) A primer set specific to Salmonella Infantis,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7,
A primer set in which the reverse primer consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:8;
(4) A primer set specific to Salmonella Enteritidis,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO:9,
A primer set in which the reverse primer consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10;
(5) A primer set specific to Salmonella Typhimurium,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11,
The reverse primer is a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO:12.
（６）サルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１３に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセットである。 A primer set for distinguishing the serotype of Salmonella spp., comprising the primer set according to claim 1 or 2 and at least one primer set selected from the primer sets shown in (6) to (7) below:
(6) A primer set specific to Salmonella Hadar,
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13,
A primer set in which the reverse primer consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14;
(7) A primer set for amplifying an invA gene region specific to Salmonella spp., comprising:
The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15,
The reverse primer is a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO:16.
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