JP2024061003A - Methods for detecting rhabdomyosarcoma and biomarkers thereof - Google Patents
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Abstract
【課題】 横紋筋肉腫およびそのサブタイプ並びに高リスクの横紋筋肉腫を検出する新規な方法並びに横紋筋肉腫およびそのサブタイプ並びに高リスクの横紋筋肉腫の新規なバイオマーカーの提供。【解決手段】 本発明によれば、被験対象の生体試料中における代謝物の量または濃度を指標にする、横紋筋肉腫およびそのサブタイプ並びに高リスクの横紋筋肉腫の検出方法が提供される。本発明によればまた、生体代謝物を含んでなる、横紋筋肉腫およびそのサブタイプ並びに高リスクの横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーが提供される。代謝物の量または濃度は例えば質量分析装置で測定することができる。【選択図】図１[Problem] To provide a novel method for detecting rhabdomyosarcoma, its subtypes, and high-risk rhabdomyosarcoma, and a novel biomarker for rhabdomyosarcoma, its subtypes, and high-risk rhabdomyosarcoma. [Solution] According to the present invention, there is provided a method for detecting rhabdomyosarcoma, its subtypes, and high-risk rhabdomyosarcoma, which uses the amount or concentration of a metabolite in a biological sample from a subject as an indicator. According to the present invention, there is also provided a biomarker for detecting rhabdomyosarcoma, its subtypes, and high-risk rhabdomyosarcoma, which comprises a biological metabolite. The amount or concentration of the metabolite can be measured, for example, by a mass spectrometer. [Selected Figure] FIG. 1
Description
本発明は、横紋筋肉腫の検出方法およびそのバイオマーカーに関する。本発明はまた、横紋筋肉腫のサブタイプおよび高リスクの横紋筋肉腫の検出方法とそれらのバイオマーカーに関する。 The present invention relates to a method for detecting rhabdomyosarcoma and a biomarker thereof. The present invention also relates to a method for detecting subtypes of rhabdomyosarcoma and high-risk rhabdomyosarcoma and a biomarker thereof.
横紋筋肉腫は小児肉腫の中で最も頻度が高い希少性、難治性の肉腫であり、小児がんの５～８％を占める。横紋筋肉腫の５年無増悪生存率は中間・高リスク群で約５０％前後であり、現在の診断治療法だけでは未だ十分な治療効果とはいいがたく、新たな診断および治療法の開発が急務である。しかし、横紋筋肉腫については未だ有効な腫瘍マーカーが報告されていない。 Rhabdomyosarcoma is the most common and rare, intractable sarcoma in children, accounting for 5-8% of childhood cancers. The 5-year progression-free survival rate for rhabdomyosarcoma is approximately 50% in the intermediate- and high-risk groups, and current diagnostic and treatment methods alone are not yet sufficiently effective, making the development of new diagnostic and treatment methods urgently necessary. However, no effective tumor markers have yet been reported for rhabdomyosarcoma.
本発明は横紋筋肉腫を検出する新規な方法と、横紋筋肉腫のサブタイプまたは高リスクの横紋筋肉腫を検出する新規な方法を提供することを目的とする。本発明はまた、横紋筋肉腫の新規なバイオマーカーと、横紋筋肉腫のサブタイプまたは高リスクの横紋筋肉腫の新規なバイオマーカーを提供することを目的とする。 The present invention aims to provide a novel method for detecting rhabdomyosarcoma and a novel method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma or high-risk rhabdomyosarcoma. The present invention also aims to provide a novel biomarker for rhabdomyosarcoma and a novel biomarker for a subtype of rhabdomyosarcoma or high-risk rhabdomyosarcoma.
本発明者らは今般、横紋筋肉腫患者から得られた生体試料について質量分析装置により分析を実施し、生体代謝物を指標にすることにより横紋筋肉腫を検出できることを見出した。本発明らはまた、生体代謝物を指標にすることにより横紋筋肉腫のサブタイプを検出できることを見出した。本発明らはさらに、生体代謝物を指標にすることにより高リスクの横紋筋肉腫を検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。 The present inventors have now performed analysis of biological samples obtained from rhabdomyosarcoma patients using a mass spectrometer and found that rhabdomyosarcoma can be detected by using biological metabolites as indicators. The present inventors have also found that subtypes of rhabdomyosarcoma can be detected by using biological metabolites as indicators. The present inventors have further found that high-risk rhabdomyosarcoma can be detected by using biological metabolites as indicators. The present invention is based on these findings.
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］被験対象の生体試料中における代謝物の量または濃度を指標にして横紋筋肉腫もしくはそのサブタイプまたは高リスクの横紋筋肉腫を検出する、横紋筋肉腫もしくはそのサブタイプまたは高リスクの横紋筋肉腫の検出方法。
［２］横紋筋肉腫の検出方法である、上記［１］に記載の検出方法であって、前記代謝物が、
(1) エチルグルクロニド、
(2) チミン、
(3) Ｎ－アセチルノイラミン酸、
(4) ５－メチルシチジンおよび
(5) カルノシン
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ａ））である、検出方法。
［３］前記(1)～(5)のすべての物質を指標にする、上記［２］に記載の検出方法。
［４］代謝物（ａ）以外の物質の量または濃度をさらに指標にする、上記［２］または［３］に記載の検出方法であって、代謝物（ａ）以外の物質が、
(6) リン酸フェニル、
(7) ベンゾイルグリシン、
(8) グアニジノ酢酸、
(9) Ｌ－アルギニノコハク酸、
(10) アゼライン酸、
(11) Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンおよび
(12) イミダゾール－４－酢酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｂ））である、検出方法。
［５］前記(1)～(12)のすべての物質を指標にする、上記［４］に記載の検出方法。
［６］横紋筋肉腫の検出方法である、上記［１］に記載の検出方法であって、前記代謝物が、
(21) カルノシン、
(22) アンセリン、
(23) Ｌ－グルタミン酸、
(24) Ｌ－システイン、
(25) １，３－ジアミノプロパン、
(26) タウリン、
(27) イミダゾール酢酸、
(28) α－リノレン酸および
(29) アラキドン酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｃ））である、検出方法。
［７］前記(21)～(29)のすべての物質または前記(21)～(24)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を指標にする、上記［６］に記載の検出方法。
［８］横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法である、上記［１］に記載の検出方法であって、前記代謝物が、
(101) Ｌ－フェニルアラニン、
(102) ホモシトルリン、
(103) ＧＤＰグルコース、
(104) Ｌ－ヒスチジン、
(105) Ｎ，Ｎ－ジメチルアルギニン、
(106) Ｎ２－アセチル－Ｌ－リジンおよび
(107) チミジン一リン酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｄ））である、検出方法。
［９］前記(101)～(107)のすべての物質を指標にする、上記［８］に記載の検出方法。
［１０］代謝物（ｄ）以外の物質の量または濃度をさらに指標にする、上記［８］または［９］に記載の検出方法であって、代謝物（ｄ）以外の物質が、
(108) Ｌ－２－アミノアジピン酸、
(109) βアミノイソ酪酸、
(110) １－メチルヒスチジン、
(111) α－Ｄ－グルコース６－リン酸、
(112) Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、
(113) グアニジノ酢酸および
(114) １６－エピエストリオール
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｅ））である、検出方法。
［１１］前記(101)～(114)のすべての物質を指標にする、上記［１０］に記載の検出方法。
［１２］横紋筋肉腫のサブタイプが胎児型および胞巣型である、上記［１］および［８］～［１１］のいずれかに記載の検出方法。
［１３］高リスクの横紋筋肉腫の検出方法である、上記［１］に記載の検出方法であって、前記代謝物が、
(121) オキソグルタル酸、
(122) Ｌ－ヒスチジン、
(123) リノール酸、
(124) ベタイン、
(125) ジメチルグリシン、
(126) サッカロピン、
(127) アミノアジピン酸、
(128) α－リノレン酸および
(129) グアニド酢酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｆ））である、検出方法。
［１４］前記(121)～(129)のすべての物質または前記(121)～(125)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を指標にする、上記［１３］に記載の検出方法。
［１５］前記被験対象の生体試料中における代謝物の量または濃度を測定する工程を含む、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の検出方法。
［１６］前記被験対象の生体試料中における代謝物の量もしくは濃度、または前記被験対象の生体試料中の２種以上の代謝物の量もしくは濃度の測定値から算出された一つの結合指標値を、カットオフ値と比較する工程を含む、上記［１］～［１５］のいずれかに記載の検出方法。
［１７］被験対象が２０歳未満のヒトである、上記［１］～［１６］のいずれかに記載の検出方法。
［１８］生体試料が尿試料である、上記［１］～［１７］のいずれかに記載の検出方法。
［１９］代謝物の量または濃度を質量分析装置で測定する、上記［１］～［１８］のいずれかに記載の検出方法。
［２０］横紋筋肉腫の診断を補助する方法である、上記［１］～［７］および［１３］～［１７］のいずれかに記載の検出方法。
［２１］横紋筋肉腫のサブタイプの診断を補助する方法である、上記［１］、［８］～［１２］および［１５］～［１９］のいずれかに記載の検出方法。
［２２］高リスクの横紋筋肉腫の診断を補助する方法である、上記［１］、［１３～［１９］のいずれかに記載の検出方法。
［２３］横紋筋肉腫もしくはそのサブタイプまたは高リスクの横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーとしての、生体代謝物の使用。
［２４］生体代謝物が尿代謝物である、上記［２３］に記載の使用。
［２５］横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーとしての、上記［２３］または［２４］の使用であって、前記代謝物が、上記［２］に記載の代謝物（ａ）および場合によっては上記［４］に記載の代謝物（ｂ）である、使用。
［２６］横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーとしての、上記［２３］または［２４］の使用であって、前記代謝物が、上記［６］に記載の代謝物（ｃ）である、使用。
［２７］横紋筋肉腫のサブタイプの検出用バイオマーカーとしての、上記［２３］または［２４］の使用であって、前記代謝物が、上記［８］に記載の代謝物（ｄ）および場合によっては上記［１０］に記載の代謝物（ｅ）である、使用。
［２８］高リスクの横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーとしての、上記［２３］または［２４］の使用であって、前記代謝物が、上記［１３］に記載の代謝物（ｆ）である、使用。
［２９］生体代謝物を含んでなる、横紋筋肉腫またはそのサブタイプの検出用バイオマーカー。
［３０］生体代謝物が尿代謝物である、上記［２９］に記載のバイオマーカー。
［３１］横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーである、上記［２９］または［３０］のバイオマーカーであって、前記代謝物が、上記［２］に記載の代謝物（ａ）および場合によっては上記［４］に記載の代謝物（ｂ）である、バイオマーカー。
［３２］横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーである、上記［２９］または［３０］のバイオマーカーであって、前記代謝物が、上記［６］に記載の代謝物（ｃ）である、バイオマーカー。
［３３］横紋筋肉腫のサブタイプの検出用バイオマーカーである、上記［２９］または［３０］のバイオマーカーであって、前記代謝物が、上記［８］に記載の代謝物（ｄ）および場合によっては上記［１０］に記載の代謝物（ｅ）である、バイオマーカー。
［３４］高リスクの横紋筋肉腫の検出用バイオマーカーである、上記［２９］または［３０］のバイオマーカーであって、前記代謝物が、上記［１３］に記載の代謝物（ｆ）である、バイオマーカー。
［３５］横紋筋肉腫の治療方法であって、上記［１］～［７］のいずれかに記載の検出方法により横紋筋肉腫の存在が示された対象または横紋筋肉腫の存在可能性が示された対象を選択し、選択された対象に横紋筋肉腫の治療を行う、前記治療方法。
［３６］胞巣型または胎児型の横紋筋肉腫の治療方法であって、上記［１］、［８］～［１２］および［１５］～［１９］のいずれかに記載の検出方法により胞巣型もしくは胎児型の横紋筋肉腫の存在が示された対象または胞巣型もしくは胎児型の横紋筋肉腫の存在可能性が示された対象を選択し、選択された対象に胞巣型または胎児型の横紋筋肉腫の治療を行う、前記治療方法。
［３７］高リスクの横紋筋肉腫または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の治療方法であって、上記［１］および［１３］～［１９］のいずれかに記載の検出方法により高リスクの横紋筋肉腫または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の存在が示された対象、あるいは高リスクの横紋筋肉腫または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の存在可能性が示された対象を選択し、選択された対象に高リスクの横紋筋肉腫の治療または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の治療を行う、前記治療方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
[1] A method for detecting rhabdomyosarcoma or a subtype thereof, or high-risk rhabdomyosarcoma, comprising detecting rhabdomyosarcoma or a subtype thereof, or high-risk rhabdomyosarcoma using the amount or concentration of a metabolite in a biological sample from a subject as an indicator.
[2] The method for detecting rhabdomyosarcoma according to the above-mentioned [1], wherein the metabolite is:
(1) Ethyl glucuronide,
(2) Thymine,
(3) N-acetylneuraminic acid,
(4) 5-methylcytidine and
(5) A detection method, wherein the substance (metabolite (a)) is one or more substances selected from the group consisting of carnosine.
[3] The detection method according to [2] above, wherein all of the substances (1) to (5) above are used as indicators.
[4] The detection method according to the above-mentioned [2] or [3], further using the amount or concentration of a substance other than the metabolite (a) as an indicator, wherein the substance other than the metabolite (a) is:
(6) phenyl phosphate,
(7) Benzoylglycine,
(8) guanidinoacetic acid,
(9) L-argininosuccinic acid,
(10) azelaic acid,
(11) N-acetyl-L-phenylalanine and
(12) A method for detecting the compound (b), wherein the compound (b) is one or more substances selected from the group consisting of imidazole-4-acetic acid (metabolites).
[5] The detection method according to the above [4], wherein all of the substances (1) to (12) are used as indicators.
[6] The method for detecting rhabdomyosarcoma according to the above-mentioned [1], wherein the metabolite is:
(21) Carnosine,
(22) anserine,
(23) L-glutamic acid,
(24) L-cysteine,
(25) 1,3-diaminopropane,
(26) Taurine,
(27) Imidazole acetic acid,
(28) α-linolenic acid and
(29) A method for detecting the metabolite (c), wherein the metabolite (c) is one or more substances selected from the group consisting of arachidonic acid.
[7] The detection method according to [6] above, wherein all of the substances in (21) to (29) or one or more substances selected from the group consisting of (21) to (24) above are used as indicators.
[8] The method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma according to the above-mentioned [1], wherein the metabolite is:
(101) L-phenylalanine,
(102) Homocitrulline,
(103) GDP glucose,
(104) L-histidine,
(105) N,N-dimethylarginine,
(106) N2-acetyl-L-lysine and
(107) A method for detecting the presence of one or more substances (metabolites (d)) selected from the group consisting of thymidine monophosphate.
[9] The detection method according to the above [8], wherein all of the substances (101) to (107) are used as indicators.
[10] The detection method according to the above-mentioned [8] or [9], further using the amount or concentration of a substance other than the metabolite (d) as an indicator, wherein the substance other than the metabolite (d) is:
(108) L-2-aminoadipic acid,
(109) β-aminoisobutyric acid,
(110) 1-methylhistidine,
(111) α-D-glucose 6-phosphate,
(112) N,N-dimethylglycine,
(113) Guanidinoacetic acid and
(114) A method for detecting one or more substances (metabolites (e)) selected from the group consisting of 16-epiestriol.
[11] The detection method according to the above [10], wherein all of the substances described in (101) to (114) are used as indicators.
[12] The method for detecting rhabdomyosarcoma according to any one of [1] and [8] to [11] above, wherein the subtype of rhabdomyosarcoma is embryonal or alveolar.
[13] The detection method according to the above-mentioned [1], which is a method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is:
(121) Oxoglutaric acid,
(122) L-histidine,
(123) Linoleic acid,
(124) Betaine,
(125) Dimethylglycine,
(126) Saccharopine,
(127) Aminoadipic acid,
(128) α-Linolenic acid and
(129) A method for detecting the presence of one or more substances (metabolites (f)) selected from the group consisting of guanidoacetic acid.
[14] The detection method according to the above [13], wherein one or more substances selected from the group consisting of all of the substances in (121) to (129) or the group consisting of (121) to (125) are used as indicators.
[15] The detection method according to any one of [1] to [14] above, comprising a step of measuring the amount or concentration of a metabolite in a biological sample from the subject.
[16] The detection method according to any one of the above-mentioned [1] to [15], comprising a step of comparing one binding index value calculated from the measured amounts or concentrations of a metabolite in the biological sample of the subject, or the amounts or concentrations of two or more types of metabolites in the biological sample of the subject, with a cutoff value.
[17] The detection method according to any one of [1] to [16] above, wherein the subject is a human under the age of 20.
[18] The detection method according to any one of [1] to [17] above, wherein the biological sample is a urine sample.
[19] The detection method according to any one of [1] to [18] above, wherein the amount or concentration of the metabolite is measured using a mass spectrometer.
[20] The detection method according to any one of [1] to [7] and [13] to [17] above, which is a method for assisting in the diagnosis of rhabdomyosarcoma.
[21] The detection method according to any one of the above [1], [8] to [12], and [15] to [19], which is a method for assisting in the diagnosis of a subtype of rhabdomyosarcoma.
[22] The detection method according to any one of [1] and [13] to [19] above, which is a method for assisting in the diagnosis of high-risk rhabdomyosarcoma.
[23] The use of biological metabolites as biomarkers for the detection of rhabdomyosarcoma or its subtypes or high-risk rhabdomyosarcoma.
[24] The use according to [23] above, wherein the biological metabolite is a urinary metabolite.
[25] Use of the above-mentioned [23] or [24] as a biomarker for detecting rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (a) described in the above-mentioned [2] and, optionally, metabolite (b) described in the above-mentioned [4].
[26] The use of the above-mentioned [23] or [24] as a biomarker for detecting rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (c) described in the above-mentioned [6].
[27] Use of the above-mentioned [23] or [24] as a biomarker for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (d) described in the above-mentioned [8] and, optionally, metabolite (e) described in the above-mentioned [10].
[28] Use of the above-mentioned [23] or [24] as a biomarker for detecting high-risk rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (f) described in the above-mentioned [13].
[29] A biomarker for detecting rhabdomyosarcoma or a subtype thereof, comprising a biological metabolite.
[30] The biomarker described in [29] above, wherein the biological metabolite is a urinary metabolite.
[31] The biomarker according to [29] or [30] above, which is a biomarker for detecting rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (a) according to [2] above and, in some cases, metabolite (b) according to [4] above.
[32] The biomarker according to [29] or [30] above, which is a biomarker for detecting rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (c) according to [6] above.
[33] The biomarker according to [29] or [30] above, which is a biomarker for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (d) according to [8] above and, in some cases, metabolite (e) according to [10] above.
[34] The biomarker according to [29] or [30] above, which is a biomarker for detecting high-risk rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is metabolite (f) according to [13] above.
[35] A method for treating rhabdomyosarcoma, comprising selecting a subject in which the presence of rhabdomyosarcoma or a subject in which the possibility of the presence of rhabdomyosarcoma has been shown by the detection method according to any one of [1] to [7] above, and treating the selected subject for rhabdomyosarcoma.
[36] A method for treating alveolar or embryonal rhabdomyosarcoma, comprising selecting a subject in which the presence of alveolar or embryonal rhabdomyosarcoma or a subject in which the possible presence of alveolar or embryonal rhabdomyosarcoma has been shown by the detection method described in any one of [1], [8] to [12], and [15] to [19] above is indicated, and treating the selected subject for alveolar or embryonal rhabdomyosarcoma.
[37] A method for treating high-risk or low-risk or intermediate-risk rhabdomyosarcoma, comprising selecting a subject in whom the presence of high-risk or low-risk or intermediate-risk rhabdomyosarcoma has been indicated by the detection method according to any one of [1] and [13] to [19] above, or a subject in whom the possible presence of high-risk or low-risk or intermediate-risk rhabdomyosarcoma has been indicated, and treating the selected subject for high-risk rhabdomyosarcoma or low-risk or intermediate-risk rhabdomyosarcoma.
本発明によれば、横紋筋肉腫およびそのサブタイプを検出する新規なバイオマーカーが提供されることから、本発明は横紋筋肉腫およびそのサブタイプの診断精度の向上と患者の予後改善に資する点で有利である。 The present invention provides a novel biomarker for detecting rhabdomyosarcoma and its subtypes, and is therefore advantageous in that it contributes to improving the accuracy of diagnosis of rhabdomyosarcoma and its subtypes and improving the prognosis of patients.
＜＜定義＞＞
本発明において「横紋筋肉腫」は、筋肉などの軟部組織から発生する軟部肉腫の１つであり、軟部悪性腫瘍としては小児で最も多くみられる。横紋筋肉腫は横紋筋のみならず、全身のあらゆる部位から発生し、特に、泌尿器、生殖器、頭頸部（傍髄膜および眼窩を含む）、四肢（上肢および下肢を含む）にみられる。２０２０ＷＨＯ分類によると、横紋筋肉腫は病理診断により胎児型（Embryonal）、胞巣型（Alveolar）、Spindle cell/sclerosing、Pleomorphicの４サブタイプに大別されるが、小児においては胎児型と胞巣型が殆どである。胎児型は一般的に予後良好であることが知られており、横紋筋肉腫症例の約６５％を占める。胞巣型は一般的に予後不良であることが知られており、横紋筋肉腫症例の約２５％を占める。胞巣型では染色体転座が認められ、染色体転座に伴う変異遺伝子：PAX3FOXO1またはPAX7FOXO1の存在が予後不良因子であることが知られている（非特許文献１）。
<<Definition>>
In the present invention, "rhabdomyosarcoma" is one of the soft tissue sarcomas that develop from soft tissues such as muscles, and is the most common soft tissue malignant tumor in children. Rhabdomyosarcoma develops not only in striated muscles but also in any part of the body, particularly in the urinary tract, genital tract, head and neck (including parameningeal and orbital regions), and limbs (including upper and lower limbs). According to the 2020 WHO classification, rhabdomyosarcoma is broadly classified into four subtypes based on pathological diagnosis: embryonal, alveolar, spindle cell/sclerosing, and pleomorphic, but in children, the embryonal and alveolar types are the majority. The embryonal type is generally known to have a good prognosis, accounting for approximately 65% of rhabdomyosarcoma cases. The alveolar type is generally known to have a poor prognosis, accounting for approximately 25% of rhabdomyosarcoma cases. In the alveolar type, chromosomal translocations are observed, and the presence of mutated genes associated with the chromosomal translocations, PAX3FOXO1 or PAX7FOXO1, is known to be a poor prognostic factor (Non-patent Document 1).
本発明において「生体試料」は、生体から分離された試料を意味し、例えば、尿、血液等の体液であり、好ましくは尿試料である。生体試料の採取方法は侵襲的であっても非侵襲的であってもよく、生体試料が尿試料の場合、非侵襲的に採取できる点で有利である。 In the present invention, a "biological sample" refers to a sample isolated from a living organism, such as a body fluid such as urine or blood, and preferably a urine sample. The method of collecting a biological sample may be invasive or non-invasive, and when the biological sample is a urine sample, it is advantageous in that it can be collected non-invasively.
本発明における「対象」は、ヒトを含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。ヒト以外の対象としてはモデル動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等のモデル哺乳動物）が挙げられる。 The "subject" in the present invention includes mammals including humans, and is preferably humans. Non-human subjects include model animals (e.g., model mammals such as mice, rats, and rabbits).
本発明において被験対象は２０歳未満のヒトを対象とすることができ、小児を対象とすることもできる。「小児」とは１５歳未満の者をいい、新生児（出生後４週未満）、乳児（生後４週以上、１歳未満）および幼児（１歳以上、７歳未満）を含む。 In the present invention, the subject may be a human under the age of 20, or may be a child. "Child" refers to a person under the age of 15, and includes newborns (less than 4 weeks old), infants (4 weeks or older, but less than 1 year old), and toddlers (1 year or older, but less than 7 years old).
＜＜横紋筋肉腫の検出方法＞＞
本発明によれば、横紋筋肉腫の検出方法が提供される。本発明の横紋筋肉腫の検出方法によれば、被験対象の生体試料中の代謝物の量または濃度を指標にして横紋筋肉腫の存在または横紋筋肉腫の存在可能性を判定することができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫の検出方法は、生体試料中の代謝物の量または濃度を被験対象における横紋筋肉腫の存在または横紋筋肉腫の存在可能性と関連づけることを特徴とする。なお、本発明の検出方法においては被験対象の生体試料中の代謝物の量または濃度を指標にして横紋筋肉腫の存在または横紋筋肉腫の存在可能性を判定（決定）するという側面をもつため、本発明の横紋筋肉腫の検出方法は横紋筋肉腫の判定方法と言い換えることもできる。
<<Method of detecting rhabdomyosarcoma>>
According to the present invention, a method for detecting rhabdomyosarcoma is provided. According to the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, the presence or possibility of the presence of rhabdomyosarcoma can be determined by using the amount or concentration of metabolites in a biological sample of a subject as an index. That is, the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention is characterized in that the amount or concentration of metabolites in a biological sample is related to the presence or possibility of the presence of rhabdomyosarcoma in a subject. In addition, since the detection method of the present invention has an aspect of determining (determining) the presence or possibility of the presence of rhabdomyosarcoma by using the amount or concentration of metabolites in a biological sample of a subject as an index, the detection method of rhabdomyosarcoma of the present invention can also be called a method for determining rhabdomyosarcoma.
本発明において横紋筋肉腫の指標となる代謝物は、
(1) エチルグルクロニド、
(2) チミン、
(3) Ｎ－アセチルノイラミン酸、
(4) ５－メチルシチジンおよび
(5) カルノシン
からなる群から選択される１種または２種以上の物質を少なくとも含むものとすることができる。本明細書において上記(1)～(5)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を「代謝物（ａ）」ということがある。
In the present invention, metabolites that serve as indicators of rhabdomyosarcoma are
(1) Ethyl glucuronide,
(2) Thymine,
(3) N-acetylneuraminic acid,
(4) 5-methylcytidine and
(5) Carnosine. In this specification, one or more substances selected from the group consisting of (1) to (5) above may be referred to as "metabolites (a)".
本発明において横紋筋肉腫の指標となる代謝物はまた、
(6) リン酸フェニル、
(7) ベンゾイルグリシン、
(8) グアニジノ酢酸、
(9) Ｌ－アルギニノコハク酸、
(10) アゼライン酸、
(11) Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンおよび
(12) イミダゾール－４－酢酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質を少なくとも含むものとすることができる。本明細書において上記(6)～(12)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を「代謝物（ｂ）」ということがある。
In the present invention, the metabolites that are indicative of rhabdomyosarcoma are also
(6) phenyl phosphate,
(7) Benzoylglycine,
(8) guanidinoacetic acid,
(9) L-argininosuccinic acid,
(10) azelaic acid,
(11) N-acetyl-L-phenylalanine and
(12) imidazole-4-acetic acid. In this specification, the one or more substances selected from the group consisting of (6) to (12) above may be referred to as "metabolites (b)."
本発明の好ましい態様においては、代謝物（ａ）のすべての物質を横紋筋肉腫の指標とすることができる。本発明の好ましい態様においてはまた、代謝物（ａ）のすべての物質に加えて、代謝物（ｂ）または代謝物（ｂ）のすべての物質を横紋筋肉腫の指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, all of the substances in metabolite (a) can be used as indicators of rhabdomyosarcoma. In a preferred embodiment of the present invention, in addition to all of the substances in metabolite (a), metabolite (b) or all of the substances in metabolite (b) can be used as indicators of rhabdomyosarcoma.
本発明の好ましい態様においてはさらに、代謝物（ａ）のうちいずれか１種（例えば、上記(1)の物質）を横紋筋肉腫の指標とし、残り４種のうち１種、２種、３種または４種を場合により組み合わせて横紋筋肉腫の指標とすることができる。本発明の好ましい態様においてはまた、代謝物（ｂ）のうちいずれか１種（例えば、上記(6)の物質）を横紋筋肉腫の指標とし、残り６種のうち１種、２種、３種、４種、５種または６種を場合により組み合わせて横紋筋肉腫の指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (a) (e.g., the substance (1) above) can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma, and one, two, three, or four of the remaining four can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma in combination, as appropriate. In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (b) (e.g., the substance (6) above) can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma, and one, two, three, four, five, or six of the remaining six can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma in combination, as appropriate.
本発明において横紋筋肉腫の指標となる代謝物はまた、
(21) カルノシン、
(22) アンセリン、
(23) Ｌ－グルタミン酸、
(24) Ｌ－システイン、
(25) １，３－ジアミノプロパン、
(26) タウリン、
(27) イミダゾール酢酸、
(28) α－リノレン酸および
(29) アラキドン酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質を少なくとも含むものとすることができる。本明細書において上記(21)～(29)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を「代謝物（ｃ）」ということがある。
In the present invention, the metabolites that are indicative of rhabdomyosarcoma are also
(21) Carnosine,
(22) anserine,
(23) L-glutamic acid,
(24) L-cysteine,
(25) 1,3-diaminopropane,
(26) Taurine,
(27) Imidazole acetic acid,
(28) α-linolenic acid and
(29) arachidonic acid. In the present specification, the one or more substances selected from the group consisting of (21) to (29) above may be referred to as "metabolites (c)."
本発明の好ましい態様においては、代謝物（ｃ）のうち上記(21)～(24)の物質を横紋筋肉腫の指標とすることができ、あるいは、代謝物（ｃ）のすべての物質を横紋筋肉腫の指標とすることができる。本発明の好ましい態様においてはまた、代謝物（ｃ）のすべての物質に加えて、代謝物（ａ）もしくは代謝物（ａ）のすべての物質、および／または、代謝物（ｂ）もしくは代謝物（ｂ）のすべての物質を横紋筋肉腫の指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, the above substances (21) to (24) among metabolites (c) can be used as indicators of rhabdomyosarcoma, or all substances in metabolites (c) can be used as indicators of rhabdomyosarcoma. In a preferred embodiment of the present invention, in addition to all substances in metabolites (c), metabolites (a) or all substances in metabolites (a), and/or metabolites (b) or all substances in metabolites (b) can be used as indicators of rhabdomyosarcoma.
本発明の好ましい態様においてはさらに、代謝物（ｃ）のうちいずれか１種（例えば、上記(21)の物質）を横紋筋肉腫の指標とし、残り８種のうち１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種を場合により組み合わせて横紋筋肉腫の指標とすることができる。本発明の好ましい態様においてはまた、代謝物（ｃ）のうち上記(21)～(24)の物質のいずれか１種（例えば、上記(21)の物質）を横紋筋肉腫の指標とし、残り３種のうち１種、２種または３種を場合により組み合わせて横紋筋肉腫の指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (c) (e.g., the substance (21) above) can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma, and one, two, three, four, five, six, seven, or eight of the remaining eight can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma in combination, as appropriate. In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (c) (e.g., the substance (21) above) from the substances (21) to (24) above can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma, and one, two, or three of the remaining three can be used as an indicator of rhabdomyosarcoma in combination, as appropriate.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法においては、まず、（Ａ）被験対象の生体試料中における代謝物（ａ）および場合によっては代謝物（ｂ）の量または濃度、あるいは代謝物（ｃ）の量または濃度を測定する工程を実施することができる。代謝物（ａ）、代謝物（ｂ）および代謝物（ｃ）の量および濃度の測定は、生体試料および物質の特性に応じて公知の方法を選択して実施することができる。これら代謝物を測定する場合には、質量分析装置を接続した分析システムにより測定を実施することができる。質量分析装置を接続した分析システムの例としては、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー法（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－タンデムマススペクトロメトリー法（ＬＣ－ＭＳＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー法（ＨＰＬＣ－ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー－タンデムマススペクトロメトリー法（ＨＰＬＣ－ＭＳＭＳ）、キャピラリー電気泳動－マススペクトロメトリー法（ＣＥ－ＭＳ）、キャピラリー電気泳動－タンデムマススペクトロメトリー法（ＣＥ－ＭＳＭＳ）、ガスクロマトグラフィー－マススペクトロメトリー法（ＧＣ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー－タンデムマススペクトロメトリー法（ＧＣ－ＭＳＭＳ）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、質量分析装置としては、後記実施例で使用した飛行時間型（ＴＯＦ－ＭＳ）の他、イオントラップ型、四重極型、磁場型等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, first, a step (A) of measuring the amount or concentration of metabolite (a) and, in some cases, metabolite (b), or the amount or concentration of metabolite (c) in a biological sample from a test subject can be carried out. The amounts and concentrations of metabolite (a), metabolite (b), and metabolite (c) can be measured by selecting a known method according to the characteristics of the biological sample and the substance. When measuring these metabolites, the measurement can be performed by an analysis system connected to a mass spectrometer. Examples of analysis systems connected to a mass spectrometer include, but are not limited to, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MSMS), high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS), high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS), capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS), capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry (CE-MSMS), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MSMS). Mass spectrometers include, but are not limited to, the time-of-flight type (TOF-MS) used in the examples below, as well as ion trap types, quadrupole types, and magnetic field types.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法においては、被験対象の生体試料中における代謝物の測定結果に基づいて横紋筋肉腫を検出することができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫の検出方法においては、（Ｂ）代謝物（ａ）および場合によっては代謝物（ｂ）の量または濃度を指標にして、あるいは代謝物（ｃ）の量または濃度を指標にして、生体試料を採取した被験対象について横紋筋肉腫の存在または横紋筋肉腫の存在可能性を検出または判定する工程を含むことができる。工程（Ｂ）はさらに、被験対象の生体試料中の代謝物（ａ）および場合によっては代謝物（ｂ）の量または濃度、あるいは代謝物（ｃ）の量または濃度をカットオフ値と比較する工程をさらに含んでいてもよい。 In the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, rhabdomyosarcoma can be detected based on the measurement results of metabolites in a biological sample from a subject. That is, the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention can include a step (B) of detecting or determining the presence or possibility of rhabdomyosarcoma in a subject from whom a biological sample has been collected, using the amount or concentration of metabolite (a) and, if necessary, metabolite (b) as an indicator, or the amount or concentration of metabolite (c) as an indicator. Step (B) may further include a step of comparing the amount or concentration of metabolite (a) and, if necessary, metabolite (b), or the amount or concentration of metabolite (c) in the biological sample from the subject with a cutoff value.
代謝物（ａ）のうち上記(1)～(4)の物質を指標とする場合、代謝物の量または濃度がカットオフ値より高いことが、前記対象における横紋筋肉腫の存在または横紋筋肉腫の存在可能性を示す。 When the metabolites (a) selected from the substances (1) to (4) above are used as indicators, an amount or concentration of the metabolite higher than the cutoff value indicates the presence or possible presence of rhabdomyosarcoma in the subject.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法において、指標となる代謝物が上記(1)～(4)の物質の場合、工程（Ｂ）は、（Ｂ－ａ－１）被験対象の生体試料中の上記代謝物の量または濃度とあらかじめ定めたカットオフ値とを比較する工程と、（Ｂ－ａ－２）被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以上であるか、またはカットオフ値よりも高い場合に被験対象に横紋筋肉腫が存在するか、または横紋筋肉腫が存在する可能性があると判定する工程とにより実施することができる。 In the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, when the indicative metabolite is any of the substances (1) to (4) above, step (B) can be carried out by (B-a-1) comparing the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject with a predetermined cutoff value, and (B-a-2) determining that the subject has rhabdomyosarcoma or may have rhabdomyosarcoma if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or greater than the cutoff value or is higher than the cutoff value.
指標となる代謝物が上記(1)～(4)の物質の場合においては、工程（Ｂ－ａ－２）では、被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以下であるか、またはカットオフ値よりも低い場合に被験対象に横紋筋肉腫が存在しないか、または横紋筋肉腫が存在する可能性が低いと判定することもできる。 In the case where the indicator metabolite is any of the substances (1) to (4) above, in step (B-a-2), if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or less than the cutoff value, it can be determined that the subject does not have rhabdomyosarcoma or that the possibility of the presence of rhabdomyosarcoma is low.
代謝物（ａ）および（ｂ）のうち上記(5)～(12)の物質を指標とする場合、代謝物の量または濃度がカットオフ値より低いことが、前記対象における横紋筋肉腫の存在または横紋筋肉腫の存在可能性を示す。 When the metabolites (a) and (b) listed in (5) to (12) above are used as indicators, the amount or concentration of the metabolite being lower than the cutoff value indicates the presence or possible presence of rhabdomyosarcoma in the subject.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法において、指標となる代謝物が上記(5)～(12)の物質の場合、工程（Ｂ）は、（Ｂ－ｂ－１）被験対象の生体試料中の上記代謝物の量または濃度とあらかじめ定めたカットオフ値とを比較する工程と、（Ｂ－ｂ－２）被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以下であるか、またはカットオフ値よりも低い場合に被験対象に横紋筋肉腫が存在するか、または横紋筋肉腫が存在する可能性があると判定する工程とにより実施することができる。 In the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, when the indicative metabolite is any of the substances (5) to (12) above, step (B) can be carried out by (B-b-1) comparing the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject with a predetermined cutoff value, and (B-b-2) determining that the subject has rhabdomyosarcoma or may have rhabdomyosarcoma if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or less than the cutoff value or is lower than the cutoff value.
指標となる代謝物が上記(5)～(12)の物質の場合においては、工程（Ｂ－ｂ－２）では、被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以上であるか、またはカットオフ値よりも高い場合に被験対象に横紋筋肉腫が存在しないか、または横紋筋肉腫が存在する可能性が低いと判定することもできる。 In the case where the indicator metabolite is any of the substances (5) to (12) above, in step (B-b-2), if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or greater than the cutoff value, it can be determined that the subject does not have rhabdomyosarcoma or is unlikely to have rhabdomyosarcoma when the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or greater than the cutoff value.
代謝物（ｃ）を指標とする場合、代謝物の量または濃度がカットオフ値より高いことが、前記対象における横紋筋肉腫の存在または横紋筋肉腫の存在可能性を示す。 When metabolite (c) is used as an indicator, an amount or concentration of the metabolite higher than the cutoff value indicates the presence of rhabdomyosarcoma or the possibility of the presence of rhabdomyosarcoma in the subject.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法において、指標となる代謝物が上記(21)～(29)の物質の場合、工程（Ｂ）は、（Ｂ－ｃ－１）被験対象の生体試料中の上記代謝物の量または濃度とあらかじめ定めたカットオフ値とを比較する工程と、（Ｂ－ｃ－２）被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以上であるか、またはカットオフ値よりも高い場合に被験対象に横紋筋肉腫が存在するか、または横紋筋肉腫が存在する可能性があると判定する工程とにより実施することができる。 In the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, when the indicative metabolite is any of the substances (21) to (29) above, step (B) can be carried out by (B-c-1) comparing the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject with a predetermined cutoff value, and (B-c-2) determining that the subject has rhabdomyosarcoma or may have rhabdomyosarcoma if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or greater than the cutoff value or is higher than the cutoff value.
指標となる代謝物が上記(21)～(29)の物質の場合においては、工程（Ｂ－ｃ－２）では、被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以下であるか、またはカットオフ値よりも低い場合に被験対象に横紋筋肉腫が存在しないか、または横紋筋肉腫が存在する可能性が低いと判定することもできる。 In the case where the indicator metabolite is any of the substances (21) to (29) above, in step (B-c-2), if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or less than the cutoff value, it can be determined that the subject does not have rhabdomyosarcoma or that the possibility of the presence of rhabdomyosarcoma is low.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法において２種以上の代謝物を組み合わせて検出を行うと、単独で検出を行った場合と比較して、より正確に横紋筋肉腫の存在を検出することができる。本発明の横紋筋肉腫の検出方法において２種以上の本発明の代謝物を組み合わせて検出を行う場合には、工程（Ａ）および工程（Ｂ）をそれぞれの代謝物について実施することができる。この場合、それぞれの代謝物に基づいて示された判定結果を組み合わせて横紋筋肉腫の存否を判定することができる。例えば、２種類の本発明の代謝物の両方について横紋筋肉腫の存在が示された場合（あるいは横紋筋肉腫の存在可能性が示された場合）には、それぞれの代謝物単独での結果よりも横紋筋肉腫の存在が強く示唆され、２種類の本発明の代謝物の両方について横紋筋肉腫の存在が否定された場合（あるいは横紋筋肉腫の存在可能性が低いことが示された場合）には、それぞれの代謝物単独での結果よりも横紋筋肉腫の存在が強く否定される。 In the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, when two or more metabolites are combined for detection, the presence of rhabdomyosarcoma can be detected more accurately than when they are detected individually. When two or more metabolites of the present invention are combined for detection in the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, steps (A) and (B) can be performed for each metabolite. In this case, the presence or absence of rhabdomyosarcoma can be determined by combining the results of the determination based on each metabolite. For example, when the presence of rhabdomyosarcoma is indicated for both of the two metabolites of the present invention (or when the possibility of the presence of rhabdomyosarcoma is indicated), the presence of rhabdomyosarcoma is more strongly suggested than the results of each metabolite alone, and when the presence of rhabdomyosarcoma is denied for both of the two metabolites of the present invention (or when the possibility of the presence of rhabdomyosarcoma is indicated), the presence of rhabdomyosarcoma is more strongly denied than the results of each metabolite alone.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法において２種以上の代謝物を組み合わせて検出を行う場合には、後述のように、複数種の代謝物の量または濃度の測定値の合計値、平均値、比率等を用いて一つの値（結合指標値）を算出することができ、あるいは、複数種の代謝物の量または濃度のそれぞれの測定値に重み付けをした上で合計値、平均値、比率等を一つの値（結合指標値）として算出することもできる。 When two or more types of metabolites are combined and detected in the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention, as described below, a single value (binding index value) can be calculated using the sum, average, ratio, etc. of the measured values of the amount or concentration of the multiple types of metabolites, or the measured values of the amount or concentration of the multiple types of metabolites can be weighted and then the sum, average, ratio, etc. can be calculated as a single value (binding index value).
本発明において横紋筋肉腫の検出に用いるカットオフ値は、横紋筋肉腫に罹患していない対象（正常対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値から算出し、決定することができる。このような対象は、治療中の疾患がない健常者が好ましいが、横紋筋肉腫以外の疾患を有する対象であってもよい。本発明においてカットオフ値はまた、横紋筋肉腫に罹患した対象（罹患対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値から算出し、決定することができる。上記のカットオフ値の決定方法においては、正常対象群または罹患対象群の測定値の平均値、中央値、パーセンタイル値、最大値または最小値を使用することができる。パーセンタイル値は任意の値を選択することができ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５とすることができる。カットオフ値を算出する際の正常対象および罹患対象の例数は複数例が好ましく、例えば、２例以上、５例以上、１０例以上、２０例以上または５０例以上とすることができる。 In the present invention, the cutoff value used for detecting rhabdomyosarcoma can be calculated and determined from the measured value of the amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject (normal subject) who is not affected by rhabdomyosarcoma. Such a subject is preferably a healthy person who is not undergoing treatment for a disease, but may be a subject with a disease other than rhabdomyosarcoma. In the present invention, the cutoff value can also be calculated and determined from the measured value of the amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject (affected subject) who is affected by rhabdomyosarcoma. In the above method for determining the cutoff value, the average value, median value, percentile value, maximum value, or minimum value of the measured values of a normal subject group or an affected subject group can be used. The percentile value can be any value, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, or 95. When calculating the cutoff value, the number of normal and diseased subjects is preferably multiple, and can be, for example, 2 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, or 50 or more.
本発明において横紋筋肉腫の検出に用いるカットオフ値はまた、横紋筋肉腫に罹患していない対象（正常対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値と、横紋筋肉腫に罹患した対象（罹患対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値に基づいて算出することもできる。例えば、罹患対象群と、正常対象群について、生体試料における本発明の代謝物の量または濃度を測定し、得られた測定値を用いてＲＯＣ解析等の統計解析を行うことによりカットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ曲線の作成とＲＯＣ曲線に基づくカットオフ値の設定は周知であり、感度や特異度の観点から当業者がカットオフ値を設定することができる。 The cutoff value used in the present invention for detecting rhabdomyosarcoma can also be calculated based on the measured amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject not affected with rhabdomyosarcoma (normal subject) and the measured amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject affected with rhabdomyosarcoma (diseased subject). For example, the amount or concentration of the metabolite of the present invention in biological samples from a group of diseased subjects and a group of normal subjects can be measured, and the cutoff value can be set by performing a statistical analysis such as ROC analysis using the obtained measured values. The creation of ROC curves and the setting of cutoff values based on ROC curves are well known, and a person skilled in the art can set the cutoff value from the viewpoint of sensitivity and specificity.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法の工程（Ｂ）においては、例えば、被験対象の生体試料中における前記(1)～(4)の各物質の量または濃度、あるいは被験対象の生体試料中における前記(21)～(29)の各物質の量または濃度が正常対象群の当該代謝物の量または濃度の平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．１倍以上、約２．２倍以上、約２．３倍以上、約２．４倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象に横紋筋肉腫が存在する（あるいは横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定することができる。 In step (B) of the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, for example, if the amount or concentration of each of the substances (1) to (4) in the biological sample of the subject, or the amount or concentration of each of the substances (21) to (29) in the biological sample of the subject, is higher than the average amount or concentration of the corresponding metabolite in a normal subject group, or is about 1.1 times or more, about 1.2 times or more, about 1.3 times or more, about 1.4 times or more, about 1.5 times or more, about 1.6 times or more, about 1.7 times or more, about 1.8 times or more, about 1.9 times or more, about 2.0 times or more, about 2.1 times or more, about 2.2 times or more, about 2.3 times or more, about 2.4 times or more, about 2.5 times or more, or about 3 times or more, compared to the average amount or concentration, it can be determined that the subject has rhabdomyosarcoma (or may have rhabdomyosarcoma).
本発明の検出方法の工程（Ｂ）においてはまた、例えば、被験対象の生体試料中における前記(5)～(12)の各物質の量または濃度が正常対象群の当該代謝物の量または濃度の平均値よりも低いか、あるいは該平均値と比較して約０．９倍以下、約０．８５倍以下、約０．８倍以下、約０．７５倍以下、約０．７倍以下、約０．６５倍以下、約０．６倍以下、約０．５５倍以下、約０．５倍以下、約０．４５倍以下、約０．４倍以下または約０．３５倍以下である場合に、被験対象に横紋筋肉腫が存在する（あるいは横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定することができる。 In step (B) of the detection method of the present invention, it can also be determined that the subject has rhabdomyosarcoma (or may have rhabdomyosarcoma) if the amount or concentration of each of the substances (5) to (12) in the subject's biological sample is lower than the average amount or concentration of the corresponding metabolite in a normal subject group, or is about 0.9 times or less, about 0.85 times or less, about 0.8 times or less, about 0.75 times or less, about 0.7 times or less, about 0.65 times or less, about 0.6 times or less, about 0.55 times or less, about 0.5 times or less, about 0.45 times or less, about 0.4 times or less, or about 0.35 times or less compared to the average amount or concentration.
本発明においては、本発明の代謝物のうち複数種を組み合わせて使用することにより検出精度を向上させることができる。ここで検出精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。 In the present invention, the detection accuracy can be improved by using a combination of multiple types of metabolites of the present invention. Here, improved detection accuracy means that, when ROC analysis is used, the area under the curve (AUC) of the ROC curve is improved.
本発明において本発明の代謝物を複数種組み合わせて指標とする場合には、指標となる複数種の代謝物の量または濃度の測定値に対して一つのカットオフ値を設定することもできる。例えば、複数種の代謝物の量または濃度の測定値の合計値、平均値、比率等を用いてカットオフ値を算出することができ、あるいは、複数種の代謝物の量または濃度のそれぞれの測定値に重み付けをした上で合計値、平均値、比率等を算出し、該算出値を用いてカットオフ値を算出することができる。このようにして算出されたカットオフ値を本発明に用いる場合には、カットオフ値の算出方法と同じ方法で被験対象の生体試料中の複数種の代謝物の量または濃度の測定値を処理し、得られた一つの数値（結合指標値）をあらかじめ定めたカットオフ値とを比較することで判定を行うことができる。 In the present invention, when a combination of multiple metabolites of the present invention is used as an index, a cutoff value can be set for the measured amount or concentration of the multiple metabolites that serve as an index. For example, the cutoff value can be calculated using the sum, average, ratio, etc. of the measured amount or concentration of the multiple metabolites, or the measured amount or concentration of the multiple metabolites can be weighted and the sum, average, ratio, etc. can be calculated, and the cutoff value can be calculated using the calculated value. When the cutoff value calculated in this way is used in the present invention, the measured amount or concentration of the multiple metabolites in the biological sample of the subject can be processed in the same manner as the cutoff value calculation method, and the obtained numerical value (binding index value) can be compared with a predetermined cutoff value to make a judgment.
複数種の代謝物の量または濃度のそれぞれの測定値に重み付けをした上で合計値、平均値、比率等を算出する方法は公知であり、線形判別分析（linear discriminant analysis）に従って各代謝物に対する係数を算出することができる。線形判別分析を行う数値解析ソフトウエアは当業界において入手可能である。 Methods for calculating totals, averages, ratios, etc., after weighting the measured values of the amounts or concentrations of multiple metabolites are known, and coefficients for each metabolite can be calculated according to linear discriminant analysis. Numerical analysis software for performing linear discriminant analysis is available in the industry.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法によれば、被験対象について横紋筋肉腫の存在を検出することができる。従って、本発明の横紋筋肉腫の検出方法は、横紋筋肉腫の診断に補助的に用いることができ、被験対象が横紋筋肉腫に罹患しているか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。例えば、本発明の横紋筋肉腫の検出方法により横紋筋肉腫が存在する（あるいは横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定された被験対象については、医師が他の所見を参照しつつ被験対象が横紋筋肉腫に罹患しているかを判断することができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫の検出方法は横紋筋肉腫の診断を補助する方法あるいは横紋筋肉腫の診断を支援する方法と言い換えることができる。なお、本発明の横紋筋肉腫の検出方法は、外科手術により採取した組織を病理診断せずに横紋筋肉腫の存在を判定できる点でも有利である。 According to the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention, the presence of rhabdomyosarcoma in a subject can be detected. Therefore, the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention can be used as an auxiliary in the diagnosis of rhabdomyosarcoma, and the doctor can ultimately determine whether or not a subject has rhabdomyosarcoma, possibly in combination with other findings. For example, for a subject determined to have rhabdomyosarcoma (or possible presence of rhabdomyosarcoma) by the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention, a doctor can determine whether or not the subject has rhabdomyosarcoma while referring to other findings. In other words, the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention can be rephrased as a method for assisting in the diagnosis of rhabdomyosarcoma or a method for supporting the diagnosis of rhabdomyosarcoma. The rhabdomyosarcoma detection method of the present invention is also advantageous in that it can determine the presence of rhabdomyosarcoma without pathological diagnosis of tissue collected by surgery.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法によれば、被験対象から採取された生体試料を分析し、定量的に横紋筋肉腫の検出または評価を行うことができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫の検出方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確に横紋筋肉腫を検出または評価できる点で有利である。このため本発明の横紋筋肉腫の検出方法は、横紋筋肉腫を検出または評価するための生体試料分析方法（好ましくは尿試料分析方法）と言い換えることができる。 According to the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention, a biological sample collected from a subject can be analyzed to quantitatively detect or evaluate rhabdomyosarcoma. In other words, the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention is advantageous in that it can detect or evaluate rhabdomyosarcoma simply and accurately while reducing the burden on the patient. For this reason, the rhabdomyosarcoma detection method of the present invention can be rephrased as a biological sample analysis method (preferably a urine sample analysis method) for detecting or evaluating rhabdomyosarcoma.
本発明の横紋筋肉腫の検出方法によれば、横紋筋肉腫の患者を特定することができる。このため、本発明の別の側面によれば、横紋筋肉腫の治療方法が提供される。本発明の横紋筋肉腫の治療方法は、本発明の横紋筋肉腫の検出方法を実施し、横紋筋肉腫の存在が示された対象（あるいは横紋筋肉腫の存在可能性が示された対象）を選択する工程を含んでいてもよい。この工程は、被験対象から被験試料を得ること、該試料中の代謝物の量または濃度を測定すること、および／または、該試料中の代謝物の量または濃度をカットオフ値と比較することを含んでいてもよい。本発明の横紋筋肉腫の治療方法はまた、選択された対象に対して横紋筋肉腫の治療を行う工程を含んでいてもよい。横紋筋肉腫の治療としては、外科療法、化学療法、放射線療法、免疫療法等の療法が挙げられ、緩和ケア等の緩和療法も含まれる。 According to the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention, a patient with rhabdomyosarcoma can be identified. Therefore, according to another aspect of the present invention, a method for treating rhabdomyosarcoma is provided. The method for treating rhabdomyosarcoma of the present invention may include a step of performing the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention and selecting a subject in which the presence of rhabdomyosarcoma (or the possibility of the presence of rhabdomyosarcoma) has been indicated. This step may include obtaining a test sample from the subject, measuring the amount or concentration of a metabolite in the sample, and/or comparing the amount or concentration of a metabolite in the sample with a cutoff value. The method for treating rhabdomyosarcoma of the present invention may also include a step of treating the selected subject for rhabdomyosarcoma. Treatments for rhabdomyosarcoma include therapies such as surgical therapy, chemotherapy, radiation therapy, and immunotherapy, and also include palliative care and other palliative therapies.
＜＜横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法＞＞
本発明によれば、横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法が提供される。本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法によれば、被験対象の生体試料中の代謝物の量または濃度を指標にして横紋筋肉腫のサブタイプを判定することができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法は、生体試料中の代謝物の量または濃度を被験対象における横紋筋肉腫のサブタイプと関連づけることを特徴とする。なお、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法においては被験対象の生体試料中の代謝物の量または濃度を指標にして横紋筋肉腫のサブタイプを判定（決定）するという側面をもつため、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法は横紋筋肉腫のサブタイプの判定方法と言い換えることもできる。
<<Method for detecting rhabdomyosarcoma subtypes>>
According to the present invention, a method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma is provided. According to the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, the subtype of rhabdomyosarcoma can be determined by using the amount or concentration of a metabolite in a biological sample of a test subject as an index. That is, the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention is characterized in that the amount or concentration of a metabolite in a biological sample is associated with the subtype of rhabdomyosarcoma in the test subject. In addition, since the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention has an aspect of determining (determining) the subtype of rhabdomyosarcoma by using the amount or concentration of a metabolite in a biological sample of a test subject as an index, the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention can also be said to be a method for determining the subtype of rhabdomyosarcoma.
本発明において横紋筋肉腫のサブタイプの指標となる代謝物は、
(101) Ｌ－フェニルアラニン、
(102) ホモシトルリン、
(103) ＧＤＰグルコース、
(104) Ｌ－ヒスチジン、
(105) Ｎ，Ｎ－ジメチルアルギニン、
(106) Ｎ２－アセチル－Ｌ－リジンおよび
(107) チミジン一リン酸（dTMP）
からなる群から選択される１種または２種以上の物質を少なくとも含むものとすることができる。本明細書において上記(101)～(107)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を「代謝物（ｄ）」ということがある。
In the present invention, metabolites that serve as indicators of rhabdomyosarcoma subtypes are:
(101) L-phenylalanine,
(102) Homocitrulline,
(103) GDP glucose,
(104) L-histidine,
(105) N,N-dimethylarginine,
(106) N2-acetyl-L-lysine and
(107) Thymidine monophosphate (dTMP)
In the present specification, one or more substances selected from the group consisting of (101) to (107) above may be referred to as "metabolites (d)".
本発明において横紋筋肉腫のサブタイプの指標となる代謝物はまた、
(108) Ｌ－２－アミノアジピン酸、
(109) βアミノイソ酪酸、
(110) １－メチルヒスチジン、
(111) α－Ｄ－グルコース６－リン酸、
(112) Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、
(113) グアニジノ酢酸および
(114) １６－エピエストリオール
からなる群から選択される１種または２種以上の物質を少なくとも含むものとすることができる。本明細書において上記(108)～(114)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を「代謝物（ｅ）」ということがある。
In the present invention, the metabolites that are indicative of the subtype of rhabdomyosarcoma are also
(108) L-2-aminoadipic acid,
(109) β-aminoisobutyric acid,
(110) 1-methylhistidine,
(111) α-D-glucose 6-phosphate,
(112) N,N-dimethylglycine,
(113) Guanidinoacetic acid and
(114) 16-epiestriol. In the present specification, one or more substances selected from the group consisting of (108) to (114) above may be referred to as "metabolites (e)".
本発明の好ましい態様においては、代謝物（ｄ）のすべての物質を横紋筋肉腫のサブタイプの指標とすることができる。本発明の好ましい態様においてはまた、代謝物（ｄ）のすべての物質に加えて、代謝物（ｅ）または代謝物（ｅ）のすべての物質を横紋筋肉腫のサブタイプの指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, all of the substances in metabolite (d) can be used as indicators of the subtype of rhabdomyosarcoma. In a preferred embodiment of the present invention, in addition to all of the substances in metabolite (d), metabolite (e) or all of the substances in metabolite (e) can be used as indicators of the subtype of rhabdomyosarcoma.
本発明の好ましい態様においてはさらに、代謝物（ｄ）のうちいずれか１種（例えば、上記(101)の物質）を横紋筋肉腫のサブタイプの指標とし、残り６種のうち１種、２種、３種、４種、５種または６種を場合により組み合わせて横紋筋肉腫のサブタイプの指標とすることができる。本発明の好ましい態様においてはまた、代謝物（ｅ）のうちいずれか１種（例えば、上記(108)の物質）を横紋筋肉腫のサブタイプの指標とし、残り６種のうち１種、２種、３種、４種、５種または６種を場合により組み合わせて横紋筋肉腫のサブタイプの指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (d) (e.g., the substance in (101) above) can be used as an indicator of the subtype of rhabdomyosarcoma, and one, two, three, four, five, or six of the remaining six can be used as an indicator of the subtype of rhabdomyosarcoma in combination as appropriate. In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (e) (e.g., the substance in (108) above) can be used as an indicator of the subtype of rhabdomyosarcoma, and one, two, three, four, five, or six of the remaining six can be used as an indicator of the subtype of rhabdomyosarcoma in combination as appropriate.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法においては、まず、（Ｃ）被験対象の生体試料中における代謝物（ｄ）および場合によっては代謝物（ｅ）の量または濃度を測定する工程を実施することができる。代謝物（ｄ）および代謝物（ｅ）の量および濃度の測定は、生体試料および物質の特性に応じて公知の方法を選択して実施することができる。これら代謝物の測定装置は本発明の横紋筋肉腫の検出方法において記載のものを使用することができる。 In the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, first, a step (C) of measuring the amount or concentration of metabolite (d) and, in some cases, metabolite (e) in a biological sample from a test subject can be carried out. The amount and concentration of metabolite (d) and metabolite (e) can be measured by selecting a known method according to the characteristics of the biological sample and the substance. The device for measuring these metabolites can be the one described in the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法においては、被験対象の生体試料中における代謝物の測定結果に基づいて横紋筋肉腫のサブタイプを検出することができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法においては、（Ｄ）代謝物（ｄ）および場合によっては代謝物（ｅ）の量または濃度を指標にして、生体試料を採取した被験対象について横紋筋肉腫のサブタイプを検出または判定する工程を含むことができる。工程（Ｄ）はさらに、被験対象の生体試料中の代謝物（ｄ）および場合によっては代謝物（ｅ）の量または濃度をカットオフ値と比較する工程をさらに含んでいてもよい。 In the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, the subtype of rhabdomyosarcoma can be detected based on the measurement results of metabolites in a biological sample from a subject. That is, the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention can include a step (D) of detecting or determining the subtype of rhabdomyosarcoma for a subject from whom a biological sample has been collected, using the amount or concentration of metabolite (d) and, if necessary, metabolite (e) as an indicator. Step (D) may further include a step of comparing the amount or concentration of metabolite (d) and, if necessary, metabolite (e) in the biological sample from the subject with a cutoff value.
代謝物（ｄ）および（ｅ）のうち上記(101)、(102)および(104)～(114)の物質を指標とする場合、代謝物の量または濃度がカットオフ値より高いことが、前記対象における胞巣型の横紋筋肉腫の存在または胞巣型の横紋筋肉腫の存在可能性を示す。 When the metabolites (d) and (e) listed above as (101), (102), and (104) to (114) are used as indicators, an amount or concentration of the metabolite higher than the cutoff value indicates the presence of alveolar rhabdomyosarcoma or the possibility of the presence of alveolar rhabdomyosarcoma in the subject.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法において、指標となる代謝物が上記(101)、(102)および(104)～(114)の物質の場合、工程（Ｄ）は、（Ｄ－ａ－１）被験対象の生体試料中の上記代謝物の量または濃度とあらかじめ定めたカットオフ値とを比較する工程と、（Ｄ－ａ－２）被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以上であるか、またはカットオフ値よりも高い場合に被験対象における横紋筋肉腫が胞巣型であるか、または胞巣型である可能性があると判定する工程とにより実施することができる。 In the method of detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, when the indicative metabolite is any of the substances (101), (102), and (104) to (114) above, step (D) can be carried out by (D-a-1) comparing the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject with a predetermined cutoff value, and (D-a-2) determining that the rhabdomyosarcoma in the subject is of the alveolar type or may be of the alveolar type if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or greater than the cutoff value or is higher than the cutoff value.
指標となる代謝物が上記(101)、(102)および(104)～(114)の物質の場合においては、工程（Ｄ－ａ－２）では、被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以下であるか、またはカットオフ値よりも低い場合に被験対象における横紋筋肉腫が胞巣型ではないか、または胞巣型である可能性が低いと判定することもできる。 In the case where the indicative metabolite is any of the substances (101), (102), and (104) to (114) above, in step (D-a-2), if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or less than the cutoff value, it can be determined that the rhabdomyosarcoma in the subject is not of the alveolar type, or is unlikely to be of the alveolar type.
代謝物（ｄ）のうち上記(103)の物質を指標とする場合、代謝物の量または濃度がカットオフ値より低いことが、前記対象における胞巣型の横紋筋肉腫の存在または胞巣型の横紋筋肉腫の存在可能性を示す。 When the substance (103) among metabolites (d) is used as an indicator, the amount or concentration of the metabolite being lower than the cutoff value indicates the presence of alveolar rhabdomyosarcoma or the possibility of the presence of alveolar rhabdomyosarcoma in the subject.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法において、指標となる代謝物が上記(103)の物質の場合、工程（Ｄ）は、（Ｄ－ｂ－１）被験対象の生体試料中の上記代謝物の量または濃度とあらかじめ定めたカットオフ値とを比較する工程と、（Ｄ－ｂ－２）被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以下であるか、またはカットオフ値よりも低い場合に被験対象における横紋筋肉腫が胞巣型であるか、または胞巣型である可能性があると判定する工程とにより実施することができる。 In the method of detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, when the indicative metabolite is the substance (103) above, step (D) can be carried out by (D-b-1) comparing the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject with a predetermined cutoff value, and (D-b-2) determining that the rhabdomyosarcoma in the subject is or may be of the alveolar type when the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or less than the cutoff value or is lower than the cutoff value.
指標となる代謝物が上記(103)の物質の場合においては、工程（Ｄ－ｂ－２）では、被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以上であるか、またはカットオフ値よりも高い場合に被験対象における横紋筋肉腫が胞巣型ではないか、または胞巣型である可能性が低いと判定することもできる。 When the indicator metabolite is the substance (103) above, in step (D-b-2), if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or greater than the cutoff value, it can be determined that the rhabdomyosarcoma in the subject is not of the alveolar type, or is unlikely to be of the alveolar type.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法において２種以上の代謝物を組み合わせて検出を行うと、単独で検出を行った場合と比較して、より正確に横紋筋肉腫のサブタイプを検出することができる。本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法において２種以上の本発明の代謝物を組み合わせて検出を行う場合には、工程（Ｃ）および工程（Ｄ）をそれぞれの代謝物について実施することができる。この場合、それぞれの代謝物に基づいて示された判定結果を組み合わせて横紋筋肉腫のサブタイプを判定することができる。例えば、２種類の本発明の代謝物の両方について胞巣型の横紋筋肉腫の存在が示された場合（あるいは胞巣型の横紋筋肉腫の存在可能性が示された場合）には、それぞれの代謝物単独での結果よりも胞巣型の横紋筋肉腫の存在が強く示唆され、２種類の本発明の代謝物の両方について胞巣型の横紋筋肉腫の存在が否定された場合（あるいは胞巣型の横紋筋肉腫の存在可能性が低いことが示された場合）には、それぞれの代謝物単独での結果よりも胞巣型の横紋筋肉腫の存在が強く否定される。 In the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, when two or more metabolites are combined for detection, the subtype of rhabdomyosarcoma can be detected more accurately than when they are detected individually. When two or more metabolites of the present invention are combined for detection in the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, steps (C) and (D) can be performed for each metabolite. In this case, the subtype of rhabdomyosarcoma can be determined by combining the determination results shown based on each metabolite. For example, when the presence of alveolar rhabdomyosarcoma is indicated for both of the two metabolites of the present invention (or when the possibility of the presence of alveolar rhabdomyosarcoma is indicated), the presence of alveolar rhabdomyosarcoma is more strongly suggested than the results of each metabolite alone, and when the presence of alveolar rhabdomyosarcoma is denied for both of the two metabolites of the present invention (or when the possibility of the presence of alveolar rhabdomyosarcoma is indicated), the presence of alveolar rhabdomyosarcoma is more strongly denied than the results of each metabolite alone.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法において２種以上の代謝物を組み合わせて検出を行う場合には、後述のように、複数種の代謝物の量または濃度の測定値の合計値、平均値、比率等を用いて一つの値（結合指標値）を算出することができ、あるいは、複数種の代謝物の量または濃度のそれぞれの測定値に重み付けをした上で合計値、平均値、比率等を一つの値（結合指標値）として算出することもできる。 When two or more types of metabolites are combined for detection in the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, as described below, a single value (binding index value) can be calculated using the sum, average, ratio, etc. of the measured values of the amount or concentration of the multiple types of metabolites, or the measured values of the amount or concentration of the multiple types of metabolites can be weighted and then the sum, average, ratio, etc. can be calculated as a single value (binding index value).
本発明において横紋筋肉腫のサブタイプの検出に用いるカットオフ値は、胎児型の横紋筋肉腫に罹患した対象（胎児型罹患対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値から算出し、決定することができる。本発明においてカットオフ値はまた、胞巣型の横紋筋肉腫に罹患した対象（胞巣型罹患対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値から算出し、決定することもできる。上記のカットオフ値の決定方法においては、胎児型罹患対象群または胞巣型罹患対象群の測定値の平均値、中央値、パーセンタイル値、最大値または最小値を使用することができる。パーセンタイル値は任意の値を選択することができ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５とすることができる。カットオフ値を算出する際の胎児型罹患対象および胞巣型罹患対象の例数は複数例が好ましく、例えば、２例以上、５例以上、１０例以上、２０例以上または５０例以上とすることができる。 In the present invention, the cutoff value used for detecting the subtype of rhabdomyosarcoma can be calculated and determined from the measured value of the amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject suffering from embryonic rhabdomyosarcoma (fetal-type affected subject). In the present invention, the cutoff value can also be calculated and determined from the measured value of the amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject suffering from alveolar rhabdomyosarcoma (alveolar-type affected subject). In the above-mentioned method for determining the cutoff value, the average value, median value, percentile value, maximum value or minimum value of the measured values of the fetal-type affected subject group or the alveolar-type affected subject group can be used. The percentile value can be any value, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 or 95. When calculating the cutoff value, the number of subjects with fetal type and alveolar type disease is preferably multiple, and can be, for example, 2 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, or 50 or more.
本発明において横紋筋肉腫のサブタイプの検出に用いるカットオフ値はまた、胎児型横紋筋肉腫に罹患した対象（胎児型罹患対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値と、胞巣型横紋筋肉腫に罹患した対象（胞巣型罹患対象）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値に基づいて算出することもできる。例えば、胞巣型罹患対象群と、胎児型罹患対象群について、生体試料における本発明の代謝物の量または濃度を測定し、得られた測定値を用いてＲＯＣ解析等の統計解析を行うことによりカットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ曲線の作成とＲＯＣ曲線に基づくカットオフ値の設定は周知であり、感度や特異度の観点から当業者がカットオフ値を設定することができる。 The cutoff value used in the present invention for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma can also be calculated based on the measured value of the amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject with embryonal rhabdomyosarcoma (fetal-type affected subject) and the measured value of the amount or concentration of the metabolite of the present invention in a sample from a subject with alveolar rhabdomyosarcoma (alveolar-type affected subject). For example, the amount or concentration of the metabolite of the present invention in biological samples from a group of subjects with alveolar rhabdomyosarcoma and a group of subjects with embryonal rhabdomyosarcoma can be measured, and the cutoff value can be set by performing a statistical analysis such as ROC analysis using the obtained measured values. The creation of an ROC curve and the setting of a cutoff value based on an ROC curve are well known, and a person skilled in the art can set the cutoff value from the viewpoint of sensitivity and specificity.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法の工程（Ｄ）においては、例えば、被験対象の生体試料中における前記(101)、(102)および(104)～(114)の物質の量または濃度が胎児型罹患対象群の当該代謝物の量または濃度の平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．１倍以上、約２．２倍以上、約２．３倍以上、約２．４倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象に胞巣型の横紋筋肉腫が存在する（あるいは胞巣型の横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定することができる。 In step (D) of the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, for example, if the amount or concentration of the substances (101), (102), and (104) to (114) in the biological sample of the subject is higher than the average amount or concentration of the metabolites in the fetal-type disease subject group, or is about 1.1 times or more, about 1.2 times or more, about 1.3 times or more, about 1.4 times or more, about 1.5 times or more, about 1.6 times or more, about 1.7 times or more, about 1.8 times or more, about 1.9 times or more, about 2.0 times or more, about 2.1 times or more, about 2.2 times or more, about 2.3 times or more, about 2.4 times or more, about 2.5 times or more, or about 3 times or more, compared to the average amount or concentration, it can be determined that the subject has alveolar rhabdomyosarcoma (or may have alveolar rhabdomyosarcoma).
本発明の検出方法の工程（Ｄ）においてはまた、例えば、被験対象の生体試料中における前記(103)の物質の量または濃度が胎児型罹患対象群の当該代謝物の量または濃度の平均値よりも低いか、あるいは該平均値と比較して約０．９倍以下、約０．８５倍以下、約０．８倍以下、約０．７５倍以下、約０．７倍以下、約０．６５倍以下、約０．６倍以下、約０．５５倍以下、約０．５倍以下、約０．４５倍以下、約０．４倍以下または約０．３５倍以下である場合に、被験対象に胞巣型の横紋筋肉腫が存在する（あるいは胞巣型の横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定することができる。 In step (D) of the detection method of the present invention, it can also be determined that the subject has alveolar rhabdomyosarcoma (or may have alveolar rhabdomyosarcoma) if the amount or concentration of the substance (103) in the biological sample of the subject is lower than the average amount or concentration of the metabolite in the fetal disease subject group, or is about 0.9 times or less, about 0.85 times or less, about 0.8 times or less, about 0.75 times or less, about 0.7 times or less, about 0.65 times or less, about 0.6 times or less, about 0.55 times or less, about 0.5 times or less, about 0.45 times or less, about 0.4 times or less, or about 0.35 times or less compared to the average amount or concentration.
本発明においては、本発明の代謝物のうち複数種を組み合わせて使用することにより検出精度を向上させることができる。ここで検出精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。 In the present invention, the detection accuracy can be improved by using a combination of multiple types of metabolites of the present invention. Here, improved detection accuracy means that, when ROC analysis is used, the area under the curve (AUC) of the ROC curve is improved.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法において、本発明の代謝物を複数種組み合わせて指標とする場合には、本発明の横紋筋肉腫の検出方法において記載した内容に従ってカットオフ値および測定値（結合指標値）を算出することができる。 In the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, when a combination of multiple metabolites of the present invention is used as an index, the cutoff value and the measurement value (binding index value) can be calculated according to the contents described in the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法によれば、被験対象について横紋筋肉腫のサブタイプを検出することができる。従って、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法は、横紋筋肉腫のサブタイプの診断に補助的に用いることができ、被験対象がどのサブタイプの横紋筋肉腫に罹患しているか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。例えば、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法により胞巣型の横紋筋肉腫が存在する（あるいは胞巣型の横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定された被験対象については、医師が他の所見を参照しつつ被験対象が胞巣型の横紋筋肉腫に罹患しているかを判断することができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法は横紋筋肉腫のサブタイプの診断を補助する方法あるいは横紋筋肉腫のサブタイプの診断を支援する方法と言い換えることができる。なお、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法は、外科手術により採取した組織を病理診断せずに横紋筋肉腫のサブタイプを判定できる点でも有利である。 According to the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, the subtype of rhabdomyosarcoma can be detected in a subject. Therefore, the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention can be used as an auxiliary method for diagnosing a subtype of rhabdomyosarcoma, and the doctor can ultimately determine which subtype of rhabdomyosarcoma a subject has, in combination with other findings as the case may be. For example, for a subject determined to have alveolar rhabdomyosarcoma (or to possibly have alveolar rhabdomyosarcoma) by the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, a doctor can determine whether the subject has alveolar rhabdomyosarcoma while referring to other findings. In other words, the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention can be rephrased as a method for assisting in the diagnosis of a subtype of rhabdomyosarcoma or a method for supporting the diagnosis of a subtype of rhabdomyosarcoma. The method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention is also advantageous in that it can determine the subtype of rhabdomyosarcoma without pathological diagnosis of tissue collected by surgery.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法によれば、被験対象から採取された生体試料を分析し、定量的に横紋筋肉腫のサブタイプについて検出または評価を行うことができる。すなわち、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確に横紋筋肉腫のサブタイプを検出または評価できる点で有利である。このため本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法は、横紋筋肉腫のサブタイプを検出または評価するための生体試料分析方法（好ましくは尿試料分析方法）と言い換えることができる。 According to the method for detecting a rhabdomyosarcoma subtype of the present invention, a biological sample collected from a subject can be analyzed to quantitatively detect or evaluate the subtype of rhabdomyosarcoma. In other words, the method for detecting a rhabdomyosarcoma subtype of the present invention is advantageous in that it can easily and accurately detect or evaluate the subtype of rhabdomyosarcoma while reducing the burden on the patient. Therefore, the method for detecting a rhabdomyosarcoma subtype of the present invention can be rephrased as a biological sample analysis method (preferably a urine sample analysis method) for detecting or evaluating the subtype of rhabdomyosarcoma.
本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法によれば、横紋筋肉腫の患者のサブタイプを特定することができる。このため、本発明の別の側面によれば、胞巣型または胎児型の横紋筋肉腫の治療方法が提供される。本発明の胞巣型の横紋筋肉腫の治療方法は、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法を実施し、胞巣型の横紋筋肉腫の存在が示された対象（あるいは胞巣型の横紋筋肉腫の存在可能性が示された対象）を選択する工程を含んでいてもよい。本発明の胎児型の横紋筋肉腫の治療方法は、本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法を実施し、胎児型の横紋筋肉腫の存在が示された対象（あるいは胎児型の横紋筋肉腫の存在可能性が示された対象）を選択する工程を含んでいてもよい。この工程は、被験対象から被験試料を得ること、該試料中の代謝物の量または濃度を測定すること、および／または、該試料中の代謝物の量または濃度をカットオフ値と比較することを含んでいてもよい。本発明の胞巣型または胎児型横紋筋肉腫の治療方法はまた、選択された対象に対して胞巣型または胎児型の横紋筋肉腫の治療を行う工程を含んでいてもよい。胞巣型および胎児型の横紋筋肉腫の治療としては、外科療法、化学療法、放射線療法、免疫療法等の療法が挙げられ、緩和ケア等の緩和療法も含まれる点では共通するが、胞巣型の場合には胎児型と比べて予後不良である可能性が高いため、例えば、化学療法および放射線療法を組み合わせて実施する、治療を長期間実施する等、強い治療を実施することができる。また胎児型の場合には胞巣型と比べて予後不良である可能性が低いため、例えば、経過観察を含めた軽度の治療を実施することができる。 According to the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention, the subtype of a patient with rhabdomyosarcoma can be identified. Therefore, according to another aspect of the present invention, a method for treating alveolar or embryonal rhabdomyosarcoma is provided. The method for treating alveolar rhabdomyosarcoma of the present invention may include a step of carrying out the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention and selecting a subject in which the presence of alveolar rhabdomyosarcoma has been indicated (or a subject in which the possibility of the presence of alveolar rhabdomyosarcoma has been indicated). The method for treating embryonal rhabdomyosarcoma of the present invention may include a step of carrying out the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention and selecting a subject in which the presence of embryonal rhabdomyosarcoma has been indicated (or a subject in which the possibility of the presence of embryonal rhabdomyosarcoma has been indicated). This step may include obtaining a test sample from a test subject, measuring the amount or concentration of a metabolite in the sample, and/or comparing the amount or concentration of a metabolite in the sample with a cutoff value. The method for treating alveolar or embryonal rhabdomyosarcoma of the present invention may also include a step of treating the selected subject with alveolar or embryonal rhabdomyosarcoma. Treatments for alveolar and embryonal rhabdomyosarcoma include surgery, chemotherapy, radiation therapy, immunotherapy, and other therapies, and are similar in that they also include palliative care and other palliative care. However, since the alveolar type is more likely to have a poor prognosis than the embryonal type, more intensive treatments can be implemented, such as a combination of chemotherapy and radiation therapy, or long-term treatment. Also, since the fetal type is less likely to have a poor prognosis than the alveolar type, more intensive treatments can be implemented, such as follow-up observation.
＜＜高リスクの横紋筋肉腫の検出方法＞＞
本発明によれば、高リスクの横紋筋肉腫の検出方法が提供される。本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法によれば、被験対象の生体試料中の代謝物の量または濃度を指標にして高リスクの横紋筋肉腫を判定することができる。すなわち、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は、生体試料中の代謝物の量または濃度を被験対象における高リスクの横紋筋肉腫と関連づけることを特徴とする。
<<How to detect high-risk rhabdomyosarcoma>>
According to the present invention, a method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma is provided. According to the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, high-risk rhabdomyosarcoma can be determined using the amount or concentration of metabolites in a biological sample of a test subject as an index. That is, the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention is characterized in that the amount or concentration of metabolites in a biological sample is associated with high-risk rhabdomyosarcoma in a test subject.
なお、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法においては被験対象の生体試料中の代謝物の量または濃度を指標にして高リスクの横紋筋肉腫を判定（決定）するという側面をもつため、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は高リスクの横紋筋肉腫の判定方法と言い換えることもできる。本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法においてはまた、被験対象の生体試料中の代謝物の量または濃度を指標にして横紋筋肉腫のリスク分類を判定（決定）するという側面をもつため、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は横紋筋肉腫のリスク分類の判定方法と言い換えることもできる。 The method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention has an aspect of judging (determining) high-risk rhabdomyosarcoma using the amount or concentration of metabolites in a biological sample of a subject as an indicator, and therefore the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention can also be referred to as a method for determining high-risk rhabdomyosarcoma.The method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention also has an aspect of judging (determining) the risk classification of rhabdomyosarcoma using the amount or concentration of metabolites in a biological sample of a subject as an indicator, and therefore the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention can also be referred to as a method for determining the risk classification of rhabdomyosarcoma.
本発明において高リスクの横紋筋肉腫の指標となる代謝物は、
(121) オキソグルタル酸、
(122) Ｌ－ヒスチジン、
(123) リノール酸、
(124) ベタイン、
(125) ジメチルグリシン、
(126) サッカロピン、
(127) アミノアジピン酸、
(128) α－リノレン酸および
(129) グアニド酢酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質を少なくとも含むものとすることができる。本明細書において上記(121)～(129)からなる群から選択される１種または２種以上の物質を「代謝物（ｆ）」ということがある。
In the present invention, metabolites that are indicative of high-risk rhabdomyosarcoma are:
(121) Oxoglutaric acid,
(122) L-histidine,
(123) Linoleic acid,
(124) Betaine,
(125) Dimethylglycine,
(126) Saccharopine,
(127) Aminoadipic acid,
(128) α-Linolenic acid and
(129) guanidoacetic acid. In the present specification, one or more substances selected from the group consisting of (121) to (129) above may be referred to as "metabolites (f)".
本発明の好ましい態様においては、代謝物（ｆ）のうち上記(121)～(125)の物質を横紋筋肉腫の指標とすることができ、あるいは、代謝物（ｆ）のすべての物質を高リスクの横紋筋肉腫の指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, among metabolites (f), the above substances (121) to (125) can be used as indicators of rhabdomyosarcoma, or all substances in metabolites (f) can be used as indicators of high-risk rhabdomyosarcoma.
本発明の好ましい態様においてはさらに、代謝物（ｆ）のうちいずれか１種（例えば、上記(121)の物質）を高リスクの横紋筋肉腫の指標とし、残り８種のうち１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種を場合により組み合わせて高リスクの横紋筋肉腫の指標とすることができる。本発明の好ましい態様においてはまた、代謝物（ｆ）の上記(121)～(125)の物質のうちいずれか１種（例えば、上記(121)の物質）を高リスクの横紋筋肉腫の指標とし、残り４種のうち１種、２種、３種または４種を場合により組み合わせて高リスクの横紋筋肉腫の指標とすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (f) (e.g., the substance (121) above) can be used as an indicator of high-risk rhabdomyosarcoma, and one, two, three, four, five, six, seven, or eight of the remaining eight can be used as an indicator of high-risk rhabdomyosarcoma in combination as appropriate. In a preferred embodiment of the present invention, any one of the metabolites (f) (121) to (125) above (e.g., the substance (121) above) can be used as an indicator of high-risk rhabdomyosarcoma, and one, two, three, or four of the remaining four can be used as an indicator of high-risk rhabdomyosarcoma in combination as appropriate.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法においては、まず、（Ｅ）被験対象の生体試料中における代謝物（ｆ）の量または濃度を測定する工程を実施することができる。代謝物（ｆ）の量および濃度の測定は、生体試料および物質の特性に応じて公知の方法を選択して実施することができる。これら代謝物の測定装置は本発明の横紋筋肉腫の検出方法において記載のものを使用することができる。 In the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, first, a step (E) of measuring the amount or concentration of metabolite (f) in a biological sample from a test subject can be carried out. The amount and concentration of metabolite (f) can be measured by selecting a known method according to the characteristics of the biological sample and the substance. The measurement device for these metabolites can be the one described in the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法においては、被験対象の生体試料中における代謝物の測定結果に基づいて高リスクの横紋筋肉腫を検出することができる。すなわち、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法においては、（Ｆ）代謝物（ｆ）の量または濃度を指標にして、生体試料を採取した被験対象について高リスクの横紋筋肉腫を検出または判定する工程を含むことができる。工程（Ｆ）はさらに、被験対象の生体試料中の代謝物（ｆ）の量または濃度をカットオフ値と比較する工程をさらに含んでいてもよい。 In the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, high-risk rhabdomyosarcoma can be detected based on the measurement results of metabolites in a biological sample from a subject. That is, the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention can include a step (F) of detecting or determining high-risk rhabdomyosarcoma in a subject from whom a biological sample was collected, using the amount or concentration of metabolite (f) as an indicator. Step (F) may further include a step of comparing the amount or concentration of metabolite (f) in the biological sample from the subject with a cutoff value.
代謝物（ｆ）を指標とする場合、代謝物の量または濃度がカットオフ値より高いことが、前記対象における高リスクの横紋筋肉腫の存在または高リスクの横紋筋肉腫の存在可能性を示す。 When metabolite (f) is used as an indicator, an amount or concentration of the metabolite higher than the cutoff value indicates the presence of high-risk rhabdomyosarcoma or the possibility of the presence of high-risk rhabdomyosarcoma in the subject.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法において、指標となる代謝物が上記(121)～(129)の物質の場合、工程（Ｆ）は、（Ｆ－ａ－１）被験対象の生体試料中の上記代謝物の量または濃度とあらかじめ定めたカットオフ値とを比較する工程と、（Ｆ－ａ－２）被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以上であるか、またはカットオフ値よりも高い場合に被験対象における横紋筋肉腫が高リスクの横紋筋肉腫であるか、または中間リスクの横紋筋肉腫または低リスクの横紋筋肉腫ではないと判定する工程とにより実施することができる。 In the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, when the indicative metabolite is any of the substances (121) to (129) above, step (F) can be carried out by: (F-a-1) comparing the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject with a predetermined cutoff value; and (F-a-2) determining that the rhabdomyosarcoma in the subject is high-risk rhabdomyosarcoma or is not intermediate-risk or low-risk rhabdomyosarcoma when the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or greater than the cutoff value or higher than the cutoff value.
指標となる代謝物が上記(121)～(129)の物質の場合においては、工程（Ｆ－ａ－２）では、被験対象の生体試料中における上記代謝物の量または濃度がカットオフ値以下であるか、またはカットオフ値よりも低い場合に被験対象における横紋筋肉腫が高リスクの横紋筋肉腫ではないか、または中間リスクの横紋筋肉腫または低リスクの横紋筋肉腫であると判定することもできる In the case where the indicator metabolite is any of the above substances (121) to (129), in step (F-a-2), if the amount or concentration of the metabolite in the biological sample of the subject is equal to or less than the cutoff value, it can be determined that the rhabdomyosarcoma in the subject is not high-risk rhabdomyosarcoma, or is intermediate-risk or low-risk rhabdomyosarcoma.
本発明において、横紋筋肉腫のリスク群の分類は、日本横紋筋肉腫研究グループ（JRSG：Japan Rhabdomyosarcoma Study Group）が用いる「リスク分類」（JRS-IIリスク分類またはそれと同等の分類）に従うものとする。すなわち、「治療前ステージ分類」および「手術後グループ分類」の結果を組み合わせてリスク分類を行うことができる。このため、高リスクの横紋筋肉腫は、胎児型の場合、治療前ステージＩＶで、かつ、手術後グループＩＶ（遠隔転移）の症例が該当し、胞巣型の場合、治療前ステージＩＩで、かつ、手術後グループＩＩＩ（眼窩以外、リンパ節転移なし）の症例；治療前ステージＩＩＩで、かつ、手術後グループＩＩＩ（眼窩以外）の症例；および治療前ステージＩＶで、かつ、手術後グループＩＶ（遠隔転移）の症例が該当する。なお、JRSGのリスク分類による「低リスクＡ」および「低リスクＢ」は低リスク群とした。 In the present invention, the risk group classification of rhabdomyosarcoma is based on the "risk classification" (JRS-II risk classification or equivalent classification) used by the Japan Rhabdomyosarcoma Study Group (JRSG). In other words, risk classification can be performed by combining the results of the "pretreatment stage classification" and the "postoperative group classification". For this reason, high-risk rhabdomyosarcoma includes cases of embryonal type in pretreatment stage IV and postoperative group IV (distant metastasis), and cases of alveolar type in pretreatment stage II and postoperative group III (other than the orbit, no lymph node metastasis), cases of pretreatment stage III and postoperative group III (other than the orbit), and cases of pretreatment stage IV and postoperative group IV (distant metastasis). Note that "low risk A" and "low risk B" according to the JRSG risk classification were considered to be low-risk groups.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法において２種以上の代謝物を組み合わせて検出を行うと、単独で検出を行った場合と比較して、より正確に高リスクの横紋筋肉腫を検出することができる。本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法において２種以上の本発明の代謝物を組み合わせて検出を行う場合には、工程（Ｅ）および工程（Ｆ）をそれぞれの代謝物について実施することができる。この場合、それぞれの代謝物に基づいて示された判定結果を組み合わせて高リスクの横紋筋肉腫を判定することができる。例えば、２種類の本発明の代謝物の両方について高リスクの横紋筋肉腫の存在が示された場合（あるいは胞巣型の横紋筋肉腫の存在可能性が示された場合）には、それぞれの代謝物単独での結果よりも高リスクの横紋筋肉腫の存在が強く示唆され、２種類の本発明の代謝物の両方について高リスクの横紋筋肉腫の存在が否定された場合（あるいは高リスクの横紋筋肉腫の存在可能性が低いことが示された場合）には、それぞれの代謝物単独での結果よりも高リスクの横紋筋肉腫の存在が強く否定される。 In the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, when two or more metabolites are combined for detection, high-risk rhabdomyosarcoma can be detected more accurately than when they are detected individually. When two or more metabolites of the present invention are combined for detection in the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, steps (E) and (F) can be performed for each metabolite. In this case, high-risk rhabdomyosarcoma can be determined by combining the determination results shown based on each metabolite. For example, when the presence of high-risk rhabdomyosarcoma is indicated for both of the two metabolites of the present invention (or when the possibility of the presence of alveolar rhabdomyosarcoma is indicated), the presence of high-risk rhabdomyosarcoma is more strongly suggested than the results of each metabolite alone, and when the presence of high-risk rhabdomyosarcoma is denied for both of the two metabolites of the present invention (or when the possibility of the presence of high-risk rhabdomyosarcoma is indicated), the presence of high-risk rhabdomyosarcoma is more strongly denied than the results of each metabolite alone.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法において２種以上の代謝物を組み合わせて検出を行う場合には、後述のように、複数種の代謝物の量または濃度の測定値の合計値、平均値、比率等を用いて一つの値（結合指標値）を算出することができ、あるいは、複数種の代謝物の量または濃度のそれぞれの測定値に重み付けをした上で合計値、平均値、比率等を一つの値（結合指標値）として算出することもできる。 When two or more types of metabolites are combined for detection in the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, as described below, a single value (binding index value) can be calculated using the sum, average, ratio, etc. of the measured values of the amount or concentration of the multiple types of metabolites, or the measured values of the amount or concentration of each of the multiple types of metabolites can be weighted and then the sum, average, ratio, etc. can be calculated as a single value (binding index value).
本発明において高リスクの横紋筋肉腫の検出に用いるカットオフ値は、低リスクおよび中間リスクの横紋筋肉腫に罹患した対象（低リスク・中間リスク群）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値から算出し、決定することができる。本発明においてカットオフ値はまた、高リスクの横紋筋肉腫に罹患した対象（高リスク群）の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値から算出し、決定することもできる。上記のカットオフ値の決定方法においては、低リスク・中間リスク群または高リスク群の測定値の平均値、中央値、パーセンタイル値、最大値または最小値を使用することができる。パーセンタイル値は任意の値を選択することができ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５とすることができる。カットオフ値を算出する際の低リスク・中間リスク群および高リスク群の例数は複数例が好ましく、例えば、２例以上、５例以上、１０例以上、２０例以上または５０例以上とすることができる。 In the present invention, the cutoff value used for detecting high-risk rhabdomyosarcoma can be calculated and determined from the measured amount or concentration of the metabolite of the present invention in samples from subjects with low-risk and intermediate-risk rhabdomyosarcoma (low-risk and intermediate-risk groups). In the present invention, the cutoff value can also be calculated and determined from the measured amount or concentration of the metabolite of the present invention in samples from subjects with high-risk rhabdomyosarcoma (high-risk group). In the above-mentioned method for determining the cutoff value, the average value, median value, percentile value, maximum value, or minimum value of the measured values of the low-risk, intermediate-risk group, or high-risk group can be used. The percentile value can be any value, and can be, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, or 95. When calculating the cutoff value, the number of examples in the low-risk, intermediate-risk group, and high-risk group is preferably multiple, and can be, for example, 2 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, or 50 or more.
本発明において高リスクの横紋筋肉腫の検出に用いるカットオフ値はまた、低リスク・中間リスク群の対象の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値と、高リスク群の対象の試料における本発明の代謝物の量または濃度の測定値に基づいて算出することもできる。例えば、高リスク群の対象と、低リスク・中間リスク群の対象について、生体試料における本発明の代謝物の量または濃度を測定し、得られた測定値を用いてＲＯＣ解析等の統計解析を行うことによりカットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ曲線の作成とＲＯＣ曲線に基づくカットオフ値の設定は周知であり、感度や特異度の観点から当業者がカットオフ値を設定することができる。 In the present invention, the cutoff value used for detecting high-risk rhabdomyosarcoma can also be calculated based on the measured amount or concentration of the metabolite of the present invention in samples from subjects in the low-risk and intermediate-risk groups, and the measured amount or concentration of the metabolite of the present invention in samples from subjects in the high-risk group. For example, the amount or concentration of the metabolite of the present invention in biological samples from subjects in the high-risk group and subjects in the low-risk and intermediate-risk groups can be measured, and the cutoff value can be set by performing statistical analysis such as ROC analysis using the obtained measured values. The creation of ROC curves and the setting of cutoff values based on ROC curves are well known, and a person skilled in the art can set the cutoff value from the standpoint of sensitivity and specificity.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法の工程（Ｆ）においては、例えば、被験対象の生体試料中における代謝物（ｆ）の量または濃度が低リスク・中間リスク群の当該代謝物の量または濃度の平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．１倍以上、約２．２倍以上、約２．３倍以上、約２．４倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象に高リスクの横紋筋肉腫が存在する（あるいは高リスクの横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定することができる。 In step (F) of the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, for example, if the amount or concentration of metabolite (f) in the biological sample of the subject is higher than the average amount or concentration of the metabolite in the low-risk/intermediate-risk group, or is about 1.1 times or more, about 1.2 times or more, about 1.3 times or more, about 1.4 times or more, about 1.5 times or more, about 1.6 times or more, about 1.7 times or more, about 1.8 times or more, about 1.9 times or more, about 2.0 times or more, about 2.1 times or more, about 2.2 times or more, about 2.3 times or more, about 2.4 times or more, about 2.5 times or more, or about 3 times or more, compared to the average, it can be determined that the subject has high-risk rhabdomyosarcoma (or may have high-risk rhabdomyosarcoma).
本発明においては、本発明の代謝物のうち複数種を組み合わせて使用することにより検出精度を向上させることができる。ここで検出精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。 In the present invention, the detection accuracy can be improved by using a combination of multiple types of metabolites of the present invention. Here, improved detection accuracy means that, when ROC analysis is used, the area under the curve (AUC) of the ROC curve is improved.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法において、本発明の代謝物を複数種組み合わせて指標とする場合には、本発明の横紋筋肉腫の検出方法において記載した内容に従ってカットオフ値および測定値（結合指標値）を算出することができる。 In the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, when a combination of multiple metabolites of the present invention is used as an index, the cutoff value and measurement value (binding index value) can be calculated according to the contents described in the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法によれば、被験対象について高リスクの横紋筋肉腫を検出することができる。従って、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は、高リスクの横紋筋肉腫の診断に補助的に用いることができ、被験対象がどのリスク分類の横紋筋肉腫に罹患しているか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。例えば、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法により高リスクの横紋筋肉腫が存在する（あるいは高リスクの横紋筋肉腫が存在する可能性がある）と判定された被験対象については、医師が他の所見を参照しつつ被験対象が高リスクの横紋筋肉腫に罹患しているかを判断することができる。すなわち、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は横紋筋肉腫のリスク分類の診断を補助する方法あるいは横紋筋肉腫のリスク分類の診断を支援する方法と言い換えることができる。なお、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は、外科手術により採取した組織を病理診断せずに横紋筋肉腫のリスク分類を判定できる点でも有利である。 According to the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, it is possible to detect high-risk rhabdomyosarcoma in a subject. Therefore, the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention can be used as an auxiliary for diagnosing high-risk rhabdomyosarcoma, and the doctor can ultimately determine which risk category of rhabdomyosarcoma a subject has, in combination with other findings as the case may be. For example, for a subject determined to have high-risk rhabdomyosarcoma (or to possibly have high-risk rhabdomyosarcoma) by the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, a doctor can determine whether the subject has high-risk rhabdomyosarcoma while referring to other findings. In other words, the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention can be rephrased as a method for assisting in the diagnosis of risk category of rhabdomyosarcoma or a method for supporting the diagnosis of risk category of rhabdomyosarcoma. The method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention is also advantageous in that it can determine the risk category of rhabdomyosarcoma without pathological diagnosis of tissue collected by surgery.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法によれば、被験対象から採取された生体試料を分析し、定量的に高リスクの横紋筋肉腫について検出または評価を行うことができる。すなわち、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確に横紋筋肉腫のリスク分類を検出または評価できる点で有利である。このため本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法は、高リスクの横紋筋肉腫を検出または評価するための生体試料分析方法（好ましくは尿試料分析方法）と言い換えることができる。 According to the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, a biological sample collected from a subject can be analyzed to quantitatively detect or evaluate high-risk rhabdomyosarcoma. In other words, the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention is advantageous in that it can easily and accurately detect or evaluate the risk classification of rhabdomyosarcoma while reducing the burden on the patient. Therefore, the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention can be rephrased as a biological sample analysis method (preferably a urine sample analysis method) for detecting or evaluating high-risk rhabdomyosarcoma.
本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法によれば、横紋筋肉腫の患者のリスク分類を特定することができる。このため、本発明の別の側面によれば、高リスクの横紋筋肉腫または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の治療方法が提供される。本発明の高リスクの横紋筋肉腫の治療方法は、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法を実施し、高リスクの横紋筋肉腫の存在が示された対象（あるいは高リスクの横紋筋肉腫の存在可能性が示された対象）を選択する工程を含んでいてもよい。本発明の低リスクまたは中間リスクの横紋筋肉腫の治療方法は、本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法を実施し、高リスクの横紋筋肉腫の存在が否定された対象（あるいは低リスクまたは中間リスクの横紋筋肉腫の存在が示された対象）を選択する工程を含んでいてもよい。この工程は、被験対象から被験試料を得ること、該試料中の代謝物の量または濃度を測定すること、および／または、該試料中の代謝物の量または濃度をカットオフ値と比較することを含んでいてもよい。本発明の高リスクの横紋筋肉腫または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の治療方法はまた、選択された対象に対して高リスクの横紋筋肉腫または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の治療を行う工程を含んでいてもよい。高リスクの横紋筋肉腫または低リスクもしくは中間リスクの横紋筋肉腫の治療としては、外科療法、化学療法、放射線療法、免疫療法等の療法が挙げられ、緩和ケア等の緩和療法も含まれる点では共通するが、高リスクの横紋筋肉腫の場合には低リスク・中間リスクと比べて予後不良である可能性が高いため、例えば、化学療法および放射線療法を組み合わせて実施する、治療を長期間実施する等、強い治療を実施することができる。また低リスク・中間リスクの横紋筋肉腫の場合には高リスクと比べて予後不良である可能性が低いため、例えば、経過観察を含めた軽度の治療を実施することができる。 According to the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention, the risk classification of a patient with rhabdomyosarcoma can be identified. Therefore, according to another aspect of the present invention, a method for treating high-risk rhabdomyosarcoma or low-risk or intermediate-risk rhabdomyosarcoma is provided. The method for treating high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention may include a step of carrying out the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention and selecting a subject in which the presence of high-risk rhabdomyosarcoma has been indicated (or a subject in which the possibility of the presence of high-risk rhabdomyosarcoma has been indicated). The method for treating low-risk or intermediate-risk rhabdomyosarcoma of the present invention may include a step of carrying out the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention and selecting a subject in which the presence of high-risk rhabdomyosarcoma has been denied (or a subject in which the presence of low-risk or intermediate-risk rhabdomyosarcoma has been indicated). This step may include obtaining a test sample from a test subject, measuring the amount or concentration of a metabolite in the sample, and/or comparing the amount or concentration of a metabolite in the sample with a cutoff value. The method for treating high-risk or low- or intermediate-risk rhabdomyosarcoma of the present invention may also include a step of treating high-risk or low- or intermediate-risk rhabdomyosarcoma on a selected subject. Treatments for high-risk or low- or intermediate-risk rhabdomyosarcoma include surgical therapy, chemotherapy, radiation therapy, immunotherapy, and other therapies, and are common in that they also include palliative care and other palliative care. However, since high-risk rhabdomyosarcoma is more likely to have a poor prognosis than low- or intermediate-risk rhabdomyosarcoma, stronger treatments, such as a combination of chemotherapy and radiation therapy or long-term treatment, can be implemented. Furthermore, since low- or intermediate-risk rhabdomyosarcoma is less likely to have a poor prognosis than high-risk rhabdomyosarcoma, milder treatments, such as follow-up, can be implemented.
＜＜バイオマーカー＞＞
本発明において「バイオマーカー」は、通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性を意味する。すなわち、本発明によれば、生体代謝物、特に、代謝物（ａ）および場合によっては代謝物（ｂ）または代謝物（ｃ）、を横紋筋肉腫のバイオマーカーとして使用することができる。本発明によればまた、生体代謝物、特に、代謝物（ｄ）および場合によっては代謝物（ｅ）、を横紋筋肉腫のサブタイプ（特に胞巣型の横紋筋肉腫）のバイオマーカーとして使用することができる。本発明によればさらに、生体代謝物、特に、代謝物（ｆ）、を横紋筋肉腫のリスク分類（特に高リスクの横紋筋肉腫）のバイオマーカーとして使用することができる。
<<Biomarkers>>
In the present invention, the term "biomarker" refers to a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes, pathological processes, or pharmacological responses to therapeutic intervention. That is, according to the present invention, a biological metabolite, in particular metabolite (a) and, in some cases, metabolite (b) or metabolite (c), can be used as a biomarker for rhabdomyosarcoma. According to the present invention, a biological metabolite, in particular metabolite (d) and, in some cases, metabolite (e), can also be used as a biomarker for rhabdomyosarcoma subtypes (particularly alveolar rhabdomyosarcoma). According to the present invention, a biological metabolite, in particular metabolite (f), can also be used as a biomarker for rhabdomyosarcoma risk classification (particularly high-risk rhabdomyosarcoma).
従って本発明の別の側面によれば、横紋筋肉腫の検出、判定または診断用バイオマーカーとしての、あるいは、横紋筋肉腫の検出、判定または診断の指標としての、生体代謝物の使用が提供される。本発明によればまた、生体代謝物を含んでなる、横紋筋肉腫の検出、判定または診断用バイオマーカーが提供される。生体代謝物は好ましくは尿代謝物であり、より好ましくは代謝物（ａ）および場合によっては代謝物（ｂ）である。代謝物（ａ）および代謝物（ｂ）は１種であっても、２種以上を組み合わせたものであってもよい。上記のバイオマーカーおよびバイオマーカーとしての使用は本発明の横紋筋肉腫の検出方法の記載に従って実施することができる。 Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided the use of a biological metabolite as a biomarker for the detection, determination or diagnosis of rhabdomyosarcoma or as an indicator for the detection, determination or diagnosis of rhabdomyosarcoma. The present invention also provides a biomarker for the detection, determination or diagnosis of rhabdomyosarcoma, comprising a biological metabolite. The biological metabolite is preferably a urinary metabolite, more preferably metabolite (a) and, in some cases, metabolite (b). Metabolite (a) and metabolite (b) may be one type or a combination of two or more types. The above biomarkers and their use as biomarkers can be carried out according to the description of the method for detecting rhabdomyosarcoma of the present invention.
本発明の別の側面によればまた、横紋筋肉腫のサブタイプの検出、判定または診断用バイオマーカーとしての、あるいは、横紋筋肉腫のサブタイプの検出、判定または診断の指標としての、生体代謝物の使用が提供される。本発明によればまた、生体代謝物を含んでなる、横紋筋肉腫のサブタイプの検出、判定または診断用バイオマーカーが提供される。生体代謝物は好ましくは尿代謝物であり、より好ましくは代謝物（ｄ）および場合によっては代謝物（ｅ）である。代謝物（ｄ）および代謝物（ｅ）は１種であっても、２種以上を組み合わせたものであってもよい。上記のバイオマーカーおよびバイオマーカーとしての使用は本発明の横紋筋肉腫のサブタイプの検出方法の記載に従って実施することができる。 According to another aspect of the present invention, there is provided the use of a biological metabolite as a biomarker for detecting, determining or diagnosing a subtype of rhabdomyosarcoma, or as an indicator for detecting, determining or diagnosing a subtype of rhabdomyosarcoma. According to the present invention, there is also provided a biomarker for detecting, determining or diagnosing a subtype of rhabdomyosarcoma, comprising a biological metabolite. The biological metabolite is preferably a urinary metabolite, more preferably metabolite (d) and, in some cases, metabolite (e). Metabolite (d) and metabolite (e) may be one type or a combination of two or more types. The above biomarkers and their use as biomarkers can be carried out according to the description of the method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma of the present invention.
本発明の別の側面によればさらに、高リスクの横紋筋肉腫の検出、判定または診断用バイオマーカーとしての、あるいは、高リスクの横紋筋肉腫の検出、判定または診断の指標としての、生体代謝物の使用が提供される。本発明によればまた、生体代謝物を含んでなる、高リスクの横紋筋肉腫の検出、判定または診断用バイオマーカーが提供される。生体代謝物は好ましくは尿代謝物であり、より好ましくは代謝物（ｆ）である。代謝物（ｆ）は１種であっても、２種以上を組み合わせたものであってもよい。上記のバイオマーカーおよびバイオマーカーとしての使用は本発明の高リスクの横紋筋肉腫の検出方法の記載に従って実施することができる。 According to another aspect of the present invention, there is further provided the use of a biological metabolite as a biomarker for detecting, determining or diagnosing high-risk rhabdomyosarcoma, or as an indicator for detecting, determining or diagnosing high-risk rhabdomyosarcoma. The present invention also provides a biomarker for detecting, determining or diagnosing high-risk rhabdomyosarcoma, comprising a biological metabolite. The biological metabolite is preferably a urinary metabolite, more preferably metabolite (f). Metabolite (f) may be one type or a combination of two or more types. The above biomarkers and their use as biomarkers can be carried out according to the description of the method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma of the present invention.
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
例１：横紋筋肉腫のバイオマーカーの同定
（１）尿検体の前処理方法
名古屋大学医学部附属病院等において横紋筋肉腫（rhabdomyosarcoma）と診断された１歳～１９歳の患者（ｎ＝１１）の尿検体と、３歳～１４歳の健常者（ｎ＝１０）の尿検体を横紋筋肉腫の診断マーカーの探索に使用した。本研究は名古屋大学生命倫理審査委員会の承認のもとで実施した。
Example 1: Identification of biomarkers for rhabdomyosarcoma (1) Method for pretreatment of urine samples Urine samples from patients (n=11) aged 1 to 19 years who were diagnosed with rhabdomyosarcoma at Nagoya University Hospital and other institutions, and urine samples from healthy subjects (n=10) aged 3 to 14 years were used to search for diagnostic markers for rhabdomyosarcoma. This study was conducted with the approval of the Nagoya University Bioethics Committee.
得られた尿検体は前処理を行った。すなわち、１．５ｍＬエッペンチューブに尿検体２００μＬを取り、メタノール８００μＬを加え、よく混合した。室温条件にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。上清８００μＬを別のエッペンチューブに取り分けた。４０℃条件下でターボバップにて窒素乾固した。乾固物に２００μＬの１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／９０％水溶液を加え、再溶解した。室温条件にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。 The obtained urine samples were pretreated. Specifically, 200 μL of urine sample was placed in a 1.5 mL Eppendorf tube, 800 μL of methanol was added, and the sample was mixed well. The sample was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at room temperature. 800 μL of the supernatant was separated into another Eppendorf tube. The sample was dried with nitrogen in a turbovap at 40°C. 200 μL of 10% acetonitrile (ACN)/90% aqueous solution was added to the dried sample to redissolve it. The sample was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at room temperature.
ＣＥ－ＴＯＦ－ＭＳシステムでの分析には次の処理を行った。すなわち、カチオン性代謝物測定用の内部標準としてメチオニンスルホン（Methionine Sulfone）を、アニオン性代謝物測定用の内部標準としてカンファースルホン酸および２－モノフォリノエタンスルホン酸を、それぞれ２５ｍＭになるように超純水で希釈し、内部標準溶液を作成した。尿検体８０μＬに対し、内部標準溶液２０μＬを加え、限外濾過ユニットのフィルターカップに検体を注入した。蓋を閉めた後、４℃、９１００ｇ、５分で遠心した。フィルターカップをはずし、ろ過された検体を１０μＬサンプルカップに注入し、ＣＥ－ＴＯＦ－ＭＳシステムに供した。 The following procedure was used for analysis using the CE-TOF-MS system. Methionine sulfone was used as an internal standard for measuring cationic metabolites, and camphorsulfonic acid and 2-monofolinoethanesulfonic acid were used as internal standards for measuring anionic metabolites, and each was diluted with ultrapure water to 25 mM to prepare an internal standard solution. 20 μL of the internal standard solution was added to 80 μL of urine sample, and the sample was poured into the filter cup of the ultrafiltration unit. After closing the lid, the unit was centrifuged at 4°C, 9100 g, and 5 minutes. The filter cup was removed, and 10 μL of the filtered sample was poured into a sample cup and subjected to the CE-TOF-MS system.
ＬＣ－ＭＳシステムでの分析には次の処理を行った。すなわち、分析用に尿検体を１２０μＬ取り、４分の１量のＬＣ用内部標準（３０μＬ）を添加し、ＬＣ－ＭＳシステムに供した。内部標準物質はＣＥ－ＴＯＦ－ＭＳシステムと同様とした。 The following procedure was used for analysis using the LC-MS system. That is, 120 μL of urine sample was taken for analysis, and one-fourth the amount of LC internal standard (30 μL) was added, and the sample was subjected to the LC-MS system. The internal standard substance was the same as that used for the CE-TOF-MS system.
（２）ＣＥ－ＴＯＦ－ＭＳによる分析
標準物質、内部標準物質、試薬および機器・器具を用いてＣＥ－ＴＯＦ－ＭＳシステムを準備し、分析前に３０分間泳動バッファーでフラッシングをしてフューズドシリカキャピラリーカラム内壁の平衡化を行った後、電圧を徐々に印加して電流が流れることを確認してから分析を進めた。
(2) Analysis by CE-TOF-MS A CE-TOF-MS system was prepared using standard substances, internal standard substances, reagents, and devices and instruments. Prior to analysis, the inner wall of the fused silica capillary column was equilibrated by flushing with electrophoresis buffer for 30 minutes, and then a voltage was gradually applied to confirm that a current was flowing before proceeding with the analysis.
標準物質および内部標準物質は、全て特級か、純度の高いものを使用した。ポリアミン代謝、メチオニン代謝および尿素回路関連の陽イオン性化合物と内部標準物質を２００μＭになるように合わせて適宜溶解させた後、１．５ｍＬチューブに小分けして、－８０℃で保管した。凍結融解の繰り返しにより化合物が不安定化する可能性があるため、測定の際に小分け分を融解して使い切りとした。 All standards and internal standards used were of special grade or of high purity. Cationic compounds related to polyamine metabolism, methionine metabolism, and the urea cycle and the internal standards were mixed to 200 μM and dissolved appropriately, then aliquoted into 1.5 mL tubes and stored at -80°C. Because repeated freezing and thawing can cause the compounds to become unstable, the aliquots were thawed and used up when measuring.
ＣＥ－ＴＯＦ－ＭＳシステムは、送液用ポンプ（1260 Infinity II、アジレントテクノロジー社）を接続したキャピラリー電気泳動（7100 Capillary Electrophoresis、アジレントテクノロジー社）を前段に設置した飛行時間型質量分析装置（6546 Q-TOF、アジレントテクノロジー社）を使用した。フューズドシリカキャピラリーカラム（スパイラルラップ、Molex社、製品No. 106815-0017）、は、専用のダイヤモンドカッターで１００ｃｍにカットし、外側を覆うポリビニルフィルムを５ｍｍほどライターで焼いた後、焦げカスをメタノールで拭き取り、内側のガラス部分が両端ともに見えるようにした。片方をキャピラリー電気泳動専用カセットに納め、もう片方を質量分析装置のネブライザーに差し込んだ。キャピラリーカラムの先端は、質量分析装置側へ入る切り口が、ネブライザーから出ているインナーニードルの長さの約１／３程度の長さでインナーニードルから露出するようにし、専用の拡大鏡を用いてシース液が霧状に放出されているかを確認して、イオン化室に設置されるスプレイヤーにセットした。 The CE-TOF-MS system used was a time-of-flight mass spectrometer (6546 Q-TOF, Agilent Technologies) equipped with a capillary electrophoresis (7100 Capillary Electrophoresis, Agilent Technologies) connected to a solution pump (1260 Infinity II, Agilent Technologies) in the front stage. A fused silica capillary column (Spiral Wrap, Molex, product no. 106815-0017) was cut to 100 cm using a dedicated diamond cutter, and the polyvinyl film covering the outside was burned off by about 5 mm with a lighter, after which the burnt residue was wiped off with methanol so that the inner glass part could be seen at both ends. One end was placed in a cassette dedicated to capillary electrophoresis, and the other end was inserted into the nebulizer of the mass spectrometer. The tip of the capillary column was exposed from the inner needle at a length approximately 1/3 of the length of the inner needle protruding from the nebulizer, and a special magnifying glass was used to check that the sheath liquid was being released in a mist. The column was then set on the sprayer installed in the ionization chamber.
分析に使用した試薬類は、すべて質量分析用のものを用いた。具体的には、LC-MS用メタノール（富士フイルム和光純薬社、製品No. 138-14521）を試薬調整および分析時のシース液に用い、LC-MS用１ｍｏｌ／Ｌギ酸（富士フイルム和光純薬社、製品No.067-04531）をカチオンモード分析用泳動バッファーに用いた。
All reagents used in the analysis were intended for mass spectrometry. Specifically, LC-MS grade methanol (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, product no. 138-14521) was used as the sheath liquid for reagent preparation and analysis, and LC-
カチオン性標準物質は表１に記載のものを用いた。
カチオン性代謝物測定条件は表２の通りであった。
ギ酸アンモニウム（富士フイルム和光純薬社、製品No. 011-21031）、１％アンモニア水（ナカライテスク社、製品No.7432-65）をアニオンモード分析用泳動バッファーに用いた。バッファーは４０ｍＭギ酸アンモニウムを超純水で調整し、これに１Ｍアンモニア水を滴下してｐＨ１０に調整したものを使用した。 Ammonium formate (FUJIFILM Wako Pure Chemicals, product no. 011-21031) and 1% aqueous ammonia (Nacalai Tesque, product no. 7432-65) were used as the migration buffer for anion mode analysis. The buffer used was prepared by adjusting 40 mM ammonium formate with ultrapure water, and then adding 1 M aqueous ammonia to adjust the pH to 10.
アニオン性標準物質は表３に記載のものを用いた。
アニオン性代謝物測定条件は表４の通りであった。
カチオン性代謝物測定、アニオン性代謝物測定で測定モードを変更する際は、必ずカラムとネブライザーの交換システムチューニングを実施し、質量分析装置の補正を行った。また、測定が一時中断した場合はキャリブレーションを実施し、軸ズレが１ｐｐｍを超える場合は、チューニングを行った。その際、イオンソースやネブライザー、プランジャー、電極の洗浄を実施した。 When changing the measurement mode between cationic and anionic metabolite measurements, the column and nebulizer exchange system tuning was always performed and the mass spectrometer was corrected. In addition, calibration was performed if the measurement was temporarily interrupted, and tuning was performed if the axis misalignment exceeded 1 ppm. At that time, the ion source, nebulizer, plunger, and electrodes were cleaned.
（３）ＬＣ－ＭＳによる分析
上記（１）で前処理を行った尿検体をＬＣ－ＭＳシステムに供して分析を行った。測定条件は表５の通りであった。
（４）データ前処理
代謝物濃度をクレアチニン濃度で補正するため、尿検体のクレアチニン濃度を下記方法（Jaffe法）にて行った。すなわち、尿をミリＱ水にて１００倍に希釈し、その１５０μＬに１ｇ／１００ｍＬピクリン酸を６０μＬ加えた。さらに０．７５Ｎ ＮａＯＨ（６０μＬ）を加えた後、２５℃で１５分インキュベートした。このうち、２００μＬを９６ウェルプレートに注入し、吸光度４９０ｎｍで測定した。別に、クレアチニンを０、０．２５、０．５、０．７５、１ｍｇ／１００ｍＬの濃度になるように溶解し、これらを用いて検量線を作成した。
(4) Data preprocessing In order to correct the metabolite concentration with the creatinine concentration, the creatinine concentration of the urine sample was measured by the following method (Jaffe method). That is, urine was diluted 100 times with Milli-Q water, and 60 μL of 1 g/100 mL picric acid was added to 150 μL of the diluted solution. After adding 0.75 N NaOH (60 μL), the solution was incubated at 25° C. for 15 minutes. Of this, 200 μL was injected into a 96-well plate and the absorbance was measured at 490 nm. Separately, creatinine was dissolved to concentrations of 0, 0.25, 0.5, 0.75, and 1 mg/100 mL, and a calibration curve was created using these solutions.
また、検出された物質のうち、６－アミノペニシラン酸（6-Aminopenicillanic Acid）、クルクミン（Curcumin）、エルロチニブ（Erlotinib）、キニン（Quinine）の外因性物質を候補物質から除外した。 In addition, of the detected substances, the exogenous substances 6-aminopenicillanic acid, curcumin, erlotinib, and quinine were excluded from the list of candidate substances.
（５）データ解析
本実施例で行ったランダムフォレスト、OPLS-DA、パスウェイ解析、ROC解析のすべての解析を、Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)を使用して行った。MetaboAnalyst 5.0は、メタボロミクスデータ解析専用の包括的なウェブプラットフォームであり、生のMSスペクトル処理、包括的なデータ正規化、統計分析、機能分析、メタ分析および他のオミクスデータとの統合分析をサポートする、メタボロミクス コミュニティで最も広く使用されているプラットフォームである。ＣＥ－ＴＯＦ－ＭＳによる分析結果と、ＬＣ－ＭＳによる分析結果を上記解析プラットフォームへ入力し、メタボロミクスデータ解析を行った。
(5) Data Analysis All analyses of random forest, OPLS-DA, pathway analysis, and ROC analysis performed in this example were performed using Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/). MetaboAnalyst 5.0 is a comprehensive web platform dedicated to metabolomics data analysis, and is the most widely used platform in the metabolomics community, supporting raw MS spectrum processing, comprehensive data normalization, statistical analysis, functional analysis, meta-analysis, and integrated analysis with other omics data. The analysis results by CE-TOF-MS and the analysis results by LC-MS were input into the above analysis platform, and metabolomics data analysis was performed.
（６）結果
ア 横紋筋肉腫のバイオマーカー（１）
患者群の試料分析データと健常者群の試料分析データをもとにランダムフォレスト分析を行った。結果は図１に示される通りであった。図１からMean Decrease Accuracyに基づいて代謝物の順位付けを行い、下記表６の１２種の物質を横紋筋肉腫のバイオマーカー候補として選択した。健常者群および患者群のいずれが高値（Ｈ）または低値（Ｌ）を示すかは表６に示した。
(6) Results A. Biomarkers for rhabdomyosarcoma (1)
Random forest analysis was performed based on the sample analysis data of the patient group and the healthy subject group. The results are shown in Figure 1. Metabolites were ranked based on Mean Decrease Accuracy from Figure 1, and 12 substances in Table 6 below were selected as biomarker candidates for rhabdomyosarcoma. Table 6 shows which of the healthy subject group and the patient group showed high values (H) and which showed low values (L).
選択した１２種の代謝物をOPLS-DAで分析した。結果は図２に示される通りであった。１２種の代謝物を組み合わせることで横紋筋肉腫の患者群試料を健常者群試料と精度よく分離できることが示された。 The 12 selected metabolites were analyzed by OPLS-DA. The results are shown in Figure 2. It was shown that by combining the 12 metabolites, it is possible to accurately separate rhabdomyosarcoma patient samples from healthy control samples.
上記１２種の代謝物それぞれをＲＯＣ解析した結果は下記表７に示される通りであった。代謝物はＡＵＣの高い順に並べた。また上記１２種の代謝物を１つの指標としてＲＯＣ解析した結果は図３に示される通りであった。 The results of the ROC analysis of each of the above 12 metabolites are shown in Table 7 below. The metabolites are listed in descending order of AUC. The results of the ROC analysis of the above 12 metabolites as a single index are shown in Figure 3.
以上の結果から、上記１２種の代謝物は横紋筋肉腫の検出バイオマーカーとして有用であることが示された。 These results indicate that the above 12 metabolites are useful as biomarkers for detecting rhabdomyosarcoma.
本実施例ではまた、表７の代謝物のうちＲＯＣ解析結果の上位５種を除いた７種の代謝物をOPLS-DAで分析するとともに、７種を１つの指標としてＲＯＣ解析した。結果は図４および５に示される通りであった。ＲＯＣ解析の上位５種を除くと横紋筋肉腫の患者群試料を健常者群試料と精度よく分離できないことが判明した。 In this example, seven metabolites in Table 7, excluding the top five in the ROC analysis results, were analyzed by OPLS-DA, and the seven metabolites were used as one index for ROC analysis. The results are shown in Figures 4 and 5. It was found that excluding the top five in the ROC analysis made it impossible to accurately separate rhabdomyosarcoma patient samples from healthy subject samples.
本実施例ではさらに、表７の代謝物のうちＲＯＣ解析結果の上位５種および上位６種を１つの指標としてＲＯＣ解析した。結果はそれぞれ図６および７に示される通りであった。図６から、上位５種の代謝物が横紋筋肉腫の患者群試料の判別に貢献していること示された。また図７から、上位６番目の成分を加えてもＡＵＣに大きな変化が認められなかった。 In this example, furthermore, ROC analysis was performed using the top five and top six metabolites in the ROC analysis results of the metabolites in Table 7 as a single index. The results are shown in Figures 6 and 7, respectively. Figure 6 shows that the top five metabolites contribute to the discrimination of rhabdomyosarcoma patient group samples. Also, Figure 7 shows that adding the top sixth component did not significantly change the AUC.
以上から、ランダムフォレスト分析で選択した１２種の代謝物（表６）のうち、ＲＯＣ解析の上位５種の代謝物は横紋筋肉腫の診断バイオマーカーとして特に有用であることが示された。 From the above, it was shown that of the 12 metabolites selected by random forest analysis (Table 6), the top five metabolites in the ROC analysis are particularly useful as diagnostic biomarkers for rhabdomyosarcoma.
イ 横紋筋肉腫のバイオマーカー（２）
患者群の試料分析データと健常者群の試料分析データをもとにパスウェイ解析を行った。結果は図８に示される通りであった。図８においては、定量的メタボロームデータにおいて横紋筋肉腫との関係で有意に豊富化された、生物学的に意味あるパターン（すなわち代謝経路）を特定し、代謝経路の順位付けを行った。その結果、下記表８の５種のパスウェイと９種の物質を横紋筋肉腫と関連する経路および横紋筋肉腫のバイオマーカー候補としてそれぞれ特定した。
B. Biomarkers for Rhabdomyosarcoma (2)
Pathway analysis was performed based on the sample analysis data of the patient group and the sample analysis data of the healthy group. The results are shown in FIG. 8. In FIG. 8, biologically meaningful patterns (i.e., metabolic pathways) that were significantly enriched in the quantitative metabolome data in relation to rhabdomyosarcoma were identified, and the metabolic pathways were ranked. As a result, five pathways and nine substances in Table 8 below were identified as pathways related to rhabdomyosarcoma and candidate biomarkers for rhabdomyosarcoma, respectively.
上記表８の代謝物のうち４種の代謝物（カルノシン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－システインおよびアンセリン）を１つの指標としてＲＯＣ解析した結果は図９に示される通りであった。 The results of ROC analysis using four of the metabolites in Table 8 above (carnosine, L-glutamic acid, L-cysteine, and anserine) as one indicator are shown in Figure 9.
以上から、パスウェイ解析で特定した９種の代謝物（表８）のうち上記４種は横紋筋肉腫の診断バイオマーカーとして特に有用であることが示された。 From the above, it was shown that of the nine metabolites identified by pathway analysis (Table 8), the above four are particularly useful as diagnostic biomarkers for rhabdomyosarcoma.
ウ 胎児型と胞巣型の鑑別マーカー
胎児型群の試料分析結果と胞巣型群の試料分析結果をもとにランダムフォレスト分析を行った。結果は図１０に示される通りであった。図１０からMean Decrease Accuracyに基づいて代謝物の順位付けを行い、下記表９の１４種の物質を横紋筋肉腫のサブタイプの鑑別バイオマーカー候補として選択した。胎児型群および胞巣型群のいずれが高値（Ｈ）または低値（Ｌ）を示すかは表９に示した。
C. Markers for distinguishing fetal type and alveolar type Random forest analysis was performed based on the results of the sample analysis of the fetal type group and the alveolar type group. The results are shown in Figure 10. Metabolites were ranked based on the Mean Decrease Accuracy from Figure 10, and 14 substances in Table 9 below were selected as candidates for biomarkers for distinguishing rhabdomyosarcoma subtypes. Table 9 shows which of the fetal type group and the alveolar type group showed high values (H) and which showed low values (L).
選択した１４種の代謝物をOPLS-DAで分析した。結果は図１１に示される通りであった。１４種の代謝物を組み合わせることで横紋筋肉腫の患者群のうち胎児型を胞巣型と精度よく分離できることが示された。 The 14 selected metabolites were analyzed by OPLS-DA. The results are shown in Figure 11. It was shown that by combining the 14 metabolites, fetal type and alveolar type can be accurately separated in a patient group with rhabdomyosarcoma.
上記１４種の代謝物それぞれをＲＯＣ解析した結果は下記表１０に示される通りであった。代謝物はＡＵＣの高い順に並べた。また上記１４種の代謝物を１つの指標としてＲＯＣ解析した結果は図１２に示される通りであった。 The results of the ROC analysis of each of the above 14 metabolites are shown in Table 10 below. The metabolites are listed in descending order of AUC. The results of the ROC analysis of the above 14 metabolites as a single index are shown in Figure 12.
以上の結果から、上記１４種の代謝物は横紋筋肉腫の胎児型と胞巣型を判別するバイオマーカーとして有用であることが示された。 These results indicate that the above 14 metabolites are useful as biomarkers for distinguishing between fetal and alveolar types of rhabdomyosarcoma.
本実施例ではまた、表１０の代謝物のうちＲＯＣ解析結果の上位７種を除いた７種の代謝物をOPLS-DAで分析するとともに、７種を１つの指標としてＲＯＣ解析した。結果は図１３および１４に示される通りであった。ＲＯＣ解析の上位７種を除くと横紋筋肉腫の胎児型と胞巣型を精度よく分離できないことが判明した。 In this example, seven metabolites, excluding the top seven in the ROC analysis results, from among the metabolites in Table 10, were analyzed by OPLS-DA, and ROC analysis was performed using the seven metabolites as one index. The results are shown in Figures 13 and 14. It was found that when the top seven in the ROC analysis were excluded, it was not possible to accurately separate embryonal and alveolar types of rhabdomyosarcoma.
本実施例ではさらに、表１０の代謝物のうちＲＯＣ解析結果の上位７種および上位８種を１つの指標としてＲＯＣ解析した。結果は図１５および１６に示される通りであった。図１５から、上位７種の代謝物が横紋筋肉腫の胎児型と胞巣型の判別に貢献していること示された。また図１６から、上位８番目の成分を加えてもＡＵＣに大きな変化が認められなかった。 In this example, furthermore, ROC analysis was performed using the top seven and top eight metabolites in the ROC analysis results from Table 10 as a single index. The results are shown in Figures 15 and 16. Figure 15 shows that the top seven metabolites contribute to distinguishing between embryonal and alveolar types of rhabdomyosarcoma. Also, Figure 16 shows that adding the top eighth component did not significantly change the AUC.
以上から、ランダムフォレスト分析で選択した１４種の代謝物（表９）のうち、ＲＯＣ解析の上位７種の代謝物は横紋筋肉腫の胎児型と胞巣型の鑑別バイオマーカーとして特に有用であることが示された。 From the above, it was shown that of the 14 metabolites selected by random forest analysis (Table 9), the top seven metabolites in the ROC analysis were particularly useful as biomarkers for distinguishing between embryonal and alveolar types of rhabdomyosarcoma.
エ 高リスク横紋筋肉腫の鑑別マーカー
高リスク群の試料分析結果と、中間リスク群および低リスク群の試料分析結果をもとにパスウェイ解析を行った。結果は図１７に示される通りであった。図１７においては、定量的メタボロームデータにおいて横紋筋肉腫の高リスクとの関係で有意に豊富化された、生物学的に意味あるパターン（すなわち代謝経路）を特定し、代謝経路の順位付けを行った。その結果、下記表１１の５種のパスウェイと９種の物質を高リスク横紋筋肉腫と関連する経路および高リスク横紋筋肉腫のバイオマーカー候補としてそれぞれ特定した。
D. Markers for distinguishing high-risk rhabdomyosarcoma Pathway analysis was performed based on the results of the analysis of samples from the high-risk group and the intermediate-risk and low-risk groups. The results were as shown in FIG. 17. In FIG. 17, biologically meaningful patterns (i.e., metabolic pathways) that were significantly enriched in the quantitative metabolome data in relation to high risk of rhabdomyosarcoma were identified, and the metabolic pathways were ranked. As a result, five pathways and nine substances in Table 11 below were identified as pathways associated with high-risk rhabdomyosarcoma and candidate biomarkers for high-risk rhabdomyosarcoma, respectively.
上記リスク群の分類は、日本横紋筋肉腫研究グループ（JRSG：Japan Rhabdomyosarcoma Study Group）が用いる「リスク分類」に従って行った。なお、JRSGのリスク分類による「低リスクＡ」および「低リスクＢ」は低リスク群とした。 The above risk group classification was performed according to the "risk classification" used by the Japan Rhabdomyosarcoma Study Group (JRSG). Note that "low risk A" and "low risk B" according to the JRSG risk classification were considered to be in the low risk group.
上記表１１の代謝物のうち５種の代謝物（ジメチルグリシン、Ｌ－ヒスチジン、ベタイン、リノール酸およびオキソグルタル酸）を１つの指標としてＲＯＣ解析した結果は図１８に示される通りであった。 The results of ROC analysis using five of the metabolites in Table 11 above (dimethylglycine, L-histidine, betaine, linoleic acid, and oxoglutaric acid) as one indicator are shown in Figure 18.
以上から、パスウェイ解析で特定した９種の代謝物（表１１）のうち特に５種は横紋筋肉腫の診断バイオマーカーとして特に有用であることが示された。 From the above, it was shown that of the nine metabolites identified by pathway analysis (Table 11), five in particular are particularly useful as diagnostic biomarkers for rhabdomyosarcoma.
Claims (28)
(1) エチルグルクロニド、
(2) チミン、
(3) Ｎ－アセチルノイラミン酸、
(4) ５－メチルシチジンおよび
(5) カルノシン
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ａ））である、検出方法。 The method for detecting rhabdomyosarcoma according to claim 1, wherein the metabolite is:
(1) Ethyl glucuronide,
(2) Thymine,
(3) N-acetylneuraminic acid,
(4) 5-methylcytidine and
(5) A detection method, wherein the substance (metabolite (a)) is one or more substances selected from the group consisting of carnosine.
(6) リン酸フェニル、
(7) ベンゾイルグリシン、
(8) グアニジノ酢酸、
(9) Ｌ－アルギニノコハク酸、
(10) アゼライン酸、
(11) Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンおよび
(12) イミダゾール－４－酢酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｂ））である、検出方法。 The detection method according to claim 2 or 3, further comprising using the amount or concentration of a substance other than the metabolite (a) as an indicator, the substance other than the metabolite (a) being:
(6) phenyl phosphate,
(7) Benzoylglycine,
(8) guanidinoacetic acid,
(9) L-argininosuccinic acid,
(10) azelaic acid,
(11) N-acetyl-L-phenylalanine and
(12) A method for detecting the compound (b), wherein the compound (b) is one or more substances selected from the group consisting of imidazole-4-acetic acid (metabolites).
(21) カルノシン、
(22) アンセリン、
(23) Ｌ－グルタミン酸、
(24) Ｌ－システイン、
(25) １，３－ジアミノプロパン、
(26) タウリン、
(27) イミダゾール酢酸、
(28) α－リノレン酸および
(29) アラキドン酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｃ））である、検出方法。 The method for detecting rhabdomyosarcoma according to claim 1, wherein the metabolite is:
(21) Carnosine,
(22) anserine,
(23) L-glutamic acid,
(24) L-cysteine,
(25) 1,3-diaminopropane,
(26) Taurine,
(27) Imidazole acetic acid,
(28) α-linolenic acid and
(29) A method for detecting the metabolite (c), wherein the metabolite (c) is one or more substances selected from the group consisting of arachidonic acid.
(101) Ｌ－フェニルアラニン、
(102) ホモシトルリン、
(103) ＧＤＰグルコース、
(104) Ｌ－ヒスチジン、
(105) Ｎ，Ｎ－ジメチルアルギニン、
(106) Ｎ２－アセチル－Ｌ－リジンおよび
(107) チミジン一リン酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｄ））である、検出方法。 2. The method of claim 1, which is a method for detecting a subtype of rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is:
(101) L-phenylalanine,
(102) Homocitrulline,
(103) GDP glucose,
(104) L-histidine,
(105) N,N-dimethylarginine,
(106) N2-acetyl-L-lysine and
(107) A method for detecting the presence of one or more substances (metabolites (d)) selected from the group consisting of thymidine monophosphate.
(108) Ｌ－２－アミノアジピン酸、
(109) βアミノイソ酪酸、
(110) １－メチルヒスチジン、
(111) α－Ｄ－グルコース６－リン酸、
(112) Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、
(113) グアニジノ酢酸および
(114) １６－エピエストリオール
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｅ））である、検出方法。 The detection method according to claim 8 or 9, further comprising using the amount or concentration of a substance other than the metabolite (d) as an indicator, wherein the substance other than the metabolite (d) is:
(108) L-2-aminoadipic acid,
(109) β-aminoisobutyric acid,
(110) 1-methylhistidine,
(111) α-D-glucose 6-phosphate,
(112) N,N-dimethylglycine,
(113) Guanidinoacetic acid and
(114) A method for detecting one or more substances (metabolites (e)) selected from the group consisting of 16-epiestriol.
(121) オキソグルタル酸、
(122) Ｌ－ヒスチジン、
(123) リノール酸、
(124) ベタイン、
(125) ジメチルグリシン、
(126) サッカロピン、
(127) アミノアジピン酸、
(128) α－リノレン酸および
(129) グアニド酢酸
からなる群から選択される１種または２種以上の物質（代謝物（ｆ））である、検出方法。 2. The method of claim 1, which is a method for detecting high-risk rhabdomyosarcoma, wherein the metabolite is:
(121) Oxoglutaric acid,
(122) L-histidine,
(123) Linoleic acid,
(124) Betaine,
(125) Dimethylglycine,
(126) Saccharopine,
(127) Aminoadipic acid,
(128) α-Linolenic acid and
(129) A method for detecting the presence of one or more substances (metabolites (f)) selected from the group consisting of guanidoacetic acid.
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