JP2024057599A - マイクロｒｎａ２２の阻害剤 - Google Patents

マイクロｒｎａ２２の阻害剤 Download PDF

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Abstract

【課題】ｍｉＲ－２２阻害組成物を提供する。【解決手段】一態様として、ｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔからなる配列を有する核酸を含むｍｉＲ－２２阻害組成物であって、前記核酸は、少なくとも６個、または少なくとも８個のロック核酸修飾を含む、ｍｉＲ－２２阻害組成物である。【選択図】なし

Description

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、多くの発生および細胞過程における遺伝子発現の重要な転写後制御因子として機能し、広範なヒト疾患の発症機序および進行に関与している。ｍｉＲＮＡは、治療介入のための新しい標的クラスとなっており、したがって、ｍｉＲＮＡ活性ｍｉＲを調節する組成物および方法が必要とされている。
マイクロＲＮＡ－２２（ｍｉＲ－２２）は、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、およびウマを含む多くの脊椎動物種にわたって高度に保存されている。この保存レベルは、機能的重要性を示唆している。ＭｉＲ－２２は、以前、赤血球の成熟に関与していることが同定され、その後、がん化に関与していることが明らかになった。ＭｉＲ－２２は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）およびテトメチルシトシンジオキシゲナーゼ（ＴＥＴ）を直接標的とし、腫瘍形成、転移、および代謝障害を促進する。いくつかのグループによる最近の文献は、ｍｉＲ－２２が線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ－２１）のような肝臓代謝の重要要素を制御し得る方法をも示している。Ｈｕ Ｙ．らは、ＪＨＥＰ Ｒｅｐ．２０２０，２（２）：１０００９３には、ｍｉＲ－２２阻害剤によって誘導された肝ＦＧＦ２１およびＦＧＦＲ１の増加が、ＡＭＰＫおよびＥＲＫ１／２の活性化をもたらし、マウスモデルにおけるアルコール性脂肪症の治療に有効であったことを記載している。さらに、転写因子ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベータ１α（ＰＧＣ１α）に対するｍｉＲ－２２の既知の効果は、ｍｉＲ－２２レベルが肝臓および白色脂肪組織を含む様々な組織の代謝状態をいかに制御し得るかを証明している。
本開示は、ｍｉＲ－２２機能を薬理学的に阻害するための新規組成物および方法を提供する。このような阻害は、例えば、ロック核酸（ＬＮＡ）修飾アンチｍｉＲオリゴヌクレオチドを含む、成熟ｍｉＲ－２２配列に相補的な化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、いわゆる抗ｍｉＲによって媒介され得る。１つの態様では、本発明は、抗ｍｉＲ－２２阻害剤組成物を提供する。本開示は、ｍｉＲ－２２機能が存在する場合、薬理学的に阻害するための新規組成物および方法を提供する。
図１Ａ～１Fは、示された抗Ｒ－２２オリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力を示す棒グラフである。
本開示は、例えばマイクロＲＮＡの発現および／または活性を阻害することによって、ｍｉＲ－２２を阻害するための新規組成物および方法を提供する。
特定の理論に縛られることを望むものではないが、成熟ｍｉＲＮＡは、ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩによって生成され、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる最初の転写物から生じると考えられている。これらのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、数千塩基長であることが多く、そのため、より短い成熟ｍｉＲＮＡを作るために処理される。これらのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、マルチシストロニックであり得、多くのｍｉＲＮＡに発展し得るものを組織化するいくつかのクラスター配列の転写から生じる。ｍｉＲＮＡを得るためのプロセシングは、２段階あり得る。まず、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、核内でＲＮａｓｅ Ｄｒｏｓｈａによって、約７０から約１００ヌクレオチドのヘアピン状の前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）にプロセシングされ得る。次に、細胞質への転移後、ヘアピンｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｄｉｃｅｒによってさらに処理され、二本鎖のｍｉＲＮＡが生成される。成熟ｍｉＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ得、これは、標的ｍＲＮＡと塩基対の相補性によって結合し、タンパク質の発現を抑制する。ＲＩＳＣサイレンシング複合体に入るために優先的に選択されないｍｉＲＮＡ二重鎖のもう一方の鎖は、パッセンジャー鎖またはマイナーｍｉＲＮＡ、あるいはスター（＊）鎖として知られている。この鎖は、分解され得る。本明細書で使用されるｍｉＲＮＡは、別段の指定がない限り、ｐｒｉ－および／またはｐｒｅ－および／または成熟および／またはマイナー（スター）鎖および／または二重鎖バージョンのｍｉＲＮＡを指し得ることが理解されたい。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ遺伝子は、タンパク質コード遺伝子のイントロン内、または非コード転写ユニットのイントロンもしくはエクソン内に位置し得る。イントロンｍｉＲＮＡの発現は、それらが通常同じ方向に向いておりそれらが存在するプレｍＲＮＡと協調して発現されるため、ホスティング転写ユニットの発現と一致し得る。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の配列に結合し得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲ外の配列に結合し得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲ内外の両方に結合し得る。
いくつかの実施形態では、標的認識のために、ｍｉＲＮＡの第２ヌクレオチドおよび第７ヌクレオチド（ｍｉＲＮＡシード配列）と標的３’ＵＴＲに沿った対応する配列（シードマッチ）との間のヌクレオチド対合が起こり得る。従って、ｍｉＲＮＡと標的との間の結合は、約５ヌクレオチドの塩基対を含み得る。さらに、ｍｉＲＮＡと標的との間の結合は、５ヌクレオチド超の塩基対を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡとそれが制御する遺伝子との間の結合は、ｍｉＲＮＡが標的核酸の最大２個、最大４個、最大６個、最大８個、または最大１０個の部位に結合することによって媒介され得る。
（マイクロＲＮＡ－２２（ｍｉＲ－２２））
ＭｉＲ－２２は、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ウマなど多くの脊椎動物種にわたって高度に保存されている。この保存レベルは、機能的重要性を示唆している。ＭｉＲ－２２は、以前、赤血球の成熟に関与することが明らかにされ、その後、がん化に関与することが明らかにされた。ＭｉＲ－２２は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）とテトメチルシトシンジオキシゲナーゼ（ＴＥＴ）とを直接標的とし、腫瘍形成、転移、代謝障害を促進する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、ＰＴＥＮおよび／またはＴＥＴ２の活性および／または発現を増加させる。
予測されるｍｉＲ－２２ヘアピン前駆体は、非コード転写物であるＣｌ７ｏｒｆ９１のエクソン２内に完全に含有されており、タンパク質をコードする可能性がないにもかかわらず、スプライシングパターンは、概してヒトとマウスとで保存される。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、「哺乳類マイクロＲＮＡ宿主遺伝子および転写ユニットの同定」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４年１０月１４日（１０Ａ）：１９０２－１０を参照されたい。マウスモデルでｍｉｒ－２２を包含するＣ１７ｏｒｆ９１のエクソン２を欠失させると、ｍｉＲ－２２は、ＳＩＲＴ１（ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素サーチュイン－１）、ＨＤＡＣ４（ヒストン脱アセチル化酵素４）、ＰＵＲＢ（プリンリッチエレメント結合タンパク質Ｂ）、ＰＴＥＮを標的とすることによって、心肥大とリモデリングとに関与し得ることが明らかになった。Ｇｕｒｈａら、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０１２年６月５日、１２５（２２）：２７５１－６１、およびＨｕａｎｇら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３年４月２６日、１１２（９）：１２３４－４３を参照されたい。
（ｍｉＲ－２２の阻害剤）
実施形態では、ｍｉＲＮＡの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する核酸である。本発明の核酸は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。本発明の核酸は、少なくとも１つの化学修飾（非限定的な例としては、糖または骨格の修飾、例えば、ロック核酸（ＬＮＡ））を有し得る。
実施形態では、ｍｉＲ－２２を阻害する核酸の配列は、種を超えて保存される。実施形態では、核酸の配列は、ヒトｍｉＲ－２２の配列に部分的に相補的である。実施形態では、阻害剤は、細胞または対象のｍｉＲ－２２の発現および／または活性を低下させるように選択される。
実施形態では、本発明の核酸は、ヒトｍｉＲ－２２を阻害する。実施形態では、ヒトｍｉＲ－２２は、ＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むかまたはそれからなる。
実施形態では、本発明の核酸は、約８～約２０残基の長さ（例えば、約８～１８残基、または約８～１６残基、または約８～１４残基、または約８～１２残基、または約８～１０残基、または約１０～１８残基、または約１０～１６残基、または約１０～１４残基、または約１０～１２残基）である。実施形態では、核酸は、約８残基、または約９残基、または約１０残基、または約１１残基、または約１２残基の長さである。
実施形態では、本発明の核酸は、ｍｉＲ－２２の一部と完全な相同性で結合する。例えば、本発明の核酸は、１８残基の長さであり得、１８残基の各々は、ｍｉＲ－２２のヌクレオチドと相補的である。あるいは、本発明の核酸は、ｍｉＲ－２２の一部と完全な相同性をもって結合する。例えば、本発明の核酸の長さは、１６残基であり得、ｍｉＲ－２２のヌクレオチドと相補的な残基は、１５残基以下である。
実施形態では、本発明の核酸は、ｍｉＲ－２２の一部と、１位、２位、３位、４位、５位、または６位以上で異なる。
実施形態では、本発明の核酸は、ｍｉＲ－２２を阻害するのに十分な親和性でｍｉＲ－２２に結合する。実施形態では、核酸は、高い親和性（例えば、ｎＭ親和性）でｍｉＲ－２２に結合する。したがって、本発明の核酸は、ｍｉＲ－２２の一部と１つ以上の位置で異なっていても、高い親和性でｍｉＲ－２２に結合する。
本発明の核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含み得、少なくとも１個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む配列を有し得る。
ロック核酸（ＬＮＡ）では、核酸のリボース部分が、２’酸素と４’炭素とをつなぐ余剰架橋で修飾され、リボースが３’－エンドコンフォメーションにロックされる。本発明の核酸、およびＬＮＡを含む核酸は、様々な障害の治療および予防のために、効率的に送達され、十分な生物学的利用能を有する、費用効果の高い薬剤を提供する。
実施形態では、本発明の核酸は、その３’末端に向けて少なくとも２個のＬＮＡ修飾（例えば、その３’末端に向けて約２個、または約３個、または約４個、または約５個の修飾）を含む。実施形態では、核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、および少なくとも６個のＬＮＡ修飾または少なくとも８個のＬＮＡ修飾を含む。
例えば、核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の７位および８位におけるＬＮＡ修飾を含む。実施形態では、本発明の核酸は、４個以下の連続したＬＮＡ修飾（例えば、２個、または３個、または４個の連続したＬＮＡ修飾のみ）を含む。実施形態では、本発明の核酸は、３個以下の連続した非修飾残基（例えば、３個、または２個、または１個の非修飾残基のみ）を含む。実施形態では、本発明の核酸は、４個以上のＬＮＡ修飾を含む。実施形態では、核酸は、約８～約１２個のＬＮＡ修飾、例えば約８個、または約９個、または約１０個、または約１１個、または約１２個のＬＮＡ修飾を含む。
実施形態では、核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、およびｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）から選択される配列を有する核酸を含むか、またはそれからなる。実施形態では、核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、およびｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）から選択される配列を有し、約８～約１２個のＬＮＡ修飾、例えば、約８個、または約９個、または約１０個、または約１１個、または約１２個のＬＮＡ修飾を含む、核酸を含む。
実施形態では、核酸は、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、および少なくとも６個のＬＮＡ修飾、少なくとも８個のＬＮＡ修飾、または少なくとも１０個のＬＮＡ修飾からなるか、またはそれらからなる。実施形態では、核酸は、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）および８個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、１位、３位、６位、７位、１０位、１２位、１４位、および１５位にあり、例えば、核酸は、配列ＣｔＴｃａＡＣｔｇＧｃＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含むかまたはそれらからなり、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。実施形態では、核酸は、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）および１０個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、１位、２位、３位、６位、７位、１０位、１１位、１２位、１４位、および１５位にあり、例えば、核酸は、配列ＣＴＴｃａＡＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含むかまたはそれらからなり、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、および少なくとも８個のＬＮＡ修飾、少なくとも１０個のＬＮＡ修飾、または少なくとも１１個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなる。実施形態では、核酸は、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）および１０個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、１位、２位、４位、８位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、および１６位にあり、例えば、核酸は、配列ＴＣｔＴｃａａＣｔＧＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）を含むかまたはそれらからなり、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。実施形態では、核酸は、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）および１１個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、１位、２位、４位、５位、６位、８位、１１位、１２位、１３位、１５位、および１６位にあり、例えば、核酸は、配列ＴＣｔＴＣＡａＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を含むかまたはそれらからなり、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）および１１個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、１位、２位、４位、５位、６位、９位、１１位、１２位、１３位、１５位、および１６位にあり、例えば、核酸は、配列ＴＣｔＴＣＡａｃＴｇＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を含むかまたはそれらからなり、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、および少なくとも１０個のＬＮＡ修飾、または少なくとも１１個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなる。実施形態では、核酸は、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）および１１個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、１位、２位、５位、６位、７位、１０位、１２位、１３位、１４位、１６位、および１７位にあり、例えば、核酸は、配列ＴＴｃｔＴＣＡａｃＴｇＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を含むかまたはそれらからなり、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、ｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、および少なくとも９個のＬＮＡ修飾、または少なくとも１０個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなる。実施形態では、核酸は、ｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および９個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、１位、２位、６位、１０位、１３位、１４位、１６位、１７位、および１８位にあり、例えば、核酸は、配列ＧＴｔｃｔＴｃａａＣｔｇＧＣａＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を含むかまたはそれらからなり、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、およびｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）から選択される配列を有し、約８～約１２個のＬＮＡ修飾、例えば、約８個、または約９個、または約１０個、または約１１個、または約１２個のＬＮＡ修飾を含む、核酸を含むかまたは核酸からなる。
実施形態では、核酸は、ｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、および少なくとも９個のＬＮＡ修飾、または少なくとも１０個のＬＮＡ修飾、または少なくとも１１個のＬＮＡ修飾、または少なくとも１２個のＬＮＡ修飾を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態では、核酸は、少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む。
一実施形態では、核酸は１０個または１１個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む。
一実施形態では、核酸はｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）からなり、１０個または１１個の修飾を含み、当該修飾は、少なくとも１位、２位、６位、１１位、１７位、１８位にある。
一実施形態では、核酸はｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）からなり、１１個の修飾を含み、当該修飾は、少なくとも１位、２位、５位、６位、１１位、１４位、１７位、１８位にある。
一実施形態では、核酸はｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）からなり、少なくとも１つのＰＳ（ホスホロチオエート）結合は、１つのＰＯ（ホスホジエステル）結合で置換されている。
一実施形態では、核酸は、ｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）からなり、１つのＰＳ結合は、１つのＰＯ結合で置換されている。
一実施形態では、当該ＰＯ結合は、少なくとも６位、８位、１０位、１４位にある。
一実施形態では、当該ＰＯ結合は、１つのみであり、それは６位、１０位、または１４位にある。
例えば、核酸は、配列ＧＴＴｃｔＴｃＡＡｃＴＧｇＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を含むかまたはそれからなり、大文字は、ＬＮＡ修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列ＧＴｔｃＴＴＣａＡｃＴＧｇＣａｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を含むかまたはそれからなり、大文字は、ＬＮＡ修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列ＧＴｔｃＴＴｃＡａＣＴＧｇＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を含むかまたはそれからなり、大文字は、ＬＮＡ修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列ＧＴｔＣｔＴｃＡａＣＴｇｇｃＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を含むかまたはそれからなり、大文字は、ＬＮＡ修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列ＧＴｔｃＴＴｃＡａＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を含むかまたはそれからなり、大文字は、ＬＮＡ修飾であり、小文字は、非修飾である。
本発明は、ｍｉＲ－２２を阻害する方法を提供する。本方法は、ｍｉＲ－２２を、本明細書中に記載される態様または実施形態の核酸であるｍｉＲ－２２の阻害剤を含む組成物と接触させることを含む。
別の態様では、本発明は、ｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）からなる配列を有する核酸を含むｍｉＲ－２２阻害組成物を提供し、核酸は、少なくとも６個、または少なくとも８個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも１０個、または少なくとも１１個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、１０個または１１個のＬＮＡ修飾を含み、当該修飾は少なくとも１位、２位、６位、１１位、１７位、１８位にある。
いくつかの実施形態では、核酸は、１１個のＬＮＡ修飾を含み、当該修飾は少なくとも１位、２位、５位、６位、１１位、１４位、１７位、１８位にある。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含み、ヌクレオチド間結合は、１つのＰＯ（ホスフィンオキシド）結合で置換されたＰＳ（ホスホロチオエート）結合である。
いくつかの実施形態では、１つのＰＳ結合は、１つのＰＯ結合で置換されている。
いくつかの実施形態では、ＰＯ結合は少なくとも６位、８位、１０位、または１４位にある。
いくつかの実施形態では、ＰＯ結合は１つだけであり、ＰＯ結合は６位、１０位、または１４位にある。
いくつかの実施形態では、核酸は、ＧＴｔｃＴＴＣａＡｃＴＧｇＣａｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ＧＴｔＣｔＴｃＡａＣＴｇｇｃＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、またはＧＴｔｃＴＴｃＡａＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）からなる群から選択される配列を有する核酸を含み、大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は未修飾である。
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｇ＊Ｔ＊ｔ＊ｃ＊Ｔ＊ＴＣ＊ａ＊Ａ＊ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｇ＊Ｃ＊Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、Ｇ＊Ｔ＊ｔ＊Ｃ＊ｔ＊Ｔ＊ｃ＊Ａ＊ａ＊ＣＴ＊ｇ＊ｇ＊ｃ＊Ａ＊ｇ＊Ｃ＊Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、Ｇ＊Ｔ＊ｔ＊ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊ｃ＊Ａ＊ａ＊Ｃ＊ｔ＊ｇ＊Ｇ＊ＣＡ＊ｇ＊Ｃ＊Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）からなる群から選択される配列を有する核酸を含み、大文字は、ＬＮＡ修飾、小文字は、未修飾、記号＊はＰＳ結合を示し、＊記号がない場合はＰＯ結合を示す。
別の態様では、本発明は、本明細書に提供されるいずれか１つの態様または実施形態の核酸、および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される実施形態のいずれかの核酸のための配列を含むベクターまたはプラスミドを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される実施形態のいずれか１つの核酸を含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、ｍｉＲ－２２を、先の実施形態のいずれか１つのｍｉＲ－２２阻害組成物と接触させることを含む、ｍｉＲ－２２を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、被験体における代謝障害を治療する方法を提供し、本方法は、被験体に医薬組成物を投与することを含む。
実施形態では、上記の配列からなる核酸は、本明細書に記載された配列の５’に追加ヌクレオチドをさらに含み、および／または本明細書に記載された配列の３’に追加ヌクレオチドをさらに含み得る。追加ヌクレオチドは、未修飾であり得るか、または修飾され得る（例えばＬＮＡまたは追加の化学修飾など）。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、追加化学修飾をさらに含み得る。例として、化学修飾は、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、または２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡユニット、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡユニット、２’－アミノ－ＤＮＡユニット、２’－フルオロ－ＤＮＡユニット（２’位（２’Ｆ）にフッ素への置換を有するＤＮＡ類似体を含むが、これに限定されない）、ＬＮＡユニット、ＰＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡユニット、および２’ＭＯＥ ＲＮＡユニットの１つ以上である。
適切な核酸は、ＢＳＮを含有するオリゴヌクレオチドとその相補的なｍｉＲＮＡ標的鎖との間に形成される複合体に、熱安定性を向上させる１つ以上のコンフォメーション拘束性または二環糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）で構成され得る。例えば、一実施形態では、核酸は、少なくとも１個のロック核酸を含有する。ロック核酸（ＬＮＡ）は、リボース糖部分がロックコンフォメーションにある２’－０，４’－Ｃ－メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含有する。別の実施形態では、核酸は、少なくとも１つの２’，４’－Ｃ－架橋２’デオキシリボヌクレオシド（ＣＤＮＡ、構造Ｂ）を含有する。例えば、どちらもその全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，４０３，５６６号明細書およびＷａｎｇら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第９巻：１１４７－１１５０を参照されたい。さらに別の実施形態では、核酸は、構造Ｃに示す構造を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有する。脂肪関連の代謝および合成経路標的を制御するｍｉＲＮＡを標的とする核酸は、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ＣＤＮＡなど）または他の修飾ヌクレオチド、およびリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含有し得る。
あるいは、核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で構成され得、これは、糖－リン酸骨格ではなく、ペプチドベースの骨格を含有する。核酸に対する他の修飾糖またはホスホジエステルの修飾も考えられる。非限定的な例として、他の化学修飾としては、２’－ｏ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－ｏ－メトキシエチル）、２’－フルオロ、および４’－チオ修飾、ならびに１つ以上のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾が挙げられ得る（例えば、それの全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，６９３，１８７号明細書および米国特許第７，０６７，６４１号明細書を参照されたい。）一実施形態では、発がん性ｍｉＲＮＡを標的とする核酸は、各塩基上に２’－Ｏ－メチル糖修飾を含有し、ホスホロチオエート結合によって結合されている。核酸、特に短い長さの核酸（例えば、１６ヌクレオチド未満、７－８ヌクレオチド）は、ＬＮＡ、二環ヌクレオシド、ホスホノホルメート、２’ｏ－アルキル修飾などであるがこれらに限定されないような、１つ以上の親和性を高める修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、好適な核酸は、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを５’末端と３’末端の両方に含有し、中心に少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを有する２’－Ｏ－メトキシエチルギャマーである。これらのギャップマーは、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ Ｈ依存性分解メカニズムを誘発し得る。参照によってその全体が本明細書に援用される米国特許第６，８３８，２８３号明細書に記載されているような、安定性を高め有効性を改善するための核酸の他の修飾は、当技術分野で既知であり、本発明の方法での使用に適している。例えば、限定するつもりはないが、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達と安定性とを促進するために、核酸は、その３’末端においてステロイド、例えばコレステロール部分、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または他の低分子リガンドと連結し得る。
本明細書で使用されるとき、実質的に相補的とは、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列を指す（非限定的な例としては、例えばｍｉＲ－２２の成熟、マイナー、前駆体ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列が挙げられる）。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、アンタゴミルである。アンタゴミルは、一本鎖で化学修飾されたリボヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であるため、それらを発現停止させ得る。例えば、Ｋｒｉｉｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３８（７０６８）：６８５－９を参照されたい。アンタゴミルは、２’－Ｏ－メチル－糖修飾などの、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態では、アンタゴミルは、修飾ヌクレオチドのみからなる。アンタゴミルは、また、部分的または完全なホスホロチオエート骨格をもたらす１つ以上のホスホロチオエート結合を含み得る。インビボでの送達と安定性とを促進するために、アンタゴミルは、その３’末端でコレステロールや他の部位と結合させ得る。阻害に適したアンタゴミルは、長さ約１５～約５０ヌクレオチド、長さ約１８～約３０ヌクレオチド、長さ約２０～約２５ヌクレオチドであり得る。アンタゴミルは、成熟またはマイナーがん原性ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。いくつかの実施形態では、アンタゴミルは、成熟またはマイナーがん原性ｍｉＲＮＡ配列と実質的に相補的であり得、それは、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。他の実施形態では、アンタゴミルは、成熟またはマイナーがん原性ｍｉＲＮＡ配列に１００％相補的である。
本発明の核酸は、発がん性ｍｉＲＮＡの前駆体ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）または一次ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、そのｍｉＲＮＡの標的の３’－非翻訳領域の外側に位置する配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、そのｍｉＲＮＡの標的の３’－非翻訳領域の内側に位置する配列を含む。
実施形態では、核酸は、限定されたまたは全く自己結合親和性を有さない。実施形態では、核酸は、限定されたまたは全く二重鎖構造を有さない。実施形態では、核酸は、限定されたまたは全くフォールド構造を有さない。
本発明の核酸は、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはアゴニストをコードする発現ベクターを細胞に送達することによって、標的細胞に送達し得る。ベクターは、目的の核酸を細胞内部に送達するために使用され得る物質組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスなどを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、ベクターという用語には、自己複製プラスミドまたはウイルスも含まれる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。発現コンストラクトは、生きた細胞で複製され得るか、または合成的に作製され得る。本出願において、発現構築物、発現ベクター、およびベクターという用語は、一般的、例示的な意味で本発明の適用を示すために互換的に使用されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
一実施形態では、本発明の核酸を発現するための発現ベクターは、本発明の核酸をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。本明細書で使用される「作動可能に連結されている」または「転写制御下にある」という表現は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置および向きにあることを意味する。
本明細書で使用されるとき、プロモーターは、遺伝子の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成装置、または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列を指す。適切なプロモーターとしては、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびＲｏｕｓ肉腫ウイルス長末端リピート）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明の核酸をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当技術分野で知られており、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
発現構築物および核酸を細胞に送達する方法は、当技術分野で既知であり、非限定的な例として、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション、細胞超音波処理、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子ボンバードメント、および受容体媒介トランスフェクションが挙げられ得る。
本発明の一態様は、本明細書に記載した本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。
本発明のもう一つの態様は、ｍｉＲ－２２を阻害する方法を提供する。本方法は、ｍｉＲ－２２を、本明細書中に記載される本発明の任意の核酸であるｍｉＲ－２２阻害組成物と接触させることを含む。本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載される任意の本発明の核酸と、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。
臨床応用が意図される場合、医薬組成物は、意図される応用に適した形態で調製され得る。概して、これは、パイロジェン、およびヒトまたは動物に有害な可能性のある他の不純物を本質的に含まない、組成物を調製することを必要とする。
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される有効量の本発明の核酸を含む。有効量は、有益または望ましい臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。何が有効量とみなされるかの正確な決定は、患者の体格、年齢、代謝異常のタイプ、阻害剤またはアゴニストの性質（非限定的な例として、アンタゴミル、発現構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二重鎖など）など、各患者に固有の要因に基づき得る。したがって、投与量は、本開示および当技術分野の知識から、当業者であれば容易に見出し得る。例えば、投与量は、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，６６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＰＤＲ Ｎｅｔｗｏｒｋ、２０１２ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１、１２、２７）を参照して決定され得る。
高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質をベースとする系などのコロイド分散系は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸の送達ビヒクルとして使用され得る。本開示の核酸を脂肪組織（例えば、脂肪細胞）に送達するのに適した市販の脂肪乳剤としては、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤＯ、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）ＩＩ、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似の脂質乳剤が挙げられる。生体内送達ビヒクルとして使用するコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。このようなシステムの調製と使用とは、当技術分野で既知である。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書、米国特許第６，２１７，９００号明細書、米国特許第６，３８３，５１２号明細書、米国特許第５，７８３，５６５号明細書、米国特許第７，２０２，２２７号明細書、米国特許第６，３７９，９６５号明細書、米国特許第６，１２７，１７０号明細書、米国特許第５，８３７，５３３号明細書、米国特許第６，７４７，０１４号明細書、および国際公開第０３／０９３４４９号にも開示されており、これらは参照によってその全体が本明細書に援用される。
概して、送達ビヒクルを安定化させ、標的細胞に取り込ませるために、適切な塩類および緩衝剤を使用することが望ましい。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された、本明細書に記載される本発明の任意の核酸を含む送達ビヒクル（例えば、リポソームまたは他の複合体または発現ベクター）の有効量を含む。薬学的に許容されるあるいは薬理学的に許容されるという表現は、動物もしくはヒトに投与しても有害反応、アレルギー反応、またはその他の有害反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用されるとき、薬学的に許容される担体は、ヒトへの投与に適した医薬などの医薬の製剤化に使用するのに許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。このような媒体および薬剤を薬学的活性物質に使用することは、当技術分野で既知である。従来の媒体または薬剤が本発明の有効成分と不適合である場合を除き、治療用組成物への使用が企図されている。組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活性化しない場合に限り、補助的な活性成分も組成物に組み込まれ得る。
医薬品の形態としては、例えば、無菌の水溶液または分散液、無菌の注射液または分散液を即座に調製するための無菌の粉末などがある。概して、これらの製剤は、無菌であり、注射しやすい程度に流動性がある。製剤は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。適切な溶媒または分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤を使用し、分散液の場合は、必要な粒子径を維持し、界面活性剤を使用することで維持し得る。微生物の作用を防ぐには、さまざまな抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを使用する。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射用組成物の吸収の延長は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤の組成物への使用によってもたらされる。
無菌注射液は、本明細書に記載された本発明の核酸を、所望の他の成分（例えば、上記に列挙したような）と共に溶媒に適量取り込み、次いで濾過滅菌することによって調製され得る。概して、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒と、例えば上記に列挙したような所望の他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法には、真空乾燥および凍結乾燥技術が含まれ、これによって、あらかじめ無菌濾過した溶液から、有効成分（単数または複数）および任意の追加所望成分の粉末が得られる。
製剤化の際、溶液は、投与製剤と適合する方法で、および治療上有効な量で、投与され得る。
本明細書に開示された発明をより効率的に理解するために、下記に実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる方法においても本発明を限定するものとして解釈されるものではない。
（実施例１：ＬＮＡ修飾抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチドの設計）
すべてのＬＮＡ抗ｍｉＲ－２２はヒトとマウスの両方で有用である。宿主遺伝子は、ヒトとマウスとの間で４９％の相補性を示した。ＬＮＡ抗ＨＧ－ｍｉＲ－２２は、主にヒトにおいて機能する。
オリゴヌクレオチドは、シード配列をカバーするように設計され、８ｎｔから２０ｎｔの長さを含有し、許容されるＬＮＡの特異的な長さ割合を有し、ｍｉＲ－２２に対する結合親和性ができるだけ高い。
設計要素は、少なくとも８個のＬＮＡ修飾を含んだ。さらに設計要素は、一列に４個以下のＬＮＡ修飾を含んだ。さらなるデザインエレメントは、一列に３個以下の非修飾残基を含んだ。
オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２２を阻害するのに十分な親和性でｍｉＲ－２２に結合するように設計された。また、オリゴヌクレオチドは、自己結合親和性が制限されるか、または全くないように設計された（例えば、二重鎖または折りたたみ構造がないか、または制限される）。
下記の配列（比較）において、大文字は、ＬＮＡ修飾、小文字は、非修飾である、ｍｉＲ－２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の配向は、５’から３’である。５’から３’に配向されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のオリゴヌクレオチドは、スクランブル配列であり、ｍｉＲ－２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）にハイブリダイズしない。
ｈｓａ－ｍｉＲ－２２ ＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＣＲＭ０００８ ＴＧＧＣＡＧＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＣＲＭ０００９ ＣｔＴｃａＡＣｔｇＧｃＡｇＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
ＣＲＭ００１０ ＣＴＴｃａＡＣｔｇＧＣＡｇＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
ＣＲＭ００１１ ＴＣｔＴＣＡａＣｔｇＧＣＡｇＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
ＣＲＭ００１２ ＴＣｔＴｃａａＣｔＧＧＣＡｇＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
ＣＲＭ００１３ ＴＣｔＴＣＡａｃＴｇＧＣＡｇＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
ＣＲＭ００１４ ＴＴｃｔＴＣＡａｃＴｇＧＣＡｇＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
ＣＲＭ００１５ ＧＴｔｃｔＴｃａａＣｔｇＧＣａＧＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
ＣＲＭ００１６ ＣＧａＡＴＡｇＴｔａＧＴＡｇＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
ＣＲＭ００１７ ＦＡＭ標識ＣＧａＡＴＡｇＴｔａＧＴＡｇＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
表１では、大文字は、ＬＮＡで修飾され、小文字は、未修飾である。ｍｉＲ－２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の配向は５’から３’である。１つのＰＳ（ホスホロチオエート）結合は、各抗ｍｉＲ－２２化合物において１つのＰＯ（ホスホジエステル）結合で置換される。ホスホロチオエート結合は、表１において＊で示される。
比較のために、ＣＲＭ００１０、別称ＬＮＡ－１０、またはＲＥＳ－０１０もオリゴに含まれている。
（実施例２：ｍｉＲ－２２ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いた抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチド化合物のインビトロ効力の評価）
（細胞株）
ヒト肝癌細胞株ＳＫ－Ｈｅｐ－１およびＨｕｈ－７Ｄ１を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、英国）から購入した。ＳＫ－Ｈｅｐ－１細胞株を、１０％ＦＢＳ（シグマ）、１％グルタミン（２ｍＭ、シグマ）、１％Ｐ／Ｓ（シグマ）、１％ＮＥＡＡ（シグマ）、１％ピルビン酸ナトリウム溶液（１ｍＭ ＮａＰ、滅菌濾過、シグマ）を添加したＥＭＥＭ（シグマ）で培養した。Ｈｕｈ－７Ｄ１２細胞は、１０％ＦＢＳ（シグマ）、１％グルタミン（２ｍＭ、シグマ）、１％Ｐ／Ｓ（シグマ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ）で培養した。全ての細胞培養を、５％ ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。細胞数を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてカウントした。
（ｍｉＲ－２２ルシフェラーゼレポータープラスミドの作製）
ｍｉＲ－２２完全一致（ＰＭ）標的部位レポーターは、ｍｉＲ－２２のＰＭ部位（１ｘＰＭ）をＰｓｉＣＨＥＣＫＴＭ２ベクター（Ｃ８０２１、Ｐｒｏｍｅｇａ）のレニラルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）下流の多重クローニング部位にクローニングすることによって作製した。簡単に述べると、Ｘｈｏｌ（５’）およびＮｏｔｌ（３’）オーバーハングを含むＰＭプライマー対を、ｍｉＲ－２２ ＰＭセンス、ＣＴＣＧＡＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、ｍｉＲ－２２ ＰＭアンチセンス、ＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）のプライマーを用いて作製した。プライマーのアニーリング（１０分、８５℃、その後１℃／分で４℃まで冷却）後、ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）－２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃ８０２１）をＮＥＢ－ｂｕｆｆｅｒ ３．１（ＮＥＢ Ｂ７２０３Ｓ）中、ＮｏｔＩ（ＮＥＢ Ｒ０１８９Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ Ｒ０１４６Ｓ）とで３７℃、２時間消化した。酵素を６５℃で１５分間熱不活性化し、プラスミドＤＮＡ精製Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｑｕｉｃｋｐｕｒｅ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １１９０２３６２）を用いてプラスミドを精製した。プラスミドとＰＣＲ断片とをＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ Ｍ０２０２Ｓ）を用いて室温で１時間ライゲーションした。ライゲーションミックスをＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｃ４０４０－０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ５３５４）を加えたＬＢ－プレート（ＡＧＡＲ（Ｍｉｌｌｅｒ）Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌ３１４７を含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ）に伝播させ、３７℃で一晩培養した。コロニーを２ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（ＬＢ Ｂｒｏｔｈ （Ｍｉｌｌｅｒ） Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌ３５２２）中で採取し、３７℃で一晩振盪培養した。選択したコロニーのインサートを確認するために、共通のフォワードプライマー（ＣＴＡＴＴＧＴＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、ｈｌｕｃ遺伝子に位置する）とインサートに特異的なリバースプライマー（ｍｉＲ－２２リバース、ＣＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５））を用いて、１，５％アガロースゲルで目的の特異的断片を増幅した（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）バイオシステムを適用したＤＮＡポリメラーゼ、４３１１８０６）。プラスミドをＱｕｉｃｋＬｙｓｅ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ ２７４０５）を用いて精製し、次ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ２共通フォワード、ＣＴＡＴＴＧＴＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ２共通リバース、ＧＣＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）のプライマーを用いてＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓで配列決定した。最後に、確認されたｍｉＲ－２２ルシフェラーゼレポータープラスミドを５０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐで一晩培養し、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ １２３６２）を用いて精製した。
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチドおよびｍｉＲ－２２ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＰｓｉＣＨＥＣＫ ２－ｍｉＲ－２２ ＰＭ）のトランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８－０１９）を用いてＳＫ－Ｈｅｐ－１およびＨｕｈ－７Ｄ１２で行った。簡単に説明すると、トランスフェクションの１日前に、細胞をコラーゲンでコートした９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェルホワイトポリスチレンマイクロプレート、Ｓｉｇｍａ ＣＬＳ３６１０－４８ＥＡ）にプレーティングした（トランスフェクション時には８０－９０％コンフルエント）。リポフェクタミン混合液（ＳＫ－Ｈｅｐ－１：５μｇ／ｍＬ、Ｈｕｈ－７Ｄ１２：２．５μｇ／ｍＬ）を添加する前に、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５１９８５－０２６）で一度洗浄した。プラスミド（０．０００１μｇ／μＬ）および抗Ｒ－２２オリゴヌクレオチド（最終濃度１．０、０．２、または０．０４ｎＭ）を添加する前に、細胞をＲＴで７分間インキュベートした。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした後、ＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄した。７５μＬの培地を加えた後、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で２０時間培養した。ルシフェラーゼ活性（ホタルおよびウミシイタケ）を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ２９２０）を用いて、製造元のプロトコールに従って測定した。バックグラウンド減算後、各ウェル内のレニラ活性をホタルに対して正規化した（ウミシイタケ／ホタル）。抗Ｒ－２２オリゴヌクレオチドの効力をＣＲＭ００１０と比較した。データを図１のＡ－Ｆに報告する。ＮＲＣ０１３１、ＮＲＣ０１３３およびＮＲＣ０１３４は、ＣＲＭ００１０と比較して０．２ｎＭ濃度においてより効力があるようである。
米国特許第６，４０３，５６６号明細書 米国特許第６，６９３，１８７号明細書 米国特許第７，０６７，６４１号明細書 米国特許第６，８３８，２８３号明細書 米国特許第５，９８１，５０５号明細書 米国特許第６，２１７，９００号明細書 米国特許第６，３８３，５１２号明細書 米国特許第５，７８３，５６５号明細書 米国特許第７，２０２，２２７号明細書 米国特許第６，３７９，９６５号明細書 米国特許第６，１２７，１７０号明細書 米国特許第５，８３７，５３３号明細書 米国特許第６，７４７，０１４号明細書 国際公開第０３／０９３４４９号

Claims (16)

  1. ｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）からなる配列を有する核酸を含むｍｉＲ－２２阻害組成物であって、前記核酸は、少なくとも６個、または少なくとも８個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む、ｍｉＲ－２２阻害組成物。
  2. 前記核酸は、少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む、請求項１に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  3. 前記核酸は、１０個または１１個のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む、請求項１に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  4. 前記核酸は、１０個または１１個のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾は、少なくとも１位、２位、６位、１１位、１７位、１８位にある、請求項１に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  5. 前記核酸は、１１個のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾は、少なくとも１位、２位、５位、６位、１１位、１４位、１７位、１８位にある、請求項１に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  6. 前記核酸配列中の少なくとも１つのＰＳ（ホスホロチオエート）結合は、１つのＰＯ（ホスホジエステル）結合で置換されている、請求項１に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  7. １つのＰＳ結合は、１つのＰＯ結合で置換されている、請求項６に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  8. 前記ＰＯ結合は、少なくとも６位、８位、１０位または１４位である、請求項６または７に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  9. 前記ＰＯ結合は、１つのみであり、前記結合は、６位、１０位または１４位である、請求項６または７に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  10. 前記核酸は、ＧＴｔｃＴＴＣａＡｃＴＧｇＣａｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ＧＴｔＣｔＴｃＡａＣＴｇｇｃＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、およびＧＴｔｃＴＴｃＡａＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）からなる群から選択される配列を有し、大文字は、ＬＮＡ修飾であり、小文字は、未修飾である、請求項１に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  11. 前記核酸は、Ｇ＊Ｔ＊ｔ＊ｃ＊Ｔ＊ＴＣ＊ａ＊Ａ＊ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｇ＊Ｃ＊Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、Ｇ＊Ｔ＊ｔ＊Ｃ＊ｔ＊Ｔ＊ｃ＊Ａ＊ａ＊ＣＴ＊ｇ＊ｇ＊ｃ＊Ａ＊ｇ＊Ｃ＊Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、およびＧ＊Ｔ＊ｔ＊ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊ｃ＊Ａ＊ａ＊Ｃ＊ｔ＊ｇ＊Ｇ＊ＣＡ＊ｇ＊Ｃ＊Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）からなる群から選択される配列を有し、大文字は、ＬＮＡ修飾であり、小文字は、未修飾であり、記号＊は、ＰＳ結合を示し、記号＊がない場合は、ＰＯ結合を示す、請求項１に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物。
  12. 上記請求項のいずれか一項に記載の核酸と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
  13. 上記請求項のいずれか一項に記載の核酸分子をコードする配列を含むベクターまたはプラスミド。
  14. 上記請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
  15. ｍｉＲ－２２を、請求項１から１１のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２２阻害組成物と接触させることを含む、ｍｉＲ－２２を阻害する方法。
  16. 代謝異常の治療に使用するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
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