JP2024057599A - マイクロrna22の阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】miR-22阻害組成物を提供する。【解決手段】一態様として、gttcttcaactggcagctからなる配列を有する核酸を含むmiR-22阻害組成物であって、前記核酸は、少なくとも6個、または少なくとも8個のロック核酸修飾を含む、miR-22阻害組成物である。【選択図】なし
Description
マイクロRNA(miRNA)は、多くの発生および細胞過程における遺伝子発現の重要な転写後制御因子として機能し、広範なヒト疾患の発症機序および進行に関与している。miRNAは、治療介入のための新しい標的クラスとなっており、したがって、miRNA活性miRを調節する組成物および方法が必要とされている。
マイクロRNA-22(miR-22)は、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、およびウマを含む多くの脊椎動物種にわたって高度に保存されている。この保存レベルは、機能的重要性を示唆している。MiR-22は、以前、赤血球の成熟に関与していることが同定され、その後、がん化に関与していることが明らかになった。MiR-22は、ホスファターゼテンシンホモログ(PTEN)およびテトメチルシトシンジオキシゲナーゼ(TET)を直接標的とし、腫瘍形成、転移、および代謝障害を促進する。いくつかのグループによる最近の文献は、miR-22が線維芽細胞増殖因子21(FGF-21)のような肝臓代謝の重要要素を制御し得る方法をも示している。Hu Y.らは、JHEP Rep.2020,2(2):100093には、miR-22阻害剤によって誘導された肝FGF21およびFGFR1の増加が、AMPKおよびERK1/2の活性化をもたらし、マウスモデルにおけるアルコール性脂肪症の治療に有効であったことを記載している。さらに、転写因子ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベータ1α(PGC1α)に対するmiR-22の既知の効果は、miR-22レベルが肝臓および白色脂肪組織を含む様々な組織の代謝状態をいかに制御し得るかを証明している。
本開示は、miR-22機能を薬理学的に阻害するための新規組成物および方法を提供する。このような阻害は、例えば、ロック核酸(LNA)修飾アンチmiRオリゴヌクレオチドを含む、成熟miR-22配列に相補的な化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、いわゆる抗miRによって媒介され得る。1つの態様では、本発明は、抗miR-22阻害剤組成物を提供する。本開示は、miR-22機能が存在する場合、薬理学的に阻害するための新規組成物および方法を提供する。
本開示は、例えばマイクロRNAの発現および/または活性を阻害することによって、miR-22を阻害するための新規組成物および方法を提供する。
特定の理論に縛られることを望むものではないが、成熟miRNAは、pol IIまたはpol IIIによって生成され、pri-miRNAと呼ばれる最初の転写物から生じると考えられている。これらのpri-miRNAは、数千塩基長であることが多く、そのため、より短い成熟miRNAを作るために処理される。これらのpri-miRNAは、マルチシストロニックであり得、多くのmiRNAに発展し得るものを組織化するいくつかのクラスター配列の転写から生じる。miRNAを得るためのプロセシングは、2段階あり得る。まず、pri-miRNAは、核内でRNase Droshaによって、約70から約100ヌクレオチドのヘアピン状の前駆体(pre-miRNA)にプロセシングされ得る。次に、細胞質への転移後、ヘアピンpre-miRNAは、RNase Dicerによってさらに処理され、二本鎖のmiRNAが生成される。成熟miRNA鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ得、これは、標的mRNAと塩基対の相補性によって結合し、タンパク質の発現を抑制する。RISCサイレンシング複合体に入るために優先的に選択されないmiRNA二重鎖のもう一方の鎖は、パッセンジャー鎖またはマイナーmiRNA、あるいはスター(*)鎖として知られている。この鎖は、分解され得る。本明細書で使用されるmiRNAは、別段の指定がない限り、pri-および/またはpre-および/または成熟および/またはマイナー(スター)鎖および/または二重鎖バージョンのmiRNAを指し得ることが理解されたい。
いくつかの実施形態では、miRNA遺伝子は、タンパク質コード遺伝子のイントロン内、または非コード転写ユニットのイントロンもしくはエクソン内に位置し得る。イントロンmiRNAの発現は、それらが通常同じ方向に向いておりそれらが存在するプレmRNAと協調して発現されるため、ホスティング転写ユニットの発現と一致し得る。
いくつかの実施形態では、miRNAは、標的遺伝子転写物の3’非翻訳領域(3’UTR)内の配列に結合し得る。いくつかの実施形態では、miRNAは、標的遺伝子転写物の3’UTR外の配列に結合し得る。いくつかの実施形態では、miRNAは、標的遺伝子転写物の3’UTR内外の両方に結合し得る。
いくつかの実施形態では、標的認識のために、miRNAの第2ヌクレオチドおよび第7ヌクレオチド(miRNAシード配列)と標的3’UTRに沿った対応する配列(シードマッチ)との間のヌクレオチド対合が起こり得る。従って、miRNAと標的との間の結合は、約5ヌクレオチドの塩基対を含み得る。さらに、miRNAと標的との間の結合は、5ヌクレオチド超の塩基対を含み得る。いくつかの実施形態では、miRNAとそれが制御する遺伝子との間の結合は、miRNAが標的核酸の最大2個、最大4個、最大6個、最大8個、または最大10個の部位に結合することによって媒介され得る。
(マイクロRNA-22(miR-22))
MiR-22は、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ウマなど多くの脊椎動物種にわたって高度に保存されている。この保存レベルは、機能的重要性を示唆している。MiR-22は、以前、赤血球の成熟に関与することが明らかにされ、その後、がん化に関与することが明らかにされた。MiR-22は、ホスファターゼテンシンホモログ(PTEN)とテトメチルシトシンジオキシゲナーゼ(TET)とを直接標的とし、腫瘍形成、転移、代謝障害を促進する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、PTENおよび/またはTET2の活性および/または発現を増加させる。
MiR-22は、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ウマなど多くの脊椎動物種にわたって高度に保存されている。この保存レベルは、機能的重要性を示唆している。MiR-22は、以前、赤血球の成熟に関与することが明らかにされ、その後、がん化に関与することが明らかにされた。MiR-22は、ホスファターゼテンシンホモログ(PTEN)とテトメチルシトシンジオキシゲナーゼ(TET)とを直接標的とし、腫瘍形成、転移、代謝障害を促進する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、PTENおよび/またはTET2の活性および/または発現を増加させる。
予測されるmiR-22ヘアピン前駆体は、非コード転写物であるCl7orf91のエクソン2内に完全に含有されており、タンパク質をコードする可能性がないにもかかわらず、スプライシングパターンは、概してヒトとマウスとで保存される。Rodriguezら、「哺乳類マイクロRNA宿主遺伝子および転写ユニットの同定」、Genome Research 2004年10月14日(10A):1902-10を参照されたい。マウスモデルでmir-22を包含するC17orf91のエクソン2を欠失させると、miR-22は、SIRT1(NAD依存性脱アセチル化酵素サーチュイン-1)、HDAC4(ヒストン脱アセチル化酵素4)、PURB(プリンリッチエレメント結合タンパク質B)、PTENを標的とすることによって、心肥大とリモデリングとに関与し得ることが明らかになった。Gurhaら、「Targeted deletion of microRNA-22 promotes stress-induced cardiac dilation and contractile dysfunction」、Circulation. 2012年6月5日、125(22):2751-61、およびHuangら、「MicroRNA-22 regulates cardiac hypertrophy and remodelling in response to stress」、Circulation Research 2013年4月26日、112(9):1234-43を参照されたい。
(miR-22の阻害剤)
実施形態では、miRNAの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する核酸である。本発明の核酸は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。本発明の核酸は、少なくとも1つの化学修飾(非限定的な例としては、糖または骨格の修飾、例えば、ロック核酸(LNA))を有し得る。
実施形態では、miRNAの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する核酸である。本発明の核酸は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。本発明の核酸は、少なくとも1つの化学修飾(非限定的な例としては、糖または骨格の修飾、例えば、ロック核酸(LNA))を有し得る。
実施形態では、miR-22を阻害する核酸の配列は、種を超えて保存される。実施形態では、核酸の配列は、ヒトmiR-22の配列に部分的に相補的である。実施形態では、阻害剤は、細胞または対象のmiR-22の発現および/または活性を低下させるように選択される。
実施形態では、本発明の核酸は、ヒトmiR-22を阻害する。実施形態では、ヒトmiR-22は、AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU(SEQ ID NO:1)を含むかまたはそれからなる。
実施形態では、本発明の核酸は、約8~約20残基の長さ(例えば、約8~18残基、または約8~16残基、または約8~14残基、または約8~12残基、または約8~10残基、または約10~18残基、または約10~16残基、または約10~14残基、または約10~12残基)である。実施形態では、核酸は、約8残基、または約9残基、または約10残基、または約11残基、または約12残基の長さである。
実施形態では、本発明の核酸は、miR-22の一部と完全な相同性で結合する。例えば、本発明の核酸は、18残基の長さであり得、18残基の各々は、miR-22のヌクレオチドと相補的である。あるいは、本発明の核酸は、miR-22の一部と完全な相同性をもって結合する。例えば、本発明の核酸の長さは、16残基であり得、miR-22のヌクレオチドと相補的な残基は、15残基以下である。
実施形態では、本発明の核酸は、miR-22の一部と、1位、2位、3位、4位、5位、または6位以上で異なる。
実施形態では、本発明の核酸は、miR-22を阻害するのに十分な親和性でmiR-22に結合する。実施形態では、核酸は、高い親和性(例えば、nM親和性)でmiR-22に結合する。したがって、本発明の核酸は、miR-22の一部と1つ以上の位置で異なっていても、高い親和性でmiR-22に結合する。
本発明の核酸は、tggcagct(SEQ ID NO:2)を含み得、少なくとも1個のロック核酸(LNA)修飾を含む配列を有し得る。
ロック核酸(LNA)では、核酸のリボース部分が、2’酸素と4’炭素とをつなぐ余剰架橋で修飾され、リボースが3’-エンドコンフォメーションにロックされる。本発明の核酸、およびLNAを含む核酸は、様々な障害の治療および予防のために、効率的に送達され、十分な生物学的利用能を有する、費用効果の高い薬剤を提供する。
実施形態では、本発明の核酸は、その3’末端に向けて少なくとも2個のLNA修飾(例えば、その3’末端に向けて約2個、または約3個、または約4個、または約5個の修飾)を含む。実施形態では、核酸は、tggcagct(SEQ ID NO:2)、および少なくとも6個のLNA修飾または少なくとも8個のLNA修飾を含む。
例えば、核酸は、tggcagct(SEQ ID NO:2)の7位および8位におけるLNA修飾を含む。実施形態では、本発明の核酸は、4個以下の連続したLNA修飾(例えば、2個、または3個、または4個の連続したLNA修飾のみ)を含む。実施形態では、本発明の核酸は、3個以下の連続した非修飾残基(例えば、3個、または2個、または1個の非修飾残基のみ)を含む。実施形態では、本発明の核酸は、4個以上のLNA修飾を含む。実施形態では、核酸は、約8~約12個のLNA修飾、例えば約8個、または約9個、または約10個、または約11個、または約12個のLNA修飾を含む。
実施形態では、核酸は、tggcagct(SEQ ID NO:2)、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)、ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)、およびgttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)から選択される配列を有する核酸を含むか、またはそれからなる。実施形態では、核酸は、tggcagct(SEQ ID NO:2)、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)、ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)、およびgttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)から選択される配列を有し、約8~約12個のLNA修飾、例えば、約8個、または約9個、または約10個、または約11個、または約12個のLNA修飾を含む、核酸を含む。
実施形態では、核酸は、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)、および少なくとも6個のLNA修飾、少なくとも8個のLNA修飾、または少なくとも10個のLNA修飾からなるか、またはそれらからなる。実施形態では、核酸は、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)および8個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、1位、3位、6位、7位、10位、12位、14位、および15位にあり、例えば、核酸は、配列CtTcaACtgGcAgCT(SEQ ID NO:7)を含むかまたはそれらからなり、大文字はLNA修飾であり、小文字は非修飾である。実施形態では、核酸は、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)および10個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、1位、2位、3位、6位、7位、10位、11位、12位、14位、および15位にあり、例えば、核酸は、配列CTTcaACtgGCAgCT(SEQ ID NO:8)を含むかまたはそれらからなり、大文字はLNA修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)、および少なくとも8個のLNA修飾、少なくとも10個のLNA修飾、または少なくとも11個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなる。実施形態では、核酸は、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)および10個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、1位、2位、4位、8位、10位、11位、12位、13位、15位、および16位にあり、例えば、核酸は、配列TCtTcaaCtGGCAgCT(SEQ ID NO:10)を含むかまたはそれらからなり、大文字はLNA修飾であり、小文字は非修飾である。実施形態では、核酸は、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)および11個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、1位、2位、4位、5位、6位、8位、11位、12位、13位、15位、および16位にあり、例えば、核酸は、配列TCtTCAaCtgGCAgCT(SEQ ID NO:9)を含むかまたはそれらからなり、大文字はLNA修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)および11個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、1位、2位、4位、5位、6位、9位、11位、12位、13位、15位、および16位にあり、例えば、核酸は、配列TCtTCAacTgGCAgCT(SEQ ID NO:11)を含むかまたはそれらからなり、大文字はLNA修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)、および少なくとも10個のLNA修飾、または少なくとも11個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなる。実施形態では、核酸は、ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)および11個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、1位、2位、5位、6位、7位、10位、12位、13位、14位、16位、および17位にあり、例えば、核酸は、配列TTctTCAacTgGCAgCT(SEQ ID NO:12)を含むかまたはそれらからなり、大文字はLNA修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)、および少なくとも9個のLNA修飾、または少なくとも10個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなる。実施形態では、核酸は、gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)および9個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなり、当該修飾は、1位、2位、6位、10位、13位、14位、16位、17位、および18位にあり、例えば、核酸は、配列GTtctTcaaCtgGCaGCT(SEQ ID NO:13)を含むかまたはそれらからなり、大文字はLNA修飾であり、小文字は非修飾である。
実施形態では、核酸は、tggcagct(SEQ ID NO:2)、およびgttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)から選択される配列を有し、約8~約12個のLNA修飾、例えば、約8個、または約9個、または約10個、または約11個、または約12個のLNA修飾を含む、核酸を含むかまたは核酸からなる。
実施形態では、核酸は、gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)、および少なくとも9個のLNA修飾、または少なくとも10個のLNA修飾、または少なくとも11個のLNA修飾、または少なくとも12個のLNA修飾を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態では、核酸は、少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個のロック核酸(LNA)修飾を含む。
一実施形態では、核酸は10個または11個のロック核酸(LNA)修飾を含む。
一実施形態では、核酸はgttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)からなり、10個または11個の修飾を含み、当該修飾は、少なくとも1位、2位、6位、11位、17位、18位にある。
一実施形態では、核酸はgttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)からなり、11個の修飾を含み、当該修飾は、少なくとも1位、2位、5位、6位、11位、14位、17位、18位にある。
一実施形態では、核酸はgttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)からなり、少なくとも1つのPS(ホスホロチオエート)結合は、1つのPO(ホスホジエステル)結合で置換されている。
一実施形態では、核酸は、gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)からなり、1つのPS結合は、1つのPO結合で置換されている。
一実施形態では、当該PO結合は、少なくとも6位、8位、10位、14位にある。
一実施形態では、当該PO結合は、1つのみであり、それは6位、10位、または14位にある。
例えば、核酸は、配列GTTctTcAAcTGgCAgCT(SEQ ID NO:16)を含むかまたはそれからなり、大文字は、LNA修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列GTtcTTCaAcTGgCagCT(SEQ ID NO:17)を含むかまたはそれからなり、大文字は、LNA修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列GTtcTTcAaCTGgCAgCT(SEQ ID NO:18)を含むかまたはそれからなり、大文字は、LNA修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列GTtCtTcAaCTggcAgCT(SEQ ID NO:19)を含むかまたはそれからなり、大文字は、LNA修飾であり、小文字は、非修飾である。
例えば、核酸は、配列GTtcTTcAaCtgGCAgCT(SEQ ID NO:20)を含むかまたはそれからなり、大文字は、LNA修飾であり、小文字は、非修飾である。
本発明は、miR-22を阻害する方法を提供する。本方法は、miR-22を、本明細書中に記載される態様または実施形態の核酸であるmiR-22の阻害剤を含む組成物と接触させることを含む。
別の態様では、本発明は、gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)からなる配列を有する核酸を含むmiR-22阻害組成物を提供し、核酸は、少なくとも6個、または少なくとも8個のロック核酸(LNA)修飾を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個のロック核酸(LNA)修飾を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも10個、または少なくとも11個のロック核酸(LNA)修飾を含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、10個または11個のLNA修飾を含み、当該修飾は少なくとも1位、2位、6位、11位、17位、18位にある。
いくつかの実施形態では、核酸は、11個のLNA修飾を含み、当該修飾は少なくとも1位、2位、5位、6位、11位、14位、17位、18位にある。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも1つのヌクレオチド間結合を含み、ヌクレオチド間結合は、1つのPO(ホスフィンオキシド)結合で置換されたPS(ホスホロチオエート)結合である。
いくつかの実施形態では、1つのPS結合は、1つのPO結合で置換されている。
いくつかの実施形態では、PO結合は少なくとも6位、8位、10位、または14位にある。
いくつかの実施形態では、PO結合は1つだけであり、PO結合は6位、10位、または14位にある。
いくつかの実施形態では、核酸は、GTtcTTCaAcTGgCagCT(SEQ ID NO:17)、GTtCtTcAaCTggcAgCT(SEQ ID NO:19)、またはGTtcTTcAaCtgGCAgCT(SEQ ID NO:20)からなる群から選択される配列を有する核酸を含み、大文字はLNA修飾であり、小文字は未修飾である。
いくつかの実施形態では、核酸は、G*T*t*c*T*TC*a*A*c*T*G*g*C*a*g*C*T(SEQ ID NO:17)、G*T*t*C*t*T*c*A*a*CT*g*g*c*A*g*C*T(SEQ ID NO:19)、G*T*t*c*T*T*c*A*a*C*t*g*G*CA*g*C*T(SEQ ID NO:20)からなる群から選択される配列を有する核酸を含み、大文字は、LNA修飾、小文字は、未修飾、記号*はPS結合を示し、*記号がない場合はPO結合を示す。
別の態様では、本発明は、本明細書に提供されるいずれか1つの態様または実施形態の核酸、および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される実施形態のいずれかの核酸のための配列を含むベクターまたはプラスミドを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される実施形態のいずれか1つの核酸を含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、miR-22を、先の実施形態のいずれか1つのmiR-22阻害組成物と接触させることを含む、miR-22を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、被験体における代謝障害を治療する方法を提供し、本方法は、被験体に医薬組成物を投与することを含む。
実施形態では、上記の配列からなる核酸は、本明細書に記載された配列の5’に追加ヌクレオチドをさらに含み、および/または本明細書に記載された配列の3’に追加ヌクレオチドをさらに含み得る。追加ヌクレオチドは、未修飾であり得るか、または修飾され得る(例えばLNAまたは追加の化学修飾など)。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、追加化学修飾をさらに含み得る。例として、化学修飾は、ホスホロチオエート、2’-O-メチル、または2’-O-メトキシエチル、2’-O-アルキル-RNAユニット、2’-OMe-RNAユニット、2’-アミノ-DNAユニット、2’-フルオロ-DNAユニット(2’位(2’F)にフッ素への置換を有するDNA類似体を含むが、これに限定されない)、LNAユニット、PNAユニット、HNAユニット、INAユニット、および2’MOE RNAユニットの1つ以上である。
適切な核酸は、BSNを含有するオリゴヌクレオチドとその相補的なmiRNA標的鎖との間に形成される複合体に、熱安定性を向上させる1つ以上のコンフォメーション拘束性または二環糖ヌクレオシド修飾(BSN)で構成され得る。例えば、一実施形態では、核酸は、少なくとも1個のロック核酸を含有する。ロック核酸(LNA)は、リボース糖部分がロックコンフォメーションにある2’-0,4’-C-メチレンリボヌクレオシド(構造A)を含有する。別の実施形態では、核酸は、少なくとも1つの2’,4’-C-架橋2’デオキシリボヌクレオシド(CDNA、構造B)を含有する。例えば、どちらもその全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第6,403,566号明細書およびWangら(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters、第9巻:1147-1150を参照されたい。さらに別の実施形態では、核酸は、構造Cに示す構造を有する少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含有する。脂肪関連の代謝および合成経路標的を制御するmiRNAを標的とする核酸は、BSN(LNA、CDNAなど)または他の修飾ヌクレオチド、およびリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含有し得る。
あるいは、核酸は、ペプチド核酸(PNA)で構成され得、これは、糖-リン酸骨格ではなく、ペプチドベースの骨格を含有する。核酸に対する他の修飾糖またはホスホジエステルの修飾も考えられる。非限定的な例として、他の化学修飾としては、2’-o-アルキル(例えば、2’-O-メチル、2’-o-メトキシエチル)、2’-フルオロ、および4’-チオ修飾、ならびに1つ以上のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾が挙げられ得る(例えば、それの全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第6,693,187号明細書および米国特許第7,067,641号明細書を参照されたい。)一実施形態では、発がん性miRNAを標的とする核酸は、各塩基上に2’-O-メチル糖修飾を含有し、ホスホロチオエート結合によって結合されている。核酸、特に短い長さの核酸(例えば、16ヌクレオチド未満、7-8ヌクレオチド)は、LNA、二環ヌクレオシド、ホスホノホルメート、2’o-アルキル修飾などであるがこれらに限定されないような、1つ以上の親和性を高める修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、好適な核酸は、2’-O-メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを5’末端と3’末端の両方に含有し、中心に少なくとも10個のデオキシリボヌクレオチドを有する2’-O-メトキシエチルギャマーである。これらのギャップマーは、RNA標的のRNase H依存性分解メカニズムを誘発し得る。参照によってその全体が本明細書に援用される米国特許第6,838,283号明細書に記載されているような、安定性を高め有効性を改善するための核酸の他の修飾は、当技術分野で既知であり、本発明の方法での使用に適している。例えば、限定するつもりはないが、in vivoでの送達と安定性とを促進するために、核酸は、その3’末端においてステロイド、例えばコレステロール部分、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または他の低分子リガンドと連結し得る。
本明細書で使用されるとき、実質的に相補的とは、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%相補的な配列を指す(非限定的な例としては、例えばmiR-22の成熟、マイナー、前駆体miRNA、またはpri-miRNA配列が挙げられる)。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、アンタゴミルである。アンタゴミルは、一本鎖で化学修飾されたリボヌクレオチドであり、miRNAと少なくとも部分的に相補的であるため、それらを発現停止させ得る。例えば、Kriitzfeldtら、Nature(2005)438(7068):685-9を参照されたい。アンタゴミルは、2’-O-メチル-糖修飾などの、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態では、アンタゴミルは、修飾ヌクレオチドのみからなる。アンタゴミルは、また、部分的または完全なホスホロチオエート骨格をもたらす1つ以上のホスホロチオエート結合を含み得る。インビボでの送達と安定性とを促進するために、アンタゴミルは、その3’末端でコレステロールや他の部位と結合させ得る。阻害に適したアンタゴミルは、長さ約15~約50ヌクレオチド、長さ約18~約30ヌクレオチド、長さ約20~約25ヌクレオチドであり得る。アンタゴミルは、成熟またはマイナーがん原性miRNA配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%相補的である。いくつかの実施形態では、アンタゴミルは、成熟またはマイナーがん原性miRNA配列と実質的に相補的であり得、それは、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、または99%相補的である。他の実施形態では、アンタゴミルは、成熟またはマイナーがん原性miRNA配列に100%相補的である。
本発明の核酸は、発がん性miRNAの前駆体miRNA配列(pre-miRNA)または一次miRNA配列(pri-miRNA)と実質的に相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、そのmiRNAの標的の3’-非翻訳領域の外側に位置する配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、そのmiRNAの標的の3’-非翻訳領域の内側に位置する配列を含む。
実施形態では、核酸は、限定されたまたは全く自己結合親和性を有さない。実施形態では、核酸は、限定されたまたは全く二重鎖構造を有さない。実施形態では、核酸は、限定されたまたは全くフォールド構造を有さない。
本発明の核酸は、miRNA阻害剤またはアゴニストをコードする発現ベクターを細胞に送達することによって、標的細胞に送達し得る。ベクターは、目的の核酸を細胞内部に送達するために使用され得る物質組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスなどを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、ベクターという用語には、自己複製プラスミドまたはウイルスも含まれる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。発現コンストラクトは、生きた細胞で複製され得るか、または合成的に作製され得る。本出願において、発現構築物、発現ベクター、およびベクターという用語は、一般的、例示的な意味で本発明の適用を示すために互換的に使用されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
一実施形態では、本発明の核酸を発現するための発現ベクターは、本発明の核酸をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。本明細書で使用される「作動可能に連結されている」または「転写制御下にある」という表現は、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置および向きにあることを意味する。
本明細書で使用されるとき、プロモーターは、遺伝子の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成装置、または導入された合成装置によって認識されるDNA配列を指す。適切なプロモーターとしては、RNA pol I、pol II、pol III、およびウイルスプロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)即時型初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、およびRous肉腫ウイルス長末端リピート)が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明の核酸をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当技術分野で知られており、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインIIAプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド/甲状腺ホルモン/レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRが挙げられるが、これらに限定されない。
発現構築物および核酸を細胞に送達する方法は、当技術分野で既知であり、非限定的な例として、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、DEAE-デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション、細胞超音波処理、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子ボンバードメント、および受容体媒介トランスフェクションが挙げられ得る。
本発明の一態様は、本明細書に記載した本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。
本発明のもう一つの態様は、miR-22を阻害する方法を提供する。本方法は、miR-22を、本明細書中に記載される本発明の任意の核酸であるmiR-22阻害組成物と接触させることを含む。本方法は、in vitroまたはin vivoであり得る。
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載される任意の本発明の核酸と、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。
臨床応用が意図される場合、医薬組成物は、意図される応用に適した形態で調製され得る。概して、これは、パイロジェン、およびヒトまたは動物に有害な可能性のある他の不純物を本質的に含まない、組成物を調製することを必要とする。
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される有効量の本発明の核酸を含む。有効量は、有益または望ましい臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、約1mg/kg~約100mg/kg、約2.5mg/kg~約50mg/kg、または約5mg/kg~約25mg/kgであり得る。何が有効量とみなされるかの正確な決定は、患者の体格、年齢、代謝異常のタイプ、阻害剤またはアゴニストの性質(非限定的な例として、アンタゴミル、発現構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二重鎖など)など、各患者に固有の要因に基づき得る。したがって、投与量は、本開示および当技術分野の知識から、当業者であれば容易に見出し得る。例えば、投与量は、その全体が参照によって本明細書に援用される、Physicians’ Desk Reference,66th Edition,PDR Network、2012 Edition(2011、12、27)を参照して決定され得る。
高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質をベースとする系などのコロイド分散系は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸の送達ビヒクルとして使用され得る。本開示の核酸を脂肪組織(例えば、脂肪細胞)に送達するのに適した市販の脂肪乳剤としては、INTRALIPIDO、LIPOSYN(登録商標)、LIPOSYN(登録商標)II、LIPOSYN(登録商標)III、Nutrilipid、および他の類似の脂質乳剤が挙げられる。生体内送達ビヒクルとして使用するコロイド系は、リポソーム(すなわち、人工膜小胞)である。このようなシステムの調製と使用とは、当技術分野で既知である。例示的な製剤は、米国特許第5,981,505号明細書、米国特許第6,217,900号明細書、米国特許第6,383,512号明細書、米国特許第5,783,565号明細書、米国特許第7,202,227号明細書、米国特許第6,379,965号明細書、米国特許第6,127,170号明細書、米国特許第5,837,533号明細書、米国特許第6,747,014号明細書、および国際公開第03/093449号にも開示されており、これらは参照によってその全体が本明細書に援用される。
概して、送達ビヒクルを安定化させ、標的細胞に取り込ませるために、適切な塩類および緩衝剤を使用することが望ましい。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された、本明細書に記載される本発明の任意の核酸を含む送達ビヒクル(例えば、リポソームまたは他の複合体または発現ベクター)の有効量を含む。薬学的に許容されるあるいは薬理学的に許容されるという表現は、動物もしくはヒトに投与しても有害反応、アレルギー反応、またはその他の有害反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用されるとき、薬学的に許容される担体は、ヒトへの投与に適した医薬などの医薬の製剤化に使用するのに許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。このような媒体および薬剤を薬学的活性物質に使用することは、当技術分野で既知である。従来の媒体または薬剤が本発明の有効成分と不適合である場合を除き、治療用組成物への使用が企図されている。組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活性化しない場合に限り、補助的な活性成分も組成物に組み込まれ得る。
医薬品の形態としては、例えば、無菌の水溶液または分散液、無菌の注射液または分散液を即座に調製するための無菌の粉末などがある。概して、これらの製剤は、無菌であり、注射しやすい程度に流動性がある。製剤は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。適切な溶媒または分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤を使用し、分散液の場合は、必要な粒子径を維持し、界面活性剤を使用することで維持し得る。微生物の作用を防ぐには、さまざまな抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを使用する。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射用組成物の吸収の延長は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤の組成物への使用によってもたらされる。
無菌注射液は、本明細書に記載された本発明の核酸を、所望の他の成分(例えば、上記に列挙したような)と共に溶媒に適量取り込み、次いで濾過滅菌することによって調製され得る。概して、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒と、例えば上記に列挙したような所望の他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法には、真空乾燥および凍結乾燥技術が含まれ、これによって、あらかじめ無菌濾過した溶液から、有効成分(単数または複数)および任意の追加所望成分の粉末が得られる。
製剤化の際、溶液は、投与製剤と適合する方法で、および治療上有効な量で、投与され得る。
本明細書に開示された発明をより効率的に理解するために、下記に実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる方法においても本発明を限定するものとして解釈されるものではない。
(実施例1:LNA修飾抗miR-22オリゴヌクレオチドの設計)
すべてのLNA抗miR-22はヒトとマウスの両方で有用である。宿主遺伝子は、ヒトとマウスとの間で49%の相補性を示した。LNA抗HG-miR-22は、主にヒトにおいて機能する。
すべてのLNA抗miR-22はヒトとマウスの両方で有用である。宿主遺伝子は、ヒトとマウスとの間で49%の相補性を示した。LNA抗HG-miR-22は、主にヒトにおいて機能する。
オリゴヌクレオチドは、シード配列をカバーするように設計され、8ntから20ntの長さを含有し、許容されるLNAの特異的な長さ割合を有し、miR-22に対する結合親和性ができるだけ高い。
設計要素は、少なくとも8個のLNA修飾を含んだ。さらに設計要素は、一列に4個以下のLNA修飾を含んだ。さらなるデザインエレメントは、一列に3個以下の非修飾残基を含んだ。
オリゴヌクレオチドは、miR-22を阻害するのに十分な親和性でmiR-22に結合するように設計された。また、オリゴヌクレオチドは、自己結合親和性が制限されるか、または全くないように設計された(例えば、二重鎖または折りたたみ構造がないか、または制限される)。
下記の配列(比較)において、大文字は、LNA修飾、小文字は、非修飾である、miR-22(SEQ ID NO:1)および抗miR-22オリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:7からSEQ ID NO:13)の配向は、5’から3’である。5’から3’に配向されたSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15のオリゴヌクレオチドは、スクランブル配列であり、miR-22(SEQ ID NO:1)にハイブリダイズしない。
hsa-miR-22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU(SEQ ID NO:1)
CRM0008 TGGCAGCT (SEQ ID NO:2)
CRM0009 CtTcaACtgGcAgCT (SEQ ID NO:7)
CRM0010 CTTcaACtgGCAgCT (SEQ ID NO:8)
CRM0011 TCtTCAaCtgGCAgCT (SEQ ID NO:9)
CRM0012 TCtTcaaCtGGCAgCT (SEQ ID NO:10)
CRM0013 TCtTCAacTgGCAgCT (SEQ ID NO:11)
CRM0014 TTctTCAacTgGCAgCT (SEQ ID NO:12)
CRM0015 GTtctTcaaCtgGCaGCT (SEQ ID NO:13)
CRM0016 CGaATAgTtaGTAgCG (SEQ ID NO:14)
CRM0017 FAM標識CGaATAgTtaGTAgCG (SEQ ID NO:15)
CRM0008 TGGCAGCT (SEQ ID NO:2)
CRM0009 CtTcaACtgGcAgCT (SEQ ID NO:7)
CRM0010 CTTcaACtgGCAgCT (SEQ ID NO:8)
CRM0011 TCtTCAaCtgGCAgCT (SEQ ID NO:9)
CRM0012 TCtTcaaCtGGCAgCT (SEQ ID NO:10)
CRM0013 TCtTCAacTgGCAgCT (SEQ ID NO:11)
CRM0014 TTctTCAacTgGCAgCT (SEQ ID NO:12)
CRM0015 GTtctTcaaCtgGCaGCT (SEQ ID NO:13)
CRM0016 CGaATAgTtaGTAgCG (SEQ ID NO:14)
CRM0017 FAM標識CGaATAgTtaGTAgCG (SEQ ID NO:15)
表1では、大文字は、LNAで修飾され、小文字は、未修飾である。miR-22(SEQ ID NO:1)および抗miR-22オリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:16~SEQ ID NO:20)の配向は5’から3’である。1つのPS(ホスホロチオエート)結合は、各抗miR-22化合物において1つのPO(ホスホジエステル)結合で置換される。ホスホロチオエート結合は、表1において*で示される。
比較のために、CRM0010、別称LNA-10、またはRES-010もオリゴに含まれている。
(実施例2:miR-22ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いた抗miR-22オリゴヌクレオチド化合物のインビトロ効力の評価)
(細胞株)
ヒト肝癌細胞株SK-Hep-1およびHuh-7D1を、European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC、英国)から購入した。SK-Hep-1細胞株を、10%FBS(シグマ)、1%グルタミン(2mM、シグマ)、1%P/S(シグマ)、1%NEAA(シグマ)、1%ピルビン酸ナトリウム溶液(1mM NaP、滅菌濾過、シグマ)を添加したEMEM(シグマ)で培養した。Huh-7D12細胞は、10%FBS(シグマ)、1%グルタミン(2mM、シグマ)、1%P/S(シグマ)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、シグマ)で培養した。全ての細胞培養を、5% CO2中、37℃でインキュベートした。細胞数を、Countess II FL Automated Cell Counter(Thermo Fisher Scientific)を用いてカウントした。
(細胞株)
ヒト肝癌細胞株SK-Hep-1およびHuh-7D1を、European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC、英国)から購入した。SK-Hep-1細胞株を、10%FBS(シグマ)、1%グルタミン(2mM、シグマ)、1%P/S(シグマ)、1%NEAA(シグマ)、1%ピルビン酸ナトリウム溶液(1mM NaP、滅菌濾過、シグマ)を添加したEMEM(シグマ)で培養した。Huh-7D12細胞は、10%FBS(シグマ)、1%グルタミン(2mM、シグマ)、1%P/S(シグマ)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、シグマ)で培養した。全ての細胞培養を、5% CO2中、37℃でインキュベートした。細胞数を、Countess II FL Automated Cell Counter(Thermo Fisher Scientific)を用いてカウントした。
(miR-22ルシフェラーゼレポータープラスミドの作製)
miR-22完全一致(PM)標的部位レポーターは、miR-22のPM部位(1xPM)をPsiCHECKTM2ベクター(C8021、Promega)のレニラルシフェラーゼ(Rluc)下流の多重クローニング部位にクローニングすることによって作製した。簡単に述べると、Xhol(5’)およびNotl(3’)オーバーハングを含むPMプライマー対を、miR-22 PMセンス、CTCGAGACAGTTCTTCAACTGGCAGCTTGCGGCCG(SEQ ID NO:22)、miR-22 PMアンチセンス、GGCCGCAAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTC(SEQ ID NO:23)のプライマーを用いて作製した。プライマーのアニーリング(10分、85℃、その後1℃/分で4℃まで冷却)後、psiCHECK(商標)-2ベクター(Promega、C8021)をNEB-buffer 3.1(NEB B7203S)中、NotI(NEB R0189S)とXhoI(NEB R0146S)とで37℃、2時間消化した。酵素を65℃で15分間熱不活性化し、プラスミドDNA精製Nucleospin Quickpure(Fisher Scientific 11902362)を用いてプラスミドを精製した。プラスミドとPCR断片とをT4 DNA Ligase(NEB M0202S)を用いて室温で1時間ライゲーションした。ライゲーションミックスをOne Shot TOP10 Chemically Competent E.coli細胞(C4040-03、Invitrogen)に形質転換し、50μg/mLのアンピシリン(Ampicillin-Sigma-Aldrich A5354)を加えたLB-プレート(AGAR(Miller)Sigma-Aldrich L3147を含むLB Broth)に伝播させ、37℃で一晩培養した。コロニーを2mlのLB+アンピシリン(LB Broth (Miller) Sigma-Aldrich L3522)中で採取し、37℃で一晩振盪培養した。選択したコロニーのインサートを確認するために、共通のフォワードプライマー(CTATTGTCGAGGGAGCTAAGAAGT(SEQ ID NO:24)、hluc遺伝子に位置する)とインサートに特異的なリバースプライマー(miR-22リバース、CGCAAGCTGCCAGTTGAAGAACTG(SEQ ID NO:25))を用いて、1,5%アガロースゲルで目的の特異的断片を増幅した(AmpliTaq Gold(商標)バイオシステムを適用したDNAポリメラーゼ、4311806)。プラスミドをQuickLyse Miniprep(Qiagen 27405)を用いて精製し、次psiCHECKTM2共通フォワード、CTATTGTCGAGGGAGCTAAGAAGT(SEQ ID NO:26)、psiCHECKTM2共通リバース、GCGTCAGACAAACCCTAACCA(SEQ ID NO:27)のプライマーを用いてEurofins Genomicsで配列決定した。最後に、確認されたmiR-22ルシフェラーゼレポータープラスミドを50mlのLB+Ampで一晩培養し、Endofree Plasmid Maxiキット(Qiagen 12362)を用いて精製した。
miR-22完全一致(PM)標的部位レポーターは、miR-22のPM部位(1xPM)をPsiCHECKTM2ベクター(C8021、Promega)のレニラルシフェラーゼ(Rluc)下流の多重クローニング部位にクローニングすることによって作製した。簡単に述べると、Xhol(5’)およびNotl(3’)オーバーハングを含むPMプライマー対を、miR-22 PMセンス、CTCGAGACAGTTCTTCAACTGGCAGCTTGCGGCCG(SEQ ID NO:22)、miR-22 PMアンチセンス、GGCCGCAAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTC(SEQ ID NO:23)のプライマーを用いて作製した。プライマーのアニーリング(10分、85℃、その後1℃/分で4℃まで冷却)後、psiCHECK(商標)-2ベクター(Promega、C8021)をNEB-buffer 3.1(NEB B7203S)中、NotI(NEB R0189S)とXhoI(NEB R0146S)とで37℃、2時間消化した。酵素を65℃で15分間熱不活性化し、プラスミドDNA精製Nucleospin Quickpure(Fisher Scientific 11902362)を用いてプラスミドを精製した。プラスミドとPCR断片とをT4 DNA Ligase(NEB M0202S)を用いて室温で1時間ライゲーションした。ライゲーションミックスをOne Shot TOP10 Chemically Competent E.coli細胞(C4040-03、Invitrogen)に形質転換し、50μg/mLのアンピシリン(Ampicillin-Sigma-Aldrich A5354)を加えたLB-プレート(AGAR(Miller)Sigma-Aldrich L3147を含むLB Broth)に伝播させ、37℃で一晩培養した。コロニーを2mlのLB+アンピシリン(LB Broth (Miller) Sigma-Aldrich L3522)中で採取し、37℃で一晩振盪培養した。選択したコロニーのインサートを確認するために、共通のフォワードプライマー(CTATTGTCGAGGGAGCTAAGAAGT(SEQ ID NO:24)、hluc遺伝子に位置する)とインサートに特異的なリバースプライマー(miR-22リバース、CGCAAGCTGCCAGTTGAAGAACTG(SEQ ID NO:25))を用いて、1,5%アガロースゲルで目的の特異的断片を増幅した(AmpliTaq Gold(商標)バイオシステムを適用したDNAポリメラーゼ、4311806)。プラスミドをQuickLyse Miniprep(Qiagen 27405)を用いて精製し、次psiCHECKTM2共通フォワード、CTATTGTCGAGGGAGCTAAGAAGT(SEQ ID NO:26)、psiCHECKTM2共通リバース、GCGTCAGACAAACCCTAACCA(SEQ ID NO:27)のプライマーを用いてEurofins Genomicsで配列決定した。最後に、確認されたmiR-22ルシフェラーゼレポータープラスミドを50mlのLB+Ampで一晩培養し、Endofree Plasmid Maxiキット(Qiagen 12362)を用いて精製した。
(ルシフェラーゼレポーターアッセイ)
抗miR-22オリゴヌクレオチドおよびmiR-22ルシフェラーゼレポータープラスミド(PsiCHECK 2-miR-22 PM)のトランスフェクションを、Lipofectamine 2000(Thermo Scientific、11668-019)を用いてSK-Hep-1およびHuh-7D12で行った。簡単に説明すると、トランスフェクションの1日前に、細胞をコラーゲンでコートした96ウェル(Corning(登録商標)96ウェルホワイトポリスチレンマイクロプレート、Sigma CLS3610-48EA)にプレーティングした(トランスフェクション時には80-90%コンフルエント)。リポフェクタミン混合液(SK-Hep-1:5μg/mL、Huh-7D12:2.5μg/mL)を添加する前に、細胞をOptiMEM(Thermo Scientific、51985-026)で一度洗浄した。プラスミド(0.0001μg/μL)および抗R-22オリゴヌクレオチド(最終濃度1.0、0.2、または0.04nM)を添加する前に、細胞をRTで7分間インキュベートした。細胞を37℃、5% CO2で4時間インキュベートした後、OptiMEMで1回洗浄した。75μLの培地を加えた後、細胞を37℃、5% CO2で20時間培養した。ルシフェラーゼ活性(ホタルおよびウミシイタケ)を、Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega,E2920)を用いて、製造元のプロトコールに従って測定した。バックグラウンド減算後、各ウェル内のレニラ活性をホタルに対して正規化した(ウミシイタケ/ホタル)。抗R-22オリゴヌクレオチドの効力をCRM0010と比較した。データを図1のA-Fに報告する。NRC0131、NRC0133およびNRC0134は、CRM0010と比較して0.2nM濃度においてより効力があるようである。
抗miR-22オリゴヌクレオチドおよびmiR-22ルシフェラーゼレポータープラスミド(PsiCHECK 2-miR-22 PM)のトランスフェクションを、Lipofectamine 2000(Thermo Scientific、11668-019)を用いてSK-Hep-1およびHuh-7D12で行った。簡単に説明すると、トランスフェクションの1日前に、細胞をコラーゲンでコートした96ウェル(Corning(登録商標)96ウェルホワイトポリスチレンマイクロプレート、Sigma CLS3610-48EA)にプレーティングした(トランスフェクション時には80-90%コンフルエント)。リポフェクタミン混合液(SK-Hep-1:5μg/mL、Huh-7D12:2.5μg/mL)を添加する前に、細胞をOptiMEM(Thermo Scientific、51985-026)で一度洗浄した。プラスミド(0.0001μg/μL)および抗R-22オリゴヌクレオチド(最終濃度1.0、0.2、または0.04nM)を添加する前に、細胞をRTで7分間インキュベートした。細胞を37℃、5% CO2で4時間インキュベートした後、OptiMEMで1回洗浄した。75μLの培地を加えた後、細胞を37℃、5% CO2で20時間培養した。ルシフェラーゼ活性(ホタルおよびウミシイタケ)を、Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega,E2920)を用いて、製造元のプロトコールに従って測定した。バックグラウンド減算後、各ウェル内のレニラ活性をホタルに対して正規化した(ウミシイタケ/ホタル)。抗R-22オリゴヌクレオチドの効力をCRM0010と比較した。データを図1のA-Fに報告する。NRC0131、NRC0133およびNRC0134は、CRM0010と比較して0.2nM濃度においてより効力があるようである。
Claims (16)
- gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)からなる配列を有する核酸を含むmiR-22阻害組成物であって、前記核酸は、少なくとも6個、または少なくとも8個のロック核酸(LNA)修飾を含む、miR-22阻害組成物。
- 前記核酸は、少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個のロック核酸(LNA)修飾を含む、請求項1に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記核酸は、10個または11個のロック核酸(LNA)修飾を含む、請求項1に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記核酸は、10個または11個のLNA修飾を含み、前記修飾は、少なくとも1位、2位、6位、11位、17位、18位にある、請求項1に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記核酸は、11個のLNA修飾を含み、前記修飾は、少なくとも1位、2位、5位、6位、11位、14位、17位、18位にある、請求項1に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記核酸配列中の少なくとも1つのPS(ホスホロチオエート)結合は、1つのPO(ホスホジエステル)結合で置換されている、請求項1に記載のmiR-22阻害組成物。
- 1つのPS結合は、1つのPO結合で置換されている、請求項6に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記PO結合は、少なくとも6位、8位、10位または14位である、請求項6または7に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記PO結合は、1つのみであり、前記結合は、6位、10位または14位である、請求項6または7に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記核酸は、GTtcTTCaAcTGgCagCT(SEQ ID NO:17)、GTtCtTcAaCTggcAgCT(SEQ ID NO:19)、およびGTtcTTcAaCtgGCAgCT(SEQ ID NO:20)からなる群から選択される配列を有し、大文字は、LNA修飾であり、小文字は、未修飾である、請求項1に記載のmiR-22阻害組成物。
- 前記核酸は、G*T*t*c*T*TC*a*A*c*T*G*g*C*a*g*C*T(SEQ ID NO:17)、G*T*t*C*t*T*c*A*a*CT*g*g*c*A*g*C*T(SEQ ID NO:19)、およびG*T*t*c*T*T*c*A*a*C*t*g*G*CA*g*C*T(SEQ ID NO:20)からなる群から選択される配列を有し、大文字は、LNA修飾であり、小文字は、未修飾であり、記号*は、PS結合を示し、記号*がない場合は、PO結合を示す、請求項1に記載のmiR-22阻害組成物。
- 上記請求項のいずれか一項に記載の核酸と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
- 上記請求項のいずれか一項に記載の核酸分子をコードする配列を含むベクターまたはプラスミド。
- 上記請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
- miR-22を、請求項1から11のいずれか一項に記載のmiR-22阻害組成物と接触させることを含む、miR-22を阻害する方法。
- 代謝異常の治療に使用するための、請求項12に記載の医薬組成物。
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