JP2024045883A - Black stain forming method - Google Patents
Black stain forming method Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024045883A JP2024045883A JP2022150951A JP2022150951A JP2024045883A JP 2024045883 A JP2024045883 A JP 2024045883A JP 2022150951 A JP2022150951 A JP 2022150951A JP 2022150951 A JP2022150951 A JP 2022150951A JP 2024045883 A JP2024045883 A JP 2024045883A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substrate
- forming
- forming bacteria
- black
- suspension
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 94
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 93
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 89
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 57
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 38
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 38
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 29
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 26
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 63
- 206010000496 acne Diseases 0.000 claims description 57
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 47
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 26
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 8
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 claims description 4
- -1 fatty acid salts Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 61
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 34
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 18
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 16
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 12
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 12
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 12
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 5
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 5
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 3
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 3
- NKWPZUCBCARRDP-UHFFFAOYSA-L calcium bicarbonate Chemical compound [Ca+2].OC([O-])=O.OC([O-])=O NKWPZUCBCARRDP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000020 calcium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 3
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 description 3
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 description 3
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 description 3
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 description 3
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 description 3
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 description 3
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M Sodium oleate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 2
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000726119 Acidovorax Species 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241001024600 Aggregatibacter Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241001465178 Bipolaris Species 0.000 description 1
- 241001626906 Blastomonas Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000131407 Brevundimonas Species 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 241001633123 Cladophialophora Species 0.000 description 1
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 1
- 241000223208 Curvularia Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000192093 Deinococcus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241001492222 Epicoccum Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000223682 Exophiala Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 241000122862 Fonsecaea Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000589323 Methylobacterium Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010052143 Ocular discomfort Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000222831 Phialophora <Chaetothyriales> Species 0.000 description 1
- 241001503951 Phoma Species 0.000 description 1
- 241000605894 Porphyromonas Species 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000223667 Rhinocladiella Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 241000191025 Rhodobacter Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241001524057 Scolecobasidium Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000383837 Sphingobium Species 0.000 description 1
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 1
- 241000383873 Sphingopyxis Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000122971 Stenotrophomonas Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241001470488 Tannerella Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000266300 Ulocladium Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N cellotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019645 odor Nutrition 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、基材上に黒ずみを効率的に形成できる黒ずみ形成方法に関する。また、本発明は、当該黒ずみ形成方法を利用した、抗黒ずみ効果の評価方法、及び抗黒ずみ効果を有する物質のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for forming dark spots that can efficiently form dark spots on a substrate. The present invention also relates to a method for evaluating an anti-blackhead effect and a method for screening for a substance having an anti-blackhead effect using the method for forming blackheads.
黒ずみは、トイレ、浴室、台所、洗面所等の水廻りで発生し易く、特に、トイレ便器内の水面付近ではリング状の黒ずみが発生し易いことが知られている。黒ずみの発生機序については解明が進んでおり、先ず、細菌が付着して増殖することによりバイオフィルムを形成して黒色真菌が付着し易い環境を作り、その後、バイオフィルムに黒色真菌が付着して増殖することにより発生すると考えられている。 Blackening is likely to occur in areas around water such as toilets, bathrooms, kitchens and washrooms, and it is known that ring-shaped blackening is particularly likely to occur near the water surface in the toilet bowl. Progress has been made in elucidating the mechanism by which blackening occurs, and it is thought that it occurs when bacteria first attach and grow to form a biofilm, creating an environment in which black fungus can easily attach, and then the black fungus attaches to the biofilm and grows.
生活空間で発生する黒ずみは、視覚的な不快感を与えるだけでなく、異臭を発散したり、感染症の感染源にもなったりすることもある。そこで、従来、黒ずみ対策用の洗浄剤として、抗菌成分を配合した洗浄組成物が開発されている。 The blackening that occurs in living spaces not only causes visual discomfort, but can also emit unpleasant odors and become a source of infection. For this reason, cleaning compositions containing antibacterial ingredients have been developed as cleaning agents to combat blackening.
一方、黒ずみ対策用の洗浄剤を開発する上で、黒ずみの形成遅延効果を評価することは不可欠であるが、前述の通り、黒ずみは、バイオフィルムと黒色真菌の複雑な集合体であるため、洗浄剤の抗菌活性を測定するだけでは、黒ずみの形成遅延効果を正しく評価できない。そのため、従来、洗浄剤の黒ずみの形成遅延効果を評価するには、実際の家庭において洗浄剤を使用し、黒ずみの発生を観察するフィールドテストが必要であった。しかしながら、フィールドテストでは、長い期間を要し、Ｎ数を確保するためにコストも高くなるという問題点がある。 On the other hand, in developing detergents to combat blackheads, it is essential to evaluate the effect of retarding the formation of blackheads, but as mentioned above, blackheads are complex aggregates of biofilms and blackheads. Merely measuring the antibacterial activity of a detergent cannot accurately evaluate its effect on retarding the formation of blackheads. Therefore, conventionally, in order to evaluate the effectiveness of detergents in retarding the formation of dark spots, it has been necessary to conduct field tests in which detergents are used in actual households and the occurrence of dark spots is observed. However, the field test requires a long period of time and has the problem that the cost is high to ensure the number N.
そこで、近年、基材上にバイオフィルムを形成した後に、当該バイオフィルムに黒色真菌を付着させて増殖することにより、人工的に黒ずみを形成させる手法が開発され、黒ずみ形成に及ぼす影響を評価できるラボ試験系が構築されている（非特許文献１参照）。しかしながら、従来の黒ずみの形成手法では、バイオフィルム中の細菌の種類によっては黒色真菌の増殖が進行しない、形成される黒ずみが小さい、黒ずみの形成に長期間要する、等の欠点があり、効率的に黒ずみを形成することはできない。 In recent years, a method has been developed to artificially form dark spots by forming a biofilm on a substrate, and then attaching and growing black fungi on the biofilm, and a laboratory test system has been constructed that can evaluate the effect on black spot formation (see Non-Patent Document 1). However, conventional methods for forming dark spots have drawbacks, such as the black fungus not growing depending on the type of bacteria in the biofilm, the black spots formed being small, and the formation of black spots taking a long time, making it impossible to form dark spots efficiently.
このような従来技術を背景として、基材上に黒ずみを効率的に形成できる手法を確立し、抗黒ずみ効果を評価できるラボ試験系を構築することが切望されている。 Given this background of conventional technology, there is a strong desire to establish a method for efficiently forming darkening on a substrate and to construct a laboratory test system that can evaluate the anti-darkening effect.
本発明の目的は、基材上に黒ずみを効率的に形成できる黒ずみ形成方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、当該黒ずみ形成方法を利用した、抗黒ずみ効果の評価方法、及び抗黒ずみ効果を有する物質のスクリーニング方法を提供することである。 The object of the present invention is to provide a method for forming a darkening layer that can efficiently form a darkening layer on a substrate. Another object of the present invention is to provide a method for evaluating an anti-darkening effect and a method for screening a substance having an anti-darkening effect, using the method for forming a darkening layer.
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させた後に、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、基材上に黒ずみを効率的に形成できることを見出した。また、本発明者は、前記黒ずみ形成方法を利用することにより、抗黒ずみ効果の評価、及び抗黒ずみ効果を有する物質のスクリーニングが可能になることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。 The inventors conducted intensive research to solve the above problems and found that blackening can be efficiently formed on a substrate by attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of the substrate, and then immersing and culturing the portion of the substrate to which the biofilm-forming bacteria are attached in a black fungus suspension containing at least one selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, sugars, fatty acids, and salts of fatty acids. The inventors also found that the use of the above-mentioned blackening formation method makes it possible to evaluate the anti-blackening effect and screen for substances having anti-blackening effects. The present invention was completed through further research based on these findings.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 以下の工程を含む、黒ずみの形成方法：
基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる第１工程、並びに
タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程。
項２． 前記第１工程後且つ前記第２工程前に、前記第１工程で得られた基材のバイオフィルム形成細菌が付着している領域に液体培地を接触させる工程を含む、項１に記載の黒ずみの形成方法。
項３． 前記第２工程において、一定時間毎に前記基材を浸漬させている黒色真菌懸濁液を新鮮なものに交換する、項１又は２に記載の黒ずみの形成方法。
項４． 前記基材を浸漬させている黒色真菌懸濁液を新鮮なものに交換する前に、前記基材に液体培地を接触させる、項３に記載の黒ずみの形成方法。
項５． 被験試料の抗黒ずみ効果を評価する方法であって、
基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる第１工程、並びに
タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程を含み、
前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、前記第２工程中、及び前記第２工程後よりなる群から選択される少なくとも１つの段階において、被験試料を添加し、被験試料を添加した条件と被験試料を添加していない条件で黒ずみの状態を対比する、評価方法。
項６． 抗黒ずみ効果を有する物質のスクリーニング方法であって、
基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる第１工程、並びに
タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程を含み、
前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、前記第２工程中、及び前記第２工程後よりなる群から選択される少なくとも１つの段階において、候補試料を添加し、候補試料を添加した条件と候補試料を添加していない条件で黒ずみの状態を対比する、評価方法。
That is, the present invention provides the inventions of the following aspects.
Item 1. A method of forming blackheads, including the following steps:
A first step of attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of the substrate, and a black fungal suspension containing at least one member selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, saccharides, fatty acids, and salts of fatty acids. A second step of forming dark spots by immersing and culturing a part of the substrate to which biofilm-forming bacteria have adhered.
Item 2. 2. Darkening according to item 1, comprising the step of bringing a liquid medium into contact with a region of the substrate obtained in the first step to which biofilm-forming bacteria are attached, after the first step and before the second step. How to form.
Item 3. Item 3. The method for forming blackheads according to item 1 or 2, wherein in the second step, the black fungal suspension in which the substrate is immersed is replaced with a fresh one at regular intervals.
Item 4. 4. The method for forming blackheads according to item 3, wherein the substrate is brought into contact with a liquid medium before replacing the black fungal suspension in which the substrate is immersed with a fresh one.
Item 5. A method for evaluating the anti-blackening effect of a test sample, the method comprising:
A first step of attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of the substrate, and a black fungal suspension containing at least one member selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, saccharides, fatty acids, and salts of fatty acids. , a second step of forming blackheads by immersing and culturing a part of the substrate to which biofilm-forming bacteria have adhered;
In at least one stage selected from the group consisting of during the first step, after the first step and before the second step, during the second step, and after the second step, a test sample is added, An evaluation method that compares the state of darkening under conditions in which the test sample is added and conditions in which the test sample is not added.
Item 6. A method of screening for a substance having an anti-blackhead effect, the method comprising:
A first step of attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of the substrate, and a black fungal suspension containing at least one member selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, saccharides, fatty acids, and salts of fatty acids. , a second step of forming blackheads by immersing and culturing a part of the substrate to which biofilm-forming bacteria have adhered;
In at least one stage selected from the group consisting of during the first step, after the first step and before the second step, during the second step, and after the second step, a candidate sample is added. An evaluation method that compares the state of darkening under conditions with and without the addition of candidate samples.
本発明の黒ずみ形成方法では、基材上に黒ずみを効率的に形成できるので、抗黒ずみ効果（黒ずみ形成を遅延させる効果、及び形成された黒ずみを除去する効果）を評価するための試験系を提供でき、黒ずみ対策用の洗浄剤等の開発を効率的に行うことが可能になる。 Since the blackhead formation method of the present invention can efficiently form blackheads on the substrate, a test system for evaluating the anti-blackhead effect (the effect of delaying the formation of blackheads and the effect of removing the formed blackheads) has been developed. This makes it possible to efficiently develop detergents and other products to combat dark spots.
また、トイレ便器の洗浄では、フラッシュ水に洗浄剤を溶出させて定期的に（フラッシュの度に）トイレ便器を洗浄する手法が汎用されている。これに対して、本発明の黒ずみ形成方法では、黒色真菌により黒ずみを形成させる工程中に、黒ずみ形成に影響を及ぼす試料を定期的に添加することができるので、フラッシュ水に溶出させるトイレ用洗浄剤の使用態様に即した条件で、当該トイレ用洗浄剤の抗黒ずみ効果を評価することも可能になる。 In addition, a commonly used method for cleaning toilet bowls is to dissolve a cleaning agent into flush water and clean the toilet bowl periodically (every time it is flushed). On the other hand, in the method of forming blackheads of the present invention, a sample that affects the formation of blackheads can be added periodically during the process of forming blackheads by black fungi. It also becomes possible to evaluate the anti-blackening effect of the toilet cleaning agent under conditions appropriate to the manner in which the agent is used.
１．黒ずみ形成方法
本発明の黒ずみ形成方法は、基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる第１工程；並びに、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の黒ずみ形成方法について詳述する。
1. Blackhead Formation Method The blackhead formation method of the present invention includes a first step of attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of a substrate; The present invention is characterized in that it includes a second step of forming blackheads by immersing and culturing a part of the substrate on which biofilm-forming bacteria have adhered to a black fungal suspension containing at least one species of bacteria. Hereinafter, the method for forming dark spots of the present invention will be explained in detail.
［第１工程（バイオフィルム形成細菌の付着工程）］
第１工程では、基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる。
[Step 1 (attachment step of biofilm-forming bacteria)]
In the first step, biofilm-forming bacteria are attached to at least a portion of a substrate.
第１工程で使用する基材は、最終的に黒ずみの足場としての役割を果たす。第１工程で使用する基材の素材については、試験目的等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、陶磁器、ガラス、ステンレス、セラミックス、プラスチック等の硬質素材、繊維質素材等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、陶磁器、ガラス、ステンレス、セラミックス、プラスチック等の硬質素材が挙げられる。 The substrate used in the first step will ultimately serve as a base for the blackening. The material of the substrate used in the first step may be appropriately selected depending on the test purpose, etc., but examples of the material include hard materials such as ceramics, glass, stainless steel, ceramics, and plastics, and fibrous materials. Among these, hard materials such as ceramics, glass, stainless steel, ceramics, and plastics are preferred.
第１工程で使用する基材の形状については、試験目的等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、シート状、ブロック状、紐状、粒状等が挙げられる。これらの中でも、操作簡便性等の観点から、好ましくはシート状、ブロック状、更に好ましくはシート状が挙げられる。また、第１工程で使用する基材の大きさについては、試験目的等に応じて適宜設定すればよい。 The shape of the substrate used in the first step may be appropriately set depending on the test purpose, etc., and may be, for example, a sheet, a block, a string, or a granule. Among these, from the viewpoint of ease of operation, etc., a sheet or a block is preferable, and a sheet is more preferable. The size of the substrate used in the first step may be appropriately set depending on the test purpose, etc.
また、第１工程で使用する基材には、必要に応じて、ミネラル、ケイ素等を付着させるコーティング処理等が施されていてもよい。 The substrate used in the first step may be subjected to a coating treatment to attach minerals, silicon, etc., as necessary.
第１工程で使用されるバイオフィルム形成細菌とは、基材上でバイオフィルムを形成する能力を有する細菌（以下、「ＢＦ形成菌」と表記することもある）である。ＢＦ形成菌の種類については、特に制限されないが、例えば、リゾビウム属（Rhizobium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、スフィンゴピキシス属（Sphingopyxis）、スフィンゴビウム属（Sphingobium）、ブレバンディモナス属（Brevundimonas）、ブラストモナス属（Blastomonas）、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、エロモナス属（Aeromonas）、クレブシェラ属（Klebsiella）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、オクロバクテリウム属（Ochrobactrum）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、フゾバクテリウム属（Fusobacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、バークホリデリア属（Burkholderia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、シトロバクター属（Citrobacter）、アグリゲイティバクター属（Aggregatibacter）、ロドバクター属（Rhodobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エスケリキア属（Escherichia）、ラルストニア属（Ralstonia）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、エルシニア属（Yersinia）、アシドヴォラックス属（Acidovorax）、プレボテラ属（Prevotella）、タネレラ属（Tannerella）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）等のグラム陰性細菌やスタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、デイノコッカス属（Deinococcus）等のグラム陽性細菌が挙げられる。これらの細菌は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。 The biofilm-forming bacteria used in the first step are bacteria that have the ability to form a biofilm on a substrate (hereinafter sometimes referred to as "BF-forming bacteria"). The type of BF-forming bacteria is not particularly limited, but examples include Rhizobium, Pseudomonas, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingobium, Brevundimonas, Blastomonas, Stenotrophomonas, Porphyromonas, Aeromonas, Klebsiella, Flavobacterium ), Ochrobacterium, Methylobacterium, Fusobacterium, Brevibacterium, Burkholderia, Enterobacter, Acinetobacter (Acinetobacter), Citrobacter, Aggregatibacter, Rhodobacter, Erwinia, Escherichia, Ralstonia, Salmonella, Gram-negative bacteria such as Serratia, Yersinia, Acidovorax, Prevotella, Tannerella, Alcaligenes, and Staphylococcus , Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Lactobacillus, Deinococcus, and other Gram-positive bacteria. These bacteria may be used alone or in combination of two or more.
第１工程において、基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる手法については、特に制限されないが、例えば、ＢＦ形成菌を含む懸濁液（以下、「ＢＦ形成菌懸濁液」と表記することもある）を基材に接触させればよく、具体的には、ＢＦ形成菌懸濁液に基材の少なくとも一部を浸漬する方法；ＢＦ形成菌懸濁液を基材上に貯留させる方法等が挙げられる。 In the first step, the method for attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of the substrate is not particularly limited, but may be, for example, by contacting the substrate with a suspension containing BF-forming bacteria (hereinafter, sometimes referred to as a "BF-forming bacteria suspension"). Specific examples include a method of immersing at least a portion of the substrate in the BF-forming bacteria suspension; a method of storing the BF-forming bacteria suspension on the substrate, etc.
ＢＦ形成菌懸濁液におけるＢＦ形成菌の濃度については、使用するＢＦ形成菌の種類、基材との接触時間等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、ＢＦ形成菌懸濁液の吸光度（OD600nm）が0.01以上、好ましくは0.10～2.0、より好ましくは0.50～1.50が挙げられる。 The concentration of BF-forming bacteria in the BF-forming bacteria suspension may be appropriately set depending on the type of BF-forming bacteria used, the contact time with the substrate, etc. (OD600nm) is 0.01 or more, preferably 0.10 to 2.0, more preferably 0.50 to 1.50.
ＢＦ形成菌懸濁液において基剤となる液体媒体については、ＢＦ形成菌の生育に悪影響を及ぼさないものであればよく、例えば、液体培地、生理食塩水、水等が挙げられる。これらの中でも、液体培地が好ましい。 The liquid medium that serves as the base for the BF-forming bacteria suspension may be any medium that does not adversely affect the growth of the BF-forming bacteria, such as liquid culture medium, physiological saline, water, etc. Among these, liquid culture medium is preferred.
ＢＦ形成菌懸濁液の液体媒体として液体培地を使用する場合、当該液体培地の成分組成については、特に制限されず、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、ビタミン源、及びミネラル源等の成分の１種以上を含んでいればよい。 When a liquid medium is used as the liquid medium for the BF-forming bacteria suspension, the component composition of the liquid medium is not particularly limited, and it is sufficient that the liquid medium contains one or more components such as a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, a phosphorus source, a vitamin source, and a mineral source.
ＢＦ形成菌懸濁液の液体媒体として液体培地を使用する場合、当該液体培地はマンニトールを含んでいることが好ましい。当該液体培地にマンニトールを含有させる場合、その含有量としては、例えば、5～20g/l、好ましくは5～15g/l、更に好ましくは7.5～12.5g/lが挙げられる。 When a liquid medium is used as the liquid medium for the BF-forming bacteria suspension, the liquid medium preferably contains mannitol. When the liquid medium contains mannitol, the content thereof is, for example, 5 to 20 g/l, preferably 5 to 15 g/l, and more preferably 7.5 to 12.5 g/l.
また、ＢＦ形成菌懸濁液の液体媒体として液体培地を使用する場合、当該液体培地は酵母エキスを含んでいることが好ましい。当該液体培地に酵母エキスを含有させる場合、その含有量としては、例えば、2.0～6.0g/l、好ましくは2.0～5.0g/l、更に好ましくは2.5～3.5g/lが挙げられる。 When a liquid medium is used as the liquid medium for the BF-forming bacteria suspension, the liquid medium preferably contains yeast extract. When the liquid medium contains yeast extract, the content is, for example, 2.0 to 6.0 g/l, preferably 2.0 to 5.0 g/l, and more preferably 2.5 to 3.5 g/l.
また、ＢＦ形成菌懸濁液の液体媒体として液体培地を使用する場合、当該液体培地は水溶性カルシウム塩を含んでいることが好ましい。水溶性カルシウム塩としては、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム等が挙げられる。これらの水溶性カルシウム塩は、水和物の形態であってもよい。当該液体培地に水溶性カルシウム塩を含有させる場合、その含有量としては、例えば、水溶性カルシウム塩の無水物換算量で、0.1～1.5g/l、好ましくは0.2～1.0g/l、更に好ましくは0.3～0.8g/lが挙げられる。 When a liquid medium is used as the liquid medium for the BF-forming bacteria suspension, the liquid medium preferably contains a water-soluble calcium salt. Examples of water-soluble calcium salts include calcium chloride, calcium lactate, calcium gluconate, calcium acetate, and calcium bicarbonate. These water-soluble calcium salts may be in the form of a hydrate. When the liquid medium contains a water-soluble calcium salt, the content of the water-soluble calcium salt is, for example, 0.1 to 1.5 g/l, preferably 0.2 to 1.0 g/l, and more preferably 0.3 to 0.8 g/l, calculated as the anhydrous amount of the water-soluble calcium salt.
第１工程において、基材の少なくとも一部にＢＦ形成菌懸濁液を接触させる時間として、使用するＢＦ形成菌の種類、ＢＦ形成菌懸濁液のＢＦ形成菌濃度等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、0.5～48時間、好ましくは1～24時間、より好ましくは1～12時間、更に好ましくは1～6時間が挙げられる。 In the first step, the time for which the BF-forming bacteria suspension is brought into contact with at least a portion of the substrate may be appropriately set depending on the type of BF-forming bacteria used, the BF-forming bacteria concentration in the BF-forming bacteria suspension, etc., but may be, for example, 0.5 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours, more preferably 1 to 12 hours, and even more preferably 1 to 6 hours.
また、第１工程において、基材の少なくとも一部にＢＦ形成菌懸濁液を接触させる際の温度については、ＢＦ形成菌の生育可能温度域であることを限度として特に制限されないが、例えば、15～35℃、好ましくは20～30℃、より好ましくは22～27℃が挙げられる。 Furthermore, in the first step, the temperature at which the BF-forming bacteria suspension is brought into contact with at least a portion of the substrate is not particularly limited as long as it is within the temperature range in which the BF-forming bacteria can grow, but for example, 15 to 35°C, preferably 20 to 30°C, more preferably 22 to 27°C.
斯くして第１工程を行うことにより、ＢＦ形成菌が付着した基材（以下、ＢＦ形成菌付着基材）が得られる。基材上にＢＦ形成菌が付着されていることは、例えば、クリスタルバイオレット等の染色液を用いて染色することにより確認できる。 Thus, by carrying out the first step, a substrate to which BF-forming bacteria are attached (hereinafter, BF-forming bacteria-attached substrate) is obtained. The attachment of BF-forming bacteria to the substrate can be confirmed, for example, by staining with a staining solution such as crystal violet.
第１工程により得られたＢＦ形成菌付着基材は、必要に応じて、水洗等の洗浄処理を行った後に、第２工程に供してもよいが、第２工程前に以下の栄養源補給工程に供することが好ましい。 The BF-forming bacteria-attached substrate obtained in the first step may be subjected to a cleaning treatment such as washing with water if necessary, and then subjected to the second step. It is preferable to subject it to a process.
［栄養源補給工程］
栄養源補給工程では、第１工程により得られたＢＦ形成菌付着基材においてＢＦ形成菌が付着している領域に液体培地（以下、「第１液体培地」と表記することもある）を接触させる。第１工程により得られたＢＦ形成菌付着基材を、第２工程前に当該栄養源補給工程に供することにより、第２工程において黒ずみの形成を促進させることが可能になる。
[Nutritional source supply process]
In the nutrient source supply step, a liquid medium (hereinafter sometimes referred to as "first liquid medium") is brought into contact with the region to which BF-forming bacteria are attached in the BF-forming bacteria-attached substrate obtained in the first step. let By subjecting the BF-forming bacteria-attached substrate obtained in the first step to the nutrient supply step before the second step, it becomes possible to promote the formation of dark spots in the second step.
第１液体培地の成分組成については、特に制限されず、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、ビタミン源、及びミネラル源等の成分の１種以上を含んでいればよい。 The composition of the first liquid medium is not particularly limited, and may contain one or more of the following components: a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, a phosphorus source, a vitamin source, and a mineral source.
第１液体培地は、マンニトールを含んでいることが好ましい。当該液体培地にマンニトールを含有させる場合、その含有量としては、例えば、5～20g/l、好ましくは5～15g/l、更に好ましくは7.5～12.5g/lが挙げられる。 The first liquid medium preferably contains mannitol. When the liquid medium contains mannitol, the content is, for example, 5 to 20 g/l, preferably 5 to 15 g/l, and more preferably 7.5 to 12.5 g/l.
また、第１液体培地では、酵母エキスを含んでいることが好ましい。当該液体培地に酵母エキスを含有させる場合、その含有量としては、例えば、2.0～6.0g/l、好ましくは2.0～5.0g/l、更に好ましくは2.5～3.5g/lが挙げられる。 The first liquid medium preferably contains yeast extract. When the liquid medium contains yeast extract, the content is, for example, 2.0 to 6.0 g/l, preferably 2.0 to 5.0 g/l, and more preferably 2.5 to 3.5 g/l.
また、第１液体培地は、水溶性カルシウム塩を含んでいることが好ましい。水溶性カルシウム塩としては、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム等が挙げられる。これらの水溶性カルシウム塩は、水和物の形態であってもよい。当該液体培地に水溶性カルシウム塩を含有させる場合、その含有量としては、例えば、水溶性カルシウム塩の無水物換算量で、0.1～1.5g/l、好ましくは0.2～1.0g/l、更に好ましくは0.3～0.8g/lが挙げられる。 Moreover, it is preferable that the first liquid medium contains a water-soluble calcium salt. Examples of water-soluble calcium salts include calcium chloride, calcium lactate, calcium gluconate, calcium acetate, calcium hydrogen carbonate, and the like. These water-soluble calcium salts may be in the form of hydrates. When the liquid medium contains a water-soluble calcium salt, the content thereof is, for example, 0.1 to 1.5 g/l, preferably 0.2 to 1.0 g/l, more preferably 0.2 to 1.0 g/l, in terms of anhydrous content. The range is 0.3 to 0.8g/l.
栄養源補給工程において、ＢＦ形成菌付着基材においてＢＦ形成菌が付着している領域に第１液体培地を接触させる手法については、特に制限されないが、ＢＦ形成菌付着基材のＢＦ形成菌が付着している領域を第１液体培地に浸漬する方法；ＢＦ形成菌付着基材のＢＦ形成菌が付着している領域の上に第１液体培地を貯留させる方法等が挙げられる。 In the nutrient supply step, the method of contacting the first liquid medium with the region of the BF-forming bacteria-adhering substrate to which the BF-forming bacteria are attached is not particularly limited, but examples include a method of immersing the region of the BF-forming bacteria-adhering substrate to which the BF-forming bacteria are attached in the first liquid medium; a method of storing the first liquid medium above the region of the BF-forming bacteria-adhering substrate to which the BF-forming bacteria are attached, and the like.
栄養源補給工程において、ＢＦ形成菌付着基材のＢＦ形成菌が付着している領域に第１液体培地を接触させる時間については、特に制限されないが、例えば、1～60分間、好ましくは5～30分間、より好ましくは5～20分間が挙げられる。 In the nutrient supply step, the time for which the first liquid medium is brought into contact with the region of the BF-forming bacteria-attached substrate to which the BF-forming bacteria are attached is not particularly limited, but may be, for example, 1 to 60 minutes, preferably 5 to 30 minutes, and more preferably 5 to 20 minutes.
また、第１工程において、ＢＦ形成菌付着基材のＢＦ形成菌が付着している領域に第１液体培地を接触させる際の温度については、ＢＦ形成菌の生育可能温度域であることを限度として特に制限されないが、例えば、15～35℃、好ましくは20～30℃、より好ましくは22～27℃が挙げられる。 In the first step, the temperature at which the first liquid medium is brought into contact with the region of the BF-forming bacteria-attached substrate to which the BF-forming bacteria are attached is not particularly limited, as long as it is within the temperature range in which the BF-forming bacteria can grow, but examples of this include 15 to 35°C, preferably 20 to 30°C, and more preferably 22 to 27°C.
栄養源補給工程後のＢＦ形成菌付着基材は、第２工程に供される。 After the nutrient supply step, the substrate with BF-forming bacteria attached is subjected to the second step.
［第２工程（黒ずみ形成工程）］
第２工程では、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、ＢＦ形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる。このように、タンパク質等の特定成分を含む黒色真菌懸濁液に、ＢＦ形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させることにより、黒色真菌懸濁液の水面（喫水面）に接する基材の周辺領域に黒ずみを効率的に形成することが可能になる。
[Second step (blackening formation step)]
In the second step, a part of the substrate to which the BF-forming bacteria are attached is immersed in a black fungus suspension containing at least one selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, sugars, fatty acids, and salts of fatty acids, and cultured to form black spots. In this way, by immersing a part of the substrate to which the BF-forming bacteria are attached in a black fungus suspension containing specific components such as proteins, it becomes possible to efficiently form black spots in the peripheral area of the substrate that contacts the water surface (water surface) of the black fungus suspension.
本発明において、黒色真菌懸濁液とは、黒色真菌の胞子及び／又は菌糸が含まれる懸濁液である。また、本発明において、黒色真菌とは、メラニン色素の産生により暗色を呈する真菌である。第２工程で使用される黒色真菌の種類については、特に制限されないが、例えば、クラドスポリウム属（Cladosporium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、オーレオバシディウム属（Aureobasidium）、アルタナリア属（Alternaria）、ビポラリス属（Bipolaris）、クラドフィアロフォラ属（Cladophialophora）、エクソフィアラ属（Exophiala）、フォンセセア属（Fonsecaea）、フィアロフォラ属（Phialophora）、リノクラジエア属（Rhinocladiella）、フォーマ属（Phoma）、スコレコバシディウム属（Scolecobasidium）、ウロクラディウム属（Ulocladium）、エピコッカム属（Epicoccum）、カルバラリア属（Curvularia）、ケトミウム属（Chaetomium）、等の真菌が挙げられる。これらの黒色真菌は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。 In the present invention, a black fungus suspension is a suspension containing spores and/or hyphae of a black fungus. In addition, in the present invention, a black fungus is a fungus that is dark in color due to the production of melanin pigment. The type of black fungus used in the second step is not particularly limited, but examples thereof include fungi of the genera Cladosporium, Aspergillus, Aureobasidium, Alternaria, Bipolaris, Cladophialophora, Exophiala, Fonsecaea, Phialophora, Rhinocladiella, Phoma, Scolecobasidium, Ulocladium, Epicoccum, Curvularia, and Chaetomium. These black fungi may be used alone or in combination of two or more.
第２工程で使用される黒色真菌懸濁液の好適な一例として、黒色真菌の胞子を含む懸濁液が挙げられる。 A suitable example of the black fungus suspension used in the second step is a suspension containing black fungus spores.
黒色真菌懸濁液における黒色真菌の濃度については、使用する黒色真菌の種類、培養時間等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、100～100000 cfu/ml、好ましくは100～10000 cfu/ml、より好ましくは500～5000 cfu/mlが挙げられる。 The concentration of the black fungus in the black fungus suspension may be set appropriately depending on the type of black fungus used, the culture time, etc., but may be, for example, 100 to 100,000 cfu/ml, preferably 100 to 10,000 cfu/ml, and more preferably 500 to 5,000 cfu/ml.
黒色真菌懸濁液には、黒色真菌に加えて、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種が含まれる。これらの成分を含むことによって、効率的な黒ずみ形成が可能になる。 The black fungus suspension contains, in addition to black fungus, at least one selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, sugars, fatty acids, and salts of fatty acids. The inclusion of these components enables efficient blackening.
黒色真菌懸濁液に含有させるタンパク質については、その由来は、特に制限されず、動物由来、植物由来、昆虫由来等のいずれであってもよい。また、当該タンパク質は、遺伝子工学的手法により製造された組換タンパク質や変異タンパク質等であってもよい。タンパク質として、具体的には、ウシ胎児血清アルブミン（BSA）、卵由来アルブミン等が挙げられる。これらのタンパク質は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、好適な例としてウシ胎児血清アルブミンが挙げられる。 The origin of the protein contained in the black fungus suspension is not particularly limited, and may be derived from animals, plants, insects, etc. Further, the protein may be a recombinant protein, a mutant protein, or the like produced by genetic engineering techniques. Specific examples of the protein include fetal bovine serum albumin (BSA), egg-derived albumin, and the like. These proteins may be used alone or in combination of two or more. Among these, a preferred example is fetal bovine serum albumin.
本発明において、ペプトンとはタンパク質を加水分解して得られるアミノ酸および低分子量のペプチドの混合物の総称である。黒色真菌懸濁液に含有させるペプトンの種類については、特に制限されないが、例えば、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトン、大豆ペプトン、トリプトン等が挙げられる。これらのペプトンは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、好適な例としてカゼインペプトンが挙げられる。 In the present invention, peptone is a general term for a mixture of amino acids and low molecular weight peptides obtained by hydrolyzing proteins. The type of peptone to be contained in the black fungus suspension is not particularly limited, but examples include casein peptone, meat peptone, cardiac muscle peptone, gelatin peptone, soybean peptone, and tryptone. These peptones may be used alone or in combination of two or more. Among these, casein peptone is a preferred example.
黒色真菌懸濁液に含有させるアミノ酸については、天然型アミノ酸又は非天然型アミノ酸のいずれであってもよいが、好ましくは天然型アミノ酸が挙げられる。アミノ酸として天然型アミノ酸を使用する場合、２０種の天然型アミノ酸の中の１種又は２種以上の組み合わせであればよいが、好ましくは２種以上の組み合わせ、より好ましくは５種以上の組み合わせ、１０種以上又は１５種以上の組み合わせ、更に好ましくは１９種又は２０種の組み合わせであることが望ましい。天然型アミノ酸の内、システインは黒ずみ形成を遅延させる傾向があるので、黒ずみをより一層効率的に形成させるという観点から、黒色真菌懸濁液に含有させるアミノ酸として、システインを除く１９種の天然型アミノ酸の中から、好ましくは１種又は２種以上の組み合わせ、より好ましくは２種以上、更に好ましくは５種以上、１０種以上又は１５種以上の組み合わせ、特に好ましくは１９種組み合わせ（即ち、システイン以外の１９種の天然型アミノ酸の組み合わせ）が挙げられる。２種以上のアミノ酸を組み合わせて使用する場合、２種以上のアミノ酸の混合比については、特に制限されないが、例えば、２種以上のアミノ酸がそれぞれ等モル程度の混合比であることが挙げられる。 The amino acid to be contained in the black fungus suspension may be either a natural amino acid or a non-natural amino acid, but natural amino acids are preferred. When using natural amino acids as amino acids, it may be one or a combination of two or more of the 20 natural amino acids, preferably a combination of two or more, more preferably a combination of five or more, It is desirable to use a combination of 10 or more or 15 or more types, more preferably a combination of 19 or 20 types. Among natural amino acids, cysteine tends to delay the formation of blackheads, so from the viewpoint of forming blackheads more efficiently, 19 natural types of amino acids excluding cysteine were added to the black fungus suspension. Among amino acids, preferably one type or a combination of two or more types, more preferably two or more types, still more preferably a combination of 5 or more types, 10 or more types, or 15 or more types, particularly preferably a combination of 19 types (i.e. cysteine combinations of 19 natural amino acids other than When using two or more amino acids in combination, the mixing ratio of the two or more amino acids is not particularly limited, but for example, the mixing ratio of the two or more amino acids may be about equimolar.
黒色真菌懸濁液に含有させる糖類の種類については、特に制限されず、グルコ―ス、フルクトース、ガラクトース、マンノース等の単糖類；マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース等の二糖類；マルトトリオース、セロトリオース、ラフィノース等の三糖類等が挙げられる。これらの糖類は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、好ましくは単糖類、より好ましくはグルコースが挙げられる。 The type of sugar to be contained in the black fungus suspension is not particularly limited, and examples thereof include monosaccharides such as glucose, fructose, galactose, mannose, etc.; disaccharides such as maltose, sucrose, lactose, cellobiose, etc.; and trisaccharides such as maltotriose, cellotriose, raffinose, etc. These sugars may be used alone or in combination of two or more. Among these, monosaccharides are preferred, and glucose is more preferred.
黒色真菌懸濁液に含有させる脂肪酸及びその塩の種類については、特に制限されないが、例えば、炭素数6～24の脂肪酸及びその塩、好ましくは炭素数12～22の脂肪酸及びその塩、より好ましくは炭素数14～20の脂肪酸及びその塩が挙げられる。黒色真菌懸濁液に含有させる脂肪酸及びその塩は、飽和脂肪酸及びその塩、又は不飽和脂肪酸及びその塩のいずれであってもよい。黒色真菌懸濁液に含有させる脂肪酸及びその塩としては、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキジン酸、アラキドン酸、これらのアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等が挙げられる。これらの脂肪酸及びその塩の中から１種を選択して使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、好適な例としてオレイン酸及び／又はその塩が挙げられる。 The types of fatty acids and salts thereof to be contained in the black fungus suspension are not particularly limited, but for example, fatty acids having 6 to 24 carbon atoms and salts thereof, preferably fatty acids having 12 to 22 carbon atoms and salts thereof, more preferably. Examples include fatty acids having 14 to 20 carbon atoms and their salts. The fatty acid and its salt contained in the black fungus suspension may be either a saturated fatty acid and its salt, or an unsaturated fatty acid and its salt. Specifically, the fatty acids and salts thereof to be contained in the black fungus suspension include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidic acid, arachidonic acid, and alkali metal salts thereof ( sodium salt, potassium salt, etc.). One type may be selected from these fatty acids and their salts, or two or more types may be used in combination. Among these, preferred examples include oleic acid and/or its salts.
黒色真菌懸濁液において、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸、及び脂肪酸の塩の中の１種が単独で含まれていてもよく、また、これらの中の２種以上が組み合わされて含まれていてもよい。 The black fungus suspension may contain one of proteins, peptones, amino acids, sugars, fatty acids, and salts of fatty acids, or may contain a combination of two or more of these.
黒ずみをより一層効率的に形成させるという観点から、黒色真菌懸濁液の好適な例として、(1)ペプトンと、(2)糖類、脂肪酸、及び脂肪酸の塩の中の少なくとも１種とを含むものが挙げられる。黒色真菌懸濁液において、ペプトンと糖類とを組み合わせて使用する場合、これらの比率については、特に制限されないが、例えば、ペプトン100重量部当たり、糖類が10～1000重量部、好ましくは50～500重量部、より好ましくは50～250重量部、さらに好ましくは50～150重量部が挙げられる。また、黒色真菌懸濁液において、ペプトンと脂肪酸及び／又はその塩とを組み合わせて使用する場合、これらの比率については、特に制限されないが、例えば、ペプトン１００重量部当たり、脂肪酸及び／又はその塩が1～100重量部、好ましくは1～50重量部、より好ましくは5～25重量部、さらに好ましくは5～15重量部が挙げられる。 From the viewpoint of forming black spots more efficiently, a suitable example of a black fungal suspension includes one containing (1) peptone and (2) at least one of sugars, fatty acids, and salts of fatty acids. When peptone and sugars are used in combination in a black fungal suspension, the ratio is not particularly limited, but for example, 10 to 1000 parts by weight, preferably 50 to 500 parts by weight, more preferably 50 to 250 parts by weight, and even more preferably 50 to 150 parts by weight of sugar per 100 parts by weight of peptone. When peptone and fatty acids and/or salts thereof are used in combination in a black fungal suspension, the ratio is not particularly limited, but for example, 1 to 100 parts by weight, preferably 1 to 50 parts by weight, more preferably 5 to 25 parts by weight, and even more preferably 5 to 15 parts by weight of fatty acids and/or salts thereof per 100 parts by weight of peptone.
黒色真菌懸濁液において、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸、及び脂肪酸の塩の中の１種の成分の含有量については、使用する成分の種類等に応じて適宜設定すればよい。例えば、タンパク質の場合であれば、黒色真菌懸濁液における含有量として、1～50g/l、好ましくは3～30g/l、更に好ましくは5～20g/lが挙げられる。ペプトンの場合であれば、黒色真菌懸濁液における含有量として、1～50g/l、好ましくは3～30g/l、更に好ましくは5～20g/lが挙げられる。アミノ酸の場合であれば、黒色真菌懸濁液における含有量として、1～50g/l、好ましくは3～30g/l、更に好ましくは5～20g/lが挙げられる。糖類の場合であれば、黒色真菌懸濁液における含有量として、1～50g/l、好ましくは3～30g/l、更に好ましくは5～20g/lが挙げられる。脂肪酸及び／又はその塩の場合であれば、黒色真菌懸濁液における含有量として、0.1～5g/l、好ましくは0.3～3g/l、更に好ましくは0.5～2g/lが挙げられる。 In the black fungus suspension, the content of one component among proteins, peptones, amino acids, saccharides, fatty acids, and salts of fatty acids may be appropriately set depending on the type of component used. For example, in the case of protein, the content in the black fungus suspension may be 1 to 50 g/l, preferably 3 to 30 g/l, and more preferably 5 to 20 g/l. In the case of peptone, the content in the black fungal suspension is 1 to 50 g/l, preferably 3 to 30 g/l, and more preferably 5 to 20 g/l. In the case of amino acids, the content in the black fungus suspension is 1 to 50 g/l, preferably 3 to 30 g/l, and more preferably 5 to 20 g/l. In the case of sugars, the content in the black fungus suspension is 1 to 50 g/l, preferably 3 to 30 g/l, and more preferably 5 to 20 g/l. In the case of fatty acids and/or salts thereof, the content in the black fungal suspension is 0.1 to 5 g/l, preferably 0.3 to 3 g/l, and more preferably 0.5 to 2 g/l.
また、黒色真菌懸濁液には、前述する成分の他に、必要に応じて、硫黄源、リン源、ビタミン源、及びミネラル源等が含まれていてもよい。 In addition to the above-mentioned components, the black fungus suspension may also contain a sulfur source, a phosphorus source, a vitamin source, a mineral source, etc., as necessary.
第２工程では、黒ずみを形成させるために、黒色真菌懸濁液にＢＦ形成菌付着基材の一部を浸漬させて培養する。第２工程の培養によって、黒色真菌懸濁液の水面（喫水面）付近のＢＦ形成菌付着基材の表面領域に黒ずみが形成される。従って、ＢＦ形成菌付着基材のＢＦ形成細菌が付着している領域の少なくとも一部が黒色真菌懸濁液に浸漬した状態であり、且つ当該ＢＦ形成細菌が付着している領域の端部が黒色真菌懸濁液の水面と同じ高さ又は当該水面より高い位置になるように、ＢＦ形成菌付着基材を黒色真菌懸濁液に浸漬させることが好ましい。 In the second step, in order to form blackheads, a part of the BF-forming bacteria-attached substrate is immersed in a black fungal suspension and cultured. By culturing in the second step, dark spots are formed on the surface area of the BF-forming bacteria-attached substrate near the water surface (draft surface) of the black fungus suspension. Therefore, at least a part of the region of the BF-forming bacteria-adhering substrate to which the BF-forming bacteria are attached is immersed in the black fungal suspension, and the edge of the region to which the BF-forming bacteria are attached is It is preferable to immerse the BF-forming bacteria-attached substrate in the black fungal suspension so that it is at the same height as the water surface of the black fungal suspension or at a position higher than the water surface.
第２工程における培養時間については、黒ずみ形成が認められる範囲で適宜設定すればよいが、例えば、3日間以上、好ましくは4～14日間、より好ましくは5～10日間が挙げられる。 The culturing time in the second step may be appropriately set within a range where darkening formation is observed, and examples thereof include 3 days or more, preferably 4 to 14 days, and more preferably 5 to 10 days.
第２工程における培養時の温度については、黒ずみが形成可能な範囲であればよいが、例えば、15～35℃、好ましくは20～30℃、より好ましくは22～27℃また、第２工程における培養時の湿度については、例えば、50～100%RH、好ましくは70～100%RH、より好ましくは80～100%RHが挙げられる。 The temperature during the culture in the second step may be within a range in which blackening can occur, for example, 15 to 35°C, preferably 20 to 30°C, and more preferably 22 to 27°C. The humidity during the culture in the second step may be, for example, 50 to 100% RH, preferably 70 to 100% RH, and more preferably 80 to 100% RH.
また、第２工程において、より一層効率的に黒ずみを形成させるために、一定時間毎に、ＢＦ形成細菌付着基材を浸漬させている黒色真菌懸濁液を新鮮なものに交換することが好ましい。具体的には、6～48時間に１回、好ましくは12～36時間に１回、より好ましくは18～30時間に１回の頻度で、黒色真菌懸濁液を新鮮なものに交換することにより、より一層効率的に黒ずみを形成させることができる。 In addition, in the second step, in order to form black spots more efficiently, it is preferable to replace the black fungus suspension in which the BF-forming bacteria-adhering substrate is immersed with a fresh one at regular intervals. Specifically, by replacing the black fungus suspension with a fresh one once every 6 to 48 hours, preferably once every 12 to 36 hours, and more preferably once every 18 to 30 hours, black spots can be formed more efficiently.
更に、第２工程において、新鮮な黒色真菌懸濁液に交換する際には、その交換操作の前に、黒色真菌懸濁液に浸漬させているＢＦ形成細菌付着基材の領域に液体培地（以下、「第２液体培地」と表記することもある）を接触させることが好ましい。このように新鮮な黒色真菌懸濁液への交換毎に液体培地と接触させることにより、より一層効率的に黒ずみを形成させることができる。 Furthermore, in the second step, when exchanging to a fresh black fungal suspension, before the exchanging operation, a liquid medium ( Hereinafter, it is preferable to bring into contact a liquid medium (also referred to as a "second liquid medium"). By contacting the liquid medium each time the suspension is replaced with a fresh black fungus suspension, blackheads can be formed more efficiently.
黒色真菌懸濁液を浸漬させているＢＦ形成細菌付着基材の領域に第２液体培地を接触させるには、ＢＦ形成細菌付着基材を浸漬している黒色真菌懸濁液に第２液体培地を添加する方法、ＢＦ形成細菌付着基材を浸漬している黒色真菌懸濁液を除去して第２液体培地に交換する方法等によって行うことができる。 In order to bring the second liquid medium into contact with the area of the BF-forming bacteria-adhering substrate in which the black fungal suspension is immersed, the second liquid medium is added to the black fungal suspension in which the BF-forming bacteria-adhering substrate is immersed. This can be carried out by a method in which the black fungal suspension in which the BF-forming bacteria adheres substrate is immersed is removed and replaced with a second liquid medium, and the like.
第２液体培地の成分組成については、特に制限されず、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、ビタミン源、及びミネラル源等の成分の１種以上を含んでいればよい。 The composition of the second liquid medium is not particularly limited, and may contain one or more of the following components: a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, a phosphorus source, a vitamin source, and a mineral source.
第２液体培地は、マンニトールを含んでいることが好ましい。当該液体培地にマンニトールを含有させる場合、その濃度としては、例えば、5～20g/l、好ましくは5～15g/l、更に好ましくは7.5～12.5g/lが挙げられる。当該濃度は、ＢＦ形成細菌付着基材と接触する際のマンニトール濃度であり、ＢＦ形成細菌付着基材を浸漬している黒色真菌懸濁液に第２液体培地を添加する場合には、添加後のマンニトール濃度が前記範囲になるように調整すればよい。 Preferably, the second liquid medium contains mannitol. When the liquid medium contains mannitol, its concentration is, for example, 5 to 20 g/l, preferably 5 to 15 g/l, and more preferably 7.5 to 12.5 g/l. This concentration is the concentration of mannitol at the time of contact with the BF-forming bacteria adhesion substrate, and when adding the second liquid medium to the black fungus suspension in which the BF-forming bacteria adhesion substrate is immersed, the concentration is the mannitol concentration after the addition. The mannitol concentration may be adjusted to fall within the above range.
また、第２液体培地は、酵母エキスを含んでいることが好ましい。当該液体培地に酵母エキスを含有させる場合、その含有量としては、例えば、2.0～6.0g/l、好ましくは2.0～5.0g/l、更に好ましくは2.5～3.5g/lが挙げられる。当該濃度は、ＢＦ形成細菌付着基材と接触する際の酵母エキス濃度であり、ＢＦ形成細菌付着基材を浸漬している黒色真菌懸濁液に第２液体培地を添加する場合には、添加後の酵母エキス濃度が前記範囲になるように調整すればよい。 The second liquid medium preferably contains yeast extract. When yeast extract is contained in the liquid medium, the content is, for example, 2.0 to 6.0 g/l, preferably 2.0 to 5.0 g/l, and more preferably 2.5 to 3.5 g/l. This concentration is the yeast extract concentration when it comes into contact with the BF-forming bacteria-adhering substrate, and when the second liquid medium is added to the black fungus suspension in which the BF-forming bacteria-adhering substrate is immersed, the yeast extract concentration after addition may be adjusted to be within the above range.
また、第２液体培地は、水溶性カルシウム塩を含んでいることが好ましい。水溶性カルシウム塩としては、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム等が挙げられる。これらの水溶性カルシウム塩は、水和物の形態であってもよい。当該液体培地に水溶性カルシウム塩を含有させる場合、その含有量としては、例えば、水溶性カルシウム塩の無水物換算量で、0.1～1.5g/l、好ましくは0.2～1.0g/l、更に好ましくは0.3～0.8g/lが挙げられる。当該濃度は、ＢＦ形成細菌付着基材と接触する際の水溶性カルシウム塩濃度であり、ＢＦ形成細菌付着基材を浸漬している黒色真菌懸濁液に第２液体培地を添加する場合には、添加後の水溶性カルシウム塩濃度が前記範囲になるように調整すればよい。 The second liquid medium preferably contains a water-soluble calcium salt. Examples of water-soluble calcium salts include calcium chloride, calcium lactate, calcium gluconate, calcium acetate, and calcium bicarbonate. These water-soluble calcium salts may be in the form of hydrates. When the liquid medium contains a water-soluble calcium salt, the content of the water-soluble calcium salt is, for example, 0.1 to 1.5 g/l, preferably 0.2 to 1.0 g/l, and more preferably 0.3 to 0.8 g/l, calculated as the anhydrous amount of the water-soluble calcium salt. This concentration is the concentration of the water-soluble calcium salt when it comes into contact with the BF-forming bacteria-adhering substrate. When the second liquid medium is added to the black fungus suspension in which the BF-forming bacteria-adhering substrate is immersed, the concentration of the water-soluble calcium salt after the addition may be adjusted to be within the above range.
黒色真菌懸濁液を浸漬させているＢＦ形成細菌付着基材の領域に第２液体培地を接触させる時間については、特に制限されないが、例えば、1～60分間、好ましくは5～30分間、より好ましくは5～15分間が挙げられる。 The time period for which the second liquid medium is brought into contact with the area of the BF-forming bacteria-attached substrate in which the black fungus suspension is immersed is not particularly limited, but may be, for example, 1 to 60 minutes, preferably 5 to 30 minutes, or more. Preferably, the time is 5 to 15 minutes.
斯くして第２工程を行うことにより、黒色真菌懸濁液の水面（喫水面）付近に位置していた基材の表面領域に黒ずみが形成される。 By performing the second step in this manner, dark spots are formed on the surface region of the substrate that was located near the water surface (draft surface) of the black fungal suspension.
２．抗黒ずみ効果の評価方法
本発明の抗黒ずみ効果の評価方法は、基材の少なくとも一部にＢＦ形成細菌を付着させる第１工程；並びに、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、ＢＦ形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程を含み、前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、前記第２工程中、及び前記第２工程後よりなる群から選択される少なくとも１つの段階において、被験試料を添加し、被験試料を添加した条件と被験試料を添加していない条件で黒ずみの状態を対比することを特徴とする。
2. Method for evaluating anti-blackening effect The method for evaluating anti-blackening effect of the present invention includes a first step of attaching BF-forming bacteria to at least a portion of a substrate; a second step of forming blackheads by immersing and culturing a part of the substrate on which the BF-forming bacteria are attached to a black fungal suspension containing at least one species selected from the group consisting of: During one step, at least one step selected from the group consisting of after the first step and before the second step, during the second step, and after the second step, adding the test sample; It is characterized by comparing the state of darkening under conditions in which the test sample was added and conditions in which the test sample was not added.
本発明の抗黒ずみ効果の評価方法は、被験試料が有する抗黒ずみ効果を評価する方法である。抗黒ずみ効果とは、黒ずみ形成を遅延させる効果、及び形成された黒ずみを除去する効果を指しており、本発明の抗黒ずみ効果の評価方法では、被験試料が有する抗黒ずみ効果の有無及び強弱を判定することができる。 The method for evaluating the anti-darkening effect of the present invention is a method for evaluating the anti-darkening effect of a test sample. The anti-darkening effect refers to the effect of delaying the formation of darkening and the effect of removing darkening that has already formed, and the method for evaluating the anti-darkening effect of the present invention can determine the presence or absence and the strength of the anti-darkening effect of the test sample.
被験試料とは、抗黒ずみ効果の有無及び強弱の評価対象となる試料であり、単一化合物であってもよく、また、２以上の成分が含まれる組成物（例えば、トイレ便器用の洗浄剤組成物）であってもよい。 The test sample is a sample to be evaluated for the presence or absence of anti-blackhead effect and its strength, and may be a single compound or a composition containing two or more components (for example, a toilet bowl cleaner). composition).
本発明の抗黒ずみ効果の評価方法において、第１工程及び第２工程の具体的態様は、前記黒ずみ形成方法の場合と同様である。また、本発明の抗黒ずみ効果の評価方法において、第１工程後且つ第２工程前には、前記黒ずみ形成方法の場合と同様に、栄養源補給工程を行ってもよい。 In the method for evaluating the anti-darkening effect of the present invention, the specific aspects of the first step and the second step are the same as in the case of the method for forming darkening. Further, in the method for evaluating the anti-blackhead effect of the present invention, a nutrient source supplying step may be performed after the first step and before the second step, as in the case of the method for forming blackheads.
前記第１工程中に被験試料を添加する場合、予め被験試料を添加した前記ＢＦ形成菌懸濁液を基材に接触させてもよく、また、前記ＢＦ形成菌懸濁液と基材を接触させている段階で、前記ＢＦ形成菌懸濁液中に被験試料を添加してもよい。前記第１工程後且つ第２工程前に被験試料を添加する場合、前記第１工程後のＢＦ形成菌付着基材に被験試料を添加すればよく、また、栄養源補給工程を行う場合には、前記第１液体培地中に被験試料を添加してもよく、更に栄養源補給工程後のＢＦ形成菌付着基材に被験試料を添加してもよい。前記第２工程中に被験試料を添加する場合、前記黒色真菌懸濁液中に被験試料を添加してもよく、また前記第２液体培地中に被験試料を添加してもよい。また、前記第２工程後に被験試料を添加する場合、第２工程後に形成された黒ずみに対して被験試料を添加すればよい。 When adding a test sample during the first step, the BF-forming bacteria suspension to which the test sample has been added may be brought into contact with the substrate, or the BF-forming bacteria suspension may be brought into contact with the substrate. During this step, a test sample may be added to the BF-forming bacteria suspension. When adding the test sample after the first step and before the second step, the test sample may be added to the BF-forming bacteria adhesion substrate after the first step, and when performing the nutrient supply step, , the test sample may be added to the first liquid medium, and further the test sample may be added to the BF-forming bacteria-attached substrate after the nutrient supply step. When adding a test sample during the second step, the test sample may be added to the black fungal suspension, or may be added to the second liquid medium. Furthermore, when adding a test sample after the second step, the test sample may be added to the dark spots formed after the second step.
前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、又は前記第２工程中に被験試料を添加した場合、第２工程後に形成された黒ずみの状態（大きさ、数等）を観察し、被験試料を添加していない条件での黒ずみに比べて、黒ずみの数が少ない、又は黒ずみが小さい場合には、当該被験試料は、黒ずみ形成を遅延させる効果があると判定される。 If the test sample is added during the first step, after the first step and before the second step, or during the second step, observe the state (size, number, etc.) of the dark spots formed after the second step. However, if the number of blackheads is smaller or the number of blackheads is smaller than that under conditions where the test sample is not added, it is determined that the test sample has the effect of delaying the formation of blackheads.
また、前記第２工程後に被験試料を添加した場合、被験試料添加後に黒ずみの状態（大きさ、数等）を経時的に観察し、被験試料を添加していない条件での黒ずみに比べて、黒ずみの数が減っている、又は黒ずみが小さくなっている場合には、当該被験試料は、黒ずみを除去する効果があると判定される。 In addition, when the test sample is added after the second step, the state of the darkening (size, number, etc.) is observed over time after the addition of the test sample, and compared to the darkening under the condition where the test sample is not added. If the number of blackheads has decreased or the size of blackheads has become smaller, the test sample is determined to be effective in removing blackheads.
３．抗黒ずみ効果を有する物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、基材の少なくとも一部にＢＦ形成細菌を付着させる第１工程；並びに、タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、ＢＦ形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程を含み、前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、前記第２工程中、及び前記第２工程後よりなる群から選択される少なくとも１つの段階において、候補物質を添加し、候補物質を添加した条件と候補物質を添加していない条件で形成された黒ずみの状態を対比することを特徴とする。
3. Screening method for substances having anti-darkening effect The screening method of the present invention comprises a first step of attaching BF-forming bacteria to at least a part of a substrate, and a second step of immersing and culturing a part of the substrate to which the BF-forming bacteria are attached in a black fungus suspension containing at least one member selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, sugars, fatty acids, and salts of fatty acids, thereby forming darkening, and is characterized in that a candidate substance is added in at least one stage selected from the group consisting of during the first step, after the first step and before the second step, during the second step, and after the second step, and the state of darkening formed under conditions where the candidate substance is added is compared with that formed under conditions where the candidate substance is not added.
抗黒ずみ効果とは、黒ずみを形成させない効果、黒ずみの形成を遅延させる効果、及び形成された黒ずみを除去する効果を指しており、本発明のスクリーニング方法では、候補物質の中から抗黒ずみ効果を有するものを選択することができる。 The anti-blackhead effect refers to the effect of preventing the formation of blackheads, the effect of delaying the formation of blackheads, and the effect of removing formed blackheads.In the screening method of the present invention, the anti-blackhead effect is selected from candidate substances. You can choose what you have.
候補物質は、抗黒ずみ効果の有無が判定される試料であり、単一化合物であってもよく、また、２以上の成分が含まれる組成物（例えば、トイレ便器用の洗浄剤組成物）であってもよい。 The candidate substance is a sample for which the presence or absence of anti-blackhead effect is determined, and may be a single compound or a composition containing two or more components (for example, a toilet bowl cleaning composition). There may be.
本発明のスクリーニング方法において、第１工程及び第２工程の具体的態様は、前記黒ずみ形成方法の場合と同様である。また、本発明のスクリーニング方法において、第１工程後且つ第２工程前には、前記黒ずみ形成方法の場合と同様に、栄養源補給工程を行ってもよい。 In the screening method of the present invention, the specific aspects of the first step and the second step are the same as in the case of the dark spot forming method. Further, in the screening method of the present invention, after the first step and before the second step, a nutrient source supply step may be performed as in the case of the blackhead forming method.
前記第１工程中に候補試料を添加する場合、予め候補試料を添加した前記ＢＦ形成菌懸濁液を基材に接触させてもよく、また、前記ＢＦ形成菌懸濁液と基材を接触させている段階で、前記ＢＦ形成菌懸濁液中に候補試料を添加してもよい。前記第１工程後且つ第２工程前に候補試料を添加する場合、前記第１工程後のＢＦ形成菌付着基材に候補試料を添加すればよく、また、栄養源補給工程を行う場合には、前記第１液体培地中に候補試料を添加してもよく、更に栄養源補給工程後のＢＦ形成菌付着基材に候補試料を添加してもよい。前記第２工程中に候補試料を添加する場合、前記黒色真菌懸濁液中に候補試料を添加してもよく、また前記第２液体培地中に候補試料を添加してもよい。また、前記第２工程後に候補試料を添加する場合、第２工程後に形成された黒ずみに対して候補試料を添加すればよい。 When adding a candidate sample during the first step, the BF-forming bacteria suspension to which the candidate sample has been added may be brought into contact with the substrate, or the BF-forming bacteria suspension may be brought into contact with the substrate. During this step, a candidate sample may be added to the BF-forming bacteria suspension. When adding a candidate sample after the first step and before the second step, the candidate sample may be added to the BF-forming bacteria adhesion substrate after the first step, and when performing the nutrient supply step, , the candidate sample may be added to the first liquid medium, and furthermore, the candidate sample may be added to the BF-forming bacteria-attached substrate after the nutrient supply step. When adding a candidate sample during the second step, the candidate sample may be added to the black fungal suspension, or may be added to the second liquid medium. Furthermore, when adding a candidate sample after the second step, the candidate sample may be added to the dark spots formed after the second step.
前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、又は前記第２工程中に候補試料を添加した場合、第２工程後に形成された黒ずみの状態（大きさ、数等）を観察し、候補物質を添加していない条件での黒ずみに比べて、黒ずみの数が少ない、又は黒ずみが小さい場合には、当該候補物質は、黒ずみ形成を遅延させる効果を有すると判定される。 When the candidate sample is added during the first step, after the first step and before the second step, or during the second step, the state (size, number, etc.) of the dark spots formed after the second step is observed, and if the number of dark spots is smaller or the dark spots are smaller than those formed under conditions in which the candidate substance is not added, the candidate substance is determined to have the effect of delaying the formation of dark spots.
また、前記第２工程後に候補物質を添加した場合、候補物質添加後に黒ずみの状態（大きさ、数等）を経時的に観察し、候補物質を添加していない条件での黒ずみに比べて、黒ずみの数が減っている、又は黒ずみが小さくなっている場合には、当該候補物質は、黒ずみを除去する効果があると判定される。 In addition, if a candidate substance is added after the second step, the state of the dark spots (size, number, etc.) is observed over time after the addition of the candidate substance, and if the number of dark spots is reduced or the dark spots are smaller than when the candidate substance is not added, the candidate substance is determined to have the effect of removing dark spots.
本発明のスクリーニング方法において、抗黒ずみ効果（黒ずみ形成を遅延させる効果、及び／又は黒ずみを除去する効果）があると判定された候補物質は、抗黒ずみ効果を有している物質として選択される。 In the screening method of the present invention, a candidate substance determined to have an anti-blackhead effect (effect of delaying the formation of blackheads and/or effect of removing blackheads) is selected as a substance having an anti-blackhead effect. .
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in detail based on Examples, but the present invention is not limited thereto.
試験例１：黒ずみ形成試験
１．方法
ＢＦ形成菌（Rhizobium sp.、環境分離株）を前培養し、その前培養液を液体培地（酵母エキス3 g/l、CaCl2・2H2O 0.83 g/l、及びマンニトール10 g/l含有）にOD(600nm)が1.0となるよう加えて、ＢＦ形成菌懸濁液を作製した。次いで、ＢＦ形成菌懸濁液2mlを12ウェルプレートの各ウェルに分注し、更に各ウェルにカバーガラス（基材；縦1.8 cm、横1.8 cm）を立てかけて、ウェル中のＢＦ形成菌懸濁液にカバーガラスの一部を浸漬させた。その後、12ウェルプレートに蓋をして、25 ℃、100 ％RHのインキュベーター内で2時間静置し、カバーガラスの表面にＢＦ形成菌を付着させた。
Test example 1: Dark spot formation test
1. Method BF-forming bacteria (Rhizobium sp., an environmental isolate) were precultured and the preculture was mixed with a liquid medium (yeast extract 3 g/l, CaCl 2 2H 2 O 0.83 g/l, and mannitol 10 g/l). (containing) so that the OD (600 nm) was 1.0 to prepare a BF-forming bacterial suspension. Next, 2 ml of the BF-forming bacteria suspension was dispensed into each well of a 12-well plate, and a cover glass (substrate; length 1.8 cm, width 1.8 cm) was placed against each well to remove the BF-forming bacteria suspension in the well. A part of the cover glass was immersed in the suspension. Thereafter, the 12-well plate was covered and left to stand for 2 hours in an incubator at 25°C and 100% RH to allow BF-forming bacteria to adhere to the surface of the cover glass.
第１液体培地（酵母エキス3 g/l、CaCl2・2H2O 0.83 g/l、及びマンニトール10 g/l含有）2 mlを新たな12ウェルプレートの各ウェルに分注し、更に各ウェルにＢＦ形成菌を付着させたカバーガラスを立てかけて、カバーガラスのＢＦ形成菌が付着している領域を液体培地中に浸漬させた。その後、12ウェルプレートに蓋をして、25 ℃のインキュベーター内で10分間静置した。 2 ml of the first liquid medium (containing 3 g/l yeast extract, 0.83 g/l CaCl2 · 2H2O , and 10 g/l mannitol) was dispensed into each well of a new 12-well plate, and a cover glass with BF-forming bacteria attached was placed upright in each well so that the area of the cover glass with the BF-forming bacteria attached was immersed in the liquid medium. The 12-well plate was then covered with a lid and left to stand in an incubator at 25°C for 10 minutes.
次いで、カバーガラスを立てかけている各ウェル中の液体培地を除去した後に、表１及び２に示す組成の黒色真菌懸濁液2 mlを分注し、カバーガラスのＢＦ形成菌が付着している領域を黒色真菌懸濁液中に浸漬させた。その後、12ウェルプレートに蓋をして、25 ℃、100 ％RHのインキュベーター内で1日間培養した。 Next, after removing the liquid medium from each well in which the cover glass was propped up, 2 ml of a black fungus suspension with the composition shown in Tables 1 and 2 was dispensed, and the area of the cover glass to which the BF-forming bacteria were attached was immersed in the black fungus suspension. The 12-well plate was then covered and cultured for one day in an incubator at 25°C and 100% RH.
その後、カバーガラスを立てかけている各ウェルに第２液体培地（酵母エキス15 g/l、CaCl2・2H2O 4.15 g/l、及びマンニトール50 g/l含有）0.5 mlを添加し、12ウェルプレートに蓋をして、25 ℃のインキュベーター内で10分間培養した（操作Ａ）。次いで、カバーガラスを立てかけている各ウェル中の液体を除去した後に、表１及び２に示す組成の黒色真菌懸濁液2 mlを再度分注し、12ウェルプレートに蓋をして、25 ℃、100％RHのインキュベーター内で1日間培養した（操作Ｂ）。この操作Ａ及びＢを合計6回繰り返し実施した。 Then, 0.5 ml of the second liquid medium (containing 15 g/l of yeast extract, 4.15 g/l of CaCl 2 2H 2 O, and 50 g/l of mannitol) was added to each well on which the cover glass was propped up, and 12 wells were added. The plate was covered and incubated for 10 minutes in an incubator at 25°C (Procedure A). Next, after removing the liquid in each well on which the cover glass was propped, 2 ml of the black fungal suspension with the composition shown in Tables 1 and 2 was again dispensed, the 12-well plate was covered, and the mixture was incubated at 25 °C. , and cultured in a 100% RH incubator for 1 day (Procedure B). These operations A and B were repeated a total of 6 times.
その後、各ウェルからカバーガラスを取り出して目視で観察し、カバーガラス表面での黒ずみの形成の有無及び程度を以下の基準に従って評価した。
＜黒ずみの形成の評価基準＞
－ ：黒ずみが形成されていない。
± ：黒ずみが形成されているが、その形成量は少ない。
＋ ：黒ずみが形成されているが、その形成量はやや少ない。
＋＋ ：黒ずみが形成されているが、その形成量はやや多い。
＋＋＋ ：黒ずみが形成されており、その形成量は多い。
＋＋＋＋：黒ずみが形成されており、その形成量は非常に多い。
Thereafter, the cover glass was removed from each well and visually observed, and the presence or absence and the degree of blackening on the surface of the cover glass were evaluated according to the following criteria.
<Evaluation criteria for darkening formation>
-: No dark spots formed.
±: Dark spots were formed, but the amount of formation was small.
+: Dark spots are formed, but the amount of formation is rather small.
++: Dark spots are formed, but the amount is somewhat large.
+++: Dark spots have formed and the amount of formation is large.
++++: Dark spots are formed and the amount of formation is very large.
２．結果
黒ずみの形成の評価結果を表１及び２に示す。また、試験終了後に、カバーガラスを立てかけている各ウェルの外観を観察した結果を図１に示す。この結果、ＢＦ形成菌を付着させた基材に対して、カゼインペプトン、ウシ胎児血清アルブミン、アミノ酸、グルコース、及びオレイン酸ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも１種の存在下で、黒色真菌を培養することにより、カバーガラスの喫水部周辺に黒ずみを形成できることが明らかとなった（実施例１～１５）。特に、カゼインペプトンと、グルコース及び／又はオレイン酸ナトリウムとを併用した場合には、黒ずみの形成を格段に促進できることが確認された（実施例１３、１４及び１５）。
2. Results The evaluation results for the formation of dark spots are shown in Tables 1 and 2. Furthermore, after the test was completed, the appearance of each well with a cover glass propped up was observed, and the results are shown in FIG. As a result, black fungi were grown on the substrate to which BF-forming bacteria were attached in the presence of at least one selected from the group consisting of casein peptone, fetal bovine serum albumin, amino acids, glucose, and sodium oleate. It was revealed that by culturing, dark spots could be formed around the draft part of the cover glass (Examples 1 to 15). In particular, it was confirmed that when casein peptone and glucose and/or sodium oleate were used in combination, the formation of dark spots could be significantly promoted (Examples 13, 14, and 15).
試験例２：黒ずみ形成を遅延させる効果の評価試験
１．方法
黒色真菌懸濁液の代わりに表３に示す薬剤含有又は非含有の黒色真菌懸濁液を使用したこと以外は、前記試験例１と同様の方法で試験を行い、黒ずみの形成の有無及び程度を評価した。なお、黒色真菌懸濁液に添加されている薬剤Ａは、除菌剤が含まれておらず、除菌作用が低い洗浄剤である。また、黒色真菌懸濁液に添加されている薬剤Ｂは、除菌剤が含まれており、除菌作用が高い洗浄剤である。
Test Example 2: Evaluation test of effect of delaying formation of dark spots
1. Method: A test was performed in the same manner as in Test Example 1, except that a black fungus suspension containing or not containing a drug shown in Table 3 was used instead of the black fungus suspension, and the presence or absence and the degree of blackening were evaluated. Note that Drug A added to the black fungus suspension does not contain a disinfectant and is a cleaning agent with low disinfecting action. Drug B added to the black fungus suspension contains a disinfectant and is a cleaning agent with high disinfecting action.
２．結果
黒ずみの形成の評価結果および黒ずみ形成遅延効果を表３に示す。また、試験終了後に、カバーガラスを立てかけている各ウェルの外観を観察した結果を図２に示す。この結果、ＢＦ形成菌を付着させた基材に対して、カゼインペプトン及びグルコースの存在下で黒色真菌を培養する際に薬剤を共存させると、当該薬剤の除菌作用の程度に応じて、黒ずみの形成速度を遅延させ得ることが分かった。即ち、試験例１の各実施例で示した黒ずみ形成方法は、薬剤の除菌作用の評価に利用できることが明らかとなった。
2. Results The evaluation results for the formation of dark spots and the effect of delaying the formation of dark spots are shown in Table 3. Furthermore, after the test was completed, the appearance of each well with a cover glass propped up was observed, and the results are shown in FIG. As a result, if a drug is allowed to coexist with a substrate on which BF-forming bacteria are adhered when culturing black fungi in the presence of casein peptone and glucose, blackheads will occur depending on the degree of sterilization effect of the drug. It has been found that the rate of formation of can be retarded. That is, it became clear that the method of forming blackheads shown in each example of Test Example 1 can be used for evaluating the sterilizing effect of drugs.
Claims (6)
基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる第１工程、並びに
タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程。 A method for forming a dark spot, comprising the steps of:
A first step comprises attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of a substrate, and a second step comprises immersing the portion of the substrate to which the biofilm-forming bacteria is attached in a black fungus suspension containing at least one member selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, sugars, fatty acids, and salts of fatty acids, and culturing the suspension to form a black spot.
基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる第１工程、並びに
タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程を含み、
前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、前記第２工程中、及び前記第２工程後よりなる群から選択される少なくとも１つの段階において、被験試料を添加し、被験試料を添加した条件と被験試料を添加していない条件で黒ずみの状態を対比する、評価方法。 A method for evaluating the anti-darkening effect of a test sample, comprising the steps of:
The method includes a first step of attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of a substrate, and a second step of immersing and culturing the portion of the substrate to which the biofilm-forming bacteria is attached in a black fungus suspension containing at least one member selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, sugars, fatty acids, and salts of fatty acids, thereby forming a black spot,
An evaluation method comprising adding a test sample at at least one stage selected from the group consisting of during the first step, after the first step and before the second step, during the second step, and after the second step, and comparing the state of darkening under a condition in which the test sample is added with a condition in which the test sample is not added.
基材の少なくとも一部にバイオフィルム形成細菌を付着させる第１工程、並びに
タンパク質、ペプトン、アミノ酸、糖類、脂肪酸及び脂肪酸の塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含む黒色真菌懸濁液に、バイオフィルム形成細菌が付着した基材の一部を浸漬させて培養することにより、黒ずみを形成させる第２工程を含み、
前記第１工程中、前記第１工程後且つ第２工程前、前記第２工程中、及び前記第２工程後よりなる群から選択される少なくとも１つの段階において、候補試料を添加し、候補試料を添加した条件と候補試料を添加していない条件で黒ずみの状態を対比する、評価方法。 A method of screening for a substance having an anti-blackhead effect, the method comprising:
A first step of attaching biofilm-forming bacteria to at least a portion of the substrate, and a black fungal suspension containing at least one member selected from the group consisting of proteins, peptones, amino acids, saccharides, fatty acids, and salts of fatty acids. , a second step of forming blackheads by immersing and culturing a part of the substrate to which biofilm-forming bacteria have adhered;
In at least one stage selected from the group consisting of during the first step, after the first step and before the second step, during the second step, and after the second step, a candidate sample is added. An evaluation method that compares the state of darkening under conditions with and without the addition of candidate samples.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022150951A JP2024045883A (en) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | Black stain forming method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022150951A JP2024045883A (en) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | Black stain forming method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024045883A true JP2024045883A (en) | 2024-04-03 |
Family
ID=90481378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022150951A Pending JP2024045883A (en) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | Black stain forming method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2024045883A (en) |
-
2022
- 2022-09-22 JP JP2022150951A patent/JP2024045883A/en active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6552416B2 (en) | Mixture of dried spore germinant compounds | |
| JP6790104B2 (en) | Probiotic composition and its use | |
| US20050079594A1 (en) | Method of removing a biofilm | |
| US5366983A (en) | Use of quaternary ammonium compounds to remove salmonella contamination from meat products | |
| JP2006504835A (en) | Biofilm removal method | |
| BRPI0715486A2 (en) | BIOFILME ENZYMATIC CONTROL AND PREVENTION | |
| Millsap et al. | Adhesive interactions between voice prosthetic yeast and bacteria on silicone rubber in the absence and presence of saliva | |
| JP2024045883A (en) | Black stain forming method | |
| JP2009067715A (en) | Mold treating agent and mold treatment method | |
| Perry et al. | Enzymes released during hatching of Globodera rostochiensis and Meloidogyne incognita | |
| Zampatti et al. | An in vitro mouth model to test antiplaque agents: preliminary studies using a toothpaste containing chlorhexidine | |
| JP2008520231A (en) | Lawsonia intracellularis culture method | |
| JP5670783B2 (en) | Biofilm removal method | |
| JP7370203B2 (en) | How to form blackheads | |
| JPH11513901A (en) | Methods and kits for pretreatment of a target surface | |
| US12048754B2 (en) | Dental desensitizer | |
| TWI718658B (en) | Bittern is used to treat or prevent oral related diseases | |
| US20210322284A1 (en) | Dental desensitizer | |
| JP2012126758A (en) | Biofilm removing agent | |
| Areekijseree et al. | Activity profiles at different pH and temperature of cellulases and lipases in freshwater pearl mussel: Hyriopsis (Hyriopsis) bialatus, Simpson 1900 | |
| Heungens | Pre-and post-infection interactions between the biocontrol agent Burkholderia vietnamiensis AMMDR1 and oomycete pathogens of pea | |
| Pronk et al. | Laccase from Myceliophthora thermophila expressed in Aspergillus oryzae | |
| Ramesh | Development and evaluation of a prototype poultry transport container decontamination system | |
| Pruett | Sanitizer efficacy against bacteria attached to synthetic meat processing surfaces | |
| 沈继红 | Medium optimization of Tetraselmis sp.-1 using response surface methodology |