JP2023554620A

JP2023554620A - System and method for regenerating chips

Info

Publication number: JP2023554620A
Application number: JP2023536196A
Authority: JP
Inventors: チェン、グオジュン; シュミッド、ジェラード; リアリック、トッド; レイモンドサーストン、トーマス; ホワン、ハイドン
Original assignee: Quantum Si Inc
Current assignee: Quantum Si Inc
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2023-12-28
Also published as: WO2022132821A1; US20220187205A1; CN116847930A; AU2021400519A1; EP4243988A1; CA3205123A1; WO2022132821A9

Abstract

本開示の態様は、センサチップ表面を再生するための方法およびシステムに関連し、連続する試料採取サイクルの間にセンサチップの表面を再生することにより、複数の試料採取サイクルにおいて単一のセンサチップを再使用するための技術を含む。試料を処理する集積デバイスを再使用するための方法であって、試料が複数のアリコートに分割され、方法が、複数のアリコートの第１のアリコートを、集積デバイスの複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する工程と、分析物が複数のチャンバの少なくとも一部に存在する間に、第１のアリコートの分析物を試料採取する工程と、集積デバイスの複数のチャンバの少なくとも一部から第１のアリコートを取り出す工程と、複数のアリコートの第２のアリコートを、集積デバイスの複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する工程とを含む方法が提供される。Aspects of the present disclosure relate to methods and systems for regenerating a sensor chip surface, wherein a single sensor chip in multiple sampling cycles by regenerating the surface of the sensor chip during successive sampling cycles. including techniques for reusing. A method for reusing an integration device for processing a sample, wherein the sample is divided into a plurality of aliquots, the method comprising: placing a first aliquot of the plurality of aliquots into at least a portion of a plurality of chambers of the integration device. loading a first aliquot of the analyte while the analyte is present in at least a portion of the plurality of chambers; and sampling the first aliquot from at least a portion of the plurality of chambers of the integration device. and loading a second aliquot of the plurality of aliquots into at least a portion of the plurality of chambers of the integrated device.

Description

本開示は、何万もの反応チャンバに対して同時に短光パルスを提供し、反応チャンバから試料分析用の蛍光信号を受け取ることによって、試料の超並列分析を行うことのできる集積デバイスおよびそれに関連する機器に関する。当該機器はポイント・オブ・ケア遺伝学的シークエンシングや個人化医療に有用であり得る。 The present disclosure relates to an integrated device capable of performing massively parallel analysis of a sample by simultaneously providing short light pulses to tens of thousands of reaction chambers and receiving fluorescent signals for sample analysis from the reaction chambers. Regarding equipment. The device may be useful for point-of-care genetic sequencing and personalized medicine.

様々な用途で光を検出するのに光検出器が使用される。入射光の強度を示す電気信号を生成する集積型光検出器が開発されている。撮像用途の集積型光検出器は、シーン全体から受光した光の強度を検出するピクセルアレイを含む。集積型光検出器の例には、電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサや相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサが含まれる。 Photodetectors are used to detect light in a variety of applications. Integrated photodetectors have been developed that generate electrical signals indicative of the intensity of incident light. Integrated photodetectors for imaging applications include pixel arrays that detect the intensity of light received from across a scene. Examples of integrated photodetectors include charge coupled device (CCD) image sensors and complementary metal oxide semiconductor (CMOS) image sensors.

生物学的試料や化学的試料を超並列分析できる機器は、大きなサイズ、可搬性の欠如、当該機器を操作する熟練技術者の要求、出力の必要性、制御された操作環境の必要性、コストといった理由から、一般に研究室での使用に限定されている。このような機器を使用して試料を分析する場合、臨床でまたは現場で試料を抽出し、その試料を研究室に送り、分析結果を待つのが一般的なパラダイムである。結果を待つ時間は、数時間から数日の幅がある。 Instruments capable of massively parallel analysis of biological and chemical samples suffer from large size, lack of portability, requirement for skilled technicians to operate the instrument, need for output, need for a controlled operating environment, and cost. For these reasons, it is generally limited to use in laboratories. When analyzing samples using such instruments, the common paradigm is to extract the sample clinically or in the field, send the sample to a laboratory, and await analysis results. The wait time for results can range from several hours to several days.

本明細書で開示される技術の態様は、ポリペプチド分子または核酸分子を含有する試料の同一性または配列を決定する方法と関連する。さらなる態様は、単一分子シークエンシングを含む、試料を次世代シークエンシングするための方法およびデバイスと関連する。本開示の態様は、発光分子、例えば発光標識等（例えば、フルオロフォア）を使用してポリペプチドまたは核酸分子をシークエンシングするための方法およびシステムと関連する。 Aspects of the technology disclosed herein relate to methods of determining the identity or sequence of a sample containing polypeptide or nucleic acid molecules. Further aspects relate to methods and devices for next generation sequencing of samples, including single molecule sequencing. Aspects of the present disclosure relate to methods and systems for sequencing polypeptides or nucleic acid molecules using luminescent molecules, such as luminescent labels (eg, fluorophores).

本開示に基づくシステムは単一分子分析を可能にする。例示的システムは、集積デバイス（チップとも呼ばれる）、および集積デバイスとインタフェース接続するように構成された装置を含む。集積デバイスは、ピクセルのアレイを含み得るが、個々のピクセルは試料ウェルおよび少なくとも１つの光検出器を含む。集積デバイスの試料ウェルは、集積デバイスの表面上に、またはそれを通じて形成され、そして集積デバイスの表面上に配置される試料を受け入れるように構成され得る。総じて、試料ウェルは試料ウェルのアレイとして形成され得る。試料ウェルの少なくとも一部分が単一試料（例えば、単一種類の生体分子を含有する試料）を受け入れるように、複数の試料ウェルが適するサイズおよび形状を有し得る。一部の実施形態では、一部の試料ウェルが１つの試料を収納する一方、その他の試料ウェルは、０、２個、またはそれ超の試料を収納するように、試料ウェル中の試料の数が集積デバイスの試料ウェルにおいて分布し得る。 Systems based on the present disclosure enable single molecule analysis. An example system includes an integrated device (also referred to as a chip) and an apparatus configured to interface with the integrated device. The integrated device may include an array of pixels, each pixel including a sample well and at least one photodetector. A sample well of an integrated device may be formed on or through a surface of the integrated device and configured to receive a sample disposed on the surface of the integrated device. Generally, the sample wells can be formed as an array of sample wells. The plurality of sample wells can have a suitable size and shape such that at least a portion of the sample wells receive a single sample (eg, a sample containing a single type of biomolecule). In some embodiments, the number of samples in the sample wells is such that some sample wells contain one sample while other sample wells contain zero, two, or more samples. may be distributed in the sample well of the integrated device.

本開示の一部の実施形態は、複数のアリコートに分割される試料を処理する集積デバイスを再使用するための方法を提供する。様々な実施形態では、試料が分析物を含み、そして分析物が１つまたは複数の発光標識された分子を含む生体分子を含み、方法は、複数のアリコートの第１のアリコートを、集積デバイスの複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する（ｌｏａｄｉｎｇ）工程と；分析物が複数のチャンバの少なくとも一部に存在する間に、第１のアリコートの分析物を試料採取する工程であって、１つまたは複数の発光標識された分子により放出されたシグナルの発光寿命、発光強度、波長、パルス持続時間、および／またはパルス間の持続時間を決定することを含む、試料採取する工程と；集積デバイスの複数のチャンバの少なくとも一部から第１のアリコートを取り出す工程と；複数のアリコートの第２のアリコートを、集積デバイスの複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する工程とを含む。アリコートという用語は、一部の実施形態では、同一試料のいくつかの部分を指す場合があるが、他の実施形態では、第１および第２のアリコートは、異なる供給源に由来する第１および第２の試料のいくつかの部分を含み得る。 Some embodiments of the present disclosure provide methods for reusing integrated devices that process samples that are divided into multiple aliquots. In various embodiments, the sample includes an analyte, and the analyte includes a biomolecule including one or more luminescently labeled molecules, and the method includes transferring a first aliquot of the plurality of aliquots to an integrated device. loading at least a portion of the plurality of chambers; sampling a first aliquot of the analyte while the analyte is present in at least a portion of the plurality of chambers, the step of: or determining the luminescence lifetime, luminescence intensity, wavelength, pulse duration, and/or interpulse duration of the signal emitted by the plurality of luminescently labeled molecules; removing a first aliquot from at least some of the plurality of chambers; and loading a second aliquot of the plurality of aliquots into at least some of the plurality of chambers of the integrated device. The term aliquot, in some embodiments, may refer to several portions of the same sample, while in other embodiments, the first and second aliquots are derived from different sources. It may include several portions of the second sample.

一部の実施形態は、試料を処理する集積デバイスを再使用するための方法であって、試料が分析物を含み、分析物が１つまたは複数の発光標識された分子を含む生体分子を含み、方法が、試料の少なくとも一部分を集積デバイスの複数のチャンバに負荷する工程と、分析物が複数のチャンバ内に存在する間に、試料の少なくとも一部分の分析物を試料採取する工程であって、発光寿命、発光強度、波長、パルス持続時間、および／またはパルス間の持続時間を示す、１つまたは複数の発光標識された分子により放出されたシグナルを収集することを含む、試料採取する工程と、複数のチャンバから試料の少なくとも一部分を取り出す工程であって、複数のチャンバの表面に結合したそれぞれのコーティング分子とカップリング部分との間の共有結合を破壊することを含み、試料の少なくとも一部分の分析物がカップリング部分に結合している、取り出す工程とを含む方法を提供する。 Some embodiments are a method for reusing an integrated device that processes a sample, the sample comprising an analyte, the analyte comprising a biomolecule comprising one or more luminescently labeled molecules. , a method includes loading at least a portion of a sample into a plurality of chambers of an integration device; and sampling an analyte of at least a portion of the sample while the analyte is present in the plurality of chambers, the method comprising: a sampling step comprising collecting a signal emitted by one or more luminescently labeled molecules indicative of luminescence lifetime, luminescence intensity, wavelength, pulse duration, and/or duration between pulses; , removing at least a portion of the sample from the plurality of chambers, the step comprising: breaking the covalent bond between each coating molecule bound to the surface of the plurality of chambers and the coupling moiety; the analyte is bound to the coupling moiety.

一部の実施形態は、試料が集積デバイスの１つまたは複数のチャンバ内に存在するかどうかを判定するための方法であって、試料の少なくとも一部分を集積デバイスの１つまたは複数のチャンバに負荷する工程と、試料の少なくとも一部分を集積デバイスの１つまたは複数のチャンバから取り出す工程と、集積デバイスの１つまたは複数のチャンバに対して励起光を送達する工程と、励起光に応答して複数のチャンバから放出されたシグナルを、集積デバイスの光検出領域において収集する工程と、シグナルに基づき、試料の少なくとも一部分の少なくとも一部が、集積デバイスの１つまたは複数のチャンバ内に存在するかどうかを判定する工程と、を含む方法を提供する。 Some embodiments provide a method for determining whether a sample is present in one or more chambers of an integration device, the method comprising: loading at least a portion of the sample into the one or more chambers of the integration device; removing at least a portion of the sample from the one or more chambers of the integration device; delivering excitation light to the one or more chambers of the integration device; collecting a signal emitted from a chamber of the integrated device at a light detection region of the integrated device; and, based on the signal, whether at least a portion of the at least a portion of the sample is present within the one or more chambers of the integrated device. A method is provided that includes the step of determining.

一部の実施形態は、集積デバイスを用いた試料の処理を継続するかどうかを判定するための方法であって、試料が複数のアリコートに分割され、方法が、分析物が集積デバイスの１つまたは複数のチャンバ内に存在する間に、複数のアリコートの第１のアリコートの分析物を試料採取する工程であって、少なくとも１つの光源から送達された励起光を用いて第１のアリコートの分析物を励起すること、少なくとも１つの光源から送達された光により励起されたときに、集積デバイスの光検出領域において第１のアリコートの分析物から放出されたシグナルを収集することを含む、試料採取する工程と、第１のアリコートの分析物から放出されたシグナルに基づき、複数のアリコートの第２のアリコートを集積デバイスの１つまたは複数のチャンバに負荷するか判定する工程と、複数のアリコートの第２のアリコートを集積デバイスの１つまたは複数のチャンバに負荷する工程とを含む、方法を提供する。 Some embodiments provide a method for determining whether to continue processing a sample with a collection device, the method comprising: the sample being divided into multiple aliquots, the method comprising: or sampling an analyte of a first aliquot of the plurality of aliquots while in the plurality of chambers, the step of: analyzing the first aliquot using excitation light delivered from at least one light source; collecting a signal emitted from the first aliquot of the analyte in a light detection region of the integrated device when excited by light delivered from the at least one light source; determining whether to load a second aliquot of the plurality of aliquots into one or more chambers of the integration device based on the signal emitted from the analyte of the first aliquot; loading a second aliquot into one or more chambers of an integrated device.

一部の実施形態は、試料を処理するための再利用可能なデバイスであって、試料が複数のアリコートに分割され、デバイスが、複数のアリコートの第１のアリコートを受け入れるための複数の反応チャンバであって、複数の反応チャンバの表面が、第１のアリコートの分析物に結合したカップリング部分と結合するように構成されたコーティング分子でコーティングされている、複数の反応チャンバと、複数のチャンバに送達される励起光に応答して、複数のチャンバから放出されたシグナルを受け取るように構成された光検出領域と、光検出領域により受け取られたシグナルに基づき、複数のチャンバが第１のアリコートの分析物の少なくとも一部分を含有するかどうかを判定するように構成された少なくとも１つのプロセッサと、を備えるデバイスを提供する。 Some embodiments are reusable devices for processing a sample, wherein the sample is divided into a plurality of aliquots, and the device includes a plurality of reaction chambers for receiving a first aliquot of the plurality of aliquots. a plurality of reaction chambers, wherein a surface of the plurality of reaction chambers is coated with a coating molecule configured to bind a coupling moiety bound to an analyte of the first aliquot; a light detection region configured to receive signals emitted from the plurality of chambers in response to excitation light delivered to the plurality of chambers; and based on the signals received by the light detection region, the plurality of chambers at least one processor configured to determine whether the analyte contains at least a portion of an analyte.

一部の実施形態は、第１の試料を再利用可能なチップの複数のチャンバに負荷する工程であって、再利用可能なチップが、少なくとも１つの光源を備える装置から受け取られた励起光を複数のチャンバに対して方向付けるための複数の導波路、および第１の試料から放出された光を受け取るための複数の光検出領域を有する、工程と、装置の少なくとも１つの光源から、再利用可能なチップの複数のチャンバに対して励起光を送達する工程と、第１の試料の分析物のシークエンシングを実施する工程と、再利用可能なチップの複数のチャンバから第１の試料を取り出す工程と、第２の試料を再利用可能なチップの複数のチャンバに負荷する工程とを含む方法を提供する。 Some embodiments include loading a first sample into a plurality of chambers of a reusable chip, the reusable chip receiving excitation light from a device comprising at least one light source. reusing the process and from at least one light source of the apparatus having a plurality of waveguides for directing to the plurality of chambers and a plurality of light detection regions for receiving light emitted from the first sample; delivering excitation light to the plurality of chambers of the reusable chip; performing sequencing of analytes of the first sample; and removing the first sample from the plurality of chambers of the reusable chip. and loading a second sample into a plurality of chambers of a reusable chip.

一部の実施形態は、少なくとも１つの光源を備える装置と共に使用するための再利用可能なチップであって、第１の試料を受け入れるための複数のチャンバと、少なくとも１つの光源から複数のチャンバに対して励起光を方向付けるための複数の導波路と、第１の試料から放出された光を受け取るための複数の光検出領域とを備える再利用可能なチップを備え、再利用可能なチップが、第１の試料を複数のチャンバから取り出すことができ、第１の試料が取り出された後に、第２の試料を複数のチャンバ内に受け入れることができるように構成されている、デバイスを提供する。 Some embodiments provide a reusable chip for use with a device that includes at least one light source, the chip having a plurality of chambers for receiving a first sample and a plurality of chambers from the at least one light source. a reusable chip comprising a plurality of waveguides for directing excitation light toward a first sample and a plurality of light detection regions for receiving light emitted from a first sample; , a device configured such that a first sample can be removed from a plurality of chambers and a second sample can be received within the plurality of chambers after the first sample is removed. .

一部の実施形態は、チップ表面の再生を通じてチップを再使用するためのデバイスおよび方法を提供するが、デバイスおよび方法は生体試料または化学的試料の大規模な並行分析に適する。一部の実施形態では、このようなデバイスおよび方法は、自動化された大規模な並行分析にさらに適する。 Some embodiments provide devices and methods for reusing chips through chip surface regeneration, where the devices and methods are suitable for massively parallel analysis of biological or chemical samples. In some embodiments, such devices and methods are further suited for automated, massively parallel analysis.

一部の実施形態による、集積デバイスおよび機器のブロック図である。1 is a block diagram of integrated devices and equipment, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、集積デバイスの概略図である。1 is a schematic diagram of an integrated device, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、集積デバイスのピクセルの概略図である。1 is a schematic diagram of a pixel of an integrated device, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、図１Ｃのピクセルの回路図である。1C is a circuit diagram of the pixel of FIG. 1C, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１Ｃのピクセルの上面図である。1C is a top view of the pixel of FIG. 1C, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１Ｃおよび図１Ｄのピクセルの平面図である。1D is a top view of the pixel of FIGS. 1C and ID, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、集積デバイスの代替ピクセルの概略図である。2 is a schematic diagram of an alternative pixel of an integrated device, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、図１Ｇのピクセルの回路図である。1G is a circuit diagram of the pixel of FIG. 1G, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１Ｃおよび図１Ｄのピクセルの平面図である。1D is a top view of the pixel of FIGS. 1C and ID, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、集積デバイスのチャンバ内に固定化された分析物の例示的な図である。FIG. 2 is an exemplary illustration of an analyte immobilized within a chamber of an integration device, according to some embodiments. 一部の実施形態による、複数の試料を処理するために図１の集積デバイスを再利用するための例示的な処理の図である。2 is an illustration of an example process for reusing the integrated device of FIG. 1 to process multiple samples, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１の例示的な集積デバイスのチャンバの表面を再生するための例示的な処理の図である。2 is an illustration of an example process for resurfacing a chamber of the example integrated device of FIG. 1, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１Ａの集積デバイスのチャンバの表面を再生するための別の例示的な処理の図である。1B is an illustration of another exemplary process for regenerating the surface of a chamber of the integrated device of FIG. 1A, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１Ａの集積デバイスのチャンバの表面を再生するための別の例示的な処理の図である。1A is an illustration of another exemplary process for regenerating the surface of a chamber of the integrated device of FIG. 1A, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１Ａの集積デバイスのチャンバの表面を再生するための別の例示的な処理の図である。1A is an illustration of another exemplary process for regenerating the surface of a chamber of the integrated device of FIG. 1A, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、チップ負荷および再生の処理の間に得られた分析物の存在を示す例示的なグラフである。3 is an exemplary graph showing the presence of analytes obtained during a chip loading and regeneration process, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、チップ負荷および再生の処理の間に得られた分析物の存在を示す例示的なグラフである。3 is an exemplary graph showing the presence of analytes obtained during a chip loading and regeneration process, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、チップ負荷および再生の処理の間に得られた分析物の存在を示す例示的なグラフである。3 is an exemplary graph showing the presence of analytes obtained during a chip loading and regeneration process, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、チップ負荷および再生の処理の間に得られた分析物の存在を示す例示的なグラフである。3 is an exemplary graph showing the presence of analytes obtained during a chip loading and regeneration process, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、異なる条件下で例示的な再生溶液に浸漬された試料のスペクトルの図である。FIG. 3 is an illustration of spectra of samples immersed in an exemplary regeneration solution under different conditions, according to some embodiments. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示す例示的なグラフである。3 is an example graph showing signals obtained from a reaction chamber of an example integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間の例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間の例示的な集積デバイスの反応チャンバから取得されたシグナルを示すさらなる例示的なグラフである。3 is a further exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an exemplary integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments; FIG. 一部の実施形態による、試料が図１Ａの集積デバイスのチャンバ内に存在するかどうか判定するための例示的な処理を示すフローチャートである。1A is a flowchart illustrating an example process for determining whether a sample is present within a chamber of the integrated device of FIG. 1A, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、図１Ａの集積デバイスを用いて試料の処理を継続するかどうかを判定するための例示的な処理を示すフローチャートである。1A is a flowchart illustrating an example process for determining whether to continue processing a sample using the integrated device of FIG. 1A, according to some embodiments. FIG. 一部の実施形態による、コンパクトなモードロックレーザモジュールを備える分析機器のブロック図である。FIG. 2 is a block diagram of an analytical instrument with a compact mode-locked laser module, according to some embodiments. 一部の実施形態による、分析機器に組み込まれた例示的なコンパクトなモードロックレーザモジュールの図である。FIG. 2 is an illustration of an example compact mode-locked laser module incorporated into an analytical instrument, according to some embodiments. 一部の実施形態による、１つまたは複数の導波路を介してパルスレーザによって光学的に励起され得る並列反応チャンバの例の図である。FIG. 3 is an illustration of an example of parallel reaction chambers that can be optically excited by a pulsed laser via one or more waveguides, according to some embodiments. 一部の実施形態による、集積デバイス反応チャンバ、光導波路、および時間ビニング光検出器のさらなる詳細の図である。FIG. 3 is a diagram of additional details of an integrated device reaction chamber, optical waveguide, and time-binning photodetector, according to some embodiments. 図７Ａおよび図７Ｂは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ＤＮＡ分析物のシークエンシング精度を評価する実験の結果を示す図であり、図７Ａは、再生工程と負荷工程との間の例示的な集積デバイスでの３回の逐次実行（２回のチップ再生）から取得されたシグナルの間の平均読み取り長さを示す折れ線グラフである。7A and 7B are diagrams showing the results of an experiment evaluating the sequencing accuracy of DNA analytes according to an exemplary method of regenerating a chip in some embodiments of the present disclosure; FIG. 2 is a line graph showing the average read length between signals acquired from three sequential runs (two chip regenerations) on an exemplary integrated device between steps and loading steps; 本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ＤＮＡ分析物のシークエンシング精度を評価する実験の結果の図である（これらの３回の実行の各々の平均精度、最大精度、および「アラインメント」を示す折れ線グラフを示す）。FIG. 3 is an illustration of the results of an experiment evaluating the sequencing accuracy of DNA analytes according to an exemplary method of regenerating a chip in some embodiments of the present disclosure (average accuracy of each of these three runs, maximum accuracy, and a line graph showing "alignment"). 本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ＤＮＡ分析物のシークエンシング精度を評価する実験の結果の図である（これらの３回の実行の各々の平均精度、最大精度、および「アラインメント」を示す折れ線グラフを示す）。FIG. 3 is an illustration of the results of an experiment evaluating the sequencing accuracy of DNA analytes according to an exemplary method of regenerating a chip in some embodiments of the present disclosure (average accuracy of each of these three runs, maximum accuracy, and a line graph showing "alignment"). 図８Ａは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図であり（この実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）、図８Ｂは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図である（この実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）。FIG. 8A shows signal readout results for an experiment evaluating sequencing accuracy across three read lengths of peptide analytes according to an exemplary method of regenerating a chip in accordance with some embodiments of the present disclosure. (This experiment was repeated on two CMOS chips), Figure 8B evaluates sequencing accuracy over three read lengths of peptide analytes by an exemplary method of regenerating chips in some embodiments of the present disclosure. (This experiment was repeated on two CMOS chips). 図８Ｃは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図である（この実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）、図８Ｄは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図である（この実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）。FIG. 8C shows signal readout results of an experiment evaluating sequencing accuracy across three read lengths of peptide analytes according to an exemplary method of regenerating a chip in accordance with some embodiments of the present disclosure. (This experiment was repeated on two CMOS chips), Figure 8D evaluates sequencing accuracy over three read lengths of peptide analytes by an exemplary method of regenerating chips in some embodiments of the present disclosure. (This experiment was repeated on two CMOS chips). 図８Ｅは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図であるこの実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）、図８Ｆは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図である（この実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）。FIG. 8E shows signal readout results for an experiment evaluating sequencing accuracy across three read lengths of peptide analytes according to an exemplary method of regenerating a chip in accordance with some embodiments of the present disclosure. (Experiments were repeated on two CMOS chips), FIG. 8F evaluates sequencing accuracy over three read lengths of peptide analytes by an exemplary method of regenerating chips in some embodiments of the present disclosure. Figure 2 shows the signal readout results of the experiment (this experiment was repeated on two CMOS chips). 図８Ｇは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図であり（この実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）、図８Ｈは、本開示の一部の実施形態におけるチップを再生する例示的な方法による、ペプチド分析物の３つの読み取り長さにわたってシークエンシング精度を評価する実験のシグナル読み取り結果を示す図である（この実験は２つのＣＭＯＳチップで繰り返した）。FIG. 8G shows signal readout results for an experiment evaluating sequencing accuracy across three read lengths of peptide analytes according to an exemplary method of regenerating a chip in accordance with some embodiments of the present disclosure. (This experiment was repeated on two CMOS chips), Figure 8H evaluates sequencing accuracy over three read lengths of peptide analytes by an exemplary method of regenerating chips in some embodiments of the present disclosure. (This experiment was repeated on two CMOS chips). 一部の実施形態による、光退色を使用して集積デバイスを含むシステムを較正するための例示的プロセスを示す図である。FIG. 3 illustrates an example process for calibrating a system including an integrated device using photobleaching, according to some embodiments. 一部の実施形態による、表面に付着された色素で標識された試料を示す図である。FIG. 3 illustrates a sample labeled with a dye attached to a surface, according to some embodiments. 一部の実施形態による、反応チャンバ内に付着された色素で標識された試料を示す図である。FIG. 3 illustrates a dye-labeled sample deposited within a reaction chamber, according to some embodiments. 一部の実施形態による、経時的な光源励起出力を示す例示的なグラフを示す図である。FIG. 4 illustrates an example graph showing light source excitation power over time, according to some embodiments. 一部の実施形態による、参照色素からの経時的に測定された信号を示す例示的なグラフを示す図である。FIG. 3 illustrates an exemplary graph showing measured signals over time from a reference dye, according to some embodiments. 一部の実施形態による、反応チャンバ内の単一分子の収集に関する測定された退色時間および色素強度の例示的なヒストグラムを示す図である。FIG. 3 shows an exemplary histogram of measured fading times and dye intensities for a collection of single molecules in a reaction chamber, according to some embodiments. 一部の実施形態による、反応チャンバ内のシークエンシング反応を示す図である。FIG. 3 illustrates a sequencing reaction within a reaction chamber, according to some embodiments. 一部の実施形態による、１つまたは複数の反応チャンバの負荷を定量化するための例示的なプロセスを示す図である。FIG. 3 illustrates an example process for quantifying the loading of one or more reaction chambers, according to some embodiments. 一部の実施形態による、単一負荷されたウェルを表す、チップ負荷プロセスからの例示的なトレースを示す図である。FIG. 3 shows an exemplary trace from a chip loading process representing a single loaded well, according to some embodiments. 一部の実施形態による、二重負荷ウェルを表す、チップ負荷プロセスからの例示的なトレースを示す図である。FIG. 6 shows an example trace from a chip loading process representing a dual loading well, according to some embodiments. 一部の実施形態による、多重負荷ウェルを表す、チップ負荷プロセスからの例示的なトレースを示す図である。FIG. 6 shows an example trace from a chip loading process representing multiple loading wells, according to some embodiments. 一部の実施形態による、生体分子に可逆的に結合される蛍光分子の周期的パルス化パターンを示す図である。FIG. 3 illustrates a periodic pulsing pattern of fluorescent molecules reversibly bound to biomolecules, according to some embodiments. 一部の実施形態による、負荷パーセントを例示する反応チャンバの例示的なヒートマップを示す図である。FIG. 3 illustrates an example heat map of a reaction chamber illustrating percent loading, according to some embodiments.

本開示の特徴および利点は、図面とともに、以下に記載される詳細な説明からより明かになり得る。図面を参照して実施形態を説明するとき、方向の言及（「上」、「下」、「頂部」、「底部」、「左」、「右」、「水平」、「垂直」等）を使用することがある。このような参照は、通常の向きで図面を見る読者の助けとなることのみが意図される。これらの方向の言及は具現化されるデバイスの特徴部の好適な向きまたは唯一の向きを記述することを意図するわけではない。デバイスは他の向きを使用しても具現化することができる。 The features and advantages of the present disclosure may become more apparent from the detailed description provided below, taken together with the drawings. When describing embodiments with reference to the drawings, references to directions (such as "top," "bottom," "top," "bottom," "left," "right," "horizontal," "vertical," etc.) May be used. Such references are only intended as an aid to the reader viewing the drawings in their normal orientation. These directional references are not intended to describe the preferred or only orientations of the features of the implemented devices. The device can also be implemented using other orientations.

Ｉ．緒言
本開示の態様は、センサチップ表面を再生するための方法およびシステムと関連し、センサチップは集積デバイスの全部または一部を形成する。特に、一部の実施形態によれば、連続する試料採取サイクル間においてセンサチップの表面を再生することにより、複数の試料採取サイクルにおいて単一センサチップを再使用するための技術が提供される。 I. Introduction Aspects of the present disclosure relate to methods and systems for regenerating the surface of a sensor chip, where the sensor chip forms all or part of an integrated device. In particular, some embodiments provide techniques for reusing a single sensor chip in multiple sampling cycles by regenerating the surface of the sensor chip between successive sampling cycles.

集積デバイスは、それぞれ試料を受け入れるための複数の反応チャンバを有するセンサチップを備え得る。試料データは、複数の反応チャンバ内に配置された試料の一部分を励起光を用いて励起し、励起に応答して試料から放出されたシグナルを光検出器を用いて収集することにより取得され得る。試料採取を実施するために、反応チャンバ内に存在する試料の一部分が固定化される。例えば、各反応チャンバの表面は、分子、例えばビオチン等を用いてコーティングされ得るが、試料部分は、反応チャンバ内に試料の一部分を固定するために、ビオチン結合タンパク質、例えばストレプトアビジン等を用いて機能化され得る。一般的に、センサチップは、試料採取を実施した後に配置される。 The integrated device may include a sensor chip having multiple reaction chambers, each for receiving a sample. Sample data may be obtained by exciting a portion of a sample located within a plurality of reaction chambers using excitation light and collecting signals emitted from the sample in response to the excitation using a photodetector. . To perform sampling, a portion of the sample present within the reaction chamber is immobilized. For example, the surface of each reaction chamber can be coated with a molecule, such as biotin, while the sample portion is coated with a biotin-binding protein, such as streptavidin, to immobilize the sample portion within the reaction chamber. Can be functionalized. Generally, the sensor chip is placed after sampling has been performed.

多くの用途において、１試料中に存在する多数の分析物種を検出するのが望ましい。しかしながら、試料採取を実施する集積デバイスは、ピクセルの数、したがって試料の分析物種を受け入れるために利用可能な反応チャンバに制約がある。多くの場合、集積デバイス上の反応チャンバの数は、試料採取されるのが望ましい分析物種の数よりも少ない。それに加えて、単一の分析物種を受け入れる反応チャンバの数を最大化するタイトレーションを取得するために試料は希釈され得るが、反応チャンバは、分析物を含有しないかまたは２つ以上の分析物種を含有することから、望ましい単一の分析物測定結果を取得することが不可能であるので、多くの反応チャンバは有用な測定結果をなおももたらさない。したがって、単一の集積デバイスが多数種を含有する試料を処理するのは一般的に不可能である。 In many applications, it is desirable to detect multiple analyte species present in one sample. However, integrated devices that perform sampling are limited in the number of pixels and therefore the reaction chambers available to receive the analyte species of the sample. Often the number of reaction chambers on an integrated device is less than the number of analyte species desired to be sampled. In addition, samples may be diluted to obtain titrations that maximize the number of reaction chambers that accept a single analyte species, whereas reaction chambers contain no analyte or contain more than one analyte species. Many reaction chambers still do not yield useful measurements because it is not possible to obtain the desired single analyte measurements from containing . Therefore, it is generally not possible for a single integrated device to process samples containing multiple species.

単一試料内に存在する多数の分析物種を試料採取するための１つの技術は、試料を細分化物（本明細書ではアリコートと呼ばれる）に分割し、そして異なる実験としてアリコートを個別に処理することである。例えば、試料の各アリコートは、各集積デバイスにより個別に処理され得る。しかしながら、そのような技術は、複数の集積デバイスの使用を必要とするので高価である。 One technique for sampling multiple analyte species present within a single sample is to divide the sample into subdivisions (referred to herein as aliquots) and process the aliquots individually as different experiments. It is. For example, each aliquot of the sample can be processed individually by each integration device. However, such techniques are expensive as they require the use of multiple integrated devices.

本発明者らは、単一の試料および／または複数の試料を対象に複数の実験を実施するための単一の集積デバイスを、集積デバイスを廃棄する前に再使用することが有利であることを認識した。そのようにして、多数の分析物種を含む試料が複数のアリコートに分割され、単一の集積デバイスを使用しながら連続した実験において処理され得る。従来技術によれば、試料は、（１）分子、例えばビオチン等を用いてチップ表面をコーティングすること；（２）コーティングに結合するためのカップリング部分、例えばストレプトアビジン等に結合した分析物を含有する試料の第１のアリコートを負荷し、そして標識された分析物がチップの表面に結合するのを可能にすること；（３）未結合の種をリンスすること；および（４）測定を実施すること（例えば、反応チャンバの表面に結合した分析物を励起し、励起された分析物から放出されたシグナルを収集することにより）により処理され得る。本明細書に記載されるように、試料をタイトレーション（単一種の分析物のみを受け入れる反応チャンバの数を最大化する）まで希釈しても、やはり分析物を含有しないいくつかの反応チャンバをもたらす。したがって、集積デバイスに第２のアリコートの試料を再負荷することで、未占有のまま存続する反応チャンバ内での分析物の測定を可能にすることが可能である。しかしながら、第１のアリコートの初回負荷によって反応チャンバが占有された場合、第２のアリコート内の分析物の測定が阻害または妨害され得る。 The inventors have demonstrated that it is advantageous to reuse a single integrated device for performing multiple experiments on a single sample and/or multiple samples before disposing of the integrated device. I recognized it. In that way, samples containing multiple analyte species can be divided into multiple aliquots and processed in consecutive experiments while using a single integration device. According to the prior art, the sample is prepared by (1) coating the chip surface with a molecule, such as biotin; (2) analyte bound to a coupling moiety, such as streptavidin, for binding to the coating. (3) rinsing unbound species; and (4) performing measurements. (e.g., by exciting the analyte bound to the surface of the reaction chamber and collecting the signal emitted from the excited analyte). As described herein, diluting the sample to titration (maximizing the number of reaction chambers that accept only a single species of analyte) still leaves some reaction chambers containing no analyte. bring. Therefore, reloading the integration device with a second aliquot of sample may allow measurement of the analyte in the reaction chamber that remains unoccupied. However, if the reaction chamber is occupied by the initial loading of the first aliquot, measurement of the analyte in the second aliquot may be inhibited or prevented.

したがって、本発明者らは、これまでに使用されたセンサチップ表面を再生するための技術を開発した。特に、本明細書に記載される技術は、ビオチン－ストレプトアビジン結合またはその他の相互作用を介してセンサチップの表面にこれまでに結合した分析物種を除荷する（ｕｎｌｏａｄｉｎｇ）ための方法と関連する。例えば、センサチップを除荷するための事例的技術には、（ａ）結合した係留（例えば、ストレプトアビジンおよびビオチンの）を破壊すること；（ｂ）センサチップの表面から分子（例えば、ビオチン）コーティングを剥離すること；（ｃ）占有された反応チャンバ内の試料分析物を酵素消化すること；および（ｄ）試料分析物とカップリング部分（例えば、ストレプトアビジン、ビオチン）との間の結合を融解することが含まれる。センサチップ表面の再生の後で、集積デバイスには、第２のアリコートの試料が再負荷され得る。そのような技術は、多数の分析物種が試料内に存在するにもかかわらず、複数のアリコートを含む試料全体の処理を可能にする。 Therefore, the inventors have developed a technique for regenerating previously used sensor chip surfaces. In particular, the techniques described herein relate to methods for unloading analyte species previously bound to the surface of a sensor chip via biotin-streptavidin binding or other interactions. . For example, exemplary techniques for unloading a sensor chip include (a) breaking bound tethers (e.g., of streptavidin and biotin); (b) molecules (e.g., of biotin) from the surface of the sensor chip. (c) enzymatically digesting the sample analyte in the occupied reaction chamber; and (d) removing the binding between the sample analyte and the coupling moiety (e.g., streptavidin, biotin). Includes melting. After regeneration of the sensor chip surface, the integrated device may be reloaded with a second aliquot of sample. Such techniques allow processing of entire samples containing multiple aliquots despite the presence of multiple analyte species within the sample.

本発明者らは、複数の実験において集積デバイスを再使用する際に、センサチップを長期にわたり使用すると、集積デバイスのコンポーネントが劣化し得ることもさらに認識した。したがって、本明細書に記載される技術の一部の態様は、集積デバイスの使用寿命を増加させるための技術と関連する。 In reusing the integrated device in multiple experiments, the inventors further recognized that long-term use of the sensor chip can degrade the components of the integrated device. Accordingly, some aspects of the techniques described herein relate to techniques for increasing the useful life of integrated devices.

集積デバイスのセンサチップ表面を再生するための本明細書に記載される技術は、一部の実施形態では、ＤＮＡ／ＲＮＡ、および／またはタンパク質シークエンシング用途と組み合わせて使用され得る。 The techniques described herein for regenerating sensor chip surfaces of integrated devices may be used in some embodiments in combination with DNA/RNA and/or protein sequencing applications.

本明細書に記載される集積デバイスは、本明細書に記載される技術の一部または全部を、単独または組み合わせて組み込むことができるものと認識すべきである。さらに、本明細書に記載されるものに加えて、その他の集積デバイスが記載されている方法および構造を採用することができる。 It should be appreciated that the integrated devices described herein can incorporate some or all of the techniques described herein, alone or in combination. Additionally, other integrated devices in addition to those described herein may employ the described methods and structures.

表面の機能化またはコーティング
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される技術は、目的の分子を、試料ウェルの所望の領域（本明細書では反応チャンバとも呼ばれる）にコーティングする（または機能化する、または閉じ込める）のに使用可能である。一部の実施形態では、試料ウェルは、集積デバイスの表面に形成された開口部（集積デバイスの第１の層を通過して第２の層の中まで延在し、開口部に対して遠位側の底部表面に至る）により定義される体積または空間を占有する。一部の実施形態では、試料ウェルの開口部と底部表面との間に配置される第１の層および第２の層の露出表面は、側壁（試料ウェルにより占有される体積または空間をさらに定義する）と呼ばれることがある。 Surface Functionalization or Coating In certain embodiments, the techniques described herein coat (or functionalize) a molecule of interest onto a desired region of a sample well (also referred to herein as a reaction chamber). can be used to confine or confine In some embodiments, the sample well includes an opening formed in the surface of the integrated device that extends through the first layer into the second layer of the integrated device and is far away relative to the opening. occupies a volume or space defined by In some embodiments, the exposed surfaces of the first layer and the second layer disposed between the opening and the bottom surface of the sample well include sidewalls (further defining the volume or space occupied by the sample well). ) is sometimes called.

複数の実施形態では、１つまたは複数の分析物（例えば、ＤＮＡ分析物またはペプチド分析物）が底部表面上に固定化されるとき、底部表面をコーティングして、１つまたは複数の分子または複合体の連結を可能にするのが望ましいことがある。一部の実施形態では、底部表面がコーティング分子でコーティングされる。一部の実施形態では、コーティング分子はアビジンタンパク質である。アビジンタンパク質はビオチン結合タンパク質であり、アビジンタンパク質の４つのサブユニットのそれぞれにおいてビオチン結合部位を一般的に有する。アビジンタンパク質として、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、トラプトアビジン（ｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ）、タマビジン、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、キセナビジン（ｘｅｎａｖｉｄｉｎ）、ならびにその同族体およびバリアントが挙げられる。一部の実施形態では、アビジンタンパク質はストレプトアビジンである。４つの結合部位のそれぞれはビオチン分子と独立に結合する能力を有するので、アビジンタンパク質の多価性は、様々な結合コンフィギュレーションを可能にすることができる。 In embodiments, when one or more analytes (e.g., a DNA analyte or a peptide analyte) are immobilized on the bottom surface, the bottom surface is coated with one or more molecules or complexes. It may be desirable to allow for body coupling. In some embodiments, the bottom surface is coated with coating molecules. In some embodiments, the coating molecule is an avidin protein. Avidin protein is a biotin-binding protein and generally has a biotin-binding site in each of the four subunits of the avidin protein. Avidin proteins include, for example, avidin, streptavidin, traptavidin, tamavidin, bradavidin, xenavidin, and homologs and variants thereof. In some embodiments, the avidin protein is streptavidin. The multivalency of the avidin protein can enable a variety of binding configurations, as each of the four binding sites has the ability to bind biotin molecules independently.

ある特定の実施形態では、コーティング分子は、ビオチン、ストレプトアビジン、およびビオチン－ストレプトアビジン複合体のうちの１つである。一部の実施形態では、コーティング分子はビオチンのアナログまたはストレプトアビジンのアナログである。一部の実施形態では、コーティング分子はビスビオチンである。一部の実施形態では、コーティング分子は、カップリング部分（例えば、ストレプトアビジン部分等）との相互作用、例えばビスビオチン－ストレプトアビジン結合等に関与する。 In certain embodiments, the coating molecule is one of biotin, streptavidin, and biotin-streptavidin complex. In some embodiments, the coating molecule is an analog of biotin or an analog of streptavidin. In some embodiments, the coating molecule is bisbiotin. In some embodiments, the coating molecule involves an interaction with a coupling moiety (eg, a streptavidin moiety, etc.), such as bisbiotin-streptavidin binding.

一部の実施形態では、コーティング分子はアルキル鎖を含むシランである。一部の実施形態では、コーティング分子は、必要に応じて置換されたアルキル鎖を含むシランである。一部の実施形態では、コーティング分子は、ポリ（エチレングリコール）鎖を含むシランである。一部の実施形態では、コーティング分子は、カップリング部分を含むシランである。例えば、カップリング部分は、化学部分、例えばアミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、金属、キレート剤等を含み得る。あるいは、カップリング部分は、特異的結合エレメント、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、レクチン等、ＳＮＡＰ－ＴＡＧ（登録商標（自己標識型タンパク質タグ）、会合性または結合性のペプチドまたはタンパク質、抗体または抗体断片、核酸または核酸アナログ等を含み得る。カップリング部分はメチルエーテル基を含み得る。付加的または二者択一的に、中間結合剤および／またはコポリマーが、目的の分子とカップリングまたは結合するのに使用される追加の基（いくつかのケースでは、化学官能基および特異的結合エレメントの両方を含み得る）にカップリングするのに使用され得る。例として、カップリング部分、例えばビオチンが基質表面上に積層され、そして所定のエリア内で選択的に活性化され得る。中間結合剤、例えば、ストレプトアビジンは、次にビオチンカップリング部分とカップリングし得る。目的とする分析物（例示的ワークフローにおいてそれ自体がビオチン化され得る）が、次にストレプトアビジンとカップリングする。 In some embodiments, the coating molecule is a silane that includes an alkyl chain. In some embodiments, the coating molecule is a silane containing an optionally substituted alkyl chain. In some embodiments, the coating molecule is a silane that includes poly(ethylene glycol) chains. In some embodiments, the coating molecule is a silane that includes a coupling moiety. For example, the coupling moiety can include chemical moieties such as amine groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, sulfhydryl groups, metals, chelating agents, and the like. Alternatively, the coupling moiety is a specific binding element, such as biotin, avidin, streptavidin, neutravidin, lectin, etc., SNAP-TAG®, an associative or binding peptide or protein, may include antibodies or antibody fragments, nucleic acids or nucleic acid analogs, etc. The coupling moiety may include a methyl ether group. Additionally or alternatively, intermediate binding agents and/or copolymers may be used for coupling with the molecule of interest. or to additional groups (which in some cases may include both chemical functional groups and specific binding elements). For example, a coupling moiety, e.g. Biotin can be deposited onto the substrate surface and selectively activated within predetermined areas. An intermediate binding agent, e.g. streptavidin, can then be coupled to the biotin coupling moiety. The analyte of interest (which itself can be biotinylated in an exemplary workflow) is then coupled with streptavidin.

ビオチンの化学構造を下記に再現する： The chemical structure of biotin is reproduced below:

ストレプトアビジンは４つのビオチン結合部位を含有する。ストレプトアビジンが試料ウェルの底部表面上にコーティングされた後でも、余分の３つの結合部位が、ビオチンまたはビオチンコンジュゲートポリマーとのコンジュゲーションのために存続する。 Streptavidin contains four biotin binding sites. Even after streptavidin is coated onto the bottom surface of the sample well, three extra binding sites remain for conjugation with biotin or biotin-conjugated polymer.

コーティング分子の例として、非限定的に、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）部分、テトラジン部分、アジド部分、アルキン部分、アルデヒド部分、メチルエーテル部分、イソシアナート部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分、チオール部分、アルケン部分、ジベンゾシクロオクチル部分、ビシクロノニン部分、およびチアミンピロホスフェート部分が挙げられる。共有結合カップリング部分を含むコーティング分子の例として、非限定的に、アジド－シランおよびアジド－オルガノシラン、例えばアジド－ＰＥＧ－シラン（例えば、アジド－ＰＥＧ_３－シラン、アジド－ＰＥＧ_５－シラン）、ならびにアジド－アルキルシラン（例えば、アジド－Ｃ_１１－シラン）等が挙げられる。一部の実施形態では、カップリング部分は非共有結合カップリング部分である。 Examples of coating molecules include, but are not limited to, trans-cyclooctene (TCO) moieties, tetrazine moieties, azide moieties, alkyne moieties, aldehyde moieties, methyl ether moieties, isocyanate moieties, N-hydroxysuccinimide moieties, thiol moieties, alkenes. moieties, dibenzocyclooctyl moieties, bicyclononine moieties, and thiamine pyrophosphate moieties. Examples of coating molecules containing covalent coupling moieties include, but are not limited to, azido-silanes and azido-organosilanes, such as azido-PEG-silanes (e.g., azido-PEG ₃ -silanes, azido-PEG ₅ -silanes). , and azido-alkylsilanes (eg, azido-C ₁₁ -silane). In some embodiments, the coupling moiety is a non-covalent coupling moiety.

カップリング部分の例として、非限定的に、ビオチン部分、アビジンタンパク質、ストレプトアビジンタンパク質、レクチンタンパク質、ＳＮＡＰ－タグ、メチルエーテル、およびビオチン－ストレプトアビジン複合体（例えば、ビス－ビオチン－ストレプトアビジン複合体）が挙げられる。例示的なビオチン部分には、モノビオチン（遊離ビオチン）およびビスビオチンが含まれる。一部の実施形態では、カップリング部分はアビジンタンパク質を含む。 Examples of coupling moieties include, but are not limited to, biotin moieties, avidin proteins, streptavidin proteins, lectin proteins, SNAP-tags, methyl ethers, and biotin-streptavidin complexes (e.g., bis-biotin-streptavidin complexes). ). Exemplary biotin moieties include monobiotin (free biotin) and bisbiotin. In some embodiments, the coupling moiety comprises an avidin protein.

一部の実施形態では、方法は、試料ウェルの底部表面を、複数のコーティング分子、例えば第１のコーティング分子および第２のコーティング分子等でコーティングする工程をさらに含む。第２のコーティング分子として、ビオチン部分、アビジンタンパク質、ストレプトアビジンタンパク質、アジド部分、アルキン部分、ケトン部分、ヒドロキシルアミン部分を挙げることができる。一部の実施形態では、第２のコーティング分子は、ビオチン部分またはストレプトアビジンタンパク質である。一部の実施形態では、第１のコーティング分子および第２のコーティング分子は同一である。一部の実施形態では、第１のコーティング分子および第２のコーティング分子は異なる。一部の実施形態では、第１のコーティング分子および第２のコーティング分子は、いずれもビオチンである。一部の実施形態では、第１のコーティング分子および第２のコーティング分子は、いずれもストレプトアビジンである。一部の実施形態では、第２のコーティング分子はアジド部分である。一部の実施形態では、分析物は、ビオチン部分を含む第１のコーティング剤に固定化されている一方、アジド部分を含む第２のカップリング部分はコンジュゲートしていない。 In some embodiments, the method further comprises coating the bottom surface of the sample well with a plurality of coating molecules, such as a first coating molecule and a second coating molecule. The second coating molecule can include a biotin moiety, an avidin protein, a streptavidin protein, an azide moiety, an alkyne moiety, a ketone moiety, a hydroxylamine moiety. In some embodiments, the second coating molecule is a biotin moiety or streptavidin protein. In some embodiments, the first coating molecule and the second coating molecule are the same. In some embodiments, the first coating molecule and the second coating molecule are different. In some embodiments, the first coating molecule and the second coating molecule are both biotin. In some embodiments, the first coating molecule and the second coating molecule are both streptavidin. In some embodiments, the second coating molecule is an azide moiety. In some embodiments, the analyte is immobilized to a first coating agent that includes a biotin moiety, while the second coupling moiety that includes an azide moiety is not conjugated.

本明細書で使用される場合、一部の実施形態では、「表面」とは、１つまたは複数の試料ウェルを備える基材または固体支持体の表面を指す。一部の実施形態では、固体支持体とは、積層された材料、例えば本明細書に記載されるような機能化されたペプチドまたはＤＮＡポリメラーゼ等を支持することができる表面、例えば受容表面等を有する材料、層、またはその他の構造を指す。一部の実施形態では、基材の受容表面は、ナノスケールまたはマイクロスケールの凹みのある特質、例えば試料ウェルのアレイ等を含む、１つまたは複数の特質を必要に応じて有し得る。一部の実施形態では、アレイは、平面配置のエレメント、例えばセンサまたは試料ウェル等である。アレイは一次元または二次元であり得る。一次元アレイは、第１の次元内に１列または１行のエレメントおよび第２の次元内に複数の列または行を有するアレイである。第１および第２の次元内の列または行の数は、同一である場合もあれば、またそうでない場合もある。一部の実施形態では、アレイは、例えば、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、または１０^７個の試料ウェルを含み得る。 As used herein, in some embodiments, "surface" refers to the surface of a substrate or solid support that includes one or more sample wells. In some embodiments, a solid support includes a surface, such as a receptive surface, that can support a layered material, such as a functionalized peptide or DNA polymerase as described herein. refers to a material, layer, or other structure that has In some embodiments, the receiving surface of the substrate can optionally have one or more features, including nanoscale or microscale recessed features, such as an array of sample wells. In some embodiments, the array is a planar arrangement of elements, such as sensors or sample wells. Arrays can be one-dimensional or two-dimensional. A one-dimensional array is an array that has one column or row of elements in a first dimension and multiple columns or rows in a second dimension. The number of columns or rows in the first and second dimensions may or may not be the same. In some embodiments, the array can include, for example, 10 ² , 10 ³ , 10 ⁴ , 10 ⁵ , 10 ⁶ , or 10 ⁷ sample wells.

ＩＩ．集積デバイスの概要
本明細書に記載される技術は、集積デバイスのセンサチップ表面を再生するのに使用され得る。集積デバイスは、１つの例示的な実施形態において、装置内に位置する１つまたは複数の励起源から、集積デバイス内の試料を含有する反応チャンバへの励起光の提供を可能にし得る。励起光は、反応チャンバ内の照射領域を照射するために、エレメント、例えば集積デバイスの導波路等によって、反応チャンバを備える１つまたは複数のピクセルに向けて、少なくとも一部について方向付けられ得る。試料（例えば、蛍光標識等）に連結した反応チャンバまたは反応コンポーネント内に配置される試料は、反応チャンバの照射領域内に位置するとき、励起光による照射に応答して放射光を放射し得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の励起源は装置内に位置し、そこに集積デバイスが挿入され、そして協同して作動するが、そのいずれもシステム全体の一部である。 II. Overview of Integrated Devices The techniques described herein can be used to regenerate sensor chip surfaces of integrated devices. The integrated device, in one exemplary embodiment, may enable the provision of excitation light from one or more excitation sources located within the apparatus to a reaction chamber containing a sample within the integrated device. The excitation light may be directed, at least in part, by an element, such as a waveguide of an integrated device, towards one or more pixels comprising the reaction chamber to illuminate an illumination region within the reaction chamber. A sample disposed within a reaction chamber or reaction component coupled to a sample (eg, a fluorescent label, etc.) may emit synchrotron radiation in response to irradiation with excitation light when located within the illumination region of the reaction chamber. In some embodiments, one or more excitation sources are located within an apparatus into which an integrated device is inserted and act cooperatively, both of which are part of the overall system.

集積デバイスを再使用するという概念が、装置（集積デバイスが挿入され、協同して作動する）が少なくとも１つのレーザ光源を含み、ならびに集積デバイスが光を方向付けるための導波路、ならびに反応チャンバおよび検出領域を有するピクセルを含むといった例示的システムの実施形態に関して記載されているが、新規性はそのように限定されない。その他の装置デザインおよび集積デバイスデザインが、光源が装置内に位置しないデザイン、および／または集積デバイスではなくむしろ追加の光学的コンポーネントが装置内に位置するデザイン（例えば、「オフ－チップ」）を含め想定される。 The concept of reusing integrated devices is such that the apparatus (in which the integrated devices are inserted and act cooperatively) includes at least one laser light source and a waveguide for directing the light, as well as a reaction chamber and Although described in terms of exemplary system embodiments including pixels having detection regions, the novelty is not so limited. Other device and integrated device designs include designs in which the light source is not located within the device, and/or designs in which additional optical components are located within the device rather than the integrated device (e.g., "off-chip"). is assumed.

１つまたは複数の反応チャンバ（例えば、一部の実施形態において、少なくとも２つの反応チャンバ）から放出される放出光は、集積デバイスのピクセル内の１つまたは複数の光検出器によって検出され得る。本明細書で説明されるように、集積デバイスは、複数のピクセル（例えば、ピクセルのアレイ）を有するように構成されてもよく、従って、複数の反応チャンバおよび対応する複数の光検出器を有し得る。検出された放出光の特徴は、放出光に関連付けられる標識を同定するための指示を提供することができる。そのような特徴は、光検出器によって検出される光子の到着時間、光検出器によって経時にわたって蓄積される光子の量、および／または２つ以上の光検出器にまたがる光子の分布を含む、任意の好適なタイプの特徴を含むことができる。一部の実施形態において、光検出器は、放出光に関連付けられる１つ以上の特徴、例えばタイミング特徴（例えば、発光寿命、パルス持続時間、パルス間持続時間）、波長、および／または、強度を検出可能にする構造を有することができる。一例では、１つまたは複数の光検出器は、励起光のパルスが集積デバイスを通じて伝搬した後の光子到着時間の分布を検出することができ、到着時間の分布は、放出光のタイミング特徴（例えば、発光寿命、パルス持続時間、および／またはパルス間持続時間のプロキシ）の指示を提供することができる。そのような情報は、例えば、「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＰＲＯＴＥＩＮＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」と題する米国特許出願第１６／６８６，０２８号（２０１９年１１月１５日出願、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００４２ＵＳ０２）、「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＰＲＯＴＥＩＮＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１８３１号（２０１９年１１月１５日出願、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００４２ＷＯ００）、「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤＳＥＮＳＯＲＦＯＲＭＵＬＴＩ－ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬＳＩＧＮＡＬＡＮＡＬＹＳＩＳ」と題する米国特許出願第１７／１９０，３３１号（２０２１年３月２日出願、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００９０ＵＳ０１）、「ＬＡＢＥＬＥＤＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」と題する米国特許出願第１５／６００，９７９号（２０１７年５月２２日出願、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００１８ＵＳ０２）、および「ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」と題する米国特許出願第１５／１６１，１２５号（２０１６年５月２０日出願、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００２０ＵＳ００）に記載の技術を含む、試料中の分子の検出および／または同定のための技術において使用されてもよく、これらの出願の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。一部の実施形態において、１つまたは複数の光検出器は、蛍光標識によって放出される放出光の確率（例えば、発光強度）の指示を提供する。一部の実施形態において、１つまたは複数の光検出器は、放出光の空間的な分布（例えば、波長）を捕捉するようにサイズ決めおよび配置され得る。１つまたは複数の光検出器からの出力信号を使用して複数の標識の中からある蛍光標識を区別することができ、この場合、複数の標識を使用して、本明細書に記載されているように、試料またはその構造を同定することができる。 Emitted light emitted from one or more reaction chambers (eg, in some embodiments, at least two reaction chambers) may be detected by one or more photodetectors within a pixel of the integrated device. As described herein, an integrated device may be configured to have multiple pixels (e.g., an array of pixels), and thus have multiple reaction chambers and corresponding multiple photodetectors. It is possible. Characteristics of the detected emitted light can provide an indication for identifying a label associated with the emitted light. Such characteristics may include any time of arrival of photons detected by a photodetector, the amount of photons accumulated over time by a photodetector, and/or the distribution of photons across two or more photodetectors. may include any suitable type of feature. In some embodiments, the photodetector detects one or more characteristics associated with the emitted light, such as timing characteristics (e.g., emission lifetime, pulse duration, interpulse duration), wavelength, and/or intensity. It can have a structure that makes it detectable. In one example, the one or more photodetectors can detect the distribution of photon arrival times after the pulse of excitation light propagates through the integrated device, and the distribution of arrival times is based on timing characteristics of the emitted light (e.g. , luminescence lifetime, pulse duration, and/or proxies for interpulse duration). Such information may be found, for example, in U.S. patent application Ser. MPOSITIONS PCT Application No. PCT/US19/61831 entitled ``FOR PROTEIN SEQUENCING'' (filed November 15, 2019, Attorney Docket No. R0708.70042WO00), ``INTEGRATED SENSOR FOR MULTI-DIMENSIONAL SI U.S. Patent Application No. 17 entitled “GNAL ANALYSIS” No. 190,331 (filed March 2, 2021, Attorney Docket No. R0708.70090US01), U.S. Patent Application No. 15 entitled “LABELED NUCLEOTIDE COMBINATIONS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING” / No. 600,979 (May 2017 No. 15/161,125 entitled “METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING” (filed May 20, 2016, Attorney Docket No. R0708.70020US00) ), each of which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, one or more photodetectors provide an indication of the probability (eg, emission intensity) of emitted light emitted by the fluorescent label. In some embodiments, one or more photodetectors may be sized and positioned to capture the spatial distribution (eg, wavelength) of the emitted light. The output signal from one or more photodetectors can be used to distinguish a fluorescent label from among multiple labels, in which case multiple labels may be used to The sample or its structure can be identified as it is.

本明細書で使用される場合、「集積デバイス」は、ベース装置とインタフェース接続する能力を有するデバイスである。一部の実施形態では、集積デバイスは、１つもしくは複数の試料ウェルおよび／またはセンサを含み得る。一部の実施形態では、集積デバイスは、光を放射または検出するベース装置とインタフェース接続する能力を有し得る。そのような実施形態では、集積デバイスは１つまたは複数の試料ウェル（そのそれぞれは導波路を備える）を含み得る。「集積デバイス」は、本明細書ではマイクロチップ（または「チップ」）、例えばＣＭＯＳチップ等と呼ばれ得る。例示的集積デバイスはピクセルのアレイを備えるＣＭＯＳチップであり、個々のピクセルは試料ウェルおよび光検出器を備える。 As used herein, an "integrated device" is a device that has the ability to interface with a base device. In some embodiments, an integrated device may include one or more sample wells and/or sensors. In some embodiments, the integrated device may have the ability to interface with a base device that emits or detects light. In such embodiments, the integrated device may include one or more sample wells, each of which includes a waveguide. An "integrated device" may be referred to herein as a microchip (or "chip"), such as a CMOS chip. An exemplary integrated device is a CMOS chip with an array of pixels, each pixel comprising a sample well and a photodetector.

一部の態様では、本開示は、金属酸化物表面およびシリカ表面を有する試料ウェルを含む基材を含む集積デバイスを提供する。一部の実施形態では、集積デバイスは、親水性頭部基および疎水性テール基を含む両親媒性試薬により形成された金属酸化物表面上にコーティング層をさらに含む。一部の実施形態では、集積デバイスは、シリカ表面に結合した機能化剤をさらに含み、機能化剤はカップリング部分を含む。一部の実施形態では、基材は試料ウェルのアレイを含み、各試料ウェルは金属酸化物表面およびシリカ表面を有する。一部の実施形態では、アレイは微細加工されたマイクロアレイである。一部の実施形態では、基材は１２８，０００個の試料ウェルを備える。一部の実施形態では、試料ウェルは、基材の表面に形成された上部開口部、および基材の表面に対して遠位側の底部表面を含む。一部の実施形態では、底部表面はシリカ表面により構成される。 In some aspects, the present disclosure provides an integrated device that includes a substrate that includes a sample well with a metal oxide surface and a silica surface. In some embodiments, the integrated device further comprises a coating layer on the metal oxide surface formed by the amphiphilic reagent that includes a hydrophilic head group and a hydrophobic tail group. In some embodiments, the integrated device further includes a functionalizing agent attached to the silica surface, where the functionalizing agent includes a coupling moiety. In some embodiments, the substrate includes an array of sample wells, each sample well having a metal oxide surface and a silica surface. In some embodiments, the array is a microfabricated microarray. In some embodiments, the substrate comprises 128,000 sample wells. In some embodiments, the sample well includes a top opening formed in the surface of the substrate and a bottom surface distal to the surface of the substrate. In some embodiments, the bottom surface is comprised of a silica surface.

一部の実施形態では、試料ウェルは、基材（目的の分析物に結合する）の表面、例えばそのような表面にカップリングしたポリペプチドまたは核酸を有する試料ウェルの底部表面等の独立した領域であり得る固定化領域を含む。一部の実施形態では、試料ウェルは、定義された形状および体積（基材またはデバイス内に作製される）を有する空洞またはウェルを備える。試料ウェルは、当技術分野において記載されている技術（例えば、その全体を本願明細書に援用する米国特許出願第１６／５５５，９０２号に開示されるような）を使用して製作され得る。 In some embodiments, the sample well is a separate area of the surface of the substrate (that binds the analyte of interest), such as the bottom surface of the sample well that has the polypeptide or nucleic acid coupled to such surface. including an immobilization region that may be In some embodiments, the sample well comprises a cavity or well (created within the substrate or device) with a defined shape and volume. Sample wells can be fabricated using techniques described in the art, such as those disclosed in US patent application Ser. No. 16/555,902, which is incorporated herein by reference in its entirety.

一部の実施形態では、試料ウェルは、非金属性層を含む底部表面および金属性層を含む側壁表面により形成される。一部の実施形態では、非金属性層は、透明な層（例えば、ガラス、シリカ）を含む。一部の実施形態では、金属性層は、金属酸化物表面（例えば、二酸化チタン）を含む。一部の実施形態では、金属性層は、表面不活性化コーティング（例えば、リン含有層、例えば有機ホスホン酸層等）を含む。底部表面は、機能的部分を含む非金属性層を含み得る。一部の実施形態では、試料ウェルは、アルミニウムフィルム、窒化チタン（チナイト）フィルム、またはその両方を含有する上部表面を備える。上部表面は、選択的表面化学コーティング、例えば当技術分野において公知のコーティング等をさらに含み得る。一部の実施形態では、集積デバイスは、次世代シークエンシング装置、例えば、ベンチトップ次世代シークエンシング（ＮＧＳ）装置等とインタフェース接続するように構成される。 In some embodiments, the sample well is formed by a bottom surface that includes a non-metallic layer and a sidewall surface that includes a metallic layer. In some embodiments, the non-metallic layer includes a transparent layer (eg, glass, silica). In some embodiments, the metallic layer includes a metal oxide surface (eg, titanium dioxide). In some embodiments, the metallic layer includes a surface passivating coating (eg, a phosphorus-containing layer, such as an organic phosphonic acid layer). The bottom surface may include a non-metallic layer that includes a functional portion. In some embodiments, the sample well comprises a top surface containing an aluminum film, a titanium nitride (tinite) film, or both. The top surface may further include a selective surface chemical coating, such as coatings known in the art. In some embodiments, the integrated device is configured to interface with next generation sequencing equipment, such as benchtop next generation sequencing (NGS) equipment.

本明細書に記載されるタイプの集積デバイスは、目的の分子をその中に受け入れるように構成された１つまたは複数の試料ウェルを備え得る。一部の実施形態では、試料ウェルは、試料ウェルの表面、例えば底部表面等に配置され得る目的の分子を受け入れる。一部の実施形態では、試料ウェルが集積デバイス内に形成され、試料ウェルの底部表面は集積デバイス（この中に試料ウェルが形成される）の表面に対して遠位側にある。一部の実施形態では、目的の分子が配置される底部表面は、所望のレベルの励起エネルギーを用いて目的の分子を励起させるように構成された導波路から距離を有し得る。一部の実施形態では、試料ウェルは、導波路に沿って伝播する光学モードのエバネッセント場が目的の分子とオーバーラップするように、導波路に関して配置され得る。 An integrated device of the type described herein can include one or more sample wells configured to receive molecules of interest therein. In some embodiments, the sample well receives a molecule of interest that may be placed on a surface, such as the bottom surface, of the sample well. In some embodiments, a sample well is formed within the integration device, and the bottom surface of the sample well is distal to the surface of the integration device in which the sample well is formed. In some embodiments, the bottom surface on which the molecule of interest is placed can have a distance from the waveguide configured to excite the molecule of interest with a desired level of excitation energy. In some embodiments, the sample well may be positioned with respect to the waveguide such that the evanescent field of the optical mode propagating along the waveguide overlaps the molecule of interest.

例えば、例示的なシステム１－１００の概略的な概説が図１Ａにおいて示されている。システムは、機器１－１０４とインタフェースする集積デバイス１－１０２の双方を備える。一部の実施形態において、機器１－１０４は、機器１－１０４の一部として集積される１つ以上の励起源１－１０６を含むことができる。一部の実施形態において、励起源は、機器１－１０４および集積デバイス１－１０２の双方の外部にあるものとすることができ、機器１－１０４は、励起光を励起源から受け取るとともに、励起光を集積デバイスに方向付けるように構成することができる。集積デバイスは、集積デバイスを受けるとともに集積デバイスを励起源と光学的に正確に位置合わせして保持するため、任意の好適なソケットを使用して機器とインタフェースすることができる。励起源１－１０６は、集積デバイス１－１０２に励起光を提供するように構成することができる。図１Ａにおいて概略的に示されているように、集積デバイス１－１０２は、複数のピクセル１－１１２を有し、この場合、ピクセルの少なくとも一部分は、対象の試料の独立した分析を行うことができる。ピクセルがそのピクセルとは別々の光源１－１０６から励起光を受け取るため、そのようなピクセル１－１１２は「受動源ピクセル」と称することができる。この場合、この源からの励起光が、ピクセル１－１１２のうちのいくつかまたはすべてを励起する。励起源１－１０６は、任意の好適な光源とすることができる。好適な励起源の例は、２０１５年８月７日に出願され、「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤＤＥＶＩＣＥＦＯＲＰＲＯＢＩＮＧ，ＤＥＴＥＣＴＩＮＧＡＮＤＡＮＡＬＹＺＩＮＧＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」と題する米国特許出願第１４／８２１，６８８号（代理人管理番号Ｒ０７０８．７０００４ＵＳ０２）に記載されており、この出願は参照によりその全体が援用される。一部の実施形態において、励起源１－１０６は、励起光を集積デバイス１－１０２に照射するように組み合わせられる複数の励起源を含む。複数の励起源は、複数の励起エネルギーまたは波長を生成するように構成することができる。 For example, a schematic overview of an exemplary system 1-100 is shown in FIG. 1A. The system includes both equipment 1-104 and an interfacing integrated device 1-102. In some embodiments, instrument 1-104 can include one or more excitation sources 1-106 integrated as part of instrument 1-104. In some embodiments, the excitation source can be external to both instrument 1-104 and integrated device 1-102, where instrument 1-104 receives excitation light from the excitation source and The light can be configured to direct light to the integrated device. The integrated device may be interfaced with the equipment using any suitable socket for receiving the integrated device and holding the integrated device in precise optical alignment with the excitation source. Excitation source 1-106 may be configured to provide excitation light to integrated device 1-102. As shown schematically in FIG. 1A, the integrated device 1-102 has a plurality of pixels 1-112, where at least a portion of the pixels are capable of performing an independent analysis of the sample of interest. can. Such a pixel 1-112 may be referred to as a "passive source pixel" because the pixel receives excitation light from a light source 1-106 separate from the pixel. In this case, excitation light from this source excites some or all of pixels 1-112. Excitation source 1-106 may be any suitable light source. An example of a suitable excitation source is U.S. patent application Ser. S02) , which application is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, excitation source 1-106 includes multiple excitation sources that are combined to direct excitation light to integrated device 1-102. Multiple excitation sources can be configured to produce multiple excitation energies or wavelengths.

図１Ｂを参照すると、ピクセル１－１１２は、関心対象の少なくとも１つの試料を受け取るように構成された反応チャンバ１－１０８、および、励起源１－１０６によって提供される励起光によって試料および反応チャンバ１－１０８の少なくとも一部分を照らすことに反応して、反応チャンバから放出される放出光を検出する光検出器１－１１０を有する。一部の実施形態において、反応チャンバ１－１０８は、集積デバイス１－１０２の表面に近接して試料を保持し得、これは、試料への励起光の照射および試料または反応成分（例えば、発光標識）からの放出光の検出を容易にし得る。図１Ｂの図示された実施形態に示されるように、反応チャンバ１－１０８および光検出器１－１１０は、１対１の対応を有する。一部の実施形態において、本明細書に説明されるように、各ピクセルは、光検出器毎に複数の反応チャンバを備え得る。 Referring to FIG. 1B, the pixel 1-112 includes a reaction chamber 1-108 configured to receive at least one sample of interest, and an excitation light provided by an excitation source 1-106 that directs the sample and reaction chamber to the reaction chamber 1-108. A photodetector 1-110 detects emitted light emitted from the reaction chamber in response to illuminating at least a portion of the reaction chamber 1-108. In some embodiments, the reaction chamber 1-108 may hold a sample in close proximity to the surface of the integrated device 1-102, which may be used for illumination of the sample with excitation light and for sample or reaction components (e.g., emitting light). can facilitate the detection of emitted light from (labels). As shown in the illustrated embodiment of FIG. 1B, reaction chamber 1-108 and photodetector 1-110 have a one-to-one correspondence. In some embodiments, each pixel may include multiple reaction chambers per photodetector, as described herein.

励起光源１－１０６からの励起光を集積デバイス１－１０２に結合するとともに、励起光を反応チャンバ１－１０８にガイドする光学素子が、集積デバイス１－１０２および機器１－１０４のうちの一方または双方に位置付けられ得る。源からチャンバへの光学素子は、集積デバイス１－１０２に位置付けられる１つ以上の格子カプラを備えることができ、励起光を集積デバイスおよび導波路に結合して、励起光を機器１－１０４からピクセル１－１１２内の反応チャンバに照射する。１つ以上の光学スプリッタ素子は、格子カプラと導波路との間に位置することができる。光学スプリッタは、格子カプラからの励起光を結合するとともに、励起光を導波路のうちの少なくとも１つに送達することができる。一部の実施形態において、光学スプリッタは、励起光を、すべての導波路にわたって実質的に均一に送達することを可能にする構造を有することができ、それによって、導波路のそれぞれは、実質的に同様の量の励起光を受け取る。そのような実施形態は、集積デバイスの反応チャンバによって受け取られる励起光の均一性を改善することによって、集積デバイスの性能を改善することができる。 An optical element that couples excitation light from excitation light source 1-106 to integrated device 1-102 and guides the excitation light to reaction chamber 1-108 is coupled to one or more of integrated device 1-102 and instrument 1-104. It can be positioned on both sides. Source-to-chamber optics can include one or more grating couplers positioned on the integrated device 1-102 to couple the excitation light to the integrated device and the waveguide to direct the excitation light from the instrument 1-104. Irradiate the reaction chamber within pixel 1-112. One or more optical splitter elements can be located between the grating coupler and the waveguide. The optical splitter can combine the excitation light from the grating coupler and deliver the excitation light to at least one of the waveguides. In some embodiments, the optical splitter can have a structure that allows excitation light to be delivered substantially uniformly across all waveguides, such that each of the waveguides is substantially receive a similar amount of excitation light. Such embodiments can improve the performance of the integrated device by improving the uniformity of the excitation light received by the reaction chamber of the integrated device.

反応チャンバ１－１０８、励起源からチャンバへの光学系の一部分、および、反応チャンバから光検出器への光学系は、集積デバイス１－１０２に位置付けられる。励起源１－１０６および源からチャンバへのコンポーネントの一部分は、機器１－１０４内に位置付けられる。一部の実施形態において、単一のコンポーネントが、励起光を反応チャンバ１－１０８に結合すること、および、反応チャンバ１－１０８からの放出光を光検出器１－１１０に送達することの双方においての役割を果たし得る。励起光を反応チャンバに結合するおよび／または放出光を光検出器に方向付けるための、集積デバイスに含まれる好適なコンポーネントの例は、２０１５年８月７日に出願された「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ
ＤＥＶＩＣＥＦＯＲＰＲＯＢＩＮＧ，ＤＥＴＥＣＴＩＮＧＡＮＤＡＮＡＬＹＺＩＮＧＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」と題する米国特許出願第１４／８２１，６８８号（代理人管理番号Ｒ０７０８．７０００４ＵＳ０２）、および、２０１４年１１月１７日に出願された「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤＤＥＶＩＣＥＷＩＴＨＥＸＴＥＲＮＡＬＬＩＧＨＴＳＯＵＲＣＥＦＯＲＰＲＯＢＩＮＧ，ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ，ＡＮＤＡＮＡＬＺＩＮＧＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」と題する米国特許出願第１４／５４３，８６５号（代理人管理番号Ｒ０７０８．７０００５ＵＳ００）に記載されており、これらの双方は参照によりその全体が援用される。 The reaction chamber 1-108, a portion of the excitation source to chamber optics, and the reaction chamber to photodetector optics are located in the integrated device 1-102. The excitation source 1-106 and a portion of the source-to-chamber components are located within the instrument 1-104. In some embodiments, a single component both couples excitation light to reaction chamber 1-108 and delivers emitted light from reaction chamber 1-108 to photodetector 1-110. It can play a role in Examples of suitable components included in an integrated device for coupling excitation light into a reaction chamber and/or directing emitted light to a photodetector are disclosed in "INTEGRATED", filed August 7, 2015.
U.S. patent application Ser. DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE US patent application Ser.

ピクセル１－１１２は、それ自体の個々の反応チャンバ１－１０８および少なくとも１つの光検出器１－１１０に関連付けられる。集積デバイス１－１０２の複数のピクセルは、任意の好適な形状、サイズ、および／または寸法を有するように構成することができる。集積デバイス１－１０２は、任意の好適な数のピクセルを有することができる。集積デバイス１－１０２内のピクセルの数は、およそ１００，０００ピクセル～６４，０００，０００ピクセルの範囲内、またはその範囲内における任意の範囲内の値とすることができる。一部の実施形態において、ピクセルは、１０２４個のピクセル×２０４８個のピクセルのアレイに配置することができる。集積デバイス１－１０２は、任意の好適な方法で機器１－１０４とインタフェースすることができる。一部の実施形態において、機器１－１０４は、集積デバイス１－１０２に着脱可能に結合するインタフェースを有することができ、それによってユーザは、集積デバイス１－１０２の使用のために集積デバイス１－１０２を機器１－１０４に取り付けて懸濁液中の少なくとも１つの関心対象の試料を分析するとともに、別の集積デバイスを取り付け可能にするために集積デバイス１－１０２を機器１－１０４から取り外し得る。機器１－１０４のインタフェースは、機器１－１０４の回路部と結合するように集積デバイス１－１０２を位置決めし、１つ以上の光検出器からの読み出し信号を機器１－１０４に送信することを可能にすることができる。集積デバイス１－１０２および機器１－１０４は、大きなピクセルアレイ（例えば、１０，０００超のピクセル）に関連付けられるデータを取り扱うためにマルチチャネル高速通信リンクを含むことができる。 Pixel 1-112 is associated with its own individual reaction chamber 1-108 and at least one photodetector 1-110. Pixels of integrated device 1-102 may be configured to have any suitable shape, size, and/or dimensions. Integrated device 1-102 may have any suitable number of pixels. The number of pixels within integrated device 1-102 may be within the range of approximately 100,000 pixels to 64,000,000 pixels, or any range within that range. In some embodiments, the pixels can be arranged in an array of 1024 pixels by 2048 pixels. Integrated device 1-102 may interface with equipment 1-104 in any suitable manner. In some embodiments, equipment 1-104 can have an interface that removably couples to integrated device 1-102, allowing a user to connect integrated device 1-102 for use with integrated device 1-102. 102 may be attached to instrument 1-104 to analyze at least one sample of interest in suspension, and the accumulation device 1-102 may be removed from instrument 1-104 to allow attachment of another accumulation device. . An interface of instrument 1-104 positions integrated device 1-102 for coupling with circuitry of instrument 1-104 and for transmitting readout signals from the one or more photodetectors to instrument 1-104. can be made possible. Integrated device 1-102 and equipment 1-104 can include multi-channel high speed communication links to handle data associated with large pixel arrays (eg, greater than 10,000 pixels).

機器１－１０４は、機器１－１０４および集積デバイス１－１０２のうちの少なくとも一方の動作を制御するためにユーザインタフェースを含むことができる。ユーザインタフェースは、機器の機能を制御するために使用されるコマンドおよび／または設定などの情報をユーザが機器に入力可能とするように構成することができる。一部の実施形態において、ユーザインタフェースは、ボタン、スイッチ、ダイヤル、および、音声命令のためのマイクを含むことができる。ユーザインタフェースは、ユーザが、適切な位置合わせおよび／または集積デバイス上の光検出器からの読み出し信号によって取得される情報などの、機器および／または集積デバイスの性能に関するフィードバックを受け取ることを可能にすることができる。一部の実施形態において、ユーザインタフェースは、スピーカを使用してフィードバックを提供し、可聴フィードバックを提供することができる。一部の実施形態において、ユーザインタフェースは、ユーザに視覚的なフィードバックを提供するための、インジケータライトおよび／またはディスプレイスクリーンを含むことができる。 Instrument 1-104 may include a user interface to control operation of at least one of instrument 1-104 and integrated device 1-102. The user interface may be configured to allow a user to enter information into the device, such as commands and/or settings used to control the functionality of the device. In some embodiments, the user interface may include buttons, switches, dials, and a microphone for voice commands. The user interface allows the user to receive feedback regarding the performance of the equipment and/or the integrated device, such as information obtained by proper alignment and/or readout signals from photodetectors on the integrated device. be able to. In some embodiments, the user interface may provide feedback using a speaker to provide audible feedback. In some embodiments, the user interface may include indicator lights and/or display screens to provide visual feedback to the user.

一部の実施形態において、機器１－１０４は、コンピューティングデバイスと接続するように構成されたコンピュータインタフェースを含むことができる。コンピュータインタフェースは、ＵＳＢインタフェース、ファイヤーワイヤーインタフェース、または任意の他の好適なコンピュータインタフェースとすることができる。コンピューティングデバイスは、ラップトップまたはデスクトップコンピュータなどの任意の汎用コンピュータとすることができる。一部の実施形態において、コンピューティングデバイスは、好適なコンピュータインタフェースを介して無線ネットワークを通じてアクセス可能なサーバ（例えば、クラウドベースのサーバ）とすることができる。コンピュータインタフェースは、機器１－１０４とコンピューティングデバイスとの間の情報の通信を容易にすることができる。機器１－１０４を制御および／または構成するための入力情報を、コンピュータインタフェースを介して、コンピューティングデバイスに提供するとともに、機器１－１０４に送信することができる。機器１－１０４によって生成される出力情報は、コンピュータインタフェースを介してコンピューティングデバイスによって受け取られることができる。出力情報は、機器１－１０４の性能、集積デバイス１－１０２の性能、および／または光検出器１－１１０の読み出し信号から生成されるデータについてのフィードバックを含むことができる。 In some embodiments, equipment 1-104 can include a computer interface configured to connect with a computing device. The computer interface may be a USB interface, a FireWire interface, or any other suitable computer interface. A computing device can be any general purpose computer, such as a laptop or desktop computer. In some embodiments, the computing device may be a server (eg, a cloud-based server) accessible through a wireless network via a suitable computer interface. A computer interface can facilitate communication of information between equipment 1-104 and a computing device. Input information for controlling and/or configuring the appliance 1-104 can be provided to the computing device and transmitted to the appliance 1-104 via the computer interface. Output information generated by equipment 1-104 can be received by a computing device via a computer interface. The output information may include feedback about the performance of the instrument 1-104, the performance of the integrated device 1-102, and/or data generated from the readout signal of the photodetector 1-110.

一部の実施形態において、機器１－１０４は、集積デバイス１－１０２の１つ以上の光検出器から受け取られるデータを分析するとともに制御信号を励起源１－１０６に送信する、または集積デバイス１－１０２の１つ以上の光検出器から受け取られるデータを分析するか、もしくは制御信号を励起源１－１０６に送信するように構成された処理デバイスを含むことができる。一部の実施形態において、処理デバイスは、汎用プロセッサ、特別に適応されたプロセッサ（例えば、１つ以上のマイクロプロセッサもしくはマイクロコントローラコアなどの中央処理ユニット（ＣＰＵ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、カスタム集積回路、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せ）を含むことができる。一部の実施形態において、１つ以上の光検出器からのデータの処理は、機器１－１０４の処理デバイスおよび外部のコンピューティングデバイスの双方によって行うことができる。他の実施形態においては、外部のコンピューティングデバイスを省いてよく、１つ以上の光検出器からのデータの処理は、集積デバイス１－１０２の処理デバイスのみによって行ってよい。 In some embodiments, the instrument 1-104 analyzes data received from one or more photodetectors of the integrated device 1-102 and sends control signals to the excitation source 1-106, or A processing device configured to analyze data received from one or more photodetectors of -102 or to send control signals to the excitation source 1-106. In some embodiments, the processing device is a general purpose processor, a specially adapted processor (e.g., a central processing unit (CPU) such as one or more microprocessor or microcontroller cores, a field programmable gate array (FPGA), an application specific integrated circuit (ASIC), a custom integrated circuit, a digital signal processor (DSP), or a combination thereof). In some embodiments, processing of data from one or more photodetectors can be performed by both a processing device of instrument 1-104 and an external computing device. In other embodiments, the external computing device may be omitted and processing of data from one or more photodetectors may be performed solely by the processing device of integrated device 1-102.

図１Ｂには、ピクセル１－１１２の行を示す集積デバイス１－１０２の断面概略図が示されている。集積デバイス１－１０２は、結合領域１－２０１、ルーティング領域１－２０２、およびピクセル領域１－２０３を含み得る。ピクセル領域１－２０３は、励起光（破線の矢印として示される）が集積デバイス１－１０２に結合する結合領域１－２０１から離れた位置の表面上に配置された複数の反応チャンバ１－１０８を有する複数のピクセル１－１１２を含み得る。複数の反応チャンバ１－１０８は、１つまたは複数の金属層１－１０６を貫通して形成され得る。点線の矩形によって示される１つのピクセル１－１１２は、反応チャンバ１－１０８と、１つまたは複数の光検出器１－１１０を有する光検出領域とを含む集積デバイス１－１０２の領域である。図示された実施形態において、ピクセルは単一の反応チャンバ１－１０８を含む。一部の実施形態において、各ピクセルは、２つ以上の反応チャンバを備え得る。 A cross-sectional schematic diagram of integrated device 1-102 showing rows of pixels 1-112 is shown in FIG. 1B. Integrated device 1-102 may include a coupling region 1-201, a routing region 1-202, and a pixel region 1-203. Pixel region 1-203 includes a plurality of reaction chambers 1-108 located on the surface remote from coupling region 1-201 where excitation light (shown as dashed arrows) couples to integrated device 1-102. A plurality of pixels 1-112 may be included. A plurality of reaction chambers 1-108 may be formed through one or more metal layers 1-106. One pixel 1-112, indicated by a dotted rectangle, is an area of an integrated device 1-102 that includes a reaction chamber 1-108 and a photodetection area with one or more photodetectors 1-110. In the illustrated embodiment, the pixel includes a single reaction chamber 1-108. In some embodiments, each pixel may include two or more reaction chambers.

図１Ｂは、励起光のビームを結合領域１－２０１および反応チャンバ１－１０８に結合することによる励起経路（破線で示される）を示す。図１Ｂに示される反応チャンバ１－１０８の行は、導波路１－２２０と光学的に結合するように位置付けられ得る。励起光は、反応チャンバ内に位置付けられる試料を照射し得る。試料または反応成分（例えば、蛍光標識）は、励起光によって照射されることに反応して、励起状態に達し得る。試料または反応成分が励起状態にあるとき、試料または反応成分は、反応チャンバに関連付けられた１つまたは複数の光検出器によって検出され得る放出光を放出し得る。図１Ｂは、反応チャンバ１－１０８からピクセル１－１１２の１つまたは複数の光検出器１－１１０への放出光（実線として示される）の光軸を概略的に示す。ピクセル１－１１２の１つまたは複数の光検出器１－１１０は、反応チャンバ１－１０８からの放出光を検出するように構成および配置され得る。好適な光検出器の例は、２０１５年８月７日に出願された「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤＤＥＶＩＣＥＦＯＲＴＥＭＰＯＲＡＬＢＩＮＮＩＮＧＯＦＲＥＣＥＩＶＥＤＰＨＯＴＯＮＳ」と題する米国特許出願第１４／８２１，６５６号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７０００２ＵＳ０２）に記載されており、この出願は参照によりその全体が援用される。個々のピクセル１－１１２に関して、反応チャンバ１－１０８および個々の光検出器１－１１０は、共通の軸に沿って（図１Ａに示されるｙ方向に沿って）整列され得る。このように、光検出器（複数可）は、ピクセル１－１１２内で反応チャンバと重なり得る。 FIG. 1B shows the excitation path (indicated by dashed lines) by coupling a beam of excitation light into coupling region 1-201 and reaction chamber 1-108. The rows of reaction chambers 1-108 shown in FIG. 1B may be positioned to optically couple with waveguides 1-220. Excitation light may illuminate a sample positioned within the reaction chamber. A sample or reaction component (eg, a fluorescent label) can reach an excited state in response to being irradiated with excitation light. When the sample or reaction component is in an excited state, the sample or reaction component may emit emitted light that can be detected by one or more photodetectors associated with the reaction chamber. FIG. 1B schematically depicts the optical axis of emitted light (shown as a solid line) from reaction chamber 1-108 to one or more photodetectors 1-110 of pixel 1-112. One or more photodetectors 1-110 of pixel 1-112 may be constructed and arranged to detect emitted light from reaction chamber 1-108. An example of a suitable photodetector is disclosed in U.S. patent application Ser. , which application is incorporated by reference in its entirety. For an individual pixel 1-112, the reaction chamber 1-108 and the individual photodetector 1-110 may be aligned along a common axis (along the y direction shown in FIG. 1A). In this manner, the photodetector(s) may overlap the reaction chamber within pixel 1-112.

反応チャンバ１－１０８からの放出光の方向性は、１つまたは複数の金属層１－１０６が放出光を反射するように作用し得るため、１つまたは複数の金属層１－１０６に対する反応チャンバ１－１０８内の試料の位置に応じて変わり得る。このように、１つまたは複数の金属層１－１０６と反応チャンバ１－１０８内に位置する蛍光マーカとの間の距離は、蛍光マーカによって放出される光を検出するための、反応チャンバと同じピクセル内にある、１つまたは複数の光検出器１－１１０の効率に影響を及ぼし得る。１つまたは複数の金属層１－１０６と、動作中に試料が位置可能な場所に近接する反応チャンバ１－１０８の底面との間の距離は、１００ｎｍ～５００ｎｍの範囲内、またはその範囲内の任意の値もしくは値の範囲内であり得る。一部の実施形態において、金属層１－１０６と反応チャンバ１－１０８の底面との間の距離は、約３００ｎｍである。 The directionality of the emitted light from the reaction chamber 1-108 is such that the directionality of the emitted light from the reaction chamber relative to the one or more metal layers 1-106 is such that the one or more metal layers 1-106 may act to reflect the emitted light. 1-108 depending on the location of the sample. In this way, the distance between the one or more metal layers 1-106 and the fluorescent marker located within the reaction chamber 1-108 is the same as that of the reaction chamber for detecting the light emitted by the fluorescent marker. The efficiency of one or more photodetectors 1-110 within a pixel may be affected. The distance between the metal layer or layers 1-106 and the bottom of the reaction chamber 1-108 adjacent to where the sample can be located during operation is in the range of 100 nm to 500 nm, or within the range It can be any value or range of values. In some embodiments, the distance between metal layer 1-106 and the bottom of reaction chamber 1-108 is about 300 nm.

試料と１つまたは複数の光検出器との間の距離もまた、放出光を検出する際の効率に影響を及ぼし得る。光が試料と光検出器との間を移動しなければならない距離を減少させることによって、放出光の検出効率が改善され得る。加えて、試料と光検出器との間の距離を小さくすると、集積デバイスに占めるピクセルの設置面積を小さくすることを可能にし得、これにより、より多くの数のピクセルが集積デバイスに含まれることを可能にし得る。反応チャンバ１－１０８の底面と１つまたは複数の光検出器との間の距離は、１マイクロメートル～１５マイクロメートルの範囲、またはその範囲内の任意の値もしくは値の範囲であり得る。一部の実施形態において、放出光は、励起光源および反応チャンバ以外の手段を通して提供され得ることを理解されたい。従って、一部の実施形態は、反応チャンバ１－１０８を含まなくてもよい。 The distance between the sample and the photodetector or photodetectors can also affect the efficiency in detecting emitted light. By reducing the distance that light must travel between the sample and the photodetector, the detection efficiency of emitted light can be improved. In addition, reducing the distance between the sample and the photodetector may allow the pixels to occupy a smaller footprint in the integrated device, thereby allowing a greater number of pixels to be included in the integrated device. can be made possible. The distance between the bottom of the reaction chamber 1-108 and the one or more photodetectors can range from 1 micrometer to 15 micrometers, or any value or range of values within that range. It should be appreciated that in some embodiments, emitted light may be provided through means other than an excitation light source and a reaction chamber. Accordingly, some embodiments may not include reaction chamber 1-108.

１つまたは複数のフォトニック構造１－２３０は、反応チャンバ１－１０８と光検出器１－１１０との間に配置され得るとともに、励起光が光検出器１－１１０に到達することを低減または防止するように構成され得、そうでなければ、励起光は放出光を検出する際の信号ノイズの一因となり得る。図１Ｂに示すように、１つまたは複数のフォトニック構造１－２３０は、導波路１－２２０と光検出器１－１１０との間に配置され得る。１つまたは複数のフォトニック構造１－２３０は、スペクトルフィルタ、偏光フィルタ、および空間フィルタを含む１つまたは複数の光除去フォトニック構造を含み得る。１つまたは複数のフォトニック構造１－２３０は、共通の軸に沿って個々の反応チャンバ１－１０８及びそれらの個々の１つまたは複数の光検出器１－１１０と整列するように配置され得る。集積デバイス１－１０２の回路として機能し得る金属層１－２４０は、一部の実施形態によれば、空間フィルタまたは偏光フィルタとしても機能し得る。そのような実施形態において、１つまたは複数の金属層１－２４０は、励起光の一部または全部が光検出器１－１１０に到達することを阻止するように配置され得る。 One or more photonic structures 1-230 may be positioned between the reaction chamber 1-108 and the photodetector 1-110 and reduce or reduce excitation light from reaching the photodetector 1-110. The excitation light may otherwise contribute to signal noise in detecting the emitted light. As shown in FIG. 1B, one or more photonic structures 1-230 may be positioned between the waveguide 1-220 and the photodetector 1-110. The one or more photonic structures 1-230 may include one or more light removal photonic structures including spectral filters, polarization filters, and spatial filters. The one or more photonic structures 1-230 may be arranged to align with the respective reaction chambers 1-108 and their respective one or more photodetectors 1-110 along a common axis. . Metal layer 1-240, which may function as a circuit of integrated device 1-102, may also function as a spatial or polarization filter, according to some embodiments. In such embodiments, one or more metal layers 1-240 may be arranged to block some or all of the excitation light from reaching the photodetector 1-110.

結合領域１－２０１は、外部の励起源、例えば、図１Ａに示される１つまたは複数の励起源１－１１６からの励起光を結合するように構成された１つまたは複数の光学コンポーネントを含み得る。結合領域１－２０１は、励起光のビームの一部又は全部を受光するように配置された格子カプラ１－２１６を含み得る。好適な格子カプラの例は、２０１７年１２月１５日に出願された「ＯＰＴＩＣＡＬＣＯＵＰＬＥＲＡＮＤＷＡＶＥＧＵＩＤＥＳＹＳＴＥＭ」と題する米国特許出願第１５／８４４，４０３号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７００２１ＵＳ０１）、および２０２０年４月２９日に出願された「ＳＬＩＣＥＤＧＲＡＴＩＮＧＣＯＵＰＬＥＲＷＩＴＨＩＮＣＲＥＡＳＥＤＢＥＡＭＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳＥＮＳＩＴＩＶＩＴＹ」と題された米国特許出願第１６／８６１，３９９号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７００７１ＵＳ０１）に記載されており、これらの出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される。格子カプラ１－２１６は、励起光を、１つまたは複数の反応チャンバ１－１０８の近傍に伝搬するように構成され得る導波路１－２２０に結合し得る。代替的に、結合領域１－２０１は、光を導波路に結合するための他の周知の構造を備え得る。 Coupling region 1-201 includes one or more optical components configured to couple excitation light from an external excitation source, e.g., one or more excitation sources 1-116 shown in FIG. 1A. obtain. Coupling region 1-201 may include a grating coupler 1-216 arranged to receive part or all of the beam of excitation light. Examples of suitable lattice couplers are disclosed in U.S. patent application Ser. No. 16/861,399 (Attorney Docket No. R0708.70071US01) entitled "SLICED GRATING COUPLER WITH INCREASED BEAM ALIGNMENT SENSITIVITY" filed on April 29th; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. A grating coupler 1-216 may couple the excitation light to a waveguide 1-220 that may be configured to propagate into the vicinity of one or more reaction chambers 1-108. Alternatively, coupling region 1-201 may comprise other known structures for coupling light into a waveguide.

集積デバイスから離れて配置されたコンポーネントを使用して、励起源１－１１６を集積デバイスに対して位置決めおよび位置合わせし得る。このようなコンポーネントは、レンズ、鏡、プリズム、ウィンドウ、アパーチャ、減衰器、および／または光ファイバを含む光学コンポーネントを含み得る。１つまたは複数の位置合わせコンポーネントの制御を可能にするために、付加的な機械的なコンポーネントが器具に含まれ得る。そのような機械的なコンポーネントは、アクチュエータ、ステッパモータ、および／またはノブを含み得る。好適な励起源及び位置合わせ機構の例は、２０１６年５月２０日に出願された「ＰＵＬＳＥＤＬＡＳＥＲＡＮＤＳＹＳＴＥＭ」と題する米国特許出願第１５／１６１，０８８号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７００１０ＵＳ０２）に記載されており、この出願は参照によりその全体が援用される。ビームステアリングモジュールの別の例は、２０１７年１２月１４日に出願された「ＣｏｍｐａｃｔＢｅａｍＳｈａｐｉｎｇａｎｄＳｔｅｅｒｉｎｇＡｓｓｅｍｂｌｙ」と題する米国特許出願第１５／８４２，７２０号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７００２４ＵＳ０１）に記載されており、この出願は参照により本明細書に援用される。 Components located remotely from the integrated device may be used to position and align the excitation source 1-116 with respect to the integrated device. Such components may include optical components including lenses, mirrors, prisms, windows, apertures, attenuators, and/or optical fibers. Additional mechanical components may be included in the instrument to allow control of one or more alignment components. Such mechanical components may include actuators, stepper motors, and/or knobs. Examples of suitable excitation sources and alignment mechanisms are provided in U.S. patent application Ser. This application is incorporated by reference in its entirety. Another example of a beam steering module is described in U.S. patent application Ser. , which application is incorporated herein by reference.

分析される試料は、ピクセル１－１１２の反応チャンバ１－１０８に導入され得る。試料は、生物試料又は化学的試料などの任意の他の適切な試料であり得る。試料は、複数の分子を含み得、反応チャンバは、単一分子を分離するように構成され得る。いくつかの例においては、反応チャンバの寸法は、単一分子を反応チャンバ内に閉じ込めるように作用し得、測定が単一分子に対して実行されることを可能にする。励起光は、反応チャンバ１－１０８内の照射領域内にある間に、試料、または試料に付着されるか、または試料に別様に関連付けられた少なくとも１つの蛍光マーカを励起するように、反応チャンバ１－１０８内に照射され得る。 A sample to be analyzed may be introduced into reaction chamber 1-108 of pixel 1-112. The sample can be any other suitable sample, such as a biological or chemical sample. The sample may include multiple molecules and the reaction chamber may be configured to separate single molecules. In some examples, the dimensions of the reaction chamber can act to confine a single molecule within the reaction chamber, allowing measurements to be performed on a single molecule. The excitation light is configured to excite the sample, or at least one fluorescent marker attached to or otherwise associated with the sample, while within the illuminated region within the reaction chamber 1-108. may be irradiated into chamber 1-108.

動作時、反応チャンバ内の試料の並列な分析は、励起光を使用してウェル内の試料の一部または全部を励起し、試料放出からの信号を光検出器で検出することによって実行される。試料からの放出光は、対応する光検出器によって検出され、少なくとも１つの電気信号に変換され得る。放出光の様々な特性（例えば、波長、発光寿命、強度、パルス持続時間、および／または任意の他の適切な特性）に関する情報は、本明細書で説明されるように、収集され、後続の分析のために使用され得る。電気信号は、集積デバイスの回路内の導電線（例えば、金属層１－２４０）に沿って送信され得、導電線は、集積デバイスとインタフェースする機器に接続され得る。電気信号は、続いて処理および／または分析され得る。電気信号の処理または分析は、機器上または機器から離れて配置された好適なコンピューティングデバイス上で行われ得る。 In operation, parallel analysis of the sample in the reaction chamber is performed by exciting part or all of the sample in the well using excitation light and detecting the signal from the sample emission with a photodetector. . Emitted light from the sample can be detected by a corresponding photodetector and converted into at least one electrical signal. Information regarding various characteristics of the emitted light (e.g., wavelength, emission lifetime, intensity, pulse duration, and/or any other suitable characteristics) is collected and subsequently analyzed as described herein. Can be used for analysis. Electrical signals may be transmitted along conductive lines (eg, metal layers 1-240) within the circuitry of the integrated device, and the conductive lines may be connected to equipment that interfaces with the integrated device. The electrical signal may subsequently be processed and/or analyzed. Processing or analysis of the electrical signals may be performed on a suitable computing device located on or remote from the equipment.

図１Ｃは、一部の実施形態による、集積デバイス１－１０２のピクセル１－１１２の断面図を示す。図１Ｄは、ピクセル１－１１２の回路図を示す。図１Ｅは、一部の実施形態による、集積デバイス１－１０２に含まれ得るピクセル１－１１２の例示的なアレイおよび処理回路１－１１４を示す。 FIG. 1C shows a cross-sectional view of pixel 1-112 of integrated device 1-102, according to some embodiments. FIG. 1D shows a circuit diagram of pixel 1-112. FIG. 1E shows an exemplary array of pixels 1-112 and processing circuitry 1-114 that may be included in integrated device 1-102, according to some embodiments.

図１Ｃ及び図１Ｄにおいて、ピクセル１－１１２は、ピン止めフォトダイオード（ＰＰＤ：ｐｉｎｎｅｄｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）であり得る光検出領域と、蓄積ダイオード（ＳＤ（ｓｔｏｒａｇｅｄｉｏｄｅ）０及びＳＤ１）であり得る２つの電荷蓄積領域と、浮遊拡散（ＦＤ：ｆｌｏａｔｉｎｇｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）領域であり得る読み出し領域とを含む。また図示のように、ピクセル１－１１２は、ドレイン領域Ｄと、転送ゲートＳＴ０、ＴＸ０、ＴＸ１、およびＲＥＪとを含む。 In FIGS. 1C and 1D, pixel 1-112 has a photodetection region, which may be a pinned photodiode (PPD), and two charge storage regions, which may be storage diodes (SD0 and SD1). and a readout region, which may be a floating diffusion (FD) region. Also as shown, pixel 1-112 includes a drain region D and transfer gates ST0, TX0, TX1, and REJ.

一部の実施形態において、光検出領域ＰＰＤ、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１、及び読み出し領域ＦＤは、基板の一部をドーピングすることによって集積回路基板上に形成される。例えば、基板は低濃度にドープされ得、光検出領域ＰＰＤ、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１、および読み出し領域ＦＤはより高濃度にドープされ得る。この例では、基板は低濃度にｐ型ドープされ得、光検出領域ＰＰＤ、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１、ならびに読み出し領域ＦＤはｎ型ドープされ得る。代替的に、本明細書で説明される実施形態はそのように限定されないため、基板が低濃度にｎ型ドープされ得、光検出領域ＰＰＤ、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１、および読み出し領域ＦＤがｐ型ドープされ得る。 In some embodiments, photodetection regions PPD, charge storage regions SD0, SD1, and readout regions FD are formed on an integrated circuit substrate by doping a portion of the substrate. For example, the substrate may be lightly doped, and the photodetection region PPD, charge storage regions SD0, SD1, and readout region FD may be more heavily doped. In this example, the substrate may be lightly p-doped, and the photodetection region PPD, charge storage regions SD0, SD1, and readout region FD may be n-doped. Alternatively, the substrate may be lightly n-doped and the photodetection region PPD, charge storage regions SD0, SD1, and readout region FD are p-doped, as embodiments described herein are not so limited. Can be type doped.

一部の実施形態において、光検出領域ＰＰＤは、入射光子が光検出領域ＰＰＤ内で受け入れられると、電荷キャリア（例えば、光電子）を生成するように構成され得る。一部の実施形態において、電荷蓄積領域ＳＤ０及びＳＤ１は、光検出領域ＰＰＤにかつ／又は互いに電気的に結合され得る。例えば、ピクセル１－１１２は、電荷蓄積領域ＳＤ０及びＳＤ１を光検出領域ＰＰＤに及び／又は互いに電気的に結合する１つまたは複数の転送チャネルを含み得る。一部の実施形態において、転送チャネルは、領域間に配置された集積回路基板の部分をドープすることによって形成され得る。例えば、これらの部分は、領域（例えば、ｎ型ドープＰＰＤおよびＳＤ０との間に配置されたｎ型ドープチャネル）と同じ導電型でドープされ得る。図１Ｄを参照すると、例えば、光検出領域ＰＰＤと電荷蓄積領域ＳＤ０との間に結合されたトランジスタのチャネルは、光検出領域ＰＰＤを電荷蓄積領域ＳＤ０に電気的に結合する転送チャネルである。同様に、電荷蓄積領域ＳＤ０とＳＤ１との間に結合されたトランジスタのチャネルは、電荷蓄積領域ＳＤ０とＳＤ１とを電気的に結合する転送チャネルであり、電荷蓄積領域ＳＤ１と読み出し領域ＦＤとの間に結合されたトランジスタのチャネルは、電荷蓄積領域ＳＤ１と読み出し領域ＦＤとを電気的に結合する転送チャネルである。光検出領域ＰＰＤとドレイン領域Ｄとの間に結合されたトランジスタのチャネルは、光検出領域ＰＰＤとドレイン領域Ｄとの間の転送チャネルである。 In some embodiments, the photodetection region PPD may be configured to generate charge carriers (eg, photoelectrons) when an incident photon is received within the photodetection region PPD. In some embodiments, charge storage regions SD0 and SD1 may be electrically coupled to photodetection region PPD and/or to each other. For example, pixel 1-112 may include one or more transfer channels that electrically couple charge storage regions SD0 and SD1 to photodetection region PPD and/or to each other. In some embodiments, transfer channels may be formed by doping portions of the integrated circuit substrate disposed between the regions. For example, these parts may be doped with the same conductivity type as the region (eg, the n-doped channel located between the n-doped PPD and the SD0). Referring to FIG. 1D, for example, the channel of the transistor coupled between the photodetection region PPD and the charge storage region SD0 is a transfer channel that electrically couples the photodetection region PPD to the charge storage region SD0. Similarly, the channel of the transistor coupled between the charge storage regions SD0 and SD1 is a transfer channel that electrically couples the charge storage regions SD0 and SD1, and the channel between the charge storage region SD1 and the readout region FD. The channel of the transistor coupled to is a transfer channel that electrically couples the charge storage region SD1 and the readout region FD. The channel of the transistor coupled between the photodetection region PPD and the drain region D is a transfer channel between the photodetection region PPD and the drain region D.

一部の実施形態において、転送ゲートＳＴ０、ＴＸ０、ＴＸ１、およびＲＥＪは、光検出領域ＰＰＤから蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１への、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１との間の、および／または電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１と読み出し領域ＦＤとの間の電荷キャリアの転送を制御するように構成され得る。例えば、転送ゲートＳＴ０、ＴＸ０、ＴＸ１、およびＲＥＪは、適切な制御信号が転送ゲートに印加されたときに領域間で電荷キャリアを転送するために、ピクセル１－１１２の領域を電気的に結合するように転送チャネルに電気的に結合され、かつ転送チャネルをバイアスするように構成され得る。様々な実施形態によれば、転送ゲートは、転送チャネルに導電的に（例えば、物理的に）結合され得、かつ／または転送チャネルに十分に近接して配置され得、かつ／または転送チャネルに容量的に結合するために十分に薄い絶縁体によって分離され得る。一部の実施形態において、本明細書で説明する転送ゲートは、金属などの導電性材料を使用して形成され得る。代替的または追加的に、一部の実施形態において、本明細書で説明される転送ゲートは、ポリシリコンなどの半導体材料を使用して形成され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載の転送ゲートを形成するために使用される材料は、少なくとも部分的に不透明であり得る。 In some embodiments, the transfer gates ST0, TX0, TX1, and REJ are connected from the photodetection region PPD to the storage regions SD0, SD1, between the charge storage regions SD0, SD1, and/or the charge storage region SD0. , SD1 and the readout region FD. For example, transfer gates ST0, TX0, TX1, and REJ electrically couple regions of pixels 1-112 to transfer charge carriers between the regions when appropriate control signals are applied to the transfer gates. may be electrically coupled to the transfer channel and configured to bias the transfer channel. According to various embodiments, the transfer gate may be conductively coupled (e.g., physically) to the transfer channel, and/or may be located in sufficient proximity to the transfer channel, and/or may be in close proximity to the transfer channel. They may be separated by sufficiently thin insulators to couple capacitively. In some embodiments, the transfer gates described herein may be formed using conductive materials such as metals. Alternatively or additionally, in some embodiments, the transfer gates described herein may be formed using a semiconductor material such as polysilicon. In some embodiments, the materials used to form the transfer gates described herein can be at least partially opaque.

一部の実施形態において、制御信号が転送ゲートで受信されると、転送ゲートは、制御信号を転送チャネルに電気的に結合し、転送チャネルにバイアスをかけ、それによって転送チャネルの導電率を増加させ得る。一部の実施形態において、転送チャネルは、同じ導電型であるが、転送チャネルによって電気的に結合されたピクセル１－１１２の領域よりも低いドーパント濃度でドープされてもよく、それによって、領域間に固有電位障壁（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｂａｒｒｉｅｒ）を生成する。固有電位障壁は、転送ゲートまたは転送チャネルに外部電界が印加されない場合であっても、領域間に存在し得る。例えば、光検出領域ＰＰＤと電荷蓄積領域ＳＤ０との間の転送チャネルのドーパント濃度によって、光検出領域ＰＰＤと電荷蓄積領域ＳＤ０との間に固有電位障壁が生成され得る。一部の実施形態において、転送チャネルによって電気的に結合された領域間の固有電位障壁を低下させて、転送チャネルの導電率を増加させ、領域間の電荷キャリアの転送を引き起こすように構成される制御信号が転送ゲートに印加され得る。例えば、ｎ型ドープされた転送チャネルの場合、制御信号は、領域のうちの１つ（例えば、転送チャネルのソース端子）における電圧よりも少なくとも転送チャネルの閾値電圧だけ大きい電圧を有し得、閾値電圧は、転送チャネルのサイズ、転送チャネルに近接する集積デバイス１－１０２の基板電圧、および他のそのようなパラメータに依存する。同様に、ｐ型ドープされた転送チャネルの場合、制御信号は、領域のうちの１つにおける電圧よりも少なくとも閾値電圧だけ低い電圧を有し得る。一部の実施形態において、集積デバイス１－１０２の制御回路は、本明細書でさらに説明されるように、そのような制御信号を生成して転送ゲートに提供するように構成され得る。 In some embodiments, when the control signal is received at the transfer gate, the transfer gate electrically couples the control signal to the transfer channel and biases the transfer channel, thereby increasing the conductivity of the transfer channel. can be done. In some embodiments, the transfer channel may be doped with a lower dopant concentration than the regions of pixels 1-112 that are of the same conductivity type but electrically coupled by the transfer channel, thereby generates an intrinsic electric potential barrier. Intrinsic potential barriers may exist between regions even when no external electric field is applied to the transfer gate or transfer channel. For example, the dopant concentration of the transfer channel between the photodetection region PPD and the charge storage region SD0 may create an inherent potential barrier between the photodetection region PPD and the charge storage region SD0. In some embodiments, the structure is configured to lower the intrinsic potential barrier between regions electrically coupled by the transfer channel to increase the conductivity of the transfer channel and cause charge carrier transfer between the regions. A control signal may be applied to the transfer gate. For example, in the case of an n-doped transfer channel, the control signal may have a voltage that is at least the threshold voltage of the transfer channel greater than the voltage at one of the regions (e.g., the source terminal of the transfer channel); The voltage depends on the size of the transfer channel, the substrate voltage of the integrated device 1-102 in proximity to the transfer channel, and other such parameters. Similarly, for a p-type doped transfer channel, the control signal may have a voltage that is at least a threshold voltage lower than the voltage in one of the regions. In some embodiments, the control circuitry of integrated device 1-102 may be configured to generate and provide such control signals to the transfer gates, as further described herein.

図１Ｃにおいて、ピクセル１－１１２は、光検出領域ＰＰＤ、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１、および読み出し領域ＦＤが転送ゲートＲＥＪ、ＳＴ０、ＴＸ０、及びＴＸ１から間隔を空けている方向（例えば、前面照射）において入射光子を受光するように構成された構成で示されている。しかしながら、一部の実施形態において、光検出領域ＰＰＤは、転送ゲートＲＥＪ、ＳＴ０、ＴＸ０、およびＴＸ１が光検出領域ＰＰＤ、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１、および読み出し領域ＦＤから間隔を空けている方向（例えば、裏面照射）において入射光子を受光するように構成され得ることを理解されたい。一部の実施形態において、そのような構成は、転送ゲートの光学特性が入射光子に及ぼす影響が低減されるため、転送ゲートの電気特性を改善することができる。 In FIG. 1C, pixel 1-112 is arranged in a direction (e.g., front-illuminated) in which the photodetection region PPD, charge storage region SD0, SD1, and readout region FD are spaced from transfer gates REJ, ST0, TX0, and TX1. is shown in a configuration configured to receive incident photons. However, in some embodiments, the photodetection region PPD is arranged in a direction ( It should be appreciated that the device may be configured to receive incident photons in, for example, backside illumination). In some embodiments, such a configuration can improve the electrical properties of the transfer gate because the effect of the optical properties of the transfer gate on incident photons is reduced.

図１Ｄにおいて、ピクセル１－１１２は、読み出し領域ＦＤに結合されるとともに、高電圧ＶＤＤＰに結合するように構成されたリセット（ＲＳＴ）転送ゲートと、読み出し領域ＦＤとビット線との間に結合された行選択（ＲＳ）転送ゲートとをさらに含む。集積デバイス１－１０２が電源（例えば、少なくともＤＣ電源）に結合されると、転送ゲートＲＳＴは高電圧ＶＤＤＰに結合され得、高電圧ＶＤＤＰは、電源によって供給され、および／または集積デバイス１－１０２の電圧レギュレータによって調整される。 In FIG. 1D, pixel 1-112 is coupled to a readout region FD and has a reset (RST) transfer gate configured to couple to a high voltage VDDP and between the readout region FD and a bit line. and a row select (RS) transfer gate. When integrated device 1-102 is coupled to a power source (eg, at least a DC power source), transfer gate RST may be coupled to a high voltage VDDP, which is supplied by the power source and/or integrated device 1-102. regulated by a voltage regulator.

一部の実施形態において、転送ゲートＲＳＴは、読み出し領域ＦＤの電圧をリセットするように構成され得る。例えば、リセット信号が転送ゲートＲＳＴに印加されると、転送ゲートＲＳＴは、読み出し領域ＦＤを高電圧ＶＤＤＰに電気的に結合するように転送チャネルをバイアスして、転送チャネルの導電率を増加させて、電荷キャリアを読み出し領域ＦＤから高電圧ＶＤＤＰに転送し得る。一部の実施形態において、リセット転送ゲートＲＳＴは、電荷蓄積領域ＳＤ０および／またはＳＤ１の電圧をリセットするようにさらに構成され得る。例えば、リセット信号がリセット転送ゲートＲＳＴに印加され、制御信号が転送ゲートＴＸ１に印加されると、転送ゲートＴＸ１は、電荷蓄積領域ＳＤ１内の電荷キャリアを読み出し領域ＦＤに転送し、転送ゲートＲＳＴは、電荷キャリアを高電圧ＶＤＤＰに転送し得る。同様に、リセット信号がリセット転送ゲートＲＳＴに印加され、制御信号が転送ゲートＴＸ１およびＴＸ０に印加されると、転送ゲートＴＸ０は電荷蓄積領域ＳＤ０内の電荷キャリアをＳＤ１に転送し、転送ゲートＴＸ１は電荷蓄積領域ＳＤ１内の電荷キャリアを読み出し領域ＦＤに転送し、転送ゲートＲＳＴは電荷キャリアを高電圧ＶＤＤＰに転送し得る。一部の実施形態において、集積デバイス１－１０２は、電荷キャリアを収集および読み出す前に、読み出し領域ＦＤおよび電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１をリセットするように構成され得る。例えば、集積デバイス１－１０２は、電荷キャリアを収集して読み出す前に、読み出し領域ＦＤをリセットし、次いで電荷蓄積領域ＳＤ１をリセットし、次いで電荷蓄積領域ＳＤ０をリセットするように構成され得る。 In some embodiments, transfer gate RST may be configured to reset the voltage of read region FD. For example, when a reset signal is applied to transfer gate RST, transfer gate RST biases the transfer channel to electrically couple readout region FD to high voltage VDDP, increasing the conductivity of the transfer channel. , charge carriers can be transferred from the readout region FD to the high voltage VDDP. In some embodiments, reset transfer gate RST may be further configured to reset the voltage of charge storage regions SD0 and/or SD1. For example, when a reset signal is applied to the reset transfer gate RST and a control signal is applied to the transfer gate TX1, the transfer gate TX1 transfers the charge carriers in the charge storage region SD1 to the readout region FD, and the transfer gate RST , charge carriers can be transferred to the high voltage VDDP. Similarly, when a reset signal is applied to reset transfer gate RST and a control signal is applied to transfer gates TX1 and TX0, transfer gate TX0 transfers the charge carriers in charge storage region SD0 to SD1, and transfer gate TX1 The charge carriers in the charge storage region SD1 can be transferred to the readout region FD, and the transfer gate RST can transfer the charge carriers to the high voltage VDDP. In some embodiments, integrated device 1-102 may be configured to reset readout region FD and charge storage regions SD0, SD1 before collecting and reading out charge carriers. For example, integrated device 1-102 may be configured to reset readout region FD, then reset charge storage region SD1, and then reset charge storage region SD0 before collecting and reading charge carriers.

一部の実施形態において、ビット線は、読み出し領域ＦＤに読み出された電荷キャリアを示す電圧レベルを受け取るように構成された集積デバイス１－１０２上の処理回路および／または外部回路に結合され得る。一部の実施形態において、処理回路１－１１４は、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）を含み得る。一部の実施形態において、集積デバイス１－１０２は、電荷キャリアを読み出す前に、各ピクセルの読み出し領域ＦＤの電圧をリセットするように構成され得る。例えば、集積デバイス１－１０２は、読み出し領域ＦＤの電圧をリセットし、電圧をサンプリングし、電荷キャリアを読み出し領域ＦＤに転送し、再び電圧をサンプリングするように構成され得る。この例では、第２のサンプリングされた電圧は、第１のサンプリングされた電圧と比較したときに読み出し領域ＦＤに転送された電荷キャリアの数を示し得る。一部の実施形態において、集積デバイス１－１０２は、行ごとおよび／または列ごとなど、各ピクセル１－１１２からビット線に順次電荷キャリアを読み出すように構成され得る。ピクセル１－１１２のいくつかのアレイは、ピクセル１－１１２の異なるピクセルおよび／またはグループに電気的に結合された複数のビット線を有し得ることを理解されたい。一部の実施形態において、複数の列のピクセルは、同時に個々の処理回路に読み出され得る。例えば、各列の第１のピクセル（例えば、ピクセル（１，１）および（１，２）等）は、同時に個々の処理回路に読み出され、次いで、各列の第２のピクセル（例えば、ピクセル（２，１）および（２，２）等）は、同時に個々の処理回路に読み出され得る。一部の実施形態において、処理回路が、各列の代替として、または各列に加えて、アレイの各行に対して設けられてもよいことを理解されたい。一部の実施形態において、集積デバイス１－１０２は、処理回路の複数のユニット（各々がビット線に電気的に結合されるもの等）を含み得る。 In some embodiments, the bit line may be coupled to processing circuitry on integrated device 1-102 and/or external circuitry configured to receive a voltage level indicative of charge carriers being read out to readout region FD. . In some embodiments, processing circuit 1-114 may include an analog-to-digital converter (ADC). In some embodiments, the integrated device 1-102 may be configured to reset the voltage of the readout region FD of each pixel before reading out the charge carriers. For example, integrated device 1-102 may be configured to reset the voltage in readout region FD, sample the voltage, transfer charge carriers to readout region FD, and sample the voltage again. In this example, the second sampled voltage may indicate the number of charge carriers transferred to the readout region FD when compared to the first sampled voltage. In some embodiments, integrated device 1-102 may be configured to read charge carriers from each pixel 1-112 to the bit line sequentially, such as row by row and/or column by column. It should be appreciated that several arrays of pixels 1-112 may have multiple bit lines electrically coupled to different pixels and/or groups of pixels 1-112. In some embodiments, multiple columns of pixels may be read out to individual processing circuits simultaneously. For example, the first pixels of each column (e.g., pixels (1,1) and (1,2), etc.) are simultaneously read out to individual processing circuits, and then the second pixels of each column (e.g., Pixels (2,1) and (2,2), etc.) can be read out to individual processing circuits simultaneously. It should be appreciated that in some embodiments, processing circuitry may be provided for each row of the array as an alternative to, or in addition to, each column. In some embodiments, integrated device 1-102 may include multiple units of processing circuitry, such as each unit electrically coupled to a bit line.

様々な実施形態によれば、本明細書で説明する転送ゲートは、１つまたは複数の半導体材料および／または金属を含み得るとともに、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）のゲート、バイポーラ接合トランジスタ（ＢＪＴ）のベースなどを含み得ることを理解されたい。様々な転送ゲートに印加される、本明細書で説明される制御信号は、半導体領域および半導体領域に電気的に結合された領域（例えば、隣接する領域）の電位などに応じて、形状および／または電圧が変化し得ることも理解されたい。 According to various embodiments, the transfer gates described herein may include one or more semiconductor materials and/or metals, and may include the gate of a field effect transistor (FET), the gate of a bipolar junction transistor (BJT), etc. It is to be understood that it may include bases, etc. The control signals described herein that are applied to the various transfer gates may vary depending on the shape and/or the potential of the semiconductor region and regions electrically coupled to the semiconductor region (e.g., adjacent regions). It is also understood that the voltage may vary.

一部の実施形態において、本明細書に記載されるピクセルは、２つより多い電荷蓄積領域を含み得る。例えば、図１Ｇ～図１Ｉに関連して本明細書で説明されるピクセル２－１１２は、３つの電荷蓄積領域を含む。 In some embodiments, pixels described herein may include more than two charge storage regions. For example, pixel 2-112 described herein with respect to FIGS. 1G-1I includes three charge storage regions.

図１Ｅは、一部の実施形態による、代替ピクセル１－１１２’の平面図である。一部の実施形態において、ピクセル１－１１２’は、ピクセル１－１１２について説明した態様で構成され得る。図１Ｅにおいて、ピクセル１－１１２’のドレイン領域Ｄは、光検出領域ＰＰＤの電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１および読み出し領域ＦＤと同じ側に配置されている。また、図１Ｅに示されるように、光検出領域ＰＰＤは、三角形の開口部を有するマスクを含み得、三角形の開口部は、電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１およびドレイン領域Ｄに近接する光検出領域の側にある三角形の開口部の底辺部と、ドレイン領域Ｄおよび電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１とは反対側の光検出領域ＰＰＤの側にある三角形の開口部の対応する頂部とを有する。 FIG. 1E is a top view of an alternative pixel 1-112', according to some embodiments. In some embodiments, pixel 1-112' may be configured in the manner described for pixel 1-112. In FIG. 1E, the drain region D of pixel 1-112' is located on the same side as the charge storage regions SD0, SD1 and the readout region FD of the photodetection region PPD. Further, as shown in FIG. 1E, the photodetection region PPD may include a mask having a triangular opening, and the triangular opening is located in the photodetection region adjacent to the charge storage regions SD0, SD1 and the drain region D. The triangular opening has a bottom portion on the side thereof, and a corresponding top portion of the triangular opening on the side of the photodetection region PPD opposite to the drain region D and the charge storage regions SD0, SD1.

一部の実施形態において、光検出領域ＰＰＤは、光検出領域ＰＰＤから電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１およびドレイン領域Ｄに向かう方向に固有電界（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃｅｌｅｃｔｒｉｃｆｉｅｌｄ）を誘起するように構成され得る。例えば、光検出領域ＰＰＤは、開口部を通して集積デバイス１－１０２の基板をドーピングすることによって形成され得、ドーピング中にマスクによって覆われた領域よりも、開口部を通して露出された基板の領域においてより高いドーパント濃度がもたらされる。この例では、三角形の開口部の底辺部におけるドーパント（例えば、ｎ型ドーパント）の量が多いほど、ドレイン領域Ｄおよび電荷蓄積領域ＳＤ０に近接する光検出領域ＰＰＤの底辺部の電位が、光検出領域ＰＰＤの反対側の光検出領域ＰＰＤの頂部の電位よりも低くなり得る。光検出領域ＰＰＤにおける固有電界は、ピクセル１－１１２に印加される外部電界が存在しない場合であっても存在し得る。本発明者らは、光検出領域ＰＰＤの固有電界が、光検出領域ＰＰＤからドレイン領域Ｄおよび／または蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１への電荷転送の速度を増加させ、ピクセル１－１１２の動作中に電荷キャリアが排出および／または収集される効率を増加させることを認識した。図１Ｅの例では、固有電界は、ドレイン領域と電荷蓄積領域ＳＤ０との間の点線の矢印に沿って方向付けられ得る。例えば、固有電界は、電荷キャリアを点線の矢印に沿って流れることができ、転送ゲートＲＥＪまたはＳＴ０に印加される制御信号によって誘導される外部電界は、電荷キャリアをそれぞれドレイン領域Ｄまたは電荷蓄積領域ＳＤ０に流れさせることができる。 In some embodiments, the photodetection region PPD may be configured to induce an intrinsic electric field in a direction from the photodetection region PPD toward the charge storage regions SD0, SD1 and the drain region D. For example, the photodetection region PPD may be formed by doping the substrate of integrated device 1-102 through an opening, with more in the regions of the substrate exposed through the opening than in the regions covered by the mask during doping. A high dopant concentration is provided. In this example, as the amount of dopant (for example, n-type dopant) at the bottom of the triangular opening increases, the potential at the bottom of the photodetection region PPD near the drain region D and the charge storage region SD0 increases. The potential may be lower than the potential at the top of the photodetection area PPD on the opposite side of the area PPD. The intrinsic electric field in photodetection region PPD may exist even in the absence of an external electric field applied to pixel 1-112. The inventors have demonstrated that the inherent electric field of the photodetection region PPD increases the rate of charge transfer from the photodetection region PPD to the drain region D and/or the storage region SD0, SD1, causing the charge to increase during operation of the pixel 1-112. It has been recognized that carriers increase the efficiency with which they are ejected and/or collected. In the example of FIG. 1E, the intrinsic electric field may be directed along the dotted arrow between the drain region and the charge storage region SD0. For example, an intrinsic electric field can cause charge carriers to flow along the dotted arrows, and an external electric field induced by a control signal applied to transfer gate REJ or ST0 can cause charge carriers to flow in drain region D or charge storage region, respectively. It can be made to flow to SD0.

図１Ｆは、一部の実施形態による、ピクセル１－１１２’の上面概略図である。図１Ｆに示すように、コンタクトは、ピクセル１－１１２’の部分の上方に配置され得る。一部の実施形態において、コンタクトは、入射光子が光検出領域ＰＰＤ以外のピクセル１－１１２’の部分に到達すること、及び／又は斜めの入射角で隣接するピクセルの光検出領域に到達することを阻止するように構成され得る。例えば、コンタクトは、光検出ＰＰＤが入射光子を受光するように構成されている光軸に平行な方向に細長くなっていてもよい。一部の実施形態において、コンタクトは、タングステンなどの不透明材料を使用して形成され得る。本発明者らは、本明細書で説明されるコンタクトが、多くのまたは全ての入射光子が光軸以外の光路に沿って電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１に到達することを防止して、入射光子が電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１においてノイズ電荷キャリアを生成することを防止することを認識した。 FIG. 1F is a top schematic view of pixel 1-112', according to some embodiments. As shown in FIG. 1F, the contact may be placed over a portion of pixel 1-112'. In some embodiments, the contact allows the incident photon to reach a portion of pixel 1-112' other than the photodetection region PPD and/or to reach the photodetection region of an adjacent pixel at an oblique angle of incidence. may be configured to prevent For example, the contacts may be elongated in a direction parallel to the optical axis along which the photodetecting PPD is configured to receive incident photons. In some embodiments, contacts may be formed using an opaque material such as tungsten. We believe that the contacts described herein prevent many or all incident photons from reaching the charge storage regions SD0, SD1 along optical paths other than the optical axis, so that the incident photons are It has been recognized that generation of noise charge carriers in the charge storage regions SD0, SD1 is prevented.

図１Ｆにおいて、一対のコンタクトが光検出領域ＰＰＤの両側に配置され、一対のコンタクトの第１のコンタクトはマスクの三角形の開口部の頂部のより近くに配置され、一対のコンタクトの第２のコンタクトはマスクの三角形の開口部の底辺部のより近くに配置される。第２のコンタクトは、入射光子が電荷蓄積領域ＳＤ０、ＳＤ１に到達するのを阻止するように構成され得る。第３のコンタクトが、光検出領域ＰＰＤが配置される端部とは反対側のピクセル１－１１２の端部に配置される。第１および第３のコンタクトはピクセル１－１１２と個々の隣接するピクセルとの間に配置され、第２のコンタクトは光検出領域ＰＰＤと転送ゲートＳＴ０，ＲＥＪとの間に配置される。一部の実施形態において、光検出領域ＰＰＤの両側のコンタクトの対は、単一の円筒形コンタクト壁など、光検出領域ＰＰＤを少なくとも部分的に取り囲む少なくとも１つのコンタクト壁で置き換えられ得ることを理解されたい。 In FIG. 1F, a pair of contacts are placed on either side of the photodetection region PPD, a first contact of the pair of contacts is placed closer to the top of the triangular opening in the mask, and a second contact of the pair of contacts is placed closer to the top of the triangular opening in the mask. is placed closer to the base of the triangular opening of the mask. The second contact may be configured to block incident photons from reaching the charge storage regions SD0, SD1. A third contact is placed at the end of pixel 1-112 opposite to the end where photodetection region PPD is placed. The first and third contacts are arranged between pixels 1-112 and respective adjacent pixels, and the second contact is arranged between the photodetection region PPD and the transfer gates ST0,REJ. It is understood that in some embodiments, the pair of contacts on either side of the photodetection region PPD may be replaced with at least one contact wall that at least partially surrounds the photodetection region PPD, such as a single cylindrical contact wall. I want to be

図１Ｇは、一部の実施形態による、集積デバイス１－１０２に含まれ得る代替の例示的なピクセル２－１１２の断面図である。一部の実施形態において、ピクセル２－１１２は、図１Ａ～図１Ｆに関連してピクセル１－１１２について説明した態様で構成され得る。例えば、図１Ｇに示されるように、領域ＦＤ、およびドレイン領域Ｄ、ならびに転送ゲートは、それぞれ、ピクセル１－１１２に関して説明した態様で構成され得る。ピクセル２－１１２は、電荷蓄積領域ＳＤ１と読み出し領域ＦＤとの間に電気的に結合された電荷蓄積領域ＳＤ２をさらに含む。例えば、複数の転送チャネルは、電荷蓄積領域ＳＤ１を電荷蓄積領域ＳＤ２に電気的に結合し、電荷蓄積領域ＳＤ２を読み出し領域ＦＤに電気的に結合し得る。図１Ｇにおいて、転送ゲートＴＸ０は、電荷蓄積領域ＳＤ１から電荷蓄積領域ＳＤ２への電荷キャリアの転送を制御するように構成され、転送ゲートＴＸ１は、電荷蓄積領域ＳＤ２から読み出し領域ＦＤへの電荷キャリアの転送を制御するように構成される。 FIG. 1G is a cross-sectional view of an alternative exemplary pixel 2-112 that may be included in integrated device 1-102, according to some embodiments. In some embodiments, pixel 2-112 may be configured in the manner described for pixel 1-112 in connection with FIGS. 1A-1F. For example, as shown in FIG. 1G, region FD and drain region D and transfer gate may each be configured in the manner described with respect to pixel 1-112. Pixel 2-112 further includes a charge storage region SD2 electrically coupled between charge storage region SD1 and readout region FD. For example, a plurality of transfer channels may electrically couple charge storage region SD1 to charge storage region SD2 and electrically couple charge storage region SD2 to readout region FD. In FIG. 1G, transfer gate TX0 is configured to control the transfer of charge carriers from charge storage region SD1 to charge storage region SD2, and transfer gate TX1 is configured to control the transfer of charge carriers from charge storage region SD2 to readout region FD. Configured to control transfer.

図１Ｈは、一部の実施形態による、ピクセル２－１１２の回路図である。図１Ｈに示すように、電荷蓄積領域ＳＤ１を電荷蓄積領域ＳＤ２に電気的に結合する転送チャネルは、転送ゲートＴＸ０を有するトランジスタのチャネルであり、電荷蓄積領域ＳＤ２を読み出し領域ＦＤに電気的に結合する転送チャネルは、転送ゲートＴＸ１を有するトランジスタのチャネルである。リセットゲートＲＳＴを有するトランジスタおよび行選択転送ゲートＲＳを有するトランジスタなど、図１Ｈに示すピクセル２－１１２の他のトランジスタは、ピクセル１－１１２に関して説明した態様で構成され得る。例えば、ピクセル２－１１２のアレイは、ピクセル１－１１２に関して本明細書で説明したような処理回路を備える構成で配置され得る。 FIG. 1H is a circuit diagram of pixel 2-112, according to some embodiments. As shown in FIG. 1H, the transfer channel that electrically couples the charge storage region SD1 to the charge storage region SD2 is a channel of a transistor having a transfer gate TX0, and electrically couples the charge storage region SD2 to the readout region FD. The transfer channel is the channel of the transistor having the transfer gate TX1. The other transistors of pixel 2-112 shown in FIG. 1H, such as the transistor with reset gate RST and the transistor with row select transfer gate RS, may be configured in the manner described with respect to pixel 1-112. For example, an array of pixels 2-112 may be arranged in a configuration with processing circuitry as described herein with respect to pixels 1-112.

図１Ｉは、一部の実施形態による、集積デバイス１－１０２に含まれ得るピクセル２－１１２’の上面図である。一部の実施形態において、ピクセル２－１１２’は、ピクセル１－１１２’に関して本明細書で説明した態様で構成され得る。例えば、ピクセル２－１１２’の光検出領域ＰＰＤは、光検出領域ＰＰＤから電荷蓄積領域ＳＤ０及びドレイン領域Ｄに向かう方向に固有電界を誘起するように構成され得る。 FIG. 1I is a top view of a pixel 2-112' that may be included in integrated device 1-102, according to some embodiments. In some embodiments, pixel 2-112' may be configured in the manner described herein with respect to pixel 1-112'. For example, the photodetection region PPD of pixel 2-112' may be configured to induce a characteristic electric field in a direction from the photodetection region PPD toward the charge storage region SD0 and the drain region D.

一部の実施形態では、集積デバイスは、例えば検出および／または分析するために、生体試料を調製する方法を実施する能力を有する試料調製モジュールを備える。一部の実施形態では、本明細書に記載される生体試料を調製する方法は、生体試料内の１つまたは複数の標的分子の同一性または配列（例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）を含む、試料の特性または特徴を特定するのに使用され得る。一部の実施形態では、生体試料は、単一細胞、哺乳動物細胞組織、動物試料、真菌試料、または植物試料である。一部の実施形態では、生体試料は、血液試料、唾液試料、喀痰試料、糞便試料、尿試料、バッカルスワブ試料、羊水試料、***試料、滑膜試料、脊髄試料、または胸膜液試料である。一部の実施形態では、生体試料は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、または任意のその他の哺乳動物に由来する。一部の実施形態では、生体試料は、細菌細胞培養物（例えば、病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞培養物）に由来する。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的分子は核酸である。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的分子はタンパク質である。 In some embodiments, the integrated device comprises a sample preparation module capable of performing a method of preparing a biological sample, eg, for detection and/or analysis. In some embodiments, the methods of preparing a biological sample described herein involve determining the identity or sequence (e.g., nucleotide sequence or amino acid sequence) of one or more target molecules within the biological sample. Can be used to identify properties or characteristics of a sample. In some embodiments, the biological sample is a single cell, mammalian cell tissue, animal sample, fungal sample, or plant sample. In some embodiments, the biological sample is a blood sample, saliva sample, sputum sample, fecal sample, urine sample, buccal swab sample, amniotic fluid sample, semen sample, synovial membrane sample, spinal cord sample, or pleural fluid sample. In some embodiments, the biological sample is derived from a human, non-human primate, rodent, dog, cat, horse, or any other mammal. In some embodiments, the biological sample is derived from a bacterial cell culture (eg, a pathogenic E. coli cell culture). In some embodiments, one or more target molecules are nucleic acids. In some embodiments, one or more target molecules are proteins.

一部の実施形態では、生体試料を調製する方法は、１つまたは複数の試料変換工程、例えば試料の溶解、試料精製、試料の断片化、断片化された試料の精製、ライブラリー調製（例えば、核酸ライブラリー調製）、ライブラリー調製物の精製、試料の富化（例えば、親和性ＳＣＯＤＡを使用する）、および／または標的分子の検出／分析等を含み得る。 In some embodiments, the method of preparing a biological sample includes one or more sample transformation steps, such as sample lysis, sample purification, sample fragmentation, fragmented sample purification, library preparation (e.g. , nucleic acid library preparation), purification of library preparations, enrichment of samples (eg, using affinity SCODA), and/or detection/analysis of target molecules, etc.

一部の実施形態では、試料（例えば、細胞または組織を含む試料）は、調製、例えば溶解され得る（例えば、破壊、分解され、および／またはさもなければ消化される）。一部の実施形態では、細胞または組織を含む試料は、標的分子（例えば、標的核酸または標的タンパク質）を前記細胞または組織から放出させるために、公知の物理的または化学的方法論のいずれかを使用して溶解される。一部の実施形態では、試料は、当業者にとって公知の任意の方法を使用して溶解され得る。例えば、試料は、電気分解的方法、酵素的方法、界面活性剤に基づく方法、および／または機械的ホモジナイゼーションを使用して溶解され得る。一部の実施形態では、試料（例えば、複合体組織、グラム陽性菌またはグラム陰性菌）は、複数の溶解法を連続して実施することを必要とし得る。一部の実施形態では、試料は、緩衝系の存在下で調製、例えば溶解される。この緩衝系は、本明細書に記載される方法を含む、任意の公知の溶解方法論の実施期間中にスラリー状の試料を作成し、試料を懸濁させ、および／または試料を安定化するのに使用され得る。一部の実施形態では、機械的ホモジナイゼーションにより溶解を引き起こす方法として、ビーズビーティング法、加熱法（例えば、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、または９５℃を上回る、細胞壁を破壊するのに十分に高温となるまで）、シリンジ／針／マイクロチャネル通過法（剪断作用を引き起こす）、超音波処理法、またはグラインダーによる浸軟が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。一部の実施形態では、試料調製は、細胞破壊（すなわち、溶解後の望ましくない細胞および組織エレメントの除去が後続する）を含む。一部の実施形態では、細胞破壊は、タンパク質および／または核酸沈殿を伴う。一部の実施形態では、沈殿後に、溶解および破壊された試料には遠心分離が施される。一部の実施形態では、遠心分離後に上清は廃棄される。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは免疫沈降に付される。 In some embodiments, a sample (eg, a sample containing cells or tissue) can be prepared, eg, lysed (eg, disrupted, degraded, and/or otherwise digested). In some embodiments, a sample containing cells or tissues is prepared using any known physical or chemical methodologies to release target molecules (e.g., target nucleic acids or target proteins) from said cells or tissues. and dissolved. In some embodiments, the sample may be lysed using any method known to those of skill in the art. For example, a sample can be lysed using electrolytic methods, enzymatic methods, detergent-based methods, and/or mechanical homogenization. In some embodiments, a sample (eg, a complex tissue, Gram-positive or Gram-negative bacteria) may require multiple lysis methods to be performed in series. In some embodiments, the sample is prepared, eg, lysed, in the presence of a buffer system. This buffer system can be used to create a slurry, suspend a sample, and/or stabilize a sample during the performance of any known lysis methodology, including the methods described herein. can be used for. In some embodiments, methods for causing lysis by mechanical homogenization include bead beating, heating (e.g., above 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C, or 95°C), cell wall syringe/needle/microchannel passage (which causes a shearing effect), sonication, or grinder maceration. In some embodiments, sample preparation includes cell disruption (ie, lysis followed by removal of unwanted cells and tissue elements). In some embodiments, cell disruption involves protein and/or nucleic acid precipitation. In some embodiments, after precipitation, the lysed and disrupted sample is subjected to centrifugation. In some embodiments, the supernatant is discarded after centrifugation. In some embodiments, the protein or peptide is subjected to immunoprecipitation.

一部の実施形態では、試料（例えば、標的核酸または標的タンパク質を含む試料）は、本開示に基づく方法において、例えば溶解後に精製され得る。一部の実施形態では、試料は、クロマトグラフィー（例えば、試料に選択的に結合する親和性クロマトグラフィー）、または電気泳動を使用して精製され得る。一部の実施形態では、試料は沈殿化剤の存在下で精製され得る。一部の実施形態では、精製工程または方法の後に、試料は洗浄され、および／または溶出緩衝液を使用して精製マトリックス（例えば、親和性クロマトグラフィーマトリックス）から遊離され得る。一部の実施形態では、精製工程または方法は、可逆的切り替え可能なポリマー、例えば電気活性ポリマー等の使用を含み得る。一部の実施形態では、試料は、多孔性マトリックス（例えば、セルロースアセテート、アガロース、アクリルアミド）を通じて試料を電気泳動的に通過させることにより精製され得る。 In some embodiments, a sample (eg, a sample containing a target nucleic acid or protein) can be purified, eg, after lysis, in a method based on the present disclosure. In some embodiments, the sample may be purified using chromatography (eg, affinity chromatography that selectively binds to the sample), or electrophoresis. In some embodiments, the sample may be purified in the presence of a precipitating agent. In some embodiments, after the purification step or method, the sample can be washed and/or released from the purification matrix (eg, an affinity chromatography matrix) using an elution buffer. In some embodiments, the purification process or method may include the use of reversibly switchable polymers, such as electroactive polymers. In some embodiments, a sample may be purified by electrophoretically passing the sample through a porous matrix (eg, cellulose acetate, agarose, acrylamide).

一部の実施形態では、試料（例えば、標的核酸または標的タンパク質を含む試料）は、本開示に基づく方法において断片化される（すなわち、消化される）ことがある。一部の実施形態では、核酸試料は、配列特異的同定を行うための小さな（＜１キロベース）断片から、ロングリードシークエンシング用途のための大きな（最大１０＋キロベース）断片まで、そのような断片を生成するために断片化され得る。核酸またはタンパク質の断片化は、一部の実施形態では、機械的（例えば、流体剪断作用）、化学的（例えば、鉄（Ｆｅ＋）切断）、および／または酵素的（例えば、制限酵素、トランスポゼースを使用するタグメンテーション）方法を使用して実現され得る。一部の実施形態では、タンパク質試料は、任意の長さのペプチド断片を生成するように断片化され得る。タンパク質の断片化は、一部の実施形態では、化学的および／または酵素的（例えば、タンパク質分解酵素、例えばトリプシン等）方法を使用して実現され得る。一部の実施形態では、平均断片長は、反応時間、温度、ならびに試料および／または酵素（例えば、制限酵素、トランスポゼース）の濃度により制御され得る。一部の実施形態では、核酸の断片化および蛍光分子（例えば、フルオロフォア）による標識が同時に行われるように、核酸はタグメンテーションにより断片化され得る。一部の実施形態では、小さなおよび／または望ましくない断片、ならびに残留するペイロード、断片化工程期間中に使用した化学物質および／または酵素（例えば、トランスポゼース）を取り除くために、断片化された試料には、精製（例えば、クロマトグラフィーまたは電気泳動）のラウンドが施される。 In some embodiments, a sample (eg, a sample containing a target nucleic acid or protein) may be fragmented (ie, digested) in a method based on the present disclosure. In some embodiments, the nucleic acid sample can range from small (<1 kilobase) fragments for sequence-specific identification to large (up to 10+ kilobase) fragments for long-read sequencing applications. May be fragmented to produce fragments. Fragmentation of nucleic acids or proteins is accomplished mechanically (e.g., fluid shearing), chemically (e.g., iron (Fe+) cleavage), and/or enzymatically (e.g., restriction enzymes, transposases, etc.) in some embodiments. tagmentation) method. In some embodiments, protein samples can be fragmented to generate peptide fragments of any length. Protein fragmentation, in some embodiments, may be achieved using chemical and/or enzymatic (eg, proteolytic enzymes, such as trypsin) methods. In some embodiments, average fragment length can be controlled by reaction time, temperature, and concentration of sample and/or enzyme (eg, restriction enzyme, transposase). In some embodiments, a nucleic acid can be fragmented by tagmentation such that fragmentation of the nucleic acid and labeling with a fluorescent molecule (eg, a fluorophore) occur simultaneously. In some embodiments, the fragmented sample is is subjected to rounds of purification (eg chromatography or electrophoresis).

一部の実施形態では、試料（例えば、標的核酸または標的タンパク質を含む試料）は、本開示に基づく方法において、標的分子について富化され得る。富化は、富化されない試料の複雑性がシークエンシングプラットフォームの能力を上回るとき、または試料内に存在する標的分子の存在量が低い（例えば、シークエンシングプラットフォームによって容易に検出することができない等）ときに一般的に使用される。富化は、標的分子を選択的に増幅する機構の使用を伴う。この富化は、標的分子（複数可）（例えば、標的タンパク質（複数可）または標的核酸（複数可））を選択的に増幅するための、抗体、アプタマー、サイズに基づく選択、または静電荷に基づく選択の使用を伴い得る。試料調製の意図が特定の標的分子の配列決定にあるとき、富化が一般的に使用され得る。標的分子が相互に関連するかまたは相同であるとき、富化は、プロテオミック、ゲノム、またはメタゲノム分析または調査を実施または実行するのに使用され得る。 In some embodiments, a sample (eg, a sample containing a target nucleic acid or protein) can be enriched for target molecules in a method based on the present disclosure. Enrichment occurs when the complexity of the unenriched sample exceeds the capabilities of the sequencing platform, or when the abundance of target molecules present in the sample is low (e.g., cannot be easily detected by the sequencing platform). sometimes commonly used. Enrichment involves the use of mechanisms that selectively amplify target molecules. This enrichment can be achieved by using antibodies, aptamers, size-based selection, or electrostatic charges to selectively amplify target molecule(s) (e.g., target protein(s) or target nucleic acid(s)). may involve the use of selection based on Enrichment can generally be used when the intent of sample preparation is the sequencing of specific target molecules. When target molecules are related or homologous to each other, enrichment can be used to perform or carry out proteomic, genomic, or metagenomic analyzes or investigations.

一部の実施形態では、試料は、電気泳動法を使用しながら標的分子について富化される。一部の実施形態では、試料は、親和性ＳＣＯＤＡを使用しながら標的分子について富化される。一部の実施形態では、試料は、電場反転ゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）を使用しながら標的分子について富化される。一部の実施形態では、試料は、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用しながら標的分子について富化される。一部の実施形態では、富化期間中に使用されるマトリックス（例えば、多孔性媒体、電気泳動ポリマーゲル）は、試料内に存在する標的分子と結合する固定化された親和性薬剤（「固定化捕捉用プローブ」としても知られている）を含む。一部の実施形態では、富化期間中に使用されるマトリックスは、１、２、３、４、５個、またはそれ超の固有の固定化捕捉用プローブを含み、そのそれぞれは固有の標的分子と結合し、および／または異なる結合親和性を有して同一の標的分子と結合する。 In some embodiments, the sample is enriched for target molecules using electrophoresis. In some embodiments, the sample is enriched for target molecules using affinity SCODA. In some embodiments, the sample is enriched for target molecules using field inversion gel electrophoresis (FIGE). In some embodiments, the sample is enriched for target molecules using pulsed field gel electrophoresis (PFGE). In some embodiments, the matrix used during the enrichment period (e.g., porous media, electrophoretic polymer gel) contains an immobilized affinity agent (“immobilized (also known as ``capture probes''). In some embodiments, the matrix used during the enrichment period includes 1, 2, 3, 4, 5, or more unique immobilized capture probes, each of which has a unique target molecule. and/or bind to the same target molecule with different binding affinities.

標的分子の増幅に付加して、または標的分子の増幅に代替して、試料は、望ましくない非標的分子（例えば、存在量の高いタンパク質（例えば、アルブミン））の枯渇により富化され得る（例えば、存在量が低い標的分子について）。望ましくない非標的分子の枯渇は、上記で議論したような戦略と類似した捕捉戦略を使用して実施され得る。枯渇戦略を使用するとき、捕捉用プローブは望ましくない非標的分子と結合し、そして標的分子が溶液内に留まるのを可能にする。この戦略は、標的分子の富化（すなわち、標的分子（複数可）の相対的濃度の増加）を同様に可能にする。 In addition to or in place of target molecule amplification, the sample can be enriched by depletion of undesirable non-target molecules (e.g., highly abundant proteins (e.g., albumin)), e.g. , for target molecules with low abundance). Depletion of unwanted non-target molecules can be carried out using capture strategies similar to those discussed above. When using a depletion strategy, the capture probe binds unwanted non-target molecules and allows the target molecules to remain in solution. This strategy also allows enrichment of target molecules (ie, increasing the relative concentration of target molecule(s)).

一部の実施形態では、標的核酸は、標的核酸の配列決定前に富化される（例えば電気泳動法、例えば親和性ＳＣＯＤＡを使用して富化される）。一部の実施形態では、試料（例えば、精製された試料、細胞ライセート、単一の細胞、細胞の集団、または組織）内に存在する複数の標的核酸（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０個、またはそれ超）の配列を決定する方法が本明細書に提示される。一部の実施形態では、試料は、試料内に存在する標的核酸または複数の標的核酸の配列を決定する前に、本明細書に記載されるように調製される（例えば、標的核酸について溶解、精製、断片化、および／または富化される）。一部の実施形態では、標的核酸は富化された標的核酸である（例えば電気泳動法、例えば親和性ＳＣＯＤＡを使用して富化された）。 In some embodiments, the target nucleic acid is enriched (eg, enriched using electrophoretic methods, eg, affinity SCODA) prior to sequencing the target nucleic acid. In some embodiments, a plurality of target nucleic acids (e.g., at least 2, 3, 4, 5 , 10, 15, 20, 30, 50, or more) are provided herein. In some embodiments, the sample is prepared as described herein (e.g., lysed, purified, fragmented, and/or enriched). In some embodiments, the target nucleic acid is an enriched target nucleic acid (eg, enriched using an electrophoretic method, eg, affinity SCODA).

一部の実施形態では、本開示に基づく方法において、標的分子または標的分子（複数）は、前記標的分子（複数可）およびその上流試料の分析を可能にするために、富化および後続する放出後に検出され得る。一部の実施形態では、標的核酸は、遺伝子シークエンシング、吸収、蛍光、電気的伝導度、キャパシタンス、表面プラズモン共鳴、ハイブリッド捕捉、抗体、核酸の直接標識（例えば、末端標識化、標識されたタグメンテーションペイロード）、インターカレーティング色素（例えば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ色素）による非特異的標識、または核酸検出のための任意のその他の公知の方法論を使用して検出され得る。一部の実施形態では、標的タンパク質またはペプチド断片は、吸収、蛍光、質量分析法、アミノ酸シークエンシング、またはタンパク質もしくはペプチド検出のための任意のその他の公知の方法論を使用して検出され得る。 In some embodiments, in a method based on the present disclosure, the target molecule or target molecules are enriched and subsequently released to enable analysis of said target molecule(s) and its upstream sample. can be detected later. In some embodiments, the target nucleic acid can be used for gene sequencing, absorption, fluorescence, electrical conductivity, capacitance, surface plasmon resonance, hybrid capture, antibodies, direct labeling of nucleic acids (e.g., end-labeling, labeled tags). mentation payload), non-specific labeling with intercalating dyes (eg, ethidium bromide, SYBR dyes), or any other known methodology for nucleic acid detection. In some embodiments, target protein or peptide fragments can be detected using absorption, fluorescence, mass spectrometry, amino acid sequencing, or any other known methodology for protein or peptide detection.

一部の実施形態では、デバイスは、デバイスのモジュールの任意の１つの中、内部または外部に、１つまたは複数の流体を輸送するように構成されたポンプ（例えば、ペリスタポンプ）をさらに備える。一部の実施形態では、デバイスは、デバイスまたはデバイスのモジュールにより受け入れられたカートリッジのマイクロ流体チャネルのいずれかの内部に、またはそれを通じて１つもしくは複数の流体を輸送するように構成されたポンプ（例えば、ペリスタポンプ）をさらに含む。一部の実施形態では、デバイスは、１０００マイクロリッター以下、１００マイクロリッター以下、５０マイクロリッター以下、または１０マイクロリッター以下の流量分解能を有して流体を輸送するように構成される。一部の実施形態では、デバイスは、２つ以上のカートリッジを同時に受け入れるように構成される。一部の実施形態では、デバイスは、デバイスにより同時に受け入れられた２つ以上のカートリッジ間で流体連通を確立するように構成される。一部の実施形態では、デバイスは、２つ以上のカートリッジを逐次的に受け入れるように構成される。 In some embodiments, the device further comprises a pump (eg, a peristaltic pump) configured to transport one or more fluids into, within, or external to any one of the modules of the device. In some embodiments, the device includes a pump ( For example, a peristaltic pump). In some embodiments, the device is configured to transport fluid with a flow resolution of 1000 microliters or less, 100 microliters or less, 50 microliters or less, or 10 microliters or less. In some embodiments, the device is configured to accept two or more cartridges simultaneously. In some embodiments, the device is configured to establish fluid communication between two or more cartridges simultaneously received by the device. In some embodiments, the device is configured to accept two or more cartridges sequentially.

一部の実施形態では、ペリスタポンプは、ローラーおよび流体デバイス（例えば、カートリッジ）を含む装置を備える。一部の実施形態では、ペリスタポンプは、ローラーおよびローラーと接続した回転揺動機構を含む装置を備える。一部の実施形態では、デバイスは試料調製モジュールを含み、試料調製モジュールはペリスタポンプ（チャネルを備えた表面を有する基層を含む流体カートリッジを含む）を含み、その場合、チャネルの少なくとも一部の少なくとも一部分は、実質的に三角形の形をした断面（チャネルの基部において１つの頂点を有し、および基層の表面において他の２つの頂点を有する）を有する。検出モジュールは、試料調製モジュールの下流に位置し得る。一部の実施形態では、試料調製領域は２つ以上の流体カートリッジを含む。 In some embodiments, a peristaltic pump comprises an apparatus that includes a roller and a fluidic device (eg, a cartridge). In some embodiments, a peristaltic pump includes a device that includes a roller and a rotating rocking mechanism connected to the roller. In some embodiments, the device includes a sample preparation module that includes a peristaltic pump (including a fluidic cartridge including a base layer having a surface with a channel), in which case at least a portion of at least a portion of the channel has a substantially triangular shaped cross-section with one vertex at the base of the channel and two other vertices at the surface of the base layer. The detection module may be located downstream of the sample preparation module. In some embodiments, the sample preparation area includes two or more fluidic cartridges.

一部の態様によれば、流体系が提供される。流体系は、一部の実施形態によれば、例えばペリスタポンプを使用して流体を流体容器に移転するのに使用可能である。一部の実施形態によれば、流体系は、アラインメントの特質を使用して流体容器を受け入れるように構成されたカートリッジまたはモジュールを含む。ある特定の実施形態によれば、カートリッジまたはモジュールは、アラインメントの特質を介して流体容器と流体的に接続するように構成される。これは、デバイスのカートリッジまたはモジュールと流体容器とのアラインメントおよび流体接続が同時になされるのを可能にし得る。ある特定の実施形態によれば、接続にこのような多様性があることで、デバイスのカートリッジまたはモジュールと流体容器との間の流体接続のデッドボリュームが有利に低下する（例えば、余分のチャネル長に対する必要性を低下させることにより）。 According to some embodiments, a fluid system is provided. The fluid system can be used to transfer fluid to a fluid container using, for example, a peristaltic pump, according to some embodiments. According to some embodiments, the fluid system includes a cartridge or module configured to receive a fluid container using alignment characteristics. According to certain embodiments, the cartridge or module is configured to fluidly connect with the fluid container via alignment features. This may allow alignment and fluid connection of the cartridge or module of the device and the fluid container to be made simultaneously. According to certain embodiments, such versatility in connections advantageously reduces the dead volume of fluidic connections between the cartridge or module of the device and the fluid container (e.g., by eliminating extra channel length). (by reducing the need for).

２つのコンポーネントは、実施形態のいくつかのコンフィギュレーションにおいて、流体がその間を通過し得る場合、流体的に接続されている。例えば、第１の流体コンポーネントおよび第２の流体コンポーネントは、チャネル、マイクロチャネル、または管により接続される場合には、流体連通した状態にあり得る。別の例として、バルブが２つのコンポーネント間で流体の流通を可能にするように構成され得る限り、バルブにより分離されている２つのコンポーネントも流体的に接続されているとなおも考えられる。対照的に、その間に流体経路を有さず、機械的に接続されているに過ぎない２つのコンポーネントは、流体的に接続されているとはみなされない。流体的に接続されているコンポーネントは直接流体的に接続され得る（すなわち、中間コンポーネントのいずれも通過しない流体経路により接続され得る）。しかしながら、流体的に接続されているコンポーネントは、いくつかのケースでは、１、２、３、４、５、８、１０、１５、２０個、またはそれ超の中間コンポーネントを通過する流体経路により接続されることがある。 Two components, in some configurations of embodiments, are fluidly connected if fluid can pass between them. For example, a first fluidic component and a second fluidic component can be in fluid communication when connected by a channel, microchannel, or tube. As another example, two components that are separated by a valve are still considered to be fluidly connected, so long as the valve can be configured to allow fluid communication between the two components. In contrast, two components that are only mechanically connected without a fluid path between them are not considered to be fluidly connected. Components that are fluidically connected may be directly fluidly connected (ie, connected by a fluid path that does not pass through any intermediate components). However, fluidically connected components may in some cases be connected by fluid paths that pass through 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20, or more intermediate components. may be done.

デバイスは、一部の実施形態によれば、チャネルを含む。チャネルは、一部の実施形態では、デバイスのアラインメントの特質と流体的に接続されている。アラインメントの特質は、デバイスの第１のアラインメントの特質であり得る。一部の実施形態によれば、デバイスは第２のアラインメントの特質をさらに含む。第２のアラインメントの特質は、ある特定の実施形態によれば、例えば流体容器を貫通する流体経路により確立された流体接続を介してチャネルと接続する。しかしながら、一部の実施形態またはコンフィギュレーションでは、第２のアラインメントの特質はチャネルと接続しない。一部の実施形態によれば、デバイスは流体容器を受け入れるように構成される。例えば、デバイスは、一部の実施形態によれば、流体容器を保持するように構成される。一部の実施形態によれば、デバイスはカートリッジを含む。一部の実施形態では、デバイスは、固体基材（例えば、カートリッジの固体基材）を含む。固体基材は、流体容器を受け入れるように構成された凹部を含み得る。 The device, according to some embodiments, includes a channel. The channel, in some embodiments, is fluidly connected to the alignment feature of the device. The alignment feature may be a first alignment feature of the device. According to some embodiments, the device further includes a second alignment feature. The second alignment feature, according to certain embodiments, connects with the channel via a fluid connection established, for example, by a fluid path through a fluid container. However, in some embodiments or configurations, the second alignment feature does not connect with the channel. According to some embodiments, the device is configured to receive a fluid container. For example, the device is configured to hold a fluid container, according to some embodiments. According to some embodiments, the device includes a cartridge. In some embodiments, the device includes a solid substrate (eg, the solid substrate of a cartridge). The solid substrate can include a recess configured to receive a fluid container.

流体容器は、適する様々な形状のいずれかを有し得る。例えば、流体容器は、ある特定の実施形態によれば、実質的に長方形の横断面を有し得る。一部の実施形態では、流体容器は、流体容器の最低横寸法と比較したとき、幅の狭い横断寸法を有する。一部の実施形態では、流体容器は、基材（例えば、集積デバイス、チップ）を収容するように構成され得る。一部の実施形態によれば、流体容器はフローセルである（例えば、内部、入口、および出口を含み、入口を通じて流体を受け入れ、および出口を通じて流体を移送するように構成されたセル）。例えば、流体容器は、集積デバイスを含むフローセルであり得る。一部の実施形態では、流体容器は内部（例えば、内部チャンバ）を有する。一部の実施形態では、デバイスの内部は、流体で少なくとも部分的にまたは完全に充填される能力を有する。流体デバイスの内部は、一部の実施形態ではある体積を有する。一部の実施形態では、流体容器は２以上の内部を有する。例えば、流体容器は、１、２、３、４、５個、またはそれ超の内部を含み得る。一部の実施形態によれば、これらの内部の少なくとも一部は、相互に流体接続している。一部の実施形態では、これらの内部は、流体が１つの内部から別の内部に直接流出することができないように、相互に分割される。流体容器に複数の内部を組み込むことは、一部の実施形態によれば、複数の集積デバイスまたは集積デバイスのいくつかの部分の同時充填が可能となり得るので有利である。複数の集積デバイスまたは集積デバイスのいくつかの部分を同時充填することで、流体の流れの均一性を高めることが可能となり得、および／または複数の試料（別の集積デバイスまたは集積デバイスのいくつかの部分と相互作用することが同時に可能である）の分析が可能となり得る。 The fluid container may have any of a variety of suitable shapes. For example, the fluid container may have a substantially rectangular cross-section, according to certain embodiments. In some embodiments, the fluid container has a narrow transverse dimension when compared to the lowest lateral dimension of the fluid container. In some embodiments, the fluid container may be configured to house a substrate (eg, an integrated device, chip). According to some embodiments, the fluid container is a flow cell (eg, a cell that includes an interior, an inlet, and an outlet and is configured to receive fluid through the inlet and transport fluid through the outlet). For example, the fluid container can be a flow cell that includes an integration device. In some embodiments, the fluid container has an interior (eg, an interior chamber). In some embodiments, the interior of the device has the ability to be at least partially or completely filled with fluid. The interior of the fluidic device has a volume in some embodiments. In some embodiments, the fluid container has more than one interior. For example, a fluid container may include 1, 2, 3, 4, 5, or more interiors. According to some embodiments, at least some of these interiors are in fluid communication with each other. In some embodiments, these interiors are separated from each other such that fluid cannot flow directly from one interior to another. Incorporating multiple interiors into a fluid container is advantageous as it may allow simultaneous filling of multiple integrated devices or portions of integrated devices, according to some embodiments. Simultaneous filling of multiple integration devices or several parts of an integration device may make it possible to increase the uniformity of the fluid flow and/or to fill multiple samples (another integration device or some of the integration devices) simultaneously. It is possible to simultaneously interact with parts of

流体容器の各内部は入口および出口を含み得る。一部の実施形態によれば、入口および／または出口は流体デバイスに接続され得る（例えば、１つまたは複数のアラインメントの特質を介して）。一部の実施形態では、流体（例えば、生体分子、例えばペプチドまたはポリヌクレオチド等を含む流体試料）は、流体容器の１つまたは複数の内部を流通する。内部を通じた流体の流れは、一部の実施形態では、少なくとも部分的にまたは完全に流体容器の内部を充填することができる。 Each interior of the fluid container may include an inlet and an outlet. According to some embodiments, the inlet and/or outlet may be connected to a fluidic device (eg, via one or more alignment features). In some embodiments, a fluid (eg, a fluid sample containing biomolecules, such as peptides or polynucleotides) flows through one or more fluid containers. The flow of fluid through the interior can, in some embodiments, at least partially or completely fill the interior of the fluid container.

一部の実施形態では、デバイスのカートリッジまたはモジュールは、チャネルを含む表面を有する基層を含む。一部の実施形態では、チャネルの少なくとも一部の少なくとも一部分は、チャネルの基部において１つの頂点を有し、そして基層の表面において他の２つの頂点を有する、実質的に三角形の形をした断面を有する。一部の実施形態では、チャネルの少なくとも一部の少なくとも一部分は表層を有する。表層はエラストマーを含み得る。表層は、チャネルの表面開口部を実質的に密閉するように構成され得る。 In some embodiments, the cartridge or module of the device includes a base layer having a surface that includes channels. In some embodiments, at least a portion of at least a portion of the channel has a substantially triangular-shaped cross-section with one vertex at the base of the channel and two other vertices at the surface of the base layer. has. In some embodiments, at least a portion of at least a portion of the channel has a surface layer. The surface layer may include an elastomer. The surface layer may be configured to substantially seal the surface opening of the channel.

本明細書で使用される場合、用語「チャネル」は当業者にとって公知であり、また流体を収納しおよび／または輸送するように構成された構造を意味し得る。チャネルは、壁；基部（例えば、壁と接続しおよび／または壁から形成された基部）；およびチャネルの１つまたは複数の部分において開放、カバー、および／または密閉され得る表面開口部を一般的に含む。一部の実施形態では、密閉される表面部分は完全に密閉される。一部の実施形態では、密閉される表面部分は実質的に密閉される。表面開口部は、表面開口部の５０％超、６０％超、７５％超、９０％超、または９５％超が密閉される場合には、実質的に密閉され得る。一部の実施形態では、表面開口部はエラストマーにより密閉される。 As used herein, the term "channel" is known to those skilled in the art and may refer to a structure configured to contain and/or transport fluid. Channels generally include walls; bases (e.g., bases connected to and/or formed from walls); and surface openings that may be open, covered, and/or sealed in one or more portions of the channel. Included in In some embodiments, the surface portion to be sealed is completely sealed. In some embodiments, the surface portion that is sealed is substantially sealed. A surface opening can be substantially sealed if more than 50%, more than 60%, more than 75%, more than 90%, or more than 95% of the surface opening is sealed. In some embodiments, the surface opening is sealed with an elastomer.

本明細書で使用される場合、用語「マイクロチャネル」とは、１０００ミクロン以下のサイズの少なくとも１つの寸法を含むチャネルを指す。例えば、マイクロチャネルは、サイズとして１０００ミクロン以下（例えば、１００ミクロン以下、１０ミクロン以下、５ミクロン以下）の少なくとも１つの寸法（例えば、幅、高さ）を含み得る。一部の実施形態では、マイクロチャネルは、１ミクロン以上（例えば、２ミクロン以上、１０ミクロン以上）の少なくとも１つの寸法を含む。上記で引用された範囲の組合せも可能である（例えば、１ミクロン以上かつ１０００ミクロン以下、１０ミクロン以上かつ１００ミクロン以下）。その他の範囲も可能である。一部の実施形態では、マイクロチャネルは、１０００ミクロン以下の水力直径を有する。本明細書で使用される場合、用語「水力直径」（ＤＨ：ｈｙｄｒａｕｌｉｃｄｉａｍｅｔｅｒ）は当業者にとって公知であり、そしてＤＨ＝４Ａ／Ｐとして決定され得るが、式中、Ａはチャネルを通過する流体の流れの断面積であり、またＰは断面の潤辺である（流体に接触したチャネル断面の周囲長）。 As used herein, the term "microchannel" refers to a channel that includes at least one dimension that is 1000 microns or less in size. For example, a microchannel can include at least one dimension (eg, width, height) that is 1000 microns or less in size (eg, 100 microns or less, 10 microns or less, 5 microns or less). In some embodiments, the microchannels include at least one dimension of 1 micron or greater (eg, 2 microns or greater, 10 microns or greater). Combinations of the ranges cited above are also possible (eg, greater than or equal to 1 micron and less than or equal to 1000 microns, greater than or equal to 10 microns and less than or equal to 100 microns). Other ranges are also possible. In some embodiments, the microchannels have a hydraulic diameter of 1000 microns or less. As used herein, the term "hydraulic diameter" (DH) is known to those skilled in the art and can be determined as DH=4A/P, where A is the fluid passing through the channel. is the cross-sectional area of the flow, and P is the wet edge of the cross-section (perimeter of the channel cross-section in contact with the fluid).

一部の実施形態では、流体コンポーネントは、デバイスのリザーバおよび／またはチャネル（例えば、インキュベーションチャネル）に対して、それから、またはその間に液体を移動させるように作動することができる。一部の実施形態では、デバイスコンポーネントは、デバイスのチャネル（複数可）を通じて、例えば、流体デバイスのリザーバおよび／またはその他のチャネル（例えば、インキュベーションチャネル）に対して、それから、またはその間に液体を移動させるように作動することができる。一部の実施形態では、デバイスコンポーネントは、チャネルを通じて流体をポンプ搬送するためのカートリッジまたはモジュールのチャネルと関連するエラストマーコンポーネント（例えば、エラストマーを含む表層）と相互作用するように構成されたペリスタポンプ輸送機構（例えば、装置）を介して液体を移動させる。 In some embodiments, the fluidic component can be actuated to move liquid to, from, or between reservoirs and/or channels (eg, incubation channels) of the device. In some embodiments, the device components move liquid through the channel(s) of the device, e.g., to, from, or between reservoirs and/or other channels (e.g., incubation channels) of the fluidic device. It can be operated to In some embodiments, the device component is a peristaltic pumping mechanism configured to interact with an elastomeric component (e.g., an elastomer-containing surface layer) associated with a channel of a cartridge or module for pumping fluid through the channel. (e.g., a device).

一部の実施形態では、モジュールまたはカートリッジの負荷期間中に流体交換が生ずる。例えば、一部の実施形態では、生体試料を集積デバイスの試料調製モジュールに負荷する期間中に流体交換が生ずる。試料負荷期間中の流体交換は、試料を収納するリザーバ内への溶液（例えば、緩衝化溶液、または試料を溶解するための溶液）の添加または除去を伴い得る。一部の実施形態では、試料負荷期間中の流体交換は、第１のチャネル、マイクロチャネル、またはリザーバ（例えば、試料インプットで使用されるチャネル、マイクロチャネル、またはリザーバ）から第２のチャネル、マイクロチャネル、またはリザーバ（例えば、溶解、断片化、消化、富化等のための）への試料の流体移送を伴い得る。さらに、一部の実施形態では、１つまたは複数の標的分子を検出モジュールまたはデバイス（例えば、本明細書に記載されるようなシークエンシングモジュールまたはシークエンシングデバイス）に負荷する期間中に、流体交換が生ずる。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的分子を検出モジュールまたはデバイスに負荷する期間中に生ずる流体交換は、検出に関与する溶液（例えば、フルオロフォアまたは参照分子を含む溶液）の添加または除去を伴う。 In some embodiments, fluid exchange occurs during loading periods of the module or cartridge. For example, in some embodiments, fluid exchange occurs during loading of a biological sample into a sample preparation module of an integrated device. Fluid exchange during a sample loading period may involve adding or removing a solution (eg, a buffered solution or a solution for dissolving the sample) into a reservoir containing the sample. In some embodiments, fluid exchange during the sample loading period is from a first channel, microchannel, or reservoir (e.g., the channel, microchannel, or reservoir used for sample input) to a second channel, microchannel, or reservoir. It may involve fluidic transfer of the sample to a channel or reservoir (eg, for lysis, fragmentation, digestion, enrichment, etc.). Additionally, in some embodiments, during the period of loading one or more target molecules into a detection module or device (e.g., a sequencing module or device as described herein), fluid exchange occurs. In some embodiments, the fluid exchange that occurs during loading one or more target molecules into a detection module or device includes the addition of a solution involved in detection (e.g., a solution containing a fluorophore or reference molecule) or With removal.

一部の実施形態では、１つまたは複数の標的分子（例えば、配列決定される標的タンパク質、ポリペプチド、または核酸）の検出期間中、またはデータの取得期間中に流体交換が生ずる。例えば、一部の実施形態では、試料ウェル（例えば、１つまたは複数の標的分子を含む試料ウェル）または反応チャンバ内での検出および／またはデータ取得期間中に流体交換が生ずる。一部の実施形態では、検出および／またはデータ取得期間中に生ずる流体交換は、検出および／またはデータ取得で使用される溶液（例えば、検出用のフルオロフォアを含む緩衝液）の添加または除去を伴う。一部の実施形態では、検出および／またはデータ取得期間中に生ずる流体交換は、試料ウェルまたは反応チャンバを剥離、再負荷、および／または除荷するのに使用される溶液（反応チャンバ表面からコーティング分子を剥離するのに使用される溶液）の添加または取り出しを伴う。 In some embodiments, fluid exchange occurs during detection of one or more target molecules (eg, target protein, polypeptide, or nucleic acid to be sequenced) or during data acquisition. For example, in some embodiments, fluid exchange occurs during detection and/or data acquisition within a sample well (eg, a sample well containing one or more target molecules) or reaction chamber. In some embodiments, the fluid exchange that occurs during the detection and/or data acquisition period involves the addition or removal of solutions (e.g., buffers containing detection fluorophores) used in the detection and/or data acquisition. Accompany. In some embodiments, the fluid exchange that occurs during the detection and/or data acquisition period includes the solution used to strip, reload, and/or unload the sample well or reaction chamber (coated from the reaction chamber surface). involving the addition or removal of a solution (used to exfoliate molecules).

一部の実施形態では、デバイス、それを使用する方法、および関連する流体は、数ある開示の中でも、２０２０年１０月２８日出願の「流体のペリスタポンプ輸送、および関連する方法、システム、およびデバイス（ＰＥＲＩＳＴＡＬＴＩＣＰＵＭＰＩＮＧＯＦＦＬＵＩＤＳＡＮＤＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤＭＥＴＨＯＤＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＮＤＤＥＶＩＣＥＳ）」と題する米国特許出願第１７／０８３，１０６号；２０２０年１０月２８日出願の「生体分析用途のための流体のペリスタポンプ輸送、および関連する方法、システム、およびデバイス（ＰＥＲＩＳＴＡＬＴＩＣＰＵＭＰＩＮＧＯＦＦＬＵＩＤＳＦＯＲＢＩＯＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳＡＮＤＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤＭＥＴＨＯＤＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＮＤＤＥＶＩＣＥＳ）」と題する米国特許出願第１７／０８３，１２６号；２０２０年１０月２８日出願の「試料調製するためのシステムおよび方法（ＳＹＳＴＥＭＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＳＡＭＰＬＥＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ）」と題する米国特許出願第１７／０８２，２２３号；２０２０年１０月２８日出願の「シークエンシングのための方法およびデバイス（ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＤＥＶＩＣＥＳＦＯＲＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）」と題する米国特許出願第１７／０８２，２２６号；２０２１年１月２０日出願の「選択的Ｃ末端標識するための化合物および方法（ＣＯＭＰＯＵＮＤＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＳＥＬＥＣＴＩＶＥＣ－ＴＥＲＭＩＮＡＬＬＡＢＥＬＩＮＧ）」と題する米国特許出願第１７／１５３，４９０号；および２０２１年４月２１日出願の「シークエンシングのためのデバイスおよび方法（ＤＥＶＩＣＥＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）」と題する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２８４７１に記載されている通りであり、上記各号の全内容を本願明細書に援用する。 In some embodiments, the devices, methods of using the same, and associated fluids are described in the ``Peristaltic Pumping of Fluids, and Related Methods, Systems, and Devices'' filed Oct. 28, 2020, among other disclosures. 17/083,106, filed October 28, 2020; U.S. Patent Application No. 17/2007 entitled ``PERISTALTIC PUMPING OF FLUIDS FOR BIOANALYTICAL APPLICATIONS AND ASSOCIATED METHODS, SYSTEMS, AND DEVICES'' No. 083,126; “Sample preparation” filed on October 28, 2020 SYSTEMS AND METHODS FOR SAMPLE PREPARATION,” U.S. Patent Application No. 17/082,223, filed October 28, 2020; CING U.S. Patent Application No. 17/082,226 entitled "COMPOUNDS AND METHODS FOR SELECTIVE C-TERMINAL LABELING" filed January 20, 2021 Patent Application No. 17/153,490; and International Patent Application No. PCT/US2021/028471 entitled "DEVICES AND METHODS FOR SEQUENCING," filed April 21, 2021. The entire content of each of the above items is incorporated herein by reference.

ＩＩＩ．チップを再使用するための技術
本明細書に記載されるように、本発明者らは、試料の連続した部分を処理するように集積デバイスのセンサチップを再使用する技術を開発した。本発明者らは、単に集積デバイスに試料の追加アリコートを負荷するだけで、それ以外何もしなければ、これまでに負荷された試料が新規に負荷された試料のシグナル収集を妨害し得るので、不正確な結果をもたらすことを認識した。したがって、本明細書に記載される技術は、これまでに負荷された試料を集積デバイスの反応チャンバから除荷し、そして後続する試料が負荷された後に集積デバイスを再使用するための方法と関連する。 III. Techniques for Reusing Chips As described herein, the inventors have developed a technique for reusing sensor chips of integrated devices to process successive portions of a sample. We believe that by simply loading an additional aliquot of sample into the integration device, and doing nothing else, the previously loaded sample may interfere with signal collection of the newly loaded sample. I realized that it would give inaccurate results. Therefore, the techniques described herein relate to a method for unloading a previously loaded sample from the reaction chamber of an accumulation device and reusing the accumulation device after a subsequent sample has been loaded. do.

図２Ａは、一部の実施形態に基づく、集積デバイスのチャンバ１５８内に固定化された分析物１５９の事例的ダイアグラムである。分析物１５９は、生体分子、例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド等を含み得る。図２Ａは、反応チャンバ１５８の例を、試料採取される分析物１５９（例えば、ペプチドの鎖等）と共に提示する。分析物１５９は、反応チャンバ１５８の表面１５０をコーティングするコーティング分子１５２（例えば、ビオチン）と、分析物１５９に結合したカップリング部分１５４（例えば、ストレプトアビジン）との間の結合を介して反応チャンバ１５８の表面１５０と結合し得る。コーティング分子１５２とカップリング部分１５４との間の結合は、分析物１５９の試料採取が実施される間に、反応チャンバ１５８内の分析物１４９を固定化する。分析物１５９は蛍光色素で標識され得る。分析物の標識化は、特定の分析物と結合するように構成された認識分子１６０Ａ、１６０Ｂを用いて可能となり得る。反応チャンバ１５８は、相補的金属酸化物半導体チップ１６４、および反応チャンバ１５８からの放射光を収集するためのフォトニックコンポーネント１６２を含む光検出領域１６１に近接して配置され得る。試料採取の後で、分析物１５９の少なくとも一部分が、本明細書に記載されるように、カッター分子１５６により切断され得る。 FIG. 2A is an example diagram of an analyte 159 immobilized within a chamber 158 of an integrated device, according to some embodiments. Analyte 159 may include a biomolecule, such as a polypeptide or polynucleotide. FIG. 2A presents an example of a reaction chamber 158 with a sampled analyte 159 (eg, a chain of peptide, etc.). Analyte 159 enters reaction chamber 158 via a bond between a coating molecule 152 (e.g., biotin) that coats surface 150 of reaction chamber 158 and a coupling moiety 154 (e.g., streptavidin) bound to analyte 159. 158 may be coupled to surface 150 of 158 . The bond between coating molecule 152 and coupling moiety 154 immobilizes analyte 149 within reaction chamber 158 while sampling of analyte 159 is performed. Analyte 159 can be labeled with a fluorescent dye. Labeling of analytes may be enabled using recognition molecules 160A, 160B configured to bind specific analytes. Reaction chamber 158 may be positioned proximate a light detection region 161 that includes a complementary metal oxide semiconductor chip 164 and a photonic component 162 for collecting emitted light from reaction chamber 158. After sampling, at least a portion of analyte 159 may be cleaved by cutter molecule 156, as described herein.

図２Ｂは、一部の実施形態に基づく、複数の試料を処理するように図１Ａの集積デバイスを再使用するための事例的方法である。工程（ｐｒｏｃｅｓｓ）２００は動作（ａｃｔ）２０２において開始し、試料の第１のアリコートが集積デバイスの反応チャンバ中に負荷され得る。例えば、多数の分析物種を含む試料が、集積デバイスを用いて連続的に処理されるように、複数のアリコートに分割され得る。第１のアリコートが集積デバイスの反応チャンバ中に負荷され得る。例えば、反応チャンバの表面は、コーティング分子、例えばビオチン等を用いてコーティングされ得る。試料の第１のアリコートの分析物は、カップリング部分、例えばストレプトアビジン等に結合し得る。第１のアリコートが反応チャンバ内に負荷されると、カップリング部分（試料の）がコーティング分子（反応チャンバ表面に固定されている）に結合することにより、分析物は反応チャンバの表面に固定（または付加）される。 FIG. 2B is an example method for reusing the integrated device of FIG. 1A to process multiple samples, according to some embodiments. Process 200 begins at act 202, where a first aliquot of sample may be loaded into a reaction chamber of an integrated device. For example, a sample containing multiple analyte species can be divided into multiple aliquots for sequential processing using an integrated device. A first aliquot may be loaded into the reaction chamber of the integrated device. For example, the surfaces of the reaction chamber can be coated with a coating molecule, such as biotin. The analyte of the first aliquot of the sample may be bound to a coupling moiety, such as streptavidin. When the first aliquot is loaded into the reaction chamber, the analyte is immobilized on the surface of the reaction chamber ( or appended).

図２Ｂの動作２０４において、第１のアリコートの分析物は、分析物が反応チャンバ内に存在する間に試料採取され得る。分析物を試料採取する工程は、動作２０５Ａにおいて、励起光を反応チャンバに送達して分析物および／またはそれに連結した蛍光標識を励起させる工程を含み得る。励起された試料は、動作２０５Ｂにおいて、集積デバイスの光検出領域により収集され得るシグナル（例えば、光子）を放出する。放出されたシグナルは、一部の実施形態では、分析物を特定するのに使用され得る。 In act 204 of FIG. 2B, a first aliquot of analyte may be sampled while the analyte is within the reaction chamber. Sampling the analyte may include delivering excitation light to the reaction chamber to excite the analyte and/or the fluorescent label coupled thereto in operation 205A. The excited sample emits a signal (eg, a photon) that can be collected by a photodetection region of the integrated device in operation 205B. The emitted signal, in some embodiments, can be used to identify the analyte.

一部の実施形態では、分析物は、試料採取される１つのペプチドまたは複数のペプチドを含む。一部の実施形態では、分析物は１つまたは複数のペプチドを含み、そして励起される蛍光標識がアミノ酸認識分子にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ペプチド分析物の同定は、ポリペプチドを１つまたは複数のアミノ酸認識分子（１つまたは複数の種類の末端アミノ酸と会合する）と接触させることにより進めることができる。一部の実施形態では、図２Ａに示すような切断分子またはカッターが、分析物の一部分を取り出すのに使用され得（例えば、ペプチドの鎖からペプチドを取り出すことにより）、そして分析物の次の部分が試料採取され得る。 In some embodiments, the analyte comprises a peptide or peptides that are sampled. In some embodiments, the analyte comprises one or more peptides and an excited fluorescent label is conjugated to an amino acid recognition molecule. In some embodiments, identification of peptide analytes can proceed by contacting the polypeptide with one or more amino acid recognition molecules (associated with one or more types of terminal amino acids). In some embodiments, a cleaving molecule or cutter, such as that shown in FIG. 2A, can be used to remove a portion of the analyte (e.g., by removing the peptide from a chain of peptides) and to A portion may be sampled.

分析物から十分なシグナルが収集されたら、動作２０６において、第１のアリコートが集積デバイスの反応チャンバから取り出され得る。例えば、追加試料に関する情報を収集するために、追加試料（すなわち、試料の追加アリコート）を集積デバイス中に負荷することが望ましいと考えられる。しかしながら、本明細書に記載されるように、反応チャンバ内に存在するこれまでに処理された分析物が、新規に負荷された分析物のシグナル収集を妨害し得る。したがって、追加試料を集積デバイス内に負荷する前に、第１のアリコートが集積デバイスから取り出され得る。 Once sufficient signal has been collected from the analyte, a first aliquot may be removed from the reaction chamber of the integration device in operation 206. For example, it may be desirable to load additional samples (ie, additional aliquots of the sample) into the integration device in order to collect information about the additional samples. However, as described herein, previously processed analytes present in the reaction chamber can interfere with signal collection of newly loaded analytes. Accordingly, a first aliquot may be removed from the collection device before loading additional sample into the collection device.

センサチップを除荷するための例示的技術には、（ａ）カップリング部分とコーティング分子との間（例えば、ストレプトアビジンとビオチンとの間）の結合した係留を破壊する工程；（ｂ）分子（例えば、ビオチン）コーティングをセンサチップの表面から剥離する工程；（ｃ）被占有反応チャンバ内の試料分析物を酵素消化する工程；およびｄ）試料分析物とカップリング部分（例えば、ストレプトアビジン、ビオチン）との間の結合を融解する工程が含まれる。そのような技術は本明細書にさらに記載される。 Exemplary techniques for unloading the sensor chip include (a) breaking the bonded tether between the coupling moiety and the coating molecule (e.g., between streptavidin and biotin); (b) molecule (c) enzymatically digesting the sample analyte in the occupied reaction chamber; and d) peeling the sample analyte and the coupling moiety (e.g., streptavidin) from the surface of the sensor chip; biotin). Such techniques are further described herein.

動作２０６において、集積デバイスから第１のアリコートを取り出す工程の後で、試料の第２のアリコートが、動作２０８において反応チャンバ中に負荷され得る。第２のアリコートの分析物は、反応チャンバの表面をコーティングする（例えば、それに結合した）コーティング分子と結合するように構成されたカップリング部分に同様に結合し得る。第２のアリコートの分析物は、分析物に関する情報を収集するために試料採取され得る。 After removing the first aliquot from the collection device in operation 206, a second aliquot of sample may be loaded into the reaction chamber in operation 208. The second aliquot of analyte may similarly bind to a coupling moiety configured to bind to a coating molecule coating (eg, bound to) a surface of the reaction chamber. A second aliquot of the analyte may be sampled to collect information about the analyte.

集積デバイスに試料の複数のアリコートを負荷するおよび除荷する上記工程は、要望に応じて反復され得る。工程は、試料を複数のアリコートに分割することにより、多数の分析物の種を含む試料を処理すること、および各アリコートを連続的に処理することを可能にする。本明細書に記載される除荷技術は、妨害（新規に負荷されたアリコートの試料採取期間中に、これまでに負荷された分析物が新シグナルを発することに起因し得る）を阻止する。以下に記載する除荷技術のいずれも、研究者の目的を実現するために組み合わせて（例えば、連続して）使用され得る。 The above steps of loading and unloading multiple aliquots of sample onto the collection device may be repeated as desired. The process allows for processing samples containing multiple analyte species by dividing the sample into multiple aliquots and for processing each aliquot sequentially. The unloading techniques described herein prevent interference, which may result from previously loaded analytes emitting new signals during the sampling period of newly loaded aliquots. Any of the unloading techniques described below can be used in combination (e.g., sequentially) to achieve the researcher's objectives.

コーティング分子とカップリング部分との間の結合の破壊
集積デバイスの反応チャンバから試料の一部分を除荷するための第１の例示的技術は、反応チャンバの表面をコーティングするコーティング分子と試料の分析物に結合したカップリング部分との間の共有結合を破壊することを伴う。コーティング分子とカップリング部分との間の結合を破壊すると、固定されていた分析物が反応チャンバの表面から放出され、分析物が集積デバイスからフラッシングされることが可能になる。一部の実施形態では、コーティング分子とカップリング部分との間の共有結合を破壊する工程は、カップリング部分とコーティング分子とを解離させる工程を含む。 Breaking the Bond Between the Coating Molecule and the Coupling Moiety A first exemplary technique for unloading a portion of the sample from the reaction chamber of an integrated device is to break down the bond between the coating molecule coating the surface of the reaction chamber and the analyte of the sample. involves breaking the covalent bond between the coupling moiety attached to the Breaking the bond between the coating molecule and the coupling moiety releases the immobilized analyte from the surface of the reaction chamber, allowing the analyte to be flushed from the integration device. In some embodiments, breaking the covalent bond between the coating molecule and the coupling moiety comprises dissociating the coupling moiety and the coating molecule.

図３Ａは、一部の実施形態に基づく、図１Ａの集積デバイスのチャンバの表面を再生するための事例的工程である。工程３１０は、動作３１２（第１のアリコートの分析物が、集積デバイスの反応チャンバ内に存在する間に試料採取される）において開始する。例えば、少なくとも１つの光源から発した励起光が反応チャンバに送達され得るが、また反応チャンバから（例えば、第１のアリコートの分析物および／またはそれに連結した蛍光標識から）放出されたシグナルは、集積デバイスの光検出領域において検出され得る。 FIG. 3A is an example process for resurfacing the chamber of the integrated device of FIG. 1A, according to some embodiments. Process 310 begins at operation 312, where a first aliquot of analyte is sampled while within the reaction chamber of the integration device. For example, excitation light emitted from at least one light source may be delivered to the reaction chamber, while a signal emitted from the reaction chamber (e.g., from the analyte of the first aliquot and/or a fluorescent label coupled thereto) may be It can be detected in the photodetection region of the integrated device.

動作３１４における試料採取する工程の後で、第１のアリコートが反応チャンバから取り出され得る。例えば、第１のアリコートからのシグナル妨害を受けることなく、試料の第２のアリコートの負荷を可能にするために、第１のアリコートが集積デバイスから取り出され得る。動作３１４は、第１のアリコートを集積デバイスから除荷する１例を提供するが、それは、反応チャンバの表面をコーティングするコーティング分子（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）と、反応チャンバの表面に固定された試料分析物に結合したカップリング部分（例えば、ストレプトアビジン、ビオチン）との間の結合を破壊することを伴う。 After the sampling step in operation 314, a first aliquot may be removed from the reaction chamber. For example, a first aliquot may be removed from the collection device to allow loading of a second aliquot of sample without signal interference from the first aliquot. Act 314 provides one example of unloading the first aliquot from the integration device, which includes a coating molecule (e.g., biotin, streptavidin) that coats the surface of the reaction chamber and a first aliquot that is immobilized on the surface of the reaction chamber. It involves breaking the bond between a coupling moiety (eg, streptavidin, biotin) bound to a sample analyte.

本発明者らは、分子、例えばビオチン等とストレプトアビジンとの間の結合を破壊するための従来技術は不適切であることを認識した。そのような技術は、高温（例えば、摂氏９０度）および集積デバイスに対して損傷を引き起こすおそれがある化学物質を含む、過酷な条件を一般的に必要とする。そのような技術は、実施するのに長時間（例えば、６０分を上回る）を要する可能性があり、単一の集積デバイス上で試料の連続するアリコートを連続的に処理するという要望と矛盾する。 The inventors have recognized that conventional techniques for disrupting the binding between molecules such as biotin and streptavidin are inadequate. Such techniques typically require harsh conditions, including high temperatures (eg, 90 degrees Celsius) and chemicals that can cause damage to integrated devices. Such techniques can take a long time to perform (e.g., greater than 60 minutes) and are inconsistent with the desire to sequentially process successive aliquots of a sample on a single integrated device. .

したがって、本発明者らは、コーティング分子とカップリング部分との間の結合を破壊するための改善した技術を開発した。コーティング分子－カップリング部分結合を破壊するための事例的方法は、動作３１５Ａにおいて開始する。動作３１５Ａにおいて、反応チャンバの表面は、再生溶液と接触し得る（例えば、その中に浸漬される）。再生溶液は、コーティング分子とカップリング部分との間の結合の破壊を促進する。 Therefore, the inventors have developed an improved technique for breaking the bond between the coating molecule and the coupling moiety. The exemplary method for breaking coating molecule-coupling moiety bonds begins at act 315A. In operation 315A, a surface of the reaction chamber may be contacted with (eg, immersed in) a regeneration solution. The regeneration solution facilitates the breaking of bonds between the coating molecule and the coupling moiety.

一部の実施形態では、再生溶液は酢酸塩および水を含む。一部の実施形態では、酢酸塩は酢酸アンモニウムである。酢酸アンモニウムは、分析物が反応チャンバの表面から放出されたら、分析物が溶解し、および／またはフラッシング除去されるように、分析物（例えば、ペプチドまたはその他の生体試料）の溶解度を改善し得る。他の実施形態では、酢酸塩は酢酸ナトリウムである。本明細書に記載されるように、結合分子とコーティング分子との間の結合を破壊する既存の溶液は、集積デバイスのコンポーネントに損傷を与えるおそれのある強刺激性の化学薬品を含有する。水は、対照的に、集積デバイスコンポーネントと適合性があり、また集積デバイスに対する損傷を引き起こすリスクを有さない。 In some embodiments, the regeneration solution includes acetate and water. In some embodiments, the acetate salt is ammonium acetate. Ammonium acetate may improve the solubility of the analyte (e.g., a peptide or other biological sample) such that the analyte is dissolved and/or flushed away once it is released from the surface of the reaction chamber. . In other embodiments, the acetate salt is sodium acetate. As described herein, existing solutions that disrupt the bond between binding molecules and coating molecules contain harsh chemicals that can damage components of integrated devices. Water, in contrast, is compatible with integrated device components and poses no risk of causing damage to the integrated device.

再生溶液は、カップリング部分およびコーティング分子を破壊するように考案された化合物（例えば、有機化合物）をさらに含み得る。例えば、一部の実施形態では、再生溶液は、ビオチン－ストレプトアビジン複合体を破壊するための有機化合物、例えばフッ素化されたアルコール（またはフルオロアルコール）等、例えばヘキサフルオロ－２－プロパノール（すなわち、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール、ヘキサフルオロ－イソ－プロパノール、または「ＨＦＩＰ」）、またはヘキサフルオロ－２－プロパノールアナログ等を含む。そのような化合物は、コーティング分子とカップリング部分との間の結合を破断することができ、これにより反応チャンバ表面からの分析物の放出が可能となる。一部の実施形態では、化合物は、ボンディング分子と分析物との間の結合を破断してカップリング部分（例えば、ストレプトアビジン）複合体そのものをさらに破壊し得る。 The regeneration solution may further include compounds (eg, organic compounds) designed to disrupt the coupling moieties and coating molecules. For example, in some embodiments, the regeneration solution includes an organic compound to disrupt the biotin-streptavidin complex, such as a fluorinated alcohol (or fluoroalcohol), such as hexafluoro-2-propanol (i.e., 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, hexafluoro-iso-propanol, or "HFIP"), or hexafluoro-2-propanol analogs, and the like. Such compounds can rupture the bond between the coating molecule and the coupling moiety, thereby allowing release of the analyte from the reaction chamber surface. In some embodiments, the compound can disrupt the bond between the bonding molecule and the analyte, further disrupting the coupling moiety (eg, streptavidin) complex itself.

一部の実施形態では、再生溶液は、アルコール、酢酸塩（例えば、酢酸アンモニウム）、および水を含む。一部の実施形態では、再生溶液は、フッ素化されたアルコール、酢酸塩、および水を含む。一部の実施形態では、再生溶液は、フッ素化されたケトン、酢酸塩、および水を含む。一部の実施形態では、再生溶液は、アルコール性刺激物質、酢酸塩、および水を含む。一部の実施形態では、再生溶液は、遊離ビオチンまたはそのアナログ、例えば、モノビオチン、イミノビオチン、および／またはデスチオビオチンをさらに含む。 In some embodiments, the regeneration solution includes alcohol, acetate (eg, ammonium acetate), and water. In some embodiments, the regeneration solution includes a fluorinated alcohol, acetate, and water. In some embodiments, the regeneration solution includes a fluorinated ketone, acetate, and water. In some embodiments, the regeneration solution includes an alcoholic irritant, acetate, and water. In some embodiments, the regeneration solution further comprises free biotin or an analog thereof, such as monobiotin, iminobiotin, and/or desthiobiotin.

遊離ビオチンアナログには、一部の実施形態では、再生溶液の溶解度を増加させるためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーまたは別のリンカーを有するビオチンが含まれることがある。例示的遊離ビオチンアナログの化学構造を下記に提示する。 Free biotin analogs may, in some embodiments, include biotin with a polyethylene glycol (PEG) linker or another linker to increase solubility in the regeneration solution. The chemical structures of exemplary free biotin analogs are presented below.

本明細書に記載されるように、分子を破壊するための既存技術は冗長であり、試料を連続的に処理するという要望と矛盾する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるような組成物を有する再生溶液は、コーティング分子およびカップリング部分を６０分以内に破壊する能力を有するか、またはそのように考案されている。一部の実施形態では、浸漬工程が、３０分以内の個別の期間実施される。浸漬期間が短い方が、定常流を用いながら試料の複数のアリコートを処理することが可能になる。一部の実施形態では、本明細書に記載される再生溶液は、自動化されたチップ再生方法に適する。 As described herein, existing techniques for disrupting molecules are tedious and inconsistent with the desire to process samples continuously. In some embodiments, a regeneration solution having a composition as described herein has or is designed to destroy coating molecules and coupling moieties within 60 minutes. . In some embodiments, the soaking steps are performed for discrete periods of up to 30 minutes. Shorter immersion periods allow multiple aliquots of the sample to be processed while using a steady flow. In some embodiments, the regeneration solutions described herein are suitable for automated chip regeneration methods.

本明細書に記載されるように、分子を破壊するための既存技術は、高温、例えば摂氏９０度で実施されなければならない。本明細書に記載されるような組成物を有する再生溶液は、コーティング分子およびカップリング部分を室温（例えば、少なくとも摂氏２０度かつ摂氏２２度以下）で破壊する能力を有する。操作温度が低いほど、高温度の使用に起因し得る、試料、集積デバイス、および／またはオペレーターに対する損傷のリスクが低下する。 As described herein, existing techniques for breaking molecules must be performed at high temperatures, such as 90 degrees Celsius. A regeneration solution having a composition as described herein has the ability to destroy coating molecules and coupling moieties at room temperature (eg, at least 20 degrees Celsius and below 22 degrees Celsius). Lower operating temperatures reduce the risk of damage to the sample, integration device, and/or operator that may result from the use of high temperatures.

一部の実施形態では、再生溶液はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。一部の実施形態では、再生溶液はホルムアミドを含む。一部の実施形態では、再生溶液はＥＤＴＡおよびホルムアミドを含む。一部の実施形態では、再生溶液は酢酸ナトリウムおよびホルムアミドを含む。一部の実施形態では、再生溶液は、ヘキサフルオロ－２－プロパノール、ノナフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、２，２，３，３，４，４，４－ヘプタフルオロ－１－ブタノール、およびオクタフルオロ－２－ブタノンから選択されるフルオロアルコールを含有する。一部の実施形態では、再生溶液はヘキサフルオロ－２－プロパノールを含む。一部の実施形態では、再生溶液は、ヘキサフルオロ－２－プロパノール、例えばノナフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、２，２，３，３，４，４，４－ヘプタフルオロ－１－ブタノール、オクタフルオロ－２－ブタノール、またはオクタフルオロ－２－ブタノンのアナログを含む。一部の実施形態では、再生溶液は、ノナフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、２，２，３，３，４，４，４－ヘプタフルオロ－１－ブタノール、およびオクタフルオロ－２－ブタノン、酢酸塩（例えば、酢酸アンモニウム）、および水のうちの１つまたは複数を含む。 In some embodiments, the regeneration solution includes ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). In some embodiments, the regeneration solution includes formamide. In some embodiments, the regeneration solution includes EDTA and formamide. In some embodiments, the regeneration solution includes sodium acetate and formamide. In some embodiments, the regeneration solution includes hexafluoro-2-propanol, nonafluoro-tert-butyl alcohol, 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol, and octafluoro-1-butanol. Contains a fluoroalcohol selected from 2-butanone. In some embodiments, the regeneration solution includes hexafluoro-2-propanol. In some embodiments, the regeneration solution includes hexafluoro-2-propanol, such as nonafluoro-tert-butyl alcohol, 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol, octafluoro- Contains analogs of 2-butanol or octafluoro-2-butanone. In some embodiments, the regeneration solution comprises nonafluoro-tert-butyl alcohol, 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol, and octafluoro-2-butanone, acetate ( (e.g., ammonium acetate), and water.

動作３１５Ｂにおいて、例えばチップに再生溶液を適用することにより結合分子とコーティング分子との間の結合を破断することによって、コーティング分子から各カップリング部分が破壊される。例えば、本明細書に記載されるように、再生溶液は、カップリング部分からボンディング分子を破壊するための化合物、例えばヘキサフルオロ－２－プロパノール等（例えば、ＨＦＩＰ）を含有し得る。ＨＦＩＰは芳香臭を有する無毒性アルコールである。ＨＦＩＰは、皮膚および粘膜に対して腐食性であるので、刺激物である。一部の実施形態では、溶液は、約１～５ｍＬ、３～７ｍＬ、４～８ｍＬ、５～９ｍＬ、５～１０ｍＬ、８～１０ｍＬ、９～１１ｍＬ、１０～１２．５ｍＬ、または１２．５ｍＬを上回る量のヘキサフルオロ－２－プロパノールを含有する。 In operation 315B, each coupling moiety is broken from the coating molecule, such as by breaking the bond between the binding molecule and the coating molecule by applying a regeneration solution to the chip. For example, as described herein, the regeneration solution may contain a compound to disrupt the bonding molecule from the coupling moiety, such as hexafluoro-2-propanol (eg, HFIP). HFIP is a non-toxic alcohol with an aromatic odor. HFIP is an irritant as it is corrosive to the skin and mucous membranes. In some embodiments, the solution contains about 1-5 mL, 3-7 mL, 4-8 mL, 5-9 mL, 5-10 mL, 8-10 mL, 9-11 mL, 10-12.5 mL, or 12.5 mL. Contains a greater amount of hexafluoro-2-propanol.

一部の実施形態では、溶液は、約１、２、３、４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、または１２．５ｍＬを上回る量のＨＦＩＰを含有する。一部の実施形態では、溶液は、約１、２、３、４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、または１２．５ｍＬを上回る量のＨＦＩＰを含有する。一部の実施形態では、溶液は、約１～１５ｍＬ、１～１２．５ｍＬ、１～５ｍＬ、３～７ｍＬ、４～８ｍＬ、６～９ｍＬ、５～１０ｍＬ、７～１１ｍＬ、８～１０ｍＬ、９～１１ｍＬ、１０～１２．５ｍＬ、または１２．５ｍＬを上回る量のＨＦＩＰを含有する。一部の実施形態では、溶液は約９ｍＬの量のＨＦＩＰを含有する。一部の実施形態では、溶液は９ｍＬの量のＨＦＩＰを含有する。 In some embodiments, the solution is about 1, 2, 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10 , 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, or 12.5 mL of HFIP. In some embodiments, the solution is about 1, 2, 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10 , 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, or 12.5 mL of HFIP. In some embodiments, the solution is about 1-15 mL, 1-12.5 mL, 1-5 mL, 3-7 mL, 4-8 mL, 6-9 mL, 5-10 mL, 7-11 mL, 8-10 mL, 9 ~11 mL, 10-12.5 mL, or greater than 12.5 mL of HFIP. In some embodiments, the solution contains HFIP in an amount of about 9 mL. In some embodiments, the solution contains HFIP in an amount of 9 mL.

再生溶液は酢酸アンモニウム（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ_２・Ｈ_３Ｎ）をさらに含有し得る。一部の実施形態では、溶液は、０．１、０．２、０．２５、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｍＬの量の５Ｍ酢酸アンモニウムを含有する。一部の実施形態では、溶液は０．５ｍＬの量の５Ｍ酢酸アンモニウムを含有する。 _The regeneration solution _may further contain _ammonium acetate ( _C2H4O2.H3N ). In some embodiments, the solution is 0.1, 0.2, 0.25, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.7, Contains 5M ammonium acetate in an amount of 0.8, 0.9, or 1.0 mL. In some embodiments, the solution contains 5M ammonium acetate in an amount of 0.5 mL.

一部の実施形態では、溶液はビオチン化合物を含有する。ビオチン化合物を添加することで、機能化された試料ウェル表面における、ストレプトアビジン結合部位に対する再生溶液の競合が増強し得る。ビオチン化合物を添加することで、溶液のヘキサフルオロ－２－プロパノールコンポーネントにより媒介されるように、試料ウェルの表面におけるビオチン－ストレプトアビジン相互作用の解離が（さらにまたは別途）促進される可能性がある。溶液はモノビオチンまたはビスビオチンを含有し得る。一部の実施形態では、溶液はペグ化されたビオチン、例えばビオチン－ＰＥＧ_３等である。ＰＥＧリンカーは、溶液中のビオチンの溶解度を増強し得る。一部の実施形態では、溶液は、ビオチン－ＰＥＧ_３、ビオチン－ＰＥＧ_４、ビオチン－ＰＥＧ_５、ビオチン－ＰＥＧ_６、ビオチン－ＰＥＧ_７、またはビオチン－ＰＥＧ_８を含有する。一部の実施形態では、再生溶液は、１０～５００μＭの間、５０～２５０μＭの間、１００～２５０μＭの間、１００～５００μＭの間、１００～２００μＭの間、または１００～１５０μＭの間の濃度でビオチン化合物を含有する。一部の実施形態では、再生溶液は、１００μＭ～２００μＭの間の濃度のビオチン化合物を含有する。 In some embodiments, the solution contains a biotin compound. Addition of a biotin compound can enhance competition of regeneration solution for streptavidin binding sites on the functionalized sample well surface. Addition of a biotin compound may (in addition or separately) promote the dissociation of biotin-streptavidin interactions at the surface of the sample well, as mediated by the hexafluoro-2-propanol component of the solution. . The solution may contain monobiotin or bisbiotin. In some embodiments, the solution is pegylated biotin, such as biotin-PEG ₃ . PEG linkers can enhance the solubility of biotin in solution. In some embodiments, the solution contains biotin-PEG ₃ , biotin-PEG ₄ , biotin-PEG ₅ , biotin-PEG ₆ , biotin-PEG ₇ , or biotin-PEG ₈ . In some embodiments, the regeneration solution is at a concentration between 10 and 500 μM, between 50 and 250 μM, between 100 and 250 μM, between 100 and 500 μM, between 100 and 200 μM, or between 100 and 150 μM. Contains biotin compounds. In some embodiments, the regeneration solution contains a biotin compound at a concentration between 100 μM and 200 μM.

例示的な実施形態では、再生溶液は、９ｍＬのＨＦＩＰ、０．５ｍＬの５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＬの水、および１００μＭ～２００μＭの間の濃度でビオチン－ＰＥＧ_３（ビスビオチン－ＰＥＧ_４）を含有する。 In an exemplary embodiment, the regeneration solution contains 9 mL HFIP, 0.5 mL 5M ammonium acetate, 1 mL water, and biotin-PEG ₃ (bisbiotin-PEG ₄ ) at a concentration between 100 μM and 200 μM. .

再生溶液の一部の実施形態、例えば核酸分析物の同定および／またはシークエンシングで使用される実施形態では、再生溶液はＤＮａｓｅ酵素を含有する。ＤＮａｓｅ酵素はヌクレオシド消化ミックスの一部分として提供され得る。 In some embodiments of the regeneration solution, such as those used in nucleic acid analyte identification and/or sequencing, the regeneration solution contains a DNase enzyme. DNase enzyme can be provided as part of a nucleoside digestion mix.

例示的な実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素（またはヌクレオシド消化ミックス）が、再生溶液とは別にチップに適用される。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提示されるチップ再生方法は、再生溶液およびＤＮａｓｅ酵素の同時または個別の適用を含む。一部の実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素が再生溶液の前にチップに適用される。したがって、これらの実施形態では、試料ウェルの表面を再生溶液と接触させる前に、核酸（ＤＮＡ）分析物がＤＮａｓｅを用いて少なくとも部分的に酵素消化される。 In an exemplary embodiment, the DNase enzyme (or nucleoside digestion mix) is applied to the chip separately from the regeneration solution. Thus, in some embodiments, the chip regeneration methods presented herein include simultaneous or separate application of a regeneration solution and a DNase enzyme. In some embodiments, the DNase enzyme is applied to the chip before the regeneration solution. Thus, in these embodiments, the nucleic acid (DNA) analyte is at least partially enzymatically digested with DNase prior to contacting the surface of the sample well with the regeneration solution.

一部の実施形態では、反応チャンバの表面を再生溶液内に浸漬する工程は、カップリング部分と破壊される分析物との間の共有結合をさらに引き起こす。この破壊の結果として、分析物およびカップリング部分は、動作３１５Ｃにおいて、各反応チャンバの表面から放出される。放出された分析物およびカップリング部分は、動作３１５Ｄにおいて、反応チャンバからフラッシングされ得る。本明細書に記載されるように、再生溶液は、分析物、例えば酢酸アンモニウム等の溶解度を増加させるためのコンポーネントを含有し得る。したがって、一部の実施形態では、分析物は、付加的または代替的に再生溶液に溶解され得る。 In some embodiments, immersing the surface of the reaction chamber in the regeneration solution further causes covalent bonding between the coupling moiety and the analyte to be disrupted. As a result of this destruction, analyte and coupling moiety are released from the surface of each reaction chamber in operation 315C. The released analyte and coupling moiety may be flushed from the reaction chamber in operation 315D. As described herein, the regeneration solution may contain components to increase the solubility of the analyte, such as ammonium acetate. Thus, in some embodiments, the analyte may additionally or alternatively be dissolved in the regeneration solution.

集積デバイスの反応チャンバから第１のアリコートを取り出した後、工程３１０は動作３１６に進むことができる。本明細書に記載される取り出し工程は、後で負荷されたアリコートを試料採取するときに生ずる、これまでに負荷されたアリコートから放出されたシグナルに起因する妨害が存在しないことを保証する。したがって、第１のアリコートが取り出されたら、動作３１６において、第２のアリコートを集積デバイスの反応チャンバ内に負荷することができる。第２のアリコートは分析物を含み得るが、分析物は各カップリング部分に結合している。反応チャンバの表面をコーティングするコーティング分子は、第１のアリコートを取り除いた後にも、反応チャンバ内に留まり得る。したがって、工程３１０は、第２のアリコートを負荷する前に、集積デバイスの反応チャンバ内に追加のコーティング分子を負荷するという再コーティング工程を不要とし得る。第２のアリコートのカップリング部分は、試料採取工程が実施され得るように、残存するコーティング分子と結合して第２のアリコートの分析物を反応チャンバの表面に固定し得る。 After removing the first aliquot from the reaction chamber of the integrated device, process 310 may proceed to operation 316. The extraction step described herein ensures that there are no interferences due to signals emitted from previously loaded aliquots that occur when later loaded aliquots are sampled. Thus, once the first aliquot has been removed, a second aliquot can be loaded into the reaction chamber of the integrated device in operation 316. The second aliquot may contain the analyte, which is bound to each coupling moiety. The coating molecules that coat the surfaces of the reaction chamber may remain within the reaction chamber even after the first aliquot is removed. Thus, step 310 may eliminate the need for a recoating step of loading additional coating molecules into the reaction chamber of the integrated device before loading the second aliquot. The coupling portion of the second aliquot may bind the remaining coating molecules to immobilize the analyte of the second aliquot to the surface of the reaction chamber so that a sampling step can be performed.

動作３１６の後で、第２のアリコートの分析物が試料採取され得る。例えば、少なくとも１つの光源から発した励起光は反応チャンバに送達され得、そして反応チャンバから（例えば、第２のアリコートの分析物および／またはそれに連結した蛍光標識から）放出されたシグナルが集積デバイスの光検出領域において検出され得る。コーティング分子およびカップリング部分の結合を破壊するための技術を介して集積デバイスを負荷および除荷する上記工程は、要望に応じて多数回反復され得る。 After operation 316, a second aliquot of analyte may be sampled. For example, excitation light emitted from at least one light source can be delivered to a reaction chamber, and a signal emitted from the reaction chamber (e.g., from a second aliquot of analyte and/or a fluorescent label coupled thereto) can be transmitted to the integration device. can be detected in the photodetection area of . The above steps of loading and unloading the integrated device via techniques to break the bonds of coating molecules and coupling moieties can be repeated as many times as desired.

一部の実施形態では、方法は、カップリング部分と複数のコーティング分子（例えば第１のコーティング分子および第２のコーティング分子等）との間の１つまたは複数の結合を破壊する工程を含み、第１および第２のコーティング分子はウェル表面に対して機能化されている。一部の実施形態では、第１および第２のコーティング分子は異なる。一部の実施形態では、第１のコーティング分子はストレプトアビジンタンパク質であり、および第２のコーティング分子は、ストレプトアビジンタンパク質ではない（例えば、アビジンタンパク質またはアジド部分である）。一部の実施形態では、方法は、コーティング分子と複数種類のカップリング部分（例えば第１および第２のカップリング部分等）との間の結合を破壊する工程を含み、コーティング分子は、ウェル表面に対して機能化されている。一部の実施形態では、第１および第２のカップリング部分は異なる。一部の実施形態では、第１のカップリング部分はビオチン部分であり、および第２のカップリング部分はビオチン部分ではない（例えば、ＳＮＡＰ－タグまたはアジド部分である）。そのようなすべての実施形態において、開示される方法に基づき再生溶液を使用することで、複数種類のコーティング分子と複数種類のカップリング部分とが組み合わさったそれらの間の結合の分解を実現し得る。 In some embodiments, the method includes disrupting one or more bonds between the coupling moiety and a plurality of coating molecules (e.g., a first coating molecule, a second coating molecule, etc.); The first and second coating molecules are functionalized to the well surface. In some embodiments, the first and second coating molecules are different. In some embodiments, the first coating molecule is a streptavidin protein and the second coating molecule is not a streptavidin protein (eg, an avidin protein or an azide moiety). In some embodiments, the method includes disrupting the bond between the coating molecule and multiple types of coupling moieties (e.g., first and second coupling moieties, etc.), wherein the coating molecule is It is functionalized for. In some embodiments, the first and second coupling portions are different. In some embodiments, the first coupling moiety is a biotin moiety and the second coupling moiety is not a biotin moiety (eg, a SNAP-tag or an azide moiety). In all such embodiments, the use of a regeneration solution in accordance with the disclosed method achieves cleavage of bonds between combinations of multiple types of coating molecules and multiple types of coupling moieties. obtain.

一部の実施形態では、反応チャンバの表面を、動作３１５Ａにおいて再生溶液と接触させる前に、コーティング分子とカップリング部分との間の結合を破壊するために、分析物は少なくとも部分的に酵素消化され得る。例えば、一部の実施形態では（例えば、ＤＮＡシークエンシング用途において）、再生溶液（カップリング部分およびコーティング分子を破壊するように考案された化合物を含む）と反応チャンバ表面との接触が分析物のサイズに起因して阻止され得るように、試料採取される分析物はきわめて大きい。したがって、一部の実施形態では、カップリング部分およびコーティング分子を破壊するように考案された化合物が反応チャンバの表面と接触するのを可能にするために、反応チャンバ内の試料採取された分析物の少なくとも一部分は酵素消化され得る。例えば、分析物がＤＮＡ鎖（例えば、ＤＮＡシークエンシングにおいて）を含む場合、ＤＮＡ鎖の少なくとも一部分は、反応チャンバの表面が再生溶液と接触する前に酵素消化され得る（例えば、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）および／またはエキソヌクレアーゼ消化を使用して）。 In some embodiments, the analyte is at least partially enzymatically digested to break the bond between the coating molecule and the coupling moiety before contacting the surface of the reaction chamber with the regeneration solution in operation 315A. can be done. For example, in some embodiments (e.g., in DNA sequencing applications), contact of a regeneration solution (containing a compound designed to disrupt coupling moieties and coating molecules) with a reaction chamber surface is The analytes sampled are quite large so that they can be blocked due to size. Accordingly, in some embodiments, a sampled analyte within the reaction chamber is used to allow a compound designed to disrupt the coupling moiety and coating molecules to contact the surfaces of the reaction chamber. At least a portion of the can be enzymatically digested. For example, if the analyte includes a DNA strand (e.g., in DNA sequencing), at least a portion of the DNA strand may be enzymatically digested (e.g., endonuclease, e.g., before the surface of the reaction chamber contacts the regeneration solution). using DNase) and/or exonuclease digestion).

反応チャンバコーティングの剥離
集積デバイスの反応チャンバから試料の一部分を除荷するための第２の例示的技術は、反応チャンバ表面からコーティング分子を剥離することを伴う。反応チャンバ表面からコーティング分子を剥離することで、コーティング分子に結合したカップリング部分およびそれに連結した分析物が反応チャンバから放出され、そして放出されたコンポーネントの溶解および／または集積デバイスからのフラッシングが可能になる。 Stripping Reaction Chamber Coatings A second exemplary technique for unloading a portion of a sample from a reaction chamber of an integrated device involves stripping coating molecules from the reaction chamber surfaces. Stripping the coating molecules from the reaction chamber surface releases the coupling moiety bound to the coating molecule and the analyte linked thereto from the reaction chamber, allowing for dissolution and/or flushing of the released components from the integrated device. become.

例えば、図３Ｂは、図１Ａに示す集積デバイスのチャンバ表面を再生する事例的方法であり、一部の実施形態によれば、コーティングを反応チャンバ表面から剥離することを伴う。工程３２０は動作３２２において開始し、第１のアリコートの分析物が集積デバイスの反応チャンバ内に存在する間に試料採取される。例えば、少なくとも１つの光源から発した励起光が反応チャンバに送達され得るが、また反応チャンバから（例えば、第１のアリコートの分析物および／またはそれに連結した蛍光標識から）放出されたシグナルが集積デバイスの光検出領域において検出され得る。 For example, FIG. 3B is an exemplary method of regenerating a chamber surface of the integrated device shown in FIG. 1A, which, according to some embodiments, involves stripping a coating from a reaction chamber surface. The process 320 begins at operation 322, where a first aliquot of analyte is sampled while within the reaction chamber of the integration device. For example, excitation light emitted from at least one light source can be delivered to the reaction chamber, while signals emitted from the reaction chamber (e.g., from the analyte of the first aliquot and/or a fluorescent label coupled thereto) can be integrated. can be detected in the photodetection region of the device.

試料採取する工程の後で、動作３２４において、第１のアリコートが反応チャンバから除去され得る。例えば、第１のアリコートからのシグナル妨害を受けずに、試料の第２のアリコートの負荷を可能にするために、第１のアリコートが集積デバイスから除去され得る。動作３２４は、集積デバイスから第１のアリコートを除荷する第２の例を提供するが、それは、１つまたは複数のコーティング分子（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）を含むコーティングを反応チャンバの表面から取り除くことを伴う。 After the sampling step, the first aliquot may be removed from the reaction chamber in operation 324. For example, a first aliquot may be removed from the integration device to allow loading of a second aliquot of sample without signal interference from the first aliquot. Operation 324 provides a second example of unloading a first aliquot from the integration device, but it removes a coating containing one or more coating molecules (e.g., biotin, streptavidin) from the surface of the reaction chamber. involves removing.

特に、動作３２５Ａにおいて、反応チャンバの表面をコーティングする１つまたは複数のコーティング分子が反応チャンバ表面から剥がされる。一部の実施形態では、１つまたは複数のコーティング分子を剥離する工程は、上記で開示したような任意の再生溶液の添加を含む。一部の実施形態では、この工程は、ＨＦＩＰまたは１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールの溶液の添加を含む。 In particular, in operation 325A, one or more coating molecules coating a surface of the reaction chamber are stripped from the reaction chamber surface. In some embodiments, stripping one or more coating molecules includes adding an optional regeneration solution as disclosed above. In some embodiments, this step includes adding a solution of HFIP or 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.

本明細書に記載されるように、カップリング部分は、反応チャンバ内のコーティング分子に結合し、カップリング部分に結合した第１のアリコートの試料分析物を反応チャンバの表面に固定して、試料採取を可能にする。したがって、コーティングを取り除いた結果として、分析物およびカップリング部分は、動作３２５Ｂにおいて各反応チャンバの表面からやはり放出される。放出された分析物およびカップリング部分は、動作３２５Ｃにおいて反応チャンバからフラッシングされ得る。一部の実施形態では、放出されたコンポーネントは、例えば溶液、例えば本明細書に記載される再生溶液のいずれか等中にチップの表面を浸漬することにより、付加的または代替的に溶解され得る。一部の実施形態では、開示される方法は、第１のコーティング分子および第２のコーティング分子を反応チャンバ表面から剥離する工程を含み、ただし第１および第２のコーティング分子は異なる。そのような実施形態では、第１のコーティング分子はストレプトアビジンタンパク質を含み得、および第２のコーティング分子は、ストレプトアビジンタンパク質ではない部分（例えば、アビジンタンパク質またはアジド部分であり得る）を含み得る。 As described herein, the coupling moiety binds to a coating molecule within the reaction chamber and immobilizes a first aliquot of sample analyte bound to the coupling moiety to the surface of the reaction chamber to Enable collection. Therefore, as a result of removing the coating, analyte and coupling moiety are still released from the surface of each reaction chamber in operation 325B. The released analyte and coupling moiety may be flushed from the reaction chamber in operation 325C. In some embodiments, the released components may additionally or alternatively be dissolved, e.g., by dipping the surface of the chip into a solution, such as any of the regeneration solutions described herein. . In some embodiments, the disclosed method includes stripping a first coating molecule and a second coating molecule from a reaction chamber surface, where the first and second coating molecules are different. In such embodiments, the first coating molecule may include a streptavidin protein and the second coating molecule may include a moiety that is not a streptavidin protein (eg, may be an avidin protein or an azide moiety).

集積デバイスの反応チャンバから第１のアリコートを取り出した後、工程３２０は、動作３２６に進むことができる。動作３２６において、反応チャンバの表面は、追加のコーティング分子（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）を反応チャンバ中に負荷することにより再コーティングされ、第２のアリコートの負荷に備える。 After removing the first aliquot from the reaction chamber of the integrated device, process 320 can proceed to operation 326. In operation 326, the surfaces of the reaction chamber are recoated by loading additional coating molecules (eg, biotin, streptavidin) into the reaction chamber in preparation for loading a second aliquot.

動作３２８において、集積デバイスの反応チャンバには、試料の第２のアリコートが再負荷され得る。動作３２８の後で、第２のアリコートの分析物が、試料採取され得る。反応チャンバコーティングを剥離するための技術を介して集積デバイスを負荷および除荷する上記工程は、要望に応じて反復され得る。 In operation 328, the reaction chamber of the integration device may be reloaded with a second aliquot of sample. After operation 328, a second aliquot of analyte may be sampled. The above steps of loading and unloading the integrated device via techniques to strip the reaction chamber coating can be repeated as desired.

分析物の酵素消化
試料の一部分を集積デバイスの反応チャンバから除荷するための第３の例示的技術は、試料採取する工程の後で、反応チャンバ内に存在する分析物（例えば、ペプチド）を酵素消化することを伴う。試料採取する工程の後で分析物を酵素消化することで、コーティング分子およびカップリング部分の破壊、または集積デバイスの反応チャンバ表面の再コーティングを必要とせずに、これまでに試料採取された分析物を反応チャンバから取り出すことが可能になる。 Enzymatic Digestion of Analytes A third exemplary technique for unloading a portion of a sample from the reaction chamber of an integration device is to remove the analytes (e.g., peptides) present in the reaction chamber after the step of sampling. Involves enzymatic digestion. Enzymatic digestion of the analyte after the sampling step removes previously sampled analytes without the need for disruption of coating molecules and coupling moieties or recoating of the reaction chamber surfaces of the integrated device. can be removed from the reaction chamber.

例えば、図３Ｃは、図１Ａの集積デバイスのチャンバ表面を再生する事例的方法であり、一部の実施形態に基づき、これまでに試料採取された分析物を酵素消化することを伴う。工程３３０は動作３３２において開始し、第１のアリコートの分析物が、集積デバイスの反応チャンバ内に存在する間に試料採取される。例えば、少なくとも１つの光源から発した励起光が反応チャンバに送達され得、そして反応チャンバから（例えば、第１のアリコートの分析物、および／またはそれに連結した蛍光標識から）放出されたシグナルが、集積デバイスの光検出領域において検出され得る。 For example, FIG. 3C is an exemplary method of regenerating the chamber surface of the integrated device of FIG. 1A, which involves enzymatic digestion of previously sampled analytes, according to some embodiments. The process 330 begins at operation 332, where a first aliquot of analyte is sampled while within the reaction chamber of the integration device. For example, excitation light emitted from at least one light source can be delivered to the reaction chamber, and a signal emitted from the reaction chamber (e.g., from the analyte of the first aliquot and/or a fluorescent label coupled thereto) It can be detected in the photodetection region of the integrated device.

試料採取する工程の後で、動作３３４において、第１のアリコートが反応チャンバから取り出され得る。例えば、第１のアリコートが集積デバイスから取り出され、第１のアリコートからのシグナル妨害を受けずに試料の第２のアリコートの負荷を可能にし得る。動作３３４は、集積デバイスの反応チャンバ内に存在するこれまでに試料採取された分析物を完全に酵素消化することを伴う、集積デバイスから第１のアリコートを除荷する第２の例を提供する。 After the sampling step, a first aliquot may be removed from the reaction chamber at operation 334. For example, a first aliquot may be removed from the collection device to allow loading of a second aliquot of sample without signal interference from the first aliquot. Act 334 provides a second example of unloading the first aliquot from the collection device, which involves completely enzymatically digesting the previously sampled analyte present in the reaction chamber of the collection device. .

特に、動作３３５Ａにおいて、第１のアリコートの分析物が、酵素消化され得る。例えば、図２Ａに示す、カッターとも呼ばれ、またタンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡのシークエンシングで一般的に使用される切断酵素は、分析物を反応チャンバ表面上のその固定された位置から切断するのに使用され得る。一般的に、切断酵素が、シークエンシングを実施するために、ペプチドの鎖から単一のペプチドを切断するのに使用される。しかしながら、本発明者らは、参照チャンバを、ある濃度の切断酵素を含有する溶液内に長期化した期間浸漬することにより、ペプチド鎖全体が、反応チャンバ表面上のその固定されたポイントから切断され得ることを認識した。酵素消化された分析物は、集積デバイスから第１のアリコートの分析物を取り除くために、その後フラッシングされ、および／または溶解され得る。 In particular, in act 335A, the first aliquot of analyte may be enzymatically digested. For example, shown in Figure 2A, a cleaving enzyme, also called a cutter and commonly used in protein and DNA/RNA sequencing, is used to cleave an analyte from its fixed location on the reaction chamber surface. can be used. Generally, cleaving enzymes are used to cleave single peptides from a chain of peptides in order to perform sequencing. However, we have shown that by immersing the reference chamber in a solution containing a concentration of cleavage enzyme for an extended period of time, the entire peptide chain is cleaved from its fixed point on the reaction chamber surface. I realized that I would get it. The enzymatically digested analyte may then be flushed and/or lysed to remove the first aliquot of analyte from the collection device.

一部の実施形態では、各反応チャンバは、反応チャンバの表面をコーティングする複数のコーティング分子を含み得る。したがって、これまでに結合したコーティング分子がこれまでに結合した分析物（工程３３０の動作３３５Ａにおいて酵素消化される）により占有される場合であっても、追加のコーティング分子が反応チャンバ内に留まり、試料の後続するアリコートのカップリング部分と結合することができる。一部の実施形態では、追加のコーティング分子は、動作３３５の後で、反応チャンバの表面を再コーティングするためにチップ内に負荷されてもよい。 In some embodiments, each reaction chamber may include a plurality of coating molecules coating the surface of the reaction chamber. Thus, even if previously bound coating molecules are occupied by previously bound analyte (which is enzymatically digested in act 335A of step 330), additional coating molecules remain within the reaction chamber; Subsequent aliquots of the sample can be combined with coupling moieties. In some embodiments, additional coating molecules may be loaded into the chip after operation 335 to recoat the surfaces of the reaction chamber.

集積デバイスの反応チャンバから第１のアリコートを取り出した後、工程３３０は動作３３６に進むことができる。動作３３６において、集積デバイスの反応チャンバは、試料の第２のアリコートで再コーティングされ得る。第２のアリコートの分析物はカップリング部分を介して、反応チャンバ内に存在する残存コーティング分子に結合し得る。動作３３６の後で、第２のアリコートの分析物は試料採取され得る。これまでに試料採取された分析物を酵素消化するための技術を介して集積デバイスを負荷および除荷する上記工程は、要望に応じて反復され得る。 After removing the first aliquot from the reaction chamber of the integrated device, process 330 can proceed to operation 336. In operation 336, the reaction chamber of the integrated device may be recoated with a second aliquot of sample. The second aliquot of analyte may bind via the coupling moiety to the remaining coating molecules present within the reaction chamber. After operation 336, a second aliquot of analyte may be sampled. The above steps of loading and unloading the integration device via techniques for enzymatic digestion of previously sampled analytes can be repeated as desired.

分析物－カップリング部分間結合の融解
集積デバイスの反応チャンバから試料の一部分を除荷するための第４の例示的技術は、試料分析物が反応チャンバ内に存在する間に、試料分析物とそれに連結したカップリング部分との間の結合を融解することを伴う。例えば、図３Ｄは、図１Ａに示す集積デバイスのチャンバ表面を再生する例示的方法を示し、一部の実施形態によれば、試料分析物とカップリング部分との間で形成された結合を融解することを伴う。工程３４０は動作３４２において開始し、第１のアリコートの分析物が集積デバイスの反応チャンバ内に存在する間に試料採取される。例えば、少なくとも１つの光源から発した励起光は反応チャンバに送達され得、また反応チャンバから（例えば、第１のアリコートの分析物、および／またはそれに連結した蛍光標識から）放出されたシグナルは、集積デバイスの光検出領域において検出され得る。一部の実施形態では、試料分析物とカップリング部分との間で形成された結合は二本鎖核酸分子（例えば、タンパク質シークエンシング用途におけるＤＮＡ分子リンカー）を含み、また結合の融解は、二本鎖核酸分子を一本鎖に変性させて試料分析物を放出させる工程を含む。 Melting bonds between analyte-coupling moieties A fourth exemplary technique for unloading a portion of a sample from the reaction chamber of an integrated device is to melt the bond between the sample analyte and the sample analyte while the sample analyte is present in the reaction chamber. It involves melting the bond between the coupling moiety connected thereto. For example, FIG. 3D shows an exemplary method of regenerating the chamber surface of the integrated device shown in FIG. involves doing. Process 340 begins at operation 342, where a first aliquot of analyte is sampled while within the reaction chamber of the integration device. For example, excitation light emitted from at least one light source can be delivered to the reaction chamber, and a signal emitted from the reaction chamber (e.g., from the analyte of the first aliquot and/or a fluorescent label coupled thereto) can be It can be detected in the photodetection region of the integrated device. In some embodiments, the bond formed between the sample analyte and the coupling moiety comprises a double-stranded nucleic acid molecule (e.g., a DNA molecule linker in protein sequencing applications), and melting of the bond denaturing the double-stranded nucleic acid molecule into single strands to release the sample analyte.

試料採取する工程の後で、動作３４４において、第１のアリコートが反応チャンバから取り出され得る。例えば、第１のアリコートからのシグナル妨害を受けることなく、試料の第２のアリコートの負荷を可能にするために、第１のアリコートが集積デバイスから取り出され得る。動作３４４は、集積デバイスから第１のアリコートを除荷する工程の第２の例を提供するが、それは、試料分析物と、反応チャンバの表面をコーティングするコーティング分子に結合するように構成されたカップリング部分との間で形成された結合を融解することを伴う。 After the sampling step, a first aliquot may be removed from the reaction chamber in operation 344. For example, a first aliquot can be removed from the collection device to allow loading of a second aliquot of sample without signal interference from the first aliquot. Operation 344 provides a second example of unloading a first aliquot from the integration device, which is configured to bind sample analyte and coating molecules coating the surface of the reaction chamber. It involves melting the bond formed between the coupling part.

特に、動作３３５Ａにおいて、試料分析物とカップリング部分との間の結合は融解され得る。一部の実施形態では、動作３３５Ａは、試料分析物をカップリング部分にリンクさせるＤＮＡ鎖を、二本鎖ＤＮＡから単一鎖ＤＮＡに変性させて、分析物を放出させることを含む。試料分析物とカップリング部分との間で形成されたＤＮＡ分子リンカーを変性する工程は、エネルギー、例えば熱等をシステムに注入してＤＮＡ鎖を融解することを含み得る。一部の実施形態では、この工程は、上記で開示したような任意の再生溶液の添加、および／または任意のその他の化学溶液の付着を含む。 In particular, in act 335A, the bond between the sample analyte and the coupling moiety may be melted. In some embodiments, act 335A includes denaturing the DNA strand that links the sample analyte to the coupling moiety from double-stranded DNA to single-stranded DNA to release the analyte. Denaturing the DNA molecule linker formed between the sample analyte and the coupling moiety may include injecting energy, such as heat, into the system to melt the DNA strands. In some embodiments, this step includes adding any regeneration solution as disclosed above and/or depositing any other chemical solution.

本明細書に記載されるように、試料分析物は、反応チャンバ表面をコーティングするコーティング分子と、試料分析物に付着したカップリング部分との間に形成される結合を介して反応チャンバ表面に固定されるように構成される。工程３４０は、カップリング部分と試料分析物との間の結合を破壊し、それによって、分析物が反応チャンバ表面にもはや固定されないことを企図している。したがって、カップリング部分と試料分析物との間の共有結合を融解した後で、第１のアリコートの分析物は、動作３４５Ｂで反応チャンバの表面から放出され得る。放出された成分は、動作３４５Ｃで反応チャンバからフラッシングされ得る。一部の実施形態では、放出された成分は追加的および／または代替的に溶解され得る。 As described herein, the sample analyte is immobilized on the reaction chamber surface via bonds formed between coating molecules coating the reaction chamber surface and coupling moieties attached to the sample analyte. configured to be used. Step 340 contemplates breaking the bond between the coupling moiety and the sample analyte, such that the analyte is no longer immobilized on the reaction chamber surface. Accordingly, after melting the covalent bond between the coupling moiety and the sample analyte, the first aliquot of analyte may be released from the surface of the reaction chamber in operation 345B. The released components may be flushed from the reaction chamber in operation 345C. In some embodiments, the released components may additionally and/or alternatively be dissolved.

集積デバイスの反応チャンバから第１のアリコートを除去した後、工程３４０は動作３４６に進むことができる。動作３４６では、集積デバイスの反応チャンバは、試料の第２のアリコートを再負荷され得る。第２のアリコートの分析物は、反応チャンバ内に存在する残りのコーティング分子にカップリング部分を介して結合することができる。動作３４６の後、第２のアリコートの分析物を試料採取することができる。カップリング部分－分析物の結合を融解するための技術を介して集積デバイスを負荷および除荷する上記の処理は、要求に応じて繰り返すことができる。 After removing the first aliquot from the reaction chamber of the integrated device, process 340 can proceed to operation 346. In operation 346, the reaction chamber of the integration device may be reloaded with a second aliquot of sample. The second aliquot of analyte can be coupled via the coupling moiety to the remaining coating molecules present within the reaction chamber. After operation 346, a second aliquot of analyte may be sampled. The above process of loading and unloading the integration device via techniques to melt the coupling moiety-analyte bond can be repeated as required.

一部の実施形態では、試料分析物とカップリング部分との間の結合を融解する工程は、分析物と、複数の種類のカップリング部分、例えば、第１および第２のカップリング部分との間の結合を融解する工程を含む。一部の実施形態では、第１および第２のカップリング部分は異なる。一部の実施形態では、第１のカップリング部分はビオチン部分であり、第２のカップリング部分はビオチン部分ではない（例えば、ＳＮＡＰタグまたはアジド部分である）。 In some embodiments, melting the bond between the sample analyte and the coupling moiety includes bonding the analyte with more than one type of coupling moiety, e.g., a first and a second coupling moiety. and melting the bonds between them. In some embodiments, the first and second coupling portions are different. In some embodiments, the first coupling moiety is a biotin moiety and the second coupling moiety is not a biotin moiety (eg, a SNAP tag or an azide moiety).

集積デバイスから試料の一部を除去するための技術の有効性を、例えば、図４Ａ～４Ｊに示されるように、本明細書でさらに実証する。特に、図４Ａ～４Ｊは、コーティング分子とカップリング部分との間の結合を破壊するためのチップ再生技術を使用して蓄積されたデータを示す。以下のデータを生成した実験で使用した再生溶液は、酢酸アンモニウム、水、および１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）を含む。特に、再生溶液は、９ｍＬのＨＦＩＰ、０．５ｍＬの５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＬの水、および１００μＭから２００μＭの間の濃度のビオチン－ＰＥＧ_３を含有する。 The effectiveness of the technique for removing a portion of a sample from an integrated device is further demonstrated herein, as shown, for example, in FIGS. 4A-4J. In particular, FIGS. 4A-4J show data accumulated using a chip regeneration technique to break the bond between the coating molecule and the coupling moiety. The regeneration solution used in the experiment that generated the following data contained ammonium acetate, water, and 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP). Specifically, the regeneration solution contains 9 mL HFIP, 0.5 mL 5M ammonium acetate, 1 mL water, and biotin-PEG ₃ at a concentration between 100 μM and 200 μM.

図４Ａ～Ｄは、一部の実施形態による、チップの負荷および再生の処理の間に得られた分析物の存在を示す例示的なグラフを示す。例えば、図４Ａを挙げると、連続する３つのグラフ４１１～４１３が示される。グラフ４１１は、集積デバイスの反応チャンバに分析物が９３．６％負荷されているときのシグナル取得を示す。グラフ４１２は、本明細書に記載される破壊技術（２２．５％負荷での）に従って分析物を反応チャンバから除去してから１５分後に得られたシグナル取得を示す。グラフ４１３は、集積デバイスの反応チャンバに６８％の負荷で追加の試料を再負荷した後のシグナル取得を示す。 4A-D depict exemplary graphs showing the presence of analytes obtained during chip loading and regeneration processing, according to some embodiments. For example, referring to FIG. 4A, three consecutive graphs 411-413 are shown. Graph 411 shows signal acquisition when the reaction chamber of the integrated device is 93.6% loaded with analyte. Graph 412 shows signal acquisition obtained 15 minutes after removing analyte from the reaction chamber according to the disruption technique described herein (at 22.5% load). Graph 413 shows signal acquisition after reloading the reaction chamber of the integrated device with additional sample at 68% loading.

図４Ｂ～４Ｄは、集積デバイスを負荷および除荷する処理の間に得られた分析物の存在を示すさらなる例示的なグラフを示す。図４Ｂに示されるように、グラフ４２１は、第１の負荷を５８．７％の負荷で実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４２２は、その後の除荷を（８．５％の負荷で）実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４２３は、第２の負荷を２７．７％の負荷で実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４２４は、その後の除荷を（３．８％の負荷で）実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４２５は、第３の再負荷を２３．４％の負荷で実施した後のシグナル取得を示す。図４Ｃに示されるように、グラフ４３１は、第１の負荷を３０．４％の負荷で実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４３２は、その後の除荷を（１３．８％のパーセントの負荷で）実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４３３は、第２の負荷を５７．７％の負荷で実施した後のシグナル取得を示す。図４Ｄに示されるように、グラフ４４１は、第１の負荷を２７．９％の負荷で実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４４２は、その後の除荷を（７．２％の負荷で）実施した後のシグナル取得を示し、グラフ４４３は、第２の負荷を６４．９％の負荷で実施した後のシグナル取得を示す。 4B-4D show additional exemplary graphs showing the presence of analytes obtained during the process of loading and unloading the integrated device. As shown in FIG. 4B, graph 421 shows the signal acquisition after performing the first loading at 58.7% load, and graph 422 shows the subsequent unloading (at 8.5% load). ), graph 423 shows the signal acquisition after performing the second load with a load of 27.7%, and graph 424 shows the signal acquisition after performing a subsequent unloading with a load of (3.8%). Graph 425 shows the signal acquisition after performing the third reload at 23.4% load. As shown in FIG. 4C, graph 431 shows the signal acquisition after performing the first loading with a load of 30.4%, and graph 432 shows the subsequent unloading (with a percentage of 13.8%). Graph 433 shows the signal acquisition after performing the second load at 57.7% load. As shown in FIG. 4D, graph 441 shows the signal acquisition after performing the first loading at 27.9% load, and graph 442 shows the subsequent unloading (at 7.2% load). Graph 443 shows the signal acquisition after implementing the second load at 64.9% load.

図４Ｅは、一部の実施形態による、高速液体クロマトグラフィーを使用して得られた、異なる条件下で再生溶液に浸漬された試料のスペクトルを示す。特に、曲線４５１は、最初に水で希釈し、続いて剥離緩衝液と混合した試料からのシグナル取得を示し、曲線４５２は、剥離緩衝液と１０分間インキュベートし、続いて水で希釈した試料からのシグナル取得を示し、曲線４５３は、剥離緩衝液と５０分間インキュベートし、続いて水で希釈した試料からのシグナル取得を示す。 FIG. 4E shows spectra of samples immersed in regeneration solution under different conditions obtained using high performance liquid chromatography, according to some embodiments. In particular, curve 451 shows signal acquisition from a sample that was first diluted with water and then mixed with stripping buffer, and curve 452 is from a sample that was incubated with stripping buffer for 10 minutes and then diluted with water. Curve 453 shows the signal acquisition from a sample incubated with stripping buffer for 50 minutes and subsequently diluted with water.

図４Ｆは、一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に集積デバイスの反応チャンバから取得したシグナルを示す例示的なグラフを示す。特に、第１のグラフは、除荷の間に集積デバイスに送達される認識パルスに応答したシグナル取得を示す。第２のグラフは、第１の再生工程および負荷工程後のシグナル取得を示す。第３のグラフは、集積デバイスの追加の負荷後のシグナル取得を示す。第４のグラフは、集積デバイスの除荷および再生後のシグナル取得を示す。 FIG. 4F shows an exemplary graph showing signals obtained from a reaction chamber of an integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments. In particular, the first graph shows signal acquisition in response to recognition pulses delivered to the integration device during unloading. The second graph shows signal acquisition after the first regeneration step and loading step. The third graph shows the signal acquisition after additional loading of the integrated device. The fourth graph shows signal acquisition after unloading and regeneration of the integrated device.

図４Ｇ～４Ｉは、一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に集積デバイスの反応チャンバから取得したシグナルを示す追加の例示的なグラフを示す。図４Ｇに示されるように、グラフ４６１Ａおよび４６１Ｂは、２８％の試料を負荷した集積デバイスの反応チャンバからのシグナル取得を示す。グラフ４６２Ａおよび４６２Ｂは、７％の試料を負荷した集積デバイスの反応チャンバからのシグナル取得を示す。グラフ４６３Ａおよび４６３Ｂは、６５％の試料を負荷した集積デバイスの反応チャンバからのシグナル取得を示す。 4G-4I depict additional exemplary graphs showing signals obtained from a reaction chamber of an integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments. As shown in FIG. 4G, graphs 461A and 461B show signal acquisition from the reaction chamber of an integrated device loaded with 28% sample. Graphs 462A and 462B show signal acquisition from the reaction chamber of an integrated device loaded with 7% sample. Graphs 463A and 463B show signal acquisition from the reaction chamber of an integrated device loaded with 65% sample.

図４Ｊは、一部の実施形態による、再生工程と負荷工程との間に集積デバイスの反応チャンバから取得したシグナルを示す追加の例示的なグラフを示す。特に、グラフの第１の行は、集積デバイスの第１の試料負荷後のシグナル取得を示し、グラフの第２の行は、集積デバイスの第１の除荷後のシグナル取得を示し、グラフの第３の行は、集積デバイスの再負荷後のシグナル取得を示す。 FIG. 4J shows additional exemplary graphs showing signals obtained from a reaction chamber of an integrated device during a regeneration step and a loading step, according to some embodiments. In particular, the first row of the graph shows the signal acquisition after the first sample loading of the integrating device, the second row of the graph shows the signal acquisition after the first unloading of the integrating device, and the second row of the graph shows the signal acquisition after the first unloading of the integrating device, The third row shows the signal acquisition after reloading the integrated device.

ＩＶ．チップ再利用技術に関する態様
本発明者らは、本明細書に記載されるチップ再利用技術と組み合わせて使用できるさらなる技術をさらに開発した。例えば、図５Ａは、一部の実施形態による、図１の集積デバイスのチャンバ内に試料が存在するかどうかを判定するための例示的な処理である。本発明者らは、集積デバイスに追加の試料を負荷する前に、本明細書に記載される除荷技術が首尾良く実施されたかどうかを判定することが有利であることを認識した。 IV. Aspects Related to Chip Reuse Techniques The inventors have further developed additional techniques that can be used in combination with the chip reuse techniques described herein. For example, FIG. 5A is an exemplary process for determining whether a sample is present within the chamber of the integrated device of FIG. 1, according to some embodiments. The inventors have recognized that it is advantageous to determine whether the unloading techniques described herein have been successfully performed before loading additional samples to the integration device.

図５Ａに示される工程５００は動作５０２から始まり、試料の第１の部分が集積デバイスの反応チャンバから除去される。例えば、動作５０２は、本明細書に記載される集積デバイスの反応チャンバから試料を除去するための技術のいずれかに従って実施され得る。試料の第１の部分は、複数のアリコートに分割された試料の第１のアリコートを含み得る。 The process 500 shown in FIG. 5A begins with operation 502, in which a first portion of a sample is removed from a reaction chamber of an integrated device. For example, operation 502 may be performed according to any of the techniques for removing a sample from a reaction chamber of an integrated device described herein. The first portion of the sample may include a first aliquot of the sample divided into a plurality of aliquots.

集積デバイスから試料の第１の部分を除去した後、認識処理を実施することができ、それによって動作５０２において、励起光の認識パルスを使用して、集積デバイスの反応チャンバ内に試料が残っているかどうか、または試料が十分に除去されているかどうかを判定する。したがって、動作５０４において、少なくとも１つの光源からの励起光が集積デバイスの反応チャンバに送達される。 After removing the first portion of the sample from the integration device, a recognition process can be performed such that in operation 502, a recognition pulse of excitation light is used to determine whether the sample remains within the reaction chamber of the integration device. or whether the sample has been sufficiently removed. Accordingly, in operation 504, excitation light from at least one light source is delivered to a reaction chamber of the integrated device.

動作５０２の後に試料の第１の部分の分析物が反応チャンバ内に残っている場合、残っている分析物および／またはそれに付着した蛍光標識は、動作５０４において少なくとも１つの光源からの励起光の送達に応答して励起され得る。励起された分析物および／またはそれに付着した蛍光標識は、励起に応答して光子を放出し、その光子は動作５０４において集積デバイスの光検出領域によって収集され得る。さらに、コーティング分子、カップリング部分、および／またはそれに付着した蛍光標識は、励起光に応答してシグナルを放出し得る。したがって、一部の実施形態では、集積デバイスの光検出領域によって反応チャンバから受信されたいずれかのシグナルを使用して、いずれかのコーティング分子および／またはカップリング部分が集積デバイスの反応チャンバ内に存在するかどうかを判定することができる。 If analytes in the first portion of the sample remain in the reaction chamber after operation 502, the remaining analytes and/or fluorescent labels attached thereto are exposed to excitation light from at least one light source in operation 504. can be excited in response to delivery. The excited analyte and/or the fluorescent label attached thereto emits photons in response to the excitation, which can be collected by the photodetection region of the integrated device in operation 504. Furthermore, the coating molecule, the coupling moiety, and/or the fluorescent label attached thereto can emit a signal in response to excitation light. Accordingly, in some embodiments, any signals received from the reaction chamber by the photodetection region of the integrated device are used to cause any coating molecules and/or coupling moieties to be detected within the reaction chamber of the integrated device. You can determine whether it exists.

動作５０８では、試料の第１の部分のいずれかが、動作５０６で収集されたシグナルに基づいて集積デバイスの反応チャンバ内に存在するかどうかが判定される。例えば、放出されたシグナルは、分析物、コーティング分子、カップリング部分および／またはシグナルが放出されたものに付着した蛍光標識に関する情報（例えば、発光強度、発光寿命、波長、パルス持続時間、パルス間隔持続時間）を含み得る。集積デバイスは、何かあれば、反応チャンバ内に何が存在するかを判定するために放出情報を使用するように構成され得る。 In operation 508, it is determined whether any of the first portion of the sample is present within the reaction chamber of the integrated device based on the signal collected in operation 506. For example, the emitted signal may contain information about the analyte, the coating molecule, the coupling moiety, and/or the fluorescent label attached to the thing from which the signal was emitted (e.g., emission intensity, emission lifetime, wavelength, pulse duration, pulse interval). duration). The integrated device may be configured to use the emission information to determine what, if anything, is present within the reaction chamber.

動作５０８において、試料の第１の部分の少なくとも一部が依然として反応チャンバ内に存在すると判定された場合、工程５００は、是の分岐を通って動作５０２に進むことができ、試料の第１の部分を反応チャンバから除荷するための除去処理が繰り返される。一部の実施形態では、是の分岐を通って動作５０２に戻ったときに実施される除去処理は、工程５００の開始時に実施される最初の除去処理とは異なり得る。 If it is determined in operation 508 that at least a portion of the first portion of the sample is still present within the reaction chamber, the process 500 may proceed through another branch to operation 502, in which the first portion of the sample is The removal process is repeated to unload the portion from the reaction chamber. In some embodiments, the removal process performed upon returning through this branch to operation 502 may be different from the initial removal process performed at the beginning of process 500.

動作５０８において、動作５０６で収集されたシグナルに基づいて、試料の第１の部分が反応チャンバ内にもはや存在しないと判定された場合、工程５００は、是の分岐を通って動作５１０に進むことができ、試料の第２の部分が集積デバイスの反応チャンバに負荷される。試料の第２の部分は、試料が分割された複数のアリコートの第２のアリコートを含み得る。 If, in operation 508, it is determined that the first portion of the sample is no longer present in the reaction chamber based on the signal collected in operation 506, the process 500 proceeds through a branch to operation 510. A second portion of the sample is loaded into the reaction chamber of the integrated device. The second portion of the sample may include a second aliquot of the plurality of aliquots into which the sample was divided.

したがって、工程５００は、追加の試料による集積デバイスの再負荷がいつ実施されるべきかを判定するために使用され得る。本明細書に記載されるように、本発明者らは、新しく負荷された分析物が試料採取されるときに反応チャンバ内に存在する以前に試料採取された分析物が、新たに負荷された分析物からのシグナル収集を妨げる場合があることを認識した。したがって、工程５００は、以前に試料採取された分析物が、集積デバイスの再負荷に進む前に十分に除去されたことを確認するために使用され得る。 Accordingly, step 500 may be used to determine when reloading the integration device with additional samples should be performed. As described herein, we discovered that previously sampled analytes present in the reaction chamber when newly loaded analytes are sampled are It was recognized that this may interfere with signal collection from the analyte. Accordingly, step 500 may be used to ensure that previously sampled analytes have been sufficiently removed before proceeding to reload the collection device.

一部の実施形態では、動作５０８において、試料の第１の部分が反応チャンバ内に存在するかどうかを判定する工程は、反応チャンバ内に残っている第１の試料の量を決定する工程を含む。このような実施形態では、決定された量を閾値と比較することができる。決定された量が閾値を下回る場合、工程５００は動作５１０に進むことができ、追加の試料が集積デバイスの反応チャンバに負荷される。代わりに、動作５０８において、決定された量が閾値を下回っていない場合、工程５００は、追加の試料を反応チャンバに負荷することを中止することができる。 In some embodiments, in operation 508, determining whether the first portion of the sample is present in the reaction chamber includes determining the amount of the first sample remaining in the reaction chamber. include. In such embodiments, the determined amount may be compared to a threshold value. If the determined amount is below the threshold, the process 500 can proceed to operation 510, where additional sample is loaded into the reaction chamber of the integrated device. Alternatively, in operation 508, if the determined amount is not below the threshold, the process 500 may cease loading additional sample into the reaction chamber.

本明細書に記載されるように、動作５０６で収集されたシグナルは、反応チャンバ内のコーティング分子および／またはカップリング部分の存在を判定するために使用され得る。このような実施形態では、収集されたシグナルは、例えば、試料の第２の部分を集積デバイスの反応チャンバに負荷する前に、追加のコーティング分子および／またはカップリング部分を集積デバイスの反応チャンバに負荷するかどうかを判定するために使用され得る。 As described herein, the signals collected in operation 506 can be used to determine the presence of coating molecules and/or coupling moieties within the reaction chamber. In such embodiments, the collected signal may be used, for example, to apply additional coating molecules and/or coupling moieties to the reaction chamber of the integration device before loading the second portion of the sample into the reaction chamber of the integration device. It can be used to determine whether to load or not.

本発明者らは、複数のアリコートに分割された試料の後続のアリコートの試料採取を継続するかどうかを判定するための、本明細書に記載されるチップ再利用技術と組み合わせて使用できる技術をさらに開発した。例えば、本発明者らは、一部の試料は目的の情報を含み得るが、他の試料は完全に試料採取する必要がないことを認識した。したがって、試料に関する情報は、試料の複数のアリコートの第１のアリコートから収集され、試料の第２のアリコートを集積デバイスに負荷することによって試料の処理を継続するかどうかを判定するために使用され得る。 We developed a technique that can be used in combination with the chip reuse technique described herein to determine whether to continue sampling subsequent aliquots of a sample that has been divided into multiple aliquots. further developed. For example, the inventors have recognized that some samples may contain information of interest, while other samples do not need to be sampled completely. Information about the sample is thus collected from a first aliquot of the plurality of aliquots of the sample and used to determine whether to continue processing the sample by loading a second aliquot of the sample into the collection device. obtain.

例えば、図５Ｂは、一部の実施形態による、図１Ａの集積デバイスを用いて試料の処理を継続するかどうかを判定するための例示的な処理である。図５Ｂに示される工程５００は、動作５２２から始まり、試料の第１の部分が集積デバイスの反応チャンバに負荷される。例えば、試料の第１の部分は、試料の第１のアリコートを含んでもよく、試料は複数のアリコートに分割されている。試料の第１の部分は、試料採取される複数の分析物を含んでもよい。分析物は、カップリング部分と、反応チャンバの表面をコーティングするコーティング分子との間の結合を介して反応チャンバの表面に分析物を固定するために、本明細書に記載されるカップリング部分に結合することができる。一部の実施形態では、分析物は蛍光色素で標識されてもよい。 For example, FIG. 5B is an exemplary process for determining whether to continue processing a sample using the integrated device of FIG. 1A, according to some embodiments. The process 500 shown in FIG. 5B begins with operation 522, where a first portion of a sample is loaded into a reaction chamber of an integrated device. For example, the first portion of the sample may include a first aliquot of the sample, where the sample is divided into a plurality of aliquots. The first portion of the sample may include multiple analytes to be sampled. The analyte is attached to the coupling moiety described herein to immobilize the analyte on the surface of the reaction chamber via a bond between the coupling moiety and a coating molecule that coats the surface of the reaction chamber. Can be combined. In some embodiments, the analyte may be labeled with a fluorescent dye.

動作５２４～５２６では、動作５２２で反応チャンバに負荷された試料の第１の部分が試料採取され得る。例えば、動作５２４において、少なくとも１つの光源からの励起光が、集積デバイスの反応チャンバ内に存在している間に試料の第１の部分に送達され得る。結果として、試料の第１の部分の分析物および／またはそれに付着した蛍光標識が励起され、動作５２６で集積デバイスの光検出領域によって収集された光子を放出することができる。 In acts 524-526, a first portion of the sample loaded into the reaction chamber in act 522 may be sampled. For example, in operation 524, excitation light from at least one light source may be delivered to the first portion of the sample while within the reaction chamber of the integrated device. As a result, the analyte in the first portion of the sample and/or the fluorescent label attached thereto may be excited and emit photons that are collected by the photodetection region of the integrated device at operation 526.

動作５２８では、動作５２６で収集されたシグナルに基づいて、試料の第２の部分を集積デバイスの反応チャンバに負荷するかどうかが判定される。例えば、本明細書に記載されるように、放出シグナルは、特徴的な強度、波長、発光寿命、パルス持続時間、パルス間持続時間等の、集積デバイスによって抽出され得る情報を含むことができる。一部の実施形態では、抽出された情報は、試料の第１の部分に存在する分析物の同一性を決定するために使用され得る。分析物の同一性に基づいて、全体として試料が目的のものであり、試料の追加のアリコートのさらなる処理が望ましいことを判定することができる。そのような場合、工程５２０は、是の分岐を通って動作５３０に進むことができる。 In operation 528, it is determined whether to load a second portion of the sample into the reaction chamber of the integration device based on the signal collected in operation 526. For example, as described herein, the emitted signal can include information that can be extracted by an integrated device, such as characteristic intensity, wavelength, emission lifetime, pulse duration, interpulse duration, etc. In some embodiments, the extracted information may be used to determine the identity of the analyte present in the first portion of the sample. Based on the identity of the analyte, it can be determined that the sample as a whole is of interest and that further processing of additional aliquots of the sample is desired. In such a case, step 520 may proceed through another branch to operation 530.

他の例では、分析物の決定された同一性に基づいて、全体として試料が目的のものではないこと、ならびに時間および他のリソースを試料のさらなる処理に費やす必要がないことを判定することができる。したがって、動作５２８で、試料の第２の部分を負荷しないと判定された場合、工程５２０は、否の分岐を通って動作５３２に進むことができる。動作５３２において、ユーザは、試料の第２の部分を集積デバイスの反応チャンバに負荷することを中止することができる。代わりに、試料の第１の部分は、集積デバイスの反応チャンバから除去されてもよい。一部の実施形態では、動作５３２で、第２の追加の試料の第１の部分が、試料採取のために集積デバイスの反応チャンバに負荷され得る。一部の実施形態では、集積デバイスのセンサチップが追加的または代替的に処分されてもよい。 In other examples, based on the determined identity of the analyte, it may be determined that the sample as a whole is not of interest and that time and other resources need not be spent on further processing the sample. can. Accordingly, if in operation 528 it is determined not to load the second portion of the sample, step 520 may proceed through the no branch to operation 532. In operation 532, the user may cease loading the second portion of the sample into the reaction chamber of the integration device. Alternatively, the first portion of the sample may be removed from the reaction chamber of the integrated device. In some embodiments, at operation 532, a first portion of a second additional sample may be loaded into the reaction chamber of the integration device for sample collection. In some embodiments, the sensor chip of the integrated device may additionally or alternatively be disposed of.

動作５２８において、試料の第２の部分が負荷されるべきであると判定された場合、工程５２０は、是の分岐を通って動作５３０に進むことができ、例えば本明細書に記載される技術のいずれかに従って、試料の第１の部分が除去され、試料の第２の部分が集積デバイスの反応チャンバに負荷される。動作５３０に続いて、試料の第２の部分が処理される動作５２４に戻ることによって、工程５２０を要求に応じて繰り返すことができる。 If, in operation 528, it is determined that the second portion of the sample is to be loaded, then step 520 can proceed through another branch to operation 530, e.g., using the techniques described herein. A first portion of the sample is removed and a second portion of the sample is loaded into the reaction chamber of the integrated device. Following operation 530, step 520 can be repeated as desired by returning to operation 524, where a second portion of the sample is processed.

Ｖ．チップの寿命の増加
本明細書に記載されるように、本発明者らは、集積デバイスを複数の実験に再利用する際に、センサチップの長期間の使用により集積デバイスのコンポーネントが劣化する場合があることを認識した。したがって、本明細書に記載される技術の一部の態様は、集積デバイスの使用寿命を増加させるための技術に関する。例えば、集積デバイスのコンポーネントは、反応チャンバを再生溶液に繰り返し浸漬することにより腐食を受けやすくなる場合がある。したがって、一部の実施形態では、集積デバイスのコンポーネントは、そのような劣化に耐えるように構成され得る（例えば、耐食性コーティング等を含む）。一部の実施形態では、集積デバイスのコンポーネントは、チップおよび／またはフローセルの逐次再生によって生じ得るシークエンシングワークフローによって生成される発光シグナルとの干渉に耐えるように構成され得る。 V. Increased Chip Lifetime As described herein, the inventors have demonstrated that when reusing an integrated device for multiple experiments, if long-term use of the sensor chip degrades the components of the integrated device. I realized that there is. Accordingly, some aspects of the technology described herein relate to techniques for increasing the useful life of integrated devices. For example, components of an integrated device may become susceptible to corrosion due to repeated immersion of the reaction chamber in a regeneration solution. Accordingly, in some embodiments, components of the integrated device may be configured to resist such degradation (e.g., include corrosion-resistant coatings, etc.). In some embodiments, components of the integrated device may be configured to withstand interference with luminescent signals generated by the sequencing workflow, which may result from sequential regeneration of the chip and/or flow cell.

例えば、一部の実施形態では、集積デバイスチップの寿命の増加は、集積デバイスの反応チャンバの表面コーティングの安定性を維持することによって可能となり得る。集積デバイスの反応チャンバの表面コーティングの安定性を維持するための適切な技術の例は、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００６６ＵＳ０１の下で、「気相における表面改質（ＳＵＲＦＡＣＥＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＩＮＴＨＥＶＡＰＯＲＰＨＡＳＥ）」と題する２０２０年１０月９日に出願された米国特許出願第１７／０６７，１８４号に記載されており、その全体を本願明細書に援用する。一部の実施形態では、本明細書に記載される再生溶液のＰＨ値は、反応チャンバ表面コーティングの安定性を増加させるために７に維持され得る。 For example, in some embodiments, increasing the lifetime of an integrated device chip may be enabled by maintaining the stability of the surface coating of the reaction chamber of the integrated device. An example of a suitable technique for maintaining the stability of the surface coating of the reaction chamber of an integrated device is "SURFACE MODIFICATION IN THE VAPOR PHASE" under Attorney Docket No. R0708.70066US01. No. 17/067,184, filed October 9, 2020, which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the PH value of the regeneration solution described herein may be maintained at 7 to increase the stability of the reaction chamber surface coating.

ＶＩ．追加のデバイスコンポーネント
一部の態様によれば、本明細書に記載される集積デバイスは、１つまたは複数の追加のコンポーネントを有するように構成され得る。例えば、図６Ａは、一部の実施形態による、コンパクトなモードロックレーザモジュールを含む分析機器のブロック図である。図６Ａに示されるように、ポータブル先端分析機器６－１００は、機器６－１００内に交換可能なモジュールとして取り付けられるか、またはそうでなければ機器６－１００に結合される１つまたは複数のパルス光源６－１０６を備えることができる。ポータブル分析機器６－１００は、光結合システム６－１１５および分析システム６－１６０を含むことができる。光結合システム６－１１５は、光学部品のいくつかの組合せ（例えば、以下の部品：レンズ、ミラー、光フィルタ、減衰器、ビームステアリング部品、ビーム整形部品のどれも含まなくてもよいか、それらの中から１つ、またはそれらの中から１つより多い部品を含んでもよい）を含むことができ、パルス光源６－１０６からの出力光パルス６－１２２に作用し、かつ／またはパルス光源６－１０６からの出力光パルス６－１２２を分析機器６－１６０に結合するように構成され得る。分析システム６－１６０は、試料分析のために光パルスを少なくとも１つの反応チャンバに導き、少なくとも１つの反応チャンバから１つまたは複数の光信号（例えば、蛍光、後方散乱線）を受信し、受信した光信号を表す１つまたは複数の電気信号を生成するように構成される複数のコンポーネントを含むことができる。一部の実施形態では、分析システム６－１６０は、１つまたは複数の光検出器を含むことができ、また、光検出器からの電気信号を処理するように構成された信号処理電子機器（例えば、１つまたは複数のマイクロコントローラ、１つまたは複数のフィールドプログラマブルゲートアレイ、１つまたは複数のマイクロプロセッサ、１つまたは複数のデジタル信号プロセッサ、論理ゲート等）を含むこともできる。分析システム６－１６０はまた、外部デバイス（例えば、機器６－１００が１つまたは複数のデータ通信リンクを介して接続できるネットワーク上の１つまたは複数の外部デバイス）へ、およびその外部デバイスからデータを送信および受信するように構成されたデータ送信ハードウェアを含むこともできる。一部の実施形態では、分析システム６－１６０は、分析される１つまたは複数の試料を保持するバイオオプトエレクトロニクスチップ６－１４０を受け入れるように構成され得る。 VI. Additional Device Components According to some aspects, the integrated devices described herein may be configured to have one or more additional components. For example, FIG. 6A is a block diagram of an analytical instrument that includes a compact mode-locked laser module, according to some embodiments. As shown in FIG. 6A, the portable advanced analytical instrument 6-100 may be mounted as a replaceable module within the instrument 6-100 or otherwise coupled to the instrument 6-100. A pulsed light source 6-106 may be provided. Portable analytical instrument 6-100 can include an optical coupling system 6-115 and an analytical system 6-160. The optical coupling system 6-115 may include some combination of optical components (e.g., any of the following components: lenses, mirrors, optical filters, attenuators, beam steering components, beam shaping components, may include one or more components of the pulsed light source 6-106) and act on the output light pulses 6-122 from the pulsed light source 6-106 and/or -106 can be configured to couple output light pulses 6-122 from -106 to analytical instrument 6-160. The analysis system 6-160 directs light pulses to at least one reaction chamber for sample analysis and receives one or more light signals (e.g., fluorescence, backscatter radiation) from the at least one reaction chamber. may include a plurality of components configured to generate one or more electrical signals representative of the optical signals. In some embodiments, analysis system 6-160 can include one or more photodetectors and signal processing electronics configured to process electrical signals from the photodetectors ( For example, one or more microcontrollers, one or more field programmable gate arrays, one or more microprocessors, one or more digital signal processors, logic gates, etc.). Analysis system 6-160 also transmits data to and from external devices (e.g., one or more external devices on a network to which instrument 6-100 can connect via one or more data communication links). Data transmission hardware configured to transmit and receive data may also be included. In some embodiments, analysis system 6-160 may be configured to receive a bio-optoelectronic chip 6-140 that holds one or more samples to be analyzed.

図６Ｂは、コンパクトなパルス光源６－１０８を含むポータブル分析機器６－１００のさらに詳細な例を示す。この例では、パルス光源６－１０８は、コンパクトな受動的モードロックレーザモジュール６－１１３を備える。受動的モードロックレーザは、外部パルス信号の印加をせずに、自律的に光パルスを生成することができる。一部のインプリメンテーションでは、モジュールは機器のシャーシまたはフレーム６－１０３に取り付けることができ、機器の外側ケーシングの内側に配置することができる。一部の実施形態によれば、パルス光源６－１０６は、光源を操作し、光源６－１０６からの出力ビームに対して操作するために使用され得る追加のコンポーネントを含むことができる。モードロックレーザ６－１１３は、レーザの縦周波数モードの位相ロックを誘発する、レーザキャビティ内の、またはレーザキャビティに結合された要素（例えば、可飽和吸収体、音響光学変調器、カーレンズ）を備えることができる。レーザキャビティは、キャビティエンドミラー６－１１１、６－１１９によって部分的に画定することができる。このような周波数モードのロックは、レーザのパルス動作をもたらし（例えば、キャビティ内パルス６－１２０がキャビティエンドミラー間で往復する）、部分的に透過する一方のエンドミラー６－１１１から出力光パルス６－１２２のストリームを生成する。 FIG. 6B shows a more detailed example of a portable analytical instrument 6-100 that includes a compact pulsed light source 6-108. In this example, the pulsed light source 6-108 comprises a compact passive mode-locked laser module 6-113. Passively modelocked lasers can generate optical pulses autonomously without the application of an external pulse signal. In some implementations, the module can be attached to the chassis or frame 6-103 of the device and can be placed inside the outer casing of the device. According to some embodiments, the pulsed light source 6-106 may include additional components that may be used to operate the light source and operate on the output beam from the light source 6-106. A mode-locked laser 6-113 includes elements within or coupled to the laser cavity (e.g., saturable absorbers, acousto-optic modulators, Kerr lenses) that induce phase locking of the longitudinal frequency modes of the laser. You can prepare. The laser cavity may be partially defined by cavity end mirrors 6-111, 6-119. Such frequency mode locking results in pulsed operation of the laser (e.g., the intracavity pulse 6-120 is shuttled between the cavity end mirrors) and the output optical pulse from one end mirror 6-111 is partially transmitted. 6-122 streams are generated.

一部の場合、分析機器６－１００は、取り外し可能でパッケージ化されたバイオオプトエレクトロニクスまたはオプトエレクトロニクスチップ６－１４０（「使い捨てチップ」とも呼ばれる）を受け入れるように構成される。使い捨てチップは、例えば、複数の反応チャンバ、光励起エネルギーを反応チャンバに送達するように構成された集積光学部品、および反応チャンバからの蛍光発光を検出するように構成された集積光検出器を備えるバイオオプトエレクトロニクスチップを含むことができる。一部のインプリメンテーションでは、チップ６－１４０は、１回の使用後に使い捨てにすることができるが、他のインプリメンテーションでは、チップ６－１４０を２回以上再利用することができる。チップ６－１４０が機器６－１００によって受け取られると、それは、パルス光源６－１０６および分析システム６－１６０内の装置と電気的および光学的に通信することができる。電気通信は、例えば、チップパッケージ上の電気接点を通じて行われてもよい。 In some cases, the analytical instrument 6-100 is configured to accept a removable packaged bio-optoelectronic or optoelectronic chip 6-140 (also referred to as a "disposable chip"). The disposable chip may, for example, be a biological device comprising a plurality of reaction chambers, integrated optics configured to deliver optical excitation energy to the reaction chambers, and integrated photodetectors configured to detect fluorescence emission from the reaction chambers. It can include an optoelectronic chip. In some implementations, the tip 6-140 can be disposable after a single use, while in other implementations the tip 6-140 can be reused more than once. Once the chip 6-140 is received by the instrument 6-100, it can communicate electrically and optically with the pulsed light source 6-106 and devices within the analysis system 6-160. Electrical communication may occur, for example, through electrical contacts on the chip package.

一部の実施形態では、図６Ｂを参照すると、使い捨てチップ６－１４０は、追加の電子機器を含むことができるプリント回路基板（ＰＣＢ）等の電子回路基板６－１３０上に（例えば、ソケット接続を介して）取り付けることができる。例えば、ＰＣＢ６－１３０は、電力、１つまたは複数のクロック信号、および制御信号をオプトエレクトロニクスチップ６－１４０に提供するように構成された回路、ならびに反応チャンバから検出された蛍光発光を表す信号を受信するように構成された信号処理回路を含むことができる。オプトエレクトロニクスチップから戻されたデータは、機器６－１００上の電子機器によって部分的または全体的に処理され得るが、一部のインプリメンテーションでは、データはネットワーク接続を介して１つまたは複数の遠隔データプロセッサに送信され得る。ＰＣＢ６－１３０はまた、オプトエレクトロニクスチップ６－１４０の導波路に結合された光パルス６－１２２の光結合および電力レベルに関連するフィードバック信号をチップから受信するように構成された回路を含むこともできる。フィードバック信号は、光パルス６－１２２の出力ビームの１つまたは複数のパラメータを制御するために、パルス光源６－１０６および光学システム６－１１５の一方または両方に提供することができる。一部の場合、ＰＣＢ６－１３０は、光源および光源６－１０６における関連回路を操作するために、パルス光源６－１０６に電力を提供または経路指定することができる。 In some embodiments, referring to FIG. 6B, the disposable chip 6-140 is mounted on an electronic circuit board 6-130, such as a printed circuit board (PCB) that can include additional electronics (e.g., a socket connection). ) can be attached. For example, PCB 6-130 includes circuitry configured to provide power, one or more clock signals, and control signals to optoelectronic chip 6-140, as well as signals representative of fluorescence emissions detected from the reaction chamber. A signal processing circuit configured to receive may be included. Although the data returned from the optoelectronic chip may be processed in part or in whole by electronics on the device 6-100, in some implementations the data is processed via one or more network connections. may be transmitted to a remote data processor. PCB 6-130 may also include circuitry configured to receive a feedback signal from the chip related to the optical coupling and power level of the optical pulse 6-122 coupled to the waveguide of optoelectronic chip 6-140. can. Feedback signals may be provided to one or both of pulsed light source 6-106 and optical system 6-115 to control one or more parameters of the output beam of light pulses 6-122. In some cases, the PCB 6-130 can provide or route power to the pulsed light source 6-106 to operate the light source and associated circuitry in the light source 6-106.

一部の実施形態によれば、パルス光源６－１０６は、コンパクトなモードロックレーザモジュール６－１１３を備える。モードロックレーザは、利得媒体６－１０５（一部の実施形態では固体材料であり得る）、出力カプラ６－１１１、およびレーザキャビティエンドミラー６－１１９を備えることができる。モードロックレーザの光キャビティは、出力カプラ６－１１１およびエンドミラー６－１１９に結合することができる。レーザキャビティの光軸６－１２５は、レーザキャビティの長さを長くし、所望のパルス繰り返し率を提供するために、１つまたは複数の折り目（曲がり）を有することができる。パルス繰り返し率は、レーザキャビティの長さ（例えば、光パルスがレーザキャビティ内を往復する時間）によって決定される。 According to some embodiments, the pulsed light source 6-106 comprises a compact mode-locked laser module 6-113. The mode-locked laser may include a gain medium 6-105 (which may be a solid material in some embodiments), an output coupler 6-111, and a laser cavity end mirror 6-119. The optical cavity of the mode-locked laser can be coupled to an output coupler 6-111 and an end mirror 6-119. The optical axis 6-125 of the laser cavity can have one or more folds (bends) to increase the length of the laser cavity and provide the desired pulse repetition rate. The pulse repetition rate is determined by the length of the laser cavity (eg, the time the light pulse travels back and forth within the laser cavity).

一部の実施形態では、ビーム整形、波長選択、および／またはパルス形成のために、レーザキャビティ内に追加の光学素子（図６Ｂには示さず）が存在してもよい。一部の場合、エンドミラー６－１１９は、縦キャビティモードの受動的モードロックを誘導し、結果としてモードロックレーザのパルス動作をもたらす可飽和吸収ミラー（ＳＡＭ）を備える。モードロックレーザモジュール６－１１３は、利得媒体６－１０５を励起するためのポンプ源（例えば、レーザダイオード、図６Ｂには示さず）をさらに含むことができる。モードロックレーザモジュール６－１１３のさらなる詳細は、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００２５ＵＳ０１の下で２０１７年１２月１５日に出願された「コンパクトなモードロックレーザモジュール（ＣｏｍｐａｃｔＭｏｄｅ－ＬｏｃｋｅｄＬａｓｅｒＭｏｄｕｌｅ）」と題する米国特許出願第１５／８４４，４６９号に見出すことができ、これを本願明細書に援用する。 In some embodiments, additional optical elements (not shown in FIG. 6B) may be present within the laser cavity for beam shaping, wavelength selection, and/or pulse formation. In some cases, the end mirror 6-119 comprises a saturable absorption mirror (SAM) that induces passive mode-locking of the longitudinal cavity mode, resulting in pulsed operation of the mode-locked laser. The mode-locked laser module 6-113 may further include a pump source (eg, a laser diode, not shown in FIG. 6B) to pump the gain medium 6-105. Further details of the Mode-Locked Laser Module 6-113 are provided in the application entitled "Compact Mode-Locked Laser Module" filed on December 15, 2017 under Attorney Docket No. R0708.70025US01. No. 15/844,469, which is incorporated herein by reference.

レーザ６－１１３がモードロックされている場合、キャビティ内パルス６－１２０は、エンドミラー６－１１９と出力カプラ６－１１１との間を循環することができ、キャビティ内パルスの一部は出力カプラ６－１１１を介して出力パルス６－１２２として送信することができる。したがって、出力パルス６－１２２のトレーンは、キャビティ内パルス６－１２０がレーザキャビティ内の出力カプラ６－１１１とエンドミラー６－１１９との間で往復するときに出力カプラで検出することができる。 If the laser 6-113 is mode-locked, the intracavity pulse 6-120 can circulate between the end mirror 6-119 and the output coupler 6-111, with a portion of the intracavity pulse passing through the output coupler. 6-111 as an output pulse 6-122. Therefore, the train of output pulses 6-122 can be detected at the output coupler as intracavity pulse 6-120 shuttles between output coupler 6-111 and end mirror 6-119 within the laser cavity.

一部のインプリメンテーションによれば、ビームステアリングモジュール６－１５０は、パルス光源６－１０６から出力パルスを受信することができ、オプトエレクトロニクスチップ６－１４０の光カプラ（例えば、格子カプラ）上への光パルスの少なくとも位置および入射角を調整するように構成される。一部の場合、パルス光源６－１０６からの出力パルス６－１２２は、オプトエレクトロニクスチップ６－１４０上の光カプラにおけるビーム形状および／またはビーム回転を追加的または代替的に変更するために、ビームステアリングモジュール６－１５０によって操作され得る。一部のインプリメンテーションでは、ビームステアリングモジュール６－１５０は、光カプラ上への出力パルスのビームの集束および／または偏光調整をさらに提供することができる。ビームステアリングモジュールの一例は、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００１０ＵＳ０２の下で２０１６年５月２０日に出願された「パルスレーザおよび生物学的分析システム（ＰｕｌｓｅｄＬａｓｅｒａｎｄＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃＳｙｓｔｅｍ）」と題する米国特許出願第１５／１６１，０８８号に記載されており、これを本願明細書に援用する。ビームステアリングモジュールの別の例は、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００２４ＵＳ０１の下で２０１７年１２月１４日に出願され、「コンパクトなビーム成形およびステアリングアセンブリ（ＣｏｍｐａｃｔＢｅａｍＳｈａｐｉｎｇａｎｄＳｔｅｅｒｉｎｇＡｓｓｅｍｂｌｙ）」と題する別個の米国特許出願第１５／８４２，７２０号に記載されており、これを本願明細書に援用する。 According to some implementations, the beam steering module 6-150 can receive output pulses from the pulsed light source 6-106 and direct them onto an optical coupler (e.g., a grating coupler) of the optoelectronic chip 6-140. configured to adjust at least the position and angle of incidence of the light pulses. In some cases, the output pulses 6-122 from the pulsed light source 6-106 are used to additionally or alternatively modify the beam shape and/or beam rotation at an optical coupler on the optoelectronic chip 6-140. It may be operated by a steering module 6-150. In some implementations, the beam steering module 6-150 may further provide beam focusing and/or polarization adjustment of the output pulses onto the optical coupler. An example of a beam steering module is disclosed in U.S. Patent Application No. 1, entitled "Pulsed Laser and Bioanalytical System," filed on May 20, 2016 under attorney docket number R0708.70010US02. No. 15/161,088, which is incorporated herein by reference. Another example of a beam steering module is a separate application filed on December 14, 2017 under attorney docket number R0708.70024US01 and entitled “Compact Beam Shaping and Steering Assembly.” No. 15/842,720, herein incorporated by reference.

図６Ｃは、一部の実施形態による、１つまたは複数の導波路を介してパルスレーザによって光学的に励起され得る並列反応チャンバの例を示す。図６Ｃを参照すると、パルス光源からの出力パルス６－１２２は、例えば、バイオオプトエレクトロニクスチップ６－１４０上の１つまたは複数の光導波路６－３１２に結合され得る。一部の実施形態では、光パルスは、格子カプラ６－３１０を介して１つまたは複数の導波路に結合され得るが、一部の実施形態では、オプトエレクトロニクスチップ上の１つまたは複数の光導波路の端部への結合が使用され得る。一部の実施形態によれば、クワッド検出器６－３２０が、光パルス６－１２２のビームの格子カプラ６－３１０へのアラインメントを支援するために半導体基板６－３０５（例えば、シリコン基板）上に配置され得る。１つまたは複数の導波路６－３１２および反応チャンバまたは反応チャンバ６－３３０は、基板、導波路、反応チャンバ、および光検出器６－３２２の間に誘電体層（例えば、二酸化ケイ素層）を介在させて同じ半導体基板上に集積することができる。 FIG. 6C shows an example of parallel reaction chambers that can be optically excited by a pulsed laser via one or more waveguides, according to some embodiments. Referring to FIG. 6C, output pulses 6-122 from a pulsed light source may be coupled to one or more optical waveguides 6-312 on a bio-optoelectronic chip 6-140, for example. In some embodiments, the light pulses may be coupled to one or more waveguides via a grating coupler 6-310, while in some embodiments the light pulses may be coupled to one or more waveguides on an optoelectronic chip. Coupling to the ends of the wavepath may be used. According to some embodiments, a quad detector 6-320 is mounted on a semiconductor substrate 6-305 (e.g., a silicon substrate) to assist in aligning the beam of light pulses 6-122 to the grating coupler 6-310. can be placed in The one or more waveguides 6-312 and the reaction chamber or reaction chamber 6-330 include a dielectric layer (e.g., a silicon dioxide layer) between the substrate, the waveguide, the reaction chamber, and the photodetector 6-322. They can be interposed and integrated on the same semiconductor substrate.

各導波路６－３１２は、導波路に沿って反応チャンバに結合される光パワーを均質化するために、反応チャンバ６－３３０の下にテーパ部分６－３１５を含むことができる。テーパの減少により、より多くの光エネルギーが導波路のコアの外側に強制的に進められ、反応チャンバへの結合が増加し、反応チャンバへの光結合の損失を含む、導波路に沿った光損失を補償することができる。第２の格子カプラ６－３１７は、光エネルギーを集積フォトダイオード６－３２４に導くために各導波路の端部に配置することができる。集積フォトダイオードは、導波路の下方で結合された電力量を検出し、検出された信号を、例えば、ビームステアリングモジュール６－１５０を制御するフィードバック回路に提供することができる。 Each waveguide 6-312 can include a tapered portion 6-315 below the reaction chamber 6-330 to homogenize the optical power coupled into the reaction chamber along the waveguide. The reduced taper forces more optical energy to travel outside the core of the waveguide, increasing coupling into the reaction chamber and reducing the amount of light along the waveguide, including loss of optical coupling to the reaction chamber. losses can be compensated. A second grating coupler 6-317 can be placed at the end of each waveguide to direct optical energy to an integrated photodiode 6-324. An integrated photodiode can detect the amount of power coupled down the waveguide and provide a detected signal to a feedback circuit that controls the beam steering module 6-150, for example.

反応チャンバ６－３３０または反応チャンバ６－３３０は、導波路のテーパ部分６－３１５とアラインメントされ、タブ６－３４０に埋め込まれ得る。各反応チャンバ６－３３０についての半導体基板６－３０５上に光検出器６－３２２を配置することができる。一部の実施形態では、半導体吸収体（図６－５では光フィルタ６－５３０として示される）が、各ピクセルにおいて導波路と光検出器６－３２２との間に配置され得る。金属コーティングおよび／または多層コーティング６－３５０を、反応チャンバの周囲および導波路の上に形成して、反応チャンバ内にない（例えば、反応チャンバの上の溶液中に分散している）フルオロフォアの光励起を阻止することができる。金属コーティングおよび／または多層コーティング６－３５０は、各導波路の入力端部および出力端部における導波路６－３１２内の光エネルギーの吸収損失を低減するために、タブ６－３４０の端を越えて高くなっていてもよい。 Reaction chamber 6-330 or reaction chamber 6-330 may be aligned with waveguide tapered portion 6-315 and embedded in tab 6-340. A photodetector 6-322 can be placed on the semiconductor substrate 6-305 for each reaction chamber 6-330. In some embodiments, a semiconductor absorber (shown as optical filter 6-530 in FIG. 6-5) may be placed between the waveguide and photodetector 6-322 at each pixel. A metallic coating and/or multilayer coating 6-350 is formed around the reaction chamber and over the waveguide to contain fluorophores that are not within the reaction chamber (e.g., dispersed in a solution above the reaction chamber). Photoexcitation can be blocked. A metallic coating and/or multilayer coating 6-350 extends beyond the ends of the tabs 6-340 to reduce absorption loss of optical energy within the waveguides 6-312 at the input and output ends of each waveguide. It may be higher.

オプトエレクトロニクスチップ６－１４０上には、複数の行の導波路、反応チャンバ、および時間ビニング光検出器が存在し得る。例えば、一部のインプリメンテーションでは、各々が５１２個の反応チャンバを有する１２８個の行があり、合計６５，５３６個の反応チャンバがあってもよい。他のインプリメンテーションは、より少ないまたはより多くの反応チャンバを含んでもよく、他のレイアウト構成を含んでもよい。パルス光源６－１０６からの光パワーは、チップ６－１４０に対する光カプラ６－３１０と複数の導波路６－３１２との間に位置する、１つもしくは複数のスターカプラもしくはマルチモード干渉カプラを介して、または任意の他の手段によって、複数の導波路に分配することができる。 There may be multiple rows of waveguides, reaction chambers, and time-binning photodetectors on the optoelectronic chip 6-140. For example, in some implementations there may be 128 rows with 512 reaction chambers each for a total of 65,536 reaction chambers. Other implementations may include fewer or more reaction chambers and may include other layout configurations. Optical power from the pulsed light source 6-106 is routed through one or more star couplers or multimode interference couplers located between the optical coupler 6-310 and the plurality of waveguides 6-312 to the chip 6-140. or by any other means to multiple waveguides.

反応チャンバ６－３３０内で起こる生物学的反応の非限定的な例を図６Ｄに示す。この例は、標的核酸に相補的な伸長鎖へのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの逐次的な取り込みを示す。逐次的な取り込みは反応チャンバ６－３３０内で行うことができ、ＤＮＡをシークエンシングするための先端分析機器によって検出することができる。反応チャンバは、約１５０ｎｍから約２５０ｎｍの間の深さ、および約８０ｎｍから約１６０ｎｍの間の直径を有することができる。メタライゼーション層６－５４０（例えば、電気的な基準電位のためのメタライゼーション）を光検出器６－３２２の上にパターン化して、隣接する反応チャンバおよび他の不要な光源からの迷光を遮断するアパーチャまたは絞りを提供することができる。一部の実施形態によれば、ポリメラーゼ６－５２０は、反応チャンバ６－３３０内に位置することができる（例えば、チャンバの底部に取り付けられる）。ポリメラーゼは、標的核酸６－５１０（例えば、ＤＮＡに由来する核酸の一部）を取り込み、相補的核酸の伸長鎖をシークエンシングして、ＤＮＡ６－５１２の伸長鎖を生成することができる。異なるフルオロフォアで標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、反応チャンバの上および反応チャンバ内の溶液中に分散させることができる。 A non-limiting example of a biological reaction that occurs within reaction chamber 6-330 is shown in FIG. 6D. This example shows the sequential incorporation of nucleotides or nucleotide analogs into a growing strand complementary to a target nucleic acid. Sequential uptake can occur within the reaction chamber 6-330 and can be detected by advanced analytical instruments for sequencing the DNA. The reaction chamber can have a depth of between about 150 nm and about 250 nm and a diameter of between about 80 nm and about 160 nm. A metallization layer 6-540 (e.g., metallization for an electrical reference potential) is patterned over the photodetector 6-322 to block stray light from adjacent reaction chambers and other unwanted light sources. An aperture or diaphragm can be provided. According to some embodiments, the polymerase 6-520 can be located within the reaction chamber 6-330 (eg, attached to the bottom of the chamber). The polymerase can incorporate target nucleic acid 6-510 (eg, a portion of a nucleic acid derived from DNA) and sequence an extended strand of complementary nucleic acid to generate an extended strand of DNA 6-512. Nucleotides or nucleotide analogs labeled with different fluorophores can be dispersed in a solution above and within the reaction chamber.

ＶＩＩ．チップ再利用技術の応用
このように、単一のデバイスによって処理される試料の数を増加させるためにセンサチップを再利用するための複数の技術を説明してきたが、ここで、チップ再利用技術の例示的な応用について説明する。例えば、本発明者らは、解析中の試料中の１つまたは複数の分子の同定が、本明細書に記載される技術と組み合わせて実施できることを認識した。特に、放出光の１つまたは複数の特性の測定値を、本明細書に記載される集積デバイス等のデバイスによって取得することができ、収集された測定値を、蛍光マーカについての測定された特性の既知の値と比較して、どの蛍光マーカが放出光源である可能性が最も高いかを判定することができる。次に、蛍光マーカを同定することにより、蛍光マーカが付着することが知られている特定の種類の分子に基づいて、蛍光マーカが付着している分子の同一性を知ることができる。 VII. Application of Chip Reuse Techniques Having thus described multiple techniques for reusing sensor chips to increase the number of samples processed by a single device, here we introduce chip reuse techniques. An exemplary application of is described. For example, the inventors have recognized that identification of one or more molecules in a sample under analysis can be performed in combination with the techniques described herein. In particular, measurements of one or more properties of the emitted light can be obtained by a device, such as the integrated devices described herein, and the collected measurements can be used to determine the measured properties of the fluorescent marker. can be compared to known values of to determine which fluorescent marker is most likely to be the source of the emitted light. Identification of the fluorescent marker can then determine the identity of the molecule to which the fluorescent marker is attached, based on the particular type of molecule to which the fluorescent marker is known to be attached.

本明細書に記載される技術は、例えば、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００４２ＵＳ０２の下で２０１９年１１月１５日に出願された「タンパク質シークエンシングのための方法および組成物（ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＰＲＯＴＥＩＮＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）」と題する米国特許出願第１６／６８６，０２８号、代理人整理番号Ｒ０７０８．７００４２ＷＯ００の下で２０１９年１１月１５日に出願された「タンパク質シークエンシングのための方法および組成物（ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＰＲＯＴＥＩＮＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１８３１号、および代理人整理番号Ｒ０７０８．７００９０ＵＳ０１の下で２０２１年３月２日に出願された「多次元信号解析のための集積センサ（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤＳＥＮＳＯＲＦＯＲＭＵＬＴＩ－ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬＳＩＧＮＡＬＡＮＡＬＹＳＩＳ）」と題する米国特許出願第１７／１９０，３３１号に記載されている技術を含む、試料中の分子を検出および／または同定するための技術と組み合わせて使用することができ、これらの各々は、それらの全体を本願明細書に援用する。このような技術は、例えば、タンパク質シークエンシングおよび／または核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）シークエンシングの応用に使用され得る。 The techniques described herein are disclosed, for example, in the METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROTEIN SEQUENCING filed on November 15, 2019 under Attorney Docket No. R0708.70042US02. METHODS AND COMPOSITIONS, filed on November 15, 2019 under Attorney Docket No. R0708.70042WO00. PCT Application No. PCT/US19/61831 entitled “FOR PROTEIN SEQUENCING” and “Integrated Sensors for Multidimensional Signal Analysis (INTEGRATED SENSOR FOR MULTI-DIMENSIONAL SIGNAL ANALYSIS)'' , each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Such techniques can be used, for example, in protein sequencing and/or nucleic acid (eg, DNA and/or RNA) sequencing applications.

核酸シークエンシング
本開示の一部の態様は、核酸およびタンパク質等の生物学的ポリマーのシークエンシングに有用である。一部の実施形態では、本開示に記載される方法、組成物、およびデバイスは、（例えば、一連の標識されたヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーの取り込みの時間経過を検出することによって）核酸またはタンパク質に取り込まれる一連のヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーを同定するために使用され得る。一部の実施形態では、本開示に記載される方法およびデバイスは、ポリメラーゼ酵素によって合成される鋳型依存性核酸シークエンシング反応生成物に取り込まれる一連のヌクレオチドを同定するために使用され得る。 Nucleic Acid Sequencing Certain aspects of the present disclosure are useful for sequencing biological polymers such as nucleic acids and proteins. In some embodiments, the methods, compositions, and devices described in this disclosure allow for the incorporation of a series of labeled nucleotide or amino acid monomers into a nucleic acid or protein (e.g., by detecting the time course of incorporation of a series of labeled nucleotide or amino acid monomers). can be used to identify a series of nucleotide or amino acid monomers. In some embodiments, the methods and devices described in this disclosure can be used to identify a series of nucleotides that are incorporated into a template-dependent nucleic acid sequencing reaction product synthesized by a polymerase enzyme.

一部の実施形態では、核酸シークエンシングは、カップリング部分および／またはコーティング分子を介して固体支持体の表面にコーティングされる（例えば、試料ウェルの底面に付着された）目的の核酸を提供することを含む。一部の実施形態では、カップリング部分－コーティング分子コンジュゲートは、ビオチンカップリング部分とウェルの表面にコーティングされたストレプトアビジンカップリング部分との間の連結によって形成される。 In some embodiments, nucleic acid sequencing provides a nucleic acid of interest that is coated onto the surface of a solid support (e.g., attached to the bottom of a sample well) via a coupling moiety and/or a coating molecule. Including. In some embodiments, a coupling moiety-coating molecule conjugate is formed by a linkage between a biotin coupling moiety and a streptavidin coupling moiety coated on the surface of the well.

一部の態様では、標的核酸をシークエンシングする方法が提供される。一部の実施形態では、標的核酸をシークエンシングする方法は、（ｉ）（ａ）前記標的核酸、（ｂ）前記標的核酸に相補的なプライマー、（ｃ）核酸ポリメラーゼ、および（ｄ）前記標的核酸に相補的な伸長核酸鎖に取り込むためのヌクレオチドを含む混合物を提供する工程であって、前記ヌクレオチドは、異なる種類の発光標識されたヌクレオチドを含み、前記発光標識されたヌクレオチドは、前記伸長核酸鎖への逐次的な取り込み中に検出可能なシグナルを生成し、前記異なる種類の発光標識されたヌクレオチドの検出可能なシグナルは、タイムドメインで互いに区別可能である（例えば、検出可能なシグナルのタイミングおよび／または頻度を決定することによって）、工程；（ｉｉ）プライマーの伸長によって前記伸長核酸鎖を生成するのに十分な条件下で、（ｉ）の前記混合物を重合反応に供する工程；（ｉｉｉ）前記伸長核酸鎖への逐次的な取り込み後、前記発光標識されたヌクレオチドからの前記検出可能なシグナルを測定する工程；ならびに（ｉｖ）前記伸長核酸鎖への逐次的な取り込みの際の前記発光標識されたヌクレオチドからの前記測定された検出可能なシグナルのタイミングおよび／または頻度を決定して、前記伸長核酸鎖への前記発光標識されたヌクレオチドの取り込みの時系列を特定し、それによって前記標的核酸の配列を決定する工程を含む。 In some embodiments, methods of sequencing target nucleic acids are provided. In some embodiments, a method of sequencing a target nucleic acid comprises (i) (a) said target nucleic acid, (b) a primer complementary to said target nucleic acid, (c) a nucleic acid polymerase, and (d) said target providing a mixture comprising nucleotides for incorporation into an elongated nucleic acid strand complementary to a nucleic acid, the nucleotides comprising different types of luminescently labeled nucleotides; The detectable signals of the different types of luminescently labeled nucleotides generate detectable signals during sequential incorporation into the strand, and the detectable signals of the different types of luminescently labeled nucleotides are distinguishable from each other in the time domain (e.g., due to the timing of the detectable signals). (ii) subjecting said mixture of (i) to a polymerization reaction under conditions sufficient to produce said extended nucleic acid strand by extension of a primer; (iii) ) measuring the detectable signal from the luminescently labeled nucleotide after sequential incorporation into the elongated nucleic acid strand; and (iv) the luminescence upon sequential incorporation into the elongated nucleic acid strand. The timing and/or frequency of the measured detectable signal from labeled nucleotides is determined to identify the time sequence of incorporation of the luminescently labeled nucleotide into the elongated nucleic acid strand, thereby The step includes determining the sequence of the nucleic acid.

一部の態様では、（ｉ）標的体積の試料ウェル中の複合体を１つまたは複数の標識されたヌクレオチドに曝露する工程であって、複合体は、試料中に存在する標的核酸または複数の核酸、前記標的核酸に相補的な少なくとも１つのプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む、工程；（ｉｉ）プライマーの伸長によって伸長核酸鎖を生成するのに十分な条件下で複合体を重合反応に供する工程；（ｉｉｉ）励起光の一連のパルスを標的体積に方向付ける工程；（ｉｖ）プライマーを含む伸長核酸へのヌクレオチドの逐次的な取り込みの後、１つまたは複数の標識されたヌクレオチドから放出された複数の光子を検出する工程；ならびに（ｖ）放出された光子の１つまたは複数の特性を決定することによって、取り込まれたヌクレオチドの配列を特定する工程を含む、シークエンシングする方法が提供される。これらの特性は、発光寿命、保持時間、発光強度、発光波長、パルス持続時間、および／またはパルス間持続時間から選択され得る。一部の実施形態では、特性は発光寿命である。 In some embodiments, the step of (i) exposing a complex in a sample well of a target volume to one or more labeled nucleotides, wherein the complex is one or more of the target nucleic acids present in the sample. (ii) subjecting the complex to a polymerization reaction under conditions sufficient to produce an extended nucleic acid strand by extension of the primer; (iii) directing a series of pulses of excitation light into the target volume; (iv) sequential incorporation of nucleotides into an extended nucleic acid containing a primer, followed by release from one or more labeled nucleotides; and (v) determining the sequence of the incorporated nucleotides by determining one or more properties of the emitted photons. . These properties may be selected from emission lifetime, retention time, emission intensity, emission wavelength, pulse duration, and/or interpulse duration. In some embodiments, the characteristic is luminescence lifetime.

一部の実施形態では、遊離ヌクレオチドは、発光標識されたヌクレオチドについての検出可能なシグナルがタイムドメインにおいて互いに区別可能（例えば、検出可能なシグナルのタイミング、強度および／または頻度を決定することによって）であるように、同じ種類の発光標識にコンジュゲートされる。例示的な実施形態では、遊離ヌクレオチドは同じ種類の標識にコンジュゲートされ、検出可能なシグナルの強度の差がタイムドメイン内で測定される。ポリメラーゼによって標的核酸に相補的な伸長核酸鎖に取り込まれたヌクレオチドは、遊離ヌクレオチドよりも長い持続時間の間、検出領域に留まり、そのため、それらの強度は取り込まれていないヌクレオチドよりも大きくおよび／または長くなる。 In some embodiments, the free nucleotides are such that the detectable signals for the luminescently labeled nucleotides are distinguishable from each other in the time domain (e.g., by determining the timing, intensity, and/or frequency of the detectable signals). is conjugated to the same type of luminescent label. In an exemplary embodiment, the free nucleotides are conjugated to the same type of label and the difference in detectable signal intensity is measured within the time domain. Nucleotides incorporated by the polymerase into an extended nucleic acid strand complementary to the target nucleic acid will remain in the detection region for a longer duration than free nucleotides, and therefore their intensity will be greater and/or greater than unincorporated nucleotides. become longer.

一部の実施形態では、遊離ヌクレオチド（例えば、４種類のヌクレオチド）は、発光標識されたヌクレオチドについての検出可能なシグナルがタイムドメインにおいて互いに区別可能（例えば、検出可能なシグナルのタイミング、強度および／または頻度を決定することによって）であるように、異なる種類の発光標識に各々コンジュゲートされる。ポリメラーゼによって標的核酸に相補的な伸長核酸鎖に取り込まれたヌクレオチドは、遊離ヌクレオチドよりも長い持続時間の間、検出領域に留まり、そのため、それらの強度は取り込まれていないヌクレオチドよりも大きくおよび／または長くなる。 In some embodiments, the free nucleotides (e.g., four types of nucleotides) are such that the detectable signals for the luminescently labeled nucleotides are distinguishable from each other in the time domain (e.g., the timing, intensity, and/or or by determining the frequency), each is conjugated to a different type of luminescent label. Nucleotides incorporated by the polymerase into an extended nucleic acid strand complementary to the target nucleic acid will remain in the detection region for a longer duration than free nucleotides, and therefore their intensity will be greater and/or greater than unincorporated nucleotides. become longer.

本明細書に提供されるチップ再生方法の実施形態は、高精度および長い読み取り長さ、例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、もしくは９９．９９９９％の精度、および／または約１０塩基対（ｂｐ）、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、２，５００ｂｐ、５，０００ｂｐ、６，０００ｂｐ、７，０００ｂｐ、７，５００ｂｐ、７，７５０ｂｐ、８，０００ｂｐ、８，５００ｂｐ、９，０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、もしくは１００，０００ｂｐ以上の読み取り長さで単一の核酸分子をシークエンシングすることができる。例示的な実施形態では、開示される方法は、約７０％、約７２．５％、約７４％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９２％の精度で単一の核酸分子をシークエンシングすることができる。一部の実施形態では、開示される方法は、約９４％の精度で単一の核酸分子をシークエンシングすることができる。例示的な実施形態では、開示される方法は、約８５００塩基対の読み取り長さで単一の核酸分子をシークエンシングすることができる。 Embodiments of the chip regeneration methods provided herein provide high accuracy and long read lengths, e.g., at least about 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%. , 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, or 99.9999% accuracy, and/or about 10 base pairs (bp); 50bp, 100bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 1000bp, 2,500bp, 5,000bp, 6,000bp, 7,000bp, 7,500bp, 7,750bp, 8,000bp, 8,500bp, 9,000bp, Single nucleic acid molecules can be sequenced with read lengths of 10,000 bp, 20,000 bp, 30,000 bp, 40,000 bp, 50,000 bp, or 100,000 bp or more. In exemplary embodiments, the disclosed method has an accuracy of about 70%, about 72.5%, about 74%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, or about 92%. Single nucleic acid molecules can be sequenced. In some embodiments, the disclosed methods are capable of sequencing single nucleic acid molecules with about 94% accuracy. In an exemplary embodiment, the disclosed method is capable of sequencing a single nucleic acid molecule with a read length of approximately 8500 base pairs.

一部の実施形態では、標的核酸または核酸ポリメラーゼは支持体に付着される。一部の実施形態では、取り込みの時系列は、（ｉ）の混合物を重合反応に供した後に特定される。一部の実施形態では、本出願の態様は、生体試料をアッセイするために、例えば、試料中の１つもしくは複数の核酸もしくはポリペプチドの配列を決定するために、および／または試料中の１つもしくは複数の核酸もしくはポリペプチドのバリアント（例えば、目的の遺伝子における１つまたは複数の変異）の存在または不在を決定するために使用され得る。一部の実施形態では、診断、予後、および／または治療の目的のために、核酸配列情報を提供するため、または目的の１つもしくは複数の核酸の存在もしくは不在を決定するために、患者試料（例えば、ヒト患者試料）に対して検査を実施することができる。一部の例では、診断検査は、例えば、対象の生体試料中の無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子および／または発現産物（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ））をシークエンシングすることによって、対象の生体試料中の核酸分子をシークエンシングすることを含み得る。 In some embodiments, the target nucleic acid or nucleic acid polymerase is attached to a support. In some embodiments, the time sequence of incorporation is determined after subjecting the mixture of (i) to a polymerization reaction. In some embodiments, aspects of the present application are useful for assaying a biological sample, e.g., for determining the sequence of one or more nucleic acids or polypeptides in the sample, and/or for determining the sequence of one or more nucleic acids or polypeptides in the sample. It can be used to determine the presence or absence of one or more nucleic acid or polypeptide variants (eg, one or more mutations in a gene of interest). In some embodiments, patient samples are used to provide nucleic acid sequence information or to determine the presence or absence of one or more nucleic acids of interest for diagnostic, prognostic, and/or therapeutic purposes. (e.g., human patient samples). In some instances, a diagnostic test is performed to determine whether a subject's biological body is known, e.g., by sequencing cell-free deoxyribonucleic acid (DNA) molecules and/or expression products (e.g., ribonucleic acid (RNA)) in the subject's biological sample. It may include sequencing nucleic acid molecules in the sample.

一部の実施形態では、発光寿命および／または強度を使用して分析される（例えば、調査および／または同定される）１つまたは複数の分析物は、標識された分子（例えば、１つまたは複数の発光マーカで標識された分析物）であり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の生体分子を含む分析物はマーカを使用して同定され得る。いくつかの例では、発光マーカが生体分子の個々のサブユニットを同定するのに使用される。一部の実施形態は、外因性または内因性マーカであり得る発光マーカ（本明細書において「マーカ」とも呼ばれる）を使用する。外因性マーカは、発光標識するためのレポーターおよび／またはタグとして使用される外部発光マーカであり得る。外因性マーカの例として、蛍光分子、フルオロフォア、蛍光色素、蛍光剤染色剤、有機色素、蛍光タンパク質、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する種、酵素、および／または量子ドットを挙げることができるが、ただしこれらに限定されない。その他の外因性マーカも当技術分野において公知である。そのような外因性マーカは、特定の標的またはコンポーネントと特異的に結合するプローブまたは官能基（例えば、分子、イオン、および／またはリガンド）にコンジュゲートし得る。外因性タグまたはレポーターをプローブに連結させれば、外因性タグまたはレポーターの存在を検出することによって標的の同定が可能となる。プローブの例として、タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）分子、脂質、および抗体プローブを挙げることができる。外因性マーカと官能基を組み合わせることで、分子プローブ、標識されたプローブ、ハイブリダイゼーションプローブ、抗体プローブ、タンパク質プローブ（例えば、ビオチン結合プローブ）、酵素標識、蛍光プローブ、蛍光タグ、および／または酵素レポーターを含む、検出で使用される任意の適するプローブ、タグ、および／または標識を形成することができる。 In some embodiments, the one or more analytes that are analyzed (e.g., investigated and/or identified) using luminescence lifetime and/or intensity are labeled molecules (e.g., one or more analyte labeled with multiple luminescent markers). In some embodiments, analytes including one or more biomolecules can be identified using markers. In some examples, luminescent markers are used to identify individual subunits of biomolecules. Some embodiments use luminescent markers (also referred to herein as "markers"), which can be extrinsic or intrinsic markers. Extrinsic markers can be external luminescent markers used as reporters and/or tags for luminescent labeling. Examples of extrinsic markers may include fluorescent molecules, fluorophores, fluorescent dyes, fluorophore stains, organic dyes, fluorescent proteins, species involved in fluorescence resonance energy transfer (FRET), enzymes, and/or quantum dots. Yes, but not limited to: Other extrinsic markers are also known in the art. Such extrinsic markers may be conjugated to probes or functional groups (eg, molecules, ions, and/or ligands) that specifically bind to a particular target or component. Linking an exogenous tag or reporter to the probe allows identification of the target by detecting the presence of the exogenous tag or reporter. Examples of probes can include protein, nucleic acid (eg, DNA, RNA) molecules, lipid, and antibody probes. By combining extrinsic markers and functional groups, molecular probes, labeled probes, hybridization probes, antibody probes, protein probes (e.g., biotin-conjugated probes), enzyme labels, fluorescent probes, fluorescent tags, and/or enzyme reporters Any suitable probe, tag, and/or label for use in detection can be formed, including.

一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、芳香族またはヘテロ芳香族化合物を含む色素から選択することができ、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、カルバゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、フェナントリジン、フェノキサジン、ポルフィリン、キノリン、エチジウム、ベンズアミド、シアニン、カルボシアニン、サリチレート、アントラニレート、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、またはその他同様の化合物であり得る。例示的色素として、キサンテン色素、例えばフルオレセイン等、またはローダミン色素、ナフタレン色素、クマリン色素、アクリジン色素、シアニン色素、ベンゾキサゾール色素、スチルベン色素、ピレン色素、フタロシアニン色素、フィコビリンタンパク質色素、スクアライン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）色素、ボディパイ（ＢＯＤＩＰＹ）色素等が挙げられる。 In some embodiments, the luminescent label in the set of four nucleotides can be selected from dyes that include aromatic or heteroaromatic compounds, such as pyrene, anthracene, naphthalene, acridine, stilbene, indole, benzindole, It can be an oxazole, carbazole, thiazole, benzothiazole, phenanthridine, phenoxazine, porphyrin, quinoline, ethidium, benzamide, cyanine, carbocyanine, salicylate, anthranilate, coumarin, fluorescein, rhodamine, or other similar compounds. Exemplary dyes include xanthene dyes, such as fluorescein, or rhodamine dyes, naphthalene dyes, coumarin dyes, acridine dyes, cyanine dyes, benzoxazole dyes, stilbene dyes, pyrene dyes, phthalocyanine dyes, phycobiliprotein dyes, squaraine dyes, etc. ) pigment, BODIPY pigment, etc.

一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ｃｙ（登録商標）３Ｂ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ならびにＦＲＥＴｐａｉｒＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５およびＣｙ（登録商標）３．５を含む。一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｃｙ（登録商標）３．５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、およびＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１を含む。一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｃｙ（登録商標）３．５、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、およびＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１を含む。一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｃｙ（登録商標）３Ｂ、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、およびＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１を含む。一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｃｙ（登録商標）３Ｂ、ＡＴＴＯ５４２、およびＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１を含む。一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｃｙ（登録商標）３Ｂ、ＡＴＴＯ５４２、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６を含む。一部の実施形態では、４つのヌクレオチドからなるセットにおける発光標識は、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）３Ｂ、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、およびＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１を含む。 In some embodiments, the luminescent labels in the set of four nucleotides are Alexa Fluor® 546, Cy® 3B, Alexa Fluor® 555, and Alexa Fluor® 555, and FRET pair Alexa Fluor® 555 and Cy® 3.5. In some embodiments, the luminescent labels in the set of four nucleotides include Alexa Fluor® 555, Cy® 3.5, Alexa Fluor® 546, and DyLight® 554. - Contains R1. In some embodiments, the luminescent labels in the set of four nucleotides include Alexa Fluor® 555, Cy® 3.5, ATTO Rho6G, and DyLight® 554-R1. In some embodiments, the luminescent labels in the set of four nucleotides include Alexa Fluor® 555, Cy® 3B, ATTO Rho6G, and DyLight® 554-R1. In some embodiments, the luminescent labels in the set of four nucleotides include Alexa Fluor® 555, Cy® 3B, ATTO 542, and DyLight® 554-R1. In some embodiments, the luminescent labels in the set of four nucleotides include Alexa Fluor® 555, Cy® 3B, ATTO 542, and Alexa Fluor® 546. In some embodiments, the luminescent labels in the set of four nucleotides include Cy® 3.5, Cy® 3B, ATTO Rho6G, and DyLight® 554-R1.

ある特定の実施形態では、発光標識されたヌクレオチドの種類のうち、少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、または少なくとも４種類は、６－ＴＡＭＲＡ、５／６－カルボキシローダミン６Ｇ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｂｅｒｒｉｏｒＳｔａｒ６３５、ＡＴＴＯ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ４９５、ＡＴＴＯ５１４、ＡＴＴＯ５２０、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ５４２、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＡＴＴＯＲｈｏ１４、Ｃｈｒｏｍｉｓ６３０、Ｃｈｒｏｍｉｓ６５４Ａ、Ｃｈｒｏｍｅｏ（商標）６４２、ＣＦ（商標）５１４、ＣＦ（商標）５３２、ＣＦ（商標）５４３、ＣＦ（商標）５４６、ＣＦ（商標）５４６、ＣＦ（商標）５５５、ＣＦ（商標）５６８、ＣＦ（商標）６３３、ＣＦ（商標）６４０Ｒ、ＣＦ（商標）６６０Ｃ、ＣＦ（商標）６６０Ｒ、ＣＦ（商標）６８０Ｒ、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３Ｂ、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）５．５、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５３０、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５４７Ｐ１、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５４９Ｐ１、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５５０、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５５４、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５５５、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５５６、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－５６０、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－６５０、ディオミクス（Ｄｙｏｍｉｃｓ）－６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５３０－Ｒ２、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６３５－Ｂ２、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５５－Ｂ４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６７５－Ｂ２、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６７５－Ｂ４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ５３２、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ５５５、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ５９４、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０Ｒ、Ｓｅｔａ（商標）５５５、Ｓｅｔａ（商標）６７０、Ｓｅｔａ（商標）７００、Ｓｅｔａ（商標）ｕ６４７、およびＳｅｔａ（商標）ｕ６６５からなる群から選択される発光色素を含むか、または本明細書に記載されるような、式（色素１０１）、（色素１０２）、（色素１０３）、（色素１０４）、（色素１０５）、または（色素１０６）の発光色素である。 In certain embodiments, at least one, at least two, at least three, or at least four of the luminescently labeled nucleotide types include 6-TAMRA, 5/6-carboxyrhodamine 6G, Alexa Fluor ( (registered trademark) 546, Alexa Fluor (registered trademark) 555, Alexa Fluor (registered trademark) 568, Alexa Fluor (registered trademark) 610, Alexa Fluor (registered trademark) 647, Aberrior Star635, ATTO425, ATTO465, ATTO488 , ATTO495, ATTO514, ATTO520, ATTO Rho6G, ATTO542, ATTO647N, ATTO Rho14, Chromis630, Chromis654A, Chromeo(TM) 642, CF(TM) 514, CF(TM) 532, CF(TM) 543, CF(TM) 546, CF( trademark) 546, CF (trademark) 555, CF (trademark) 568, CF (trademark) 633, CF (trademark) 640R, CF (trademark) 660C, CF (trademark) 660R, CF (trademark) 680R, Cy (registered trademark) 3 , Cy (registered trademark) 3B, Cy (registered trademark) 3.5, Cy (registered trademark) 5, Cy (registered trademark) 5.5, Dyomics-530, Dyomics-547P1, Dyomics )-549P1, Dyomics-550, Dyomics-554, Dyomics-555, Dyomics-556, Dyomics-560, Dyomics-650, Dyomics -680, DyLight (registered trademark) 554-R1, DyLight (registered trademark) 530-R2, DyLight (registered trademark) 594, DyLight (registered trademark) 635-B2, DyLight (registered trademark) 650, DyLight (registered trademark) 655 -B4, DYLIGHT (registered trademark) 675 -B2, DYLIGHT (registered trademark) 675 -B4, DYLIGHT (registered trademark) 680, HILYTE (trademark) Fluor532, HILYTE (trademark) fluor555, HILYTE (trademark) flu. OR594, LiGHTCYCLER (registered trademark) ) 640R, Seta(TM) 555, Seta(TM) 670, Seta(TM) 700, Seta(TM) u647, and Seta(TM) u665; A luminescent dye of the formula (dye 101), (dye 102), (dye 103), (dye 104), (dye 105), or (dye 106) as described in .

一部の実施形態では、発光標識されたヌクレオチドの種類のうち、少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、または少なくとも４種類は、それぞれ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｃｙ（登録商標）３Ｂ、Ｃｙ（登録商標）３．５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｔｔｏＲｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ４９５、ＡＴＴＯ５１４、ＡＴＴＯ５２０、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、およびＡＴＴＯ５４２からなる群から選択される発光色素を含む。 In some embodiments, at least one, at least two, at least three, or at least four of the luminescently labeled nucleotide types are Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® ) 555, Cy (registered trademark) 3B, Cy (registered trademark) 3.5, DyLight (registered trademark) 554-R1, Alexa Fluor (registered trademark) 546, Atto Rho6G, ATTO425, ATTO465, ATTO488, ATTO495, ATTO514, ATTO520 , ATTO Rho6G, and ATTO542.

一部の実施形態では、第１の種類の発光標識されたヌクレオチドはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６を含み、第２の種類の発光標識されたヌクレオチドはＣｙ（登録商標）３Ｂを含み、第３の種類の発光標識されたヌクレオチドは２つのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５を含み、および第４の種類の発光標識されたヌクレオチドはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５およびＣｙ（登録商標）３．５を含む。 In some embodiments, the first type of luminescently labeled nucleotide comprises Alexa Fluor® 546, the second type of luminescently labeled nucleotide comprises Cy®3B, and the third type of luminescently labeled nucleotide comprises A type of luminescently labeled nucleotide includes two Alexa Fluor® 555s, and a fourth type of luminescently labeled nucleotide includes Alexa Fluor® 555 and Cy® 3.5. include.

一部の実施形態では、発光標識されたヌクレオチドの種類のうち、少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、または少なくとも４種類は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＣＦ（商標）５３２、ＣＦ（商標）５４３、ＣＦ（商標）５５５、ＣＦ（商標）５９４、Ｃｙ（登録商標）３、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５３０－Ｒ２、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９０－Ｒ２、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６１０－Ｂ１からなる群から選択される発光色素を含むか、または式（色素１０１）、（色素１０２）、（色素１０３）、（色素１０４）、（色素１０５）、または（色素１０６）の発光色素である。 In some embodiments, at least one, at least two, at least three, or at least four of the luminescently labeled nucleotide types are Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546 , Alexa Fluor(R) 555, Alexa Fluor(R) 594, Alexa Fluor(R) 610, CF(TM) 532, CF(TM) 543, CF(TM) 555, CF(TM) 594, Cy (registered trademark) 3, DyLight (registered trademark) 530-R2, DyLight (registered trademark) 554-R1, DyLight (registered trademark) 590-R2, DyLight (registered trademark) 594, and DyLight (registered trademark) 610-B1. or is of the formula (Dye 101), (Dye 102), (Dye 103), (Dye 104), (Dye 105), or (Dye 106).

一部の実施形態では、第１および第２の種類の発光標識されたヌクレオチドは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＣＦ（商標）５３２、ＣＦ（商標）５４３、ＣＦ（商標）５５５、Ｃｙ（登録商標）３、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５３０－Ｒ２、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５４－Ｒ１からなる群から選択される発光色素を含み、ならびに第３および第４の種類の発光標識されたヌクレオチドは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＣＦ（商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９０－Ｒ２、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６１０－Ｂ１からなる群から選択される発光色素を含むか、または式（色素１０１）、（色素１０２）、（色素１０３）、（色素１０４）、（色素１０５）、または（色素１０６）の発光色素である。 In some embodiments, the first and second types of luminescently labeled nucleotides are Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, CF™ 532, CF(TM) 543, CF(TM) 555, Cy(R) 3, DyLight(R) 530-R2, DyLight(R) 554-R1, and the third and fourth types of luminescently labeled nucleotides include Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, CF® 594, DyLight® 590-R2, DyLight® (Dye 101), (Dye 102), (Dye 103), (Dye 104), (Dye 105) ), or (dye 106).

ある特定の実施形態では、発光標識されたヌクレオチド分子のうちの少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、または少なくとも４種類は、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、シリウス（Ｓｉｒｉｕｓ）、サファイヤ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、Ｔ－サファイヤ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、ＥＣＦＰ、セルーリアン（Ｃｅｒｕｌｅａｎ）、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍターコイズ（ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）、ｍターコイズ（ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）２、単量体ミドリイシイ・シアン（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、エメラルド（Ｅｍｅｒａｌｄ）、スーパーフォルダー（Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ）ＧＦＰ、単量体アザミグリーン（ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ）、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍワサビ（ｍＷａｓａｂｉ）、クローバー（Ｃｌｏｖｅｒ）、ｍネオングリン（ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、ＥＹＦＰ、シトリン（Ｃｉｔｒｉｎｅ）、ヴィーナス（Ｖｅｎｕｓ）、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、単量体クサビラ・オレンジ（Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＫＯＫ、ｍＫＯ２、ｍオレンジ（ｍＯｒａｎｇｅ）、ｍオレンジ（ｍＯｒａｎｇｅ）２、ｍラズベリー（ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ）、ｍチェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）、ｍストロベリー（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ）、ｍタンジェリン（ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ）、ｔｄトマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍアップル（ｍＡｐｐｌｅ）、ｍルビー（ｍＲｕｂｙ）、ｍルビー（ｍＲｕｂｙ）２、ｍプラム（ｍＰｌｕｍ）、ＨｃＲｅｄ－タンデム（ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ）、ｍＫａｔｅ２、ｍネプチューン（ｍＮｅｐｔｕｎｅ）、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、ｉＲＦＰ、ｍケイマレッド（ｍＫｅｉｍａＲｅｄ）、ＬＳＳ－ｍケイト（ｍＫａｔｅ）１、ＬＳＳ－ｍケイト（ｍＫａｔｅ）２、ｍＢｅＲＦＰ、ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍチェリー（ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ）１、ＰＡＴａｇＲＦＰ、カエデ（Ｋａｅｄｅ）（ｇｒｅｅｎ）、カエデ（Ｋａｅｄｅ）（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ－ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、またはドロンパ（Ｄｒｏｎｐａ）からなる群から選択される発光タンパク質を含む。 In certain embodiments, at least one, at least two, at least three, or at least four of the luminescently labeled nucleotide molecules are TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalamal, Sirius, Sapphire. (Sapphire), T-Sapphire, ECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, Monomer Midoriishi-Cyan, TagC FP, mTFP1, EGFP, Emerald, Superfolder GFP, Monomer Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover, mNeonGreen, EYFP, Citrine ( Citrine, Venus, SYFP2, TagYFP, monomer Kusabira-Orange, mKOK, mKO2, mOrange, mOrange2, mRaspberry, mCherry ( mCherry), mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby, mRuby2, mPlum ), HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune, NirFP, TagRFP657, IFP1.4, iRFP, mKeima Red, LSS-mKate 1, LSS-mKate ( mKate) 2, mBeRFP, PA-GFP, PAmCherry 1, PATagRFP, Kaede (green), Kaede (red), KikGR1 (green), KikGR1 (red), PS-CFP2, mEos2 (green), mEos2 (red), PSmOrange, or Dronpa.

本開示は発光マーカについて言及しているが、その他の種類のマーカも、本明細書に提示されるデバイス、システムおよび方法と共に使用され得る。そのようなマーカは、質量タグ、静電タグ、電気化学的標識、または任意のこれらの組合せであり得る。 Although this disclosure refers to luminescent markers, other types of markers may also be used with the devices, systems, and methods presented herein. Such markers can be mass tags, electrostatic tags, electrochemical labels, or any combination thereof.

外因性マーカが試料に添加され得るが、内因性マーカがすでに試料の一部分であることもある。内因性マーカには、励起エネルギーの存在下で発光するかまたは「自己蛍光を発する」ことができる現存する任意の発光マーカが含まれ得る。内因性フルオロフォアの自己蛍光は、外因性フルオロフォアの導入を必要としない、ラベルフリーの非侵襲的標識化を提供し得る。そのような内因性フルオロフォアの例には、ヘモグロビン、オキシヘモグロビン、脂質、コラーゲンおよびエラスチン架橋、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化型フラビン（ＦＡＤおよびＦＭＮ）、リポフスチン、ケラチン、ならびに／またはポルフィリンが、例としておよび非限定的に含まれる。 Although extrinsic markers may be added to the sample, endogenous markers may already be part of the sample. Intrinsic markers can include any existing luminescent marker that can emit light or "autofluoresce" in the presence of excitation energy. Autofluorescence of endogenous fluorophores can provide label-free, non-invasive labeling that does not require the introduction of exogenous fluorophores. Examples of such endogenous fluorophores include hemoglobin, oxyhemoglobin, lipids, collagen and elastin crosslinks, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), oxidized flavins (FAD and FMN), lipofuscin, keratin, and/or or porphyrins are included by way of example and without limitation.

本開示は、異なる分子を標識するための発光タグ（例えば、発光マーカ、発光標識）のセットを使用しながら、単一分子を検出するための技術を提示する。そのような単一分子は、タグを有するヌクレオチドまたはアミノ酸であり得る。タグは、単一分子に結合している間に単一分子から放出された際に、または単一分子に結合し、そして放出された際に検出され得る。いくつかの事例では、タグは発光性タグである。選択されたセット内の各発光性タグは各分子と会合する。例えば、４つのタグからなるセットは、ＤＮＡ内に存在する核酸塩基を「標識する」のに使用され得る－セットの各タグは異なる核酸塩基と会合し、例えば、第１のタグはアデニン（Ａ）と会合し、第２のタグはシトシン（Ｃ）と会合し、第３のタグはグアニン（Ｇ）と会合し、そして第４のタグはチミン（Ｔ）と会合する。それに加えて、タグのセット内の発光タグのそれぞれは、セットの第１のタグをセット内のその他のタグから区別するのに使用され得る異なる特性を有する。このように、各タグは、これらの識別的な特徴のうちの１つまたは複数を使用して一義的に特定可能である。例としておよび非限定的に、１つのタグを別のタグから区別するのに使用され得るタグの特徴には、励起エネルギーに応答してタグにより放出された光の発光エネルギーおよび／または波長、特定のタグにより吸収され、タグを励起した状態に置く励起光の波長、および／またはタグの発光寿命が含まれ得る。 This disclosure presents techniques for detecting single molecules while using a set of luminescent tags (eg, luminescent markers, luminescent labels) to label different molecules. Such a single molecule can be a nucleotide or an amino acid with a tag. A tag can be detected while bound to and released from a single molecule, or when bound to and released from a single molecule. In some cases, the tag is a luminescent tag. Each luminescent tag in the selected set is associated with a respective molecule. For example, a set of four tags can be used to "label" nucleobases present within DNA - each tag in the set is associated with a different nucleobase, for example, the first tag is adenine (A ), the second tag is associated with cytosine (C), the third tag is associated with guanine (G), and the fourth tag is associated with thymine (T). In addition, each of the luminescent tags within a set of tags has different characteristics that can be used to distinguish a first tag of the set from other tags within the set. In this way, each tag is uniquely identifiable using one or more of these distinguishing characteristics. By way of example and without limitation, characteristics of a tag that may be used to distinguish one tag from another include: the emission energy and/or wavelength of light emitted by the tag in response to excitation energy; may include the wavelength of excitation light that is absorbed by the tag and places the tag in an excited state, and/or the emission lifetime of the tag.

ある特定の実施形態では、鋳型依存性核酸シークエンシング産物が、天然に存在する核酸ポリメラーゼにより実施される。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼの突然変異体または改変されたバリアントである。一部の実施形態では、鋳型依存性核酸シークエンシング産物は、鋳型核酸鎖に対して相補的な１つまたは複数のヌクレオチドセグメントを含む。１つの態様では、本開示は、その相補的な核酸鎖の配列を決定することにより、鋳型（または標的）核酸鎖の配列を決定する方法を提供する。 In certain embodiments, template-dependent nucleic acid sequencing products are performed with naturally occurring nucleic acid polymerases. In some embodiments, the polymerase is a mutant or modified variant of a naturally occurring polymerase. In some embodiments, the template-dependent nucleic acid sequencing product includes one or more nucleotide segments that are complementary to the template nucleic acid strand. In one aspect, the present disclosure provides a method of determining the sequence of a template (or target) nucleic acid strand by determining the sequence of its complementary nucleic acid strand.

用語「ポリメラーゼ」とは、本明細書で使用される場合、重合反応を触媒する能力を有する任意の酵素（または重合化酵素）を一般的に指す。ポリメラーゼの例として、非限定的に、核酸ポリメラーゼ、転写酵素、またはリガーゼが挙げられる。ポリメラーゼは重合酵素であり得る。 The term "polymerase" as used herein generally refers to any enzyme (or polymerizing enzyme) that has the ability to catalyze a polymerization reaction. Examples of polymerases include, without limitation, nucleic acid polymerases, transcriptases, or ligases. A polymerase can be a polymerizing enzyme.

単一分子の核酸伸長（例えば、核酸シークエンシングのため）に関する実施形態は、標的核酸分子に対して相補的な核酸を合成する能力を有する任意のポリメラーゼを使用し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および／またはその１つまたは複数の突然変異体または変化形態であり得る。 Embodiments involving single molecule nucleic acid extension (eg, for nucleic acid sequencing) may use any polymerase capable of synthesizing nucleic acid complementary to a target nucleic acid molecule. In some embodiments, the polymerase can be a DNA polymerase, an RNA polymerase, a reverse transcriptase, and/or one or more mutants or altered forms thereof.

ポリメラーゼの例として、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変されたポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼφ２９（ｐｓｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ－Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびにそのバリアント、改変された産物、および誘導体が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。一部の実施形態では、ポリメラーゼは単一サブユニットポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例およびその特性は、とりわけ、ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ、コーンバーグおよびベーカー（ＫｏｒｎｂｅｒｇａｎｄＢａｋｅｒ）、ダブリュー・エイチ・フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳記されている。 Examples of polymerases include DNA polymerase, RNA polymerase, thermostable polymerase, wild type polymerase, modified polymerase, E. coli DNA polymerase I, T7 DNA polymerase, bacteriophage T4 DNA polymerase φ29 (psi29) DNA polymerase, Taq polymerase. , Tth polymerase, Tli polymerase, Pfu polymerase, Pwo polymerase, VENT polymerase, DEEPVENT polymerase, EX-Taq polymerase, LA-Taq polymerase, Sso polymerase, Poc polymerase, Pab polymerase, Mth polymerase, ES4 polymerase, Tr u polymerase, Tac polymerase, Tne polymerase, Tma polymerase, Tca polymerase, Tih polymerase, Tfi polymerase, Platinum Taq polymerase, Tbr polymerase, Tfl polymerase, Tth polymerase, Pfutubo polymerase, Pyrobest polymerase, Pwo polymerase, KOD polymerase , Bst polymerase, Sac polymerase, Klenow fragment, 3 Includes, but is not limited to, polymerases with '→5' exonuclease activity, and variants, modified products, and derivatives thereof. In some embodiments, the polymerase is a single subunit polymerase. Non-limiting examples of DNA polymerases and their properties can be found in, among others, DNA Replication 2nd edition, Kornberg and Baker, W.H. Freeman, New York, N.C. Y. (1991).

標的核酸の核酸塩基と相補的なｄＮＴＰとの間で塩基対が形成されると、ポリメラーゼは、新規に合成された鎖の３’ヒドロキシル末端とｄＮＴＰのアルファリン酸との間でホスホジエステル結合を形成することにより、新規に合成された核酸鎖にｄＮＴＰを組み込む。ｄＮＴＰにコンジュゲートした発光タグがフルオロフォアである実施例において、その存在は励起によりシグナル伝達され、そして組み込み工程期間中またはその後に発光のパルスが検出される。ｄＮＴＰの末端（ガンマ）リン酸にコンジュゲートした検出標識の場合、ｄＮＴＰが新規に合成された鎖に組み込まれると、ベータおよびガンマリン酸が放出され、そして試料ウェル内で自由に拡散する検出標識は、フルオロフォアから検出される発光の減少を引き起こす。 Once a base pair is formed between the nucleobase of the target nucleic acid and the complementary dNTP, the polymerase creates a phosphodiester bond between the 3' hydroxyl end of the newly synthesized strand and the alpha phosphate of the dNTP. dNTPs are incorporated into newly synthesized nucleic acid strands by formation of dNTPs. In embodiments where the luminescent tag conjugated to the dNTP is a fluorophore, its presence is signaled by excitation and a pulse of luminescence detected during or after the incorporation step. In the case of a detection label conjugated to the terminal (gamma) phosphate of a dNTP, once the dNTP is incorporated into the newly synthesized strand, the beta and gamma phosphates are released, and the detection label freely diffusing within the sample well is , causing a decrease in the luminescence detected from the fluorophore.

一部の実施形態では、ポリメラーゼは高処理性のポリメラーゼである。しかしながら、一部の実施形態では、ポリメラーゼは低処理性のポリメラーゼである。ポリメラーゼの処理性とは、核酸鋳型を放出せずに、ｄＮＴＰを核酸鋳型中に連続的に組み込むポリメラーゼの能力を一般的に指す。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’→５’エキソヌクレアーゼ（活性）が低いポリメラーゼである。一部の実施形態では、対応する野生型ポリメラーゼと比較して、それより低下した５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’→５’活性を有するように、ポリメラーゼは改変される（例えば、アミノ酸置換により）。ＤＮＡポリメラーゼのさらなる非限定的な例として、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイグランドバイオラボ社（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、およびクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）エキソポリメラーゼのＰ６８０Ｇ突然変異体（ツスケら（Ｔｕｓｋｅｅｔａｌ．）（２０００）ＪＢＣ２７５（３１）：２３７５９－２３７６８）が挙げられる。一部の実施形態では、ポリメラーゼが有する処理性が低ければ、ヌクレオチド反復の１つまたは複数のストレッチ（例えば、同一種類の２つ以上の連続した塩基）を含有するシークエンシング鋳型に対して正確性が向上する。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、非標識核酸に対するよりも標識ヌクレオチドに対してより高い親和性を有するポリメラーゼである。 In some embodiments, the polymerase is a high processivity polymerase. However, in some embodiments, the polymerase is a low processivity polymerase. Polymerase processivity generally refers to the ability of a polymerase to continuously incorporate dNTPs into a nucleic acid template without releasing the nucleic acid template. In some embodiments, the polymerase is a polymerase with low 5'→3' exonuclease activity and/or 3'→5' exonuclease (activity). In some embodiments, the polymerase is modified to have reduced 5'→3' exonuclease activity and/or 3'→5' activity compared to the corresponding wild-type polymerase (e.g. , by amino acid substitution). Additional non-limiting examples of DNA polymerases include 9°Nm™ DNA polymerase (New England Biolabs), and the P680G mutant of Klenow exopolymerase (Tuske et al. ) (2000) JBC 275(31):23759-23768). In some embodiments, a less processive polymerase may result in one or more stretches of nucleotide repeats (e.g., two of the same type). Accuracy is improved for sequencing templates that contain (one or more consecutive bases). In some embodiments, the polymerase is a polymerase that has a higher affinity for labeled nucleotides than for unlabeled nucleic acids. It is.

他の態様では、本開示は、標的核酸が断片を含む場合に、複数の核酸断片をシークエンシングすることにより標的核酸をシークエンシングする方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、親標的核酸についてその配列または部分配列を提供するために、複数の断片配列を組み合わせる工程を含む。一部の実施形態では、組み合わせる工程は、コンピューターハードウェアおよびソフトウェアにより実施される。本明細書に記載される方法は、関連する標的核酸のセット、例えば染色体またはゲノム全体等の配列決定を可能にし得る。 In other aspects, the disclosure provides a method of sequencing a target nucleic acid by sequencing a plurality of nucleic acid fragments, where the target nucleic acid comprises fragments. In certain embodiments, the method includes combining multiple fragment sequences to provide a sequence or subsequence for a parent target nucleic acid. In some embodiments, the combining step is performed by computer hardware and software. The methods described herein may enable the sequencing of a set of related target nucleic acids, such as a chromosome or an entire genome.

シークエンシング中、重合化酵素は、標的核酸分子のプライミング位置とカップリングし（例えば、それに連結し）得る。プライミング位置は、標的核酸分子の一部分に対して相補的であるプライマーであり得る。あるいは、プライミング位置は、標的核酸分子の二本鎖セグメント内に提供されるギャップまたはニックである。ギャップまたはニックは、長さが０から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、または４０個のヌクレオチドであり得る。ニックは、二本鎖配列の一方の鎖内に切断箇所を提供することができる（重合化酵素、例えば鎖置換型ポリメラーゼ酵素等のためのプライミング位置を提供し得る）。 During sequencing, a polymerizing enzyme may be coupled to (eg, ligated to) a priming position on a target nucleic acid molecule. The priming position can be a primer that is complementary to a portion of the target nucleic acid molecule. Alternatively, the priming location is a gap or nick provided within a double-stranded segment of the target nucleic acid molecule. A gap or nick can be from 0 to at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, or 40 nucleotides in length. A nick can provide a cleavage site within one strand of a double-stranded sequence (can provide a priming site for a polymerizing enzyme, such as a strand-displacing polymerase enzyme).

いくつかのケースでは、シークエンシングプライマーは、固体支持体に固定化されることもあれば、またされないこともある標的核酸分子に対してアニーリングされ得る。固体支持体は、例えば、核酸シークエンシングで使用されるマイクロチップ（またはチップ）上に試料ウェル（例えば、ナノアパーチャ、反応チャンバ）を備え得る。一部の実施形態では、シークエンシングプライマーは固体支持体に固定化され得るが、また標的核酸分子のハイブリダイゼーションでも、標的核酸分子を固体支持体に固定する。一部の実施形態では、ポリメラーゼが固体支持体に固定化され、そして可溶性プライマーおよび標的核酸がポリメラーゼと接触する。しかしながら、一部の実施形態では、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体が溶液の状態で形成され、そして複合体は固体支持体に固定化される（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、および／または標的核酸の固定化を介して）。 In some cases, sequencing primers can be annealed to target nucleic acid molecules that may or may not be immobilized to a solid support. The solid support can include sample wells (eg, nanoapertures, reaction chambers) on microchips (or chips) used in nucleic acid sequencing, for example. In some embodiments, the sequencing primer may be immobilized to a solid support, but hybridization of the target nucleic acid molecule also immobilizes the target nucleic acid molecule to the solid support. In some embodiments, the polymerase is immobilized on a solid support and the soluble primer and target nucleic acid are contacted with the polymerase. However, in some embodiments, a complex comprising a polymerase, a target nucleic acid, and a primer is formed in solution, and the complex is immobilized on a solid support (e.g., a polymerase, a target nucleic acid, and/or via immobilization of the target nucleic acid).

適切な条件下では、アニーリングしたプライマー／標的核酸に接触するポリメラーゼ酵素は、１つまたは複数のヌクレオチドをプライマーに添加するかまたは組み込むことができ、またいくつかのヌクレオチドが、５’→３’の方向、鋳型依存性の様式でプライマーに添加可能である。ヌクレオチドのそのようなプライマーへの組み込み（例えば、ポリメラーゼの作用を介して）は、プライマー伸長反応と一般的に呼ばれ得る。各ヌクレオチドは、核酸伸長反応期間中に検出可能および同定可能（例えば、その発光寿命および／またはその他の特徴に基づき）であり、また伸長されたプライマーに組み込まれた各ヌクレオチド、したがって新規に合成された核酸分子の配列を決定するのに使用される検出可能なタグと会合し得る。新規に合成された核酸分子の配列相補性を介して、標的核酸分子の配列も決定可能である。いくつかのケースでは、シークエンシングプライマーの標的核酸分子に対するアニーリング、およびヌクレオチドのシークエンシングプライマーへの組み込みが、類似した反応条件（例えば、同一または類似した反応温度）または異なる反応条件（例えば、異なる反応温度）において生じ得る。 Under appropriate conditions, the polymerase enzyme that contacts the annealed primer/target nucleic acid can add or incorporate one or more nucleotides to the primer, and some nucleotides may be added to the 5'→3' It can be added to the primer in a directionally, template-dependent manner. Incorporation of nucleotides into such primers (eg, via the action of a polymerase) can be commonly referred to as a primer extension reaction. Each nucleotide is detectable and identifiable (e.g., based on its luminescent lifetime and/or other characteristics) during the nucleic acid extension reaction, and each nucleotide incorporated into the extended primer and thus newly synthesized can be associated with a detectable tag used to sequence a nucleic acid molecule. Through sequence complementarity of newly synthesized nucleic acid molecules, the sequence of a target nucleic acid molecule can also be determined. In some cases, the annealing of the sequencing primer to the target nucleic acid molecule and the incorporation of nucleotides into the sequencing primer may occur under similar reaction conditions (e.g., the same or similar reaction temperature) or under different reaction conditions (e.g., different reactions). temperature).

したがって、一部の態様では、本開示は、核酸生体分子からヌクレオチド配列情報を決定するための（例えば、ポリヌクレオチドをシークエンシングするための）方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列情報は、単一の核酸生体分子について決定可能である。本開示のシークエンシング法は、「合成によるシークエンシング」アッセイ法を含み得る。本開示のシークエンシング法は、タイムコース（またはタイムドメイン）測定アッセイ法を含み得る。一部の実施形態では、合成によるシークエンシング法は、標的核酸分子の集団（例えば、標的核酸のコピー）の提示、および／または標的核酸の集団を実現するために標的核酸を増幅させる工程を含み得る。しかしながら、一部の実施形態では、合成によるシークエンシングは、評価される各反応において単一分子の配列を決定するのに使用される（そしてシークエンシングのための標的鋳型の調製において、核酸増幅は不要とされる）。一部の実施形態では、本出願の一部の態様によれば、複数の単一分子シークエンシング反応が並行して（例えば、単一のチップ上で）実施される。例えば、一部の実施形態では、複数の単一分子シークエンシング反応が、単一のチップ上に作製された分離型の反応チャンバ（例えば、ナノアパーチャ、試料ウェル）内でそれぞれ実施される。 Accordingly, in some aspects, the present disclosure provides methods and compositions for determining nucleotide sequence information from nucleic acid biomolecules (eg, for sequencing polynucleotides). In some embodiments, nucleotide sequence information can be determined for a single nucleic acid biomolecule. Sequencing methods of the present disclosure may include "sequencing-by-synthesis" assays. Sequencing methods of the present disclosure can include time course (or time domain) measurement assays. In some embodiments, the sequencing-by-synthesis method comprises presenting a population of target nucleic acid molecules (e.g., copies of the target nucleic acid) and/or amplifying the target nucleic acid to achieve a population of target nucleic acids. obtain. However, in some embodiments, sequencing by synthesis is used to sequence a single molecule in each reaction evaluated (and in the preparation of target templates for sequencing, nucleic acid amplification is deemed unnecessary). In some embodiments, according to some aspects of the present application, multiple single molecule sequencing reactions are performed in parallel (eg, on a single chip). For example, in some embodiments, multiple single molecule sequencing reactions are each performed in separate reaction chambers (eg, nanoapertures, sample wells) fabricated on a single chip.

一部の実施形態では、開示される核酸シークエンシング法は、相補的な金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）チップ上に作製された試料ウェル内で実施される。各ウェルは、ＣＭＯＳフォトダイオードに対してアラインメントされ得る。一部の実施形態では、開示される核酸シークエンシング法は、ベンチトップ集積デバイスと連携してＣＭＯＳチップ上で実施される。一部の実施形態では、シークエンシング法は、１チャネルまたは複数チャネル光検出式の合成による配列決定型集積デバイスと連携して、ＣＭＯＳチップ上で実施される（図２Ａを参照）。 In some embodiments, the disclosed nucleic acid sequencing methods are performed in sample wells fabricated on complementary metal oxide semiconductor (CMOS) chips. Each well may be aligned to a CMOS photodiode. In some embodiments, the disclosed nucleic acid sequencing methods are implemented on a CMOS chip in conjunction with a benchtop integrated device. In some embodiments, the sequencing method is performed on a CMOS chip in conjunction with a single-channel or multi-channel optical detection synthetic sequencing integrated device (see FIG. 2A).

一部の実施形態では、発光標識されたヌクレオチドの核酸は、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１つに対してアニーリングされる第３のオリゴヌクレオチド鎖をさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１つに対してアニーリングされる第４のオリゴヌクレオチド鎖をさらに含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖は、ホリデイジャンクションを形成する。 In some embodiments, the luminescently labeled nucleotide nucleic acid further comprises a third oligonucleotide strand annealed to at least one of the first and second oligonucleotide strands. In some embodiments, the nucleic acid further comprises a fourth oligonucleotide strand annealed to at least one of the first, second, and third oligonucleotide strands. In some embodiments, the oligonucleotide strands form a Holliday junction.

一部の態様では、本開示は鋳型核酸の配列を決定する方法を提示する。一部の実施形態では、方法は、標的体積内の複合体（複合体は鋳型核酸、プライマー、および重合化酵素を含む）を、複数種類の発光標識されたヌクレオチドに曝露することを含む工程を含む。一部の実施形態では、各種類の発光標識されたヌクレオチドは、核酸を介して１つまたは複数のヌクレオシドポリホスフェートと結びついた１つまたは複数の発光標識を含む（例えば、同一の発光標識を含むかまたは異なる発光標識を含む）。一部の実施形態では、核酸は保護分子を含む。したがって、一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される発光標識されたヌクレオシドポリホスフェート組成物のいずれかを利用する核酸シークエンシング法を提示する。 In some aspects, the present disclosure provides methods for determining the sequence of a template nucleic acid. In some embodiments, the method includes exposing a complex in the target volume (the complex includes a template nucleic acid, a primer, and a polymerizing enzyme) to multiple types of luminescently labeled nucleotides. include. In some embodiments, each type of luminescently labeled nucleotide comprises one or more luminescent labels associated with one or more nucleoside polyphosphates via a nucleic acid (e.g., contains identical luminescent labels). or different luminescent labels). In some embodiments, the nucleic acid includes a protective molecule. Accordingly, in some aspects, the present disclosure provides nucleic acid sequencing methods that utilize any of the luminescently labeled nucleoside polyphosphate compositions described herein.

一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の励起エネルギーの一連のパルスを標的体積の近傍に向けて方向付ける工程をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、プライマーを含む核酸への逐次的な組み込み期間中に、発光標識されたヌクレオチドから発した複数の放出光子を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、放出光子のタイミングおよび必要に応じて周波数を決定することにより、組み込まれたヌクレオチドの配列を特定する工程をさらに含む。 In some embodiments, the method further includes directing a series of one or more pulses of excitation energy into the vicinity of the target volume. In some embodiments, the method further comprises detecting a plurality of emitted photons emitted from the luminescently labeled nucleotide during sequential incorporation into the nucleic acid containing the primer. In some embodiments, the method further comprises determining the sequence of the incorporated nucleotides by determining the timing and optionally the frequency of the emitted photons.

一部の実施形態では、反応混合物内の異なる４種類のヌクレオチド（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン／ウラシル）は、それぞれ、１つまたは複数の発光分子（例えば、１つまたは複数の発光標識）で標識され得る。一部の実施形態では、各種類のヌクレオチドは、２つ以上の同一の発光分子（例えば、ヌクレオチドに結びついた２つ以上の同一の蛍光色素）に結びつくことができる。一部の実施形態では、各発光分子は、２つ以上のヌクレオチド（例えば、２つ以上の同一ヌクレオチド）に結びつくことができる。一部の実施形態では、２つ以上のヌクレオチドは、２つ以上の発光分子に結びつくことができる（例えば、１つまたは複数の保護分子を含む核酸リンカーを介して）。一部の実施形態では、４つのヌクレオチドすべてが、同一のスペクトル範囲（例えば、５２０～５７０ｎｍ）内で吸収および放出する発光分子で標識される。 In some embodiments, each of the four different nucleotides (e.g., adenine, guanine, cytosine, thymine/uracil) in the reaction mixture is associated with one or more luminescent molecules (e.g., one or more luminescent labels). ) may be labeled. In some embodiments, each type of nucleotide can be attached to two or more identical luminescent molecules (eg, two or more identical fluorescent dyes attached to the nucleotide). In some embodiments, each luminescent molecule can be attached to two or more nucleotides (eg, two or more identical nucleotides). In some embodiments, two or more nucleotides can be linked to two or more luminescent molecules (eg, via a nucleic acid linker that includes one or more protective molecules). In some embodiments, all four nucleotides are labeled with a luminescent molecule that absorbs and emits within the same spectral range (eg, 520-570 nm).

一部の実施形態は、高い正確性および長いリード長、例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、もしくは９９．９９９９％の正確性、および／または約１０塩基対（ｂｐ）、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、もしくは１００，０００ｂｐ以上のリード長等を有して、単一の核酸分子をシークエンシングする能力を有する。一部の実施形態では、単一分子のシークエンシングで使用される標的核酸分子は、固体支持体、例えば試料ウェルの底部または側壁等に固定されるかまたは連結した、シークエンシング反応の少なくとも１つの追加コンポーネント（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、シークエンシングプライマー）を含有する試料ウェル（例えば、ナノアパーチャ）に添加または固定化される一本鎖標的核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ誘導体、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＲＮＡ誘導体）鋳型である。標的核酸分子またはポリメラーゼは、試料壁、例えば試料ウェルの底部または側壁等に、直接またはリンカーを介して連結可能である。試料ウェル（例えば、ナノアパーチャ）は、プライマー伸長反応を介する核酸合成に必要とされる任意のその他の試薬、例えば適する緩衝剤、補助因子、酵素（例えば、ポリメラーゼ）等、ならびにデオキシリボヌクレオシドポリホスフェート、例えばデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、（デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）を含む）ｄＮＴＰ等を含有し得るが、これらは発光タグ、例えばフルオロフォア等を含む。一部の実施形態では、ｄＮＴＰ（例えば、アデニン含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ）、シトシン含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＣＴＰ）、グアニン含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＧＴＰ）、ウラシル含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＵＴＰ）、およびチミン含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＴＴＰ））の各クラスが、タグから放出された光の検出が新規に合成された核酸に組み込まれたｄＮＴＰの同一性を示すように、異なる発光タグにコンジュゲートしている。蛍光タグからの放射光は、例えば本明細書において別途記載されるような検出用のデバイスおよび方法等を含む、任意の適するデバイスおよび／または方法を介して検出可能、およびその該当する蛍光タグ（したがって、関連するｄＮＴＰ）に帰属可能である。蛍光タグは、蛍光タグの存在が新規に合成された核酸鎖へのｄＮＴＰの組み込みを阻害しない、またはポリメラーゼの活性を阻害しないような任意の位置においてｄＮＴＰにコンジュゲートし得る。一部の実施形態では、蛍光タグはｄＮＴＰの末端リン酸（例えば、ガンマリン酸）にコンジュゲートしている。 Some embodiments provide high accuracy and long read lengths, such as at least about 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. , 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, or 99.9999% accuracy, and/or approximately 10 base pairs (bp), 50bp, 100bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp , 1000bp, 10,000bp, 20,000bp, 30,000bp, 40,000bp, 50,000bp, or a read length of 100,000bp or more, and has the ability to sequence a single nucleic acid molecule. In some embodiments, the target nucleic acid molecule used in single molecule sequencing is immobilized or coupled to a solid support, such as the bottom or sidewall of a sample well, in at least one of the sequencing reactions. A single-stranded target nucleic acid (e.g., deoxyribonucleic acid (DNA), DNA derivative, Ribonucleic acid (RNA), RNA derivative) template. The target nucleic acid molecule or polymerase can be linked to a sample wall, such as the bottom or side wall of a sample well, directly or via a linker. The sample well (e.g., nanoaperture) contains any other reagents required for nucleic acid synthesis via the primer extension reaction, such as suitable buffers, cofactors, enzymes (e.g., polymerases), etc., as well as deoxyribonucleoside polyphosphates, For example, deoxyribonucleoside triphosphates, including deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxycytidine triphosphate (dCTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxyuridine triphosphate (dUTP), and deoxythymidine triphosphate (dTTP). These include luminescent tags, such as fluorophores, etc., although they may contain dNTPs and the like. In some embodiments, dNTPs, such as adenine-containing dNTPs (e.g., dATP), cytosine-containing dNTPs (e.g., dCTP), guanine-containing dNTPs (e.g., dGTP), uracil-containing dNTPs (e.g., dUTP), and thymine-containing dNTPs (e.g., dUTP), Each class of dNTPs (eg, dTTPs) is conjugated to a different luminescent tag such that detection of light emitted from the tag indicates the identity of the dNTP incorporated into the newly synthesized nucleic acid. Emitted light from a fluorescent tag can be detected via any suitable device and/or method, including, for example, devices and methods for detection as described elsewhere herein, and the corresponding fluorescent tag ( Therefore, it can be assigned to the related dNTP). The fluorescent tag may be conjugated to the dNTP at any position such that the presence of the fluorescent tag does not inhibit incorporation of the dNTP into the newly synthesized nucleic acid strand or inhibit the activity of the polymerase. In some embodiments, the fluorescent tag is conjugated to the terminal phosphate (eg, gamma phosphate) of the dNTP.

一部の実施形態では、一本鎖標的核酸鋳型は、核酸合成に必要なシークエンシングプライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、およびその他の試薬と接触し得る。一部の実施形態では、すべての該当するｄＮＴＰが、ｄＮＴＰの組み込みが連続して生じ得るように、一本鎖標的核酸鋳型と同時に接触し得る（例えば、すべてのｄＮＴＰが同時に存在する）。他の実施形態では、ｄＮＴＰは一本鎖標的核酸鋳型と逐次的に接触し得るが、その場合、一本鎖標的核酸鋳型が異なるｄＮＴＰと接触する間に洗浄工程を設けながら、一本鎖標的核酸鋳型は各該当するｄＮＴＰと個別に接触する。一本鎖標的核酸鋳型を各ｄＮＴＰと個別に接触させ、その後洗浄するそのようなサイクルは、同定される一本鎖標的核酸鋳型の連続する各塩基位置に対して反復され得る。 In some embodiments, a single-stranded target nucleic acid template may be contacted with sequencing primers, dNTPs, polymerases, and other reagents necessary for nucleic acid synthesis. In some embodiments, all applicable dNTPs may contact the single-stranded target nucleic acid template simultaneously (eg, all dNTPs are present at the same time) such that incorporation of dNTPs may occur sequentially. In other embodiments, the dNTPs may be contacted with a single-stranded target nucleic acid template sequentially, with washing steps provided between contacts of the single-stranded target nucleic acid template with different dNTPs. The nucleic acid template is individually contacted with each appropriate dNTP. Such cycles of individually contacting the single-stranded target nucleic acid template with each dNTP and then washing can be repeated for each successive base position of the single-stranded target nucleic acid template that is identified.

一部の実施形態では、シークエンシングプライマーが一本鎖標的核酸鋳型に対してアニーリングし、そしてポリメラーゼが、一本鎖標的核酸鋳型に基づき、ｄＮＴＰ（またはその他のデオキシリボヌクレオシドポリホスフェート）をプライマーに連続的に組み込む。組み込まれた各ｄＮＴＰと会合する固有の発光タグは、ｄＮＴＰをプライマーに組み込む期間中またはその後に適する励起光を用いて励起され得るが、またその発光は、本明細書において別途記載される検出用のデバイスおよび方法を含む、任意の適するデバイス（複数可）および／または方法（複数可）を使用してその後検出され得る。光（例えば、特定の放射（発光）寿命、強度、スペクトル、および／またはその組合せを有する）の特定の放射を検出することで、その検出を組み込まれた特定のｄＮＴＰに帰属することができる。検出された発光タグの収集から得られた配列は、次に配列相補性を介して一本鎖標的核酸鋳型の配列を決定するのに使用され得る。 In some embodiments, a sequencing primer anneals to a single-stranded target nucleic acid template, and a polymerase sequentially attaches a dNTP (or other deoxyribonucleoside polyphosphate) to the primer based on the single-stranded target nucleic acid template. Incorporate it. The unique luminescent tag associated with each incorporated dNTP can be excited using suitable excitation light during or after incorporation of the dNTP into the primer, but its luminescence can also be emitted for detection as described elsewhere herein. The detection may then be performed using any suitable device(s) and/or method(s), including the devices and methods of . By detecting a particular emission of light (e.g., having a particular emission lifetime, intensity, spectrum, and/or combination thereof), the detection can be attributed to the particular dNTP incorporated. The sequence obtained from the collection of detected luminescent tags can then be used to determine the sequence of a single-stranded target nucleic acid template via sequence complementarity.

本開示はｄＮＴＰについて言及するが、本明細書に提示されるデバイス、システム、および方法は、様々な種類のヌクレオチド、例えばリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド等（例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個のリン酸基を有するデオキシリボヌクレオシドポリホスフェート）と共に使用され得る。そのようなリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドは、様々な種類のタグ（またはマーカ）およびリンカーを含み得る。一部の実施形態では、本開示は、各内容を本願明細書に援用する、米国特許出願第１４／５４３，８６５号、同第１４／５４３，８６７号、同第１４／５４３，８８８号、同第１４／８２１，６５６号、同第１４／８２１，６８６号、同第１４／８２１，６８８号、同第１５／１６１，０６７号、同第１５／１６１，０８８号、同第１５／１６１，１２５号、同第１５／２５５，２４５号、同第１５／２５５，３０３号、同第１５／２５５，６２４号、同第１５／２６１，６９７号、および同第１５／２６１，７２４号に記載されている技術において有利に利用され得る方法および組成物を提供する。 Although this disclosure refers to dNTPs, the devices, systems, and methods presented herein can be applied to various types of nucleotides, such as ribonucleotides and deoxyribonucleotides (e.g., at least 4, 5, 6, 7, 8 , 9, or 10 phosphate groups). Such ribonucleotides and deoxyribonucleotides can include various types of tags (or markers) and linkers. In some embodiments, this disclosure relates to U.S. patent application Ser. 14/821,656, 14/821,686, 14/821,688, 15/161,067, 15/161,088, 15/161 , No. 125, No. 15/255,245, No. 15/255,303, No. 15/255,624, No. 15/261,697, and No. 15/261,724. Methods and compositions that can be advantageously utilized in the described technology are provided.

ヌクレオチドが組み込まれた際に放出されたシグナルはメモリ内に保管され、そして標的核酸鋳型の配列を決定するために後ほど処理され得る。これは、組み込まれたヌクレオチドの同一性を時間の関数として決定するために、シグナルを参照シグナルと比較することを含み得る。二者択一的または付加的に、ヌクレオチドが組み込まれた際に放出されたシグナルは、収集され、そして標的核酸鋳型の配列をリアルタイムで決定するためにリアルタイム処理され得る（例えば、ヌクレオチドが組み込まれた際に）。 The signal emitted upon incorporation of a nucleotide can be stored in memory and later processed to determine the sequence of the target nucleic acid template. This may involve comparing the signal to a reference signal to determine the identity of the incorporated nucleotide as a function of time. Alternatively or additionally, the signal emitted when a nucleotide is incorporated can be collected and processed in real-time to determine the sequence of a target nucleic acid template in real-time (e.g., when a nucleotide is incorporated). ).

用語「核酸」とは、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の核酸サブユニットを含む分子を一般的に指す。核酸は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、またはそのバリアントから選択される１つまたは複数のサブユニットを含み得る。いくつかの事例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはその誘導体である。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は環状であり得る。 The term "nucleic acid" as used herein generally refers to a molecule that includes one or more nucleic acid subunits. Nucleic acids may include one or more subunits selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T), and uracil (U), or variants thereof. In some cases, the nucleic acid is deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), or a derivative thereof. Nucleic acids can be single-stranded or double-stranded. Nucleic acids can be circular.

用語「ヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、核酸サブユニット（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、もしくはＵ、またはそのバリアントもしくはアナログを含み得る）を一般的に指す。ヌクレオチドは、増殖する核酸鎖に組み込み可能である任意のサブユニットを含み得る。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵであるか、あるいは１つもしくは複数の相補的Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、もしくはＵに対して特異的であるか、またはプリン（例えば、ＡもしくはＧ、またはそのバリアントもしくはアナログ）もしくはピリミジン（例えば、Ｃ、Ｔ、もしくはＵ、またはそのバリアントもしくはアナログ）に対して相補的である任意のその他のサブユニットであり得る。サブユニットは、個々の核酸塩基、または塩基の群（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡ、またはそのウラシルカウンターパート）の溶解を可能にすることができる。 The term "nucleotide" as used herein generally refers to a nucleic acid subunit (which may include A, C, G, T, or U, or variants or analogs thereof). Nucleotides can include any subunit that can be incorporated into a propagating nucleic acid strand. Such subunits may be A, C, G, T, or U, or may be specific for one or more complementary A, C, G, T, or U; (eg, A or G, or a variant or analog thereof) or any other subunit that is complementary to a pyrimidine (eg, C, T, or U, or a variant or analog thereof). The subunit allows for the dissolution of individual nucleobases or groups of bases (e.g., AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TG, AC, CA, or its uracil counterpart) be able to.

ヌクレオチドは、ヌクレオシドおよび少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ超のリン酸（ＰＯ_３）基を一般的に含む。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）、および１つまたは複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドモノホスフェートまたはヌクレオシドポリホスフェートであり得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドポリホスフェート、例えばデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート等であり得、それはデオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択され得るが、これらは検出可能なタグ、例えば発光タグまたはマーカ等（例えば、フルオロフォア）を含む。 Nucleotides generally include a nucleoside and at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more phosphate ( _PO3 ) groups. A nucleotide may contain a nucleobase, a pentose sugar (either ribose or deoxyribose), and one or more phosphate groups. Ribonucleotides are nucleotides whose sugar is ribose. Deoxyribonucleotides are nucleotides whose sugar is deoxyribose. The nucleotides can be nucleoside monophosphates or nucleoside polyphosphates. The nucleotide may be a deoxyribonucleoside polyphosphate, such as deoxyribonucleoside triphosphate, such as deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxycytidine triphosphate (dCTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxyuridine triphosphate (dUTP). and deoxythymidine triphosphate (dTTP) dNTPs, which include detectable tags, such as luminescent tags or markers (eg, fluorophores).

ヌクレオシドポリホスフェートは「ｎ個」のリン酸基を有し得るが、ただし「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の数である。ヌクレオシドポリホスフェートの例として、ヌクレオシドジホスフェートおよびヌクレオシドトリホスフェートが挙げられる。ヌクレオチドは、末端リン酸が標識されたヌクレオシド、例えば末端リン酸が標識されたヌクレオシドポリホスフェート等であり得る。そのような標識は、発光性（例えば、蛍光性または化学発光性）の標識、蛍光誘発性の標識、有色の標識、発色性の標識、質量タグ、静電標識、または電気化学的標識であり得る。標識（またはマーカ）はリンカーを介して末端リン酸と結びつくことができる。リンカーは、例えば少なくとも１つまたは複数のヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、またはハロアルキル基を含み得、それらは、例えば、天然または改変されたヌクレオチドの末端リン酸において、リン酸エステル、チオエステル、ホスホルアミデート、またはアルキルホスホナート結合を形成するのに適すると考えられる。リンカーは、例えば重合酵素の支援を得る等して末端リン酸から標識を分離するように、切断可能であり得る。ヌクレオチドおよびリンカーの例は、本願明細書に援用する米国特許第７，０４１，８１２号明細書に提示されている。 The nucleoside polyphosphate can have "n" phosphate groups, where "n" is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or a number greater than or equal to 10. Examples of nucleoside polyphosphates include nucleoside diphosphates and nucleoside triphosphates. The nucleotide may be a terminal phosphate labeled nucleoside, such as a terminal phosphate labeled nucleoside polyphosphate. Such labels may be luminescent (e.g., fluorescent or chemiluminescent), fluorescence-inducing, colored, chromogenic, mass tags, electrostatic, or electrochemical labels. obtain. A label (or marker) can be attached to the terminal phosphate via a linker. The linker may contain, for example, at least one or more hydroxyl, sulfhydryl, amino, or haloalkyl groups, such as phosphoric acid esters, thioesters, phosphoric acid esters, etc., at the terminal phosphate of the natural or modified nucleotide. lamidate, or alkylphosphonate linkages. The linker may be cleavable, such as to separate the label from the terminal phosphate, such as with the aid of a polymerizing enzyme. Examples of nucleotides and linkers are provided in US Pat. No. 7,041,812, which is incorporated herein by reference.

ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドポリホスフェート）は、メチル化された核酸塩基を含み得る。例えば、メチル化されたヌクレオチドは、核酸塩基に連結した（例えば、核酸塩基の環に直接連結した、核酸塩基の環の置換基に連結した）１つまたは複数のメチル基を含むヌクレオチドであり得る。例示的なメチル化された核酸塩基として、１－メチルチミン、１－メチルウラシル、３－メチルウラシル、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、７－メチルアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ_６、Ｎ_６－ジメチルアデニン、１－メチルグアニン、７－メチルグアニン、Ｎ_２－メチルグアニン、およびＮ_２、Ｎ_２－ジメチルグアニンが挙げられる。 Nucleotides (eg, nucleotide polyphosphates) can include methylated nucleobases. For example, a methylated nucleotide can be a nucleotide that includes one or more methyl groups linked to the nucleobase (e.g., directly linked to the nucleobase ring, linked to a substituent in the nucleobase ring). . Exemplary methylated nucleobases include 1-methylthymine, 1-methyluracil, 3-methyluracil, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, 1-methyladenine, 2-methyladenine, 7-methyladenine, N6-methyladenine, _N6 , _N6 -dimethyladenine, 1-methylguanine, 7-methylguanine, _N2 -methylguanine, and _N2 , _N2 -dimethylguanine.

用語「プライマー」とは、本明細書で使用される場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、および／またはＵ、あるいはそのバリアントまたはアナログを含む配列を含み得る核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を一般的に指す。プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはそのバリアントもしくはアナログを含む合成オリゴヌクレオチドであり得る。プライマーは、そのヌクレオチド配列が標的鎖に対して相補的であるように設計され得るか、またはプライマーはランダムヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、尾部（例えば、ポリＡ尾部、インデックスアダプター、分子バーコード等）を含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、５～１５塩基、１０～２０塩基、１５～２５塩基、２０～３０塩基、２５～３５塩基、３０～４０塩基、３５～４５塩基、４０～５０塩基、４５～５５塩基、５０～６０塩基、５５～６５塩基、６０～７０塩基、６５～７５塩基、７０～８０塩基、７５～８５塩基、８０～９０塩基、８５～９５塩基、９０～１００塩基、９５～１０５塩基、１００～１５０塩基、１２５～１７５塩基、１５０～２００塩基、または２００塩基超を含み得る。 The term "primer" as used herein refers generally to a nucleic acid molecule (e.g., an oligonucleotide) that may include a sequence containing A, C, G, T, and/or U, or a variant or analog thereof. point to. Primers can be synthetic oligonucleotides containing DNA, RNA, PNA, or variants or analogs thereof. The primer can be designed such that its nucleotide sequence is complementary to the target strand, or the primer can contain a random nucleotide sequence. In some embodiments, a primer can include a tail (eg, a poly A tail, an index adapter, a molecular barcode, etc.). In some embodiments, the primers are 5-15 bases, 10-20 bases, 15-25 bases, 20-30 bases, 25-35 bases, 30-40 bases, 35-45 bases, 40-50 bases, 45-55 bases, 50-60 bases, 55-65 bases, 60-70 bases, 65-75 bases, 70-80 bases, 75-85 bases, 80-90 bases, 85-95 bases, 90-100 bases, It may contain 95-105 bases, 100-150 bases, 125-175 bases, 150-200 bases, or more than 200 bases.

ペプチドシークエンシング
一部の実施形態では、本開示の態様は、生体試料をアッセイするのに、例えば、試料中の１つもしくは複数のポリペプチドの同一性もしくは配列を決定し、および／または試料中の１つもしくは複数のバリアント（例えば、目的のポリペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸置換）の有無を判定するのに使用可能である。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物には、ペプチド分解工程期間中に単一分子結合相互作用を検出することによるペプチドシークエンシング（「ポリペプチドシークエンシング」とも呼ばれる）を施すことができる。一部の実施形態では、目的のペプチドは、表面に共有結合的または非共有結合的に連結している。 Peptide Sequencing In some embodiments, aspects of the present disclosure are useful for assaying biological samples, e.g., determining the identity or sequence of one or more polypeptides in a sample, and/or determining the identity or sequence of one or more polypeptides in a sample. can be used to determine the presence or absence of one or more variants (eg, one or more amino acid substitutions within a polypeptide of interest). In some embodiments, the compounds described herein are subjected to peptide sequencing (also referred to as "polypeptide sequencing") by detecting single molecule binding interactions during the peptidolysis step. be able to. In some embodiments, the peptide of interest is covalently or non-covalently linked to the surface.

本明細書で使用される場合、ポリペプチドのシークエンシングとは、ポリペプチドについて配列情報を決定することを指す。一部の実施形態では、これは、ポリペプチドの一部（または全部）について、連続する各アミノ酸の同一性を決定することを伴い得る。しかしながら、一部の実施形態では、これは、ポリペプチド内のアミノ酸のサブセットの同一性を評価すること（および、例えば、ポリペプチド内の各アミノ酸の同一性を決定することなく、１つまたは複数のアミノ酸の種類について、その相対的な位置を決定すること）を伴い得る。一部の実施形態では、アミノ酸含有量情報は、ポリペプチド内の異なる種類のアミノ酸の相対的位置を直接決定することなく、ポリペプチドから取得可能である。アミノ酸含有量は、それ単独で、存在するポリペプチドの同一性を推測するのに使用され得る（例えば、アミノ酸含有量をポリペプチド情報のデータベースと比較し、そしてどのポリペプチド（複数可）が同一のアミノ酸含有量を有するか決定することにより）。 As used herein, sequencing a polypeptide refers to determining sequence information about a polypeptide. In some embodiments, this may involve determining the identity of each consecutive amino acid for part (or all) of the polypeptide. However, in some embodiments, this involves assessing the identity of a subset of amino acids within a polypeptide (and, e.g., one or more amino acids without determining the identity of each amino acid within a polypeptide). (determining the relative positions of different types of amino acids). In some embodiments, amino acid content information can be obtained from a polypeptide without directly determining the relative positions of different types of amino acids within the polypeptide. Amino acid content alone can be used to infer the identity of polypeptides present (e.g., comparing amino acid content to a database of polypeptide information and determining which polypeptide(s) are identical). (by determining whether it has an amino acid content of ).

一部の態様では、本明細書に提示されるペプチドをシークエンシングするための方法は、ポリペプチドの１種類または複数種類のアミノ酸を特定することにより実施され得る。一部の実施形態では、ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸（例えば、末端アミノ酸および／または内部アミノ酸）は標識され（例えば、結合剤、例えばアミノ酸認識分子等を使用しながら、例えば直接的または間接的に）、そしてポリペプチド内の標識されたアミノ酸の相対的な位置が決定される。一部の実施形態では、ポリペプチド内のアミノ酸の相対的な位置は、一連のアミノ酸標識を使用して決定される。ある特定の実施形態では、ポリペプチド内のアミノ酸の相対的な位置は、一連の標識工程および切断工程を使用して決定される。しかしながら、一部の実施形態では、ポリペプチド内の標識されたアミノ酸の相対的な位置は、ポリペプチドからアミノ酸を取り除くことなく、むしろ標識されたポリペプチドを、孔（例えば、タンパク質チャネル）を通じて配置転換させ、そしてポリペプチド分子内の標識されたアミノ酸の相対的な位置を決定するために、孔を通じて配置転換させる期間中に標識されたアミノ酸（複数可）からのシグナル（例えば、ＦＲＥＴシグナル）を検出することにより決定可能である。 In some aspects, the methods for sequencing peptides provided herein can be performed by identifying one or more amino acids of a polypeptide. In some embodiments, one or more amino acids (e.g., terminal amino acids and/or internal amino acids) of a polypeptide are labeled (e.g., directly or indirectly), and the relative position of the labeled amino acid within the polypeptide is determined. In some embodiments, the relative positions of amino acids within a polypeptide are determined using a series of amino acid labels. In certain embodiments, the relative positions of amino acids within a polypeptide are determined using a series of labeling and cleavage steps. However, in some embodiments, the relative position of a labeled amino acid within a polypeptide is such that the labeled polypeptide is positioned through a pore (e.g., a protein channel) without removing the amino acid from the polypeptide. A signal (e.g., a FRET signal) from the labeled amino acid(s) during translocation through the pores to determine the relative position of the labeled amino acid within the polypeptide molecule. It can be determined by detection.

一部の実施形態では、末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸）の同一性が評価され、その後に、末端アミノ酸が除去され、そして末端に位置する次のアミノ酸の同一性が評価されるが、この工程は、ポリペプチド内の複数の連続するアミノ酸が評価されるまで、繰り返される。一部の実施形態では、アミノ酸の同一性を評価する工程は、存在するアミノ酸の種類の決定を含む。一部の実施形態では、アミノ酸の種類の決定は、例えば、天然に存在する２０個のアミノ酸のうちのどれが末端アミノ酸であるか決定することにより（例えば、個々の末端アミノ酸に対して特異的である結合剤を使用しながら）、実際のアミノ酸の同一性を決定する工程を含む。一部の実施形態では、アミノ酸の種類は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セレノシステイン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される。 In some embodiments, the identity of the terminal amino acid (e.g., N-terminal or C-terminal amino acid) is assessed, then the terminal amino acid is removed, and the identity of the next terminally located amino acid is assessed. However, this step is repeated until multiple consecutive amino acids within the polypeptide have been evaluated. In some embodiments, assessing amino acid identity includes determining the types of amino acids present. In some embodiments, determining the type of amino acid is determined, e.g., by determining which of the 20 naturally occurring amino acids is the terminal amino acid (e.g., specific for each terminal amino acid). (using a binding agent that is a binding agent), including the step of determining the identity of the actual amino acid. In some embodiments, the amino acid types include alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, selenocysteine, serine, threonine, selected from tryptophan, tyrosine, and valine.

しかしながら、一部の実施形態では、末端アミノ酸種類の同一性を評価する工程は、ポリペプチドの末端に存在し得る潜在的アミノ酸のサブセットを決定する工程を含み得る。一部の実施形態では、これは、アミノ酸は１つまたは複数の特定のアミノ酸ではない（したがって、その他のアミノ酸のいずれかであり得る）ことを決定することにより実現可能である。一部の実施形態では、これは、アミノ酸の特定のサブセットのどれが（例えば、サイズ、電荷、疎水性、翻訳後修飾、結合特性に基づき）、ポリペプチドの末端に位置し得るか（例えば、２つ以上の末端アミノ酸の特定のサブセットと結合する結合剤を使用しながら）決定することにより実現可能である。一部の実施形態では、末端アミノ酸種類の同一性を評価する工程は、アミノ酸が翻訳後修飾を含むことを決定する工程を含む。 However, in some embodiments, assessing terminal amino acid class identity may include determining a subset of potential amino acids that may be present at the ends of the polypeptide. In some embodiments, this can be accomplished by determining that the amino acid is not one or more specific amino acids (and thus can be any of the other amino acids). In some embodiments, this determines which of a particular subset of amino acids (e.g., based on size, charge, hydrophobicity, post-translational modification, binding properties) may be located at the end of a polypeptide (e.g., (using a binding agent that binds a specific subset of two or more terminal amino acids). In some embodiments, assessing the identity of the terminal amino acid species comprises determining that the amino acid contains a post-translational modification.

一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、ポリペプチドを、１種類の末端アミノ酸に選択的に結合する標識されたアミノ酸認識分子と接触させる工程を含む。一部の実施形態では、標識された認識分子は、その他の種類の末端アミノ酸よりも、１種類の末端アミノ酸に選択的に結合する。一部の実施形態では、標識された認識分子は、同一種類の内部アミノ酸よりも１種類の末端アミノ酸に選択的に結合する。なおも他の実施形態では、標識された認識分子は、ポリペプチドの任意の位置において１種類のアミノ酸、例えば末端アミノ酸および内部アミノ酸と同一種類のアミノ酸に選択的に結合する。 In some embodiments, the methods provided herein include contacting the polypeptide with a labeled amino acid recognition molecule that selectively binds to one type of terminal amino acid. In some embodiments, the labeled recognition molecule binds selectively to one type of terminal amino acid over other types of terminal amino acids. In some embodiments, the labeled recognition molecule binds selectively to one type of terminal amino acid over internal amino acids of the same type. In yet other embodiments, the labeled recognition molecule selectively binds to one type of amino acid at any position of the polypeptide, such as the same type of amino acid as the terminal and internal amino acids.

一部の実施形態では、ポリペプチドシークエンシングは、１種類または複数種類の末端アミノ酸と会合するポリペプチドを１つまたは複数のアミノ酸認識分子と接触させることにより進行可能である。一部の実施形態では、標識されたアミノ酸認識分子は、末端アミノ酸と会合することによりポリペプチドと相互作用する。 In some embodiments, polypeptide sequencing can proceed by contacting a polypeptide associated with one or more terminal amino acids with one or more amino acid recognition molecules. In some embodiments, the labeled amino acid recognition molecule interacts with the polypeptide by associating with the terminal amino acid.

一部の実施形態では、標識された認識分子の１つまたは複数の電気的特徴を検出することにより、１種類または複数種類のアミノ酸が同定される。一部の実施形態では、標識された認識分子は、１種類のアミノ酸に選択的に結合する認識分子、および認識分子と会合する伝導度標識を含む。このように、１つまたは複数の電気的特徴（例えば、電荷、電流振動カラー（ｃｕｒｒｅｎｔｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｃｏｌｏｒ）、およびその他の電気的特徴）は、ポリペプチドのアミノ酸を同定するための認識分子の選択的結合と関連し得る。一部の実施形態では、複数種類の標識された認識分子が、本出願に基づく方法に使用され得るが、その場合、各種類は、複数の中から一意的に特定可能な電気信号の変化（例えば伝導性の変化、例えば伝導度の強度変化や特徴的なパターンの伝導度遷移等）を生成する伝導度標識を含む。一部の実施形態では、複数種類の標識された認識分子のそれぞれは、異なる数の荷電基（例えば、異なる数の負荷電基および／または正荷電基）を有する伝導度標識を含む。したがって、一部の実施形態では、伝導度標識は電荷標識である。電荷標識の例として、複数の荷電基を有するデンドリマー、ナノ粒子、核酸、およびその他のポリマーが挙げられる。一部の実施形態では、伝導度標識は、その正味電荷（例えば、正味の正電荷または正味の負電荷）により、その電荷密度により、および／またはその荷電基の数により一義的に特定可能である。 In some embodiments, one or more amino acids are identified by detecting one or more electrical signatures of a labeled recognition molecule. In some embodiments, the labeled recognition molecule includes a recognition molecule that selectively binds to one type of amino acid and a conductivity label associated with the recognition molecule. Thus, one or more electrical characteristics (e.g., charge, current oscillation color, and other electrical characteristics) can be used to selectively bind a recognition molecule to identify amino acids of a polypeptide. It can be related to In some embodiments, more than one type of labeled recognition molecule may be used in a method based on the present application, where each type has a uniquely identifiable change in electrical signal ( For example, conductivity markers that produce changes in conductivity, such as intensity changes in conductivity or characteristic patterns of conductivity transitions, etc. In some embodiments, each of the plurality of types of labeled recognition molecules includes a conductivity label with a different number of charged groups (eg, a different number of negatively charged groups and/or positively charged groups). Thus, in some embodiments, the conductivity label is a charge label. Examples of charge labels include dendrimers, nanoparticles, nucleic acids, and other polymers with multiple charged groups. In some embodiments, a conductivity label is uniquely identifiable by its net charge (e.g., net positive charge or net negative charge), by its charge density, and/or by its number of charged groups. be.

したがって、一部の実施形態では、１種類または複数種類のアミノ酸に選択的に結合する１つまたは複数の標識されたアミノ酸認識分子の発光寿命または発光強度を検出することにより、１種類または複数種類のアミノ酸が同定される。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、ポリペプチドを、１種類または複数種類の末端アミノ酸に選択的に結合する１つまたは複数の標識されたアミノ酸認識分子（または認識分子）と接触させる工程を含む。例証的および非限定的な例として、４つの標識された認識分子が本出願の方法で使用される場合、任意の１つの試薬が、１種類の末端アミノ酸（他の３試薬のいずれかが選択的に結合する別の種類のアミノ酸とは異なる）に選択的に結合する（例えば、第１の試薬は第１の種類の末端アミノ酸に結合し、第２の試薬は第２の種類の末端アミノ酸に結合し、第３の試薬は第３の種類の末端アミノ酸に結合し、そして第４の試薬は第４の種類の末端アミノ酸に結合する）。 Accordingly, in some embodiments, one or more amino acids can be identified by detecting the luminescence lifetime or intensity of one or more labeled amino acid recognition molecules that selectively bind to one or more amino acids. amino acids are identified. In some embodiments, the methods presented herein provide a method for binding a polypeptide to one or more labeled amino acid recognition molecules (or recognition molecules) that selectively bind one or more terminal amino acids. ). As an illustrative and non-limiting example, if four labeled recognition molecules are used in the methods of the present application, any one reagent may be used to identify one type of terminal amino acid (any of the other three reagents may (e.g., the first reagent binds to the terminal amino acid of the first type and the second reagent selectively binds to the terminal amino acid of the second type). a third reagent binds to a third type of terminal amino acid, and a fourth reagent binds to a fourth type of terminal amino acid).

一部の実施形態では、認識分子は、従来知られている技術を使用しながら、当業者により工学操作され得る。一部の実施形態では、望ましい特性は、１種類のアミノ酸がポリペプチドの末端（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に位置するときに限り、高い親和性を有してそれに選択的に結合する能力を含み得る。なおも他の実施形態では、望ましい特性は、１種類のアミノ酸がポリペプチドの末端（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に位置するとき、およびポリペプチドの内部位置に位置するときに、高い親和性を有してそれに選択的に結合する能力を含み得る。一部の実施形態では、望ましい特性には、２種類以上のアミノ酸に、低親和性を有しながら（例えば、約５０ｎＭ以上、例えば約５０ｎＭ～約５０μＭの間、約１００ｎＭ～約１０μＭの間、約５００ｎＭ～約５０μＭの間のＫ_Ｄを有しながら）選択的に結合する能力が含まれる。例えば、一部の態様では、本開示は、可逆的結合相互作用を検出することによりシークエンシングする方法を提示する。有利には、そのような方法は、低親和性を有しながら２種類以上のアミノ酸（例えば、アミノ酸タイプのサブセット）に可逆的に結合する認識分子を使用して実施され得る。 In some embodiments, recognition molecules can be engineered by those skilled in the art using techniques known in the art. In some embodiments, a desirable property is the ability to selectively bind to one type of amino acid with high affinity only when it is located at the terminal end (e.g., N-terminus or C-terminus) of the polypeptide. may include. In still other embodiments, the desirable property is high affinity when one amino acid is located at the terminal end of the polypeptide (e.g., N-terminus or C-terminus) and when located at an internal position of the polypeptide. and the ability to selectively bind thereto. In some embodiments, desirable properties include having a low affinity for two or more amino acids (e.g., about 50 nM or more, such as between about 50 nM and about 50 μM, between about 100 nM and about 10 μM), The ability to bind selectively (with a K _D between about 500 nM and about 50 μM) is included. For example, in some aspects, the present disclosure provides methods of sequencing by detecting reversible binding interactions. Advantageously, such methods may be performed using recognition molecules that reversibly bind more than one amino acid (eg, a subset of amino acid types) with low affinity.

一部の実施形態では、ポリペプチドシークエンシングは、カップリング部分および／またはコーティング分子を通じて固体支持体の表面体にコーティングされた（例えば、試料ウェルの底部表面に連結した）目的のポリペプチドを提供することを含む。一部の実施形態では、カップリング部分－コーティング分子コンジュゲートは、ウェルの表面にコーティングされたビオチンカップリング部分とストレプトアビジンカップリング部分との間のリンケージにより形成される。 In some embodiments, polypeptide sequencing provides a polypeptide of interest coated on the surface of a solid support (e.g., linked to the bottom surface of a sample well) through a coupling moiety and/or a coating molecule. including doing. In some embodiments, the coupling moiety-coating molecule conjugate is formed by a linkage between a biotin coupling moiety and a streptavidin coupling moiety coated on the surface of the well.

一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、カップリング部分を通じて、一方の末端部において表面に固定化される一方、他方の末端部はシークエンシング反応において末端アミノ酸が検出および切断されるように自由な状態にある。したがって、一部の実施形態では、ある特定のポリペプチドシークエンシング反応で使用される試薬は、ポリペプチドの非固定化された（例えば、遊離した）末端において、末端アミノ酸と選好的に相互作用する。このように、ポリペプチドは、検出および切断の反復したサイクルにおいて固定化されたまま存続する。 In some embodiments, the polypeptide of interest is immobilized to the surface at one end through a coupling moiety, while the other end is such that the terminal amino acid is detected and cleaved in a sequencing reaction. is in a free state. Thus, in some embodiments, reagents used in certain polypeptide sequencing reactions preferentially interact with terminal amino acids at the non-immobilized (e.g., free) ends of the polypeptide. . In this way, the polypeptide remains immobilized through repeated cycles of detection and cleavage.

一部の実施形態では、ポリペプチドシークエンシングは、ポリペプチドを、１種類または複数種類の末端アミノ酸と会合する１つまたは複数のアミノ酸認識分子と接触させることにより進めることができる。一部の実施形態では、標識されたアミノ酸認識分子は、末端アミノ酸と会合することによりポリペプチドと相互作用する。 In some embodiments, polypeptide sequencing can proceed by contacting the polypeptide with one or more amino acid recognition molecules that are associated with one or more terminal amino acids. In some embodiments, the labeled amino acid recognition molecule interacts with the polypeptide by associating with the terminal amino acid.

一部の実施形態では、方法は、標識されたアミノ酸認識分子を検出することによりポリペプチドのアミノ酸（末端または内部アミノ酸）を同定する工程をさらに含む。一部の実施形態では、検出する工程は、標識されたアミノ酸認識分子から発した発光を検出する工程を含む。一部の実施形態では、発光は標識されたアミノ酸認識分子と一義的に関連し、これにより、発光は標識されたアミノ酸認識分子が選択的に結合するアミノ酸の種類と関連する。したがって、一部の実施形態では、標識されたアミノ酸認識分子の１つまたは複数の発光特性を決定することにより、アミノ酸の種類が特定される。 In some embodiments, the method further comprises identifying amino acids (terminal or internal amino acids) of the polypeptide by detecting a labeled amino acid recognition molecule. In some embodiments, detecting includes detecting luminescence emitted from the labeled amino acid recognition molecule. In some embodiments, the luminescence is uniquely associated with the labeled amino acid recognition molecule, such that the luminescence is associated with the type of amino acid that the labeled amino acid recognition molecule selectively binds. Thus, in some embodiments, the type of amino acid is identified by determining one or more luminescent properties of a labeled amino acid recognition molecule.

他の実施形態では、ポリペプチドシークエンシングは、ポリペプチドをエキソペプチダーゼ（ポリペプチドの末端アミノ酸に結合し、それを切断する）と接触させることにより末端アミノ酸を取り除くことによって進行する。エキソペプチダーゼにより末端アミノ酸が取り除かれると、ポリペプチドシークエンシングは、ポリペプチド（ｎ－１個のアミノ酸を有する）を末端アミノ酸の認識および切断の追加サイクルに付すことにより進行する。一部の実施形態では、これらの工程は、例えば、動的ペプチドシークエンシング反応の場合と同じ反応混合物において生じ得る。一部の実施形態では、これらの工程は、当技術分野において公知のその他の方法、例えばエドマン分解によるペプチドシークエンシング等を使用して実施され得る。 In other embodiments, polypeptide sequencing proceeds by removing terminal amino acids by contacting the polypeptide with an exopeptidase, which binds to and cleaves the terminal amino acids of the polypeptide. Once the terminal amino acid is removed by an exopeptidase, polypeptide sequencing proceeds by subjecting the polypeptide (having n-1 amino acids) to additional cycles of terminal amino acid recognition and cleavage. In some embodiments, these steps can occur in the same reaction mixture as, for example, a dynamic peptide sequencing reaction. In some embodiments, these steps may be performed using other methods known in the art, such as peptide sequencing by Edman degradation.

一部の実施形態では、動的ポリペプチドシークエンシングは、末端アミノ酸と標識されたアミノ酸認識分子、および必要に応じて切断試薬（例えば、エキソペプチダーゼ）との結合相互作用を評価することによりリアルタイムで実施される。標識されたアミノ酸認識分子は、末端アミノ酸と会合（例えば、結合）し、それから解離し得るが、それは末端アミノ酸を特定するのに使用され得る信号アウトプットにおいて一連のパルスを惹起する。一部の実施形態では、一連のパルスは、対応する末端アミノ酸の同一性の診断に役立ち得るパルシングパターン（例えば、特徴的なパターン）を提供する。 In some embodiments, dynamic polypeptide sequencing is performed in real time by assessing the binding interactions between terminal amino acids and labeled amino acid recognition molecules, and optionally cleavage reagents (e.g., exopeptidases). Implemented. A labeled amino acid recognition molecule can associate with (eg, bind to) and dissociate from a terminal amino acid, causing a series of pulses in the signal output that can be used to identify the terminal amino acid. In some embodiments, the series of pulses provides a pulsing pattern (eg, a characteristic pattern) that can aid in diagnosing the identity of the corresponding terminal amino acids.

エドマン分解は、ポリペプチドの末端アミノ酸を修飾および切断する反復したサイクルを伴い、連続的に切断されたアミノ酸のそれぞれが同定され、ポリペプチドのアミノ酸配列が決定される。従来のエドマン分解によるペプチドシークエンシングは、（１）目的のポリペプチドを、１種類または複数種類の末端アミノ酸に選択的に結合する１つまたは複数のアミノ酸認識分子と接触させることにより実施可能である。一部の実施形態では、工程（１）は、ポリペプチドに選択的に結合しない１つまたは複数の標識されたアミノ酸認識分子のいずれかを取り除く工程をさらに含む。 Edman degradation involves repeated cycles of modifying and cleaving the terminal amino acids of a polypeptide, with each successively cleaved amino acid being identified and the amino acid sequence of the polypeptide being determined. Peptide sequencing by conventional Edman degradation can be performed by (1) contacting a polypeptide of interest with one or more amino acid recognition molecules that selectively bind to one or more terminal amino acids; . In some embodiments, step (1) further comprises removing any of the one or more labeled amino acid recognition molecules that do not selectively bind to the polypeptide.

一部の実施形態では、動的ペプチドシークエンシングが、異なる会合事象、例えばアミノ酸認識分子とペプチドの末端に位置するアミノ酸との間の会合事象を観察することにより実施されるが、その場合、各会合事象は、シグナル、例えば発光シグナルの強度変化（ある期間遷延する）を生成する。 In some embodiments, dynamic peptide sequencing is performed by observing different association events, such as between an amino acid recognition molecule and an amino acid located at the end of a peptide, where each The association event generates a signal, eg a change in intensity of a luminescent signal (prolonged over a period of time).

一部の実施形態では、異なる会合事象、例えばアミノ酸認識分子とペプチドの末端に位置するアミノ酸との間の会合事象を観察することは、ペプチド分解工程期間中に実施可能である。一部の実施形態では、１つの特徴的なシグナルパターンから別のパターンへの移行は、アミノ酸切断（例えば、ペプチド分解に起因するアミノ酸切断）を示す。一部の実施形態では、アミノ酸切断とは、ポリペプチドの末端からの少なくとも１つのアミノ酸の除去（例えば、ポリペプチドからの少なくとも１つの末端アミノ酸の除去）を指す。一部の実施形態では、アミノ酸切断は、特徴的なシグナルパターン間の持続時間に基づく推定により決定される。一部の実施形態では、アミノ酸切断は、標識された切断試薬とポリペプチドの末端に位置するアミノ酸との会合により生成されたシグナルの変化を検出することにより決定される。一部の実施形態では、切断試薬（エキソペプチダーゼ）が使用される場合、アミノ酸は、分解期間中にポリペプチドの末端から逐次的に切断されるので、一連の強度変化または一連の信号パルスが検出される。 In some embodiments, observing different association events, such as between an amino acid recognition molecule and an amino acid located at the end of a peptide, can be performed during the peptidolysis step. In some embodiments, the transition from one characteristic signal pattern to another is indicative of amino acid cleavage (eg, amino acid cleavage due to peptidolysis). In some embodiments, amino acid truncation refers to the removal of at least one amino acid from the end of a polypeptide (eg, removal of at least one terminal amino acid from the polypeptide). In some embodiments, amino acid cleavage is determined by estimation based on the duration between characteristic signal patterns. In some embodiments, amino acid cleavage is determined by detecting a change in the signal generated by the association of a labeled cleavage reagent with an amino acid located at the end of a polypeptide. In some embodiments, when a cleavage reagent (exopeptidase) is used, amino acids are sequentially cleaved from the end of the polypeptide during the degradation period so that a series of intensity changes or a series of signal pulses is detected. be done.

一部の実施形態では、信号パルス情報は、一連の信号パルス内の特徴的なパターンに基づきアミノ酸を同定するのに使用され得る。一部の実施形態では、特徴的パターンは複数の信号パルスを含み、各信号パルスはパルス持続時間を含む。一部の実施形態では、複数の信号パルスが、特徴的パターンにおけるパルス持続時間の分布に関する要約統計量（例えば、平均、メジアン、時間減衰定数）により特徴付けられ得る。一部の実施形態では、特徴的パターンの平均パルス持続時間は、約１ミリセカンド～約１０秒の間（例えば、約１ｍｓ～約１秒の間、約１ｍｓ～約１００ｍｓの間、約１ｍｓ～約１０ｍｓの間、約１０ｍｓ～約１０秒の間、約１００ｍｓ～約１０秒の間、約１秒～約１０秒の間、約１０ｍｓ～約１００ｍｓの間、または約１００ｍｓ～約５００ｍｓの間）である。一部の実施形態では、単一のポリペプチド内の異なる種類のアミノ酸に対応する異なる特徴的パターンは、要約統計量における統計的有意差に基づき相互に区別され得る。例えば、一部の実施形態では、１つの特徴的パターンは、少なくとも１０ミリセカンド（例えば、約１０ｍｓ～約１０秒の間、約１０ｍｓ～約１秒の間、約１０ｍｓ～約１００ｍｓの間、約１００ｍｓ～約１０秒の間、約１秒～約１０秒の間、または約１００ｍｓ～約１秒の間）の平均パルス持続時間の差異に基づき、別の特徴的パターンから区別可能であり得る。一部の実施形態では、統計的信頼度を有してあるパターンを別のパターンと区別するには、異なる特徴的パターン間の平均パルス持続時間における差異が小さいほど、各特徴的パターンにおいてより多くのパルス持続時間を必要とし得るものと認識すべきである。 In some embodiments, signal pulse information may be used to identify amino acids based on characteristic patterns within a series of signal pulses. In some embodiments, the characteristic pattern includes a plurality of signal pulses, each signal pulse including a pulse duration. In some embodiments, a plurality of signal pulses may be characterized by summary statistics (eg, mean, median, time decay constant) regarding the distribution of pulse durations in a characteristic pattern. In some embodiments, the average pulse duration of the characteristic pattern is between about 1 millisecond and about 10 seconds (e.g., between about 1 ms and about 1 second, between about 1 ms and about 100 ms, between about 1 ms and about 10 seconds). for about 10 ms, between about 10 ms and about 10 seconds, between about 100 ms and about 10 seconds, between about 1 second and about 10 seconds, between about 10 ms and about 100 ms, or between about 100 ms and about 500 ms) It is. In some embodiments, different characteristic patterns corresponding to different types of amino acids within a single polypeptide can be distinguished from each other based on statistically significant differences in summary statistics. For example, in some embodiments, the one characteristic pattern is for at least 10 milliseconds (e.g., between about 10 ms and about 10 seconds, between about 10 ms and about 1 second, between about 10 ms and about 100 ms, about The pattern may be distinguishable from another characteristic pattern based on a difference in average pulse duration of between 100 ms and about 10 seconds, between about 1 second and about 10 seconds, or between about 100 ms and about 1 second). In some embodiments, to distinguish one pattern from another with statistical confidence, the smaller the difference in average pulse duration between different characteristic patterns, the more It should be recognized that a pulse duration of

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される化合物の任意の１つを試料ウェルの表面に連結することにより、ペプチドまたはアミノ酸認識分子を表面に固定する方法を提示する。一部の実施形態では、表面は、ペプチドの機能化された末端部に連結（例えば、共有結合）するように構成されたカップリング部分を用いて機能化される。一部の実施形態では、方法は、複数の試料ウェルそれぞれの表面に単一のペプチドを固定化する工程を含む。一部の実施形態では、試料ウェル毎に単一のペプチドを封じ込めることは、単一分子検出方法、例えば単一分子ペプチドシークエンシングにとって有利である。 In some aspects, this disclosure presents a method of immobilizing a peptide or amino acid recognition molecule to a surface by linking any one of the compounds described herein to the surface of a sample well. In some embodiments, the surface is functionalized with a coupling moiety configured to link (eg, covalently bond) to the functionalized end of the peptide. In some embodiments, the method includes immobilizing a single peptide on the surface of each of a plurality of sample wells. In some embodiments, confinement of a single peptide per sample well is advantageous for single molecule detection methods, such as single molecule peptide sequencing.

一部の実施形態では、機能化された末端部を含むペプチドは相補的なカップリング部分と接触する。一部の実施形態では、機能化された末端部およびカップリング部分は、非共有結合性の結合パートナー（例えば、ペプチドと試料ウェル表面の間に非共有結合性のリンケージを形成する）を含む。非共有結合性の結合パートナーの例として、タンパク質－タンパク質結合パートナー（例えば、バルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）およびバルスター（ｂａｒｓｔａｒ））、およびタンパク質－リガンド結合パートナー（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）が挙げられる。 In some embodiments, a peptide containing a functionalized terminus is contacted with a complementary coupling moiety. In some embodiments, the functionalized terminus and coupling moiety include a non-covalent binding partner (eg, forming a non-covalent linkage between the peptide and the sample well surface). Examples of non-covalent binding partners include protein-protein binding partners (eg, barnase and barstar) and protein-ligand binding partners (eg, biotin and streptavidin).

発光寿命測定を使用したシークエンシング
集積光検出器上の個々のピクセルは、分子または分子上の特定の位置等の１つまたは複数の標的を標識するフルオロフォアおよび／またはレポーターを特定するために使用される発光寿命測定を可能にすることができる。以下の説明は寿命測定に基づく試料の特定について論じているが、励起光に応答して反応チャンバから放出されるシグナルの１つまたは複数の追加または代替の特性が、試料を特定するために使用され得ることが理解されるべきである。例えば、その全体を本願明細書に援用する代理人整理番号Ｒ０７０８．７００９０ＵＳ０１の下で２０２１年３月２日に出願された「多次元信号解析のための集積センサ（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤＳＥＮＳＯＲＦＯＲＭＵＬＴＩ－ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬＳＩＧＮＡＬＡＮＡＬＹＳＩＳ）」と題する米国特許出願第１７／１９０，３３１号に記載されている技術のいずれかを使用することができる。 Sequencing using luminescence lifetime measurements Individual pixels on an integrated photodetector are used to identify fluorophores and/or reporters that label one or more targets, such as molecules or specific locations on molecules It is possible to measure the luminescence lifetime. Although the following discussion discusses sample identification based on lifetime measurements, one or more additional or alternative characteristics of the signal emitted from the reaction chamber in response to excitation light may be used to identify the sample. It should be understood that this can be done. For example, ``INTEGRATED SENSOR FOR MULTI-DIMENSIONAL SIGNAL ANALYSIS'' filed on March 2, 2021 under attorney docket number R0708.70090US01, which is incorporated herein in its entirety. ) can be used.

タンパク質、アミノ酸、酵素、脂質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む、任意の１つまたは複数の目的の分子は、フルオロフォアで標識され得る。放出された光のスペクトルの検出または他の標識化技術と組み合わせると、発光寿命は、使用され得るフルオロフォアおよび／またはレポーターの総数を増加させることができる。寿命に基づく特定は、タンパク質間相互作用、酵素活性、分子動力学、および／または膜上の拡散を含み得る、複合体混合物における分子相互作用の特性に関する情報を提供するために、単一分子の解析方法に使用され得る。さらに、異なる発光寿命を有するフルオロフォアを使用して、標識された成分の存在に基づく様々なアッセイ方法において標的成分をタグ付けすることができる。一部の実施形態では、フルオロフォアの特定の寿命の検出に基づいて、微小流体システムを使用する等して、成分を分離することができる。 Any one or more molecules of interest, including proteins, amino acids, enzymes, lipids, nucleotides, DNA, and RNA, can be labeled with a fluorophore. When combined with detection of the spectrum of emitted light or other labeling techniques, luminescence lifetime can increase the total number of fluorophores and/or reporters that can be used. Lifespan-based identification is used to characterize single molecules in order to provide information about the properties of molecular interactions in complex mixtures, which may include protein-protein interactions, enzymatic activity, molecular dynamics, and/or diffusion across membranes. It can be used in analytical methods. Furthermore, fluorophores with different emission lifetimes can be used to tag target components in various assay methods based on the presence of the labeled component. In some embodiments, components can be separated based on detection of a specific lifetime of a fluorophore, such as using a microfluidic system.

発光寿命の測定は、他の解析方法と組み合わせて使用され得る。例えば、発光寿命は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術と組み合わせて使用して、１つまたは複数の分子上に位置するドナーおよびアクセプターフルオロフォアの状態および／または環境を識別することができる。このような測定は、ドナーとアクセプターとの間の距離を決定するために使用され得る。一部の場合、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動により、ドナーの寿命が減少する場合がある。別の例では、発光寿命測定は、異なる寿命を有する４つのフルオロフォアを使用して、ＤＮＡ分子内の４つの異なるヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を未知のヌクレオチド配列で標識し得る場合等の、ＤＮＡシークエンシング用途で使用され得る。フルオロフォアの発光スペクトルの代わりに発光寿命が、ヌクレオチドの配列を特定するために使用され得る。特定の技術について発光スペクトルの代わりに発光寿命を使用することによって、絶対強度測定によるアーチファクトが減少するため、精度および測定分解能を向上させることができる。さらに、寿命測定により、より少ない励起エネルギー波長が必要とされ、および／またはより少ない発光エネルギー波長を検出する必要があるため、システムの複雑さおよび／または費用を軽減させることができる。 Measurement of luminescence lifetime can be used in combination with other analytical methods. For example, emission lifetimes can be used in conjunction with fluorescence resonance energy transfer (FRET) techniques to identify the state and/or environment of donor and acceptor fluorophores located on one or more molecules. Such measurements can be used to determine the distance between donor and acceptor. In some cases, energy transfer from donor to acceptor may reduce donor lifetime. In another example, luminescence lifetime measurements can be performed using four fluorophores with different lifetimes to label four different nucleotides (A, T, G, C) within a DNA molecule with an unknown nucleotide sequence. etc., can be used in DNA sequencing applications. The emission lifetime instead of the emission spectrum of a fluorophore can be used to identify the sequence of a nucleotide. By using emission lifetimes instead of emission spectra for certain technologies, accuracy and measurement resolution can be improved because artifacts from absolute intensity measurements are reduced. Furthermore, lifetime measurements can reduce system complexity and/or cost because fewer excitation energy wavelengths are required and/or fewer emission energy wavelengths need to be detected.

一部の実施形態では、本開示に記載される集積光検出器は、発光寿命を測定または識別することができる。発光寿命の測定は、１つまたは複数の蛍光分子を励起し、放出される発光の時間変化を測定することに基づく。蛍光分子が励起状態に達した後に蛍光分子が光子を放出する確率は、時間の経過とともに指数関数的に減少する。この確率が減少する速度は、蛍光分子の特徴である場合があり、異なる蛍光分子では異なる場合がある。蛍光分子によって放出された光の時間特性を検出することにより、蛍光分子を特定すること、および／または蛍光分子を互いに対して識別することが可能になり得る。発光分子は、本明細書では発光マーカ（または単に「マーカ」）、標識およびフルオロフォアとも呼ばれる。 In some embodiments, the integrated photodetector described in this disclosure can measure or identify luminescence lifetime. Measurement of luminescence lifetime is based on exciting one or more fluorescent molecules and measuring the change in emitted luminescence over time. The probability that a fluorescent molecule will emit a photon after it reaches an excited state decreases exponentially over time. The rate at which this probability decreases may be characteristic of the fluorescent molecule and may be different for different fluorescent molecules. By detecting the temporal characteristics of the light emitted by fluorescent molecules, it may be possible to identify the fluorescent molecules and/or distinguish them from each other. Luminescent molecules are also referred to herein as luminescent markers (or simply "markers"), labels and fluorophores.

励起状態に達した後、マーカは所与の時間に特定の確率で光子を放出することができる。励起されたマーカから光子が放出される確率は、マーカの励起後、時間の経過とともに減少する場合がある。時間の経過とともに光子が放出される確率の減少は、指数関数的減衰関数ｐ（ｔ）＝ｅ^－ｔ／τで表すことができ、式中、ｐ（ｔ）は時間ｔでの光子放出の確率であり、τはマーカの時間パラメータである。時間パラメータτは、マーカが光子を放出する確率が一定の値となる励起後の時間を示す。時間パラメータτは、その吸収および発光スペクトル特性とは異なり得るマーカの特性である。このような時間パラメータτは、マーカの発光寿命、または単に「寿命」と呼ばれる。一部の実施形態では、マーカは、０．１～２０ｎｓの範囲の発光寿命を有し得る。しかしながら、本明細書に記載される技術は、使用されるマーカの寿命に関して限定されない。 After reaching an excited state, the marker can emit a photon with a certain probability at a given time. The probability that a photon will be emitted from an excited marker may decrease over time after excitation of the marker. The decrease in the probability that a photon is emitted over time can be expressed by the exponential decay function p(t) = e ^{- t/τ} , where p(t) is the rate of photon emission at time t. is the probability, and τ is the time parameter of the marker. The time parameter τ indicates the time after excitation at which the probability that the marker emits a photon is a constant value. The time parameter τ is a property of the marker that may be different from its absorption and emission spectral properties. Such a time parameter τ is called the luminescence lifetime of the marker, or simply "lifetime". In some embodiments, the marker may have a luminescence lifetime in the range of 0.1-20 ns. However, the techniques described herein are not limited with respect to the lifetime of the markers used.

マーカの寿命は、１つより多いマーカを区別するために使用されてもよく、および／またはマーカを特定するために使用されてもよい。一部の実施形態では、異なる寿命を有する複数のマーカが励起源によって励起される発光寿命の測定が実施され得る。一例として、それぞれ０．５、１、２、および３ナノ秒の寿命を有する４つのマーカが、選択された波長（例えば、例として６３５ｎｍ）を有する光を放出する光源によって励起され得る。マーカは、マーカによって放出される光の寿命の測定に基づいて、互いから特定または区別され得る。 The lifetime of a marker may be used to distinguish between more than one marker and/or may be used to identify a marker. In some embodiments, emission lifetime measurements may be performed where multiple markers with different lifetimes are excited by an excitation source. As an example, four markers with lifetimes of 0.5, 1, 2, and 3 nanoseconds, respectively, can be excited by a light source that emits light having a selected wavelength (eg, 635 nm as an example). Markers may be identified or distinguished from each other based on measurements of the lifetime of light emitted by the markers.

発光寿命の測定は、絶対強度値とは対照的に、時間の経過とともに強度がどのように変化するかを比較することによる相対強度測定を使用することができる。その結果として、発光寿命の測定は、絶対強度測定の困難の一部を回避することができる。絶対強度測定は、存在するフルオロフォアの濃度に依存する場合があり、様々なフルオロフォア濃度のために較正工程が必要になる場合がある。対照的に、発光寿命の測定は、フルオロフォアの濃度に非感受性である場合がある。 Measurements of luminescence lifetime can use relative intensity measurements by comparing how the intensity changes over time, as opposed to absolute intensity values. As a result, emission lifetime measurements can avoid some of the difficulties of absolute intensity measurements. Absolute intensity measurements may depend on the concentration of fluorophore present, and a calibration step may be required for different fluorophore concentrations. In contrast, measurements of luminescence lifetime may be insensitive to fluorophore concentration.

寿命測定によってマーカ間を区別すると、発光スペクトルの測定によってマーカを区別する場合よりも、使用される励起光の波長をより少なくすることができる場合がある。一部の実施形態では、より少ない波長の励起光および／または発光性の光を使用する場合、センサ、フィルタ、および／または回折光学系の数を減らすか、または排除することができる。一部の実施形態では、標識化は、異なる寿命を有するマーカを用いて実施することができ、マーカは、同じ励起波長またはスペクトルを有する光によって励起することができる。一部の実施形態では、単一の波長またはスペクトルの光を放出する励起光源が使用されてもよく、これによりコストを削減することができる。しかしながら、任意の数の励起光の波長またはスペクトルを使用することができるため、本明細書に記載される技術はこの点に限定されない。一部の実施形態では、集積光検出器を使用して、受信した光に関するスペクトルおよび時間情報の両方を決定することができる。一部の実施形態では、存在する分子の種類の定量解析は、マーカから放出される発光の時間パラメータ、スペクトルパラメータ、または時間パラメータとスペクトルパラメータの組合せを決定することによって実施され得る。 When markers are distinguished by lifetime measurement, it may be possible to use fewer wavelengths of excitation light than when markers are distinguished by measurement of emission spectra. In some embodiments, if fewer wavelengths of excitation and/or emission light are used, the number of sensors, filters, and/or diffractive optics may be reduced or eliminated. In some embodiments, labeling can be performed using markers with different lifetimes, and the markers can be excited by light with the same excitation wavelength or spectrum. In some embodiments, an excitation light source that emits light of a single wavelength or spectrum may be used, which may reduce cost. However, the techniques described herein are not limited in this regard, as any number of excitation light wavelengths or spectra can be used. In some embodiments, integrated photodetectors can be used to determine both spectral and temporal information regarding the received light. In some embodiments, quantitative analysis of the types of molecules present may be performed by determining temporal parameters, spectral parameters, or a combination of temporal and spectral parameters of the luminescence emitted from the marker.

本出願の態様による集積光検出器を有する集積デバイスは、様々な検出およびイメージング用途に適した機能を備えて設計することができる。このような集積光検出器は、１つもしくは複数の時間間隔、または「時間ビン」内の光を検出する能力を有することができる。光の到達時間に関する情報を収集するために、入射光子に応答して電荷担体が生成され、それらの到達時間に基づいてそれぞれの時間ビンに分離され得る。 Integrated devices having integrated photodetectors according to aspects of the present application can be designed with features suitable for a variety of detection and imaging applications. Such integrated photodetectors may have the ability to detect light within one or more time intervals, or "time bins." To collect information about light arrival times, charge carriers can be generated in response to incident photons and separated into respective time bins based on their arrival times.

入射光子の到達時間を検出する集積光検出器は、追加の光学フィルタリング（例えば、光学スペクトルフィルタリング）の要件を軽減することができる。以下に記載されるように、本出願による集積光検出器は、特定の時点で光生成担体を除去するためのドレインを含むことができる。この方法で光生成担体を除去することにより、励起光パルスに応答して生成される不要な電荷担体は、励起パルスからの光の受信を防ぐための光学フィルタリングを必要とせずに廃棄され得る。このような光検出器は、全体的な設計統合の複雑さ、光学および／もしくはフィルタリング部品、ならびに／またはコストを削減することができる。 An integrated photodetector that detects the arrival time of an incident photon can reduce the requirement for additional optical filtering (eg, optical spectral filtering). As described below, an integrated photodetector according to the present application can include a drain for removing the photogenerating carrier at specific times. By removing photogenerated carriers in this way, unwanted charge carriers generated in response to an excitation light pulse can be discarded without the need for optical filtering to prevent reception of light from the excitation pulse. Such photodetectors can reduce overall design integration complexity, optical and/or filtering components, and/or cost.

一部の実施形態では、発光寿命は、発光強度値を時間の関数として検出するために集積光検出器の１つまたは複数の時間ビン内に収集された電荷担体を集合させることにより放出された発光の時間プロファイルを測定することによって決定され得る。一部の実施形態では、マーカの寿命は、マーカが励起状態に励起され、次いで光子が放出される時間が測定される複数の測定を実施することによって決定され得る。各測定について、励起源はマーカに方向付けられた励起光のパルスを生成することができ、励起パルスとその後のマーカからの光子事象との間の時間が決定され得る。追加的または代替的に、励起パルスが繰り返しかつ周期的に発生する場合、光子放出事象が発生するときと、後続の励起パルスとの間の時間を測定することができ、測定された時間を励起パルス間の時間間隔（すなわち、励起パルス波形の周期）から減算して、光子吸収事象の時間を決定することができる。 In some embodiments, the luminescence lifetime is emitted by assembling the collected charge carriers within one or more time bins of an integrated photodetector to detect luminescence intensity values as a function of time. It can be determined by measuring the temporal profile of luminescence. In some embodiments, the lifetime of a marker may be determined by performing multiple measurements in which the time that the marker is excited to an excited state and then a photon is emitted is measured. For each measurement, the excitation source can generate a pulse of excitation light directed at the marker, and the time between the excitation pulse and a subsequent photon event from the marker can be determined. Additionally or alternatively, if the excitation pulse occurs repeatedly and periodically, the time between when the photon emission event occurs and the subsequent excitation pulse can be measured, and the measured time The time of the photon absorption event can be determined by subtracting from the time interval between pulses (ie, the period of the excitation pulse waveform).

複数の励起パルスを用いてこのような実験を繰り返すことによって、励起後の特定の時間間隔内に光子がマーカから放出される事例の数を決定することができ、これは、励起後のこのような時間間隔内に光子が放出される確率を示す。収集された光子放出事象の数は、マーカに放出された励起パルスの数に基づき得る。測定期間にわたる光子放出事象の数は、一部の実施形態では５０～１０，０００，０００またはそれ以上の範囲であり得るが、本明細書に記載される技術はこの点に限定されない。励起後の特定の時間間隔内にマーカから光子が放出される事例の数は、一連の離散時間間隔または時間ビン内で発生する光子放出事象の数を表すヒストグラムに反映され得る。時間ビンの数および／または各ビンの時間間隔は、特定の寿命および／または特定のマーカを特定するために設定および／または調整され得る。時間ビンの数および／または各ビンの時間間隔は、放出された光子を検出するために使用されるセンサに依存する場合がある。時間ビンの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上、例えば、１６、３２、６４、またはそれ以上であってもよい。曲線適合アルゴリズムを使用して、記録されたヒストグラムに曲線を適合させることができ、その結果、所与の時間におけるマーカの励起後に光子が放出される確率を表す関数が得られる。上記の減衰関数ｐ（ｔ）＝ｅ^－ｔ／τを使用して、ヒストグラムデータを近似的に適合させることができる。このような曲線適合から、時間パラメータまたは寿命を決定することができる。決定された寿命をマーカの既知の寿命と比較して、存在するマーカの種類を特定することができる。 By repeating such an experiment with multiple excitation pulses, it is possible to determine the number of instances in which a photon is emitted from the marker within a certain time interval after excitation, which indicates the probability that a photon will be emitted within a certain time interval. The number of photon emission events collected may be based on the number of excitation pulses emitted to the marker. The number of photon emission events over the measurement period can range from 50 to 10,000,000 or more in some embodiments, although the techniques described herein are not limited in this regard. The number of instances in which photons are emitted from a marker within a particular time interval after excitation may be reflected in a histogram representing the number of photon emission events occurring within a series of discrete time intervals or time bins. The number of time bins and/or the time interval of each bin may be set and/or adjusted to identify particular lifetimes and/or particular markers. The number of time bins and/or the time interval between each bin may depend on the sensor used to detect the emitted photons. The number of time bins may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more, such as 16, 32, 64, or more. A curve fitting algorithm can be used to fit a curve to the recorded histogram, resulting in a function representing the probability that a photon will be emitted after excitation of the marker at a given time. The above decay function p(t)=e ^−t/τ can be used to approximately fit the histogram data. From such a curve fit, a time parameter or lifetime can be determined. The determined lifetime can be compared to the known lifetime of the marker to determine the type of marker present.

寿命は、２つの時間間隔で取得された強度値から計算することができる。一部の実施形態では、光検出器は少なくとも２つの時間ビンにわたる強度を測定する。時間ｔ１とｔ２との間に発光エネルギーを放出する光子は、光検出器によって強度Ｉ１として測定され、時間ｔ３とｔ４との間に放出される発光エネルギーはＩ２として測定される。任意の適切な数の強度値を取得することができる。次いでこのような強度測定値は、寿命を計算するために使用され得る。１つのフルオロフォアが１度に存在する場合、時間ビニング発光シグナルを単一の指数関数的減衰に適合させることができる。一部の実施形態では、２つのみの時間ビンが、フルオロフォアについての寿命を正確に特定するために必要とされ得る。２つ以上のフルオロフォアが存在する場合、発光シグナルを二重または三重指数関数等の複数の指数関数的減衰に適合させることによって、組み合わせた発光シグナルから個々の寿命を特定することができる。一部の実施形態では、２つ以上の時間ビンが、このようなシグナルから１つより多い発光寿命を正確に特定するために必要とされ得る。しかしながら、複数のフルオロフォアを用いる一部の事例では、単一の指数関数的減衰を発光シグナルに適合させることによって平均発光寿命を決定することができる。 Lifetime can be calculated from intensity values obtained at two time intervals. In some embodiments, the photodetector measures intensity over at least two time bins. Photons emitting luminescent energy between times t1 and t2 are measured by the photodetector as intensity I1, and luminescent energy emitting between times t3 and t4 is measured as I2. Any suitable number of intensity values can be obtained. Such intensity measurements can then be used to calculate lifetime. If one fluorophore is present at a time, the time-binning luminescence signal can be fitted to a single exponential decay. In some embodiments, only two time bins may be needed to accurately determine lifetime for a fluorophore. When more than one fluorophore is present, individual lifetimes can be determined from the combined luminescence signal by fitting the luminescence signal to multiple exponential decays, such as double or triple exponentials. In some embodiments, two or more time bins may be required to accurately identify more than one emission lifetime from such a signal. However, in some cases with multiple fluorophores, the average emission lifetime can be determined by fitting a single exponential decay to the emission signal.

一部の場合、光子放出事象の確率、したがってマーカの寿命は、周囲および／またはマーカの状態に基づいて変化し得る。例えば、励起光の波長よりも小さい直径を有する体積内に閉じ込められたマーカの寿命は、マーカがその体積中にない場合よりも短くなり得る。マーカが標識化のために使用される場合と同様の条件下で、既知のマーカを用いた寿命測定を実施することができる。既知のマーカを用いたそのような測定から決定された寿命は、マーカを特定するときに使用することができる。 In some cases, the probability of a photon emission event, and therefore the lifetime of the marker, may change based on the environment and/or the conditions of the marker. For example, a marker confined within a volume with a diameter smaller than the wavelength of the excitation light may have a shorter lifetime than if the marker were not in that volume. Lifetime measurements using known markers can be performed under similar conditions as when the markers are used for labeling. The lifetime determined from such measurements with known markers can be used in identifying markers.

本開示によるＤＮＡシークエンシング用途におけるチップ再生の例示的な方法の実施後にシークエンシング精度のオンチップ評価を実施した。ＣＭＯＳチップ上の試料ウェルのアレイに、目的の既知のＤＮＡ分子を含有する試料のアリコートを負荷した。この評価では、試料のアリコートに対する末端ＤＮＡシークエンシング性能の３回の逐次実行を実施した：１回目の実行は新しく、きれいなチップで実施した。２回目の実行は、本開示の例示的な再生溶液を適用した後に実施した。３回目の実行は、再生溶液をチップに２回目に適用した後に実施した。したがって、３回目の実行の結果は、２回目の再生工程の評価を表した。この実験で使用した再生溶液は、９ｍＬのＨＦＩＰ、０．５ｍＬの５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＬの水、１００μＭから２００μＭの間の濃度のビオチン－ＰＥＧ_３（ビス－ビオチン－ＰＥＧ_４）を含有した。 On-chip evaluation of sequencing accuracy was performed after implementation of an exemplary method of chip regeneration in DNA sequencing applications according to the present disclosure. An array of sample wells on a CMOS chip was loaded with an aliquot of sample containing a known DNA molecule of interest. In this evaluation, three sequential runs of terminal DNA sequencing performance on aliquots of the sample were performed: the first run was performed with a new, clean chip. The second run was performed after applying the exemplary regeneration solution of the present disclosure. The third run was performed after the second application of the regeneration solution to the chip. Therefore, the results of the third run represented an evaluation of the second regeneration step. The regeneration solution used in this experiment contained 9 mL HFIP, 0.5 mL 5M ammonium acetate, 1 mL water, and biotin-PEG ₃ (bis-biotin-PEG ₄ ) at a concentration between 100 μM and 200 μM.

この実験の再生工程についてのワークアップは次の通りである。１回目のシークエンシング実行後、チップから残留物を除去し、次いでヌクレオシド消化ミックス（ＮＥＢ＃Ｍ０６４９）をチップに適用した。次いでチップを３７℃で４０分間インキュベートする。続いて、再生溶液をチップに適用し、チップをさらに室温で３０分間インキュベートする。最後に、チップから再び残留物を除去する。 The workup for the regeneration process of this experiment is as follows. After the first sequencing run, the chip was cleared of residue and then the nucleoside digestion mix (NEB #M0649) was applied to the chip. The chip is then incubated at 37°C for 40 minutes. Subsequently, a regeneration solution is applied to the chip and the chip is further incubated for 30 minutes at room temperature. Finally, remove the residue from the chip again.

２回目および３回目の実行の前に再生溶液を適用すると、試料ウェルの表面におけるストレプトアビジン－ビオチン相互作用が首尾良く解離されたようである。３回の実行の各々についてのヌクレオチドシークエンシングの読み取り長さおよび精度を測定し、図７Ａおよび図７Ｂに示すグラフに表した。図７Ｂに示されるように、約７４％の平均精度および９４％以上の最大（または「最高」）精度を２回目および３回目の実行において観察した。実際、驚くべきことに、２回目および３回目の実行は、１回目の実行と同等の優れたシークエンシング性能を示した。したがって、この実験では、チップの再生および再利用により読み出しが改善された可能性がある。図７Ａは、３回の実行から取得されたシグナル間の平均読み取り長を示し、これは、約８５００ｂｐの３回目の実行の間の読み取り長さを含んだ。図７Ｂはまた、分子の既知の配列に対する配列読み出しの各々の「アラインメントスコア」を示す。 Application of the regeneration solution before the second and third runs appeared to successfully dissociate the streptavidin-biotin interactions at the surface of the sample wells. Nucleotide sequencing read length and accuracy for each of the three runs were measured and represented in the graphs shown in Figures 7A and 7B. As shown in Figure 7B, an average accuracy of approximately 74% and a maximum (or "best") accuracy of greater than 94% was observed in the second and third runs. In fact, surprisingly, the second and third runs showed as good sequencing performance as the first run. Therefore, in this experiment, reclamation and reuse of the chip may have improved readout. Figure 7A shows the average read length between signals obtained from three runs, which included a read length during the third run of approximately 8500 bp. Figure 7B also shows the "alignment score" of each sequence read against the known sequence of the molecule.

続いて、本開示によるペプチドシークエンシング用途におけるチップ再生の例示的な方法の実施後のシークエンシング精度のオンチップ評価を実施した。ＣＭＯＳチップ上の試料ウェルのアレイに、目的の既知のペプチド分子を含有する試料のアリコートを負荷した。この評価では、試料のアリコートの８回の逐次実行を実施した。１回目の実行は新しく、きれいなチップで実施した。各連続実行を上記のように再生溶液を適用した後に実施した。この実験では、末端アミノ酸に結合する標識されたアミノ酸認識分子を使用して、目的のペプチドの存在を検出した。標識された認識分子の発光により、シグナル出力に一連のパルスが発生する。一連のパルスは、対応する末端アミノ酸の同一性を診断する特徴的なパルスパターンを提供する。この実験を、２つの異なるチップであるＳ４２９０６－１６－１４およびＳ４２９０６－１６－１９を使用して繰り返した。 Subsequently, on-chip evaluation of sequencing accuracy after implementation of the exemplary method of chip regeneration in peptide sequencing applications according to the present disclosure was performed. An array of sample wells on a CMOS chip was loaded with an aliquot of sample containing a known peptide molecule of interest. For this evaluation, eight sequential runs of sample aliquots were performed. The first run was performed with a new, clean chip. Each successive run was performed after applying the regeneration solution as described above. In this experiment, a labeled amino acid recognition molecule that binds to the terminal amino acid was used to detect the presence of the peptide of interest. The luminescence of the labeled recognition molecule generates a series of pulses in the signal output. The series of pulses provides a characteristic pulse pattern that diagnoses the identity of the corresponding terminal amino acids. This experiment was repeated using two different chips, S42906-16-14 and S42906-16-19.

この実験の再生工程についてのワークアップは次の通りである。１回目のシークエンシング実行後、チップから残留物を除去し、次いで再生溶液をチップに適用し、チップを室温で３０分間インキュベートする。最後に、チップから再び残留物を除去する。 The workup for the regeneration process of this experiment is as follows. After the first sequencing run, remove the residue from the chip, then apply regeneration solution to the chip and incubate the chip for 30 minutes at room temperature. Finally, remove the residue from the chip again.

図８Ａ～図８Ｈに示されるシグナル出力結果において実証されるように、１回目の実行以降の実行についてのペプチド分子の精度および読み取り長さの結果は、予想を上回った。各実行について負荷したウェルのパーセンテージが図８Ａにプロットされる。実行５～８についての負荷パーセンテージは２５％を超えた。チップ上のウェルの総数のうち、能動的に負荷され、パルスしている試料ウェルのパーセンテージ（活性％）が図８Ｂにプロットされる。この図は、試料の約２．４％から１７．５％の間が、実行２と実行８との間で能動的にパルスを示していたことを示す。実行５と実行８との間で、活性％の頻度は約１５％であった。 The peptide molecule accuracy and read length results for runs after the first run exceeded expectations, as demonstrated in the signal output results shown in Figures 8A-8H. The percentage of wells loaded for each run is plotted in Figure 8A. The load percentage for runs 5-8 was over 25%. The percentage of sample wells that are actively loaded and pulsing (% activity) out of the total number of wells on the chip is plotted in Figure 8B. This figure shows that between about 2.4% and 17.5% of the samples were actively pulsing between runs 2 and 8. Between Runs 5 and 8, the frequency of %Activity was approximately 15%.

読み取り長さ１、２、および３（Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３）のシークエンシング結果の精度が、８回の実行の各々について図８Ｃ～８Ｅにプロットされる。ｙ軸は、プロットされている読み取り長さについてのシークエンシング読み出しを提供する試料ウェル（アパーチャ）のカウントを反映する。これらのカウントは、読み取り長さ１から読み取り長さ３に進むにつれて数が減少する。図８Ｅは、８回の実行の各々にわたるシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）の中央値を示す。図８Ｇは、すべての読み取り長さにわたる平均切断深度を示す。図８Ｈは、３を超える読み取り長さを有する各実行についてのチップの活性ウェルの割合を示す。 The accuracy of the sequencing results for read lengths 1, 2, and 3 (R1, R2, and R3) is plotted in Figures 8C-8E for each of the eight runs. The y-axis reflects the count of sample wells (apertures) providing sequencing reads for the read length being plotted. These counts decrease in number going from read length 1 to read length 3. Figure 8E shows the median signal-to-noise ratio (SNR) over each of the eight runs. Figure 8G shows the average cutting depth over all read lengths. Figure 8H shows the percentage of active wells of the chip for each run with read lengths greater than 3.

両方の実験の結果は、再生処理が、後で負荷されたアリコートをサンプリングするときに発生する、以前に負荷されたアリコートから放出されるシグナルから生じる顕著な干渉を生じなかったことを示し、したがって、チップから試料を除去するための実行可能な解決策を提示する。 The results of both experiments showed that the regeneration process did not result in significant interference resulting from signals emitted from previously loaded aliquots that occur when sampling later loaded aliquots, and thus , present a viable solution to remove the sample from the chip.

ＶＩＩＩ．光退色情報を使用した集積デバイス較正
本明細書に記載される技術の態様は、参照色素から取得される光退色情報を使用して、集積デバイスおよび／または集積デバイスと相互作用する１つまたは複数のコンポーネントを較正するための技法をさらに提供する。例えば、集積デバイスは、少なくとも１つの励起源をさらに含むシステムの一部であり得る。本明細書で説明される較正技法は、集積デバイスを備えるシステムを較正するために使用され得る。図９は、一部の実施形態による、光退色情報を使用して集積デバイスを備えるシステムを較正するための例示的なプロセス９００を示す。 VIII. Integrated Device Calibration Using Photobleaching Information Aspects of the techniques described herein use photobleaching information obtained from a reference dye to calibrate one or more integrated devices and/or interact with an integrated device. Techniques are further provided for calibrating the components of. For example, the integrated device may be part of a system that further includes at least one excitation source. The calibration techniques described herein can be used to calibrate systems that include integrated devices. FIG. 9 illustrates an example process 900 for calibrating a system comprising an integrated device using photobleaching information, according to some embodiments.

動作９０２において、試料分子は、参照色素により標識され得る。例えば、参照色素は、少なくとも１つの光源からの光による励起に反応して放出光を放出する蛍光分子を含み得る。参照色素分子は、参照色素分子によって放出される放出光の特性が、参照色素分子が結合される試料分子を同定するために使用され得るように、特定の試料分子に結合する種類のものであり得る。 At operation 902, sample molecules may be labeled with a reference dye. For example, the reference dye can include a fluorescent molecule that emits emitted light in response to excitation by light from at least one light source. The reference dye molecule is of a type that binds to a specific sample molecule such that the characteristics of the emitted light emitted by the reference dye molecule can be used to identify the sample molecule to which the reference dye molecule is bound. obtain.

動作９０４において、色素で標識された試料が１つまたは複数の反応チャンバ内に負荷される。例えば、一部の実施形態において、複数の反応チャンバから受信した信号の差を評価するために、同じ種類の複数の参照色素が複数の反応チャンバに負荷される。一部の実施形態において、本明細書に記載される技術の態様はこの点で限定されず、試料分子は、試料分子が複数の反応チャンバに負荷された後に参照色素で標識され得る。 At operation 904, a dye-labeled sample is loaded into one or more reaction chambers. For example, in some embodiments, multiple reference dyes of the same type are loaded into multiple reaction chambers to assess differences in signals received from multiple reaction chambers. In some embodiments, aspects of the techniques described herein are not limited in this respect, sample molecules may be labeled with a reference dye after the sample molecules are loaded into multiple reaction chambers.

図１０－１は、一部の実施形態による、表面１００６に付着した参照色素分子１０１０で標識された試料分子１００９を示す。図１０－２は、一部の実施形態による、反応チャンバ内に付着された色素標識試料を図示する。特に、図１０－２では、アミノ酸鎖（フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、およびセリン（Ｓ））からなる試料分子１００９が、反応チャンバ１００８内に負荷される。試料分子１００９は、参照色素分子１０１０で標識される。集積デバイスの概要を参照して本明細書で説明したように、参照色素分子１０１０によって放出されたシグナルを収集するためのフォトニックコンポーネント１０１２を含むＣＭＯＳチップ１０１４が設けられ得る。 FIG. 10-1 shows a sample molecule 1009 labeled with a reference dye molecule 1010 attached to a surface 1006, according to some embodiments. FIG. 10-2 illustrates a dye-labeled sample deposited within a reaction chamber, according to some embodiments. In particular, in FIG. 10-2, a sample molecule 1009 consisting of amino acid chains (phenylalanine (F), tryptophan (W), tyrosine (Y), leucine (L), and serine (S)) is loaded into the reaction chamber 1008. be done. Sample molecules 1009 are labeled with reference dye molecules 1010. As described herein with reference to the integrated device overview, a CMOS chip 1014 may be provided that includes a photonic component 1012 for collecting signals emitted by reference dye molecules 1010.

動作９０４は、１つまたは複数の反応チャンバが励起光により照射されていない間に実行され得る。一部の実施形態において、複数の色素で標識された試料分子が、動作９０４において複数の反応チャンバ内に負荷され得ることを理解されたい。 Operation 904 may be performed while one or more reaction chambers are not illuminated by excitation light. It should be appreciated that in some embodiments, multiple dye-labeled sample molecules may be loaded into multiple reaction chambers at operation 904.

一部の実施形態において、参照色素を有する試料分子は、反応チャンバ内に単独で負荷されてもよく、シークエンシングされる分子は、その後、反応チャンバ内に負荷されてもよい。一部の実施形態において、参照色素を有する分子は、較正プロセスを実行した後にシークエンシングされる分子と共に反応チャンバ内に負荷され得る。一部の実施形態において、参照色素は、シークエンシングされるべき分子自体に結合され得、参照色素は、シークエンシングを行う前に切断され得る。一部の実施形態において、参照色素は、反応チャンバ内に付着または他の方法で固定化される必要がない自由拡散色素分子であり得る。一部の実施形態において、参照色素は、チップの界面化学調製（ｓｕｒｆａｃｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の一部として反応チャンバ内に負荷され得る。従って、本技術の態様は、反応チャンバ内の参照色素の特定の構成に限定されない。一部の実施形態によれば、動作９０２は、２０１９年１０月２８日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＥＰＡＲＩＮＧＳＡＭＰＬＥＳＦＯＲＭＵＬＴＩＰＬＥＸＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」と題する米国特許出願第１７／０８２，９０６号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７００７７ＵＳ０１）に記載されている技法を含み得、この出願は参照によりその全体が援用される。 In some embodiments, sample molecules with a reference dye may be loaded alone into the reaction chamber, and molecules to be sequenced may then be loaded into the reaction chamber. In some embodiments, molecules with reference dyes can be loaded into the reaction chamber with molecules to be sequenced after performing a calibration process. In some embodiments, a reference dye can be attached to the molecule itself to be sequenced, and the reference dye can be cleaved before sequencing occurs. In some embodiments, the reference dye can be a free-diffusing dye molecule that does not need to be attached or otherwise immobilized within the reaction chamber. In some embodiments, the reference dye may be loaded into the reaction chamber as part of the surface chemistry preparation of the chip. Accordingly, aspects of the present technology are not limited to particular configurations of reference dyes within the reaction chamber. According to some embodiments, operation 902 may be incorporated into U.S. patent application Ser. R0708.70077US01), which application is incorporated by reference in its entirety.

動作９０６において、１つまたは複数の反応チャンバが、光源（例えば、レーザ）からの励起光により照射される。特に、動作９０６において、１つまたは複数の反応チャンバが、（例えば、光源をブロック解除すること、光源をチップに再結合すること、および／またはシステムの特性退色時間（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｂｌｅａｃｈｉｎｇｔｉｍｅ）に対して速い時間内に光源によって供給される出力を増加させることによって）励起光により周期的に照射され得る。例えば、図１１は、一部の実施形態による、経時的な光源励起出力を示す例示的なグラフ１１００を示す。励起光は、一部の実施形態において、参照色素が退色されるまで、反応チャンバに照射され得る。一部の実施形態において、反応チャンバへの励起光の照射は、参照色素分子の退色を回避するように制御され得る。光退色参照色素分子のさらなる説明は、本明細書において提供される。 At operation 906, one or more reaction chambers are illuminated with excitation light from a light source (eg, a laser). In particular, at operation 906, the one or more reaction chambers are configured to react (e.g., to unblock the light source, to recombine the light source to the chip, and/or to a characteristic bleaching time of the system). It can be irradiated periodically with excitation light (by increasing the power provided by the light source in a fast time). For example, FIG. 11 depicts an example graph 1100 showing light source pump power over time, according to some embodiments. Excitation light may be directed into the reaction chamber in some embodiments until the reference dye is bleached. In some embodiments, the irradiation of the excitation light into the reaction chamber can be controlled to avoid bleaching of the reference dye molecules. Further description of photobleaching reference dye molecules is provided herein.

動作９０８において、動作９０６において照射された１つまたは複数の試料分子を含む反応チャンバに関する退色ステップを示す時間トレースが記録される。例えば、図１２－１は、一部の実施形態による、参照色素からの経時的に測定された信号を示す例示的なグラフ１２００を示す。図１２－１に示されるように、測定された信号は、強度が上昇し、その後、ある期間後に強度が低下する。測定された信号の強度の上昇と低下との間の期間は、参照色素分子の退色時間に相当し得る。 At operation 908, a time trace is recorded representing a bleaching step for the reaction chamber containing the one or more sample molecules irradiated at operation 906. For example, FIG. 12-1 shows an example graph 1200 showing a signal measured over time from a reference dye, according to some embodiments. As shown in FIG. 12-1, the measured signal increases in intensity and then decreases in intensity after a period of time. The period between the rise and fall of the measured signal intensity may correspond to the bleaching time of the reference dye molecule.

動作９１０において、励起すべき追加の励起経路があるかどうかが判定される。動作９１０において、励起すべき追加の励起経路があると判定された場合、プロセス９００は、「是」の分岐を通って動作９０６に戻り、追加の励起経路により追加の反応チャンバを照射する。動作９１０において、追加の励起経路が存在しないと判定された場合、プロセス９００は、「否」の分岐を通って動作９１２に進行し得る。 In operation 910, it is determined whether there are additional excitation paths to excite. If it is determined in operation 910 that there are additional excitation paths to excite, the process 900 takes the yes branch back to operation 906 to irradiate additional reaction chambers with the additional excitation paths. If it is determined in act 910 that no additional excitation paths exist, process 900 may proceed through the "no" branch to act 912.

動作９１２において、参照メトリック（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍｅｔｒｉｃｓ）が保存され得る。例えば、参照メトリックは、動作９０８で取得された退色ステップを示す時間トレースを含み得る。例えば、図１２－２は、一部の実施形態による、反応チャンバ内の単一分子の収集に関する測定された退色時間および色素強度の例示的なヒストグラムを示す。グラフ１９０２は、集積デバイスの反応チャンバ内に負荷された単一分子参照色素の収集に関する測定された退色時間のヒストグラムを示す。図１２－２に示されるように、単一分子参照色素の収集に関するメジアン退色時間は、５．８秒である。グラフ１９０４は、集積デバイスの反応チャンバ内に負荷された単一分子参照色素の収集に関する測定された参照色素信号強度のヒストグラムを示す。一部の実施形態において、退色時間は、測定された信号強度に少なくとも部分的に基づいて決定され得る。例えば、測定された信号強度はピークを示し得る。ピーク強度に達してからピーク強度から低下するまでの期間が、退色時間に相当し得る。 At operation 912, reference metrics may be saved. For example, the reference metric may include a time trace indicative of the bleaching step obtained in operation 908. For example, FIG. 12-2 shows an exemplary histogram of measured fading time and dye intensity for a collection of single molecules within a reaction chamber, according to some embodiments. Graph 1902 shows a histogram of measured fading times for a collection of single molecule reference dyes loaded into the reaction chamber of an integrated device. As shown in Figure 12-2, the median fading time for collection of single molecule reference dye is 5.8 seconds. Graph 1904 shows a histogram of measured reference dye signal intensities for a collection of single molecule reference dyes loaded into the reaction chamber of an integrated device. In some embodiments, the fade time may be determined based at least in part on the measured signal strength. For example, the measured signal strength may exhibit a peak. The period from reaching the peak intensity to decreasing from the peak intensity can correspond to the fading time.

参照メトリックは、動作９０８において取得された情報から導出される情報を含み得る。一部の実施形態において、参照メトリックは、特性退色時間に基づいて決定され得る、反応チャンバ（単数または複数）内の分子（単数または複数）に関する参照励起強度を含み得る。例えば、退色時間の指数分布はｅｘｐ（－ｔ／τ）で表され、ここで、τは特性退色時間である。単一分子の収集に関して、ｌｎ（２）で除算されたメジアン退色時間は、特性退色時間τの推定値を提供する。より速い特性退色時間は、より高い励起強度から生じ得、逆もまた同様である。 The reference metric may include information derived from the information obtained in operation 908. In some embodiments, the reference metric may include a reference excitation intensity for the molecule(s) within the reaction chamber(s), which may be determined based on a characteristic bleaching time. For example, the exponential distribution of fading times is represented by exp(-t/τ), where τ is the characteristic fading time. For single molecule collections, the median bleaching time divided by ln(2) provides an estimate of the characteristic bleaching time τ. Faster characteristic bleaching times can result from higher excitation intensities and vice versa.

動作９１４において、シークエンシングパラメータは、参照メトリック（例えば、特性退色時間、励起強度）に基づいて調整され得る。一部の実施形態において、反応チャンバに励起光を照射するレーザの出力が調整され得る。例えば、一部の実施形態において、レーザ出力は、比較的速い特性退色時間を考慮して減少され得る。レーザ出力は、一部の実施形態において、その後のシークエンシング用途の間の励起強度が標的値を超えないことを確実にするために減少され得る。従って、光損傷がシークエンシング反応の寿命の要因となり得るシークエンシング用途に関する読み取り長（ｒｅａｄｌｅｎｇｔｈ）が改善され得る。 At operation 914, sequencing parameters may be adjusted based on reference metrics (eg, characteristic bleaching time, excitation intensity). In some embodiments, the power of the laser that illuminates the reaction chamber with excitation light may be adjusted. For example, in some embodiments, laser power may be reduced to account for relatively fast characteristic fade times. Laser power may be reduced in some embodiments to ensure that the excitation intensity during subsequent sequencing applications does not exceed the target value. Accordingly, read length can be improved for sequencing applications where photodamage can be a factor in the longevity of sequencing reactions.

一部の実施形態において、集積デバイスの構成は、参照メトリックに基づいて調整され得る。例えば、本発明者らは、反応チャンバにおける差異により、参照色素の特性退色時間が異なる反応チャンバ間で変化し得ることを認識した。従って、反応チャンバ、光検出器、および／または励起光をピクセルに照射する光源の構成は、参照メトリックに基づいて調整され得る。例えば、比較的速い退色時間を有する反応チャンバの場合、反応チャンバに照射される励起光の強度および／または持続時間は、減少され得る。 In some embodiments, the configuration of the integrated device may be adjusted based on the reference metric. For example, the inventors have recognized that due to differences in reaction chambers, the characteristic bleaching time of a reference dye can vary between different reaction chambers. Accordingly, the configuration of the reaction chamber, photodetector, and/or light source that illuminates the pixel with excitation light may be adjusted based on the reference metric. For example, for reaction chambers with relatively fast fading times, the intensity and/or duration of the excitation light applied to the reaction chamber may be reduced.

一部の実施形態において、退色情報は、反応チャンバ内の参照色素分子の数を特定するために使用され得る。例えば、参照色素分子が光退色するまでに、励起光が１つまたは複数の参照色素分子に照射される実施形態において、退色ステップは、反応チャンバから収集された（例えば、１つまたは複数の参照色素分子から放出された）信号の強度の経時的変化を見ることによって観察され得る。１つの参照色素分子の光退色は、強度の単一のステップ（ｓｉｎｇｌｅｓｔｅｐ）（例えば、ある時点における信号の強度の特徴的な低下）によって表され得る。一部の実施形態において、信号の強度の特徴的な低下は、退色前に参照色素分子によって放出された信号の強度と実質的に等しい。具体的には、退色後、参照色素分子はもはやシグナルを放出せず、退色前の参照色素分子によって放出された信号の強度と実質的に等しい強度の単一のステップ分の減少が生じる。 In some embodiments, bleaching information can be used to identify the number of reference dye molecules within the reaction chamber. For example, in embodiments in which excitation light is applied to one or more reference dye molecules until the reference dye molecules are photobleached, the bleaching step is performed after one or more reference dye molecules are collected from the reaction chamber (e.g., one or more reference dye molecules This can be observed by looking at the change in intensity of the signal (emitted from the dye molecules) over time. Photobleaching of one reference dye molecule may be represented by a single step in intensity (eg, a characteristic decrease in the intensity of the signal at a certain point in time). In some embodiments, the characteristic decrease in the intensity of the signal is substantially equal to the intensity of the signal emitted by the reference dye molecule prior to bleaching. Specifically, after bleaching, the reference dye molecule no longer emits a signal, resulting in a single step decrease in intensity that is substantially equal to the intensity of the signal emitted by the reference dye molecule before bleaching.

単一の退色ステップが観察される場合（例えば、経時的に観察される信号強度の変化によって表されるように）、単一の参照色素分子が退色して、信号が収集される反応チャンバ内に単一の参照色素分子が存在していると判定され得る。２つ以上の退色ステップが観察される場合、複数の参照色素分子が反応チャンバ内に負荷されたと判定され得る。反応チャンバ内に負荷されていると判定された参照色素分子の数は、反応チャンバ内に存在する試料の生体分子の数を決定するための代理とみなすことができる。一部の実施形態において、反応チャンバ内の試料分子の数の指標は、特定の反応チャンバをその後の分析に含めるか、または除外するために使用され得る。光退色を使用して定量的負荷の指標を決定するためのさらなる説明が、本明細書において提供される。 If a single bleaching step is observed (e.g., as represented by a change in signal intensity observed over time), a single reference dye molecule bleaches within the reaction chamber where the signal is collected. It can be determined that a single reference dye molecule is present. If more than one bleaching step is observed, it may be determined that multiple reference dye molecules have been loaded into the reaction chamber. The number of reference dye molecules determined to be loaded into the reaction chamber can be considered a surrogate for determining the number of sample biomolecules present within the reaction chamber. In some embodiments, an indication of the number of sample molecules within a reaction chamber can be used to include or exclude a particular reaction chamber from subsequent analysis. Further explanations for determining quantitative load indicators using photobleaching are provided herein.

較正プロセス９００の実行に続いて、集積デバイスは、１つまたは複数の反応チャンバ内に配置された分子からのシグナルを収集および分析するために使用され得る。例えば、図１３は、一部の実施形態による、較正プロセス９００に続いて実行され得る反応チャンバ内のシークエンシング反応を示す。図６に示されるシークエンシング反応は、反応チャンバ１００８内の試料１００９への参照色素分子１０１０Ａ、１０１０Ｂの付着を含み得る。本明細書に記載されるように、参照色素分子は、特定の種類のものであり得、例えば、特定の種類の試料分子に結合し得る。例えば、参照色素分子１０１０Ａは、第１の種類のアミノ酸（例えば、Ｌで示されるロイシン）のみに選択的に結合し、参照色素分子１０１０Ｂは、第２の種類のアミノ酸（例えば、それぞれＦ、Ｙ、およびＷで示されるフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）に選択的に結合する。試料分子１００９のサンプリング（例えば、励起光を反応チャンバ１００８に照射し、結合した参照色素分子１０１０Ａ、１０１０Ｂから放出されるシグナルを収集することによる）に続いて、試料分子および／またはそれに結合した参照色素分子１０１０Ａ、１０１０Ｂの切断が、切断分子３１６を用いて行われ得る。試料分子は、参照分子によって放出されるシグナルに基づいて同定され得る。結合、放出シグナルの受信、および切断のプロセスは、単一の試料分子および／または反応チャンバに対して複数回繰り返され得る。一部の実施形態において、本明細書に説明される較正技法は、タンパク質および／またはＤＮＡ／ＲＮＡシークエンシング用途における使用のために構成される集積デバイスを含むシステムを較正するために使用され得る。 Following execution of the calibration process 900, the integrated device may be used to collect and analyze signals from molecules located within one or more reaction chambers. For example, FIG. 13 illustrates a sequencing reaction within a reaction chamber that may be performed following calibration process 900, according to some embodiments. The sequencing reaction shown in FIG. 6 may include attachment of reference dye molecules 1010A, 1010B to sample 1009 within reaction chamber 1008. As described herein, a reference dye molecule can be of a particular type, eg, bind to a particular type of sample molecule. For example, reference dye molecule 1010A selectively binds only to a first type of amino acid (e.g., leucine, denoted L), and reference dye molecule 1010B selectively binds only to a first type of amino acid (e.g., F, Y, respectively). , and phenylalanine, tyrosine, and tryptophan). Following sampling of sample molecules 1009 (e.g., by shining excitation light into reaction chamber 1008 and collecting signals emitted from bound reference dye molecules 1010A, 1010B), sample molecules and/or their bound reference Cleavage of dye molecules 1010A, 1010B can be performed using cleavage molecules 316. Sample molecules can be identified based on the signal emitted by reference molecules. The process of binding, receiving release signals, and cleavage can be repeated multiple times for a single sample molecule and/or reaction chamber. In some embodiments, the calibration techniques described herein can be used to calibrate systems that include integrated devices configured for use in protein and/or DNA/RNA sequencing applications.

本明細書に説明される較正技法は、較正に続いて行われる任意の好適なサンプリング技法と組み合わせて使用され得る。例えば、一部の実施形態において、本明細書に説明される較正技法は、２０２１年１０月２２日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＳＡＭＰＬＥＰＲＯＣＥＳＳＳＣＡＬＩＮＧ」と題する米国特許出願第１７／５０８５，７８３号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７０１１２ＵＳ０２）に説明されるような試料多重化のための技法と組み合わせて使用されてもよく、この出願は参照によりその全体が援用される。 The calibration techniques described herein may be used in combination with any suitable sampling technique followed by calibration. For example, in some embodiments, the calibration techniques described herein are described in U.S. patent application Ser. (Attorney Docket No. R0708.70112US02), which application is incorporated by reference in its entirety.

ＩＸ．定量的負荷
いくつかの態様は、集積デバイスの１つまたは複数の反応チャンバの定量的負荷の指標を決定するためのシステムおよび方法に関する。例えば、本発明者らは、集積デバイスの１つまたは複数の反応チャンバの定量的負荷の指標をリアルタイムで（例えば、負荷プロセスの間に）決定することが有利であることを認識した。定量的負荷の指標は、反応チャンバ内に何個の生体分子が存在するか（例えば、反応チャンバが空であるか、単一負荷されているか、二重負荷されているか、または３個以上の生体分子が多重負荷されているか）の表示を含み得る。一部の実施形態において、定量的負荷の指標は、単一負荷（または所望される任意の他の個数に負荷）されている反応チャンバの割合の表示を含み得る。 IX. Quantitative Loading Certain aspects relate to systems and methods for determining quantitative loading indicators of one or more reaction chambers of an integrated device. For example, the inventors have recognized that it would be advantageous to determine in real time (eg, during a loading process) an indication of the quantitative loading of one or more reaction chambers of an integrated device. An indicator of quantitative loading is how many biomolecules are present in the reaction chamber (e.g., whether the reaction chamber is empty, single-loaded, double-loaded, or three or more). may include an indication of whether the biomolecule is multi-loaded). In some embodiments, quantitative loading indicators may include an indication of the percentage of reaction chambers that are single loaded (or any other number desired).

図１４は、一部の実施形態による、１つまたは複数の反応チャンバの負荷を定量化するための例示的なプロセス１４００を示す。プロセス１４００は、集積デバイスに試料が負荷される動作１４０２で開始され得る。試料は、複数の生体分子を含み得る。複数の生体分子は、任意の適切な種類のものであり得る。例えば、複数の生体分子は、シークエンシングを通じて同定されることが望まれる生体分子を含み得る。一部の実施形態において、複数の生体分子はペプチドを含む。一部の実施形態において、複数の生体分子は、核酸（例えば、リボ核酸、デオキシリボ核酸）を含む。 FIG. 14 illustrates an example process 1400 for quantifying the loading of one or more reaction chambers, according to some embodiments. Process 1400 may begin with operation 1402 in which an integrated device is loaded with a sample. A sample can include multiple biomolecules. The plurality of biomolecules can be of any suitable type. For example, the plurality of biomolecules may include biomolecules that are desired to be identified through sequencing. In some embodiments, the plurality of biomolecules include peptides. In some embodiments, the plurality of biomolecules comprises nucleic acids (eg, ribonucleic acids, deoxyribonucleic acids).

複数の生体分子は、蛍光標識分子（本明細書では参照色素分子とも呼ばれる）で標識され得る。一部の実施形態において、複数の生体分子は、試料を集積デバイス上に負荷する前に標識され得る。一部の実施形態において、複数の生体分子は、負荷時に標識されていなくてもよく、集積デバイス上に事前または後に負荷される蛍光標識分子は、複数の生体分子に結合され得る。 Multiple biomolecules can be labeled with fluorescent label molecules (also referred to herein as reference dye molecules). In some embodiments, multiple biomolecules may be labeled prior to loading the sample onto the collection device. In some embodiments, the plurality of biomolecules may be unlabeled upon loading, and fluorescently labeled molecules that are pre- or post-loaded onto the integrated device may be attached to the plurality of biomolecules.

一部の実施形態において、蛍光標識分子は、生体分子自体に直接付着され得る。蛍光標識分子は、生体分子に共有結合され得るか、または生体分子に非共有結合され得る（例えば、リンカーまたはストレプトアビジンを介して）。一部の実施形態において、蛍光標識分子は、チップの界面化学調製の一部として反応チャンバ内に負荷され得る。一部の実施形態において、蛍光標識分子は、本明細書にさらに記載されるように、生体分子に可逆的に結合される。従って、本技術の態様は、反応チャンバ内の蛍光標識分子の特定の構成に限定されない。一部の実施形態によれば、動作１４０２は、２０２０年１０月２８日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＥＰＡＲＩＮＧＳＡＭＰＬＥＳＦＯＲＭＵＬＴＩＰＬＥＸＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」と題する米国特許出願第１７／０８２，９０６号（代理人整理番号Ｒ０１４０８．７００７７ＵＳ０１）に記載されている技法を含み得、この出願は参照によりその全体が援用される。 In some embodiments, fluorescently labeled molecules can be attached directly to the biomolecule itself. A fluorescently labeled molecule can be covalently attached to a biomolecule or non-covalently attached to a biomolecule (eg, via a linker or streptavidin). In some embodiments, fluorescently labeled molecules can be loaded into the reaction chamber as part of the surface chemistry preparation of the chip. In some embodiments, a fluorescently labeled molecule is reversibly attached to a biomolecule, as further described herein. Thus, aspects of the present technology are not limited to any particular configuration of fluorescently labeled molecules within the reaction chamber. According to some embodiments, operation 1402 may be applied to U.S. patent application Ser. R01408.70077US01), which application is incorporated by reference in its entirety.

一部の実施形態において、蛍光標識分子はオリゴヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドは生体分子に共有結合され得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、生体分子に共有結合している相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。 In some embodiments, the fluorescently labeled molecules consist of oligonucleotides. Oligonucleotides can be covalently linked to biomolecules. In some embodiments, the oligonucleotide is hybridized to a complementary oligonucleotide that is covalently linked to a biomolecule.

蛍光標識分子は、生体分子から（例えば、１つまたは複数のスペーサーを介して）最小距離（例えば、１ｎｍ超、２ｎｍ超、５ｎｍ超、５～１０ｎｍ、１０ｎｍ超、１０～１５ｎｍ、１５ｎｍ超、１５～９０ｎｍ、９０ｎｍ超）分離され得る。蛍光標識分子を生体分子から最小距離だけ分離することによって、定量的負荷の決定の間（例えば、光退色の間）に生体分子に損傷が生じることが防止され得る。 The fluorescently labeled molecule is located at a minimum distance (e.g., greater than 1 nm, greater than 2 nm, greater than 5 nm, 5-10 nm, greater than 10 nm, 10-15 nm, greater than 15 nm, 15 nm) from the biomolecule (e.g., via one or more spacers). ~90 nm, >90 nm). By separating the fluorescently labeled molecules from the biomolecules by a minimum distance, damage to the biomolecules can be prevented during quantitative loading determinations (eg, during photobleaching).

動作１４０４において、励起光は、集積デバイスの１つまたは複数の反応チャンバに照射され得る。励起光は、本明細書に説明されるように、少なくとも１つの励起源（例えば、レーザ）により生成され得る。励起光は、集積デバイスの反応チャンバの全てまたはその一部に照射され得る。 At act 1404, excitation light may be applied to one or more reaction chambers of the integrated device. Excitation light may be generated by at least one excitation source (eg, a laser) as described herein. The excitation light may illuminate all or a portion of the reaction chamber of the integrated device.

励起光は、反応チャンバ内の生体分子に結合された任意の蛍光標識分子を励起させて励起光を放出させる。動作１４０６において、励起光に反応して個々の反応チャンバから１つまたは複数の参照色素分子によって放出された信号が取得され得る。 The excitation light excites any fluorescently labeled molecules bound to biomolecules within the reaction chamber, causing them to emit excitation light. At operation 1406, signals emitted by one or more reference dye molecules from respective reaction chambers in response to excitation light may be obtained.

例えば、放出光は、集積デバイスの１つまたは複数の光検出領域によって収集され得る。一部の実施形態において、集積デバイスは、各反応チャンバに対して１つの光検出領域を含み得る。一部の実施形態において、複数の光検出領域が単一の反応チャンバに対して設けられ得る。一部の実施形態において、複数の反応チャンバが単一の光検出領域に対応し得る。 For example, emitted light may be collected by one or more light detection regions of the integrated device. In some embodiments, the integrated device may include one photodetection region for each reaction chamber. In some embodiments, multiple photodetection regions may be provided for a single reaction chamber. In some embodiments, multiple reaction chambers may correspond to a single light detection region.

動作１４０８において、定量的負荷の指標が、動作１４０６において取得された放出シグナルに基づいて決定され得る。本明細書に記載されるように、定量的負荷の指標は、反応チャンバ内に何個の生体分子が存在するか（例えば、反応チャンバが空であるか、単一負荷されているか、二重負荷されているか、または３個以上の生体分子が多重負荷されているか）の表示を含み得る。一部の実施形態において、定量的負荷の指標は、単一負荷（または所望される任意の他の個数に負荷）されている反応チャンバの割合の表示を含み得る。 At act 1408, a quantitative load indicator may be determined based on the emission signal obtained at act 1406. As described herein, quantitative loading indicators are based on how many biomolecules are present in the reaction chamber (e.g., whether the reaction chamber is empty, singly loaded, or double loaded). loaded or multiloaded with three or more biomolecules). In some embodiments, quantitative loading indicators may include an indication of the percentage of reaction chambers that are single loaded (or any other number desired).

一部の実施形態において、励起光を集積デバイスの１つまたは複数の反応チャンバに照射することは、１つまたは複数の蛍光標識分子を光退色させることを含み、定量的負荷の指標は、放出シグナルにおいて表される光退色ステップの数（例えば、放出シグナルにおいて観察され得る光退色ステップの数）に基づいて決定される。例えば、反応チャンバ（単数または複数）は、（例えば、光源をブロック解除すること、光源をチップに再結合すること、および／またはシステムの特性退色時間に対して速い時間に光源によって供給される出力を増加させることによって）ステップ関数（ｓｔｅｐｆｕｎｃｔｉｏｎ）に応じて励起光により照射され得る。励起光は、参照色素が退色されるまで、反応チャンバに照射され得る。図１５－１、図１５－２、および図１５－３は、動作１４０４において光退色される蛍光標識分子を有するチャンバから取得された例示的なトレースを示す。他の実施形態において、反応チャンバ内の１つまたは複数の参照色素によって放出された信号は、光退色を行うことなく取得され得る。 In some embodiments, irradiating the one or more reaction chambers of the integrated device with excitation light includes photobleaching the one or more fluorescently labeled molecules, and the indicator of quantitative loading is determined by the emission It is determined based on the number of photobleaching steps represented in the signal (eg, the number of photobleaching steps that can be observed in the emitted signal). For example, the reaction chamber(s) may be configured to (e.g., unblock the light source, recombine the light source to the chip, and/or the output provided by the light source at a time that is fast relative to the characteristic bleaching time of the system) can be irradiated with excitation light according to a step function (by increasing . . . ). Excitation light can be applied to the reaction chamber until the reference dye is bleached. 15-1, 15-2, and 15-3 show example traces obtained from a chamber with fluorescently labeled molecules that are photobleached in operation 1404. In other embodiments, the signal emitted by one or more reference dyes within the reaction chamber may be acquired without photobleaching.

図１５－１は、一部の実施形態による、単一負荷されたウェルを表すチップ負荷プロセスからの例示的なトレース１５００Ａを示す。図１５－１に示すように、ある期間にわたる信号強度がプロットされている。励起光が最初に反応チャンバに照射されると、反応チャンバから受信される信号の強度は、ピークまで上昇し得る。（例えば、レーザ等の光源をオンにすることによって）励起光を反応チャンバに照射した後、強度の単一のステップ（例えば、ある時点における信号の強度の特徴的な低下）が図１５－１において確認される。一部の実施形態において、図１５－１に示されるように、信号の強度の特徴的な低下は、退色前に参照色素分子によって放出された信号の強度と実質的に等しい。退色後、参照色素分子はもはやシグナルを放出せず、その結果、図１５－１に示すように強度の単一のステップ分の減少が生じる。従って、図１５－１に示される信号は、反応チャンバ内の単一の蛍光標識、従って単一の生体分子の存在を示す。 FIG. 15-1 shows an example trace 1500A from a chip loading process representing a single loaded well, according to some embodiments. As shown in Figure 15-1, the signal strength over a period of time is plotted. When excitation light is first applied to the reaction chamber, the intensity of the signal received from the reaction chamber may rise to a peak. After irradiating the reaction chamber with excitation light (e.g., by turning on a light source such as a laser), a single step in intensity (e.g., a characteristic decrease in the intensity of the signal at a certain point in time) is shown in Figure 15-1. It is confirmed in In some embodiments, the characteristic decrease in the intensity of the signal is substantially equal to the intensity of the signal emitted by the reference dye molecule prior to bleaching, as shown in FIG. 15-1. After bleaching, the reference dye molecule no longer emits a signal, resulting in a single step decrease in intensity as shown in Figure 15-1. Therefore, the signal shown in Figure 15-1 indicates the presence of a single fluorescent label and therefore a single biomolecule within the reaction chamber.

図１５－２は、一部の実施形態による、二重負荷されたウェルを表すチップ負荷プロセスからの例示的なトレース１５００Ｂを示す。図１５－２に示されるように、信号は、２個の蛍光標識分子、従って反応チャンバ内の２個の生体分子の存在を示す信号強度の２つのステップを含む。 FIG. 15-2 shows an example trace 1500B from a chip loading process representing a double loaded well, according to some embodiments. As shown in Figure 15-2, the signal includes two steps in signal intensity indicating the presence of two fluorescently labeled molecules and thus two biomolecules within the reaction chamber.

図１５－３は、一部の実施形態による、多重負荷されたウェルを表すチップ負荷プロセスからの例示的なトレース１５００Ｃを示す。図１５－３に示されるように、信号は、３個の蛍光標識分子、従って反応チャンバ内の３個の生体分子の存在を示す信号強度の３つのステップ（受信信号の強度の３つの特徴的な低下）を含む。 FIG. 15-3 shows an example trace 1500C from a chip loading process representing multiple loaded wells, according to some embodiments. As shown in Figure 15-3, the signal is divided into three steps in signal intensity (three characteristic steps in the intensity of the received signal) indicating the presence of three fluorescently labeled molecules and thus three biomolecules in the reaction chamber. including significant declines).

場合によっては、光退色ステップが観察されないことがある。従って、観察された光退色の欠如に基づいて、生体分子が反応チャンバ内に存在しないことが決定され得る。
一部の実施形態において、反応チャンバ内に存在する蛍光標識分子を光退色することなく、信号が反応チャンバから取得され得る。そのような実施形態において、反応チャンバ内に存在する蛍光標識分子の数、従って生体分子の数は、反応チャンバから取得される信号の相対強度によって決定され得る。 In some cases, no photobleaching step is observed. Therefore, based on the observed lack of photobleaching, it can be determined that biomolecules are not present within the reaction chamber.
In some embodiments, a signal may be obtained from the reaction chamber without photobleaching fluorescently labeled molecules present within the reaction chamber. In such embodiments, the number of fluorescently labeled molecules, and thus the number of biomolecules, present within the reaction chamber may be determined by the relative intensity of the signal obtained from the reaction chamber.

一部の実施形態において、蛍光標識分子は、生体分子または生体分子に付着した二次生体分子に可逆的に結合され得る。例えば、二次生体分子は、Ｎ末端アミノ酸認識剤（例えば、ＣｌｐＳ、ＵＢＲボックスなど）を含み得る。一部の実施形態において、二次生体分子はオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、生体分子または生体分子に付着したオリゴヌクレオチドへの可逆的ハイブリダイゼーションが可能である。 In some embodiments, a fluorescently labeled molecule can be reversibly attached to a biomolecule or a second biomolecule attached to a biomolecule. For example, the secondary biomolecule can include an N-terminal amino acid recognition agent (eg, ClpS, UBR box, etc.). In some embodiments, the secondary biomolecule is an oligonucleotide. In some embodiments, the oligonucleotide is capable of reversible hybridization to a biomolecule or an oligonucleotide attached to a biomolecule.

蛍光標識分子の生体分子への結合のオンおよびオフは、蛍光標識分子のオンおよびオフパルス化によって表すことができる。特に、蛍光標識分子が生体分子に結合されて励起光により励起されるとき、蛍光標識分子は、１つまたは複数の光検出領域によって収集され得る放出光を放出する。結合していない場合、蛍光標識分子は放出光を放出し得ない。蛍光標識分子は、生体分子に対して周期的な結合パターンをとることができる。従って、蛍光標識は、生体分子に結合したときに蛍光標識から放出された光を収集することによって検出することができる周期的パルス化パターンを生成する。 The on and off binding of a fluorescently labeled molecule to a biomolecule can be represented by on and off pulsing of the fluorescently labeled molecule. In particular, when a fluorescently labeled molecule is bound to a biomolecule and excited by excitation light, the fluorescently labeled molecule emits emitted light that can be collected by one or more light detection regions. When unbound, the fluorescently labeled molecules cannot emit emitted light. Fluorescent labeled molecules can form periodic binding patterns with biomolecules. Thus, fluorescent labels produce a periodic pulsing pattern that can be detected by collecting the light emitted from the fluorescent label when bound to a biomolecule.

図１６は、一部の実施形態による、生体分子に可逆的に結合される蛍光分子の周期的パルス化パターンを示す図である。プロット１６０２及び１６０４は、単一パルス周期Ｔの間に１つまたは複数の光検出領域によって検出されたパルスの例を示す。 FIG. 16 is a diagram illustrating a periodic pulsing pattern of fluorescent molecules reversibly bound to biomolecules, according to some embodiments. Plots 1602 and 1604 show examples of pulses detected by one or more photodetection regions during a single pulse period T.

プロット１６０２および１６０４は、２個の生体分子およびそれに可逆的に結合された個々の蛍光標識を有する二重負荷されたウェルの例を示す。従って、パルス期間Ｔ中に２個のパルスが検出される。プロット１６０２の図示された実施形態において、２個の蛍光標識分子は、期間Ｔの間に実質的に同時に個々の生体分子に結合する。従って、２個の蛍光標識分子の各々からの個々のパルスから構成される強度２Ｉを有する単一の複合パルスが、期間Ｔ内に検出される。プロット１６０４の図示された実施形態において、２個の蛍光標識分子は、期間Ｔの間の離散時間において個々の生体分子に結合する。従って、強度Ｉを有する２個のパルスが期間Ｔ内に検出される。 Plots 1602 and 1604 show examples of double-loaded wells with two biomolecules and individual fluorescent labels reversibly bound to them. Therefore, two pulses are detected during the pulse period T. In the illustrated embodiment of plot 1602, two fluorescently labeled molecules bind to individual biomolecules substantially simultaneously during time period T. Thus, a single composite pulse with an intensity 2I consisting of individual pulses from each of the two fluorescently labeled molecules is detected within the period T. In the illustrated embodiment of plot 1604, two fluorescently labeled molecules bind to individual biomolecules at discrete times during period T. Two pulses with intensity I are therefore detected within period T.

図示される実施形態は、反応チャンバに２個の生体分子が二重負荷される例を示したが、本明細書に説明される技法は、同様に、パルス化周期Ｔの間に反応チャンバから放出されたパルスの強度を決定することによって、反応チャンバ内の単一生体分子の存在、２個を上回る生体分子の存在、または任意の生体分子の欠如を検出するために使用され得る。パルスのパルス化周期および強度は、生体分子に可逆的に結合される蛍光標識分子の特性パルス幅および特性強度に基づいて決定され得る。 Although the illustrated embodiment showed an example in which the reaction chamber is double loaded with two biomolecules, the techniques described herein similarly apply from the reaction chamber during the pulsing period T. By determining the intensity of the emitted pulses, it can be used to detect the presence of a single biomolecule, the presence of more than two biomolecules, or the absence of any biomolecules within the reaction chamber. The pulsing period and intensity of the pulse can be determined based on the characteristic pulse width and characteristic intensity of the fluorescently labeled molecule that is reversibly bound to the biomolecule.

図１６は、パルスのタイミングおよび強度を検出し、かつ使用して、個々のパルス周期Ｔの間に生体分子に結合されている反応チャンバ内の蛍光標識分子の数、従って、反応チャンバ内に現在存在する生体分子の数を決定する方法を示す。従って、プロセス１４００の動作１４０８は、本明細書に記載されるような可逆的結合分子を使用して行われ得る。 FIG. 16 shows that the timing and intensity of the pulses can be detected and used to determine the number of fluorescently labeled molecules in the reaction chamber that are bound to biomolecules during each pulse period T, and thus the number of fluorescently labeled molecules currently in the reaction chamber. A method for determining the number of biomolecules present is shown. Accordingly, act 1408 of process 1400 may be performed using reversible binding molecules as described herein.

プロセス１４００に戻ると、プロセス１４００は、放出された信号に基づいて定量的負荷の指標を決定した後、動作１４１０に進行し得る。動作１４１０において、負荷を継続するかどうかが決定される。負荷を継続するか終了するかの決定は、動作１４１０で決定された定量的負荷の指標に基づいて決定され得る。 Returning to process 1400, process 1400 may proceed to operation 1410 after determining a quantitative load indicator based on the emitted signal. In operation 1410, it is determined whether to continue with the load. The decision to continue or terminate the load may be determined based on the quantitative load indicator determined in operation 1410.

例えば、一部の実施形態において、集積デバイスの動作は、定量的負荷の指標に基づいて最適化され得る。一部の実施形態において、定量的負荷の指標は、集積デバイスへの試料の負荷を行う方法を調整するために使用され得る。一部の実施形態において、定量的負荷の指標を使用して、最適な数の反応チャンバに所望の数の生体分子が負荷されたかどうかを判定することができる。一部の実施形態において、生体分子の所望の数は１であり、従って、定量的負荷の指標を使用して、最適な数（例えば、最大）の反応チャンバが単一負荷されているかどうかが判定される。 For example, in some embodiments, integrated device operation may be optimized based on quantitative load metrics. In some embodiments, quantitative loading indicators may be used to adjust the method of performing sample loading onto the integration device. In some embodiments, quantitative loading metrics can be used to determine whether the optimal number of reaction chambers have been loaded with the desired number of biomolecules. In some embodiments, the desired number of biomolecules is 1, and therefore a quantitative loading metric is used to determine whether an optimal number (e.g., maximum) of reaction chambers are single-loaded. It will be judged.

定量的負荷の指標によって示されるように、負荷される反応チャンバの最適な数に達していない場合、追加の負荷が行われ得る。例えば、プロセス１４００は、追加の試料が集積デバイスに負荷される動作１４０２にループバックされ得る。 If the optimal number of reaction chambers to be loaded has not been reached, as indicated by the quantitative loading indicator, additional loading may be performed. For example, process 1400 may be looped back to operation 1402 where additional samples are loaded onto the integration device.

一部の実施形態において、定量的負荷の指標を使用して、後続の負荷ステップで負荷される追加の試料の量を調整することができる。例えば、試料は、特定の濃度の生体分子を含み得る。定量的負荷の指標を使用して、生体分子の濃度を増加させるかまたは減少させるかを決定することができる。例えば、単一負荷反応チャンバの最適な数が満たされていないと判定された場合、初期試料よりも生体分子の濃度が高い追加の試料を使用して追加の負荷を実施することができる。 In some embodiments, quantitative loading indicators can be used to adjust the amount of additional sample loaded in subsequent loading steps. For example, a sample may contain a specific concentration of biomolecules. Quantitative loading indicators can be used to determine whether to increase or decrease the concentration of biomolecules. For example, if it is determined that the optimal number of single-load reaction chambers is not met, additional loading can be performed using additional samples with higher concentrations of biomolecules than the initial sample.

一部の実施形態において、定量的負荷の指標は、後続の分析のために反応チャンバからの信号を処理する方法を調整するために使用され得る。例えば、反応チャンバが空であるか、二重負荷されているか、または多重負荷されていると判定された場合、これらの反応チャンバに対してシークエンシングを実行しないこと、またはこれらの反応チャンバから受信した信号を処理しないことのいずれかによって、これらの反応チャンバからの信号を無視すると判定され得る。 In some embodiments, quantitative loading indicators can be used to adjust the way signals from the reaction chamber are processed for subsequent analysis. For example, if reaction chambers are determined to be empty, doubly loaded, or multiloaded, do not perform sequencing on or receive data from these reaction chambers. It may be determined that the signals from these reaction chambers are ignored, either by not processing the detected signals.

一部の実施形態において、定量的負荷の指標は、集積デバイスの将来の動作を通知するために使用され得る。例えば、定量的負荷の指標は、集積デバイスへの試料の負荷を将来行う方法（例えば、試料中に存在する生体分子の濃度、負荷を実施する時間、負荷を実施する速度など）を調整するために使用され得る。 In some embodiments, quantitative load indicators may be used to inform future operation of the integrated device. For example, quantitative loading indicators can be used to adjust the way in which future loading of a sample into an integrated device is performed (e.g., the concentration of biomolecules present in the sample, the time at which the loading is performed, the rate at which the loading is performed, etc.) can be used for.

動作１４１０において負荷を継続しないと決定された場合、プロセス１４００は動作１４１２に進行し、そこで負荷が終了される。例えば、一部の実施形態において、終了は、固定化されていない（例えば、結合されていない）ペプチドを含む溶液の除去、洗浄、および／または交換によって実施され得る。一部の実施形態において、終了は自律的に実行され得る。 If it is determined in operation 1410 not to continue the load, the process 1400 proceeds to operation 1412 where the load is terminated. For example, in some embodiments, termination can be performed by removing, washing, and/or replacing the solution containing unimmobilized (eg, unconjugated) peptide. In some embodiments, termination may be performed autonomously.

一部の実施形態において、負荷を終了させることは、反応チャンバから蛍光標識分子を除去することを含み得る。一部の実施形態において、蛍光標識分子は、化学的切断プロセスによって除去され得る。一部の実施形態において、蛍光標識分子は、酵素的切断プロセスによって除去され得る。 In some embodiments, terminating loading may include removing the fluorescently labeled molecule from the reaction chamber. In some embodiments, fluorescently labeled molecules can be removed by a chemical cleavage process. In some embodiments, fluorescently labeled molecules can be removed by an enzymatic cleavage process.

本明細書で説明されるように、プロセス１４００は連続的に実行され得る。一部の実施形態において、プロセス１４００は、例えば、ソフトウェアを使用して自律的に実行され得る。これにより、各反応チャンバ内の標識された生体分子の数を連続的に監視することが可能になる。ソフトウェア分析プロセスは、負荷をリアルタイムで監視することができる。例えば、ソフトウェア分析は、本明細書に記載されるように、信号パルス／光退色ステップを検出し得る。 As described herein, process 1400 may be performed continuously. In some embodiments, process 1400 may be performed autonomously using software, for example. This allows continuous monitoring of the number of labeled biomolecules in each reaction chamber. Software analysis processes can monitor loads in real time. For example, software analysis can detect signal pulses/photobleaching steps as described herein.

一部の実施形態において、１つまたは複数の異なる種類の蛍光標識分子が生体分子に提供される。例えば、第１の種類の蛍光標識分子および第２の種類の蛍光標識分子が、生体分子への結合のために提供され得る。 In some embodiments, the biomolecule is provided with one or more different types of fluorescent label molecules. For example, a first type of fluorescently labeled molecule and a second type of fluorescently labeled molecule can be provided for binding to a biomolecule.

一部の実施形態において、反応チャンバの「ヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）」を生成して、１つまたは複数の生体分子が負荷された集積デバイスの割合（例えば、反応チャンバの割合）を視覚的に示し得る。図１７は、一部の実施形態による、負荷パーセントを例示する反応チャンバの例示的なヒートマップを示す。 In some embodiments, a "heatmap" of the reaction chambers is generated to visually indicate the percentage of integrated devices (e.g., percentage of reaction chambers) loaded with one or more biomolecules. obtain. FIG. 17 shows an example heat map of a reaction chamber illustrating percent loading, according to some embodiments.

一部の実施形態において、定量的負荷の指標は、集積デバイスの一部（例えば、集積デバイスの全ての反応チャンバの一部）に対してのみ取得され得る。定量的負荷の指標は、集積デバイス全体（または、従って、他の部分）に関する定量的負荷の外挿された指標を得るために、集積デバイスの残りの反応チャンバに外挿され得る。 In some embodiments, quantitative loading indicators may be obtained for only a portion of the integrated device (eg, a portion of all reaction chambers of the integrated device). The quantitative load measure may be extrapolated to the remaining reaction chambers of the integrated device to obtain an extrapolated measure of quantitative load for the entire integrated device (or, therefore, other parts).

一部の実施形態において、試料のシークエンシングは、本明細書に説明される較正および定量的負荷技法を実行した後に、（例えば、プロセス１４００の動作１４１４において）実行され得る。例えば、較正および定量的負荷技術は、例えば、２０２０年６月１２日に出願された「ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳＦＯＲＰＲＯＴＥＩＮＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＵＳＩＮＧＭＡＣＨＩＮＥＬＥＡＲＮＩＮＧＡＮＤＲＥＬＡＴＥＤＳＹＳＴＥＭＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳ」と題する米国特許出願第１６／９００，５８２号（代理人整理番号Ｒ０７０８．７００６３ＵＳ０１）に記載されるような、機械学習を使用した試料同定のための技術と組み合わせて使用されてもよく、この出願は、参照によりその全体が援用される。 In some embodiments, sequencing of the sample may be performed (eg, at act 1414 of process 1400) after performing the calibration and quantitative loading techniques described herein. For example, the calibration and quantitative loading techniques are disclosed in the US Patent Application entitled "TECHNIQUES FOR PROTEIN IDENTIFICATION USING MACHINE LEARNING AND RELATED SYSTEMS AND METHODS" filed on June 12, 2020. Patent Application No. 16/900,582 (Representative It may also be used in combination with techniques for sample identification using machine learning, such as those described in Publication No. R0708.70063US01), which application is incorporated by reference in its entirety.

集積デバイスに関連する（例えば、集積デバイスの１つまたは複数の反応チャンバの占有率に関連する）リアルタイム測定値を取得するための本明細書に記載される技術は、集積デバイスを使用している間（例えば、試料調製の間、負荷の間、シークエンシングの間、試料除去の間等）にいつでも実装することができ、そのような技術は、集積デバイスの負荷の間の使用に限定されない。 The techniques described herein for obtaining real-time measurements related to an integrated device (e.g., related to occupancy of one or more reaction chambers of the integrated device) use the integrated device. Such techniques are not limited to use during loading of integrated devices, and can be implemented at any time during loading (eg, during sample preparation, loading, sequencing, sample removal, etc.).

Ｘ．均等物および範囲
本開示の技術のいくつかの態様および実施形態をこのように記載したが、様々な改変、変更および改良が当業者に容易に想起されることを理解されたい。そのような改変、変更および改良は、本明細書に記載される技術の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、上記の実施形態は例として提示されているものにすぎないこと、ならびに、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は詳細に記載されているものとは別様に実践され得ることを理解されたい。加えて、本明細書に記載される２つ以上の特徴部、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴部、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に矛盾するものでなければ、本開示の範囲内に含まれる。 X. Equivalents and Scope Having thus described certain aspects and embodiments of the disclosed technology, it is to be understood that various modifications, changes, and improvements will readily occur to those skilled in the art. Such modifications, changes, and improvements are intended to be within the spirit and scope of the technology described herein. It is therefore understood that the embodiments described above are presented by way of example only, and that, within the scope of the appended claims and equivalents thereof, embodiments of the invention may be described in detail. It should be understood that may be implemented differently. In addition, any combination of two or more features, systems, articles, materials, kits, and/or methods described herein may be combined with any combination of two or more features, systems, articles, materials, kits, and/or methods described herein. Provided that the methods are not mutually exclusive, they are within the scope of this disclosure.

また、記載したように、いくつかの態様は、１つ以上の方法として具現化してよい。方法の一部として実施される動作は、任意の好適な形で順序付けることができる。それに応じて、例示的な実施形態では連続的な動作として示されている場合であっても、いくつかの動作を同時に実施することを含み得る、示されているものとは異なる順序で動作が実施される実施形態を構築することができる。 Also, as described, some aspects may be embodied in one or more methods. The operations performed as part of the method may be ordered in any suitable manner. Accordingly, even though the example embodiments show sequential acts, the acts may be performed in a different order than shown, which may include performing some acts simultaneously. Implemented embodiments can be constructed.

本明細書において定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により援用される文献中の定義および定義される用語の通常の意味の両方、またはそのいずれかを超えて統括するものと理解されたい。 All definitions defined and used herein shall supersede dictionary definitions and/or definitions in literature incorporated by reference and the ordinary meaning of the term defined. I want to be understood.

本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明らかにそれとは反対のことが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されたい。 As used in this specification and in the claims, the indefinite articles "a" and "an" are to be understood to mean "at least one," unless clearly indicated to the contrary.

「および／または」などの句は、本明細書および特許請求の範囲において本願明細書で使用されるとき、そのように連結された要素の「一方または両方」を、すなわち、ある場合には連言的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素を意味するものと理解されたい。 Phrases such as "and/or," as used herein in the specification and claims, refer to "one or both" of the elements so concatenated, i.e., in some cases conjoint. It should be understood to mean elements that exist disjunctively and in other cases disjunctively.

本明細書および特許請求の範囲において本願明細書で使用されるとき、１つ以上の要素の列挙に関して、「少なくとも１つ」という句は、要素の列挙中の要素のうちのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されたいが、必ずしも、要素の列挙内に具体的に列挙されるあらゆる要素のうちの少なくとも１つを含むとは限らず、また要素の列挙中の要素の任意の組み合わせを排除するわけではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が言及する要素の列挙内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関するか関しないかにかかわらず、任意選択的に存在し得ることを可能にする。 As used herein in the specification and claims, in reference to a listing of one or more elements, the phrase "at least one" refers to any one or more of the elements in the listing of elements. is understood to mean at least one element selected from, but does not necessarily include at least one of every element specifically listed within the enumeration of elements, and does not necessarily include at least one of every element specifically listed within the enumeration of elements. It does not exclude any combination of elements within. This definition also applies to elements other than those specifically identified in the enumeration of elements to which the phrase "at least one" refers, whether or not they relate to those specifically identified elements. may be optionally present.

特許請求の範囲および上記の明細書において、「備える」、「含む」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「から構成される」などのようなすべての移行句はオープンエンド、すなわち限定はされないが含むことを意味するものであると理解されたい。「からなる」および「本質的に～からなる」という移行句はそれぞれクローズドまたはセミクローズドの移行句とする。 In the claims and the above specification, terms such as "comprising," "including," "carrying," "having," "containing," "accompanying," "holding," "consisting of," and the like are used. All transitional phrases such as are to be understood as open-ended, meaning including but not limited to. The transitional phrases "consisting of" and "consisting essentially of" are closed or semi-closed transitional phrases, respectively.

Claims

試料を処理する集積デバイスを再使用するための方法であって、前記試料が複数のアリコートに分割され、前記試料が分析物を含み、前記分析物が１つまたは複数の発光標識された分子を含む生体分子を含み、前記方法が、
前記複数のアリコートの第１のアリコートを、前記集積デバイスの複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する工程と、
分析物が前記複数のチャンバの少なくとも一部に存在する間に、前記第１のアリコートの前記分析物を試料採取する工程であって、前記１つまたは複数の発光標識された分子により放出されたシグナルの発光寿命、発光強度、波長、パルス持続時間、および／またはパルス間の持続時間を決定することを含む、前記試料採取する工程と、
前記集積デバイスの前記複数のチャンバの少なくとも一部から前記第１のアリコートを取り出す工程と、
前記複数のアリコートの第２のアリコートを、前記集積デバイスの前記複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する工程と、を含む方法。 A method for reusing an integrated device for processing a sample, the sample being divided into a plurality of aliquots, the sample containing an analyte, and the analyte containing one or more luminescently labeled molecules. the method comprises a biomolecule comprising:
loading a first aliquot of the plurality of aliquots into at least a portion of the plurality of chambers of the integrated device;
sampling the first aliquot of the analyte while the analyte is present in at least a portion of the plurality of chambers, the step of: sampling the analyte released by the one or more luminescently labeled molecules; said sampling step comprising determining the luminescence lifetime, luminescence intensity, wavelength, pulse duration, and/or interpulse duration of the signal;
removing the first aliquot from at least a portion of the plurality of chambers of the integrated device;
loading a second aliquot of the plurality of aliquots into at least a portion of the plurality of chambers of the integrated device.

前記第２のアリコートの分析物が前記複数のチャンバの少なくとも一部に存在する間に、前記第２のアリコートの前記分析物を試料採取する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, further comprising sampling the analyte of the second aliquot while it is present in at least a portion of the plurality of chambers.

前記複数のチャンバの少なくとも一部から前記第１のアリコートを取り出す工程が、前記複数のチャンバの表面に結合した２つ以上のコーティング分子とカップリング部分との間の共有結合を破壊することを含み、前記第１のアリコートの前記分析物が前記カップリング部分に結合している、請求項１または２に記載の方法。 Removing the first aliquot from at least a portion of the plurality of chambers includes breaking a covalent bond between a coupling moiety and two or more coating molecules bound to a surface of the plurality of chambers. , wherein the analyte of the first aliquot is bound to the coupling moiety.

解離させる工程が、前記複数のチャンバの表面を溶液と個別の期間接触させることにより実施される、請求項３に記載の方法。 4. The method of claim 3, wherein the step of dissociating is carried out by contacting surfaces of the plurality of chambers with a solution for discrete periods of time.

解離させる工程が、摂氏２０度以上かつ摂氏２２度以下の温度で実施される、請求項４に記載の方法。 5. The method of claim 4, wherein the step of dissociating is carried out at a temperature of 20 degrees Celsius or more and 22 degrees Celsius or less.

前記個別の期間が６０分以下を含む、請求項４に記載の方法。 5. The method of claim 4, wherein the discrete time periods include 60 minutes or less.

前記溶液が、酢酸アンモニウム、水、およびヘキサフルオロ－２－プロパノールを含む、請求項４に記載の方法。 5. The method of claim 4, wherein the solution comprises ammonium acetate, water, and hexafluoro-2-propanol.

前記溶液が、遊離ビオチンおよび／または１つもしくは複数の遊離ビオチンのアナログをさらに含む、請求項４に記載の方法。 5. The method of claim 4, wherein the solution further comprises free biotin and/or one or more analogs of free biotin.

前記溶液が、酢酸アンモニウム、水、および１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを含む、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, wherein the solution comprises ammonium acetate, water, and 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.

前記溶液が、酢酸アンモニウム、水、ならびにノナフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、２，２，３，３，４，４，４－ヘプタフルオロ－１－ブタノールおよびオクタフルオロ－２－ブタノンのうちの１つまたは複数を含む、請求項４に記載の方法。 The solution comprises ammonium acetate, water and one of nonafluoro-tert-butyl alcohol, 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol and octafluoro-2-butanone or 5. The method of claim 4, comprising a plurality.

前記複数のチャンバの少なくとも一部から前記第１のアリコートを取り出す工程が、前記複数のチャンバの表面からコーティング分子を取り出すことを含み、前記第１のアリコートの前記分析物が、カップリング部分により前記複数のチャンバの少なくとも一部において前記コーティング分子の少なくとも一部に結合している、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。 Removing the first aliquot from at least a portion of the plurality of chambers includes removing coating molecules from a surface of the plurality of chambers, wherein the analyte of the first aliquot is coupled to the analyte by a coupling moiety. 11. A method according to any one of claims 1 to 10, wherein the coating molecules are bound to at least a portion of the coating molecules in at least a portion of a plurality of chambers.

前記第２のアリコートを前記複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する工程の前に、前記複数のチャンバの表面を前記コーティング分子で再コーティングする工程を含む、請求項１１に記載の方法。 12. The method of claim 11, comprising recoating surfaces of the plurality of chambers with the coating molecules prior to loading the second aliquot into at least some of the plurality of chambers.

前記複数のチャンバの少なくとも一部から前記第１のアリコートを取り出す工程が、前記複数のチャンバの少なくとも一部において前記第１のアリコートの前記分析物を酵素消化することを含む、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。 Claims 1-12, wherein the step of removing the first aliquot from at least a portion of the plurality of chambers comprises enzymatically digesting the analyte of the first aliquot in at least a portion of the plurality of chambers. The method according to any one of the above.

前記第１のアリコートの前記分析物がカップリング部分に結合しており、前記複数のチャンバの少なくとも一部から前記第１のアリコートを取り出す工程が、前記カップリング部分と前記第１のアリコートの前記分析物との間の共有結合リンカーを破壊することを含む、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。 the analyte of the first aliquot is bound to a coupling portion, and the step of removing the first aliquot from at least a portion of the plurality of chambers includes binding the analyte of the first aliquot to the coupling portion; 14. A method according to any one of claims 1 to 13, comprising destroying the covalent linker between the analyte and the analyte.

前記試料採取する工程が、
少なくとも１つの光源から送達された励起光を用いて前記第１のアリコートの前記分析物を励起すること、
前記少なくとも１つの光源から送達された光により励起されたときに、前記集積デバイスの光検出領域において前記第１のアリコートの前記分析物から放出されたシグナルを収集すること、をさらに含む、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。 The step of collecting the sample includes:
exciting the analyte in the first aliquot using excitation light delivered from at least one light source;
Claim further comprising: collecting a signal emitted from the analyte of the first aliquot in a light detection region of the integrated device when excited by light delivered from the at least one light source. 15. The method according to any one of 1 to 14.

前記第１のアリコートを前記複数のチャンバの少なくとも一部に負荷する前に、前記複数のチャンバの表面をコーティング分子でコーティングする工程をさらに含み、前記第１のアリコートの分析物が、前記コーティング分子と結合するためのカップリング部分に結合している、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。 prior to loading the first aliquot into at least a portion of the plurality of chambers, further comprising coating a surface of the plurality of chambers with a coating molecule, wherein the analyte of the first aliquot is coated with the coating molecule. 16. A method according to any one of claims 1 to 15, wherein the method is coupled to a coupling moiety for coupling with.

前記コーティング分子がビオチンおよびストレプトアビジンのうちの一方を含み、前記カップリング部分がビオチンおよびストレプトアビジンのうちの一方を含み、前記カップリング部分が前記コーティング分子とは異なる、請求項１６に記載の方法。 17. The method of claim 16, wherein the coating molecule comprises one of biotin and streptavidin, the coupling moiety comprises one of biotin and streptavidin, and the coupling moiety is different from the coating molecule. .

前記複数のチャンバの少なくとも一部から前記第１のアリコートの前記分析物を取り出す工程の後で、前記コーティング分子が前記複数のチャンバ内に留まる、請求項１７に記載の方法。 18. The method of claim 17, wherein the coating molecules remain within the plurality of chambers after removing the first aliquot of the analyte from at least a portion of the plurality of chambers.

前記第１のアリコートを前記複数のチャンバの少なくとも一部に負荷した後で、前記複数のチャンバの他のものは前記第１のアリコートの前記分析物を一切含有しない、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の方法。 19. After loading the first aliquot into at least some of the plurality of chambers, other of the plurality of chambers do not contain any of the analyte of the first aliquot. or the method described in paragraph 1.

前記複数のチャンバの少なくとも一部から前記第１のアリコートの前記分析物を取り出す工程の後で、前記複数のチャンバに対して励起光を送達することにより、前記複数のチャンバから認識シグナルを取得し、前記励起光に応答して前記複数のチャンバから放出されたシグナルを収集する工程と、
前記励起光に応答して前記複数のチャンバから放出された前記シグナルに基づき、前記第１のアリコートが前記複数のチャンバの少なくとも一部から実質的に取り出されたかどうかを判定する工程と、をさらに含む、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。 After removing the first aliquot of the analyte from at least a portion of the plurality of chambers, obtaining a recognition signal from the plurality of chambers by delivering excitation light to the plurality of chambers. , collecting signals emitted from the plurality of chambers in response to the excitation light;
determining whether the first aliquot has been substantially removed from at least a portion of the plurality of chambers based on the signal emitted from the plurality of chambers in response to the excitation light. 20. A method according to any one of claims 1 to 19, comprising:

前記生体分子がポリヌクレオチドである、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。 21. The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the biomolecule is a polynucleotide.

前記生体分子がポリペプチドである、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。 22. A method according to any one of claims 1 to 21, wherein the biomolecule is a polypeptide.

試料を処理する集積デバイスを再使用するための方法であって、前記試料が分析物を含み、前記分析物が１つまたは複数の発光標識された分子を含む生体分子を含み、前記方法が、
前記試料の少なくとも一部分を、前記集積デバイスの複数のチャンバに負荷する工程と、
分析物が前記複数のチャンバ内に存在する間に、前記試料の少なくとも一部分の前記分析物を試料採取する工程であって、発光寿命、発光強度、波長、パルス持続時間、およびパルス間の持続時間を示す、前記１つまたは複数の発光標識された分子により放出されたシグナルを収集する工程を含む、前記試料採取する工程と、
前記複数のチャンバから前記試料の少なくとも一部分を取り出す工程であって、
前記複数のチャンバの表面に結合したそれぞれのコーティング分子とカップリング部分との間の共有結合を破壊することを含み、前記試料の少なくとも一部分の前記分析物が前記カップリング部分に結合している、前記取り出す工程と、を含む方法。 A method for reusing an integrated device for processing a sample, the sample comprising an analyte, the analyte comprising a biomolecule including one or more luminescently labeled molecules, the method comprising:
loading at least a portion of the sample into a plurality of chambers of the integrated device;
sampling the analyte of at least a portion of the sample while the analyte is present in the plurality of chambers, the step comprising: emitting lifetime, emitting intensity, wavelength, pulse duration, and duration between pulses; said sampling step comprising collecting a signal emitted by said one or more luminescently labeled molecules indicating
removing at least a portion of the sample from the plurality of chambers,
breaking a covalent bond between a respective coating molecule bound to a surface of the plurality of chambers and a coupling moiety, wherein the analyte of at least a portion of the sample is bound to the coupling moiety; A method comprising the step of taking out.

前記共有結合が前記分析物を前記複数のチャンバの表面に結合させ、前記結合を破壊することにより、前記分析物が前記複数のチャンバの表面から放出される、請求項２３に記載の方法。 24. The method of claim 23, wherein the covalent bond binds the analyte to a surface of the plurality of chambers and breaking the bond releases the analyte from the surface of the plurality of chambers.

前記取り出す工程が、破壊の後で、前記分析物を前記複数のチャンバからフラッシングすることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the step of removing further comprises flushing the analyte from the plurality of chambers after disruption.

前記破壊する工程が、前記複数のチャンバの表面を、溶液と個別の期間接触させることにより実施される、請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の方法。 26. A method according to any one of claims 23 to 25, wherein said disrupting step is carried out by contacting surfaces of said plurality of chambers with a solution for discrete periods of time.

前記破壊する工程が、摂氏２０度以上かつ摂氏２２度以下の温度で実施される、請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the breaking step is performed at a temperature of 20 degrees Celsius or more and 22 degrees Celsius or less.

前記個別の期間が６０分以下を含む、請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the discrete time periods include 60 minutes or less.

前記個別の期間が３０分以下を含む、請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the discrete time periods include 30 minutes or less.

前記コーティング分子がビオチンを含み、前記カップリング部分がストレプトアビジンを含む、請求項２３乃至２９のいずれか１項に記載の方法。 30. The method of any one of claims 23-29, wherein the coating molecule comprises biotin and the coupling moiety comprises streptavidin.

前記コーティング分子がストレプトアビジンを含み、前記カップリング部分がビオチンを含む、請求項２３乃至３０のいずれか１項に記載の方法。 31. The method of any one of claims 23-30, wherein the coating molecule comprises streptavidin and the coupling moiety comprises biotin.

溶液が酢酸アンモニウムおよび水を含む、請求項３０に記載の方法。 31. The method of claim 30, wherein the solution comprises ammonium acetate and water.

前記溶液がヘキサフルオロ－２－プロパノールをさらに含む、請求項３２に記載の方法。 33. The method of claim 32, wherein the solution further comprises hexafluoro-2-propanol.

前記接触の後で、
少なくとも１つの光源から前記複数のチャンバに対して励起光を送達することにより、前記複数のチャンバから認識シグナルを取得し、前記励起光に応答して前記複数のチャンバから放出されたシグナルを収集する工程と、
前記励起光に応答して前記複数のチャンバから放出された前記シグナルに基づき、前記試料の少なくとも一部分の前記分析物が前記複数のチャンバから取り出されたかどうかを判定する工程と、をさらに含む、請求項２６に記載の方法。 After said contact,
obtaining recognition signals from the plurality of chambers by delivering excitation light from at least one light source to the plurality of chambers and collecting signals emitted from the plurality of chambers in response to the excitation light; process and
determining whether the analyte of at least a portion of the sample has been removed from the plurality of chambers based on the signal emitted from the plurality of chambers in response to the excitation light. The method according to item 26.

前記複数のチャンバから前記試料の少なくとも一部分を取り出す工程の後で、前記試料の残りの部分を前記複数のチャンバに負荷する工程をさらに含む、請求項２３乃至３４のいずれか１項に記載の方法。 35. The method of any one of claims 23-34, further comprising loading a remaining portion of the sample into the plurality of chambers after removing at least a portion of the sample from the plurality of chambers. .

試料が集積デバイスの１つまたは複数のチャンバ内に存在するかどうかを判定するための方法であって、
前記試料の少なくとも一部分を、前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバに負荷する工程と、
前記試料の少なくとも一部分を、前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバから取り出す工程と、
前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバに対して励起光を送達する工程と、
前記励起光に応答して前記複数のチャンバから放出されたシグナルを、前記集積デバイスの光検出領域において収集する工程と、
前記シグナルに基づき、前記試料の少なくとも一部分の少なくとも一部が、前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバ内に存在するかどうかを判定する工程と、を含む方法。 A method for determining whether a sample is present in one or more chambers of an integration device, the method comprising:
loading at least a portion of the sample into the one or more chambers of the integrated device;
removing at least a portion of the sample from the one or more chambers of the integrated device;
delivering excitation light to the one or more chambers of the integrated device;
collecting signals emitted from the plurality of chambers in response to the excitation light at a light detection region of the integrated device;
determining whether at least a portion of at least a portion of the sample is present within the one or more chambers of the integrated device based on the signal.

前記取り出す工程の後で、前記シグナルに基づき、前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバ内に残存する前記試料の少なくとも一部分の量を決定する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。 37. The method of claim 36, further comprising determining an amount of at least a portion of the sample remaining in the one or more chambers of the integrated device based on the signal after the removing step.

前記１つまたは複数のチャンバ内に残存する前記試料の少なくとも一部分の量が閾値未満であると判定されたときに、前記試料の残りの部分を前記１つまたは複数のチャンバに負荷する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。 loading a remaining portion of the sample into the one or more chambers when it is determined that the amount of at least a portion of the sample remaining in the one or more chambers is less than a threshold; 38. The method of claim 37, comprising:

前記１つまたは複数のチャンバ内に残存する前記試料の少なくとも一部分の量が前記閾値未満ではないと判定されたときに、前記試料の残りの部分を前記１つまたは複数のチャンバに負荷することを中止する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。 loading a remaining portion of the sample into the one or more chambers when it is determined that the amount of at least a portion of the sample remaining in the one or more chambers is not less than the threshold; 39. The method of claim 38, further comprising the step of discontinuing.

前記取り出す工程が、前記１つまたは複数のチャンバの表面に結合したそれぞれのコーティング分子とカップリング部分との間の共有結合を破壊することを含み、前記試料の少なくとも一部分の分析物が前記カップリング部分に結合している、請求項３６乃至３９のいずれか１項に記載の方法。 said removing step comprises breaking the covalent bond between a respective coating molecule bound to a surface of said one or more chambers and a coupling moiety, wherein said analyte of at least a portion of said sample is bound to said coupling moiety. 40. A method according to any one of claims 36 to 39, wherein the method is bonded to a portion.

前記破壊する工程が、前記１つまたは複数のチャンバの表面を、溶液と個別の期間接触させることにより実施される、請求項４０に記載の方法。 41. The method of claim 40, wherein said disrupting step is performed by contacting a surface of said one or more chambers with a solution for a discrete period of time.

前記破壊する工程が、摂氏２０度以上かつ摂氏２２度以下の温度で実施される、請求項４１に記載の方法。 42. The method of claim 41, wherein the breaking step is performed at a temperature of 20 degrees Celsius or more and 22 degrees Celsius or less.

前記個別の期間が６０分以下を含む、請求項４１に記載の方法。 42. The method of claim 41, wherein the discrete time periods include 60 minutes or less.

前記溶液が酢酸アンモニウム、水、およびヘキサフルオロ－２－プロパノールを含む、請求項４１に記載の方法。 42. The method of claim 41, wherein the solution comprises ammonium acetate, water, and hexafluoro-2-propanol.

前記取り出す工程が、前記１つまたは複数のチャンバの表面からコーティング分子を取り出す工程を含み、前記試料の少なくとも一部分の分析物が、カップリング部分により前記１つまたは複数のチャンバ内の前記コーティング分子の少なくとも一部に結合している、請求項３５乃至４４のいずれか１項に記載の方法。 The removing step includes removing coating molecules from a surface of the one or more chambers, and the analyte of at least a portion of the sample is coupled to the coating molecules in the one or more chambers by a coupling moiety. 45. A method according to any one of claims 35 to 44, wherein the method is at least partially coupled.

前記１つまたは複数のチャンバの表面を前記コーティング分子で再コーティングする工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。 46. The method of claim 45, further comprising recoating a surface of the one or more chambers with the coating molecule.

前記取り出す工程が、前記１つまたは複数のチャンバ内に存在する前記試料の少なくとも一部分の分析物を酵素消化することを含む、請求項３５乃至４６のいずれか１項に記載の方法。 47. A method according to any one of claims 35 to 46, wherein the step of removing comprises enzymatically digesting the analyte of at least a portion of the sample present in the one or more chambers.

前記試料の少なくとも一部分の分析物がカップリング部分に結合しており、前記取り出す工程が、前記カップリング部分と前記試料の少なくとも一部分の分析物との間の共有結合リンカーを破壊することを含む、請求項３５乃至４７のいずれか１項に記載の方法。 an analyte of at least a portion of the sample is bound to a coupling moiety, and the removing step comprises breaking a covalent linker between the coupling moiety and the analyte of the at least a portion of the sample; 48. A method according to any one of claims 35 to 47.

集積デバイスを用いた試料の処理を継続するかどうかを判定するための方法であって、前記試料が複数のアリコートに分割され、前記方法が、
分析物が前記集積デバイスの１つまたは複数のチャンバ内に存在する間に、前記複数のアリコートの第１のアリコートの前記分析物を試料採取する工程であって、
少なくとも１つの光源から送達された励起光を用いて前記第１のアリコートの前記分析物を励起すること、
前記少なくとも１つの光源から送達された光により励起されたときに、前記集積デバイスの光検出領域において前記第１のアリコートの前記分析物から放出されたシグナルを収集することを含む、前記試料採取する工程と、
前記第１のアリコートの前記分析物から放出された前記シグナルに基づき、前記複数のアリコートの第２のアリコートを前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバに負荷するか判定する工程と、
前記複数のアリコートの第２のアリコートを前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバに負荷する工程と、を含む方法。 A method for determining whether to continue processing a sample with an integration device, wherein the sample is divided into a plurality of aliquots, the method comprising:
sampling a first aliquot of the plurality of aliquots of the analyte while the analyte is present in one or more chambers of the integration device;
exciting the analyte in the first aliquot using excitation light delivered from at least one light source;
said sampling, comprising collecting a signal emitted from said analyte of said first aliquot in a light detection region of said integrated device when excited by light delivered from said at least one light source; process and
determining whether to load a second aliquot of the plurality of aliquots into the one or more chambers of the integration device based on the signal emitted from the analyte of the first aliquot;
loading a second aliquot of the plurality of aliquots into the one or more chambers of the integrated device.

前記複数のアリコートの前記第２のアリコートを前記集積デバイスの前記１つまたは複数のチャンバに負荷する工程が、請求項１乃至４８のいずれか１項に記載の方法に従い実施される、請求項４９に記載の方法。 49. Loading the second aliquot of the plurality of aliquots into the one or more chambers of the integration device is carried out according to the method of any one of claims 1-48. The method described in.

前記判定する工程が、
前記第１のアリコートの分析物から放出された前記シグナルに基づき、前記第１のアリコートの前記分析物の少なくとも１つの特徴を特定すること、
前記少なくとも１つの特徴に基づき、前記第２のアリコートを負荷するかどうかを判定すること、を含む、請求項４９乃至５０のいずれか１項に記載の方法。 The determining step includes:
identifying at least one characteristic of the analyte of the first aliquot based on the signal emitted from the analyte of the first aliquot;
51. The method of any one of claims 49-50, comprising determining whether to load the second aliquot based on the at least one characteristic.

前記第１のアリコートの前記分析物の前記少なくとも１つの特徴が、波長、発光寿命、強度、パルス持続時間、またはパルス間の持続時間のうちの少なくとも１つを含む、請求項５１に記載の方法。 52. The method of claim 51, wherein the at least one characteristic of the analyte of the first aliquot includes at least one of wavelength, emission lifetime, intensity, pulse duration, or duration between pulses. .

前記少なくとも１つの特徴に基づき、前記第１のアリコートの前記分析物の１つまたは複数の同一性を決定する工程と、
前記第１のアリコートの１つまたは複数の分析物の同一性に基づき、前記第２のアリコートを負荷するかどうかを判定する工程と、をさらに含む、請求項５１に記載の方法。 determining the identity of one or more of the analytes of the first aliquot based on the at least one characteristic;
52. The method of claim 51, further comprising determining whether to load the second aliquot based on the identity of one or more analytes of the first aliquot.

試料を処理するための再利用可能なデバイスであって、前記試料が複数のアリコートに分割され、前記デバイスが、
複数のアリコートの第１のアリコートを受け入れるための複数の反応チャンバであって、前記複数の反応チャンバの表面が、前記第１のアリコートの分析物に結合したカップリング部分と結合するように構成されたコーティング分子でコーティングされている、前記複数の反応チャンバと、
前記複数の反応チャンバに送達される励起光に応答して、前記複数の反応チャンバから放出されたシグナルを受け取るように構成された光検出領域と、
前記光検出領域により受け取られた前記シグナルに基づき、前記複数の反応チャンバが前記第１のアリコートの前記分析物の少なくとも一部分を含有するかどうかを判定するように構成された少なくとも１つのプロセッサと、を備えるデバイス。 A reusable device for processing a sample, wherein the sample is divided into a plurality of aliquots, the device comprising:
a plurality of reaction chambers for receiving a first aliquot of the plurality of aliquots, wherein a surface of the plurality of reaction chambers is configured to bind a coupling moiety bound to an analyte of the first aliquot; the plurality of reaction chambers coated with coating molecules;
a light detection region configured to receive signals emitted from the plurality of reaction chambers in response to excitation light delivered to the plurality of reaction chambers;
at least one processor configured to determine whether the plurality of reaction chambers contain at least a portion of the analyte of the first aliquot based on the signal received by the light detection region; A device with.

前記少なくとも１つのプロセッサが、前記光検出領域により受け取られた前記シグナルに基づき、前記複数の反応チャンバに含有される前記第１のアリコートの前記分析物の少なくとも一部分の量を決定するようにさらに構成されている、請求項５４に記載のデバイス。 The at least one processor is further configured to determine an amount of the at least a portion of the analyte of the first aliquot contained in the plurality of reaction chambers based on the signal received by the light detection region. 55. The device of claim 54.

前記少なくとも１つのプロセッサが、前記光検出領域により受け取られた前記シグナルに基づき、前記複数の反応チャンバが前記コーティング分子の少なくとも一部分を含有するかどうかを判定するようにさらに構成されている、請求項５４乃至５５のいずれか１項に記載のデバイス。 13. The at least one processor is further configured to determine whether the plurality of reaction chambers contain at least a portion of the coating molecules based on the signal received by the photodetection region. 56. The device according to any one of 54 to 55.

前記少なくとも１つのプロセッサが、前記光検出領域により受け取られた前記シグナルに基づき、前記複数の反応チャンバに含有される前記コーティング分子の少なくとも一部分の量を決定するようにさらに構成されている、請求項５６に記載のデバイス。 12. The at least one processor is further configured to determine an amount of at least a portion of the coating molecules contained in the plurality of reaction chambers based on the signal received by the photodetection region. 56. The device according to 56.

前記少なくとも１つのプロセッサが、前記光検出領域により受け取られた前記シグナルに基づき、前記複数の反応チャンバが前記カップリング部分の少なくとも一部分を含有するかどうかを判定するようにさらに構成されている、請求項５４乃至５７のいずれか１項に記載のデバイス。 5. The at least one processor is further configured to determine whether the plurality of reaction chambers contain at least a portion of the coupling moiety based on the signal received by the photodetection region. 58. The device according to any one of items 54 to 57.

前記少なくとも１つのプロセッサが、前記光検出領域により受け取られた前記シグナルに基づき、前記複数の反応チャンバに含有される前記カップリング部分の少なくとも一部分の量を決定するようにさらに構成されている、請求項５８に記載のデバイス。 4. The at least one processor is further configured to determine an amount of at least a portion of the coupling moiety contained in the plurality of reaction chambers based on the signal received by the photodetection region. 59. The device according to paragraph 58.

方法であって、
第１の試料を、再利用可能なチップの複数のチャンバに負荷する工程であって、前記再利用可能なチップが、少なくとも１つの光源を備える装置から受け取られた励起光を前記複数のチャンバに対して方向付けるための複数の導波路、および前記第１の試料から放出された光を受け取るための複数の光検出領域を有する、前記負荷する工程と、
前記装置の前記少なくとも１つの光源から、前記再利用可能なチップの前記複数のチャンバに対して励起光を送達する工程と、
前記第１の試料の分析物のシークエンシングを実施する工程と、
前記再利用可能なチップの前記複数のチャンバから前記第１の試料を取り出す工程と、
第２の試料を、前記再利用可能なチップの前記複数のチャンバに負荷する工程と、を含む方法。 A method,
loading a first sample into a plurality of chambers of a reusable chip, the reusable chip applying excitation light received from a device comprising at least one light source to the plurality of chambers; a plurality of waveguides for directing light toward the first sample; and a plurality of light detection regions for receiving light emitted from the first sample;
delivering excitation light from the at least one light source of the device to the plurality of chambers of the reusable chip;
performing analyte sequencing of the first sample;
removing the first sample from the plurality of chambers of the reusable chip;
loading a second sample into the plurality of chambers of the reusable chip.

デバイスであって、
少なくとも１つの光源を備える装置と共に使用するための再利用可能なチップを備え、前記再利用可能なチップは、
第１の試料を受け入れるための複数のチャンバと、
前記少なくとも１つの光源から前記複数のチャンバに対して励起光を方向付けるための複数の導波路と、
前記第１の試料から放出された光を受け取るための複数の光検出領域と、を含み、前記再利用可能なチップが、前記第１の試料を複数のチャンバから取り出すことができ、前記第１の試料が取り出された後に、第２の試料を前記複数のチャンバ内に受け入れることができるように構成されている、デバイス。 A device,
a reusable chip for use with a device comprising at least one light source, the reusable chip comprising:
a plurality of chambers for receiving a first sample;
a plurality of waveguides for directing excitation light from the at least one light source to the plurality of chambers;
a plurality of light detection regions for receiving light emitted from the first sample, the reusable chip being capable of removing the first sample from a plurality of chambers; a second sample can be received within the plurality of chambers after a second sample has been removed.