JP2023552829A - 免疫細胞機能を調節するための変異インターロイキン-10ポリペプチドの抗原結合分子との融合物 - Google Patents
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Abstract
変異インターロイキン-10ポリペプチド、ならびに変異インターロイキン-10ポリペプチド及び抗原結合分子を含む融合ポリペプチドが本明細書で提供される。本開示は、免疫細胞を本開示の融合ポリペプチドと接触させることによって免疫細胞機能を調節する方法を提供する。さらに、本開示はまた、本開示の融合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞も提供する。本開示は、融合分子を生成するための方法、それを含む医薬組成物、及びその使用をさらに提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年12月9日に出願された米国仮特許出願第63/123,387号、及び2021年4月1日に出願された第63/169,604号の優先権の利益を主張するものであり、これらそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年12月9日に出願された米国仮特許出願第63/123,387号、及び2021年4月1日に出願された第63/169,604号の優先権の利益を主張するものであり、これらそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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分野
本開示は、変異インターロイキン-10ポリペプチド、ならびに変異インターロイキン-10ポリペプチド及び抗原結合分子を含む融合ポリペプチドを提供する。本開示は、免疫細胞を本開示の融合ポリペプチドと接触させることによって免疫細胞機能を調節する方法を提供する。さらに、本開示はまた、本開示の融合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞も提供する。本開示は、融合分子を生成するための方法、それを含む医薬組成物、及びその使用をさらに提供する。
本開示は、変異インターロイキン-10ポリペプチド、ならびに変異インターロイキン-10ポリペプチド及び抗原結合分子を含む融合ポリペプチドを提供する。本開示は、免疫細胞を本開示の融合ポリペプチドと接触させることによって免疫細胞機能を調節する方法を提供する。さらに、本開示はまた、本開示の融合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞も提供する。本開示は、融合分子を生成するための方法、それを含む医薬組成物、及びその使用をさらに提供する。
インターロイキン-10(IL-10)は、単球、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、T細胞、NK細胞などを含む多くの免疫細胞サブセットを調節するサイトカインである。IL-10は、ヘテロ二量体受容体(IL-10受容体、IL-10R)と結合し、この受容体は、IL-10に対して特異的で、主に免疫細胞上に発現するIL-10RAと、他のサイトカインと共有され、さらに広く発現するIL-10RBとの2つのサブユニットからなる。IL-10のその受容体との結合は、受容体関連ヤヌスキナーゼJAK1、及びチロシンキナーゼTYK2のリン酸化を誘導し、これがリンパ球において多くの遺伝子の転写を制御するSTAT3転写因子(pSTAT3)のリン酸化を促進する。
IL-10シグナル伝達は、標的細胞に応じて多様な効果を誘導する(Geginat et al,cytokine Growth Factor Rev.2016 Aug;30:87-93で概説される)。マクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞との結合が炎症性サイトカインの産生及びT細胞を刺激する能力を阻害するため、IL-10は免疫抑制性サイトカインであると考えられる。例えば、IL-10/IL-10R経路に遺伝子欠陥を有するマウス及び患者は、自然に大腸炎を発症し、このことは、腸の免疫細胞の恒常性を促進し、自己免疫を妨げるためにIL-10が必要とされることを示唆する。しかしながら、IL-10は、B細胞に対する成長分化因子としての作用により全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の発症にも関わっている。さらに、IL-10は、CD8+ T細胞機能を促進することができ、このIL-10の免疫刺激活性(Chan et al,J Interferon Cytokine Res.2015 Dec;35(12):948-55;Nizzoli et al,Eur J Immunol.2016 Jul;46(7):1622-32)は、マウスにおける強力な抗腫瘍免疫応答を誘発する能力(Mumm et al,Cancer Cell.2011 Dec 13;20(6):781-96;Emmerich et al,Cancer Res.2012 Jul 15;72(14):3570-81)、及びがん患者におけるCD8+ T細胞を活性化する能力(Naing et al,Cancer Cell.2018 Nov 12;34(5):775-791 )に関連している可能性がある。
免疫応答を調節する際の多面的作用から、IL-10サイトカインは、自己免疫及びがんの両方の治療薬として使用されてきた。しかしながら、前臨床モデルにおける強力な免疫抑制効果にもかかわらず、クローン病、乾癬、及び関節リウマチにおけるIL-10投与の臨床的有用性は限定されたものであった(O’Garra A,Immunol Rev.2008;223:114-131)。同様に、IL-10の治療効果は複数の進行固形腫瘍にわたり評価され、臨床活性は示されたが、臨床的有用性はあまり大きくなく、最も有望であったのも少数の適応症であった(Autio et al,Curr Oncol Rep.2019 Feb 21;21(2):19)。
IL-10のこの一見矛盾したように見える効果は、所与の状況で免疫応答を抑制も活性化もすることができる免疫細胞上のその受容体の存在によって説明可能である。例えば、がんの状況において、マクロファージ、樹状細胞、及び制御性T細胞(Treg)のIL-10による刺激は免疫抑制をもたらし、IL-10によるCD8+ T細胞の刺激は免疫活性化をもたらすであろう。これは、IL-10活性を特定の免疫細胞サブセットに制限することが、がんの治療効果を高めるのに有益であろうことを示唆する。さらに、IL-10療法は、特定の患者に輸血が必要とされ得る重症貧血及び高フェリチン血症と関連づけられた(Tilg et al,J Immunol.2002 Aug 15;169(4):2204-9)。IL-10は、活性化単核球細胞においてフェリチン翻訳を直接刺激することが示され(Tilg et al,J Immunol.2002 Aug 15;169(4):2204-9)、これは赤血球形成に必要とされる鉄の隔離につながる可能性がある。単球におけるフェリチンの誘導に加えて、IL-10は、赤血球形成を直接抑制する可能性もあるであろう(Oehler et al,Exp Hematol.1999 Feb;27(2):217-23;Mullarky et al,Infect Immun.2007 May;75(5):2630-3)。
CD8+ T細胞は、多くの前臨床がんモデルにおいてIL-10を含む免疫治療剤の効果を媒介することが示されてきており(Mumm et al,Cancer Cell.2011 Dec 13;20(6):781-96;Emmerich et al,Cancer Res.2012 Jul 15;72(14):3570-81)、それらは患者における免疫療法に対する応答とも相関している(Sade-Feldman et al,Cell.2018 Nov 1;175(4):998-1013)。CD8+ T細胞は、CD8アルファ(CD8a)ホモ二量体及びCD8アルファ・CD8ベータ(CD8b)ヘテロ二量体として細胞表面上に見られるI型膜貫通糖タンパク質であるCD8を発現する。アルファベータCD8+ T細胞は、CD8aa及びCD8ab二量体の両方を発現することができ、同時に、低いレベルではあるが、NK、NK T、及び上皮内Tγδ細胞などの一部の自然リンパ球上にもCD8aaホモ二量体が発現する場合がある(Baume et al,Cell Immunol.1990 Dec;131(2):352-65;Kadivar et al,J Immunol 2016;197:4584-4592;Mayassi & Jabri,Mucosal Immunology 11,1281-1289,2018)。CD8二量体は、標的細胞上の主要組織適合性(MHC)クラスI分子と相互作用し、この相互作用がCD8+ T細胞活性化の間、TCRをMHCとしっかり結合し続ける。CD8aの細胞質側末端は、T細胞活性化中にTCRの下流でシグナル伝達を開始するT細胞キナーゼ(Lck)に対する結合部位を含む一方、CD8bは、MHCクラスIと結合するCD8のアビディティーを高め、CD8/MHC/TCR相互作用の特異性に影響を与えると考えられる(Bosselut et al,Immunity.2000 Apr;12(4):409-18)。
前臨床がんモデル及びがん患者において効果と関連づけられたCD8+ T細胞を含む、T細胞における活性を増大させ、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びTregを含む、IL-10の毒性及び望ましくない影響と関連づけられた他の細胞における活性を低減することによってIL-10の毒性を低下させ、効果を向上させる必要がある。
特許出願、特許公報、及びUniProtKB/Swiss-Prot受託番号を含む、本明細書において引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献が、参照によって組み込まれることを具体的かつ個々に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特許出願、特許公報、及びUniProtKB/Swiss-Prot受託番号を含む、本明細書において引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献が、参照によって組み込まれることを具体的かつ個々に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Geginat et al,cytokine Growth Factor Rev.2016 Aug;30:87-93
Chan et al,J Interferon Cytokine Res.2015 Dec;35(12):948-55
Nizzoli et al,Eur J Immunol.2016 Jul;46(7):1622-32
Mumm et al,Cancer Cell.2011 Dec 13;20(6):781-96
Emmerich et al,Cancer Res.2012 Jul 15;72(14):3570-81
Naing et al,Cancer Cell.2018 Nov 12;34(5):775-791
Autio et al,Curr Oncol Rep.2019 Feb 21;21(2):19
Tilg et al,J Immunol.2002 Aug 15;169(4):2204-9
Oehler et al,Exp Hematol.1999 Feb;27(2):217-23
Mullarky et al,Infect Immun.2007 May;75(5):2630-3
Sade-Feldman et al,Cell.2018 Nov 1;175(4):998-1013
Baume et al,Cell Immunol.1990 Dec;131(2):352-65
Kadivar et al,J Immunol 2016;197:4584-4592
Mayassi & Jabri,Mucosal Immunology 11,1281-1289,2018
Bosselut et al,Immunity.2000 Apr;12(4):409-18
IL-10RBに対する結合親和性を増大させ、IL-10RAに対する結合親和性を低下させ、及び/またはヘパリンとの結合を低減する置換を含む変異IL-10ポリペプチドが本明細書において提供される。そのような変異IL-10ポリペプチドを含む融合タンパク質が本明細書においてさらに提供される。本開示は、変異IL-10ポリペプチドを目的の細胞種に特異的に導く能力など、特定の融合タンパク質に関連する著しい利点を実証する。例えば、特定の融合タンパク質は、単球よりもCD8+ T細胞を優先的に活性化することが本明細書において示される。
いくつかの態様において、変異IL-10ポリペプチドが本明細書で提供され、変異IL-10ポリペプチドは、図1Aに示される野生型成熟IL-10のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、変異IL-10ポリペプチドは、図1Bに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RAポリペプチドに対して低下した結合親和性を示す。IL-10RAに対する親和性の低下は、野生型IL-10ポリペプチドの配列にアミノ酸置換を導入して、図2及び図3に示されるとおりの本開示の変異IL-10ポリペプチドを生成することによって得られる。本開示の変異IL-10ポリペプチドは、図1Aに示される野生型IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、本開示の変異IL-10ポリペプチドは、図1Bに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RAポリペプチドに対して50%以上低下した、150%以上低下した、2分の1以下に低下した、または10分の1以下に低下した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34R、K34Q、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38H、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38N、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、D44A、D44E、D44S、D44V、D44G、D44H、D44I、D44K、D44P、D44L、D44N、D44F、D44T、D44R、D44Q、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148G、N148P、N148S、N148D、N148T、N148K、N148V、N148I、N148E、N148F、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148P、N148D、N148I、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号87~89、188~201、及び310~318からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、表4A、表8、表11、または表13に示されるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、本開示の変異IL-10ポリペプチドはまた、i)図1Cに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RBポリペプチドに対して増加した結合親和性を示し、ii)図1Aに示される野生型成熟IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有してもよい。さらに別の実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、図1Cに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RBポリペプチドに対して150%以上増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18、D28、N92、K99、及びL103からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18F、N18L、N18Y、D28Q、D28R、N92F、N92H、N92I、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、N92Y、K99N、L103N、及びL103Qからなる群から選択される。
いくつかの態様において、IL-10RBポリペプチドに対して増加した結合親和性を示し、例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含むか、または図1Cに示されるアミノ酸配列を有する変異IL-10ポリペプチドが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1に従う野生型成熟IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列に対して1つ以上のアミノ酸置換を含み、1つ以上のアミノ酸置換は、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18、D28、N92、K99、及びL103からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18F、N18L、N18Y、D28Q、D28R、N92F、N92H、N92I、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、N92Y、K99N、L103N、及びL103Qからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、IL-10RBポリペプチドに対して50%以上、100%以上、または150%以上増加した結合親和性を示し、例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含むか、または図1Cに示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、図1Aに示される野生型成熟IL-10のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、変異IL-10ポリペプチドは、IL-10RAポリペプチドに対して低下した結合親和性を示し、例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、または図1Bに示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1に従う野生型IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列に対して1つ以上のアミノ酸置換をさらに含み、1つ以上のアミノ酸置換は、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34R、K34Q、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38H、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38N、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、D44A、D44E、D44S、D44V、D44G、D44H、D44I、D44K、D44P、D44L、D44N、D44F、D44T、D44R、D44Q、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148G、N148P、N148S、N148D、N148T、N148K、N148V、N148I、N148E、N148F、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148P、N148D、N148I、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、または図1Bに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RAポリペプチドに対して50%以上低下した、100%以上低下した、150%以上低下した、2分の1以下に低下した、または10分の1以下に低下した結合親和性を示す。
いくつかの態様において、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%アミノ酸、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のアミノ酸置換を有する、変異IL-10ポリペプチドが本明細書において提供され、1つ以上のアミノ酸置換は、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18、D28、N92、K99、及びL103からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18F、N18L、N18Y、D28Q、D28R、N92F、N92H、N92I、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、N92Y、K99N、L103N、及びL103Qからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-10RBポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含む、IL-10RBポリペプチドに対して増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-10RBポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含む、IL-10RBポリペプチドに対して50%以上、100%以上、または150%以上増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含み、1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含み、1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、R24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34R、K34Q、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38H、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38N、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、D44A、D44E、D44S、D44V、D44G、D44H、D44I、D44K、D44P、D44L、D44N、D44F、D44T、D44R、D44Q、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148G、N148P、N148S、N148D、N148T、N148K、N148V、N148I、N148E、N148F、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148P、N148D、N148I、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含むIL-10RAポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含む、IL-10RAポリペプチドに対して低下した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含むIL-10RAポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含む、IL-10RAポリペプチドに対して50%以上低下した、100%以上低下した、150%以上低下した、2分の1以下に低下した、または10分の1以下に低下した結合親和性を示す。本明細書に記載される実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態において、(例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含む、例えば、IL-10RBポリペプチドに対する増加した結合親和性をもたらす)1つ以上のアミノ酸置換を含む変異IL-10ポリペプチドは、1、2、3、4、または5つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態において、(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含む、例えば、IL-10RAポリペプチドに対する低下した結合親和性をもたらす)1つ以上のアミノ酸置換を含む変異IL-10ポリペプチドは、1、2、3、4、または5つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、IL-10RBポリペプチドに対する増加した結合親和性と関連する1つ以上のアミノ酸置換(例えば、1または2つのアミノ酸置換)及びIL-10RAポリペプチドに対する低下した結合親和性と関連する1つ以上のアミノ酸置換(例えば、1または2つのアミノ酸置換)を含む。
いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置R24にアミノ酸置換、例えば、R24Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置R27にアミノ酸置換、例えば、R27Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置K34にアミノ酸置換、例えば、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34R、K34Q、K34V、またはK34Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置Q38にアミノ酸置換、例えば、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38H、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38N、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、またはQ38Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置D44にアミノ酸置換、例えば、D44A、D44E、D44S、D44V、D44G、D44H、D44I、D44K、D44P、D44L、D44N、D44F、D44T、D44R、またはD44Qを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置I87にアミノ酸置換、例えば、I87Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置K138にアミノ酸置換、例えば、K138Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置E142にアミノ酸置換、例えば、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、またはE142Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置D144にアミノ酸置換、例えば、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、またはD144Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置N148にアミノ酸置換、例えば、N148G、N148P、N148S、N148D、N148T、N148K、N148V、N148I、N148E、またはN148Fを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置E151にアミノ酸置換、例えば、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、またはE151Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置N18にアミノ酸置換、例えば、N18F、N18L、またはN18Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置D28にアミノ酸置換、例えば、D28QまたはD28Rを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置N92にアミノ酸置換、例えば、N92F、N92H、N92I、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、またはN92Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置K99にアミノ酸置換、例えば、K99Nを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する位置L103にアミノ酸置換、例えば、L103NまたはL103Qを含む。
いくつかの態様において、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%アミノ酸、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のアミノ酸置換を有する、変異IL-10ポリペプチドが本明細書において提供され、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、R24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34R、K34Q、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38H、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38N、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、D44A、D44E、D44S、D44V、D44G、D44H、D44I、D44K、D44P、D44L、D44N、D44F、D44T、D44R、D44Q、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148G、N148P、N148S、N148D、N148T、N148K、N148V、N148I、N148E、N148F、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148P、N148D、N148I、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、E151A及びK138A、E151A及びD144A、E151A及びR27A、Q38A及びR27A、R24A及びQ38A、R24A及びE151A、Q38A及びE142A、E138A及びE142A、R27A及びK138A、R24A及びK138A、ならびにR24A及びR27Aからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含むIL-10RAポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含む、IL-10RAポリペプチドに対して低下した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含むIL-10RAポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含む、IL-10RAポリペプチドに対して変異IL-10ポリペプチドは、50%以上低下した、100%以上低下した、150%以上低下した、2分の1以下に低下した、または10分の1以下に低下した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含み、1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18、D28、N92、K99、及びL103からなる群から選択される位置(複数可)にある。いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18F、N18L、N18Y、D28Q、D28R、N92F、N92H、N92I、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、N92Y、K99N、L103N、及びL103Qからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-10RBポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号3のアミノ酸配列 を含む、IL-10RBポリペプチドに対して増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-10RBポリペプチドに対する配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して)例えば、配列番号3のアミノ酸配列を含む、IL-10RBポリペプチドに対して50%以上、100%以上、または150%以上増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号87~89、188~201、及び310~318からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して位置R107にアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1に従うナンバリングで、R107A変異をさらに含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号422~428からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表11に示される変異単量体IL-10ポリペプチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号87~89、188~201、310~318、及び422~428からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、二量体、例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、例えば、N116とK117の間に単量体としてのフォールディング及び発現を可能にするアミノ酸またはペプチド挿入を含む、単量体である(例えば、図1Dに示されるとおり)。いくつかの実施形態において、挿入は、1~15アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、挿入は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸長である。特定の実施形態において、挿入は、6アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、残基C114、E115、N116、K117、S118、K119、またはA120の直後に1つのアミノ酸、または1から15個の間のアミノ酸のペプチド挿入を有する配列番号1のアミノ酸配列を含む。挿入の例としては、G、GG、GGG、GGGG(配列番号80)、GGGSG(配列番号81)、GGGGG(配列番号82)、GGGGGG(配列番号83)、及びGGGSGG(配列番号84)を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号187のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の変異単量体IL-10ポリペプチドは、図1Bに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RAポリペプチドに対して低下した結合親和性を有し、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158の群から選択される(またはR24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151の群から選択される)アミノ酸置換を有し、アミノ酸のナンバリングは6リンカー挿入を含まない野生型IL-10ポリペプチドの対応するアミノ酸を指す。いくつかの実施形態において、本開示の変異単量体IL-10ポリペプチドはまた、図1Cに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RBポリペプチドに対して増加した結合親和性を有し、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111の群から選択される(またはN18、D28、N92、K99、及びL103からなる群から選択される)アミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで位置N92にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N92I、N92A、N92V、N92L、N92M、N92Y、N92F、N92S、N92T、N92H、またはN92Qを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N92F、N92H、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、またはN92Yを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、アミノ酸置換N18I、K99N及びF111Lのうちの1つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、アミノ酸置換N18I、K99N及びF111Lをさらに含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N及びF111Lを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号188の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N及びF111Lを含み、配列番号1に基づくナンバリングで、位置(複数可)R24、R27、Q38、I87、K138、E142、D144、及び/またはE151に1つ以上のさらなるアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号87~89、188~201、310~318、及び422~428からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本明細書で開示される変異IL-10ポリペプチドは、IL-10R複合体に対する低下した結合親和性のため、前臨床がんモデルにおいてIL-10の有益な効果に関係することが示されたCD8+ T細胞を含む、IL-10R発現細胞を刺激する能力が低下していた(Mumm et al,Cancer Cell.2011 Dec 13;20(6):781-96;Emmerich et al,Cancer Res.2012 Jul 15;72(14):3570-81)。変異IL-10ポリペプチドをがん及び特定の感染症などの他の免疫関連疾患の処置に対してより安全で、より有効であり得る治療薬にするために、開示の変異IL-10ポリペプチド及びCD8などのCD8+ T細胞上に存在する抗原に対する抗原結合分子、例えば、抗体を含む融合タンパク質が生成された。変異IL-10ポリペプチド及び特定の抗原と結合する抗体から構成されるそのような融合タンパク質は、融合物の抗原結合分子によって認識された抗原と結合するため「標的化」融合タンパク質とも呼ばれる。これは、それらを変異IL-10ポリペプチド及び任意の特定の抗原と結合しない対照抗体(すなわち、IL-10ポリペプチドとのFc 融合物または対照抗体融合物;Poutahidis et al,Carcinogenesis.2007 Dec;28(12):2614-23)を含む「非標的化」融合タンパク質と区別する。
理論に縛られることを望まないが、図4Aは、CD8+ T細胞上の抗原と結合する抗原結合分子が、変異IL-10ポリペプチドを含む開示の標的化融合タンパク質との関連で、変異IL-10ポリペプチドによるCD8+ T細胞との結合及び/またはその刺激を増加させるためにどのように働くであろうかに関する概括的なメカニズムを示す。特定の抗原結合分子は、変異IL-10ポリペプチドに融合されると、融合物の抗原結合分子に対する抗原を発現する細胞上でのみ変異IL-10ポリペプチドの結合及び/または活性を実質的に増加させる能力を有し、結果として抗原非発現細胞よりも抗原発現細胞を優先的に活性化させる(図4A)。標的化融合タンパク質とは異なり、同じ変異IL-10ポリペプチドを含む非標的化融合タンパク質は、抗原発現細胞と優先的に結合せず、及び/またはそれを活性化しない(図4A)。図4Bは、変異単量体IL-10ポリペプチドに関する概括的なメカニズムを示す。
理論に縛られることを望まないが、標的化融合タンパク質による抗原非発現細胞に対する抗原発現細胞の活性化の違い、及び標的化融合タンパク質と非標的化融合タンパク質による抗原発現細胞の活性化の違いが治療薬としての標的化融合タンパク質の有効性に対して重要だと考えられる。毒性または効力に対する望ましくない影響と関連づけられる他の細胞よりもCD8+ T細胞などの効果と関連づけられる細胞に対して選択的な融合タンパク質は、より大きな治療係数を有する可能性がある。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、単球の活性化と比較して、CD8+ T細胞を10倍以上の効力、または50倍以上の効力で活性化する。いくつかの実施形態において、前記変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1の配列を含み、配列番号1に対して1つ以上のアミノ酸置換を有し、置換は、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158からなる群から選択される(またはR24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151からなる群から選択される)配列番号1の位置にある。他の実施形態において、前記変異IL-10ポリペプチドはまた、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111からなる群から選択される(またはN18、D28、N92、K99、及びL103からなる群から選択される)配列番号1の1つ以上の位置に1つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるIL-10融合タンパク質は、単球などの抗原非発現IL-10R+細胞よりもCD8+ T細胞などの抗原発現IL-10R+細胞を少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または少なくとも200倍活性化する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、例えば、IL-10変異ポリペプチド及び前記細胞上に発現する任意の抗原と結合しない対照抗体を含む融合分子と比較して、抗原発現IL-10R+細胞を少なくとも50倍、少なくとも100倍、または少なくとも200倍活性化する。いくつかの実施形態において、IL-10融合タンパク質による前記細胞活性化は、前記IL-10融合タンパク質による処置後の前記細胞におけるpSTAT3の発現を測定することによって判断される。
いくつかの態様において、本明細書で開示される融合タンパク質は、目的の特定の免疫細胞サブセット、例えば、CD8+ T細胞に対するIL-10の効果を低減することによって、IL-10R複合体を発現する免疫細胞に対するIL-10の多面的作用を一部の効果に低減する場合もある。そのような低減は、治療薬として投与された場合、腫瘍抗原特異的なCD8+ T細胞またはウイルス抗原特異的なCD8+ T細胞を含むT細胞のサブセットに作用を誘導し、それにより、1)効力に寄与しない可能性のあるT細胞、または2)IL-10Rを発現し、シンクとして毒性または作用に寄与する可能性のある全身に分布する骨髄細胞、3)効力に対して負に寄与する可能性のある樹状細胞及びTregなどの他の免疫細胞を免れさせることによってIL-10ポリペプチドの効力を増加させ、毒性を低下させることができる。
本明細書に記載される実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態において、T細胞(例えば、CD8+ T細胞)は、ヒトT細胞である。いくつかの実施形態において、単球/他の免疫細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド及びT細胞上の抗原と結合する抗原結合分子、例えば、CD8(例えば、CD8ab、CD8a、もしくはCD8aa;またはCD8b及び/またはCD8ab)、CD4、またはPD-1を含む。いくつかの実施形態において、本開示のCD8ポリペプチド、抗原、または二量体(例えば、CD8a、CD8b、CD8aa、及び/またはCD8ab)は、ヒト CD8ポリペプチド、抗原、または二量体である。いくつかの実施形態において、本開示のCD4ポリペプチド、抗原、または二量体は、ヒトCD4ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、本開示のPD-1ポリペプチド、抗原、または二量体は、ヒトPD-1ポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、重鎖可変(VH)ドメイン及び軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合分子を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号177のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、X1がS、K、G、N、R、D、T、またはGであり、X2がY、L、H、またはFである、X1X2AISのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号259)と、X1がGまたはHであり、X2がIまたはFであり、X3がI、N、またはMであり、X4がG、N、H、S、R、I、またはAであり、X5がA、N、H、S、T、F、またはYであり、X6がA、D、またはGであり、X7がT、E、K、V、Q、またはAであり、X8がAまたはTであり、X9がNまたはKであり、X10がAまたはNであり、X11がQまたはTである、X1X2X3PX4X5X6X7X8X9YX10QKFX11Gのアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号260)と、X1がDまたはAであり、X2がA、G、E、R、Y、K、N、Q、L、またはFであり、X3がA、L、P、またはYであり、X4がIまたはLであり、X5がR、A、Q、またはSであり、X6がAまたはDであり、X7がD、E、A、またはSである、X1X2X3GX4X5LFX6X7のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号261)とを含み、VLドメインは、X1がRまたはGであり、X2がAまたはTであり、X3がQまたはEであり、X4がE、N、T、S、A、K、D、G、R、またはQであり、X5がY、またはSであり、X6がAまたはVである、X1X2SX3X4IX5GX6LNのアミノ酸配列を含むCDR-L1(配列番号262)と、X1がAまたはSであり、X2がT、S、E、Q、またはDであり、X3がN、R、A、E、またはHであり、X4がQまたはAであり、X5がSまたはDである、GX1X2X3LX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-L2(配列番号263)と、X1がS、N、D、Q、A、またはEであり、X2がT、I、またはSであり、X3がY、L、またはFであり、X4がD、G、T、E、Q、A、またはYであり、X5がA、T、R、S、K、またはYである、QX1X2X3X4X5PWTのアミノ酸配列を含むCDR-L3(配列番号264)とを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号226のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号227のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号232のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号232のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、X1がS、D、E、A、またはQであり、X2がA、G、またはTである、X1YX2MSのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号268)と、X1がT、N、S、Q、E、H、R、またはAであり、X2がY、W、F、またはHであり、X3がA、S、Q、E、またはTであり、X4がGまたはEであり、X5がSまたはIであり、X6がAまたはGである、DIX1X2X3GX4X5TX6YADSVKGのアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号269)と、X1がSまたはAであり、X2がN、H、A、D、L、Q、Y、またはRであり、X3がA、N、S、またはGであり、X4がA、V、R、E、またはSであり、X5がDまたはSであり、X6がD、N、Q、E、S、T、またはLであり、X7がL、F、またはMであり、X8がI、Y、またはVである、X1X2X3YX4WX5X6AX7DX8のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号270)とを含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、QQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号230のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号237のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号34のアミノ酸配列を含む
CDR-L1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、X1がG、Y、S、またはAであり、X2がT、S、G、R、N、またはHであり、X3がS、T、R、H、Y、G、またはPであり、X4がS、K、G、N、R、D、T、またはGであり、X5がY、L、H、またはFである、GX1X2FX3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号265)と、X1がI、N、またはMであり、X2がG、N、H、S、R、I、またはAであり、X3がA、N、H、S、T、F、またはYであり、X4がA、D、またはGであり、X5がT、E、K、V、Q、またはAである、X1PX2X3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号266)と、X1がDまたはAであり、X2がA、G、E、R、Y、K、N、Q、L、またはFであり、X3がA、L、P、またはYであり、X4がIまたはLであり、X5がR、A、Q、またはSであり、X6がAまたはDであり、X7がD、E、A、またはSである、X1X2X3GX4X5LFX6X7のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号267)とを含み、VLドメインは、X1がRまたはGであり、X2がAまたはTであり、X3がQまたはEであり、X4がE、N、T、S、A、K、D、G、R、またはQであり、X5がYまたはSであり、X6がAまたはVである、X1X2SX3X4IX5GX6LNのアミノ酸配列を含むCDR-L1(配列番号262)と、X1がAまたはSであり、X2がT、S、E、Q、またはDであり、X3がN、R、A、E、またはHであり、X4がQまたはAであり、X5がSまたはDである、GX1X2X3LX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-L2(配列番号263)と、X1がS、N、D、Q、A、またはEであり、X2がT、I、またはSであり、X3がY、L、またはFであり、X4がD、G、T、E、Q、A、またはYであり、X5がA、T、R、S、K、またはYである、QX1X2X3X4X5PWTを含むアミノ酸配列を含むCDR-L3(配列番号264)とを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号239のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、X1がS、D、E、Q、S、またはAであり、X2がS、D、E、A、またはQである、GFTFX1X2Yのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号271)と、X1がT、N、S、Q、E、H、RまたはAであり、X2がY、W、F、またはHであり、X3がA、S、Q、E、またはTであり、X4がGまたはEであり、X5がSまたはIである、X1X2X3GX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号272)と、X1がSまたはAであり、X2がN、H、A、D、L、Q、Y、またはRであり、X3がA、N、S、またはGであり、X4がA、V、R、E、またはSであり、X5がDまたはSであり、X6がD、N、Q、E、S、T、またはLであり、X7がL、F、またはMであり、X8がI、Y、またはVである、X1X2X3YX4WX5X6AX7DX8のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号273)とを含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、QQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号241のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号244のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号62の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号63の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号62の配列を含み、VLドメインは、配列番号63の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号64の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号65の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号64の配列を含み、VLドメインは、配列番号65の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号66の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号67の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号66の配列を含み、VLドメインは、配列番号67の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号68の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号69の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号68の配列を含み、VLドメインは、配列番号69の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号70の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号71の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号70の配列を含み、VLドメインは、配列番号71の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号72の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号73の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号72の配列を含み、VLドメインは、配列番号73の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号245の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号246の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号245の配列を含み、VLドメインは、配列番号246の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号251の
配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号252の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号251の配列を含み、VLドメインは、配列番号252の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号253の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号254の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号253の配列を含み、VLドメインは、配列番号254の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号247の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号248の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号247の配列を含み、VLドメインは、配列番号248の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号249の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号250の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号249の配列を含み、VLドメインは、配列番号250の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号255の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号256の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号255の配列を含み、VLドメインは、配列番号256の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号257の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号258の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号257の配列を含み、VLドメインは、配列番号258の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号58の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号59の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号58の配列を含み、VLドメインは、配列番号59の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号185の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号186の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号185の配列を含み、VLドメインは、配列番号186の配列を含む。
CDR-L1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、X1がG、Y、S、またはAであり、X2がT、S、G、R、N、またはHであり、X3がS、T、R、H、Y、G、またはPであり、X4がS、K、G、N、R、D、T、またはGであり、X5がY、L、H、またはFである、GX1X2FX3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号265)と、X1がI、N、またはMであり、X2がG、N、H、S、R、I、またはAであり、X3がA、N、H、S、T、F、またはYであり、X4がA、D、またはGであり、X5がT、E、K、V、Q、またはAである、X1PX2X3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号266)と、X1がDまたはAであり、X2がA、G、E、R、Y、K、N、Q、L、またはFであり、X3がA、L、P、またはYであり、X4がIまたはLであり、X5がR、A、Q、またはSであり、X6がAまたはDであり、X7がD、E、A、またはSである、X1X2X3GX4X5LFX6X7のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号267)とを含み、VLドメインは、X1がRまたはGであり、X2がAまたはTであり、X3がQまたはEであり、X4がE、N、T、S、A、K、D、G、R、またはQであり、X5がYまたはSであり、X6がAまたはVである、X1X2SX3X4IX5GX6LNのアミノ酸配列を含むCDR-L1(配列番号262)と、X1がAまたはSであり、X2がT、S、E、Q、またはDであり、X3がN、R、A、E、またはHであり、X4がQまたはAであり、X5がSまたはDである、GX1X2X3LX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-L2(配列番号263)と、X1がS、N、D、Q、A、またはEであり、X2がT、I、またはSであり、X3がY、L、またはFであり、X4がD、G、T、E、Q、A、またはYであり、X5がA、T、R、S、K、またはYである、QX1X2X3X4X5PWTを含むアミノ酸配列を含むCDR-L3(配列番号264)とを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号239のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、X1がS、D、E、Q、S、またはAであり、X2がS、D、E、A、またはQである、GFTFX1X2Yのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号271)と、X1がT、N、S、Q、E、H、RまたはAであり、X2がY、W、F、またはHであり、X3がA、S、Q、E、またはTであり、X4がGまたはEであり、X5がSまたはIである、X1X2X3GX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号272)と、X1がSまたはAであり、X2がN、H、A、D、L、Q、Y、またはRであり、X3がA、N、S、またはGであり、X4がA、V、R、E、またはSであり、X5がDまたはSであり、X6がD、N、Q、E、S、T、またはLであり、X7がL、F、またはMであり、X8がI、Y、またはVである、X1X2X3YX4WX5X6AX7DX8のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号273)とを含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、QQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号241のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号244のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号62の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号63の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号62の配列を含み、VLドメインは、配列番号63の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号64の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号65の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号64の配列を含み、VLドメインは、配列番号65の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号66の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号67の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号66の配列を含み、VLドメインは、配列番号67の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号68の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号69の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号68の配列を含み、VLドメインは、配列番号69の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号70の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号71の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号70の配列を含み、VLドメインは、配列番号71の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号72の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号73の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号72の配列を含み、VLドメインは、配列番号73の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号245の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号246の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号245の配列を含み、VLドメインは、配列番号246の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号251の
配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号252の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号251の配列を含み、VLドメインは、配列番号252の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号253の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号254の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号253の配列を含み、VLドメインは、配列番号254の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号247の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号248の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号247の配列を含み、VLドメインは、配列番号248の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号249の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号250の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号249の配列を含み、VLドメインは、配列番号250の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号255の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号256の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号255の配列を含み、VLドメインは、配列番号256の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号257の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号258の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号257の配列を含み、VLドメインは、配列番号258の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号58の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号59の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号58の配列を含み、VLドメインは、配列番号59の配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号185の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号186の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号185の配列を含み、VLドメインは、配列番号186の配列を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、4つのポリペプチド鎖を含み、(1)第1のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号115のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含む;(2)第1のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号116のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含む;(3)第1のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号119のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含む;(4)第1のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号120のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含む;(5)第1のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号122のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号123のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含む;(6)第1のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号122のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号124のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含む;(7)第1のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号126のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号127のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含む;(8)第1のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号126のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号128のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含む;(9)第1のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号130のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号131のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含む;(10)第1のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号130のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号132のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含む;(11)第1のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号134のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号135のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含む;(12)第1のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号134のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号136のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含む;(13)第1のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号138のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号139のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含む;(14)第1のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号138のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号140のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含む;(15)第1のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号143のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含む;(16)第1のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号144のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含む;(17)第1のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号146のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号147のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含む;(18)第1のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号146のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号148のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含む;(19)第1のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号150のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号151のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含む;(20)第1のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号150のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号152のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含む;(21)第1のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号154のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号155のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含む;(22)第1のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号154のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号156のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含む;(23)第1のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号158のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号159のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含む;または(24)第1のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号158のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号160のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、2つの変異IL-10ポリペプチドの二量体を含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方は、抗原結合分子に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、それぞれが抗原結合部位を含む、2つのポリペプチドを含み、変異IL-10ポリペプチドのうちの一方は、ポリペプチドのそれぞれに融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、変異IL-10単量体ポリペプチドは、抗原結合分子に融合される。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、直接またはリンカーを介して抗原結合分子に融合される。
いくつかの実施形態において、抗原結合分子は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインの第1のC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインの第2のC末端に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つの変異IL-10ポリペプチドを含み、変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインの第1のC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインの第2のC末端に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つの変異IL-10ポリペプチドを含み、変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される。
いくつかの実施形態において、抗原結合分子は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]、
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]、
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端または第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端のうちの一方に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つの変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端または第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端のうちの一方に融合される。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]、
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]、
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端または第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端のうちの一方に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つの変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端または第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端のうちの一方に融合される。
いくつかの実施形態において、抗体重鎖ポリペプチドの一方または両方は、EUインデックスによるナンバリングで、以下のアミノ酸置換:L234A、L235A、及びG237Aを含む。いくつかの実施形態において、EUインデックスによるナンバリングで、2つのFcドメインの第1は、アミノ酸置換Y349C及びT366Wを含み、2つのFcドメインの第2は、アミノ酸置換S354C、T366S、L368A及びY407Vを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列(GGGS)xGn(配列番号74)、(GGGGS)xGn(配列番号75)、(GGGGGS)xGn(配列番号76)、S(GGGS)xGn(配列番号386)、S(GGGGS)xGn(配列番号387)、またはS(GGGGGS)xGn(配列番号388)を含み、x=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12であり、n=0、1、2または3である。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号79)、SGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号77)、またはSGGGGSGGGGSGGGG(配列番号78)を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖ポリペプチドは、ヒトIgG1 Fc領域を含む。
上記の実施形態のいずれか1つの変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする1つ以上の単離ポリヌクレオチドが本明細書でさらに提供される。上記の実施形態のいずれか1つの1つ以上のポリヌクレオチドを含む1つ以上のベクターが本明細書でさらに提供される。上記の実施形態のいずれか1つの1つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞(例えば、単離及び/または組み換え宿主細胞)が本明細書でさらに提供される。変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質を生成する方法であって、上記の実施形態のいずれか1つの宿主細胞をポリペプチドまたは融合タンパク質の生成に適した条件下で培養することを含む、方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ポリペプチドまたは融合タンパク質を宿主細胞から回収することをさらに含む。
上記の実施形態のいずれか1つの変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書でさらに提供される。
がんを処置する方法であって、がんを有する個体に有効量の上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物を投与することを含む、方法が本明細書でさらに提供される。医薬として使用するための上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物が本明細書でさらに提供される。がんの処置を必要とする個体においてがんを処置する方法に使用するための上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物が本明細書でさらに提供される。がんの処置を必要とする個体においてがんを処置するための医薬を製造する際に使用するための、上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、方法は、個体にT細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、IL-2 ポリペプチド、または免疫チェックポイント阻害剤(ICI)を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、ICIは、PD-1、PD-L1、またはCTLA-4の阻害剤である。いくつかの実施形態において、T細胞療法は、キメラ抗原受容体(CAR)ベースのT細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)ベースの療法、または形質導入TCRを有するT細胞を用いた療法を含む。
感染症(例えば、慢性及び/またはウイルス感染症)を処置する方法であって、それを必要とする個体に有効量の上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物を投与することを含む、方法が本明細書でさらに提供される。医薬として使用するための上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物が本明細書でさらに提供される。感染症の処置を必要とする個体において感染症(例えば、慢性及び/またはウイルス感染症)を処置する方法に使用するための上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物が本明細書でさらに提供される。感染症の処置を必要とする個体において感染症を処置するための医薬を製造する際に使用するための上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物が本明細書でさらに提供される。
T細胞を(例えば、エクスビボで)増殖させる方法であって、1つ以上のT細胞を(例えば、エクスビボで)有効量の上記の実施形態のいずれか1つによる変異IL-10ポリペプチド、融合タンパク質、またはその組成物と接触させることを含む、方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、1つ以上のT細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である。
本明細書に記載の種々の実施形態の特性のうちの1つ、一部、または全てを組み合わせて、本開示の他の実施形態が形成され得るということが理解されるものとする。本開示のこれらの及び他の態様は、当業者に明らかになるであろう。本開示のこれらの及び他の実施形態は、後続の発明を実施するための形態によってさらに説明される。
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、2つ以上のそのような分子の組み合わせなどを任意に含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、2つ以上のそのような分子の組み合わせなどを任意に含む。
本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における、「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む(及び記載している)。
「免疫細胞」は、本明細書において使用される場合、微生物、または宿主の免疫系に対して異物と考えられる他の要素と反応する免疫系の細胞である。これらは、外来性の病原体、微生物及び疾患から宿主を保護する。白血球とも呼ばれる免疫細胞は、病原体と戦う自然免疫応答及び適応免疫応答の両方に関与する。自然免疫応答は、さらなるプライミングまたは学習プロセスを伴わず、病原体に曝露されるとすぐに生じる。適応免疫プロセスは、最初のプライミングを必要とし、その後、メモリーを作り出し、それが、その後、同じ病原体に遭遇しているときに結果として増強された応答性をもたらす。自然免疫細胞としては、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞を含む自然リンパ球細胞(ILC)、好中球、巨核球、好酸球及び好塩基球が挙げられるが、これらに限定されない。適応免疫細胞としては、B及びTリンパ球/細胞が挙げられる。T細胞サブセットとしては、アルファベータCD4+ T(ナイーブCD4+、メモリーCD4+、エフェクターメモリーCD4+、エフェクターCD4+、制御性CD4+)、及びアルファベータCD8+ T(ナイーブCD8+、メモリーCD8+、エフェクターメモリーCD8+、エフェクターCD8+)が挙げられるが、これらに限定されない。B細胞サブセットとしては、ナイーブB、メモリーB、及び形質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。NK T細胞及びTガンマデルタ(Tγδ)細胞は、自然リンパ球及び適応リンパ球の両方の特性を示す。いくつかの実施形態において、本明細書中の任意の免疫細胞は、ヒト細胞である。
「T細胞」または「Tリンパ球」は、健康及び疾患における免疫応答の編成において重要な役割を果たす免疫細胞である。特有の機能及び特性を有する2つの主要なT細胞サブセットが存在し、CD8抗原を発現するT細胞(CD8+T細胞)は、グランザイム及びパーフォリンなどの細胞傷害性タンパク質を使用して標的細胞を溶解させることができる細胞傷害性またはキラーT細胞であり、CD4抗原を発現するT細胞(CD4+ T細胞)は、CD8+T細胞、B細胞、マクロファージなどの機能を含む、多くの他の免疫細胞種の機能を制御することができるヘルパーT細胞である。さらに、CD4+ T細胞は、免疫応答を抑制することができる制御性T(Treg)細胞、ならびにサイトカインなどの免疫調節タンパク質を分泌することによって様々な種類の免疫応答を制御するTヘルパー1(Th1)、Tヘルパー2(Th2)、及びTヘルパー17(Th17)細胞などのいくつかのサブセットにさらに細分される。T細胞は、固有の抗原特異的なモチーフと結合するアルファベータT細胞受容体を介して標的を認識し、この認識メカニズムは、一般に細胞傷害機能及びサイトカイン分泌機能を誘発するために必要とされる。「自然リンパ球」はまた、細胞傷害活性またはTh1、Th2、及びTh17サイトカインの分泌などのCD8+及びCD4+ T細胞の特性を示す場合がある。これらの自然リンパ球サブセットのいくつかは、NK細胞、ならびにILC1、ILC2、及びILC3細胞;ならびに自然様T細胞、例えば、Tγδ細胞;ならびにNK T細胞を含む。一般に、これらの細胞は、免疫調節性サイトカインなどの、感染または損傷組織からの炎症性刺激に速やかに応答することができるが、アルファベータT細胞とは異なり、これらは、抗原特異的なパターンを認識する必要なく応答することができる。
「サイトカイン」は、始原/初代細胞と標的/エフェクター細胞の間のクロストークを媒介する免疫調節性ポリペプチドの一形態である。これは、可溶型または細胞表面結合として機能し、標的免疫細胞上の「サイトカイン受容体」と結合してシグナル伝達を活性化することができる。「サイトカイン受容体」(すなわち、IL-10RA及びIL-10RBの2つのサブユニットから構成されるIL-10受容体、IL-10R)は、本明細書で使用される場合、細胞外細胞表面上のサイトカインとの結合時に細胞内シグナル伝達を活性化する細胞表面上のポリペプチドである。サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインは、免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞、及び間質細胞を含む、幅広い細胞により産生される。所与のサイトカインが、2つ以上の細胞種によって産生される場合もある。サイトカインは多面的であり、受容体が複数の免疫細胞サブセット上で発現するため、1つのサイトカインが複数の細胞においてシグナル伝達経路を活性化することができる。ただし、細胞種に応じて、サイトカインに対するシグナル伝達事象は、活性化、増殖、生存、アポトーシス、エフェクター機能及び他の免疫調節タンパク質の分泌などの異なる下流の細胞事象をもたらす可能性がある。
「アミノ酸」とは、本明細書で使用される場合、アラニン(3文字コード:ala、1文字コード:A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、トレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、及びバリン(val、V)を含む、天然に存在するカルボキシα-アミノ酸を指す。
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、単量体(アミノ酸)が(アミド結合としても知られている)ペプチド結合によって互いに直線的に連結された分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸の鎖を言及するために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの任意の用語の代わりに、またはそれらと区別なく使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、天然の生物学的原料由来であっても、または組み換え技術によって生成されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らないポリペプチドの生成物を指すことが意図される。それは、化学合成を含む任意の様式で生成されてもよい。ポリペプチドは、通常、規定の三次元構造を有するが、それらは、必ずしもそのような構造を有する訳ではない。本開示のポリペプチドは、約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上のアミノ酸のサイズであってもよい。規定の三次元構造を有するポリペプチドはフォールディングと呼ばれ、規定の三次元構造を持たず、むしろ多くの異なる立体構造をとることができるポリペプチドはアンフォールディングと呼ばれる。ポリペプチドは、多量体、すなわち、2つ以上のポリペプチド分子からなる多量体、例えば、二量体、三量体及びさらに多くのオリゴマーをさらに形成する場合もある。二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても、または同一でなくてもよい。したがって、そのような多量体の対応するさらに高次の構造は、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと呼ばれる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はまた、修飾ポリペプチド/タンパク質も指し、以下に限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む発現後修飾が影響を受ける。
「残基」は、本明細書で使用される場合、タンパク質中の位置及びその関連づけられるアミノ酸の正体を意味する。例えば、(Leu234またはL234とも言及される)Leu 234は、ヒト抗体IgG1の位置234にある残基である。
「野生型」は、本明細書中では、対立遺伝子変異を含む、自然界で見られるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。野生型タンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
「置換」または「変異」とは、ポリペプチドの野生型配列に生じるアミノ酸が前記ポリペプチドの同じ位置で別のアミノ酸に置換されるポリペプチド骨格の変化を指す。いくつかの実施形態において、受容体に対するポリペプチドの親和性を改変するために、変異(複数可)が導入され、それによって野生型同種ポリペプチドの親和性及び活性とは異なるようになるよう活性を変える。変異は、ポリペプチドの生物物理学的特性を改善する場合もある。アミノ酸変異は、当該技術分野において周知の遺伝学的または化学的方法を使用して生じさせることができる。遺伝学的方法としては、部位特異的変異誘発、PCR、遺伝子合成などを挙げることができる。化学修飾などの遺伝子操作以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を改変する方法も有用であり得ることが予想される。
「インターロイキン-10」または「IL-10」という用語は、本明細書で使用される場合、別途指定されない限り、霊長類(例えば、ヒト)及び齧歯動物(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然IL-10を指す。IL-10は、通常、ホモ二量体として存在する。「IL-10」は、未プロセシングのIL-10ならびに細胞におけるプロセシングの結果生じるIL-10の形態である「成熟IL-10」を包含する。「成熟IL-10」の配列を図1Aに示す。未プロセシングのヒトIL-10の一例示的形態は、成熟IL-10に結合した付加的なN末端アミノ酸シグナルペプチドを含む。「IL-10」は、以下に限定されないが、天然に存在するIL-10のバリアント、例えば、対立遺伝子またはスプライスバリアントまたはバリアントも含む。例示的なヒトIL-10のアミノ酸配列は、UniProt P22301(IL10_HUMAN)として示されている。
「IL-10ホモ二量体」または「IL-10二量体」は、IL-10R α鎖(IL-10RA)の2つの分子及びIL-10R β鎖(IL-10RB)の2つの分子からなる、細胞上の四量体IL-10受容体(IL-10R)複合体と結合するもともと対称のホモ二量体型の野生型IL-10ポリペプチドを指す。各IL-10ポリペプチド鎖のα-ヘリックスは、一方の鎖の最初の4つのヘリックス(A~D)が他方の最後の2つのヘリックス(E及びF)と会合するように絡み合い、これによって二量体化したときに各ドメインの構造的完全性を維持する(Walter & Nagabhushan,Biochemistry.1995 Sep 26;34(38):12118-25)。「IL-10単量体」とは、交換された二次構造要素を接続するループを延長することによって形成され得る単量体型のIL-10を指す。Josephson et al,Biochemistry 1995 Sep 26;34(38):12118-25に記載されているとおり、二量体形成を妨げ、IL-10単量体形成を誘導するのには、前記ループへの6アミノ酸の挿入で十分であった。得られたIL-10単量体は、生物学的に活性であり、単一のIL-10RA分子と結合し、単一のIL-10RB分子をシグナル伝達複合体にリクルートして、IL-10が関係する細胞の応答を誘発することができた。したがって、ループD(残基C114で終わる)とループE(残基V121で始まる)の間のIL-10ポリペプチド(すなわち、野生型IL-10または本開示の任意の変異IL-10ポリペプチド)の配列への短いアミノ酸配列または短いリンカーの挿入は、前記IL-10ポリペプチドの「単量体の異性体」を生じる。この付加したアミノ酸配列またはリンカーは、C114、E115、N116、K117、S118、K119、またはA120の直後に挿入することができる。本明細書に記載されるとおり、IL-10単量体ポリペプチドに関するアミノ酸のナンバリングは、リンカー配列/アミノ酸(複数可)がカウントされないよう、配列番号1(すなわち、IL-10二量体ポリペプチド)の数に基づくものである。例えば、図2B及び3Bを参照。
「親和性」または「結合親和性」は、分子(例えば、抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の、合計の非共有性相互作用の強さを指す。別途指定されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対の要素(例えば、抗体及び抗原)間の1:1の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。親和性は、一般に、解離速度定数と結合速度定数(それぞれ、koff及びkon)の比である解離定数(KD)によって表すことができる。したがって、速度定数の比が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、酵素結合免疫吸着測定(ELISA)、表面プラズモン共鳴(SPR)技術(例えば、BIAcore)、バイオレイヤー干渉(BLI)技術(例えば、Octet)及びその他の従来の結合アッセイなどの当該技術分野において既知の一般的な方法によって測定することができる(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002)。
「結合」または「特異的結合」は、本明細書で使用される場合、それぞれ、ポリペプチドに対する受容体または標的抗原と選択的に相互作用するポリペプチドまたは抗原結合分子の能力を指し、この特異的な相互作用は、非標的または望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別され得る。
「変異IL-10ポリペプチド」とは、野生型IL-10とは異なるアミノ酸配列を有するIL-10ポリペプチドを指す。例えば、変異IL-10ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、及び挿入を有する場合もある。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、受容体に対する親和性が低下しており、そのような低下した親和性は、変異体の低下した生物学的活性をもたらす。親和性の低下及びそれによる活性の低下は、少数のアミノ酸変異または置換を導入することによって得ることができる。変異IL-10ポリペプチドは、所望の特性、例えば、IL-10Rに対する低下した親和性を有する最終構築物を形成する、以下に限定されないが、ポリペプチドのアミノ酸欠失、置換、環化、ジスルフィド結合、もしくは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化または改変された炭水化物)、ポリペプチドに対する化学的もしくは酵素的改変(例えば、ポリペプチド骨格へのPEGの結合)、ペプチドタグもしくは標識の付加、またはタンパク質もしくはタンパク質ドメインとの融合を含む、他の改変をペプチド骨格に有する場合もある。所望の活性はまた、野生型IL-10ポリペプチドと比較して改善された生物物理学的特性を含む場合もある。複数の改変を組み合わせて、親和性の低下または改善された生物物理学的特性などの所望の活性改変を達成することができる。非限定例として、グリコシル化を可能にするために、コンセンサスN-結合型グリコシル化のためのアミノ酸配列がポリペプチドに組み込まれてもよい。別の非限定例は、ペグ化を可能にするために、リジンがポリペプチドに組み込まれてもよいことである。いくつかの実施形態において、受容体に対する親和性を低下させることによって活性を改変するために、ポリペプチドに変異(複数可)が導入される。
「標的化部分」及び「抗原結合分子」は、本明細書で使用される場合、最も広い意味で抗原決定基と特異的に結合する分子を指す。標的化部分または抗原結合分子は、タンパク質、炭水化物、脂質、またはその他の化合物であり得る。これらとしては、抗体、抗体フラグメント(Chames et al,2009;Chan & Carter,2010;Leavy,2010;Holliger & Hudson,2005)、足場抗原結合タンパク質(Gebauer and Skerra,2009;Stumpp et al, 2008)、シングルドメイン抗体(sdAb)、ミニボディ(Tramontano et al,1994)、重鎖抗体の可変ドメイン(ナノボディ、VHH)、新規抗原受容体の可変ドメイン(VNAR)、炭水化物結合ドメイン(CBD)(Blake et al,2006)、コラーゲン結合ドメイン(Knight et al,2000)、レクチン結合タンパク質 (テトラネクチン)、コラーゲン結合タンパク質、アドネクチン/フィブロネクチン(Lipovsek,2011)、血清トランスフェリン(トランスボディ)、エヴィボディ、プロテインA由来の分子、例えば、プロテインAのZ-ドメイン(アフィボディ)(Nygren et al,2008)、A-ドメイン(アヴィマー/マキシボディ)、アルファボディ(WO2010066740)、アヴィマー/マキシボディ、設計アンキリンリピートドメイン(DARPin)(Stumpp et al,2008)、アンチカリン(Skerra et al,2008)、ヒトガンマ-クリスタリンまたはユビキチン(アフィリン分子)、ヒトプロテアーゼインヒビターのクニッツ型ドメイン、ノッチン(Kolmar et al,2008)、半減期を延長するための融合物を伴うか、または伴わない直鎖状または制限されたペプチド、例えば、(Fc融合物-ペプチボディ)(Rentero Rebollo & Heinis,2013;EP1144454B2;Shimamoto et al,2012;US7205275B2)、制限された二環式ペプチド(US2018/0200378A1)、アプタマー、操作されたCH2ドメイン(ナノ抗体;Dimitrov,2009))及び操作されたCH3ドメイン「Fcab」ドメイン(Wozniak-Knopp et al,2010)が挙げられるが、これらに限定されない。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、同義に使用され、本明細書では最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体(例えば、完全長または完全なモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、抗体フラグメント、及びシングルドメイン抗体(本明細書でさらに詳細に記載される)を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
いくつかの実施形態において、抗体(免疫グロブリン)は、天然の抗体構造と実質的に同様の構造を有するタンパク質を指す。「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然免疫グロブリンのIgGクラスは、ジスルフィド結合した2つの軽鎖及び2つの重鎖から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン(variable heavy domain)または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)と、それに続く重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2、及びCH3)を有する。同様に、N末端からC末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン(variable light domain)または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)と、それに続く軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽(CL)ドメインを有する。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知であり、例えば、Abbas et al.,2000,Cellular and Mol,and Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)に一般的に記載されている。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体(免疫グロブリン)は、異なるクラスに割り当てられる。抗体には、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、またはμ(IgM)の5つの主要なクラスがあり、その一部はさらにサブタイプ、例えば、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)、及びα2(IgA2)に分類され得る。免疫グロブリンの軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプうちの1つが割り当てられ得る。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して連結された2つのFab分子と1つのFcドメインから基本的になる。
「Fc」、「Fc領域」、または「Fcドメイン」は、本明細書で使用される場合、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のC末端領域を指す。この用語は、天然配列Fc領域及びバリアントFc領域を含む。Fcは、IgA、IgD、及びIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、CH2及びCH3)、IgE及びIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびに場合によりこれらのドメインのN末端側にあるフレキシブルヒンジの全てまたは一部を指すことができる。IgA及びIgMの場合、FcにはJ鎖が含まれる場合がある。IgG Fc領域は、IgG CH2及びIgG CH3ドメインを含み、場合によってはヒンジを含む。本明細書において別段明記されない限り、Fc領域または定常領域内のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md,1991に記載される、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。「ヒンジ」領域は、通常、およそ位置216のアミノ酸残基からおよそ位置230のアミノ酸残基まで延びる。ヒンジ領域は、本明細書では天然のヒンジドメインまたは変異ヒンジドメインであってもよい。ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」は、通常、およそ位置231のアミノ酸残基からおよそ位置340のアミノ酸残基まで延びる。CH2ドメインは、本明細書では天然配列CH2ドメインまたは変異CH2ドメインであってもよい。「CH3ドメイン」は、IgGのおよそ位置341のアミノ酸残基からおよそ位置447のアミノ酸残基まで、Fc領域におけるC末端からCH2ドメインまでの一続きの残基を含む。CH3領域は、本明細書では、天然配列CH3ドメインまたは変異CH3ドメインであってもよい(例えば、その一方の鎖に組み込まれた「突起」(「ノブ」)及びその他方の鎖に組み込まれた対応する「空所」(「ホール」)を有するCH3ドメイン;明確に参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,821,333号を参照)。したがって、「Fcドメイン」の定義には、アミノ酸231~447(CH2-CH3)もしくは216~447(ヒンジ-CH2-CH3)の両方、またはそれらのフラグメントが含まれる。「Fcフラグメント」は、この文脈において、N末端及びC末端のいずれか、またはその両方の少数のアミノ酸を含む場合もあるが、依然として別のFcドメインまたはFcフラグメントと二量体を形成する能力を保持し、これも一般にサイズに基づく標準的な方法(例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど)を使用して検出可能である。ヒトIgG Fcドメインは、本開示において特に有用であり、ヒトIgG1、IgG2またはIgG4由来のFcドメインであり得る。
「変異Fcドメイン」または「Fcバリアント」または「変異Fc」は、親Fcドメインと比較して、アミノ酸改変(例えば、置換、付加、及び欠失)を含む。この用語は、免疫グロブリンのFc領域の天然に存在する対立遺伝子バリアントも含む。一般に、変異Fcドメインは、対応する親ヒトIgG Fcドメインと少なくとも約80、85、90、95、97、98または99の同一性パーセントを有する(後述の同一性アルゴリズムを使用、一実施形態は、デフォルトパラメータを使用した当該技術分野において既知のBLASTアルゴリズムを利用した)。あるいは、変異Fcドメインは、親Fcドメインと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を有することがある。例えば、生物学的機能を実質的に喪失することなく免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1つ以上のアミノ酸を欠失させることができる。さらに、本明細書で述べられているとおり、変異Fcドメインは、本明細書では、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載の既知の技術を使用して測定した場合、別のFcドメインと二量体を形成する能力を依然として保持している。
「Fcガンマ受容体」、「FcγR」または「FcガンマR」は、本明細書で使用される場合、IgG抗体 Fc領域と結合し、FcγR遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーのあらゆるメンバーを意味する。ヒトでのこのファミリーは、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、及びFcγRIcを含む、FcγRI(CD64);アイソフォームFcγRIIa(アロタイプH131及びR131を含む)、FcγRIIb(FcγRIIb-1及びFcγRIIb-2を含む)、及びFcγRIIcを含む、FcγRII(CD32);ならびにアイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158及びF158を含む)及びFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIb-NA1及びFcγRIIb-NA2を含む)を含む、FcγRIII (CD16)(Jefferis et al.,2002,Immunol Lett 82:57-65、参照により全体が組み込まれる)、ならびにあらゆる未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプを含むが、これらに限定されない。FcγRは、以下に限定されないがヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む、任意の生物由来であってもよい。マウスFcγRとしては、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、及びFcγRIII-2(CD16-2)、ならびに任意の未発見のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプが挙げられるが、これらに限定されない。
「エフェクター機能」とは、本明細書で使用される場合、抗体Fc領域のFcレセプターまたはリガンドとの相互作用の結果として生じる生化学的事象を意味し、これは、抗体アイソタイプにより変化する。エフェクター機能としては、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体が関係する抗原取り込み、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)のダウンレギュレーション、及びB細胞活性化が挙げられるが、これらに限定されない。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」または「ADCC」とは、FcRを発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ADCCは、FcγRIIIaとの結合と相関しており、FcγRIIIaとの結合を増加させるとADCC活性の増加につながる。対象とする分子のADCC活性を評価するために、例えば、米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記載されるものなどのインビトロADCCアッセイが実施されてもよい。「ADCP」または抗体依存性細胞貪食とは、本明細書で使用される場合、FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の貪食を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。
「Fcヌル」及び「Fcヌルバリアント」は、同義に使用され、本明細書ではエフェクター機能が低下したか、または破壊された改変型Fcを示すために使用される。そのようなFcヌルまたはFcヌルバリアントは、FcγR及び/または補体受容体が減少しているか、または破壊されている。いくつかの実施形態において、そのようなFcヌルまたはFcヌルバリアントは、エフェクター機能が破壊されている。改変のための例示的な方法としては、化学的改変、アミノ酸残基置換、挿入及び欠失が挙げられるが、これらに限定されない。得られるバリアントのエフェクター機能を低下させるために1つ以上の改変が組み込まれたFc分子の例示的なアミノ酸位置(EUナンバリング方式に基づくナンバリング)は、位置i)IgG1:C220、C226、C229、E233、L234、L235、G237、P238、S239、D265、S267、N297、L328、P331、K322、A327及びP329、ii)IgG2:V234、G237、D265、H268、N297、V309、A330、A331、K322ならびにiii)IgG4:L235、G237、D265及びE318である。エフェクター機能が低下した例示的なFc分子は、以下の置換の1つ以上を有するものを含む:i)IgG1:N297A、N297Q、N297G、D265A/N297A、D265A/N297Q、C220S/C226S/C229S/P238S、S267E/L328F、C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、L234F/L235E/P331S、L234A/L235A、L234A/L235A/G237A、L234A/L235A/G237A/K322A、L234A/L235A/G237A/A330S/A331S、L234A/L235A/P329G、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G及びE233P/L234V/L235A/G236del、L234A/L235A/G237欠失;ii)IgG2:A330S/A331S、V234A/G237A、V234A/G237A/D265A、D265A/A330S/A331S、V234A/G237A/D265A/A330S/A331S、及びH268Q/V309L/A330S/A331S;iii)IgG4:L235A/G237A/E318A、D265A、L235A/G237A/D265A及びL235A/G237A/D265A/E318A。
「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域と特異的に結合することができる決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集まりであり、通常、特定の構造的特性、ならびに特定の電荷特性を有する。単一の抗原が2つ以上のエピトープを有する場合もある。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基(言い換えると、アミノ酸残基が抗原結合ペプチドのフットプリント内にある)を含む場合もある。エピトープは、高次構造または直鎖のいずれかであり得る。エピトープは、一般に、少なくとも3個、より通常は、少なくとも5個または8~10個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、別の抗体の標的抗原との結合をブロックする抗体の能力を示す単純なイムノアッセイ、例えば、「ビニング」で確認することができる。
「リンカー」は、本明細書で使用される場合、2つのポリペプチド鎖を接続する分子を指す。リンカーは、ポリペプチドリンカーまたは合成化学リンカーであり得る(例えば、Protein Engineering,9(3),299-305,1996で開示されているものを参照)。ポリペプチドリンカーの長さ及び配列は、特に限定されず、当業者が目的に応じて選択することができる。ポリペプチドリンカーは、1つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも5アミノ酸長、いくつかの実施形態では、5から100、または10から50アミノ酸長のペプチドである。一実施形態において、前記ペプチドリンカーは、G、S、GS、SG、SGG、GGS、及びGSG(G=グリシン及びS=セリン)である。別の実施形態において、前記ペプチドリンカーは、(GGGS)xGn(配列番号74)、(GGGGS)xGn(配列番号75)、(GGGGGS)xGn(配列番号76)、S(GGGS)xGn(配列番号386)、S(GGGGS)xGn(配列番号387)、またはS(GGGGGS)xGn(配列番号388)であり、x=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12及びn=0、1、2または3である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、(GGGGS)xGnであり、x=2、3、または4であり、n=0であり(配列番号85)、いくつかの実施形態において、前記リンカーは、(GGGGS)xGnであり、x=3であり、n=0である(配列番号86)。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号79)、SGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号77)、またはSGGGGSGGGGSGGGG(配列番号78)を含む。合成化学リンカーとしては、ペプチドを架橋するために通常使用される架橋薬剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)、ビス(スクシンイミジル)スベラート(BS3)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)(DSP)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)(DTSSP)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)(EGS)、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)(スルホ-EGS)、酒石酸ジスクシンイミジル(DST)、酒石酸ジスルホスクシンイミジル(スルホ-DST)、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、及びビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)が挙げられる。
タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、特定の(親)配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内である種々の方式で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。1つの特定のプログラムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20160244525号の段落[0279]から[0280]に概要が示されるALIGN-2プログラムである。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本開示のポリペプチドをコードする単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、ウイルス由来のRNA、またはプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、従来的なリン酸ジエステル結合または非従来的な結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)において見られるものなどのアミド結合)を含んでもよい。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の1つ以上の核酸セグメント、例えば、DNAまたはRNAフラグメントを指す。いくつかの態様において、そのような核酸を含む1つ以上のベクター(特に発現ベクター)が提供される。一態様において、本開示のポリペプチドを生成するための方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること及びポリペプチドを宿主細胞から回収することを含む、方法が提供される。「組み換え」とは、タンパク質が組み換え核酸技術を使用して外来宿主細胞において生成されることを意味する。宿主細胞で発現させた組み換え生成タンパク質は、任意の適切な技術によって、分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然のタンパク質または組み換えタンパク質と同様に、本発明の目的においては、単離されているものと見なされる。
本明細書で開示されている様々なポリペプチドについて記載するために使用される場合、「単離された」という用語は、発現した細胞または細胞培養物から特定され、分離及び/または回収されたポリペプチドを意味する。一般に、単離ポリペプチドは、少なくとも1つの精製ステップにより精製されることになる。純度のレベルは必要とされず、「精製」または「精製された」とは、出発材料と比較して組成物中の夾雑物の濃度に対して標的タンパク質濃度を増加させることを指す。「単離タンパク質」は、本明細書で使用される場合、異なる結合特異性を有するその他のタンパク質を実質的に含まない標的タンパク質を指す。
「がん」という用語は、一般に体の他の部分に浸潤するか、または広がる可能性のある未制御で異常な細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理的状態を指す。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるがこれらに限定されない。そのようながんのさらに具体的な例としては、下記のがんのいずれかの難治性の種類、または1つ以上の下記のがんの組み合わせを含む、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細気管支肺胞癌、扁平上皮癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮がん腫、腹膜のがん、頭頸部癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭または頸部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、甲状腺癌、子宮癌、胃腸癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域のがん、胃癌(stomach cancer、gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮内膜癌、子宮癌、卵管癌、子宮頸部のがん腫、膣のがん腫、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系のがん、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱のがん、腎臓または輸尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、膀胱癌、肝癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、子宮頸癌、唾液腺癌、胆管癌、中枢神経系(CNS)の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫が挙げられる。
変異IL-10ポリペプチド
いくつかの実施形態において、本開示は、変異IL-10ポリペプチド、及びその融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3の配列を含む)IL-10RBポリペプチドに対する結合親和性を増加させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号2の配列を含む)IL-10RAポリペプチドに対する結合親和性を低下させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3の配列を含む)IL-10RBポリペプチドに対する結合親和性を増加させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含み、(例えば、配列番号2の配列を含む)IL-10RAポリペプチドに対する結合親和性を低下させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、図1Aに示される野生型成熟IL-10、または図1Dに示される成熟単量体IL-10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、変異IL-10ポリペプチド、及びその融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3の配列を含む)IL-10RBポリペプチドに対する結合親和性を増加させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号2の配列を含む)IL-10RAポリペプチドに対する結合親和性を低下させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、(例えば、配列番号3の配列を含む)IL-10RBポリペプチドに対する結合親和性を増加させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含み、(例えば、配列番号2の配列を含む)IL-10RAポリペプチドに対する結合親和性を低下させる(例えば、配列番号1に対して)1つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、図1Aに示される野生型成熟IL-10、または図1Dに示される成熟単量体IL-10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、図1Aに示される野生型成熟IL-10、または図1Dに示される成熟単量体IL-10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、i)図1Bに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RAポリペプチドに対して低下した結合親和性を示し、ii)図2A~3Bに示されるとおり、図1Aに示される野生型IL-10ポリペプチドまたは図1Dに示される成熟単量体IL-10のアミノ酸配列に対して、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、本開示の変異IL-10ポリペプチドは、図1Bに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RAポリペプチドに対して50%以上低下した結合親和性を示す。IL-10RAに対する野生型及び変異IL-10ポリペプチドの結合親和性の差は、当業者に周知のタンパク質間相互作用の親和性を測定する標準的なSPRアッセイで測定される。
いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、図1Aに示される野生型成熟IL-10、または図1Dに示される成熟単量体IL-10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、i)図1Cに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RBポリペプチドに対して増加した結合親和性を示し、ii)図1Aに示される野生型成熟IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有してもよい(図2A~3B)。さらに別の実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、図1Cに示されるアミノ酸配列を有するIL-10RBポリペプチドに対して150%以上増加した結合親和性を示す。
野生型成熟IL-10ポリペプチドの配列において可能性のあるアミノ酸置換の位置が図2に示される。いくつかの実施形態において、野生型成熟IL-10ポリペプチドの配列において示されたアミノ酸は、図3に示されるとおりアラニンまたは別のアミノ酸で置換された。
いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドはまた、改善された生物物理学的特性などの付加的な利点を提供する、変異及び欠失を含むが、これらに限定されない他の改変も含む。改善された生物物理学的特性としては、改善された熱安定性、凝集傾向、酸可逆性、粘度、及び哺乳動物または細菌または酵母菌細胞における産生が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるとおりの、単量体である。例えば、図1D、2B、及び3Bに示される配列番号187を参照。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N及びF111Lを含み、例えば、下記表4Aに配列番号188として示される。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表4Aに列挙されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号188~201からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N及びF111Lならびに1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、位置(複数可)R24、R27、Q38、I87、K138、E142、D144、及び/またはE151にある。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、Q38A、N92I、K99N及びF111Lを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号189の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、R24A、N92I、K99N及びF111Lを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号190の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、R24A、Q38A、N92I、K99N及びF111Lを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号191の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N、F111L及びE151Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号192の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、R24A、N92I、K99N、F111L及びE151Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号193の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、I87A、N92I、K99N及びF111Lを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号194の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N、F111L及びK138Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号195の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、R27A、N92I、K99N及びF111Lを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号196の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N、F111L及びE142Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号197の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N、F111L及びD144Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号198の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、Q38A、N92I、K99N、F111L及びE142Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号199の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N18I、N92I、K99N、F111L、E142A及びK138Aを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号200の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N92Iを含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号201の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号87~89及び188~201からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表4Aに示される変異単量体IL-10ポリペプチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表4Aに示される変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸置換及び/またはアミノ酸挿入配列を含む。
いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号310~318からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表8に示される変異単量体IL-10ポリペプチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表8に示される変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸置換及び/またはアミノ酸挿入配列を含む。
いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号422~428からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表11に示される変異単量体IL-10ポリペプチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表11に示される変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸置換及び/またはアミノ酸挿入配列を含む。
表4Bは、本開示のIL-10単量体ポリペプチドに関する例示的なアミノ酸挿入及び挿入位置を示す(挿入には下線を付す)。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表4Bに列挙されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号91~101からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、表4Bに列挙されているアミノ酸挿入を、及び/または表4Bに列挙されている位置に含む。いくつかの実施形態において、挿入は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、残基C114、E115、N116、K117、S118、K119、またはA120の直後に1つのアミノ酸、または1から15個の間のアミノ酸のペプチド挿入を有する本開示の変異IL-10単量体ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。挿入の例としては、G、GG、GGG、GGGG(配列番号80)、GGGSG(配列番号81)、GGGGG(配列番号82)、GGGGGG(配列番号83)、及びGGGSGG(配列番号84)を挙げることができるが、これらに限定されない。
融合タンパク質
本開示の変異IL-10ポリペプチドのいずれか1つ及びT細胞上の抗原と結合する抗原結合分子を含む融合タンパク質が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、単球よりもT細胞を優先的に刺激する。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質は、変異IL-10ポリペプチド及びCD8+ T細胞と結合する抗原結合分子を含み、前記融合タンパク質は、単球よりもCD8+ T細胞を優先的に刺激する。いくつかの実施形態において、抗原結合分子は、CD8(例えば、CD8ab、CD8a、もしくはCD8aa)、CD4、またはPD-1、例えば、ヒトCD8(例えば、ヒトCD8ab、ヒトCD8a、もしくはヒトCD8aa)、ヒトCD4、またはヒトPD-1と結合する。ヒトCD8、CD4、及びPD-1配列は、当該技術分野において知られており、例えば、ヒトCD8aについてはNP_001139345、ヒトCD8bについてはNP_001171571、ヒトCD4についてはNP_000607、及びヒトPD-1についてはNP_005009を参照。
本開示の変異IL-10ポリペプチドのいずれか1つ及びT細胞上の抗原と結合する抗原結合分子を含む融合タンパク質が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、単球よりもT細胞を優先的に刺激する。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質は、変異IL-10ポリペプチド及びCD8+ T細胞と結合する抗原結合分子を含み、前記融合タンパク質は、単球よりもCD8+ T細胞を優先的に刺激する。いくつかの実施形態において、抗原結合分子は、CD8(例えば、CD8ab、CD8a、もしくはCD8aa)、CD4、またはPD-1、例えば、ヒトCD8(例えば、ヒトCD8ab、ヒトCD8a、もしくはヒトCD8aa)、ヒトCD4、またはヒトPD-1と結合する。ヒトCD8、CD4、及びPD-1配列は、当該技術分野において知られており、例えば、ヒトCD8aについてはNP_001139345、ヒトCD8bについてはNP_001171571、ヒトCD4についてはNP_000607、及びヒトPD-1についてはNP_005009を参照。
他の実施形態において、融合タンパク質は、変異IL-10ポリペプチド及びCD8ab及び/またはCD8a抗原と結合する抗原結合分子を含み、前記融合タンパク質は、単球よりもCD8+ T細胞を優先的に刺激する。
抗原発現細胞に対する本開示の標的化IL-10融合タンパク質の優先的な活性は、IL-10Rも発現する抗原発現細胞及び抗原非発現細胞を含むアッセイにおいて実証される。そのようなアッセイの1つは、IL-10ポリペプチドへの曝露時のヒト末梢血などのヒト免疫細胞及び/または腫瘍浸潤免疫細胞におけるSTAT3リン酸化(pSTAT3)を測定するインビトロアッセイである。アッセイの一様式では、抗原発現細胞に対する選択性を実証するために、抗原発現細胞及び抗原非発現細胞に対する標的化IL-10融合タンパク質の活性が測定される。アッセイの別の様式では、抗原結合分子と融合された場合の変異IL-10ポリペプチドのシグナル伝達におけるレスキューの規模を実証するために、変異IL-10ポリペプチドを含む標的化IL-10融合タンパク質の抗原発現細胞に対する活性が、同じ変異IL-10ポリペプチド及び抗原発現細胞上のいかなる抗原も認識しない対照抗体を含む非標的化IL-10融合タンパク質の活性と比較される。
いくつかの実施形態において、CD8ab抗原結合分子を含む本開示の融合タンパク質は、CD8ab- IL-10R+細胞よりもCD8ab+ IL-10R+細胞を少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍活性化する。いくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、前記IL-10変異ポリペプチド及び前記細胞上に発現する任意の抗原と結合しない対照抗体を含む融合分子と比較してCD8ab+ IL-10R+細胞を50倍超、またはより望ましくは、少なくとも100倍、またはさらにより望ましくは、少なくとも200倍活性化する。IL-10融合タンパク質による前記細胞活性化は、前記IL-10融合タンパク質による処置後の前記細胞におけるpSTAT3の発現を測定することによって判定される。
いくつかの実施形態において、CD8a抗原結合分子を含む本開示の融合タンパク質は、CD8a- IL-10R+細胞よりもCD8a+ IL-10R+細胞を少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍活性化する。いくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、前記IL-10変異ポリペプチド及び前記細胞上に発現する任意の抗原と結合しない対照抗体を含む融合分子と比較してCD8a+ IL-10R+細胞を50倍超、またはより望ましくは、少なくとも100倍、またはさらにより望ましくは、少なくとも200倍活性化する。IL-10融合タンパク質による前記細胞活性化は、前記IL-10融合タンパク質による処置後の前記細胞におけるpSTAT3の発現を測定することによって判定される。
融合タンパク質形式
本開示は、とりわけ、抗原結合分子(例えば、抗体またはその他の抗原結合タンパク質)及び本開示の変異IL-10ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、IL-10融合タンパク質は、例えば、図6に示されるとおりの、様々な形式を有する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、2つの変異IL-10ポリペプチドの二量体を含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方は、抗原結合分子に融合される (例えば、IL-10の二量体が単一の結合により抗原結合分子に融合される)。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、抗原結合分子に融合された単一の変異単量体IL-10ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、2つの抗原結合分子を含み1つの変異IL-10ポリペプチドは、2つの抗原結合分子のそれぞれに融合される(例えば、抗原結合分子は、それぞれが単一の変異IL-10ポリペプチドに融合される、2つのポリペプチド鎖を含み、2つの変異IL-10ポリペプチドは、融合タンパク質の構築時に二量体として結合する)。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチド及び抗原結合分子は、リンカーを介して(例えば、共有結合的に)融合される。
本開示は、とりわけ、抗原結合分子(例えば、抗体またはその他の抗原結合タンパク質)及び本開示の変異IL-10ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、IL-10融合タンパク質は、例えば、図6に示されるとおりの、様々な形式を有する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、2つの変異IL-10ポリペプチドの二量体を含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方は、抗原結合分子に融合される (例えば、IL-10の二量体が単一の結合により抗原結合分子に融合される)。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、抗原結合分子に融合された単一の変異単量体IL-10ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、2つの抗原結合分子を含み1つの変異IL-10ポリペプチドは、2つの抗原結合分子のそれぞれに融合される(例えば、抗原結合分子は、それぞれが単一の変異IL-10ポリペプチドに融合される、2つのポリペプチド鎖を含み、2つの変異IL-10ポリペプチドは、融合タンパク質の構築時に二量体として結合する)。いくつかの実施形態において、変異IL-10ポリペプチド及び抗原結合分子は、リンカーを介して(例えば、共有結合的に)融合される。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインである。例えば、図6のA、D、及びFを参照。いくつかの実施形態において、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインである。例えば、図6のA、D、及びFを参照。いくつかの実施形態において、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合され、例えば、図6のAに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインの第1のC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインの第2のC末端に融合され、例えば、図6のDに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つの変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合され、例えば、図6のFに示されるとおりである。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]、
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]、
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインである。例えば、図6のB、C、E、G、及びHを参照。いくつかの実施形態において、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]、
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]、
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインである。例えば、図6のB、C、E、G、及びHを参照。いくつかの実施形態において、VH/VLは、抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端または第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端のうちの一方に融合され、例えば、図6のBに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのヒンジ領域のN末端に融合され、例えば、図6のCに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して、第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合され、例えば、図6のEに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つの変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端または第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端のうちの一方に融合され、例えば、図6のG及びHに示されるとおりである。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、図6のAに示されるとおりである。例えば、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、各重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、各重鎖のVHドメインは、それぞれ対をなす軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、各重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、各重鎖のVHドメインは、それぞれ対をなす軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、図6のBに示されるとおりである。例えば、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、第1の重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、第1の重鎖のVHドメインは、軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、第1の重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、第1の重鎖のVHドメインは、軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、図6のDに示されるとおりである。例えば、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2-CH3は、抗体Fcドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、2つのCH3ドメインの第1のC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、2つのCH3ドメインの第2のC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、各重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、各重鎖のVHドメインは、それぞれ対をなす軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2-CH3は、抗体Fcドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、2つのCH3ドメインの第1のC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、2つのCH3ドメインの第2のC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、各重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、各重鎖のVHドメインは、それぞれ対をなす軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、図6のEに示されるとおりである。例えば、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、第1の重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、第1の重鎖のVHドメインは、軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、第1の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合され、2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、第2の抗体重鎖ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、第1の重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、第1の重鎖のVHドメインは、軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、図6のFに示されるとおりである。例えば、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、1つの変異単量体IL-10ポリペプチドを含み、変異単量体IL-10ポリペプチドのN末端は、2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、各重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、各重鎖のVHドメインは、それぞれ対をなす軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含む抗原結合分子を含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、融合タンパク質は、1つの変異単量体IL-10ポリペプチドを含み、変異単量体IL-10ポリペプチドのN末端は、2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される(例えば、本開示のリンカーを介して共有結合的に融合される)。いくつかの実施形態において、各重鎖は、軽鎖と対になる。いくつかの実施形態において、各重鎖のVHドメインは、それぞれ対をなす軽鎖のVLドメインと抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質の前記第1及び第2のFcドメインは、エフェクター機能を低下させるために、EUナンバリングに従って1つ以上の以下のFc変異:L234A、L235A、G237A、及びK322Aを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の前記第1及び第2のFcドメインは、エフェクター機能を低下させるために、EUナンバリングに従って以下のFc変異:L234A、L235A、及びG237Aを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の前記第1及び第2のFcドメインは、エフェクター機能を低下させるために、EUナンバリングに従って以下のFc変異:L234A、L235A、G237A、及びK322Aを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の前記第1及び第2のFcドメインは、ヘテロ二量体形成を促進するために以下のアミノ酸置換:Y349C/T366W(ノブ)ならびにS354C、T366S、L368A及びY407V(ホール)を含む。いくつかの実施形態において、抗体Fcドメインの一方または両方は、C末端リジンを有さない。いくつかの実施形態において、第1及び第2のFcドメインは、ヒトIgG1 Fcドメインである。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、半抗体から生成後構築によって形成することができ、それによって、重鎖と軽鎖の誤対形成の問題を解決する。これらの抗体は、半抗体のヘテロ二量体化を促進するための改変を含む場合が多い。例示的なシステムとしては、ノブ・イントゥ・ホール、IgG1(EEE-RRR)、IgG2(EEE-RRRR)(Strop et al.J Mol Biol(2012))及びデュオボディ(F405L-K409R)が挙げられるが、これらに限定されない。そのような場合、半抗体は、別々の細胞株で個別に産生され、精製される。次いで、精製された抗体は、後で二重特異性抗体に構築される半抗体を得るために、穏やかな還元に供された。その後、ヘテロ二量体の二重特異性抗体は、従来の精製方法を使用して混合物から精製された。
いくつかの実施形態において、優先的な鎖対形成によらない二重特異性抗体生成に対する戦略も使用できる。これら戦略は、一般にヘテロ二量体がホモ二量体とは異なる生化学的または生物物理学的特性を有することになるような様式で抗体に遺伝子改変を導入することを含み、それにより、構築後または発現ヘテロ二量体をホモ二量体から選択的に精製することができる。一例は、IgG1 CH3ドメインにH435R/Y436Fを導入して、プロテインA樹脂とのFcの結合を止めた後、H435R/Y436Fバリアントを野生型Fcと共発現させることである。2コピーのH435R/Y436Fを含む得られたホモ二量体抗体は、プロテインAカラムと結合することができないが、1コピーのH435R/Y436F変異を含むヘテロ二量体抗体は、ホモ二量体野生型抗体の強い相互作用と比較して、プロテインAに対して低下した親和性を有することになる(Tustian et al Mabs 2016)。その他の例としては、カッパ/ラムダ抗体(Fischer et al.,Nature Communication 2015)及びそれぞれの鎖への差のある電荷の導入(E357Q、S267K またはN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)(US2018/0142040A1;(Strop et al.J Mol Biol (2012))が挙げられる。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、付加的な結合部位を免疫グロブリン重鎖または軽鎖のいずれかに融合することにより生成することができる。付加的な結合部位の例としては、可変領域、scFv、Fab、VHH、及びペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体変異及び/またはFcガンマ受容体結合を改変する変異は、結果としてFc安定性を低下させた。したがって、安定性を高める付加的な変異(複数可)がFc領域に追加された。例えば、A287C及びL306C、V259C及びL306C、R292C及びV302C、ならびにV323C及びI332Cなどの1対以上のジスルフィド結合がFc領域に導入される。別の例は、ヒンジジスルフィドを安定させるために、IgG4ベースの二重特異性抗体にS228Pを導入することである。さらなる例としては、Fc安定性及び凝集抵抗性を向上させるためにK338I、A339K、及びK340S変異を導入することが挙げられる(Gao et al,2019 Mol Pharm.2019;16:3647)。
いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質は、リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、化学リンカーであり得る(例えば、Protein Engineering,9(3),299-305,1996で開示されているものを参照)。合成化学リンカーとしては、ペプチドを架橋するために通常使用される架橋薬剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)、ビス(スクシンイミジル)スベラート(BS3)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)(DSP)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)(DTSSP)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)(EGS)、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)(スルホ-EGS)、酒石酸ジスクシンイミジル(DST)、酒石酸ジスルホスクシンイミジル(スルホ-DST)、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、及びビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)が挙げられる。
いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸またはペプチドベースのリンカーである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも5アミノ酸長のペプチド、または5から100、もしくは10から50アミノ酸長のペプチドである。一実施形態において、前記ペプチドリンカーは、G、S、GS、SG、SGG、GGS、及びGSG(G=グリシン及びS=セリン)である。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列(GGGS)xGn(配列番号74)、(GGGGS)xGn(配列番号75)、(GGGGGS)xGn(配列番号76)、S(GGGS)xGn(配列番号386)、S(GGGGS)xGn(配列番号387)、またはS(GGGGGS)xGn(配列番号388)を含み、x=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12であり、n=0、1、2または3である。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号79)、SGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号77)、またはSGGGGSGGGGSGGGG(配列番号78)を含む。
抗原結合分子
いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8a上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8aとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHCクラスI分子とCD8aaまたはCD8abの相互作用を妨げない。いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8b上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8bとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHCクラスI分子とCD8abの相互作用を妨げない。
いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8a上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8aとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHCクラスI分子とCD8aaまたはCD8abの相互作用を妨げない。いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8b上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8bとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHCクラスI分子とCD8abの相互作用を妨げない。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ヒトCD8と結合し、融合タンパク質のCD8との結合は、MHCクラスIとCD8の相互作用を妨げない。いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8ab上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8abとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHC クラスI分子とCD8aaまたはCD8abの相互作用を妨げない。いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8a上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8aとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHCクラスI分子とCD8abの相互作用を妨げない。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ヒトCD8と結合し、融合タンパク質のCD8との結合は、MHCクラスIとCD8の相互作用を妨げない。いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8α上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8αとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHCクラスI分子とCD8ααまたはCD8αβの相互作用を妨げない。いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子は、CD8β上のエピトープと結合し、抗原結合分子のCD8βとの結合は、標的細胞または抗原提示細胞上のMHCクラスI分子とCD8αβの相互作用を妨げない。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質がMHCクラスIとCD8の相互作用を妨げるか否かは、例えば、抗CD8抗体または融合タンパク質の存在下または非存在下においてCD8+ T細胞(例えば、抗原刺激時)の活性化状態をアッセイすることによってアッセイすることができる。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPTKGLEWVAYINTGGGTTYYRDSVKGRFTISRDDAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCTTAIGYYFDYWGQGVMVTVSS(配列番号102)の配列を含むVHドメイン及びDIQLTQSPASLSASLGETVSIECLASEDIYSYLAWYQQKPGKSPQVLIYAANRLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKISGMQPEDEGDYFCLQGSKFPYTFGAGTKLELK(配列番号103)の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、EVKLQESGPSLVQPSQTLSLTCSVSGFSLISDSVHWVRQPPGKGLEWMGGIWADGSTDYNSALKSRLSISRDTSKSQGFLKMNSLQTDDTAIYFCTSNRESYYFDYWGQGTMVTVSS(配列番号104)の配列を含むVHドメイン及びDIQMTQSPASLSASLGDKVTITCQASQNIDKYIAWYQQKPGKAPRQLIHYTSTLVSGTPSRFSGSGSGRDYSFSISSVESEDIASYYCLQYDTLYTFGAGTKLELK(配列番号105)の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、EVKLQESGPSLVQPSQTLSLTCSVSGFSLISDSVHWVRQPPGKGLEWMGGIWADGSTDYNSALKSRLSISRDTSKSQGFLKMNSLQTDDTAIYFCTSARESYYFDYWGQGTMVTVSS(配列番号106)の配列を含むVHドメイン及びDIQMTQSPASLSASLGDKVTITCQASQNIDKYIAWYQQKPGKAPRQLIHYTSTLVSGTPSRFSGSGSGRDYSFSISSVESEDIASYYCLQYATLYTFGAGTKLELK(配列番号107)の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、EVQLVESGGALVQPGRSLKLSCAASGLTFSDCYMAWVRQTPTKGLEWVSYISSDGGSTYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDMATYYCACATDLSSYWSFDFWGPGTMVTVSS(配列番号108)の配列を含むVHドメイン及びDIQMTQSPSSLPVSLGERVTISCRASQGISNNLNWYQQKPDGTIKPLIYHTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLEPEDFAMYYCQQDATFPLTFGSGTKLEIK(配列番号109)の配列を含むVLドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号58の配列を含むVHドメイン及び配列番号59の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号62の配列を含むVHドメイン及び配列番号63の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号64の配列を含むVHドメイン及び配列番号65の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号66の配列を含むVHドメイン及び配列番号67の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号68の配列を含むVHドメイン及び配列番号69の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号70の配列を含むVHドメイン及び配列番号71の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号72の配列を含むVHドメイン及び配列番号73の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号185の配列を含むVHドメイン及び配列番号186の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号245の配列を含むVHドメイン及び配列番号246の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号247の配列を含むVHドメイン及び配列番号248の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号249の配列を含むVHドメイン及び配列番号250の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号251の配列を含むVHドメイン及び配列番号252の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号253の配列を含むVHドメイン及び配列番号254の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号255の配列を含むVHドメイン及び配列番号256の配列を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体または融合タンパク質は、配列番号257の配列を含むVHドメイン及び配列番号258の配列を含むVLドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合分子(及び融合タンパク質)は、ヒトCD8b及び/またはヒトCD8abと特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、ヒト抗体または抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、ヒト化抗体または抗体フラグメントである。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞(例えば、ヒトNK細胞)上に発現する、ヒトCD8a及び/またはヒトCD8aaとの結合よりも少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍、または少なくとも200倍高い親和性でヒトCD8b及び/またはヒトCD8abと特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞上に発現する、ヒトCD8a及び/またはヒトCD8aaとの結合よりも少なくとも10倍高い親和性でヒトCD8b及び/またはヒトCD8abと特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ヒトCD8b及び/またはヒトCD8abは、ヒト細胞、例えば、ヒトT細胞の表面上に発現する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、表面上にヒトCD8abヘテロ二量体を発現する細胞(例えば、ヒトT細胞)と1000nM未満のEC50で特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、ヒトCD8+ T細胞と特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v1の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または1、2、または3つの抗体xhCD8v1の軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号177のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v8の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v8の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号62の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号63の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v2の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v2の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号64の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号65の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v3の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v3の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号66の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号67の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v4の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v4の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号68の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号69の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v5の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v5の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号70の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号71の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v6の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v6の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトである。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号72の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号73の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v7の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v7の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトである。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、X1がS、K、G、N、R、D、T、またはGであり、X2がY、L、H、またはFである、X1X2AISのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号259)と、X1がGまたはHであり、X2がIまたはFであり、X3がI、N、またはMであり、X4がG、N、H、S、R、I、またはAであり、X5がA、N、H、S、T、F、またはYであり、X6がA、D、またはGであり、X7がT、E、K、V、Q、またはAであり、X8がAまたはTであり、X9がNまたはKであり、X10がAまたはNであり、X11がQまたはTである、X1X2X3PX4X5X6X7X8X9YX10QKFX11Gのアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号260)と、X1がDまたはAであり、X2がA、G、E、R、Y、K、N、Q、L、またはFであり、X3がA、L、P、またはYであり、X4がIまたはLであり、X5がR、A、Q、またはSであり、X6がAまたはDであり、X7がD、E、A、またはSである、X1X2X3GX4X5LFX6X7のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号261)とを含むVHドメイン、ならびにX1がRまたはGであり、X2がAまたはTであり、X3がQまたはEであり、X4がE、N、T、S、A、K、D、G、R、またはQであり、X5がY、またはSであり、X6がAまたはVである、X1X2SX3X4IX5GX6LNのアミノ酸配列を含むCDR-L1(配列番号262)と、X1がAまたはSであり、X2がT、S、E、Q、またはDであり、X3がN、R、A、E、またはHであり、X4がQまたはAであり、X5がSまたはDである、GX1X2X3LX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-L2(配列番号263)と、X1がS、N、D、Q、A、またはEであり、X2がT、I、またはSであり、X3がY、L、またはFであり、X4がD、G、T、E、Q、A、またはYであり、X5がA、T、R、S、K、またはYである、QX1X2X3X4X5PWTのアミノ酸配列を含むCDR-L3(配列番号264)とを含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS(配列番号274)を含むFW-1、配列WVRQAPGQGLEWMG(配列番号275)を含むFW-2、配列RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号276)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号226のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号227のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号245の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号246の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v9の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v9の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号245の配列のCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号246の配列のCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS(配列番号274)を含むFW-1、配列WVRQAPGQGLEWMG(配列番号275)を含むFW-2、配列RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号276)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号232のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号251の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号252の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号251のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号252のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v12の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v12の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号251の配列からのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号252の配列からのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS(配列番号274)を含むFW-1、配列WVRQAPGQGLEWMG(配列番号275)を含むFW-2、配列RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号276)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号232のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号253の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号254の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v13の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v13の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号253の配列からのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号254の配列からのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS(配列番号274)を含むFW-1、配列WVRQAPGQGLEWMG(配列番号275)を含むFW-2、配列RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号276)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、X1がS、D、E、A、またはQであり、X2がA、G、またはTである、X1YX2MSのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号268)と、X1がT、N、S、Q、E、H、R、またはAであり、X2がY、W、F、またはHであり、X3がA、S、Q、E、またはTであり、X4がGまたはEであり、X5がSまたはIであり、X6がAまたはGである、DIX1X2X3GX4X5TX6YADSVKGのアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号269)と、X1がSまたはAであり、X2がN、H、A、D、L、Q、Y、またはRであり、X3がA、N、S、またはGであり、X4がA、V、R、E、またはSであり、X5がDまたはSであり、X6がD、N、Q、E、S、T、またはLであり、X7がL、F、またはMであり、X8がI、Y、またはVである、X1X2X3YX4WX5X6AX7DX8のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号270)とを含むVHドメイン、ならびにRASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、QQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号281)を含むFW-1、配列WVRQAPGKGLEWVS(配列番号282)を含むFW-2、配列RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号283)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号230のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号247の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号248の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v10の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v10の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号247の配列からのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号248の配列からのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号281)を含むFW-1、配列WVRQAPGKGLEWVS(配列番号282)を含むFW-2、配列RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号283)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号230のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号249の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号250の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号249のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号250のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v11の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v11の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号249の配列からのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号250の配列からのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号281)を含むFW-1、配列WVRQAPGKGLEWVS(配列番号282)を含むFW-2、配列RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号283)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号237のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号255の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号256の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v14の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v14の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号255の配列からのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号256の配列からのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号281)を含むFW-1、配列WVRQAPGKGLEWVS(配列番号282)を含むFW-2、配列RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号283)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号237のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列番号257の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/またはVLドメインは、配列番号258の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、抗体xhCD8v15の1、2、または3つの重鎖CDR(例えば、表1~3に示される)及び/または抗体xhCD8v15の1、2、または3つの軽鎖CDR(例えば、表1~3に示される)を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号257の配列からのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号258の配列からのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号281)を含むFW-1、配列WVRQAPGKGLEWVS(配列番号282)を含むFW-2、配列RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号283)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。
抗体可変ドメインのCDR配列に関する複数の定義が当該技術分野において知られている。他に指定がない限り、CDR配列は、Kabatの定義に従って本明細書に記載されている(例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD (1991),vols.1-3を参照)。ただし、他の定義は知られており、使用が意図される。例えば、いくつかの実施形態において、CDR配列は、Chothia(例えば、Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)を参照)の定義に記載される場合がある。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、X1がG、Y、S、またはAであり、X2がT、S、G、R、N、またはHであり、X3がS、T、R、H、Y、G、またはPであり、X4がS、K、G、N、R、D、T、またはGであり、X5がY、L、H、またはFである、GX1X2FX3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号265)と、X1がI、N、またはMであり、X2がG、N、H、S、R、I、またはAであり、X3がA、N、H、S、T、F、またはYであり、X4がA、D、またはGであり、X5がT、E、K、V、Q、またはAである、X1PX2X3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号266)と、X1がDまたはAであり、X2がA、G、E、R、Y、K、N、Q、L、またはFであり、X3がA、L、P、またはYであり、X4がIまたはLであり、X5がR、A、Q、またはSであり、X6がAまたはDであり、X7がD、E、A、またはSである、X1X2X3GX4X5LFX6X7のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号267)とを含むVHドメイン、ならびにX1がRまたはGであり、X2がAまたはTであり、X3がQまたはEであり、X4がE、N、T、S、A、K、D、G、R、またはQであり、X5がYまたはSであり、X6がAまたはVである、X1X2SX3X4IX5GX6LNのアミノ酸配列を含むCDR-L1(配列番号262)と、X1がAまたはSであり、X2がT、S、E、Q、またはDであり、X3がN、R、A、E、またはHであり、X4がQまたはAであり、X5がSまたはDである、GX1X2X3LX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-L2(配列番号263)と、X1がS、N、D、Q、A、またはEであり、X2がT、I、またはSであり、X3がY、L、またはFであり、X4がD、G、T、E、Q、A、またはYであり、X5がA、T、R、S、K、またはYである、QX1X2X3X4X5PWTを含むアミノ酸配列を含むCDR-L3(配列番号264)とを含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS(配列番号278)を含むFW-1、配列AISWVRQAPGQGLEWMGGI(配列番号279)を含むFW-2、配列ANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号280)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号239のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS(配列番号278)を含むFW-1、配列AISWVRQAPGQGLEWMGGI(配列番号279)を含むFW-2、配列ANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号280)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS(配列番号278)を含むFW-1、配列AISWVRQAPGQGLEWMGGI(配列番号279)を含むFW-2、配列ANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号280)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS(配列番号278)を含むFW-1、配列AISWVRQAPGQGLEWMGGI(配列番号279)を含むFW-2、配列ANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(配列番号280)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTLVTVSS(配列番号277)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号289)含むFW-1、配列WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号290)を含むFW-2、配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号291)を含むFW-3、及び/または配列FGGGTKVEIK(配列番号292)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、X1がS、D、E、Q、S、またはAであり、X2がS、D、E、A、またはQである、GFTFX1X2Yのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号271)と、X1がT、N、S、Q、E、H、RまたはAであり、X2がY、W、F、またはHであり、X3がA、S、Q、E、またはTであり、X4がGまたはEであり、X5がSまたはIである、X1X2X3GX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号272)と、X1がSまたはAであり、X2がN、H、A、D、L、Q、Y、またはRであり、X3がA、N、S、またはGであり、X4がA、V、R、E、またはSであり、X5がDまたはSであり、X6がD、N、Q、E、S、T、またはLであり、X7がL、F、またはMであり、X8がI、Y、またはVである、X1X2X3YX4WX5X6AX7DX8のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号273)とを含むVHドメイン、ならびにRASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、QQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号286)を含むFW-1、配列AMSWVRQAPGKGLEWVSDI(配列番号287)を含むFW-2、配列TAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号288)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号241のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号286)を含むFW-1、配列AMSWVRQAPGKGLEWVSDI(配列番号287)を含むFW-2、配列TAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号288)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CD8抗体は、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号244のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインならびに配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、VHドメインは、配列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号286)を含むFW-1、配列AMSWVRQAPGKGLEWVSDI(配列番号287)を含むFW-2、配列TAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号288)を含むFW-3、及び/または配列WGQGTMVTVSS(配列番号284)もしくはWGQGTLVTVSS(配列番号285)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、VLドメインは、配列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号293)を含むFW-1、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号294)を含むFW-2、配列GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(配列番号295)を含むFW-3、及び/または配列FGQGTKVEIK(配列番号296)を含むFW-4をさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示は、表1に列挙されている単一の抗体のCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3配列を含むVHドメインならびに表1に列挙されている単一の抗体のCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3配列を含むVLドメインを含む抗CD8抗体を提供する。例えば、抗CD8抗体は、表1に示される抗体xhCD8v1、xhCD8v1.1、xhCD8v2、xhCD8v3、xhCD8v4、xhCD8v5、xhCD8v6、xhCD8v7、xhCD8v8、xhCD8v9、xhCD8v10、xhCD8v11、xhCD8v12、xhCD8v13、xhCD8v14、xhCD8v15、V9ファミリー、またはV11ファミリーの6つのCDRを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、表2に列挙されている単一の抗体のCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3配列を含むVHドメインならびに表2に列挙されている単一の抗体のCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3配列を含むVLドメインを含む抗CD8抗体を提供する。例えば、抗CD8抗体は、表2に示される抗体xhCD8v1、xhCD8v1.1、xhCD8v2、xhCD8v3、xhCD8v4、xhCD8v5、xhCD8v6、xhCD8v7、xhCD8v8、xhCD8v9、xhCD8v10、xhCD8v11、xhCD8v12、xhCD8v13、xhCD8v14、xhCD8v15、V9ファミリー、またはV11ファミリーの6つのCDRを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、表1に列挙されている単一の抗体のCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3配列を含むVHドメイン、ならびに表1に列挙されている単一の抗体のCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3配列を含むVLドメインを含む抗CD8抗体を含む融合タンパク質を提供する。例えば、融合タンパク質の抗CD8抗体は、表1に示される抗体xhCD8v1、xhCD8v1.1、xhCD8v2、xhCD8v3、xhCD8v4、xhCD8v5、xhCD8v6、xhCD8v7、xhCD8v8、xhCD8v9、xhCD8v10、xhCD8v11、xhCD8v12、xhCD8v13、xhCD8v14、xhCD8v15、V9ファミリー、またはV11ファミリーの6つのCDRを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、表2に列挙されている単一の抗体のCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3配列を含むVHドメイン、ならびに表2に列挙されている単一の抗体のCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3配列を含むVLドメインを含む抗CD8抗体を含む融合タンパク質を提供する。例えば、融合タンパク質の抗CD8抗体は、表2に示される抗体xhCD8v1、xhCD8v1.1、xhCD8v2、xhCD8v3、xhCD8v4、xhCD8v5、xhCD8v6、xhCD8v7、xhCD8v8、xhCD8v9、xhCD8v10、xhCD8v11、xhCD8v12、xhCD8v13、xhCD8v14、xhCD8v15、V9ファミリー、またはV11ファミリーの6つのCDRを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、表3に列挙されているVHドメインのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3配列を含むVHドメイン、ならびに表3に列挙されているVLドメインのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3配列を含むVLドメインを含む抗CD8抗体を提供する(いくつかの実施形態において、VH及びVLドメインは、表3に列挙されている同じ単一の抗体由来である)。例えば、抗CD8抗体は、表3に示される抗体xhCD8v1、xhCD8v1.1、xhCD8v2、xhCD8v3、xhCD8v4、xhCD8v5、xhCD8v6、xhCD8v7、xhCD8v8、xhCD8v9、xhCD8v10、xhCD8v11、xhCD8v12、xhCD8v13、xhCD8v14、またはxhCD8v15のVH及びVLを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、表3に列挙されているVHドメインのCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3配列を含むVHドメイン、ならびに表3に列挙されているVLドメインのCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3配列を含むVLドメインを含む抗CD8抗体を含む融合タンパク質を提供する(いくつかの実施形態において、VH及びVLドメインは、表3に列挙されている同じ単一の抗体由来である)。いくつかの実施形態において、本開示は、表3に列挙されている単一の抗体に関するVHドメイン配列及びVLドメイン配列を含む抗CD8抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、表3に列挙されている単一の抗体に関するVHドメイン配列及びVLドメイン配列を含む抗CD8抗体を含む融合タンパク質を提供する。例えば、融合タンパク質の抗CD8抗体は、表3に示される抗体xhCD8v1、xhCD8v1.1、xhCD8v2、xhCD8v3、xhCD8v4、xhCD8v5、xhCD8v6、xhCD8v7、xhCD8v8、xhCD8v9、xhCD8v10、xhCD8v11、xhCD8v12、xhCD8v13、xhCD8v14、またはxhCD8v15のVH及びVLを含む。
本明細書で開示される抗CD8抗体、または抗原結合ドメイン、または抗体フラグメントのいずれか1つを含む融合タンパク質が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質は、を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、表13に列挙されている単一の融合タンパク質の2つの重鎖配列及び2つの軽鎖配列を含む融合タンパク質を提供し、重鎖配列の一方はIL-10融合物を有し、他方の重鎖配列はIL-10融合物を含まず、2つの軽鎖配列は同一である。いくつかの実施形態において、IL-10融合物を含まない重鎖配列は、C末端にリジンを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、図6に示される形式Fのものである。例えば、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、4つのポリペプチド鎖を含み、(1)第1のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号115のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含む;(2)第1のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号116のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含む;(3)第1のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号119のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含む;(4)第1のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号120のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含む;(5)第1のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号122のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号123のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含む;(6)第1のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号122のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号124のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含む;(7)第1のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号126のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号127のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含む;(8)第1のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号126のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号128のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含む;(9)第1のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号130のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号131のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含む;(10)第1のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号130のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号132のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含む;(11)第1のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号134のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号135のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含む;(12)第1のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号134のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号136のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含む;(13)第1のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号138のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号139のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含む;(14)第1のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号138のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号140のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含む;(15)第1のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号143のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含む;(16)第1のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号144のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含む;(17)第1のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号146のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号147のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含む;(18)第1のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号146のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号148のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含む;(19)第1のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号150のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号151のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含む;(20)第1のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号150のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号152のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含む;(21)第1のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号154のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号155のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含む;(22)第1のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号154のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号156のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含む;(23)第1のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号158のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号159のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含む;または(24)第1のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号158のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号160のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、及び融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド(例えば、単離ポリヌクレオチド)が本明細書でさらに提供される。本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、及び融合タンパク質のいずれかをコードするベクター(例えば、発現ベクター)が本明細書でさらに提供される。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞(例えば、単離宿主細胞または宿主細胞株)が本明細書でさらに提供される。
本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、及び融合タンパク質のいずれかを生成する方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、方法は、本開示の宿主細胞を抗体、抗体フラグメント、または融合タンパク質の生成に適した条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、抗体、抗体フラグメント、または融合タンパク質を回収することをさらに含む。
抗体、抗体フラグメント、及び融合タンパク質は、例えば、下で例示される、組み換え法を使用して生成することができる。いくつかの実施形態において、抗体/融合タンパク質をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングのため、または発現のために、複製可能なベクターに挿入することができる。抗体/融合タンパク質をコードするDNAは、従来の手順を使用して、容易に単離及び配列決定することができる(例えば、抗体/フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブにより)。多くのベクターが当該技術分野において既知である。ベクター構成要素としては、一般に、シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書におけるベクター内のDNAのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。組み換え技術を使用するとき、抗体/融合タンパク質は、細胞内で産生され得るか、細胞膜周辺腔内で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体/フラグメントが細胞内で産生される場合、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかの粒状細片が、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去される。抗体/融合タンパク質が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して最初に濃縮される。
いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質及び1つ以上の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物の一部である。本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の純度を有する活性成分(例えば、融合タンパク質)を1つ以上の任意の薬学的に許容される担体(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。薬学的に許容される担体は、一般にレシピエントに対して、使用される投与量及び濃度で無毒であり、それらとしては、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)、及び/または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質は、凍結乾燥される。
本開示の特定の態様は、がんまたは慢性感染症を処置する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の融合タンパク質または抗体、あるいは融合タンパク質もしくは抗体及び学的に許容される担体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記処置を必要とする患者は、がんと診断されている。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質または組成物は、T細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤(ICI)と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、キナーゼ阻害剤、代謝拮抗薬、細胞毒もしくは細胞***阻害剤、抗ホルモン剤、白金ベースの化学療法剤、メチルトランスフェラーゼ阻害剤、抗体、または抗がんペプチドである。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-L1、PD-1、CTLA-4、CEACAM、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、CD276、VTCN1、HVEM、KIR、A2AR、MHCクラスI、MHCクラスII、GALS、アデノシン、TGFR、OX40、CD137、CD40、CD47、TREM1、TREM2、HLA-G、CCR4、CCR8、CD39、CD73、IDO、CSF1R、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、TIGIT、IDO、MICA/B、LILRB4、SIGLEC-15、またはアルギナーゼを標的とし、以下に限定されないが、PD-1(例えば、抗PD-1抗体)、PD-L1(例えば、抗PD-L1抗体)、またはCTLA-4(例えば、抗CTLA-4抗体)の阻害剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質または組成物は、IL-2ポリペプチド(変異タンパク質もしくはそのバリアントを含む)、またはIL-2ポリペプチド(変異タンパク質もしくはそのバリアントを含む)を含む、以下に限定されない抗体:IL-2融合タンパク質(例えば、抗CD8:IL-2融合タンパク質)などの融合タンパク質と組み合わせて投与される。
抗PD-1抗体の例としては、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ジンベレリマブ(Arcus)、ササンリマブ(Pfizer)、JTX-4014、スパルタリズマブ(PDR001;Novartis)、カムレリズマブ(SHR1210;Jiangsu HengRui Medicine)、シンチリマブ(IBI308;Innovent及びEli Lilly)、チスレリズマブ(BGB-A317)、トリパリマブ(JS 001)、ドスタルリマブ(TSR-042、WBP-285)、INCMGA00012(MGA012)、AMP-224、及びAMP-514(MEDI0680)が挙げられるが、これらに限定されない。抗PD-L1抗体の例としては、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、KN035、及びCK-301(チェックポイント治療薬)が挙げられるが、これらに限定されない。PD-L1阻害剤の例(非抗体ベース)としては、AUNP12、CA-170、及びBMS-986189が挙げられるが、これらに限定されない。抗CTLA-4抗体の例としては、イピリムマブ、トレメリムマブ、BMS-986218、BMS-986249、BMS-986288、HBM4003、ONC-392、KN044、ADG116、ADU-1604、AGEN1181、AGEN1884、MK-1308、及びREGN4659が挙げられるが、これらに限定されない。
T細胞療法の例としては、CD4+またはCD8+ T細胞ベースの療法、養子T細胞療法、キメラ抗原受容体(CAR)ベースのT細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)ベースの療法、自家T細胞療法、同種T細胞療法、及び形質導入TCRを有するT細胞を用いた療法が挙げられるが、これらに限定されない。例示的ながんワクチンとしては、樹状細胞ワクチン、1つ以上のがん抗原をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むワクチン、及び1つ以上のがん抗原ペプチドを含むワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の特定の態様は、例えば、エクスビボで、T細胞を増殖させる方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、1つ以上のT細胞を、例えば、エクスビボで有効量の本開示の抗体または融合タンパク質と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、1つ以上のT細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である。いくつかの実施形態において、方法は、腫瘍または腫瘍試料から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、1つ以上のT細胞を、IL-2ポリペプチド(変異タンパク質もしくはそのバリアントを含む)、またはIL-2ポリペプチド(変異タンパク質もしくはそのバリアントを含む)を含む、以下に限定されない抗体:IL-2融合タンパク質(例えば、抗CD8:IL-2融合タンパク質)などの融合タンパク質と組み合わせて、例えば、エクスビボで有効量の本開示の抗体または融合タンパク質と接触させることを含む。
実施例1:IL-10融合タンパク質の調製及びSTAT3のリン酸化によりSTAT3を活性化するIL-10の能力
材料及び方法
組み換えDNA技術
組み換えDNA操作を含む技術は、Sambrook et al.,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989に以前に記載されている。すべての試薬は、製造業者の指示に従って使用した。DNA配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
材料及び方法
組み換えDNA技術
組み換えDNA操作を含む技術は、Sambrook et al.,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989に以前に記載されている。すべての試薬は、製造業者の指示に従って使用した。DNA配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを適切な鋳型を使用したPCRによって生成するか、または合成オリゴヌクレオチドからGenewiz(South Plainfield、NJ)、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)もしくはGeneScript(Piscataway、NJ)で合成した。Gibson assembly(登録商標)法を使用するか、または制限消化に続くライゲーションを使用して遺伝子セグメントを発現ベクターにクローニングした。DNAを形質転換細菌から精製し、濃度をUV可視分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列を確認するためにDNAシーケンシングを使用した。
所望の遺伝子セグメントを適切な鋳型を使用したPCRによって生成するか、または合成オリゴヌクレオチドからGenewiz(South Plainfield、NJ)、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)もしくはGeneScript(Piscataway、NJ)で合成した。Gibson assembly(登録商標)法を使用するか、または制限消化に続くライゲーションを使用して遺伝子セグメントを発現ベクターにクローニングした。DNAを形質転換細菌から精製し、濃度をUV可視分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列を確認するためにDNAシーケンシングを使用した。
抗体遺伝子の単離
CD8抗原と結合する抗体を、マウス抗体のヒト化またはインビトロファージディスプレイ系のいずれかを使用して生成した。
CD8抗原と結合する抗体を、マウス抗体のヒト化またはインビトロファージディスプレイ系のいずれかを使用して生成した。
ヒト化のために、マウス残基の相補性決定領域(CDR)を、親マウスフレームワークに近い配列類似性及び良好な安定性を示す選択されたヒトフレームワーク(複数可)にグラフトした。得られたCDRグラフト抗体を、さらにヒト化して、あらゆる不要な非ヒト変異を除去した。
インビトロディスプレイ法に関しては、ナイーブB細胞から生成した非免疫性ヒト単鎖Fvファージライブラリーを5から6回パニングして、CD8抗原に対する抗体を単離した。パニング後、ELISAで非特異的抗原よりも標的抗原に対して特異的な結合を示した個々のファージクローンを特定した。続いて、特異的なバインダーの重鎖及び軽鎖VドメインのDNAフラグメントをクローニングし、配列決定した。
抗体構築物のクローニング
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Lefranc et al. IMGT(登録商標),the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)25 years on.Nucleic Acids Res.2015 Jan;43のIMGT(登録商標)(the international ImMunoGeneTics information system(登録商標))に示されている。重鎖及び軽鎖VドメインのDNAフラグメントを、ヒトIgG1及びCKを含む哺乳動物発現ベクターにインフレームで挿入した。
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Lefranc et al. IMGT(登録商標),the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)25 years on.Nucleic Acids Res.2015 Jan;43のIMGT(登録商標)(the international ImMunoGeneTics information system(登録商標))に示されている。重鎖及び軽鎖VドメインのDNAフラグメントを、ヒトIgG1及びCKを含む哺乳動物発現ベクターにインフレームで挿入した。
融合構築物のクローニング
構築物のIL-10部分を、IgG重鎖のC末端とIL-10のN末端の間にグリシン・セリンベースのリンカーを使用して重鎖とインフレームでクローニングした。IgG重鎖のC末端リジン残基を、IL-10部分の融合後に除去した。非対称形状を有する構築物を生成するために、ノブ・イントゥ・ホール改変をFc領域のCH3ドメインに導入し、ヘテロ二量体化を促進した。具体的には、「ホール」ドメインはCH3ドメインにY349C、T366S、L368A及びY407V変異を有するが、「ノブ」ドメインはCH3ドメインにS354C及びT366W変異を有した(EUナンバリング)。FcγR結合/エフェクター機能を止め、FcRの共活性化を防ぐために、変異L234A/L235A/G237A(EUナンバリング)を各IgG重鎖またはFc領域のCH2ドメインに導入した。抗体・IL-10融合構築物の発現は、CMVプロモーターによって駆動され、転写はコード配列の下流に位置する合成ポリAシグナル配列によって終了した。
構築物のIL-10部分を、IgG重鎖のC末端とIL-10のN末端の間にグリシン・セリンベースのリンカーを使用して重鎖とインフレームでクローニングした。IgG重鎖のC末端リジン残基を、IL-10部分の融合後に除去した。非対称形状を有する構築物を生成するために、ノブ・イントゥ・ホール改変をFc領域のCH3ドメインに導入し、ヘテロ二量体化を促進した。具体的には、「ホール」ドメインはCH3ドメインにY349C、T366S、L368A及びY407V変異を有するが、「ノブ」ドメインはCH3ドメインにS354C及びT366W変異を有した(EUナンバリング)。FcγR結合/エフェクター機能を止め、FcRの共活性化を防ぐために、変異L234A/L235A/G237A(EUナンバリング)を各IgG重鎖またはFc領域のCH2ドメインに導入した。抗体・IL-10融合構築物の発現は、CMVプロモーターによって駆動され、転写はコード配列の下流に位置する合成ポリAシグナル配列によって終了した。
IL-10ポリペプチドとの融合タンパク質の精製
実施例で使用したIL-10ポリペプチドとの融合タンパク質をコードする構築物は、ポリエチレンイミン(PEI)を使用して指数関数的に増殖するExpi293細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることによって生成した。上清を培養4~5日後に回収した。IL-10融合構築物は、まずプロテインAマトリクスを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。プロテインAカラムを平衡化し、リン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中で洗浄した。融合構築物を、20mMクエン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、pH3.6で溶出した。溶出画分をプールし、10mM MES、25mM塩化ナトリウム、pH6に透析した。タンパク質を、イオン交換クロマトグラフ(Mono-S、GE Healthcare)を使用してさらに精製して、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を精製した。タンパク質を充填後、カラムを10mM MES、25mM塩化ナトリウム、pH6で洗浄した。次に、タンパク質を10mM MES、pH6バッファー中で25mMから500mMまで塩化ナトリウムの濃度勾配を増加させて溶出した。ヘテロ二量体と対応する主な溶離液ピークを回収し、濃縮した。次いで、精製タンパク質を、PBS中でサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200、GE Healthcare)によって精製した。
実施例で使用したIL-10ポリペプチドとの融合タンパク質をコードする構築物は、ポリエチレンイミン(PEI)を使用して指数関数的に増殖するExpi293細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることによって生成した。上清を培養4~5日後に回収した。IL-10融合構築物は、まずプロテインAマトリクスを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。プロテインAカラムを平衡化し、リン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中で洗浄した。融合構築物を、20mMクエン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、pH3.6で溶出した。溶出画分をプールし、10mM MES、25mM塩化ナトリウム、pH6に透析した。タンパク質を、イオン交換クロマトグラフ(Mono-S、GE Healthcare)を使用してさらに精製して、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を精製した。タンパク質を充填後、カラムを10mM MES、25mM塩化ナトリウム、pH6で洗浄した。次に、タンパク質を10mM MES、pH6バッファー中で25mMから500mMまで塩化ナトリウムの濃度勾配を増加させて溶出した。ヘテロ二量体と対応する主な溶離液ピークを回収し、濃縮した。次いで、精製タンパク質を、PBS中でサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200、GE Healthcare)によって精製した。
アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用して280nmで吸光度(OD)を測定することによって精製IL-10融合構築物のタンパク質濃度を求めた。融合構築物の純度、完全性及び単量体状態を、還元剤(5mM 1,4-ジチオスレイトール)の存在下及び非存在下においてSDS-PAGEによって分析し、クマシーブルー(SimpleBlue(商標)SafeStain、Invitrogen)で染色した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の指示に従って使用した(4~20%トリスグリシンゲルまたは3~12%ビストリス)。イムノコンジュゲートサンプルの凝集体含有量を、Superdex200 10/300GL分析的サイズ排除カラム(GE Healthcare)を使用して分析した。
表面プラズモン共鳴(SPR)によるCD8、IL-10RA及びIL-10RBに関する結合親和性測定
ヒト及びカニクイザルCD8、IL-10RA及びIL-10RBに対するIL-10融合タンパク質の動態速度定数(kon及びkoff)ならびに親和性(KD)を、37℃でBIAcore(登録商標)T200(Cytiva)を使用した表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。簡単にいえば、ヒト及びカニクイザルCD8に対する親和性を測定するために、Human Antibody Capture Kit(Cytiva)を使用して作製した共有結合で固定された抗ヒトFc捕捉抗体によってFcを介して抗体または融合タンパク質をCM4センサーチップ上に捕捉した。リファレンス表面として働くフローセル1上にはタンパク質は捕捉されなかった。KDの0.1×から10×に及ぶ4つ以上の濃度でHBS-EP+緩衝液中に希釈した可溶性抗原を、抗体/融合タンパク質を捕捉した表面上に1~2分間流した。解離を5~10分間監視し、それぞれ次のサイクルで抗体/融合タンパク質を再捕捉する前に抗hIgG-Fc表面を3M MgCl2で再生した。マストランスポートモデルとともに1:1ラングミュアを使用してBiacore(登録商標)Evaluation Softwareバージョン3.2によって結合データを分析した。
ヒト及びカニクイザルCD8、IL-10RA及びIL-10RBに対するIL-10融合タンパク質の動態速度定数(kon及びkoff)ならびに親和性(KD)を、37℃でBIAcore(登録商標)T200(Cytiva)を使用した表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。簡単にいえば、ヒト及びカニクイザルCD8に対する親和性を測定するために、Human Antibody Capture Kit(Cytiva)を使用して作製した共有結合で固定された抗ヒトFc捕捉抗体によってFcを介して抗体または融合タンパク質をCM4センサーチップ上に捕捉した。リファレンス表面として働くフローセル1上にはタンパク質は捕捉されなかった。KDの0.1×から10×に及ぶ4つ以上の濃度でHBS-EP+緩衝液中に希釈した可溶性抗原を、抗体/融合タンパク質を捕捉した表面上に1~2分間流した。解離を5~10分間監視し、それぞれ次のサイクルで抗体/融合タンパク質を再捕捉する前に抗hIgG-Fc表面を3M MgCl2で再生した。マストランスポートモデルとともに1:1ラングミュアを使用してBiacore(登録商標)Evaluation Softwareバージョン3.2によって結合データを分析した。
IL-10RAとの親和性を測定するために、共有結合で固定された抗ヒトFc抗体によってFcを介して抗体または融合タンパク質をCM4センサーチップ上に捕捉した(Southern Biotech、カタログ番号2081-01)。リファレンス表面として働くフローセル1上にはタンパク質は捕捉されなかった。1g/LのBSAを加えたHBS-P+緩衝液中に8、40、200、1000、及び5000nMの濃度で希釈した社内で生成したヒトIL-10RA ECD、または緩衝液を、融合タンパク質を捕捉した表面上に30μL/分で2分間流した。解離を4~5分間監視し、分析サイクル間に75mMリン酸の30秒間の3回の注入により抗hIgG-Fc表面を再生した。マストランスポートモデルとともに1:1ラングミュアを使用してBiacore(登録商標)Evaluation Softwareバージョン3.2または定常状態親和性分析によって結合データを分析した。
IL-10RBとの結合を測定するために、製造業者の指示に従いCAPセンサーチップ(Cytiva)上にまず固定したbiotin CAPture試薬(Cytiva)を有するチップ上に社内で生成したビオチン化ヒトIL-10RAを捕捉した。表面を20μMのアミン-PEG2-ビオチン(ThermoFisher Scientific)で60秒間ブロックした後、IL-10融合タンパク質を10μL/分で3分間注入した。リファレンス表面として働くフローセル1にはIL-10融合タンパク質は捕捉されなかった。1g/LのBSAを加えたHBS-EP+緩衝液中に0.2、1、5、10、及び20μMの濃度で希釈した社内で生成したヒトIL-10RB ECD、または緩衝液を分析物として30μL/分で2分間流し、4分間解離させた。分析サイクル間に3部の8Mグアニジン-HClと1部の1M NaOHの混合物の2分間の注入によりCAPセンサーチップ表面を再生した。センサーグラムをダブルリファレンスした。結合をランク付けするために、IL-10融合タンパク質の捕捉応答単位を正規化した後、IL-10RBの結合応答単位を、最高濃度で結合ステップの終了の5秒前にBiacore Evaluation Softwareバージョン3.2を使用して記録した。
初代ヒト細胞におけるSTAT3リン酸化アッセイ
ヒトPBMCまたはヒト全血におけるフローサイトメトリーによってSTAT3のリン酸化を測定するアッセイにおいて、様々な免疫細胞サブセットを活性化するIL-10の能力を測定した。
ヒトPBMCまたはヒト全血におけるフローサイトメトリーによってSTAT3のリン酸化を測定するアッセイにおいて、様々な免疫細胞サブセットを活性化するIL-10の能力を測定した。
Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)を使用して健康なドナーの血液からPBMCを単離し、製造業者の指示に従ってACK溶解緩衝液(Gibco)を使用して赤血球を溶解させた。一般に、PBMCを無血清RPMI1640培地に20×106細胞/mlで再懸濁させ、96ウェルU底プレート(各ウェル当たり50μl)に等分した。IL-10融合タンパク質及び対照タンパク質、例えば、野生型IL-10二量体及び対照融合タンパク質を所望の濃度に希釈し、ウェルに添加した(2×刺激として50μl添加した)。インキュベーションは、一般に37℃で30分行った。CD8抗体、例えば、CD8aで染色するために(SK1、Biolegend;RPA-T8、Biolegend)、抗体をウェルに直接加え、氷上で10分間インキュベートした。染色は、100μlの氷冷8%PFA(4%最終)により氷上で10分間停止させた。細胞を洗浄緩衝液(PBS中の2%FBS)で3回洗浄した。製造業者の手順に従って予め冷却した100mlのPhosflow Perm緩衝液III(BD Biosciences)中で細胞を透過処理し、-20℃で一晩保存した。翌日、細胞を洗浄緩衝液で2回洗浄し、CD3(UCHT1、BD Biosciences)、CD4(RPA-T4、Biolegend)、CD14(M5E2、Biolegend)、CD25(M-A251、Biolegend)、CD56(HCD56、Biolegend)及び/またはパーフォリン(クローンδG9、BD Biosciences)、Foxp3(259D、Biolegend)、pSTAT3[pY705](クローン4、BD Biosciences)に対する抗体により4℃で30~45分間染色した。その後、細胞をフローサイトメーターで分析した。データはpSTAT3陽性パーセントとして、ある場合にはpSTAT3 平均蛍光強度(MFI)として表し、GraphPad Prismにインポートした。
ヒト全血におけるアッセイのために、1mLの96ウェルディーププレートウェルにおいて各ウェルあたり90μLのヒト血液を使用し、37℃で10分間予熱した。IL-10融合タンパク質及び対照タンパク質、例えば、野生型IL-10二量体及び対照融合タンパク質を調製し、10倍の強度で37℃に予熱した。10μLの予熱した10×刺激を各ウェルに加えて、1×刺激濃度で100μLの総体積にした。インキュベーションは、一般に37℃で25分行った。プレフィックス抗体染色カクテルを添加することによって刺激をクエンチして、短時間ボルテックスし、暗所において氷上で10分間インキュベートした。プレフィックス染色カクテルは、TruStain FcX(Biolgened)ならびに、CD4(RPA-T4、Biolegend)、CD19(HIB19、BD)、CD56(NCAM16.2、BD)、CD16(3G8、Biolegend)、及びCD8(SK1、Biolegend)に対する抗体を含むものであった。900μLの予熱したLyse Fix(BD)をサンプルウェルに添加し、37℃で10分間インキュベートした。PBS+0.5%ウシ血清アルブミン及び2mM EDTAを含む予め冷却した洗浄緩衝液中で細胞を洗浄した。予め冷却したPerm Buffer III(BD)を添加し、-20℃で60分間インキュベートした後、洗浄緩衝液中で2回洗浄し、TFP Perm/Wash(BD)中で1回洗浄した。CD3(UCHT、BD)、CD14(MΦP9、BD)、CD11c(B-ly6、BD)、HLADR(L243、Biolegend)、及びpSTAT3 pY705(4/P-STAT3、BD)に対する抗体を含むTFP Perm/Wash中で調製された25μLの「メタノール後」染色カクテルに細胞を再懸濁させた。細胞を暗所において4℃で30分間インキュベートした後、TFP Perm/Wash緩衝液中で洗浄し、続いて、100μLの4%PFA中において室温で10分間固定した。細胞を洗浄緩衝液中で2回洗浄し、フローサイトメーターにおいて分析した。データはpSTAT3陽性パーセントとして表し、GraphPad Prismにインポートした。
ELISAによる多反応性評価
候補融合タンパク質の多反応性を評価するために、ELISAアッセイを使用して、無関係の抗原のパネルとの結合について調べた。抗原として以下のものを使用し、これらは、Sigmaから購入した:dsDNAサケ***、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、リポ多糖、インスリン、及びヘパリンビオチンナトリウム塩。
候補融合タンパク質の多反応性を評価するために、ELISAアッセイを使用して、無関係の抗原のパネルとの結合について調べた。抗原として以下のものを使用し、これらは、Sigmaから購入した:dsDNAサケ***、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、リポ多糖、インスリン、及びヘパリンビオチンナトリウム塩。
抗原をPBS中で0.3~10μg/mLに及ぶ濃度に希釈し、各ウェル当たり25μLの容量で384ウェルNunc MaxiSorpプレート(Thermo Fisher Scientific)にコーティングした。抗原なし対照として、25μLのPBSのみを使用した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。抗原を除去し、プレートをmilli-Q水(Millipore)で洗浄した。ウェルを0.05%Tween(登録商標)及び1mM EDTA(アッセイ緩衝液)を加えたPBSで満たした後、室温で1時間インキュベートした。アッセイ緩衝液を除去し、ウェルをmilli-Q水で洗浄した。アッセイ緩衝液中に希釈した10μg/mLの融合タンパク質または多反応性に関する陽性対照であるボコシズマブを25μL添加し、室温で1時間インキュベートした。サンプルを除去し、プレートをmilli-Q水で洗浄した。25μlの検出抗体、1:25000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch)を添加し、室温で1時間インキュベートした。試薬を除去し、ウェルをmilli-Q水で洗浄した。25μLのKPL SureBlue TMB Microwell Substrate(SeraCare)を使用して5~7分間ウェルを発色させ、25μLの0.1M HClでクエンチした。450nmにおける吸光度をSpectraMax iD5プレートリーダー(Molecular Devices)において記録し、抗原なし対照ウェルに対して正規化した。
結果
単球及びCD8+ T細胞においてSTAT3を活性化する野生型IL-10二量体の能力を図5A及び5Bに示す。2人の健康なドナーのPBMCを使用し、代表的なデータを図5Aに示す。2人の異なる健康なドナーの全血を使用し、代表的なデータを図5Bに示す。各細胞種における活性化の程度及び活性化のEC50は、両アッセイにわたり同等である。両アッセイにおいて、単球(CD14+CD3-としてゲート)が、IL-10に対してCD8+ T細胞よりも感受性が高いことがわかった。
単球及びCD8+ T細胞においてSTAT3を活性化する野生型IL-10二量体の能力を図5A及び5Bに示す。2人の健康なドナーのPBMCを使用し、代表的なデータを図5Aに示す。2人の異なる健康なドナーの全血を使用し、代表的なデータを図5Bに示す。各細胞種における活性化の程度及び活性化のEC50は、両アッセイにわたり同等である。両アッセイにおいて、単球(CD14+CD3-としてゲート)が、IL-10に対してCD8+ T細胞よりも感受性が高いことがわかった。
実施例2:IL-10二量体を含む融合タンパク質によるCD8+ T細胞におけるSTAT3の優先的活性化
CD8抗体及びIL-10二量体ポリペプチドを含む融合タンパク質を、5つの二量体形式(図6に示されるA、B、C、D及びE)のうちの1つで作製した。
CD8抗体及びIL-10二量体ポリペプチドを含む融合タンパク質を、5つの二量体形式(図6に示されるA、B、C、D及びE)のうちの1つで作製した。
形式AのIL-10融合タンパク質によるhPBMCにおけるSTAT3活性化の選択性及び効力を図7に示す。試験した融合タンパク質には、野生型IL-10ポリペプチド及びマウスCD8を標的とする対照抗体を含む形式AのxmCD8a-IL10wt(図7A)、ならびに野生型IL-10ポリペプチド及びヒトCD8を標的とする抗体を含む形式AのxhCD8a-IL10wt (図7B)が含まれた。抗体xmCD8aは以前に公開された抗マウスCD8抗体(2.43クローン)であり、xhCD8aは以前に公開された抗ヒトCD8抗体(OKT8)であった。ヒトPBMCにおけるSTAT3活性化は、実施例1に記載されているとおりに測定した。ヒトCD8と特異的に結合する抗体を含む形式AのIL-10融合タンパク質xhCD8a-IL10wtは、単球よりもCD8+ T細胞を優先的に活性化したが、対照抗体を含む形式AのIL-10融合タンパク質であるxmCD8a-IL10wtは、単球を優先的に活性化した。
形式CのIL-10融合タンパク質xmCD8a-IL10wt及びxhCD8a-IL10wtを作製し、ヒトPBMCにおいてSTAT3を活性化する能力を評価した。形式CのxmCD8a-IL10wtに関する結果を図8Aに、形式CのxhCD8a-IL10wtに関する結果を図8Bに示す。形式Cの融合タンパク質xmCD8a-IL10wtの効力は、形式AのxmCD8a-IL10wtの約10分の1であり(図7Aと図8Aを比較)、これは、ヒトFcのN末端におけるIL-10の融合が、IL-10がヒトFcのC末端で融合された場合のものと比較して、活性を低下させたことを示唆する。さらに、低濃度(最大0.01nM)を除いて、形式Cは、ヒトCD8と結合する抗体を含むIL-10融合タンパク質に最適ではなかった。高濃度の形式CのxhCD8a-IL10wtは、CD8+ T細胞において完全にはSTAT3を活性化せず、単球よりもCD8+ T細胞を優先的に活性化しなかった(図8B)。
形式DのIL-10融合タンパク質によるhPBMCにおけるSTAT3活性化の選択性及び効力を図9に示す。形式DのxmCD8a-IL10wtに関する結果を図9Aに、形式DのxhCD8a-IL10wtに関する結果を図9Bに示す。ヒトCD8と特異的に結合する抗体を含む形式DのIL-10融合タンパク質xhCD8a-IL10wtは、単球よりもCD8+ T細胞を優先的に活性化したが、対照抗体を含む形式DのIL-10融合タンパク質であるxmCD8a-IL10wtは、単球を優先的に活性化した。
実施例3:IL-10単量体を含む融合タンパク質によるCD8+ T細胞におけるSTAT3の優先的活性化
CD8抗体及びIL-10単量体ポリペプチドを含む融合タンパク質を、図6に示される形式Fに従って作製した。融合タンパク質の一部として構築されたIL-10単量体ポリペプチドのアミノ酸配列を、IL10monoと呼ぶ無改変の単量体IL-10ポリペプチドの場合は図1Dに示し、または変異単量体IL-10ポリペプチドの場合は上記の表4Aに示す。IL10mono_RBenhは、以前に示された変異単量体IL-10ポリペプチドである(Gorby et al.Sci Signal.2020 Sep15;13(649):eabc0653)。それは、IL10monoバックグラウンドにアミノ酸置換N18I、N92I、K99N及びF111Lを含み、IL-10RBに対する結合親和性が増加している。IL10mono_RBenh2は、IL10monoバックグラウンドに単一のアミノ酸置換N92Iを含む変異単量体IL-10ポリペプチドである。
CD8抗体及びIL-10単量体ポリペプチドを含む融合タンパク質を、図6に示される形式Fに従って作製した。融合タンパク質の一部として構築されたIL-10単量体ポリペプチドのアミノ酸配列を、IL10monoと呼ぶ無改変の単量体IL-10ポリペプチドの場合は図1Dに示し、または変異単量体IL-10ポリペプチドの場合は上記の表4Aに示す。IL10mono_RBenhは、以前に示された変異単量体IL-10ポリペプチドである(Gorby et al.Sci Signal.2020 Sep15;13(649):eabc0653)。それは、IL10monoバックグラウンドにアミノ酸置換N18I、N92I、K99N及びF111Lを含み、IL-10RBに対する結合親和性が増加している。IL10mono_RBenh2は、IL10monoバックグラウンドに単一のアミノ酸置換N92Iを含む変異単量体IL-10ポリペプチドである。
IL-10単量体融合タンパク質によるhPBMCにおけるSTAT3活性化の選択性及び効力を図10A~10Cに示す。試験した融合タンパク質には、上記のIL10monoポリペプチド及びヒトCD8を標的とする抗体を含む形式FのxhCD8b-IL10mono(図10A);上記のIL10mono_RBenh変異単量体IL-10ポリペプチド及びヒトCD8を標的とする抗体を含む形式FのxhCD8b-IL10mono_RBenh(図10B);ならびに、上記のIL10mono_RBenh2変異単量体IL-10ポリペプチド及びヒトCD8を標的とする抗体を含む形式FのxhCD8b-IL10mono_RBenh2(図10C)が含まれた。抗体xhCD8bは、ヒトCD8bに対して特異性を有する抗体であった。ヒトPBMCにおけるSTAT3活性化を実施例2に記載されているとおりに測定した。
融合タンパク質xhCD8b-IL10monoは、1nM以下の濃度で単球及びCD4+ T細胞よりもCD8+ T細胞を優先的に活性化したが、活性化の程度は比較的低かった(図10A)。ヒトCD8と特異的に結合する抗体を含む、IL-10RB親和性を増強させた変異単量体融合タンパク質xhCD8b-IL10mono_RBenhも、単球及びCD4+ T細胞よりもCD8+ T細胞を優先的に活性化した(図10B)。単球/CD4 T細胞に対するCD8+ T細胞のxhCD8b-IL10mono_RBenhによる活性化効力の差は、単球/CD4 T細胞に対するCD8+ T細胞のxhCD8b-IL10monoによる活性化効力の差よりも著しく高かった。さらに、xhCD8b-IL10mono_RBenhによるCD8+ T細胞の活性化の効力は、xhCD8b-IL10monoによるものよりもはるかに高く、野生型二量体IL-10の融合タンパク質のものと同等であった。これは、IL-10RBに対する結合親和性の増加が、CD8+ T細胞の活性化の効力ならびに単球及びCD4+ T細胞に対するCD8+ T細胞の活性化の選択性の両方に対して無改変のIL-10RBよりも好ましいことを示す。IL10monoバックグラウンドに単一のN92I置換のみを含む融合タンパク質xhCD8b-IL10mono_RBenh2も、効力の増加ならびに単球及びCD4+ T細胞に対するCD8+ T細胞の選択的な活性化を示した(図10C)。
実施例4:IL-10RAに対する結合親和性の減弱
実施例3及び図10に示されるとおり、IL-10RBとの結合の増強は、単量体IL-10によるSTAT3活性化を増強させることができた。この目的のために、IL-10RB結合を増強させると考えられるIL-10monoバックグラウンドに対する変異を、IL-10及びその受容体の既存の構造(例えば、PDB ID:1J7V、6X93、3LQM)ならびに類似のサイトカイン/受容体複合体に対するホモロジーモデリング(例えば、PDB ID:5T5W、4DOH、1Y6K)の組み合わせを使用して特定した。評価した代表的な変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列を表5に示す。
実施例3及び図10に示されるとおり、IL-10RBとの結合の増強は、単量体IL-10によるSTAT3活性化を増強させることができた。この目的のために、IL-10RB結合を増強させると考えられるIL-10monoバックグラウンドに対する変異を、IL-10及びその受容体の既存の構造(例えば、PDB ID:1J7V、6X93、3LQM)ならびに類似のサイトカイン/受容体複合体に対するホモロジーモデリング(例えば、PDB ID:5T5W、4DOH、1Y6K)の組み合わせを使用して特定した。評価した代表的な変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列を表5に示す。
IL-10RB増強IL-10単量体のパネルとxhCD8b抗体の融合タンパク質、IL10mono_RBenh3からIL10mono_RBenh20によるhPBMCにおけるSTAT3活性化を図11Aから11Dに示す。すべての融合タンパク質を形式Fで構築し、ヒトPBMCにおけるSTAT3活性化は、実施例1に記載されているとおりに測定した。IL10mono_RBenh3からIL10mono_RBenh13の融合タンパク質のSTAT3活性化を、CD8 T細胞に関しては図11Aに、単球に関しては図11Bに示す。IL10mono_RBenh14からIL10mono_RBenh20の融合タンパク質のSTAT3活性化をCD8 T細胞に関しては図11Cに、単球に関しては図11Dに示す。すべての図において、STAT3活性化は、xhCDb-IL10mono_RBenh2のものと比較している。このパネルから、CD8b-IL10mono_RBenh3からCD8b-IL10mono_RBenh13、ならびにCD8b-IL10mono_RBenh17からCD8b-IL10mono_RBenh20のすべての融合物は、xCD8b-IL10monoと比較して、CD8 T細胞における増強されたSTAT3活性化及び単球よりもCD8 T細胞選択性を示した。また、IL10mono_RBenh3、IL10mono_RBenh4、IL10mono_RBenh6、IL10mono_RBenh7、IL10mono_RBenh8、IL10mono_RBenh18、及びIL10mono_RBenh19の融合タンパク質は、IL10mono_RBenh2融合タンパク質と同等のSTAT3活性化の効力及びCD8選択性を示す。
IL-10RB増強に対して予想されるさらなる変異を実施例1に記載されているとおりに構築し、BIAcoreベースのアッセイを使用してスクリーニングした。IL-10RBに対する結合親和性が低いため、厳密な動態を特定することはできなかった。代わりに、IL10mono変異タンパク質のIL-10RBに対する相対的な結合親和性をランク付けするために、20μM IL-10RBに対する結合応答を測定し、IL10mono融合タンパク質の捕捉レベルに対して正規化した。IL10mono_RBenh21からIL10mono_RBenh60の融合タンパク質に関する正規化したIL-10RBに対する結合応答を、いくつかの対照とともに表6に示す。特に、IL10mono_RBenh38、IL10mono_RBenh40、及びIL10mono_RBenh60は、IL10monoよりも増強した結合を示す。
BIAcoreベースのスクリーニングによって特定した選択された融合タンパク質に関してヒト全血におけるSTAT3活性化を評価した。STAT3活性化をCD8 T細胞に関しては図11Eに、単球に関しては図11Fに示す。ここで、IL10mono_RBenh38の融合タンパク質は、CD8 T細胞においてSTAT3活性化を示し、これは、IL10mono_RBenh2のものよりわずかに低いが、類似している。
実施例5:IL-10RAに対する結合親和性の減弱
実施例3に示されるとおり、CD8抗体及びIL-10単量体ポリペプチドを含む融合タンパク質は、単球及びCD4+ T細胞よりもCD8+ T細胞を選択的に活性化した。非特異的な細胞に対する活性をさらに低下させるために、IL-10RB増強ポリペプチド、IL10mono_RBenhまたはIL10mono_RBenh2のバックグラウンドに対してIL-10RAに対する結合親和性を低下させるためのアミノ酸置換のパネルを設計した。評価した代表的な変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸置換及びアミノ酸配列を表4Aに示す。これらの構築物のIL-10RAに対する結合親和性を実施例1に記載されているとおりにBIAcoreによって測定し、これらのデータの概要を表7に示す。あらゆる場合において、IL-10ポリペプチドは、列2に明記される抗体結合ドメイン及び図6に示される概略図に基づいて、括弧内に示される形式を有する融合タンパク質として表される。結合のKdを列3に列挙し、ここで、「ND」は、結合は検出されたが、親和性が低すぎて、Kdの確実な計算ができなかったことを示す。「NT」は、変異タンパク質がBIAcoreによって評価されなかったことを示す。
実施例3に示されるとおり、CD8抗体及びIL-10単量体ポリペプチドを含む融合タンパク質は、単球及びCD4+ T細胞よりもCD8+ T細胞を選択的に活性化した。非特異的な細胞に対する活性をさらに低下させるために、IL-10RB増強ポリペプチド、IL10mono_RBenhまたはIL10mono_RBenh2のバックグラウンドに対してIL-10RAに対する結合親和性を低下させるためのアミノ酸置換のパネルを設計した。評価した代表的な変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸置換及びアミノ酸配列を表4Aに示す。これらの構築物のIL-10RAに対する結合親和性を実施例1に記載されているとおりにBIAcoreによって測定し、これらのデータの概要を表7に示す。あらゆる場合において、IL-10ポリペプチドは、列2に明記される抗体結合ドメイン及び図6に示される概略図に基づいて、括弧内に示される形式を有する融合タンパク質として表される。結合のKdを列3に列挙し、ここで、「ND」は、結合は検出されたが、親和性が低すぎて、Kdの確実な計算ができなかったことを示す。「NT」は、変異タンパク質がBIAcoreによって評価されなかったことを示す。
すべての場合において、変異は、IL-10ポリペプチドの結合親和性を低下させ、このことは、単球及び他の非特異的な細胞種に対する活性を低下させるのにこれらのアミノ酸置換が有用であることを示す。
IL10mono_RBenhまたはIL10mono_RBenh2のいずれかのバックグラウンドにおけるIL-10RA減弱構築物のパネルに対するxhCD8b抗体の融合タンパク質によるhPBMCにおけるSTAT3活性化の選択性及び効力を図12Aから12Fに示す。すべての融合タンパク質を形式Fで構築し、ヒトPBMC中のSTAT3活性化は、実施例1に記載されているとおりに測定した。図12A及び12Bは、それぞれ、IL-10RAとの結合が十分に減弱されていない融合タンパク質のCD8 T細胞及び単球におけるSTAT3活性化を示す。図12Bに示されるとおり、単球に対する活性はほとんど変化しないままである。図12C、12D、12E及び12Fは、それぞれ、IL-10RAとの結合が様々な程度に減弱された融合タンパク質のCD8 T細胞及び単球におけるSTAT3活性化を示す。図12D及び12Fの結果は、単球における効力の低下がIL10mono_RBenh_m10に関する約2分の1の減弱からIL10mono_RBenh_m11に関する100分の1以下の減弱に及ぶことを示す。いかなるIL-10RA変異も含まないIL-10mono_RBenhと比較して、同様のレベルの効力の低下が、これらのIL-10RA変異タンパク質のそれぞれに対して単球及びCD8 T細胞の両方で確認された。選択された融合物のIL-10RAに対する親和性も表7に報告する。
これらの結果に基づいて、選択されたIL-10RA-減弱変異を、様々なIL-10RB-増強変異と組み合わせ、ヒト全血においてSTAT3アッセイで評価した。評価した代表的な変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列を表8に示す。図12G及び12Hは、それぞれ、これらの代表的な融合タンパク質のCD8 T細胞及び単球におけるSTAT3活性化を示す。試験したすべての構築物において、単球よりもCD8 T細胞の活性化の選択性が存在し、IL10mono_RBenh2_m10またはIL10mono_RBenh7_m10の融合タンパク質でより高い効力及び選択性が確認されている。
実施例6:IL-10RAに対する結合親和性が減弱された構築物のさらなるスクリーニング
IL-10RA結合を減弱することが予想される変異を設計し、IL10mono_RBenh6バックグラウンドに組み込んだ。評価した代表的な変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列を表9に示す。
IL-10RA結合を減弱することが予想される変異を設計し、IL10mono_RBenh6バックグラウンドに組み込んだ。評価した代表的な変異単量体IL-10ポリペプチドのアミノ酸配列を表9に示す。
IL-10RAに対する結合親和性を減弱する変異タンパク質のスクリーニングを、実施例1に記載されているとおりにBIAcoreによって実施した。親和性データを表10に示す。IL-10RAとの結合が弱いか、または検出できない構築物を、プロテインGとの結合に関して、ならびに分解タンパク質の可能性を除外するために、SDS-PAGEによって完全性に関して評価した。「ND」は、結合は検出されたが、親和性が低すぎてKdの確実な計算ができなかったことを示す。「NB」は、緩衝液のみの対照を超える結合が検出されなかったことを示す。
実施例7:IL-10上のグリコサミノグリカン結合部位の除去
IL-10は、IL-10に対する最も強力なバインダーとしてヘパリンを含む、グリコサミノグリカンと結合することが示されている正電荷パッチを含む(Kunze et al.J Biol Chem,2016)。IL-10のこの特性は、IL-10の機能を調節するのに役立つと推測されるが、曝露の減少によりIL-10の治療効果を制限する可能性もある。R107は、特にグリコサミノグリカンと相互作用する最も重要な残基と特定されており、分子モデリングに基づくと、他の残基ではR107の喪失を補うことができない(Gehrcke et al.J Mol Graph Model,2015)。
IL-10は、IL-10に対する最も強力なバインダーとしてヘパリンを含む、グリコサミノグリカンと結合することが示されている正電荷パッチを含む(Kunze et al.J Biol Chem,2016)。IL-10のこの特性は、IL-10の機能を調節するのに役立つと推測されるが、曝露の減少によりIL-10の治療効果を制限する可能性もある。R107は、特にグリコサミノグリカンと相互作用する最も重要な残基と特定されており、分子モデリングに基づくと、他の残基ではR107の喪失を補うことができない(Gehrcke et al.J Mol Graph Model,2015)。
m117と呼ばれるR107Aの変異をIL10mono_RBenh2バックグラウンドに形式FのxhCD8b抗体との融合物として組み込み、ヒト全血においてSTAT3アッセイで試験した。この構築物の配列を表11に示す。CD8 T細胞及び単球に関するSTAT3活性化データを、それぞれ図13A及び13Bに示す。CD8 T細胞及び単球の両方に対するSTAT3活性化は、IL10mono_RBenh2とIL10mono_RBenh2_m117の間で同等であり、これは、m117変異の追加が活性に大きな影響を及ぼさないことを示す。
無関係のタンパク質のパネルとの結合を測定する多反応性ELISAアッセイの結果を表12に示す。ポリ反応性であることが示されているボコシズマブも陽性対照として含まれる。IL10mono_RBenh2をIL10mono_RBenh2_m117と比較すると、多くの無関係の標的との非特異的な結合が減少している。これはヘパリンに関しても同様である。要するに、これは、m117の導入が非特異的な無関係のタンパク質との反応性を低下させ、その結果として曝露の改善につながる可能性があることを示す。
Claims (80)
- 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、変異IL-10ポリペプチドであって、前記1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18、N21、M22、R24、D25、D28、S31、R32、D55、M68、I69、L73、E74、M77、P78、Q79、E81、N82、K88、A89、H90、N92、S93、G95、E96、N97、K99、T100、L101、L103、R104、R107、R110及びF111からなる群から選択される位置(複数可)にある、前記変異IL-10ポリペプチド。
- 前記1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18、D28、N92、K99、及びL103からなる群から選択される位置(複数可)にある、請求項1に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、N18F、N18L、N18Y、D28Q、D28R、N92F、N92H、N92I、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、N92Y、K99N、L103N、及びL103Qからなる群から選択される、請求項2に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-10RBポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号3のアミノ酸配列を含む前記IL-10RBポリペプチドに対して増加した結合親和性を示す、請求項1~3のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記配列番号3のアミノ酸配列を含む前記IL-10RBポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号3のアミノ酸配列を含む前記IL-10RBポリペプチドに対して50%以上増加した結合親和性を示す、請求項4に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記配列番号3のアミノ酸配列を含む前記IL-10RBポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号3のアミノ酸配列を含む前記IL-10RBポリペプチドに対して150%以上増加した結合親和性を示す、請求項4に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含み、前記1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158からなる群から選択される位置(複数可)にある、請求項1~6のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含み、前記1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、R24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151からなる群から選択される位置(複数可)にある、請求項7に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34R、K34Q、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38H、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38N、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、D44A、D44E、D44S、D44V、D44G、D44H、D44I、D44K、D44P、D44L、D44N、D44F、D44T、D44R、D44Q、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148G、N148P、N148S、N148D、N148T、N148K、N148V、N148I、N148E、N148F、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される、請求項8に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記1つ以上のさらなるアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148P、N148D、N148I、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される、請求項9に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、配列番号87~89、188~201、及び310~318からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して1つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異IL-10ポリペプチドであって、前記1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号1に従うナンバリングで、P20、L23、R24、R27、D28、K34、T35、Q38、M39、D41、L43、D44、N45、L46、K49、I87、V91、L94、L98、K138、S141、E142、D144、N148、E151、及びI158からなる群から選択される位置(複数可)にある、前記変異IL-10ポリペプチド。
- 前記1つ以上のアミノ酸置換は、R24、R27、K34、Q38、D44、I87、K138、E142、D144、N148、及びE151からなる群から選択される位置(複数可)にある、請求項12に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34R、K34Q、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38H、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38N、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、D44A、D44E、D44S、D44V、D44G、D44H、D44I、D44K、D44P、D44L、D44N、D44F、D44T、D44R、D44Q、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148G、N148P、N148S、N148D、N148T、N148K、N148V、N148I、N148E、N148F、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される、請求項13に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記1つ以上のアミノ酸置換は、R24A、R27A、K34A、K34D、K34E、K34S、K34P、K34G、K34T、K34H、K34L、K34N、K34F、K34V、K34Y、Q38A、Q38D、Q38P、Q38G、Q38I、Q38L、Q38R、Q38K、Q38F、Q38T、Q38E、Q38S、Q38V、Q38Y、I87A、K138A、E142A、E142G、E142N、E142L、E142F、E142I、E142V、E142K、E142R、E142P、E142Q、E142T、E142S、E142Y、D144A、D144E、D144G、D144H、D144R、D144I、D144K、D144N、D144Q、D144P、D144S、D144L、D144T、D144V、D144Y、N148P、N148D、N148I、E151A、E151G、E151H、E151I、E151N、E151F、E151L、E151V、E151R、E151K、E151P、E151Q、E151S、E151T、及びE151Yからなる群から選択される、請求項14に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含むIL-10RAポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号2のアミノ酸配列を含むIL-10RAポリペプチドに対して低下した結合親和性を示す、請求項7~15のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対して50%以上低下した結合親和性を示す、請求項16に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対して150%以上低下した結合親和性を示す、請求項16に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対して2分の1以下に低下した結合親和性を示す、請求項16に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記野生型成熟IL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記配列番号2のアミノ酸配列を含む前記IL-10RAポリペプチドに対して10分の1以下に低下した結合親和性を示す、請求項16に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して位置R107にアミノ酸置換をさらに含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、配列番号1に従うナンバリングで、R107A変異をさらに含む、請求項21に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、配列番号422~428からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、二量体である、請求項1~23のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、ホモ二量体である、請求項24に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、ヘテロ二量体である、請求項24に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、単量体である、請求項1~23のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、残基C114、E115、N116、K117、S118、K119、またはA120の直後に1から15個の間のアミノ酸のペプチド挿入を有する前記配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、位置N92にアミノ酸置換を含む、請求項27または請求項28に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N92Iを含む、請求項29に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、アミノ酸置換N92F、N92H、N92K、N92L、N92R、N92S、N92T、N92V、またはN92Yを含む、請求項29に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、アミノ酸置換N18I、K99N及びF111Lのうちの1つ以上をさらに含む、請求項29~31のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号1に基づくナンバリングで、位置(複数可)R24、R27、Q38、I87、K138、E142、D144、及び/またはE151に1つ以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項29~32のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、配列番号87~89、188~201、310~318及び422~428からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の変異IL-10ポリペプチド。
- 請求項1から34のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチド及びT細胞上の抗原と結合する抗原結合分子を含む、融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、単球よりもT細胞を選択的に刺激する、請求項35に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原結合分子は、CD8と結合する、請求項35または請求項36に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原結合分子は、CD8ab、CD8a、またはCD8aaと結合する、請求項37に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原結合分子は、CD8b及び/またはCD8abと結合する、請求項37に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原結合分子は、重鎖可変(VH)ドメイン及び軽鎖可変(VL)ドメインを含み、
(a)前記VHドメインは、配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(b)前記VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(c)前記VHドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(d)前記VHドメインは、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(e)前記VHドメインは、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(f)前記VHドメインは、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(g)前記VHドメインは、配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(h)前記VHドメインは、配列番号177のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(i)前記VHドメインは、X1がS、K、G、N、R、D、T、またはGであり、X2がY、L、H、またはFである、X1X2AISのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号259)と、X1がGまたはHであり、X2がIまたはFであり、X3がI、N、またはMであり、X4がG、N、H、S、R、I、またはAであり、X5がA、N、H、S、T、F、またはYであり、X6がA、D、またはGであり、X7がT、E、K、V、Q、またはAであり、X8がAまたはTであり、X9がNまたはKであり、X10がAまたはNであり、X11がQまたはTである、X1X2X3PX4X5X6X7X8X9YX10QKFX11Gのアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号260)と、X1がDまたはAであり、X2がA、G、E、R、Y、K、N、Q、L、またはFであり、X3がA、L、P、またはYであり、X4がIまたはLであり、X5がR、A、Q、またはSであり、X6がAまたはDであり、X7がD、E、A、またはSである、X1X2X3GX4X5LFX6X7のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号261)とを含み、前記VLドメインは、X1がRまたはGであり、X2がAまたはTであり、X3がQまたはEであり、X4がE、N、T、S、A、K、D、G、R、またはQであり、X5がY、またはSであり、X6がAまたはVである、X1X2SX3X4IX5GX6LNのアミノ酸配列を含むCDR-L1(配列番号262)と、X1がAまたはSであり、X2がT、S、E、Q、またはDであり、X3がN、R、A、E、またはHであり、X4がQまたはAであり、X5がSまたはDである、GX1X2X3LX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-L2(配列番号263)と、X1がS、N、D、Q、A、またはEであり、X2がT、I、またはSであり、X3がY、L、またはFであり、X4がD、G、T、E、Q、A、またはYであり、X5がA、T、R、S、K、またはYである、QX1X2X3X4X5PWTのアミノ酸配列を含むCDR-L3(配列番号264)とを含む;
(j)前記VHドメインは、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号226のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号227のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(k)前記VHドメインは、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号232のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(l)前記VHドメインは、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号232のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(m)前記VHドメインは、X1がS、D、E、A、またはQであり、X2がA、G、またはTである、X1YX2MSのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号268)と、X1がT、N、S、Q、E、H、R、またはAであり、X2がY、W、F、またはHであり、X3がA、S、Q、E、またはTであり、X4がGまたはEであり、X5がSまたはIであり、X6がAまたはGである、DIX1X2X3GX4X5TX6YADSVKGのアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号269)と、X1がSまたはAであり、X2がN、H、A、D、L、Q、Y、またはRであり、X3がA、N、S、またはGであり、X4がA、V、R、E、またはSであり、X5がDまたはSであり、X6がD、N、Q、E、S、T、またはLであり、X7がL、F、またはMであり、X8がI、Y、またはVである、X1X2X3YX4WX5X6AX7DX8のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号270)とを含み、前記VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、QQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含む;
(n)前記VHドメインは、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号230のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;または
(o)前記VHドメインは、配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号237のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、請求項37に記載の融合タンパク質。 - 前記抗原結合分子は、重鎖可変(VH)ドメイン及び軽鎖可変(VL)ドメインを含み、
(a)前記VHドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(b)前記VHドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(c)前記VHドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(d)前記VHドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(e)前記VHドメインは、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(f)前記VHドメインは、配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(g)前記VHドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(h)前記VHドメインは、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(i)前記VHドメインは、X1がG、Y、S、またはAであり、X2がT、S、G、R、N、またはHであり、X3がS、T、R、H、Y、G、またはPであり、X4がS、K、G、N、R、D、T、またはGであり、X5がY、L、H、またはFである、GX1X2FX3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号265)と、X1がI、N、またはMであり、X2がG、N、H、S、R、I、またはAであり、X3がA、N、H、S、T、F、またはYであり、X4がA、D、またはGであり、X5がT、E、K、V、Q、またはAである、X1PX2X3X4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号266)と、X1がDまたはAであり、X2がA、G、E、R、Y、K、N、Q、L、またはFであり、X3がA、L、P、またはYであり、X4がIまたはLであり、X5がR、A、Q、またはSであり、X6がAまたはDであり、X7がD、E、A、またはSである、X1X2X3GX4X5LFX6X7のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号267)とを含み、前記VLドメインは、X1がRまたはGであり、X2がAまたはTであり、X3がQまたはEであり、X4がE、N、T、S、A、K、D、G、R、またはQであり、X5がYまたはSであり、X6がAまたはVである、X1X2SX3X4IX5GX6LNのアミノ酸配列を含むCDR-L1(配列番号262)と、X1がAまたはSであり、X2がT、S、E、Q、またはDであり、X3がN、R、A、E、またはHであり、X4がQまたはAであり、X5がSまたはDである、GX1X2X3LX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-L2(配列番号263)と、X1がS、N、D、Q、A、またはEであり、X2がT、I、またはSであり、X3がY、L、またはFであり、X4がD、G、T、E、Q、A、またはYであり、X5がA、T、R、S、K、またはYである、QX1X2X3X4X5PWTを含むアミノ酸配列を含むCDR-L3(配列番号264)とを含む;
(j)前記VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号239のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(k)前記VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(l)前記VHドメインは、配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;
(m)前記VHドメインは、X1がS、D、E、Q、S、またはAであり、X2がS、D、E、A、またはQである、GFTFX1X2Yのアミノ酸配列を含むCDR-H1(配列番号271)と、X1がT、N、S、Q、E、H、RまたはAであり、X2がY、W、F、またはHであり、X3がA、S、Q、E、またはTであり、X4がGまたはEであり、X5がSまたはIである、X1X2X3GX4X5のアミノ酸配列を含むCDR-H2(配列番号272)と、X1がSまたはAであり、X2がN、H、A、D、L、Q、Y、またはRであり、X3がA、N、S、またはGであり、X4がA、V、R、E、またはSであり、X5がDまたはSであり、X6がD、N、Q、E、S、T、またはLであり、X7がL、F、またはMであり、X8がI、Y、またはVである、X1X2X3YX4WX5X6AX7DX8のアミノ酸配列を含むCDR-H3(配列番号273)とを含み、前記VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、QQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含む;
(n)前記VHドメインは、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号241のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む;または
(o)前記VHドメインは、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号244のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、前記VLドメインは、RASQSVSSNLA(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L1、GASSRAT(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及びQQYGSSPPVT(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、請求項37に記載の融合タンパク質。 - (a)前記VHドメインは、配列番号62の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号63の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(b)前記VHドメインは、配列番号64の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号65の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(c)前記VHドメインは、配列番号66の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号67の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(d)前記VHドメインは、配列番号68の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号69の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(e)前記VHドメインは、配列番号70の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号71の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(f)前記VHドメインは、配列番号72の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号73の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(g)前記VHドメインは、配列番号245の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号246の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(h)前記VHドメインは、配列番号251の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号252の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(i)前記VHドメインは、配列番号253の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号254の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(j)前記VHドメインは、配列番号247の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号248の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(k)前記VHドメインは、配列番号249の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号250の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(l)前記VHドメインは、配列番号255の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号256の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(m)前記VHドメインは、配列番号257の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号258の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;
(n)前記VHドメインは、配列番号58の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号59の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む;または
(o)前記VHドメインは、配列番号185の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、前記VLドメインは、配列番号186の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項40または請求項41に記載の融合タンパク質。 - 前記抗原結合分子は、CD4と結合する、請求項35または請求項36に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原結合分子は、PD-1と結合する、請求項35または請求項36に記載の融合タンパク質。
- 前記T細胞は、ヒトT細胞である、請求項35~44のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、2つの変異IL-10ポリペプチドの二量体を含み、前記2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方は、前記抗原結合分子に融合される、請求項35~45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、それぞれが抗原結合部位を含む、2つのポリペプチドを含み、1つの変異IL-10ポリペプチドは、前記ポリペプチドのそれぞれに融合される、請求項35~45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、前記変異IL-10単量体ポリペプチドは、前記抗原結合分子に融合される、請求項35~45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記変異IL-10ポリペプチドは、直接またはリンカーを介して前記抗原結合分子に融合される、請求項35~48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原結合分子は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]
に従う構造を含む、2つの抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]
に従う構造を含む2つの抗体軽鎖ポリペプチドとを含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、VH/VLは、抗原結合部位を形成する、請求項35~45及び49のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、前記2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して前記2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される、請求項50に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、前記2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して前記2つのCH3ドメインの第1のC末端に融合され、前記2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して前記2つのCH3ドメインの第2のC末端に融合される、請求項50に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、1つの変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、前記変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して前記2つのCH3ドメインのうちの一方のC末端に融合される、請求項50に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原結合分子は、式[I]、N末端からC末端に、
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [I]、
に従う構造を含む第1の抗体重鎖ポリペプチドと、式[II]、N末端からC末端に、
VL-CL [II]、
に従う構造を含む抗体軽鎖ポリペプチドと、式[III]、N末端からC末端に、
ヒンジ-CH2-CH3 [III]、
に従う構造を含む第2の抗体重鎖ポリペプチドとを含み、VHは、抗体重鎖可変(VH)ドメインであり、CH1は、抗体CH1ドメインであり、ヒンジは、抗体ヒンジドメインであり、CH2は、抗体CH2ドメインであり、CH3は、抗体CH3ドメインであり、VLは、抗体軽鎖可変(VL)ドメインであり、CLは、抗体定常軽鎖ドメインであり、VH/VLは、抗原結合部位を形成する、請求項35~45及び49のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、前記2つの変異IL-10ポリペプチドのうちの一方のN末端は、直接またはリンカーを介して、前記第2の抗体重鎖ポリペプチドの前記CH3ドメインのC末端または前記第1の抗体重鎖ポリペプチドの前記CH3ドメインのC末端のうちの一方に融合される、請求項54に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、二量体に結合した2つの変異IL-10ポリペプチドを含み、前記2つの変異IL-10ポリペプチドの第1のN末端は、直接またはリンカーを介して前記第1の抗体重鎖ポリペプチドの前記CH3ドメインのC末端に融合され、前記2つの変異IL-10ポリペプチドの第2のN末端は、直接またはリンカーを介して前記第2の抗体重鎖ポリペプチドの前記CH3ドメインのC末端に融合される、請求項54に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、1つの変異IL-10単量体ポリペプチドを含み、前記変異IL-10単量体ポリペプチドのN末端は、直接またはリンカーを介して、前記第2の抗体重鎖ポリペプチドの前記CH3ドメインのC末端または前記第1の抗体重鎖ポリペプチドの前記CH3ドメインのC末端のうちの一方に融合される、請求項54に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体重鎖ポリペプチドの一方または両方は、EUインデックスによるナンバリングで、以下のアミノ酸置換:L234A、L235A、及びG237Aを含む、請求項50~57のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- EUインデックスによるナンバリングで、前記2つのFcドメインの第1は、アミノ酸置換Y349C及びT366Wを含み、前記2つのFcドメインの第2は、アミノ酸置換S354C、T366S、L368A及びY407Vを含む、請求項50~58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーは、配列(GGGS)xGn(配列番号74)、(GGGGS)xGn(配列番号75)、(GGGGGS)xGn(配列番号76)、S(GGGS)xGn(配列番号386)、S(GGGGS)xGn(配列番号387)、またはS(GGGGGS)xGn(配列番号388)を含み、x=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12であり、n=0、1、2または3である、請求項50~59のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーは、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号79)またはSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号77)を含む、請求項60に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、4つのポリペプチド鎖を含み、
第1のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号115のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号116のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号119のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号120のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号122のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号123のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号122のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号124のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号121のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号126のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号127のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号126のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号128のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号125のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号130のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号131のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号130のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号132のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号129のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号134のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号135のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号134のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号136のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号133のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号138のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号139のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号138のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号140のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号137のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号143のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号144のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号141のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号146のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号147のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号146のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号148のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号145のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号150のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号151のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号150のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号152のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号149のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号154のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号155のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号154のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号156のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号153のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号158のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号159のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含む;
前記第1のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖は、配列番号158のアミノ酸配列を含み、前記第3のポリペプチド鎖は、配列番号160のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチド鎖は、配列番号157のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、1つ以上の単離ポリヌクレオチド。
- 請求項63に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含む、1つ以上のベクター。
- 前記ベクター(複数可)は、発現ベクター(複数可)である、請求項64に記載の1つ以上のベクター。
- 請求項62に記載の1つ以上のポリヌクレオチドまたは請求項64もしくは請求項65に記載の1つ以上のベクターを含む、宿主細胞。
- 変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質を生成する方法であって、請求項66に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質の生成に適した条件下で培養することを含む、前記方法。
- 前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質を前記宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項67に記載の方法。
- 請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質。
- がんを処置する方法であって、がんを有する個体に有効量の請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドもしくは融合タンパク質、または請求項69に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記個体にT細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、IL-2ポリペプチド、または免疫チェックポイント阻害剤(ICI)を施すことをさらに含む、請求項71に記載の方法。
- 前記ICIは、PD-1、PD-L1、またはCTLA-4の阻害剤である、請求項72に記載の方法。
- 前記T細胞療法は、キメラ抗原受容体(CAR)ベースのT細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)ベースの療法、または形質導入TCRを有するT細胞を用いた療法を含む、請求項72に記載の方法。
- がんを有する個体に有効量の前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質を投与することを含む、がんを処置する方法に使用するための請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質。
- 感染症を処置する方法であって、感染症の処置を必要とする個体に有効量の請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドもしくは融合タンパク質、または請求項69に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記感染症は、ウイルス感染症である、請求項76に記載の方法。
- がんまたは慢性感染症を処置するための医薬の製造のための請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドまたは融合タンパク質の使用。
- 1つ以上のT細胞をエクスビボで有効量の請求項1~62のいずれか1項に記載の変異IL-10ポリペプチドもしくは融合タンパク質または請求項69に記載の組成物と接触させることを含む、エクスビボでT細胞を増殖させる方法。
- 前記1つ以上のT細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である、請求項79に記載の方法。
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