JP2023552037A - Ｒｎａ編集のための人工核酸 - Google Patents

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Abstract

本発明は、増強された編集特異性を有し、望ましくない標的外編集を回避する、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸を提供する。前記人工核酸は、編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む標的化配列を含み、ここで、当該標的化配列は、デアミナーゼをリクルートすることができる第１のリクルート部分と、デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分とに隣接し、当該第１および第２のリクルート部分の少なくとも１つは、標的ＲＮＡ中の相補的な領域に結合する少なくとも１つのリクルートメント配列を含み、好ましくは２つのリクルートメント配列を含む。

Description

発明の詳細な説明
本発明は標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸に関する。特に、本発明は、内因性デアミナーゼを利用することによって内因性転写産物を部位特異的に編集することができる人工核酸を提供する。さらに、本発明は、増強された編集特異性を提供し、望ましくない標的外編集を回避する、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸を提供する。本発明はまた、上記人工核酸を作製するための方法を含み、前記方法の少なくともいくつかの工程は、コンピュータで支援またはコンピュータで実行される。また、本発明は、上記人工核酸をコードするベクター、ならびに上記人工核酸を含む細胞、組成物、およびキットを提供する。さらに、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集またはインビトロ診断のための人工核酸、ベクター、細胞、組成物またはキットの使用を提供する。加えて、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、組成物、またはキットは、医薬品としての使用のために、または疾患もしくは障害の診断における使用のために提供される。
〔背景技術〕
従来の遺伝子治療では、遺伝情報は典型的にはＤＮＡレベルで操作され、したがってゲノムを永久的に変化させる。用途に応じて、ゲノムの持続的な修飾は、有益であるか、または深刻なリスクを伴うかのいずれかであり得る。この点において、ＤＮＡの代わりにＲＮＡを標的化することは、魅力的な代替アプローチと言える。ＲＮＡレベルで対象を治療する場合、遺伝子発現の変化は通常可逆的であり、調整可能であり、かつ、非常に多くの場合、より効率的でもある。一方では、効果の持続時間が限られることにより、有害な副作用に関連するリスクも制限される。また、効果を微調整できる場合、時間および用量依存的に治療法を継続的に調整し、有害作用を制御することが可能となる。さらに、例えば、遺伝子欠損が致死的であるか、または重複した処理によって容易に補償される場合、遺伝子発現の多くの操作はゲノムレベルでは実行不可能であるか、または効果がない。例えば、ＲＮＡレベルでシグナリングネットワークを標的とすることは特に魅力的であると思われる。多くのシグナリングの合図は必須であるかまたは大幅に重複しているので、ノックアウトが明確な表現型をもたらさない場合がある一方、ノックダウンは明確な表現型をもたらす場合もある。
したがって、ＲＮＡ標的化ストラテジーの設計に対する関心が高まっている。そのようなストラテジーの一つはＲＮＡ編集である。アデノシン（Ａ）－イノシン（Ｉ）ＲＮＡ編集は、トランスクリプトームを多様化するための天然の酵素メカニズムである。イノシンは生物化学的にグアノシンと解釈されるので、ＡからＩへの編集は形式的に(formally)ＡからＧへの変異を導入し、とりわけ、アミノ酸コドン、開始コドンおよび終止コドンの再コード化、スプライシングの変化、およびｍｉＲＮＡ活性の変化がもたらされ得る。このような酵素活性を選択された転写産物の特定の部位に標的化することは、部位特異的ＲＮＡ編集と呼ばれるストラテジーであり、疾患の治療や、タンパク質やＲＮＡの機能の研究全般において大きな期待が寄せられている。改変デアミナーゼに基づくＲＮＡ編集ストラテジーが開発されている（例えば、Vogel, P., Schneider, M.F., Wettengel, J., Stafforst, T. Improving Site-Directed RNA Editing In Vitro and in Cell Culture by Chemical Modification of the GuideRNA. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 6267-6271 (2014)参照）。しかしながら、治療の場では、ＲＮＡに作用する広く発現した内因性デアミナーゼの利用が最も魅力的と思われる。それにより、任意の（改変された）タンパク質の異所性発現を必要とせずに、オリゴヌクレオチド薬物のみの投与によって、トランスクリプトームに特定の変異を導入することが可能になると考えられる。例えば、Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌら（Wettengel, J., Reautschnig, J., Geisler, S., Kahle, P. J., Stafforst, T.: Harnessing human ADAR2 for RNA repair - Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy. Nucl. Acids Res. 45, 2797-2808 (2017)）は、人工タンパク質を必要とせずに、細胞ＡＤＡＲ２を使用するシステムを報告している。また、部位特異的ＲＮＡ編集のためのオリゴヌクレオチドコンストラクトが、国際特許出願ＷＯ２０１６／０９７２１２およびＷＯ２０１７／０１０５５６に記載されている。また、ドイツ特許ＤＥ１０ ２０１５ ０１２ ５２２ Ｂ３には、部位特異的ＲＮＡ編集のためのガイドＲＮＡ分子が記載されている。
Ｑｕら(Liang Qu et al.: Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nature Biotechnology, 37, 133-138 (2019))は、ヒト野生型ＡＤＡＲをある程度リクルートするが、バイスタンダーの標的外編集には大きな問題がある長い非構造ｇＲＮＡを構築した。
Ｃｏｘら(Cox D. B. T., et al.: RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027 (2017))は、高活性Ｅ１００８Ｑ変異体ＡＤＡＲ１のデアミナーゼドメインをＲＮＡガイド化ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰエフェクターに融合させることによって、ＡＤＡＲリクルートＲＮＡを構築した。
しかしながら、当該技術分野で知られているストラテジーには同様の問題がある。つまり、一方では、十分なＲＮＡ編集を提供するために効率的に十分なデアミナーゼ、特に内因性デアミナーゼをリクルートすることが困難であることが判明した。他方、効率的な編集は、典型的には低特異性、例えば、ｇＲＮＡ－ｍＲＮＡ二本鎖内の多数のバイスタンダーの標的外編集、ならびにトランスクリプトーム全体にわたるグローバル標的外編集を伴う。加えて、当技術分野で公知のストラテジーは、それらのｇＲＮＡが標的ｍＲＮＡ内の標的アデノシンの周りに単に逆相補的に結合するので、極めて限られた配列空間を有する。
Ｍｅｒｋｌｅら(Merkle, T. Merz, S., Reautschnig, J., Blaha, A., Li, Q., Vogel, P., Wettengel, J., Li, J., Stafforst, T.: Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology, 37, 1059-1069 (2019))は、内因性ヒトＡＤＡＲをリクルートして内因性転写物をより特異的な方法で編集する、化学的修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ガイドＲＮＡ）の構造が記載されている。しかしながら、化学的修飾のために、このアプローチで使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生物自体によって合成することができないため、対象に投与されなければならない。
したがって、標的外編集をもたらさない高い編集収率および高い特異性を可能にするＲＮＡ編集ストラテジーが緊急に必要とされている。特に、内因性デアミナーゼをリクルートするのに適しており、例えば注射によって個々に添加される必要はないが、ガイド核酸をコードするベクターに基づいて個々自体によって発現され得る化合物が必要とされる。
したがって、本発明の目的は、デアミナーゼ、好ましくは内因性デアミナーゼ、例えばアデノシンデアミナーゼを、編集対象のＲＮＡ標的にリクルートすることができる化合物を提供することである。本発明の特定の目的は、高い効率および高い特異性で、特に標的外編集の割合が減少された、ＲＮＡ標的を編集するのに適した化合物を提供することである。したがって、改善されたＲＮＡ編集アプローチが提供され、これは、好ましくは他のトランスクリプトーム部位での非特異的編集の減少を伴わないか、または伴う、標的ＲＮＡにおける特異的標的部位でのＲＮＡ編集の高収率を可能にする。本発明の別の特定の目的は、好ましくは上述の利点を特徴とする、生物自体によって内因的に発現され得るデアミナーゼをリクルートすることができる化合物を提供することである。
前記目的の解決策は、本明細書に記載され、特許請求の範囲によって定義される実施形態によって達成される。
〔発明の詳細な説明〕
第１の態様において、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための新規な人工核酸に関する。特に、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸が、本明細書において提供され、当該人工核酸は５’から３’への方向、または３’から５’への方向において以下を含む：
ａ）デアミナーゼをリクルートすることができる第１のリクルート部分であって、前記標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する少なくとも１つのリクルートメント配列を含む、第１のリクルート部分；
ｂ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列、および
ｃ）デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分、
ここで、前記標的ＲＮＡ中の前記第１の領域および前記標的ＲＮＡ中の前記標的配列が、少なくとも１つのヌクレオチドによって隔てられ、前記ヌクレオチドは前記少なくとも１つのリクルートメント配列によっては結合されず、かつ、人工核酸の標的化配列に相補的でない。
本発明者らは驚くべきことに、本明細書に記載の人工核酸、特に、２つのリクルート部分が隣接する標的化配列を含む人工核酸であって、リクルート部分の少なくとも１つが、本明細書に定義されるような少なくとも１つのリクルートメント配列またはリクルートメント配列のクラスターを含む人工核酸が、デアミナーゼ、特に内因性デアミナーゼをＲＮＡ標的にリクルートし、前記ＲＮＡ中の標的部位においてヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジンヌクレオチドを特異的に編集することができることを見出した。有利なことに、標的ＲＮＡが本明細書に記載される人工核酸によって高効率で編集され、したがって、編集された標的ＲＮＡの高収率を提供する一方で、望ましくない標的外編集を回避することができる。したがって、本明細書に記載される人工核酸は高い効率ならびに高い特異性の両方を有する部位特異的ＲＮＡ編集を可能にし、最先端のソリューションよりも有利な特性を有するガイドＲＮＡの大きな配列空間を開く。
本発明者らは、人工核酸が多種多様な転写物、例えば、ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＮＵＰ４３、ＧＵＳＢ、ＰＤＥ４Ｄ）の内因性ｍＲＮＡ、ならびに疾患関連遺伝子（例えば、ＢＭＰＲ２またはＣＯＬ３Ａ１）のプラスミドコード化ｃＤＮＡ転写物を編集するのに適していることを見出した。有利なことに、本発明に係るシステムが不死化細胞株および腫瘍細胞株からいくつかの初代ヒト細胞に及ぶ多種多様な細胞に適用可能であることが証明された。例えば、本発明のシステムを使用して、本発明者らは、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞における疾患関連ｈＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘアンバー変異を首尾よく補正した。多価リクルートメントクラスターの使用は、任意の内因性（ｍ）ＲＮＡの標的化のための最適なガイドＲＮＡを設計するための大きな配列空間を開く。したがって、本発明者らは、標的（ｍ）ＲＮＡ上で互いに数千ヌクレオチド離れたイントロン配列またはエクソン配列に結合している場合でさえも、リクルートメント配列が有効であることを見出した。
本明細書において使用される場合、「人工核酸（分子）」という表現は、典型的には天然には存在しない核酸を指す。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子であってもよい。このような人工核酸分子は、その個々の配列（自然には存在しない配列）のために、および／またはこれに関して自然には存在しないヌクレオチドの他の修飾、例えば、構造的な修飾のために、非天然であり得る。本明細書において使用される場合、人工核酸は、好ましくは少なくとも一つのヌクレオチドが、またはヌクレオチドの少なくとも一つの修飾によって、天然に存在する核酸とは異なる。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含むハイブリッド分子であり得る。好ましい実施形態では、人工核酸はＲＮＡ分子である。特に、本明細書で使用される人工核酸は、修飾されていないまたは修飾されたリボヌクレオチドおよび／または修飾されていないまたは修飾されたデオキシヌクレオチドを含み得、好ましくは修飾されていないリボヌクレオチドおよび／またデオキシヌクレオチドを含む。さらに、「人工核酸（分子）」という表現は、「単一分子」に限定されず、同一の分子の集合も指す場合がある。したがって、この表現は、例えば、サンプル中に含まれる複数の同一の分子を指し得る。
本発明に関して、「ＲＮＡ編集」という表現は、標的ＲＮＡ中のヌクレオチド、好ましくはアデノシンヌクレオチドまたはシチジンヌクレオチドが脱アミノ化反応によって別のヌクレオチドに変換される反応を指す。変化したヌクレオチドは好ましくはコドンの変化をもたらし、例えばＲＮＡから翻訳されたポリペプチドへの別のアミノ酸の組み込みまたは終止コドンの生成もしくは欠失をもたらすので、その変化は典型的には異なる遺伝子産物をもたらす。特に、標的ＲＮＡ中のアデノシンヌクレオチドは、脱アミノ化によって、例えば本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼによってイノシンに変換される。別の実施形態において、標的ＲＮＡ中のシチジンヌクレオチドはウリジンヌクレオチドに変換される。本明細書で使用される「標的ＲＮＡ」という用語は、典型的には本明細書に記載の人工核酸によって支持される編集反応に供されるＲＮＡを指す。
本明細書に記載の人工核酸によって達成されるＲＮＡ編集はさらに「部位特異的」であり、これは標的ＲＮＡ中の標的部位における特定のヌクレオチドが好ましくは他のヌクレオチドを編集することなく、または本質的に編集することなく編集されることを意味する。典型的には標的部位のヌクレオチドが本明細書に記載の人工核酸の標的化配列によって標的化され、ここで、標的化配列は好ましくは生理学的条件下で、標的配列と特定の塩基対を形成することができる。したがって、本発明に関して、「標的配列」という表現は、典型的には人工核酸の標的化配列に（少なくとも部分的に）相補的である核酸配列に関して使用される。標的配列は標的部位を含み、ここで、当該標的部位は、典型的には編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンヌクレオチドまたはシチジンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的部位が編集対象の二つ以上のヌクレオチドを含んでもよく、ここで、これらのヌクレオチドは好ましくは少なくとも一つ、好ましくは二つの他のヌクレオチドだけ互いに離れている。本明細書で使用される場合、「相補的」または「部分的に相補的」という用語は、好ましくはそれらの相補的であるヌクレオチドのために、好ましくは生理学的条件下で、特定の分子間塩基対形成、好ましくはワトソン－クリック塩基対形成が可能である核酸配列を指す。本明細書で使用される「相補的」という用語は、逆相補的配列を指すこともある。本明細書に記載の人工核酸はまた、人工核酸が典型的には標的ＲＮＡ中の核酸配列のアンチセンスを表す標的化配列中の核酸配列を含むので、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」と本明細書中で称され得る。本発明に関して、用語「ガイドＲＮＡ」は、好ましくはデアミナーゼ機能を標的部位にガイドする人工核酸を指すために使用されてもよい。
標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸が、本明細書において提供され、当該人工核酸は５’から３’への方向、または３’から５’への方向において以下を含む：
ａ）デアミナーゼをリクルートすることができる第１のリクルート部分であって、前記標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する少なくとも１つのリクルートメント配列を含む、第１のリクルート部分；
ｂ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列、および
ｃ）デアミナーゼに結合することができる核酸配列。
これに関して、デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分は、好ましくはデアミナーゼを結合することができる核酸配列、好ましくは本明細書に定義される核酸配列、例えばＲ／Ｇモチーフを含む。
（リクルート部分）
本発明の人工核酸は、標的化配列に隣接する少なくとも２つのリクルート部分を含む。本発明に関して、用語「リクルート部分」は、デアミナーゼをリクルートし、典型的には標的化配列に共有結合される、本明細書に記載の人工核酸の部分を指す。したがって、そのような「リクルート部分」は、標的ＲＮＡ中の標的部位へデアミナーゼをリクルートし、ここで、標的ＲＮＡ（および標的部位）は、好ましくは標的化配列および少なくとも１つのリクルート部分によって配列特異的な様式で認識され、そして結合される。
本発明の人工核酸は、少なくとも２つのリクルート部分、第１のリクルート部分および第２のリクルート部分を含み、第１および第２のリクルート部分のうちの少なくとも１つは標的化配列の３’に位置し、第１および第２のリクルート部分のうちの少なくとも１つは標的化配列の５’に位置する。
用語「第１のリクルート部分」および「第２のリクルート部分」は、第１および第２のリクルート部分の性質に関するいかなる制限も意味することなく、標的化配列の３’および５’に位置する人工核酸のリクルート部分を区別するためにあることに留意しなければならない。言い換えると、「第１の」リクルート部分に関して記載した特徴は「第２の」リクルート部分にも適用することができ、逆もまた同様である。
（第１のリクルート部分）
本発明の人工核酸において、第１のリクルート部分は、標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する少なくとも１つのリクルートメント配列を含む。好ましい実施形態では、人工核酸の少なくとも１つのリクルートメント配列は標的ＲＮＡ中の第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む。したがって、第１のリクルート部分のリクルートメント配列は標的化配列と共に、配列特異的な様式で標的ＲＮＡ中の標的部位にデアミナーゼを向ける。
本発明のさらに好ましい実施形態では、第１のリクルート部分がヌクレオチドリンカーを介して連結された少なくとも２つのリクルートメント配列を含むリクルートメント配列のクラスターを含む。好ましくは、クラスターが少なくとも３個のリクルートメント配列、例えば３～２０個のリクルートメント配列、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のリクルートメント配列を含み、より好ましくは３～１０個のリクルートメント配列を含む。
リクルートメント配列、より好ましくはリクルートメント配列のクラスターは、編集対象のヌクレオチドを含む標的領域においてのみ標的ＲＮＡに相補的であるガイド核酸と比較して、標的ＲＮＡに対する人工核酸分子の結合親和性を増加させる。さらに、標的ＲＮＡ中の複数の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である複数のリクルートメント配列の提供はまた、人工核酸および標的ＲＮＡの遭遇の確率を増加させ得る。
リクルートメント配列のクラスターに含まれる２つのリクルートメント配列は、互いにすぐ隣に配置されるか、またはヌクレオチドリンカーを介して連結されるかのいずれかである。別の言い方をすれば、任意のヌクレオチドリンカーは、好ましくはリクルートメント配列のクラスター中の２つのリクルートメント配列を隔てることができる。リクルートメント配列を連結するヌクレオチドリンカーは、好ましくは人工核酸の（少なくとも２つの）リクルートメント配列によって結合されるか、またはそれに相補的である、標的ＲＮＡ中の領域には結合せず、かつ、標的ＲＮＡ中の領域に相補的でない少なくとも１つのヌクレオチドを含む。人工核酸の第１のリクルート部分の（少なくとも２つの）リクルートメント配列を連結するヌクレオチドリンカーは例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンまたはチミジンヌクレオチドなどの任意の種類のヌクレオチドを含むことができ、好ましくは、（１つまたは複数の）アデノシンヌクレオチドを含む。リクルートメント配列を連結するヌクレオチドリンカーは、例えば、１～１００個のヌクレオチド、例えば、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０または１～１０個のヌクレオチドを含み得、好ましくは２～６個のヌクレオチド、好ましくはアデノシンヌクレオチドを含み得る。
人工核酸が標的ＲＮＡに結合すると、人工核酸中の２つのリクルートメント配列を連結するヌクレオチドリンカーはしたがって、リクルートメント配列に相補的でなく、それゆえリクルートメント配列によって結合されていない、標的ＲＮＡのヌクレオチドを「架橋」する。しかしながら、２つの個々のリクルートメント配列によって結合される標的ＲＮＡ上の２つの領域間に位置するヌクレオチドの数は一般に、人工核酸中のリクルートメント配列を連結するヌクレオチドリンカーのヌクレオチドの数と一致しないことに留意しなければならない。例えば、人工核酸の２つの隣接するリクルートメント配列への結合部位として機能する標的ＲＮＡ上の２つの領域間の距離は、数百個または数千個までのヌクレオチドを含むことができ、一方、２つの隣接するリクルートメント配列は、かなり短い、好ましくは本明細書に定義されるヌクレオチドリンカーによって隔てられる。この特定の場合、リクルートメント配列の標的ＲＮＡの相補的領域への結合の過程において、リクルートメント配列の２つの特異的結合部位間に位置する標的ＲＮＡの領域は、標的ＲＮＡ中にループを形成し得る。相互にそのような広範囲の距離（大きな配列空間）でリクルートメント配列を使用することの実現可能性は、最新技術と比較して本発明の柔軟性を強調する。
第１のリクルート部分の少なくとも１つのリクルートメント配列は、標的ＲＮＡ中の第１の領域のヌクレオチドに結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中の第１の領域のヌクレオチドに相補的である任意の数のヌクレオチドを含み得る。好ましくは、（少なくとも１つの）リクルートメント配列が少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。本発明の好ましい実施形態において、少なくとも１つのリクルートメント配列は１０～２００個のヌクレオチドを含み、より好ましくは、１０～１００個のヌクレオチドまたは１５～１００個のヌクレオチドまたは２０～１００個のヌクレオチドを含む。好ましくは、第１のリクルート部分の少なくとも１つのリクルートメント配列は、本質的に一本鎖核酸として、特に生理学的条件下で存在する。
上述のように、好ましい実施形態では、人工核酸の第１のリクルート部分は、少なくとも２つのリクルートメント配列を含むリクルートメント配列のクラスターを含む。したがって、好ましい実施形態では、第１のリクルートメント配列は標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中の第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含み、第２のリクルートメント配列またはさらなるリクルートメント配列は標的ＲＮＡ中の第２の領域またはさらなる領域に結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中の第２の領域またはさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む。例えば、特定の実施形態では第１のリクルート部分は３個のリクルートメント配列を含み、第１のリクルートメント配列は標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中の第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含み、第２のリクルートメント配列は標的ＲＮＡ中の第２の領域に結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中の第２の領域またはさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含み、第３のリクルートメント配列は標的ＲＮＡ中の第３の領域に結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中の第３の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む。
人工核酸の第１のリクルート部分においてリクルートメント配列のクラスターを形成する複数のリクルートメント配列はしたがって、標的化配列と共に、デアミナーゼを配列特異的な様式で標的部位に導き、それによって、標的ＲＮＡに対する人工核酸の結合親和性を増加させる。各リクルートメント配列に利用可能な大きな配列空間のために、それらの選択は非常に柔軟であり、したがって、編集効率、特異性、バイスタンダー編集、ならびに安定性、免疫原性、毒性、およびその他を含む、ガイドＲＮＡの様々な重要な特性を最適化することを可能にする。
好ましくは、第１のリクルート部分の第１のリクルートメント配列によって結合される標的ＲＮＡ中の第１の領域、ならびに／または第１のリクルート部分の第２のおよび／もしくはさらなるリクルートメント配列によって結合される標的ＲＮＡ中の第２のおよび／もしくはさらなる領域は、編集可能なアデノシンヌクレオチドを含まない。すなわち、標的配列の第１の領域およびさらなる領域は好ましくは、減少されたもしくは存在しないＲＮＡ編集に供される特異的コドンコンテクストにおけるアデノシンヌクレオチド（例えば、５’－ＧＡ－３’コンテクストにおけるグアノシンヌクレオチドに続くアデノシンヌクレオチド）または特異的位置（例えば、リクルートメント配列の５’または３’末端から５ｎｔ以内）におけるアデノシンヌクレオチドを除いて、いかなるアデノシンヌクレオチドも含まない。
したがって、人工核酸の第１のリクルート部分のリクルートメント配列は、好ましくは、リクルートメント配列のいずれかの末端（５’または３’）から５ｎｔ以内であるか、または５’－ＮＵＳ（Ｓ＝ＣまたはＧ）コンテクスト中にあるか、のいずれかでない限り、ウリジン塩基が枯渇している。
本発明の特定の実施形態では、人工核酸の第１のリクルート部分のリクルートメント配列は、好ましくは低減されたウリジン含有量を有する。例えば、第１のリクルート部分のリクルートメント配列は、リクルートメント配列のいずれかの末端（５’または３’）から５ｎｔ以内であるか、または５’－ＮＵＳ（Ｓ＝ＣまたはＧ）コンテクスト中にあるかのいずれかでない限り、リクルートメント配列に含まれるヌクレオチドの総数に対して、５０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または１％未満のウリジンヌクレオチドを含むことが好ましい。より好ましくは、人工核酸の第１のリクルート部分のリクルートメント配列は、リクルートメント配列のいずれかの末端（５’または３’）から５ｎｔ以内であるか、または５’－ＮＵＳ（Ｓ＝ＣまたはＧ）コンテクスト中にあるか、のいずれかでない限り、いかなるウリジン塩基も含まない。
このようにして、標的ＲＮＡの第１およびさらなる領域ならびにリクルートメント配列によって形成される二本鎖領域における標的外編集事象が回避される。
好ましい実施形態では、人工核酸は、第１のリクルート部分と標的化配列との間にヌクレオチドスペーサーを含む。ヌクレオチドスペーサーは、好ましくは、ｉ）人工核酸の標的化配列に隣接するリクルートメント配列によって結合される標的ＲＮＡ中の第１の領域、およびｉｉ）標的ＲＮＡ中の標的配列、に結合せず、かつ相補的でもない。
第１のリクルート部分と人工核酸の標的化配列との間に位置し得る任意のヌクレオチドスペーサーは、任意のヌクレオチド、例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンまたはチミジンヌクレオチドを含み得、好ましくは（１つまたは複数の）アデノシンヌクレオチドを含む。第１のリクルート部分のリクルートメント配列を連結する任意のヌクレオチドリンカーに関して本明細書に記載されるように、第１のリクルート部分と標的化配列との間に任意に位置するヌクレオチドスペーサーは、好ましくは少なくとも１つのヌクレオチド、例えば１～１００個のヌクレオチド、より好ましくは１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０または１～１０個のヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは２～６個のヌクレオチドを含み、当該ヌクレオチドは好ましくはアデノシンヌクレオチドである。
したがって、人工核酸中の標的化配列と第１のリクルートメント配列とを連結するヌクレオチドスペーサーは、標的配列（人工核酸の標的化配列によって結合される）と標的ＲＮＡ中の第１の領域（人工核酸の第１のリクルートメント配列によって結合される）との間に位置する標的ＲＮＡのヌクレオチドを「架橋」する。ここでもまた、標的配列と標的ＲＮＡ上の第１の領域（それぞれ、標的化配列および第１のリクルートメント配列によって結合される）との間に位置するヌクレオチドの数は、一般に、ヌクレオチドスペーサーのヌクレオチドの数と一致しないことに留意しなければならない。むしろ、標的化配列への結合部位として機能する標的ＲＮＡ上の領域と、人工核酸の第１のリクルートメント配列との間の距離は、例えば、数百個または数千個までのヌクレオチドを含み得る。この特定の場合、標的化配列および第１のリクルートメント配列が標的ＲＮＡの相補的領域に結合する過程において、標的化配列および第１のリクルートメント配列の特異的結合部位間に位置するヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中にループを形成するだろう。
（標的化配列）
人工核酸の第１のリクルート部分および第２のリクルート部分に隣接する標的化配列は、編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む。好ましくは、標的化配列は、標的ＲＮＡ中の核酸配列に相補的または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％相補的である核酸配列を含み、標的ＲＮＡ中の相補的核酸配列は標的部位を含み、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５または少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、標的化配列は、１０～５０、より好ましくは１６～４０個のヌクレオチドを含む。好ましくは、人工核酸の標的化配列は、本質的に一本鎖核酸として、特に生理学的条件下で存在する。
いくつかの実施形態によれば、人工核酸の標的化配列は標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置に、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を含む。好ましくは、標的化配列は、標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置に、好ましくは編集対象のアデノシン、編集対象のアデノシンとミスマッチするシチジンヌクレオチドを含む。好ましくは、編集対象のアデノシンとミスマッチするシチジンヌクレオチドは、標的化配列の５’または３’末端のいずれかから少なくとも６個のヌクレオチド離れて位置する。より好ましくは、編集対象のアデノシンとミスマッチするシチジンヌクレオチドは、標的化配列内の中心外に位置する。例えば、２０個のヌクレオチドからなる標的化配列において、編集対象のアデノシンとミスマッチするシチジンヌクレオチドは、標的化配列の３’または５’末端、好ましくは３’末端に対して８位に位置する。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的部位が編集対象の２つ以上のヌクレオチドを含み、これらのヌクレオチドは好ましくは少なくとも１つ、好ましくは２つの他のヌクレオチドによって互いに隔てられる。これらの実施形態では、標的化配列が編集対象のヌクレオチドに対応する各位置に、上記のヌクレオチド、好ましくはシチジンヌクレオチドまたはそのバリアントを含み得る。
所与の標的ＲＮＡを編集するための人工核酸の標的化配列の個々の核酸配列は、典型的には編集対象の特定の標的ＲＮＡの標的部位の配列に依存する。
（第２のリクルート部分）
第１のリクルート部分および標的化配列に加えて、本発明の人工核酸は、標的化配列に対して３’または５’に位置するデアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分を含む。したがって、人工核酸は、構造５’－第１のリクルート部分－標的化配列－第２のリクルート部分－３’または５’－第２のリクルート部分－標的化配列－第１のリクルート部分－３’を含み得る。
人工核酸の一実施形態では、第２のリクルート部分は、第１のリクルート部分に関して定義されたリクルート部分であってもよい。すなわち、第２のリクルート部分は、標的ＲＮＡ中の特定の領域に結合し、好ましくはそれに相補的であるか、または少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つのリクルートメント配列を含んでもよく、より好ましくは、第１のリクルート部分に関して上で定義された任意のヌクレオチドリンカーを介して連結される少なくとも２つのリクルートメント配列のクラスターを含む。この特定の実施形態では、人工核酸は、標的化配列と第２のリクルート部分との間に任意でヌクレオチドスペーサー、好ましくは標的化配列と第１のリクルート部分との間に存在し得るヌクレオチドスペーサーに関して定義されるヌクレオチドスペーサーを任意に含み得る。
しかしながら、好ましい実施形態では、第２のリクルート部分は、標的ｍＲＮＡに結合することなく、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼに結合することができる核酸配列を含む。すなわち、人工核酸の好ましい実施形態では、第１のリクルート部分および第２のリクルート部分は、デアミナーゼをリクルートするそれらの様式が異なる。
特定の実施形態では、人工核酸の第２のリクルート部分はデアミナーゼをリクルートすることができる少なくとも１つのカップリング剤を含むか、または当該カップリング剤からなり、デアミナーゼは前記カップリング剤に結合する部分を含む。デアミナーゼをリクルートするカップリング剤は、典型的には標的化配列の５’末端または３’末端に共有結合される。あるいは、カップリング剤は、標的化配列の内部ヌクレオチド（すなわち、５’－または３’－末端ヌクレオチドではない）に、例えば、ヌクレオチドバリアントまたは修飾ヌクレオチド（好ましくはアミノチミジンなどの本明細書に記載のもの）への連結を介して連結されていてもよい。
カップリング剤は、Ｏ６－ベンジルグアニン、Ｏ２－ベンジルシトシン、クロロアルカン、１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、４ｘＢＧ、およびこれらのいずれかのバリアントからなる群より選ばれる。特に好ましい実施形態によれば、カップリング剤は、２ｘＢＧまたは４ｘＢＧなどの分岐分子であり、その各々は好ましくはデアミナーゼ分子をリクルートすることができ、したがって、好ましくは、編集反応を増幅することができる。好適な分岐カップリング剤の例示的構造を以下に示す：
カップリング剤は、好ましくはデアミナーゼ中の部分に特異的に結合することができる。デアミナーゼ中の上記部分は好ましくはタグであり、これは本明細書に記載のデアミナーゼ、好ましくは本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼに連結される。より好ましくは、上記タグは、ＳＮＡＰ－ｔａｇ、ＣＬＩＰ－ｔａｇ、ＨａｌｏＴａｇ、およびこれらのいずれか一つの断片またはバリアントからなる群より選ばれる。
本発明に関して、核酸配列またはアミノ酸配列の「バリアント」は、当該バリアントが由来する配列に対して、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、同一であることが好ましい。バリアントは、機能性バリアントであることが好ましい。
本明細書に使用される場合、核酸配列またはアミノ酸配列の「断片」は、完全長配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の連続配列に相当する、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の連続配列からなり、これは、当該断片が由来する完全長配列の、少なくとも５％、１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、に相当する。本発明の意味において、このような断片は、機能性断片であることが好ましい。
したがって、これらの実施形態においてカップリング剤によって結合されるデアミナーゼは、好ましくは内因性デアミナーゼの人工物バージョン、好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼの人工物バージョンである。好ましくは、デアミナーゼは、好ましくは本明細書に記載の、ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰ、ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰｆ、Ｈａｌｏ－ＡＤＡＲ１、Ｈａｌｏ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－Ｈａｌｏ、Ｃｌｉｐ－ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐ－ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐｆ－ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐｆ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－ＣｌｉｐおよびＡｐｏｂｅｃ１－Ｃｌｉｐｆからなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選択され、ここで、デアミナーゼは好ましくはヒト、マウスまたはラットに由来するものである。より好ましくは、デアミナーゼは、ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ２、ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ２、Ｈａｌｏ－ＡＤＡＲ１、Ｈａｌｏ－ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐ－ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐ－ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐｆ－ＡＤＡＲ１およびＣｌｉｐｆ－ＡＤＡＲ２からなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選ばれ、ここで、デアミナーゼはヒトに由来するものである。別の実施形態によれば、デアミナーゼは、ｍＡｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰ、ｍＡｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰｆ、ｍＡｐｏｂｅｃ１－Ｈａｌｏ、ｍ Ａｐｏｂｅｃ１－ＣｌｉｐおよびｍＡｐｏｂｅｃ１－Ｃｌｉｐｆからなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選ばれ、ここで、デアミナーゼはマウスに由来するものである。
特に好ましい実施形態において、デアミナーゼは本明細書に記載のデアミナーゼのいずれかの過剰活性(hyperactive)変異体であり、好ましくは過剰活性Ｑ変異体であり、より好ましくはＡＤＡＲ１デアミナーゼ、ＡＤＡＲ２デアミナーゼの過剰活性Ｑ変異体（例えば、ヒトＡＤＡＲ１ｐ１５０、Ｅ１００８Ｑ；ヒトＡＤＡＲ１ｐ１１０、Ｅ７１３Ｑ；ヒトＡＤＡＲ２、Ｅ４８８Ｑ）であり、またはこれらのタグ付きバージョン、最も好ましくは本明細書に記載のものであり、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。
別の実施形態において、デアミナーゼは本明細書に記載のデアミナーゼのいずれかの変異体であり、当該変異体はデアミナーゼのヌクレオチド特異性をアデノシンから別のヌクレオチドに変更させる変異体であり、例えば、Ｃ－から－ＵへのＲＮＡ編集を行うことができるＡＤＡＲ２デアミナーゼ変異体である（Abudayyeh, O. O., et al.: A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science 365(6451): 382-386. (2019)を参照されたい）。
好ましくは本明細書に記載のタグ付きデアミナーゼ（例えば、ＳＮＡＰ－、ＳＮＡＰｆ－、Ｃｌｉｐ－、Ｃｌｉｐｆ－、Ｈａｌｏ－タグ付きデアミナーゼまたはそれらの断片もしくはバリアント）は、好ましくはＲＮＡ編集のために、例えば、上記タグ付きデアミナーゼをコードするベクターによる細胞の一過性トランスフェクションによって、または形質転換細胞、組織もしくは生体における安定な発現によって、過剰発現する。
特定の実施形態において、人工核酸の第２のリクルート部分は、少なくとも１つのＲＮＡモチーフ（例えば、ＭＳ２ループ、トランス活性化ｃｒ ＲＮＡのダイレクトリピート、Ｂｏｘ Ｂモチーフ、ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ヘアピン）を含むか、または当該少なくとも１つのＲＮＡモチーフからなり、当該ＲＮＡモチーフは、デアミナーゼ、またはテザリングアプローチのために開発された他のエフェクター融合タンパク質（類似のＭＣＰ－ＡＤＡＲ(Azad, M. T. A., et al.: Site-directed RNA editing by adenosine deaminase acting on RNA for correction of the genetic code in gene therapy. Gene Ther 24(12): 779-786 (2017)、およびD. Katrekar et al.: In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nat. Methods 16(3), 239-242 (2019))；または類似のｄＣａｓ－ＡＤＡＲ(Cox, D. B. T., et al., supra; Omar O. Abudayyeh, et al., supra)、または類似のＬａｍｂｄａＮ－ＡＤＡＲ(Montiel-Gonzalez, M. F., et al.: Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by site-directed RNA editing. Proc Natl Acad Sci U S A 110(45): 18285-18290(2013))、または類似のＴＢＰ－ＡＤＡＲ(S. Rauch et al.: Programmable RNA-Guided RNA Effector Proteins Built from Human Parts. Cell 178, 122-134.e12 (2019))をリクルートすることができる。
本発明の好ましい実施形態において、第２のリクルート部分は、デアミナーゼ（好ましくはアデノシンまたはシチジンデアミナーゼ、より好ましくはアデノシンデアミナーゼ）
の二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合することができる核酸配列を含むか、または当該核酸配列からなる。有利なことに、デアミナーゼに結合することができる核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなるリクルート部分は、内因性デアミナーゼに結合する。これにより、本発明に係る人工核酸は、内因性（または異種発現）デアミナーゼを用いる部位特異的ＲＮＡ編集を促進する。
人工核酸はデアミナーゼによるＲＮＡの部位特異的編集に適しており、ここで、デアミナーゼは好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはその断片もしくはバリアント、好ましくはＡＤＡＲ（ｄｓＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）酵素またはその断片もしくはバリアントであり、より好ましくはＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびその断片もしくはバリアントからなる群より選ばれ、例えば、アデノシンデアミナーゼドメインを含むペプチドもしくはタンパク質である。しかしながら、シチジンデアミナーゼまたはその断片もしくはバリアント、例えばＡｐｏｂｅｃ１またはその断片もしくはバリアント、例えばシチジンデアミナーゼドメインを含むペプチドまたはタンパク質、も企図される。
本明細書で使用される用語「デアミナーゼ」は、標的ＲＮＡ中のヌクレオチドまたはそのバリアントの脱アミノ化、特にアデノシンまたはシチジンの脱アミノ化を触媒することができる任意のペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインを指す。したがって、この用語は、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡｐｏｂｅｃ１などの完全長および野生型デアミナーゼを指すだけでなく、デアミナーゼの断片またはバリアント、好ましくは機能性断片または機能性バリアント、も指す。特に、当該用語は、好ましくは本明細書に記載の、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡｐｏｂｅｃ１の変異体などのデアミナーゼの変異体およびバリアントも指す。さらに、本明細書で使用される用語「デアミナーゼ」は、任意のデアミナーゼ融合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９およびＣａｓ１３、ＭＳ２コートタンパク質もしくはＬａｍｂｄａ－Ｎ－ペプチド、ＴＡＲ結合タンパク質に基づく）も含む。本発明に関して、用語「デアミナーゼ」はまた、ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰ、ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰｆ、Ｈａｌｏ－ＡＤＡＲ１、Ｈａｌｏ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－Ｈａｌｏ、Ｃｌｉｐ－ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐ－ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐｆ－ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐｆ－ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１－ＣｌｉｐおよびＡｐｏｂｅｃ１－Ｃｌｉｐｆからなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選択されるデアミナーゼなどのデアミナーゼのタグ付きバリアントも指し、ここで、デアミナーゼは好ましくはヒト、マウスまたはラットに由来するものである。
好ましい実施形態において、デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１、好ましくはＡＤＡＲ１ｐ１５０もしくはＡＤＡＲ１ｐ１１０、またはＡＤＡＲ２など）、好ましくは真核生物のアデノシンデアミナーゼ、より好ましくは脊椎動物のアデノシンデアミナーゼ、さらにより好ましくは哺乳類のアデノシンデアミナーゼ、最も好ましくはｈＡＤＡＲ１もしくはｈＡＤＡＲ２などのヒトのアデノシンデアミナーゼ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。
別の実施形態によれば、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ（Ａｐｏｂｅｃ１、好ましくはヒトＡｐｏｂｅｃ１、ネズミ科の動物Ａｐｏｂｅｃ１（ｍＡｐｏｂｅｃ１）またはラットＡｐｏｂｅｃ１（ｒＡｐｏｂｅｃ１）など）、例えば、脊椎動物のシチジンデアミナーゼ、好ましくは哺乳類のシチジンデアミナーゼ、より好ましくはネズミ科の動物もしくはヒトのシチジンデアミナーゼなどの真核生物のシチジンデアミナーゼ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。デアミナーゼは、タグ付きシチジンデアミナーゼ、またはその断片もしくはバリアントであってもよい。デアミナーゼは、ｍＡｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰ、ｍＡｐｏｂｅｃ１－ＳＮＡＰｆ、ｍＡｐｏｂｅｃ１－Ｈａｌｏ、ｍＡｐｏｂｅｃ１－ＣｌｉｐおよびｍＡｐｏｂｅｃ１－Ｃｌｉｐｆ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントからなる群より選ばれてもよく、ここでデアミナーゼはヒト、マウスまたはラットに由来するものである。
代替的な実施形態では、デアミナーゼは本明細書に記載のデアミナーゼのいずれかの過剰活性変異体（例えばＡＤＡＲ１デアミナーゼ、ＡＤＡＲ２デアミナーゼの過剰活性Ｑ変異体（例えば、ヒトＡＤＡＲ１ｐ１５０、Ｅ１００８Ｑ；ヒトＡＤＡＲ１ｐ１１０、Ｅ７１３Ｑ；ヒトＡＤＡＲ２、Ｅ４８８Ｑ）などの過剰活性Ｑ変異体）もしくはこれらのタグ付きバージョン、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。
好ましくは、第２のリクルート部分は、デアミナーゼの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合することができる核酸配列を含むか、または当該核酸配列からなり、ここで、当該核酸配列は、好ましくは標的化配列の５’末端または３’末端のいずれか、より好ましくは標的化配列の５’末端に共有結合している。
いくつかの実施形態では、リクルート部分は分子内塩基対形成が可能な核酸配列を含むかまたは当該核酸配列からなる。リクルート部分は、好ましくはステムループ構造を形成することができる核酸配列を含むかまたは当該核酸配列からなる。特定の実施形態において、上記ステムループ構造は、少なくとも二つのミスマッチを含む二重らせんステムを含むかまたは当該二重らせんステムからなる。好ましい実施形態では、ステムループ構造は、３個～８個、好ましくは４個～６個、より好ましくは５個のヌクレオチドからなるループを含む。当該ループは、好ましくは核酸配列ＧＣＵＡＡまたはＧＣＵＣＡを含むかまたは当該核酸配列ＧＣＵＡＡまたはＧＣＵＣＡからなる。
好ましい実施形態において、人工核酸の第２のリクルート部分は、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＵＧＵ ＣＧＡＧＡ ＡＧＡＧＧ ＡＧＡＡＣ ＡＡＵＡＵ ＧＣＵＡＡ ＡＵＧＵＵ ＧＵＵＣＵ ＣＧＵＣＵ ＣＣＵＣＧ ＡＣＡＣＣ－３’を含む。このヌクレオチド配列は、ＡＤＡＲ１、特にＡＤＡＲ１ｐ１１０への結合において特に有効であることが判明している。
他の実施形態において、人工核酸の第２のリクルート部分は、ヌクレオチド配列５’－ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡＵ ＡＡＣ ＡＡＵ ＡＵＧ ＣＵＡ ＡＡＵ ＧＵＵ ＧＵＵ ＡＵＡ ＧＵＡ ＵＣＣ ＣＡＣ－３’を含み、特にこのヌクレオチド配列は、ＡＤＡＲ２への結合において有効的であることが示された。
上記の配列は、グルタミン酸受容体２ｍＲＮＡ中の周知のＡＤＡＲ２標的部位から適用されるので、Ｒ／Ｇモチーフとしても知られている。
したがって、第２のリクルート部分は、第１のリクルート部分に関して定義されたリクルート部分、すなわち、少なくとも１つのリクルートメント配列を含み、好ましくは標的ＲＮＡ中の第１の領域および好ましくはさらなる領域に結合し、好ましくは当該領域に相補的または少なくとも部分的に相補的であるリクルートメント配列のクラスターを含む、リクルート部分であってもよいが、第１および第２のリクルート部分のうち少なくとも１つが、デアミナーゼ、好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼ、に結合することができる核酸配列を含むことが好ましい。
したがって、本発明の人工核酸は、好ましくは一本鎖（ｓｓ）核酸分子である。好ましい実施形態では、人工核酸は生理学的条件下で二本鎖（ｄｓ）領域を含む一本鎖核酸である。好ましくは、人工核酸は、リクルート部分内に二本鎖領域を含む一本鎖核酸であり、デアミナーゼに結合することができる標的ｍＲＮＡに結合することは意図されない。
したがって、好ましい実施形態において、本発明の人工核酸は、５’から３’への方向、または３’から５’への方向において以下を含む：
ａ）標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する少なくとも１つのリクルートメント配列を含み、好ましくは標的ＲＮＡの第１の領域およびさらなる領域に結合するリクルートメント配列のクラスターを含む、第１のリクルート部分；
ｂ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列、および
ｃ）デアミナーゼに結合することができる核酸配列、好ましくは上記で定義された核酸配列、例えばＲ／Ｇモチーフ、を含む、第２のリクルート部分。
より好ましい実施形態において、本発明の人工核酸は、３’から５’への方向において、上記で定義されたａ）第１のリクルート部分、ｂ）標的化配列、およびｃ）第２のリクルート部分を含む。
デアミナーゼに結合することができる核酸配列、好ましくは上記で定義された核酸配列、例えばＲ／Ｇモチーフを含む、第２のリクルート部分はまた、標的ＲＮＡ中のさらなる領域に結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中のさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つのリクルートメント配列、または標的ＲＮＡ中のさらなる領域にそれぞれ結合し、好ましくは当該領域にそれぞれ相補的または少なくとも部分的に相補的であるリクルートメント配列のクラスターを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明の人工核酸は、５’から３’への方向、または３’から５’への方向において以下を含む：
ａ）標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合し、好ましくは前記標的ＲＮＡ中の第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つのリクルートメント配列を含むか、または標的ＲＮＡの第１の領域およびさらなる領域に結合し、好ましくは前記標的ＲＮＡの第１の領域およびさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的であるリクルートメント配列のクラスターを含む、第１のリクルート部分；
ｂ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列、および
ｃ）標的ＲＮＡ中のさらなる領域に結合し、好ましくは標的ＲＮＡ中のさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つのリクルートメント配列、およびデアミナーゼに結合することができる核酸配列、好ましくは上記で定義された核酸配列、例えばＲ／Ｇモチーフを含む、第２のリクルート部分。
例えば、第１のリクルート部分は、標的ＲＮＡ中の第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である１つのリクルートメント配列を含むことができ、一方、第２のリクルート部分は、標的ＲＮＡ中の第２および第３の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である２つのリクルートメント配列と、デアミナーゼに結合することができる核酸配列とを含む。別の実施形態として、第１のリクルート部分は、標的ＲＮＡ中の第１および第２の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である２つのリクルートメント配列を含むことができ、一方、第２のリクルート部分は、標的ＲＮＡ中の第３の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である第３のリクルートメント配列と、デアミナーゼに結合することができる核酸配列とを含む。好ましくは、Ｒ／Ｇモチーフなどのデアミナーゼに結合することができる核酸配列は、人工核酸の５’末端に位置する。
標的ＲＮＡのさらなる領域およびリクルートメント配列によって形成される二本鎖領域における標的外編集事象を回避するために、第２のリクルート部分のリクルートメント配列は、リクルートメント配列のいずれかの末端（５’または３’）から５ｎｔ以内であるか、または５’－ＮＵＳ（Ｓ＝ＣまたはＧ）コンテクスト中にあるか、のいずれかでない限り、ウリジン塩基が枯渇している。
したがって、第２のリクルート部分のリクルートメント配列は、好ましくは低減されたウリジン含有量を有する。例えば、第２のリクルート部分のリクルートメント配列は、リクルートメント配列のいずれかの末端（５’または３’）から５ｎｔ以内、または５’－ＮＵＳ（Ｓ＝ＣまたはＧ）コンテクスト中のいずれかにウリジンヌクレオチドがない限り、リクルートメント配列に含まれるヌクレオチドの総数に対して、５０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または１％未満のウリジンヌクレオチドを含む。より好ましくは、人工核酸の第２のリクルート部分のリクルートメント配列は、リクルートメント配列のいずれかの末端（５’または３’）から５ｎｔ以内であるか、または５’－ＮＵＳ（Ｓ＝ＣまたはＧ）コンテクスト中にあるか、のいずれかでない限り、いかなるウリジン塩基も含まない。
標的ＲＮＡにおいて、第１の領域（第１のリクルート部分の少なくとも１つのリクルートメント配列によって結合される）および標的配列（標的化配列に相補的である）は、少なくとも１つのリクルートメント配列によっては結合されず、かつ、人工核酸の標的化配列に相補的でない、少なくとも１つのヌクレオチドによって隔てられる。すなわち、標的ＲＮＡ中の第１の領域および標的配列は、好ましくは互いにマージしない。標的ＲＮＡ中の第１の領域および標的配列は好ましくは、少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは２～１０，０００個のヌクレオチド、例えば２～５０００個のヌクレオチド、２～１０００個のヌクレオチド、２～５００個のヌクレオチド、２～４００個のヌクレオチド、２～３００個のヌクレオチド、２～２００個のヌクレオチドまたは２～１００個のヌクレオチドによって隔てられ得る。より好ましくは、標的ＲＮＡ中の第１の領域および標的配列は、２～５０個のヌクレオチド、例えば、２～４０個のヌクレオチド、２～３０個のヌクレオチド、２～２０個のヌクレオチドまたは２～１０個のヌクレオチドによって隔てられる。
同様に、標的ＲＮＡにおいて、第１の領域（第１のリクルート部分の第１のリクルートメント配列によって結合される）および第２のもしくはさらなる領域（第１のリクルート部分の第２のまたはさらなるリクルートメント配列によって結合される）は、好ましくは少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは２～１０，０００個のヌクレオチド、例えば、２～５０００個のヌクレオチド、２～１０００個のヌクレオチド、２～５００個のヌクレオチド、２～４００個のヌクレオチド、２～３００個のヌクレオチド、２～２００個のヌクレオチドまたは２～１００個のヌクレオチドによって隔てられる。より好ましくは、標的ＲＮＡにおける第１の領域および第２のもしくはさらなる領域は、２～５０個のヌクレオチド、例えば、２～４０個のヌクレオチド、２～３０個のヌクレオチド、２～２０個のヌクレオチドまたは２～１０個のヌクレオチドによって隔てられる。
したがって、少なくとも１つのリクルートメント配列および標的化配列を介して標的ＲＮＡに結合する本発明の人工核酸は、標的ＲＮＡ上の１０００個、１０，０００個、またはさらには１００，０００個のヌクレオチドの領域にわたり得、それによって、デアミナーゼを標的ＲＮＡの特異的標的部位にリクルートする。人工核酸の標的化配列によって結合された標的ＲＮＡの標的配列が、人工核酸の第１のリクルートメント配列によって結合された第１の領域から数百個または数千個のヌクレオチド、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１０，０００または１００，０００個のヌクレオチドだけ離れている場合、これらのヌクレオチドは、人工核酸が結合すると、標的ＲＮＡ中でループを形成し得ることに留意されたい。
本発明に係る人工核酸はその長さが限定されるものではなく、例えば、オリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は短い核酸分子（例えば、６量体または１０量体）ならびにより長いオリゴヌクレオチド（例えば、１００個または２００個ものヌクレオチドを含む核酸分子）を指し得るものであり、ここで、オリゴヌクレオチドは、（修飾されていないまたは修飾された）リボヌクレオチドおよび／または（修飾されていないまたは修飾された）デオキシヌクレオチドを含み得る。好ましい実施形態によれば、人工核酸は、少なくとも約１５個、好ましくは少なくとも約２０個、より好ましくは少なくとも約２５個、さらにより好ましくは少なくとも約３０個、さらにより好ましくは少なくとも約３５個、最も好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチドを含む。あるいは、人工核酸の長さは、約１５個～１０００個のヌクレオチド、例えば、約１５個～約４００個のヌクレオチド、約１５個～約３００個のヌクレオチド、約１５個～約２００個のヌクレオチドであり、好ましくは、約２０個～約１５０個のヌクレオチド、より好ましくは約２０個～約１００個のヌクレオチド、最も好ましくは約２０個～約８０個のヌクレオチドである。
本発明の特定の実施形態において、人工核酸は、化学的に修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、用語「化学修飾」は、好ましくは、脱塩基部位を含む、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾から選択される化学修飾を指す。本発明に関して、「化学的に修飾された核酸」は、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む核酸を指し得る。
本発明の特定の実施形態において、人工核酸の第１のリクルート部分および/または標的化配列および/または第２のリクルート部分は、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得る。特に、第１のリクルート部分および/または標的化配列および/または第２のリクルート部分は、例えばＷＯ／２０２０／００１７９３にて開示されている特定の修飾パターンをもたらし得る複数の化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得る。
一般に、本発明の人工核酸分子は、天然の（＝自然界に存在する）ヌクレオチドならびに化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、一般に、（修飾されていないおよび修飾された）リボヌクレオチド、ならびに（修飾されていないおよび修飾された）デオキシヌクレオチドを含む。したがって、「ヌクレオチド」という用語は、好ましくはアデノシン、デオキシアデノシン、グアノシン、デオキシグアノシン、イノシン、デオキシイノシン、５－メトキシウリジン、チミジン、ウリジン、デオキシウリジン、シチジン、デオキシシチジンまたはそれらのバリアントを指す。さらに、本明細書において「ヌクレオチド」に言及する場合、それぞれのヌクレオシドも同様に含まれることが好ましい。
この点において、ヌクレオチドの「バリアント」は、典型的にはヌクレオチドの天然または人工バリアントである。したがって、バリアントは、好ましくは天然ヌクレオチドに対して付加または欠失し、またはヌクレオチドの天然に存在する官能基を置換する、非天然官能基を有する化学的に誘導体化されたヌクレオチドである。したがって、このようなヌクレオチドバリアントにおいて、天然ヌクレオチド（好ましくはリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド）の各部分は修飾されてもよく、つまり、塩基部分、糖（リボース）部分および／または人工核酸の骨格を形成するリン酸部分は、好ましくは本明細書に記載の修飾によって修飾されてもよい。したがって、用語「（ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドなどの）バリアント」もまた、好ましくは本明細書に記載の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
本明細書において使用される場合、化学的に修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、およびシチジンのバリアントであり、例えばアセチル化、メチル化、ヒドロキシル化などによって化学的に改変された天然のまたは非天然のいずれかのグアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、またはシチジンが挙げられるがこれらに限定されず、１－メチル－アデノシン、１－メチル－グアノシン、１－メチル－イノシン、２，２－ジメチル－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド、２－アミノプリン－リボシド、２’－アラアデノシン、２’－アラシチジン、２’－アラウリジン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシシチジン、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン、２’－アジド－２’－デオキシウリジン、２－クロロアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン、２’－フルオロチミジン、２－メチル－アデノシン、２－メチル－グアノシン、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－２－アミノアデノシン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシアデノシン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシシチジン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルイノシン、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、２－チオシチジン、２－チオ－シチジン、３－メチル－シチジン、４－アセチル－シチジン、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－アミノアリルシチジン、５－アミノアリル－デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－クロロ－アラ－シトシン、５－フルオロ－ウリジン、５－ヨードウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン、５－メトキシ－ウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン、６－アザシチジン、６－アザウリジン、６－クロロ－７－デアザ－グアノシン、６－クロロプリンリボシド、６－メルカプト－グアノシン、６－メチル－メルカプトプリン－リボシド、７－デアザ－２’－デオキシ－グアノシン、７－デアザアデノシン、７－メチル－グアノシン、８－アザアデノシン、８－ブロモ－アデノシン、８－ブロモ－グアノシン、８－メルカプト－グアノシン、８－オキソグアノシン、ベンズイミダゾール－リボシド、ベータ－Ｄ－マンノシル－クエオシン、ジヒドロ－ウリジン、イノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、Ｎ６－（［６－アミノヘキシル］カルバモイルメチル）－アデノシン、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、Ｎ６－メチル－アデノシン、Ｎ７－メチル－キサントシン、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、クエオシン、ウラシル－５－オキシ酢酸、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキソシン、キサントシン、およびキシロ－アデノシン、が挙げられる。そのようなバリアントの調製方法は当業者にとって公知であり、例えば、米国特許ＵＳ４，３７３，０７１、ＵＳ４，４０１，７９６、ＵＳ４，４１５，７３２、ＵＳ４，４５８，０６６、ＵＳ４，５００，７０７、ＵＳ４，６６８，７７７、ＵＳ４，９７３，６７９、ＵＳ５，０４７，５２４、ＵＳ５，１３２，４１８、ＵＳ５，１５３，３１９、ＵＳ５，２６２，５３０、または５，７００，６４２に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、２－アミノプリン－リボシド－５’－三リン酸、２－アミノアデノシン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－三リン酸、２－チオシチジン－５’－三リン酸、２－チオウリジン－５’－三リン酸、２’－フルオロチミジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチル－イノシン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－ヨードシチジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ヨードウリジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、６－アザシチジン－５’－三リン酸、６－アザウリジン－５’－三リン酸、６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、７－デアザアデノシン－５’－三リン酸、７－デアザグアノシン－５’－三リン酸、８－アザアデノシン－５’－三リン酸、８－アジドアデノシン－５’－三リン酸、ベンズイミダゾール－リボシド－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－三リン酸、プソイドウリジン－５’－三リン酸、ピューロマイシン－５’－三リン酸、またはキサントシン－５’－三リン酸、から選ばれる少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、ピリジン－４－一リボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、および４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、から選ばれる少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンより選ばれる少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニンより選ばれる少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンより選ばれる少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、本明細書に記載の人工核酸は、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、アルファ－チオ－シチジン、プソイド－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、アルファ－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、５－メチル－ウリジン、ピロロ－シチジン、イノシン、アルファ－チオ－グアノシン、６－メチル－グアノシン、５－メチル－シチジン、８－オキソ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、プソイド－イソ－シチジン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、アルファ－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシンより選ばれる少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、人工核酸は、２’位が化学的に修飾された、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。好ましくは、上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位の炭素原子において置換基を含み、上記置換基は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれ、好ましくは２’－水素（２’－デオキシ）、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－フルオロから選ばれる。人工核酸に関して、特に、人工核酸がＲＮＡまたはリボヌクレオチドを含む分子である場合、デオキシシチジンまたはそのバリアントなどの２’－デオキシヌクレオチド（２’位の炭素原子において置換基として水素を含む）はまた、「化学的に修飾されたヌクレオチド」と呼ばれ得る。
本明細書に記載のヌクレオチドの２’位に関する別の化学修飾は、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、および（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである。これらの骨格修飾は、修飾ヌクレオチドの糖を好ましいノーザン立体配置(northern conformation)に固定する。人工核酸の標的化配列におけるこの種の修飾の存在によって、標的ＲＮＡへの標的化配列のより強力でより迅速な結合が可能になると考えられる。
いくつかの実施形態によれば、人工核酸は少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、人工核酸分子に組み込まれているリン酸骨格は修飾されている。骨格のリン酸基は、例えば、一つ以上の酸素原子を別の置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載のように、修飾されていないリン酸部分を修飾されたホスフェートで全置換することを含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、立体純粋ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ハイドロジェンホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、およびホスホトリエステルからなる群が挙げられるが、これらに限定されない。ホスフェートリンカーはまた、結合酸素を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによっても修飾され得る。
さらに好ましい実施形態によれば、人工核酸は脱塩基部位を含む。本明細書で使用される場合、「脱塩基部位」は、有機塩基を欠くヌクレオチドである。好ましい実施形態において、脱塩基ヌクレオチドは、リボースの２’位に本明細書に記載の化学修飾をさらに含む。好ましくは、リボースの２’位のＣ原子は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’－水素（２’－デオキシ）、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－フルオロから選ばれる置換基で置換される。したがって、本発明に関して、「化学的に修飾されたヌクレオチド」は、脱塩基部位でもあり得る。
他の実施形態によれば、人工核酸分子は、いわゆる「５’キャップ構造」を追加することによって修飾されてもよい。５’キャップは、概して成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する構成要素、典型的には修飾ヌクレオチドの構成要素である。５’キャップは、典型的には、修飾ヌクレオチドによって形成されてもよく、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成されてもよい。好ましくは、５’キャップは、人工核酸の５’末端に対して５’－５’－三リン酸結合を介して連結される。５’キャップは、メチル化されてもよく、例えばｍ７ＧｐｐｐＮであってもよい。ここで、Ｎは、５’キャップを保有する核酸の、５’末端のヌクレオチドであり、典型的には、ＲＮＡの５’末端である。５’キャップ構造のさらなる例には、グリセリル、逆位(inverted)デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１－（ベータ－Ｄ－エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環状ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、アルファ－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’－セコヌクレオチド、非環状３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－逆位ヌクレオチド部分、３’－３’－逆位脱塩基部分、３’－２’－逆位ヌクレオチド部分、３’－２’－逆位脱塩基部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋性もしくは非架橋性メチルホスホネート部分が含まれる。特に好ましい修飾５’キャップ構造は、ＣＡＰ１（ｍ７Ｇに隣接するヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ２（ｍ７Ｇの下流の２番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ３（ｍ７Ｇの下流の３番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ４（ｍ７Ｇの下流の４番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチ－リバースＣＡＰアナログ）、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオエート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンである。
いくつかの実施形態では、人工核酸は、当該人工核酸の細胞内取り込みを増強する部分を含む。好ましくは、上記細胞内取り込みを増強する部分は、好ましくは人工核酸の３’末端または５’末端と接合するトリアンテナ型Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ３）である。
本発明の好ましい実施形態では、人工核酸は、非修飾リボヌクレオチドおよび／または非修飾デオキシヌクレオチドを含む。より好ましくは、本発明に係る人工核酸は、ＲＮＡまたはＲＮＡ類似体である。最も好ましくは、本発明に係る人工核酸は、内因的に発現可能なＲＮＡである。
一態様において、本発明は、上記で定義される標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列を生成するための方法を提供する。
標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列を生成するための方法は、以下の工程を含む
ｉ）第１のリクルート部分の配列を生成し、ここで、前記第１のリクルート部分は、標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する、少なくとも１つのリクルートメント配列を含む；
ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドを含むヌクレオチドスペーサーの配列を任意に生成する；
ｉｉｉ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列を生成する；
ｉｖ）デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分の配列を生成する；および
ｖ）第１のリクルート部分の配列、任意でヌクレオチドスペーサー、標的化配列、および第２のリクルート部分の配列を、５’から３’への方向または３’から５’への方向においてアセンブルする。
好ましい実施形態において、人工核酸の配列を生成するための方法中の工程ｉ）および任意で工程ｉｖ）は、少なくとも２つのリクルートメント配列を含むリクルート部分を生成すること、好ましくはヌクレオチドリンカーを介して連結されたリクルートメント配列のクラスターを生成することを含む。
生成された核酸配列は、インビトロまたはインビボで発現され、それによって本発明の人工核酸分子を合成することができる。生成された配列に基づいて合成された人工核酸は上述のように、高い効率および高い特異性で、特に標的外編集の割合が低減された、ＲＮＡ標的を編集するのに適している。
本発明の人工核酸の第１のリクルート部分、および任意で第２のリクルート部分は、標的ＲＮＡの第１の領域および任意でさらなる領域に結合する、少なくとも１つのリクルートメント配列、好ましくはリクルートメント配列のクラスターを含む。少なくとも１つのリクルートメント配列ならびに標的ＲＮＡの第１の領域およびさらなる領域によって形成される二本鎖領域における望ましくない標的外事象を回避するために、少なくとも１つのリクルートメント配列によって結合される標的ＲＮＡは、好ましくは編集可能なヌクレオチドを含まず、より好ましくは編集可能なアデノシンヌクレオチドを含まない。したがって、標的ＲＮＡの第１の領域および任意でさらなる領域に結合する、人工核酸の第１および任意で第２のリクルート部分のリクルートメント配列を生成するために、標的ＲＮＡは好ましくは、人工核酸の少なくとも１つのリクルートメント配列への結合部位として適切であり、好ましくは編集可能なアデノシンヌクレオチドを含まない、領域についてスクリーニングされる。第１およびさらなる領域の「手動による」選択は非常に面倒であり得るので、前記スクリーニング工程は、好ましくは後述するコンピュータプログラム（「Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｉｎｄｅｒ」（ＲＣＦ））の手段によって達成される。
したがって、本発明の人工核酸の配列を生成するための方法において、工程ｉ）、および任意で工程ｉｖ）は好ましくは、少なくとも１つのリクルートメント配列への結合部位として適切であり、好ましくは編集可能なアデノシンヌクレオチドを含まない、核酸配列について編集対象の標的ＲＮＡをスクリーニングする工程を含むコンピュータで実行される方法によって達成される。
本発明の人工核酸の第１および任意で第２のリクルート部分の配列を生成するためのコンピュータで実行される方法を使用する場合、標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への結合部位として適切な核酸配列の長さ、および標的ＲＮＡ上の個々のリクルートメント配列への結合部位間の距離などの、さらなる特定を作製して、リクルート配列の有益な、またはさらに最適な配列を生成することができる。
本発明の人工核酸の配列を生成するための方法のより好ましい実施形態において、全ての工程（ｉ）～（ｖ）は、コンピュータにより実行される。
好ましくは、本発明のコンピュータで実行される方法において、本発明の人工核酸の配列は、例えば、以下の点に関してプリセットに基づいて生成される
－ 標的ＲＮＡ上の標的化配列への結合部位として機能する核酸配列の長さ、
－ 標的化配列への結合部位と、標的ＲＮＡ上の少なくとも１つのリクルートメント配列への結合部位との間の距離、
－ ヌクレオチドリンカーの長さ、および任意のヌクレオチドスペーサーの長さ、
－ 標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への結合部位として適切な核酸配列の長さ、および／または
－ 標的ＲＮＡ上の個々のリクルートメント配列への結合部位間の距離。
本発明のコンピュータで実行される方法において使用されるプリセットの一部として、標的ＲＮＡ上の標的化配列への結合部位として機能する核酸配列の長さは、例えば、５～１００個のヌクレオチド、例えば、５～９０、５～８０、５～７０、５～６０、５～５０、５～４０個のヌクレオチドの範囲に設定されてもよく、好ましくは１０～５０、より好ましくは１６～４０個のヌクレオチドの範囲である。
さらに、標的化配列（標的配列）への結合部位と、標的ＲＮＡ中の少なくとも１つのリクルートメント配列（第１の領域）への結合部位との間の距離は、少なくとも１個のヌクレオチドに設定される。好ましくは、標的配列と標的ＲＮＡ中の第１の領域との間の距離は、２～１００，０００個のヌクレオチド、例えば、２～１００，０００、２～１０，０００、２～５０００、２～１０００、２～５００、２～４００、２～３００、２～２００、２～１００個のヌクレオチドの範囲に設定され、より好ましくは２～５０個のヌクレオチドの範囲に設定される。
さらに、リクルートメントクラスターのリクルートメント配列を連結するヌクレオチドリンカーの長さ、および人工核酸の第１のリクルート部分と標的化配列との間に位置する任意であるヌクレオチドスペーサーの長さは、少なくとも１個のヌクレオチドに設定される。好ましくは、ヌクレオチドリンカーの長さ、および任意であるヌクレオチドスペーサーの長さは、１～１００個のヌクレオチド、例えば、１～９０個のヌクレオチド、１～８０個のヌクレオチド、１～７０個のヌクレオチド、１～６０個のヌクレオチド、１～５０個のヌクレオチド、１～４０個のヌクレオチド、１～３０個のヌクレオチド、１～２０個のヌクレオチド、１～１０個のヌクレオチドの範囲に設定され、好ましくは２～６個のヌクレオチドの範囲に設定される。
コンピュータで実行される方法において使用されるプリセットの一部として、標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への結合部位として適切な核酸配列の長さは、少なくとも１０個のヌクレオチド（例えば、１０～５００、１０～４００、１０～３００、または１０～２００個のヌクレオチド）、または少なくとも２０個のヌクレオチド、好ましくは２０～１００個のヌクレオチドの範囲に設定され得る。
また、本発明に係る人工核酸の配列を生成するためのコンピュータで実行される方法において、標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への個々の結合部位間の距離は、少なくとも１個のヌクレオチドに設定され、例えば、１～１００，０００個のヌクレオチド（例えば、１～１００，０００、１～１０，０００、１～５０００、１～１０００、１～９００、１～８００、１～７００、１～６００、１～５００、１～４００、１～３００、１～２００または１～１００個のヌクレオチド）の範囲に設定され、好ましくは２～５００個のヌクレオチド（例えば、２～４００、２～３００、２～２００、２～１００個のヌクレオチド）の範囲に設定され、より好ましくは２～５０個のヌクレオチドの範囲に設定される。
上記のプリセットの手段により、少なくとも１つのヌクレオチド配列が、本発明の人工核酸を合成することができるコンピュータで実行される方法によって作製される。好ましい実施形態では、本発明の人工核酸の配列を生成するためのコンピュータで実行される方法は、人工核酸の代替配列、特に、リクルートメント配列のクラスターを含む第１のリクルート部分の代替配列を作製することを含む。
より好ましい実施形態では、本発明の人工核酸の配列を生成するためのコンピュータで実行される方法は、アセンブルされた人工核酸内の潜在的な分子内塩基対形成事象を決定する工程をさらに含む。このようにして、潜在的な人工核酸の作製された代替配列のうち、最小の潜在的な分子内塩基対形成を提示する人工核酸が検出され得、特定の標的ＲＮＡの部位特異的編集に特に適した人工核酸分子として選択され得る。
この目的のために、コンピュータで実行される方法は、選択されたリクルートメント配列または選択されたリクルートメント配列のクラスター、好ましくは人工核酸が、標的ＲＮＡ上の他の部位または生物のトランスクリプトーム中の別のＲＮＡ分子に結合することができ、望ましくないミスマッチおよび標的外事象をもたらすかどうかを評価し、そのようなリクルートメント配列またはそのようなリクルートメント配列のクラスターを排除する工程をさらに含む。
本発明の特定の実施形態において、人工核酸の配列を生成するための上記方法の工程ｉｖ）は、工程ｉ）に関して定義されたものと同じ工程を含む。すなわち、第１のリクルート部分の配列と同様に、第２のリクルート部分の配列は、少なくとも１つのリクルートメント配列を含み、好ましくは標的ＲＮＡ上の特定の領域に結合するリクルートメント配列のクラスターを含む配列として生成される。言い換えれば、本発明の方法によって生成される人工核酸は、少なくとも１つのリクルートメント配列、好ましくは標的化配列のリクルートメント配列３’および５’のクラスターを含み得る。
しかしながら、上述のように、好ましい実施形態では、人工核酸の第２のリクルート部分は、デアミナーゼに結合することができる核酸配列を含む。したがって、好ましい実施形態では、デアミナーゼに結合することができる核酸配列、好ましくは上記で定義される核酸配列は、本発明の人工核酸の配列を生成するための方法における第２のリクルート部分としてプリセットされる。
上記のように、第１のリクルート部分、任意でヌクレオチドスペーサー、標的化配列および第２のリクルート部分は、５’から３’への方向または３’から５’への方向においてアセンブルされ得る。好ましくは、人工核酸の成分の配列は、３’から５’への方向においてアセンブルされる。
本発明の好ましい実施形態では、上記のすべての工程ｉ）～ｖ）、ならびに潜在的な分子内塩基対形成事象を決定するさらなる工程、および人工核酸が標的ＲＮＡ上の他の部位もしくは特定の生物のトランスクリプトーム中の別の分子に結合することができるかどうかを評価するさらなる工程は、コンピュータで実行され、それによって、特定の標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の最適な配列が作製される。
したがって、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列を生成するための好ましい方法は以下の工程を含む
ｉ）少なくとも１つのリクルートメント配列を含み、好ましくは、少なくとも３個、好ましくは３～１０個のリクルートメント配列のクラスターを含む、第１のリクルート部分の配列であって、
前記リクルートメント配列はそれぞれ、少なくとも１０個、好ましくは１５～１００個のヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ中の第１の領域およびさらなる領域に結合し、ヌクレオチドリンカー、より好ましくはアデノシンリンカーを介して連結される、
第１のリクルート部分の配列を生成する；
ｉｉ）少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは２～６個のヌクレオチド、より好ましくはアデノシンヌクレオチドを含む、ヌクレオチドスペーサーの配列を生成する；
ｉｉｉ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含み、少なくとも１０個、好ましくは１６～４０個のヌクレオチドを含む、標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列を生成する；
ｉｖ）標的ＲＮＡに結合することなく、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼに結合することができる核酸配列、好ましくは上記で定義された配列を含む、第２のリクルート部分の配列を生成する；
ｖ）第１のリクルート部分の配列、ヌクレオチドスペーサー、標的化配列、および第２のリクルート部分の配列を、５’から３’への方向または３’から５’への方向、より好ましくは３’から５’への方向においてアセンブルする；
ｖｉ）アセンブルされた人工核酸内の潜在的な分子内塩基対形成事象を決定し、最小の潜在的な分子内塩基対形成を提示する人工核酸を選択する；
ｖｉｉ）選択されたリクルートメント配列または選択されたリクルートメント配列のクラスター、好ましくは人工核酸が、標的ＲＮＡ上の他の部位または生物のトランスクリプトーム中の別のＲＮＡ分子に結合することができ、望ましくないミスマッチおよび標的外事象をもたらすかどうかを評価し、そのようなリクルートメント配列またはそのようなリクルートメント配列のクラスターを排除する。
本明細書に記載の人工核酸は、本発明の方法によって生成された配列に基づいて、当該技術分野で知られている方法によって合成され得る。人工核酸は、好ましくは本明細書に記載のように、適切なベクターから化学的に、またはインビトロ転写によって合成され得る。好ましくは、本発明の人工核酸は、本明細書に記載のように、細胞または生物において事前にトランスフェクトされた、適切なベクターからインビボで合成される。
別の態様では、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列を生成するための方法を実行するように構成されている手段を含む、データ処理デバイスを対象とし、当該方法は下記による
ｉ）標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する、少なくとも１つのリクルートメント配列を含む、第１のリクルート部分の配列を生成する；
ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドを含むヌクレオチドスペーサーの配列を任意に生成する；
ｉｉｉ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列を生成する；
ｉｖ）デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分の配列を生成する；および
ｖ）第１のリクルート部分の配列、任意でヌクレオチドスペーサー、標的化配列、および第２のリクルート部分の配列を、５’から３’への方向または３’から５’への方向においてアセンブルする。
好ましくは、データ処理デバイスは、編集対象のＲＮＡの配列情報と、以下の点に関してユーザによって入力されたプリセットとに基づいて、本発明の方法を実行するように構成される
－ 標的ＲＮＡ上の標的化配列への結合部位として機能する核酸配列の長さ、
－ 標的化配列への結合部位と、標的ＲＮＡ上の少なくとも１つのリクルートメント配列への結合部位との間の距離、
－ ヌクレオチドリンカーの長さ、および任意のヌクレオチドスペーサーの長さ、
－ 標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への結合部位として適切な核酸配列の長さ、および／または
－ 標的ＲＮＡ上の個々のリクルートメント配列への結合部位間の距離、本発明に係る標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の候補。
より好ましい実施形態では、データ処理デバイスは、以下を行うように構成されている
ｖｉ）アセンブルされた人工核酸内の潜在的な分子内塩基対形成事象を決定し、最小の潜在的な分子内塩基対形成を提示する人工核酸を選択する；および／または
ｖｉｉ）選択されたリクルートメント配列または選択されたリクルートメント配列のクラスター、好ましくは人工核酸が、標的ＲＮＡ上の他の部位または生物のトランスクリプトーム中の別のＲＮＡ分子に結合することができ、望ましくないミスマッチおよび標的外事象をもたらすかどうかを評価し、そのようなリクルートメント配列またはそのようなリクルートメント配列のクラスターを排除する。
さらなる態様では、本発明は、プログラムがコンピュータによって実行される場合、上述した編集対象のＲＮＡの配列情報とユーザによって入力されたプリセットとに基づいて、コンピュータに標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列を生成するための方法を実行させる命令を含む、コンピュータプログラムを対象とする。
基本的な機能として、コンピュータプログラムは、人工核酸のリクルート部分を構成するいくつかのリクルートメント配列を含むリクルートメントクラスターの配列を生成する「Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｉｎｄｅｒ」を含む。
この目的を達成するために、「Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｉｎｄｅｒ」は、以下の主要な機能を含むことができる：
機能１：この機能は、入力標的配列内のＧ、Ｃ、Ｔ、ＧＡブロックを探索する。
機能２：この機能は、リクルートメント配列をリクルートメントクラスターに再結合する。次いで、リクルートメントクラスターは、入力基準、リクルートメント配列のサイズおよび距離について、フィルタリングされる。基準（ヒット）を満たす全てのグループは、ＶｉｅｎｎａＲＮＡによって後に使用されるファイルに保存される。
機能３：この機能は、ブロック相補を変換する。
機能４：この機能は、ガイドＲＮＡを折り畳むためにＶｉｅｎｎａＲＮＡ［１９６］を実行する。結果は出力リストに保存される。
機能５：ＶｉｅｎｎａＲＮＡの結果は、最初に選択された基準（「数値順」、「ドット／ブラケット比率順」または「最小エネルギー順」）によって分類される。その後、結果テーブルが生成される。
さらに、本発明がコンピュータによって実行される場合には、本発明は、コンピュータに標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列を生成するための方法を実行させる命令を含む、コンピュータ可読記憶媒体を対象とする。コンピュータ可読記憶媒体は、例えば、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、または半導体のシステム、装置、もしくはデバイス、または前述の任意の適切な組合せであり得るが、これらに限定されない。コンピュータ可読記憶媒体のより具体的な例（非網羅的リスト）は、以下を含む：１つ以上のワイヤーを有する電気接続、ポータブルコンピューターディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能でプログラム可能なリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、光ファイバー、ポータブルコンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、光記憶デバイス、磁気記憶デバイス、または前述の任意の適切な組合せ。コンピュータ可読ポータブルメモリデバイスの具体例は、ＵＳＢフラッシュメモリデバイスである。コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれらに関連して使用するためのプログラムを含むか、または記憶することができる任意の有形媒体であり得る。
一態様では、本発明が本明細書に記載の人工核酸をコードするベクターを提供する。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、典型的には核酸分子を指し、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明に関して、ベクターは、所望の核酸配列（人工核酸の核酸配列またはその断片など）を組み込むかまたは宿すのに適切である。このようなベクターとしては、ストレージベクター(storage vectors)、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクターなどが挙げられる。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターであり得る。トランスファーベクターは、核酸分子を細胞または生物に導入するのに適切なベクターであり得、例えば、ウイルスベクターである。好ましくは、本願の意味におけるベクターは、クローニング部位、抗生物質耐性因子などの選択マーカー、および複製起点などのベクターの増殖に適切な配列、を含む。
ベクターは、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターであり得る。好ましくは、ベクターはＤＮＡベクターである。ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどの、当業者に公知の任意のベクターであり得る。好ましくは、ベクターはプラスミドベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。特定の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびハイブリッドベクターからなる群より選ばれる。
好ましくは、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの製造に好適である。したがって、好ましくは、ベクターは転写に必要な要素（プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）など）を含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルスまたはファージの転写系を用いる転写、例えば真核細胞、原核細胞、または真核生物、原核生物、ウイルスもしくはファージのインビトロ転写系を用いる転写、に適している。したがって、例えば、ベクターは、ポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼなど）によって、例えば真核生物、原核生物、ウイルス、またはファージのＲＮＡポリメラーゼによって、認識されるプロモーター配列を含み得る。好ましい実施形態において、ベクターは、ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７、好ましくはＴ７プロモーターなど）を含む。好ましくは、ベクターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ転写系などのファージに基づくインビトロ転写系を用いるインビトロ転写に適している。
いくつかの実施形態において、ベクターは、真核細胞へのトランスフェクションの際の、好ましくは哺乳類細胞へのトランスフェクションの際の、または対象への投与の際の、好ましくは本明細書に記載のような人工核酸の転写用に設計される。好ましい実施形態において、ベクターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ、より好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる人工核酸の転写用に設計される。特定の実施形態において、ベクターは、Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１プロモーター、および任意に、選択マーカー、例えば、レポーター遺伝子（ＧＦＰなど）または耐性遺伝子（ピューロマイシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子など）を含み得る。
本発明の一態様によれば、本明細書に記載の人工核酸またはベクターを含む細胞が提供される。細胞は、細菌細胞または真核細胞などの任意の細胞、好ましくは昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）などの脊椎動物細胞であってもよい。細胞は、例えば細菌細胞において、例えば本発明のベクターの複製のために使用され得る。さらに、細胞、好ましくは、真核細胞は、本発明に係る人工核酸分子の合成のために使用され得る。
本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション法、形質導入法、または形質転換法などの標準的な核酸導入法によって得られる。本明細書において使用される場合、用語「トランスフェクション」は一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分子などの核酸分子の細胞への、好ましくは真核細胞への導入を指す。本発明に関して、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞（例えば哺乳類細胞）に導入するための当業者に公知の任意の方法を包含する。このような方法には、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法（例えば、カチオン性脂質および／またはリポソームに基づくリポフェクション法）、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、またはカチオン性のポリマー（例えば、ＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミンなど）に基づくトランスフェクションが包含される。これに関して、本明細書に記載の人工核酸またはベクターは、過渡的アプローチで、または細胞中（例えば、安定な細胞株中）で人工核酸またはベクターを安定に維持するために、細胞中に導入され得る。
好ましくは、細胞は、哺乳類細胞（ヒト対象の細胞、家畜の細胞、実験動物の細胞（マウス細胞またはラット細胞など）など）である。好ましくは、細胞はヒト細胞である。細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３Ｔ、ＣＯＳ－７、ＨＥＬＡ、ＨＥＫ、ジャーカット細胞株などの確立された細胞株の細胞であってもよく、あるいは、細胞は、ヒト皮膚線維芽（ＨＤＦ）細胞などの初代細胞であってもよく、好ましくは生体から単離された細胞であってもよい。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳類対象、好ましくはヒト対象の単離細胞である。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の人工核酸、ベクターまたは細胞、および任意に、追加の賦形剤、好ましくは薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に関する。本明細書に記載の組成物は、好ましくは薬学的組成物である。本明細書に記載の組成物は、遺伝子治療アプローチにおけるような、対象の治療または予防において使用され得る。あるいは、組成物はまた、診断目的のために、または実験用の使用（例えば、インビトロ実験）のために使用され得る。
好ましくは、組成物は一つ以上のビヒクル、希釈剤、および／または賦形剤をさらに含み、それらは薬学的に許容されるものであることが好ましい。本発明に関して、薬学的に許容されるビヒクルは、典型的に、本明細書に記載の組成物用の液体基剤または非液体基剤を含む。一実施形態において、組成物は液体形態で提供される。これに関して、好ましくは、ビヒクルは、発熱物質を含まない水、等張性塩水、緩衝化（水性）溶液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩などの緩衝化溶液）などの水をベースにしたものである。緩衝液は、特定の基準媒質を基準として高張性、等張性または低張性であってもよく、つまり、緩衝液は、特定の基準媒質を基準にしてより高い、同一の、またはより低い塩分を有してもよく、好ましくは、浸透性または他の濃縮影響による哺乳類細胞のダメージをもたらさない、そのような濃度の上述の塩が使用されてもよい。基準媒質は、例えば、インビボ方法で生じる液体（血液、リンパ液、細胞質液、または他の体液など）であり、または、例えば、インビトロ方法において基準媒質として使用され得る液体（一般的な緩衝液または液体など）である。このような一般的な緩衝液または液体は、当業者に既知である。液体基剤としては、乳酸リンゲル液が特に好ましい。
対象への投与に適切な、相溶性のある固体もしくは液体の充填剤または希釈剤またはカプセル化化合物の一つ以上が、本発明の薬学的組成物に同様に使用され得る。本明細書において使用される場合、用語「相溶性のある」は好ましくは、（薬学的）組成物のこれらの成分が、組成物の薬学的有効性を典型的な使用条件のもとで実質的に低下させるような相互作用を生じない様式において、本明細書に規定する人工核酸、ベクター、または細胞と混合可能であることを意味する。
本発明に係る組成物は、任意に、一つ以上の追加の薬学的に活性な成分をさらに含んでもよい。これに関して、薬学的に活性な成分は、特定の徴候または疾患を治癒、改善または予防するための治療的効果を示す化合物である。このような化合物としては、ペプチドもしくはタンパク質、核酸、（治療的に活性な）低分子量の有機化合物もしくは無機化合物（分子量５０００未満、好ましくは１０００未満）、糖、抗原もしくは抗体、または従来技術において既に知られている他の治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、組成物は、人工核酸分子用またはベクター用の担体を含み得る。このような担体は、生理学的に許容される液体への溶解、薬学的に活性な人工核酸分子もしくはベクターの輸送および細胞内取り込みを媒介するのに適し得る。したがって、このような担体は、本明細書に記載の人工核酸分子もしくはベクターのデポー(depot)および送達に適した成分であり得る。このような成分は例えば、トランスフェクション剤または複合体形成剤として機能し得るカチオン性もしくはポリカチオン性の担体または化合物であり得る。これに関して、特に好ましいトランスフェクション剤または複合体形成剤は、カチオン性またはポリカチオン性の化合物である。
「カチオン性化合物」という用語は、典型的には、１～９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５～９）、または８以下（例えば、５～８）、または７以下（例えば、５～７）のｐＨ値、最も好ましくは生理的ｐＨ（例えば７．３～７．４）で正に帯電した（カチオン）荷電分子を指す。したがって、カチオン性化合物は、任意の正に帯電した化合物またはポリマー、好ましくは、生理的条件下で、特にインビボでの生理的条件下で、正に帯電したカチオン性のペプチドもしくはタンパク質、またはカチオン性脂質から選択され得る。「カチオン性のペプチドまたはタンパク質」は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎから選択される、少なくとも一つの正に帯電したアミノ酸、または二つ以上の正に帯電したアミノ酸、を含有し得る。したがって、「ポリカチオン性化合物」は、所定の条件下で二つ以上の陽電荷を示す範囲にも含まれる。
本明細書に記載の組成物は、好ましくはネイキッド(naked)形態または複合形態の人工核酸またはベクターを含む。好ましい実施形態において、組成物は、ナノ粒子、好ましくは脂質ナノ粒子またはリポソーム、の形態の人工核酸またはベクターを含む。
さらなる態様によると、本発明は、本発明の人工核酸分子、ベクター、細胞および／または（薬学的）組成物を含むキットまたはパーツのキットに関する。
好ましくは、キットは、取扱説明書、トランスフェクション用の細胞、組成物を投与するための手段、（薬学的に許容される）担体もしくはビヒクル、および／または人工核酸分子、ベクター、細胞もしくは組成物を溶解もしくは希釈するための（薬学的に許容される）溶液をさらに含む。好ましい実施形態では、キットは、液体形態もしくは固体形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかの本明細書に記載の人工核酸もしくはベクター、および投与用の（薬学的に許容される）ビヒクルを含む。例えば、キットは、人工核酸またはベクターおよびビヒクル（例えば、水、ＰＢＳ、乳酸リンゲルまたは他の好適な緩衝液）を含んでもよく、これらは、対象への投与前に混合される。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、組成物またはキットの使用に関する。
特に、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸、ベクター、細胞、組成物またはキットの使用を含む。そこで、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、組成物またはキットは、好ましくは、標的化配列を介して標的ＲＮＡに特異的に結合することによって、および少なくとも１つのリクルートメント配列、それによる本明細書に記載のデアミナーゼを標的部位にリクルートすることによって、標的ＲＮＡの部位特異的編集を促進するために使用されることが好ましい。この反応は、インビトロまたはインビボで起こり得る。
好ましい実施形態において、人工核酸、ベクターまたは組成物は、編集対象の標的ＲＮＡを含む細胞に投与または導入される。標的ＲＮＡを含む当該細胞は、好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼをさらに含むことが好ましい。当該デアミナーゼは、好ましくは、内因性デアミナーゼ、より好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、または組み換えデアミナーゼ（好ましくは本明細書に記載の、タグ付きデアミナーゼまたは変異デアミナーゼなど）であり、これは、好ましくは人工核酸、ベクターまたは組成物に先行してまたは同時に、上記細胞中で安定に発現されるか、または上記細胞中に導入される。あるいは、本明細書に記載の人工核酸またはベクターを含む細胞は、好ましくは本明細書に記載のように、例えばトランスフェクションによって、細胞と標的ＲＮＡとを接触させることによって、または細胞に標的ＲＮＡを導入することによって、標的ＲＮＡの部位特異的編集のために使用される。
さらに好ましい実施形態では、本発明は、標的ＲＮＡを部位特異的編集するための方法であって、標的ＲＮＡを人工核酸と接触させることを含み、ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸、ベクター、組成物または細胞の使用に関する本明細書に記載の工程を本質的に含む、方法を提供する。
編集反応は、好ましくは標的ＲＮＡの配列分析によってモニターまたは制御される。
本明細書に記載の使用および方法は、さらに、疾患または障害のインビトロ診断においても採用され得る。ここで、当該疾患または障害は、好ましくは、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患もしくは障害からなる群より選ばれ、より好ましくは、遺伝性疾患または遺伝性障害から選択され、これらは、好ましくは、代謝性疾患、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患および神経疾患からなる群より選ばれる。
さらなる態様において、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、組成物、またはキットは、例えば、遺伝子治療における医薬品としての使用のために提供される。好ましくは、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、組成物、細胞、またはキットは、疾患または障害の治療または予防に使用するために提供され、ここで、当該疾患または障害は、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患もしくは障害からなる群より選ばれる。好ましい実施形態によれば、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、組成物、またはキットは、医薬品としての使用のために、または（好ましくは本明細書に規定する）疾患もしくは障害の治療または予防における使用のために提供され、ここで、医薬品としての使用または治療もしくは予防は、標的ＲＮＡの部位特異的編集工程を含む。
一態様において、本発明は、疾患または障害に罹患している対象を治療する方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞または組成物の有効量を対象に投与する工程を含む。本開示に関する有効量は、典型的には、所望の治療効果を誘発するのに十分な量、すなわち、標的ＲＮＡの編集を達成するのに十分な量であると理解される。
当該疾患または障害は、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患もしくは障害からなる群より選ばれ得、ここで、当該疾患または障害は、好ましくは、遺伝性疾患または遺伝性障害から選択され、好ましくは代謝性疾患、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患および神経疾患からなる群より選ばれる。
本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸に、経鼻的に、頬側に、経腟的に、埋め込みリザーバを介して、またはジェット注射を介して、投与され得る。本明細書で用いられる用語「非経口」としては、硝子体内、網膜下、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、心臓内、動脈内、および舌下注射または注入の技術が挙げられる。好ましい実施形態において、本明細書に記載の人工核酸分子、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、無針注射（例えばジェット注射）によって投与される。
好ましくは、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、非経口的に投与され、例えば、注射剤によって投与され、より好ましくは、硝子体内、網膜下、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、心臓内、動脈内、舌下注射または注入の技術によって投与される。特に、皮内注射および筋肉内注射が好ましい。本発明の薬学的組成物の注入可能な無菌の形態は、水性懸濁液または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤ならびに懸濁剤を用いて、当該技術分野で知られている技術にしたがって調合され得る。
本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物はまた、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むが、これらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与されてもよい。
本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、特に、治療の標的が例えば、皮膚または任意の他の到達可能な上皮組織の疾患を含む、局所施用によって容易に到達可能な領域または器官を含む場合に、局所的に投与することもできる。適切な局所製剤は、これらの領域または器官のそれぞれに対して容易に調製される。局所施用のために、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、一つ以上の担体に懸濁または溶解された適切な軟膏中に製剤化され得る。
一実施形態では、医薬品としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション工程、好ましくは哺乳類細胞のインビトロまたはエクスビボトランスフェクション工程、より好ましくは医薬品によって治療される対象の単離細胞のインビトロトランスフェクション工程、を含む。使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬品としての使用は、トランスフェクションされた細胞の患者への再投与をさらに含み得る。人工核酸またはベクターの医薬品としての使用は、首尾よくトランスフェクションされた単離細胞の選択工程をさらに含み得る。したがって、ベクターは、選択マーカーをさらに含む場合に有益であり得る。
本発明の他の態様によれば、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、疾患または障害の診断に使用するために提供され、ここで、当該疾患または障害は、好ましくは感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患もしくは障害からなる群より選ばれ、特に、遺伝性疾患または遺伝性障害から選択され、好ましくは、代謝性疾患、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患および神経疾患からなる群より選ばれる。
〔図面の簡単な説明〕
以下に示す図面は単に例示的なものであり、本発明をさらに説明する。これらの図面は、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
図１：実施例１で使用した人工核酸：
Ａ：８位にＣ／Ａミスマッチを有する２０ヌクレオチドのアンチセンス部分と、ステムループ構造を含む模式的Ｒ／Ｇモチーフとを含む、人工核酸分子。
Ｂ：８位にＣ／Ａミスマッチを有する２０ヌクレオチド標的化配列（ＴＳ）と、ステムループ構造を有するＲ／Ｇモチーフと、アデノシンリンカー（ＡＡＡ）を介して連結された１１～１６個のヌクレオチドを有する３個のリクルートメント配列（ＲＳ ＃１、ＲＳ ＃２、ＲＳ ＃３）のクラスターとを含む、本発明に係る人工核酸分子。
Ｂ：ＨｅＬａ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いたデュアルルシフェラーゼＷ４１７Ｘアンバーレポーターの編集。１２０，０００個の細胞を、２４ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して１ウェルあたり、人工核酸ＡおよびＢをそれぞれコードする８００ｎｇのプラスミド、ならびに２００ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターで、トランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取した。ＲＮＡ単離、ＤＮａｓｅ－Ｉ消化およびＲＴ－ＰＣＲの後、続いてサンガーシーケンスを行った。
図２：Ａ：実施例２で使用した人工核酸およびＲ／Ｇモチーフバージョン：
（Ａ）：リクルートメント配列（ＲＳ）を有さず、１６ｎｔアンチセンス部分およびＲ／Ｇモチーフバージョン２０（ＲＧ－Ｖ２０）を有する、先行技術の設計。
（Ｂ）：３つのリクルートメント配列（３×ＲＳ）およびＲ／Ｇモチーフバージョン２１（ＲＧ－Ｖ２１）を含む、リクルートメントクラスターを有する新規設計。
（Ｃ）：ＲＧモチーフバージョン２０およびバージョン２１の配列。
Ｂ：内因性ヒトＡＤＡＲ１およびアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＡｄＶ）コード化Ｒ／Ｇ ｇＲＮＡを用いた、ＨｅＬａ細胞における編集。
２００ｋ個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種時に１７５ ＭＯＩ ｇＲＮＡ ＡｄＶを用いて、リバーストランスダクション(Reverse transduction)を行った。１７５ ＭＯＩデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂ ＡｄＶまたは５ ＭＯＩ ｗｔ／ｗｔを使用して、播種の２４時間後にフォワードトランスダクション(Forward transduction)を達成した。注：ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）はレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）上で常に正規化されるので、ｗｔ／ｗｔ ＡｄＶの量は、最終パーセンテージに影響を及ぼさない。ルシフェラーゼアッセイは、リバースインフェクション(reverse infection)の９６時間後に行った。
図３：いくつかの細胞株における、ＡｄＶコード化３×ＲＳガイドＲＮＡを用いた内因性ヒトＡＤＡＲ１のリクルートメントを介したデュアルルシフェラーゼレポーターの編集。デュアルルシフェラーゼアッセイを介した分析（Ｎ＝３、それぞれ２回の技術的反復を伴う）。
各細胞タイプについて２５ｋ個の細胞を９６ウェルスケール中に播種した。ＨｅＬａ細胞において、フォワードトランスダクションは播種の２４時間後に達成された。他の全ての細胞において、リバーストランスダクションは播種時に達成された。採取およびルシフェラーゼアッセイは、感染の９６時間後に達成された。
ルシフェラーゼアッセイ：４２０データポイント（Ｄａｔａｐｏｉｎｔｓ）（３５の設定、１つの設定当たり６のレニラおよび６のホタル）
設定：ｇＲＮＡ ＭＯＩ：ＨｅＬａ（１００ ＭＯＩ）、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（１００ ＭＯＩ）、Ｈｕｈ７（７５ ＭＯＩ）、Ａ５４９（７５ ＭＯＩ）、ＨｅｐＧ２（７５ ＭＯＩ）、ＳＹ５Ｙ（１００ ＭＯＩ）、Ｕ８７ＭＧ（１００ ＭＯＩ）、Ｕ２ＯＳ（７５ ＭＯＩ）；ＤＬ ｗｔ／ａｍｂ ５０ ＭＯＩ；ＤＬ ｗｔ／ｗｔ ５ ＭＯＩ。
図４：いくつかの細胞株における、ＡｄＶコード化３×ＲＳガイドＲＮＡを用いた内因性ヒトＡＤＡＲ１のリクルートを介したデュアルルシフェラーゼレポーターの編集。サンガーシーケンスを介した分析。
Ｈｕｈ７細胞、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＳＹ５Ｙ細胞の場合：１ウェルあたり２５，０００個の細胞（９６ウェルスケール）を、１日目の播種時に指示されたＭＯＩでリバースインフェクションさせた。２～４日目に、培地交換を行った。５日目に、１回のＲＴ－ＰＣＲあたり６ウェルの採取およびプールを行った。ＨｅＬａ細胞の場合：１日目に、１ウェルあたり２５，０００個の細胞（９６ウェルスケール）を播種した。２日目に、以下のＭＯＩによるフォワードインフェクションを行った：ＨｅＬａ：ｎ＝２［７５ ＭＯＩ］、ｎ＝２［１００ ＭＯＩ］、ｎ＝２［１２５ ＭＯＩ］；Ｈｕｈ７：ｎ＝３［７５ ＭＯＩ］；Ａ５４９：ｎ＝３［７５ ＭＯＩ］；ＨｅｐＧ２：ｎ＝３［７５ ＭＯＩ］；ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）：ｎ＝３［１００ ＭＯＩ］；ＳＨ－ＳＹ５Ｙ：ｎ＝３［１００ ＭＯＩ］。３～５日目に、培地交換を行った。６日目に、１回のＲＴ－ＰＣＲあたり６ウェルの採取およびプールを行った。
図５：Ａ：６－９×ＲＳガイドＲＮＡおよび内因性ＡＤＡＲ１を使用するＨｅＬａ細胞における、いくつかの疾患関連標的ｍＲＮＡの編集。１２０，０００個の細胞を、２４ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり８００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび２００ｎｇの標的コードプラスミド（ｃＤＮＡ）で、トランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取した。ＲＮＡ単離、ＤＮａｓｅ－Ｉ消化およびＲＴ－ＰＣＲの後、続いてサンガーシーケンスを行った。
Ｂ：標的部位の周囲に標的外バイスタンダー編集が完全に存在しないことを示す、図５Ａに表示されたデータの例示的なサンガーシーケンストレース。
図６：プラスミドをコード化したＲＧ－Ｖ２１＿２０ｐ８＿３×ＲＳおよびＲＧ－Ｖ２１＿２０ｐ８＿８×ＲＳガイドＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞において主にＡＤＡＲ１アイソフォームｐ１１０をリクルートする。１．２×１０５個のＨｅＬａ細胞を１２ウェルスケールに播種し、リバーストランスフェクションを、１ウェルあたり２．５ｐｍｏｌ ｓｉＲＮＡ（３μｌのＨｉｇｈＰｅｒｆｅｃｔ＋２．５μｌの１μＭのｓｉＲＮＡ、およびＯｐｔｉＭｅｍを用いて２００μｌ）を用いる、スクランブルｓｉＲＮＡ、ＡＤＡＲ１ ｓｉＲＮＡ、またはＡＤＡＲ１ｐ１５０ ｓｉＲＮＡで達成した。１つのｓｉＲＮＡあたり６ウェルに播種した。１２ウェルプレートの各使用ウェルは、対応するｓｉＲＮＡについて、示された２００μｌのトランスフェクション混合物を含有した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後、同様に処理したウェルを回収し、細胞をプールした。次いで、２５，０００個の異なる処理をされたＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。
図７：リクルートメント配列の数が編集収率に及ぼす影響。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。ルシフェラーゼ転写産物上の標的配列の位置は濃い灰色で示され、各々のＲＳ結合領域の位置は明るい灰色で示される。編集標的
の位置も示される。個々のＲＳは９～１６ｎｔ長であり、ＡＡＡリンカーによって分離されている。
図８：Ａ：リクルートメント配列長（７～１５ｎｔ／ＲＳ）が編集収率に及ぼす影響。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。
Ｂ：３７℃でのガイドＲＮＡの最小自由エネルギー構造の模式図。
図９：Ａ：アデノシンリンカー長が編集収率に及ぼす影響。ルシフェラーゼ活性（倍率変化）は、ｍＲＮＡ上の対応するｇＲＮＡ結合領域（ＢＲ）を示す模式図の隣に表示される。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。
Ｂ：図９Ａのデータセットは、リクルートメント配列（ＲＳ）間のリンカーとして使用されるアデノシンヌクレオチドの数、およびリクルートメント配列＃１と標的化配列との間のスペーサーとして使用されるアデノシンヌクレオチドの数に関して、対応するｇＲＮＡ組成物を示す模式図の隣に表示される。
図１０：標的ｍＲＮＡ上の３つのリクルートメント配列の配置の最適化。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。（Ｓ＝２つのＲＳ間の短い距離（１５～６２ｎｔ）；Ｌ＝２つのＲＳ間の長い距離（３７５～４６０ｎｔ））
図１１：標的ｍＲＮＡ上の２つの短いリクルートメント配列（１５ｎｔ）のコンテクストにおける、拡張リクルートメント配列（２０ｎｔ）の配置の最適化。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。（Ｓ＝２つのＲＳ間の短い距離（１５～６２ｎｔ）；Ｌ＝２つのＲＳ間の長い距離（３７５～４６０ｎｔ）；１５ｎｔから２０ｎｔに拡張されたＲＳが強調されている）
図１２：Ａ：リクルートメント配列マスキングの影響（アンチセンス部分に強い二次構造を有するガイドＲＮＡのシミュレーション）。図１２Ａの左上の部分は、ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの相互作用を示すために使用される表現を描写する。結合模式図の部分は、ｍＲＮＡ上のｇＲＮＡのリクルートメント配列の結合領域（ＢＲ）を示す。ＲＳ＃１はＢＲ＃１に結合する。ｇＲＮＡ模式図は、Ｒ／ＧモチーフＶ２１、標的化配列、アデノシンヌクレオチドリンカー／スペーサー、リクルートメント配列（ＲＳ）＃１～＃３、およびいくつかの場合では、マスキングリクルートメント配列（ｍＲＳ）＃４～＃６からなるｇＲＮＡの組成を示す。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。
Ｂ：３７℃でのガイドＲＮＡの最小自由エネルギー構造の模式図。
図１３：ｇＲＮＡおよびレポータープラスミドの流体力学的尾静脈（ＨＤＴＶ）注入後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、デュアルルシフェラーゼＷ４１７Ｘアンバーレポーターの編集。陰性対照群マウスを１０μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂレポータープラスミドで処理し、陽性対照群マウスを１０μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ｗｔレポータープラスミドで処理し、編集群マウスを５μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂレポータープラスミドおよび２５μｇのガイドＲＮＡプラスミドで処理した。ガイドＲＮＡは２０－１５－１５－２０ｐ８ガイドＲＮＡであり、したがって、３つのＲＳ（２０ｎｔ長、１５ｎｔ長、および１５ｎｔ長を有する）と、８位のアデノシンとミスマッチするシトシンを有する典型的な２０ｎｔ標的化配列と、を含む。ガイドＲＮＡはさらに、その５’末端にＶ２１Ｒ／Ｇモチーフを含んでいた（図示せず）。編集は、デュアルルシフェラーゼアッセイ（タンパク質レベル）によって、および逆転写後のサンガーシーケンス（ＲＮＡレベル）によって分析した。例示的なサンガーシーケンストレースを示す。
図１４：ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性ＵＴＲ標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。例示的なサンガーシーケンストレースが示され、編集部位および収率が示される。「Ａ」および「Ｇ」は、それぞれアデノシンピークおよびグアノシンピークを表す。
図１５：ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性ＯＲＦ標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて、１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。例示的なサンガーシーケンストレースが示され、編集部位および編集収率が示される。「Ａ」および「Ｇ」は、それぞれアデノシンピークおよびグアノシンピークを表す。
図１６：Ａ：本発明のガイドＲＮＡを、ＮＵＰ４３ Ｖ２３３Ｖを標的とする従来技術のＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡと比較するベンチマーク。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて、１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。Ｎ＝３の生物学的反復。
Ｂ：本発明のガイドＲＮＡを、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ ＴＡＧ＃１を標的とする従来技術のＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡと比較するベンチマーク。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて、１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。Ｎ＝３の生物学的反復。
図１７：リクルートメントクラスターファインダーツールを使用したリクルートメントクラスターインシリコ最適化。
図１８：Ａ：図１８Ｂおよび図１８Ｃの凡例。ＲＭ＝リクルート部分。
Ｂ：リクルートメント配列（ＲＳ）および二本鎖ＡＤＡＲリクルートドメイン（例えば、Ｒ／Ｇモチーフ）は、特定の柔軟性をもって標的化配列（ＴＳ）の周囲に配置することができる。ＨｅＬａ細胞におけるデュアルルシフェラーゼレポーターを標的とするＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡのアンチセンス部分の成分を、従来の＃６－＃５－＃４－ＴＳ設計から開始して、新たに配置した。
Ｃ：デュアルルシフェラーゼアッセイの結果。データは、Ｎ＝５の生物学的反復の平均±ｓ．ｄ．として示す。特に、いくつかの設計（例えば、＃４－ＴＳ－＃３－＃２）は、従来の＃６－＃５－＃４－ＴＳ設計と比較して、良好な編集収率を与えた。重要なことに、前者の設計は、ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡの結合のための標的化アデノシンの配列スペース３’（例えば、結合部位＃３、＃２、＃１）を含むことを可能にする。この実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。
図１９：Ａ：化学的に合成されたＣＬＵＳＴＥＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクションによる、Ｈｕｒｌｅｒ症候群患者由来の初代線維芽細胞（Ｈｕｒｌｅｒ ＦＢ、ＧＭ０６２１４）における疾患関連ｈＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘアンバー突然変異の補正。編集収率は、サンガーシーケンスによって決定した。Ｈｕｒｌｅｒ症候群（ＧＭ０６２１４）を有する患者由来の線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国）から購入した。２．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ中の２．５×１０５個の細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。各試験条件について、１つの６ウェルを使用して、サンガーシーケンスによってＲＮＡ編集率を決定した。ＣＬＵＳＴＥＲ ＡＳＯは、３×ＲＳ（２０－２０ｐ８－２５－２０）ＣＬＵＳＴＥＲ設計を有する、ＰＡＧＥ精製され、末端ブロックされた（２’－ＯＭｅ、ＰＳ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、これは、２つの市販の購入された（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ ＧｍｂＨ、ドイツ）、６９ｎｔ（５’部分）長および８０ｎｔ（３’部分）長のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドから、本発明者らの最近公開されたプロトコールに従って、インハウスでライゲーションされた（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）。完全な配列および修飾パターンを、以下の適用されたｇＲＮＡのリストに示す。トランスフェクションは、それぞれ２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈した１２５ｐｍｏｌのＡＳＯおよび７．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸを用いて播種した２４時間後に行った。両方の溶液を５分間インキュベーションした後に合わせ、さらに２０分間インキュベーションした後、トランスフェクション混合物を１つのウェルに均等に分配した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後、線維芽細胞をＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ、＃７９２１６）中で採取し、続いてＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（ＮＥＢ、＃Ｔ２０３０Ｌ）を用いてＲＮＡ単離を行った。Ｔｕｒｂｏ－ＤＮａｓｅ消化は、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃ＡＭ１９０７）を用いて行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃１８０９００５０）を用いて、５２℃で１時間、ランダムプライマーを用いて逆転写を行った。Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ、＃Ｍ２６７Ｓ）を用いて、１０％ＤＭＳＯを含有する各反応で、通常のＰＣＲ、続いてネステッドＰＣＲを行った。第２のＰＣＲの後、生成物をＳＢ－アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＰＣＲクリーンアップ（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０６０９）後、サンガーシーケンス（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）を行った。
Ｂ：さらに、タンパク質機能の回復を、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性アッセイを用いて決定した。Ｈｕｒｌｅｒ線維芽細胞における測定されたｈＩＤＵＡ酵素活性を、Ｓｃｈｅｉｅ患者線維芽細胞（Ｓｃｈｅｉｅ ＦＢ、ＧＭ０１３２３）にて測定されたＩＤＵＡ酵素活性に対して正規化した。データは個々のデータ点によって示されるように、Ｎ＝４～５の生物学的反復の平均±ｓ．ｄ．として示される。Ｓｃｈｅｉｅ症候群（ＧＭ０１３２３）およびＨｕｒｌｅｒ症候群（ＧＭ０６２１４）の患者由来の線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国）から購入した。２．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１５％ ＦＢＳ中２．５×１０５個の細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。各試験条件について、２つの６ウェルをＩＤＵＡアッセイに使用した。ＣＬＵＳＴＥＲ ＡＳＯは、３×ＲＳ（２０－２０ｐ８－２５－２０）ＣＬＵＳＴＥＲ設計を有する、ＰＡＧＥ精製され、末端ブロックされた（２’－ＯＭｅ、ＰＳ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、これは、２つの市販品（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ ＧｍｂＨ、ドイツ）、ならびに６９ｎｔ（５’部分）および８０ｎｔ（３’部分）長のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドから、本発明者らの最近公開されたプロトコールに従って、インハウスでライゲーションされた（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）。完全な配列および修飾パターンを、以下の適用されたｇＲＮＡのリストに示す。トランスフェクションは、それぞれ２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈した１２５ｐｍｏｌのＡＳＯおよび７．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸで播種した２４時間後に行った。両方の溶液を５分間インキュベートした後に合わせ、さらに２０分間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を１つのウェルに均等に分配した。トランスフェクションの２４時間後に、培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後、線維芽細胞を分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳ中の４０μｌの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を細胞ペレットに添加し、氷上で３０分間インキュベートし、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素アッセイを行った。α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性アッセイによる編集読み出しのために、４－メチルウンベリフェロン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ１３８１）の標準希釈系を、１×ＰＢＳ中で調製した。各濃度について、２５μｌの標準溶液を２５μｌの０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に添加し、３反復で９６ウェルＬｕｍｉＮｕｎｃプレート（ＶＷＲ、７３２－２６９６）に適用した。基質（４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニド、グリコシン、＃４４０７６）を０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、最終濃度を１８０μＭとした。ＨｅＬａ細胞を用いたマウスＩＤＵＡアッセイのために、２５μｌの１：３希釈細胞溶解物（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ）をプレート中の２５μｌの基質に加え、暗所で、３７℃で、４５分間インキュベートした。２５μｌの未希釈の細胞溶解物（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ）をプレート中の２５μｌの基質に加え、暗所で、３７℃で、９０分間インキュベートした。２００μｌの炭酸グリシン緩衝液（０．１７Ｍグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１０．４）を添加することによって、両方の場合で反応をクエンチした。４－メチルウンベリフェロンの蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーを用いて、励起波長３５５ｎｍ、発光波長４６０ｎｍで測定した。計算された酵素活性は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、２３２２７）によって決定されるタンパク質量を基準とした。酵素活性をＳｃｈｅｉｅ線維芽細胞溶解物に標準化した。
図２０：Ａ：１９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡを用いて、２９３個のＦＴ細胞から内因性ＲＡＢ７Ａの３’－ＵＴＲにおける５’ＵＡＧ部位まで、内因性ＡＤＡＲをリクルートするためのポリ（Ａ）＋トランスクリプトームにおける標的外編集の分析。散布図は、ＣＬＵＳＴＥＲまたは非標的化ガイドＲＮＡを有するプラスミドでトランスフェクションされた細胞における編集レベルを比較する約３０，０００個の部位での差次的編集を示す。実験は、２つの独立した反復を用いて行った。標的上の編集は矢印で示される。有意に異なる編集部位（調整Ｐ＜０．０１、フィッシャーの正確確率検定、両側、Ｎ≧５０）を、黒色で強調する。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定には、非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）およびＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡが含まれる。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて、２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。
Ｂ：２９３個のＦＴ細胞から１１１ｎｔのＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを有する内因性ＲＡＢ７Ａの３’－ＵＴＲにおける５’ＵＡＧ部位に、内因性ＡＤＡＲをリクルートするためのポリ（Ａ）＋トランスクリプトームにおける標的外編集の分析。散布図は、ＬＥＡＰＥＲまたは非標的化ガイドＲＮＡを有するプラスミドでトランスフェクションされた細胞における編集レベルを比較する約３０，０００個の部位での差次的編集を示す。実験は、２つの独立した反復を用いて行った。標的上の編集は矢印で示される。有意に異なる編集部位（調整Ｐ＜０．０１、正確確率検定、両側、Ｎ≧５０）を黒色で強調する。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）およびＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。
Ｃ：バイスタンダー編集のための標的上の編集を用いて全てのＮＧＳリードを分析することによって編集精度を評価する。ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡは主にクリーンなシーケンスリード、および小さい割合で単一のバイスタンダー編集を伴うリードを与えるが、ＬＥＡＰＥＲサンプル由来のリードは、非常に頻繁にいくつかのバイスタンダー編集を含んでいた。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、（１）非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）、（２）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡ、および（３）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。
Ｄ：クリーン編集（バイスタンダー無し）と標的上の全ての編集の収率の推定。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、（１）非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）、（２）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡ、および（３）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。
図２１：次世代シーケンシングによって決定された、ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡおよびＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを用いたＲＮＡ編集によって誘導された、標的外事象のリスト。このリストは、細胞がＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡまたはＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡのいずれかで処理され、非標的化対照ガイドＲＮＡ（ＮＴ ｇＲＮＡ）と比較された場合に、少なくとも１つのサンプル中の有意に区別されるように編集された部位を探索するパイプラインによって検出された、「未知（unknown）」の部位での標的外編集事象のサブセットを示す。部位がＲＡＤＡＲデータベースに列挙されていない場合には、部位に「未知」を割り当てた。非同義編集は、単一の部位ＨＴＡＴＳＦ１（Ｓ７４２Ｇ）についてのみ検出された。マッピング分析は、ＣＴＮＮＡＬ１、ＨＴＡＴＳＦ１、およびＺＮＦ７４０に対するＲＡＢ７ＡガイドＲＮＡの潜在的な標的外結合のための部位を検出した。検出されたＲＡＢ７Ａ部位は、パイプラインの有意性およびカットオフ基準を満たす、標的部位の近いバイスタンダー編集部位の割合を表す。データは、Ｎ＝２のＮＧＳ反復の平均±ｓ．ｄ．を表す。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、（１）非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）、（２）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡ、および（３）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。
実施例
以下に示す実施例は単なる例示であり、本発明をさらに説明するものである。これらの実施例は、本発明をそれに限定するものと解釈されるべきではない。
別段の記載がない限り、本明細書で提供される核酸配列は、５’から３’へと印刷される。別の言い方をすれば、本明細書に印刷される核酸配列中の最初のヌクレオチド残基は別段の記載がない限り、前記核酸配列の５’末端である。アミノ酸配列は別段の記載がない限り、Ｎ末端からＣ末端へと印刷される。
実施例１：ＨｅＬａ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いたデュアルルシフェラーゼＷ４１７Ｘアンバーレポーターの編集
実施例１で用いた人工核酸の一般構造を図１Ａに示す：
Ａ：８位にＣ／Ａミスマッチを有する２０個のヌクレオチドのアンチセンス部分と、ステムループ構造を有する模式的Ｒ／Ｇモチーフとを含む先行技術の人工核酸分子。
Ｂ：８位にＣ／Ａミスマッチを有する２０個のヌクレオチドのアンチセンス部分と、ステムループ構造を有するＲ／Ｇモチーフと、アデノシンリンカー（ＡＡＡ）を介して連結された１１～１６個のヌクレオチドを有する３個のリクルートメント配列（ＲＳ ＃１、ＲＳ ＃２、ＲＳ ＃３）のクラスターとを含む、本発明に係る人工核酸分子。
１２０，０００個のＨｅＬａ細胞を２４ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して１ウェルあたり、人工核酸ＡおよびＢをそれぞれコードする８００ｎｇのＲＮＡプラスミド、ならびに４０ｎｔのアンチセンス部分を含む人工核酸、および８個のリクルートメント配列のクラスターを含む人工核酸、および２００ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取した。ＲＮＡ単離、ＤＮａｓｅ－Ｉ消化およびＲＴ－ＰＣＲの後、続いてサンガーシーケンスを行った。
図１Ｂに示されるように、リクルートメント配列（ＲＳ）のない先行技術の２０ｎｔの短いＲ／ＧガイドＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞において内因性ＡＤＡＲ１を効率的にリクルートすることができない。２０ｎｔの標的化配列を有するガイドＲＮＡへの３個のリクルートメント配列の添加は、編集を０％から２０％まで劇的に増加させる。２０ｎｔの標的化配列を有するガイドＲＮＡへの８個のリクルートメント配列の添加は、編集を０％から２４％まで劇的に増加させる。ＩＦＮａによるＨｅＬａ細胞の処理は、編集をわずかに増加させる。
実施例２：内因性ヒトＡＤＡＲ１およびＡｄＶコード化Ｒ／Ｇ ｇＲＮＡを用いたＨｅＬａ細胞における編集
さらなる実験において、ＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡ編集を、Ｒ／Ｇ－Ｖ２０モチーフと１６個のヌクレオチドの標的化配列とを含む先行技術のガイドＲＮＡ設計、および、Ｒ／Ｇ－Ｖ２１モチーフと、２０個のヌクレオチドの標的化配列と、トリプルアデノシンリンカー（ＡＡＡ）によって連結された１１～１６個のヌクレオチドを有する３個のリクルートメント配列を含むリクルートメントクラスターとを含む本発明に係る人工核酸を用いて研究した。人工核酸のリクルートメント配列（ＲＳ ＃１、ＲＳ ＃２、ＲＳ ＃３）によって結合される標的ＲＮＡ上の領域は、標的ＲＮＡ上で１０～１００個のヌクレオチド隔てられていることに留意されたい（図２Ａ参照）。
２００ｋ個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種時に１７５ ＭＯＩ（感染多重度）ｇＲＮＡ ＡｄＶを用いてリバーストランスダクション(Reverse transduction)を行った。１７５ ＭＯＩデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂ ＡｄＶまたは５ ＭＯＩ ｗｔ／ｗｔを使用して、播種の２４時間後にフォワードトランスダクション(Forward transduction)を達成した。ルシフェラーゼアッセイは、リバースインフェクション(reverse infection)の９６時間後に行った。
図２Ｂに示されるように、標的ＲＮＡ上の１１～１６個のヌクレオチドの領域に結合する３個のリクルートメント配列（ＲＳ ＃１、ＲＳ ＃２、ＲＳ ＃３）を含むリクルート部分を含む本発明に係る人工核酸は、ルシフェラーゼ活性を１００％に回復させるが、リクルートメント配列を欠く先行技術の設計は、（正規化された）ルシフェラーゼ活性を１．５％までしか回復させることができない。
実施例３：いくつかの細胞株におけるアデノウイルスコード化３×ＲＳガイドＲＮＡを用いた内因性ヒトＡＤＡＲ１のリクルートを介したデュアルルシフェラーゼレポーターの編集
いくつかの細胞株においてアデノウイルス（ＡｄＶ）コード化３×ＲＳガイドＲＮＡを用いた内因性ヒトＡＤＡＲ１のリクルートを介したデュアルルシフェラーゼレポーターの編集を評価するために、各細胞タイプについて２５ｋ個の細胞を９６ウェルスケール中に播種した。ＨｅＬａ細胞において、フォワードトランスダクションは、播種の２４時間後に達成された。他の全ての細胞において、リバーストランスダクションは、播種時に達成された。採取およびルシフェラーゼアッセイは、感染の９６時間後に行われた。
図３に示すように、ＲＮＡ編集によるホタルルシフェラーゼ活性の回復は、内因性ＡＤＡＲ１のみを利用することによって、異なる組織（脳、肝臓、肺、子宮頸部）に由来するいくつかの細胞株において達成することができた。ＨｅＬａ細胞において、正規化されたホタルルシフェラーゼ活性は、野生型レベルの９０％まで回復することができた。読み出しはルシフェラーゼアッセイであった。
実施例４：ＡｄＶコード化３×ＲＳガイドＲＮＡおよび内因性ＡＤＡＲ１を用いた、いくつかの細胞株におけるデュアルルシフェラーゼレポーターの編集
Ｈｕｈ７、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２およびＳＹ５Ｙ細胞の場合：１ウェルあたり２５，０００個の細胞（９６ウェルスケール）を、１日目の播種時に指示されたＭＯＩでリバースインフェクションさせた。２～４日目に培地交換を行った。１回のＲＴ－ＰＣＲあたり６ウェルの採取およびプールを５日目に行った。ＨｅＬａ細胞の場合：１ウェルあたり２５，０００個の細胞（９６ウェルスケール）を１日目に播種した。指示されたＭＯＩによるフォワードインフェクションを２日目に行った。３～５日目に培地交換を行った。１回のＲＴ－ＰＣＲあたり６ウェルの採取およびプールを６日目に行った。
図４に示されるように、編集は、内因性ＡＤＡＲ１のみを使用することによって、異なる組織（脳、肝臓、肺、子宮頸部）に由来するいくつかの細胞株において達成することができた。今回、読み出しはサンガーシーケンス（ＲＮＡレベル）であった。しかしながら、結果は、実施例３、図３に示されるルシフェラーゼ活性（タンパク質レベル）の回復と一致する。
実施例５：６－９×ＲＳガイドＲＮＡおよび内因性ＡＤＡＲ１を用いた、ＨｅＬａ細胞におけるいくつかの疾患関連標的ｍＲＮＡの編集
本発明の人工核酸（ガイドＲＮＡ）の治療可能性を評価するために、６－９×ＲＳガイドＲＮＡおよび内因性ＡＤＡＲ１を用いて、ＨｅＬａ細胞における以下の疾患関連標的ｍＲＮＡの編集を試験した。標的ｍＲＮＡは、ｐｃＤＮＡ３発現プラスミド上のｃＤＮＡとしてコードされた。
ＢＭＰＲ２：骨形成タンパク質受容体タイプＩＩ（ＢＭＰＲ２）における変異は、肺動脈高血圧症の最も一般的な遺伝的原因である。
ＣＯＬ３Ａ１：ＣＯＬ３Ａ１における突然変異は、常染色体優性結合組織疾患であるエーラース－ダンロー症候群タイプＩＶの根底にあることが同定されている。
ＦＡＮＣＣ：ＦＡＮＣＣ（ファンコニ貧血相補性群Ｃ）の突然変異に関連する疾患には、ファンコニ貧血、相補性群Ｃおよびファンコニ貧血、相補性群Ａが含まれる。
ＡＨＩ：ＡＨＩ１はＪｏｕｂｅｒｉｎタンパク質を特異的にコードし、当該遺伝子の発現における突然変異は、ジュベール症候群の特定の形態を引き起こすことが知られている。
ＭＹＢＰＣ：心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭｙＢＰ－Ｃ、ＭＹＢＰＣ３によってコードされる）における突然変異は、肥大型心筋症の最も一般的な原因である。
ＩＬ２ＲＧ：重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）は、重度の細胞性および体液性免疫障害の症候群である。ヒトにおいて、ＳＣＩＤは、インターロイキン－２および複数の他のサイトカインに対する白血球受容体の共通γ鎖、γｃをコードするＸ連鎖遺伝子ＩＬ２ＲＧにおける突然変異によって最も一般的に引き起こされる。
ＰＩＮＫ１：ＰＴＥＮ誘導キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）は、ＰＩＮＫ１遺伝子によってコードされるミトコンドリアセリン／トレオニン－タンパク質キナーゼである。ストレス誘発性ミトコンドリア機能不全から細胞を保護すると考えられている。この遺伝子における突然変異は、常染色体劣性早発性パーキンソン病の一形態を引き起こす。
１２０，０００個の細胞を２４ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり８００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび２００ｎｇの標的コードプラスミド（ｃＤＮＡ）でトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取した。ＲＮＡ単離後、ＤＮａｓｅ－Ｉ消化およびＲＴ－ＰＣＲを行い、続いてサンガーシーケンスを行った。
図５Ａに示されるように、標的部位での編集は、全ての疾患関連標的ｍＲＮＡにおいて検出された。標的上の編集レベルは、ＰＩＮＫ１＿Ｗ４３７Ｘ、ＩＬ２ＲＧ＿Ｗ２３７Ｘ、およびＭＹＢＰＣ３＿Ｗ１０９８Ｘ ｍＲＮＡでは５～１５％、ＡＨＩ＿Ｗ７２５ＸおよびＦＡＮＣＣ＿Ｗ５０６Ｘ ｍＲＮＡでは３０％まで、ＣＯＬ３Ａ１＿Ｗ１２７８ＸおよびＢＭＰＲ２＿Ｗ２９８Ｘ ｍＲＮＡでは最大５５～６０％まで変動した。特に、標的アデノシンのごく近傍に存在する編集可能なアデノシンヌクレオチドであっても、標的外バイスタンダー編集は、サンガーシーケンスによって検出されなかった。これを示す４個の例示的なサンガーシーケンストレースを図５Ｂに示す。
実施例６：プラスミドをコード化したＲＧ－Ｖ２１＿２０ｐ８＿３×ＲＳガイドＲＮＡおよびＲＧ－Ｖ２１＿２０ｐ８＿８×ＲＳガイドＲＮＡはＨｅＬａ細胞において主にＡＤＡＲ１ｐ１１０をリクルートする
どのＡＤＡＲアイソタイプが本発明の人工核酸（ガイドＲＮＡ）によって主にリクルートされるかを調べるために、１．２×１０５個のＨｅＬａ細胞を１２ウェルスケール中に播種し、１ウェルあたり２．５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ（３μｌのＨｉｇｈＰｅｒｆｅｃｔ＋２．５μｌの１μＭのｓｉＲＮＡ、ＯｐｔｉＭｅｍを用いて２００μｌ）を使用して、スクランブルｓｉＲＮＡ、ＡＤＡＲ１ ｓｉＲＮＡ、またはＡＤＡＲ１ｐ１５０ ｓｉＲＮＡを用いてリバーストランスフェクションを行った。１つのｓｉＲＮＡあたり６ウェルに播種した。１２ウェルプレートの各使用ウェルは、対応するｓｉＲＮＡについて示された２００μｌのトランスフェクション混合物を含有していた。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後、同様に処理したウェルを採取し、細胞をプールした。次いで、別に処理された２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図６に示されるように、ＡＤＡＲ１（アイソフォームｐ１１０およびｐ１５０）のｓｉＲＮＡノックダウンはルシフェラーゼアッセイにおいて編集をほぼ１０倍減少させたが、特異的ＡＤＡＲ１ｐ１５０ノックダウンは編集収率に対して最小の効果しか有さなかった。細胞のインターフェロン－α誘導は、編集収率をほとんど増加させず、編集がＩＦＮ－α誘導性ＡＤＡＲ１ｐ１５０アイソフォームによるよりもむしろ構成的に発現されたＡＤＡＲ１ｐ１１０によって行われることを支持した。対応するウエスタンブロットで見られるように、ノックダウンは非常に効率的であり、標的タンパク質のほぼ完全な除去をもたらした。
実施例７：リクルートメント配列の数が編集収率に及ぼす影響
リクルート部分に含まれるリクルートメント配列の数が編集収率に及ぼす影響を調べるために、０、１、２、３、６、８、または２０個のリクルートメント配列、２０ｎｔの標的化配列およびＲＧ－Ｖ２１モチーフをそれぞれ含むリクルート部分を有するいくつかの人工核酸（ガイドＲＮＡ）を構築した。ＲＳは長さが９～１６ｎｔの間であり、トリプルアデノシンリンカーによって互いに連結されていた。
２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図７に示されるように、本発明におけるＲＳ要素の数は、効率的な編集を達成するために重要である。少なくとも２個のＲＳは、顕著な編集を提供する。３～８個のＲＳが最適と思われる。しかしながら、ＲＳの数の単なる増加、例えば２０×ＲＳは、改善された編集収率を与えなかった。
実施例８：リクルートメント配列の長さが編集収率に及ぼす影響
リクルートメント配列の長さが編集収率に及ぼす影響を調べるために、異なる長さの３個のリクルートメント配列を含むリクルート部分を有する、本発明に係るいくつかの人工核酸（ガイドＲＮＡ）を構築した。ＲＳの長さと標的ｍＲＮＡ上のそれらの結合領域の位置を図８において異なる構築物に対して示した。標的配列、ＲＳの結合領域および標的コドン
を示す。ガイドＲＮＡはさらに、５’端末Ｒ／Ｇモチーフを含んでいた（Ｖ２１、示さず）。
２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図８に示すように、リクルートメント配列（ＲＳ）の長さは、効率的な編集を達成するための本発明における重要な最適化パラメータである。典型的には、顕著な編集収率が１１ｎｔ以上のリクルートメント配列（ＲＳ）を用いて得られる。
実施例９：リンカーの長さが編集収率に及ぼす影響
リクルートメント配列を隔てるヌクレオチドリンカー／スペーサーの長さが編集収率に及ぼす影響を調べるために、リンカー、ならびに０、１、２、３、４、５および１０個のアデノシンヌクレオチドを含むスペーサーをそれぞれ有するいくつかの人工核酸（ガイドＲＮＡ）を構築した。図９Ａの左上の部分は、ｇＲＮＡとｍＲＮＡの相互作用を示すために用いられた図である。けば線およびパターンは図９Ａの右上の凡例に示されるように、ｇＲＮＡ（標的化配列、スペーサー、第１のリクルートメント配列、リンカー、第２のリクルートメント配列、リンカー、第３のリクルートメント配列）および標的ｍＲＮＡ（標的配列、次の結合領域までの距離、結合領域＃１、次の結合領域までの距離、結合領域＃２、次の結合領域までの距離、結合領域＃３）の部分構造を示した。リンカーを介して互いに連結されているリクルートメント配列、およびスペーサーを介して第１のリクルートメント配列に連結されている標的化配列は図９Ａの下部に示されているように、この実施例で比較した全ての人工核酸についてｍＲＮＡ上の同じ結合領域に結合する。図９Ｂは、リクルートメント配列間のアデノシンヌクレオチドの数が異なるｇＲＮＡ間の差異を示す。
編集収率（リンカーとして３つのアデノシンヌクレオチドを用いた設計に対する相対的な倍率変化として表示）を図９Ａおよび９Ｂで、対応するｇＲＮＡ結合部位（図９Ａ）またはｇＲＮＡ組成（図９Ｂ）の隣にそれぞれ表示する。２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図９Ａ（ｍＲＮＡ上のｇＲＮＡの結合領域）および図９Ｂ（ガイドＲＮＡの組成）に示されるように、リンカーの長さは、本発明における編集収率に比較的わずかな効果を有する。しかし、ＲＳ間の３個のアデノシンの最適なリンカーの長さが観察された。
実施例１０：標的ｍＲＮＡ上の３つのリクルートメント配列の配置の最適化
領域を隔てる距離が、個々のリクルートメント配列が結合する標的ｍＲＮＡに及ぼす影響を評価するために、標的ＲＮＡ上の特定の領域にそれぞれ短い距離（１５～６２個のヌクレオチド）または長い距離（３７５～４６０個のヌクレオチド）で結合する１５個のヌクレオチドの３個のリクルートメント配列を有するいくつかの人工核酸（ガイドＲＮＡ）を構築した。構築物および標的ｍＲＮＡ上のそれらの位置を図１０に示す。
２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図１０に示すように、個々のＲＳの位置はＲＮＡ編集収率に影響を及ぼし、標的部位に近い位置を好む。しかしながら、１つのＲＳが標的部位の近くに位置しない限り、他のＲＳは効率の重大な損失なしに、かなり遠い領域に結合することができ、本発明におけるガイドＲＮＡ設計の柔軟性および最適化に利用可能な大きな配列空間を強調する。
実施例１１：標的ｍＲＮＡ上の２つの短いＲＳ（１５ｎｔ）のコンテクストにおける拡張ＲＳ（２０ｎｔ）の配置の最適化
標的ｍＲＮＡ上のリクルートメント配列結合領域の距離とリクルートメント配列の長さとの相関を評価するために、それぞれ１５ｎｔの２個のＲＳおよび２０ｎｔの１個のＲＳを有するいくつかの人工核酸（ガイドＲＮＡ）を構築した。それらは、それぞれ短い距離（１５～６２個のヌクレオチド）または長い距離（３７５～４６０個のヌクレオチド）で標的ＲＮＡ上の特定の領域に結合する。構築物および標的ｍＲＮＡ上のそれらの位置を図１１に示す。
２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図１１に示されるように、標的部位（短い）にごく近接したＲＳの位置は、他の設定（長い）よりも好ましい。このことは実施例１０、図１０と一致している。しかし、拡張ＲＳ（２０ｎｔ）の配置は両方の設定（長いおよび短い）において、ガイドＲＮＡの３’末端で最も有効である。したがって、ガイドＲＮＡの３’末端に延長されたリクルートメント配列（ＲＳ）の配置は、ＲＳからＲＳまでの距離（短い対長い）とは無関係に編集収率が増加する可能性がある。それゆえ、３’末端ＲＳは、他のＲＳよりも長いことが好ましい。ＲＳ ＃１および＃２の長さは、それほど重要ではないようである。
実施例１２：リクルートメント配列マスキングが編集収率に及ぼす影響（アンチセンス部分に強い二次構造を有するガイドＲＮＡのシミュレーション）
リクルートメント配列マスキングの影響を評価するために、標的ｍＲＮＡ上の特定の領域に結合する３個のリクルートメント配列（ＲＳ＃１、ＲＳ＃２、ＲＳ＃３）と、様々な程度でさらなるリクルートメント配列（ＲＳ＃４、ＲＳ＃５、ＲＳ＃６）とをそれぞれ含むいくつかの人工核酸（ガイドＲＮＡ）を構築し、それによって、アンチセンス部分において強い二次構造を有するガイドＲＮＡをシミュレートした。構築物を図１２に示す。図１２Ａの左上は、ｇＲＮＡとｍＲＮＡの相互作用を示すのに用いられた図である。けば線およびパターンは図１２Ａの右上の凡例に示されるように、ｇＲＮＡ（標的化配列、スペーサー、第１のリクルートメント配列、リンカー、第２のリクルートメント配列、リンカー、第３のリクルートメント配列）および標的ｍＲＮＡ（標的配列、次の結合領域までの距離、結合領域＃１、次の結合領域までの距離、結合領域＃２、次の結合領域までの距離、結合領域＃３）の部分構造を示した。図１２Ａの結合模式図の部分に示されるように、この実施例において比較される全ての人工核酸について、リクルートメント配列および標的化配列は、ｍＲＮＡ上の同じ結合領域に結合する。ｇＲＮＡ中の対応するリクルートメント配列がマスキングリクルートメント配列（ｍＲＳ）によってマスキングされている結合領域は、垂直線パターンで強調されている。マスキングリクルートメント配列（ｍＲＳ）は実際のｍＲＮＡ結合リクルートメント配列まで折り返され、それによって、これらのリクルートメント配列がそれらのそれぞれの結合領域と相互作用することを妨げる。ｇＲＮＡ中のリクルートメント配列をマスキングすることによってマスキングされず、したがってｇＲＮＡ－ｍＲＮＡ相互作用のために使用され得る結合領域は、右傾きの線パターンによって強調される。図１２ＡのｇＲＮＡ模式図の部分は、ｇＲＮＡ間の差異を示している。これらの差異は追加のマスキングリクルートメント配列（ｍＲＳ）であり、実際のｍＲＮＡ結合リクルートメント配列まで折り返され、それによってｇＲＮＡ－ｍＲＮＡ相互作用の目的のためにそれらをマスキングする。
２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図１２Ａに示されるように、マスキングされたリクルートメント配列を有するガイドＲＮＡは、３個のマスキングされていないヌクレオチドリクルートメント配列（３×ＲＳ ｇＲＮＡ、マスキングなし）を含むガイドＲＮＡと比較して、明らかに減少した編集収率を示す。編集収率は、マスキングされたリクルートメント配列の数の増加と共に段階的に減少した。したがって、この実験は、アンチセンス部分（ＲＳおよび標的化配列）に強い二次構造を有するガイドＲＮＡが、減少した編集収率を示し、回避されるべきであることを示唆しており、したがって、ガイドＲＮＡ配列のコンピュータによる設計に含まれている。
図１２Ｂに、実施例１２で使用したガイドＲＮＡ構築物の最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造を表す。図８Ｂにおける最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造との比較は、記載されたソフトウェアが弱い二次構造を有するｇＲＮＡをスクリーニングすることをどれだけ効率的に可能にするかを示し、また、この実験に関してその重要性を強調する。
実施例１３：ｇＲＮＡおよびレポータープラスミドのＨＤＴＶ注射後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるデュアルルシフェラーゼＷ４１７Ｘアンバーレポーターのインビボ編集
動物実験における本発明の人工核酸の編集能力を調べるために、人工核酸（ガイドＲＮＡ）を、流体力学的尾静脈（ＨＤＴＶ）注射を介してＣ５７ＢＬ／６マウスに送達した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、その体重の１０％に等しい総体積で生理食塩水中に希釈したエンドトキシンを含まないプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）で処理した。前記総体積の流体力学的尾静脈（ＨＤＴＶ）注入を５～１０秒以内に行った。陰性対照群マウスを１０μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂレポータープラスミドで処理し、陽性対照群マウスを１０μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ｗｔレポータープラスミドで処理し、編集群マウスを５μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂレポータープラスミドおよび２５μｇのガイドＲＮＡプラスミドで処理した。注射の７２時間後、マウスを屠殺した。肝葉を個々に摘出した。各葉を３つの断片に切断し、それを他の葉の断片と一緒に再びプールして、最終的に１匹のマウスあたり３つのサンプルカテゴリーを得、それぞれが等量の各肝葉を含有していた（サンプルカテゴリーＡ、Ｂ、およびＣ）。カテゴリーＡのサンプルをルシフェラーゼアッセイに使用し、カテゴリーＢのサンプルをＲＮＡ単離に使用し、カテゴリーＣのサンプルをバックアップ材料として－８０℃で保存した。カテゴリーＢおよびＣのサンプルを液体窒素中で直ちに凍結した。カテゴリーＡのサンプルを、５００μｌの１×受動的溶解緩衝液(passive lysis buffer)中で、マイクロ乳棒を用いてホモジナイズした。サンプルを５～１０秒間回転させた後、１ウェルあたり５０μｌのサンプルを白い９６ウェルＬｕｍｉＮｕｎｃプレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に移した。各サンプルを、１ウェルあたり３５μｌの各アッセイ基質を用いて、自動注射器を備えたＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーで３回測定した。カテゴリーＢのサンプルを、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）およびマイクロ乳棒を用いて、１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中でホモジナイズした。２００μｌのクロロホルムを添加し、３０秒間ボルテックスした後、それらを室温で５～１０分間インキュベーションした。その後、４℃、１２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次いで、水相を新しいチューブに移し、７００μｌの氷冷イソプロパノールを加えた。－２０℃で一晩沈殿させた後、沈殿物を１４，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、５００μｌの７５％ ＥｔＯＨで２回洗浄した。１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ペレットを５０℃で３分間乾燥し、次いで８７．５μｌのヌクレアーゼを含まない水に溶解した。ＴＲＩｚｏｌ単離後、１０μｌのＤＮａｓｅ－Ｉ緩衝液および２．５μｌのＤＮａｓｅ－Ｉ（ＮＥＢ）を添加することにより、３７℃で３０分間、ＲＮＡをＤＮａｓｅ－Ｉ消化した。次に、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＲＮＡ単離キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＲＮＡを今回２回洗浄した。逆転写は、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＮＥＢ）、ランダムプライマーミックス（Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１μｇの全ＲＮＡを用いて行った。ＰＣＲクリーンアップ（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｋｉｔ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）後、プライマー対２８９８＋２８９９を用いて２．５μｌのｃＤＮＡをＱ５－ポリメラーゼ（ＮＥＢ）ＰＣＲに使用し、続いてプライマー対３８５０＋３８５１を用いてネステッドＰＣＲを行った。サンガーシーケンス（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を、プライマー３８５０を用いて行った。
図１３に示すように、５μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂレポータープラスミドおよび２５μｇのガイドＲＮＡプラスミドルシフェラーゼで処理したマウスでは、活性は、ルシフェラーゼシグナル（タンパク質レベル）の回復によって示されるように、陽性対照群と比較して１０．６％に回復した。陰性対照群と比較して、本発明の人工核酸（ガイドＲＮＡ）で処理された「編集群」のルシフェラーゼ活性は、約＞１０００倍増加した。ルシフェラーゼシグナルの回復（陽性対照の１０．６％）は、ＲＴ－ＰＣＲ後のサンガーシーケンスによってＲＮＡレベルで確認された（１０．６％編集収率）。代表的なサンガーシーケンストレースと編集収率を示した。
実施例１４：ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性非翻訳領域（ＵＴＲ）標的の編集
Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－７ａはヒトにおいてＲＡＢ７Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、ＲＡＢ７Ａ遺伝子における突然変異は、例えばシャルコー・マリー・トゥース病を含むいくつかの疾患に関連する。
ＲＡＢ７Ａ遺伝子のＵＴＲ標的配列の編集を評価するために、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に本発明の人工核酸（ガイドＲＮＡ）をトランスフェクションした。
６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。
図１４に示されるように、本発明のガイドＲＮＡはＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＲＡＢ７Ａ ＵＴＲ標的部位での最良の編集と共に、平均で２０～４４％の編集収率を提供する。特に、標的部位の周囲に検出可能なバイスタンダー編集はなかった。例として、サンガーシーケンストレースは、ＲＡＢ７Ａ標的部位について与えられる（図１４、下パネルを参照）。この標的のＲＳ結合領域のさらなる分析を図１６に示す（ＬＥＡＰＥＲベンチマーク）。
実施例１５：ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いたいくつかの内因性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）標的の編集
ＮＵＰ４３遺伝子は、細胞質と核との間の巨大分子の双方向輸送に影響する核膜孔複合体の構成要素であるヌクレオポリン４３をコードし、ＮＵＰ４３遺伝子の突然変異は、ファンコニ貧血、相補群Ｌ、および家族性心房細動を含むいくつかの疾患と関連している。
ＧｕｓＢは、グルコサミノグリカンの分解に関与するβ－グルコロニダーゼをコードする遺伝子であり、ＧｕｓＢ遺伝子における突然変異は、ムコ多糖症、ＶＩＩ型、およびムコ多糖症、ＶＩ型を含むいくつかの疾患と関連する。
ＮＵＰ４３およびＧｕｓＢ遺伝子のＯＲＦ標的配列の編集を評価するために、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に本発明の人工核酸（ガイドＲＮＡ）をトランスフェクションした。
６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。
図１５に示されるように、本発明のガイドＲＮＡは例えば、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞においてＧＵＳＢ中のＯＲＦ部位Ｌ４５６Ｌを標的とする場合、３８％までの編集収率を提供する。特に、バイスタンダーの標的外編集は、標的部位の周囲にほとんど存在しない。ＧＵＳＢ Ｌ４５６ＬおよびＮＵＰ４３ Ｖ２３３Ｖについて、標的部位の周りの例示的なサンガーシーケンストレースを示す（図１５、下パネル）。ＮＵＰ４３標的のＲＳ結合領域のさらなる分析を図１６に示す（ＬＥＡＰＥＲベンチマーク）。
実施例１６：本発明の標的上の収率および望ましくないバイスタンダーの標的外編集と先行技術のＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡとを比較するベンチマーク
６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。
図１６Ａおよび１６Ｂに示されるように、本発明のガイドＲＮＡは望ましくないバイスタンダーの標的外編集を回避しながら、高収率で効率的な標的上の編集を可能にする。データは、ＲＳのインシリコ選択プロセスがバイスタンダー編集の大幅な低減または完全な回避さえももたらすが、１１１ｎｔのＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡはバイスタンダー編集を確実に回避するために必要な設計柔軟性を欠いていることを示している。ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡは、Ｑｕら（Nature Biotech、上記）に従って、標的部位の周りに対称的に配置された非構造化１１１ｎｔガイドＲＮＡとして設計された。彼らの以前の研究の通り、ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡは様々な部位、例えば、ＲＡＢ７Ａにおいて最大２０部位で、最大５０％の編集収率まで、大量のバイスタンダーの標的外編集を誘導した（図１６Ｂを参照）。彼らの以前の研究に従い、バイスタンダー編集を抑制するために、Ａ：Ｇミスマッチを含めた。ただし、１つのケース（ＮＵＰ４３）では、バイスタンダー編集を完全に抑制することはできなかった（図１６Ａを参照）。もう１つのケース（ＲＡＢ７Ａ）ではバイスタンダー編集は抑制できたが、標的上の編集の犠牲の下であった（図１６Ｂを参照）。対照的に、本発明に従って設計されたガイドＲＮＡは、同等の標的上の編集収率で有意に改善された編集特異性（ほとんどバイスタンダーの標的外編集なし）を可能にした。
実施例１７：インシリコ最適化を用いた標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列の生成。
少なくとも１つのリクルートメント配列を含み、好ましくは編集対象の特定の標的ｍＲＮＡの第１およびさらなる領域に結合するリクルートメント配列のクラスターを含む人工核酸（ガイドＲＮＡ）のリクルート部分の配列の生成を容易にするために、インシリコアプローチを使用して、リクルートメント配列の結合部位として適切な標的ｍＲＮＡ上の配列を検出し、例えば潜在的な分子内塩基対形成事象に関して、人工核酸（ガイドＲＮＡ）を最適化することが好ましい。例示的なリクルートメントクラスターインシリコ最適化のステップを図１７Ａ～１７Ｃに示す。
コンピュータにより実行されるリクルートメントクラスターインシリコ最適化の前に、多数のプリセットがユーザによって作成される。特に、ユーザによって入力されるプリセットは以下に関して作成される：
－ 編集対象の標的ＲＮＡの配列；
－ 標的ＲＮＡ上の標的配列に結合する標的化配列（ＴＳ）の長さ（例えば、１６～４０個のヌクレオチド）；
－ リクルートメント配列の長さ（例えば、１１～１６個のヌクレオチド）；
－ 標的ＲＮＡ上の、標的配列と第１のリクルートメント配列によって結合される配列との間の距離（例えば、１０～１００個のヌクレオチド）；
－ 標的ＲＮＡ上の、第１およびさらなるリクルートメント配列によって結合される領域（結合部位）間の距離（例えば、１０～１００個のヌクレオチド）；
－ ヌクレオチドリンカーの長さ（たとえばＡＡＡ）；
－ 第２のリクルート部分の配列（例えば、Ｒ／Ｇモチーフ）：
－ 任意の３’末端配列（例えばＵＵＵ）。
ユーザによって入力された上記のプリセットに基づいて、入力された標的ＲＮＡの部位特異的編集に適したガイドＲＮＡの候補が、「リクルートメントクラスターインシリコ最適化」プロセスにおいて作成される。
図１７Ａ～図１７Ｃは、入力データを処理するためにアルゴリズムによって使用される正確な組み合わせの実装を説明するのではなく、より良い理解のために概念的な方法でツールの背後にあるアイデアを説明する。
図１７Ａ～１７Ｃに示されるように、リクルートメントクラスターインシリコ最適化法の工程１において、標的ｍＲＮＡに対応する入力されたｃＤＮＡを、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＧＡのみを含むリクルートメント配列結合領域の候補についてスクリーニングする（グアノシンヌクレオチドが標的ｍＲＮＡ中のアデノシンヌクレオチドに対して５’に位置する場合、編集はない）。例えば、スクリーニングは、編集対象のヌクレオチドを含む標的配列の５’で実施される。工程２では、標的配列から開始して、標的配列から特定の距離（例えば、１０～１００個のヌクレオチド）を有する５’に位置するリクルートメント配列結合領域を検出する。工程３において、これらのリクルートメント配列結合領域を選択し、それらのサイズ（例えば、１１および１３個のヌクレオチド）について分析する。工程４において、リクルートメント配列サイズの入力（例えば、１１個のヌクレオチド）を使用して、リクルートメント配列結合領域の誘導体を生成する。例えば、中断されないリクルートメント配列結合領域が１３個のヌクレオチドの長さを有する場合、入力されたリクルートメント配列サイズが１１個のヌクレオチドに設定されると、３つの誘導体リクルートメント配列を作製することができる。工程５では、第１の組の誘導体リクルートメント配列結合領域（１Ａ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）から開始して、設定された範囲（例えば、１０～１００個のヌクレオチド）内の次のリクルートメント配列結合領域が検出される。工程６では、検出されたリクルートメント配列結合領域が選択され、それらのサイズについて分析される。ｎ個（例えば３個）のリクルートメント配列結合領域が選択されるまで、工程４～６を繰り返す。工程７において、全てが入力変数に一致する、得られたリクルートメント配列結合領域のリストをリクルートメント配列に変換し、標的配列を標的化配列に変換し、生成された配列を、入力されたＲ／Ｇモチーフ（第２のリクルート部分）、トリプルアデノシンリンカー／スペーサー、およびＵ６終止配列から生じる３つの末端ウリジンとアセンブルする。工程８では、Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡパッケージ（ＲＮＡ二次構造の予測および分析に使用されるスタンドアロンプログラムおよびライブラリーのセット）を使用して、リスト内の全ての人工核酸（ガイドＲＮＡ）を折り畳み、これらの折り畳みのドット－ブラケット表現を生成する。「Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｉｎｄｅｒ」（ＲＣＦ）は、構造を、それらの自由エネルギーによって、またはそれらのドット－ブラケット比率（ドット－ブラケット表記の比率）によってソートすることを可能にする。好ましいドット－ブラケット比率を有する構造（ガイドＲＮＡのアンチセンス部分内の最小塩基対形成）は、アンチセンス部分内の一行中の最低数のブラケットによってさらにソートされる。最も弱い二次構造を表す最も短いものは、最も高いランキングを得る。次いで、好ましい二次構造を有する得られたガイドＲＮＡの選択されたリクルートメント配列をブラストさせて(blasted)、トランスクリプトーム内で標的外編集効果を引き起こし得るリクルートメント配列を排除することができる。
実施例１８：リクルートメント配列（ＲＳ）および二本鎖ＡＤＡＲリクルートドメイン（例えば、Ｒ／Ｇモチーフ）は、特定の柔軟性をもって標的化配列（ＴＳ）の周囲に配置され得る
この実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルスケール中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いてトランスフェクションの４８時間後に行った。
図１８Ａ～Ｃに示されるように、リクルートメント配列を標的化配列の５’および／または３’に配置することが可能である。標的化配列は典型的にはＡＤＡＲリクルートドメインの隣に配置された場合に非常に良好に機能したが、編集効率を失うことなく他の配置も可能である。
実施例１９：化学的に合成されたＣＬＵＳＴＥＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクションによる、Ｈｕｒｌｅｒ症候群患者由来の初代線維芽細胞（Ｈｕｒｌｅｒ ＦＢ、ＧＭ０６２１４）における疾患関連ｈＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘアンバー突然変異の補正。
Ｓｃｈｅｉｅ症候群（ＧＭ０１３２３）およびＨｕｒｌｅｒ症候群（ＧＭ０６２１４）の患者由来の線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国）から購入した。２．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１５％ ＦＢＳ中２．５×１０５個の細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。各試験条件について、２つの６ウェルをＩＤＵＡアッセイに使用し、１つの６ウェルを使用して、サンガーシーケンスによりＲＮＡ編集収率を決定した。ＣＬＵＳＴＥＲ ＡＳＯは３×ＲＳ（２０－２０ｐ８－２５－２０）ＣＬＵＳＴＥＲ設計を有する、ＰＡＧＥ精製され、末端ブロックされた（２’－ＯＭｅ、ＰＳ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、これは、２つの市販の購入された（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ ＧｍｂＨ、ドイツ）、６９ｎｔ（５’部分）長および８０ｎｔ（３’部分）長のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドから、インハウスでライゲーションされた（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）。完全な配列および修飾パターンを、以下の適用されたｇＲＮＡのリストに示す。トランスフェクションは、それぞれ２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈した１２５ｐｍｏｌのＡＳＯおよび７．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸを用いて播種した２４時間後に行った。両方の溶液を５分間インキュベーションした後に合わせ、さらに２０分間インキュベーションした後、トランスフェクション混合物を１つのウェルに均等に分配した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。
サンガーシーケンスのために：トランスフェクションの４８時間後、線維芽細胞をＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ、＃７９２１６）中で採取し、続いてＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（ＮＥＢ、＃Ｔ２０３０Ｌ）を使用してＲＮＡ単離を行った。Ｔｕｒｂｏ－ＤＮａｓｅ消化は、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃ＡＭ１９０７）を用いて行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃１８０９００５０）を用いて、５２℃で１時間、ランダムプライマーを用いて逆転写を行った。１０％ ＤＭＳＯを含有する各反応で、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ、＃Ｍ２６７Ｓ）を用いて、通常のＰＣＲ、続いてネステッドＰＣＲを実施した。第２のＰＣＲの後、生成物をＳＢ－アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＰＣＲクリーンアップ（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０６０９）後、サンガーシーケンス（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）を行った。
α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性アッセイについて：培地をトランスフェクションの２４時間後に交換した。トランスフェクションの４８時間後、線維芽細胞を分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳ中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を４０μｌ、細胞ペレットに添加し、氷上で３０分間インキュベーションし、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素アッセイを行った。α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性アッセイによる編集読み出しのために、４－メチルウンベリフェロン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ１３８１）の標準希釈系列を１×ＰＢＳ中で調製した。各濃度について、２５μｌの標準溶液を２５μｌの０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に添加し、３反復で９６ウェルＬｕｍｉＮｕｎｃプレート（ＶＷＲ、７３２－２６９６）に適用した。基質（４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニド、Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ、＃４４０７６）を０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、最終濃度を１８０μＭとした。ＨｅＬａ細胞を用いたマウスＩＤＵＡアッセイのために、２５μｌの１：３希釈細胞溶解物（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ）をプレート中の２５μｌの基質に加え、暗所で３７℃で４５分間インキュベーションした。２５μｌの未希釈の細胞溶解物（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ）をプレート中の２５μｌの基質に加え、暗所で３７℃で９０分間インキュベーションした。両方の場合において、２００μｌの炭酸グリシン緩衝液（０．１７Ｍグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１０．４）を添加することにより反応をクエンチした。４－メチルウンベリフェロンの蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーを用いて、励起波長３５５ｎｍ、発光波長４６０ｎｍで測定した。計算された酵素活性は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、２３２２７）によって決定されるタンパク質量を基準とした。酵素活性をＳｃｈｅｉｅ線維芽細胞溶解物に標準化した。
これらの実験では、Ｈｕｒｌｅｒ患者から採取した線維芽細胞におけるｈＩＤＵＡ活性の回復のためのＣＬＵＳＴＥＲアプローチを試験した。これらの細胞における強力なプラスミドトランスフェクションバイアスを克服するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの形態のＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡを適用した。サンガーシーケンスにより、２４％のガイドＲＮＡ依存性編集収率が測定され（図１９Ａ）、ＩＤＵＡ酵素活性のＳｃｈｅｉｅ対照線維芽細胞で得られたレベルまでの回復が観察された（図１９Ｂ）。Ｓｃｈｅｉｅ症候群はあまり重症ではない疾患であるため、データは臨床的に有益な効果が手の届く範囲内であり得ることを示す。
実施例２０：ＣＬＵＳＴＥＲ ｇＲＮＡおよびＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡのための、グローバルな標的外効果のＮＧＳ特性評価およびクリーンな編集事象の定量化。
２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定には、非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）およびＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡが含まれる。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベーションし、９５℃まで３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再び精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーはＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびリードのマッピング：ＲＮＡ－ｓｅｑリードをゲノム上に正確にアラインメントするための、以前に公開されたパイプラインを採用した（Ramaswami, G., et al., Accurate identification of human Alu and non-Alu RNA editing sites. Nat Methods, 2012. 9(6): p. 579-81; Ramaswami, G., et al., Identifying RNA editing sites using RNA sequencing data alone. Nat Methods, 2013. 10(2): p. 128-32参照）。ＳＴＡＲ（バージョン２．５．３ａ）（Dobin, A., et al., STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics, 2013. 29(1): p. 15-21参照）を使用して、リードをｈｇ１９参照ゲノムにアラインメントし、Ｐｉｃａｒｄツール（バージョン１．１２９）を実行して、同じ位置にマッピングされたクローンリード（ＰＣＲ重複物）を除去した。これらの同一のリードのうち、最高のマッピングクオリティを有するリードのみが、下流分析のために保持された。ユニークかつ非重複のリードを、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ、バージョン３．６）のＩｎｄｅｌＲｅａｌｉｇｎｅｒおよびＴａｂｌｅＲｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎを使用して、局所リアラインメントおよび塩基スコア再較正に供した（Li, H., et al., The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics, 2009. 25(16): p. 2078-9参照）。上記のステップを、ＲＮＡ－ｓｅｑサンプルのそれぞれに別々に適用した。ＲＮＡ－ｓｅｑデータからの編集部位の同定：標的化領域に対して誤ってアラインメントされたＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡ配列を除去するために、ｓａｍｔｏｏｌｓにおけるｒｍｄｕｐコマンド（Li, H., et al., The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics, 2009. 25(16): p. 2078-9参照）を使用して、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ領域におけるＰＣＲ重複物を除去した。さらに、配列「ＡＡＧＧＧＴＧ」（ＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡの３’末端）を含む全てのリードおよび「ＴＣＡＡＡＧＡＣ」（ＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡの５’末端）で終わるリードを除去した。最後のステップとして、ＲＡＢ７Ａ遺伝子のアンチセンス配列に由来する全てのリードを除去した。この手順を全てのサンプル（ＣＬＵＳＴＥＲ、ＬＥＡＰＥＲ、非標的化ｇＲＮＡ）に適用した。マッピングされたＲＮＡ－ｓｅｑリードからバリアントをコールするために、ＧＡＴＫのＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（McKenna, A., et al., The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res, 2010. 20(9): p. 1297-303参照）を用いた。バリアントのコールの通常のプラクティスとは対照的に、比較的緩い基準を持つバリアントを、ＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒツールを使用してオプションｓｔａｎｄ＿ｃａｌｌ＿ｃｏｎｆ ０、ｓｔａｎｄ＿ｅｍｉｔ＿ｃｏｎｆ ０、および出力モードＥＭＩＴ＿ＶＡＲＩＡＮＴＳ＿ＯＮＬＹで同定した。非反復および反復非Ａｌｕ領域由来のバリアントは、参照ゲノム配列とＲＮＡ－ｓｅｑとの間のミスマッチを含む少なくとも３つのリードによってサポートされる必要があった。１つのミスマッチリードのサポートは、Ａｌｕ領域におけるバリアントに必要であった。このバリアント候補のセットは、編集サイトのコールの精度を高めるために、いくつかのフィルタリングステップに供された。最初に、ｄｂＳＮＰビルド１３７中に存在する全ての既知のヒトＳＮＰを除去した（分子タイプ「ｃＤＮＡ」のＳＮＰを除く；データベースバージョン１３５；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）、１０００ゲノムプロジェクト、およびワシントン大学エクソーム配列決定プロジェクト（http://evs.gs.washington.edu/EVS/）。技術的アーチファクトに起因する偽陽性ＲＮＡ－ｓｅｑバリアントのコールを除去するために、以前に記載されたようにさらなるフィルターを適用した（Ramaswami, G., et al., Accurate identification of human Alu and non-Alu RNA editing sites. Nat Methods, 2012. 9(6): p. 579-81; Merkle, T. and T. Stafforst, New Frontiers for Site-Directed RNA Editing: Harnessing Endogenous ADARs. Methods Mol Biol, 2021. 2181: p. 331-349参照）。簡潔には、バリアントのコールのクオリティＱ＞２０を必要とし（Ramaswami, G., et al., Accurate identification of human Alu and non-Alu RNA editing sites. Nat Methods, 2012. 9(6): p. 579-81; Merkle, T. and T. Stafforst, New Frontiers for Site-Directed RNA Editing: Harnessing Endogenous ADARs. Methods Mol Biol, 2021. 2181: p. 331-349参照）、バリアントは、リードの最初の６塩基で生じた場合には破棄され、単純な反復におけるバリアントが除去され（Li, H., et al., The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics, 2009. 25(16): p. 2078-9参照）、スプライス接合部の４ｂｐ内にあったイントロンバリアントが除去され、ホモポリマーにおけるバリアントが破棄された。さらに、ＢＬＡＴによってトランスクリプトームの高度に類似した領域にマッピングされたリードを除去した（Kent, W.J., BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Res, 2002. 12(4): p. 656-64参照）。最後に、Ｇｅｎｃｏｄｅ、ＲｅｆＳｅｑ、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＵＣＳＣからの遺伝子モデルに基づくＡＮＮＯＶＡＲ（Wang, K., M. Li, and H. Hakonarson, ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res, 2010. 38(16): p. e164参照）を用いて、バリアントにアノテーションを行った。ＲＮＡ－ｓｅｑデータから同定された全ての部位を、ＲＡＤＡＲデータベース（Ramaswami, G. and J.B. Li, RADAR: a rigorously annotated database of A-to-I RNA editing. Nucleic Acids Res, 2014. 42(Database issue): p. D109-13参照）で入手可能な全ての部位と比較し、ＲＡＤＡＲで見出された場合は「既知」の部位、または見出されない場合は「新規」の部位と呼んだ。有意に異なって編集された部位の同定：ＲＡＤＡＲデータベースの部位を有するＲＮＡ ｓｅｑサンプル中に見出された全ての部位を併合し、５０リードのカバレッジ（両方の反復を合わせたカバレッジ）を有する編集された部位の編集レベルを定量し、フィッシャーの正確確率検定に続いて、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの多重検定補正（調整Ｐ＜０．０１）を行い、サンプル全体で有意に異なって編集された部位を同定した（絶対的な編集の差異＞１０％）。ＲＡＢ７Ａ編集精度（クリーンなリード）の測定：ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡおよびＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡの特異性を比較するために、編集された標的配列「ＧＣＴＧＧＣＧＧ」を含むマッピングされた全てのリードを選択した。編集されたリードおよびそれらのパートナーのリードを、編集領域をカバーするＲＡＢ７Ａ配列と比較して、Ａ－Ｇミスマッチを同定した。対照として、非標的化サンプルを使用して、非編集標的配列「ＧＣＴＡＧＣＧＧ」をカバーしたリードにおけるＡ－Ｇミスマッチを定量した。
ＬＥＡＰＥＲアプローチとＣＬＵＳＴＥＲアプローチとの間の、グローバルな標的外効果および低レベルのバイスタンダー編集を比較するために、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＲＡＢ７Ａ標的についてのトランスクリプトーム全体のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ配列決定実験を行った。非標的化ガイドＲＮＡを対照としてトランスフェクションした。確立されたパイプライン（Merkle, T., et al., Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides. Nat Biotechnol, 2019. 37(2): p. 133-138参照）を使用して、トランスクリプトームにおける有意に異なって編集された部位を同定し、それぞれＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡ（５９）およびＣＬＵＳＴＥＲ（４４）ガイドＲＮＡに対する少数のヒットが見出された（図２０Ａおよび２０Ｂ）。このグローバルな標的外事象の数は、何千もの事象が報告されている改変されたエディターゼ（例えば、Ｌａｍｂｄａ－Ｎ－ＡＤＡＲ、Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ）を利用するシステムと比較して非常に少ない。ＮＧＳアプローチはまた、同じリード内でバイスタンダー編集によって標的上の編集が破損する周波数を研究することを可能にする。ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡを用いたリードの８８．４％はクリーンに編集されたが、これはＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡにおいてはリードの１６．６％についてのみであった（図２０Ｃ）。これを考慮すると、ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡのクリーンな標的上の編集の総収率は３１％であり、９．２％しか達成されなかったＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡよりも明らかに勝っている（図２０Ｄ）。
実施例２１：次世代シーケンシングによって決定された、ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡおよびＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを用いたＲＮＡ編集によって誘導された標的外事象のリスト。
ＲＮＡ編集実験およびＮＧＳデータ処理を、実施例２０について説明したように行った。このリストは、細胞がＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡまたはＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡのいずれかで処理され、非標的化対照ガイドＲＮＡ（ＮＴ ｇＲＮＡ）と比較された場合に、少なくとも１つのサンプル中の有意に区別されるように編集された部位を探索するパイプラインによって検出された、「未知」の部位での標的外編集事象のサブセットを示す。ＲＡＤＡＲデータベースに列挙されていない場合、部位には「未知」が割り当てられた。非同義編集は、単一の部位ＨＴＡＴＳＦ１（Ｓ７４２Ｇ）についてのみ検出された。マッピング分析は、ＣＴＮＮＡＬ１、ＨＴＡＴＳＦ１、およびＺＮＦ７４０に対するＲＡＢ７ＡガイドＲＮＡの潜在的な標的外結合のための部位を検出した。検出されたＲＡＢ７Ａ部位は、パイプラインの有意性およびカットオフ基準を満たす、標的上の部位に近いバイスタンダー編集部位の割合を表す。データは、Ｎ＝２のＮＧＳ反復の平均±ｓ．ｄ．を表す。
新規であり、非標的化対照において編集されていない部位の数は、ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡについては（標的部位のほか）わずか３個、ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡについては７個であった（図２１）。ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡについては、３つの新規部位のうちの２つがエクソン部位（ＨＴＡＴＳＦ１、ＣＴＮＮＡＬ１）であった。両方ともガイドＲＮＡの推定結合部位を含み、低い編集収率（≦１２．２％）を与えた。ＨＴＡＴＳＦ１編集部位は、非同義アミノ酸変化を与える唯一のものであった。特に、ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡは、同様の程度にその部位を編集した。ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを有する他の７つの検出された新規部位は、標的上の部位にごく近接したバイスタンダーの標的外編集であった。
実施例１で使用した人工核酸： Ａ：８位にＣ／Ａミスマッチを有する２０ヌクレオチドのアンチセンス部分と、ステムループ構造を含む模式的Ｒ／Ｇモチーフとを含む、人工核酸分子。
Ｂ：８位にＣ／Ａミスマッチを有する２０ヌクレオチド標的化配列（ＴＳ）と、ステムループ構造を有するＲ／Ｇモチーフと、アデノシンリンカー（ＡＡＡ）を介して連結された１１～１６個のヌクレオチドを有する３個のリクルートメント配列（ＲＳ ＃１、ＲＳ ＃２、ＲＳ ＃３）のクラスターとを含む、本発明に係る人工核酸分子。
ＨｅＬａ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いたデュアルルシフェラーゼＷ４１７Ｘアンバーレポーターの編集。１２０，０００個の細胞を、２４ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して１ウェルあたり、人工核酸ＡおよびＢをそれぞれコードする８００ｎｇのプラスミド、ならびに２００ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターで、トランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取した。ＲＮＡ単離、ＤＮａｓｅ－Ｉ消化およびＲＴ－ＰＣＲの後、続いてサンガーシーケンスを行った。 実施例２で使用した人工核酸およびＲ／Ｇモチーフバージョン： （Ａ）：リクルートメント配列（ＲＳ）を有さず、１６ｎｔアンチセンス部分およびＲ／Ｇモチーフバージョン２０（ＲＧ－Ｖ２０）を有する、先行技術の設計。
（Ｂ）：３つのリクルートメント配列（３×ＲＳ）およびＲ／Ｇモチーフバージョン２１（ＲＧ－Ｖ２１）を含む、リクルートメントクラスターを有する新規設計。
（Ｃ）：ＲＧモチーフバージョン２０およびバージョン２１の配列。
内因性ヒトＡＤＡＲ１およびアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＡｄＶ）コード化Ｒ／Ｇ ｇＲＮＡを用いた、ＨｅＬａ細胞における編集。
２００ｋ個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種時に１７５ ＭＯＩ ｇＲＮＡ ＡｄＶを用いて、リバーストランスダクション(Reverse transduction)を行った。１７５ ＭＯＩデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂ ＡｄＶまたは５ ＭＯＩ ｗｔ／ｗｔを使用して、播種の２４時間後にフォワードトランスダクション(Forward transduction)を達成した。注：ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）はレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）上で常に正規化されるので、ｗｔ／ｗｔ ＡｄＶの量は、最終パーセンテージに影響を及ぼさない。ルシフェラーゼアッセイは、リバースインフェクション(reverse infection)の９６時間後に行った。
いくつかの細胞株における、ＡｄＶコード化３×ＲＳガイドＲＮＡを用いた内因性ヒトＡＤＡＲ１のリクルートメントを介したデュアルルシフェラーゼレポーターの編集。デュアルルシフェラーゼアッセイを介した分析（Ｎ＝３、それぞれ２回の技術的反復を伴う）。
各細胞タイプについて２５ｋ個の細胞を９６ウェルスケール中に播種した。ＨｅＬａ細胞において、フォワードトランスダクションは播種の２４時間後に達成された。他の全ての細胞において、リバーストランスダクションは播種時に達成された。採取およびルシフェラーゼアッセイは、感染の９６時間後に達成された。
ルシフェラーゼアッセイ：４２０データポイント（Ｄａｔａｐｏｉｎｔｓ）（３５の設定、１つの設定当たり６のレニラおよび６のホタル）
設定：ｇＲＮＡ ＭＯＩ：ＨｅＬａ（１００ ＭＯＩ）、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（１００ ＭＯＩ）、Ｈｕｈ７（７５ ＭＯＩ）、Ａ５４９（７５ ＭＯＩ）、ＨｅｐＧ２（７５ ＭＯＩ）、ＳＹ５Ｙ（１００ ＭＯＩ）、Ｕ８７ＭＧ（１００ ＭＯＩ）、Ｕ２ＯＳ（７５ ＭＯＩ）；ＤＬ ｗｔ／ａｍｂ ５０ ＭＯＩ；ＤＬ ｗｔ／ｗｔ ５ ＭＯＩ。
いくつかの細胞株における、ＡｄＶコード化３×ＲＳガイドＲＮＡを用いた内因性ヒトＡＤＡＲ１のリクルートを介したデュアルルシフェラーゼレポーターの編集。サンガーシーケンスを介した分析。
Ｈｕｈ７細胞、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＳＹ５Ｙ細胞の場合：１ウェルあたり２５，０００個の細胞（９６ウェルスケール）を、１日目の播種時に指示されたＭＯＩでリバースインフェクションさせた。２～４日目に、培地交換を行った。５日目に、１回のＲＴ－ＰＣＲあたり６ウェルの採取およびプールを行った。ＨｅＬａ細胞の場合：１日目に、１ウェルあたり２５，０００個の細胞（９６ウェルスケール）を播種した。２日目に、以下のＭＯＩによるフォワードインフェクションを行った：ＨｅＬａ：ｎ＝２［７５ ＭＯＩ］、ｎ＝２［１００ ＭＯＩ］、ｎ＝２［１２５ ＭＯＩ］；Ｈｕｈ７：ｎ＝３［７５ ＭＯＩ］；Ａ５４９：ｎ＝３［７５ ＭＯＩ］；ＨｅｐＧ２：ｎ＝３［７５ ＭＯＩ］；ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）：ｎ＝３［１００ ＭＯＩ］；ＳＨ－ＳＹ５Ｙ：ｎ＝３［１００ ＭＯＩ］。３～５日目に、培地交換を行った。６日目に、１回のＲＴ－ＰＣＲあたり６ウェルの採取およびプールを行った。
６－９×ＲＳガイドＲＮＡおよび内因性ＡＤＡＲ１を使用するＨｅＬａ細胞における、いくつかの疾患関連標的ｍＲＮＡの編集。１２０，０００個の細胞を、２４ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり８００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび２００ｎｇの標的コードプラスミド（ｃＤＮＡ）で、トランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取した。ＲＮＡ単離、ＤＮａｓｅ－Ｉ消化およびＲＴ－ＰＣＲの後、続いてサンガーシーケンスを行った。 標的部位の周囲に標的外バイスタンダー編集が完全に存在しないことを示す、図５Ａに表示されたデータの例示的なサンガーシーケンストレース。 プラスミドをコード化したＲＧ－Ｖ２１＿２０ｐ８＿３×ＲＳおよびＲＧ－Ｖ２１＿２０ｐ８＿８×ＲＳガイドＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞において主にＡＤＡＲ１アイソフォームｐ１１０をリクルートする。１．２×１０５個のＨｅＬａ細胞を１２ウェルスケールに播種し、リバーストランスフェクションを、１ウェルあたり２．５ｐｍｏｌ ｓｉＲＮＡ（３μｌのＨｉｇｈＰｅｒｆｅｃｔ＋２．５μｌの１μＭのｓｉＲＮＡ、およびＯｐｔｉＭｅｍを用いて２００μｌ）を用いる、スクランブルｓｉＲＮＡ、ＡＤＡＲ１ ｓｉＲＮＡ、またはＡＤＡＲ１ｐ１５０ ｓｉＲＮＡで達成した。１つのｓｉＲＮＡあたり６ウェルに播種した。１２ウェルプレートの各使用ウェルは、対応するｓｉＲＮＡについて、示された２００μｌのトランスフェクション混合物を含有した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後、同様に処理したウェルを回収し、細胞をプールした。次いで、２５，０００個の異なる処理をされたＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。 リクルートメント配列の数が編集収率に及ぼす影響。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。ルシフェラーゼ転写産物上の標的配列の位置は濃い灰色で示され、各々のＲＳ結合領域の位置は明るい灰色で示される。編集標的
の位置も示される。個々のＲＳは９～１６ｎｔ長であり、ＡＡＡリンカーによって分離されている。
リクルートメント配列長（７～１５ｎｔ／ＲＳ）が編集収率に及ぼす影響。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。 ３７℃でのガイドＲＮＡの最小自由エネルギー構造の模式図。 アデノシンリンカー長が編集収率に及ぼす影響。ルシフェラーゼ活性（倍率変化）は、ｍＲＮＡ上の対応するｇＲＮＡ結合領域（ＢＲ）を示す模式図の隣に表示される。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。 図９Ａのデータセットは、リクルートメント配列（ＲＳ）間のリンカーとして使用されるアデノシンヌクレオチドの数、およびリクルートメント配列＃１と標的化配列との間のスペーサーとして使用されるアデノシンヌクレオチドの数に関して、対応するｇＲＮＡ組成物を示す模式図の隣に表示される。 標的ｍＲＮＡ上の３つのリクルートメント配列の配置の最適化。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。（Ｓ＝２つのＲＳ間の短い距離（１５～６２ｎｔ）；Ｌ＝２つのＲＳ間の長い距離（３７５～４６０ｎｔ）） 標的ｍＲＮＡ上の２つの短いリクルートメント配列（１５ｎｔ）のコンテクストにおける、拡張リクルートメント配列（２０ｎｔ）の配置の最適化。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。（Ｓ＝２つのＲＳ間の短い距離（１５～６２ｎｔ）；Ｌ＝２つのＲＳ間の長い距離（３７５～４６０ｎｔ）；１５ｎｔから２０ｎｔに拡張されたＲＳが強調されている） リクルートメント配列マスキングの影響（アンチセンス部分に強い二次構造を有するガイドＲＮＡのシミュレーション）。図１２Ａの左上の部分は、ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの相互作用を示すために使用される表現を描写する。結合模式図の部分は、ｍＲＮＡ上のｇＲＮＡのリクルートメント配列の結合領域（ＢＲ）を示す。ＲＳ＃１はＢＲ＃１に結合する。ｇＲＮＡ模式図は、Ｒ／ＧモチーフＶ２１、標的化配列、アデノシンヌクレオチドリンカー／スペーサー、リクルートメント配列（ＲＳ）＃１～＃３、およびいくつかの場合では、マスキングリクルートメント配列（ｍＲＳ）＃４～＃６からなるｇＲＮＡの組成を示す。特性評価実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。 ３７℃でのガイドＲＮＡの最小自由エネルギー構造の模式図。 ｇＲＮＡおよびレポータープラスミドの流体力学的尾静脈（ＨＤＴＶ）注入後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、デュアルルシフェラーゼＷ４１７Ｘアンバーレポーターの編集。陰性対照群マウスを１０μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂレポータープラスミドで処理し、陽性対照群マウスを１０μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ｗｔレポータープラスミドで処理し、編集群マウスを５μｇのデュアルルシフェラーゼｗｔ／ａｍｂレポータープラスミドおよび２５μｇのガイドＲＮＡプラスミドで処理した。ガイドＲＮＡは２０－１５－１５－２０ｐ８ガイドＲＮＡであり、したがって、３つのＲＳ（２０ｎｔ長、１５ｎｔ長、および１５ｎｔ長を有する）と、８位のアデノシンとミスマッチするシトシンを有する典型的な２０ｎｔ標的化配列と、を含む。ガイドＲＮＡはさらに、その５’末端にＶ２１Ｒ／Ｇモチーフを含んでいた（図示せず）。編集は、デュアルルシフェラーゼアッセイ（タンパク質レベル）によって、および逆転写後のサンガーシーケンス（ＲＮＡレベル）によって分析した。例示的なサンガーシーケンストレースを示す。 ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性ＵＴＲ標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。例示的なサンガーシーケンストレースが示され、編集部位および収率が示される。「Ａ」および「Ｇ」は、それぞれアデノシンピークおよびグアノシンピークを表す。 ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性ＯＲＦ標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて、１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。例示的なサンガーシーケンストレースが示され、編集部位および編集収率が示される。「Ａ」および「Ｇ」は、それぞれアデノシンピークおよびグアノシンピークを表す。 本発明のガイドＲＮＡを、ＮＵＰ４３ Ｖ２３３Ｖを標的とする従来技術のＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡと比較するベンチマーク。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて、１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。Ｎ＝３の生物学的反復。 本発明のガイドＲＮＡを、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ ＴＡＧ＃１を標的とする従来技術のＬＥＡＰＥＲ ｇＲＮＡと比較するベンチマーク。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における内因性ＡＤＡＲ１を用いた内因性標的の編集。６０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、２４ウェルスケール中で、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。２４時間後、１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６を用いて、１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（トランスフェクショングレード）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、その後、Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの直前に、サンプルを１μｌの１０μＭセンスオリゴと混合し、７０℃に加熱して、残りのガイドＲＮＡを標的ｍＲＮＡから分離した。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ混合物を添加し、ＰＣＲを実施した。これに続いて、１．４％アガロースゲル、ＰＣＲクリーンアップおよびサンガーシーケンス（ＭＷＧ）を行った。Ｎ＝３の生物学的反復。 リクルートメントクラスターファインダーツールを使用したリクルートメントクラスターインシリコ最適化。 リクルートメントクラスターファインダーツールを使用したリクルートメントクラスターインシリコ最適化。 リクルートメントクラスターファインダーツールを使用したリクルートメントクラスターインシリコ最適化。 図１８Ｂおよび図１８Ｃの凡例。ＲＭ＝リクルート部分。 リクルートメント配列（ＲＳ）および二本鎖ＡＤＡＲリクルートドメイン（例えば、Ｒ／Ｇモチーフ）は、特定の柔軟性をもって標的化配列（ＴＳ）の周囲に配置することができる。ＨｅＬａ細胞におけるデュアルルシフェラーゼレポーターを標的とするＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡのアンチセンス部分の成分を、従来の＃６－＃５－＃４－ＴＳ設計から開始して、新たに配置した。 デュアルルシフェラーゼアッセイの結果。データは、Ｎ＝５の生物学的反復の平均±ｓ．ｄ．として示す。特に、いくつかの設計（例えば、＃４－ＴＳ－＃３－＃２）は、従来の＃６－＃５－＃４－ＴＳ設計と比較して、良好な編集収率を与えた。重要なことに、前者の設計は、ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡの結合のための標的化アデノシンの配列スペース３’（例えば、結合部位＃３、＃２、＃１）を含むことを可能にする。この実験のルシフェラーゼアッセイ設定：２５，０００個のＨｅＬａ細胞を、９６ウェルスケールに播種した。播種の２４時間後、細胞を、１：１．５のプラスミド対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００の比率を使用して、１ウェルあたり１６０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミドおよび４０ｎｇのデュアルルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、トランスフェクションの４８時間後に行った。 化学的に合成されたＣＬＵＳＴＥＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクションによる、Ｈｕｒｌｅｒ症候群患者由来の初代線維芽細胞（Ｈｕｒｌｅｒ ＦＢ、ＧＭ０６２１４）における疾患関連ｈＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘアンバー突然変異の補正。編集収率は、サンガーシーケンスによって決定した。Ｈｕｒｌｅｒ症候群（ＧＭ０６２１４）を有する患者由来の線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国）から購入した。２．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ中の２．５×１０５個の細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。各試験条件について、１つの６ウェルを使用して、サンガーシーケンスによってＲＮＡ編集率を決定した。ＣＬＵＳＴＥＲ ＡＳＯは、３×ＲＳ（２０－２０ｐ８－２５－２０）ＣＬＵＳＴＥＲ設計を有する、ＰＡＧＥ精製され、末端ブロックされた（２’－ＯＭｅ、ＰＳ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、これは、２つの市販の購入された（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ ＧｍｂＨ、ドイツ）、６９ｎｔ（５’部分）長および８０ｎｔ（３’部分）長のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドから、本発明者らの最近公開されたプロトコールに従って、インハウスでライゲーションされた（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）。完全な配列および修飾パターンを、以下の適用されたｇＲＮＡのリストに示す。トランスフェクションは、それぞれ２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈した１２５ｐｍｏｌのＡＳＯおよび７．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸを用いて播種した２４時間後に行った。両方の溶液を５分間インキュベーションした後に合わせ、さらに２０分間インキュベーションした後、トランスフェクション混合物を１つのウェルに均等に分配した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後、線維芽細胞をＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ、＃７９２１６）中で採取し、続いてＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（ＮＥＢ、＃Ｔ２０３０Ｌ）を用いてＲＮＡ単離を行った。Ｔｕｒｂｏ－ＤＮａｓｅ消化は、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃ＡＭ１９０７）を用いて行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃１８０９００５０）を用いて、５２℃で１時間、ランダムプライマーを用いて逆転写を行った。Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ、＃Ｍ２６７Ｓ）を用いて、１０％ＤＭＳＯを含有する各反応で、通常のＰＣＲ、続いてネステッドＰＣＲを行った。第２のＰＣＲの後、生成物をＳＢ－アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＰＣＲクリーンアップ（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０６０９）後、サンガーシーケンス（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）を行った。 さらに、タンパク質機能の回復を、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性アッセイを用いて決定した。Ｈｕｒｌｅｒ線維芽細胞における測定されたｈＩＤＵＡ酵素活性を、Ｓｃｈｅｉｅ患者線維芽細胞（Ｓｃｈｅｉｅ ＦＢ、ＧＭ０１３２３）にて測定されたＩＤＵＡ酵素活性に対して正規化した。データは個々のデータ点によって示されるように、Ｎ＝４～５の生物学的反復の平均±ｓ．ｄ．として示される。Ｓｃｈｅｉｅ症候群（ＧＭ０１３２３）およびＨｕｒｌｅｒ症候群（ＧＭ０６２１４）の患者由来の線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国）から購入した。２．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１５％ ＦＢＳ中２．５×１０５個の細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。各試験条件について、２つの６ウェルをＩＤＵＡアッセイに使用した。ＣＬＵＳＴＥＲ ＡＳＯは、３×ＲＳ（２０－２０ｐ８－２５－２０）ＣＬＵＳＴＥＲ設計を有する、ＰＡＧＥ精製され、末端ブロックされた（２’－ＯＭｅ、ＰＳ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、これは、２つの市販品（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ ＧｍｂＨ、ドイツ）、ならびに６９ｎｔ（５’部分）および８０ｎｔ（３’部分）長のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドから、本発明者らの最近公開されたプロトコールに従って、インハウスでライゲーションされた（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）。完全な配列および修飾パターンを、以下の適用されたｇＲＮＡのリストに示す。トランスフェクションは、それぞれ２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈した１２５ｐｍｏｌのＡＳＯおよび７．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸで播種した２４時間後に行った。両方の溶液を５分間インキュベートした後に合わせ、さらに２０分間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を１つのウェルに均等に分配した。トランスフェクションの２４時間後に、培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後、線維芽細胞を分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳ中の４０μｌの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を細胞ペレットに添加し、氷上で３０分間インキュベートし、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素アッセイを行った。α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性アッセイによる編集読み出しのために、４－メチルウンベリフェロン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ１３８１）の標準希釈系を、１×ＰＢＳ中で調製した。各濃度について、２５μｌの標準溶液を２５μｌの０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に添加し、３反復で９６ウェルＬｕｍｉＮｕｎｃプレート（ＶＷＲ、７３２－２６９６）に適用した。基質（４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニド、グリコシン、＃４４０７６）を０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、最終濃度を１８０μＭとした。ＨｅＬａ細胞を用いたマウスＩＤＵＡアッセイのために、２５μｌの１：３希釈細胞溶解物（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ）をプレート中の２５μｌの基質に加え、暗所で、３７℃で、４５分間インキュベートした。２５μｌの未希釈の細胞溶解物（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ）をプレート中の２５μｌの基質に加え、暗所で、３７℃で、９０分間インキュベートした。２００μｌの炭酸グリシン緩衝液（０．１７Ｍグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１０．４）を添加することによって、両方の場合で反応をクエンチした。４－メチルウンベリフェロンの蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーを用いて、励起波長３５５ｎｍ、発光波長４６０ｎｍで測定した。計算された酵素活性は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、２３２２７）によって決定されるタンパク質量を基準とした。酵素活性をＳｃｈｅｉｅ線維芽細胞溶解物に標準化した。 １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡを用いて、２９３個のＦＴ細胞から内因性ＲＡＢ７Ａの３’－ＵＴＲにおける５’ＵＡＧ部位まで、内因性ＡＤＡＲをリクルートするためのポリ（Ａ）＋トランスクリプトームにおける標的外編集の分析。散布図は、ＣＬＵＳＴＥＲまたは非標的化ガイドＲＮＡを有するプラスミドでトランスフェクションされた細胞における編集レベルを比較する約３０，０００個の部位での差次的編集を示す。実験は、２つの独立した反復を用いて行った。標的上の編集は矢印で示される。有意に異なる編集部位（調整Ｐ＜０．０１、フィッシャーの正確確率検定、両側、Ｎ≧５０）を、黒色で強調する。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定には、非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）およびＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡが含まれる。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて、２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。 ２９３個のＦＴ細胞から１１１ｎｔのＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを有する内因性ＲＡＢ７Ａの３’－ＵＴＲにおける５’ＵＡＧ部位に、内因性ＡＤＡＲをリクルートするためのポリ（Ａ）＋トランスクリプトームにおける標的外編集の分析。散布図は、ＬＥＡＰＥＲまたは非標的化ガイドＲＮＡを有するプラスミドでトランスフェクションされた細胞における編集レベルを比較する約３０，０００個の部位での差次的編集を示す。実験は、２つの独立した反復を用いて行った。標的上の編集は矢印で示される。有意に異なる編集部位（調整Ｐ＜０．０１、正確確率検定、両側、Ｎ≧５０）を黒色で強調する。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）およびＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。 バイスタンダー編集のための標的上の編集を用いて全てのＮＧＳリードを分析することによって編集精度を評価する。ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡは主にクリーンなシーケンスリード、および小さい割合で単一のバイスタンダー編集を伴うリードを与えるが、ＬＥＡＰＥＲサンプル由来のリードは、非常に頻繁にいくつかのバイスタンダー編集を含んでいた。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、（１）非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）、（２）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡ、および（３）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。 クリーン編集（バイスタンダー無し）と標的上の全ての編集の収率の推定。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、（１）非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）、（２）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡ、および（３）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。 次世代シーケンシングによって決定された、ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡおよびＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを用いたＲＮＡ編集によって誘導された、標的外事象のリスト。このリストは、細胞がＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡまたはＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡのいずれかで処理され、非標的化対照ガイドＲＮＡ（ＮＴ ｇＲＮＡ）と比較された場合に、少なくとも１つのサンプル中の有意に区別されるように編集された部位を探索するパイプラインによって検出された、「未知（unknown）」の部位での標的外編集事象のサブセットを示す。部位がＲＡＤＡＲデータベースに列挙されていない場合には、部位に「未知」を割り当てた。非同義編集は、単一の部位ＨＴＡＴＳＦ１（Ｓ７４２Ｇ）についてのみ検出された。マッピング分析は、ＣＴＮＮＡＬ１、ＨＴＡＴＳＦ１、およびＺＮＦ７４０に対するＲＡＢ７ＡガイドＲＮＡの潜在的な標的外結合のための部位を検出した。検出されたＲＡＢ７Ａ部位は、パイプラインの有意性およびカットオフ基準を満たす、標的部位の近いバイスタンダー編集部位の割合を表す。データは、Ｎ＝２のＮＧＳ反復の平均±ｓ．ｄ．を表す。２４セルフォーマットで１：３の比率のＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６９１）を使用して、播種の２４時間後に１２００ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、＃７４０４９０）を６×１０４個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションすることによって、ＲＮＡ編集試験を行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。全体として、３つの設定を実施し、それぞれ独立した反復を行った。これらの設定は、（１）非標的化ガイドＲＮＡ（ＮＴ－ＲＮＡ）、（２）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １９－１１－１３－２０ｐ８ ＣＬＵＳＴＥＲガイドＲＮＡ、および（３）ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ １１１ｐ５６ ＬＥＡＰＥＲガイドＲＮＡを含む。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４２０４）で単離し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で処理し、それぞれのガイドＲＮＡのアンチセンス部分に逆相補的であるＲＮＡ鎖と共にインキュベートし、９５℃に３分間加熱し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔで再度精製した。精製ＲＮＡを、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ配列決定のためにＣｅＧａＴ（ドイツ）に送達した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて２００ｎｇのＲＮＡから調製し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（５０Ｍリード、２×１００ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて配列決定した。

Claims (64)

  1. ５’から３’への方向、または３’から５’への方向において以下を含む、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸であって：
    ａ）デアミナーゼをリクルートすることができる第１のリクルート部分であって、前記標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する少なくとも１つのリクルートメント配列を含む、第１のリクルート部分；
    ｂ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列、および
    ｃ）デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分、
    ここで、前記標的ＲＮＡ中の第１の領域および前記標的ＲＮＡ中の前記標的配列は、少なくとも１つのヌクレオチドによって隔てられ、前記ヌクレオチドは前記少なくとも１つのリクルートメント配列によっては結合されず、かつ、人工核酸の標的化配列に相補的でない、
    人工核酸。
  2. 前記少なくとも１つのリクルートメント配列が、前記標的ＲＮＡ中の前記第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、請求項１に記載の人工核酸。
  3. 前記第１のリクルート部分が、ヌクレオチドリンカーを介して連結された少なくとも２つのリクルートメント配列を含むリクルートメント配列のクラスターを含む、請求項１または２に記載の人工核酸。
  4. 前記リクルートメント配列のクラスターが、少なくとも３個、好ましくは３～１０個のリクルートメント配列を含む、請求項３に記載の人工核酸。
  5. リクルートメント配列を連結する前記ヌクレオチドリンカーが、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは２～６個のヌクレオチドを含む、請求項３または４に記載の人工核酸。
  6. 前記ヌクレオチドが、アデノシンヌクレオチドである、請求項５に記載の核酸配列。
  7. 前記少なくとも１つのリクルートメント配列が、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の人工核酸。
  8. 前記少なくとも１つのリクルートメント配列が、１０～２００個、好ましくは２０～１００の個のヌクレオチドを含む、請求項７に記載の人工核酸。
  9. 第１のリクルートメント配列が、前記標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合し、好ましくは前記標的ＲＮＡ中の第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含み、および
    第２のまたはさらなるリクルートメント配列が、前記標的ＲＮＡ中の第２のまたはさらなる領域に結合し、好ましくは前記標的ＲＮＡ中の第２のまたはさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、
    請求項３～８のいずれか１項に記載の人工核酸。
  10. 前記標的ＲＮＡ中の第１の領域、ならびに／または前記標的ＲＮＡ中の第２のおよび／もしくはさらなる領域が編集可能なアデノシンヌクレオチドを含まない、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  11. 前記人工核酸が、前記第１のリクルート部分と前記標的化配列との間にヌクレオチドスペーサーを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  12. 前記ヌクレオチドスペーサーが、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは２～６個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の人工核酸。
  13. 前記ヌクレオチドが、アデノシンヌクレオチドである、請求項１２に記載の人工核酸。
  14. 前記標的化配列が、少なくとも１０個のヌクレオチド、好ましくは１０～５０個、より好ましくは１６～４０個のヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  15. 前記標的化配列が、編集対象のヌクレオチド、好ましくは編集対象のアデノシンに対応する位置に、編集対象のアデノシンとミスマッチするシチジンヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  16. 前記編集対象のアデノシンとミスマッチするシチジンヌクレオチドが、前記標的化配列の５’末端または３’末端のいずれかから６個のヌクレオチドだけ離れて位置する、請求項１５に記載の人工核酸。
  17. 前記第１のリクルート部分および前記第２のリクルート部分のうちの少なくとも１つが、前記標的ＲＮＡに結合することなく、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼに結合することができる核酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  18. 前記核酸配列が、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼのｄｓＲＮＡ結合ドメインに結合することができる、請求項１７に記載の人工核酸。
  19. 前記核酸配列が、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２、好ましくはＡＤＡＲ１、好ましくはヒトＡＤＡＲ１、特にＡＤＡＲ１ｐ１１０に結合することができる、請求項１８に記載の人工核酸。
  20. 前記核酸配列が、分子内塩基対を形成可能であり、好ましくはステムループ構造を形成可能である、請求項１８または１９に記載の人工核酸。
  21. 前記ステムループ構造が、少なくとも２個のミスマッチを含む二重らせんステムと、３～８個、好ましくは４～６個、より好ましくは５個のヌクレオチドからなるループとを含み、該ループが、好ましくは核酸配列ＧＣＵＡＡまたはＧＣＵＣＡを含む、請求項２０に記載の人工核酸。
  22. 前記核酸配列が、５’－ＧＧＵＧＵ ＣＧＡＧＡ ＡＧＡＧＧ ＡＧＡＡＣ ＡＡＵＡＵ ＧＣＵＡＡ ＡＵＧＵＵ ＧＵＵＣＵ ＣＧＵＣＵ ＣＣＵＣＧ ＡＣＡＣＣ－３’のヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の人工核酸。
  23. 前記核酸配列が、５’－ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡＵ ＡＡＣ ＡＡＵ ＡＵＧ ＣＵＡ ＡＡＵ ＧＵＵ ＧＵＵ ＡＵＡ ＧＵＡ ＵＣＣ ＣＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の人工核酸。
  24. 前記第２のリクルート部分が、請求項１～１０において第１のリクルート部分に関して定義されているリクルート部分である、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  25. 前記標的化配列と前記第２のリクルート部分との間にヌクレオチドスペーサー、好ましくは請求項１１～１３のいずれか１項で定義されているヌクレオチドスペーサーを含む、請求項２４に記載の人工核酸。
  26. 前記第２のリクルート部分が、デアミナーゼに結合することができる核酸配列、好ましくは請求項１８～２３で定義されている核酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の人工核酸。
  27. 前記第１のリクルート部分が、請求項３～９のいずれか１項で定義されているリクルートメント配列のクラスターを含む、請求項２６に記載の人工核酸。
  28. ５’から３’への方向、または３’から５’への方向において以下を含む、請求項２６または２７に記載の人工核酸：
    ａ）標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合し、好ましくは前記標的ＲＮＡ中の第１の領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つのリクルートメント配列を含む、第１のリクルート部分であって、好ましくは、前記標的ＲＮＡの第１の領域およびさらなる領域に結合し、好ましくは前記標的ＲＮＡの第１の領域およびさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的であるリクルートメント配列のクラスターを含む、第１のリクルート部分；
    ｂ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列、および
    ｃ）デアミナーゼに結合することができる核酸配列を含む、第２のリクルート部分。
  29. 第１のリクルートメント配列および／またはさらなるリクルートメント配列は、リクルートメント配列の５’もしくは３’末端のいずれかから５ｎｔ以内であるか、またはＳ＝ＣもしくはＧである５’－ＮＵＳコンテクスト中にあるか、のいずれかでない限り、ウリジン塩基が枯渇している、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  30. 前記第２のリクルート部分が、標的ＲＮＡ中のさらなる領域に結合し、好ましくは前記標的ＲＮＡ中のさらなる領域に相補的または少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つのさらなるリクルートメント配列を含み、
    前記さらなるリクルートメント配列が、好ましくは、リクルートメント配列の５’もしくは３’末端のいずれかから５ｎｔ以内であるか、またはＳ＝ＣもしくはＧである５’－ＮＵＳコンテクスト中にあるか、のいずれかでない限り、ウリジン塩基が枯渇している、
    請求項２８または２９に記載の人工核酸。
  31. ５’から３’への方向、または３’方向から５’への方向において以下を含む、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸：
    ａ）デアミナーゼをリクルートすることができる第１のリクルート部分であって、標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する少なくとも１つのリクルートメント配列を含む、第１のリクルート部分；
    ｂ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列、および
    ｃ）デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分であって、好ましくは、デアミナーゼに結合できる核酸配列を含む、第２のリクルート部分。
  32. 前記第１のリクルート部分、前記標的化配列、および前記第２のリクルート部分が、請求項１に記載の人工核酸に関して請求項１～９および１１～３０で定義されている通りである、請求項３１に記載の人工核酸。
  33. ＲＮＡまたはＲＮＡアナログである、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  34. 内因的に発現可能なＲＮＡである、前記請求項のいずれか１項に記載の人工核酸。
  35. 以下の工程を含む、請求項１～３４のいずれか１項で定義された標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸の配列を生成するための方法
    ｉ）標的ＲＮＡ中の第１の領域に結合する、少なくとも１つのリクルートメント配列を含む、第１のリクルート部分の配列を生成する；
    ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドを含むヌクレオチドスペーサーの配列を任意に生成する；
    ｉｉｉ）編集対象の１つ以上のヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含む、標的化配列を生成する；
    ｉｖ）デアミナーゼをリクルートすることができる第２のリクルート部分の配列を生成する；および
    ｖ）第１のリクルート部分の配列、任意でヌクレオチドスペーサー、標的化配列、および第２のリクルート部分の配列を、５’から３’への方向または３’から５’への方向においてアセンブルする。
  36. 前記工程ｉ）および任意で前記工程ｉｖ）が、少なくとも２つのリクルートメント配列を含むリクルート部分を生成すること、好ましくはヌクレオチドリンカーを介して連結されたリクルートメント配列のクラスターを生成することを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記工程ｉ）および任意で前記工程ｉｖ）が、少なくとも１つのリクルートメント配列への結合部位として適切であり、好ましくは編集可能なアデノシンヌクレオチドを含まない、核酸配列について編集対象の標的ＲＮＡをスクリーニングする工程を含む、コンピュータで実行される方法によって達成される、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記工程ｉ）～ｖ）の全てが、コンピュータで実行される、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記コンピュータで実行される方法が、以下の点に関してプリセットに基づいて実行される、請求項３８に記載の方法
    － 標的ＲＮＡ上の標的化配列への結合部位として機能する核酸配列の長さ、
    － 標的化配列への結合部位と、標的ＲＮＡ上の少なくとも１つのリクルートメント配列への結合部位との間の距離、
    － ヌクレオチドリンカーの長さ、および任意のヌクレオチドスペーサーの長さ、
    － 標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への結合部位として適切な核酸配列の長さ、および／または
    － 標的ＲＮＡ上の個々のリクルートメント配列への結合部位間の距離。
  40. － 前記標的ＲＮＡ上の標的化配列への結合部位として機能する核酸配列の長さが、１０～５０個、好ましくは１６～４０個のヌクレオチドの範囲に設定され、
    － 前記標的化配列への結合部位と、標的ＲＮＡ上の少なくとも１つのリクルートメント配列への結合部位との間の距離が、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは２～５００個のヌクレオチド、より好ましくは２～５０個のヌクレオチドの範囲に設定され、
    － 前記ヌクレオチドリンカーの長さ、および前記ヌクレオチドスペーサーの長さが、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは２～６個のヌクレオチドの範囲に設定され、
    － 前記標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への結合部位として適切な核酸配列の長さが、１０～２００個、好ましくは２０～１００個のヌクレオチドの範囲に設定され、および／または
    － 前記標的ＲＮＡ上のリクルートメント配列への個々の結合部位間の距離が、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは２～５００個のヌクレオチド、より好ましくは２～５０個ヌクレオチドの範囲に設定される、
    請求項３９に記載の方法。
  41. 前記コンピュータで実行される方法が、リクルートメント配列のクラスターの代替配列を作製することを含む、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記コンピュータで実行される方法が、アセンブルされた人工核酸内の潜在的な分子内塩基対形成事象を決定し、最小の潜在的な分子内塩基対形成を提示する人工核酸を選択する工程をさらに含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記コンピュータで実行される方法が、選択されたリクルートメント配列または選択されたリクルートメント配列のクラスター、好ましくは人工核酸が、標的ＲＮＡ上の他の部位または生物のトランスクリプトーム中の別のＲＮＡ分子に結合することができ、望ましくないミスマッチおよび標的外事象をもたらすかどうかを評価し、そのようなリクルートメント配列またはそのようなリクルートメント配列のクラスターを排除する工程をさらに含む、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記工程ｉｖ）が、工程ｉ）に関して定義されたものと同じ工程を含む、請求項３５～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記第２のリクルート部分が、デアミナーゼに結合することができる核酸配列、好ましくは、請求項１８～２３で定義された核酸配列を含む、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記第１のリクルート部分、任意で前記ヌクレオチドスペーサー、前記標的化配列、および前記第２のリクルート部分が、３’から５’への方向においてアセンブルされる、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 請求項３７～４６のいずれか１項に記載の方法を実行するように構成されている手段を含む、データ処理デバイス。
  48. コンピュータによって実行される場合に、前記コンピュータに、請求項３７～４６のいずれか１項に記載の方法を実行させる命令を含む、コンピュータプログラム。
  49. コンピュータによって実行される場合に、前記コンピュータに、請求項３７～４６のいずれか１項に記載の方法を実行させる命令を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
  50. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸をコードする、ベクター。
  51. 前記人工核酸の配列が、請求項３５～４６のいずれか１項に記載の方法によって生成される、請求項５０に記載のベクター。
  52. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、または請求項５０もしくは５１に記載のベクターを含む、細胞。
  53. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、または請求項５２に記載の細胞、ならびに追加の賦形剤、好ましくは薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
  54. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、または請求項５３に記載の組成物を含む、キット。
  55. 標的ＲＮＡの部位特異的編集のための、請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、請求項５３に記載の組成物、または請求項５４に記載のキットの使用。
  56. 医薬品として使用するための、請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、請求項５３に記載の組成物、または請求項５４に記載のキット。
  57. 好ましくは代謝性疾患、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患および神経性疾患からなる群から選択される、遺伝性疾患または遺伝性障害の治療または予防に使用するための、請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、請求項５３に記載の組成物、または請求項５４に記載のキット。
  58. 感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患もしくは障害からなる群から選択される、疾患または障害の治療または予防に使用するための、請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、請求項５３に記載の組成物、または請求項５４に記載のキット。
  59. 治療または予防が、標的ＲＮＡの部位特異的編集の工程を含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、請求項５３に記載の組成物、または請求項５４に記載のキット。
  60. 好ましくは、代謝性疾患、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患および神経性疾患からなる群から選択される、遺伝性疾患または遺伝性障害の診断に使用するための、請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、請求項５３に記載の組成物、または請求項５４に記載のキット。
  61. 好ましくは、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患もしくは障害からなる群から選択される、疾患または障害の診断に使用するための、請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、請求項５３に記載の組成物、または請求項５４に記載のキット。
  62. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の人工核酸、請求項５０もしくは５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞、または請求項５３に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、疾患または障害に罹患している対象を治療するための方法。
  63. 前記疾患または障害が、遺伝性疾患である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記疾患または障害が、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患もしくは障害からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
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