JP2023548209A

JP2023548209A - ILD, PF - Viral vectors and nucleic acids for ILD and IPF treatment

Info

Publication number: JP2023548209A
Application number: JP2023527121A
Authority: JP
Inventors: ゼバスチャンクロイツ; ホルガークライン; ベンヤミンシュトローベル; シュテファンクレー; トルシュテンラムラ; マークケスレ; ルドガーイッケンシュタイン
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-11-15
Also published as: EP4240852A2; US20230416738A1; WO2022096092A1; JP2023547681A; WO2022096612A3; WO2022096612A2; EP4240850A1; US20230407303A1; CN116802291A; CN116783298A

Abstract

カプシドおよびパッケージ化された核酸を含み、前記核酸がブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡの増加、または前記核酸がブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでアップレギュレートされるｍｉＲＮＡの阻害のいずれかをするウイルスベクター。an increase in miRNA comprising a capsid and a packaged nucleic acid, wherein said nucleic acid is downregulated in a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or an AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model, or said nucleic acid is downregulated in a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model; Viral vectors that either inhibit miRNAs that are upregulated in the model or the AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model.

Description

間質性肺炎（ＩＬＤ）という用語は、大きく不均一な２００以上の肺疾患のグループを含み、そのほとんどは稀な疾患として分類される。ＩＬＤにおける主な異常は、遠位肺実質の破壊であり、結果としてガス交換障害および拘束性換気障害となる。一般的に、肺胞上皮細胞の幾つかの損傷形態が修復機構と対になった炎症性反応を始動すると考えられている。創傷治癒過程は炎症、線維症または両方の組合せとして病理学的に反映される。根底にある病態生理と関係なく、結果として生じる間質腔の変質は呼吸困難および咳のような臨床症状をもたらし、そして肺機能検査において制限的換気障害およびガス交換障害という結果になる（ＳｃｈｗａｒｔｚＭＩら、２０１１）。一般的に認められていたＩＬＤの単一の分類はない。それらは通常、その病因（関連性または原因が既知である突発性疾患またはＩＬＤ）、臨床経過（急性、亜急性、または慢性ＩＬＤ）、および主な病理学的特徴（炎症性または線維化性ＩＬＤ）に基づいて分類されうる。線維化性ＩＬＤは、それらの縦断的な疾患活動性に基づいて３つのグループに分けられる（ＷｅｌｌｓＡＵ、２００４）。
● 本質的に非進行性、例えば薬剤除去後の薬剤誘導性肺疾患または誘因除去後の過敏性肺炎（ＨＰ）の幾つかの症例；
● 進行性だが免疫調節により安定、例えば結合組織病（ＣＴＤ）－ＩＬＤの幾つかの症例（ＴａｓｈｋｉｎＤＰら、２００６、ＦｉｓｃｈｅｒＡら、２０１３、ＭｏｒｉｓｓｅｔＪら、２０１７、ＡｄｅｇｕｎｓｏｙｅＡら、２０１７）；
● 個々のＩＬＤで適当と考えられた治療にも関わらず進行性、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）。 The term interstitial lung disease (ILD) encompasses a highly heterogeneous group of over 200 lung diseases, most of which are classified as rare diseases. The main abnormality in ILD is destruction of the distal lung parenchyma, resulting in impaired gas exchange and restrictive ventilation. It is generally believed that some form of damage to alveolar epithelial cells initiates an inflammatory response coupled with repair mechanisms. The wound healing process is reflected pathologically as inflammation, fibrosis or a combination of both. Irrespective of the underlying pathophysiology, the resulting interstitial space alterations lead to clinical symptoms such as dyspnea and cough, and result in restrictive ventilation and impaired gas exchange on pulmonary function tests (Schwartz MI et al., 2011). There is no single generally accepted classification of ILD. They are usually distinguished by their etiology (idiopathic disease or ILD with known association or cause), clinical course (acute, subacute, or chronic ILD), and main pathological features (inflammatory or fibrotic ILD). ) can be classified based on Fibrotic ILDs are divided into three groups based on their longitudinal disease activity (Wells AU, 2004).
● Some cases of essentially non-progressive, e.g. drug-induced lung disease after removal of the drug or hypersensitivity pneumonitis (HP) after removal of the trigger;
● Progressive but stable with immunomodulation, such as some cases of connective tissue disease (CTD)-ILD (Tashkin DP et al., 2006, Fischer A et al., 2013, Morisset J et al., 2017, Adegunsoye A et al., 2017);
● Progressive despite treatment considered appropriate for the individual ILD, eg idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).

ＩＰＦは最も知られている進行性線維化を伴うＩＬＤ（ＰＦ－ＩＬＤ）の基本型である一方、ＩＰＦ以外の異なるＩＬＤ臨床診断を有し、その疾患経過中に進行性繊維化表現型を生じる患者グループがある。これらの患者は、疾患がイメージングでの肺線維症の程度の増加によって定義されること、肺機能の低下、それぞれのＩＬＤで適当とされる管理にも関わらず呼吸症状や生活の質の悪化、そして最終的には早期死亡といったＩＰＦを有する患者との多数の類似性を示す（ＦｌａｈｅｒｔｙＫＲら、２０１７；ＷｅｌｌｓＡＵら、２０１８；ＣｏｔｔｉｎＶら、２０１９；ＫｏｌｂＭら、２０１９）。ＩＰＦと同様、これらの他の線維化を伴うＩＬＤを有する患者において、ＦＶＣの低下は患者の死亡率を予想する（ＪｅｇａｌＹら、２００５；ＳｏｌｏｍｏｎＪＪら、２０１６；ＧｉｍｅｎｅｚＡら、２０１７；ＧｏｈＮＳら、２０１７；ＶｏｌｋｍａｎｎＥＲら、２０１９）。ＩＰＦの患者を除き、進行性線維化を伴うＩＬＤの患者に対しては承認された疾患緩和薬物療法がなく、満たされていない医療ニーズが多くある。それらの臨床的類似性に従って、進行性線維化を伴うＩＬＤは組織損傷に対して共通の線維化反応を示す病態生理学的メカニズムを共有する（図３参）（ＴｈａｎｎｉｃｋａｌＶＪら、２０１４；ＢａｇｎａｔｏＧａｔｅａｌ．、２０１５；ＷｏｌｌｉｎＬら、２０１９；ＬｕｃｋｈａｒｄｔＴＲら、２０１５）。これらのメカニズムは多因子性で複雑である。ＩＬＤ患者の肺における繊維化促進性および増殖促進性の環境は平滑筋細胞および内皮細胞の増加および増殖をもたらす。結果として生じた遠位肺小動脈の筋性化および増加した毛細血管の成長は血管抵抗の増加に寄与している可能性が高い。 While IPF is the most well-known prototype of ILD with progressive fibrosis (PF-ILD), there are different clinical diagnoses of ILD other than IPF, resulting in a progressive fibrotic phenotype during the course of the disease. There is a patient group. These patients have disease defined by an increased degree of pulmonary fibrosis on imaging, decreased lung function, and worsening of respiratory symptoms and quality of life despite appropriate management for their respective ILD. and ultimately show many similarities to patients with IPF, such as early death (Flaherty KR et al., 2017; Wells AU et al., 2018; Cottin V et al., 2019; Kolb M et al., 2019). Similar to IPF, in patients with these other fibrotic ILDs, decreased FVC predicts patient mortality (Jegal Y et al., 2005; Solomon JJ et al., 2016; Gimenez A et al., 2017; Goh NS et al., 2017; Volkmann ER et al., 2019). With the exception of patients with IPF, there are no approved disease-modifying drug treatments for patients with ILD with progressive fibrosis, and there are many unmet medical needs. In line with their clinical similarities, ILD with progressive fibrosis share pathophysiological mechanisms that exhibit a common fibrotic response to tissue injury (see Figure 3) (Thannickal VJ et al., 2014; Bagnato Gate al., 2015; Wollin L et al., 2019; Luckhardt TR et al., 2015). These mechanisms are multifactorial and complex. The pro-fibrotic and pro-proliferative environment in the lungs of ILD patients results in an increase and proliferation of smooth muscle cells and endothelial cells. The resulting muscularization of distal pulmonary arterioles and increased capillary growth likely contribute to increased vascular resistance.

科学文献によると、進行性線維症を合併し得るＩＬＤは、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）（ＫｉｍＭＹら、２０１２）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）（ＧｕｌｅｒＳＡら、２０１８）、過敏性肺炎（ＨＰ）（ＳａｄｅｌｅｅｒＬＪら、２０１９）、関節リウマチ関連ＩＬＤ（ＲＡ－ＩＬＤ）（ＤｏｙｌｅＴＪ＆ＤｅｌｌａｒｉｐａＰＦ２０１７）およびＳＳｃ－ＩＬＤＧｕｌｅｒＳＡら、２０１８）のような自己免疫性ＩＬＤ、サルコイドーシス（ＷａｌｓｈＳＬら、２０１４）、職業関連肺疾患（ＫｈａｌｉｌＮら、２００７）を含むが、それに限定されるものではない。ＩＰＦのような進行性線維化を伴うＩＬＤの病因はまだ不明である。しかし、喫煙を含む様々な刺激物、職業上の危険、ウイルスおよび細菌感染ならびに放射線療法および化学療法剤（ブレオマイシンなど）がＩＰＦの進展の潜在的な危険因子として記述されている。過去数年間にわたるＩＰＦ診断基準の変化により、ＩＰＦの有病率は文献においてかなり異なる。最近のデータによると、ＩＰＦの有病率は１００，０００当たり１４．０から６３．０例で変動し、一方、その発生は１００，０００当たり年間の新規症例数が６．８と１７．４例の間にある（ＬｅｙＢら、２０１３）。ＩＰＦは通常高齢者で診断され、疾患発症の平均年齢は６６歳である（ＨｏｐｋｉｎｓＲＢら、２０１６）。初期診断後、ＩＰＦは３から５年以内に約６０％の死亡率で急速に進行する。ＩＰＦと対照的に、ＣＴＤ（関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群および全身性強皮症（ＳＳｃ）などを含む）またはサルコイドーシス患者の可変部分は進行性線維化表現型を示し、ＲＡ患者の約１０～２０％、シェーグレン症候群の９～２４％、ＳＳｃの＞７０％（ＭａｔｈａｉＳＣおよびＤａｎｏｆｆＳＫ、２０１６）およびサルコイドーシス患者の２０～２５％（ＳｐａｇｎｏｌｏＰら、２０１８）で肺線維症を発症する。 According to the scientific literature, ILDs that can be complicated by progressive fibrosis include idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP) (Kim MY et al., 2012), unclassifiable idiopathic interstitial pneumonia (IIP) (Guler et al. SA et al., 2018), hypersensitivity pneumonitis (HP) (Sadeleer LJ et al., 2019), rheumatoid arthritis-associated ILD (RA-ILD) (Doyle TJ & Dellaripa PF 2017) and SSc-ILD Guler SA et al., 2018). including, but not limited to, sexual ILD, sarcoidosis (Walsh SL et al., 2014), and work-related lung disease (Khalil N et al., 2007). The pathogenesis of ILD with progressive fibrosis like IPF is still unclear. However, various irritants including smoking, occupational hazards, viral and bacterial infections, as well as radiation therapy and chemotherapeutic agents (such as bleomycin) have been described as potential risk factors for the development of IPF. Due to changes in IPF diagnostic criteria over the past few years, the prevalence of IPF varies considerably in the literature. According to recent data, the prevalence of IPF varies from 14.0 to 63.0 cases per 100,000, while its incidence varies between 6.8 and 17.4 new cases per 100,000 per year. Among the examples (Ley B et al., 2013). IPF is usually diagnosed in older adults, with the average age of disease onset being 66 years (Hopkins RB et al., 2016). After initial diagnosis, IPF progresses rapidly with approximately 60% mortality within 3 to 5 years. In contrast to IPF, a variable proportion of patients with CTD (including rheumatoid arthritis (RA), Sjögren's syndrome and systemic sclerosis (SSc), etc.) or sarcoidosis exhibits a progressive fibrotic phenotype, with approximately 10% of patients with RA Pulmonary fibrosis develops in ~20%, 9-24% of Sjögren's syndrome, >70% of SSc (Mathai SC and Danoff SK, 2016) and 20-25% of sarcoidosis patients (Spagnolo P et al., 2018).

２つの主な病理組織学的特徴がＰＦ－ＩＬＤで観察され、すなわち非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）および通常間質性肺炎（ＵＩＰ）である。ＩＰＦの病理組織学的特徴は、ＵＩＰおよび過度の細胞外マトリックス沈着によって引き起こされる進行性間質性線維症である。ＵＩＰは、胸膜下および胸膜傍の線維化領域と、影響の少ないまたは正常な肺実質組織領域が交互に現れる不均質な外観によって特徴づけられる。活動的な線維化領域、いわゆる線維芽細胞巣は、線維芽細胞集積および過剰なコラーゲン沈着によって特徴づけられる。線維芽細胞巣は血管内皮および肺胞上皮の間に位置することが多く、それによって肺の構造が破壊され、特徴的な「蜂巣状構造」が形成される、ＩＰＦの臨床症状は、劇的な酸素拡散障害、進行性肺機能低下、咳および深刻な生活の質の障害である。 Two main histopathological features are observed in PF-ILD: nonspecific interstitial pneumonia (NSIP) and usual interstitial pneumonia (UIP). The histopathological hallmarks of IPF are progressive interstitial fibrosis caused by UIP and excessive extracellular matrix deposition. UIP is characterized by a heterogeneous appearance with areas of subpleural and parapleural fibrosis alternating with areas of less affected or normal lung parenchyma. Active fibrosis areas, so-called fibroblast foci, are characterized by fibroblast accumulation and excessive collagen deposition. Fibroblast nests are often located between the vascular endothelium and the alveolar epithelium, thereby destroying the structure of the lungs and forming the characteristic "honeycomb structure." The clinical symptoms of IPF are dramatic. It is associated with impaired oxygen diffusion, progressive lung function decline, coughing and severe impairment of quality of life.

ＵＩＰはまた、ＲＡ－ＩＬＤおよび後期サルコイドーシスの主要な病理組織学的特徴の１つである。しかし、ＳＳｃまたはシェーグレンのような他のＣＴＤは主に非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）で特徴づけられる。 UIP is also one of the major histopathological features of RA-ILD and late-stage sarcoidosis. However, other CTDs such as SSc or Sjögren's are primarily characterized by non-specific interstitial pneumonia (NSIP).

ＮＳＩＰは少ない空間不均一性によって特徴づけられ、すなわち病理学的異常は肺にわたってやや均一な広がりを持つ。細胞ＮＳＩＰサブタイプ場合、病理組織は炎症細胞で特徴づけられるが、より一般的な線維化サブタイプの場合、著しい線維化の領域の追加が明らかである。しかし、病理学的症状は多種多様であるため、それによって正確な診断およびＵＩＰ／ＩＰＦのような他の線維症タイプとの区別が複雑になる。 NSIP is characterized by less spatial heterogeneity, ie, the pathological abnormalities have a rather uniform spread across the lungs. In the case of the cellular NSIP subtype, the histopathology is characterized by inflammatory cells, whereas in the case of the more common fibrotic subtype, additional areas of significant fibrosis are evident. However, the pathological symptoms are diverse, which complicates accurate diagnosis and differentiation from other fibrosis types such as UIP/IPF.

ＩＰＦの病因が不明であるため、細胞および分子レベルの病理学的メカニズムに関する知識はまだ限られている。しかし、機能的研究のための疾患実験モデル（インビトロおよびインビボ）ならびにゲノミクス／プロテオミクス分析のためのＩＰＦ患者からの組織サンプルを使用したトランスレーショナルリサーチの最近の進歩は重要な疾患メカニズムへの貴重な知見を可能にした。現時点での理解によると、ＩＰＦは反復的な肺胞上皮細胞（ＡＥＣ）の微小損傷で始まり、最終的には制御不能で持続的な創傷治癒反応をもたらす。さらに詳細には、ＡＥＣ損傷が隣接する上皮細胞の異常な活性化を誘導し、それによって損傷部位への免疫細胞および幹細胞または前駆細胞の動員につながる。様々なサイトカイン、ケモカインおよび成長因子を分泌することにより、浸潤細胞は炎症促進性環境を生み出し、最終的には線維芽細胞の拡大および活性化をもたらす。生理的状態の下では、これらのいわゆる筋線維芽細胞は胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分を産生し、損傷組織を安定化させ、修復する。さらに、創傷治癒過程の後期において、筋線維芽細胞はそれら固有の収縮性機能を通して組織収縮および創傷閉鎖に寄与する。生理的創傷治癒と対照的に、ＩＰＦにおいて炎症およびＥＣＭ産生は自己制限されない。その結果、これはＥＣＭの継続的な沈着につながり、最終的には進行性肺硬化および肺構造の破壊をもたらす。実際、ＥＣＭバイオマーカーはＰＦ－ＩＬＤの治療開始の決定に使用できる。ＷＯ２０１７／２０７６４３参照。分子レベルでは、ＩＰＦの病因は多数の線維化促進メディエーターおよびシグナリング経路により編成されている。強力な繊維化効果によりＩＰＦで中心的役割を果たすＴＧＦβの他に、チロシンキナーゼシグナリングおよび例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のような様々な対応成長因子の上昇がＩＰＦの発病に寄与する。 Because the pathogenesis of IPF is unknown, knowledge about the pathological mechanisms at the cellular and molecular level is still limited. However, recent advances in translational research using disease experimental models (in vitro and in vivo) for functional studies and tissue samples from IPF patients for genomics/proteomics analyzes have provided valuable insight into important disease mechanisms. made knowledge possible. According to current understanding, IPF begins with repeated alveolar epithelial cell (AEC) microinjuries that ultimately result in an uncontrolled and sustained wound healing response. More specifically, AEC injury induces aberrant activation of adjacent epithelial cells, thereby leading to the recruitment of immune cells and stem or progenitor cells to the injury site. By secreting various cytokines, chemokines and growth factors, infiltrating cells create a pro-inflammatory environment, ultimately leading to fibroblast expansion and activation. Under physiological conditions, these so-called myofibroblasts produce extravesicular matrix (ECM) components to stabilize and repair damaged tissue. Furthermore, late in the wound healing process, myofibroblasts contribute to tissue contraction and wound closure through their intrinsic contractile function. In contrast to physiological wound healing, inflammation and ECM production are not self-limited in IPF. Consequently, this leads to continued deposition of ECM, ultimately leading to progressive lung consolidation and destruction of lung structure. Indeed, ECM biomarkers can be used to determine the initiation of treatment for PF-ILD. See WO2017/207643. At the molecular level, the pathogenesis of IPF is orchestrated by numerous profibrotic mediators and signaling pathways. Besides TGFβ, which plays a central role in IPF due to its strong fibrotic effects, there is an increase in tyrosine kinase signaling and various corresponding growth factors, such as platelet-derived growth factor (PDGF) and fibroblast growth factor (FGF). Contributes to the onset of IPF.

近年、いくつかの薬剤がＩＰＦ治療のために臨床試験された。しかし、今までのところピルフェニドン（Ｅｓｂｒｉｅｔ（登録商標）、ロシュ社／ジェネンテック社）およびニンテダニブ（Ｏｆｅｖ（登録商標）、ベーリンガーインゲルハイム社）の２剤だけが、肺機能低下率の低下の実証により疾患進行度の減速という納得できる治療効果を示した。これらの有望な結果にもかかわらず、ＩＰＦにおける医療ニーズはまだ高く、有効性が向上し、理想的には疾患修正の可能性を有する更なる治療法が緊急に求められている。ニンテダニブはまた、全身性強皮症関連のＩＬＤの治療ならび進行性表現型を有する慢性線維化性間質性肺炎に対して承認されている。一般的に、現在のＩＬＤ管理は副腎皮質ステロイドまたは免疫調節療法による炎症抑制が主である。後者は、事例報告およびアザチオプリン、シクロスポリン、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、リツキシマブおよびタクロリムスを使用した小規模な症例シリーズにおける制御されていない治療反応に基づいている。幾つかのＩＬＤ、例えばＣＴＤ－ＩＬＤの幾つかの症例は免疫調節により安定化でき（ＴａｓｈｋｉｎＤＰら、２００６；ＦｉｓｃｈｅｒＡら、２０１３；ＭｏｒｉｓｓｅｔＪら、２０１７；ＡｄｅｇｕｎｓｏｙｅＡら、２０１７）、その他はそれぞれのＩＬＤで適当と考えられる（薬理学的および／または非薬理学的）治療にも関わらず進行性であり（ＷｅｌｌｓＡＵ２００４）、革新的な治療アプローチに対する残存する高い要求をさらに論証している。 In recent years, several drugs have been clinically tested for the treatment of IPF. However, to date, only two drugs, pirfenidone (Esbriet®, Roche/Genentech) and nintedanib (Ofev®, Boehringer Ingelheim), have demonstrated a reduction in the rate of lung function decline. It showed a convincing therapeutic effect in slowing down the progression of the disease. Despite these promising results, medical needs in IPF remain high and additional treatments with improved efficacy and ideally disease-modifying potential are urgently needed. Nintedanib is also approved for the treatment of systemic sclerosis-associated ILD and chronic fibrosing interstitial pneumonia with a progressive phenotype. In general, current management of ILD focuses on inflammation suppression using corticosteroids or immunomodulatory therapy. The latter is based on case reports and uncontrolled treatment responses in small case series using azathioprine, cyclosporine, cyclophosphamide, mycophenolate mofetil, rituximab, and tacrolimus. Some cases of ILD, such as CTD-ILD, can be stabilized by immunomodulation (Tashkin DP et al., 2006; Fischer A et al., 2013; Morisset J et al., 2017; Adegunsoye A et al., 2017), while others of ILD is progressive despite treatment (pharmacological and/or non-pharmacological) considered appropriate (Wells AU 2004), further demonstrating the high remaining need for innovative therapeutic approaches. .

肺高血圧症（ＰＨ）は、最も頻繁なＩＬＤ合併症の１つであり、早期死亡率の独立した駆動因子でありうる（Ｇａｌｉe Ｎら、２０１５）。ＰＨは右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の上昇、右室圧過負荷、ならびに右心房および心室拡張を有する疾患として定義される（Ｓｍｉｔｈら（２０１３）、ＡｍＪＭｅｄＳｃｉ、３４６（３）：２２１－２２５）。 Pulmonary hypertension (PH) is one of the most frequent ILD complications and may be an independent driver of early mortality (Galie N et al., 2015). PH is defined as a disease with elevated right ventricular systolic pressure (RVSP), right ventricular pressure overload, and right atrial and ventricular dilatation (Smith et al. (2013), Am J Med Sci, 346(3):221 -225).

慢性線維化珪肺症はＩＬＤの系統に属する。結晶性シリカの慢性的で反復的な吸入により引き起こされ、肺胞空間における上皮細胞を損傷し、マクロファージを活性化させて炎症反応を起こさせる。両因子は、常在線維芽細胞の活性化およびこれらの肺領域における関連する細胞外マトリックスの大量沈着をもたらす。 Chronic fibrosing silicosis belongs to the ILD family. It is caused by chronic and repeated inhalation of crystalline silica, which damages epithelial cells in the alveolar space and activates macrophages to produce an inflammatory response. Both factors lead to activation of resident fibroblasts and associated massive deposition of extracellular matrix in these lung regions.

ＩＰＦおよび他の線維化ＩＬＤの発病に関わるおびただしい数の経路によって、様々な疾患メカニズムを同時に調節することを目的としたマルチターゲット治療が最も効果的である可能性が高い。しかし、低分子化合物（ＮＣＥ）または、例えばモノクローナル抗体のような生物物質（ＮＢＥ）を使用した古典的な薬理学的戦略では、それぞれのアプローチで実施するのが難しい。なぜなら両様式とも通常単一の薬物標的または密接に関わる分子の小さなセットを特異的に阻害または活性化するよう設計されるからである。ＰＦ－ＩＬＤに対するマルチターゲット治療を可能にするため、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、生理的および病態生理学的条件の下、特定の標的遺伝子セットのｍＲＮＡ発現レベルを制御することにより、シグナリング経路全体または細胞メカニズムを制御および微調節する能力に基づく新規かつ非常に魅力的な標的クラスの代表例である。ｍｉＲＮＡは小さな非コーディングＲＮＡであり、前駆体分子（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）として転写される。核内で、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは第１成熟過程を受け、小ヘアピン構造によって特徴づけられる、いわゆるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが生成する。核外搬出に続いて、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはＤｉｃｅｒ酵素を介した第２プロセッシング工程を受け、それによって約２２ヌクレオチドの長さの２本鎖の完全な成熟ｍｉＲＮＡが生成される。その遺伝子制御機能を発揮するため、成熟ｍｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に統合され、標的ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに位置するｍｉＲＮＡ結合部位に結合することを可能にする。結合すると、ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの不安定化および切断を誘導、および／または各ｍＲＮＡのタンパク質翻訳の阻害によって遺伝子発現を調節する。現在まで、ヒトでは２０００以上のｍｉＲＮＡが見出され、トランスクリプトームの３０％までを制御する可能性がある（ＨａｍｍｏｎｄＳＭ、２０１５）。 Due to the large number of pathways involved in the pathogenesis of IPF and other fibrotic ILDs, multi-targeted treatments aimed at modulating various disease mechanisms simultaneously are likely to be most effective. However, classical pharmacological strategies using small molecule compounds (NCEs) or biological agents (NBEs), such as monoclonal antibodies, are difficult to implement in the respective approaches. This is because both modalities are usually designed to specifically inhibit or activate a single drug target or a small set of closely related molecules. To enable multi-target therapy against PF-ILD, microRNAs (miRNAs) can be used to target entire signaling pathways or cells by controlling the mRNA expression levels of specific target gene sets under physiological and pathophysiological conditions. They represent a novel and highly attractive class of targets based on their ability to control and fine-tune mechanisms. miRNAs are small non-coding RNAs that are transcribed as precursor molecules (pri-miRNAs). In the nucleus, pri-miRNAs undergo a first maturation process, producing so-called pre-miRNAs, which are characterized by small hairpin structures. Following nuclear export, the pre-miRNA undergoes a second processing step via the Dicer enzyme, thereby generating a double-stranded, fully mature miRNA approximately 22 nucleotides in length. To exert its gene regulatory function, mature miRNAs are integrated into the RNA-induced silencing complex (RISC), which allows them to bind to miRNA binding sites located in the 3'-UTR of target mRNAs. Upon binding, miRNAs regulate gene expression by inducing destabilization and cleavage of target mRNAs and/or inhibiting protein translation of the respective mRNAs. To date, over 2000 miRNAs have been found in humans and may control up to 30% of the transcriptome (Hammond SM, 2015).

本発明は、線維化肺疾患の発病に関わるｍｉＲＮＡの同定、およびウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用したＩＬＤ患者、好ましくはＰＦ－ＩＬＤ患者、特にＩＰＦ患者における、各ｍｉＲＮＡの機能調節によるＰＦ－ＩＬＤのような肺疾患の治療法を開示する。本発明は、ヒトの治療に焦点を当てるが、いずれかの哺乳動物、特にウマ、イヌ、ネコのような伴生種哺乳動物も発明の領域内である。 The present invention aims to identify miRNAs involved in the pathogenesis of fibrotic lung diseases, and to modulate the function of each miRNA in ILD patients, preferably PF-ILD patients, especially IPF patients using viral vectors, especially adeno-associated virus (AAV). Discloses a method for treating lung diseases such as PF-ILD. Although the present invention focuses on treating humans, any mammal, particularly companion species mammals such as horses, dogs, and cats, is also within the scope of the invention.

中程度（チャイルドピューＢ）または重度（チャイルドピューＣ）の肝障害を有する患者でのオフェブ（Ｏｆｅｖ）の治療は推奨されていない（ＥＰＡＲ参照）。エスブリエット（Ｅｓｂｒｉｅｔ）は、既にフルボキサミンを服用している患者（鬱および強迫性障害の治療に使用される薬剤）または重度の肝または腎異常を有する患者に使用してはいけない（ＥＰＡＲ参照）。従って、ＰＦ－ＩＬＤ患者に対して、特に重度肝および腎異常を有するＩＰＦ患者に対してまだ高い医療ニーズがある。本発明の目的は、代替治療を提供することである。本発明の別の目的は、既存の治療から恩恵を受けることができない患者グループであっても適格な代替治療を提供することである。 Ofev treatment is not recommended in patients with moderate (Child-Pugh B) or severe (Child-Pugh C) liver impairment (see EPAR). Esbriet should not be used in patients already taking fluvoxamine (a drug used to treat depression and obsessive-compulsive disorder) or in patients with severe liver or kidney abnormalities (see EPAR). Therefore, there is still a high medical need for PF-ILD patients, especially for IPF patients with severe liver and renal abnormalities. The aim of the invention is to provide an alternative treatment. Another objective of the invention is to provide alternative treatments that are suitable even for patient groups that cannot benefit from existing treatments.

エスブリエットおよびオフェブは確実な有効性を示す一方、両剤の併用療法に対するオプションを制限する可能性がある副作用も伴う（両方のＥＰＡＲ参照）。従って、少ない副作用、または少なくともオフェブまたはエスブリエットとは異なる副作用がある、ＰＦ－ＩＬＤおよび特にＩＰＦ治療のようなＩＬＤ治療にはまだ高い医療ニーズがあるため、オフェブまたはエスブリエットのいずれかとの併用療法が全体的な治療効果を増加させるための選択肢となりうる。本発明の別の目的は、確立された治療オプションと比べて異なるリスク／ベネフィットプロファイルを持つ、例えば確立された治療選択肢と比較してより少ない副作用または異なる副作用を持つ、別の治療選択肢を提供することである。オフェブおよびエスブリエットは、経口すなわち全身的な使用が意図されているが、局所投与または局所および全身経路の両方によって投与可能な治療選択肢がまだ求められている。本発明の別の目的は、局所投与または局所および全身経路の両方によって投与可能な治療選択肢を提供することである。本発明の別の目的は、各マイクロＲＮＡを効率的に発現するウイルスベクターを提供することである。本発明のさらに別の目的は、ウイルスベクターがその対応物よりさらに効率的に各マイクロＲＮＡを発現することであり、例えば各マイクロＲＮＡが５ｐである場合、５ｐマイクロＲＮＡは、その３ｐ対応物より効率的に発現されることである。 While Esbriet and Ofev have shown robust efficacy, they are also associated with side effects that may limit options for combination therapy with both drugs (see both EPARs). Therefore, there is still a high medical need for ILD treatments, such as PF-ILD and especially IPF treatments, that have fewer side effects, or at least different side effects than Ofev or Esbriet, so combination therapy with either Ofev or Esbriet is an overall may be an option to increase therapeutic efficacy. Another object of the invention is to provide alternative treatment options with a different risk/benefit profile compared to established treatment options, e.g. having fewer or different side effects compared to established treatment options. That's true. Although Ofev and Esbriet are intended for oral or systemic use, there remains a need for therapeutic options that can be administered locally or by both local and systemic routes. Another object of the invention is to provide therapeutic options that can be administered by local administration or both local and systemic routes. Another object of the present invention is to provide viral vectors that efficiently express each microRNA. Yet another object of the invention is that the viral vector expresses each microRNA more efficiently than its counterpart, e.g. if each microRNA is 5p, the 5p microRNA is more efficient than its 3p counterpart. It must be expressed efficiently.

本発明のさらに別の目的は、
－有効成分の単回または回数限定の投与のＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤおよび／またはＩＰＦの表現型の複数の態様に対処するＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤおよび／またはＩＰＦの表現型の複数の態様でも対処するＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよび／またはＩＰＦと重大な併存疾患を起こす疾患に有益作用をもたらす可能性のあるＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦの動物モデルおよび細胞モデルにおいて、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦの表現型の１つあるいはそれ以上の態様を低減するツール化合物の組成物
を提供することである。 Yet another object of the invention is to
- treatment options for ILD, PF-ILD or IPF of single or limited administration of active ingredients; and/or - treatment options for ILD, PF-ILD or IPF that address multiple aspects of the ILD and/or IPF phenotype; Treatment options for ILD, PF-ILD or IPF that also address multiple aspects of the ILD and/or IPF phenotype, and/or - Significant comorbidity with ILD, PF-ILD and/or IPF Treatment options for ILD, PF-ILD or IPF that may have a beneficial effect on the disease causing disease and/or - ILD, PF-ILD or IPF in animal and cell models of ILD, PF-ILD or IPF. An object of the present invention is to provide compositions of tool compounds that reduce one or more aspects of the phenotype.

本発明は、一態様において、一般にＩＬＤの治療、および特にＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦの治療のための治療薬、すなわちウイルスベクターまたはｍｉＲＮＡ模倣物に関する。 The present invention, in one aspect, relates to therapeutic agents, ie, viral vectors or miRNA mimetics, for the treatment of ILD in general, and PF-ILD and IPF in particular.

本発明によるウイルスベクターは、ＩＬＤ、好ましくはＰＦ－ＩＬＤ、さらに好ましくはＩＰＦで見られるＥＣＭ沈着のような組織変容の１つまたはそれ以上の態様をｍｉＲＮＡ機能調節により阻止または遅らせるため、これらの疾患で見られる肺活量低下を阻止または遅らせる（ＷＯ２０１７／２０７６４３および参考文献参照）。本発明に記載のウイルスベクターは局所（鼻腔内、気管内、吸入）または全身（静脈内）経路で患者に投与できる。特にＡＡＶベクターは、極めて効率的に肺を標的とすることができ、低い抗原性をするため、特に全身投与にも適している。 Viral vectors according to the invention prevent or delay one or more aspects of tissue alterations, such as ECM deposition, seen in ILD, preferably PF-ILD, and more preferably IPF, by modulating miRNA function, thereby preventing these diseases. (see WO2017/207643 and references). The viral vectors according to the invention can be administered to a patient by local (intranasal, intratracheal, inhalation) or systemic (intravenous) routes. AAV vectors in particular can target the lungs very efficiently and have low antigenicity, making them particularly suitable for systemic administration.

治療の観点から、ｍｉＲＮＡ模倣物を送達することにより線維化状態でダウンレギュレートされる内因性ｍｉＲＮＡ効果を増大させることで、またはｍｉＲＮＡをブロックする分子あるいはいわゆるアンチｍｉＲまたはｍｉＲＮＡスポンジを送達することにより、その利用可能率を減少させて、病的状態下でアップレギュレートされる内因性ｍｉＲＮＡの機能性を阻害することで、ｍｉＲＮＡ機能は調節可能である。 From a therapeutic point of view, by increasing the endogenous miRNA effects that are down-regulated in fibrotic conditions by delivering miRNA mimetics, or by delivering miRNA-blocking molecules or so-called anti-miRs or miRNA sponges. , miRNA function can be regulated by decreasing its availability and inhibiting the functionality of endogenous miRNAs that are upregulated under pathological conditions.

さらに、アップレギュレートされる本発明で記載のｍｉＲＮＡもまた天然の抗線維化反応の一部として保護機能を発揮することもある。しかし、この効果はそれ自体で病状を解消するには十分ではないことは明らかである。従って、特定のケースにおいては、線維化状態で既に上昇している配列のｍｉＲＮＡ模倣物の送達は、その抗線維化効力をさらに高める可能性があり、それによって治療介入に追加モデルを提供する。 Furthermore, the miRNAs described in the present invention that are upregulated may also exert protective functions as part of the natural anti-fibrotic response. However, it is clear that this effect by itself is not sufficient to eliminate the pathology. Therefore, in certain cases, delivery of miRNA mimics of sequences already elevated in fibrotic conditions may further enhance their anti-fibrotic efficacy, thereby providing an additional model for therapeutic intervention.

ｍｉＲＮＡが複数の標的遺伝子の同時制御を指揮するという事実に基づき、ウイルスベクターを介するｍｉＲＮＡ機能の調節は、異なる疾患経路に影響することでマルチターゲット治療を可能にする魅力的な戦略を示す。本発明に記載した肺線維症関連ｍｉＲＮＡは、異なる標的遺伝子セットを調節することにより、以前同定されたｍｉＲＮＡと区別され、それによって向上した治療有効性の可能性を提供する。 Based on the fact that miRNAs direct the simultaneous regulation of multiple target genes, viral vector-mediated modulation of miRNA function represents an attractive strategy to enable multi-target therapy by affecting different disease pathways. The pulmonary fibrosis-associated miRNAs described in this invention are distinguished from previously identified miRNAs by regulating a different set of target genes, thereby offering the potential for improved therapeutic efficacy.

本発明では、２つの疾患関連動物モデル、特に斑状の急性炎症誘発線維化表現型によって特徴づけられるブレオマイシン誘導型肺損傷、およびより均質なＮＳＩＰパターンを連想させるＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘発線維症の詳細な特性解析および計算解析により、肺線維症関連のｍｉＲＮＡセットが同定された。疾患関連ｍｉＲＮＡの同定を可能にするため、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの縦断的な転写プロファイルならびに機能データが作成された。さらに、配列と発現の反相関に基づいて高い信頼度のｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ調節関係が構築され、それらの標的セットに基づいて疾患モデルのコンテクストにおいてｍｉＲＮＡを特徴づけることができた。これらの知見をさらに具体化するために、選択されたｍｉＲＮＡ候補（ｍｉｒ－２９ａ－３ｐ、ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐ、ｍｉｒ－２１２－５ｐ）の合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド模倣物を作製し、ヒト初代肺線維芽細胞、ヒト初代気管支気道上皮細胞およびＡ５４９細胞の細胞線維症モデルにおいて一過性のトランスフェクション実験に使用した。一過性にトランスフェクトされたｍｉＲＮＡの効果をＴＧＦβ誘導性線維化リモデリング（炎症、増殖、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行（ＦＭＴ）、上皮から間葉への移行（ＥＭＴ））の主な側面において調査することにより、選択されたｍｉＲＮＡの予測される抗線維化効果が確認された。最終的に、これらの知見を臨床応用に移すため、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく遺伝子送達を使用することによりＰＦ－ＩＬＤ関連ｍｉＲＮＡの調節を可能にする線維化肺疾患に対する新規治療方法について記述する。 Here, we provide detailed characterization of two disease-related animal models, specifically bleomycin-induced lung injury, which is characterized by a patchy acute inflammation-induced fibrosis phenotype, and AAV-TGFβ1-induced fibrosis, which is reminiscent of a more homogeneous NSIP pattern. Analysis and computational analysis identified a set of miRNAs associated with pulmonary fibrosis. To enable the identification of disease-associated miRNAs, longitudinal miRNA and mRNA transcriptional profiles and functional data were generated. Furthermore, high-confidence miRNA-mRNA regulatory relationships were constructed based on the anticorrelation between sequence and expression, and miRNAs could be characterized in the context of disease models based on their target sets. To further substantiate these findings, synthetic RNA of selected miRNA candidates (mir-29a-3p, mir-10a-5p, mir-181a-5p, mir-181b-5p, mir-212-5p) Oligonucleotide mimetics were generated and used for transient transfection experiments in cellular fibrosis models of human primary lung fibroblasts, human primary bronchial airway epithelial cells, and A549 cells. Effects of transiently transfected miRNAs on TGFβ-induced fibrotic remodeling (inflammation, proliferation, fibroblast-to-myofibroblast transition (FMT), and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)) The predicted anti-fibrotic effects of the selected miRNAs were confirmed by investigating the main aspects of the miRNAs. Finally, to translate these findings into clinical applications, we will discuss novel therapeutic approaches for fibrotic lung diseases that allow modulation of PF-ILD-associated miRNAs by using adeno-associated virus (AAV) vector-based gene delivery. Describe.

本発明によるｍｉＲＮＡ模倣物は、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのようなＩＬＤＳで見られるＥＣＭ沈着のような組織変容の１つあるいはそれ以上の態様をｍｉＲＮＡ機能調節により阻止または遅らせるため、これらの疾患で見られる努力性肺活量の低下を停止または遅らせる（ＷＯ２０１７／２０７６４３および参考文献参照）。本発明によるウイルスベクターと比較して、それらは潜在的に低い抗原性などの異なる副作用プロファイル持ち、それによって免疫抑制剤併用治療を用いず複数の治療を潜在的に可能にする。 miRNA mimetics according to the invention prevent or delay one or more aspects of tissue alterations, such as ECM deposition, seen in ILDS, such as PF-ILD and IPF, by modulating miRNA function. (See WO2017/207643 and references). Compared to the viral vectors according to the invention, they have a different side effect profile, such as potentially lower antigenicity, thereby potentially allowing multiple treatments without immunosuppressant combination therapy.

２つの疾患関連動物モデル、すなわちマウスでのブレオマイシンおよびＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘発肺線維症モデルにおいて縦断的に詳細分析を行うことで、２８の新規ｍｉＲＮＡセットが同定された。最も関連性のあるｍｉＲＮＡを選択するために、遺伝子発現プロファイルデータおよび基本的な機能的疾患パラメータ間の体系的な相関分析に基づいて、本発明者らはヒット選択戦略を開発した。本発明者らは、ＰＦ－ＩＬＤの慢性的性質に配慮して、ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターによるｍｉＲＮＡ、アンチｍｉＲまたはｍｉＲＮＡスポンジの発現を、線維症関連ｍｉＲＮＡの機能調節のための治療用核酸の長期持続発現を可能にする新規治療コンセプトとして記述する。 A detailed longitudinal analysis in two disease-related animal models, bleomycin and AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis models in mice, identified 28 novel miRNA sets. To select the most relevant miRNAs, we developed a hit selection strategy based on systematic correlation analysis between gene expression profile data and basic functional disease parameters. Considering the chronic nature of PF-ILD, the present inventors used expression of miRNAs, anti-miRs or miRNA sponges by viral vectors, especially adeno-associated virus (AAV)-based vectors, to modulate the function of fibrosis-related miRNAs. This is described as a novel therapeutic concept that enables long-term sustained expression of therapeutic nucleic acids for the treatment of cancer.

研究デザインを図示する。合計１３０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスは、気管内投与で、ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｋｇブレオマイシンまたはＡＡＶ６．２－スタッファーコントロールまたはＡＡＶ６．２－ＣＭＶ－ＴＧＦβ１ベクターのいずれかの２．５ｘ１０¹¹ベクターゲノム（ｖｇ）が投与された。スキームに示した各読出しおよびサンプリング（ＲＳ）時間で、肺機能測定が行われ、湿肺重量を測定した。次に、左肺は線維化進展の組織学的評価に使用され、右肺は全肺ＲＮＡの単離のため溶解した。ＲＮＡは、疾患の出現と相関する遺伝子発現変化をプロファイルするため次世代シーケンスに用いた。Illustrate the study design. A total of 130 C57Bl/6 mice were administered intratracheally with 2.5x10 ¹¹ vector genomes (vg) of either NaCl, 1 mg/kg bleomycin or AAV6.2-stuffer control or AAV6.2-CMV-TGFβ1 vector. was administered. At each readout and sampling (RS) time shown in the scheme, pulmonary function measurements were taken and wet lung weights were determined. The left lung was then used for histological evaluation of fibrosis progression, and the right lung was lysed for isolation of total lung RNA. The RNA was used for next generation sequencing to profile gene expression changes that correlate with disease emergence. 肺病理の機能的特性解析に関するデータを示す。マウスは図１に記載したように処理し、線維化の進展を測定した。（Ａ）マッソントリクローム染色した組織学的肺切片は、投与後２１日から肺胞中隔肥厚、細胞外マトリックス沈着の増加および免疫細胞の存在から明らかな線維化出現を示した。下のパネル画像は、上のパネルの顕微鏡写真を１０ｘ拡大した詳細を示す。（Ｂ）ＡＡＶ－ＴＧＦβ１およびブレオマイシン処理動物での湿肺重量の増加は、ＥＣＭ沈着の増加を示し、（Ｃ）線維化動物での肺機能の強い障害に至った。平均＋／－ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、各コントロール処理と比較。Data regarding functional characterization of lung pathology are presented. Mice were treated as described in Figure 1 and the development of fibrosis was measured. (A) Histological lung sections stained with Masson's trichrome showed the appearance of fibrosis evident from alveolar septal thickening, increased extracellular matrix deposition, and the presence of immune cells from 21 days after administration. The lower panel image shows a 10x magnification detail of the upper panel photomicrograph. (B) Increased wet lung weight in AAV-TGFβ1 and bleomycin treated animals indicated increased ECM deposition, leading to (C) strong impairment of lung function in fibrotic animals. Mean +/-SD, **p<0.01, ***p<0.001 compared to each control treatment. 遺伝子発現解析の結果の概要を示す。ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの並行シーケンシングを行うことによって、両モデルにおける分析された全時点でアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたｍＲＮＡ（Ａ）およびｍｉＲＮＡ（Ｂ）が同定された。差次的発現遺伝子を同定するためのカットオフ基準、Ｐａｄｊ．（ＦＤＲ）≦０．０５、ａｂｓ（ｌｏｇ２ＦＣ）≧０．５（ＦＣ≧１．４１４）。（Ｃ）１つのモデルでのみ差次的発現を示すｍＲＮＡを、両モデル（共通にＤＥ）で差次的に発現したｍＲＮＡから各時点で分離し、ＫＥＧＧ経路エンリッチメント分析を行った。データでは、ブレオマイシンモデルにおいて初期時点での急性炎症（「サイトカイン－サイトカイン相互作用」）に対するエンリッチメントが見られたがＡＡＶモデルでは見られなかった。一方、線維化進展（ＥＣＭ受容体相互作用）に対するエンリッチメントが両モデルにおいて時間依存的な様式で観察された。A summary of the results of gene expression analysis is shown. By performing parallel sequencing of mRNA and miRNA, up- and down-regulated mRNAs (A) and miRNAs (B) were identified at all time points analyzed in both models. Cutoff criteria for identifying differentially expressed genes, P adj. (FDR)≦0.05, abs(log2FC)≧0.5 (FC≧1.414). (C) mRNAs differentially expressed in only one model were separated from mRNAs differentially expressed in both models (commonly DE) at each time point and subjected to KEGG pathway enrichment analysis. Data showed enrichment for acute inflammation ("cytokine-cytokine interaction") at early time points in the bleomycin model but not in the AAV model. On the other hand, enrichment for fibrosis progression (ECM receptor interaction) was observed in a time-dependent manner in both models. 線維症関連ｍｉＲＮＡの同定に適用したフィルタ処理の全体像を提供する。第１段階では、２つのモデルのうち少なくとも１つにおいて肺機能および／または肺重量と相関するｍｉＲＮＡ（Ｃ）または反相関するｍｉＲＮＡ（ＡＣ）が同定された。続いて、相関および反相関のｍｉＲＮＡをフィルタにかけ、差次的遺伝子発現を示す候補を探した。定義上、少なくとも１つの動物モデルにおいて１時点あるいはそれ以上で発現レベルが変化（Ｐａｄｊ．（ＦＤＲ）≦０．０５、ａｂｓ（ｌｏｇ２ＦＣ）≧０．５；上方または下方制御）した場合、ｍｉＲＮＡは差次的に発現したとみなした。最終段階では、フィルタしたｍｉＲＮＡを種の保存に関して評価した。シード領域において配列同一性を示し、マウスとヒトの間で成熟ｍｉＲＮＡ配列に対するアラインメント・スコアが少なくとも２０のｍｉＲＮＡはホモログとみなし、一方残りのｍｉＲＮＡはマウス特異的、従って非保存として分類した。最後に、結果として得られたヒットリストは、異なるまたは強い変動発現プロファイルを有する候補、特許取得済みのｍｉＲＮＡおよびアップレギュレートされる非保存ｍｉＲＮＡはヒトにおいて標的にはならないので除外することでマニュアルキュレーションした。Provides an overview of the filtering applied to the identification of fibrosis-associated miRNAs. In the first step, miRNAs correlated (C) or anticorrelated (AC) with lung function and/or lung weight in at least one of the two models were identified. Correlated and anti-correlated miRNAs were then filtered for candidates exhibiting differential gene expression. By definition, a miRNA is considered a miRNA if its expression level changes (P adj. (FDR) ≦ 0.05, abs (log2FC) ≧ 0.5; up- or down-regulated) at one or more time points in at least one animal model. considered to be differentially expressed. In the final step, filtered miRNAs were evaluated for species conservation. miRNAs that showed sequence identity in the seed region and an alignment score of at least 20 to the mature miRNA sequence between mouse and human were considered homologs, while the remaining miRNAs were classified as mouse-specific and therefore non-conserved. Finally, the resulting hit list can be manually refined by excluding candidates with different or strongly variable expression profiles, patented miRNAs and non-conserved miRNAs that are upregulated as they are not targeted in humans. ration. 図４に記載の通りフィルタ処理の適用により同定された線維症関連ｍｉＲＮＡを示す。ヒトホモログが同定されなかったｍｍｕ－ｍｉＲ－３０ｆおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－７６５６－３ｐを除いて、表示したｍｉＲＮＡは全て種保存されている（非常に類似または一致）。ヒトホモログに対するミスマッチは太字および下線で示す。表示した配列はプロセス化され完全成熟したｍｉＲＮＡを表す。Figure 4 shows fibrosis-associated miRNAs identified by applying filtering as described in Figure 4. All miRNAs shown are species conserved (very similar or identical), except for mmu-miR-30f and mmu-miR-7656-3p, for which no human homologs were identified. Mismatches to the human homolog are shown in bold and underlined. The sequences shown represent processed and fully mature miRNAs. マウス配列の最も近いヒトホモログで非常に類似した（しかし一致していない）ものを図５Ｂに示す。表示した配列はまた配列表にまとめられている。配列表および図５Ａおよび図５Ｂの間で矛盾した場合、図５が真正の配列を表す。The closest human homolog of the mouse sequence is shown in Figure 5B, which is very similar (but not identical). The sequences shown are also summarized in a sequence listing. In case of discrepancies between the sequence listing and FIGS. 5A and 5B, FIG. 5 represents the true sequence. 標的予測のワークフローを模式的に示す。図５に載せたｍｉＲＮＡ候補について、ＤＩＡＮＡ、ＭｉＲａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎおよびｍｉＲＤＢデータベースで照合することによりｍＲＮＡ標的を予測した。５つのデータベースのうち少なくとも２つで予測されたｍＲＮＡを検討し、動物モデルでのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ測定値の間の発現の反相関によってさらにフィルタにかけた。その縦断的な発現が対応するｍｉＲＮＡ発現と反相関（ｒｈｏ≦－０．６）した予測ｍＲＮＡを推定標的と呼んだ。それに続き、標的リストは、ｍｉＲＮＡ標的スペクトルの機能的特徴のための経路エンリッチメント分析に供した。The workflow of target prediction is schematically shown. For the miRNA candidates listed in FIG. 5, mRNA targets were predicted by checking with DIANA, MiRanda, PicTar, TargetScan, and miRDB databases. Predicted mRNAs in at least two of the five databases were considered and further filtered by the anticorrelation of expression between miRNA and mRNA measurements in animal models. Predicted mRNAs whose longitudinal expression was anticorrelated (rho≦−0.6) with the corresponding miRNA expression were called putative targets. Subsequently, the target list was subjected to pathway enrichment analysis for functional features of the miRNA target spectrum. 予測された標的セットのエンリッチメントに基づいてｍｉＲＮＡ機能の特徴を示す。各ｍｉＲＮＡに対する予測標的セットには、異なるソースからの参照遺伝子セットに対してエンリッチメントテストを行った。表は、肺線維症のコンテクストにおいて関連のある選ばれた遺伝子セットの小さなサブセットに対する、選ばれたｍｉＲＮＡセットのサブセットの－ｌｏｇ（ｐａｄｊ）を示す。より高い値はより強いエンリッチメントを示す。Figure 3 shows the characterization of miRNA function based on enrichment of predicted target sets. The predicted target set for each miRNA was subjected to enrichment tests against reference gene sets from different sources. The table shows -log(p adj) of a selected subset of miRNA sets for a small subset of selected gene sets that are relevant in the context of pulmonary fibrosis. Higher values indicate stronger enrichment. ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的コンストラクトの発現を可能にするためのベクターデザインを記載する。（Ａ）線維化状態下でダウンレギュレートされる単独のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ組合せはポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ－ＩＩ）またはポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ－ＩＩＩ）プロモーターを使ってベクターから発現できる。ｍｉＲＮＡ配列は各ｍｉＲＮＡの天然バックボーンを使ってまたは外来ｍｉＲＮＡバックボーンに埋め込むことで発現でき、それによって人工的ｍｉＲＮＡを産生する。両方の場合で、ｍｉＲＮＡは前駆体ｍｉＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ）として発現し、細胞内で成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。機構的に、プロセシングされたｍｉＲＮＡは標的遺伝子の３’－ＵＴＲに位置するｍｉＲＮＡ結合部位に選択的に結合し、それによってｍＲＮＡ分解および／またはタンパク質翻訳阻害を通して線維症関連遺伝子の発現レベルの減少をもたらす。（Ｂ）線維化状態下でアップレギュレートされる内因性ｍｉＲＮＡの阻害は、アンチセンス様分子いわゆるアンチｍｉＲの発現により達成できる。各配列はｓｈＲＮＡバックボーンまたは人工的ｍｉＲＮＡバックボーンからＰｏｌ－ＩＩまたはＰｏｌ－ＩＩＩプロモーターを使用して発現させることができる。細胞内プロセシングの後、アンチｍｉＲが線維化促進性標的ｍｉＲＮＡに結合し、それによってそれらの機能性を阻害する。（Ｃ）線維化促進性ｍｉＲＮＡを阻害する別のアプローチは、ｍｉＲＮＡ特異的標的配列、いわゆるスポンジの発現である。Ｐｏｌ－ＩＩプロモーターを使用した発現によって、ｍｉＲＮＡスポンジは線維化促進性ｍｉＲＮＡの封鎖をもたらし、それによってそれらの病理学的機能を阻害する。Vector designs are described to enable expression of miRNA or miRNA targeting constructs. (A) Single miRNAs or miRNA combinations that are downregulated under fibrotic conditions can be expressed from vectors using Polymerase II (Pol-II) or Polymerase III (Pol-III) promoters. miRNA sequences can be expressed using each miRNA's natural backbone or by embedding into a foreign miRNA backbone, thereby producing an artificial miRNA. In both cases, miRNAs are expressed as precursor miRNAs (pri-miRNAs) and are processed into mature miRNAs within the cell. Mechanistically, processed miRNAs selectively bind to miRNA binding sites located in the 3'-UTR of target genes, thereby reducing the expression levels of fibrosis-related genes through mRNA degradation and/or protein translation inhibition. bring. (B) Inhibition of endogenous miRNAs that are upregulated under fibrotic conditions can be achieved by the expression of antisense-like molecules, so-called anti-miRs. Each sequence can be expressed using a Pol-II or Pol-III promoter from an shRNA backbone or an artificial miRNA backbone. After intracellular processing, anti-miRs bind to profibrotic target miRNAs, thereby inhibiting their functionality. (C) Another approach to inhibit profibrotic miRNAs is the expression of miRNA-specific target sequences, so-called sponges. By expression using the Pol-II promoter, miRNA sponges lead to sequestration of profibrotic miRNAs, thereby inhibiting their pathological functions. ｍｉＲＮＡ発現またはｍｉＲＮＡ標的コンストラクトの肺送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの生成を図示する。５’末端および３’末端でのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）による発現コンストラクトのフランキングは、ＡＡＶベクターへのパッケージングを可能にする。様々な天然血清型（ＡＡＶ５、ＡＡＶ６）または修飾カプシド変異（ＡＡＶ２－Ｌ１、ＡＡＶ６．２）は、局所（鼻腔内、気管内、吸入）または全身（静脈内）投与経路の両方で肺への効率的な遺伝子送達を可能にする非常に強力なベクターとして過去に記述されている。Figure 2 illustrates the generation of adeno-associated virus (AAV) vectors for miRNA expression or pulmonary delivery of miRNA targeting constructs. Flanking the expression construct with AAV inverted terminal repeats (ITRs) at the 5' and 3' ends allows packaging into AAV vectors. Various native serotypes (AAV5, AAV6) or modified capsid variants (AAV2-L1, AAV6.2) have been shown to be effective to the lungs both by local (intranasal, intratracheal, inhalation) or systemic (intravenous) routes of administration. It has been described in the past as a very powerful vector that allows for universal gene delivery. 異なるＡＡＶ血清型またはカプシド変異体による肺へのＡＡＶ仲介遺伝子送達の例を提供する。（Ａ）最近記載された全身投与で肺特異的遺伝子送達を可能にするペプチド挿入モチーフを内部に持つＡＡＶ２変異である、ＡＡＶ２－Ｌ１－ＧＦＰ（３ｘ１０¹¹ｖｇ／マウス）の静脈注射の２週間後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス肺切片での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現の免疫組織学的染色（ＫоｒｂｅｌｉｎＪら、２０１６）。ＰＢＳコントロール群ではバックグラウンド染色をこ得る特異的なシグナルは観察されなかった。１群当たり動物ｎ＝６のうちマウス２匹（ｍｓ１、ｍｓ２）からの代表画像。（Ｂ）ＦＶＢ／ＮマウスにおけるインビボイメージングによるＡＡＶ２－Ｌ１体内分布評価（発表データ、ＫоｒｂｅｌｉｎＪら、２０１６）。ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）の肺特異的発現は、投与量５ｘ１０¹⁰ｖｇ／マウスでｆＬｕｃ発現ＡＡＶ２－Ｌ１ベクターの静脈注射後２週間で観察された。（Ｃ）ｆＬｕｃ発現ＡＡＶ５ベクター（２．９ｘ１０¹⁰ｖｇ／マウス）または陰性コントロールとしてＰＢＳの気管内点滴２週間後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから調製したマウス肺のエクスビボイメージング。定量的な肺形質導入は、ＡＡＶ５－ｆＬｕｃ処理動物においてｆＬｕｃ陽性細胞から生じる発光を発光（Ｌｕｍ）チャネルで検出することにより観察した。準備した肺の明視野（ＢＦ）像を上パネルに示す。グループ当たり動物ｎ＝４のうちマウス２匹（ｍｓ１、ｍｓ２）の代表画像を示す。（Ｄ）投与量３ｘ１０¹¹ｖｇ／マウスでＧＦＰ発現ＡＡＶ６．２ベクターの気管内投与３週間後のＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＡＡＶ６．２介在肺送達の分析。組織学的肺切片の顕微鏡写真は直接ＧＦＰ蛍光（右）およびＧＦＰ発現の免疫組織学的分析（左）を示す。ＰＢＳコントロール群ではバックグラウンド染色を超える特異的なシグナルは観察されなかった。１群当たり動物ｎ＝５の代表画像を示す。Examples of AAV-mediated gene delivery to the lung with different AAV serotypes or capsid variants are provided. (A) Two weeks after intravenous injection of AAV2-L1-GFP (3x10 ¹¹ vg/mouse), a recently described AAV2 mutation harboring an internal peptide insertion motif that allows lung-specific gene delivery with systemic administration. Immunohistochemical staining of green fluorescent protein (GFP) expression in C57BL/6J mouse lung sections (Korbelin J et al., 2016). No specific signal overcoming background staining was observed in the PBS control group. Representative images from 2 mice (ms1, ms2) out of n=6 animals per group. (B) AAV2-L1 biodistribution evaluation by in vivo imaging in FVB/N mice (published data, Korbelin J et al., 2016). Lung-specific expression of firefly luciferase (fLuc) was observed 2 weeks after intravenous injection of fLuc-expressing AAV2-L1 vector at a dose of 5x10 ¹⁰ vg/mouse. (C) Ex vivo imaging of mouse lungs prepared from C57BL/6J mice 2 weeks after intratracheal instillation of fLuc-expressing AAV5 vector (2.9x10 ¹⁰ vg/mouse) or PBS as a negative control. Quantitative lung transduction was observed in AAV5-fLuc-treated animals by detecting the luminescence generated from fLuc-positive cells in the luminescence (Lum) channel. A bright field (BF) image of the prepared lung is shown in the upper panel. Representative images of two mice (ms1, ms2) out of n=4 animals per group are shown. (D) Analysis of AAV6.2-mediated pulmonary delivery in Balb/c mice 3 weeks after intratracheal administration of a GFP-expressing AAV6.2 vector at a dose of 3×10 ¹¹ vg/mouse. Photomicrographs of histological lung sections show direct GFP fluorescence (right) and immunohistological analysis of GFP expression (left). No specific signal above background staining was observed in the PBS control group. Representative images of n=5 animals per group are shown. 異なるｍｉＲＮＡ発現カセットの例を提供する。Ａ）ＣＭＶ－ｍｉｒ１８１ａ－ｓｃＡＡＶ（ｃＤＮＡ（ｅＧＦＰ）とｍｉＲＮＡの同時発現用２本鎖ＡＡＶベクターゲノム）およびＣＭＶ－ｍｉｒ１８１ａ－ｍｉｒ１８１ｂ－ｍｉｒ１０ａ－ｓｃＡＡＶ（３つのｍｉＲＮＡの同時発現用２本鎖ＡＡＶベクターゲノム）のベクターマップ。Ｂ）例としてｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐを使用したｍｉＲ－Ｅバックボーンでの異なるｍｉＲＮＡデザインの図解。最初の２つの例では、完全に一致する相補鎖を使用してｍｉＲ－Ｅバックボーンでパッセンジャーまたはガイド位置で完全成熟ｍｉＲＮＡ（２３ｎｔ）として組み込まれたｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐを示す。２番目の例では天然型ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ－Ｅバックボーンにｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐを組み込んだコンストラクトデザインを示す。ｍｉｒＢａｓｅ由来の予測されるｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐの２Ｄ構造（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）。Examples of different miRNA expression cassettes are provided. A) CMV-mir181a-scAAV (double-stranded AAV vector genome for co-expression of cDNA (eGFP) and miRNA) and CMV-mir181a-mir181b-mir10a-scAAV (double-stranded AAV vector genome for co-expression of three miRNAs) vector map. B) Illustration of different miRNA designs in the miRE-E backbone using mir-181b-5p as an example. The first two examples show mir-181b-5p integrated as a fully mature miRNA (23 nt) at the passenger or guide position in the miR-E backbone using perfectly matched complementary strands. The second example shows a construct design incorporating mir-181b-5p into the miRE-E backbone as a natural pre-miRNA. Predicted 2D structure of mir-181b-5p from mirBase (http://mirbase.org/). ３’ＵＴＲに対応する標的配列を有するＧＦＰ発現コンストラクト上のｍｉｒ－ＥバックボーンにおけるｍｉＲ１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐのノックダウン効率を示す。ＨＥＫ－２９３細胞に１つのｍｉＲＮＡをコードしたプラスミドと共にＧＦＰ発現コンストラクトを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。陽性コントロールは最適なｍｉｒ－Ｅコンストラクトであり、一方陰性コントロールは３’ＵＴＲに標的配列の無いＧＦＰコンストラクトである。ｍｉｒ１８１ａ－５ｐの実験は配列番号４９および４７によるガイド位置、ｍｉＲ－Ｅバックボーンを基にしたコンストラクトで行った。ｍｉＲ２１２－５ｐについての実験はそれぞれ配列番号６１および５９によるコンストラクト（ｍｉＲ－Ｅバックボーン、ガイド位置）に基づいた。図２５も参照。ｍｉＲ２９ａ－３ｐについての実験では配列番号８６によるコンストラクトを使用し、コントロールについても同様に配列番号８３によるコンストラクトを使用した。特に、配列番号４９および配列番号６１はそれぞれ配列番号１５および配列番号１７による各参照配列ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐおよびｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐより３’末端で１ｎｔ短いｍｉＲＮＡを保有する。Figure 2 shows the knockdown efficiency of miR181a-5p and miR212-5p in the mir-E backbone on a GFP expression construct with target sequences corresponding to the 3'UTR. HEK-293 cells were transiently transfected with a GFP expression construct along with a plasmid encoding one miRNA. GFP fluorescence was measured 72 hours after transfection. The positive control is the optimal mir-E construct, while the negative control is a GFP construct without the target sequence in the 3'UTR. Experiments with mir181a-5p were performed with guide positions according to SEQ ID NOs: 49 and 47, a construct based on the miRE-E backbone. Experiments on miR212-5p were based on constructs according to SEQ ID NOs: 61 and 59 (miR-E backbone, guide position), respectively. See also Figure 25. The construct according to SEQ ID NO: 86 was used in the experiment regarding miR29a-3p, and the construct according to SEQ ID NO: 83 was similarly used for the control. In particular, SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 61 carry miRNAs that are 1 nt shorter at the 3' end than the respective reference sequences miRNA212-5p and miRNA181a-5p according to SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 17, respectively. ｎ＝６の複製でｓｍａｌｌＲＮＡ配列決定を使用して測定した、ヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）におけるマウスｍｉＲＮＡ候補のヒトオルソログの基礎的ｍｉＲＮＡ発現を示す。発現レベルは１００万当たりのカウント（ｃｐｍ）で示す。矢印はさらに機能的特性解析に選択された、特に興味のあるｍｉＲＮＡ候補を示す。Basal miRNA expression of human orthologs of mouse miRNA candidates in human normal lung fibroblasts (NHLF) measured using small RNA sequencing with n=6 replicates. Expression levels are expressed in counts per million (cpm). Arrows indicate miRNA candidates of particular interest selected for further functional characterization. 無刺激またはＴＧＦβ１で刺激したＡ５４９細胞で炎症性ＩＬ６発現に対するｍｉＲＮＡの効果を示す。ＩＬ－６は、様々な線維性疾患、例えばＩＰＦまたは全身性強皮症において１つの主要な炎症性サイトカインである。上記サイトカインは、なかでもとりわけ、活性化した上皮細胞によって産生され、線維芽細胞および免疫細胞を刺激することができ、線維化反応／変容を刺激する。従って、ＴＧＦβ処理Ａ５４９肺上皮細胞はＩＰＦにおける炎症の病態生理学的側面を模倣する良い代替モデルである。（Ａ）ＩＬ６の発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）または表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物を濃度２ｎＭで細胞にトランスフェクションして評価した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１でさらに２４時間刺激した。抽出したＲＮＡはその後ｃＤＮＡへ逆転写し、ＩＬ６遺伝子発現をｑＰＣＲで測定した。（Ｂ）細胞をトランスフェクトし、（Ａ）に記載の通り刺激して、細胞上清の分泌されたＩＬ６タンパク質をＥＬＩＳＡ測定で検出した。発現レベルは無刺激ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）に対する相対値で表す。トリプル＝ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐの同時トランスフェクション。実験ｎ＝３、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。Figure 3 shows the effects of miRNAs on inflammatory IL6 expression in unstimulated or TGFβ1-stimulated A549 cells. IL-6 is one major inflammatory cytokine in various fibrotic diseases such as IPF or systemic sclerosis. The cytokines are produced by activated epithelial cells, among others, and can stimulate fibroblasts and immune cells, stimulating fibrotic responses/transformations. Therefore, TGFβ-treated A549 lung epithelial cells are a good alternative model to mimic the pathophysiological aspects of inflammation in IPF. (A) IL6 expression was assessed by transfecting cells with a miRNA control construct (Ctrl) or mimics of the indicated miRNA candidates at a concentration of 2 nM. 24 hours after transfection, cells were stimulated with 5 ng/mL TGFβ1 for an additional 24 hours. The extracted RNA was then reverse transcribed into cDNA, and IL6 gene expression was measured by qPCR. (B) Cells were transfected and stimulated as described in (A), and secreted IL6 protein in the cell supernatant was detected by ELISA measurement. Expression levels are expressed relative to the unstimulated miRNA control construct (Ctrl). Triple = co-transfection of miR-10a-5p, miR-181a-5p and miR-181b-5p. Experiment n=3, mean±SD, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (miRNA candidates vs. Ctrl). ヒト正常気管支上皮細胞（ＮＨＢＥＣ）の上皮－間葉移行（ＥＭＴ）における単独のｍｉＲＮＡおよびそれらの組合せの効果を示す。ＥＭＴは線維肺リモデリングの発生において１つの重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｄａｍａｇｅ）により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、上皮細胞の間葉（様）細胞への変化が誘導される。これらの細胞はその上皮細胞機能／完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を失い、バリア機能、空気交換能力の低下をもたらし、細胞外マトリックス沈着の増加がはじまる。３つの側面全てがＩＰＦ疾患の特徴である。機能的および完全体上皮細胞に対するマーカーは細胞マーカーＥ－カドヘリンである。Ｅ－カドヘリンの消失はＥＭＴのマーカーとしてみなされる。Ｅ－カドヘリンの増加は上皮特性の維持を示しており、従って抗線維化と考えられる。ＥＭＴは、図示するように、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭ、またはそれらの組合せ４ｎＭまたは１２ｎＭで細胞にトランスフェクションし、その後５ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１で刺激して評価した。Ｅ－カドヘリン（上皮細胞のマーカー）は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数により正規化し、ここにｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍変化をここに示した。繰り返しｎ＝４、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。ＳＳＭＤ：厳密標準化平均差；＃：｜ＳＳＭＤ｜＞２、＃＃：｜ＳＳＭＤ｜＞３、＃＃＃：｜ＳＳＭＤ｜＞５。Figure 2 shows the effects of single miRNAs and their combinations on the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of human normal bronchial epithelial cells (NHBECs). EMT is regarded as one important initiating factor in the development of fibropulmonary remodeling. Recurrent epithelial cell damage results in chronic secretion of the growth factor TGFβ, which induces the transformation of epithelial cells into mesenchymal(like) cells. These cells lose their epithelial cell function/integrity, resulting in a decrease in barrier function, air exchange capacity, and an increase in extracellular matrix deposition begins. All three aspects are characteristic of IPF disease. A marker for functional and intact epithelial cells is the cell marker E-cadherin. Loss of E-cadherin is regarded as a marker of EMT. Increased E-cadherin indicates maintenance of epithelial properties and is therefore considered anti-fibrotic. EMT was assessed by transfecting cells with miRNA control construct (Ctrl), 2 nM mimic concentration of the indicated miRNA candidates, or their combination 4 nM or 12 nM, followed by stimulation with 5 ng/mL TGFβ1, as indicated. . E-cadherin (an epithelial cell marker) was immunostained after 72 hours, quantified by high-content cell imaging, normalized by the number of cells detected, and the fold change between miRNA candidates and controls is shown here. Repetitions n=4, mean±SD, *p<0.05, **p<0.01 (miRNA candidates vs. Ctrl). SSMD: strict standardized mean difference; #: |SSMD|>2, ##: |SSMD|>3, ###: |SSMD|>5. ヒト正常気管支上皮細胞（ＮＨＢＥＣ）の上皮－間葉移行（ＥＭＴ）における単独のｍｉＲＮＡ（それぞれｍｉＲ１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－３ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐ）およびそれらの組合せの用量／応答実験を提供する。ＥＭＴは、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物の増加濃度（０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ）のどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。表示した濃度は合計濃度である。２つまたは３つのｍｉＲＮＡ組合せについては、関与する単独のｍｉＲＮＡ模倣物の濃度にするために、合計濃度をそれぞれ２または３で割る必要がある。細胞は５ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１で刺激した。Ｅ－カドヘリン（上皮細胞のマーカー）は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数により正規化し、ここにｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍変化を示した。Ｅ－カドヘリンの増加は上皮特性の維持を示しており、従って抗線維化と考えられる。繰り返しｎ＝４、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。Single miRNAs (miR181a-5p, miR-181b-5p, miR-10a-5p and miR-212-3p and miR-212-5p, respectively) in the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of human normal bronchial epithelial cells (NHBECs) ) and their combinations. EMT was assessed by transfecting cells with either miRNA control constructs (Ctrl), increasing concentrations of mimics of the indicated miRNA candidates (0.25 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 4 nM, 8 nM, 16 nM). did. Concentrations shown are total concentrations. For two or three miRNA combinations, the total concentration needs to be divided by 2 or 3, respectively, to give the concentration of the single miRNA mimetic involved. Cells were stimulated with 5ng/mL TGFβ1. E-cadherin (an epithelial cell marker) was immunostained after 72 hours, quantified by high-content cell imaging, normalized by the number of cells detected, and fold change between miRNA candidates and controls is shown. Increased E-cadherin indicates maintenance of epithelial properties and is therefore considered anti-fibrotic. Repetitions n=4, mean±SD, *p<0.05, **p<0.01 (miRNA candidates vs. Ctrl). 無刺激またはＴＧＦβ１で刺激したヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）における炎症性ＩＬ６発現に対するｍｉＲＮＡの効果を示す。ＩＬ－６は、様々な線維性疾患、例えばＩＰＦまたは全身性強皮症において１つの主要な炎症性サイトカインである。上記サイトカインは、なかでもとりわけ、活性化した上皮細胞によって産生され、線維芽細胞および免疫細胞を刺激することができ、線維化反応／形質転換を引き起こす。しかし、活性化した線維化促進性の線維芽細胞も、特に老化表現型を有するものが、多くの炎症性サイトカインを産生し、一方ＩＬ－６は最も顕著な因子の一つである。従って、ＴＧＦβ処理ヒト初代肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）はＩＰＦにおける炎症の病態生理学的側面を模倣する良い代替モデルである。ＩＬ６の発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）または表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭで細胞をトランスフェクションして評価した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１でさらに２４時間刺激した。抽出したＲＮＡはその後ｃＤＮＡへ逆転写し、ＩＬ６遺伝子発現をｑＰＣＲで測定した。繰り返しｎ＝３、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。Figure 3 shows the effect of miRNAs on inflammatory IL6 expression in unstimulated or TGFβ1-stimulated human normal lung fibroblasts (NHLF). IL-6 is one major inflammatory cytokine in various fibrotic diseases such as IPF or systemic sclerosis. The cytokines are produced by activated epithelial cells, among others, and can stimulate fibroblasts and immune cells, causing fibrotic reactions/transformation. However, activated profibrotic fibroblasts, especially those with a senescent phenotype, also produce many inflammatory cytokines, with IL-6 being one of the most prominent factors. Therefore, TGFβ-treated human primary lung fibroblasts (NHLF) are a good alternative model to mimic the pathophysiological aspects of inflammation in IPF. IL6 expression was assessed by transfecting cells with a miRNA control construct (Ctrl) or a miRNA concentration of 2 nM of the indicated miRNA candidates. 24 hours after transfection, cells were stimulated with 5 ng/mL TGFβ1 for an additional 24 hours. The extracted RNA was then reverse transcribed into cDNA, and IL6 gene expression was measured by qPCR. Repetitions n=3, mean±SD, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (miRNA candidate vs. Ctrl). 無刺激またはＴＧＦβ１で刺激したヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）の増殖に対するｍｉＲＮＡの効果を示す。制御された線維芽細胞の増殖はあらゆる損傷治癒過程において重要な側面である。肺線維症を含む線維性疾患は、異常で制御されていない線維芽細胞増殖を有する異常な損傷治癒過程である。これも部分的には成長因子ＴＧＦβによって駆動される。従って、ＴＧＦβ活性化肺線維芽細胞の増殖の測定は、この病態生理学的な側面を模倣するのに重要な分析である。線維芽細胞増殖の減少は抗線維化効果としてみなされる。増殖は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）または表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭで細胞をトランスフェクション入し、その後５ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１で刺激して評価した。増殖は、細胞数との直接相関として細胞代謝活性（ミトコンドリア脱水素酵素）を測定する分光光度酵素的ＷＳＴ－１増殖分析を使用して測定した。繰り返しｎ＝３、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。Figure 2 shows the effect of miRNA on the proliferation of unstimulated or TGFβ1-stimulated human normal lung fibroblasts (NHLF). Controlled fibroblast proliferation is an important aspect of any wound healing process. Fibrotic diseases, including pulmonary fibrosis, are abnormal wound healing processes with abnormal and uncontrolled fibroblast proliferation. This is also driven in part by the growth factor TGFβ. Therefore, measuring the proliferation of TGFβ-activated lung fibroblasts is an important assay to mimic this pathophysiological aspect. A reduction in fibroblast proliferation is considered an anti-fibrotic effect. Proliferation was assessed by transfecting cells with miRNA control construct (Ctrl) or miRNA candidate mimic concentrations of 2 nM as indicated, followed by stimulation with 5 ng/mL TGFβ1. Proliferation was measured using a spectrophotometric enzymatic WST-1 proliferation assay that measures cellular metabolic activity (mitochondrial dehydrogenase) as a direct correlation to cell number. Repetitions n=3, mean±SD, *p<0.05, **p<0.01 (miRNA candidates vs. Ctrl). ヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）の線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行（ＦＭＴ）に対する単独のｍｉＲＮＡおよびそれらの組合せの効果を示す。ＦＭＴは線維肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。α－平滑筋アクチンの発現により、筋線維芽細胞は非常に収縮しやすくなり、コラーゲンを含む多くの細胞外マトリックス構成成分の大量沈着の増加が始まる。筋線維芽細胞は線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。筋線維芽細胞の２つのマーカーはα－平滑筋アクチンとサブユニットＣｏｌ１ａ１を通して検出される沈着コラーゲンの細胞レベルの増加である。Ｅ－カドヘリンの増加は上皮特性の維持を示しており、従って抗線維化と考えられる。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。ＦＭＴは、図示するように、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭ、またはそれらの組合せ４ｎＭまたは１２ｎＭで細胞をトランスフェクションし、その後５ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１で刺激して評価した。コラーゲンタイプ１ α１（筋線維芽細胞のマーカー）は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数で正規化し、ｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍率変化をここに示した。ドナーｎ＝２（繰り返し各４回）、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。ＳＳＭＤ：厳密標準化平均差；＃：｜ＳＳＭＤ｜＞２。Figure 3 shows the effects of single miRNAs and their combinations on the fibroblast-to-myofibroblast transition (FMT) of human normal lung fibroblasts (NHLF). FMT is regarded as another important initiating factor in the development of fibropulmonary remodeling. With recurrent epithelial cell injury, there is chronic secretion of the growth factor TGFβ, which induces the activation of normal resident lung fibroblasts into myofibroblasts. Expression of α-smooth muscle actin makes myofibroblasts highly contractile and initiates increased mass deposition of many extracellular matrix components, including collagen. Myofibroblasts are regarded as the main drivers of the scarring process in fibrotic diseases. Two markers of myofibroblasts are increased cellular levels of α-smooth muscle actin and deposited collagen detected through the subunit Col1a1. Increased E-cadherin indicates maintenance of epithelial properties and is therefore considered anti-fibrotic. A decrease in collagen indicates a loss of myofibroblastic properties and is therefore considered antifibrotic. FMT was assessed by transfecting cells with miRNA control construct (Ctrl), 2 nM mimic concentration of the indicated miRNA candidates, or their combination 4 nM or 12 nM, followed by stimulation with 5 ng/mL TGFβ1, as indicated. . Collagen type 1 α1 (a marker for myofibroblasts) was immunostained after 72 hours, quantified by high-content cell imaging, normalized by the number of cells detected, and the fold change between miRNA candidates and controls is shown here. . Donor n=2 (4 replicates each), mean±SD, *p<0.05, **p<0.01 (miRNA candidate vs. Ctrl). SSMD: strict standardized mean difference; #: |SSMD|>2. 正常およびＩＰＦ肺線維芽細胞のコラーゲン１沈着に対する単独のｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの効果を示す。コラーゲン１の沈着は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物の増加濃度（０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ）のどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１で刺激した。コラーゲンタイプ１ α１は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数で正規化し、ｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍率変化をここに示した。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。ドナーｎ＝７、平均±ＳＤ。２元配置分散分析、ダネットの多重比較。Figure 3 shows the effects of miRNA-181a-5p and miR-212-5p alone on collagen 1 deposition in normal and IPF lung fibroblasts. Collagen 1 deposition was determined by transfecting cells with either a miRNA control construct (Ctrl), increasing concentrations of mimics of the indicated miRNA candidates (0.25 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 4 nM, 8 nM, 16 nM). and evaluated. Cells were stimulated with 5ng/ml TGFβ1. Collagen type 1 α1 was immunostained after 72 hours, quantified by high-content cell imaging, normalized to the number of cells detected, and the fold change between miRNA candidates and control is shown here. A decrease in collagen indicates a loss of myofibroblastic properties and is therefore considered antifibrotic. Donors n=7, mean±SD. Two-way analysis of variance, Dunnett's multiple comparisons. 肺線維芽細胞における異なるコラーゲンサブタイプの発現に対するｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐの効果を示す。ＦＭＴは線維性肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。筋線維芽細胞は、多くの細胞外マトリックス構成成分たとえば異なるタイプのコラーゲンを産生するため、線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。特にコラーゲン１、３および５は線維性瘢痕マトリックスの構成成分としてみなされる。ＴＧＦβ活性化後の線維芽細胞でのコラーゲンサブユニット（Ｃｏｌ１ａ１、３ａ１および５ａ１）の検出は、線維性疾患におけるこの病態生理学的側面の良好な代理としてみなされる。コラーゲンサブユニットの減少は、抗線維化として考慮される。Ａ）Ｃｏｌ１ａ１およびＢ）Ｃｏｌ５ａ１タンパク質の発現ならびにＣ）Ｃｏｌ３ａ１ｍＲＮＡの発現を、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物２ｎＭ（１本鎖ｍｉＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡの組合せ２＋２ｎＭで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１で刺激した。７２時間後、コラーゲンタイプ１α１および５α１はウエスタンブロット技術で免疫染色し、デンシトメトリーで定量した。コラーゲンの発現はＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。Ｃｏｌ３ａ１は２４時間後にＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。Ｃｏｌ３ａ１ｍＲＮＡの発現はデルタ／デルタｃＴ法でＨＰＲＴｍＲＮＡに対して正規化した。コラーゲンの減少は線維化の減少を示している。Ａ（ｎ＝５）およびＢ（ｎ＝３）についてはｍｉＲＮＡ候補とコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化、Ｃ（ｎ＝４）についてはｍｉＲＮＡ候補とｍｉＲＮＡコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。Figure 3 shows the effects of miRNA-181a-5p and miR212-5p on the expression of different collagen subtypes in lung fibroblasts. FMT is regarded as another important initiating factor in the development of fibrotic lung remodeling. With recurrent epithelial cell injury, there is chronic secretion of the growth factor TGFβ, which induces the activation of normal resident lung fibroblasts into myofibroblasts. Myofibroblasts are regarded as the main drivers of the scarring process in fibrotic diseases because they produce many extracellular matrix components, such as different types of collagen. In particular, collagens 1, 3 and 5 are considered as constituents of the fibrous scar matrix. Detection of collagen subunits (Col1a1, 3a1 and 5a1) in fibroblasts after TGFβ activation is regarded as a good surrogate of this pathophysiological aspect in fibrotic diseases. Reduction of collagen subunits is considered anti-fibrotic. Expression of A) Col1a1 and B) Col5a1 proteins and C) Col3a1 mRNA was determined by transfecting cells with miRNA control construct (Ctrl), 2 nM of the indicated miRNA candidate mimic (single-stranded miRNA) or miRNA combination 2+2 nM. and evaluated. Cells were stimulated with 5ng/ml TGFβ1. After 72 hours, collagen types 1α1 and 5α1 were immunostained by Western blot technique and quantified by densitometry. Collagen expression was normalized to GAPDH expression. Col3a1 was quantified by RT-qPCR after 24 hours. Col3a1 mRNA expression was normalized to HPRT mRNA using the delta/delta cT method. A decrease in collagen indicates a decrease in fibrosis. A (n=5) and B (n=3) show the fold change between the miRNA candidate and control+TGFβ1, and C (n=4) shows the fold change between the miRNA candidate and miRNA control+TGFβ1. Mean±SD, *p<0.05, **p<0.01, one-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test. Ａ５４９上皮－線維芽共培養における肺線維芽細胞上でのＣｏｌ１ａ１のｍＲＮＡ発現に対するｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐの効果を示す。Ｃｏｌ１ａ１ｍＲＮＡの発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物２ｎＭのどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。継代培養した肺線維芽細胞と共に、Ａ５４９細胞を透過性誘導細胞フィルタ上に１００％コンフルエントになるように播種した。Ａ５４９細胞および線維芽細胞はフィルタにより分離されているが、Ａ５４９分泌因子が線維芽細胞に流れ込むことは可能である。Ａ５４９細胞のみを５ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１で刺激し、一方サブシードした肺線維芽細胞は外来ＴＧＦβ１で刺激しなかった。２４時間後、肺線維芽細胞中のコラーゲンタイプ１ａ１ｍＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。Ｃｏｌ１ａ１ｍＲＮＡの発現はデルタ／デルタｃＴ法でＨＰＲＴｍＲＮＡで正規化した。コラーゲンの減少は線維化の減少を示している。ｍｉＲＮＡ候補とｍｉＲＮＡコントロール＋ＴＧＦβ１（ｎ＝３）間の倍率変化を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。Figure 3 shows the effects of miRNA-181a-5p and miR212-5p on Col1a1 mRNA expression on lung fibroblasts in A549 epithelial-fibroblast co-culture. Col1a1 mRNA expression was assessed by transfecting cells with either miRNA control construct (Ctrl) or 2 nM of miRNA candidate mimics as indicated. A549 cells were seeded to 100% confluence on permeability-inducing cell filters along with subcultured lung fibroblasts. Although A549 cells and fibroblasts are separated by a filter, it is possible for A549 secreted factors to flow into the fibroblasts. Only A549 cells were stimulated with 5ng/ml TGFβ1, whereas subseeded lung fibroblasts were not stimulated with exogenous TGFβ1. After 24 hours, collagen type 1a1 mRNA in lung fibroblasts was quantified by RT-qPCR. Col1a1 mRNA expression was normalized to HPRT mRNA using the delta/delta cT method. A decrease in collagen indicates a decrease in fibrosis. Fold change between miRNA candidates and miRNA control+TGFβ1 (n=3) is shown. Mean±SD, *p<0.05, **p<0.01, one-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test. 正常およびＩＰＦ肺線維芽細胞のコラーゲン１沈着に対する単独のｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐ、ならびにこれらのｍｉＲＮＡの組合せの効果も示す。ＦＭＴは線維肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。α－平滑筋アクチンの発現により、筋線維芽細胞は非常に収縮しやすくなり、コラーゲンを含む多くの細胞外マトリックス構成成分の大量沈着の増加が始まる。筋線維芽細胞は線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。筋線維芽細胞の２つのマーカーはα－平滑筋アクチンとサブユニットＣｏｌ１ａ１を通して検出される沈着コラーゲンの細胞レベルの増加である。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。コラーゲン１の沈着は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物の増加濃度（単独のｍｉＲＮＡ：１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、２つの組み合わせ：各０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３つの組み合わせ：各０．３３、０．６６ｎＭ、１．３３ｎＭ）のどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１で刺激した。コラーゲンタイプ１ α１は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数で正規化し、ｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍率変化をここに示した。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。単独のｍｉＲＮＡ実験についてはドナーｎ＝７、ｍｉＲＮＡ組合せ実験についてはｎ＝４、平均±ＳＤ。２元配置分散分析、ダネットの多重比較。Also shown is the effect of miRNA-29a-3p, miRNA-181a-5p and miR-212-5p alone, and combinations of these miRNAs, on collagen 1 deposition in normal and IPF lung fibroblasts. FMT is regarded as another important initiating factor in the development of fibropulmonary remodeling. With recurrent epithelial cell injury, there is chronic secretion of the growth factor TGFβ, which induces the activation of normal resident lung fibroblasts into myofibroblasts. Expression of α-smooth muscle actin makes myofibroblasts highly contractile and initiates increased mass deposition of many extracellular matrix components, including collagen. Myofibroblasts are regarded as the main drivers of the scarring process in fibrotic diseases. Two markers of myofibroblasts are increased cellular levels of α-smooth muscle actin and deposited collagen detected through the subunit Col1a1. A decrease in collagen indicates a loss of myofibroblastic properties and is therefore considered antifibrotic. Collagen 1 deposition was induced by miRNA control construct (Ctrl), increasing concentrations of mimics of the indicated miRNA candidates (miRNA alone: 1 nM, 2 nM, 4 nM, combination of the two: 0.5 nM each, 1 nM, 2 nM, combination of the three Cells were transfected with either 0.33, 0.66 nM, or 1.33 nM) and evaluated. Cells were stimulated with 5ng/ml TGFβ1. Collagen type 1 α1 was immunostained after 72 hours, quantified by high-content cell imaging, normalized to the number of cells detected, and the fold change between miRNA candidates and control is shown here. A decrease in collagen indicates a loss of myofibroblastic properties and is therefore considered antifibrotic. Donor n=7 for single miRNA experiments, n=4 for miRNA combination experiments, mean±SD. Two-way analysis of variance, Dunnett's multiple comparisons. 肺線維芽細胞（健常者およびＩＰＦ）での異なるコラーゲンの発現に対する単独のｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐ、ならびにこれらのｍｉＲＮＡの組合せの効果も示す。ＦＭＴは線維性肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。筋線維芽細胞は、多くの細胞外マトリックス構成成分たとえば異なるタイプのコラーゲンを産生するため、線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。特にコラーゲン１、３および５は線維化瘢痕マトリックスの構成成分としてみなされる。ＴＧＦβ活性化後の線維芽細胞でのコラーゲンサブユニット（Ｃｏｌ１ａ１、３ａ１および５ａ１）の検出は線維性疾患におけるこの病態生理学的側面の良好な代理としてみなされる。コラーゲンサブユニットの減少は、抗線維化として考慮される。Ａ）Ｃｏｌ１ａ１およびＢ）Ｃｏｌ５ａ１タンパク質の発現、ならびにＣ）Ｃｏｌ３ａ１ｍＲＮＡの発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物２ｎＭ（単独のｍｉＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡの組合せ２ｎＭ＋２ｎＭ、およびｍｉＲＮＡ１．３ｎＭごとの３つの組合せのいずれかで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１で刺激した。７２時間後、コラーゲンタイプ１α１および５α１をウエスタンブロット技術で免疫染色し、デンシトメトリーで定量した。コラーゲンの発現はＧＡＰＤＨ発現で正規化した。Ｃｏｌ３ａ１は２４時間後にＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。Ｃｏｌ３ａ１ｍＲＮＡの発現はデルタ／デルタｃＴ法でＨＰＲＴｍＲＮＡで正規化した。コラーゲンの減少は線維化の減少を示している。Ａ（ｎ＝５）およびＢ（ｎ＝３）についてはｍｉＲＮＡ候補とコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化、またはＣ（ｎ＝４）についてはｍｉＲＮＡ候補とｍｉＲＮＡコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。Also shown is the effect of miRNA-29a-3p, miRNA181a-5p and miR212-5p alone, and the combination of these miRNAs, on the expression of different collagens in lung fibroblasts (healthy and IPF). FMT is regarded as another important initiating factor in the development of fibrotic lung remodeling. With recurrent epithelial cell injury, there is chronic secretion of the growth factor TGFβ, which induces the activation of normal resident lung fibroblasts into myofibroblasts. Myofibroblasts are regarded as the main drivers of the scarring process in fibrotic diseases because they produce many extracellular matrix components, such as different types of collagen. In particular, collagens 1, 3 and 5 are considered as constituents of the fibrotic scar matrix. Detection of collagen subunits (Col1a1, 3a1 and 5a1) in fibroblasts after TGFβ activation is regarded as a good surrogate of this pathophysiological aspect in fibrotic diseases. Reduction of collagen subunits is considered anti-fibrotic. A) Col1a1 and B) Col5a1 protein expression, and C) Col3a1 mRNA expression were expressed using miRNA control constructs (Ctrl), 2 nM mimics of the indicated miRNA candidates (single miRNAs) or miRNA combinations 2 nM + 2 nM, and miRNA 1.3 nM Cells were transfected and evaluated with any of the three combinations of each. Cells were stimulated with 5ng/ml TGFβ1. After 72 hours, collagen types 1α1 and 5α1 were immunostained by Western blot technique and quantified by densitometry. Collagen expression was normalized to GAPDH expression. Col3a1 was quantified by RT-qPCR after 24 hours. Col3a1 mRNA expression was normalized to HPRT mRNA using the delta/delta cT method. A decrease in collagen indicates a decrease in fibrosis. For A (n=5) and B (n=3), the fold change between miRNA candidate and control+TGFβ1 is shown, or for C (n=4), the fold change between miRNA candidate and miRNA control+TGFβ1 is shown. Mean±SD, *p<0.05, **p<0.01, one-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test. 図２３で示した結果の一部を示す。A part of the results shown in FIG. 23 are shown. ２２ｎｔカセットのＡＡＶ－ｍｉＲ－２１２－５ｐの発現後のｍｉＲ－２１２－５ｐの２２ｎｔの肺発現を示す。スタッファー陰性コントロールＡＡＶまたは３つの増加投与量（９ｘ１０⁹ｖｇ、１０ｘ１０¹⁰ｖｇおよび１ｘ１０¹¹ｖｇ）のｍｉＲ－２１２－５ｐ－ＡＡＶ（２２ｎｔ）をマウスに気管内点滴した。マウスはＡＡＶ投与後７、１４、２８日後に安楽死させた。肺は液体窒素で瞬間凍結し、総ＲＮＡ単離のため凍結肺粉末処理した。異なるＡＡＶ投与量間のｍｉＲ－２１２－５ｐ（２２ｎｔ）の倍率変化を、各時間点それぞれのスタッファーコントロールと比較して示す。表示されているのは平均±ＳＤである。スタッファー群ｎ＝６～７、ｍｉＲ－２１２－５ｐＡＡＶ群ｎ＝７、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、異なる時点でダネットの多重比較検定。実験は、配列番号９９によるｍｉＲ－２１２－５ｐ、２２ｎｔを発現するための配列番号６１によるコンストラクトに基づいた。対応プラスミドについては、配列番号９１を参照。22-nt pulmonary expression of miR-212-5p after expression of the 22-nt cassette AAV-miR-212-5p. Mice were instilled intratracheally with stuffer negative control AAV or three increasing doses (9x10 ⁹ vg, 10x10 ¹⁰ vg and 1x10 ¹¹ vg) of miR-212-5p-AAV (22 nt). Mice were euthanized 7, 14, and 28 days after AAV administration. Lungs were flash frozen in liquid nitrogen and processed into frozen lung powder for total RNA isolation. The fold change of miR-212-5p (22nt) between different AAV doses is shown compared to the respective stuffer control for each time point. Shown are mean±SD. Stuffer group n=6-7, miR-212-5p AAV group n=7, p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, one-way ANOVA, different time points Dunnett's multiple comparison test. The experiment was based on the construct according to SEQ ID NO: 61 to express miR-212-5p, 22nt according to SEQ ID NO: 99. See SEQ ID NO: 91 for the corresponding plasmid.

本発明はカプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその後者の断片とを含む。本発明はまたカプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその後者の断片とを含む。特に好ましい実施態様では、本発明はカプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、ｍｉＲＮＡは配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む。従って、本発明は互いに組合せて使用される場合に効果が確認された選択されたｍｉＲＮＡの使用を意味する。ｍｉＲＮＡには、ｍｉｒ－２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡ（配列番号９２）と、ｍｉｒ－２１２－５ｐ（配列番号１５）のｍｉＲＮＡまたはｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ（配列番号１７）のｍｉＲＮＡのいずれかとの組合せを含む。また、ここにｍｉｒ－２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡもまた分子の３’末端の末端ヌクレオチドを欠くｍｉｒ－２１２－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡの断片と組み合わせることができることが分かった。これらｍｉｒ－２１２－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡの断片は、それぞれ配列番号９９および配列番号１００としてここに示す。配列番号９９および配列番号１００のＲＮＡ分子は、本発明のコンテクストにおいて自己完結型ｍｉＲＮＡ（ｓｅｌｆ－ｃｏｎｔａｉｎｅｄｍｉＲＮＡｓ）とみなされる。配列番号１５および１７の真正のｍＲＮＡとそれぞれ比較して配列番号９９および配列番号１００の３’末端での欠失は、ｍｉＲＮＡのシード領域および１３～１６のヌクレオチド領域から離れているため、配列番号９９および配列番号１００によるｍｉＲＮＡの特異性は許容される（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７）。Ｃｈｅｎ，Ｔ．らによって、マウスモデルの肺高血圧症におけるｍｉＲ－２１２－５ｐの増加は、ＲＶＳＰおよび肺血管壁リモデリングを低下しうることが示された（Ｃｈｅｎ，Ｔ．ら、２０１８，Ｃｈｅｎ，Ｔ．ら、２０１９）。珪肺症のコンテクストについては、Ｊｉａｎｇ，Ｒ．ら、２０１９およびＹａｎｇ，Ｘ．ら、２０１８参照。 The present invention relates to a viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs, the two or more miRNAs comprising a miRNA of SEQ ID NO: 92 and a miRNA of SEQ ID NO: 92; miRNA No. 15 or a fragment of the latter having the sequence SEQ ID No. 99. The present invention also relates to a viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, wherein the packaged nucleic acid encodes two or more miRNAs, the two or more miRNAs comprising a miRNA of SEQ ID NO: 92; miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment of the latter having the sequence of SEQ ID NO: 100. In a particularly preferred embodiment, the invention relates to a viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs, the miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 92; It includes the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99, and the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100. Therefore, the present invention refers to the use of selected miRNAs that have been shown to be effective when used in combination with each other. The miRNA includes a combination of mir-29a-3p miRNA (SEQ ID NO: 92) and either mir-212-5p (SEQ ID NO: 15) miRNA or mir-181a-5p (SEQ ID NO: 17) miRNA . It was also found here that the mir-29a-3p miRNA can also be combined with fragments of the mir-212-5p and mir-181a-5p miRNAs, which lack the terminal nucleotide at the 3' end of the molecule. These mir-212-5p and mir-181a-5p miRNA fragments are shown here as SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 100, respectively. The RNA molecules of SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 100 are considered self-contained miRNAs in the context of the present invention. The deletion at the 3' end of SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 100 compared to the authentic mRNAs of SEQ ID NO: 15 and 17, respectively, is away from the seed region and nucleotide region 13-16 of the miRNA, and therefore SEQ ID NO: The specificity of the miRNA according to SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 100 is acceptable (Grimson et al., 2007). Chen, T. showed that increased miR-212-5p in pulmonary hypertension in a mouse model could reduce RVSP and pulmonary vascular wall remodeling (Chen, T. et al., 2018, Chen, T. et al. 2019). For the context of silicosis, see Jiang, R. et al., 2019 and Yang, X. See et al., 2018.

従って、本発明は、カプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、該核酸は、（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉ）ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡであって、配列番号１５のｍｉＲＮＡもしくは配列番号９９の配列を有するその断片、または配列番号１７のｍｉＲＮＡもしくは配列番号１００の配列を有するその断片を含むｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方、を増加させる。１つの実施態様では、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてダウンレギュレートされ、パッケージ化された核酸によって増加するｍｉＲＮＡ（複数可）は、配列番号１９のｍｉＲＮＡをさらに含む。別の実施態様において、パッケージ化された核酸により増加される１つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡを含む。別の実施態様において、パッケージ化された核酸により増加した１つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡとを含む。 Accordingly, the present invention relates to a viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, wherein the nucleic acid comprises (i) the miRNA of SEQ ID NO: 92, or (ii) a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or AAV- miRNA that is down-regulated in a TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model, the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 99, or the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 100. or (iii) both (i) and (ii). In one embodiment, the miRNA(s) downregulated in the bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or the AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model and increased by the packaged nucleic acid comprises the miRNA of SEQ ID NO: 19. Including further. In another embodiment, the one or more miRNAs enriched by the packaged nucleic acids include the miRNA of SEQ ID NO: 92, the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99, and the miRNA of SEQ ID NO: 19. Contains miRNA. In another embodiment, the one or more miRNAs increased by the packaged nucleic acid are the miRNA of SEQ ID NO: 92, the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, and the miRNA of SEQ ID NO: 19. including.

このコンテクストでの増加は、標的細胞、好ましくは肺細胞のトランスダクションの結果として、トランスダクションされた細胞における各ｍｉＲＮＡのレベルが増加することを意味する。 Increase in this context means that as a result of transduction of target cells, preferably lung cells, the level of the respective miRNA in the transduced cells increases.

本発明はさらに、カプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、核酸は、（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉ）ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡであって、配列番号１５のｍｉＲＮＡもしくは配列番号９９の配列を有するその断片、または配列番号１７のｍｉＲＮＡもしくは配列番号１００の配列を有するその断片を含むｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）両方、を増加させ、かつ核酸は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１６のｍｉＲＮＡ、または部分的な配列が保存されているｍｉＲＮＡの場合にはそれぞれの配列の最も近いヒトホモログからなる群から選択されるｍｉＲＮＡをさらに阻害する。 The invention further relates to a viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, wherein the nucleic acid comprises (i) the miRNA of SEQ ID NO: 92, or (ii) a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or an AAV-TGFβ1-induced A miRNA that is downregulated in a pulmonary fibrosis model, comprising the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 99, or the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 100. miRNA, or (iii) both (i) and (ii), and the nucleic acid is SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, and 16, or in the case of miRNAs whose partial sequences are conserved, the closest human homologs of their respective sequences.

このコンテクストでの阻害は、標的細胞のトランスダクションの結果として、相補的結合によりトランスダクションされた細胞で各ｍｉＲＮＡの機能が低下または消失することを意味する。 Inhibition in this context means that as a result of transduction of target cells, the function of each miRNA is reduced or abolished in the transduced cells by complementary binding.

１つの実施態様では、本発明は、ウイルスベクターに関するものであって、カプシドと、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてダウンレギュレートされる１つ以上のｍｉＲＮＡをコードするパッケージ化された核酸を含み：
ａ）１つの好ましい実施態様では、パッケージ化された核酸によってコードされる１つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９２のｍｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、パッケージ化された核酸によってコードされる１つ以上のｍｉＲＮＡが、以下を含む。
（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片、または
（ｉｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片、または
（ｉｉｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片、または
（ｉｖ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡ、または
（ｖ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡ。 In one embodiment, the invention relates to a viral vector that comprises a capsid and one or more miRNAs that are downregulated in a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or an AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model. Contains a packaged nucleic acid encoding:
a) In one preferred embodiment, the one or more miRNA encoded by the packaged nucleic acid comprises the miRNA of SEQ ID NO:92. In another embodiment, the one or more miRNAs encoded by the packaged nucleic acid include:
(i) miRNA of SEQ ID NO: 92 and miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99; or (ii) miRNA of SEQ ID NO: 92 and miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100. (iii) miRNA of SEQ ID NO: 92 and miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99 and miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, or (iv ) miRNA of SEQ ID NO: 92, miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99, and miRNA of SEQ ID NO: 19; or (v) miRNA of SEQ ID NO: 92 and miRNA of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100 and the miRNA of SEQ ID NO: 19.

ｂ）１つの実施態様では、パッケージ化された核酸によってコードされる１つ以上のｍｉＲＮＡが、以下を含む。
（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡ、または
（ｉｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡ。 b) In one embodiment, the one or more miRNAs encoded by the packaged nucleic acid include:
(i) miRNA of SEQ ID NO: 92, miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99, and miRNA of SEQ ID NO: 18, or (ii) miRNA of SEQ ID NO: 92, miRNA of SEQ ID NO: 17, or A fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100 and miRNA of SEQ ID NO: 18.

核酸は通常はコーディングおよび非コーディング領域を含み、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるコード化ｍｉＲＮＡは、ウイルスベクターによってトランスダクションされた標的細胞における転写およびそれに続く成熟過程の結果であると理解される。 Nucleic acids usually include coding and non-coding regions, and the encoding miRNAs that are up-regulated or down-regulated in the bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or the AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model are transduced by the viral vector. It is understood to be the result of transcription and subsequent maturation processes in target cells.

核酸は通常はコーディングおよび非コーディング領域を含み、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてアップレギュレートされた１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するコード化ＲＮＡは、ウイルスベクターによってトランスダクションされた標的細胞における転写、および潜在的に、しかし必ずとは限らない、それに続く成熟過程の結果であると理解される。 The nucleic acid typically includes coding and non-coding regions, and the encoding RNA that inhibits the function of one or more miRNAs upregulated in the bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or the AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model is It is understood to be the result of transcription in the target cell transduced by the viral vector and potentially, but not necessarily, a subsequent maturation process.

本発明によるウイルスベクターは、肺細胞をトランスダクションする可能性を有するように選択される。肺細胞をトランスダクションするウイルスベクターの非限定的例はレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、およびパラミクソウイルスベクターを含むが、それに限定されるものではない。これらのうち、ＡＡＶベクターは特に好ましく、とりわけＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５またはＡＡＶ－６．２血清型を有するものが好ましい。配列番号２９、３０または３１を含む組み換えカプシドタンパク質を有するＡＡＶベクターが特に好ましい（ＷＯ２０１５／０１８８６０参照）。１つの実施態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ－６．２血清型であり、配列番号８２の配列のカプシドタンパク質を含む。 Viral vectors according to the invention are selected to have the potential to transduce lung cells. Non-limiting examples of viral vectors that transduce lung cells include, but are not limited to, lentiviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors (AAV vectors), and paramyxoviral vectors. Among these, AAV vectors are particularly preferred, especially those having the AAV-2, AAV-5 or AAV-6.2 serotype. Particularly preferred are AAV vectors with recombinant capsid proteins comprising SEQ ID NO: 29, 30 or 31 (see WO2015/018860). In one embodiment, the AAV vector is serotype AAV-6.2 and includes a capsid protein having the sequence of SEQ ID NO:82.

ｍｉＲＮＡをコードしそれによってその機能を増加させる配列と、１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする配列は、同じトランスジーンの中にあってもなくてもよい。 A sequence encoding an miRNA and thereby increasing its function and a sequence encoding an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs may or may not be in the same transgene.

１つの実施態様では、本発明はウイルスベクターに関するものであって、カプシドと、以下を含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸を含む：
－２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするトランスジーンであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含むか、あるいは配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含むトランスジーン、
－および、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードするトランスジーン。 In one embodiment, the invention relates to a viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid comprising one or more transgene expression cassettes including:
- a transgene encoding two or more miRNAs, the two or more miRNAs comprising the miRNA of SEQ ID NO: 92 and the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99; A transgene comprising miRNA No. 92 and miRNA SEQ ID No. 17 or a fragment thereof having the sequence SEQ ID No. 100,
- and 1 selected from the group consisting of miRNA of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35 and 36 A transgene encoding an RNA that inhibits the functions of one or more miRNAs.

従って、ｍｉＲＮＡをコードし、そのレベルを増加させるトランスジーンと、１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードするトランスジーンは異なる発現カセットに含まれる。 Thus, transgenes encoding miRNAs and increasing their levels and transgenes encoding RNAs that inhibit the function of one or more miRNAs are contained in different expression cassettes.

１つの実施態様では、本発明はウイルスベクターに関するものであって、カプシドと、トランスジーンを含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸を含み、該トランスジーンが
－２つ以上のｍｉＲＮＡであって、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含むか、あるいは配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む、２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、さらに
－配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする。 In one embodiment, the invention relates to a viral vector comprising a packaged nucleic acid comprising a capsid and one or more transgene expression cassettes comprising a transgene, wherein the transgene contains -2 or more miRNA comprising the miRNA of SEQ ID NO: 92 and the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99, or the miRNA of SEQ ID NO: 92 and the miRNA of SEQ ID NO: 17 or the miRNA of SEQ ID NO: 100. encoding two or more miRNAs, including fragments thereof having the sequence - SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16 , 34, 35 and 36.

従って、１つのトランスジーンは、その機能を増加させるｍｉＲＮＡと、１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡの両方をコードする。 Thus, one transgene encodes both a miRNA that increases its function and an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs.

本発明の別の実施態様において、ウイルスベクターは、ｍｉＲＮＡが配列番号１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、９２、９９および１００のｍｉＲＮＡ、または部分的な配列が保存されているｍｉＲＮＡの場合にはそれぞれの配列の最も近いヒトホモログからなる群から選択される。この群では、保存されたｍｉＲＮＡすなわち１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、２６、９２、９９、１００またはそれらの最も近いヒトホモログが最も好ましい。それぞれの配列の最も近いヒトホモログを、図５Ｂに示す。 In another embodiment of the invention, the viral vector has miRNAs of SEQ ID NOs: 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 92, 99 and 100. , or in the case of miRNAs whose partial sequences are conserved, the closest human homologues of the respective sequences. In this group, the conserved miRNAs 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 92, 99, 100 or their closest human homologs are most preferred. The closest human homolog of each sequence is shown in Figure 5B.

本発明のさらなる実施態様において、核酸が偶数個のトランスジーン発現カセット、および、任意にプロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含む（またはからなる）トランスジーン発現カセットを有しており、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、ウイルスベクターが提供される。 In a further embodiment of the invention, the nucleic acid has an even number of transgene expression cassettes and, optionally, a transgene expression cassette comprising (or consisting of) a promoter, a transgene and a polyadenylation signal, the promoter or the polyadenylation signal. Viral vectors are provided in which the activation signals are located opposite each other.

ウイルスベクターは、１つの実施態様において組換えＡＡＶベクターであり、本発明の他の実施態様においてＡＡＶ－２血清型、ＡＡＶ－５血清型またはＡＡＶ－６．２血清型のいずれかを有する。 The viral vector is in one embodiment a recombinant AAV vector, and in other embodiments of the invention has either the AAV-2 serotype, the AAV-5 serotype or the AAV-6.2 serotype.

本発明の異なる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号２９または３０の配列を含む第１タンパク質（ＷＯ２０１５／０１８８６０参照）を含む。
ｉ）本発明のさらなる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２との間のアラインメントに１つあるいはそれ以上のギャップが許容される。
ｉｉ）本発明の異なる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号８２の第２タンパク質に対して８０％同一、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてカウントされる。
ｉｉｉ）本発明の異なる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号８２の第２タンパク質に対して８０％同一、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントにギャップがないことが許容される。 In a different embodiment of the invention there is provided a viral vector in which the capsid comprises a first protein comprising the sequence SEQ ID NO: 29 or 30 (see WO2015/018860).
i) In a further embodiment of the invention there is provided a viral vector in which the capsid is 80% identical, more preferably 90%, most preferably 95% identical to a second protein having the sequence SEQ ID NO: 82. a first protein, one or more gaps being allowed in the alignment between the first protein and the second;
ii) In a different embodiment of the invention there is provided a viral vector in which the capsid is 80% identical, more preferably 90%, most preferably 95% identical to the second protein of SEQ ID NO: 82. A gap in the alignment between the first protein and the second protein is counted as a mismatch.
iii) In a different embodiment of the invention there is provided a viral vector in which the capsid is 80% identical, more preferably 90%, most preferably 95% identical to the second protein of SEQ ID NO:82. It is permissible to include a certain first protein and have no gaps in the alignment between the first protein and the second protein.

実施態様（ｉ）から（ｉｉｉ）の全てに関し、第１タンパク質および比較タンパク質間の同一性の決定については、２つのタンパク質間のアラインメントにおいて一致する対応部分を有しない如何なるアミノ酸もミスマッチとしてみなす（対応部分を有しないオーバーハングを含む）。同一性の決定については、最も高い同一性スコアを与えるアラインメントを使用する。 For all embodiments (i) to (iii), for the determination of identity between the first protein and the comparison protein, any amino acid that does not have a matching counterpart in the alignment between the two proteins is considered a mismatch (corresponding (including overhangs with no parts). For identity determination, use the alignment that gives the highest identity score.

パッケージ化された核酸は１本または２本鎖でもよい。特にＡＡＶベクターの代替は、ベクターゲノムが２本鎖核酸としてパッケージ化されている自己相補的な設計を使用することである。発現開始はより迅速であるが、ベクターのパッケージング能力は約２．３ｋｂに低下する。Ｎａｓｏら、２０１７、文献参照。 Packaged nucleic acids may be single or double stranded. An alternative to AAV vectors in particular is to use a self-complementary design in which the vector genome is packaged as a double-stranded nucleic acid. Although expression initiation is faster, the packaging capacity of the vector is reduced to approximately 2.3 kb. See Naso et al., 2017, literature.

本発明のもう１つの態様は、肺疾患、好ましくはＩＬＤの治療における使用のための、１つの記載されたウイルスベクターである。本発明により治療され得る疾患は、好ましくはＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ；ｃｈｒｏｎｉｃｆｉｂｒｏｓｉｎｇｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、およびサルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される。 Another aspect of the invention is one described viral vector for use in the treatment of pulmonary diseases, preferably ILD. Diseases that can be treated according to the present invention are preferably PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, chronic fibrosing hypersensitivity pneumonitis (HP), idiopathic idiopathic interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic sclerosis ILD, and sarcoidosis and fibrosarcoma.

組換えＡＡＶ治療薬の送達戦略は、例えば、Ｎａｓｏら、２０１７でも参照されている。 Recombinant AAV therapeutic delivery strategies are also referenced, for example, in Naso et al., 2017.

ＡＡＶベクターゲノムを含む２本鎖プラスミドベクターは発明のさらなる実施態様である。 Double-stranded plasmid vectors containing AAV vector genomes are a further embodiment of the invention.

本発明のさらなる実施態様は、医薬品として使用するためのこのｍｉＲＮＡ阻害剤に関する。 A further embodiment of the invention relates to this miRNA inhibitor for use as a medicament.

本発明は、また、肺疾患、好ましくはＩＬＤの予防および／または治療のためのｍｉＲＮＡ模倣物の使用を企図する。本発明のｍｉＲＮＡ模倣物で治療しうる肺疾患は、上記に提示され、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患を含む。本発明のｍｉＲＮＡ模倣物は、典型的にはおよび好ましくは、長さが２１、２２または２３の連続ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列からなる。ｍｉＲＮＡ模倣物の長さ（すなわち１本鎖模倣物の場合は「ヌクレオチドのオリゴマー」の長さ、または前記オリゴマーと前記オリゴマーに結合した他のオリゴヌクレオチドを含む２本鎖模倣物の場合「ヌクレオチドのオリゴマー」（すなわちセンス鎖）の長さ）は、一般的におよび好ましくは、それらが模倣する各ｍｉＲＮＡの長さに一致する。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐまたはｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのような２３ｎｔを有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物の場合には、ｍｉＲＮＡ模倣物の長さ（すなわち１本鎖模倣物の場合はオリゴマー、または２本鎖模倣物の場合はセンス鎖）は、２３ｎｔ（好ましい）または３’末端で１つのヌクレオチドが欠失している条件で２２ｎｔのどちらかである。真正のｍＲＮＡ（例えば、配列番号９９および１００参照）と比較して３’末端での欠失は、ｍｉＲＮＡのシード領域および１３～１６のヌクレオチド領域から離れているため、対応するｍｉＲＮＡ模倣物の特異性は許容される（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７）。 The present invention also contemplates the use of miRNA mimetics for the prevention and/or treatment of lung diseases, preferably ILD. Lung diseases that can be treated with miRNA mimetics of the invention are presented above and include fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD and IPF. The miRNA mimetics of the invention typically and preferably consist of a contiguous nucleotide sequence of 21, 22 or 23 contiguous nucleotides in length. The length of the miRNA mimetic (i.e., the length of an "oligomer of nucleotides" for a single-stranded mimetic, or the length of an "oligomer of nucleotides" for a double-stranded mimetic that includes said oligomer and another oligonucleotide attached to said oligomer). The length of the oligomers (ie, the sense strand) generally and preferably matches the length of each miRNA they mimic. In the case of miRNA mimics of miRNAs with 23 nt, such as miR-181a-5p or miRNA-212-5p, the length of the miRNA mimic (i.e., oligomers in the case of single-stranded mimics, or oligomers in the case of single-stranded mimics, or double-stranded mimics) The sense strand (in the case of a mononucleotide) is either 23 nt (preferred) or 22 nt, provided that one nucleotide is deleted at the 3' end. The deletion at the 3' end compared to the authentic mRNA (see, e.g., SEQ ID NOs: 99 and 100) is further away from the miRNA's seed region and the 13-16 nucleotide region, thus making it more specific for the corresponding miRNA mimic. (Grimson et al., 2007).

従って、本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、組合せが（ｉ）配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物とを含む。ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せは、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８および３９からなる群から選択される配列、好ましくは配列番号１８および１９からなる群から選択される配列を有するｍｉＲＮＡの１つあるいはそれ以上の模倣物をさらに含んでもよい。１つの実施態様では、ｍｉＲＮＡ模倣物がＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療の方法における使用のために提供され、ここで、ｍｉＲＮＡは配列番号９２の配列を有し、該方法は配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。別の実施態様では、ｍｉＲＮＡ模倣物は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療の方法における使用のために提供され、ここで、ｍｉＲＮＡは配列番号９２の配列を有し、該方法は配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。予防および／または治療は、好ましくは配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。 Accordingly, a further embodiment of the invention is a combination of miRNA mimetics for use in the prevention and/or treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD and IPF, wherein the combination comprises (i) the sequence (ii) an miRNA mimetic having a sequence of SEQ ID NO: 15 and/or an miRNA mimetic having a sequence of SEQ ID NO: 17. The combination of miRNA mimetics comprises sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 37, 38 and 39, preferably SEQ ID NO: 18 and 19. may further include one or more miRNA mimetics having a sequence selected from the group consisting of: In one embodiment, miRNA mimetics are provided for use in methods of prevention and/or treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD and IPF, wherein the miRNA has the sequence SEQ ID NO: 92. and the method further comprises administering an miRNA mimetic having the sequence of SEQ ID NO: 15. In another embodiment, miRNA mimetics are provided for use in methods of prevention and/or treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD and IPF, wherein the miRNA is SEQ ID NO: 92. The method further comprises administering an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17. The prevention and/or treatment preferably further comprises the administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 18 or an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

同様に、さらに実施態様では、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療法における使用のためのｍｉＲＮＡ模倣物が提供され、ここで、ｍｉＲＮＡは配列番号９２を有する。該予防および／または治療は、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。さらにより好ましくは、
－該予防および／または治療は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与を含む、または
－該予防および／または治療は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、または
－該予防および／または治療は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む。 Similarly, in a further embodiment, miRNA mimetics are provided for use in methods of prevention and/or treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD or IPF, wherein the miRNA has SEQ ID NO: 92. have The prevention and/or treatment further comprises the administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 15 or an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17. Even more preferably,
- the prevention and/or treatment comprises the administration of a miRNA mimetic with the sequence SEQ ID NO: 92, an miRNA mimetic with the sequence SEQ ID NO: 15, and an miRNA mimetic with the sequence SEQ ID NO: 18, or - the prevention and/or treatment comprises the administration of a miRNA mimetic with the sequence SEQ ID NO: 92, an miRNA mimetic with the sequence SEQ ID NO: 17, and an miRNA mimetic with the sequence SEQ ID NO: 18, or - the prevention and/or treatment comprises the administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 92, an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 15, and an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17. .

本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患治療のための、（ｉ）配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物、ならびにこれらのｍｉＲＮＡ模倣物、および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物である。 A further embodiment of the invention provides a miRNA mimetic of (i) an miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 92 and (ii) SEQ ID NO: 15 for the treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD or IPF. or a miRNA miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 17, and a pharmaceutical composition comprising these miRNA mimetics and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

本発明のさらなる実施態様は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物である。本発明の他の実施態様は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物である。好ましくは、組成物中のｍｉＲＮＡ模倣物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入される。ＬＮＰはＬＮＰ平均粒子径が３０および２００ｎｍの間であることが好ましい。医薬組成物はさらに２５～６５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含んでもよい。 A further embodiment of the invention provides a pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 92, an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 15, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. It is a thing. Another embodiment of the invention provides a pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 92, an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 17, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. It is a composition. Preferably, the miRNA mimetics in the composition are encapsulated within lipid nanoparticles (LNPs). Preferably, the LNP has an average particle size of between 30 and 200 nm. The pharmaceutical composition may further contain 25-65 mol% ionized lipid.

上記実施態様のいずれかにおいて、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、好ましくは配列番号９２の配列を有するオリゴマーである（１本鎖－１本鎖模倣物の場合）か、または該オリゴマーを含む（２本鎖模倣物の場合）。同様に、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、好ましくは、配列番号１５の配列を有するオリゴマーまたは配列番号９９の配列を有するオリゴマーであるか、または該オリゴマーを含む。配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、好ましくは、配列番号１７の配列を有するオリゴマーまたは配列番号１００の配列を有するオリゴマーであるか、または該オリゴマーを含む。 In any of the above embodiments, the miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 92 is preferably an oligomer having the sequence SEQ ID NO: 92 (in the case of a single-stranded to single-stranded mimetic), or (for double-stranded mimetics). Similarly, the miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 15 is preferably or comprises an oligomer having the sequence SEQ ID NO: 15 or an oligomer having the sequence SEQ ID NO: 99. The miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17 is preferably or comprises an oligomer having the sequence SEQ ID NO: 17 or an oligomer having the sequence SEQ ID NO: 100.

本発明はまた、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療に使用されるｍｉＲＮＡｍ２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡ模倣物を提供し、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は配列番号９２の群からなる選択された配列からなるヌクレオチドのオリゴマーである（やや好ましい）または該オリゴマーを含み（好ましい）、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーはそれぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質にコンジュゲートされている、
ここで、前記予防および／または治療は、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。 The present invention also provides miRNA mimetics of miRNA m29a-3p for use in the treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD or IPF, wherein the miRNA mimetics are from the group of SEQ ID NO:92. is (somewhat preferred) or comprises (preferred) an oligomer of nucleotides consisting of a selected sequence consisting of:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence of the respective miRNA;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence of the respective miRNA;
- the oligomer is optionally conjugated to a lipid to facilitate drug delivery;
Here, the prevention and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 15 and/or an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17.

１つの実施態様では、予防および／または治療は、さらに配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与を含む。好ましくは、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５（好ましい）または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー（やや好ましい）であるか、または該オリゴマーを含み、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む、
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている。 In one embodiment, prevention and/or treatment further comprises administration of an miRNA mimetic having the sequence of SEQ ID NO: 15. Preferably, the miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 15 is or comprises an oligomer of nucleotides consisting of SEQ ID NO: 15 (preferred) or SEQ ID NO: 99 (slightly preferred), and the following conditions are met. Has:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence of the respective miRNA,
- Oligomers are optionally conjugated with lipids to facilitate drug delivery.

他の実施態様では、予防および／または治療は、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与を含む。好ましくは、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号１７（好ましい）または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー（やや好ましい）である（やや好ましい）か、または該オリゴマーを含み（好ましい）、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている。 In other embodiments, prevention and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence of SEQ ID NO: 17. Preferably, the miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17 is (somewhat preferred) or comprises an oligomer of nucleotides consisting of SEQ ID NO: 17 (preferred) or SEQ ID NO: 100 (somewhat preferred) preferred), with the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues that exhibit base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence of the respective miRNA;
- Oligomers are optionally conjugated with lipids to facilitate drug delivery.

ｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ベースナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されて送達されない場合には、薬物送達を促進するために、前記条件に記載したオリゴマーが脂質とコンジュゲートしていることが望ましい。 If the miRNA mimetics are not delivered encapsulated in lipid-based nanoparticles (LNPs), it is desirable that the oligomers described in the above conditions be conjugated with lipids to facilitate drug delivery.

またさらに他の実施態様では、予防および／または治療は、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。好ましくは、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号１９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーである（やや好ましい）か、または該オリゴマーを含み（好ましい）、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む、
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む。 In still yet other embodiments, the prevention and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence of SEQ ID NO: 19. Preferably, the miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19 is (somewhat preferred) or comprises (preferred) an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 and has the following conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence of the respective miRNA,
- The oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence of the respective miRNA.

さらに本発明の実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療に使用される、ｍｉＲＮＡ２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡ模倣物（配列番号９２）と、ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐ（配列番号１５）またはｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐ（配列番号１７）の模倣物との組合せであり、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は、それぞれ、配列番号９２、配列番号１５または９９、および配列番号１７または１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであり、それぞれ以下の条件を有する：
－オリゴマーはそれぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む、 Further embodiments of the invention provide miRNA mimetics of miRNA 29a-3p (SEQ ID NO: 92) and miRNA 212-5p (SEQ ID NO: 92) for use in the treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD or IPF. No. 15) or miRNA 181a-5p (SEQ ID No. 17), where the miRNA mimetic is a combination of the sequences SEQ ID No. 92, SEQ ID No. 15 or 99, and SEQ ID No. 17 or 100, respectively. oligomers of nucleotides, each having the following conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined by the sequence of the respective miRNA,

本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患治療に使用される、ｍｉＲＮＡ２９ａ－３ｐ（配列番号９２）とｍｉＲＮＡ２１２－５ｐ（配列番号１５または９９）またはｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐ（配列番号１７または１００）のとの組合せのｍｉＲＮＡ模倣物であり、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９２、配列番号１５または９９、および配列番号１７または１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または該オリゴマーを含む。 A further embodiment of the invention provides miRNA 29a-3p (SEQ ID NO: 92) and miRNA 212-5p (SEQ ID NO: 15 or 99) or miRNA mimetic in combination with miRNA 181a-5p (SEQ ID NO: 17 or 100), wherein the miRNA mimetic consists of the sequences SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 15 or 99, and SEQ ID NO: 17 or 100. is or comprises an oligomer of nucleotides.

これらの実施態様はｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ベースナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されて送達される場合が望ましい。ＬＮＰ粒子が送達に使用される場合、投与量は、治療対象の１ｋｇ当たりのｍｉＲＮＡ模倣物の質量が０．０１～５ｍｇ／ｋｇり、好ましくは０．０３～３ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～０．４ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．３ｍｇ／ｋｇであり得る。ＬＮＰ粒子の投与は好ましくは全身、より好ましくは静脈内である。 These embodiments are desirable where the miRNA mimetics are delivered encapsulated in lipid-based nanoparticles (LNPs). When LNP particles are used for delivery, the dosage ranges from 0.01 to 5 mg/kg, preferably from 0.03 to 3 mg/kg, more preferably from 0.01 to 5 mg/kg of miRNA mimetic mass per kg of treated subject. It may be 1-0.4 mg/kg, most preferably 0.3 mg/kg. Administration of LNP particles is preferably systemic, more preferably intravenous.

２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物の場合には、ｍｉＲＮＡ模倣物はｍｉＲＮＡ模倣物のセンス鎖に完全または部分的に相補的な１つあるいはそれ以上のオリゴヌクレオチドに結合したヌクレオチドオリゴマー（センス鎖）を含み、前記ｍｉＲＮＡ模倣物のセンス鎖は、これらの１つ以上のオリゴヌクレオチドと共に１本鎖領域を有するオーバーハング（複数可）を形成してもよい、または形成しなくてもよい。 In the case of a double-stranded miRNA mimetic, the miRNA mimetic comprises a nucleotide oligomer (sense strand) attached to one or more oligonucleotides that are fully or partially complementary to the sense strand of the miRNA mimetic; The sense strand of the miRNA mimetic may or may not form overhang(s) with a single-stranded region with these one or more oligonucleotides.

２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物が好ましい。 Double-stranded miRNA mimetics are preferred.

本発明のさらなる実施態様は、上述に定義する医薬組成物に関し、ここで該組成物は吸入組成物である。 A further embodiment of the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said composition is an inhalation composition.

本発明のさらなる実施態様は、上述に定義する医薬組成物に関し、ここで該組成物は全身投与、好ましくは静脈内投与のためのものである。 A further embodiment of the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said composition is for systemic administration, preferably intravenous administration.

本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療または予防方法であって、それを必要とする対象に上記に定義する医薬組成物を投与することを含む方法である。 A further embodiment of the invention is a method for the treatment or prevention of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD or IPF, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition as defined above. This is a method that includes

例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡ模倣物の使用は、エアロゾル経路によって肺線維症を患う対象の病的呼吸上皮における線維化を阻害し、従って完全な機能性を回復するように病的組織の完全性を回復するのに有効でありうる。 For example, the use of miRNA inhibitors or miRNA mimetics can inhibit fibrosis in the diseased respiratory epithelium of subjects suffering from pulmonary fibrosis by the aerosol route, thus improving the integrity of the diseased tissue to restore full functionality. can be effective in recovering

さらに本発明の実施態様を、以下の１～５５に記載する。 Further embodiments of the present invention are described in 1 to 55 below.

１．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。 1. A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, wherein the one or more miRNAs are the miRNA of SEQ ID NO: 15 or the sequence of SEQ ID NO: 99. A viral vector containing a fragment thereof having

２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有すその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、
ウイルスベクター。 2. A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs;
(i) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99 and the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, or ( ii) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99 and the miRNA of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101;
Viral vector.

３．前記パッケージ化された核酸が３つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記ｍｉＲＮＡが、（ｉ）配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、（ｉｉ）配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、実施態様１または２に記載のウイルスベクター。 3. The packaged nucleic acid encodes three or more miRNAs, the miRNAs comprising: (i) the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99; and (ii) the miRNA of SEQ ID NO: 17 or the sequence thereof. Viral vector according to embodiment 1 or 2, comprising a fragment thereof having the sequence number 100 and (iii) a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101.

４．前記パッケージ化された核酸が、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードしている、実施態様３に記載のウイルスベクター。 4. The virus according to embodiment 3, wherein the packaged nucleic acid encodes miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 15, miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 17, and miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 19. vector.

５．カプシドと、以下をコードするトランスジーンを含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸とを含む、実施態様１～４のいずれかに記載のウイルスベクター。
－配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、および
－配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡ。 5. A viral vector according to any of embodiments 1 to 4, comprising a capsid and a packaged nucleic acid comprising one or more transgene expression cassettes comprising a transgene encoding:
- selected from the group consisting of the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 99; a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; and a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100. - at least one miRNA of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35 and 36 RNA that inhibits the function of one or more miRNAs selected from the group.

６．カプシドと、トランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、
－第１発現カセットが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、をコードする第１トランスジーンを含む、および
－第２発現カセットが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする第２トランスジーンを含む、
実施態様１～５のいずれかに記載のウイルスベクター。 6. A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid comprising two or more transgene expression cassettes comprising a transgene, the vector comprising:
- the first expression cassette comprises miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99, a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, and a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; at least one miRNA selected from the group consisting of fragments; and - the second expression cassette comprises a first transgene encoding at least one miRNA selected from the group consisting of: a second transgene encoding an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs selected from the group consisting of miRNAs 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35, and 36;
The viral vector according to any of embodiments 1 to 5.

７．前記ＲＮＡ阻害がＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない、実施態様５～６の１つに記載のウイルスベクター。 7. Viral vector according to one of embodiments 5-6, wherein said RNA inhibition is not subject to RNAi processing or RNAi maturation.

８．核酸が偶数個のトランスジーン発現カセットを有する、実施態様５～７の１つに記載のウイルスベクター。 8. Viral vector according to one of embodiments 5 to 7, wherein the nucleic acid has an even number of transgene expression cassettes.

９．トランスジーン発現カセットが、プロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含み、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、実施態様５～８のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 9. Viral vector according to any one of embodiments 5 to 8, wherein the transgene expression cassette comprises a promoter, a transgene and a polyadenylation signal, the promoters or polyadenylation signals being located opposite each other.

１０．ベクターが組換えＡＡＶベクターである、実施態様１～９のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 10. A viral vector according to any one of embodiments 1 to 9, wherein the vector is a recombinant AAV vector.

１１．ベクターがＡＡＶ－２血清型を有する組換えＡＡＶベクターである、実施態様１～１０のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 11. Viral vector according to any one of embodiments 1 to 10, wherein the vector is a recombinant AAV vector having the AAV-2 serotype.

１２．カプシドが配列番号２９または３０の配列を有する第１タンパク質を含む、実施態様１～１１のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 12. Viral vector according to any one of embodiments 1 to 11, wherein the capsid comprises a first protein having the sequence SEQ ID NO: 29 or 30.

１３．カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一である第１タンパク質を含むが、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントに１つ以上のギャップが許容される、実施態様１～１２のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 13. Embodiment 1, wherein the capsid comprises a first protein that is 80% identical to a second protein having the sequence of SEQ ID NO: 82, but one or more gaps in the alignment between the first and second proteins are tolerated. -12. The viral vector according to any one of 12 to 12.

１４．カプシドが配列番号８２の第２タンパク質と９５％同一である第１タンパク質を含むが、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてみなされる、実施態様１～１３のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 14. Any one of embodiments 1 to 13, wherein the capsid comprises a first protein that is 95% identical to a second protein of SEQ ID NO: 82, but a gap in the alignment between the first protein and the second protein is considered a mismatch. Viral vectors described in.

１５．ベクターがＡＡＶ５またはＡＡＶ６．２血清型を有する組換えＡＡＶベクターであり、組換えＡＡＶ６．２ベクターのカプシドが、好ましくは配列番号８２の配列を有するカプシドタンパク質を含む、実施態様１～１４のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 15. Any of embodiments 1 to 14, wherein the vector is a recombinant AAV vector having the AAV5 or AAV6.2 serotype, and the capsid of the recombinant AAV6.2 vector preferably comprises a capsid protein having the sequence SEQ ID NO: 82. The viral vector according to item 1.

１６．パッケージ化された核酸が２本鎖である、実施態様１～１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 16. Viral vector according to any one of embodiments 1 to 15, wherein the packaged nucleic acid is double-stranded.

１７．パッケージ化された核酸が１本鎖である、実施態様１～１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 17. Viral vector according to any one of embodiments 1 to 15, wherein the packaged nucleic acid is single-stranded.

１８．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の予防または治療に使用される、実施態様１～１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 18. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic Prevention of diseases selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic sclerosis ILD, sarcoidosis and fibrosarcoma. or a viral vector according to any one of embodiments 1 to 17 for use in therapy.

１９．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療法であって、前記方法が、それを必要とする患者に実施態様１～１７のいずれか１つに記載のウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む、治療法。 19. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic Treatment of diseases selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic sclerosis ILD, sarcoidosis and fibrosarcoma. 18. A method of treatment, said method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a viral vector according to any one of embodiments 1-17.

２０．医薬品として使用される、実施態様１～１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 20. Viral vector according to any one of embodiments 1 to 17, for use as a medicine.

２１．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含む、ＡＡＶベクター。 21. An AAV vector comprising a vector genome encoding two or more miRNAs, wherein the two or more miRNAs comprise the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99.

２２．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するｓｐの断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、ＡＡＶベクター。 22. An AAV vector comprising a vector genome encoding two or more miRNAs, wherein the two or more miRNAs are the miRNA of SEQ ID NO: 15 or a fragment of sp having the sequence of SEQ ID NO: 99, and the miRNA of SEQ ID NO: 17. or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100.

２３．前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号１５の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とをコードしている、実施態様２１または２２に記載のＡＡＶベクター。 23. The vector genome comprises (i) miRNA containing the sequence of SEQ ID NO: 15 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 99, and (ii) miRNA containing the sequence of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100. , (iii) an miRNA comprising the sequence SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 101.

２４．前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードしている、実施態様２３に記載のＡＡＶベクター。 24. The vector genome encodes (i) miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 15, (ii) miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 17, and (iii) miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 19. AAV vector according to aspect 23.

２５．前記ベクターゲノムが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをさらにコードしている、実施態様２１～２４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。 25. The vector genome is selected from the group consisting of miRNAs of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35 and 36. The AAV vector according to any of embodiments 21 to 24, further encoding an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs.

２６．実施態様２１～２５のいずれかのＡＡＶベクターを含む、２本鎖プラスミドベクター。 26. A double-stranded plasmid vector comprising the AAV vector of any of embodiments 21-25.

２７．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。 27. A combination of miRNA mimetics used in a method for preventing and/or treating fibroproliferative diseases, the combination comprising: (i) a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 15; and (ii) SEQ ID NO: 17. A combination of miRNA mimetics, comprising a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19 and/or an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

２８．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、前記ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号１５または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、あるいは配列番号１５または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物。 28. A miRNA mimic of miRNA-212-5p used in a method for preventing and/or treating fibroproliferative diseases, wherein the miRNA mimic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99. or an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99, and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 15;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 15;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
has
A miRNA mimetic, wherein said prevention and/or treatment further comprises the administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17 and/or an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

２９．前記予防および／または治療が配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 29. 29. A miRNA mimetic for use in the method according to embodiment 28, wherein said prophylaxis and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17.

３０．配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、
実施態様２９に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 30. The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 17 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Conditions of:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
has,
miRNA mimetic used in the method according to embodiment 29.

３１．前記予防および／または治療が、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 31. 29. A miRNA mimetic for use in the method according to embodiment 28, wherein said prophylaxis and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

３２．配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは任意に配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、
実施態様３１に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 32. The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Conditions of:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 19;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
has,
miRNA mimetics used in the method of embodiment 31.

３３．前記予防および／または治療が、配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様２８～３２のいずれか１つに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 33. miRNA mimetic for use in the method according to any one of embodiments 28 to 32, wherein said prophylaxis and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 18.

３４．配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、
実施態様３３に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 34. The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 18 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 18, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 18, and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 18;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 18;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
has,
miRNA mimetic used in the method of embodiment 33.

３５．線維増殖性疾患がＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤである、実施態様２８から３４のいずれかに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 35. 35. A miRNA mimetic for use in the method according to any of embodiments 28 to 34, wherein the fibroproliferative disease is IPF or PF-ILD.

３６．ＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤまたはＩＬＤのような線維増殖性疾患の治療薬の製造のための、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物の使用。 36. miRNA mimetic of (i) miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 15 and (ii) having the sequence of SEQ ID NO: 17 for the production of a therapeutic agent for fibroproliferative diseases such as IPF or PF-ILD or ILD Use of a miRNA mimetic of an miRNA and/or a miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19.

３７．配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 37. A pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 15, an miRNA mimetic of an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 17, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

３８．配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 38. A pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 15, an miRNA mimetic of an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 19, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

３９．配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 39. A miRNA mimetic of miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 15, an miRNA mimetic of miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 17, an miRNA mimetic of miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 19, and a pharmaceutically acceptable carrier or A pharmaceutical composition comprising a diluent.

４０．前記組成物のｍｉＲＮＡ模倣物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されている、実施態様３７、３８または３９に記載の医薬組成物。 40. 40. A pharmaceutical composition according to embodiment 37, 38 or 39, wherein the miRNA mimetics of said composition are encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs).

４１．前記組成物がイオン化脂質を２５～６５ｍｏｌ％含む、実施態様４０に記載の医薬組成物。 41. 41. A pharmaceutical composition according to embodiment 40, wherein said composition comprises 25-65 mol% ionized lipid.

４２．前記ＬＮＰの平均粒子径が３０～２００ｎｍの間である、実施態様３７から４１のいずれか１つに記載の医薬組成物。 42. 42. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 37 to 41, wherein the average particle size of the LNPs is between 30 and 200 nm.

４３．（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマー、は配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。 43. (a) A miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99. Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 15;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined in the sequence of SEQ ID NO: 15;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(b) a miRNA mimic of miRNA181a-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(c) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent;
A pharmaceutical composition comprising.

４４．（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。 44. (a) A miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99. Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 15;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined in the sequence of SEQ ID NO: 15;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(b) a miRNA mimic of miRNA181b-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or 101;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or 101;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(c) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent;
A pharmaceutical composition comprising.

４５．（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；および
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｄ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。 45. (a) A miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 99. Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 15;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined in the sequence of SEQ ID NO: 15; and - the oligomer is optionally combined with a lipid to facilitate drug delivery. is conjugated,
an miRNA mimetic having
(b) a miRNA mimic of miRNA181a-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(c) an miRNA mimic of miRNA181b-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 19;
- the oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined in the sequence of SEQ ID NO: 19;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(d) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent;
A pharmaceutical composition comprising.

４６．ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様３７から４４のいずれかに記載の医薬組成物。 46. 45. The pharmaceutical composition according to any of embodiments 37-44, wherein the miRNA mimetic of miRNA 212-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

４７．ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様３７、３９、４０、４１、４５、または４７に記載の医薬組成物。 47. The pharmaceutical composition of embodiment 37, 39, 40, 41, 45, or 47, wherein the miRNA mimetic of miRNA 181a-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

４８．ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様３７、３９、４０、４１、４５、４６、または４７に記載の医薬組成物。 48. The pharmaceutical composition of embodiment 37, 39, 40, 41, 45, 46, or 47, wherein the miRNA mimetic of miRNA 181b-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

４９．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療法であって、前記方法は、それを必要とする患者に、実施態様３７から４９のいずれかに記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、治療法。 49. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic Treatment of diseases selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic sclerosis ILD, sarcoidosis and fibrosarcoma. 50. A method of treatment, said method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition according to any of embodiments 37-49.

５０．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療薬の製造のための、実施態様３７から４９のいずれかに記載の医薬組成物の使用。 50. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic Treatment of diseases selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic sclerosis ILD, sarcoidosis and fibrosarcoma. Use of a pharmaceutical composition according to any of embodiments 37 to 49 for the manufacture of a medicament.

５１．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。 51. A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, the one or more miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 17 or the miRNA of SEQ ID NO: 100. A viral vector comprising a fragment thereof having the sequence.

５２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡを含む、
実施態様５１に記載のウイルスベクター。 52. a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs;
(i) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100 and the miRNA of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101; or (ii) ) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, and the miRNA of SEQ ID NO: 18;
A viral vector according to embodiment 51.

５３．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するそのｍｉＲＮＡを含む、ウイルスベクター。 53. A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, the one or more miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 19 or the miRNA of SEQ ID NO: 101. A viral vector comprising its miRNA having a sequence.

５４．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、実施態様５３に記載のウイルスベクター。 54. a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs, the two or more miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 19 or its sequence having the sequence of SEQ ID NO: 101. 54. A viral vector according to embodiment 53, comprising the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100.

５５．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および／または（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。 55. A combination of miRNA mimetics for use in a method for preventing and/or treating fibroproliferative diseases, the combination comprising (i) a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 15, and/or (ii) the sequence A combination of miRNA mimetics comprising a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17 and/or (iii) a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

以下、本発明のさらに特に好ましい実施態様を、実施態様Ａ１～Ａ５７として記載する。 More particularly preferred embodiments of the present invention will be described below as embodiments A1 to A57.

Ａ１．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ウイルスベクター。 A1. A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, the one or more miRNAs comprising a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99. Viral vector.

Ａ２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、
ウイルスベクター。 A2. A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs;
(i) the two or more miRNAs include a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99 and the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, or (ii) two or more miRNAs contains an miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99 and a miRNA of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101,
Viral vector.

Ａ３．パッケージ化された核酸が３つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、ｍｉＲＮＡが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、実施態様Ａ１またはＡ２の１つに記載のウイルスベクター。 A3. The packaged nucleic acid encodes three or more miRNAs, the miRNAs being (i) a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99, and (ii) a miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100. and (iii) a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101.

Ａ４．パッケージ化された核酸が、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡをコードしている、実施態様Ａ３に記載のウイルスベクター。 A4. The viral vector according to embodiment A3, wherein the packaged nucleic acid encodes a miRNA fragment having a sequence of SEQ ID NO: 99, an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 17, and an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 19. .

Ａ５．カプシドと、以下をコードするトランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含む、実施態様１～５のいずれかによるウイルスベクター。
● 配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び
● 配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡ。 A5. A viral vector according to any of embodiments 1 to 5, comprising a capsid and a packaged nucleic acid comprising two or more transgene expression cassettes comprising a transgene encoding:
- At least one miRNA fragment selected from the group consisting of a miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, and a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100. miRNA, and ● selected from the group consisting of miRNA of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35 and 36 RNA that inhibits the function of one or more miRNAs.

Ａ６．カプシドと、トランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含み、
● 第１発現カセットが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡとをコードする第１トランスジーンを含み、および
● 第２発現カセットが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする第２トランスジーンを含む、
実施態様１～５のいずれかによるウイルスベクター。 A6. a capsid and a packaged nucleic acid comprising two or more transgene expression cassettes comprising a transgene;
● The first expression cassette is from the group consisting of a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99, a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, and a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100. the second expression cassette comprises a first transgene encoding at least one selected miRNA; a second transgene encoding an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs selected from the group consisting of miRNAs 12, 13, 14, 16, 34, 35, and 36;
Viral vector according to any of embodiments 1-5.

Ａ７．ＲＮＡ阻害がＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない、実施態様Ａ５からＡ６のいずれかの１つに記載のウイルスベクター。 A7. Viral vector according to any one of embodiments A5 to A6, wherein the RNA inhibition is not subject to RNAi processing or RNAi maturation.

Ａ８．核酸が偶数個のトランスジーン発現カセットを有する、実施態様Ａ５～Ａ７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A8. Viral vector according to any one of embodiments A5 to A7, wherein the nucleic acid has an even number of transgene expression cassettes.

Ａ９．トランスジーン発現カセットが、プロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含み、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、実施態様Ａ５～Ａ８のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A9. Viral vector according to any one of embodiments A5 to A8, wherein the transgene expression cassette comprises a promoter, a transgene and a polyadenylation signal, the promoters or polyadenylation signals being located opposite each other.

Ａ１０．ベクターが組換えＡＡＶベクターである、実施態様Ａ１～Ａ９のいずれか１つによるウイルスベクター。 A10. Viral vector according to any one of embodiments A1 to A9, wherein the vector is a recombinant AAV vector.

Ａ１１．ベクターがＡＡＶ－２血清型を有する組換えＡＡＶベクターである、実施態様Ａ１～Ａ１０のいずれか１つによるウイルスベクター。 A11. Viral vector according to any one of embodiments A1 to A10, wherein the vector is a recombinant AAV vector having the AAV-2 serotype.

Ａ１２．カプシドが配列番号２９または３０の配列を有する第１タンパク質を含む、実施態様Ａ１～Ａ１１のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A12. Viral vector according to any one of embodiments A1 to A11, wherein the capsid comprises a first protein having the sequence SEQ ID NO: 29 or 30.

Ａ１３．カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一である第１タンパク質を含むが、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントに１つ以上のギャップが許容される、実施態様Ａ１～Ａ１２のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A13. Embodiment A1, wherein the capsid comprises a first protein that is 80% identical to a second protein having the sequence of SEQ ID NO: 82, but one or more gaps in the alignment between the first and second proteins are tolerated. The viral vector according to any one of ~A12.

Ａ１４．カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と９５％同一である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてみなされる、実施態様Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A14. Any of embodiments A1 to A13, wherein the capsid comprises a first protein that is 95% identical to a second protein having the sequence SEQ ID NO: 82, and a gap in the alignment between the first protein and the second protein is considered a mismatch. The viral vector according to any one of the above.

Ａ１５．ベクターがＡＡＶ５またはＡＡＶ６．２血清型を有する組換えＡＡＶベクターであり、組換えＡＡＶ６．２ベクターのカプシドが、好ましくは配列番号８２の配列を有するカプシドタンパク質を含む、実施態様Ａ１～Ａ１４のいずれか１つによるウイルスベクター。 A15. Any of embodiments A1 to A14, wherein the vector is a recombinant AAV vector having the AAV5 or AAV6.2 serotype, and the capsid of the recombinant AAV6.2 vector preferably comprises a capsid protein having the sequence SEQ ID NO: 82. Viral vector by one.

Ａ１６．パッケージ化された核酸が２本鎖である、実施態様Ａ１～Ａ１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A16. Viral vector according to any one of embodiments A1 to A15, wherein the packaged nucleic acid is double-stranded.

Ａ１７．パッケージ化された核酸が１本鎖である、実施態様Ａ１～Ａ１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A17. Viral vector according to any one of embodiments A1 to A15, wherein the packaged nucleic acid is single-stranded.

Ａ１８．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の予防または治療に使用される、実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A18. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic Prevention of diseases selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic sclerosis ILD, sarcoidosis and fibrosarcoma. or a viral vector according to any one of embodiments A1 to A17 for use in therapy.

Ａ１９．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載のウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む、方法。 A19. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic of a disease selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic scleroderma ILD, sarcoidosis, and fibrosarcoma. A method of treatment, said method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a viral vector according to any one of embodiments A1 to A17.

Ａ２０．医薬品として使用される、実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。 A20. Viral vector according to any one of embodiments A1 to A17, used as a medicine.

Ａ２１．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ＡＡＶベクター。 A21. An AAV vector comprising a vector genome encoding two or more miRNAs, the two or more miRNAs comprising an miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99.

Ａ２２．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、ＡＡＶベクター。 A22. An AAV vector comprising a vector genome encoding two or more miRNAs, where the two or more miRNAs include an miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99 and an miRNA of SEQ ID NO: 17 or the sequence of SEQ ID NO: 100. An AAV vector comprising a fragment thereof having.

Ａ２３．ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を含むｍｉＲＮＡと、（ｉｉ）配列番号１７の配列または配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とをコードしている、実施態様Ａ２１またはＡ２２に記載のＡＡＶベクター。 A23. The vector genome contains (i) miRNA containing the sequence of SEQ ID NO: 99, (ii) a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 17 or the sequence of SEQ ID NO: 100, and (iii) miRNA or sequence containing the sequence of SEQ ID NO: 19. AAV vector according to embodiment A21 or A22, encoding a fragment thereof having the sequence number 101.

Ａ２４．前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡをコードしている、実施態様Ａ２３に記載のＡＡＶベクター。 A24. The vector genome encodes (i) a miRNA fragment having a sequence of SEQ ID NO: 99, (ii) a miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 17, and (iii) a miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 19. AAV vector according to embodiment A23.

Ａ２５．ベクターゲノムが、さらに配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードしている、実施態様Ａ２１～Ａ２４に記載のＡＡＶベクター。 A25. The vector genome is further selected from the group consisting of miRNAs of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35 and 36. The AAV vector according to embodiments A21 to A24, encoding an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs.

Ａ２６．実施態様Ａ２１～Ａ２５のいずれかのＡＡＶベクターを含む、２本鎖プラスミドベクター。 A26. A double-stranded plasmid vector comprising the AAV vector of any of embodiments A21 to A25.

Ａ２７．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物とを含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。 A27. A combination of miRNA mimetics for use in a method for preventing and/or treating fibroproliferative diseases, the combination comprising: (i) a miRNA fragment mimetic having the sequence of SEQ ID NO: 99; and (ii) SEQ ID NO: 17 and/or a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

Ａ２８．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、ｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物。 A28. A miRNA mimetic of miRNA-212-5p used in a method of preventing and/or treating fibroproliferative diseases, wherein the miRNA mimetic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99 or SEQ ID NO: It contains an oligomer of nucleotides consisting of 99 sequences, and the following conditions:
● The oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-naturally occurring nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● The oligomer optionally contains nucleotide analogues that exhibit base pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● Oligomers are optionally conjugated with lipids to facilitate drug delivery;
has
miRNA mimetic of miRNA-212-5p, wherein said prevention and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17 and/or a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

Ａ２９．予防および／または治療が、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、実施態様Ａ２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 A29. miRNA mimetic used in the method according to embodiment A28, wherein the prophylaxis and/or treatment comprises the administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17.

Ａ３０．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、ｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物。 A30. A miRNA mimetic of miRNA-212-5p used in a method of preventing and/or treating fibroproliferative diseases, wherein the miRNA mimetic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99 or SEQ ID NO: It contains an oligomer of nucleotides consisting of 99 sequences, and the following conditions:
● The oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-naturally occurring nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● The oligomer optionally contains nucleotide analogues that exhibit base pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● Oligomers are optionally conjugated with lipids to facilitate drug delivery;
has
A miRNA mimetic of miRNA-212-5p, wherein said prevention and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence of SEQ ID NO: 17.

Ａ３１．配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号１７または１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは、配列番号１７または１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、実施態様Ａ２９またはＡ３０に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 A31. The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 17 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Conditions of:
● The oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or 100;
● The oligomer optionally comprises nucleotide analogues that exhibit base pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or 100;
● Oligomers are optionally conjugated with lipids to facilitate drug delivery;
An miRNA mimetic used in the method according to embodiment A29 or A30, having the following.

Ａ３２．前記予防および／または治療が、さらに配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、実施態様Ａ２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 A32. miRNA mimetic for use in the method according to embodiment A28, wherein said prophylaxis and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

Ａ３３．配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、実施態様Ａ３２に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 A33. The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Conditions of:
● The oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or 101;
● The oligomer optionally comprises nucleotide analogues that exhibit base pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or 101;
● Oligomers are optionally conjugated with lipids to facilitate drug delivery;
An miRNA mimetic used in the method according to embodiment A32, having the following.

Ａ３４．前記予防および／または治療が、配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様Ａ２８～Ａ３３のいずれか１つに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 A34. miRNA mimetic for use in the method according to any one of embodiments A28 to A33, wherein said prophylaxis and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 18.

Ａ３５．配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは、配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；、
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、実施態様Ａ３４に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 A35. The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 18 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 18, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 18, and the following conditions:
● The oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 18;
● The oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 18;
● Oligomers are optionally conjugated with lipids to facilitate drug delivery;
An miRNA mimetic used in the method according to embodiment A34, having the following.

Ａ３６．線維増殖性疾患がＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤである、実施態様Ａ２８からＡ３５のいずれかに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 A36. The miRNA mimetic used in the method according to any of embodiments A28 to A35, wherein the fibroproliferative disease is IPF or PF-ILD.

Ａ３７．ＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤまたはＩＬＤのような線維増殖性疾患の治療薬の製造のための、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物との使用。 A37. (i) miRNA mimic of the miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99 and (ii) the sequence of SEQ ID NO: 17 for the production of a therapeutic agent for fibroproliferative diseases such as IPF or PF-ILD or ILD. Use of an miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19 and/or an miRNA mimetic miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19.

Ａ３８．配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 A38. A pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of a miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 17, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Ａ３９．配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 A39. A pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of a miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Ａ４０．配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 A40. miRNA mimetic of a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99, miRNA mimetic of miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 17, miRNA mimetic of miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 19, and a pharmaceutically acceptable carrier. or a diluent.

Ａ４１．前記組成物のｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されている、実施態様Ａ３８、Ａ３９またはＡ４０に記載の医薬組成物。 A41. A pharmaceutical composition according to embodiment A38, A39 or A40, wherein the miRNA mimetic of said composition is encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs).

Ａ４２．前記組成物がイオン化脂質を２５～６５ｍｏｌ％含む、実施態様Ａ４１に記載の医薬組成物。 A42. The pharmaceutical composition according to embodiment A41, wherein the composition comprises 25-65 mol% of ionized lipid.

Ａ４３．前記ＬＮＰの平均粒子径が３０～２００ｎｍである、実施態様Ａ３８からＡ４２のいずれか１つに記載の医薬組成物。 A43. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments A38 to A42, wherein the LNPs have an average particle size of 30 to 200 nm.

Ａ４４．（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。 A44. (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(b) a miRNA mimic of miRNA181a-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises a nucleotide with a chemical modification that results in a non-natural nucleotide exhibiting base pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- the oligomer optionally comprises a nucleotide analog exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(c) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent;
A pharmaceutical composition comprising.

Ａ４５．（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。 A45. (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(b) an miRNA mimic of miRNA181b-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Contains oligomers of nucleotides, the following conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- the oligomer optionally comprises a nucleotide analog exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(b) a miRNA mimic of miRNA181a-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises a nucleotide with a chemical modification that results in a non-natural nucleotide exhibiting base pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- the oligomer optionally comprises a nucleotide analog exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(c) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent;
A pharmaceutical composition comprising.

Ａ４６．（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（C）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。 A46. (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(b) a miRNA mimic of miRNA181a-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally comprises a nucleotide with a chemical modification that results in a non-natural nucleotide exhibiting base pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- the oligomer optionally comprises a nucleotide analog exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(C) A miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101. Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- the oligomer optionally comprises a nucleotide analog exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
(c) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent;
A pharmaceutical composition comprising.

Ａ４７．ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様Ａ３８からＡ４６のいずれか１つに記載の医薬組成物。 A47. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments A38 to A46, wherein the miRNA mimetic of miRNA 212-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

Ａ４８．ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様Ａ３８、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４２、Ａ４４、またはＡ４６のいずれか１つに記載の医薬組成物。 A48. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments A38, A40, A41, A42, A44, or A46, wherein the miRNA mimetic of miRNA 181a-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

Ａ４９．ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様Ａ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４２、Ａ４５、またはＡ４６のいずれか１つに記載の医薬組成物。 A49. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments A39, A40, A41, A42, A45, or A46, wherein the miRNA mimetic of miRNA 181b-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

Ａ５０．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に実施態様Ａ３８からＡ４９またはＡ５７のいずれかに記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。 A50. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic of a disease selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic scleroderma ILD, sarcoidosis, and fibrosarcoma. A method of treatment, said method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition according to any of embodiments A38 to A49 or A57.

Ａ５１．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療薬の製造のための、実施態様Ａ３８からＡ５０のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。 A51. ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic of a disease selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic scleroderma ILD, sarcoidosis, and fibrosarcoma. Use of a pharmaceutical composition according to any one of embodiments A38 to A50 for the manufacture of a therapeutic medicament.

Ａ５２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含むウイルスベクター。 A52. a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, the one or more miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100. Viral vectors containing.

Ａ５３．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡとを含む、
実施態様Ａ５２に記載のウイルスベクター。 A53. a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs;
(i) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100 and the miRNA of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101; or (ii) ) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, and the miRNA of SEQ ID NO: 18;
Viral vector according to embodiment A52.

Ａ５４．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。 A54. a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, the one or more miRNAs having the sequence of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Viral vectors, including fragments.

Ａ５５．カプシドと、パッケージ化された核酸を含み、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、実施態様Ａ５４に記載のウイルスベクター。 A55. a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs, the two or more miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101. and the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100.

Ａ５６．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、該組合せは、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物、および／または（ｉｉ）配列番号１７の配列を有すｍｉＲＮＡの模倣物および／または（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、組合せ。 A56. A combination of miRNA mimetics for use in a method of preventing and/or treating fibroproliferative diseases, the combination comprising: (i) a mimetic of an miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99; and/or (ii) A combination comprising a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17 and/or (iii) a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

Ａ５７．（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｃ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
および
（ｄ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。 A57. (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
● Said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence of SEQ ID NO: 99; or ● Said oligomer optionally comprises lipids to facilitate drug delivery. is conjugated with
an miRNA mimetic having
or (b) an miRNA mimic of miRNA181a-5p, wherein the miRNA mimic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or from the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100. Containing oligomers of nucleotides, the following conditions:
- the oligomer optionally comprises a nucleotide with a chemical modification that results in a non-natural nucleotide exhibiting base pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- the oligomer optionally comprises a nucleotide analog exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
or (c) an miRNA mimic of miRNA181b-5p, wherein the miRNA mimic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or from the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101. containing oligomers of nucleotides with the following conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- the oligomer optionally comprises a nucleotide analog exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
● The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having
and (d) a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

前記ウイルスベクターは、好ましくは１．０ｘ１０¹⁰～１．０ｘ１０¹⁴ｖｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりのウイルスゲノム）の範囲のウイルス用量に相当する量として投与されるのが、１．０ｘ１０¹¹～１．０ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇの範囲がより好ましく、５．０ｘ１０¹¹～５．０ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇの範囲はさらに好ましく、および１．０ｘ１０¹²～５．０ｘ１０¹¹の範囲がよりさらに好ましい。約２．５ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇのウイルス用量が最も好ましい。投与されるウイルスベクター、例えば本発明によるＡＡＶベクターの量は、例えば、１つ以上のトランスジーンの発現の強さにより調節することができる。 Said viral vector is preferably administered in an amount corresponding to a viral dose ⁱⁿ the range of 1.0x10 ¹⁰ to 1.0x10 ¹⁴ vg/kg (viral genomes per kg body weight). A range of 0x10 ¹² vg/kg is more preferred, a range of 5.0x10 ¹¹ to 5.0x10 ¹² vg/kg is even more preferred, and a range of 1.0x10 ¹² to 5.0x10 ¹¹ is even more preferred. A viral dose of about 2.5x10 ¹² vg/kg is most preferred. The amount of viral vector, such as an AAV vector according to the invention, administered can be adjusted, for example, depending on the strength of expression of the one or more transgenes.

本発明のさらなる態様は、ニンテダニブまたはピルフェニドンとの併用療法のための、本発明によるウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ阻害剤およびｍｉＲＮＡ模倣物の使用である。 A further aspect of the invention is the use of viral vectors, miRNA inhibitors and miRNA mimetics according to the invention for combination therapy with nintedanib or pirfenidone.

使用される用語および定義Terms and definitions used

発現カセットは、トランスジーンと、通常はプロモーターと、ポリアデニル化シグナルとを含む。プロモーターはトランスジーンに動作可能に連結されている。適するプロモーターは、肺胞上皮細胞のような肺細胞で選択的にまたは恒常的に活性化され得る。適当なプロモーターの非限定的な具体例には、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、ヒト伸長因子ｌａプロモーターおよびヒトユビキチンｃプロモーターのような恒常的活性化プロモーターが含まれる。肺特異的プロモーターの非限定的な具体例には、サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子プロモーター、サーファクタントタンパク質Ｂプロモーター、およびクララ細胞１０ｋＤ（「ＣＣ１０」）プロモーターが含まれる。 The expression cassette includes the transgene, usually a promoter, and a polyadenylation signal. A promoter is operably linked to a transgene. Suitable promoters can be activated selectively or constitutively in lung cells, such as alveolar epithelial cells. Non-limiting examples of suitable promoters include constitutively active promoters such as the cytomegalovirus immediate early gene promoter, the Rous sarcoma virus long terminal repeat promoter, the human elongation factor la promoter, and the human ubiquitin c promoter. . Non-limiting examples of lung-specific promoters include the surfactant protein C gene promoter, the surfactant protein B promoter, and the Clara cell 10 kD (“CC10”) promoter.

トランスジーンは、本発明の実施態様によっては、（ｉ）１つ以上のｍｉＲＮＡ、例えば配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡ、またはブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされる１つ以上のｍｉＲＮＡ、または（ｉｉ）ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでアップレギュレートされるｍｉＲＮＡの１つ以上の機能を阻害するＲＮＡ、または（ｉ）および（ｉｉ）の選択肢をコードする。トランスジーンは、トランスダクションレポートのための（ｅＧＦＰなど、図１１参照）または治療目的のためのタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含んでもよい。 In some embodiments of the present invention, the transgene is a transgene that is associated with (i) one or more miRNAs, e.g. one or more miRNAs that are downregulated, or (ii) an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs that are upregulated in a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model or an AAV-TGFβ1-induced pulmonary fibrosis model; or code options (i) and (ii). Transgenes may contain open reading frames encoding proteins for transduction reporting (such as eGFP, see Figure 11) or for therapeutic purposes.

１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡは、相補的結合によりその標的ｍｉＲＮＡの機能を低下または消失させる。図８Ｂおよび図８Ｃに記載されているように、２つの異なるベクターデザイン戦略が適用されうる。
１）線維化促進性ｍｉＲＮＡに対して特異的に結合し、それによってそれらの機能を阻害するように設計されたアンチセンス様分子の発現（図８Ｂ）。アンチ－ｍｉＲと呼ばれる各分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または人工ｍｉＲＮＡとして発現ベクターに組み込むことができる。ｍｉＲＮＡ補充アプローチと同様に、いくつかのｍｉＲＮＡ標的配列を単一ベクターに組み込んで、それによって様々な標的ｍｉＲＮＡの阻害を可能にする。
２）線維化促進性ｍｉＲＮＡを選択的に隔離し、それによってそれらの機能を阻害することを目的とした、ｍｉＲＮＡ結合部位、いわゆるスポンジのいくつかのコピーを含むｍＲＮＡの発現（図８Ｃ）。この選択肢については、ＲＮＡ阻害はＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない。 RNA that inhibits the function of one or more miRNAs reduces or eliminates the function of its target miRNA through complementary binding. Two different vector design strategies can be applied, as described in FIGS. 8B and 8C.
1) Expression of antisense-like molecules designed to specifically bind to profibrotic miRNAs and thereby inhibit their function (Figure 8B). Each molecule, called anti-miR, can be incorporated into an expression vector as a short hairpin RNA (shRNA) or an artificial miRNA. Similar to miRNA recruitment approaches, several miRNA target sequences are incorporated into a single vector, thereby allowing inhibition of various target miRNAs.
2) Expression of mRNAs containing several copies of miRNA binding sites, so-called sponges, aimed at selectively sequestering pro-fibrotic miRNAs and thereby inhibiting their function (Fig. 8C). For this option, RNA inhibition does not undergo RNAi processing or RNAi maturation.

本発明によるｍｉＲＮＡ阻害剤という用語は、７から少なくとも２２ヌクレオチド長の連続した配列からなるオリゴマーを指す。 The term miRNA inhibitor according to the invention refers to an oligomer consisting of a contiguous sequence of 7 to at least 22 nucleotides in length.

ここで使用されるヌクレオチドという用語は、糖部分（通常リボースまたはデオキシリボース）、塩基部分、およびホスフェートまたはホスホロチオエートのヌクレオチド間結合基のような共有結合基（結合基）を含むグリコシドを意味する。天然ヌクレオチドと、ここではヌクレオチドアナログとして呼ばれる修飾された糖および／または塩基部分を含む非天然ヌクレオチドの両方を含む。非天然ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、または２’修飾ヌクレオチド、または２’置換ヌクレオチドなどの２’修飾ヌクレオチドのような糖部分を有するヌクレオチドが含まれる。 The term nucleotide as used herein refers to a glycoside that includes a sugar moiety (usually ribose or deoxyribose), a base moiety, and a covalently linked group (linking group), such as a phosphate or phosphorothioate internucleotide linking group. It includes both natural nucleotides and non-natural nucleotides containing modified sugar and/or base moieties, referred to herein as nucleotide analogs. Non-natural nucleotides include nucleotides with sugar moieties such as bicyclic nucleotides, or 2' modified nucleotides, or 2' modified nucleotides, such as 2' substituted nucleotides.

非天然ヌクレオチドにつながる化学修飾を有するヌクレオチドは次の修飾を含む
（ｉ）非天然糖部分を有するヌクレオチド、
例には、二環式ヌクレオチド、または２’修飾ヌクレオチド、または２’置換ヌクレオチドのような２’修飾ヌクレオチドがある。 Nucleotides with chemical modifications that lead to non-natural nucleotides include (i) nucleotides with non-natural sugar moieties ;
Examples include 2' modified nucleotides, such as bicyclic nucleotides, or 2' modified nucleotides, or 2' substituted nucleotides.

（ｉｉ）ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジチオアート（ＰＳ２）修飾を有するヌクレオチド
ｍｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性の向上ならびに血清安定性の改善および血中濃度を増加のために、ｍｉＲＮＡ阻害剤または模倣物の１つ以上のヌクレオチドにおいて、ホスホロチオエート（ＰＳ）として定義される、硫黄をヌクレオチドホスフェート基の酸素と交換できる。いくつかの配列については、これはホスホロジチオアートＰＳ２として定義される、既存ＰＳへの硫黄基の第２の導入によって、組み合わせたり相補することができる。ヌクレオチド１９＋２０または３＋１２（５’末端から数えて）でのようなセンス鎖の異なる位置でのＰＳ２修飾は、さらに血清安定性を増加させ、従ってｍｉＲＮＡ阻害剤／ｍｉＲＮＡ模倣物の薬物動態学的特性を向上させうる（ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、１２１４－１２２０）。 (ii) Nucleotides with phosphorothioate (PS) and phosphodithioate (PS2) modifications
In one or more nucleotides of the miRNA inhibitor or mimetic, sulfur is substituted with a nucleotide phosphate group, defined as phosphorothioate (PS), to improve miRNA nuclease resistance and improve serum stability and increase blood concentration. can be exchanged with oxygen. For some sequences, this can be combined or complemented by a second introduction of a sulfur group into an existing PS, defined as a phosphorodithioate PS2. PS2 modification at different positions of the sense strand, such as at nucleotides 19+20 or 3+12 (counting from the 5' end), may further increase the serum stability and thus improve the pharmacokinetic properties of miRNA inhibitors/miRNA mimetics. (ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1214-1220).

（ｉｉｉ）ボラノホスフェート修飾を有するヌクレオチド
いくつかのｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでは、リボースリン酸基の１つの酸素のＢＨ３基への交換は有益でありうる。ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのシード領域が他の化学修飾によって修飾されない場合、１つ以上のヌクレオチドにおけるボラノホスフェート修飾は血清安定性を向上させうる。ボラノホスフェート修飾はｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの血清安定性も増加させ得る（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．２０、５９９１－６０００）。 (iii) Nucleotides with boranophosphate modification
In some miRNA oligonucleotides, replacing one oxygen of the ribose phosphate group with a BH3 group may be beneficial. Boranophosphate modification on one or more nucleotides can improve serum stability if the seed region of the miRNA oligonucleotide is not modified by other chemical modifications. Boranophosphate modification can also increase the serum stability of miRNA oligonucleotides (Nucleic Acids Research, Vol. 32 No. 20, 5991-6000).

（ｉｖ）２’Ｏ－メチル修飾を有するヌクレオチド
リン酸修飾以外またはリン酸修飾に加えて、リボース環の炭素Ｃ２に結合している酸素のメチル化は、オリゴヌクレオチド修飾のさらなる選択肢になりうる。センス鎖の２’Ｏ－メチルリボース修飾は熱安定性および酵素消化耐性を向上させうる。 (iv) Nucleotide with 2'O-methyl modification
Besides or in addition to phosphate modification, methylation of the oxygen attached to carbon C2 of the ribose ring may be a further option for oligonucleotide modification. 2'O-methylribose modification of the sense strand can improve thermostability and resistance to enzymatic digestion.

（ｖ）２’ＯＨでのフッ素修飾を有するヌクレオチド
オリゴヌクレオチドの血清安定性の増強およびｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのその標的に対する結合親和性を向上させるために、ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを２’ＯＨフッ素修飾することも有益でありうる。２’ＯＨフッ素修飾は、リボース環の炭素Ｃ２の水酸基をフッ素原子に交換する。フッ素修飾はセンスおよびアンチセンスの両鎖に適用できる。 (v) Nucleotides with fluorine modification at 2'OH
It may also be beneficial to 2'OH fluorine modification of miRNA oligonucleotides to enhance the serum stability of the oligonucleotide and improve the binding affinity of the miRNA oligonucleotide to its target. 2'OH fluorine modification replaces the hydroxyl group at carbon C2 of the ribose ring with a fluorine atom. Fluorine modification can be applied to both sense and antisense strands.

「ヌクレオチドアナログ」は、糖および／または塩基部分での修飾による天然オリゴヌクレオチドの変異体である。好ましくは、この説明に制限されないが、アナログはオリゴマーがその標的に結合するように働く方法に機能的効果を有する；例えば、標的に対する結合親和性の増強、および／またはヌクレアーゼに対する耐性の増強、および／または細胞への輸送の簡易性の強化による。ヌクレオシドアナログの具体的な例は、ＦｒｅｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ，２５：４４２９－４４４３，１９９７）およびＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎｉｎＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：２９３－２１３，２０００）によって記載されている。 " Nucleotide analogs " are variants of natural oligonucleotides with modifications at the sugar and/or base moieties. Preferably, but not limited to this description, the analog has a functional effect on the way the oligomer acts to bind its target; for example, increasing binding affinity for the target and/or increasing resistance to nucleases; / or by enhanced ease of transport into cells. Specific examples of nucleoside analogs are described by Freier and Altman (Nucl. Acid Res, 25:4429-4443, 1997) and Uhlmann (Curr. Opinion in Drug Development, 3:293-213, 2000).

ロック核酸（ＬＮＡ（登録商標））を含む、オリゴマーにおける親和性増強アナログの取込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズの低下を可能にし、非特異的または異常な結合が生じる前のオリゴマーのサイズの上限も低下できる。「ＬＮＡ（登録商標）」という用語は、「ロック核酸」として知られる二環式ヌクレオシドアナログを指す（Ｒａｊｗａｎｓｈｉら、ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３９（９）１６５６－１６５９，２０００）。これは、ＬＮＡ（登録商標）モノマー、または「ＬＮＡ（登録商標）オリゴヌクレオチド」の文脈において使用される場合は１つ以上のそのような二環性アナログを含むオリゴヌクレオチドを指すことがある。 Incorporation of affinity-enhancing analogs in oligomers, including locking nucleic acids (LNA®), allows for a reduction in the size of oligomers that bind specifically and the size of oligomers before nonspecific or aberrant binding occurs. The upper limit of can also be lowered. The term "LNA®" refers to bicyclic nucleoside analogs known as "locked nucleic acids" (Rajwanshi et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl., 39(9) 1656-1659, 2000). This may refer to LNA® monomers, or oligonucleotides containing one or more such bicyclic analogs when used in the context of "LNA® oligonucleotide."

好ましくは、本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤は、特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ）に対して相補的な配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのオリゴマーは、最大７０％アナログ（ＬＮＡ（登録商標））で合計７から少なくとも２２の連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成され得る。最も短いオリゴマー（７ヌクレオチド）は、特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡの成熟体（mature to Certain up regulated miRNA）の５’末端に位置する最初の７ヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ標的特異性に関わる５’末端から２～８の位置の７ヌクレオチド配列（「シード」配列と呼ばれる）を含む）と完全な配列相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに相当するであろう（Ｌｅｗｉｓら、Ｃｅｌｌ．２００５年１月１４日；１２０（１）：１５－２０）。 Preferably, the miRNA inhibitors of the present invention target specific upregulated miRNAs (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35 and 36 miRNAs). These oligomers may contain or consist of contiguous nucleotide sequences of up to 70% analog (LNA®) and a total length of 7 to at least 22 contiguous nucleotides. The shortest oligomer (7 nucleotides) consists of the first 7 nucleotides located at the 5' end of the mature to certain up regulated miRNA (from the 5' end involved in miRNA target specificity). (Lewis et al., Cell. January 14, 2005). ;120(1):15-20).

特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ標的部位ブロッカーは、特定のｍＲＮＡに位置する特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ結合部位に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのオリゴマーは、ＵＳ２００９０１３７５０４の教示に従って設計されてもよい。これらのオリゴマーは、合計８～２３の連続ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成され得る。これらの配列は、特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ「シード」配列の逆相補体に対応する配列から５’または３’方向に２０ヌクレオチドにわたりうる。 A specific upregulated miRNA target site blocker refers to an antisense oligonucleotide having a sequence complementary to a specific upregulated miRNA binding site located on a specific mRNA. These oligomers may be designed according to the teachings of US20090137504. These oligomers may contain or consist of contiguous nucleotide sequences with a total length of 8 to 23 contiguous nucleotides. These sequences can span 20 nucleotides in the 5' or 3' direction from a sequence corresponding to the reverse complement of a particular upregulated miRNA "seed" sequence.

発明のｍｉＲＮＡ模倣物という用語は、特定のｍｉＲＮＡの活性を特異的に増加できる１本鎖または２本鎖のヌクレオチドのオリゴマーであって、特定のｍｉＲＮＡという語は、配列番号１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９および９２からなる群から選択される配列、好ましくは９２、１５、１７、１９、１８および２０、最も好ましくは１５、１７および１９、またさらに好ましくは配列番号１５を有するｍｉＲＮＡを意味する。ｍｉＲＮＡ模倣物という用語は、薬学的に許容される塩を含む。ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物は、細胞の前記ｍｉＲＮＡの機能的同等物の濃度を高め、それによって前記ｍｉＲＮＡの全体的な活性を増加させる。 The term miRNA mimetic of the invention is an oligomer of single-stranded or double-stranded nucleotides that can specifically increase the activity of a particular miRNA, where the term particular miRNA is defined as SEQ ID NO: 15, 17, 18, Sequences selected from the group consisting of 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 37, 38, 39 and 92, preferably 92, 15, 17, 19, 18 and 20, most preferably means miRNA having SEQ ID NO: 15, 17 and 19, and more preferably SEQ ID NO: 15. The term miRNA mimetic includes pharmaceutically acceptable salts. A miRNA mimetic of an miRNA increases the concentration of a functional equivalent of the miRNA in the cell, thereby increasing the overall activity of the miRNA.

本発明のこれらのｍｉＲＮＡ模倣物は、典型的および好ましくは、２１、２２または２３の連続ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列からなる。ｍｉＲＮＡ模倣物（すなわち１本鎖模倣物の場合はオリゴヌクレオチド、または２本鎖模倣物の場合はセンス鎖）の長さは、典型的にはそれらが模倣する各ｍｉＲＮＡの長さに一致する（好ましい）。 These miRNA mimetics of the invention typically and preferably consist of a contiguous nucleotide sequence of 21, 22 or 23 contiguous nucleotides in length. The length of miRNA mimetics (i.e. oligonucleotide for single-stranded mimetics or sense strand for double-stranded mimetics) typically matches the length of each miRNA they mimic ( preferable).

ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐまたはｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのような２３ｎｔを有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物の場合、ｍｉＲＮＡ模倣物の長さ（すなわち１本鎖模倣物の場合はオリゴマーまたは２本鎖模倣物の場合はセンス鎖）は、２３ｎｔ（好ましい）、または３’末端で１つのヌクレオチドが欠失している条件で２２ｎｔのどちらかである。真正のｍＲＮＡ（たとえば配列番号１００、９９参照）に比較して３’末端での欠失は、ｍｉＲＮＡのシード領域および１３～１６のヌクレオチド領域から離れているため、対応するｍｉＲＮＡ模倣物の特異性は許容される（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７）。 For miRNA mimics of miRNAs with 23 nt, such as miR-181a-5p or miRNA-212-5p, the length of the miRNA mimic (i.e. oligomeric for single-stranded mimics or oligomeric for double-stranded mimics) The sense strand) is either 23 nt (preferred) or 22 nt, provided that one nucleotide is deleted at the 3' end. The deletion at the 3' end compared to the authentic mRNA (see e.g. SEQ ID NOs: 100, 99) is further away from the seed region and 13-16 nucleotide region of the miRNA, thus affecting the specificity of the corresponding miRNA mimic. is acceptable (Grimson et al., 2007).

ｍｉＲＮＡ２９ａ－３ｐ、２１２－５ｐ、ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐおよびｍｉＲＮＡ１０ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物は、それぞれ、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療での使用を目的としており、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９２、配列番号１５または９９、配列番号１７または１００、配列番号１８、および配列番号１９の配列からなるヌクレオチドオリゴマーであるか、または該ヌクレオチドオリゴマーを含み、それぞれ条件（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、または（ｂ）および（ｃ）を有する。
（ａ）オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾、好ましくは上記の（ｉ）から（ｖ）に示すような化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
（ｂ）オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログ、好ましくはＦｒｅｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．、２５：４４２９－４４４３、１９９７）およびＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎｉｎＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、３：２９３－２１３、２０００）によって記載されたヌクレオチドアナログまたは上記に記載された二環式アナログを任意に含む；
（ｃ）オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている。 miRNA mimetics of miRNA 29a-3p, 212-5p, miRNA 181a-5p, miRNA 181b-5p and miRNA 10a-5p, respectively, for use in the treatment of fibroproliferative diseases such as ILD, PF-ILD or IPF where the miRNA mimetic is or is a nucleotide oligomer consisting of the sequences SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 15 or 99, SEQ ID NO: 17 or 100, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19. containing oligomers and having conditions (a), (b) and (c), (a) and (b), (a) and (c), or (b) and (c), respectively.
(a) The oligomer is chemically modified to become a non-natural nucleotide that exhibits base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined by the sequence of each miRNA, preferably through (i) to (v) above. optionally including nucleotides with chemical modifications as indicated;
(b) The oligomer is a nucleotide analog that exhibits base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence of the respective miRNA, preferably as described by Freier and Altman (Nucl. Acid Res., 25:4429-4443). 1997) and Uhlmann (Curr. Opinion in Drug Development, 3:293-213, 2000) or the bicyclic analogs described above;
(c) The oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery.

脂質コンジュゲートオリゴマーは当該分野でよく知られており、Ｏｓｂｏｒｎｅら、ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳＶｏｌｕｍｅ２８，Ｎｕｍｂｅｒ３，２０１８参照。 Lipid conjugate oligomers are well known in the art, see Osborne et al., NUCLEIC ACID THERAPEUTICS Volume 28, Number 3, 2018.

配列番号ｘの配列からなるオリゴマーは、オリゴマーが配列番号ｘの配列を含み、配列番号ｘに示されるのと同数の共有結合したヌクレオチド構成単位（任意に化学修飾を持つ）またはヌクレオチドアナログを有することを意味する。 An oligomer consisting of the sequence SEQ ID NO: x means that the oligomer comprises the sequence SEQ ID NO: means.

ｍｉＲＮＡ模倣物は１本鎖模倣物または２本鎖模倣物でもよい。１本鎖模倣物は、それに結合する他のオリゴヌクレオチド分子を持たず、完全または部分的な塩基対形成を有するオリゴヌクレオチドである。２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｍｉＲＮＡ模倣物と完全または部分的に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドと結合しているものと定義され、１本鎖領域を持つオリゴヌクレオチドオーバーハングを形成していてもまたはしていなくてもよい。項目１．１１に言及される３つのＲＮＡ鎖デザインは、２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物の例である。さらに例はＶｉｎｎｉｋｏｖら、（２０１４）、ｐ．１０６６１、最終段落、第１行に開示されている。 A miRNA mimetic can be a single-stranded mimetic or a double-stranded mimetic. A single-stranded mimetic is an oligonucleotide that has no other oligonucleotide molecules attached to it and has complete or partial base pairing. A double-stranded miRNA mimetic is defined as one that is associated with one or more oligonucleotides that are fully or partially complementary to the miRNA mimetic, forming an oligonucleotide overhang with a single-stranded region. It may or may not be done. The three RNA strand design mentioned in item 1.11 is an example of a double-stranded miRNA mimetic. Further examples include Vinnikov et al. (2014), p. 10661, last paragraph, first line.

ｍｉＲＮＡ模倣物は、項目１．１１に記載の通り１つ以上の実験で決定された同量の天然ｍｉＲＮＡの少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは９５％以上の生物学的効果を有することが好ましい。 The miRNA mimetic has at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably 95% or more biological It is preferable to have an effect.

ｍｉＲＮＡ模倣物またはｍｉＲＮＡ阻害剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入され、天然または非天然のヌクレオチドとして送達することもできる。カーゴ分子としてのＲＮＡについては、最も効果的なＬＮＰはｐＫａ値が一般的にｐＨ７未満のイオン化脂質含み、最大４つの構成成分、すなわちイオン化脂質、構造脂質、コレステロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質から構成される。 miRNA mimetics or miRNA inhibitors can also be encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) and delivered as natural or non-natural nucleotides. For RNA as a cargo molecule, the most effective LNPs contain ionized lipids with pKa values typically below pH 7 and can be composed of up to four constituents: ionized lipids, structured lipids, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) lipids. configured.

イオン化脂質には、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレオイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎＭＣ３－ＤＭＡ）（ＮａｓｅｒｉＮ，ＶａｌｉｚａｄｅｈＨ，Ｚａｋｅｒｉ－ＭｉｌａｎｉＰ．Ｓｏｌｉｄｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｌｉｐｉｄｃａｒｒｉｅｒｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＡｄｖＰｈａｒｍＢｕｌｌ．２０１５；５（３）：３０５－３１３）、ＡＴＸ－脂質（ＲａｍａｓｗａｍｙＳ，ＴｏｎｎｕＮ，ＴａｃｈｉｋａｗａＫ，ら、ＳｙｓｔｅｍｉｃｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｆａｃｔｏｒＩＸｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｈｅｒａｐｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１７；１１４（１０）：Ｅ１９４１－５０．）、またはＹＳＫ１２－Ｃ４－脂質（ＳａｔｏＹ，ＨａｓｈｉｂａＫ，ＳａｓａｋｉＫ，ら、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃａｔｉｏｎｉｃｌｉｐｉｄｓｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｔｈｅｒａｔｉｏｎａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｍｉｓｉｎｇｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇｓｉＲＮＡｓｉｎｖｉｖｏ．ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ．２０１９；２９５：１４０－１５２．）が含まれるが、これらに限定されない。 Ionized lipids include 1,2-dilinoleoyl-3-dimethylamine (DLin-DMA), 2,2-dilinoleoyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane (DLin-KC2-DMA), ), heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoic acid (DLinMC3-DMA) (Naseri N, Valizadeh H, Zakeri-Milani P. Solid lipid nanoparticles an d nanostructured lipid carriers: structure, preparation, andapplication. Adv Pharm Bull. 2015;5(3):305-313), ATX-lipid (Ramaswamy S, Tonnu N, Tachikawa K, et al., Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.Proc Natl Acad Sci USA.2017;114(10):E1941-50.), or YSK12-C4-lipid (Sato Y, Hashiba K, Sasaki K, et al., Understanding structure-ac relationship of pH-sensitive cationic lipids Facilitates the regional identification of promising lipid nanoparticles for delivering siRNAs in vivo.J Control Release. 2019;295:140-152.).

構造脂質には、ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）などが含まれるが、これらに限定されない。コレステロールには、コレステロール、および３－（Ｎ－（Ｎ０，Ｎ０－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール、ステロール、ステロイドなどが含まれるが、これらに限定されない。 Structural lipids include dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC), dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DMPC), distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DSPC), dipalmitoyl-sn -Glycero-3-phosphocholine (DPPC), dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DPPE), dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE), 1-palmitoyl-2-oleoyl- Examples include, but are not limited to, sn-glycero-3-phosphatidylcholine (POPC), hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), and the like. Cholesterol includes, but is not limited to, cholesterol and 3-(N-(N0,N0-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol, sterols, steroids, and the like.

ＰＥＧ－脂質には、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＭＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＰＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＯＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、ならびにそれらのＰＥＧ長さが変化した、たとえばＰＥＧ₅₀₀、ＰＥＧ₁₀₀₀、ＰＥＧ₅₀₀₀などのＰＥＧ－脂質が含まれるが、これらに限定されない。 PEG-lipids include 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000 (DSPE-mPEG ₂₀₀₀ ), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero -3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000 (DMPE-mPEG ₂₀₀₀ ), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)- 2000 (DPPE-mPEG ₂₀₀₀ ), and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000 (DOPE-mPEG ₂₀₀₀ ), and their PEG lengths varied. PEG-lipids such as, but not limited to, PEG ₅₀₀ , PEG ₁₀₀₀ , PEG ₅₀₀₀ .

ＬＮＰ製剤には、単一ＬＮＰ成分の異なる割合、異なる粒子サイズ、および正帯電ポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基と負帯電核酸ホスフェート（Ｐ）基の異なる比率（Ｎ／Ｐ比）を含むことができる。好ましい製剤は、２５～６５ｍｏｌ％のイオン化脂質、好ましくは４０ｍｏｌ％、５～３０ｍｏｌ％の構造脂質、好ましくは１５ｍｏｌ％、１５～５０ｍｏｌ％のコレステロール、好ましくは４０ｍｏｌ％および１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質、好ましくは２ｍｏｌ％で構成または含まれる。ＬＮＰ平均粒子径は３０～２００ｎｍ、Ｎ／Ｐ比は２～４の間で変更可能であるが、最も好ましいナノ粒子径は１００ｎｍ、Ｎ／Ｐ比は３である。 LNP formulations can include different proportions of a single LNP component, different particle sizes, and different ratios of positively charged polymer amine (N=nitrogen) groups to negatively charged nucleic acid phosphate (P) groups (N/P ratio). can. Preferred formulations include 25-65 mol% ionized lipids, preferably 40 mol%, 5-30 mol% structured lipids, preferably 15 mol%, 15-50 mol% cholesterol, preferably 40 mol% and 1-5 mol% PEG-lipids. , preferably 2 mol%. Although the LNP average particle diameter can be varied between 30 and 200 nm and the N/P ratio between 2 and 4, the most preferred nanoparticle diameter is 100 nm and the N/P ratio is 3.

最も好ましいＬＮＰ製剤は次の組成を有する：ＤＬｉｎＭＣ３－ＤＭＡまたはＡＴＸ脂質、またはＹＳＫ１２－Ｃ４－脂質からなるイオン化脂質４０ｍｏｌ％、ＤＳＰＣ１５ｍｏｌ％、コレステロール４０ｍｏｌ％、粒子径が１００ｎｍでＮ／Ｐ比が３のＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀２ｍｏｌ％。 The most preferred LNP formulation has the following composition: 40 mol% of ionized lipids consisting of DLinMC3-DMA or ATX lipids or YSK12-C4-lipids, 15 mol% of DSPC, 40 mol% of cholesterol, particle size of 100 nm and N/P ratio of 3. DSPE-mPEG ₂₀₀₀ 2 mol%.

ｍｉＲＮＡ模倣物のＬＮＰ送達に最も好ましいｍｉＲＮＡ様式は、アンチセンス鎖に相補的なパッセンジャーセンス鎖を含む。パッセンジャー鎖は、アンチセンス鎖をエンドヌクレアーゼから保護する。Ｖｉｎｎｉｋｏｖらにより記述されているように、両鎖はＬＮＡ修飾を持つ２つのヌクレオチドからなるＬＮＡ修飾オーバーハングを３’側に有する（Ｖｉｎｎｉｋｏｖｅｔａｌ，２０１４）。ＬＮＡはロック核酸を意味し、リボフラノース環の２－酸素と４－炭素の間にメチレン架橋を含む２つの糖部分、３’側における２つのヌクレオチドのＬＮＡ修飾オーバーハングによって定義される。また、センス鎖の５’側の最初のヌクレオチドも、ＬＮＡ修飾されており、ＲＩＳＣ複合体における鎖識別を容易にしている。ＬＮＡ部分は、ヌクレアーゼに対する並外れた耐性および非常に低い細胞毒性を持ちながらモノマーの柔軟性を制限し、それを硬い二環式Ｎ型コンフォメーションの中にロックする。さらに、これらの最小限の修飾は、インビトロおよびインビボの両適用おいて、安定性と機能性の間の妥協点を提供する（Ｅｌｍｅ’ｎｅｔａｌ．，２００５；Ｖｉｎｉｋｏｖｅｔａｌの引用のようにＭｏｏｋｅｔａｌ．，２００７）。ＬＮＡ修飾は、相補的配列とのハイブリダイゼーションにおける融解温度（Ｔｍ値）を高くする。各ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、形成されたヌクレオチドペアのＴｍを最大８℃まで上昇させることができる（ＤＯＩ：１０．１００７／３－５４０－２７２６２－３＿２１）。センスおよびアンチセンス鎖の長さは、通常２０～２２、２０～２３、２０～２４または２０～２５ヌクレオチドからなる。 The most preferred miRNA format for LNP delivery of miRNA mimetics includes a passenger sense strand that is complementary to the antisense strand. The passenger strand protects the antisense strand from endonucleases. Both strands have an LNA modified overhang on the 3' side consisting of two nucleotides with LNA modification as described by Vinnikov et al. (Vinnikov et al, 2014). LNA stands for locked nucleic acid and is defined by the LNA modified overhang of two nucleotides on the 3' side, two sugar moieties containing a methylene bridge between the 2-oxygen and 4-carbon of the ribofuranose ring. The first nucleotide on the 5' side of the sense strand is also LNA modified to facilitate strand discrimination in the RISC complex. The LNA moiety limits the flexibility of the monomer and locks it into a rigid bicyclic N-type conformation while having exceptional resistance to nucleases and very low cytotoxicity. Furthermore, these minimal modifications provide a compromise between stability and functionality in both in vitro and in vivo applications (Elme'n et al., 2005; as cited in Vinikov et al. Mook et al., 2007). LNA modifications increase the melting temperature (Tm value) upon hybridization with complementary sequences. Each LNA modified nucleotide can increase the Tm of the formed nucleotide pair by up to 8°C (DOI: 10.1007/3-540-27262-3_21). The length of the sense and antisense strands usually consists of 20-22, 20-23, 20-24 or 20-25 nucleotides.

別の選択肢は、項目１．１１（細胞分析におけるｍｉＲＮＡの機能的特性解析）で記載した３つのＲＮＡ鎖デザインで、マイクロＲＮＡ模倣物をデザインすることである。 Another option is to design microRNA mimetics with the three RNA strand design described in section 1.11 (Functional characterization of miRNAs in cellular analysis).

ＬＮＰ粒子を送達に使用する場合、投与量は、治療対象の１ｋｇ当たりのｍｉＲＮＡ模倣物量が、０．０１～５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０３～３ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～０．４ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．３ｍｇ／ｋｇであり得る。ＬＮＰ粒子の投与は好ましくは全身、より好ましくは静脈内である。 When LNP particles are used for delivery, the dosage is such that the amount of miRNA mimetic per kg of treated subject is 0.01-5 mg/kg, preferably 0.03-3 mg/kg, more preferably 0.1-0. .4 mg/kg, most preferably 0.3 mg/kg. Administration of LNP particles is preferably systemic, more preferably intravenous.

１．方法および材料
１．１ＡＡＶ産生、精製および定量
ＨＥＫ－２９３ｈ細胞を、１０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地で培養した。トランスフェクションの３日前に、細胞を１５ｃｍの組織培養プレートに播種し、トランスフェクションの日に７０～８０％のコンフルエントに達するようにした。トランスフェクションのために、培養面積１ｃｍ²当たり合計０．５μｇの全ＤＮＡを、培養液の１／１０の容量の３００ｍＭＣａＣｌ₂およびＡＡＶ産生に必要な全プラスミドと等モル比で混合した。プラスミドコンストラクトは次の通りであった：ＡＡＶ６．２ｃａｐ遺伝子をコードする１つのプラスミド（ＳｔｒｏｂｅｌＢｅｔａｌ．，２０１５）、コドン使用頻度を最適化したマウスＴｇｆｂ１遺伝子およびｈＧｈポリＡシグナルを発現させるＣＭＶプロモーターを含むＡＡＶ２ＩＴＲ隣接発現カセットを内部に持つプラスミドであってＴｇｆｂ１配列は活性タンパク質の断片を増加させるＣ２２３ＳおよびＣ２２５Ｓ変異を含む（ＢｒｕｎｎｅｒＡＭら、１９８９）；ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（ＡＡＶＨｅｌｐｅｒ－ｆｒｅｅｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）。ＧＦＰおよびスタッファーコントロールベクターの作製のために、Ｔｇｆｂ１プラスミドを、ＡＡＶ２ＩＴＲ隣接ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＳＶ４０ｐＡカセットを内部に持つｅＧＦＰプラスミド、およびＥ６－ＡＰユビキチンタンパク質リガーゼＵＢＥ３Ａの３’－ＵＴＲに由来するＡＡＶ２ＩＴＲ隣接非コーディング領域の後にＳＶ４０ポリＡシグナルを含むＡＡＶ－スタッファーコントロールプラスミドにそれぞれ交換した。 1. Methods and Materials 1.1 AAV Production, Purification and Quantification HEK-293h cells were cultured in DMEM+GlutaMAX medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Three days before transfection, cells were seeded in 15 cm tissue culture plates and allowed to reach 70-80% confluence on the day of transfection. For transfection, a total of 0.5 μg of total DNA per cm ² of culture area was mixed in equimolar ratios with 1/10 volume of culture medium of 300 mM CaCl ₂ and all plasmids required for AAV production. The plasmid constructs were as follows: one plasmid encoding the AAV6.2 cap gene (Strobel B et al., 2015), a CMV expressing the mouse Tgfb1 gene with optimized codon usage and the hGh polyA signal. The pHelper plasmid (AAV Helper-free system, Agilent ). For the generation of GFP and stuffer control vectors, the Tgfb1 plasmid was combined with the eGFP plasmid carrying the AAV2 ITR-flanked CMV-eGFP-SV40pA cassette internally, and the AAV2 ITR-flanked plasmid derived from the 3'-UTR of the E6-AP ubiquitin protein ligase UBE3A. Each was replaced with an AAV-stuffer control plasmid containing an SV40 polyA signal after the non-coding region.

次に、プラスミドＣａＣｌ₂ミックスを、等容量の２ｘＨＢＳ緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄）に滴下し、室温で２分間インキュベートして、細胞に添加した。５～６時間のインキュベーション後、培養液を新しい培地と交換した。トランスフェクションされた細胞は３７℃で合計７２時間増殖させた。細胞は最終濃度６．２５ｍＭのＥＤＴＡを加えて剥離し、室温で１０００ｘｇ、１０分間の遠心分離でペレット化した。細胞はその後、「溶解バッファー」（５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．５）に再懸濁した。ＡＡＶベクターは基本的に以前記載したように精製した（ＳｔｒｏｂｅｌＢｅｔａｌ．２０１５）：イオジキサノール勾配に基づく精製では、最大４０プレートから採取した細胞を溶解バッファー８ｍＬに溶解した。その後、液体窒素および３７℃の水浴を使った３回の凍結／溶解サイクルにより細胞を溶解した。最初にトランスフェクションした各プレートに対して、１００単位ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を混合液に加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞の残骸を２５００ｘｇ、１５分間で沈殿させた後、上清を３９ｍＬＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＱｕｉｃｋＳｅａｌチューブに移し、ＰＢＳ－ＭＫ（１ｘＰＢＳ、１ｍＭＭｇＣｌ₂、２．５ｍＭＫＣｌ）で希釈した５％ヨウジキサノール溶液８ｍＬ、２５％ヨウジキサノール溶液６ｍＬ、４０％ヨウジキサノール溶液８ｍＬ、５８％ヨウジキサノール溶液５ｍＬを細胞溶解液の下に層化することによって、イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）段階勾配を調製した。ＮａＣｌは前もって最終濃度１Ｍで１５％相に加えておいた。
勾配内の相の境界を区別しやすくするために、１５％および２５％イオジキサノール溶液に０．５％フェノールレッドを１ｍＬ当たりに１．５μＬ加え、５８％相には０．５μＬ加えた。７０Ｔｉローターで１８℃、６３０００ｒｐｍ、２時間遠心分離の後、チューブの底に穴を開けた。最初の５ミリリットル（５８％相に対応）を捨て、ＡＡＶベクター粒子が含まれる次の３．５ｍＬを回収した。ＡＡＶ画分に全量１５ｍＬになるようＰＢＳを加え、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５遠心式フィルタユニットを使用して限外濾過／濃縮を行った。約１ｍＬに濃縮した後、保持液を１５ｍＬまで満たし、再び濃縮した。この過程を合計３回繰り返した。グリセロールを最終濃度１０％で調製物に加えた。ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅＵｌｔｒａｆｒｅｅ－ＣＬｆｉｌｔｅｒｔｕｂｅｓを使用した濾過滅菌の後、ＡＡＶ産物を分注し、－８０℃で保存した。 The plasmid _CaCl2 mix was then added dropwise to an equal volume of 2x HBS buffer (50mM HEPES, 280mM NaCl, _1.5mM _Na2HPO4 ), incubated for 2 minutes at room temperature, and added to the cells. After 5-6 hours of incubation, the culture medium was replaced with fresh medium. Transfected cells were grown for a total of 72 hours at 37°C. Cells were detached by adding EDTA to a final concentration of 6.25mM and pelleted by centrifugation at 1000xg for 10 minutes at room temperature. Cells were then resuspended in "lysis buffer" (50mM Tris, 150mM NaCl, 2mM _MgCl2 , pH 8.5). AAV vectors were purified essentially as previously described (Strobel B et al. 2015): For iodixanol gradient-based purification, cells from up to 40 plates were lysed in 8 mL of lysis buffer. Cells were then lysed by three freeze/lyse cycles using liquid nitrogen and a 37°C water bath. For each initially transfected plate, 100 units of benzonase nuclease (Merck) was added to the mixture and incubated for 1 hour at 37°C. After sedimenting the cell debris at 2500xg for 15 minutes, the supernatant was transferred to a 39mL Beckman Coulter Quick Seal tube and treated with 5% iodixanol solution diluted in PBS-MK (1xPBS, 1mM MgCl ₂ , 2.5mM KCl). An iodixanol (OptiPrep, Sigma Aldrich) step gradient was prepared by layering 8 mL of 25% iodixanol solution, 6 mL of 40% iodixanol solution, 5 mL of 58% iodixanol solution below the cell lysate. . NaCl was previously added to the 15% phase at a final concentration of 1M.
To help distinguish phase boundaries within the gradient, 1.5 μL of 0.5% phenol red was added per mL to the 15% and 25% iodixanol solutions, and 0.5 μL to the 58% phase. After centrifugation in a 70Ti rotor at 18° C. and 63,000 rpm for 2 hours, a hole was made in the bottom of the tube. The first 5 ml (corresponding to 58% phase) was discarded and the next 3.5 ml containing AAV vector particles was collected. PBS was added to the AAV fraction to a total volume of 15 mL, and ultrafiltration/concentration was performed using a Merck Millipore Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit with a MWCO of 100 kDa. After concentrating to about 1 mL, the retentate was filled to 15 mL and concentrated again. This process was repeated a total of three times. Glycerol was added to the preparation at a final concentration of 10%. After sterile filtration using Merck Millipore Ultrafree-CL filter tubes, the AAV product was aliquoted and stored at -80°C.

１．２マウスモデルおよび機能的読出し
レポーター遺伝子研究のために、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した９～１２週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６またはＢａｌｂ／ｃマウスに２．９ｘ１０¹⁰ベクターゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ５－ＣＭＶ－ｆＬｕｃまたは３ｘ１０¹¹ｖｇのＡＡＶ６．２－ＣＭＶ－ＧＦＰのいずれかをそれぞれ浅麻酔（３～４％イソフルラン）下で気管内投与した。あるいは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに３ｘ１０¹¹ｖｇのＡＡＶ２－Ｌ１－ＣＭＶ－ＧＦＰを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＡＡＶ投与後２～３週間に（図の説明参照）、レポーターの読出しを行った。ルシフェラーゼ・イメージングのために、画像取得前に基質としてルシフェリン３０ｍｇ／ｋｇをマウスの腹腔内に投与した。ＧＦＰレポーターの場合、組織学的な新鮮凍結切片を準備しＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡で直接分析するか、またはＧＦＰＩＨＣ分析のためにホルマリン固定パラフィン包埋切片を準備した（さらに以下の詳細な記載参照）。 1.2 Mouse Model and Functional Readout For reporter gene studies, 2.9 x ^{10 10} vector genomes (vg) of AAV5- were injected into 9-12 week old female C57Bl/6 or Balb/c mice purchased from Charles River Laboratories. Either CMV-fLuc or 3x10 ¹¹ vg of AAV6.2-CMV-GFP were each administered intratracheally under light anesthesia (3-4% isoflurane). Alternatively, C57Bl/6 mice were administered 3×10 ¹¹ vg of AAV2-L1-CMV-GFP intravenously (i.v.). Reporter readouts were performed 2-3 weeks after AAV administration (see figure legend). For luciferase imaging, 30 mg/kg of luciferin was administered intraperitoneally to mice as a substrate before image acquisition. For GFP reporters, either histological fresh-frozen sections were prepared and GFP fluorescence was analyzed directly under a fluorescence microscope, or formalin-fixed paraffin-embedded sections were prepared for GFP IHC analysis (see further detailed description below). ).

線維症モデルについては、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した９～１２週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、２．５ｘ１０¹¹（ｖｇ）のＡＡＶ－ＴＧＦβ１またはＡＡＶ－スタッファー、ブレオマイシン１ｍｇ／ｋｇまたは生理食塩水５０μＬのどちらかを浅麻酔の下で気管内投与した。ＡＡＶ／ブレオマイシン投与後３、７、１４、２１および２８日に線維症を評価した。簡単に説明すると、肺機能を評価するために、ペントバルビタール／キシラジン塩酸塩の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与でマウスを麻酔し、気管内にカニューレ処置をして、パンクロニウムブロマイドの静脈内（ｉ．ｖ．）投与で処置した。その後、肺機能測定（すなわち肺コンプライアンス、努力性肺活量（ＦＶＣ））をＳｃｉｒｅｑｆｌｅｘｉＶｅｎｔＦＸｓｙｓｔｅｍを使って行った。その後、マウスをペントバルビタールの過剰投与で安楽死させ、肺を解剖し、重さを測定した後に、７００μＬＰＢＳで２回洗浄し、ＢＡＬ免疫細胞およびタンパク質の層別解析用のＢＡＬ液を得た（データ未発表）。各マウスの左肺は組織病理学者による組織学的評価のために処置され、一方、右肺は以下に述べるように総ＲＮＡ抽出に使用した。 For the fibrosis model, 9-12 week old male C57Bl/6 mice purchased from Charles River Laboratories received 2.5x10 ¹¹ (vg) of AAV-TGFβ1 or AAV-stuffer, 1 mg/kg of bleomycin or 50 μL of saline. Either was administered intratracheally under light anesthesia. Fibrosis was assessed on days 3, 7, 14, 21 and 28 after AAV/bleomycin administration. Briefly, to assess pulmonary function, mice were anesthetized with intraperitoneal (i.p.) administration of pentobarbital/xylazine hydrochloride, intratracheally cannulated, and administered with intravenous pancuronium bromide (i.p.). i.v.) administration. Pulmonary function measurements (ie, lung compliance, forced vital capacity (FVC)) were then performed using the Scireq flexiVent FX system. Thereafter, the mice were euthanized with an overdose of pentobarbital, and the lungs were dissected, weighed, and washed twice with 700 μL PBS to obtain BAL fluid for stratified analysis of BAL immune cells and proteins. (data not yet published). The left lung of each mouse was processed for histological evaluation by a histopathologist, while the right lung was used for total RNA extraction as described below.

ｍｉＲ－２１２－５ｐＡＡＶ薬物動態研究については、ＪａｎｖｉｅｒＬａｂｓの１０～１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊを利用した。イソフルランの短時間暴露での浅麻酔の下、マウスにスタッファー陰性コントロールＡＡＶ（１ｘ１０¹¹ｖｇ）またはｍｉＲ－２１２－５ｐ－ＡＡＶの３つの増加投与量（９ｘ１０⁹ｖｇ、１０ｘ１０¹⁰ｖｇおよび１ｘ１０¹¹ｖｇ）を気管内（ｉ．ｔ．）注入した。マウスはＡＡＶ投与後７、１４、２８日後に安楽死させた。肺は液体窒素で瞬間凍結し、総ＲＮＡ単離のために凍結肺粉末に処理された（ＱｉａｇｅｎのｍｉＲＮＡｅａｓｙキットを利用）。 For miR-212-5p AAV pharmacokinetic studies, 10-12 week old male C57BL/6JRj from Janvier Labs were utilized. Mice were given three increasing doses of stuffer negative control AAV (1x10 ¹¹ vg) or miR-212-5p-AAV (9x10 ⁹ vg, 10x10 ¹⁰ vg and 1x10 ¹¹ vg) under light anesthesia with short exposure to isoflurane. was injected intratracheally (i.t.). Mice were euthanized 7, 14, and 28 days after AAV administration. Lungs were flash frozen in liquid nitrogen and processed into frozen lung powder for total RNA isolation (utilizing Qiagen's miRNAeasy kit).

１．３組織学
組織学的肺サンプルの準備のために、左肺葉を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で満たした分液漏斗に固定し、水深２０ｃｍの水圧で２０分間膨張させた。満たされた肺はその後、気管結紮により塞ぎ、少なくとも２４時間４％ＰＦＡに浸した。それに続いて、ＰＦＡ固定した肺はパラフィンに包埋した。ミクロトームを使用して、３μｍの肺切片を作製し、乾燥させ、キシレンを用いて脱パラフィンし、エタノール低下系列（１００～７０％）で再水和した。マッソントリクローム染色は、確立されたプロトコルに従って、ＧｅｍｉｎｉＥＳＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｌｉｄｅＳｔａｉｎｅｒを用いて行った。ＧＦＰ－ＩＨＣについては、酵素的抗原回収を行い、抗体は示した比率でＢｏｎｄｐｒｉｍａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｅｎｔ（ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に希釈した。スライドは１：１０００希釈のＡｂｃａｍウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体ａｂ２９０および適当なアイソタイプコントロール抗体でそれぞれ染色した。抗原回収のみが行われたスライドは追加の陰性コントロールとして使用した。最後に、切片はＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅＡｑｕａｔｅｘｍｅｄｉｕｍでマウントした。 1.3 Histology For preparation of histological lung samples, the left lung lobe was fixed in a separatory funnel filled with 4% paraformaldehyde (PFA) and inflated with water pressure at a depth of 20 cm for 20 min. The filled lungs were then occluded with a tracheal ligation and soaked in 4% PFA for at least 24 hours. Subsequently, the PFA-fixed lungs were embedded in paraffin. 3 μm lung sections were made using a microtome, dried, deparaffinized using xylene, and rehydrated in a decreasing ethanol series (100-70%). Masson trichrome staining was performed using a Gemini ES Automated Slide Stainer according to established protocols. For GFP-IHC, enzymatic antigen retrieval was performed and antibodies were diluted in Bond primary antibody diluent (Leica Biosystems) at the indicated ratios. Slides were stained with Abcam rabbit anti-GFP polyclonal antibody ab290 and appropriate isotype control antibodies at a 1:1000 dilution, respectively. Slides on which only antigen retrieval was performed were used as additional negative controls. Finally, sections were mounted in Merck Millipore Aquatex medium.

１．４ＲＮＡ調製
全肺ＲＮＡの調製のために、右肺を解剖後直ちに液体窒素で瞬間凍結した。凍結肺は、ＰｅｑｌａｂＰｒｅｃｅｌｌｙｓ２４デュアルホモジナイザーおよび７ｍＬ－セラミック・ビーズ・チューブを使用して、予冷ＱｉａｇｅｎＲＬＴバッファー＋１％β－メルカプトエタノール２ｍＬ中でホモジナイズした。ホモジネート１５０μＬを、その後、５５０μＬのＱＩＡｚｏｌＬｙｓｉｓＲｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。１４０μＬのクロロホルムを加えた後、混合液を１５秒間激しく振とうし、４℃、１２，０００ｘｇで５分間遠心した。３５０μＬの上層のＲＮＡ含有水相を、その後、さらにＱｉａｇｅｎｍｉＲＮｅａｓｙ９６Ｋｉｔを使用してメーカーの説明に従い精製した。精製後、ＲＮＡ濃度はＳｙｎｅｒｇｙＨＴマルチモードマイクロプレートリーダーおよびＴａｋｅ３モジュール（ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。ＲＮＡの品質はＡｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使って評価した。 1.4 RNA Preparation For the preparation of whole lung RNA, the right lung was flash frozen in liquid nitrogen immediately after dissection. Frozen lungs were homogenized in 2 mL of pre-chilled Qiagen RLT buffer + 1% β-mercaptoethanol using a Peqlab Precellys 24 dual homogenizer and 7 mL-ceramic bead tubes. 150 μL of homogenate was then mixed with 550 μL of QIAzol Lysis Reagent (Qiagen). After adding 140 μL of chloroform, the mixture was shaken vigorously for 15 seconds and centrifuged at 12,000×g for 5 minutes at 4°C. 350 μL of the upper RNA-containing aqueous phase was then further purified using the Qiagen miRNeasy 96 Kit according to the manufacturer's instructions. After purification, RNA concentration was measured using a Synergy HT multimode microplate reader and Take3 module (BioTek Instruments). RNA quality was assessed using an Agilent 2100 Bioanalyzer.

１．５ＲＮＡシーケンス
ｃＤＮＡライブラリは、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＲＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔを使用して調製した。簡単に説明すると、２００ｎｇの総ＲＮＡをオリゴｄＴ結合磁性ビーズを使用したポリＡ濃縮に供した。ポリＡを含むｍＲＮＡを約１５０～１６０ｂｐの断片に断片化した。ランダムプライマーでの逆転写の後、第２のｃＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼＩで合成した。末端修復プロセスとアデニン１塩基付加の後、各ｃＤＮＡにホスホ－チミジン－結合インデックスアダプタを結合して、シーケンスフローセルへのサンプルの結合を容易にし、さらにマルチプレックスシーケンシング後のサンプル同定を可能にした。
精製およびｃＤＮＡのＰＣＲエンリッチメントの後、ライブラリを２ｎＭに希釈し、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＳＲＣｌｕｓｔｅｒＫｉｔｖ３－ｃＢｏｔ－ＨＳおよびｃＢｏｔｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して９．６ｐＭでフローセルにクラスター化した。５２ｂｐシングルリード７塩基インデックスリードのシーケンスは、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＳＢＳＫｉｔｖ３－ＨＳを使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００で実施した。サンプル当たり約２千万ロードをシーケンスした。 1.5 RNA-Seq cDNA libraries were prepared using the Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit. Briefly, 200 ng of total RNA was subjected to polyA enrichment using oligo-dT-coupled magnetic beads. The polyA-containing mRNA was fragmented into approximately 150-160 bp fragments. After reverse transcription with random primers, the second cDNA strand was synthesized with DNA polymerase I. After the end repair process and single adenine addition, each cDNA was attached with a phospho-thymidine-linked index adapter to facilitate sample attachment to the sequencing flow cell and further enable sample identification after multiplex sequencing. .
After purification and PCR enrichment of cDNA, the library was diluted to 2 nM and clustered on a flow cell at 9.6 pM using Illumina TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS and cBot instrument. Sequencing of 52 bp single read 7 base index reads was performed on an Illumina HiSeq 2000 using an Illumina TruSeq SBS Kit v3-HS. Approximately 20 million loads were sequenced per sample.

ｍｉＲＮＡについては、ｃＤＮＡライブラリの調製にＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＳｍａｌｌＲＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔを使用した：ＤｉｃｅｒによるｍｉＲＮＡプロセスの結果として、ｍｉＲＮＡは、遊離の５’－リン酸基および３’－ヒドロキシル基を含み、これらは、第１および第２の鎖ｃＤＮＡ合成の前に特異的アダプタを連結するために使用した。ＰＣＲにより、その後ｃＤＮＡは増幅され、インデックスを付けた。ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡＭＰｕｒｅＸＰ磁性ビーズ精製（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して、低分子ＲＮＡを濃縮した。サンプルは最終的に９．６ｐＭでクラスター化され、ｍＲＮＡシーケンスサンプルにスパイクされながらシーケンスされた。 For miRNAs, the Illumina TruSeq Small RNA Library Preparation Kit was used for cDNA library preparation: As a result of the miRNA process by Dicer, miRNAs contain free 5'-phosphate and 3'-hydroxyl groups, which are , was used to ligate specific adapters before first and second strand cDNA synthesis. The cDNA was then amplified and indexed by PCR. Small RNAs were concentrated using Agencourt AMPure XP magnetic bead purification (Beckman Coulter). The samples were finally clustered at 9.6 pM and sequenced while being spiked into the mRNA sequencing samples.

１．６計算プロセスおよびデータ分析（ｍＲＮＡ－ＳｅｑおよびｍｉＲＮＡ－Ｓｅｑデータプロセス）
ｍＲＮＡ－Ｓｅｑリードは、ＳＴＡＲａｌｉｇｎｅｒｖ．２．５．２ａ（Ｄｏｂｉｎｅｔａｌ．，２０１３）を使用して、マウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８．ｐ６およびＥｎｓｅｍｂｌｍｏｕｓｅｇｅｎｅａｎｎｏｔａｔｉｏｎｖｅｒｓｉｏｎ８６（ｈｔｔｐ：／／ｏｃｔ２０１６．ａｒｃｈｉｖｅ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）にマップした。生の配列リードの質はＦａｓｔＱＣｖ０．１１．２使って評価し、アラインメント質メトリックスはＲＮＡＳｅＱＣｖ１．１８（ＤｅＬｕｃａＤ．Ｓ．ｅｔａｌ．，２０１２）を使用して確認した。その後、ｂａｍＵｔｉｌｖ１．０．１１を使用して、ＲＮＡ－Ｓｅｑサンプル中の重複リードをマークし、続けて重複率をｄｕｐＲａｄａｒＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒｐａｃｋａｇｅｖ１．４（Ｓａｙｏｌｓ－Ｐｕｉｇ，Ｓ．ｅｔａｌ．，２０１６）を使用して評価した。リードカウントベクトルはｆｅａｔｕｒｅｃｏｕｎｔｓｐａｃｋａｇｅ（ＬｉａｏＹ．ｅｔａｌ．，２０１４）を使用して生成した。カウント行列への集計後、データはＴｒｉｍｍｅｄｍｅａｎｏｆＭｖａｌｕｅｓ（ＴＭＭ）を使用して正規化し、ｌｏｇ（ｃｏｕｎｔｓｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎ）（ＣＰＭ）にするためｖｏｏｍ変換した（ＲｉｔｃｈｉｅＭ．Ｅ．，２０１５）。ＰＣＡおよび階層クラスタリングのような記述分析を行って、外れ値の可能性を特定した。それぞれの時点における処理および各コントロール間の発現差は、ｐａｄｊ≦０．０５およびａｂｓ（ｌｏｇ₂ＦＣ）≧０．５の有意な閾値でｌｉｍｍａを使用して行った。合計１２４中２サンプルがＱＣ基準に合格しなかったため除外された。 1.6 Computational process and data analysis (mRNA-Seq and miRNA-Seq data process)
mRNA-Seq reads were generated using STAR aligner v. 2.5.2a (Dobin et al., 2013) was used to create the mouse reference genome GRCm38. p6 and Ensembl mouse gene annotation version 86 (http://oct2016.archive.ensembl.org). The quality of raw sequence reads was assessed using FastQC v0.11.2 and alignment quality metrics were confirmed using RNASeQC v1.18 (De Luca DS et al., 2012). Duplicate reads in the RNA-Seq samples were then marked using bamUtil v1.0.11, followed by duplication rate with dupRadar Bioconductor package v1.4 (Sayols-Puig, S. et al., 2016). was used and evaluated. Read count vectors were generated using the feature counts package (Liao Y. et al., 2014). After aggregation into a count matrix, data were normalized using a trimmed mean of M values (TMM) and boom-transformed to log (counts per million) (CPM) (Ritchie M.E., 2015). Descriptive analyzes such as PCA and hierarchical clustering were performed to identify potential outliers. Expression differences between treatments and each control at each time point were performed using limma with significance thresholds of p adj ≦0.05 and abs (log ₂ FC) ≧0.5. Two samples out of a total of 124 were excluded because they did not pass the QC criteria.

ｍｉＲＮＡ－Ｓｅｑリードは、Ｋｒａｋｅｎｐａｃｋａｇｅｖ．１２－２７４（ＤａｖｉｓＭ．Ｐ．Ａ．ｅｔａｌ．，２０１３）を使ってトリミングし、続けてＳＴＡＲａｌｉｇｎｅｒｖ．２．５．２ａを使用してマウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８．ｐ６およびｍｉＲｂａｓｅｖ．２１ｍｏｕｓｅｍｉＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）にマップした。生の配列リードの質は、ＦａｓｔＱＣｖ０．１１．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を使用して評価し、トリミングサイズおよび生物型分布はインハウススクリプトを使用して評価した。カウント行列への集計後、データはＴｒｉｍｍｅｄｍｅａｎｏｆＭｖａｌｕｅｓ（ＴＭＭ）を使用して正規化し、ｌｏｇ（ｃｏｕｎｔｓｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎ）（ＣＰＭ）にするためｖｏｏｍ変換した。ＰＣＡおよび階層クラスタリングのような記述分析を行って、外れ値の可能性を特定した。それぞれの時点における処理および各コントロール間の発現差は、ｐａｄｊ≦０．０５およびａｂｓ（ｌｏｇ₂ＦＣ）≧０．５の有意な閾値でｌｉｍｍａを使用して行った。 miRNA-Seq reads were obtained from Kraken package v. 12-274 (Davis M.P.A. et al., 2013), followed by STAR aligner v. 2.5.2a was used to create the mouse reference genome GRCm38. p6 and miRbase v. 21 mouse miRNA (http://mirbase.org). The quality of raw sequence reads was assessed using FastQC v0.11.2 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), and crop size and biotype distribution were determined in-house. Evaluated using a script. After aggregation into a count matrix, the data were normalized using a trimmed mean of M values (TMM) and boom-transformed to log (counts per million) (CPM). Descriptive analyzes such as PCA and hierarchical clustering were performed to identify potential outliers. Expression differences between treatments and each control at each time point were performed using limma with significance thresholds of p adj ≦0.05 and abs (log ₂ FC) ≧0.5.

１．７統合データ分析（機能的パラメータと発現の相関）
肺機能および肺重量の測定値と、両モデルおよび全時点の全サンプルにわたる各ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡのｖｏｏｍ変換ｌｏｇ(ＣＰＭ)との間のスピアマンのｒｈｏ。 1.7 Integrated data analysis (correlation between functional parameters and expression)
Spearman's rho between lung function and lung weight measurements and the voom-transformed log (CPM) of each miRNA and mRNA across all samples for both models and all time points.

１．８推定ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ標的ペアの決定
ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的を決定するために、段階的アプローチを実施した。まず、低発現のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを発現マトリックスから取り除いた。続いて、ＷＧＣＮＡｖ．１．６０のｃｏｒＡｎｄＰｖａｌｕｅ関数（Ｌａｎｇｆｅｌｄｅｒ＆Ｈｏｒｖａｔｈ，２００８）を使用して、両モデルおよび全時点の全サンプルにおいて、各ｍｉＲＮＡ対各ｍＲＮＡのｖｏｏｍ変換ｌｏｇ(ＣＰＭ)間でスピアマンのｒｈｏを計算した。推定ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡペアに基づく相関セットは、相関≦－０．６である全ての組合せとして定義される。推定ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡペアの配列ベースの予測を追加するために、バイオコンダクターパッケージｍｉＲＮＡｔａｐｖ．１．１０．０／ｍｉＲＮＡｔａｐ．ｄｂｖ．０．９９．１０（Ｐａｊａｋ＆Ｓｉｍｐｓｏｎ，２０１６）で利用可能で最も引用される５つのｍｉＲＮＡ予測アルゴリズム（ＤＩＡＮＡ、Ｍｉｒａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲＤＢ）のうち少なくとも２つで予測された全組合せを配列ベースのペアとした。最終的なｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡペアのセットは、反相関ベースの相互作用ペアと配列ベースの相互作用ペアの交差部分であり、予測数を顕著に減らし、信頼性の高いサブセットとした。 1.8 Determination of putative miRNA-mRNA target pairs To determine the mRNA targets of miRNAs, a stepwise approach was performed. First, low expressed miRNAs and mRNAs were removed from the expression matrix. Subsequently, WGCNA v. Spearman's rho was calculated between the voom-transformed log (CPM) of each miRNA versus each mRNA in both models and all samples for all time points using the corAndPvalue function of 1.60 (Langfelder & Horvath, 2008). A correlation set based on putative miRNA-mRNA pairs is defined as all combinations with correlation ≦-0.6. To add sequence-based prediction of putative miRNA-mRNA pairs, the Bioconductor package miRNAtap v. 1.10.0/miRNAtap. db v. 0.99.10 (Pajak & Simpson, 2016) and all combinations predicted by at least two of the five most cited miRNA prediction algorithms (DIANA, Miranda, PicTar, TargetScan, miRDB) as sequence-based pairs. And so. The final set of miRNA-mRNA pairs was the intersection of anticorrelation-based interaction pairs and sequence-based interaction pairs, significantly reducing the number of predictions and resulting in a high-confidence subset.

１．９マウスーヒトのｍｉＲＮＡ配列の保存性
ｍｉＲＢａｓｅ２１から全てのマウスおよびヒトｍｉＲＮＡについて、シード領域（２から７位）を抽出した。マウスおよびヒトｍｉＲＮＡの全組合せについては、シード領域と成熟間のグローバルアラインメントをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒＢｉｏｓｔｒｉｎｇｓｐａｃｋａｇｅ（ｖ２．４６．０）のペアワイズ・アラインメント関数を使用して計算した。マッチ・スコア１、ミスマッチ・スコア０としたＲＮＡ置換マトリックスを使用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを適用した。ｍｉＲＮＡ候補に２つのカテゴリを割り当て、同じ名前を持つｍｉＲＮＡマウスーヒト・ペアのシード領域でアラインメント・スコアが６のｍｉＲＮＡは「保存」、同じ名前を持つｍｉＲＮＡマウスーヒト・ペアのシード領域でアラインメント・スコアが６未満のｍｉＲＮＡは「非保存」とした。また、各成熟配列のアラインメントのアラインメント・スコアが２０を超えるｍｉＲＮＡはカテゴリ「成熟高い類似度（ｍａｔｕｒｅｈｉｇｈｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」に割り当てた。 1.9 Conservation of Mouse-Human miRNA Sequences Seed regions (positions 2 to 7) were extracted from miRBase 21 for all mouse and human miRNAs. For all combinations of mouse and human miRNAs, global alignment between seed regions and maturation was calculated using the pairwise alignment function of the Bioconductor Biostrings package (v2.46.0). The Needleman-Wunsch algorithm was applied using an RNA substitution matrix with a match score of 1 and a mismatch score of 0. Two categories are assigned to miRNA candidates: miRNAs with an alignment score of 6 in the seed region of a miRNA mouse-human pair with the same name are "preserved", and miRNAs with an alignment score of 6 in the seed region of a miRNA mouse-human pair with the same name are miRNAs with less than In addition, miRNAs with an alignment score of more than 20 in the alignment of each mature sequence were assigned to the category "mature high similarity".

１．１０標的遺伝子セットの遺伝子セットエンリッチメントに基づくｍｉＲＮＡの特性解析
ｍｉＲＮＡの機能解析は、ＭｅｔａｂａｓｅＲｐａｃｋａｇｅｖ．４．２．３および遺伝子セット分類「ｐａｔｈｗａｙｍａｐｓ」、「ｐａｔｈｗａｙｍａｐｆｏｌｄｅｒｓ」、「ｐｒｏｃｅｓｓｎｅｔｗｏｒｋｓ」、「ｍｅｔａｂｏｌｉｃｎｅｔｗｏｒｋｓ」、「ｔｏｘｉｃｉｔｙｎｅｔｗｏｒｋｓ」、「ｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅｓ」、「ｔｏｘｉｃｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ」、「ＧＯｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」、「ＧＯｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、「ＧＯｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ」から予測されたｍＲＮＡ標的にエンリッチメント機能を使用して行った。エンリッチメント機能は、クエリー遺伝子セットとメタベースからの参照セットの重複部分について超幾何学的試験を行う。ｍｉＲＮＡ標的セットの特徴づけに関するデータ検索は、２０１８年３月１２日にメタベース上で行われた。 1.10 Characterization of miRNA based on gene set enrichment of target gene set Functional analysis of miRNA was performed using MetabaseR package v. 4.2.3 and gene set classification “pathway maps”, “pathway map folders”, “process networks”, “metabolic networks”, “toxicity networks”, “disease genes” , "toxic pathologies", "GO processes", The enrichment function was used for the mRNA target predicted from "GO molecular functions" and "GO localizations". The enrichment function performs a hypergeometric test for overlap between the query gene set and the reference set from the metabase. Data searches for miRNA target set characterization were performed on Metabase on March 12, 2018.

１．１１細胞分析におけるｍｉＲＮＡの機能解析
ｍｉＲＮＡは、細胞の炎症促進性サイトカインＩＬ－６の産生および線維化促進性過程の線維芽細胞増殖、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行（ＦＭＴ）、コラーゲン発現、および上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）に対する影響により特徴づけた。図または図の説明で異なる記載がない限り、Ａ５４９、ＮＨＢＥＣ（ヒト正常気管支上皮細胞）またはＮＨＬＦ（ヒト正常肺線維芽細胞）細胞には、ｍｉＲＮＡ単独の場合は２ｎＭ、またはｍｉＲＮＡの組合せの場合は２＋２ｎＭの濃度でｍｉＲＮＡ模倣物を一過性にトランスフェクションした。 1.11 Functional analysis of miRNAs in cell analysis miRNAs are involved in the cellular production of the pro-inflammatory cytokine IL-6 and the pro-fibrotic process of fibroblast proliferation and fibroblast-to-myofibroblast transition (FMT). , collagen expression, and effects on epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Unless otherwise stated in figures or figure legends, A549, NHBEC (human normal bronchial epithelial cells) or NHLF (human normal lung fibroblasts) cells received 2 nM for miRNA alone or for a combination of miRNAs. miRNA mimics were transiently transfected at a concentration of 2+2 nM.

図に示した実験で使用した全てのｍｉＲＮＡ模倣物は、Ｑｉａｇｅｎから３本鎖ｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡｍｉＲＮＡＭｉｍｉｃフォーマットで購入した。ｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡｍｉＲＮＡＭｉｍｉｃの設計には、従来のｍｉＲＮＡミミックを特徴づける２本のＲＮＡ鎖ではなく、３本のＲＮＡ鎖が含まれている。ｍｉＲＮＡ（ガイド）鎖は、ｍｉＲＢａｓｅのアノテーションに対して正確に対応する配列を有する、修飾されていないＲＮＡ鎖である。しかし、パッセンジャー鎖は２本のＬＮＡ強化ＲＮＡ鎖に分けられている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－ａｎｄ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ－ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ａｎｄ－ｃｅｌｌ－ａｎａｌｙｓｉｓ／ｍｉｒｎａ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ａｎａｌｙｓｉｓ／ｍｉｒｃｕｒｙ－ｌｎａ－ｍｉｒｎａ－ｍｉｍｉｃｓ／ｍｉｒｃｕｒｙ－ｌｎａ－ｍｉｒｎａ－ｍｉｍｉｃｓ／＃ｏｒｄｅｒｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。正しく設計されれば、これらの３つのＲＮＡ鎖模倣物は従来の２本鎖ＲＮＡ模倣物と同じくらい強力である。大きな利点は、パッセンジャー鎖のセグメント化された性質により、ｍｉＲＮＡ鎖のみがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされ、２本の相補的パッセンジャー鎖からのｍｉＲＮＡ活性を生じないことである。ｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡｍｉＲＮＡミミックで観察される表現型変化は、従ってミミックによってシミュレートされたｍｉＲＮＡに起因すると考えて差し支えない（ビオチン化ミミックでのｍｉＲＮＡ標的同定の図参照）。 All miRNA mimics used in the experiments shown in the figure were purchased from Qiagen in triple-stranded miRCURY LNA miRNA Mimic format. The miRCURY LNA miRNA Mimic design includes three RNA strands rather than the two RNA strands that characterize traditional miRNA mimics. The miRNA (guide) strand is an unmodified RNA strand with a sequence that corresponds exactly to the miRBase annotation. However, the passenger strand is separated into two LNA-enhanced RNA strands (https://www.qiagen.com/de/products/discovery-and-translational-research/functional-and-cell-analyses is/mirna- functional-analysis/mircury-lna-mirna-mimics/mircury-lna-mirna-mimics/#orderinginformation). If designed correctly, these three RNA strand mimetics are as potent as traditional double-stranded RNA mimetics. A major advantage is that due to the segmented nature of the passenger strand, only the miRNA strand is loaded into the RNA-induced silencing complex (RISC), resulting in no miRNA activity from the two complementary passenger strands. The phenotypic changes observed with the miRCURY LNA miRNA mimic can therefore be attributed to the miRNAs simulated by the mimic (see figure for miRNA target identification with biotinylated mimics).

独特の３本のＲＮＡ鎖デザインは、高親和性ＬＮＡヌクレオチドを２つのパッセンジャー鎖に組み込むことにより可能になる。２本のパッセンジャー鎖の配列、長さ、およびＬＮＡスパイクパターンは、精巧な経験由来の設計アルゴリズムを使用して最適化される。Ｂｒａｍｓｅｎ，Ｊ．Ｂ．ｒａｅｔａｌ．（２００７）ＩｍｐｒｏｖｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｕｓｉｎｇｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｎａｌｌｙｓｅｇｍｅｎｔｅｄｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓ. ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ３５：５８８６－５８９７．ＰＭＩＤ：１７７２６０５７。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．（２００４）ＴｈｅｍｉＲＮＡＲｅｇｉｓｔｒｙ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＤａｔａｂａｓｅＩｓｓｕｅ３２：Ｄ１０９－１１１．３．ｍｉＲＢａｓｅ：ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ．Ｋａｈｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔａｌ．（２００９）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｓｍａｌｌＲＮＡｓｇｌｏｂａｌｌｙｐｅｒｔｕｒｂｓｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｍｉＲＮＡｓ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７（６）：５４９－５５５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１５４３． The unique three-strand RNA strand design is made possible by incorporating high-affinity LNA nucleotides into the two passenger strands. The sequences, lengths, and LNA spike patterns of the two passenger strands are optimized using sophisticated empirical design algorithms. Bramsen, J. B. raet al. (2007) Improved silencing properties using small internally segmented interfering RNAs. Nucleic Acids Research 35:5886-589 7. PMID:17726057. Griffiths-Jones, S. (2004) The miRNA Registry. Nucleic Acids Research Database Issue 32:D109-111.3. miRBase: www. mirbase. org. Kahn, A. A. , et al. (2009) Transfection of small RNAs globally perturbs gene regulation by endogenous miRNAs. Nature Biotechnology 27(6):549-555. doi:10.1038/nbt. 1543.

図２２、２３および２４では、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、およびｍｉＲ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物、ならびに対応するコントロールを使用した：
－ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ：MIMAT0000086: 5'UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
－ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ：MIMAT0000256: 5'AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU
－ｈｓａ－ｍｉＲ－２１２－５ｐ：MIMAT0022695: 5'ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACU
－陰性コントロール４：GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA In Figures 22, 23 and 24, miRNA mimics of miR-29a-3p, miR-181a-5p, and miR-212-5p and corresponding controls were used:
- hsa-miR-29a-3p: MIMAT0000086: 5'UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
- hsa-miR-181a-5p: MIMAT0000256: 5'AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU
- hsa-miR-212-5p: MIMAT0022695: 5'ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACU
- Negative control 4: GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA

他の図に使用された他の全てのｍｉＲＮＡ模倣物も同様にデザインした。従って、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐには配列番号１９の配列が使用され、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐには配列番号１８による配列が使用された。 All other miRNA mimics used in other figures were designed similarly. Therefore, the sequence according to SEQ ID NO: 19 was used for miR-181b-5p, and the sequence according to SEQ ID NO: 18 was used for miR-10a-5p.

後者の条件では、４ｎＭｍｉＲＮＡコントロールを使用した。２４時間後、細胞にＴＧＦβ１を５ｎｇ／ｍＬの濃度で加え、細胞を２４時間（ＩＬ－６、増殖分析およびコラーゲンｍＲＮＡ発現）または７２時間（コラーゲンタンパク質発現、ＦＭＴおよびＥＭＴ分析）インキュベートした。遺伝子発現の測定は、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＰｌｕｓ９６キットを使用して細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＩＬ－６遺伝子発現は、ＴａｑｍａｎｑＰＣＲアッセイ（Ｈｓ００１７４１３１＿ｍ１）で検出した。ＩＬ－６タンパク質は、ＭＳＤＶ－ＰＬＥＸＰｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＰａｎｅｌ１Ｈｕｍａｎｋｉｔを使用して細胞上清で定量した。細胞増殖を評価するために、細胞をＴＧＦβ１の存在下で２４時間増殖させ、ＷＳＴ－１ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ／Ｒｏｃｈｅ）を使用して分析した。ＦＭＴは、上記のようにＮＨＬＦ細胞を増殖させ、その後、固定およびコラーゲン１ａ１の蛍光免疫染色を行うことで評価した。画像は、ＩＮＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ２０００ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍを使用して取得し、コラーゲンを定量し、細胞数（ＤＡＰＩ染色細胞核により同定）で正規化した。ＥＭＴ評価は、ＮＨＢＥＣ細胞およびＥ－カドヘリン免疫染色を使用して、同じ原理で行った。 In the latter condition, a 4 nM miRNA control was used. After 24 hours, TGFβ1 was added to the cells at a concentration of 5 ng/mL and the cells were incubated for 24 hours (IL-6, proliferation analysis and collagen mRNA expression) or 72 hours (collagen protein expression, FMT and EMT analysis). For gene expression measurements, total RNA was extracted from cells using the Qiagen RNeasy Plus 96 kit and reverse transcribed into cDNA using the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific). I did. IL-6 gene expression was detected with Taqman qPCR assay (Hs00174131_m1). IL-6 protein was quantified in cell supernatants using the MSD V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human kit. To assess cell proliferation, cells were grown for 24 hours in the presence of TGFβ1 and analyzed using the WST-1 proliferation assay kit (Sigma/Roche). FMT was assessed by growing NHLF cells as described above, followed by fixation and fluorescent immunostaining for collagen 1a1. Images were acquired using an IN Cell Analyzer 2000 high-content cellular imaging system, collagen was quantified, and normalized by cell number (identified by DAPI-stained cell nuclei). EMT evaluation was performed on the same principle using NHBEC cells and E-cadherin immunostaining.

免疫ブロットは、ノベックス・ゲルを使用し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのバッファー、ＢｉｏＲａｄの電気泳動装置により標準的な方法に従って行った。全ての一次抗体はＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。 Immunoblots were performed using Novex gels, ThermoFisher buffers, and BioRad electrophoresis equipment according to standard methods. All primary antibodies were purchased from Cell Signaling Technology.

細胞分析はヒト患者材料由来の肺上皮細胞または初代肺線維芽細胞のいずれかで行った。従って、例えば遺伝的特徴、環境、疾患／手術の原因、細胞単離など、それぞれの患者ドナーの不均一性により、由来細胞もまた一定の不均一性が内在する。そのため、分析間でわずかなばらつきは起こりうることであり、これが、一定の標準偏差および同じ分析フォーマット間での異なる分析ウインドウを説明する。それでも、初代細胞を使用したのは、それが直接患者材料であり、従ってよりヒト疾患に関連があるからである。 Cellular analyzes were performed on either lung epithelial cells or primary lung fibroblasts derived from human patient material. Therefore, due to the heterogeneity of each patient donor, for example, genetic characteristics, environment, cause of disease/surgery, cell isolation, etc., the derived cells also have a certain degree of heterogeneity. Therefore, slight variations between assays are possible, which explains the constant standard deviation and different assay windows between the same assay formats. Nevertheless, primary cells were used because they are direct patient material and therefore more relevant to human disease.

２．結果
マウスにおけるＡＡＶ－ＴＧＦβ１およびブレオマイシン投与は肺線維化病理を誘導する。ＡＡＶ－ＴＧＦβ１、ブレオマイシン、または適当なコントロール（ＮａＣｌ、ＡＡＶ－スタッファー）の投与後、図１に示すように縦断的な線維症進展を４週間に渡って測定した。マッソントリクローム染色した２１日目肺組織切片の組織学的分析から明らかなように、肺胞中隔の肥厚、細胞外マトリックス沈着の増加、および免疫細胞の存在により特徴づけられる肺線維症表現型がＡＡＶ－ＴＧＦβ１およびブレオマイシン処理動物で明らかであったが、ＮａＣｌおよびＡＡＶ－スタッファーコントトールマウスにはなかった（図２）。疾患動物での肺重量の大きな増加は、異常ＥＣＭ沈着および組織リモデリングをはっきりと確証した。さらに、機能的な結果として、ＴＧＦβ１過剰発現およびブレオマイシン処理の後に肺機能は著しく障害し、それによって線維化ＩＬＤ患者の臨床観察を反映していた。特に、機能的読出しでのブレオマイシン誘導変化はＡＡＶ－ＴＧＦβ１モデルの変化の１週間前に生じたが、非常に類似した表現型が２１日目から明らかであった。 2. Results AAV-TGFβ1 and bleomycin administration in mice induces lung fibrosis pathology. After administration of AAV-TGFβ1, bleomycin, or appropriate controls (NaCl, AAV-stuffer), longitudinal fibrosis evolution was measured over a 4-week period as shown in FIG. 1. Pulmonary fibrosis phenotype characterized by thickening of alveolar septa, increased extracellular matrix deposition, and presence of immune cells, as evidenced by histological analysis of Masson's trichrome-stained 21-day lung tissue sections. was evident in AAV-TGFβ1 and bleomycin-treated animals, but not in NaCl and AAV-stuffer control mice (Figure 2). The large increase in lung weight in diseased animals clearly confirmed abnormal ECM deposition and tissue remodeling. Furthermore, as a functional consequence, lung function was significantly impaired after TGFβ1 overexpression and bleomycin treatment, thereby reflecting clinical observations in fibrotic ILD patients. Notably, although bleomycin-induced changes in functional readouts occurred one week prior to changes in the AAV-TGFβ1 model, a very similar phenotype was evident from day 21.

慢性疾患出現の転写特性解析。肺線維症の２つのモデルにおける疾患進展および進行の根底にある分子経路および遺伝子発現の全体的変化を分析するために、それぞれの動物の肺ホモジネートからＲＮＡを調製し、次世代シーケンス（ＮＧＳ）分析に供した。差次的に発現されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの数を図３に示す。パスウェイ解析（図３Ｃ）では、ブロマイシンモデルで早い時点で損傷および急性炎症関連プロセスのエンリッチメントが予想されが、ＡＡＶモデルにおいて炎症は初期には無く、線維症進展段階でのみ生じた（１４日目以降）。これに対して、リモデリング／ＥＣＭ関連プロセスのエンリッチメントは両方の疾患モデルで似たような様式で約１４日目以降に生じた。 Transcriptional characterization of chronic disease emergence. To analyze global changes in molecular pathways and gene expression underlying disease progression and progression in the two models of pulmonary fibrosis, RNA was prepared from lung homogenates from each animal and subjected to next-generation sequencing (NGS) analysis. Served. The numbers of differentially expressed mRNAs and miRNAs are shown in Figure 3. Pathway analysis (Figure 3C) predicted enrichment of injury and acute inflammation-related processes at early time points in the bromycin model, whereas in the AAV model, inflammation was absent early and only occurred at the advanced fibrosis stage (14 days (after). In contrast, enrichment of remodeling/ECM-related processes occurred in a similar manner in both disease models after about day 14.

臨床的に関連する疾患表現型と関係するｍｉＲＮＡの同定。疾患発症と直接関連しそうなｍｉＲＮＡ候補を同定するために、複数のフィルタ基準を用いた段階的な選択戦略を設定した（図４）。中心となる－線維症関連性－は、その縦断的発現プロファイルが観察された肺機能の低下または肺重量の増加それぞれと強く相関または反相関のいずれかが認められたｍｉＲＮＡのみを選択することにより組み込まれた。さらに、ｍｉＲＮＡ候補は一つのモデルの少なくとも一時点で差次的発現が必要であった。次に、ｍｉＲＮＡは、シード配列および完全配列類似性に基づいて、種の保存性（ヒトに保存対マウスにだけ存在）に従って分類された。得られたｍｉＲＮＡ候補リストは最終的に手作業でキュレーションを行い、２つの疾患モデルで異なる発現を持つ候補および／または発現プロファイルに変動がある候補、ならびにアップレギュレートされるがヒトで標的にならない非保存ｍｉＲＮＡを除いた。文献テキストマインイングの結果から、肺線維症のコンテクストで過去に特許が取得されたｍｉＲＮＡをさらに除外した。最終的なヒットリストを図５に示す。 Identification of miRNAs associated with clinically relevant disease phenotypes. To identify miRNA candidates that are likely to be directly associated with disease development, we set up a stepwise selection strategy using multiple filter criteria (Figure 4). The focus - fibrosis association - was determined by selecting only those miRNAs whose longitudinal expression profile was either strongly correlated or anti-correlated with the observed decline in lung function or increase in lung weight, respectively. incorporated. Furthermore, miRNA candidates required differential expression at least at one time point in one model. The miRNAs were then classified according to species conservation (conserved in humans vs. present only in mice) based on seed sequences and complete sequence similarity. The resulting miRNA candidate list was finally manually curated to identify candidates that are differentially expressed in the two disease models and/or have variable expression profiles, as well as candidates that are upregulated but not targeted in humans. We removed non-conserved miRNAs that did not exist. From the results of literature text mining, we further excluded miRNAs that were previously patented in the context of pulmonary fibrosis. The final hit list is shown in FIG.

ｍｉＲＮＡ標的予測（図６）。ｍｉＲＮＡの機能的役割を特徴づける最初のアプローチとして、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒｐａｃｋａｇｅｍｉＲＮＡｔａｐを介して、ＤＩＡＮＡ、ＭｉＲａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、およびｍｉＲＤＢデータベースを検索し、推定ｍＲＮＡ標的をコンピュータ的に予測した（詳細は材料と方法の項を参照）。５つのデータベースのうち少なくとも２つで予測された標的をさらに検討した。その後、各ｍｉＲＮＡ標的遺伝子セットは、特定疾患関連プロセスのエンリッチメントに関して分析し、図７に特定のｍｉＲＮＡによって標的化された遺伝子の推定的機能を例示している。 miRNA target prediction (Figure 6). As a first approach to characterize the functional roles of miRNAs, we searched the DIANA, MiRanda, PicTar, TargetScan, and miRDB databases and computationally predicted putative mRNA targets via the Bioconductor package miRNAtap (details in Materials and Methods). (see section). Targets predicted in at least two of the five databases were further reviewed. Each miRNA target gene set was then analyzed for enrichment of specific disease-related processes, and FIG. 7 illustrates the putative functions of genes targeted by specific miRNAs.

ｍｉｒ－ＥバックボーンにおけるｍｉＲＮＡの機能性（図１２）。ｍｉｒ－ＥバックボーンのｍｉＲＮＡ配列の機能性を実証するために、３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡの標的配列を有するＧＦＰ発現コンストラクトを使用した。ＨＥＫ－２９３細胞に、１つのｍｉＲＮＡをコードしたプラスミドとＧＦＰ発現コンストラクトを組み合わせて一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから７２時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。陰性コントロール、すなわちＧＦＰの３’ＵＴＲに標的配列を持たないｍｉＲＮＡの蛍光シグナルを１００％に設定し、他の全てのコンストラクトの蛍光シグナルの倍数変化を陰性コントロールと関連付けた。陽性コントロールは、最適なｍｉｒ－Ｅコンストラクトであり、予想通り最も顕著なＧＦＰノックダウンをもたらした。他の全てのコンストラクトも明らかなＧＦＰノックダウンをもたらし、適切に発現しているだけでなく、正確にプロセッシングされていることを示している。ｍｉｒ－Ｅバックボーンにおけるガイド鎖の最適な長さは２２ヌクレオチド（ｎｔ））であり、これが、２３ｎｔのｍｉＲ２１２－５ｐは２２ｎｔだけのｍｉＲ２１２－５ｐほど有効ではない理由を説明し得る。従って、２２ｎｔのｍｉＲ２１２－５ｐは本発明の一つの好ましい実施態様である。 Functionality of miRNAs in the mir-E backbone (Figure 12). To demonstrate the functionality of the miRNA sequences of the mir-E backbone, a GFP expression construct with the miRNA target sequence in the 3'UTR was used. HEK-293 cells were transiently transfected with a combination of a plasmid encoding one miRNA and a GFP expression construct. GFP fluorescence was measured 72 hours after transfection. The fluorescent signal of the negative control, a miRNA without a target sequence in the 3'UTR of GFP, was set to 100%, and the fold change in the fluorescent signal of all other constructs was related to the negative control. The positive control was the optimal mir-E construct, which resulted in the most significant GFP knockdown as expected. All other constructs also resulted in clear GFP knockdown, indicating not only proper expression but also correct processing. The optimal length of the guide strand in the mir-E backbone is 22 nucleotides (nt), which may explain why miR212-5p with 23 nt is not as effective as miR212-5p with only 22 nt. Therefore, 22 nt miR212-5p is one preferred embodiment of the present invention.

ヒト初代肺線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ発現（図１３）。ヒトのコンテクストでｍｉＲＮＡ候補の発現を分析するために、初代ヒト肺線維芽細胞で低分子ＲＮＡのシーケンシングを行った。図１３に示されるように、候補リストの全ｍｉＲＮＡに多様なレベルではあるが強い発現が観察され、それはマウス肺線維症モデルにおける知見をヒトに種変換するという概念を支持している。 miRNA expression in human primary lung fibroblasts (Figure 13). To analyze the expression of miRNA candidates in a human context, we performed small RNA sequencing in primary human lung fibroblasts. As shown in Figure 13, strong expression, albeit at variable levels, was observed for all miRNAs in the candidate list, supporting the concept of translating the findings in the mouse pulmonary fibrosis model to humans.

細胞分析におけるｍｉＲＮＡの機能解析（図１４－２１）。ｍｉＲＮＡ候補の抗線維化機能を実証するために、完全に成熟したｍｉＲＮＡ配列を含む合成ｍｉＲＮＡ模倣物を作製し、線維化リモデリングの重要なメカニズムを反映する細胞分析において一過性のトランスフェクション実験を行った。最初の実験セットでは、５つの選択したｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐ、ｍｉｒ－２１２－３ｐ、ｍｉｒ－２１２－５ｐ）の効果を、Ａ５４９細胞および初代気管支気道上皮細胞において線維化促進ＴＧＦβ刺激の有無で分析した。図１４（Ａ）に示したように、５つのｍｉＲＮＡ模倣物のうちの４つの一過性のトランスフェクションは、よく知られている炎症遺伝子マーカーであるＩＬ６のＴＧＦβ誘導ｍＲＮＡ発現を顕著に減少させた。唯一の例外はｍｉｒ－２１２－３ｐであり、この設定において有意な抗炎症効果は見られなかった。面白いことに、同じ結果が無刺激のＡ５４９細胞でも得られた。さらにタンパク質レベルでのこれらの知見を明確に示すために、細胞培養上清中のＩＬ６発現をＥＬＩＳＡで測定した。これらの実験では、ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐ、およびこれらｍｉＲＮＡ３つの組合せを調べた。図１４（Ｂ）に示すように、各ｍｉＲＮＡならびに３つの組合せの全てで、無刺激およびＴＧＦβ刺激Ａ５４９細胞においてＩＬ６発現の有意な減少を示し、それによってこれらｍｉＲＮＡの抗炎症効果が確認された。ＴＧＦβは、その炎症促進機能の他に、肺線維症における線維化リモデリングの特徴である上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）の誘導因子として中心的役割を果たしている。ＴＧＦβ誘導性ＥＭＴの間、上皮から線維芽細胞様（間葉）細胞表現型への転換のため、気道上皮マーカー遺伝子であるＥ－カドヘリンの発現は減少する。ＴＧＦβ誘導性ＥＭＴに対する選択されたｍｉＲＮＡ候補の潜在的な保護的役割を評価するために、Ｅ－カドヘリン発現の定量のために、ヒト初代気管上皮細胞を使用した細胞分析とハイコンテント細胞イメージング分析を組み合わせた細胞分析を適用した。図１５に示すように、コントロール群と比較してｍｉＲＮＡ処理グループではＥ－カドヘリン発現レベルが有意に高いことから実証されるように、この設定で試験した全てのｍｉＲＮＡはＴＧＦβ介在ＥＭＴ誘導に対して顕著な阻害効果を示した。 Functional analysis of miRNA in cell analysis (Figure 14-21). To demonstrate the anti-fibrotic function of miRNA candidates, we generated synthetic miRNA mimics containing fully mature miRNA sequences and performed transient transfection experiments in cellular assays that reflected important mechanisms of fibrotic remodeling. I did it. In the first set of experiments, we investigated the effects of five selected miRNAs (mir-10a-5p, mir-181a-5p, mir-181b-5p, mir-212-3p, mir-212-5p) in A549 cells and primary Bronchial airway epithelial cells were analyzed with or without profibrotic TGFβ stimulation. As shown in Figure 14(A), transient transfection of four of the five miRNA mimics significantly reduced TGFβ-induced mRNA expression of IL6, a well-known inflammatory gene marker. Ta. The only exception was mir-212-3p, which did not show significant anti-inflammatory effects in this setting. Interestingly, the same results were obtained with unstimulated A549 cells. To further clarify these findings at the protein level, IL6 expression in cell culture supernatants was measured by ELISA. These experiments investigated mir-10a-5p, mir-181a-5p, mir-181b-5p, and combinations of these three miRNAs. As shown in FIG. 14(B), each miRNA as well as all three combinations showed a significant decrease in IL6 expression in unstimulated and TGFβ-stimulated A549 cells, thereby confirming the anti-inflammatory effects of these miRNAs. In addition to its pro-inflammatory function, TGFβ plays a central role as an inducer of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), a hallmark of fibrotic remodeling in pulmonary fibrosis. During TGFβ-induced EMT, expression of the airway epithelial marker gene E-cadherin decreases due to a switch from an epithelial to a fibroblast-like (mesenchymal) cell phenotype. To evaluate the potential protective role of selected miRNA candidates against TGFβ-induced EMT, we performed cell analysis and high-content cell imaging analysis using human primary tracheal epithelial cells for quantification of E-cadherin expression. A combined cellular analysis was applied. As shown in Figure 15, all miRNAs tested in this setting were effective against TGFβ-mediated EMT induction, as demonstrated by the significantly higher E-cadherin expression levels in the miRNA-treated group compared to the control group. It showed a significant inhibitory effect.

ｍｉＲ－１０ａ＋ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐの他にｍｉＲＮＡ組合せも評価したかったため、以前のＥＭＴ分析を繰り返し、図１５Ｂに示す。単独のｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは、肺上皮細胞のＴＧＦβ処理後のＥ－カドヘリンタンパク質発現を再び回復させることができた。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－２１２－５ｐ＋ｍｉＲ１０ａ－５ｐの組合せ、およびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－２１２－５ｐの組合せも、ＥＭＴ分析でＥ－カドヘリン発現の有意な改善を示した。一貫して、最も優れた効果はｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ＋ｍｉＲ１０ａ－５ｐの３つの組合せで観察され、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－１０ａ－５ｐ単独と同様の効果を達成するためのｍｉＲＮＡ投与量の減少を可能にする（図１５Ｂ）。図１５Ａおよび図１５Ｂの間の分析ウインドウのばらつきは、わずかな分析間のばらつきと、異なるドナーからのヒト初代肺上皮細胞の異なる挙動との組合せにより説明できる。それでも、ｍｉＲＮＡ効果の方向およびその有意性は変わらない。 Since we wanted to evaluate miRNA combinations in addition to miR-10a+miR-181a-5p+miR-181b-5p, we repeated the previous EMT analysis and are shown in Figure 15B. miR-181a-5p, miR-181b-5p and miR-212-5p alone were able to restore E-cadherin protein expression after TGFβ treatment of lung epithelial cells. The combinations of miR-181a-5p+miR-212-5p+miR10a-5p and miR-181a-5p+miR-212-5p also showed significant improvement in E-cadherin expression in EMT analysis. Consistently, the best effects were observed with the three combinations of miR-181a-5p + miR-181b-5p + miR10a-5p, with similar effects to miR-181a-5p, miR-181b-5p or miR-10a-5p alone. (Figure 15B). The variation in analysis windows between Figures 15A and 15B can be explained by a combination of small inter-assay variations and different behavior of primary human lung epithelial cells from different donors. Nevertheless, the direction of the miRNA effect and its significance remain unchanged.

気道上皮細胞に加えて、線維芽細胞は、線維化過程に対して関連性の高い細胞型と考えられている。コラーゲンおよび他の細胞外マトリックス構成成分の過剰産生の主要源として作用することにより、線維芽細胞は、肺機能障害および肺の構造的完全性の最終的な消失に関わる肺硬化に直接寄与する。線維芽細胞活性化中のｍｉＲＮＡ候補の機能をさらに調べるために、ヒト初代肺線維芽細胞の無刺激およびＴＧＦβ刺激（線維化促進）条件の下で一過性トランスフェクション実験を行った。機能的指標として、ＩＬ６発現、コラーゲン発現、および線維芽細胞増殖を、ｍｉＲＮＡの有無で評価した。図１６に示すように、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したところ、分析した全てのｍｉＲＮＡはＴＧＦβ存在下及び非存在下でＩＬ６発現の有意な減少を示した。さらに、図１７に示すように、ｍｉｒ－２１２－３ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、およびｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐは、基礎条件およびＴＧＦβ誘導条件の両方で線維芽細胞増殖に対する阻害効果を示した。図１８に示すように、ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐの３つの組合せのみが、コントロール群と比較して、ＴＧＦβ誘導ＦＭＴに対して有意で用量依存的な効果を示した。一方、個々にトランスフェクションした場合、試験したｍｉＲＮＡはどれも有意な効果を示さなかった。それでも、ｍｉＲ－２１２－５ｐは、この線維芽細胞ドナーを用いたこの分析で（図１８）、コラーゲンの傾向的な減少を示した。観察されたｍｉＲ２１２－５ｐによるコラーゲン沈着の傾向的な減少が有意な減少をもたらすのかどうか、また初代細胞を扱うことにより分析変動性が生じるからなのかを明らかにするために、７つの異なる線維芽細胞ドナーとより広いｍｉＲＮＡ用量範囲でＦＭＴ分析を繰り返した（図１９）。 In addition to airway epithelial cells, fibroblasts are considered a highly relevant cell type for fibrotic processes. By acting as a major source of overproduction of collagen and other extracellular matrix components, fibroblasts directly contribute to lung stiffness, which is associated with pulmonary dysfunction and eventual loss of lung structural integrity. To further investigate the function of miRNA candidates during fibroblast activation, we performed transient transfection experiments under unstimulated and TGFβ-stimulated (pro-fibrotic) conditions in human primary lung fibroblasts. As functional indicators, IL6 expression, collagen expression, and fibroblast proliferation were evaluated in the presence or absence of miRNA. As shown in FIG. 16, all miRNAs analyzed showed a significant decrease in IL6 expression in the presence and absence of TGFβ, as measured by qRT-PCR. Furthermore, as shown in Figure 17, mir-212-3p, mir-181a-5p, and mir-181b-5p showed inhibitory effects on fibroblast proliferation under both basal and TGFβ-induced conditions. As shown in Figure 18, only the three combinations of mir-10a-5p, mir-181a-5p and mir-181b-5p had a significant and dose-dependent effect on TGFβ-induced FMT compared to the control group. It was shown to be effective. On the other hand, none of the miRNAs tested showed significant effects when transfected individually. Nevertheless, miR-212-5p showed a trending decrease in collagen in this analysis using this fibroblast donor (Figure 18). To determine whether the observed trend reduction in collagen deposition by miR212-5p results in a significant reduction and whether it is due to analytical variability introduced by working with primary cells, we tested seven different fibroblasts. FMT analysis was repeated with cell donors and a wider miRNA dose range (Figure 19).

図１９は、ＦＭＴ分析におけるＴＧＦβ刺激時のｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐ単独のコラーゲン１沈着に対する効果を示す。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐは傾向的に高濃度でコラーゲン１沈着を低下させた。ｍｉＲ－２１２－５ｐは、を各ｍｉＲＮＡコントロール模倣物と比較して、０．２５ｎＭから、正常およびＩＰＦ－肺線維芽細胞のコラーゲン１沈着著しく減少させた（図１９）。コラーゲン１沈着に加えて、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは、ヒト肺線維芽細胞においてコラーゲン１以外の新たなコラーゲン発現に変化をもたらした（図２０および２１）。ＴＧＦβで刺激すると、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは細胞内コラーゲン１ａ１およびコラーゲン５ａ１を減少させた（図２０Ａ／Ｂ）。ｍｉＲＮＡ陰性コントロールと比較して、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐの組合せは、コラーゲン１ａ１タンパク質発現のさらなる有意な減少を示した（図２０Ａ）。Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ５ａ１の減少に従い、Ｃｏｌ３ａ１ｍＲＮＡ発現も、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、およびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐの組合せによって有意に減少した（図２０Ｃ）。ヒト肺線維芽細胞におけるｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの観察された抗線維化効果がＴＧＦβシグナリングの調節を通して（だけ）ではないことを最終的に実証するために、ｍｉＲＮＡ模倣物を、細胞線維化ニッチを模倣した上皮－線維芽細胞の共培養においても試験した（図２１）。上皮細胞からの線維化促進メディエーターが共培養したヒト肺線維芽細胞を活性化する当該共培養系において、ｍｉＲ－２１２－５ｐは、上皮細胞のＴＧＦβでの前刺激とは関係なく、ヒト肺線維芽細胞でＣｏｌ１ａ１発現を有意に減少させた（図２１）。 Figure 19 shows the effect of miRNA181a-5p and miR-212-5p alone on collagen 1 deposition upon TGFβ stimulation in FMT analysis. miR-181a-5p tended to decrease collagen 1 deposition at higher concentrations. miR-212-5p significantly decreased collagen 1 deposition in normal and IPF-lung fibroblasts from 0.25 nM compared to each miRNA control mimic (Figure 19). In addition to collagen 1 deposition, miR-181a-5p and miR-212-5p altered de novo collagen expression other than collagen 1 in human lung fibroblasts (Figures 20 and 21). Upon stimulation with TGFβ, miR-181a-5p and miR-212-5p reduced intracellular collagen 1a1 and collagen 5a1 (Figure 20A/B). Compared to the miRNA negative control, the combination of miR-181a-5p and miR-212-5p showed a further significant decrease in collagen 1a1 protein expression (FIG. 20A). In accordance with the decrease in Col1a1 and Col5a1, Col3a1 mRNA expression was also significantly reduced by miR-212-5p and the combination of miR-181a-5p and miR-212-5p (FIG. 20C). To conclusively demonstrate that the observed anti-fibrotic effects of miR-181a-5p and miR-212-5p in human lung fibroblasts are not (only) through modulation of TGFβ signaling, miRNA mimics , was also tested in epithelial-fibroblast co-cultures that mimic the cellular fibrotic niche (Figure 21). In this co-culture system, in which pro-fibrotic mediators from epithelial cells activate co-cultured human lung fibroblasts, miR-212-5p stimulates human lung fibroblasts, independent of pre-stimulation of epithelial cells with TGFβ. Col1a1 expression was significantly decreased in blast cells (Figure 21).

図２２は、ＦＭＴ分析におけるＴＧＦβ刺激時のコラーゲン１沈着に対する、単独のｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐ、およびｍｉＲ－２１２－５ｐ、ならびにその組合せの効果を示す。ｍｉＲ－２９ａ－３ｐはコラーゲン沈着を５０％まで有意に減少させ、ｍｉＲ－２１２－５ｐはコラーゲン沈着を７８％まで有意に減少させた。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐは、ｍｉＲ－２９ａとの組合せで改善しうるコラーゲンの傾向的な減少を示し、より高い濃度では５０％減少にもつながった。ｍｉＲ－２９ａ－３ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐの組み合わせは、コラーゲンを８０％まで有意に減少させた。これは、ｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐまたはｍｉＲ－２１２－５ｐの単独ｍｉＲＮＡの用量と比較して、組合せのそれぞれ特定のｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ用量の半分で達成しうることは注目に値する。３つの組合せにおける各ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐのたった１．３３ｎＭの使用でさえ、ｍｉＲＮＡコントロールと比較して、約７０％のコラーゲン減少を有意に達成した（図２２）。 Figure 22 shows the effects of miRNA-29a-3p, miRNA-181a-5p, and miR-212-5p alone, and their combinations, on collagen 1 deposition upon TGFβ stimulation in FMT analysis. miR-29a-3p significantly reduced collagen deposition by 50%, and miR-212-5p significantly reduced collagen deposition by 78%. miR-181a-5p showed a trending decrease in collagen that could be improved in combination with miR-29a, leading to even a 50% decrease at higher concentrations. The combination of miR-29a-3p and miR-212-5p significantly reduced collagen by 80%. It is noteworthy that this can be achieved with half the miRNA dose for each specific miRNA in the combination compared to the dose for the single miRNA of miRNA-29a-3p or miR-212-5p. Even the use of only 1.33 nM of each miRNA, miR-29a-3p, miR-212-5p and miR-181a-5p in three combinations significantly reduced collagen by approximately 70% compared to miRNA control. This was achieved (Figure 22).

初代肺線維芽細胞におけるコラーゲン１沈着に従って、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは細胞内コラーゲン１合成を、特に組み合わせて投与した場合に、大いに阻害する（図２３Ａ、２４）。このＣｏｌ１ａ１タンパク質合成の約５０％の減少は、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ／ｍｉＲ－２１２－３ｐの２つの組合せにｍｉＲ－２９ａ－３ｐを加えることで有意に改善され、結果としてＣｏｌ１ａ１合成の完全な阻害をもたらした。Ｃｏｌ５ａ１（図２３Ｂ、２４）タンパク質合成およびＣｏｌ３ａ１ＲＮＡデノボ合成（図２３Ｃ、２４）については、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの３つの組合せで同じ傾向が観察され、ＴＧＦβ刺激後のこれらコラーゲンサブタイプのより強い阻害を示した。 In accordance with collagen 1 deposition in primary lung fibroblasts, miR-181a-5p and miR-212-5p greatly inhibit intracellular collagen 1 synthesis, especially when administered in combination (FIGS. 23A, 24). This approximately 50% reduction in Col1a1 protein synthesis was significantly improved by adding miR-29a-3p to the two combinations of miR-181a-5p/miR-212-3p, resulting in complete inhibition of Col1a1 synthesis. brought about. For Col5a1 (Figures 23B, 24) protein synthesis and Col3a1 RNA de novo synthesis (Figures 23C, 24), the same trends were observed for the three combinations of miR-29a-3p, miR-181a-5p and miR-212-5p; showed stronger inhibition of these collagen subtypes after TGFβ stimulation.

ウイルスコンストラクトの性能を特徴づけるために、ｍｉＲ－２１２－５ｐ発現カセットを含むＡＡＶ６．２コンストラクト（配列番号９１によるプラスミド由来の配列番号６１参照、図２６参照）の用量を増やしてナイーブマウスをトランスダクションし、これらのマウスをＡＡＶ気管内肺注入後７、１４、２８日後にサクリファイスした。図２５に示すように、ｍｉＲ－２１２－５ｐＡＡＶの用量の増加は、ｍｉＲ－２１２－５ｐ肺発現の用量依存的増加をもたらした（図２５）。７日目に、１ｘ１０¹¹ｖｇのｍｉＲ－２１２－５ｐＡＡＶは、ｍｉＲ－２１２－５ｐの３００倍のアップレグレートをもたらし、それは後の１４日および２８日の時点では３５０倍に増加した。 To characterize the performance of the viral construct, naive mice were transfected with increasing doses of the AAV 6.2 construct containing the miR-212-5p expression cassette (see SEQ ID NO: 61 from plasmid according to SEQ ID NO: 91, see Figure 26). The mice were sacrificed 7, 14, and 28 days after AAV intratracheal lung injection. As shown in Figure 25, increasing doses of miR-212-5p AAV resulted in a dose-dependent increase in miR-212-5p lung expression (Figure 25). At day 7, 1x10 ¹¹ vg of miR-212-5p AAV resulted in a 300-fold upregulation of miR-212-5p, which increased to 350-fold at later 14-day and 28-day time points.

要約すると、ヒト気道上皮細胞およびヒト肺線維芽細胞における機能解析は、選択されたｍｉＲＮＡ候補について、抗炎症、抗増殖および抗線維化効果を証明している。全ての分析フォーマットで最も顕著な効果は、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐおよびｍｉｒ－２１２－５ｐで観察され、一方ｍｉｒ－１０ａ－５ｐおよびｍｉｒ－２１２－３ｐは、前述のｍｉＲＮＡに比べて有効性が低いものの、同様のプロファイルを示した。ＦＭＴ分析では、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐによりポジティブな効果が観察され、一方ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐの３つの組合せはＦＭＴ分析において改善された阻害効果を示し、この組合せの付加的または相乗的効果を示している。全体として、肺上皮細胞に対するｍｉＲ－１８１ａ－５ｐの非常に強い抗線維化効果、および線維芽細胞に対するｍｉＲ－２１２－５ｐの非常に強い抗線維化効果が観察され、このことは、これら２つのｍｉＲＮＡの組み合わせは、肺線維症において最も重要な２つの細胞タイプに影響する非常に強力な抗線維化組合せであることを示唆している。従って、ｍｉＲＮＡ候補の組合せ、および特にｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの模倣物、またはそのそれぞれの模倣物は、単独のｍｉＲＮＡに比べて優れた効率プロファイルを持つ治療アプローチの開発の好ましい選択肢を提供する。さらに、線維化状態下で単独のｍｉＲ－２９ａ－３ｐの公表されているコラーゲン阻害効果を検証できた。ｍｉＲ－２９ａ－３ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐとの２つの組合せ、またはｍｉＲ－２９ａ－３ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとの３つの組み合わせの特定の組合せによって、単独のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ－２１２－５ｐとｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとの２つの組合せに比べて、さらに顕著な抗線維効果をもたらすことを示すことができた。単独での使用に比較して、組合せで伴うｍｉＲＮＡを低用量で使用することにより、抗線維化作用を維持することができ、かつトランスダクションされた細胞における望ましくない／非特異的な効果の減少につながり得る。さらに、ｍｉｒＲ－２９ａ－３ｐと、ｍｉＲ－２１２－５ｐまたはｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐの両方との特定の組合せは、すでに肺高血圧症（ＰＨ）を合併しているか、そうでなければそれを発症するであろうＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦの患者におけるＰＨに対処する可能性を与える。Ｃｈｅｎ，Ｔ．らによって、ｍｉＲ－２１２－５ｐの増加が肺高血圧症マウスモデルにおいてＲＶＳＰおよび肺血管壁リモデリングを減少させることが示された。（超）相加的または相乗的な利点に加えて、３つの組合せは、肺線維症の病因における２つの重要な細胞タイプ、上皮細胞および線維芽細胞での抗線維化効果も兼ねて備えている。肺上皮細胞の形質転換で大変著しい抗線維化効果を有するｍｉＲ－１８１ａ－５ｐと、線維芽細胞活性化およびＥＣＭ沈着の阻害で大きな抗線維化効果を有するｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ２９ａ－３ｐを組み合わせることにより、これら３つのｍｉＲＮＡのトリプルコンビネーションは単独のｍｉＲＮＡに対して生物学的治療スペクトルを増加させる。 In summary, functional analyzes in human airway epithelial cells and human lung fibroblasts demonstrate anti-inflammatory, anti-proliferative and anti-fibrotic effects for selected miRNA candidates. The most pronounced effects in all assay formats were observed for miR-181a-5p, mir-181b-5p and mir-212-5p, while mir-10a-5p and mir-212-3p had a significant effect on the aforementioned miRNAs. showed a similar profile, albeit with lower efficacy. In FMT analysis, a positive effect was observed with miR-10a-5p, miR-181a-5p, miR-181b-5p and miR-212-5p, while mir-10a-5p, mir-181a-5p and mir- The three combinations of 181b-5p showed an improved inhibitory effect in the FMT assay, indicating an additive or synergistic effect of this combination. Overall, we observed a very strong anti-fibrotic effect of miR-181a-5p on lung epithelial cells and a very strong anti-fibrotic effect of miR-212-5p on fibroblasts, which suggests that these two Our results suggest that the miRNA combination is a very potent anti-fibrotic combination that affects the two most important cell types in pulmonary fibrosis. Therefore, combinations of miRNA candidates, and in particular mimetics of miR-181a-5p and miR-212-5p, or their respective mimetics, are preferred for the development of therapeutic approaches with superior efficiency profiles compared to single miRNAs. Provide choices. Furthermore, we were able to verify the published collagen inhibitory effect of miR-29a-3p alone under fibrotic conditions. Specific combinations of the two combinations of miR-29a-3p and miR-212-5p, or the three combinations of miR-29a-3p and miR-212-5p and miR-181a-5p, can induce the release of single miRNAs or It could be shown that the combination of miR-212-5p and miR-181a-5p produced a more pronounced anti-fibrotic effect than the two combinations. Compared to their use alone, the use of lower doses of miRNAs in combination can maintain anti-fibrotic effects and reduce undesirable/non-specific effects in transduced cells. It can lead to Furthermore, certain combinations of mirR-29a-3p and miR-212-5p or both miR-212-5p and miR-181a-5p may be associated with pulmonary hypertension (PH). It offers the possibility of dealing with PH in patients with ILD, PF-ILD or IPF who would otherwise develop it. Chen, T. showed that increased miR-212-5p reduced RVSP and pulmonary vascular wall remodeling in a mouse model of pulmonary hypertension. In addition to (super)additive or synergistic benefits, the three combinations also combine anti-fibrotic effects in epithelial cells and fibroblasts, two important cell types in the pathogenesis of pulmonary fibrosis. There is. miR-181a-5p, which has a very significant anti-fibrotic effect in the transformation of lung epithelial cells, and miR-212-5p and miR29a-3p, which have a strong anti-fibrotic effect in inhibiting fibroblast activation and ECM deposition. In combination, the triple combination of these three miRNAs increases the biological therapeutic spectrum over single miRNAs.

ｍｉＲＮＡの治療適用。新規肺線維症関連ｍｉＲＮＡの発見を治療用途に移すために、ベクターを介する発現に基づくアプローチは、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的配列の長期にわたる発現を可能にすることにより、肺線維症のような慢性疾患に魅力的な機会を提供する。図８に示すように、ｍｉＲＮＡ機能を調節するために、様々なベクターデザイン戦略が利用できる。線維化状態下でダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡの補充のために、ポリメラーゼＩＩプロモーター（例えばＣＭＶ、ＣＢＡ）またはポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６，Ｈ１）を使用したベクターを、単独のｍｉＲＮＡ配列または幾つかのｍｉＲＮＡの組合せの発現に対して適用できる（図８Ａ）。両プロモータークラスも一般にｍｉＲＮＡ発現に対して適用できるが、ポリメラーゼＩＩプロモーターに基づくコンストラクトは細胞型特異的プロモーターの使用を可能にすることによって更なる利点を提供し、それによってより特異的および潜在的に安全なベクターコンストラクトのデザインを可能にする。内因性ｍｉＲＮＡは、いわゆるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとよばれる前駆体分子として発現し、細胞ＲＮＡｉ機構を通して最初にｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに、そして第２段階では成熟した生物学的に活性な形態にプロセシングされる。ベクター由来ｍｉＲＮＡを効率的に成熟させるため、対象配列は内因性前駆体ｍｉＲＮＡとしてまたは成熟ｍｉＲＮＡ配列を外来ｍｉＲＮＡバックボーン例えばｍｉＲ３０ｓｃａｆｆｏｌｄまたはその最適化された形のｍｉＲ－Ｅバックボーン（ＦｅｌｌｍａｎｎＣｅｔａｌ．，２０１３）に組み込んだ人工的ｍｉＲＮＡとしてのどちらかで発現することが可能である。ｍｉＲ－Ｅバックボーンに基づくコンストラクトの例は、下記の例の部分および配列リストの中で提供される。「ガイド位置」と注記があるコンストラクトが好ましい（表１）。配列番号４０～８１では、ｍｉＲ－Ｅバックボーンを使用したｍｉＲＮＡ発現カセットのデザイン例を提供する。配列番号４０～６９では、各ｍｉＲＮＡに対する成熟ｍｉＲＮＡまたは天然ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む発現カセットの例が、個々のｍｉＲＮＡについて記載されているが、配列番号７０～８１はモノシストロン性発現カセットにおける３つの異なるｍｉＲＮＡの組合せが記載されている。与えられた全ての発現カセットは、ＡＡＶベクターバックボーンに埋め込まれ、ＡＡＶ２由来の逆方向末端反復、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、および場合によってはｍｉＲＮＡ配列単数または複数）の上流の高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から構成される。図８Ｂおよび図８Ｃに示すように、線維化状態下でアップレギュレートされるｍｉＲＮＡの機能性を調節するために、２つの異なるベクターデザイン戦略が適用可能である：１）線維化促進性ｍｉＲＮＡに対して特異的に結合し、それによってそれらの機能を阻害するようにデザインされたアンチセンス様分子の発現（図８Ｂ）。各分子は、いわゆるアンチ－ｍｉＲであり、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または人工ｍｉＲＮＡとして発現ベクターに組み込むことができる。ｍｉＲＮＡ補充法と同様に、いくつかのｍｉＲＮＡ標的配列は単一ベクターに組み込むことができ、それによって様々な標的ｍｉＲＮＡの阻害を可能にする。２）ｍｉＲＮＡ結合部位のいくつかのコピーを含むｍＲＮＡ、いわゆるスポンジの発現は、線維化促進性ｍｉＲＮＡを選択的に封鎖し、それによってそれらの機能を阻害することを目標としている（図８Ｃ）。要約すると、様々なベクターデザイン戦略が、肺線維症関連ｍｉＲＮＡの機能的調節（補充または阻害）に利用できる。 Therapeutic applications of miRNA . To translate the discovery of novel pulmonary fibrosis-associated miRNAs into therapeutic applications, vector-mediated expression-based approaches have been proposed to treat chronic diseases such as pulmonary fibrosis by enabling long-term expression of miRNAs or miRNA target sequences. Provide attractive opportunities. As shown in Figure 8, various vector design strategies are available to modulate miRNA function. For the recruitment of miRNAs that are down-regulated under fibrotic conditions, vectors using polymerase II promoters (e.g. CMV, CBA) or polymerase III promoters (e.g. U6, H1) can be used to combine single miRNA sequences or several It can be applied to the expression of combinations of miRNAs (FIG. 8A). Although both promoter classes are generally applicable for miRNA expression, constructs based on polymerase II promoters offer an additional advantage by allowing the use of cell type-specific promoters, thereby allowing for more specific and potentially Enables the design of safe vector constructs. Endogenous miRNAs are expressed as precursor molecules, so-called pri-miRNAs, and are processed through the cellular RNAi machinery, first to pri-miRNAs and, in a second step, to the mature, biologically active form. To efficiently mature vector-derived miRNAs, the sequences of interest can be used as endogenous precursor miRNAs or by incorporating mature miRNA sequences into foreign miRNA backbones, such as the miR30 scaffold or its optimized form, the miR-E backbone (Fellmann C et al., (2013) can be expressed either as an artificial miRNA incorporated into Examples of constructs based on the miRE backbone are provided in the example section and sequence listing below. Constructs annotated with "Guide Position" are preferred (Table 1). SEQ ID NOs: 40-81 provide examples of miRNA expression cassette designs using miR-E backbones. In SEQ ID NOs: 40-69, examples of expression cassettes containing mature miRNAs or native pre-miRNAs for each miRNA are described for individual miRNAs, whereas SEQ ID NOs: 70-81 represent three different expression cassettes in a monocistronic expression cassette. Combinations of miRNAs have been described. All given expression cassettes are embedded in the AAV vector backbone and include a high-sensitivity green fluorescent protein upstream of the AAV2-derived inverted terminal repeats, the CMV promoter, the SV40 polyadenylation signal, and optionally the miRNA sequence(s). (eGFP). As shown in Figures 8B and 8C, two different vector design strategies are applicable to modulate the functionality of miRNAs that are upregulated under fibrotic conditions: 1) profibrotic miRNAs; Expression of antisense-like molecules designed to specifically bind to and thereby inhibit their function (FIG. 8B). Each molecule is a so-called anti-miR and can be incorporated into an expression vector as a short hairpin RNA (shRNA) or an artificial miRNA. Similar to miRNA recruitment methods, several miRNA target sequences can be incorporated into a single vector, thereby allowing inhibition of various target miRNAs. 2) Expression of mRNAs containing several copies of miRNA binding sites, so-called sponges, is targeted to selectively sequester profibrotic miRNAs and thereby inhibit their function (Fig. 8C). In summary, various vector design strategies are available for functional modulation (recruitment or inhibition) of pulmonary fibrosis-associated miRNAs.

前記発現コンストラクトの肺送達のために、非ウイルス性およびウイルス性の遺伝子治療ベクターが適用可能である。しかし、現在利用可能な非ウイルス性送達系、例えばリポソームのようなものと比較して、過去数年間にわたる様々な論文で実証されているように、ウイルスベクターは有効性および組織／細胞型選択性に関して優れた特性が実証済みである。さらに、ウイルスベクターは効力、選択性および安全特性をさらに向上するための工学的方法に大きな可能性をもたらす。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくウイルスベクターは、その優れた前臨床および臨床安全性プロファイルと、様々な標的臓器および完全分化細胞や非***細胞を含む細胞タイプへの非常に効率的かつ安定的な遺伝子送達に基づいて、インビボ遺伝子治療に最も良好なベクター系の１つとして出現した。１９６５年にＡＡＶの原型である血清型ＡＡＶ２の発見以来（Ａｔｃｈｉｓｏｎら）、ヒト、非ヒト霊長類、およびブタ、トリおよびその他の系統発生学的に異なる種から様々なさらなる血清型が同定されてきた。今まで、１００以上の天然ＡＡＶ分離株が報告されており、興味深いことに、これらの分離株は組織向性に関して異なっている。カプシド工学的アプローチを適用することによって、近年、遺伝子治療アプローチに利用可能なＡＡＶベクターのレパートリーがさらに拡大している。Ｌｉｍｂｅｒｉｓら（２００９）による画期的な論文では、肺トランスダクションに関する２７のＡＡＶカプシド変異体および天然血清型の体系的比較が記載されており、Ｌｉｍｂｅｒｉｓら（２００９）による画期的な論文に基づき、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ６．２が局所投与経路（例えば、鼻腔内または気管内投与）後の肺送達に非常に適したカプシドとして同定された。さらに、ＡＡＶ２に基づいて設計されたＡＡＶカプシド変異体（ＡＡＶ２－Ｌ１）は、ベクターの全身投与後に肺への特異的遺伝子送達を可能にする新規ベクターとして最近記載された（Ｋоｒｂｅｌｉｎら、２０１６）。図９に記載の通り、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの標的配列を含む発現ベクターは、５’および３’末端でＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接でき、それによってＡＡＶ２－Ｌ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ６．２で例示されるような各コンストラクトの肺送達に適したＡＡＶカプシドへのパッケージが可能になる。前述のカプシド変異体を使用したＡＡＶを介する肺送達の有効性は、マウス研究でレポーター遺伝子を発現するコンストラクト（ＧＦＰ、ｆＬｕｃ）を使用して、免疫組織化学（図１０Ａ、Ｄ）またはインビボイメージング（図１０Ｂ、Ｃ）によるトランスジーン発現の評価により確認された。組織学的レベルでは、気管支気道上皮細胞、肺胞上皮細胞および実質性細胞はレポーター遺伝子発現で陽性染色され、これらの細胞タイプへの遺伝子送達の成功を示している。さらに、全身送達されたＡＡＶ２－Ｌ１の場合には、定量的なトランスジーン発現は肺内皮細胞でも検出された。トランスジーン発現が最初のベクター投与後６か月まで発現レベルが低下することなく安定していたことは注目に値する（データは示さず）。要約すると、ＡＡＶベクターは、治療用ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的配列を、肺の疾患関連細胞ライプで安定発現させるための非常に魅力的な送達システムを表し、それによってまだ満たされていない医療ニーズのあるＩＰＦおよび他の線維化間質性肺炎に対する新規かつ非常に革新的なマルチターゲット治療方法を提供する。 Non-viral and viral gene therapy vectors are applicable for pulmonary delivery of the expression construct. However, compared to currently available non-viral delivery systems, such as liposomes, viral vectors offer superior efficacy and tissue/cell type selectivity, as demonstrated in various papers over the past few years. Excellent properties have been proven. Furthermore, viral vectors offer great potential for engineering methods to further improve efficacy, selectivity and safety properties. Viral vectors based on adeno-associated virus (AAV) have an excellent preclinical and clinical safety profile and highly efficient and stable delivery to various target organs and cell types, including fully differentiated and nondividing cells. Based on gene delivery, it has emerged as one of the most successful vector systems for in vivo gene therapy. Since the discovery of the prototype AAV, serotype AAV2, in 1965 (Atchison et al.), a variety of additional serotypes have been identified in humans, non-human primates, and pigs, birds, and other phylogenetically distinct species. Ta. To date, more than 100 natural AAV isolates have been reported, and interestingly, these isolates differ with respect to tissue tropism. By applying capsid engineering approaches, the repertoire of AAV vectors available for gene therapy approaches has been further expanded in recent years. A landmark paper by Limberis et al. (2009) describes a systematic comparison of 27 AAV capsid variants and native serotypes for pulmonary transduction, and builds on the landmark paper by Limberis et al. (2009). , AAV5, AAV6 and AAV6.2 were identified as capsids that are highly suitable for pulmonary delivery after topical routes of administration (eg, intranasal or intratracheal administration). Additionally, an AAV capsid variant designed based on AAV2 (AAV2-L1) was recently described as a novel vector that allows specific gene delivery to the lungs after systemic administration of the vector (Korbelin et al., 2016). As shown in Figure 9, expression vectors containing miRNAs or miRNA target sequences can be flanked at the 5' and 3' ends by AAV inverted terminal repeats (ITRs), thereby allowing AAV2-L1, AAV5, AAV6 and AAV6. This allows packaging of each construct into AAV capsids suitable for pulmonary delivery, as exemplified in 2. The efficacy of AAV-mediated pulmonary delivery using the aforementioned capsid variants was demonstrated in mouse studies using constructs expressing reporter genes (GFP, fLuc), immunohistochemistry (Fig. 10A,D) or in vivo imaging (Fig. 10A,D). This was confirmed by evaluation of transgene expression according to FIGS. 10B, C). At the histological level, bronchial airway epithelial cells, alveolar epithelial cells and parenchymal cells stained positive for reporter gene expression, indicating successful gene delivery to these cell types. Furthermore, in the case of systemically delivered AAV2-L1, quantitative transgene expression was also detected in lung endothelial cells. It is noteworthy that transgene expression remained stable without a decrease in expression levels up to 6 months after the first vector administration (data not shown). In summary, AAV vectors represent a very attractive delivery system for stable expression of therapeutic miRNAs or miRNA target sequences in disease-relevant cell types of the lung, thereby addressing the unmet medical needs of IPF. and other fibrotic interstitial pneumonias.

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Claims

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ウイルスベクター。 A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, and the one or more miRNAs comprising a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99. Including viral vectors.

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、
（ｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、または
（ｉｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有する前記ｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、
ウイルスベクター。 A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs;
(i) the two or more miRNAs include a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99 and the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, or (ii) the two or more miRNAs the miRNA comprises the miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99 and the miRNA of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101;
Viral vector.

前記パッケージ化された核酸が３つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記ｍｉＲＮＡが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、請求項１または２に記載のウイルスベクター。 The packaged nucleic acid encodes three or more miRNAs, and the miRNAs have (i) a miRNA fragment having a sequence of SEQ ID NO: 99, and (ii) a miRNA of SEQ ID NO: 17 or a sequence of SEQ ID NO: 100. and (iii) a fragment thereof having a sequence of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101.

前記パッケージ化された核酸が、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードする、請求項３に記載のウイルスベクター。 The viral vector according to claim 3, wherein the packaged nucleic acid encodes an miRNA fragment having a sequence of SEQ ID NO: 99, an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 17, and an miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 19. .

カプシドと、以下をコードするトランスジーンを含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸とを含む、請求項１～４のいずれかに記載のウイルスベクター。
－配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、および
－配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡ。 Viral vector according to any of claims 1 to 4, comprising a capsid and a packaged nucleic acid comprising one or more transgene expression cassettes comprising a transgene encoding:
- at least one miRNA fragment selected from the group consisting of a miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, and a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; miRNA; RNA that inhibits the function of one or more miRNAs.

カプシドと、トランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、
－第１発現カセットが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡとをコードする第１トランスジーンを含み、および
－第２発現カセットが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする第２トランスジーンを含む、
請求項１～５のいずれかに記載のウイルスベクター。 A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid comprising two or more transgene expression cassettes comprising a transgene, the vector comprising:
- the first expression cassette is from the group consisting of an miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, and a fragment thereof having the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; at least one selected miRNA, and - the second expression cassette comprises SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, a second transgene encoding an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs selected from the group consisting of miRNAs 12, 13, 14, 16, 34, 35, and 36;
The viral vector according to any one of claims 1 to 5.

前記ＲＮＡ阻害がＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない、請求項５～６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 5-6, wherein said RNA inhibition is not subject to RNAi processing or RNAi maturation.

前記核酸が偶数個のトランスジーン発現カセットを有する、請求項５～７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 5 to 7, wherein the nucleic acid has an even number of transgene expression cassettes.

前記トランスジーン発現カセットが、プロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含み、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、請求項５～８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 5 to 8, wherein the transgene expression cassette comprises a promoter, a transgene and a polyadenylation signal, the promoters or polyadenylation signals being located opposite each other.

前記ベクターが、組換えＡＡＶベクターである、請求項１～９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 1 to 9, wherein the vector is a recombinant AAV vector.

前記ベクターが、ＡＡＶ－２血清型を有する組換えＡＡＶベクターである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 1 to 10, wherein the vector is a recombinant AAV vector having the AAV-2 serotype.

前記カプシドが、配列番号２９または３０の配列を有する第１タンパク質を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 1 to 11, wherein the capsid comprises a first protein having the sequence SEQ ID NO: 29 or 30.

前記カプシドが、配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一である第１タンパク質を含むが、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の間のアラインメントに１つ以上のギャップが許容される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 said capsid comprises a first protein that is 80% identical to a second protein having the sequence of SEQ ID NO: 82, but one or more gaps are allowed in the alignment between said first protein and said second protein. , the viral vector according to any one of claims 1 to 12.

前記カプシドが、配列番号８２の第２タンパク質と９５％同一である第１タンパク質を含むが、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてみなされる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Claims 1-13, wherein the capsid comprises a first protein that is 95% identical to a second protein of SEQ ID NO: 82, but gaps in alignment between the first protein and the second protein are considered as mismatches. The viral vector according to any one of .

前記ベクターがＡＡＶ５またはＡＡＶ６．２血清型を有する組換えＡＡＶベクターであり、組換えＡＡＶ６．２ベクターのカプシドが、好ましくは配列番号８２の配列を有するカプシドタンパク質を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Any of claims 1 to 14, wherein the vector is a recombinant AAV vector having the AAV5 or AAV6.2 serotype, and the capsid of the recombinant AAV6.2 vector preferably comprises a capsid protein having the sequence SEQ ID NO: 82. The viral vector according to item 1.

パッケージ化された核酸が２本鎖である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 1 to 15, wherein the packaged nucleic acid is double-stranded.

パッケージ化された核酸が１本鎖である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 Viral vector according to any one of claims 1 to 15, wherein the packaged nucleic acid is single-stranded.

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の予防または治療に使用される、請求項１～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic of a disease selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic scleroderma ILD, sarcoidosis, and fibrosarcoma. The viral vector according to any one of claims 1 to 17, used for prevention or treatment.

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法が、それを必要とする患者に請求項１～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む、治療方法。 ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic of a disease selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic scleroderma ILD, sarcoidosis, and fibrosarcoma. 18. A method of treatment, said method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a viral vector according to any one of claims 1 to 17.

医薬品として使用される、請求項１～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。 The viral vector according to any one of claims 1 to 17, which is used as a pharmaceutical.

２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、前記２つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ＡＡＶベクター。 An AAV vector comprising a vector genome encoding two or more miRNAs, the two or more miRNAs comprising an miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99.

２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、ＡＡＶベクター。 An AAV vector comprising a vector genome encoding two or more miRNAs, the two or more miRNAs having a miRNA fragment having a sequence of SEQ ID NO: 99 and a miRNA of SEQ ID NO: 17 or a sequence of SEQ ID NO: 100. An AAV vector comprising a fragment thereof.

前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を含むｍｉＲＮＡと、（ｉｉ）配列番号１７の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とをコードする、請求項２１または２２に記載のＡＡＶベクター。 The vector genome contains (i) miRNA containing the sequence of SEQ ID NO: 99, (ii) miRNA containing the sequence of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, and (iii) a miRNA containing the sequence of SEQ ID NO: 19. 23. The AAV vector according to claim 21 or 22, which encodes a miRNA containing or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101.

前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードする、請求項２３に記載のＡＡＶベクター。 The vector genome encodes (i) an miRNA fragment having a sequence of SEQ ID NO: 99, (ii) a miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 17, and (iii) a miRNA having a sequence of SEQ ID NO: 19. The AAV vector described in 23.

前記ベクターゲノムが、さらに配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする、請求項２１～２４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。 The vector genome is further selected from the group consisting of miRNAs of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 34, 35 and 36. The AAV vector according to any one of claims 21 to 24, encoding an RNA that inhibits the function of one or more miRNAs.

請求項２１～２５のいずれかのＡＡＶベクターを含む、２本鎖プラスミドベクター。 A double-stranded plasmid vector comprising the AAV vector according to any one of claims 21 to 25.

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物とを含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。 A combination of miRNA mimetics for use in a method for preventing and/or treating fibroproliferative diseases, the combination comprising: (i) a miRNA fragment mimetic having the sequence of SEQ ID NO: 99; and (ii) SEQ ID NO: 17 and/or a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、前記ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、ｍｉＲＮＡ模倣物。 A miRNA mimetic of miRNA-212-5p used in a method for preventing and/or treating fibroproliferative diseases, wherein the miRNA mimetic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or Contains an oligomer of nucleotides consisting of the sequence number 99, and the following conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
has
miRNA mimetic, wherein said prevention and/or treatment further comprises the administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17 and/or an miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

前記予防および／または治療が、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、請求項２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 29. A miRNA mimetic for use in the method of claim 28, wherein said prophylaxis and/or treatment comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17.

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、前記ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療は、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、ｍｉＲＮＡ模倣物。 A miRNA mimetic of miRNA-212-5p used in a method for preventing and/or treating fibroproliferative diseases, wherein the miRNA mimetic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or Contains an oligomer of nucleotides consisting of the sequence number 99, and the following conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
has
The miRNA mimetic, wherein said prevention and/or treatment further comprises the administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17.

配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、請求項２９または３０に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 17 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Conditions of:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
31. The miRNA mimetic used in the method according to claim 29 or 30, having the following.

前記予防および／または治療が、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、請求項２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 29. The miRNA mimetic for use in the method of claim 28, wherein said prophylaxis and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、請求項３２に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Conditions of:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
33. The miRNA mimetic used in the method of claim 32, having the following.

前記予防および／または治療が、配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 miRNA mimetic for use in the method according to any one of claims 28 to 33, wherein said prophylaxis and/or treatment further comprises administration of a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 18.

配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、請求項３４に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 The miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 18 is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 18, or comprises an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 18, and the following conditions:
- the oligomer optionally contains nucleotides with chemical modifications that result in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 18;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 18;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
35. The miRNA mimetic used in the method of claim 34, having:

線維増殖性疾患がＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤである、請求項２８～３５のいずれかに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。 The miRNA mimetic used in the method according to any of claims 28 to 35, wherein the fibroproliferative disease is IPF or PF-ILD.

ＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤまたはＩＬＤのような線維増殖性疾患の治療薬の製造のための、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物との使用。 (i) miRNA mimic of the miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99 and (ii) the sequence of SEQ ID NO: 17 for the production of a therapeutic agent for fibroproliferative diseases such as IPF or PF-ILD or ILD. Use of an miRNA miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19 and/or an miRNA mimetic miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19.

配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of a miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 17, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising an miRNA mimetic of a miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, an miRNA mimetic of an miRNA having the sequence SEQ ID NO: 19, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。 miRNA mimetic of a miRNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 99, miRNA mimetic of miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 17, miRNA mimetic of miRNA having the sequence of SEQ ID NO: 19, and a pharmaceutically acceptable carrier. or a diluent.

前記組成物中のｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入される、請求項３８、３９または４０に記載の医薬組成物。 41. The pharmaceutical composition of claim 38, 39 or 40, wherein the miRNA mimetics in the composition are encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs).

前記組成物がイオン化脂質を２５から６５ｍｏｌ％含む、請求項４１に記載の医薬組成物。 42. The pharmaceutical composition of claim 41, wherein the composition comprises 25 to 65 mol% ionized lipid.

前記ＬＮＰの平均粒子径が３０～２００ｎｍである、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 38 to 42, wherein the LNP has an average particle size of 30 to 200 nm.

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；および
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。 (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having;
(b) an miRNA mimic of miRNA181a-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
and (c) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；および
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。 (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having;
(b) an miRNA mimic of miRNA181b-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Contains oligomers of nucleotides, the following conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
and (c) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｃ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；および
（ｄ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。 (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having;
(b) a miRNA mimic of miRNA181a-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
an miRNA mimetic having;
(c) a miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; Contains oligomers of nucleotides and the following conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- the oligomer is optionally conjugated with a lipid to facilitate drug delivery;
and (d) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、請求項３８～４６のいずれかに記載の医薬組成物。 47. The pharmaceutical composition according to any of claims 38 to 46, wherein the miRNA mimetic of miRNA212-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、請求項３８、４０、４１、４２、４４、または４６に記載の医薬組成物。 47. The pharmaceutical composition of claim 38, 40, 41, 42, 44, or 46, wherein the miRNA mimetic of miRNA-181a-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、請求項３９、４０、４１、４２、４５、または４６に記載の医薬組成物。 47. The pharmaceutical composition of claim 39, 40, 41, 42, 45, or 46, wherein the miRNA mimetic of miRNA181b-5p is a double-stranded miRNA mimetic.

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に請求項３８～４９のいずれかに記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、治療方法。 ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic of a disease selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic scleroderma ILD, sarcoidosis, and fibrosarcoma. 50. A method of treatment, said method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition according to any of claims 38-49.

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療薬の製造のための、請求項３８～５０のいずれかに記載の医薬組成物の使用。 ILD, PF-ILD, IPF, connective tissue disease (CTD)-related ILD, rheumatoid arthritis ILD, hypersensitivity pneumonitis with chronic fibrosis (HP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (iNSIP), unclassifiable idiopathic of a disease selected from the group consisting of interstitial pneumonia (IIP), environmental/occupational lung disease, pulmonary hypertension (PH), fibrosing silicosis, systemic scleroderma ILD, sarcoidosis, and fibrosarcoma. Use of a pharmaceutical composition according to any of claims 38 to 50 for the manufacture of a therapeutic medicament.

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。 A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, the one or more miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: A viral vector containing a fragment thereof with 100 sequences.

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、
（ｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、または
（ｉｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡとを含む、
請求項５２に記載のウイルスベクター。 a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs;
(i) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100 and the miRNA of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 101; or (ii) ) the two or more miRNAs include the miRNA of SEQ ID NO: 17 or a fragment thereof having the sequence of SEQ ID NO: 100, and the miRNA of SEQ ID NO: 18;
53. The viral vector according to claim 52.

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。 A viral vector comprising a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding one or more miRNAs, the one or more miRNAs being the miRNA of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: A viral vector containing a fragment thereof having a sequence of 101.

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、請求項５４に記載のウイルスベクター。 a capsid and a packaged nucleic acid, the packaged nucleic acid encoding two or more miRNAs, and the two or more miRNAs having the miRNA of SEQ ID NO: 19 or the sequence of SEQ ID NO: 101. and a fragment thereof having the miRNA of SEQ ID NO: 17 or the sequence of SEQ ID NO: 100.

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物、および／または（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および／または（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。 A combination of miRNA mimetics for use in a method of preventing and/or treating fibroproliferative diseases, the combination comprising (i) a mimetic of an miRNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 99, and/or (ii) A combination of miRNA mimetics comprising a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 17, and/or (iii) a miRNA mimetic having the sequence SEQ ID NO: 19.

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｃ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
および
（ｅ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。 (a) an miRNA mimic of miRNA212-5p, the miRNA mimic being an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, or comprising an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 99, and comprising the following: conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 99;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at corresponding positions (AU and GC) as determined in the sequence of SEQ ID NO: 99; or - said oligomer optionally comprises conjugated with lipids,
an miRNA mimetic having
or (b) an miRNA mimic of miRNA181a-5p, wherein the miRNA mimic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100, or from the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100. Containing oligomers of nucleotides, the following conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequence SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequences of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 100; or - said oligomer facilitates drug delivery. optionally conjugated with a lipid for;
an miRNA mimetic having
or (c) an miRNA mimic of miRNA181b-5p, wherein the miRNA mimic is an oligomer of nucleotides consisting of the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101, or from the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101. containing oligomers of nucleotides with the following conditions:
- said oligomer optionally comprises nucleotides with chemical modifications resulting in non-natural nucleotides exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) determined in the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101;
- said oligomer optionally comprises nucleotide analogues exhibiting base-pairing behavior at the corresponding positions (AU and GC) as determined by the sequences of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 101; or - said oligomer facilitates drug delivery. optionally conjugated with a lipid for;
an miRNA mimetic having
and (e) a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.