JP2023546561A - ウイルスタンパク質および宿主タンパク質の分解のためのキメラコンジュゲートならびに使用方法 - Google Patents
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Abstract
本出願は、必須ウイルスタンパク質またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質を標的とし、それを分解するキメラについて記載する。具体的には、本出願のキメラは、標的タンパク質(例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ(PLpro)、メインプロテアーゼ(Mpro)、もしくは他の非構造タンパク質(例えば、NSP9もしくはNSP12)、または宿主タンパク質、例えば、ブロモドメイン2、ブロモドメイン3、もしくはブロモドメイン4))に結合する部分を、タンパク質分解薬を動員する部分と組み合わせ、それによって、標的タンパク質を分解させる。一部の場合では、キメラは、タンパク質分解薬としてHDM2に係合することによって、それ自体が抗ウイルス活性を有するp53を同時に誘導する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年10月14日に出願された米国仮出願第63/091,769号に基づく優先権の利益を主張し、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年10月14日に出願された米国仮出願第63/091,769号に基づく優先権の利益を主張し、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本明細書は、コンピュータ可読形式(CRF)の配列表のコピーとともに提出されている。CRFは、00530-0409WO1_SL.txtという名称であり、2021年10月14日に作成され、サイズが25,132バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書は、コンピュータ可読形式(CRF)の配列表のコピーとともに提出されている。CRFは、00530-0409WO1_SL.txtという名称であり、2021年10月14日に作成され、サイズが25,132バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、ウイルスタンパク質、例えば、必須ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ(PLpro)、メインプロテアーゼ(Mpro)、他の非構造タンパク質(例えば、NSP9もしくはNSP12)、またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質、例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質(例えば、ブロモドメイン2、ブロモドメイン3、もしくはブロモドメイン4)の分解を標的とするキメラコンジュゲート、すなわち、タンパク質分解標的化キメラ(PROTAC)に関する。本開示はまた、ウイルス感染症、特に、コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置および予防において、そのようなキメラコンジュゲートを使用する方法にも関する。また、ウイルスの成熟および複製を阻害するために、ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ(PLpro)、メインプロテアーゼ(Mpro)、ならびに他の非構造ウイルスタンパク質(例えば、NSP9またはNSP12)を阻害するペプチドも開示される。これらのペプチドは、ウイルス感染症(例えば、コロナウイルス感染症)を処置するために使用することができる。
背景
PLproおよびMproは、SARS-CoV-2などのコロナウイルスを含むRNAウイルスの生活環における必須酵素である。PLproは、ウイルス複製に必要とされる、ウイルスおよび細胞基質におけるペプチドおよびイソペプチド結合を加水分解することによってウイルスポリタンパク質および宿主細胞タンパク質をプロセシングする多官能性システインプロテアーゼである(Baez-Santos, Y.M., et al. J Virol 88, 12511-27 (2014))。Mproは、ウイルスの生活環に必須である成熟タンパク質(NSP5-16)を生じる自己プロセシングタンパク質分解反応において主要な役割を果たす、SARS-CoV-2の主なタンパク質分解プロセシング酵素である(Chang, G.G. Molecular Biology of the SARS-Coronavirus, 115-128 (2009)。コロナウイルス非構造タンパク質、例えば、NSP9およびNSP12は、ウイルス複製に関与する必須タンパク質である。PLproおよびMproのプロテアーゼ活性を阻害し、他のウイルスNSPを阻害する、いくつかの化合物が、開発されている(例えば、Baez-Santos et al. 2014, Jin Z Nature 2020、Anand, K., et al. Science 300, 1763-7 (2003)、Ghosh, A.K. et al., J Med Chem 52, 5228-40 (2009)、Baez-Santos, Y.M., et al. Antiviral Res 115, 21-38 (2015)を参照されたい)。しかしながら、これらの阻害剤は、十分に強力ではなく、したがって、部分的な阻害しか達成されない。ウイルス、例えば、コロナウイルス、例えば、SARS-CoV-2を標的とし、宿主系がCOVID-19などの感染症を撃退するのを可能にする、効率的な治療薬を開発することが急務である。
本開示は、ウイルスタンパク質、例えば、必須ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ(PLpro)、メインプロテアーゼ(Mpro)、他の非構造タンパク質(例えば、NSP9もしくはNSP12)、またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質、例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質(例えば、ブロモドメイン2、ブロモドメイン3、もしくはブロモドメイン4)の分解を標的とするキメラコンジュゲート、すなわち、タンパク質分解標的化キメラ(PROTAC)に関する。本開示はまた、ウイルス感染症、特に、コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置および予防において、そのようなキメラコンジュゲートを使用する方法にも関する。また、ウイルスの成熟および複製を阻害するために、ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ(PLpro)、メインプロテアーゼ(Mpro)、ならびに他の非構造ウイルスタンパク質(例えば、NSP9またはNSP12)を阻害するペプチドも開示される。これらのペプチドは、ウイルス感染症(例えば、コロナウイルス感染症)を処置するために使用することができる。
背景
PLproおよびMproは、SARS-CoV-2などのコロナウイルスを含むRNAウイルスの生活環における必須酵素である。PLproは、ウイルス複製に必要とされる、ウイルスおよび細胞基質におけるペプチドおよびイソペプチド結合を加水分解することによってウイルスポリタンパク質および宿主細胞タンパク質をプロセシングする多官能性システインプロテアーゼである(Baez-Santos, Y.M., et al. J Virol 88, 12511-27 (2014))。Mproは、ウイルスの生活環に必須である成熟タンパク質(NSP5-16)を生じる自己プロセシングタンパク質分解反応において主要な役割を果たす、SARS-CoV-2の主なタンパク質分解プロセシング酵素である(Chang, G.G. Molecular Biology of the SARS-Coronavirus, 115-128 (2009)。コロナウイルス非構造タンパク質、例えば、NSP9およびNSP12は、ウイルス複製に関与する必須タンパク質である。PLproおよびMproのプロテアーゼ活性を阻害し、他のウイルスNSPを阻害する、いくつかの化合物が、開発されている(例えば、Baez-Santos et al. 2014, Jin Z Nature 2020、Anand, K., et al. Science 300, 1763-7 (2003)、Ghosh, A.K. et al., J Med Chem 52, 5228-40 (2009)、Baez-Santos, Y.M., et al. Antiviral Res 115, 21-38 (2015)を参照されたい)。しかしながら、これらの阻害剤は、十分に強力ではなく、したがって、部分的な阻害しか達成されない。ウイルス、例えば、コロナウイルス、例えば、SARS-CoV-2を標的とし、宿主系がCOVID-19などの感染症を撃退するのを可能にする、効率的な治療薬を開発することが急務である。
Anand,K.,ら、Science(2003)300、1763~7
Ghosh,A.K.ら、J Med Chem(2009)52、5228~40
Baez-Santos,Y.M.,ら、Antiviral Res(2015)115、21~38
要旨
本開示は、ウイルスタンパク質またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質の分解を標的とするキメラコンジュゲート(「キメラ」)、すなわち、タンパク質分解標的化キメラ(PROTAC)の特徴付けおよび使用に関する。一部の場合では、これらのウイルスタンパク質は、ウイルスの複製、感染性、または病原性に必須のタンパク質である。そのようなキメラは、任意のRNAウイルスの必須ウイルスタンパク質を分解し、それによって、そのようなRNAウイルスによって引き起こされる感染症を処置することができる。具体的には、本開示のキメラは、必須コロナウイルスタンパク質、例えば、パパイン様プロテアーゼ(PLpro)、メインプロテアーゼ(Mpro)、または別の非構造タンパク質(例えば、NSP9およびNSP12)を分解するために使用することができる。本開示のキメラはまた、ウイルス病原性に関与する宿主タンパク質、特に、ブロモドメイン2、ブロモドメイン3、およびブロモドメイン4(それぞれ、BRD2、BRD3、およびBRD4)の分解も標的化され得る。例えば、本開示は、図7および14Aに示される分子のそれぞれを包含する。
本開示は、ウイルスタンパク質またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質の分解を標的とするキメラコンジュゲート(「キメラ」)、すなわち、タンパク質分解標的化キメラ(PROTAC)の特徴付けおよび使用に関する。一部の場合では、これらのウイルスタンパク質は、ウイルスの複製、感染性、または病原性に必須のタンパク質である。そのようなキメラは、任意のRNAウイルスの必須ウイルスタンパク質を分解し、それによって、そのようなRNAウイルスによって引き起こされる感染症を処置することができる。具体的には、本開示のキメラは、必須コロナウイルスタンパク質、例えば、パパイン様プロテアーゼ(PLpro)、メインプロテアーゼ(Mpro)、または別の非構造タンパク質(例えば、NSP9およびNSP12)を分解するために使用することができる。本開示のキメラはまた、ウイルス病原性に関与する宿主タンパク質、特に、ブロモドメイン2、ブロモドメイン3、およびブロモドメイン4(それぞれ、BRD2、BRD3、およびBRD4)の分解も標的化され得る。例えば、本開示は、図7および14Aに示される分子のそれぞれを包含する。
本開示はまた、ウイルス感染症、特に、コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症(例えば、COVID-19)の処置において、そのようなキメラを使用する方法についても記載する。本開示のキメラは、ウイルスタンパク質または宿主タンパク質を標的とする部分(例えば、ペプチド、ステープルペプチド(stapled peptide)、小分子、ウォーヘッド(warhead)で誘導体化された小分子、またはヌクレオチドアナログ)を、タンパク質分解を誘導する部分(例えば、タンパク質分解薬(protein degrader)に結合するか、もしくはそれを動員する、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子)と組み合わせる。したがって、そのようなキメラは、目的とされる任意のウイルスタンパク質(例えば、コロナウイルスPLpro、Mpro、NSP9、NSP12など)またはウイルス病原性に関与する任意の宿主タンパク質(例えば、BRD2、BRD3、BRD4など)を標的とするために使用することができる、二官能性ステープルペプチド-小分子コンジュゲート、ペプチド-小分子コンジュゲート、ステープルペプチド-ペプチドコンジュゲート、ペプチド-ステープルペプチドコンジュゲート、ステープルペプチド-ステープルペプチドコンジュゲート、ペプチド-ペプチドコンジュゲート、小分子-ステープルペプチドコンジュゲート、および小分子-小分子コンジュゲートなどであり得る。
本開示は、目的とされるウイルスタンパク質(例えば、コロナウイルスPLpro、Mpro、NSP9、NSP12など)またはウイルス病原性に関与する任意の宿主タンパク質(例えば、BRD2、BRD3、BRD4など)の分解だけでなく、HDM2および/またはHDMXと複合体を形成していないp53タンパク質の量の増加も行うための、組成物および方法を提供する。これにより、p53に媒介される、ウイルス複製および/または病原性の抑制が可能となる。したがって、本組成物は、抗ウイルス(例えば、抗SARS)活性の相加的または相乗的増加を提供する。
ウイルスタンパク質、例えば、MproおよびNSP9に結合し、それを阻害することができる、ペプチドも開示される。
第1の態様では、本開示は、第2の部分に結合している第1の部分を含み、第1の部分および第2の部分が、互いに直接的に結合しているか、またはリンカーを介して互いに結合している、キメラを特徴とする。第1の部分は、分解について標的化される第1のタンパク質に結合する。一部の場合では、第1のタンパク質は、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルス非構造タンパク質(NSP)、またはブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質から選択される。第2の部分は、第2のタンパク質に結合し、第2のタンパク質は、「タンパク質分解薬」であるか、またはそれを動員する。一部の場合では、第2のタンパク質は、E3ユビキチンリガーゼである。
別の態様では、本開示は、直接的またはリンカーを介して第2の部分に結合している、ウイルスタンパク質(Mpro、PLpro、NSP9、NSP12)または宿主タンパク質(例えば、BRD2、BRD3、もしくはBRD4)に結合するための手段を含むキメラに関する。第2の部分は、第2のタンパク質に結合し、第2のタンパク質は、「タンパク質分解薬」であるか、またはそれを動員する。一部の場合では、第2のタンパク質は、E3ユビキチンリガーゼである。
別の態様では、本開示は、直接的にまたはリンカーを介して、E3リガーゼに結合する手段(例えば、HDM2、VHL、セレブロン、XIAP、cIAP、COP1)に結合している、分解について標的化される第1のタンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルス非構造タンパク質(NSP)、またはブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質)に結合する第1の部分を提供する。
一部の場合では、第1の部分および第2の部分は、リンカーを介して互いに結合している。例えば、リンカーは、ペプチドリンカー、化学リンカー、グリシン-セリンリンカー、例えば、(G4S)3(配列番号26)もしくは(G4S)5(配列番号27)、ベータ-アラニン(Z)リンカー、ベータ-アラニンおよびアラニン(ZA)リンカー、またはポリエチレングリコールリンカーであり得る。
ある特定の場合では、第1の部分は、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含む。
一部の場合では、コロナウイルスプロテアーゼは、パパイン様プロテアーゼ(PLpro)、またはメインプロテアーゼ(Mpro)であり、コロナウイルスNSPは、NSP9またはNSP12であり、BETタンパク質は、ブロモドメイン2(BRD2)、ブロモドメイン3(BRD3)、またはブロモドメイン4(BRD4)である。
1つの場合では、コロナウイルスプロテアーゼは、PLproであり、第1の部分は、PLproに結合する。PLproに結合する第1の部分は、PLpro阻害剤であり得る。一部の場合では、PLpro阻害剤は、GRL-0617もしくはそのPLpro結合性アナログ、ジスルフィラム、またはPLpro結合性チオプリンアナログである。
ある特定の場合では、コロナウイルスプロテアーゼは、Mproであり、第1の部分は、Mproに結合する。一部の場合では、Mpro阻害剤は、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、ASC09、ASC09F、GC376、GC813、エブセレンカルボン酸、またはペプチドである。ある特定の場合では、ペプチドは、配列番号2または配列番号3に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ペプチドは、Mproに結合し、それを阻害する。ある特定の場合では、ペプチドは、1~5個のアミノ酸置換を除いて、配列番号2または配列番号3に記載のアミノ酸配列を含み、ペプチドは、Mproに結合し、それを阻害する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがMproに結合し、それを阻害する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
一部の場合では、BETタンパク質は、BRD4であり、第1の部分は、BETタンパク質に結合する。一部の場合では、BETタンパク質に結合する第1の部分は、BETタンパク質阻害剤である。ある特定の場合では、BETタンパク質阻害剤は、JQ1、ABBV-075、I-BET151、I-BET726、OTX015、もしくはPFI-1、またはBRD4、BRD3、および/もしくはBRD2に結合するそれらのアナログである。
一部の場合では、コロナウイルスNSPは、NSP9であり、第1の部分は、NSP9に結合する。一部の場合では、NSP9に結合する第1の部分は、NSP9阻害剤である。ある特定の場合では、第1の部分は、配列番号4または配列番号5に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、ペプチドは、NSP9に結合する。ある特定の場合では、ペプチドは、1~5個のアミノ酸置換を除いて、配列番号4または配列番号5に記載のアミノ酸配列を含み、ペプチドは、NSP9に結合する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがNSP9に結合する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
ある特定の場合では、コロナウイルスNSPは、NSP12であり、第1の部分は、NSP12に結合する。一部の場合では、NSP12に結合する第1の部分は、NSP12阻害剤である。ある特定の場合では、第1の部分は、レムデシビル酸もしくはNSP12に結合するそのアナログ、またはソホスブビル酸もしくはNSP12に結合するそのアナログである。
一部の場合では、第2のタンパク質は、ヒト二重微小染色体(human double minute)2(HDM2)、フォンヒッペルリンダウ(VHL)、セレブロン、X連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、細胞アポトーシス阻害タンパク質(cellular inhibitor of apoptosis protein)(cIAP)、または構成的光形態形成(Constitutive photomorphogenic)1(COP1)である。一部の場合では、第2の部分は、タンパク質分解薬に結合するか、またはそれを動員する、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子を含む。一部の場合では、第2の部分は、小分子であるセレブロン結合性部分を含む。一部の場合では、小分子は、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、およびセレブロンに結合するそれらのアナログからなる群より選択される。一部の場合では、第2の部分は、サリドマイド部分を含む。1つの場合では、サリドマイド部分は、以下に提供される構造:
またはそのセレブロン結合性アナログ
を含む。
を含む。
一部の場合では、第2の部分は、必要に応じてVH 032およびそのVHL結合性アナログからなる群より選択される、VHL結合性部分を含む。ある特定の場合では、VHL結合性部分は、以下の構造:
またはそのVHL結合性アナログ
を含む。
を含む。
一部の場合では、第2の部分は、HDM2結合性部分を含む。ある特定の場合では、HDM2結合性部分は、HDM2および/またはHDMXに結合する、p53のトランス活性化ドメインのペプチド、またはステープルペプチド、または他の方法で化学的に安定化されたペプチドを含む。一部の場合では、HDM2結合性部分は、ATSP-7041、SP645、またはそのHDM2結合性バリアントであるステープルペプチドである。
ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列LTF(R8)EYWAQ#(S5)SAA(配列番号7)を含み、ここで、(R8)は、(R)-2-(7’-オクテニル)アラニンであり、#は、シクロブチルアラニンであり、(S5)は、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニン、またはそのHDM2結合性バリアントである。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列番号7に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号7に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸が置換されていない、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号7に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの1つまたは複数が、保存的アミノ酸と置換されている、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換を除いて、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがHDM2に結合する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列LTF(R8)EYWAQL(S5)SAA(配列番号1)を含み、ここで、(R8)は、(R)-2-(7’-オクテニル)アラニンであり、#は、シクロブチルアラニンであり、(S5)は、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニン、またはそのHDM2結合性バリアントである。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列番号1に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号1に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸が置換されていない、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号1に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの1つまたは複数が、保存的アミノ酸と置換されている、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換を除いて、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、HDM2に結合する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがHDM2に結合する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
ある特定の場合では、第2の部分は、SM-1295、SM-1280、またはそのcIAP結合性アナログであるcIAP結合性部分を含む。
一部の場合では、第2の部分は、WD40リピートタンパク質に結合するペプチドであって、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるペプチドを含む。ペプチドは、WD40リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含む。改変バージョンは、天然結合コンセンサス配列内に、少なくとも1個のアミノ酸置換、少なくとも1個のアミノ酸欠失、少なくとも1個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む。ある特定の場合では、WD40リピートタンパク質は、E3ユビキチンリガーゼHDM2またはVHLの基質アダプターである。一部の場合では、天然結合コンセンサス配列、配列番号14もしくは15、またはそのバリアント、バリアントが、1~6個のアミノ酸の位置においてコンセンサス配列とは異なる。
ある特定の場合では、第2の部分は、COP1結合性部分を含む。一部の場合では、COP1結合性部分は、トリブルズシュードキナーゼ(Tribbles Pseudokinase)1(Trib1)ペプチドまたはそのCOP1結合性バリアントであるペプチドである。一部の場合では、ペプチドは、配列DQIVPEY(配列番号6)、または配列番号6に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
一部の場合では、タンパク質分解薬は、第1のタンパク質の分解を促進する。例えば、E3ユビキチンリガーゼは、第1のタンパク質のユビキチン化および分解を促進する。
別の態様では、本開示は、図7または図14Aに示される分子のうちのいずれか1つの構造を有する分子を含むキメラに関する。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示されるペプチドまたはキメラと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。一部の場合では、医薬組成物は、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内投与のために製剤化される。
さらに別の態様では、本開示は、コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。
別の態様では、本開示は、コロナウイルスのウイルス複製の遮断およびそのウイルス感染性の低減の両方を、それを必要とする対象において行うための方法を特徴とする。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。一部の場合では、コロナウイルスは、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、またはSARS-CoV-2である。
別の態様では、本開示は、SARS-CoVまたはSARS-CoV-2の複製の遮断を、それを必要とする対象において行うための方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。
別の態様では、本開示は、RNAウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための方法を特徴とする。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。
一部の場合では、上述の方法は、対象に、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、IL-6阻害剤、IL-1阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン-ベータ、およびイカチバントからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を投与するステップをさらに含み得る。
一部の場合では、対象は、ヒト、霊長類、コウモリ、トリ、マウス、シチメンチョウ、ウシ、ブタ、ネコ、およびイヌからなる群より選択される。1つの場合では、対象は、ヒトである。
別の態様では、本開示は、配列番号2もしくは3に記載のアミノ酸配列、またはそのバリアント(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、もしくは7個のアミノ酸置換もしくは欠失により配列番号2もしくは3とは異なるペプチド)を含むペプチドであって、Mproに結合し、それを阻害する、ペプチドを提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号2または3に記載のアミノ酸配列を含み、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化(例えば、ステープル、ステッチ)ペプチドであって、少なくとも2個のアミノ酸置換により、3個または6個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、ペプチドが、Mproに結合し、それを阻害する、安定化ペプチドを特徴とする。アミノ酸置換により、3個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられる場合、非天然アミノ酸は、いずれも、S5である。アミノ酸置換により、6個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられる場合、非天然アミノ酸は、それぞれ、R8[(R)-2-(7’-オクテニル)アラニン]およびS5[(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニン]、またはR5[(R)-2-(4’-ペンテニル)アラニン]およびS8[(S)-2-(7’-オクテニル)アラニン]である。
一部の場合では、ペプチドまたは安定化ペプチドは、50個未満、40個未満、35個未満、30個未満、25個未満、24個未満、23個未満、または21個未満のアミノ酸の長さである。
別の態様では、本開示は、配列番号4もしくは5に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを含むペプチドであって、NSP9に結合する、ペプチドを特徴とする。一部の場合では、ペプチドは、NSP9の二量体化を阻害する。
別の態様では、本開示は、配列番号4または5に記載のアミノ酸配列を含み、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化(例えば、ステープル、ステッチ)ペプチドであって、少なくとも2個のアミノ酸置換により、3個または6個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、ペプチドが、NSP9に結合する、安定化ペプチドを提供する。一部の場合では、安定化ペプチドは、NSP9の二量体化を阻害する。
一部の場合では、ペプチドまたは安定化ペプチドは、50個未満、40個未満、35個未満、30個未満、25個未満、24個未満、23個未満、22個未満、または21個未満のアミノ酸の長さである。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示されるペプチドまたは安定化ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
さらに別の態様では、本開示は、コロナウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、安定化ペプチド、または医薬組成物を投与するステップを含む。一部の場合では、対象は、ヒト対象である。一部の場合では、対象は、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、またはウシである。
本開示はまた、MproまたはNSP9を阻害するための手段と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も特徴とする。
特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載するものと同様のまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書において記載する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本出願がコントロールすることになる。材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
疑いがあればそれを回避するために、「一部の実施形態では」、「ある特定の実施形態では」、「ある特定の場合では」、「一部の場合では」、「さらなる実施形態では」、「一実施形態では」、および「さらなる実施形態では」などの表現は、本明細書に記載される実施形態のいずれも、それらの実施形態の特徴のそれぞれを組み合わせることを念頭に読み取られるように、ならびに本開示が、それらの実施形態の特徴の組合せが一実施形態において詳細に説明されているのと同じように取り扱われる必要があるように、使用および意図されることが強調される。同じことが、添付の特許請求の範囲および実施例において例証されている実施形態および特徴の任意の組合せにも当てはまり、これらはまた、説明において開示される対応する実施形態からの特徴と組み合わされることも意図されており、一貫性および簡潔さのみを目的として、実施形態は、従属性によって特徴づけられているが、実際に、(多重)従属性に起因して結び付けることができるそれぞれの実施形態および特徴の組合せは、文字通り開示されていると認識されるものであり、さまざまな選択肢の中から選ばれたものとして解釈されるものではない。この文脈において、当業者であれば、実施例において開示されている実施形態および特徴が、そこで例証されているものと同じ機能を有する均等物に一般化されるよう意図することを、認識するであろう。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
詳細な説明
本開示は、タンパク質分解標的化キメラ(PROTAC)、例えば、ステープルペプチドタンパク質分解標的化キメラ(SP-PROTAC)を使用して、ウイルスタンパク質(例えば、ウイルス病原性にとって重要な必須ウイルスタンパク質)を分解することができるという発見に基づく。一部の場合では、これらのPROTACは、宿主細胞においてp53の上昇を同時に誘導して、ウイルス複製および病原性を妨げる。本開示は、E3ユビキチンリガーゼを、RNAウイルス(例えば、コロナウイルス)タンパク質標的に近接させ、分解を誘導する(例えば、治療目的で)分子を特徴とする。分解のためのウイルス標的は、任意のウイルスタンパク質(例えば、必須ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスプロテアーゼもしくは他の非構造タンパク質(NSP))、またはウイルス病原性を促進する宿主タンパク質(例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質))であり得る。一部の場合では、ウイルスタンパク質は、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ(PLpro)、またはメインプロテアーゼ(Mpro)であり、コロナウイルスNSPは、NSP9またはNSP12である。ある特定の場合では、BETタンパク質は、ブロモドメイン2(BRD2)、ブロモドメイン3(BRD3)、またはブロモドメイン4(BRD4)である。他の場合では、宿主タンパク質は、Sec61、小胞体膜タンパク質トランスロコンである。
本開示は、タンパク質分解標的化キメラ(PROTAC)、例えば、ステープルペプチドタンパク質分解標的化キメラ(SP-PROTAC)を使用して、ウイルスタンパク質(例えば、ウイルス病原性にとって重要な必須ウイルスタンパク質)を分解することができるという発見に基づく。一部の場合では、これらのPROTACは、宿主細胞においてp53の上昇を同時に誘導して、ウイルス複製および病原性を妨げる。本開示は、E3ユビキチンリガーゼを、RNAウイルス(例えば、コロナウイルス)タンパク質標的に近接させ、分解を誘導する(例えば、治療目的で)分子を特徴とする。分解のためのウイルス標的は、任意のウイルスタンパク質(例えば、必須ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスプロテアーゼもしくは他の非構造タンパク質(NSP))、またはウイルス病原性を促進する宿主タンパク質(例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質))であり得る。一部の場合では、ウイルスタンパク質は、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ(PLpro)、またはメインプロテアーゼ(Mpro)であり、コロナウイルスNSPは、NSP9またはNSP12である。ある特定の場合では、BETタンパク質は、ブロモドメイン2(BRD2)、ブロモドメイン3(BRD3)、またはブロモドメイン4(BRD4)である。他の場合では、宿主タンパク質は、Sec61、小胞体膜タンパク質トランスロコンである。
本開示は、ウイルスタンパク質標的を標的とする(例えば、ウイルスタンパク質(例えば、必須ウイルスタンパク質)またはウイルス病原性を促進する宿主タンパク質に結合する)第1の部分を、「タンパク質分解薬」であるかまたはそれを動員するタンパク質に結合する第2の部分(例えば、リガンド)と組み合わせることによって、タンパク質分解を誘導する部分としての機能を果たすキメラを提供する。例えば、第2の部分は、標的のユビキチン化を触媒する酵素または複合体を動員し、このようにして分解の標的を標識し、それが、プロテアソームによって分解される。一部の場合では、「タンパク質分解薬」は、ウイルスタンパク質をユビキチン化し、そうしてそれを分解の標的とするE3リガーゼである。
第1の部分は、必須ウイルスタンパク質または宿主タンパク質に結合する、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチドもしくはステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含み得る。一部の場合では、第1の部分は、PLpro結合剤、例えば、GRL-0617もしくはそのPLpro結合性アナログ、ジスルフィラム、またはPLpro結合性チオプリンアナログである。他の場合では、第1の部分は、Mpro結合剤、例えば、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、ASC09、GC376、GC813、エブセレンカルボン酸、または配列番号2もしくは配列番号3に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含むペプチドである。一部の場合では、第1の部分は、NSP9結合剤、例えば、配列番号4または配列番号5に記載の配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むペプチドである。他の場合では、第1の部分は、NSP12結合剤、例えば、レムデシビル酸、ソホスブビル酸、またはこれらのアナログである。ある特定の場合では、第1の部分は、BETタンパク質結合剤、例えば、JQ1、ABBV-075、I-BET151、I-BET726、OTX015、もしくはPFI-1、またはこれらのアナログである。他の場合では、第1の部分は、Sec61タンパク質結合剤、例えば、PS3061またはそのアナログである。
第2の部分は、E3ユビキチンリガーゼに結合するかもしくはそれを動員するリガンド(例えば、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子)、またはE3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるWD40リピートタンパク質に結合するペプチドを含み得る。E3ユビキチンリガーゼは、ヒト二重微小染色体2(HDM2)、フォンヒッペルリンダウ(VHL)、セレブロン、X連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、細胞アポトーシス阻害タンパク質(cIAP)、または構成的光形態形成1(COP1)であり得る。ある特定の場合では、HDM2結合性部分は、HDM2および/もしくはHDMXに結合するp53のトランス活性化ドメインのペプチドもしくはステープルペプチド、または小分子(例えば、ヌトリン-3aもしくはヌトリン-3aの誘導体、例えば、RG7112およびRG7388(イダサヌトリン(Idasanutlin)))もしくはそのHDM2結合性アナログを含み得る。一部の場合では、セレブロン結合性部分は、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、またはそのセレブロン結合性アナログである。他の場合では、VHL結合性部分は、VH 032またはそのVHL結合性アナログである。一部の場合では、XIAP結合性部分は、A410099.1またはそのXIAP結合性アナログである。ある特定の場合では、cIAP結合性部分は、SM-1295もしくはSM-1280、またはそのcIAP結合性アナログである。他の場合では、COP1結合性部分は、トリブルズシュードキナーゼ1(Trib1 -UniProtKB - Q96RU8)に由来する8~50個のアミノ酸の配列のペプチドまたはステープルペプチドを含み得る。分解薬タンパク質に効果的に結合し、それを動員するペプチドまたは小分子を、必須ウイルスタンパク質またはウイルス病原性を補助する宿主タンパク質を標的とする小分子、ペプチド、またはヌクレオチドアナログと組み合わせることによって、この新規のクラスのデグロンキメラは、ウイルス感染症と闘う新規な化合物を提供する。一部の場合では、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症、例えば、SARS-CoV-2である。本開示はまた、記載されるデグロンキメラを含む医薬組成物も提供する。さらに、本開示は、記載されるそのようなキメラおよび組成物を使用して、ウイルス感染症を処置し、ウイルス複製を遮断し、ウイルス感染性を低減させる、方法を提供する。PLproはまた、宿主免疫系を回避するウイルス機序にも関与するため、本開示のキメラの重要な利点は、それらが、ウイルス複製の遮断および免疫系が感染細胞を殺滅させる能力の回復の両方を行うように設計されていることである。
本開示に包含されるキメラの非限定的な例には、図7および14Aに示される分子のそれぞれが含まれる。
I.分解について標的化される第1のタンパク質
分解について標的化される第1のタンパク質は、ウイルス病原性において役割を果たす任意のタンパク質であり得る。一部の場合では、ウイルスタンパク質は、必須ウイルスタンパク質である。一部の場合では、分解について標的化されるタンパク質は、ウイルスのなんらかの活性を補助する宿主タンパク質である。
分解について標的化される第1のタンパク質は、ウイルス病原性において役割を果たす任意のタンパク質であり得る。一部の場合では、ウイルスタンパク質は、必須ウイルスタンパク質である。一部の場合では、分解について標的化されるタンパク質は、ウイルスのなんらかの活性を補助する宿主タンパク質である。
I.(a)必須ウイルスタンパク質
本開示のキメラにより標的化され得る必須ウイルスタンパク質には、ウイルスの複製および/または病原性、例えば、細胞へのウイルスの進入において役割を果たす任意のウイルスタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、RNAウイルス、例えば、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス2 SARS-CoV)、SARS-CoV2、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)に由来するウイルスタンパク質である。例えば、ウイルスタンパク質は、NSP、例えば、SARS-CoV2に由来するコロナウイルスプロテアーゼである。一部の実施形態では、コロナウイルスプロテアーゼは、PLproまたはMproである。一部の実施形態では、NSPは、NSP9またはNSP12である。他の実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、RNAウイルス、例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ジカウイルス、およびエンテロウイルスに由来するウイルスタンパク質である。
本開示のキメラにより標的化され得る必須ウイルスタンパク質には、ウイルスの複製および/または病原性、例えば、細胞へのウイルスの進入において役割を果たす任意のウイルスタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、RNAウイルス、例えば、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス2 SARS-CoV)、SARS-CoV2、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)に由来するウイルスタンパク質である。例えば、ウイルスタンパク質は、NSP、例えば、SARS-CoV2に由来するコロナウイルスプロテアーゼである。一部の実施形態では、コロナウイルスプロテアーゼは、PLproまたはMproである。一部の実施形態では、NSPは、NSP9またはNSP12である。他の実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、RNAウイルス、例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ジカウイルス、およびエンテロウイルスに由来するウイルスタンパク質である。
I.(a)(1)コロナウイルスプロテアーゼ
本明細書において記載するコロナウイルスプロテアーゼとしては、メインプロテアーゼ(Mpro)およびパパイン様プロテアーゼ(PLpro)が挙げられ、これらは、コロナウイルスゲノムRNAの複製に必須であるレプリカーゼポリタンパク質をプロセシングするために必要である。これらのコロナウイルスプロテアーゼは、広範なタンパク質分解プロセシングによって、2つの翻訳されたウイルスポリタンパク質(PP1AおよびPP1AB)を、協調された様式で個々の機能的構成要素に切断する(Chen Y.W. et al. F1000Research, 2020, 9:129)。
本明細書において記載するコロナウイルスプロテアーゼとしては、メインプロテアーゼ(Mpro)およびパパイン様プロテアーゼ(PLpro)が挙げられ、これらは、コロナウイルスゲノムRNAの複製に必須であるレプリカーゼポリタンパク質をプロセシングするために必要である。これらのコロナウイルスプロテアーゼは、広範なタンパク質分解プロセシングによって、2つの翻訳されたウイルスポリタンパク質(PP1AおよびPP1AB)を、協調された様式で個々の機能的構成要素に切断する(Chen Y.W. et al. F1000Research, 2020, 9:129)。
SARS-CoV-2の主なタンパク質分解プロセシング酵素として、Mproは、ウイルスの生活環に必須である成熟タンパク質(NSP5-16)を生じる自己プロセシングタンパク質分解反応において主要な役割を果たす(Chang, G.G. et al. Molecular Biology of the SARS-Coronavirus, 115-128 (2009))。ウイルス複製におけるMpro(3C様プロテアーゼ(3CLpro)としても知られる)の機能的重要性が、ヒトにおける緊密に関連する相同性の不在と組み合わさることにより、Mproは、抗ウイルス薬の設計のための有望な標的となっている。
PLproは、ウイルスポリタンパク質およびウイルス複製に必要とされる宿主細胞タンパク質をプロセシングする多官能性システインプロテアーゼである(Baez-Santos, Y.M., et al. J Virol 88, 12511-27 (2014))。PLproはまた、p53分解の促進(Ma-Lauer, Y. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 113, E5192-201 (2016))および宿主免疫系の回避(脱ユビキチン化および脱ISG化活性(Ratia, K., et al. PLoS Pathog 10, e1004113 (2014))のためのウイルス機序にも関与する。したがって、抗ウイルス薬でPLproを標的とすることは、ウイルス複製を阻害することだけでなく、周囲の未感染細胞において細胞死を引き起こし得る感染細胞におけるシグナル伝達カスケードの調節不全を阻害することにおいても、利点を有し得る。
I.(a)(2)コロナウイルス非構造タンパク質
本明細書において記載するコロナウイルス非構造タンパク質(NSP)は、本開示のキメラを使用して標的化され得る必須タンパク質である。これらの非構造タンパク質としては、コロナウイルスプロテアーゼ、NSP9およびNSP12が挙げられる。コロナウイルスの複製および転写は、レプリカーゼ遺伝子においてコードされる15個または16個のウイルスNSPによって駆動され、それらのいずれも、本開示のキメラによって標的化され得る。これらのNSPは、PP1aおよびPP1abレプリカーゼポリタンパク質の翻訳時または翻訳後プロセシング中に産生される(te Velthuis, Aartjan JW. et al. Nucleic acids research 38,1 (2010): 203-14)。複数サブユニットのコロナウイルスRNA合成機構は、NSPの複合体である(Kirchdoerfer, R.N., Ward, A.B. Nat Commun 10, 2342 (2019))。
本明細書において記載するコロナウイルス非構造タンパク質(NSP)は、本開示のキメラを使用して標的化され得る必須タンパク質である。これらの非構造タンパク質としては、コロナウイルスプロテアーゼ、NSP9およびNSP12が挙げられる。コロナウイルスの複製および転写は、レプリカーゼ遺伝子においてコードされる15個または16個のウイルスNSPによって駆動され、それらのいずれも、本開示のキメラによって標的化され得る。これらのNSPは、PP1aおよびPP1abレプリカーゼポリタンパク質の翻訳時または翻訳後プロセシング中に産生される(te Velthuis, Aartjan JW. et al. Nucleic acids research 38,1 (2010): 203-14)。複数サブユニットのコロナウイルスRNA合成機構は、NSPの複合体である(Kirchdoerfer, R.N., Ward, A.B. Nat Commun 10, 2342 (2019))。
NSP9は、ウイルス複製複合体の必須タンパク質である。その活性はまた、タンパク質-タンパク質相互作用モチーフGXXXG(配列番号8)を含むパラレルアルファ-ヘリックスによって媒介されるその二量体化に依存する。NSP12は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有する、コロナウイルスRNA複製複合体の触媒サブユニットである。NSP12は、ウイルスRNA複製を遮断するすべてのウイルスポリメラーゼおよびヌクレオチドアナログに共通のアーキテクチャを有する。
I.(a)(3)ウイルス病原性を促進する宿主タンパク質
本開示のキメラにより標的化され得るタンパク質の別の例は、ウイルス病原性において役割を果たす宿主タンパク質であり得る。例えば、宿主タンパク質は、ヒトタンパク質、例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質である。一部の実施形態では、BETタンパク質は、ブロモドメイン2(BRD2)またはブロモドメイン4(BRD4)である。他の実施形態では、BETタンパク質は、ブロモドメイン3(BRD3)である。
本開示のキメラにより標的化され得るタンパク質の別の例は、ウイルス病原性において役割を果たす宿主タンパク質であり得る。例えば、宿主タンパク質は、ヒトタンパク質、例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質である。一部の実施形態では、BETタンパク質は、ブロモドメイン2(BRD2)またはブロモドメイン4(BRD4)である。他の実施形態では、BETタンパク質は、ブロモドメイン3(BRD3)である。
II.キメラの第1の部分
本開示のキメラの第1の部分は、分解について標的化されるタンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ)に結合する。第1の部分は、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチドもしくはステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、第1の部分は、ウイルスタンパク質(例えば、ウイルスの複製または病原性に必要とされる必須ウイルスタンパク質)を標的とし得る。一部の場合では、第1の部分は、ウイルス病原性を補助する宿主タンパク質を標的とし得る。第1の部分は、分解について標的化されるタンパク質に結合することができるが、それ自体は、必ずしもなんらかの阻害作用またはアゴニスト作用を有するわけではない「分子グルー」として、完全にまたは部分的に作用し得る。
本開示のキメラの第1の部分は、分解について標的化されるタンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ)に結合する。第1の部分は、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチドもしくはステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、第1の部分は、ウイルスタンパク質(例えば、ウイルスの複製または病原性に必要とされる必須ウイルスタンパク質)を標的とし得る。一部の場合では、第1の部分は、ウイルス病原性を補助する宿主タンパク質を標的とし得る。第1の部分は、分解について標的化されるタンパク質に結合することができるが、それ自体は、必ずしもなんらかの阻害作用またはアゴニスト作用を有するわけではない「分子グルー」として、完全にまたは部分的に作用し得る。
一部の実施形態では、第1の部分は、Mpro結合剤、例えば、Mpro阻害剤であるか、またはそれを含む。他の実施形態では、第1の部分は、PLpro結合剤、例えば、PLpro阻害剤であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、第1の部分は、NSP結合剤、例えば、NSP阻害剤(例えば、NSP9またはNSP12阻害剤)であるか、またはそれを含む。他の実施形態では、第1の部分は、BET結合剤、例えば、BRD阻害剤(例えば、BRD2、BRD3、またはBRD4阻害剤)であるか、またはそれを含む。
II.(a)Mpro結合剤
本開示によって包含されるMpro結合剤としては、Mproと直接的に相互作用する薬剤、例えば、Mpro阻害剤が挙げられる。Mpro阻害剤は、Mpro二量体化および/またはMpro酵素活性を阻害し得る。Mpro阻害剤、例えば、Jin Z et al. Nature 2020 582:289-293、Zumla A et al、Nat. Rev. Drug Disc. 2016 (10):327、Li G and Clercq ED. Nature Rev. Drug Disc., Feb 2020、Ghosh A.K. et al., ChemMedChem 2020 15(11): 907-932に記載されているものを、本開示において使用することができる。
本開示によって包含されるMpro結合剤としては、Mproと直接的に相互作用する薬剤、例えば、Mpro阻害剤が挙げられる。Mpro阻害剤は、Mpro二量体化および/またはMpro酵素活性を阻害し得る。Mpro阻害剤、例えば、Jin Z et al. Nature 2020 582:289-293、Zumla A et al、Nat. Rev. Drug Disc. 2016 (10):327、Li G and Clercq ED. Nature Rev. Drug Disc., Feb 2020、Ghosh A.K. et al., ChemMedChem 2020 15(11): 907-932に記載されているものを、本開示において使用することができる。
一部の実施形態では、Mpro結合剤は、ペプチド(例えば、組換えまたは合成により産生されたペプチド)である。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにMproと相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。Mproの酵素活性は、アルファヘリックス配列TVNVLAWLYAAVINGD(配列番号9)によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号9は、ペプチドをベースとした二量体化阻害剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、Mpro結合剤ペプチドは、少なくとも6個(例えば、配列番号9の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の連続したアミノ酸)を含み得る。一部の場合では、Mpro結合剤ペプチドは、例えば、配列番号9とは、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入によって異なる、配列番号9のバリアントであってもよく、ここで、バリアントは、依然としてMproと二量体を形成することができる。
一部の実施形態では、Mpro結合剤ペプチドは、例えば、配列番号2または3のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号2または3のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号2または3におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約30%、少なくとももしくは約40%、少なくとももしくは約50%、少なくとももしくは約60%、少なくとももしくは約70%、少なくとももしくは約75%の同一性、少なくとももしくは約80%、少なくとも85%、少なくとももしくは約90%、少なくとももしくは約95%、少なくとももしくは約98%、少なくとももしくは約99%、または100%の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、Mproに結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および/または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個未満、5個未満、4個未満、3個未満、または2個未満のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてMproに結合することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるMpro結合性ペプチドのうちのいずれかのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがMproに結合する限り、変動し得る。
ある特定の実施形態では、ペプチドは、それらが、1~4個(例えば、1個、2個、3個、4個)のアミノ酸置換を有することで配列番号2または3から変動しているという点で、配列番号2または3のペプチドとは異なる。例えば、「X」とラベル付けされた位置は、配列番号2または3において、以下のように置換され得る:ATXNVLXWLYXAVIXGD(配列番号51)。Xは、保存的アミノ酸残基であってもよく、または非保存的アミノ酸残基であってもよい。一部の場合では、それぞれのXは、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である(例えば、S5)。
本明細書に記載するキメラにおいて利用することができる例示的なMpro結合剤は、以下に提供される構造を有する。
表1に示されるMpro結合剤またはそれらのMpro結合性アナログのいずれかを、本開示のキメラにおいて利用することができる。
II.(b)PLpro結合剤
本開示によって包含されるPLpro結合剤としては、PLproと直接的に相互作用する薬剤、例えば、PLpro阻害剤が挙げられる。PLpro阻害剤は、PLpro酵素活性を阻害することができる。PLpro阻害剤、例えば、Baez-Santos, Y.M., et al. J Virol 88, 12511-27 (2014)、Li G and Clercq ED. Nature Rev. Drug Disc., Feb 2020、Ghosh, A.K. et al. J Med Chem 52, 5228-40 (2009)、Baez-Santos, Y.M., et al. Antiviral Res 115, 21-38 (2015)、Elfiky A and Ibrahim NS. Biophysics Feb 11, 2020、article/rs-13849/v1 DOI: 10.21203/rs.2.23280/v1、Lin MH, et al. Antiviral Res. 2018;150:155-163に記載されるものを、本開示のキメラにおいて使用することができる。
本開示によって包含されるPLpro結合剤としては、PLproと直接的に相互作用する薬剤、例えば、PLpro阻害剤が挙げられる。PLpro阻害剤は、PLpro酵素活性を阻害することができる。PLpro阻害剤、例えば、Baez-Santos, Y.M., et al. J Virol 88, 12511-27 (2014)、Li G and Clercq ED. Nature Rev. Drug Disc., Feb 2020、Ghosh, A.K. et al. J Med Chem 52, 5228-40 (2009)、Baez-Santos, Y.M., et al. Antiviral Res 115, 21-38 (2015)、Elfiky A and Ibrahim NS. Biophysics Feb 11, 2020、article/rs-13849/v1 DOI: 10.21203/rs.2.23280/v1、Lin MH, et al. Antiviral Res. 2018;150:155-163に記載されるものを、本開示のキメラにおいて使用することができる。
本明細書に記載するキメラにおいて利用することができる例示的なPLpro結合剤は、以下に提供される構造を有する。
表2に示されるPLpro結合剤またはそれらのPLpro結合性アナログのいずれかを、本開示のキメラにおいて利用することができる。
II.(c)NSP9結合剤
本開示のNSP9結合剤は、NSP9と直接的に相互作用することができる薬剤である。NSP9結合剤は、NSP9二量体化および/またはNSP9酵素活性を抑制する、NSP9阻害剤であり得る。一部の実施形態では、NSP9結合剤は、ペプチド(例えば、組換えまたは合成により産生されたペプチド)である。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにNSP9と相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。NSP9の酵素活性は、アルファヘリックス配列NLNRGMVLGSLAATVRLQ(配列番号10)によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号10は、ペプチドをベースとした二量体化結合剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、NSP9結合剤ペプチドは、少なくとも6個(例えば、配列番号10の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、または18個の連続したアミノ酸)を含み得る。一部の場合では、NSP9結合剤ペプチドは、バリアントペプチドが依然としてNSP9に結合する限り、配列番号10において少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個のアミノ酸置換または欠失を含み得る。一部の場合では、NSP9結合剤ペプチドは、配列GXXXG(配列番号8)を含み、ここで、それぞれのXは、任意のアミノ酸であり得る。一部の場合では、Xは、任意の1つのM、ノルロイシン(B)、V、L、A、G、またはIである。
本開示のNSP9結合剤は、NSP9と直接的に相互作用することができる薬剤である。NSP9結合剤は、NSP9二量体化および/またはNSP9酵素活性を抑制する、NSP9阻害剤であり得る。一部の実施形態では、NSP9結合剤は、ペプチド(例えば、組換えまたは合成により産生されたペプチド)である。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにNSP9と相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。NSP9の酵素活性は、アルファヘリックス配列NLNRGMVLGSLAATVRLQ(配列番号10)によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号10は、ペプチドをベースとした二量体化結合剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、NSP9結合剤ペプチドは、少なくとも6個(例えば、配列番号10の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、または18個の連続したアミノ酸)を含み得る。一部の場合では、NSP9結合剤ペプチドは、バリアントペプチドが依然としてNSP9に結合する限り、配列番号10において少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個のアミノ酸置換または欠失を含み得る。一部の場合では、NSP9結合剤ペプチドは、配列GXXXG(配列番号8)を含み、ここで、それぞれのXは、任意のアミノ酸であり得る。一部の場合では、Xは、任意の1つのM、ノルロイシン(B)、V、L、A、G、またはIである。
一部の実施形態では、NSP9阻害剤ペプチドは、例えば、配列番号4または5のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号4または5のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号4または5におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約30%、少なくとももしくは約40%、少なくとももしくは約50%、少なくとももしくは約60%、少なくとももしくは約70%、少なくとももしくは約80%、少なくとも85%、少なくとももしくは約90%、少なくとももしくは約95%、少なくとももしくは約98%、少なくとももしくは約99%、または100%の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、NSP9に結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および/または欠失を含み得る。例えば、アミノ酸は、保存的であるかどうかにかかわらず、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、10個未満、5個未満、4個未満、3個未満、または2個未満のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を含み得る。したがって、本明細書において開示される任意のNSP9結合性ペプチドのアミノ酸配列は、バリアントペプチドが依然としてNSP9に結合する限り、変動し得る。一部の場合では、配列番号4もしくは5のNSP9結合剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、配列のそれぞれの末端において、1個、2個、または3個のアミノ酸だけ短縮されていてもよい。他の場合では、配列番号4もしくは5のNSP9結合剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、ステープルを含まなくてもよく、1つのステープル(例えば、R8とS5との間に形成されるステープル)を含んでもよく、または二重ステープル化されていてもよい。
II.(d)NSP12結合剤
本開示のNSP12結合剤は、NSP12と直接的に相互作用する薬剤を含む。NSP12結合剤は、NSP12酵素活性を抑制する、NSP12阻害剤であり得る。一部の実施形態では、NSP12阻害剤は、レムデシビルまたはソホスブビルアナログ(例えば、レムデシビル酸またはソホスブビルカルボン酸、またはその薬学的に許容される塩)である。
本開示のNSP12結合剤は、NSP12と直接的に相互作用する薬剤を含む。NSP12結合剤は、NSP12酵素活性を抑制する、NSP12阻害剤であり得る。一部の実施形態では、NSP12阻害剤は、レムデシビルまたはソホスブビルアナログ(例えば、レムデシビル酸またはソホスブビルカルボン酸、またはその薬学的に許容される塩)である。
II.(e)BET結合剤
本開示のBET結合剤には、BETタンパク質、例えば、ブロモドメイン2(BRD2)、BRD3、および/またはBRD4と直接的に相互作用する薬剤が含まれる。BETタンパク質結合剤は、BET酵素活性を抑制する、BETタンパク質阻害剤であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するキメラにおいて利用することができるBET阻害剤は、以下に提供される構造を有する。
本開示のBET結合剤には、BETタンパク質、例えば、ブロモドメイン2(BRD2)、BRD3、および/またはBRD4と直接的に相互作用する薬剤が含まれる。BETタンパク質結合剤は、BET酵素活性を抑制する、BETタンパク質阻害剤であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するキメラにおいて利用することができるBET阻害剤は、以下に提供される構造を有する。
表3に示されるBET阻害剤またはそれらのBET阻害アナログのいずれかを、本開示のキメラにおいて利用することができる。
III.キメラによって標的化される第2のタンパク質
本開示のキメラにより標的化される第2のタンパク質は、標的化される第1のタンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、またはBETタンパク質)を分解するタンパク質分解薬であるか、またはそれを動員する。ある特定の実施形態では、第2のタンパク質は、分解薬タンパク質、例えば、E3ユビキチンリガーゼまたはE3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第2のタンパク質はE3ユビキチンリガーゼである。E3ユビキチンリガーゼの非限定的な例としては、ヒト二重微小染色体2(HDM2)、フォンヒッペルリンダウ(VHL)、セレブロン、X連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、細胞アポトーシス阻害タンパク質(cIAP)、または構成的光形態形成1(COP1)が挙げられる。
本開示のキメラにより標的化される第2のタンパク質は、標的化される第1のタンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、またはBETタンパク質)を分解するタンパク質分解薬であるか、またはそれを動員する。ある特定の実施形態では、第2のタンパク質は、分解薬タンパク質、例えば、E3ユビキチンリガーゼまたはE3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第2のタンパク質はE3ユビキチンリガーゼである。E3ユビキチンリガーゼの非限定的な例としては、ヒト二重微小染色体2(HDM2)、フォンヒッペルリンダウ(VHL)、セレブロン、X連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、細胞アポトーシス阻害タンパク質(cIAP)、または構成的光形態形成1(COP1)が挙げられる。
IV.キメラの第2の部分
本開示のキメラの第2の部分は、標的タンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、またはBETタンパク質)を分解する「タンパク質分解薬」(例えば、E3ユビキチンリガーゼ)であるか、またはそれを動員する、タンパク質に結合する。一部の実施形態では、第2の部分は、標的のユビキチン化を触媒する酵素または複合体を動員し得る。「タンパク質分解薬」の例は、標的タンパク質をユビキチン化し、それによって、そのタンパク質を、プロテアソームによる分解の標的として標識する、E3リガーゼである。
本開示のキメラの第2の部分は、標的タンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、またはBETタンパク質)を分解する「タンパク質分解薬」(例えば、E3ユビキチンリガーゼ)であるか、またはそれを動員する、タンパク質に結合する。一部の実施形態では、第2の部分は、標的のユビキチン化を触媒する酵素または複合体を動員し得る。「タンパク質分解薬」の例は、標的タンパク質をユビキチン化し、それによって、そのタンパク質を、プロテアソームによる分解の標的として標識する、E3リガーゼである。
第2の部分は、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子であり得る。一部の実施形態では、第2の部分は、セレブロン結合性部分、VHL結合性部分、HDM2結合性部分、XIAP結合性部分、cIAP結合性部分、またはCOP1結合性部分であるか、またはそれを含む。
IV.(a)セレブロン結合性部分
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、セレブロン結合性部分であり得る。セレブロンに結合する小分子の非限定的な例としては、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、それらのアナログ、およびそれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、セレブロン結合性部分であり得る。セレブロンに結合する小分子の非限定的な例としては、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、それらのアナログ、およびそれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、セレブロン結合性部分は、第1のタンパク質を標的とするステープルペプチドのN末端にコンジュゲートしている。一部の場合では、セレブロン部分は、第1のタンパク質を標的とするステープルペプチドのC末端にコンジュゲートしている。ある特定の場合では、セレブロン部分は、第1のタンパク質を標的とするステープルペプチドのN末端とC末端との間のペプチド配列中に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる。
一部の場合では、セレブロンに結合する小分子(サリドマイド)は、第1のタンパク質を標的とする部分(例えば、ペプチド)のN末端にコンジュゲートしていてもよい。小分子(サリドマイド)が、ペプチドのN末端にコンジュゲートしている場合、それは、以下に示す構造を有する。
ある特定の場合では、セレブロン結合性部分は、第1のタンパク質を標的とするステープルペプチドのN末端とC末端との間のペプチド配列中に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる。
IV.(b)VHL結合性部分
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、VHL結合性部分であり得る。VHLに結合する小分子の非限定的な例としては、VH 032およびそのVHL結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、VHL結合性部分であり得る。VHLに結合する小分子の非限定的な例としては、VH 032およびそのVHL結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、VHL結合性部分は、第1のタンパク質を標的とするステープルペプチドのN末端にコンジュゲートしている。一部の場合では、VHL部分は、第1のタンパク質を標的とするステープルペプチドのC末端にコンジュゲートしている。ある特定の場合では、VHL部分は、第1のタンパク質を標的とするステープルペプチドのN末端とC末端との間のペプチド配列中に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる。
ある特定の場合では、VHL結合性部分は、以下に挙げられるペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド、またはそのVHL結合性バリアントである:
LAPAAGDTIISLDF(配列番号12)-E3リガーゼ:VHL、
LAPYIPMDDDFQL(配列番号13)-E3リガーゼ:VHL。
ある特定の場合では、VHL結合性部分は、以下に挙げられるペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド、またはそのVHL結合性バリアントである:
LAPAAGDTIISLDF(配列番号12)-E3リガーゼ:VHL、
LAPYIPMDDDFQL(配列番号13)-E3リガーゼ:VHL。
バリアントは、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸位置において(例えば、別のアミノ酸との置換、挿入、または欠失によって)配列番号12または13とは異なり得るが、ただし、それが依然としてVHLに結合することを条件とする。
IV.(c)HDM2結合性部分
本開示のキメラの第2の部分は、HDM2および/またはHDMXに結合するp53のトランス活性化ドメインの小分子、ペプチドもしくはステープルペプチド、または他の方法で化学的に安定化されたペプチド(例えば、ステッチ化されている)であるか、またはそれを含む、HDM2結合性部分であり得る。HDM2に結合する小分子の非限定的な例としては、ヌトリン-3、ヌトリン-3a、ヌトリン-3a誘導体、例えば、RG7112およびRG7388(イダサヌトリン)、ならびにそれらのHDM2結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
ヌトリン-3aは、以下の構造を有する。
RG7112は、以下の構造を有する。
RG7388は、以下の構造を有する。
本開示のキメラの第2の部分は、HDM2および/またはHDMXに結合するp53のトランス活性化ドメインの小分子、ペプチドもしくはステープルペプチド、または他の方法で化学的に安定化されたペプチド(例えば、ステッチ化されている)であるか、またはそれを含む、HDM2結合性部分であり得る。HDM2に結合する小分子の非限定的な例としては、ヌトリン-3、ヌトリン-3a、ヌトリン-3a誘導体、例えば、RG7112およびRG7388(イダサヌトリン)、ならびにそれらのHDM2結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
ヌトリン-3aは、以下の構造を有する。
ある特定の実施形態では、HDM2結合性部分は、当該技術分野において公知のp53ペプチドまたはステープルp53ペプチド(例えば、p53のトランス活性化ドメイン(LSQETFSDLWKLLPEN(配列番号11)を含むペプチド)、HDM2に結合するそのバリアント、またはそのステープル化バージョン)である。ある特定の場合では、HDM2結合性部分は、HDMXとHDM2との間の複合体に直接的に結合し、それを動員する、安定化またはステープルp53ペプチドである。一部の実施形態では、ステープルp53ペプチドは、HDMXに結合することができ、HDMX/HDM2複合体を動員することができる。ある特定の実施形態では、ステープルp53ペプチドは、直接的または間接的に、HDM2に結合するか、またはHDM2に結合するHDMXに結合する。
一部の場合では、本開示のHDM2結合性ステープルペプチドは、残基(R5)、(R8)、(S5)、および(S8)を有する。そのような配列(例えば、配列番号1、7、および40~47)において、「R」および「S」は、非天然アミノ酸の立体化学を指し、一方で「5」および「8」は、非天然アミノ酸のオレフィン側鎖における炭素残基の数を指す。したがって、「(R5)」は、(R)-2-(4’-ペンテニル)アラニン[(R)-α-(4’-ペンテニル)アラニンとしても知られる]であり、「(R8)」は、(R)-2-(7’-オクテニル)アラニン[(R)-α-(7’-オクテニル)アラニンとしても知られる]であり、「(S5)」は、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニン[(S)-α-(4’-ペンテニル)アラニンとしても知られる]であり、「(S8)」は、(S)-2-(7’-オクテニル)アラニン[(S)-α-(7’-オクテニル)アラニンとしても知られる]である。一部の場合では、配列番号1、7、および40~47は、(R8)が(R5)で置き換えられ、同時に、(S5)が(S8)で置き換えられるように、変動し得る。そのようなバリアントHDM2結合性ステープルペプチドは、本開示に包含される。配列番号1、7、および40~47のこれらのバリアントは、HDM2に結合する能力を保持する。例えば、配列番号1のバリアント配列は、配列番号49であり、配列番号7のバリアント配列は、配列番号50である。
本開示のキメラにおいて使用され得るステープルp53ペプチドの非限定的な例を、以下に列挙する。
LTF(R8)EYWAQL(S5)SAA(配列番号1)-SP645
LTF(R8)EYWAQ#(S5)SAA(配列番号7)-ATSP-7041、#はシクロブチルアラニンである
LTF(R5)EYWAQL(S8)SAA(配列番号49)-SP645バリアント配列2
LTF(R5)EYWAQ#(S8)SAA(配列番号50)-ATSP-7041バリアント配列
LSQETFSD(R8)WKLLPE(S5)(配列番号40)-SAH-p53-1
LSQE(R8)FSDLWK(S5)LPEN(配列番号41)-SAH-p53-2
LSQ(R8)TFSDLW(S5)LLPEN(配列番号42)-SAH-p53-3
LSQETF(R8)DLWKLL(S5)EN(配列番号43)-SAH-p53-4
LSQETF(R8)NLWKLL(S5)QN(配列番号44)-SAH-p53-5
LSQQTF(R8)NLWRLL(S5)QN(配列番号45)-SAH-p53-6
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QSQQTF(R8)NLWRLL(S5)QN(配列番号47)-SAH-p53-8
LTF(R8)EYWAQL(S5)SAA(配列番号1)-SP645
LTF(R8)EYWAQ#(S5)SAA(配列番号7)-ATSP-7041、#はシクロブチルアラニンである
LTF(R5)EYWAQL(S8)SAA(配列番号49)-SP645バリアント配列2
LTF(R5)EYWAQ#(S8)SAA(配列番号50)-ATSP-7041バリアント配列
LSQETFSD(R8)WKLLPE(S5)(配列番号40)-SAH-p53-1
LSQE(R8)FSDLWK(S5)LPEN(配列番号41)-SAH-p53-2
LSQ(R8)TFSDLW(S5)LLPEN(配列番号42)-SAH-p53-3
LSQETF(R8)DLWKLL(S5)EN(配列番号43)-SAH-p53-4
LSQETF(R8)NLWKLL(S5)QN(配列番号44)-SAH-p53-5
LSQQTF(R8)NLWRLL(S5)QN(配列番号45)-SAH-p53-6
QSQQTF(R8)NLWKLL(S5)QN(配列番号46)-SAH-p53-7
QSQQTF(R8)NLWRLL(S5)QN(配列番号47)-SAH-p53-8
HDM2および/またはHDMXに結合し、本開示のキメラにおいて使用することができる、ステープルp53ペプチドおよび他のペプチドの他の例としては、ALRN-6924、ならびに米国特許第10,202,431号、同第9,617,309号、同第9,556,227号、同第9,527,896号、同第9,517,252号、同第9,505,804号、同第9,505,801号、同第9,408,885号、同第9,175,045号、同第9,163,330号、同第8,927,500号、同第8,889,632号、同第8,592,377号、同第8,586,707号、米国特許出願公開第US20140018302号、同第US20150246946号、同第20170212125号、同第US20180030090号、同第20190076504号、国際特許出願第WO2008106507号、同第WO2014065760号、および欧州特許出願第EP2912463号に提供されるステープルまたはステッチp53ペプチドが挙げられるがこれらに限定されず、これらの文献のすべての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の場合では、依然としてHDM2および/またはHDMXに結合する配列番号1、7、40~47、および49~50のうちのいずれか1つのバリアントは、本開示によって包含される。これらのバリアントは、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸位置において(例えば、異なるアミノ酸との置換、挿入、または欠失によって)配列番号1、7、40~47、および49~50のうちのいずれか1つとは異なり得、ここで、バリアントは、HDM2に結合するその能力を保持する。1つの例では、配列番号1または7におけるトリプトファン(「W」)残基は、3-(2-ナフチル)-L-アラニン)によって置換され得る。ある特定の実施形態では、バリアントは、1~6個(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個)のアミノ酸置換を有することで配列番号1または7から変動しているという点で、配列番号1または7のペプチドとは異なる。例えば、X1、X2、X3、X4、およびX5”とラベル付けされている残基は、配列番号1または7において、以下のように置換され得る:X1TF(R8)X2YX3AQX4 (S5)X5AA(配列番号48)、ここで、X1、X2、およびX5は、任意のアミノ酸(例えば、A、W、F、L、V、I、ナフチルアラニン、E、D、Y、シクロブチルアラニン、およびそれらの側鎖アナログ)であり、X3は、W、F、または3-(2-ナフチル)-L-アラニンであり、X4は、Lまたはロイシン模倣体(例えば、シクロブチルアラニン)である。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号1または7におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約30%、少なくとももしくは約40%、少なくとももしくは約50%、少なくとももしくは約60%、少なくとももしくは約70%、少なくとももしくは約75%の同一性、少なくとももしくは約80%、少なくとも85%、少なくとももしくは約90%、少なくとももしくは約95%、少なくとももしくは約98%、少なくとももしくは約99%、または100%の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、HDM2および/またはHDMXに結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および/または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、6個未満、5個未満、4個未満、3個未満、または2個未満のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてHDM2および/またはHDMXに結合することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるHDM2および/またはHDMXペプチドのうちのいずれのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがHDM2および/またはHDMXに結合する限り、変動し得る。
一部の場合では、p53のトランス活性化ドメイン(LSQETFSDLWKLLPEN(配列番号11))、HDM2に結合するバリアント、またはその安定化(例えば、ステープル化もしくはステッチ化)形態は、本開示のキメラにおいて使用することができる。一部の場合では、上記の配列の太字のF、W、およびLは、置換されない。一部の場合では、上記の配列の太字のF、W、およびLのうちの1つまたは複数は、保存的置換によってのみ置換される。ある特定の場合では、上記の配列の1つまたは複数のアスパラギン酸(D)は、アスパラギンで置換される。ある特定の場合では、上記の配列の1つまたは複数のグルタミン酸(E)は、グルタミンで置換される。一部の場合では、上記の配列のリシンは、アルギニンで置換される。一部の場合では、上記の配列の第1のロイシンは、グルタミンで置換される。一部の場合では、フェニルアラニンの後のセリンおよび/またはフェニルアラニンの前のスレオニンは、任意のアミノ酸(例えば、非天然アミノ酸、例えば、R8)によって置換される。一部の場合では、リシンの後のロイシンおよび/またはプロリンは、任意のアミノ酸(例えば、非天然アミノ酸、例えば、S5)によって置換される。一部の場合では、配列番号11の第1、第2、第3、第4、および/または第5のN末端アミノ酸は、欠失していてもよい。一部の場合では、配列番号11のC末端アミノ酸のうちの1個、2個、および/または3個は、欠失していてもよい。ある特定の場合では、配列番号11の第1、第2、第3、第4、および/または第5のN末端アミノ酸、ならびにC末端アミノ酸のうちの1個、2個、および/または3個は、欠失していてもよい。これらの置換のうちの1つまたは複数の組合せが、本開示によって包含されることを理解されたい。一部の場合では、ペプチドまたは安定化ペプチドは、中性であるか、または正に荷電している。すべての場合で、ペプチドまたは安定化ペプチドは、HDM2に結合する(例えば、ナノモル濃度の親和性で)。一部の場合では、ペプチドまたはステープルペプチドは、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、または15個のアミノ酸の長さである。
ある特定の場合では、第2の部分のペプチドは、以下に列挙されるペプチドのうちの1つのアミノ酸配列またはそのHDM2結合性バリアント(バリエーションは、先行する段落に記載されるように行われ得る)、例えば、Chong Li et al., J Mol Biol. 2010 Apr 30; 398(2): 200-213に記載されるものを有する:
FSDLWKLL(配列番号38)-p53トランス活性化ドメイン配列、
TSFAEYWNLLSP(配列番号39)-PMI 12(duodecimal)ペプチド阻害剤。
FSDLWKLL(配列番号38)-p53トランス活性化ドメイン配列、
TSFAEYWNLLSP(配列番号39)-PMI 12(duodecimal)ペプチド阻害剤。
本明細書に記載するキメラにおいて用いることができるp53ペプチドの他の例は、国際公開第WO2017/165617号(図7)および同第WO2012/065181号(図1C)において開示されており、これらのすべての内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる(特に、ステープル化されたおよびステープル化されていないp53ペプチドの開示に関して)。
ステープルp53ペプチドは、それらの構造安定性、ペプチド溶解度、細胞透過性、およびステープルp53ペプチドが組み込まれる本明細書において開示されるキメラの関連する分解効力を強化するために、改変することができる。例えば、p53ペプチドは、α-ヘリックス含有量を増加させ、HDM2に対する高い結合親和性を保持し、細胞取り込みを強化するなどのために、改変することができる。p53ペプチドにおける一部の残基は、適切な電荷を達成するために、置換することができる。例えば、ステープルp53ペプチドにおけるアスパラギン酸およびグルタミン酸は、ペプチドの電荷を調節するために、すなわち、細胞浸透を強化するためにペプチドの電荷を負から中性または正へと変更するために、アスパラギンおよびグルタミンと置き換えられ得る。p53ペプチドにおけるある特定のアミノ酸残基はまた、核外輸送の回避(L14Q)および/または潜在的なユビキチン化の回避(K24R)のために、変異され得る。
F19、W23、およびL26は、HDM2との相互作用に関して重要なヒトp53残基である。Raj, N. and Attardi, L.D. Cold Spring Harb Perspect Med. 2017 Jan; 7(1): a026047。本開示のキメラにおいて使用することができるステープルp53ペプチドには、ヒトp53(UniProtKB-P04637)のアミノ酸14~29に対応するトランス活性化ドメイン配列のすべてもしくは一部、またはそのバリアント(例えば、少なくとも必須の相互作用アミノ酸F19、W23、およびL26)を含み、in vitro結合アッセイにおいて測定した場合に、完全にまたは部分的に、p53のHDMX、HDM2、またはHDMXおよびHDM2への結合を阻害する。HDM2およびHDMXに係合するp53トランス活性化ドメインのヒト野生型アミノ酸配列は、
LSQETFSDLWKLLPEN(配列番号11)
を含み、
これは、全長p53のアミノ酸14~29に対応する。
LSQETFSDLWKLLPEN(配列番号11)
を含み、
これは、全長p53のアミノ酸14~29に対応する。
ステープルp53ペプチドのいずれかまたはすべてのアミノ酸は、必須の相互作用するアミノ酸(上記を参照されたい)を除いて、置換することができ、かつ/または必須の相互作用するアミノ酸(上記を参照されたい)のうちの1つもしくは複数は、1つもしくは複数の保存的置換で置換されてもよい。例えば、Coffill et al Genes Dev 2016 30: 281-292およびBaek at el JACS 2012 13: 103-6を参照されたい。一部の場合では、配列番号11の第1、第2、第3、第4、および/または第5のN末端アミノ酸は、欠失していてもよい。一部の場合では、配列番号11のC末端アミノ酸のうちの1個、2個、および/または3個は、欠失していてもよい。ある特定の場合では、配列番号11の第1、第2、第3、第4、および/または第5のN末端アミノ酸、ならびにC末端アミノ酸のうちの1個、2個、および/または3個は、欠失していてもよい。
「非必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型および/または完全に機能性の配列から(その活性を破壊することも、実質的に変化させることもなしに)変更することができる残基である。「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型および/または完全に機能性の配列から変化させた場合に、ポリペプチド活性の破壊または実質的な破壊をもたらす残基である。
「必須」アミノ酸残基という用語は、本明細書で使用される場合、必須アミノ酸の保存的置換を含む。一般に、「必須」アミノ酸残基は、アルファヘリックスの相互作用面において見出される。
本明細書において開示されるステープルp53ペプチドに含めるのに好適な保存的置換は、以下で考察されており、1つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置き換えられる置換を含み得る。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。保存的アミノ酸置換の1つの例では、配列番号11における必須アミノ酸フェニルアラニン(F19)が、アラニンと置き換えられ得る。
IV.(d)XIAP結合性部分
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、XIAP結合性部分であり得る。XIAPに結合する小分子の非限定的な例としては、A410099.1またはそのXIAP結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、XIAP結合性部分であり得る。XIAPに結合する小分子の非限定的な例としては、A410099.1またはそのXIAP結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
IV.(e)cIAP結合性部分
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、cIAP結合性部分であり得る。cIAPに結合する小分子の非限定的な例としては、SM-1295もしくはSM-1280、またはそのcIAP結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。cIAP結合性部分SM-1295は、以下の構造を有する。
cIAP結合性部分SM-1280は、以下の構造を有する。
本開示のキメラの第2の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、cIAP結合性部分であり得る。cIAPに結合する小分子の非限定的な例としては、SM-1295もしくはSM-1280、またはそのcIAP結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。cIAP結合性部分SM-1295は、以下の構造を有する。
IV.(f)COP1結合性部分
本開示のキメラの第2の部分は、ペプチドまたはステープルペプチドであるか、またはそれを含む、COP1結合性部分であり得る。COP1に結合するペプチドの非限定的な例としては、以下の配列を有するトリブルズシュードキナーゼ1(Trib1)ペプチドが挙げられるが、これに限定されない:DQIVPEY(配列番号6)またはそのバリアント。
本開示のキメラの第2の部分は、ペプチドまたはステープルペプチドであるか、またはそれを含む、COP1結合性部分であり得る。COP1に結合するペプチドの非限定的な例としては、以下の配列を有するトリブルズシュードキナーゼ1(Trib1)ペプチドが挙げられるが、これに限定されない:DQIVPEY(配列番号6)またはそのバリアント。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号6におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約30%、少なくとももしくは約40%、少なくとももしくは約50%、少なくとももしくは約60%、少なくとももしくは約70%、少なくとももしくは約75%の同一性、少なくとももしくは約80%、少なくとも85%、少なくとももしくは約90%、少なくとももしくは約95%、少なくとももしくは約98%、少なくとももしくは約99%、または100%の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、COP1に結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および/または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、0個、1個、2個、3個、4個、5個、5個未満、4個未満、3個未満、または2個未満のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてCOP1に結合することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるCOP1結合性ペプチドのうちのいずれのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがCOP1に結合する限り、変動し得る。
IV.(g)基質アダプター結合性ペプチド
本開示のキメラの第2の部分は、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるタンパク質に結合するペプチドであり得る。一部の場合では、ペプチドは、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるWD-40タンパク質に結合する。ペプチドは、浅い溝にあるE3ユビキチンリガーゼの基質認識ドメインに結合し、N-またはC末端のいずれかにおける同化(すなわち、ステープルペプチド配列のコンジュゲート)に対して耐性がある。E3ユビキチンリガーゼに対する例示的な基質アダプターとしては、HDM2およびVHLが挙げられる。
本開示のキメラの第2の部分は、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるタンパク質に結合するペプチドであり得る。一部の場合では、ペプチドは、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるWD-40タンパク質に結合する。ペプチドは、浅い溝にあるE3ユビキチンリガーゼの基質認識ドメインに結合し、N-またはC末端のいずれかにおける同化(すなわち、ステープルペプチド配列のコンジュゲート)に対して耐性がある。E3ユビキチンリガーゼに対する例示的な基質アダプターとしては、HDM2およびVHLが挙げられる。
ある特定の場合では、第2の部分のペプチドは、トリブルズシュードキナーゼ1(Trib1)タンパク質配列:DQIVPEY(配列番号6)またはそのバリアントに基づく。
ある特定の場合では、第2の部分のペプチドは、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるWD40リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列に基づいている。一部の場合では、第2の部分のペプチドは、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるWD40リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列のバリアント(例えば、置換、欠失、または挿入バリアント)である。E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるWD40リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列の非限定的な例を以下に示す。
†モチーフパターンは以下の命名法を使用する:「.」は任意のアミノ酸タイプを指定し、「[X]」はその位置において許可されるアミノ酸タイプ(複数可)を指定し、パターンの最初における「^X」は、配列がアミノ酸タイプXで開始することを指定し、「[^X]」は、その位置がタイプX以外のアミノ酸を有することができることを示し、次のように指定される数「X{x,y}」のxおよびyは、その位置において必要な「X」アミノ酸タイプの最小および最大数を指定する。翻訳後に改変(例えば、リン酸化およびプロリンヒドロキシル化)されることが公知である第1級デグロン内の保存残基の位置を太字で示す。
V.第2の部分のペプチド
本明細書に記載するキメラは、E3ユビキチンリガーゼ結合性ペプチド(例えば、配列番号1、6、7、12、13、38~47、および49~50)を、第2の部分として含み得る。第2の部分のペプチドは、安定化またはステープルペプチドであり得る。当該技術分野において公知の任意の他のペプチドもまた、第2の部分として、本開示のキメラに組み込むことができる。例えば、Meszaros et al., Sci. Signal., 10(470):eaak9982 (2017);Guharoy et al., Nature Communications, 7:10239, doi:10.1038/ncomms10239 (2016);米国特許第9,783,575号;同第9,297,017号;および同第9,115,184号を参照されたく、これら全ては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載するキメラは、E3ユビキチンリガーゼ結合性ペプチド(例えば、配列番号1、6、7、12、13、38~47、および49~50)を、第2の部分として含み得る。第2の部分のペプチドは、安定化またはステープルペプチドであり得る。当該技術分野において公知の任意の他のペプチドもまた、第2の部分として、本開示のキメラに組み込むことができる。例えば、Meszaros et al., Sci. Signal., 10(470):eaak9982 (2017);Guharoy et al., Nature Communications, 7:10239, doi:10.1038/ncomms10239 (2016);米国特許第9,783,575号;同第9,297,017号;および同第9,115,184号を参照されたく、これら全ては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のペプチド(すなわち、配列番号1、6、7、12、13、38~47および49~50)のバリアントは、1個または複数(例えば、1、2、3、4、5個)のアミノ酸置換;1個または複数の欠失(例えば、1、2、3);1個または複数の挿入(例えば、1、2、3個);またはこれらの任意の2つまたはそれを超える組合せを有するペプチドを含む。適切なE3リガーゼと相互作用するバリアントが選択される。
本開示の第2の部分のペプチドは、1000nMを下回る結合親和性でその関連するE3リガーゼに結合し得る。ある特定の場合では、第2の部分ペプチドは、4から20個のアミノ酸長(例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個)である。
ある特定の場合では、第2の部分ペプチドは、配列番号1、6、7、12、13、38~47および49~50のうちのいずれか1つに記載のペプチドのアミノ酸配列を有する。一部の場合では、第2の部分ペプチドは、配列番号1、6、7、12、13、38~47および49~50のうちのいずれか1つに記載のペプチドのバリアントであるアミノ酸配列を有する。バリアントは、1個または複数(例えば、1、2、3、4、5個)のアミノ酸置換;1個または複数の欠失(例えば、1、2、3);1個または複数の挿入(例えば、1、2、3個);またはこれらの任意の2つまたはそれを超える組合せを有する第2の部分ペプチドを含む。
VI.安定化ペプチド
本開示のキメラの第1および/または第2の部分は、安定化ペプチド(例えば、ステープルペプチド)を含み得る。ペプチドヘリックスは、多くの重要な生物学的プロセス(例えば、アポトーシス)を調節する鍵となるタンパク質-タンパク質相互作用の重要なメディエーターであるが、そのようなヘリックスが、タンパク質の範囲内でその背景を無視して解釈され、単離して調製された場合、それは折りたたまれず、ランダムコイルコンフォメーションをとる場合があり、生物活性において劇的な減少につながり、したがって治療的潜在力が低下する。この問題を回避するために、構造的に安定化したペプチドを用いることができる。一部の場合では、構造的に安定化したペプチドは、内部(分子内)架橋(またはステープル)によって接合した少なくとも2個の改変アミノ酸を含む。本明細書において記載する安定化ペプチドは、ステープルペプチド、ステッチペプチド、複数のステッチを含むペプチド、複数のステープルを含むペプチド、またはステープルおよびステッチのミックスを含むペプチド、ならびに他の化学的戦略によって構造的に強化されたペプチドを含む(例えば、Balaram P. Cur. Opin. Struct. Biol. 1992;2:845;Kemp DS, et al., J. Am. Chem. Soc. 1996;118:4240;Orner BP, et al., J. Am. Chem. Soc. 2001;123:5382;Chin JW, et al., Int. Ed. 2001;40:3806;Chapman RN, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004;126:12252;Horne WS, et al., Chem., Int. Ed. 2008;47:2853;Madden et al., Chem Commun (Camb). 2009 Oct 7; (37): 5588-5590;Lau et al., Chem. Soc. Rev., 2015,44:91-102;および Gunnoo et al., Org. Biomol. Chem., 2016,14:8002-8013を参照されたく、これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。安定化ペプチドのさらなる例については、例えば、国際公開第WO2019/118893号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示のキメラの第1および/または第2の部分は、安定化ペプチド(例えば、ステープルペプチド)を含み得る。ペプチドヘリックスは、多くの重要な生物学的プロセス(例えば、アポトーシス)を調節する鍵となるタンパク質-タンパク質相互作用の重要なメディエーターであるが、そのようなヘリックスが、タンパク質の範囲内でその背景を無視して解釈され、単離して調製された場合、それは折りたたまれず、ランダムコイルコンフォメーションをとる場合があり、生物活性において劇的な減少につながり、したがって治療的潜在力が低下する。この問題を回避するために、構造的に安定化したペプチドを用いることができる。一部の場合では、構造的に安定化したペプチドは、内部(分子内)架橋(またはステープル)によって接合した少なくとも2個の改変アミノ酸を含む。本明細書において記載する安定化ペプチドは、ステープルペプチド、ステッチペプチド、複数のステッチを含むペプチド、複数のステープルを含むペプチド、またはステープルおよびステッチのミックスを含むペプチド、ならびに他の化学的戦略によって構造的に強化されたペプチドを含む(例えば、Balaram P. Cur. Opin. Struct. Biol. 1992;2:845;Kemp DS, et al., J. Am. Chem. Soc. 1996;118:4240;Orner BP, et al., J. Am. Chem. Soc. 2001;123:5382;Chin JW, et al., Int. Ed. 2001;40:3806;Chapman RN, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004;126:12252;Horne WS, et al., Chem., Int. Ed. 2008;47:2853;Madden et al., Chem Commun (Camb). 2009 Oct 7; (37): 5588-5590;Lau et al., Chem. Soc. Rev., 2015,44:91-102;および Gunnoo et al., Org. Biomol. Chem., 2016,14:8002-8013を参照されたく、これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。安定化ペプチドのさらなる例については、例えば、国際公開第WO2019/118893号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ペプチドをステープル化することによって安定化することができる(例えば、Walensky, J. Med. Chem., 57:6275-6288 (2014)を参照されたく、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。ステープルペプチドは、生体活性ペプチドの天然のα-ヘリックス形状を強化し、安定化された構造、in vivoでのプロテアーゼ耐性、強化された標的結合親和性、および好ましい薬理学を付与する(Walensky, L.D. & Bird, G.H. J Med Chem 57, 6275-88 (2014)、Walensky, L.D. et al. Science 305, 1466-70 (2004))。ペプチドは、その天然二次構造を維持する点で「安定化」されている。例えば、ステープル化は、α-ヘリックス二次構造を有する傾向があるポリペプチドが、その天然α-ヘリックスコンフォメーションを維持することを可能にする。この二次構造は、タンパク質の分解的切断および熱に対するポリペプチドの抵抗性を増加させ、標的への結合親和性、疎水性、および細胞透過性も増加させる場合がある。したがって、本明細書において記載するステープル(架橋)ポリペプチドは、対応する非ステープル(非架橋)ポリペプチドと比較して改善された生物活性を有する。
「ペプチドのステープル化」は、合成方法論から作り出された用語であり、ポリペプチド鎖に存在する2個のオレフィン含有側鎖(例えば、架橋可能な側鎖)が、閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有接合し(例えば、「一緒にステープル化され」)、架橋環を形成している(例えば、Blackwell et al., J. Org. Chem., 66: 5291-5302, 2001;Angew et al., Chem. Int. Ed. 37:3281, 1994を参照のこと)。「ペプチドのステープル化」という用語は、本明細書で使用される場合、そのような反応を促進し、単一の「ステープル」ポリペプチドを提供する任意の数の反応条件および/または触媒を使用した、ポリペプチド鎖に存在する場合がある2個の(例えば、少なくとも一対の)二重結合含有側鎖、三重結合含有側鎖、または二重結合含有および三重結合含有側鎖の接合を含む。「マルチプライ(multiply)ステープル」ポリペプチドという用語は、1個を超える個々のステープルを含み、2個、3個、またはそれを超えるさまざまな間隔の独立したステープルを含んでいてもよいポリペプチドを指す。さらに「ペプチドのステッチ化」という用語は、本明細書で使用される場合、2個のステープルが、例えば共通の残基に連結している「ステッチ」(例えば、直列のまたはマルチプライステープル)ポリペプチドを提供する、単一のポリペプチド鎖における複数のかつ直列の「ステープル化」事象を指す。ペプチドのステッチ化は、例えば、WO2008/121767およびWO2010/068684で開示されており、これら両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の場合では、ステープルは、本明細書で使用される場合、不飽和結合を保持することができるかまたは減少させることができる。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、炭化水素のステープル化によって安定化することができる。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、少なくとも2個(例えば、2、3、4、5、6個)のアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は、2個、3個、または6個のアミノ酸で隔てられ、置換されたアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である。多数の公知の非天然のまたは自然界には存在しないアミノ酸が存在し、これらのうちのいずれかは、ステープルペプチドに含まれる場合がある。自然界には存在しないアミノ酸の一部の例は、4-ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ-アミノ酪酸、ベータ-シアノアラニン、ノルバリン、4-(E)-ブテニル-4(R)-メチル-N-メチル-L-トレオニン、N-メチル-L-ロイシン、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-2-フェニル-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロブタンカルボン酸、4-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、3-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸、4-ピペリジル酢酸、4-アミノ-l-メチルピロール-2-カルボン酸、2,4-ジアミノ酪酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノ酪酸、2-アミノヘプタン二酸、4-(アミノメチル)安息香酸、4-アミノ安息香酸、オルト-、メタ-およびパラ-置換フェニルアラニン(例えば、-C(=O)C6H5;-CF3;-CN;-ハロ;-NO2;CH3で置換された)、二置換フェニルアラニン、置換チロシン(例えば、-C=O)C6H5;-CF3;-CN;-ハロ;-NO2;CH3でさらに置換された)、ならびにスタチンである。さらに、アミノ酸は、ヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、またはグリコシル化されたアミノ酸残基を含むように誘導体化することができる。
炭化水素ステープルポリペプチドは、2個の非天然アミノ酸間に1個または複数のテザー(連結)を含み、このテザーは、ポリペプチドのα-ヘリックス二次構造を顕著に強化する。一般的に、テザーは、1つまたは2つの螺旋ターン(すなわち、約3.4または約7個のアミノ酸)の長さにわたって伸長する。したがって、iおよびi+3個目;iおよびi+4個目;またはiおよびi+7個目に位置するアミノ酸は、化学的修飾および架橋に関して理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが、配列...X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9...を有する場合、X1とX4との間、またはX1とX5との間、またはX1とX8との間の架橋がそのペプチドの有用な炭化水素のステープル化形態であり、X2とX5との間、またはX2とX6との間、またはX2とX9との間などの架橋も同様である。複数の架橋(例えば、2、3、4個、またはそれを超える)の使用も検討される。複数の架橋の使用は、ペプチドの安定化および最適化において非常に効果的であり、特にペプチド長の増加を伴う。したがって、本開示のキメラに組み込まれ得るペプチドは、配列をさらに安定化させるためか、またはより長いポリペプチド伸長の構造安定化、タンパク質分解抵抗性、酸安定性、熱安定性、細胞透過性、および/または生物活性の強化を促進するために、ポリペプチド配列内に1個を超える架橋を組込み得る。炭化水素ステープルポリペプチドの作製および使用に関する追加の説明は、例えば、米国特許出願公開第2012/0172285号、同第2010/0286057号、および同第2005/0250680号で見出すことができ、これら全ての内容は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ステープルがiおよびi+3個目の残基にある場合、R-プロペニルアラニンおよびS-ペンテニルアラニン;またはR-ペンテニルアラニンおよびS-ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルがiおよびi+4個目の残基にある場合、S-ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルが、iおよびi+7個目の残基にある場合、S-ペンテニルアラニンおよびR-オクテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。一部の場合では、ペプチドがステッチ化されている場合、「ステッチ」に関与するペプチドのアミノ酸は、ビス-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニン;またはビス-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンで置換されている。
ステープルまたはステッチ位置は、ステープルウォークにおいてさまざまなステープル位置を試験することによって変更することができる。
図2(上部)は、さまざまな架橋化合物を生成するために使用することができる非天然アミノ酸の例示的な化学構造を示す。図2(中央)は、i位残基とi+3位残基との間;i位残基とi+4位残基との間;およびi位残基とi+7位残基との間に炭化水素架橋を有するペプチドを示す。図2(下部)は、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを示す。図3は、ダブルおよびトリプルステープル化戦略を含むさまざまなペプチド配列、ならびに例示的なステープルウォークを示す。図4は、さまざまな長さの分岐状ステッチ部分を使用した例示的なステープルウォークを示す。
一態様では、安定化ポリペプチドは式(I)
(式中、
各R1およびR2は、独立して、HまたはC1~C10アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり;
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル;[R4-K-R4]nであり;これらはそれぞれ0~6個のR5で置換されており;
R4は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり;
R5は、ハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光部分、または放射性同位体であり;
Kは、O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6であるか、または
であり、
R6は、H、アルキル、または治療剤であり;
nは1~4の整数であり;
xは2~10の整数であり;
各yは、独立して、0~100の整数であり;
zは、1~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)の整数であり;各Xaaは、独立してアミノ酸である)を有する。
各R1およびR2は、独立して、HまたはC1~C10アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり;
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル;[R4-K-R4]nであり;これらはそれぞれ0~6個のR5で置換されており;
R4は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり;
R5は、ハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光部分、または放射性同位体であり;
Kは、O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6であるか、または
R6は、H、アルキル、または治療剤であり;
nは1~4の整数であり;
xは2~10の整数であり;
各yは、独立して、0~100の整数であり;
zは、1~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)の整数であり;各Xaaは、独立してアミノ酸である)を有する。
テザーは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分(例えば、C5、C8、もしくはC11アルキル、C5、C8、もしくはC11アルケニル、またはC5、C8、もしくはC11アルキニル)を含んでいてもよい。テザーされたアミノ酸は、アルファ二置換(例えば、C1~C3またはメチル)とすることができる。
一部の場合では、xは2、3、または6である。一部の場合では、各yは、独立して、1から15または3から15の整数である。一部の場合では、R1およびR2は、それぞれ独立して、HまたはC1~C6アルキルである。一部の場合では、R1およびR2は、それぞれ独立して、C1~C3アルキルである。一部の場合では、R1およびR2のうちの少なくとも1つはメチルである。例えば、R1およびR2は、両方ともメチルとすることができる。一部の場合では、R3はアルキル(例えば、C8アルキル)であり、xは3である。一部の場合では、R3はC11アルキルであり、xは6である。一部の場合では、R3はアルケニル(例えば、C8アルケニル)であり、xは3である。一部の場合では、xは6であり、R3はC11アルケニルである。一部の場合では、R3は、直鎖状アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一部の場合では、R3は-CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CH2-である。
別の態様では、2個のアルファ、アルファ二置換立体中心は、両方ともR立体配置もしくはS立体配置(例えば、i、i+4個目の架橋)であるか、または一方の立体中心はRであり、もう一方はS(例えば、i、i+7個目の架橋)である。したがって、式I
として図示する場合、例えば、xが3のとき、C’およびC”二置換立体中心は、両方ともR立体配置とすることができるか、または両方ともS立体配置とすることができる。xが6である場合、C’二置換立体中心はR立体配置であり、C”二置換立体中心はS立体配置である。R3二重結合は、EまたはZ立体化学配置とすることができる。
一部の場合では、R3は、[R4-K-R4]nであり;R4は、直鎖状アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。
一部の実施形態では、本開示は、2個、3個、または6個のアミノ酸で隔てられた2個のアミノ酸の側鎖が内部ステープルで置き換えられた;3個のアミノ酸の側鎖が内部ステッチで置き換えられた;4個のアミノ酸の側鎖が2個の内部ステープルで置き換えられた、または5個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルおよび内部ステッチの組合せで置き換えられた、内部架橋された(「ステープル化された」または「ステッチ化された」)ペプチドを特徴とする。ステープル化された/ステッチ化されたペプチドは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個のアミノ酸長とすることができる。
ある特定の場合では、安定化ペプチドは、分解について標的化されるタンパク質(例えば、コロナウイルスプロテアーゼ)に結合する細胞内タンパク質のペプチド、E3ユビキチンリガーゼに結合するペプチド、またはE3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプター(例えば、WD40リピートタンパク質)に結合するペプチドである。
本開示のキメラに組み込むことができるステープルペプチドの非限定的な例を、以下に列挙する。
ATVNVLAWLYAAVINGD(配列番号2)-Mpro結合性ペプチド
ATVNVLAWLYX1AVIX2GD(配列番号3)-Mpro結合性ペプチド
ANLNAGBX1LGSX2AATVELQ(配列番号4)-NSP9結合性ペプチド
ANLNRGBX1LGSX2AATVRLQ(配列番号5)-NSP9結合性ペプチド
ここで、B=ノルロイシンであり、X1およびX2は、同じである(例えば、(S5))。
LTF(R8)EYWAQ#(S5)SAA(配列番号7)-ATSP-7041、#=シクロブチルアラニンである
LTF(R8)EYWAQL(S5)SAA(配列番号1)-p53(SP645)ある特定の実施形態では、ステープルペプチドは、配列番号1~7、12、13、38~47および49~50のうちのいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなる。ある特定の実施形態では、本開示は、ステープル/ステッチの位置が異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ-ヘリックスの非相互作用面上に1から7(例えば、1、2、3、4、5、6、7)個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。他の場合では、置換は非保守的である。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ-ヘリックスの相互作用面上に1から5(例えば、1、2、3、4、5)個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。ステープルペプチドに対する例示的な変形/改変のタイプを図5に示す。
ATVNVLAWLYAAVINGD(配列番号2)-Mpro結合性ペプチド
ATVNVLAWLYX1AVIX2GD(配列番号3)-Mpro結合性ペプチド
ANLNAGBX1LGSX2AATVELQ(配列番号4)-NSP9結合性ペプチド
ANLNRGBX1LGSX2AATVRLQ(配列番号5)-NSP9結合性ペプチド
ここで、B=ノルロイシンであり、X1およびX2は、同じである(例えば、(S5))。
LTF(R8)EYWAQ#(S5)SAA(配列番号7)-ATSP-7041、#=シクロブチルアラニンである
LTF(R8)EYWAQL(S5)SAA(配列番号1)-p53(SP645)ある特定の実施形態では、ステープルペプチドは、配列番号1~7、12、13、38~47および49~50のうちのいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなる。ある特定の実施形態では、本開示は、ステープル/ステッチの位置が異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ-ヘリックスの非相互作用面上に1から7(例えば、1、2、3、4、5、6、7)個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。他の場合では、置換は非保守的である。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ-ヘリックスの相互作用面上に1から5(例えば、1、2、3、4、5)個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。ステープルペプチドに対する例示的な変形/改変のタイプを図5に示す。
VII.安定化ペプチドにおけるテザー
炭化水素テザーが、本開示の安定化ペプチドにおいて使用される。一部の場合では、他のテザーもまた、本開示の安定化ペプチドにおいて用いられ得る。例えば、テザーは、1個または複数のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、またはアミド、またはトリアゾール部分を含んでいてもよい。一部の場合では、天然に存在するアミノ酸側鎖を、テザー中に組み込むことができる。例えば、テザーは、官能基、例えばセリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リシン中の第1級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸中の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミン中のアミドとカップリングすることができる。したがって、2個の天然に存在しないアミノ酸をカップリングすることによって作製されるテザーを使用するのではなく、天然に存在するアミノ酸を使用してテザーを生成することが可能である。天然に存在するアミノ酸とともに単一の天然に存在しないアミノ酸を使用することも可能である。トリアゾール含有(例えば、1,4トリアゾールまたは1,5トリアゾール)架橋を使用することができる(例えば、Kawamoto et al. 2012 Journal of Medicinal Chemistry 55:1137;WO2010/060112を参照のこと)。更に、異なるタイプのステープル化を行う他の方法は当技術分野において周知であり、それを用いることができる(例えば、ラクタムステープル化:Shepherd et al., J. Am. Chem. Soc., 127:2974-2983 (2005);UV付加環化ステープル化:Madden et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 21:1472-1475 (2011);ジスルフィドステープル化:Jackson et al., Am. Chem. Soc.,113:9391-9392 (1991);オキシムステープル化:Haney et al., Chem. Commun., 47:10915-10917 (2011);チオエーテルステープル化:Brunel and Dawson, Chem. Commun., 552-2554 (2005);光スイッチ(Photoswitchable)ステープル化:J. R. Kumita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97:3803-3808 (2000);ダブルクリックステープル化:Lau et al., Chem. Sci., 5:1804-1809 (2014);ビス-ラクタムステープル化:J. C. Phelan et al.,, J. Am. Chem. Soc., 119:455-460 (1997);およびビス-アリール化ステープル化:A. M. Spokoyny et al., J. Am. Chem. Soc., 135:5946-5949 (2013)を参照のこと)。
炭化水素テザーが、本開示の安定化ペプチドにおいて使用される。一部の場合では、他のテザーもまた、本開示の安定化ペプチドにおいて用いられ得る。例えば、テザーは、1個または複数のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、またはアミド、またはトリアゾール部分を含んでいてもよい。一部の場合では、天然に存在するアミノ酸側鎖を、テザー中に組み込むことができる。例えば、テザーは、官能基、例えばセリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リシン中の第1級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸中の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミン中のアミドとカップリングすることができる。したがって、2個の天然に存在しないアミノ酸をカップリングすることによって作製されるテザーを使用するのではなく、天然に存在するアミノ酸を使用してテザーを生成することが可能である。天然に存在するアミノ酸とともに単一の天然に存在しないアミノ酸を使用することも可能である。トリアゾール含有(例えば、1,4トリアゾールまたは1,5トリアゾール)架橋を使用することができる(例えば、Kawamoto et al. 2012 Journal of Medicinal Chemistry 55:1137;WO2010/060112を参照のこと)。更に、異なるタイプのステープル化を行う他の方法は当技術分野において周知であり、それを用いることができる(例えば、ラクタムステープル化:Shepherd et al., J. Am. Chem. Soc., 127:2974-2983 (2005);UV付加環化ステープル化:Madden et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 21:1472-1475 (2011);ジスルフィドステープル化:Jackson et al., Am. Chem. Soc.,113:9391-9392 (1991);オキシムステープル化:Haney et al., Chem. Commun., 47:10915-10917 (2011);チオエーテルステープル化:Brunel and Dawson, Chem. Commun., 552-2554 (2005);光スイッチ(Photoswitchable)ステープル化:J. R. Kumita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97:3803-3808 (2000);ダブルクリックステープル化:Lau et al., Chem. Sci., 5:1804-1809 (2014);ビス-ラクタムステープル化:J. C. Phelan et al.,, J. Am. Chem. Soc., 119:455-460 (1997);およびビス-アリール化ステープル化:A. M. Spokoyny et al., J. Am. Chem. Soc., 135:5946-5949 (2013)を参照のこと)。
テザーの長さが変わる場合がある点が更に想定される。例えば、二次性アルファ-ヘリックス構造に対して比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合、長さが短いテザーを使用することができるが、一部の場合では、二次性アルファ-ヘリックス構造に対して拘束は低いことが望ましく、したがって長いテザーが望まれる場合がある。
さらに、主にアルファヘリックスの片面上にあるテザーを与えるために、アミノ酸iからi+3個目、iからi+4個目、およびiからi+7個目までのテザー全長は共通であるが、テザーは、アミノ酸の数の任意の組合せに及ぶように合成することができ、複数のテザーを導入するように組み合わせて使用することもできる。
一部の場合では、本明細書において記載する炭化水素テザー(すなわち、架橋)は、更に操作することができる。一例では、(例えば、ルテニウム触媒による閉環メタセシス(RCM)を使用して合成されるような)炭化水素アルケニルテザーの二重結合を酸化し、(例えば、エポキシ化、アミノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化を介して)、以下の化合物のうちの1つを提供することができる。
エポキシド部分か、または遊離ヒドロキシル部分のうちの1つのいずれかは、さらに官能基化することができる。例えば、エポキシドは、例えば、治療剤に結合するために使用することができる追加の官能性を与える求核試薬で処置することができる。あるいはそのような誘導体化は、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端の合成操作によってまたはアミノ酸側鎖を介して達成することができる。他の薬剤、例えばポリペプチドが細胞中に侵入するのを促進する薬剤を、官能基化テザーに結合させることができる。
一部の場合では、アルファ二置換アミノ酸は、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善するためにポリペプチドにおいて使用する。しかし、アルファ二置換アミノ酸は必須ではなく、(例えば、テザーされたアミノ酸において)モノ-アルファ置換基を使用した場合も想定される。
ステープルポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコール誘導体;第2のポリペプチド;炭水化物などを含んでいてもよい。ポリマーまたは他の薬剤がステープルポリペプチドに連結している場合、組成物は実質的に均質であることが望ましい場合がある。
ポリエチレングリコール(PEG)分子が付加すると、ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性が改善される場合がある。例えば、PEG化を行うと、腎クリアランスを低下させることができ、より安定な血漿濃度をもたらす場合がある。PEGは水溶性ポリマーであり、式:
XO--(CH2CH2O)n--CH2CH2-Y
(式中、nは2から10,000であり、Xは、Hまたは末端改変、例えばC1~4アルキルであり;Yは、ポリペプチドのアミン基(これらに限定されないが、リシンのイプシロンアミン、またはN末端を含む)への、アミド、カルバメートまたは尿素連結である)としてポリペプチドへ連結しているとして表すことができる。Yはまた、チオール基(これらに限定されないがシステインのチオール基を含む)へのマレイミド連結であってもよい。PEGをポリペプチドに直接的にまたは間接的に連結するための他の方法は、当業者であれば公知である。PEGは、直鎖状または分岐状とすることができる。さまざまな官能基化誘導体を含むPEGのさまざまな形態が市販されている。
(式中、nは2から10,000であり、Xは、Hまたは末端改変、例えばC1~4アルキルであり;Yは、ポリペプチドのアミン基(これらに限定されないが、リシンのイプシロンアミン、またはN末端を含む)への、アミド、カルバメートまたは尿素連結である)としてポリペプチドへ連結しているとして表すことができる。Yはまた、チオール基(これらに限定されないがシステインのチオール基を含む)へのマレイミド連結であってもよい。PEGをポリペプチドに直接的にまたは間接的に連結するための他の方法は、当業者であれば公知である。PEGは、直鎖状または分岐状とすることができる。さまざまな官能基化誘導体を含むPEGのさまざまな形態が市販されている。
分解可能な連結を骨格において有するPEGを使用することができる。例えば、PEGは、加水分解するための対象であるエステル連結を用いて調製することができる。分解可能なPEG連結を有するコンジュゲートは、WO99/34833、WO99/14259、およびU.S.6,348,558に記載されている。
ある特定の実施形態では、高分子ポリマー(例えば、PEG)は、中間体リンカーを介して本明細書において記載する薬剤に結合している。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された1から20個のアミノ酸で構成されており(made up of)、アミノ酸は、20種類の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの一部は、当業者であれば十分に理解しているようにグリコシル化されていてもよい。他の実施形態では、1から20個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態では、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸で構成されている。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、アルキルリンカー、例えば-NH(CH2)nC(O)-(式中、n=2~20)を使用することができる。これらのアルキルリンカーは、任意の立体障害のない基、例えば低級アルキル(例えば、C1~C6)低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニル等でさらに置換されていてもよい。米国特許第5,446,090号では、二官能性PEGリンカー、および各PEGリンカー末端でペプチドを有するコンジュゲートの形成におけるその使用が記載されている。
一部の実施形態では、安定化ペプチドも、例えば、細胞取込みをさらに促進するために、またはin vivo安定性を増加させるために改変してもよい。例えば、ペプチド模倣大員環をアシル化またはPEG化すると、細胞取込みが促進され、バイオアベイラビリティが増加し、血液循環が増加し、薬物動態が変化し、免疫原性が減少しおよび/または必要とされる投与頻度が減少する。
一部の実施形態では、本明細書において開示されるステープルペプチドは、(例えば、非ステープルペプチドと比較して)細胞膜を貫通するための強化された能力を有する。
本明細書において記載する安定化ペプチドを合成する方法は当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用する場合がある。さまざまなステップを、代替の配列または順序で行い、所望の化合物を得てもよいことは理解されるであろう。本明細書において記載する化合物の合成において有用である合成化学的変換および官能基を保護する方法論(保護および脱保護)は、当技術分野において公知であり、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989);T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999);L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994);およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにこれらのその後の版に記載されているものを含む。
安定化ペプチドは、当業者であれば周知の化学的合成方法によって作製することができる。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照されたい。したがって、ペプチドは、例えばApplied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430Aまたは431において、側鎖が保護されたアミノ酸を使用してt-BocまたはFmoc化学作用で保護されたα-NH2を用いた固相合成の自動化Merrifield技術を使用して合成することができる。
本明細書において記載するペプチドを作製する一様式は、固相ペプチド合成(SPPS)を使用することである。C末端アミノ酸は、リンカー分子を用い、酸に不安定な結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は、合成のために使用する溶媒に不溶性であり、過剰な試薬および副生成物を洗い流すのを比較的単純にかつ迅速にする。N末端は、酸において安定なFmoc基で保護されるが、塩基によって取り外し可能である。任意の側鎖官能基は、塩基で安定であり、酸に不安定な基で保護される。
長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを使用して個々の合成ペプチドを連接させることによって作製してもよい。あるいは、長い合成ペプチドは、周知の組換えDNA技術によって合成することができる。そのような技術は、詳細なプロトコール含む周知の標準的なマニュアルとして提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳し、好ましくは遺伝子が発現される生物に最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的には必要に応じてペプチドおよび任意の調節性エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製する。合成遺伝子を、好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞中にトランスフェクトする。次いで、ペプチドを、選択された発現系および宿主に適切な好適な状態下で発現させる。ペプチドは精製し、標準的な方法によって特徴付ける。
ペプチドは、例えば、Advanced Chemtechから入手可能なハイスループットマルチチャンネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用したハイスループット組合せ様式で作製することができる。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を高めるために、レトロインベルソ結合(C(O)-NH);還元アミド結合(NH-CH2);チオメチレン結合(S-CH2またはCH2-S);オキソメチレン結合(O-CH2またはCH2-O);エチレン結合(CH2-CH2);チオアミド結合(C(S)-NH);トランス-オレフィン結合(CH=CH);フルオロ置換トランス-オレフィン結合(CF=CH);ケトメチレン結合(C(O)-CHR)またはCHR-C(O)(式中、RはHまたはCH3である);およびフルオロケトメチレン結合(C(O)-CFRまたはCFR-C(O)(式中、RはHまたはFまたはCH3である)で置き換えることができる。
ポリペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化(Ser、TyrまたはThr)、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によってさらに改変することができる。上記で示すように、ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG);アルキル基(例えば、C1~C20直鎖状または分岐状アルキル基);脂肪酸ラジカル;およびこれらの組合せにコンジュゲートすることができる。さまざまな長さのオレフィン側鎖を含むα、α-二置換非天然アミノ酸は、公知の方法で合成することができる(Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991;Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000;およびBird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008;Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011)。ペプチドに関しては、i+7個目のステープルに連結したi個目を使用する(ヘリックス2回転が安定化される)場合、a)1個のS5アミノ酸および1個のR8を使用するか、またはb)1個のS8アミノ酸および1個のR5アミノ酸を使用する。R8は、出発キラル助剤がR-アルキル-立体異性体をもたらすことを除いて、同様の経路を使用して合成する。また、8-ヨードオクテンを5-ヨードペンテンの代わりに使用する。阻害剤は、MBHA樹脂上での固相ペプチド合成(SPPS)を使用して固体支持体上で合成する(例えば、WO2010/148335を参照のこと)。
Fmoc-保護されたα-アミノ酸(オレフィンアミノ酸Fmoc-S5-OH、Fmoc-R8-OH、Fmoc-R8-OH、Fmoc-S8-OHおよびFmoc-R5-OH以外)、2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、およびRink Amide MBHAは、例えば、Novabiochem(San Diego、CA)から市販されている。ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル-2-ピロリジノン(NMP)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、トリフルオロ酢酸(TFA)、1,2-ジクロロエタン(DCE)、フルオロセインイソチオシアネート(FITC)、およびピペリジンは、例えば、Sigma-Aldrichから市販されている。オレフィンアミノ酸合成は、当技術分野において報告されている(Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003)。
本開示のキメラに組み込まれ得る本明細書において開示されるステープル化され、精製されたペプチドを得る(例えば、合成する)のに好適な方法もやはり、当技術分野において公知である(例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008);Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011;Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004);Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000);2010年3月18日に出願された米国特許出願公開第12/525,123号;および2010年5月25日に登録された米国特許第7,723,468号を参照されたく、これらそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、ペプチドは、非ステープルペプチド混入物質を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法としては、例えば、固相支持体上でのペプチド合成がある。環化後、固相支持体は、単離し、溶媒溶液、例えばDMSO、DMSO/ジクロロメタン混合物、またはDMSO/NMP混合物中に懸濁してもよい。DMSO/ジクロロメタンまたはDMSO/NMP混合物は、約30%、40%、50%または60%のDMSOを含んでいてもよい。特定の実施形態では、50%/50%DMSO/NMP溶液を使用する。溶液は、1、6、12または24時間インキュベートしてもよく、その後、樹脂は、例えばジクロロメタンまたはNMPで洗浄してもよい。一実施形態では、樹脂はNMPで洗浄する。振盪および溶液中への不活性ガスのバブリングを行ってもよい。
本開示の安定化(例えば、ステープル)ポリペプチドの特性は、例えば、例として、国際公開第WO2019/118893号に記載される方法を使用して、アッセイすることができ、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
VIII.リンカー
上述の構築物において使用することができるリンカーに関しては、特に制限はない。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸、例えばアミノプロピオン酸、アミノブタン酸、アミノペンタン酸、またはアミノヘキサン酸である。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴエチレングリコール、すなわち、NH2-(CH2-CH2-O)x-CH2-CH2-COOHである。一部の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の実施形態では、約1から30個の残基(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のアミノ酸)を含む任意の(any arbitrary)単一鎖ペプチドをリンカーとして使用することができる。他の実施形態では、リンカーは、10から20、10から30、10から40、10から50、10から60、10から70、10から80、10から90、10から100、10から144、または10から150個のアミノ酸長である。ある特定の場合では、リンカーは、グリシンおよび/またはセリン残基のみを含む。そのようなペプチドリンカーの例としては、Gly、Ser;GlySer;GlyGlySer;SerGlyGly;GlyGlyGlySer(配列番号16);SerGlyGlyGly(配列番号17);GlyGlyGlyGlySer(配列番号18);SerGlyGlyGlyGly(配列番号19);GlyGlyGlyGlyGlySer(配列番号20);SerGlyGlyGlyGlyGly(配列番号21);GlyGlyGlyGlyGlyGlySer(配列番号22);SerGlyGlyGlyGlyGlyGly(配列番号23);(GlyGlyGlyGlySer)n(配列番号24)n(ここで、nは1またはそれよりも多い整数である);および(SerGlyGlyGlyGly)n(配列番号25)n(ここで、nは1またはそれよりも多い整数である)がある。一部の場合では、リンカーは、リンカーの各コピーにおけるセリン残基が別のアミノ酸で置き換えられていることを除いて、配列番号16のアミノ酸配列の複数のコピー(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10コピー)を有する。
上述の構築物において使用することができるリンカーに関しては、特に制限はない。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸、例えばアミノプロピオン酸、アミノブタン酸、アミノペンタン酸、またはアミノヘキサン酸である。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴエチレングリコール、すなわち、NH2-(CH2-CH2-O)x-CH2-CH2-COOHである。一部の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の実施形態では、約1から30個の残基(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のアミノ酸)を含む任意の(any arbitrary)単一鎖ペプチドをリンカーとして使用することができる。他の実施形態では、リンカーは、10から20、10から30、10から40、10から50、10から60、10から70、10から80、10から90、10から100、10から144、または10から150個のアミノ酸長である。ある特定の場合では、リンカーは、グリシンおよび/またはセリン残基のみを含む。そのようなペプチドリンカーの例としては、Gly、Ser;GlySer;GlyGlySer;SerGlyGly;GlyGlyGlySer(配列番号16);SerGlyGlyGly(配列番号17);GlyGlyGlyGlySer(配列番号18);SerGlyGlyGlyGly(配列番号19);GlyGlyGlyGlyGlySer(配列番号20);SerGlyGlyGlyGlyGly(配列番号21);GlyGlyGlyGlyGlyGlySer(配列番号22);SerGlyGlyGlyGlyGlyGly(配列番号23);(GlyGlyGlyGlySer)n(配列番号24)n(ここで、nは1またはそれよりも多い整数である);および(SerGlyGlyGlyGly)n(配列番号25)n(ここで、nは1またはそれよりも多い整数である)がある。一部の場合では、リンカーは、リンカーの各コピーにおけるセリン残基が別のアミノ酸で置き換えられていることを除いて、配列番号16のアミノ酸配列の複数のコピー(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10コピー)を有する。
一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー、化学リンカー、グリシン-セリンリンカー、(G4S)3(配列番号26)、(G4S)5(配列番号27)、ベータ-アラニン(Z)リンカー、ベータ-アラニンおよびアラニン(ZA)リンカー、またはポリエチレングリコールリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、ベータ-アラニンを含む。別の実施形態では、リンカーは、ベータ-アラニンおよびアラニンリンカーを含む。
他の実施形態では、リンカーペプチドは、(従来のGly/Serリンカーペプチドリピートのジャンクションにおいて生じる)アミノ酸配列GSGが存在しないように改変される。例えば、ペプチドリンカーは、(GGGXX)nGGGGS(配列番号28)およびGGGGS(XGGGS)n(配列番号29)(ここで、Xは、配列へ挿入することができ、配列GSGを含むポリペプチドはもたらさない任意のアミノ酸であり、nは0から4である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーペプチドの配列は、(GGGX1X2)nGGGGS(ここで、X1はPであり、X2はSであり、nは0から4である)(配列番号30)である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、(GGGX1X2)nGGGGS(ここで、X1はGであり、X2はQであり、nは0から4である)(配列番号31)である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、(GGGX1X2)nGGGGS(ここで、X1はGであり、X2はAであり、nは0から4である)(配列番号32)である。更に別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、GGGGS(XGGGS)n(ここで、XはPであり、nは0から4である)(配列番号33)である。一実施形態では、本発明のリンカーペプチドは、アミノ酸配列(GGGGA)2GGGGS(配列番号34)を含むか、またはそれからなる。別の実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列(GGGGQ)2GGGGS(配列番号35)を含むかまたはそれからなる。更に別の実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列(GGGPS)2GGGGS(配列番号36)を含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列GGGGS(PGGGS)2(配列番号37)を含むかまたはそれからなる。
ある特定の実施形態では、リンカーは、合成化合物リンカー(化学的架橋剤)である。市場で入手可能な架橋剤の例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ-EGS)、酒石酸ジスクシンイミジル(DST)、酒石酸ジスルホスクシンイミジル(スルホ-DST)、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、およびビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)がある。
ある特定の実施形態では、リンカーは、図7で図示するリンカーである。
IX.Mpro阻害剤ペプチド
本開示は、配列番号2または3に記載の配列を有する新規なペプチドであって、Mproに結合し、それを阻害する(例えば、Mpro二量体化および/またはMpro酵素活性を阻害する)ことができ、それによって、ウイルス(例えば、コロナウイルス)の成熟および/または複製を阻害することができる、ペプチドを特徴とする。本開示はまた、バリアント、例えば、配列番号2または3とは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個のアミノ酸が異なる配列も特徴とし、ここで、バリアントは、Mproを阻害する。一部の場合では、ペプチドは、配列番号2または3におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約30%、少なくとももしくは約40%、少なくとももしくは約50%、少なくとももしくは約60%、少なくとももしくは約70%、少なくとももしくは約75%の同一性、少なくとももしくは約80%、少なくとも85%、少なくとももしくは約90%、少なくとももしくは約95%、少なくとももしくは約98%、少なくとももしくは約99%、または100%の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、Mproに結合し、Mpro二量体化および/またはMpro酵素活性を阻害する。一部の場合では、これらのペプチドは、コロナウイルス(例えば、SARS-CoV2)活性を阻害する(例えば、ウイルスの成熟および複製を阻害する)。
本開示は、配列番号2または3に記載の配列を有する新規なペプチドであって、Mproに結合し、それを阻害する(例えば、Mpro二量体化および/またはMpro酵素活性を阻害する)ことができ、それによって、ウイルス(例えば、コロナウイルス)の成熟および/または複製を阻害することができる、ペプチドを特徴とする。本開示はまた、バリアント、例えば、配列番号2または3とは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個のアミノ酸が異なる配列も特徴とし、ここで、バリアントは、Mproを阻害する。一部の場合では、ペプチドは、配列番号2または3におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約30%、少なくとももしくは約40%、少なくとももしくは約50%、少なくとももしくは約60%、少なくとももしくは約70%、少なくとももしくは約75%の同一性、少なくとももしくは約80%、少なくとも85%、少なくとももしくは約90%、少なくとももしくは約95%、少なくとももしくは約98%、少なくとももしくは約99%、または100%の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、Mproに結合し、Mpro二量体化および/またはMpro酵素活性を阻害する。一部の場合では、これらのペプチドは、コロナウイルス(例えば、SARS-CoV2)活性を阻害する(例えば、ウイルスの成熟および複製を阻害する)。
一部の実施形態では、Mpro阻害剤ペプチドは、組換えまたは合成により産生されたペプチドである。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにMproと相互作用し、その二量体化および/または酵素活性を阻害する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチドは、それらが、1~5個(例えば、1個、2個、3個、4個、5個)のアミノ酸置換を有することで配列番号2または3から変動しているという点で、配列番号2または3のペプチドとは異なる。一部の場合では、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸(例えば、S5)が、配列番号2の3位および7位に挿入される。一部の場合では、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸(例えば、S5)が、配列番号2の11位および15位に挿入される。ある特定の場合では、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸(例えば、S5)が、配列番号2の3位および7位、ならびに11位および15位に挿入される。これらのステープルペプチドのそれぞれは、これらのステープルペプチドが、Mproに結合しそれを阻害するその能力を保持する限り、1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸置換をさらに含み得る。例えば、「X」とラベル付けされた位置は、配列番号2または3において、以下のように置換され得る:ATXNVLXWLYXAVIXGD(配列番号51)。Xは、保存的アミノ酸残基であってもよく、または非保存的アミノ酸残基であってもよい。一部の実施形態では、「X」は、非天然アミノ酸、例えば、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニン(S5)である。それらの実施形態では、ペプチドは、i位とi+4位との間で単一ステープル化または二重ステープル化されていてもよい。
Mproの酵素活性は、アルファヘリックス配列TVNVLAWLYAAVINGD(配列番号9)によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号9は、ペプチドをベースとした二量体化阻害剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、Mpro阻害剤ペプチドは、少なくとも6個(例えば、配列番号9の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の連続したアミノ酸)を含み得る。一部の場合では、Mpro結合剤ペプチドは、例えば、配列番号9とは、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入によって異なる、配列番号9のバリアントであってもよく、ここで、バリアントは、依然としてMproと二量体を形成することができる。
一部の実施形態では、Mpro阻害剤ペプチドは、例えば、配列番号2または3のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号2または3のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。
あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および/または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個未満、5個未満、4個未満、3個未満、または2個未満のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてMproに結合し、その二量体化および/または酵素活性を阻害することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるMpro阻害剤ペプチドのうちのいずれのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがMproに結合し、それを阻害する限り、変動し得る。
X.NSP9阻害剤ペプチド
本開示は、配列番号4または5に記載の配列を有する新規なペプチドであって、NSP9に結合し、それを阻害する(例えば、NSP9二量体化および/またはNSP9酵素活性を阻害する)ことができ、それによって、ウイルス(例えば、コロナウイルス)の成熟および/または複製を阻害することができる、ペプチドを特徴とする。一部の実施形態では、NSP9阻害剤ペプチドは、組換えまたは合成により産生されたペプチドである。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにNSP9と相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。
本開示は、配列番号4または5に記載の配列を有する新規なペプチドであって、NSP9に結合し、それを阻害する(例えば、NSP9二量体化および/またはNSP9酵素活性を阻害する)ことができ、それによって、ウイルス(例えば、コロナウイルス)の成熟および/または複製を阻害することができる、ペプチドを特徴とする。一部の実施形態では、NSP9阻害剤ペプチドは、組換えまたは合成により産生されたペプチドである。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにNSP9と相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。
NSP9の酵素活性は、アルファヘリックス配列NLNRGMVLGSLAATVRLQ(配列番号10)によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号10は、ペプチドをベースとした二量体化結合剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、NSP9阻害剤ペプチドは、少なくとも6個(例えば、配列番号10の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、または18個の連続したアミノ酸)を含み得る。一部の場合では、NSP9阻害剤ペプチドは、バリアントペプチドが依然としてNSP9に結合し、それを阻害する限り、配列番号10において少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個のアミノ酸置換または欠失を含み得る。一部の場合では、NSP9阻害剤ペプチドは、配列GXXXG(配列番号8)を含む。
一部の実施形態では、NSP9阻害剤ペプチドは、例えば、配列番号4または5のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号4または5のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号4または5におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約30%、少なくとももしくは約40%、少なくとももしくは約50%、少なくとももしくは約60%、少なくとももしくは約70%、少なくとももしくは約80%、少なくとも85%、少なくとももしくは約90%、少なくとももしくは約95%、少なくとももしくは約98%、少なくとももしくは約99%、または100%の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、NSP9に結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および/または欠失を含み得る。例えば、アミノ酸は、保存的であるかどうかにかかわらず、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、10個未満、5個未満、4個未満、3個未満、または2個未満のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を含み得る。したがって、本明細書において開示されるNSP9阻害剤ペプチドのアミノ酸配列は、バリアントペプチドが依然としてNSP9に結合し、それを阻害する限り、変動し得る。
一部の場合では、配列番号4もしくは5のNSP9阻害剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、配列のそれぞれの末端において、1個、2個、または3個のアミノ酸だけ短縮されていてもよい。他の場合では、配列番号4もしくは5のNSP9阻害剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、ステープルを含まなくてもよく、1つのステープル(例えば、S5とS5との間(i,i+4位)、R8とS5との間(i,i+7位)、またはS5とR8との間(i,i+7)に形成されるステープル)を含んでもよく、または二重ステープル化されていてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチドは、それらが、1~4個(例えば、1個、2個、3個、4個)のアミノ酸置換を有することで配列番号4または5から変動しているという点で、配列番号4または5のペプチドとは異なる。例えば、「X」とラベル付けされた位置は、配列番号4において、以下のように置換され得る:ANLNAGBXLGSXAATVELQ(配列番号52)。Xは、保存的アミノ酸残基であってもよく、または非保存的アミノ酸残基であってもよい。一部の実施形態では、「X」は、非天然アミノ酸、例えば、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニン(S5)である。それらの実施形態では、ペプチドは、i位とi+4位との間で単一ステープル化され得る。一部の場合では、必要とされるコアペプチド配列は、GX1X2X3Gモチーフ(配列番号8)であり、X1、X2、およびX3は、任意のアミノ酸であり得る。一部の場合では、X1=M、ノルロイシン(B)、A、またはGであり、X2=V、A、G、M、またはBであり、X3=L、A、G、V、またはIである。
XI.処置の方法
本明細書において開示されるキメラは、キメラ分子が結合する標的タンパク質(例えば、ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、または宿主BETタンパク質)の分解を促進することができる。ある特定の場合では、本開示のキメラによって分解されるタンパク質は、コロナウイルスPLproタンパク質である。一部の場合では、コロナウイルスMproタンパク質は、本開示のキメラによって分解される。他の場合では、コロナウイルスNSP9タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。ある特定の場合では、コロナウイルスMproタンパク質は、本開示のキメラによって分解される。さらに他の場合では、宿主BRD2タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。一部の場合では、宿主BRD3タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。さらに一部の場合では、宿主BRD4タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、および/または宿主BETタンパク質の分解は、例えば、コロナウイルス感染症を処置すること、コロナウイルス複製を阻害すること、コロナウイルス負荷を低減すること、コロナウイルス感染症または疾患(例えば、COVID-19)と関連する症状を処置すること、ウイルス病原性を低減すること、コロナウイルスクリアランスまでの時間を低減すること、およびコロナウイルス感染症を有する対象の臨床転帰における死亡率を低減することにおいて、有用である。本開示のキメラは、個体がコロナウイルス疾患(例えば、SARSまたはCOVID-19)を発症するであろう危険性を低減する方法を、さらに提供する。一部の場合では、本開示のキメラでのコロナウイルス感染症の処置は、症状、例えば、発熱および悪寒、咳嗽、息切れまたは呼吸困難、疲労、筋肉痛または体の痛み、頭痛、味覚または嗅覚の喪失、咽喉痛、鼻詰まりまたは鼻水、吐き気または嘔吐、ならびに下痢を低減させる。
本明細書において開示されるキメラは、キメラ分子が結合する標的タンパク質(例えば、ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、または宿主BETタンパク質)の分解を促進することができる。ある特定の場合では、本開示のキメラによって分解されるタンパク質は、コロナウイルスPLproタンパク質である。一部の場合では、コロナウイルスMproタンパク質は、本開示のキメラによって分解される。他の場合では、コロナウイルスNSP9タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。ある特定の場合では、コロナウイルスMproタンパク質は、本開示のキメラによって分解される。さらに他の場合では、宿主BRD2タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。一部の場合では、宿主BRD3タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。さらに一部の場合では、宿主BRD4タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスNSP、および/または宿主BETタンパク質の分解は、例えば、コロナウイルス感染症を処置すること、コロナウイルス複製を阻害すること、コロナウイルス負荷を低減すること、コロナウイルス感染症または疾患(例えば、COVID-19)と関連する症状を処置すること、ウイルス病原性を低減すること、コロナウイルスクリアランスまでの時間を低減すること、およびコロナウイルス感染症を有する対象の臨床転帰における死亡率を低減することにおいて、有用である。本開示のキメラは、個体がコロナウイルス疾患(例えば、SARSまたはCOVID-19)を発症するであろう危険性を低減する方法を、さらに提供する。一部の場合では、本開示のキメラでのコロナウイルス感染症の処置は、症状、例えば、発熱および悪寒、咳嗽、息切れまたは呼吸困難、疲労、筋肉痛または体の痛み、頭痛、味覚または嗅覚の喪失、咽喉痛、鼻詰まりまたは鼻水、吐き気または嘔吐、ならびに下痢を低減させる。
本開示は、RNAウイルス(例えば、コロナウイルス、例えば、SARS-CoV2)によって引き起こされる感染症または疾患の予防および/または処置を、それを必要とする対象(例えば、ヒト対象)において行うために、本明細書に記載するキメラのいずれかを使用する方法を特徴とする。本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」などの用語は、対象が患う疾患または状態を軽減する、阻害する、または好転させる(ameliorate)ことを指す。例えば、本開示のキメラは、SARS-CoV2によって引き起こされるCOVID-19を処置するために使用することができる。本開示はまた、疾患(例えば、COVID-19)またはその症状を、完全にまたは部分的に予防する方法も特徴とする。
本開示は、既知のまたは疑いのあるコロナウイルスへの曝露の後に、コロナウイルス感染症の臨床徴候を呈する対象(例えば、ヒト、霊長類、コウモリ、トリ、マウス、シチメンチョウ、ウシ、ブタ、ネコ、イヌなど)におけるコロナウイルス(例えば、SARS-CoV-2)感染症を治療的に処置する方法をさらに提供する。コロナウイルス感染症と診断されている個体と濃厚接触している対象、および発熱(38℃を超えることが多い)、悪寒、咳嗽、息切れまたは呼吸困難、疲労、筋肉痛または体の痛み、頭痛、味覚喪失、嗅覚喪失、咽喉痛、鼻詰まりまたは鼻水、吐き気または嘔吐、下痢を含むがこれらに限定されない1つまたは複数の症状を呈する対象は、本開示の方法での処置に適格であると考えられる。主題の方法の利点は、コロナウイルス感染症の重症度が低減されること、例えば、ウイルス負荷が低減されること、および/またはウイルスクリアランスまでの時間が低減されること、および/または罹患率もしくは死亡率が低減されることである。
一部の実施形態では、本開示は、コロナウイルス(例えば、SARS-CoV-2)感染症の処置または予防を、それを必要とするかまたはその危険性がある対象において行うための方法であって、対象に、本開示のキメラ組成物を、1つまたは複数の抗ウイルス薬、またはコルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、IL-6阻害剤、IL-1阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、およびインターフェロン-ベータを含むがこれらに限定されない他の薬剤と組み合わせて含む組成物を投与することによって行う、方法を提供する。
本開示は、まだコロナウイルスに感染していない個体、および/またはコロナウイルス感染症に典型的な症状を呈していない個体において、コロナウイルス感染症を予防的に処置する方法を提供する。そのような個体としては、例えば、医療従事者、COVID-19を有する個体と限定された空間にいる人物(例えば、商用航空会社の職員、例えば、客室乗務員およびパイロット、旅行者、会議出席者など)、ならびにCOVID-19を有する個体と同じ世帯の居住者を含む、COVID-19を有する個体と接触したものが挙げられる。本開示の利点は、個体が病的なコロナウイルス感染症を発症するであろう危険性が低減されることである。
本明細書で使用される場合、「コロナウイルス」という用語は、コロナウイルス科の任意のメンバーを含み、これには、コロナウイルス属の任意のメンバーが含まれるが、これらに限定されない。コロナウイルス属としては、アルファコロナウイルス(Alphacoronavirus)株(例えば、ヒトコロナウイルス229E(HCoV-229E)、およびHCoV-NL63)、ベータコロナウイルス(Betacoronavirus)株(例えば、HCoV-OC43、HCoV Hong Kong University 1(HCoV-HKU1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、およびSARS-CoV-2)、ガンマコロナウイルス(Gammacoronavirus)(例えば、トリ伝染性気管支炎ウイルス、およびシチメンチョウコロナウイルス)、ならびにデルタコロナウイルス(Deltacoronavirus)株(例えば、ブタコロナウイルスHKU15、メジロコロナウイルスHKU16、スズメコロナウイルスHKU17、シキチョウコロナウイルスHKU18、ゴイサギコロナウイルスHKU19、ヒドリガモコロナウイルスHKU20、およびバンコロナウイルスHKU21)が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、対象は、SARS-CoV-2に感染しており、本開示のキメラで処置され得る。「コロナウイルス」という用語は、さらに、天然に存在する(例えば、野生型)コロナウイルス、天然に存在するコロナウイルスバリアント、および研究室において生成されたコロナウイルスバリアント(選択によって生成されたバリアント、化学的改変によって生成されたバリアント、および遺伝子改変されたバリアント(例えば、組換えDNA方法によって研究室において改変されたコロナウイルス)を含む)を含む。
一般的に、方法は、対象を選択すること、および例えば、医薬組成物中のまたは医薬組成物としての、有効量の1つまたは複数の本開示のキメラを対象に投与すること、ならびにコロナウイルス感染症、例えば、SARSまたはCOVID-19の予防または処置に必要とされるように必要に応じて投与を反復することを含み、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内で投与してもよい。対象は、例えば、対象がコロナウイルス感染症を有すること、または有すると疑われることを決定することに基づいて、処置に選択してもよい。
任意の特定の患者に関する特異的投薬量および処置レジメンは、さまざまな因子に左右されることになり、その因子としては、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、***速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患に対する患者の傾向、状態または症状、ならびに処置する医師の判断がある。
有効量は、1回または複数回の投与、適用または投薬として投与してもよい。治療有効量の治療化合物(すなわち、有効投薬量)は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、1日当たり1回または複数回から1週当たり1回または複数回、投与することができ、隔日で1回を含む。当業者であれば、これらに限定されないが、疾患または障害の重症度、治療歴、対象の全身的な健康および/または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むある特定の因子が、対象を効果的に処置するために必須の投薬量およびタイミングに影響を与える場合があることは理解するであろう。更に、本明細書において記載する治療有効量の治療化合物を用いた対象の処置は、単回の処置または一連の処置を含んでいてもよい。例えば、有効量を、少なくとも一回投与してもよい。
一部の実施形態では、本開示のキメラおよび処置の方法は、予防的に使用される。例えば、本方法は、コロナウイルス感染症に易罹患性であるかまたは罹患する危険性にあると決定された対象に、本明細書に記載するキメラおよび/またはキメラを含む組成物を投与するステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載するキメラは、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、IL-6阻害剤、IL-1阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン-ベータ、およびイカチバントを含むリストから選択される1つまたは複数の薬剤を含む、ウイルス感染症を処置するための1つまたは複数の公知かつ好適な医薬品と組み合わせて投与され得る。その文脈において、1つまたは複数の薬剤および本開示のキメラは、キメラを含む組成物と、同時に、または逐次的に、すなわち、単一の製剤として、または一緒にもしくは個々にのいずれかでパッケージングされた別個の製剤として、投与され得る。
一部の実施形態では、本開示のキメラは、図1および図12A~Cに示されるように、ウイルスの複製および/または病原性に必要な標的タンパク質(例えば、PLproタンパク質またはBRD)を相乗的に分解すること、および宿主細胞におけるp53レベルを増加させることによって、二重の作用を有し得る。実施例4も参照されたい。さらに、PLproは、宿主免疫系を回避するウイルス機序にも関与するため、本開示のキメラは、ウイルス複製の遮断、および感染細胞を殺滅させる免疫系の能力の回復の両方を行うことができる。
XII.医薬組成物
本明細書において記載する1個または複数の安定化ペプチドまたはキメラのうちのいずれかは、医薬組成物としてまたはそれにおいて使用するために製剤化することができる。そのような組成物は、任意の経路、例えば食品医薬品局(FDA)によって承認された任意の経路を介した対象への投与のために、製剤化するかまたは適応させることができる。例示的な方法は、FDAのCDER Data Standards Manual第004版(fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmにおいて利用可能である)に記載されている。例えば、組成物は、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内経路による投与のために製剤化または適合され得る。これらの経路には、吸入(例えば、経口および/または鼻吸入(例えば、ネブライザーまたはスプレーを介した))、注射(例えば、静脈内、動脈内、真皮下(subdermally)、腹腔内、筋肉内、および/または皮下);および/または経口投与、経粘膜投与、および/または局所投与(局所(例えば、鼻)スプレーおよび/または液剤を含む)が含まれる。本開示の組成物は、体重1kg当たり約0.001~約100mgの範囲の投薬量で、または特定の薬物の要件に応じて、投与され得る。あるいは、またはさらに、組成物は、例えば、FDA Data Standards Manual(DSM)(www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/FormsSubmissionRequirements/ElectronicSubmissions/DataStandardsManualmonographsにおいて入手可能)において記載されている、食品医薬品局に承認されている方法のいずれかに従って投与され得る。
本明細書において記載する1個または複数の安定化ペプチドまたはキメラのうちのいずれかは、医薬組成物としてまたはそれにおいて使用するために製剤化することができる。そのような組成物は、任意の経路、例えば食品医薬品局(FDA)によって承認された任意の経路を介した対象への投与のために、製剤化するかまたは適応させることができる。例示的な方法は、FDAのCDER Data Standards Manual第004版(fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmにおいて利用可能である)に記載されている。例えば、組成物は、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内経路による投与のために製剤化または適合され得る。これらの経路には、吸入(例えば、経口および/または鼻吸入(例えば、ネブライザーまたはスプレーを介した))、注射(例えば、静脈内、動脈内、真皮下(subdermally)、腹腔内、筋肉内、および/または皮下);および/または経口投与、経粘膜投与、および/または局所投与(局所(例えば、鼻)スプレーおよび/または液剤を含む)が含まれる。本開示の組成物は、体重1kg当たり約0.001~約100mgの範囲の投薬量で、または特定の薬物の要件に応じて、投与され得る。あるいは、またはさらに、組成物は、例えば、FDA Data Standards Manual(DSM)(www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/FormsSubmissionRequirements/ElectronicSubmissions/DataStandardsManualmonographsにおいて入手可能)において記載されている、食品医薬品局に承認されている方法のいずれかに従って投与され得る。
典型的には、本開示の医薬組成物は、1日当り約1~約6回、または代替的には連続的な注入として、投与される。そのような投与は、慢性的または急性的な治療として使用することができる。単回剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、処置される宿主および具体的な投与様式に応じて変動するであろう。典型的な調製物は、約5%~約95%の活性キメラ(重量/重量)を含むであろう。あるいは、そのような調製物は、約20%~約80%の活性キメラを含む。
一部の実施形態では、本開示のキメラの有効用量としては、例えば、静脈内で投与される、例えば、約0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~10000;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~5000;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~2500;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~1000;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~900;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~800;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~700;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~600;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~500;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~400;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~300;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~200;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~100;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~90;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~80;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~70;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~60;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~50;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~40;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~30;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~20;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~30;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1~15、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~30;0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1~10、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、もしくは10~30;または0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1~5mg/kg/日を挙げることができるが、これらに限定されない。
上記で引用されたものよりも低いかまたは高い用量が、必要とされる場合がある。任意の特定の対象に関する特異的投薬量および処置レジメンは、さまざまな因子に左右されることになり、その因子としては、用いられる特定のキメラの活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、***速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患に対する対象の傾向、状態または症状、ならびに処置する医師の判断がある。
患者の状態の改善に応じて、維持用量の本開示のキメラ、組成物、または組合せが、必要に応じて、投与され得る。続いて、投薬量または投与の頻度、またはその両方が、症状の関数として、改善された状態が保持されるレベルまで、低減され得る。対象は、しかしながら、疾患症状の任意の再発時には、長期間の間欠的な処置を必要とし得る。
本開示の組成物におけるキメラは、選択的な生物学的特性を強化するために適切な機能性を付加することによって、改変され得る。そのような改変は、当該技術分野において公知であり、これには、所与の生物学的コンパートメント(例えば、血液、リンパ系、中枢神経系)への生物学的浸透を増加させ、経口アベイラビリティを増加させ、溶解度を増加させて注射による投与を可能にし、代謝を変化させ、排出の速度を変化させるものが含まれる。
一部の場合では、医薬組成物は、有効量の1個または複数のキメラを含んでいてもよい。「有効量」および「処置に有効な」という用語は、本明細書で使用される場合、意図する効果または生理学的アウトカムをもたらすためのその投与(例えば、コロナウイルス感染症の処置)の背景内で有効な期間(急性または慢性投与および周期的または連続的投与を含む)で利用される、本明細書において記載する1個または複数のキメラまたは医薬組成物の量または濃度を指す。本明細書に記載する1つまたは複数のキメラまたは医薬組成物の有効量としては、標的タンパク質(例えば、コロナウイルスPLpro、コロナウイルスMpro、コロナウイルスNSP9、コロナウイルスNSP12、宿主BRD2、宿主BRD3、または宿主BRD4)のレベルの減少、ならびに/または細胞における宿主p53レベル(例えば、タンパク質レベル)および/もしくはp53活性(例えば、生物学的活性)の増加を促進する量が挙げられる。キメラの治療有効量は、状態(例えば、COVID-19)を治癒することを要求されるものではないが、状態の処置を提供するであろう。
本開示の医薬組成物は、1つまたは複数のキメラ、ならびに任意の薬学的に許容される担体および/またはビヒクルを含んでいてもよい。一部の場合では、医薬組成物は、疾患または感染症(例えば、COVID-19)または疾患の症状のモジュレーションまたは好転を達成するために有効な量で、1つまたは複数の追加の治療剤をさらに含み得る。1つまたは複数の治療剤としては、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、IL-6阻害剤、IL-1阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン-ベータ、およびイカチバントが挙げられるが、これらに限定されない。
「薬学的に許容される担体」という用語は、本開示のキメラとともに対象に投与してもよく、その薬理学的活性を破壊せず、治療量のキメラを送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である担体またはアジュバントを指す。
本開示の医薬組成物において使用してもよい薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、これらに限定されるものではないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達系(SEDDS)、例えばd-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシネート、医薬品投薬形態において使用する界面活性剤、例えばTween(登録商標)または他の同様の高分子送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂がある。シクロデキストリン、例えばα-、β-、およびγ-シクロデキストリンも、本明細書において記載するキメラの送達を強化するために有利に使用してもよい。
本開示のキメラの薬学的に許容される塩には、薬学的に許容される無機および有機酸および塩基に由来するものが含まれる。好適な酸性塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩(palmoate)、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロメチルスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属(例えば、ナトリウム)塩、アルカリ土類金属(例えば、マグネシウム)塩、アンモニウム塩、およびN-(アルキル)4+塩が挙げられる。
本開示の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでいてもよい。一部の場合では、製剤のpHは、キメラまたはその送達形態の安定性を強化するための薬学的に許容される酸、塩基または緩衝剤を用いて調整してもよい。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変部内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
医薬組成物は、吸入および/または経鼻投与のための液剤または散剤の形態であってもよい。そのような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤(例えば、Tween(登録商標)80)および懸濁化剤を使用して、当技術分野において公知の技術に従って製剤化してもよい。例えば、そのような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または当技術分野において公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製してもよい。
医薬組成物は、非毒性非経口で許容される希釈剤または溶媒中の、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液として注射用滅菌液剤または懸濁剤などの注射可能な滅菌調製物の形態であってもよい。用いてもよい許容されるビヒクルおよび溶媒のうちの1つは、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌、固定油を、溶媒または懸濁媒体として慣例的に用いる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無菌固定油を用いてもよい。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射可能な調製物において有用であり、天然の薬学的に許容される油、例えば特にそのポリオキシエチル化型のオリーブ油またはヒマシ油も同様である。これらの油性液剤または懸濁剤には、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース、または薬学的に許容される投薬形態の製剤、例えばエマルションおよび/もしくは懸濁剤において通常使用する同様の分散剤も含まれる場合がある。他の通常使用する界面活性剤、例えばTween(登録商標)またはSpan(登録商標)および/または薬学的に許容される固形剤、液剤、もしくは他の投薬形態の製造において通常使用する他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ促進剤も、製剤の目的で使用してもよい。
医薬組成物は、任意の経口で許容される投薬形態で、経口で投与することができ、その投薬形態としては、これらに限定されないが、カプセル剤、錠剤、エマルション剤および水性懸濁剤、分散剤および液剤がある。経口使用のための錠剤の場合、通常使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチがある。滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムも通常添加される。カプセル剤形態での経口投与に関しては、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。水性懸濁剤および/またはエマルション剤が経口で投与される場合、活性成分は、乳化剤および/または懸濁化剤と組み合わせて油性相中に懸濁するかまたは溶解してもよい。必要に応じて、ある特定の甘味料および/または香味料および/または着色剤を添加してもよい。
本開示の医薬組成物はまた、直腸投与のために坐剤の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、本開示のキメラを、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって、直腸内で融解して活性成分を放出する、好適な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製することができる。そのような材料としては、例えば、カカオバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の組成物が、本明細書に記載するキメラと1つまたは複数の追加の治療剤または予防剤との組合せを含む場合、キメラおよび追加の薬剤のいずれも、単剤療法レジメンにおいて通常投与される投薬量の約1~100%、より好ましくは約5~95%の投薬量レベルで存在すべきである。追加の薬剤は、例えば、複数回用量レジメンの一部として、本開示のキメラとは別個に投与され得る。あるいは、それらの薬剤は、単回剤形の一部として、本開示のキメラと一緒に単一の組成物に混合されてもよい。
一部の場合では、本明細書において開示される1個または複数のキメラは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲート組成物は、一価または多価であってもよい。例えば、コンジュゲート組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートしている本明細書において開示される1個のペプチドを含んでいてもよい。あるいは、コンジュゲート組成物は、担体にコンジュゲートしている2個またはそれを超える本明細書において開示されるペプチドを含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、2個の実体が互いに「コンジュゲート」している場合、これらは直接的または間接的な共有または非共有相互作用によって連結している。ある特定の実施形態では、会合は共有性である。他の実施形態では、会合は非共有性である。非共有相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、静電的相互作用などがある。間接的共有相互作用は、2個の実体が共有的に連結されている場合、必要に応じてリンカー基を介する。
担体タンパク質は、対象における免疫原性を増加させるかまたは強化する任意のタンパク質を含んでいてもよい。例示的な担体タンパク質は、当技術分野において記載されている(例えば、Fattom et al., Infect. Immun., 58:2309-2312, 1990;Devi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7175-7179, 1991;Li et al., Infect. Immun. 57:3823-3827, 1989;Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561,1991;Szu et al., J. Exp. Med. 166:1510-1524, 1987;およびSzu et al., Infect. Immun. 62:4440-4444, 1994を参照のこと)。高分子担体は、1個または複数の第1級および/または第2級アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含む天然または合成材料であってもよい。担体は、水溶性であってもよい。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書において開示されるキメラ(以下で「X」として示される)のうちのいずれか1つまたは複数を、以下の方法において使用するための方法を提供する。
本明細書において開示される1つまたは複数の状態(例えば、COVID-19、以下の例において「Y」として言及される)の処置において医薬品として使用するためのキメラX。Yの処置のための医薬品の製造のためのキメラXの使用、およびYの処置において使用するためのキメラX。
配列番号14および15におけるモチーフパターンは、以下の命名法を使用する:「.」は、任意のアミノ酸タイプを指し、「[X]」は、その位置において許容されるアミノ酸タイプを指し、パターンの開始点における「^X」は、配列がアミノ酸タイプXで開始することを指し、「[^X]」は、その位置がタイプX以外の任意のアミノ酸を有し得ることを示し、数字が続いて「X{x,y}」として示され、ここで、xおよびyは、その位置に置いて必要とされる「X」アミノ酸タイプの最小数および最大数を示す。翻訳後改変(例えば、リン酸化およびプロリンヒドロキシル化)されることが知られている一次デグロン内の保存される残基の位置は、太字で示される。配列番号1、7、40~48、および54~55において、(R8)は、 (R)-2-(7’-オクテニル)アラニンであり、(S5)は、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニンである。配列番号48において、X1、X2、およびX5は、任意のアミノ酸(例えば、A、W、F、L、V、I、ナフチルアラニン、E、D、Y、シクロブチルアラニン、およびそれらの側鎖アナログ)であり、X3:W、F、または3-(2-ナフチル)-L-アラニンであり、X4:Lまたはロイシン模倣体(例えば、シクロブチルアラニン)である。配列番号49~50において、(R5)は、(R)-2-(4’-ペンテニル)アラニンであり、(S8)は、(S)-2-(7’-オクテニル)アラニンである。配列番号7および50において、#は、シクロブチルアラニンである。配列番号3~5において、X1およびX2は、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニンである。配列番号4~5において、Bは、ノルロイシンである。配列番号28~29において、Xは、配列に挿入することができ、配列GSGを含むポリペプチドをもたらさない任意のアミノ酸であり、nは、0~4である。配列番号51~52において、Xは、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニンである。配列番号54~55において、Zは、ベータ-アラニンである。
以下の例は、特許請求する発明を更に例示するために提供され、発明の範囲を限定するものとして判断されるべきではない。特定の材料が言及されている範囲で、それは例示を目的とするにすぎず、本発明を限定することを意図しない。当業者であれば、発明の能力を行使することなくかつ発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を発展させることができる。
(実施例1)
SARS-CoV-2の生活環の必須タンパク質を分解するためのSP-PROTACの合成
ステープルまたはステッチp53ペプチドを樹脂上で合成し、可変長のリンカー(例えば、β-アラニン、PEG、Gly-Serリンカーなど)、続いて、縮合反応のために必要に応じて誘導体化された選択した小分子を付加することによって、ステープルペプチドタンパク質分解標的化キメラ(SP-PROTAC)を、標的化されるSARS-CoV-2タンパク質の分解のために生成した。図2~5によって、これらのキメラの安定化(すなわち、ステープルまたはステッチ)ペプチド部分をデザインする際のアプローチの多様性が実証される。例えば、SP645は、2つのアミノ酸を、6つのアミノ酸が隣接する(i,i+7位)非天然アミノ酸S-オクテニルアラニンおよびR-ペンテニルアラニンと置き換えることによって合成した(図6を参照されたい)。図7は、SP645(配列番号1)の構造を示す。必要とされるα,α-二置換アミノ酸の合成を、以前に説明されているように行った(Walensky, L.D. et al. Science 305, 1466-70 (2004)、Schafmeister, C.E., et al. J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892 (2000))。固相Fmoc化学およびルテニウムに触媒されるオレフィンメタセシスを、ペプチド合成およびステープル形成に使用し、続いて、リンカーおよび小分子を標準的なカップリング化学を使用して樹脂上で付加した。
SARS-CoV-2の生活環の必須タンパク質を分解するためのSP-PROTACの合成
ステープルまたはステッチp53ペプチドを樹脂上で合成し、可変長のリンカー(例えば、β-アラニン、PEG、Gly-Serリンカーなど)、続いて、縮合反応のために必要に応じて誘導体化された選択した小分子を付加することによって、ステープルペプチドタンパク質分解標的化キメラ(SP-PROTAC)を、標的化されるSARS-CoV-2タンパク質の分解のために生成した。図2~5によって、これらのキメラの安定化(すなわち、ステープルまたはステッチ)ペプチド部分をデザインする際のアプローチの多様性が実証される。例えば、SP645は、2つのアミノ酸を、6つのアミノ酸が隣接する(i,i+7位)非天然アミノ酸S-オクテニルアラニンおよびR-ペンテニルアラニンと置き換えることによって合成した(図6を参照されたい)。図7は、SP645(配列番号1)の構造を示す。必要とされるα,α-二置換アミノ酸の合成を、以前に説明されているように行った(Walensky, L.D. et al. Science 305, 1466-70 (2004)、Schafmeister, C.E., et al. J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892 (2000))。固相Fmoc化学およびルテニウムに触媒されるオレフィンメタセシスを、ペプチド合成およびステープル形成に使用し、続いて、リンカーおよび小分子を標準的なカップリング化学を使用して樹脂上で付加した。
PLpro阻害剤GRL-0617を組み込むために、例えば、化学的置換を、そのNH2基を介して達成した。GRL-0617-酸(11.3mg、0.0281mmol、1当量)を、室温で、DMF(0.28ml、0.1M)中に溶解したN-(4-アミノブチル)-2-((2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)オキシ)アセトアミドトリフルオロアセテート(14.5mg、0.0281mmol、1当量)と合わせた。DIPEA(14.7マイクロリットル、0.0843mmol、3当量)およびHATU(10.7mg、0.0281mmol、1当量)を、次いで、ペプチドに添加し、そのN末端Fmocを、ピペリジンで事前に脱保護し、混合物を、20時間、窒素下で反応させた。最終的なSP-PROTACは、ペプチドの脱保護および切断、LC/MSによる精製、ならびにアミノ酸分析による定量後に得た。SP-PROTACのC末端を、結合分析のためにFITCでさらに誘導体化した。
SP-PROTACのプロトタイプパネルは、Baez-Santos, et al. J. Virol., 88, 12511-27 (2014)、Ghosh, A.K. et al. J. Med. Chem., 52, 5228-40 (2009)、Baez-Santos, et al. Antiviral Res., 115, 21-38 (2015)、およびZhang, L. et al. Science, 368, 409-412 (2020)、およびGorgulla, C. et al. Nature, 580, 663-668 (2020))に記載されている報告されている化合物を含む、PLproおよびMproを標的とする小分子を組み込んでいた。上記のプロセスを適用して、SARS-CoV-2 Eタンパク質およびSARS-CoV-2タンパク質PLpro(図7)に結合する、ブロモドメインを含むタンパク質(BRD2、BRD3、およびBRD4)を標的としそれを分解する、例示的なSP-PROTACを生成した。
重要なSARS-CoV-2標的(PLpro、Mpro、NSP9、およびNSP12)の追加のペプチドおよび分子モジュレーターを、上述の方法を使用して、SP-PROTACに組み込んでもよい。表5は、SARS-CoV-2標的、分子のタイプ、およびSP-PROTACに組み込まれる分子の名称/構造を列挙する。関心が持たれるものの例としてはとりわけ、PLpro、Mpro、NSP9阻害剤、およびNSP12阻害剤を組み込んだSP-PROTACである。
SP-PROTACはまた、宿主タンパク質、例えば、ブロモドメインタンパク質、BRD2、BRD3、および/またはBRD4も標的とし得る。JQ1は、BRD4に結合する例示的な分子である。
さらに、以下の表6は、E3ユビキチンリガーゼの例、およびこれらの標的に結合し得るリガンド分子のタイプを列挙する。表6に列挙される分子は、表5の例示的な分子に、直接的に結合するか、またはリンカーを介して連結させて、ウイルスタンパク質またはウイルス病原性を補助する宿主タンパク質の分解のために、分解薬(例えば、E3リガーゼ)を動員することができる。
(実施例2)
SP-PROTACの結合親和性を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー
SP-PROTACの結合親和性を評価するために、SP-PROTAC、HDM2、およびSARS-CoV-2タンパク質標的の間の三元複合体の形成をモニタリングする定量的サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ベースのアッセイをデザインした。N末端ヘキサヒスチジンタグ(配列番号53)およびトロンビン切断部位を有する組換えHDM2およびSARS-CoV-2タンパク質(例えば、PLpro、Mpro)をpET28aベクターにクローニングし、BL21(DE3)大腸菌(E.coli)において発現させ、親和性Ni-NTAクロマトグラフィー、続いて、記載のようにタグ切断およびSECによって精製する(Ben-Nun, Y. et al. Structure 28(7): 847-857 (2020)、Bernal, F., et al. J Am Chem Soc 129, 2456-7 (2007))。成分を、1:1:1の比で混合し、SECプロファイルを、それぞれのタンパク質単独およびSP-PROTACを添加しないタンパク質の組合せとの比較で、記録する。この様式で、所望される結合性複合体を形成するSP-PROTACの能力を、文書化する。この結合親和性SECアッセイの適用の例として、図9Bは、BRD4に指向されるSP-PROTACが、BRD4とHDM2との間の複合体の形成を誘導したことが見出されたが(一番下のトレース)、一方で、HDM2単独、BRD4単独、HDM2+BRD4、HDM2+BRD4+SP645+JQ1は、SECによって評価した場合に複合体の形成を誘導しなかったことを示す。これらの結果により、in vitroで所望されるタンパク質複合体の核となる、SP-PROTACの能力が確認された。
SP-PROTACの結合親和性を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー
SP-PROTACの結合親和性を評価するために、SP-PROTAC、HDM2、およびSARS-CoV-2タンパク質標的の間の三元複合体の形成をモニタリングする定量的サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ベースのアッセイをデザインした。N末端ヘキサヒスチジンタグ(配列番号53)およびトロンビン切断部位を有する組換えHDM2およびSARS-CoV-2タンパク質(例えば、PLpro、Mpro)をpET28aベクターにクローニングし、BL21(DE3)大腸菌(E.coli)において発現させ、親和性Ni-NTAクロマトグラフィー、続いて、記載のようにタグ切断およびSECによって精製する(Ben-Nun, Y. et al. Structure 28(7): 847-857 (2020)、Bernal, F., et al. J Am Chem Soc 129, 2456-7 (2007))。成分を、1:1:1の比で混合し、SECプロファイルを、それぞれのタンパク質単独およびSP-PROTACを添加しないタンパク質の組合せとの比較で、記録する。この様式で、所望される結合性複合体を形成するSP-PROTACの能力を、文書化する。この結合親和性SECアッセイの適用の例として、図9Bは、BRD4に指向されるSP-PROTACが、BRD4とHDM2との間の複合体の形成を誘導したことが見出されたが(一番下のトレース)、一方で、HDM2単独、BRD4単独、HDM2+BRD4、HDM2+BRD4+SP645+JQ1は、SECによって評価した場合に複合体の形成を誘導しなかったことを示す。これらの結果により、in vitroで所望されるタンパク質複合体の核となる、SP-PROTACの能力が確認された。
(実施例3)
SP-PROTACの細胞浸透度
2つの機能が1つになった(two-in-one)生細胞タンパク質相互作用アッセイを使用して(Herce, H.D. et al. Nat Chem 9, 762-771 (2017))、SP-PROTACがHeLa細胞に進入する能力、および所望される三元複合体を生成する能力を同時に評価した。簡単に述べると、GFPを認識するラクダ科由来の一本鎖VHH抗体を、そのラミニン融合を介して、核ラミナに局在化させた。GFP-HDM2およびRFP-融合体としての標的ウイルスタンパク質を、次いで、細胞において一過的に発現させ、続いて、SP-PROTACまたはビヒクルで処置した。両方の標的に係合する細胞浸透剤SP-PROTACは、RFP-ウイルスタンパク質を、GFP-HDM2が係留された核ラミナに濃縮させることが見出され、これにより、GFP/RFPオーバーレイにおけるシグナルによってスコア付けされる、タンパク質の共局在化が生じた。図10Aに示されるように、SP-PROTAC-BRD4は、HDM2をサイトゾル(拡散パターン、上部)から、BRD4が実験的に係留している核ラミナ(集中パターン、下部)に再局在化させ、これによって、共局在化(下部、右側)が生じた。これらの結果により、in celluloで所望されるタンパク質複合体の核となる、SP-PROTACの能力が確認された(図10A)。
SP-PROTACの細胞浸透度
2つの機能が1つになった(two-in-one)生細胞タンパク質相互作用アッセイを使用して(Herce, H.D. et al. Nat Chem 9, 762-771 (2017))、SP-PROTACがHeLa細胞に進入する能力、および所望される三元複合体を生成する能力を同時に評価した。簡単に述べると、GFPを認識するラクダ科由来の一本鎖VHH抗体を、そのラミニン融合を介して、核ラミナに局在化させた。GFP-HDM2およびRFP-融合体としての標的ウイルスタンパク質を、次いで、細胞において一過的に発現させ、続いて、SP-PROTACまたはビヒクルで処置した。両方の標的に係合する細胞浸透剤SP-PROTACは、RFP-ウイルスタンパク質を、GFP-HDM2が係留された核ラミナに濃縮させることが見出され、これにより、GFP/RFPオーバーレイにおけるシグナルによってスコア付けされる、タンパク質の共局在化が生じた。図10Aに示されるように、SP-PROTAC-BRD4は、HDM2をサイトゾル(拡散パターン、上部)から、BRD4が実験的に係留している核ラミナ(集中パターン、下部)に再局在化させ、これによって、共局在化(下部、右側)が生じた。これらの結果により、in celluloで所望されるタンパク質複合体の核となる、SP-PROTACの能力が確認された(図10A)。
(実施例4)
SP-PROTACを使用したウイルスPLproタンパク質ユビキチン化
ウイルス標的のユビキチン化を可能にする三元複合体を形成するSP-PROTACの能力を測定するために、HDM2ユビキチンリガーゼキット(Boston Biochem)を使用してin vitroユビキチン化アッセイを行い、ウイルスタンパク質分子量における対応するユビキチンシフトを、ウエスタンブロット分析によってモニタリングした。図10Bに示されるように、SP-PROTAC-PLpro1(10μM)は、in vitroにおいて、HDM2に媒介されるPLproのユビキチン化を誘導した。これらの結果は、HDM2近接性を誘導することにより、ウイルス標的(例えば、PLpro)ユビキチン化を達成することができることを示す。
SP-PROTACを使用したウイルスPLproタンパク質ユビキチン化
ウイルス標的のユビキチン化を可能にする三元複合体を形成するSP-PROTACの能力を測定するために、HDM2ユビキチンリガーゼキット(Boston Biochem)を使用してin vitroユビキチン化アッセイを行い、ウイルスタンパク質分子量における対応するユビキチンシフトを、ウエスタンブロット分析によってモニタリングした。図10Bに示されるように、SP-PROTAC-PLpro1(10μM)は、in vitroにおいて、HDM2に媒介されるPLproのユビキチン化を誘導した。これらの結果は、HDM2近接性を誘導することにより、ウイルス標的(例えば、PLpro)ユビキチン化を達成することができることを示す。
(実施例5)
SP-PROTACを用いたSARS-CoV-2タンパク質に結合する宿主タンパク質の選択的な分解
細胞内タンパク質分解に関してアッセイするために、SJSA-1細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen Strep)を含むDMEM(Life Technologies、Grand Island、NY)培養培地(CM)中で、37℃で湿度制御されたCO2平衡化インキュベーターにおいて継代した。処置の前日に、細胞を継代し、6ウェルプレート中に100,000細胞/mLの密度で播種した。24時間後に、細胞を、プロテアソーム阻害剤であるカルフィルゾミブ(Advanced ChemBlocks Inc、カタログID:F-4770)、400nM)の存在下または非存在下において、2時間、さまざまな濃度のSP-PROTAC-BRD4(例えば、0.1~10μM)で処置し、その後で、それらを採取し、溶解させた。細胞溶解物を、次いで、アクチン(対照)、p53、およびBRD4抗体を使用し、標準的なウエスタンブロット技術を使用してアッセイして、タンパク質レベルおよびローディング対照のためのアクチン抗体を評価した。
SP-PROTACを用いたSARS-CoV-2タンパク質に結合する宿主タンパク質の選択的な分解
細胞内タンパク質分解に関してアッセイするために、SJSA-1細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen Strep)を含むDMEM(Life Technologies、Grand Island、NY)培養培地(CM)中で、37℃で湿度制御されたCO2平衡化インキュベーターにおいて継代した。処置の前日に、細胞を継代し、6ウェルプレート中に100,000細胞/mLの密度で播種した。24時間後に、細胞を、プロテアソーム阻害剤であるカルフィルゾミブ(Advanced ChemBlocks Inc、カタログID:F-4770)、400nM)の存在下または非存在下において、2時間、さまざまな濃度のSP-PROTAC-BRD4(例えば、0.1~10μM)で処置し、その後で、それらを採取し、溶解させた。細胞溶解物を、次いで、アクチン(対照)、p53、およびBRD4抗体を使用し、標準的なウエスタンブロット技術を使用してアッセイして、タンパク質レベルおよびローディング対照のためのアクチン抗体を評価した。
図11Aに示されるように、BRD4に指向されるSP-PROTACは、用量応答的に、SJSA-1細胞におけるp53レベルを増加させ、BRD4レベルを減少させた。プロテアソーム阻害剤(カルフィルゾミブ)の存在下において、BRD4分解は、阻害された(図11B)。
(実施例6)
SP-PROTACによる培養細胞のタンパク質のランドスケープの変化
ハイコンテントスクリーニングにより得られたもっとも強力なSP-PROTAC化合物を、天然で易罹患性のヒト由来Huh7細胞(Mossel, E.C. et al. J Virol 79, 3846-50 (2005))およびACE2を発現するCalu-3細胞(Tseng, C.T. et al. J Virol 79, 9470-9 (2005))において試験した。播種した細胞を、SP-PROTACの連続希釈物(開始用量10μM、三連)で1時間処置した後、SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/ヒト/USA/WA-CDC-WA1/2020、Genbank受託番号MN985325.1)でチャレンジした。培養上清から試料採取し、RNAse阻害剤の存在下でウイルスを溶解させ、逆転写(RT)および定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を、記載のように行った(Suzuki, Y. et al. J Vis Exp (2018))。CDCにより検証されているBHQでクエンチした色素対プライマーを、IDTから購入し、Ct値からゲノム当量を計算した。
SP-PROTACによる培養細胞のタンパク質のランドスケープの変化
ハイコンテントスクリーニングにより得られたもっとも強力なSP-PROTAC化合物を、天然で易罹患性のヒト由来Huh7細胞(Mossel, E.C. et al. J Virol 79, 3846-50 (2005))およびACE2を発現するCalu-3細胞(Tseng, C.T. et al. J Virol 79, 9470-9 (2005))において試験した。播種した細胞を、SP-PROTACの連続希釈物(開始用量10μM、三連)で1時間処置した後、SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/ヒト/USA/WA-CDC-WA1/2020、Genbank受託番号MN985325.1)でチャレンジした。培養上清から試料採取し、RNAse阻害剤の存在下でウイルスを溶解させ、逆転写(RT)および定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を、記載のように行った(Suzuki, Y. et al. J Vis Exp (2018))。CDCにより検証されているBHQでクエンチした色素対プライマーを、IDTから購入し、Ct値からゲノム当量を計算した。
もっとも強力な抗ウイルス活性を示したSP-PROTACを使用して、Huh7およびCalu-3細胞(50%を上回る感染性)を処置し、続いて、タンパク質レベルにおける動的変化についてモニタリングした。処置した細胞を、10% SDS含有緩衝液において時間をわたり(例えば、2時間、4時間、6時間、8時間)溶解させ、溶解物を、p53、SARS-CoV-2標的(PLpro、Mpro)、およびアクチン対照についてのウエスタン分析に供した。機序上のp53誘導および標的-タンパク質特異的分解(例えば、PLpro、Mpro、BRD4)を示す、処置細胞に由来する溶解物は、記載のように行われるグローバルプロテオミクス分析も受ける(Winter, G.E. et al. Science 348, 1376-81 (2015))。この様式で、細胞タンパク質のランドスケープ全体にわたる作用のSP-PROTAC特異性を、BRD4に指向されるSP-PROTACについて試験した(図12A~C)。対照(ステープルペプチドSP645単独(図12A)および非連結型小分子JQ1単独(図12B))とは対照的に、SP-PROTAC-BRD4(図12C)は、BRD 2/3/4タンパク質レベルの低減、およびp53転写標的、例えば、HDM2の誘導の両方を行うことが見出された。これらの結果は、最適な抗ウイルス活性が、p53誘導および標的タンパク質分解の相乗的なSP-PROTAC機序から導出されたことを示す。
(実施例7)
SP-PROTACによる培養細胞の機序上の細胞傷害の改善
CellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存度アッセイ(Promega、Madison、WI)を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞傷害アッセイを行った。SJSA-1細胞を、SP645、JQ1、またはSP-PROTAC-BRD4で72時間、示される濃度で処置し、in vitro分析を、技術的に三連で行い、化合物、タンパク質、または細胞の独立した調製物を用いて少なくとも2回反復し、一元配置分散分析を使用して分析した。0.05を下回る両側p値を、有意とみなした。
SP-PROTACによる培養細胞の機序上の細胞傷害の改善
CellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存度アッセイ(Promega、Madison、WI)を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞傷害アッセイを行った。SJSA-1細胞を、SP645、JQ1、またはSP-PROTAC-BRD4で72時間、示される濃度で処置し、in vitro分析を、技術的に三連で行い、化合物、タンパク質、または細胞の独立した調製物を用いて少なくとも2回反復し、一元配置分散分析を使用して分析した。0.05を下回る両側p値を、有意とみなした。
図13Aにおいて見られるように、SP-PROTAC-BRD4は、SP645およびJQ1単独と比較して、SJSA-1細胞の機序上の細胞傷害を有意に改善した(生存度パーセントの減少)。
(実施例8)
SP-PROTACによる培養細胞のウイルス感染の遮断
エボラウイルスに対する以前のスクリーニングに基づいて、SARS-CoV-2のハイスループットなウイルス検出プラットフォームを開発した(Anantpadma, M. et al. Antimicrob Agents Chemother 60, 4471-81 (2016))。384ウェルの形式で播種したVero E6細胞を、SP-PROTACの連続希釈物(開始用量50μM)で1時間処置し、三連で行い、続いて、SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/ヒト/USA/WA-CDC-WA1/2020、Genbank受託番号MN985325.1)で4時間チャレンジして、10~20%の細胞の制御感染を達成した(試験化合物の動的範囲を評価するのに最適な感染性)。次いで、感染した細胞を洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中で再洗浄し、抗SARS-CoV-2ヌクレオキャプシドモノクローナル抗体(ThermoFisher Sci、Waltham、MA)、続いて抗マウスIg二次抗体(Alexa Fluor 488、Life Technologies)で免疫染色し、細胞体をHCS CellMaskブルーで対比染色した。細胞を、Nikon Ti Eclipse自動化顕微鏡においてz面でイメージングし、CellProfilerソフトウェアによって分析し、感染細胞を総細胞で除すことによって感染効率を計算した。図13Bは、25μMおよび50μMのSP-PROTAC-PLpro1が、Vero E6細胞のSARS-CoV-2感染を遮断することが見出されたことを示す。
SP-PROTACによる培養細胞のウイルス感染の遮断
エボラウイルスに対する以前のスクリーニングに基づいて、SARS-CoV-2のハイスループットなウイルス検出プラットフォームを開発した(Anantpadma, M. et al. Antimicrob Agents Chemother 60, 4471-81 (2016))。384ウェルの形式で播種したVero E6細胞を、SP-PROTACの連続希釈物(開始用量50μM)で1時間処置し、三連で行い、続いて、SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/ヒト/USA/WA-CDC-WA1/2020、Genbank受託番号MN985325.1)で4時間チャレンジして、10~20%の細胞の制御感染を達成した(試験化合物の動的範囲を評価するのに最適な感染性)。次いで、感染した細胞を洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中で再洗浄し、抗SARS-CoV-2ヌクレオキャプシドモノクローナル抗体(ThermoFisher Sci、Waltham、MA)、続いて抗マウスIg二次抗体(Alexa Fluor 488、Life Technologies)で免疫染色し、細胞体をHCS CellMaskブルーで対比染色した。細胞を、Nikon Ti Eclipse自動化顕微鏡においてz面でイメージングし、CellProfilerソフトウェアによって分析し、感染細胞を総細胞で除すことによって感染効率を計算した。図13Bは、25μMおよび50μMのSP-PROTAC-PLpro1が、Vero E6細胞のSARS-CoV-2感染を遮断することが見出されたことを示す。
(実施例9)
SP-PROTACのα-らせん度の測定
小分子二量体化がSP-PROTACの成分であるステープルペプチド(例えば、SP645、ATSP-7041など)の構造に影響を及ぼさないことを確実にするため、SP-PROTACのらせん度を、円偏光二色性(CD)によって溶液中で測定する(Bird, G.H., et al. Methods Enzymol., 446, 369-86 (2008))。50μMのリン酸カリウム(pH7.5)またはMilli-Q脱イオン水中で再構成した化合物を用いて、CDスペクトルを、Aviv Biomedical分光計(モデル410)で記録する。190~260nmの5回のスキャンを平均して、それぞれのスペクトルを得、これを、波長対残基平均楕円率としてプロットし、らせん度%を、記載のように計算する(Forood, B., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 838-42 (1993))。上記の方法の例として、SP-PROTACのらせん度を、4つのHDM2結合性ステープルp53ペプチドステープルペプチド(SAH-p53-1~4、配列番号40~43)について、Bernal F., et al., J. Am. Chem. Soc. 129(9):2456-2457 (2007).)に示されるように、円偏光二色性によって評価した。図8A(Bernal F., et al.における図1Cと同一)は、SAH-p53-4(配列番号43)が、SAH-p53-1~3(配列番号40~42)または野生型p53ペプチド(配列番号11)よりも安定であったことを示す。
SP-PROTACのα-らせん度の測定
小分子二量体化がSP-PROTACの成分であるステープルペプチド(例えば、SP645、ATSP-7041など)の構造に影響を及ぼさないことを確実にするため、SP-PROTACのらせん度を、円偏光二色性(CD)によって溶液中で測定する(Bird, G.H., et al. Methods Enzymol., 446, 369-86 (2008))。50μMのリン酸カリウム(pH7.5)またはMilli-Q脱イオン水中で再構成した化合物を用いて、CDスペクトルを、Aviv Biomedical分光計(モデル410)で記録する。190~260nmの5回のスキャンを平均して、それぞれのスペクトルを得、これを、波長対残基平均楕円率としてプロットし、らせん度%を、記載のように計算する(Forood, B., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 838-42 (1993))。上記の方法の例として、SP-PROTACのらせん度を、4つのHDM2結合性ステープルp53ペプチドステープルペプチド(SAH-p53-1~4、配列番号40~43)について、Bernal F., et al., J. Am. Chem. Soc. 129(9):2456-2457 (2007).)に示されるように、円偏光二色性によって評価した。図8A(Bernal F., et al.における図1Cと同一)は、SAH-p53-4(配列番号43)が、SAH-p53-1~3(配列番号40~42)または野生型p53ペプチド(配列番号11)よりも安定であったことを示す。
(実施例10)
SP-PROTACのタンパク質分解安定性の測定
ステープルペプチドの重要な特性は、ステープル自体および誘導されるらせん状フォールディングによる不安定なアミド結合の遮蔽に起因するin vivoでタンパク質分解に抵抗するそれらの能力である。タンパク質分解安定性を決定するために、比較可能なタンパク質分解分析を、(Bird, G.H. et al. ACS Chem Biol, 15, 6, 1340-1348 (2020))によって記載のように液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)(Agilent 1200)を行って、細胞およびin vivo研究に関して、最もプロテアーゼ耐性が高い化合物を特定する。反応試料は、DMSO中の5μlのSP-PROTAC(1mMストック)および50mM Tris HCl、pH7.4からなる195μlの緩衝液から構成される。ゼロ時間試料の注射時に、2.5μlの100ng/μLプロテイナーゼK(New England Biolabs)を添加し、インタクトな化合物の量を、時間をわたっての逐次的な注射によって定量する。時間に対する平均二乗変位(MSD)面積のプロットにより、指数関数型崩壊曲線を生成し、半減期を、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して非線形回帰分析によって決定する。このタンパク質分解安定性評価の適用の例は、Bird G.H., et al., PNAS August 10, 2010 107 (32) 14093-14098.に示されている。図9A(Bird G.H., et al.に由来)は、単一ステープル化および二重ステープル化された抗HIV治療薬エンフビルチドが、ステープル化されていないエンフビルチドと比較して、顕著なプロテアーゼ耐性を有することが見出されたことを示す。エンフビルチドの安定性は、ステープルの数に比例して増加した。
SP-PROTACのタンパク質分解安定性の測定
ステープルペプチドの重要な特性は、ステープル自体および誘導されるらせん状フォールディングによる不安定なアミド結合の遮蔽に起因するin vivoでタンパク質分解に抵抗するそれらの能力である。タンパク質分解安定性を決定するために、比較可能なタンパク質分解分析を、(Bird, G.H. et al. ACS Chem Biol, 15, 6, 1340-1348 (2020))によって記載のように液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)(Agilent 1200)を行って、細胞およびin vivo研究に関して、最もプロテアーゼ耐性が高い化合物を特定する。反応試料は、DMSO中の5μlのSP-PROTAC(1mMストック)および50mM Tris HCl、pH7.4からなる195μlの緩衝液から構成される。ゼロ時間試料の注射時に、2.5μlの100ng/μLプロテイナーゼK(New England Biolabs)を添加し、インタクトな化合物の量を、時間をわたっての逐次的な注射によって定量する。時間に対する平均二乗変位(MSD)面積のプロットにより、指数関数型崩壊曲線を生成し、半減期を、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して非線形回帰分析によって決定する。このタンパク質分解安定性評価の適用の例は、Bird G.H., et al., PNAS August 10, 2010 107 (32) 14093-14098.に示されている。図9A(Bird G.H., et al.に由来)は、単一ステープル化および二重ステープル化された抗HIV治療薬エンフビルチドが、ステープル化されていないエンフビルチドと比較して、顕著なプロテアーゼ耐性を有することが見出されたことを示す。エンフビルチドの安定性は、ステープルの数に比例して増加した。
(実施例11)
SP-PROTACの結合親和性を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー
SP-PROTACのそれぞれの成分について相対結合親和性を評価するために、蛍光偏光(FP)結合分析を行い、ここで、C末端FITC誘導体化SP-PROTAC(例えば、25nM)を、結合緩衝液(50mM NaCl、20mM HEPES pH7.4、5mM DTT)中で、個々にそれぞれのタンパク質の連続希釈物(例えば、HDM2、PLpro)とともにインキュベートする。FPを、Spectramax M5マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)において平衡状態で測定し、データをプロットし、Kd値を、Prismソフトウェア(Graphpad)を使用して計算する。このFP分析の適用の例は、Bernal F., et al., J. Am. Chem. Soc. 129(9):2456-2457 (2007)に示されている。図8B(Bernal F. et al.における図1Dと同一)は、さまざまなステープルp53ペプチド(配列番号40~43)のHDM2への相対結合親和性を示す。SAH-p53-4は、SAH-p53-1~3または野生型p53ペプチドと比較して高い親和性で、HDM2に結合することが見出された。
SP-PROTACの結合親和性を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー
SP-PROTACのそれぞれの成分について相対結合親和性を評価するために、蛍光偏光(FP)結合分析を行い、ここで、C末端FITC誘導体化SP-PROTAC(例えば、25nM)を、結合緩衝液(50mM NaCl、20mM HEPES pH7.4、5mM DTT)中で、個々にそれぞれのタンパク質の連続希釈物(例えば、HDM2、PLpro)とともにインキュベートする。FPを、Spectramax M5マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)において平衡状態で測定し、データをプロットし、Kd値を、Prismソフトウェア(Graphpad)を使用して計算する。このFP分析の適用の例は、Bernal F., et al., J. Am. Chem. Soc. 129(9):2456-2457 (2007)に示されている。図8B(Bernal F. et al.における図1Dと同一)は、さまざまなステープルp53ペプチド(配列番号40~43)のHDM2への相対結合親和性を示す。SAH-p53-4は、SAH-p53-1~3または野生型p53ペプチドと比較して高い親和性で、HDM2に結合することが見出された。
(実施例12)
SARS-CoV-2感染症のヒト化ACE2受容体マウスモデルにおけるリードSP-PROTACの抗ウイルス活性
SP-PROTACのin vivo有効性試験を、気道上皮においてヒトACE2受容体を発現し(McCray, P.B., Jr. et al. J Virol 81, 813-21 (2007)、Yan, R. et al. Science (2020))、SARS-CoV-2ウイルスに感染した(Netland, J., et al. J Virol 82, 7264-75 (2008)、Tseng, C.T. et al. J Virol 81, 1162-73 (2007))トランスジェニックマウスにおいて行う。抗エボラウイルス治療薬の評価のために開発された方法を使用して、実験を行う(Pascal, K.E. et al. J Infect Dis 218, S612-s626 (2018)、Sakurai, Y. et al. Science 347, 995-8 (2015))。SP-PROTACを、まず、耐容性に関して試験する。3回の処置のそれぞれについて、10匹(雄性5匹、雌性5匹)の群で20匹のマウスに、高用量または低用量のSP-PROTACを、1日2回で10日間、腹腔内投薬する。別の10匹のマウスの群には、対照として食塩水のみを受容させる。動物は、それぞれの用量の前に試験し、有害作用が観察された場合には、処置を中止する。10日間の投薬後に、高用量において耐容性が示されない場合、より低い用量を使用する。耐容性を示したSP-PROTACを、hACE2マウス疾患モデルにおいて有効性に関して試験する。K18-hACE2マウス(JAX、1アーム当たりn=20匹、雄性10匹、雌性10匹)に、1日目に、104PFUのウイルス投薬量を鼻内に接種し、続いて、SP-PROTAC(投薬量および頻度は、耐容性およびPKの結果に基づく)での腹腔内処置を10日間毎日行う(2日目~12日目)。1つの群には、対照としてビヒクルを受容させる。マウスを継続的にモニタリングして、体重および臨床徴候を記録する。4日目(ウイルス血症のピーク)に、それぞれの群から4匹のマウスを、安楽死させ、細胞溶解液(tissuelyzer)(Qiagen)を使用して、記載されるように(Bao, L. et al. Nature 583, 830-833 (2020)調製した肺ホモジネート上清からqPCRによって、ウイルス負荷を定量する。もっとも有効な処置の用量を精緻化して、マウスを保護する最低量を決定する。同じ実験デザインを使用するが、3つの群に、4倍の増分でより低用量の処置を受容させる。それぞれの実験では、性別を生物学的変数として割り当て、雄性マウスおよび雌性マウスを同じ数で用いる。
SARS-CoV-2感染症のヒト化ACE2受容体マウスモデルにおけるリードSP-PROTACの抗ウイルス活性
SP-PROTACのin vivo有効性試験を、気道上皮においてヒトACE2受容体を発現し(McCray, P.B., Jr. et al. J Virol 81, 813-21 (2007)、Yan, R. et al. Science (2020))、SARS-CoV-2ウイルスに感染した(Netland, J., et al. J Virol 82, 7264-75 (2008)、Tseng, C.T. et al. J Virol 81, 1162-73 (2007))トランスジェニックマウスにおいて行う。抗エボラウイルス治療薬の評価のために開発された方法を使用して、実験を行う(Pascal, K.E. et al. J Infect Dis 218, S612-s626 (2018)、Sakurai, Y. et al. Science 347, 995-8 (2015))。SP-PROTACを、まず、耐容性に関して試験する。3回の処置のそれぞれについて、10匹(雄性5匹、雌性5匹)の群で20匹のマウスに、高用量または低用量のSP-PROTACを、1日2回で10日間、腹腔内投薬する。別の10匹のマウスの群には、対照として食塩水のみを受容させる。動物は、それぞれの用量の前に試験し、有害作用が観察された場合には、処置を中止する。10日間の投薬後に、高用量において耐容性が示されない場合、より低い用量を使用する。耐容性を示したSP-PROTACを、hACE2マウス疾患モデルにおいて有効性に関して試験する。K18-hACE2マウス(JAX、1アーム当たりn=20匹、雄性10匹、雌性10匹)に、1日目に、104PFUのウイルス投薬量を鼻内に接種し、続いて、SP-PROTAC(投薬量および頻度は、耐容性およびPKの結果に基づく)での腹腔内処置を10日間毎日行う(2日目~12日目)。1つの群には、対照としてビヒクルを受容させる。マウスを継続的にモニタリングして、体重および臨床徴候を記録する。4日目(ウイルス血症のピーク)に、それぞれの群から4匹のマウスを、安楽死させ、細胞溶解液(tissuelyzer)(Qiagen)を使用して、記載されるように(Bao, L. et al. Nature 583, 830-833 (2020)調製した肺ホモジネート上清からqPCRによって、ウイルス負荷を定量する。もっとも有効な処置の用量を精緻化して、マウスを保護する最低量を決定する。同じ実験デザインを使用するが、3つの群に、4倍の増分でより低用量の処置を受容させる。それぞれの実験では、性別を生物学的変数として割り当て、雄性マウスおよび雌性マウスを同じ数で用いる。
in vivo耐容性について、10匹のマウス/用量/化合物、および食塩水対照の10匹のマウスを使用し、マウスを、10日目(または有害徴候の場合にはそれよりも早い時点)に安楽死させ、毒性について試験する。研究は、増加した毒性を検出する80%の検出力を有する(60% v 10%)、p=0.10。in vivo有効性について、疾患進行は、10%を上回る体重減少、努力呼吸、または発育不良として定義し、SP-PROTACで処置した動物を、ビヒクルで処置した動物と比較した。1群当たり16匹の動物(に加えて4日目の評価のための4匹のマウス)により、処置したマウスの70%、対して対照マウスの22%の無増悪を検出する81%の検出力が得られるであろう、p=0.05。進行までの時間を、カプランおよびマイヤーの方法、ならびにログランク検定sを使用した差についての検定を使用して評価する。
(実施例13)
SP-PROTACを使用したウイルスNSP9タンパク質ユビキチン化
別のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質と三元複合体を形成する代替的にデザインしたSP-PROTACの能力を測定するために、本発明者らは、(1)i,i+4単一ステープル化NSP9結合性ペプチド(配列番号4)がN末端に配置され、SP-645(配列番号1)に連結されたものから構成される、SP-PROTAC-NSP9-1(配列番号54)と称されるもの、または(2)SP-645(配列番号1)がN末端に配置され、i,i+4単一ステープル化NSP9結合性ペプチド(配列番号4)に連結されたものから構成される、SP-PROTAC-NSP9-2(配列番号55、図14A)と称されるもののいずれかのSP-PROTACを生成した。いずれの場合にも、SP-PROTACは、組換えHDM2、SP-PROTAC-NSP9、および組換えNSP9の間で三元複合体の核を形成して、ウイルス標的タンパク質NSP9のHDM2ユビキチン化を可能にすることに成功した。HDM2ユビキチンリガーゼキット(Boston Biochem)を使用して、in vitroユビキチン化アッセイを行い、ウイルスタンパク質の分子量における対応するユビキチンシフトを、ウエスタンブロット分析によってモニタリングした。図14Bに示されるように、SP-PROTAC-NSP9-1および-2(10μM)は、in vitroでHDM2に媒介されるNSP9のユビキチン化を誘導した。これらの結果は、HDM2近接性を誘導することにより、分解のための標的化されるウイルスタンパク質(例えば、NSP9)のユビキチン化を達成することができることを示す。
SP-PROTACを使用したウイルスNSP9タンパク質ユビキチン化
別のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質と三元複合体を形成する代替的にデザインしたSP-PROTACの能力を測定するために、本発明者らは、(1)i,i+4単一ステープル化NSP9結合性ペプチド(配列番号4)がN末端に配置され、SP-645(配列番号1)に連結されたものから構成される、SP-PROTAC-NSP9-1(配列番号54)と称されるもの、または(2)SP-645(配列番号1)がN末端に配置され、i,i+4単一ステープル化NSP9結合性ペプチド(配列番号4)に連結されたものから構成される、SP-PROTAC-NSP9-2(配列番号55、図14A)と称されるもののいずれかのSP-PROTACを生成した。いずれの場合にも、SP-PROTACは、組換えHDM2、SP-PROTAC-NSP9、および組換えNSP9の間で三元複合体の核を形成して、ウイルス標的タンパク質NSP9のHDM2ユビキチン化を可能にすることに成功した。HDM2ユビキチンリガーゼキット(Boston Biochem)を使用して、in vitroユビキチン化アッセイを行い、ウイルスタンパク質の分子量における対応するユビキチンシフトを、ウエスタンブロット分析によってモニタリングした。図14Bに示されるように、SP-PROTAC-NSP9-1および-2(10μM)は、in vitroでHDM2に媒介されるNSP9のユビキチン化を誘導した。これらの結果は、HDM2近接性を誘導することにより、分解のための標的化されるウイルスタンパク質(例えば、NSP9)のユビキチン化を達成することができることを示す。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに併記してきたが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明をその詳細な説明とともに併記してきたが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (71)
- 第2の部分に結合している第1の部分を含むキメラであって、前記第1の部分および第2の部分が、互いに直接的に結合しているか、またはリンカーを介して互いに結合しており、
前記第1の部分が、分解について標的化される第1のタンパク質に結合し、前記第1のタンパク質が、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルス非構造タンパク質(NSP)、またはブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン(BET)タンパク質から選択され、
前記第2の部分が、第2のタンパク質に結合し、前記第2のタンパク質が、タンパク質分解薬であるか、またはそれを動員する、
キメラ。 - 前記第2のタンパク質が、E3ユビキチンリガーゼである、請求項1に記載のキメラ。
- 前記第1の部分および前記第2の部分が、リンカーを介して互いに結合しており、必要に応じて、前記リンカーが、ペプチドリンカー、化学リンカー、グリシン-セリンリンカー、(G4S)3(配列番号26)、(G4S)5(配列番号27)、ベータ-アラニン(Z)リンカー、ベータ-アラニンおよびアラニン(ZA)リンカー、またはポリエチレングリコールリンカーである、請求項1に記載のキメラ。
- 前記第1の部分が、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記コロナウイルスプロテアーゼが、パパイン様プロテアーゼ(PLpro)、またはメインプロテアーゼ(Mpro)であり、前記コロナウイルスNSPが、NSP9またはNSP12であり、前記BETタンパク質が、ブロモドメイン2(BRD2)、ブロモドメイン3(BRD3)、またはブロモドメイン4(BRD4)である、請求項1から4のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記コロナウイルスプロテアーゼが、PLproであり、前記第1の部分が、PLproに結合する、請求項5に記載のキメラ。
- PLproに結合する前記第1の部分が、PLpro阻害剤である、請求項6に記載のキメラ。
- 前記PLpro阻害剤が、GRL-0617もしくはそのPLpro結合性アナログ、ジスルフィラム、またはPLpro結合性チオプリンアナログである、請求項7に記載のキメラ。
- 前記コロナウイルスプロテアーゼが、Mproであり、前記第1の部分が、Mproに結合する、請求項5に記載のキメラ。
- Mproに結合する前記第1の部分が、Mpro阻害剤である、請求項9に記載のキメラ。
- 前記Mpro阻害剤が、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、ASC09、GC376、GC813、エブセレンカルボン酸、または配列番号2もしくは配列番号3に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、前記ペプチドが、Mproに結合する、請求項10に記載のキメラ。
- 前記BETタンパク質が、BRD4であり、前記第1の部分が、前記BETタンパク質に結合する、請求項5に記載のキメラ。
- 前記BETタンパク質に結合する前記第1の部分が、BETタンパク質阻害剤である、請求項12に記載のキメラ。
- 前記BETタンパク質阻害剤が、JQ1、ABBV-075、I-BET151、I-BET726、OTX015、もしくはPFI-1、またはBRD4、BRD3、および/もしくはBRD2に結合するそれらのアナログである、請求項13に記載のキメラ。
- 前記コロナウイルスNSPが、NSP9であり、前記第1の部分が、NSP9に結合する、請求項5に記載のキメラ。
- NSP9に結合する前記第1の部分が、NSP9阻害剤である、請求項15に記載のキメラ。
- 前記第1の部分が、配列番号4または配列番号5に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、前記ペプチドが、NSP9に結合する、請求項16に記載のキメラ。
- 前記コロナウイルスNSPが、NSP12であり、前記第1の部分が、NSP12に結合する、請求項5に記載のキメラ。
- NSP12に結合する前記第1の部分が、NSP12阻害剤である、請求項18に記載のキメラ。
- 前記第1の部分が、レムデシビル酸もしくはNSP12に結合するそのアナログ、またはソホスブビル酸もしくはNSP12に結合するそのアナログである、請求項19に記載のキメラ。
- 前記第2のタンパク質が、ヒト二重微小染色体2(HDM2)、フォンヒッペルリンダウ(VHL)、セレブロン、X連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、細胞アポトーシス阻害タンパク質(cIAP)、または構成的光形態形成1(COP1)である、請求項1から20のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、前記タンパク質分解薬に結合するか、またはそれを動員する、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、必要に応じてサリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、およびセレブロンに結合するそれらのアナログからなる群より選択される、小分子であるセレブロン結合性部分を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、サリドマイド部分を含む、請求項23に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、必要に応じてVH 032およびそのVHL結合性アナログからなる群より選択される、VHL結合性部分を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、HDM2結合性部分を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記HDM2結合性部分が、HDM2および/またはHDMXに結合する、p53のトランス活性化ドメインのペプチド、またはステープルペプチド、または他の方法で化学的に安定化されたペプチドを含む、請求項31に記載のキメラ。
- 前記HDM2結合性部分が、ATSP-7041、SP645、またはそのHDM2結合性バリアントであるステープルペプチドである、請求項32に記載のキメラ。
- 前記ステープルペプチドが、配列LTF(R8)EYWAQ#(S5)SAA(配列番号7)、またはペプチドであって、以下:
(a)配列番号7に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
(b)前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸が、置換されていない、配列番号7に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
(c)前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの1つもしくは複数が、保存的アミノ酸で置換されており、(R8)が、(R)-2-(7’-オクテニル)アラニンであり、#が、シクロブチルアラニンであり、(S5)が、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニンもしくはそのHDM2結合性バリアントである、配列番号7に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、ペプチドを含み、
前記ペプチドが、HDM2に結合する、
請求項33に記載のキメラ。 - 前記ステープルペプチドが、配列LTF(R8)EYWAQL(S5)SAA(配列番号1)、またはそのHDM2結合性バリアント、またはペプチドであって、以下:
(a)配列番号1に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
(b)前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸が、置換されていない、配列番号1に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
(c)前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの1つもしくは複数が、保存的アミノ酸で置換されている、配列番号1に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列
を含み、
(R8)が、(R)-2-(7’-オクテニル)アラニンであり、(S5)が、(S)-2-(4’-ペンテニル)アラニンである、ペプチドを含み、
前記ペプチドが、HDM2に結合する、
請求項33に記載のキメラ。 - 前記HDM2結合性部分が、ヌトリン-3aまたはそのHDM2結合性アナログである、請求項31に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、A410099.1またはそのXIAP結合性アナログであるXIAP結合性部分を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、SM-1295、SM-1280、またはそのcIAP結合性アナログであるcIAP結合性部分を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、E3ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるWD40リピートタンパク質に結合するペプチドを含み、前記WD40リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含み、前記改変型が、前記天然結合コンセンサス配列内に少なくとも1個のアミノ酸置換、少なくとも1個のアミノ酸欠失、少なくとも1個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項1から40のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記WD40リピートタンパク質が、E3ユビキチンリガーゼHDM2またはVHLの基質アダプターである、請求項41に記載のキメラ。
- 前記天然結合コンセンサス配列、配列番号14もしくは15、またはそのバリアント、前記バリアントが、1~6個のアミノ酸の位置において前記コンセンサス配列とは異なる、請求項41に記載のキメラ。
- 前記第2の部分が、COP1結合性部分を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のキメラ。
- 前記COP1結合性部分が、トリブルズシュードキナーゼ1(Trib1)ペプチドまたはそのCOP1結合性バリアントであるペプチドである、請求項44に記載のキメラ。
- 前記ペプチドが、配列DQIVPEY(配列番号6)、または配列番号6に記載の配列に対して少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項45に記載のキメラ。
- 前記タンパク質分解薬が、前記第1のタンパク質を分解する、請求項1から46のいずれか一項に記載のキメラ。
- 請求項1から47のいずれか一項に記載のキメラと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内投与のために製剤化される、請求項48に記載の医薬組成物。
- コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項1から45のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項47もしくは48に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- コロナウイルスのウイルス複製の遮断およびウイルス感染性の低減の両方を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項1から47のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項48もしくは49に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記コロナウイルスが、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、またはSARS-CoV-2である、請求項50または51に記載の方法。
- SARS-CoVまたはSARS-CoV-2の複製の遮断を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項1から47のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項48もしくは49に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- RNAウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項1から45のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項48もしくは49に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記対象に、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、IL-6阻害剤、IL-1阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン-ベータ、およびイカチバントからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項50から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ヒト、霊長類、コウモリ、トリ、マウス、シチメンチョウ、ウシ、ブタ、ネコ、およびイヌからなる群より選択される、請求項50から55のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号2もしくは3に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを含むペプチドであって、前記ペプチドが、Mproに結合し、それを阻害する、ペプチド。
- 配列番号2または3に記載のアミノ酸配列を含み、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化ペプチドであって、少なくとも2個のアミノ酸置換により、3個または6個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、前記ペプチドが、Mproに結合し、それを阻害する、安定化ペプチド。
- 50個を下回る、40個を下回る、35個を下回る、30個を下回る、または25個を下回るアミノ酸の長さである、請求項57または58に記載のペプチドまたは安定化ペプチド。
- 配列番号4もしくは5に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを含むペプチドであって、前記ペプチドが、NSP9に結合する、ペプチド。
- 配列番号4または5に記載のアミノ酸配列を含み、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化ペプチドであって、少なくとも2個のアミノ酸置換により、3個または6個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、前記ペプチドが、NSP9に結合する、安定化ペプチド。
- 50個を下回る、40個を下回る、35個を下回る、30個を下回る、または25個を下回るアミノ酸の長さである、請求項60または61に記載のペプチドまたは安定化ペプチド。
- 請求項58から62のいずれか一項に記載のペプチドまたは安定化ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- コロナウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項58から62のいずれか一項に記載のペプチドもしくは安定化ペプチド、または請求項63に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- 図7または図14Aに示される分子のうちのいずれか1つの構造を有する化合物を含むキメラ。
- 請求項65に記載のキメラと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項65に記載のキメラまたは請求項66に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- コロナウイルスのウイルス複製の遮断およびウイルス感染性の低減の両方を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項65に記載のキメラまたは請求項66に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- SARS-CoVまたはSARS-CoV-2の複製の遮断を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項65に記載のキメラまたは請求項66に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- RNAウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項65に記載のキメラまたは請求項66に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項67から70のいずれか一項に記載の方法。
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