JP2023546113A - 同時遺伝子活性化のための核酸構築物 - Google Patents

同時遺伝子活性化のための核酸構築物 Download PDF

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Abstract

本明細書には、新規ＤＮＡ構築物及びそれを使用する方法が報告される。本発明は、部位特異的リコンビナーゼとの相互作用によって活性型に変換される、ＤＮＡ分子のコード鎖及び鋳型鎖上の産生力がない／不活性なプロモーター及び遺伝子の意図的な配置を使用する。より詳細には、本発明によるＤＮＡエレメントは、含まれる第１及び第２の遺伝子の発現に関して非機能的である。第１及び第２の遺伝子の発現に関して非機能的であることにより、本発明によるＤＮＡエレメントは、含まれる構造遺伝子が組込みの直後に既に発現されているリスクなしに、細胞のゲノムに組み込まれ得る。これらの遺伝子は、ＤＮＡエレメントの組換え認識配列を認識して機能するリコンビナーゼが活性化されるか又は細胞に導入された後にのみ発現される。これにより、ゲノムに組み込まれた本発明のＤＮＡエレメント中の第１及び第２の変異リコンビナーゼ認識配列間のリコンビナーゼ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）が開始される。ＲＭＣＩは、２つの変異リコンビナーゼ認識配列の間に位置する本発明によるＤＮＡエレメントのその部分の反転をもたらす。これにより、第１のプロモーターが第１の遺伝子に作動可能に連結され、第２のプロモーターが第２の遺伝子に作動可能に連結される。その後に初めて、第１及び第２の遺伝子が転写され、それぞれのコードされたタンパク質が発現される。したがって、本発明によるＤＮＡエレメントは、細胞内の２つの遺伝子の同時活性化に特に有用である。TIFF2023546113000015.tif79141

Description

本明細書では、新規ＤＮＡ構築物及びそれを使用する方法が報告される。本発明による新規ＤＮＡ構築物では、部位特異的リコンビナーゼ技術を使用して少なくとも２つの遺伝子の転写を同時に活性化することができる。本発明は、ＤＮＡ分子のコード鎖及び鋳型鎖上のプロモーター及び遺伝子エレメントの意図的な不活性配置を使用し、部位特異的リコンビナーゼとの相互作用によってそれらの活性形態に変換される。また、本明細書には、プロモーターが交換され、ＬｏｘＰ部位が組み込まれた新規なＶＡ ＲＮＡエレメントも報告されている。
発明の背景
遺伝子療法とは、広義には、生細胞の遺伝子発現を改変し、それによってその生物学的特性を変化させるための遺伝物質の治療的投与を指す。数十年の研究の後、遺伝子療法は市場に進歩しており、ますます重要になると予想されている。一般的に、遺伝子療法は、インビボ又はエクスビボアプローチのいずれかに分けることができる。
今日では、ほとんどのインビボ療法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターによるＤＮＡ送達に依存している。ＡＡＶは、小さな天然に存在する非病原性パルボウイルスであり、これは、非エンベロープ正二十面体キャプシドで構成される。これは、約４．７ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。野生型ＡＡＶベクターのゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する２つの遺伝子、ｒｅｐ及びｃａｐを保有する。ＩＴＲは、ウイルス複製及びパッケージングのためにシスで必要である。ｒｅｐ遺伝子は４つの異なるタンパク質をコードし、その発現は２つの代替プロモーターＰ５及びＰ１９によって駆動される。さらに、選択的スプライシングによって異なる形態が生成される。Ｒｅｐタンパク質は、例えば、ＤＮＡ結合、エンドヌクレアーゼ及びヘリカーゼ活性等の複数の機能を有する。それらは、遺伝子調節、部位特異的組み込み、切除、複製及びパッケージングにおいて役割を果たす。ｃａｐ遺伝子は、３つのキャプシドタンパク質及び１つの集合体活性化タンパク質をコードする。これらのタンパク質の差次的発現は、選択的スプライシング及び選択的開始コドン使用によって達成され、ｒｅｐ遺伝子のコード領域に位置する単一プロモーターＰ４０によって駆動される。
操作された治療用ｒＡＡＶベクターにおいて、ウイルス遺伝子は、ウイルスＩＴＲに隣接したままであるが、選択されたプロモーターの制御下で目的の遺伝子をコードする導入遺伝子発現カセットで置き換えられる。野生型ウイルスとは異なり、操作されたｒＡＡＶベクターは宿主ゲノムへの部位特異的組み込みを受けず、形質導入細胞の核内で主にエピソームのままである。
ＡＡＶは、それ自体が複製能ではないが、ヘルパー遺伝子の機能を必要とする。これらは、例えばアデノウイルス又は単純ヘルペスウイルス等の共感染ヘルパーウイルスによって自然に提供される。例えば、５つのアデノウイルス遺伝子、すなわちＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡがＡＡＶ複製に必須であることが知られている。タンパク質をコードする他のヘルパー遺伝子とは対照的に、ＶＡは低分子ＲＮＡ遺伝子である。
ｒＡＡＶベクターの産生のために、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を保有するＤＮＡを、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びに必要なヘルパー遺伝子も含むパッケージング宿主細胞株に導入する。これらの３つのＤＮＡエレメント群を細胞に導入する多くの方法、及びそれらを異なるＤＮＡプラスミド上で組み合わせる方法がある（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１２（２０１７）１６００１９３）。
２つの一般的な製造方法が広く使用されている。トリプルトランスフェクション法では、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂを既に発現しているＨＥＫ２９３細胞に、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡを担持するアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰＥＲ）、ｒｅｐ／ｃａｐを含むプラスミド及びｒＡＡＶ導入遺伝子を含むプラスミドを一過性に同時トランスフェクトする。あるいは、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びウイルスヘルパー遺伝子を１つの大きなプラスミド上で組み合わせることができる（二重トランスフェクション法）。第２の方法は、一方がｒＡＡＶゲノムを保有し他方がｒｅｐ及びｃａｐを保有する２つのバキュロウイルスによる昆虫細胞（Ｓｆ９）の感染を包含する。このシステムでは、バキュロウイルスプラスミド自体によってヘルパー機能が提供される。同様に、単純ヘルペスウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞又はＢＨＫ細胞と組み合わせて使用される。より最近では、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５（２０１４）２１２－２２２；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（２０１７）１５－２２）は、ｒｅｐ及びｃａｐがゲノムに安定的に組み込まれたＳｆ９細胞を操作した。これらの細胞では、ｒＡＡＶ導入遺伝子を有する単一のバキュロウイルスがｒＡＡＶベクターを産生するのに十分である。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１３２９－１３４１）は、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びｒＡＡＶ導入遺伝子がそのゲノムに組み込まれたＨｅＬａ細胞株を作製した。細胞に野生型アデノウイルスをトランスフェクトすることによって、ｒＡＡＶベクター産生が誘導され、ｒＡＡＶベクターとアデノウイルスとの混合ストックが産生される。
ヘルパー遺伝子がそのゲノムに安定に組み込まれた哺乳動物細胞株はこれまで記載されていない。ｒｅｐ並びにウイルスヘルパー遺伝子の発現は細胞にとって毒性であり、厳密に制御する必要がある（例えば、Ｑｉａｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（２００２）１９０４－１９１３を参照のこと）。
ｒｅｐ遺伝子の場合、そのような制御は、ＬｏｘＰ部位に隣接するポリアデニル化部位を含むｒｅｐ遺伝子にイントロンを導入することによって達成されている。組換えアデノウイルスを用いてＣｒｅリコンビナーゼを導入した後、ポリアデニル化部位を除去し、イントロンをスプライシングにより除去する（例えば、Ｙｕａｎ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２（２０１１）６１３－６２４；Ｑｉａｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと）。
Ｐｏｄｈａｊｓｋａ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ４０（１９８５）１６３－１６８）は、以下の３つの新規な特性を有する遺伝子発現プラスミドのプロトタイプを報告した：（ｉ）その「オフ相」は、発現プロモーターが試験した遺伝子から離れて面しており、強力なターミネーターによってブロックされているので、すべての一般的な宿主において絶対的である；（ｉｉ）「オン相」は、プロモーターの迅速かつ効率的な逆位によって達成される；（ｉｉｉ）この２段階プロセスを開始するためには、短い熱パルス又は他の誘導剤への曝露のみが必要である。
国際公開第９７／９４４１号（ＥＰ ０ ８５０ ３１３ Ｂ１）は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、（１）一過性にトランスフェクトされた細胞を含む組成物を培養する工程であって：（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質をコードする核酸を含むＡＡＶヘルパープラスミドと、（ｂ）必須アデノウイルスヘルパー遺伝子を含むアデノウイルスヘルパープラスミドであって、前記プラスミド中に存在する前記必須アデノウイルスヘルパー遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、Ｅ４ＯＲＦ６、Ｅ４ＯＲＦ６／７、ＶＡ ＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、アデノウイルスヘルパープラスミドと、（ｃ）第１及び第２のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶプラスミドであって、前記第１及び第２のＡＡＶ ＩＴＲが、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡに隣接し、前記ＤＮＡがプロモーターＤＮＡに作動可能に連結されている、ＡＡＶプラスミドとを用いて、アデノウイルス粒子の非存在下で一過性にトランスフェクトされた細胞を含む組成物を培養する工程；及び（２）そこから産生された組換えＡＡＶを精製する工程を含む方法を報告した。
特開平１０－３３１７５号公報には、アデノ随伴ウイルスのゲノム配列に２つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスタッファー配列が挿入された遺伝子配列であって、リコンビナーゼ認識配列の挿入部位がプロモーターＰ５とｒｅｐ７８／６８遺伝子の翻訳開始コドンとの間であり、スタッファー配列が、プロモーターＰ５及びｒｅｐ７８／６８遺伝子と同じ方向に少なくとも１つの検出可能な遺伝子マーカー及びｐｏｌｙＡシグナルを含むことを特徴とする、遺伝子配列を報告した。
国際公開第９８／２４９１８号（ＥＰ ０ ９４２ ９９９ Ｂ１；ＵＳ ６，３０３，３０２ Ｂ１）は、活性化後に第２のレポーター遺伝子を活性化することができる第１のレポーター遺伝子を含有する遺伝子捕捉構築物であって、第１のレポーター遺伝子がリコンビナーゼをコードし、第２のレポーター遺伝子がタンパク質因子をコードし、第２のレポーター遺伝子が活性化され、それによってリコンビナーゼが第２のレポーター遺伝子の前に位置するＤＮＡ断片を欠失し、そのようにして第２のレポーター遺伝子をその制御下でプロモーターの下流に配置する、遺伝子捕捉構築物を報告した。
国際公開第９８／２７２０７号は、上流から下流に列挙された相対的な順序で以下の成分：（ｉ）第１の部位特異的組換え（ｓｓｒ）部位；（ｉｉ）ｓｓｒ介在配列；（ｉｉｉ）第２の部位特異的組換え（ｓｓｒ）部位を含むリコンビナーゼ活性化可能なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージングカセットを含むポリヌクレオチドであって；カセットが、プロモーターと、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子からなる群から選択されるＡＡＶパッケージング遺伝子とを含み、前記プロモーターが、ｓｓｒ介在配列内又は第１のｓｓｒ部位の上流のいずれかに位置し、前記ＡＡＶパッケージング遺伝子が、第２のｓｓｒ部位の下流又はｓｓｒ介在配列内のいずれかに位置し、前記プロモーターが、前記ＡＡＶパッケージング遺伝子に活性化可能に連結されている、ポリヌクレオチドを報告した。
国際公開第９８／１００８６号（ＵＳ ６，２７４，３５４ Ｂ１）は、組換えＡＡＶの効率的な産生のための方法を報告した。一態様では、３つのプラスミドが宿主細胞に導入される。第１のプラスミドはＣｒｅ－リコンビナーゼの発現を指示し、第２のプラスミドはプロモーター、ＬｏｘＰ部位及びｒｅｐ／ｃａｐに隣接するスペーサー配列を含み、第３のプラスミドは導入遺伝子及びＡＡＶ ＩＴＲに隣接する調節配列を含むミニ遺伝子を含む。別の態様では、宿主細胞はＣｒｅリコンビナーゼを安定的又は誘導的に発現し、システムの他のエレメントを担持する２つのプラスミドが宿主細胞に導入される。
国際公開第９８／２７２１７号（ＥＰ ０ ９５３ ６４７ Ｂ１）は、プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、ポリＡ付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、ウイルス構造タンパク質遺伝子、ポリＡ付加シグナルの順に配列したリコンビナーゼ及びその認識配列を用いてウイルス構造タンパク質遺伝子の発現を制御するＤＮＡ構築を報告した。
国際公開第２００１／３６６１５号（ＥＰ １ ２３０ ３５４ Ｂ１）は、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域の遺伝子産物の発現をもたらす少なくとも１つの核酸を含む永久羊水細胞株を報告した。
国際公開第２００１／６６７７４号は、プロモーターと機能的に関連して連結された目的の遺伝子を含む第１のＤＮＡ配列と、標的ＤＮＡ配列に特異的な組換え活性を有するポリペプチドをコードする第２の遺伝子を含む第２のＤＮＡ配列と、前記２つのＤＮＡ配列の一方に隣接する前記標的ＤＮＡ配列の２つとを含む目的の遺伝子の発現を制御するシステムであって、前記第２のＤＮＡ配列が前記プロモーターと前記目的の遺伝子との間に位置することを特徴とするシステムを報告した。
Ｓｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｐ．及びＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｄ．Ｍ．は、外因性ＬｏｘＰ部位を欠く培養細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼの連続発現が、成長の減少、細胞変性効果、及び染色体異常を引き起こすことを報告した。Ｃｒｅリコンビナーゼ発現の持続時間及び強度を制限するために負のフィードバックループを組み込んだ自己切除レトロウイルスベクターは、測定可能な毒性を回避し、ＬｏｘＰ部位に隣接する標的配列を切除する能力を保持した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ８（２００１）２３３－２４３）。
Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｗ．らは、遺伝子機能の解明のためのＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムの重要性が高まっていることを考慮して、遺伝子を活性化又は不活性化するためのより精巧なスキーム、並びに選択マーカーをその後の再使用のために再利用できるようにすることは、非適合ＬｏｘＰ部位のセットの利用可能性を必要とすることを概説した。複数の非適合ＬｏｘＰ部位を定義された位置でゲノムに組み込むことにより、その後のＣｒｅリコンビナーゼによって媒介される導入遺伝子構築物の異なる染色***置への導入が、標的化ベクター上の対応するＬｏｘＰ部位を単に指定することによって可能になる（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４９９（２００１）１４７－１５３）。
国際公開第２００２／８４０９号（ＥＰ １ ３０９ ７０９ Ａ２，ＵＳ ７，９７２，８５７）は、哺乳動物細胞において目的のＤＮＡの部位特異的置換を得る方法であって、ａ）受容体構築物を含む哺乳動物細胞を提供することであって、受容体構築物が、置換される受容体ポリヌクレオチドを含み、受容体ポリヌクレオチドが、不可逆的組換え部位（ＩＲＳ）の２つ以上のコピーに隣接している、哺乳動物細胞を提供することと、ｂ）受容体ポリヌクレオチドを置換するためのドナーポリヌクレオチドを含むドナー構築物を細胞に導入することであって、ドナーポリヌクレオチドが、相補的な不可逆的組換え部位（ＣＩＲＳ）の２つ以上に隣接している、ドナー構築物を細胞に導入することと、ｃ）受容体構築物及びドナー構築物を不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させることを含む方法を提供し、不可逆的リコンビナーゼが、ＩＲＳとＣＩＲＳとの間の組換え、及び受容体ポリヌクレオチドのドナーポリヌクレオチドによる置換を触媒し、それによって置換構築物が形成される。
国際公開第２００２／４０６８５号（ＵＳ ７，４４９，１７９ Ｂ２）は、遺伝子捕捉ライブラリーを調製する方法、及び遺伝子の条件付き不活性化のための遺伝子標的細胞を報告した。部位特異的組換え配列を有する変異エレメントカセット及び遺伝子トラップカセットを有するプラスミドを用意した。変異エレメントカセットは、第１の部位特異的組換え配列と、ポリアデニル化配列に連結された第１のマーカー遺伝子に連結されたスプライスアクセプター配列及び第２の部位特異的組換え配列を含む変異体配列を含むＤＮＡとを含んでいた。遺伝子トラップカセットは、第１の部位特異的組換え配列と、スプライスドナー配列に作動可能に連結された第２のマーカー遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１の遺伝子トラップエレメントを含むＤＮＡと、選択された宿主細胞のゲノムに存在しないユニーク配列に連結されたプロモーターを含む第２の遺伝子トラップカセットとを含んでいた。
国際公開第２００２／８８３５３号（ＥＰ １ ３８３ ８９１ Ｂ１）は、少なくとも部位特異的リコンビナーゼ標的化配列（ＳＳＲＴＳ）Ｌ１に隣接する少なくとも配列Ａと、少なくとも部位特異的リコンビナーゼ標的化配列（ＳＳＲＴＳ）Ｌ２に隣接する少なくとも配列Ｂとを含む単離ＤＮＡ分子であって、前記配列Ａ及びＢが反対の向きで転写及び翻訳される配列であり、前記ＳＳＲＴＳ Ｌ１及びＳＳＲＴＳ Ｌ２が互いに再結合することができず、配列Ｌ１が反対の向きであり、配列Ｌ２が反対の向きであり、前記ＤＮＡ分子中のＳＳＲＴＳ配列の順序が５’－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ１－Ｌ２－３’であり、前記ＳＳＲＴＳ Ｌ１のリコンビナーゼ特異的及び前記ＳＳＲＴＳ Ｌ２のリコンビナーゼ特異的が同じである単離ＤＮＡ分子を報告した。
Ｍｌｙｎａｒｏｖａ，Ｌ．らは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在下で、組換えパートナーの一方が非ｌｏｘ ＤＮＡの逆方向反復のより大きなストレッチに存在する場合、Ｌｏｘ５１１及びＬｏｘ２２７２部位の両方がＬｏｘＰに対して非常に乱雑になることを報告した（Ｇｅｎｅ ２９６（２００２）１２９－１３７）。
Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｊ．らは、相補的突然変異アーム（Ｌｏｘ６６及びＬｏｘ７１）を有するＬｏｘＰ部位の使用が、トランスでの効率的な組換えを可能にし、野生型ＬｏｘＰ部位及び二重変異アームを有する欠陥部位を生成することを報告した（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２００２）３０６７－３０７７）。二重変異ＬｏｘＰ部位はもはやリコンビナーゼにとって効率的な基質ではないので、挿入が優先され、反応は一方向に推進される。
Ｔｒｏｎｃｈｅ，Ｆ．らは、マウスにおける部位特異的リコンビナーゼの使用を報告した（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５２９（２００２）１１６－１２１）。彼らは、マウスにおいて、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰシステムを最初に使用して、所与の細胞集団における遺伝子発現をスイッチオンしたことを概説した。２つの異なるトランスジェニックマウス系統を作製した。第１のものは、「停止カセット」によってプロモーターから間隔を置いて配置されたサイレント導入遺伝子を担持する。停止カセットは、強力なポリアデニル化シグナル及び／又はスプライスドナー配列のいずれかを含有するか、又はサイレント遺伝子のＯＲＦを破壊するので、導入遺伝子の転写を防止する。第２のものは、細胞型特異的、すなわち組織特異的な方法でＣｒｅリコンビナーゼの発現を駆動する導入遺伝子を担持する。すべてのＣｒｅリコンビナーゼ発現細胞において、停止カセットは、それらの細胞においてのみ所望の導入遺伝子の発現を可能にするように切除される。Ｔｒｏｎｃｈｅらによれば、ＬｏｘＰ部位の挿入が遺伝子の正常な発現を妨げないことが不可欠である。理想的には、それらはイントロン又は非転写領域に配置され、調節領域の破壊を回避すべきである。しかしながら、いくつかの場合において、ＬｏｘＰ部位が、負の影響を伴うことなく転写されたが非翻訳領域に挿入された。Ｔｒｏｎｃｈｅらはさらに、高レベルのＣｒｅリコンビナーゼを発現する細胞における細胞増殖の減少並びにアポトーシスの増加が観察されたことを概説している。これは、細胞周期のＧ２／Ｍ期におけるＣｒｅリコンビナーゼ発現細胞の蓄積、染色体再編成及び小核の出現に関連する。これらの異常は、ゲノムに存在する潜在的標的部位に対するＣｒｅリコンビナーゼの作用によるものであり得る。
国際公開第２００３／８４９７７号は、イントロン内に位置する転写終結配列を使用する遺伝子発現制御方法を報告した。転写終結配列は、トランス作用因子の添加によって破壊可能である。例えば、「デュアルスプライシングスイッチ」では、転写終結配列は組換え部位に隣接しており、リコンビナーゼによって切除することができる。Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ組換えシステムをこの目的のために使用することができる。
Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．らは、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムにおける挿入反応は、切除事象が速度論的に有利であるため、制御がより困難であることを報告した。５０個の変異ＬｏｘＰ部位の組み合わせを天然ＬｏｘＰ部位と比較すると、Ｃｒｅリコンビナーゼ結合ドメインの内側の６ｂｐへの変異は組換えを大幅に阻害したが、外側の８ ｂｐの変異はより許容されることが明らかになった（Ｇｅｎｅｓｉｓ ３６（２００３）１６２－１６７）。
国際公開第２００４／２９２１９号は、細胞及び生物におけるｓｈＲＮＡ構築物の時間的及び空間的発現を制御するためのベクター及び方法を報告した。そのようなベクターは、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターであり得る。好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡの発現は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって調節される。そのようなプロモーターは、効率的なサイレンシングをもたらすことが知られている。本質的に任意のｐｏｌＩＩＩプロモーターが使用され得るが、望ましい例としては、ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨｌ ＲＮＡプロモーター並びにヒトｔＲＮＡ－ｖａｌプロモーターが挙げられる。
Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈ．らは、変異及び野生型ＬｏｘＰ配列を使用したｒｅｐ及びｃａｐ発現の別個の制御、並びにアデノ随伴ウイルスベクター産生のための改良されたパッケージングシステムを報告した。彼らは、２つの別個のプラスミドを使用することによってＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質の両方の誘導性発現システムを開発しており、一方は変異体配列を有し、他方は野生型ＬｏｘＰ配列を有し、２つの異なるタンパク質の発現はＣｒｅリコンビナーゼによって同時に誘導することができる（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（２００４）１－１４）。組換えを行うために、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現アデノウイルスプラスミドを培養物に適用した。ｒｅｐ及びｃａｐの発現を制御するために、スタッファー配列を２つのＬｏｘＰ（野生型又は変異）配列に隣接させる。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下では、スタッファー配列が除去され、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子が発現される。
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｐ．Ｋ．らは、インビボで得られた結果と以前に報告された結果との間の違いは、組換えに利用可能な一過性対構成的に発現されるＣｒｅリコンビナーゼタンパク質に関連し得ることを報告した。ＬｏｘＰ部位無差別性は、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質のレベル及び持続性と共に増加するようである（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（２００４）５６６８－５６７６）。
Ｖｅｎｔｕｒａ，Ａ．らは、導入遺伝子からのＣｒｅ－ｌｏｘ調節条件的ＲＮＡ干渉を報告した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（２００４）１０３８０－１０３８５）。著者らは、条件付きＣｒｅ－ｌｏｘ調節ＲＮＡ干渉のための２つのレンチウイルスベクターを作製した。一方のベクターは条件付き活性化を可能にし、他方は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現の条件付き不活性化を可能にする。前者は、マウスＵ６プロモーターを、ＬｏｘＰ部位とＴＡＴＡボックスとの間にハイブリッドを含めることによって改変した戦略に基づく。
米国特許出願公開第２００６／１１０３９０号明細書は、サイトメガロウイルス即時型初期プロモーター（ＣＭＶ）下流のアンチセンスホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に隣接する、反対向きの変異ＬｏｘＰ部位Ｌｏｘ７１及びＬｏｘ６６からなるＣｒｅリコンビナーゼ依存性ルシフェラーゼ発現プラスミドＡｄＣＵＬに基づくアデノウイルス発現ベクターＡｄＣＭＶ－Ｋｕ７０及びＡｄＣＭＶ－Ｋｕ８０を報告した。Ｌｏｘ７１とＬｏｘ６６との間のＣｒｅリコンビナーゼ媒介組換えは、ｆｌｏｘｅｄカセットをセンス方向に反転させ、ルシフェラーゼ遺伝子発現をもたらす。
米国特許出願公開第２００６／１４３７３７号明細書（米国特許第７，２６７，９７９号明細書）は、二本鎖標的配列ＲＮＡを生じ、それにより、内因性遺伝子サイレンシング機構を引き起こすように機能する、リコンビナーゼの逆位又は切除のための構築物を報告した。
国際公開第２００６／９９６１５号は、改変された標的遺伝子をアデノウイルスベクターのファイバー領域に単方向に交換するための、不適合なスペーサーを有するＣｒｅリコンビナーゼ及び半変異ＬｏｘＰ部位の適用を報告した。
Ｍｉｓｓｉｒｌｉｓ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７（２００６）Ａ１３）は、Ｃｒｅ－リコンビナーゼ媒介組換えにおけるＬｏｘＰスペーサー領域の配列及び無差別特性を特定するハイスループットのスクリーニングを報告した。彼らは、スペーサー及び逆方向反復変異体が共に首尾よく使用されていることを考えると、十分な数の無差別ＬＥ／ＲＥスペーサー変異体を同定することができれば、所与の標的分子、染色体又はゲノムに多数のＤＮＡセグメントを導入することが可能であり得ることを概説した。しかしながら、逆方向反復を介する直列化ＲＭＣＥ又は挿入組換えは、これまでに同定された少数の安定な無差別ＬｏｘＰ部位によって制限されてきた。
国際公開第２０１５／０６８４１１号は、通常は目的のタンパク質を発現しない、プロモーターの配向と反対方向にＬｏｘ７１とＬｏｘＪＴＺ１７との間に位置する標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ－ＬｏｘＰ－プラスミドを報告した。
国際公開第２０１１／１００２５０号は、真核細胞におけるインビボ遺伝子調節のための標的化プラスミドであって、ゲノム中の特定の遺伝子座にＬｏｘＰ－ＦＲＴ－Ｎｅｏ ＳＴＯＰ－ＦＲＴ－ｔｅｔＯ－ＬｏｘＰカセットを導入する標的化プラスミドを報告した。
Ｋａｗａｂｅ，Ｙ．らは、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用した抗体産生のための遺伝子組み込みシステムを報告した（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（２０１２）２６７－２７９）。野生型及び変異ＬｏｘＰ部位に隣接する交換カセットを、レシピエントファウンダー細胞の確立のためにＣＨＯ細胞の染色体に組み込んだ。次いで、適合する対のＬｏｘＰ部位に隣接し、選択マーカー用の発現カセットと抗体の発現カセットとの間に内部の対でないＬｏｘＰ部位も含むマーカー抗体発現カセットを含むドナープラスミドを調製した。ドナープラスミド及びＣｒｅリコンビナーゼ発現プラスミドをファウンダーＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトして、ＣＨＯゲノムにＲＭＣＥを生じさせ、元の野生型ＬｏｘＰ部位を回復させる抗体遺伝子の部位特異的組み込みをもたらし、ＲＭＣＥにもはや関与しない不活性二重変異ＬｏｘＰ部位を生成した。ＲＭＣＥ手順を繰り返して、組み込まれた遺伝子のコピー数を増加させ、それにより、各工程において、細胞中に存在する選択マーカーの発現カセットを切除し、除去した。
Ｎｉｅｓｎｅｒ，Ｂ．及びＭａｈｅｓｈｒｉ，Ｎ．は、目的の遺伝子の前に反転ＬｏｘＰ部位に隣接するプロモーターを挿入することによって、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介されるプロモーターの反転によって発現をランダムに変化させることができることを報告した。これは、プロモーターの配向を絶えず反転させるメリーゴーラウンドプロセスのようである。本プロセスの終了は、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現の終了によって達成される。しかし、Ｃｒｅリコンビナーゼは非常に効率的であるが、複数回の逆位事象は、ｆｌｏｘｅｄプロモーターの不可逆的喪失又は他のゲノム領域との組換えをもたらす場合があり、大規模な再編成をもたらす（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０（２０１３）２６７７－２６８６）。
国際公開第２０１３／０１４２９４号は、相同組換えによる選択マーカー、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ抗生物質マーカーを用いた第１の遺伝子の置換を報告し、それによりマーカーは、マーカーの両端にＬｏｘＰ部位が存在するために除去され得る。使用される設定では、２つの改変されたＬｏｘＰ部位（Ｌｏｘ６６及びＬｏｘ７１）が使用され、それぞれが異なる変異を有する。Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換え後、Ｌｏｘ７２部位が残され（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３（２００７）１１２６－１１３５）、これは１つではなく２つの変異を有し、もはやＣｒｅリコンビナーゼによって認識することができない。
米国特許出願公開第２０１３／５８８７１号明細書は、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ位置に配向した２つの変異ＬｏｘＰ部位（Ｌｏｘ６６及びＬｏｘ７１）を使用することによるＣｒｅ－リコンビナーゼ媒介の切り替え可能な逆位プラスミドの生成を報告した。Ｃｒｅリコンビナーゼが存在する場合、２つの変異体ＬｏｘＰ部位に隣接する遺伝子が反転され、１つのＬｏｘＰ及び１つの二重変異ＬｏｘＰ部位を形成する。二重変異ＬｏｘＰ部位はＣｒｅリコンビナーゼに対して非常に低い親和性を示すので、好ましいワンステップ反転はほぼ不可逆的であり、遺伝子を所望のとおりに安定に「オン」及び「オフ」に切り替えることを可能にする。Ｃｒｅリコンビナーゼの非存在下での発現の漏れは、ｆｌｏｘｅｄ遺伝子の側に偽ＴＡＴＡボックス及び開始コドンを含む配列を排除することによって最小限に抑えられた。
国際公開第２０１５／３８９５８号は、キャップ・イン・シスｒＡＡＶゲノムを報告し、ユビキチンＣプロモーター断片が、ｍＣｈｅｒｒｙレポーターの発現を駆動するために使用され、その後、合成ポリＡ配列が続き；ｒｅｐ調節配列によって制御されるＡＡＶキャプシド遺伝子の後に、Ｌｏｘ７１及びＬｏｘ６６が隣接するＳＶ４０後期ポリＡシグナルが続き；Ｌｏｘ６６部位はＬｏｘ７１部位に対して反転しており；この構成では、Ｃｒｅリコンビナーゼは、変異ＬｏｘＰ部位に隣接する配列の反転を媒介し；逆位の後、不適合性の二重変異体Ｌｏｘ７２及びＬｏｘＰ部位が生成され、逆位の効率が元の状態に低下する。
国際公開第２０１５／６８４１１号は、プロモーターの配向と反対方向にある、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列であるウイルスＡＡＶ－ＬｏｘＰ－ＷＧＡを報告した。この構築物は、通常、目的のタンパク質を発現しない。前記部位特異的リコンビナーゼ認識配列間の目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の方向が反転すると、標的タンパク質が発現される。
Ａｒｇｕｅｌｌｏ，Ｔ．及びＭｏｒａｅｓ，Ｃ．Ｔ．は、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性が、遠位ＬｏｘＰ部位の非対称スペーサー領域における変異によってインビボでは阻害されるが、エクスビボでは阻害されないことを報告した。
国際公開第２０１６／５７８００号は、Ｃｒｅリコンビナーゼに作動可能に連結されたＴＧＧ又はＤＲＧプロモーター及び阻害性ＲＮＡに作動可能に連結されたＬＯＸ－ｓｔｏｐ－ＬＯＸ誘導性ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを報告した。インビボにおいて、著者らは、遠位（３’）ＬｏｘＰ部位における中央スペーサー領域の４位における単一のＴからＣへの変異が、２つの条件付きマウスモデルにおいて組換え反応を完全に阻害することを見出した。
国際公開第２０１７／１００６７１号は、形質導入された標的細胞からのＡＡＶキャプシド配列のＣｒｅリコンビナーゼ依存性の回収を報告した。ｒＡＡＶ－Ｃａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－ｌｏｘ ｒＡＡＶゲノムにおいて、Ｌｏｘ７１部位及びＬｏｘ６６部位に隣接するポリアデニル化（ｐＡ）配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって反転される。
国際公開第２０１７／１８９６８３号は、遺伝子摂動カセットを含む遺伝子構築物及びそれを使用して遺伝子発現のタイミング及び順序を評価する方法を報告した。
国際公開第２０１８／９６３５６号は、標的遺伝子を含む細胞において条件付き遺伝子ノックアウトのための対立遺伝子を作製するための方法であって、人工イントロン配列を標的遺伝子のエクソンに導入することを含み、人工イントロン配列が、スプライスドナー配列；第１のヌクレアーゼ又はリコンビナーゼ部位；分岐点シーケンス；第２のヌクレアーゼ又はリコンビナーゼ部位；スプライスアクセプター配列；及び第１のヌクレアーゼ又はリコンビナーゼ部位の５’側又は内部に位置する終止コドンとを含む、導入されたイントロンの不活性化のために、細胞にリコンビナーゼ又はヌクレアーゼを導入又は活性化し、それにより、分岐点を切除又は破壊し、人工イントロン配列のスプライシングを抑止する工程を含む方法を報告した。
国際公開第２０１８／２２９２７６号は、配列Ａと、配列Ｂと、リコンビナーゼ標的部位（ＲＴＳ）の第１の対ＲＴＳ１及びＲＴＳ１’と、第２の対ＲＴＳ２及びＲＴＳ２’とを含む二本鎖ＤＮＡ分子である条件付きノックインカセットを報告し、（ｉ）第１の対のＲＴＳ及び第２の対のＲＴＳは一緒に再結合することができず、（ｉｉ）ＲＴＳ１及びＲＴＳ１’は反対の向きにあり、（ｉｉｉ）ＲＴＳ２及びＲＴＳ２’は反対の向きにあり、（ｉｖ）配列Ａ及びＢ及びＲＴＳは、５’から３’に、以下の順番：ＲＴＳ１、配列Ａ、ＲＴＳ２、配列Ｂ、ＲＴＳ１’及びＲＴＳ２’であり、（ｖ）配列Ａ及びＢはそれぞれ少なくとも１つのコード配列を含み、前記コード配列は異なるＤＮＡ鎖上にあり、（ｖｉ）配列Ａによってコードされるアミノ酸配列は、配列Ｂによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、（ｖｉｉ）配列Ａのコード鎖及び配列Ｂの非コード鎖はハイブリダイズすることができない。
国際公開第２０１９／４６０６９号は、ｃａｐ遺伝子を一対のＬｏｘＰ部位と隣接させることによるＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の選択的回収及びＣｒｅリコンビナーゼ発現の細胞型特異性の発達を報告した。Ｃｒｅリコンビナーゼ発現細胞のＡＡＶ感染とそれに続く第２鎖ＡＡＶゲノム合成は、ｆｌｏｘｅｄ ｃａｐの逆転をもたらした。変異体ＬｏｘＰ部位Ｌｏｘ６６及びＬｏｘ７１を利用して、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えの平衡を一方向反転に向けて駆動した。ＬｏｘＰ部位を最初にｃａｐの３’ＵＴＲに挿入し、Ｃｒｅリコンビナーゼ依存性回収のための標的配列を含む短いスタッファー配列に隣接させた。
Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｋ．Ｂ．らは、リコンビナーゼ依存性ＡＡＶベクターからのオフターゲット発現源及びクロスオーバー非感受性ＡＴＧ－ｏｕｔベクターによる緩和を報告した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１６（２０１９）２７００１－２７０１０）。リコンビナーゼ依存性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、トランスジェニックマウス系統産生の比較的面倒なプロセスなしに、特定の領域の標的化及び異なる導入遺伝子の発現を可能にする。ｌｏｘ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘ及びＦＲＴ－ＳＴＯＰ－ＦＲＴシステムを使用したリコンビナーゼ依存性ＡＡＶ設計が使用されてきたが、それらの設計において効果的に同一である二重反転オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＤＩＯ）及びフリップ／切除（ＦＬＥＸ）構築物は、それらの限られたサイズのために最も広く使用されており、強力なプロモーターを使用する場合には漏洩性が低いと言われている。手短に言えば、ＤＩＯ及びＦＬＥＸ設計は、所望の導入遺伝子の周りに重複した逆平行配向で、すなわち発現カセットの残りの部分に対して反転され、したがって転写的に抑制された２対の直交認識部位を使用する。適切なリコンビナーゼに曝露されると、導入遺伝子ＯＲＦは逆転し、プロモーター及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）とインセンスでロックされ、発現を駆動する。「ＡＴＧ－ｏｕｔ」又は「スプリット－導入遺伝子」と呼ばれることもある逆ＯＲＦでは、導入遺伝子のコザック配列及び開始コドンがリコンビナーゼ認識部位の第１のセットの外側に配置され、導入遺伝子ＯＲＦは組換え後にのみ再構成される。自然発生的逆位及び導入遺伝子ＯＲＦを独立して破壊することによって、著者らは、漏出を完全に抑止するために両方を破壊しなければならないことを示している。さらに、インタクトなＯＲＦからの漏れ発現は、高感度システムにおいてのみ検出可能であるが、自発的な逆位は、蛍光タンパク質の発現を低いが検出可能なレベルにすることができる。最後に、著者らは、著者らがＣＩＡＯ（交差非感受性ＡＴＧ－ｏｕｔ）と呼ぶ、ＡＴＧ－ｏｕｔ導入遺伝子設計を利用するＡＡＶにおいて相同性が低下した変異リコンビナーゼ認識部位の使用が、リコンビナーゼレポーターマウスのマウス脳における漏出発現を大幅に減少させることを示す。
一過性トランスフェクション法は、大規模発酵及びＤＮＡ精製によって産生される必要がある大量のプラスミドＤＮＡを必要とする。より重要なことに、トランスフェクション試薬とのＤＮＡ複合体化のスケーラビリティは制限される。エレクトロポレーションのスケーラビリティも制限される。さらに、細胞の一過性トランスフェクションは、ほとんど再現性がない。
単純ヘルペス又はアデノウイルス形質導入に依存するシステムは、ｒＡＡＶ調製物が複製能のあるヘルパーウイルスで汚染される固有のリスクを有する。
バキュロウイルスに基づくシステムは、３つの主要な欠点を有する：第１に、バキュロウイルスゲノムのサイズが大きく、１００ｋｂの範囲であるため、組換えウイルスＤＮＡを生成及び調製するために面倒な技術を適用する必要がある。第２に、高濃度の組換えウイルスストックを実際の生産キャンペーンの前に調製する必要がある。最後に、バキュロウイルスに基づくシステムに由来するｒＡＡＶは、カプシド組成の変化及び効力の低下を容易に被る可能性がある。したがって、異なるキャプシドタンパク質の発現比を調整するためにさらなる努力が必要である（Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（２０１７）２６６１－２６７５）。
Ｏｊａｌａ，Ｄ．Ｓ．らは、計算的に設計されたＳＣＨＥＭＡ ＡＡＶライブラリーのインビボ選択が、ＳＶＺにおける成体神経幹細胞の感染のための新規バリアントをもたらすことを報告した（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａ．２６（２０１８）３０４－３１９。
国際公開第２０２０／７８９５３号は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、ヘルパーウイルス遺伝子、並びにＡＡＶベクターのＤＮＡゲノムをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター産生細胞を報告した；ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子はイントロンを含み、イントロンは、転写終結配列を含み、第１の組換え部位が転写終結配列の上流に位置し、第２の組換え部位が転写終結配列の下流に位置し；核酸配列はすべて、ＡＡＶベクター産生細胞ゲノム内の単一遺伝子座に組み込まれていた。本発明はまた、ＡＡＶベクター産生細胞株を産生する方法に関する。
国際公開第２０１８／１５０２７１号は、少なくとも４つの異なる組換え標的部位（ＲＴＳ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子、及びＡｄ遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む哺乳動物細胞であって、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子、及びプロモーターが染色体に組み込まれている、哺乳動物細胞：；組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産生宿主細胞を作製するために細胞を使用する方法；及びＡＡＶ産生宿主細胞を使用してｒＡＡＶを産生、パッケージング及び精製するための方法を報告した。
Ｍｉｎｇｑｉ，Ｘ．らは、哺乳動物デザイナー細胞－工学原理及び生物医学的応用について報告した（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１０（２０１５）１００５－１０１８。
したがって、ゲノム配列において選択的に対処され得るトランスジェニックＤＮＡセグメントの数が増加する機能的ゲノミクスツールが必要とされている。
本明細書には、新規なデオキシリボ核酸及びそれを使用する方法が報告されている。本発明による新規なデオキシリボ核酸は、部位特異的リコンビナーゼ技術による少なくとも２つのオープンリーディングフレーム／遺伝子の発現の同時活性化に有用である。本発明は、デオキシリボ核（ＤＮＡ）分子のコード鎖（（＋）鎖、正に配向した鎖）上及び鋳型鎖（（－）鎖、負に配向した鎖）上のプロモーター及びオープンリーディングフレーム／遺伝子エレメントの意図的な不活性配置を使用し、これは、転写活性化、すなわち、前記コード配列の転写を可能にするプロモーターとコード配列との操作可能な連結、部位特異的リコンビナーゼとの相互作用による反転を必要とする。
本発明の一態様はまた、ｒＡＡＶ粒子産生のためのリコンビナーゼ活性化可能なパッケージング細胞株であり、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子並びにアデノウイルスヘルパー遺伝子はゲノムに（安定に）組み込まれており、それらの少なくとも１つ、１つの好ましい実施形態ではそれらの少なくとも２つは、本発明によるデオキシリボ核酸に含まれ、それによって部位特異的リコンビナーゼとの相互作用によって転写的に活性化され得る。特定の実施形態において、１つ又は複数のアデノウイルスヘルパー遺伝子の転写活性化は、リコンビナーゼ媒介オープンリーディングフレーム／遺伝子反転（ＲＭＣＩ）によって達成される。例えば、その活性化後、アデノウイルスヘルパータンパク質Ｅ１Ａは、自己Ｐ５プロモーターからのｒｅｐ遺伝子の転写を活性化し、これは次にｃａｐ遺伝子の転写を活性化する。特定の実施形態では、例えばＨＥＫ細胞など、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質が構成的に発現されている細胞において、本発明によるデオキシリボ核酸中のリコンビナーゼ媒介オープンリーディングフレーム／遺伝子反転を使用してｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子転写を活性化するか、又は異種プロモーターを使用してｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子転写を駆動する。特定の実施形態において、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ－リコンビナーゼ型バクテリオファージＰ１である。
特定の実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現は、少量のＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸の一過性トランスフェクションによって誘導される。一過性ウイルス産生のために通常使用されるプラスミドＤＮＡの量のわずか１０％で効率的な組換えが達成され得ることが見出された。ｍＲＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼを使用する場合、さらに少量の核酸で十分である。特定の実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸は、パッケージング細胞株のゲノムに組み込まれ、例えばＴｅｔ誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターに作動可能に連結される。好ましい一実施形態では、ＩＴＲ及び導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムもまた、パッケージング細胞株のゲノムに組み込まれる。それにより、パッケージング細胞株は、ｒＡＡＶベクター及び粒子産生細胞株になる。同様に、特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは一過性に導入される。
組換え後、産生細胞株の細胞は遺伝的に均一であり、ｒＡＡＶの複製及びパッケージングに必要なすべての遺伝子を正しい化学量論量で発現する（これとは対照的に、三重又は二重トランスフェクション法では、いくつかの細胞は、１つ又は他のプラスミド／遺伝子の最適以下の用量を受ける場合がある）。したがって、この理論に拘束されることなく、安定なｒＡＡＶベクター／粒子パッケージング又は産生細胞株は、一過性パッケージング又は産生細胞と比較してより高い製品品質をもたらし得る。さらに、ヘルパーウイルスの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸でのトランスフェクションによるｒＡＡＶベクター又は粒子の産生の誘導は、産生されたｒＡＡＶベクター／粒子の安全性を改善する。
本発明のさらなる態様は、新規アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子である。本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、逆位によるＣｒｅリコンビナーゼ媒介遺伝子活性化を可能にする。本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡでは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡの非コードエレメント、すなわち調節エレメントに導入されたＬｏｘＰ部位と共に正確な転写開始部位を有する任意のプロモーターによって駆動され得る。
本発明のさらなる態様は、新規ＬｏｘＰ部位（スペーサー配列）ＡＧＴＴＴＡＴＡ（配列番号０１（順方向）；配列番号０２（逆方向））である。このスペーサー配列は、本明細書ではＬｘと呼ばれる。これは、任意の既知の左及び右反復配列と組み合わせることができる。
特定の実施形態において、Ｌｘスペーサー配列は、変異した左逆方向反復配列及び野生型右逆方向反復配列と組み合わされる。このＣｒｅリコンビナーゼ認識配列はＬｘ－ＬＥとして示され、順方向では配列番号０３の配列を有し、逆方向では配列番号０４の配列を有する。
特定の実施形態において、Ｌｘスペーサー配列は、変異した右逆方向反復配列及び野生型左逆方向反復配列と組み合わされる。このＣｒｅリコンビナーゼ認識配列はＬｘ－ＲＥして示され、順方向では配列番号０５の配列を有し、逆方向では配列番号０６の配列を有する。
本発明の基礎となる技術的原理は、ＤＮＡ反転と、例えばプロモーターなどの調節エレメントへの付随する操作可能な連結とを組み合わせることによる、オープンリーディングフレーム又は遺伝子の転写活性化である。
本発明の１つの独立した態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む二本鎖ＤＮＡエレメントであって、
コード鎖は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、
－第１のプロモーター、
－逆方向反復の一方、すなわち、左逆方向反復又は右逆方向反復のいずれかに変異を含み、他方の逆方向反復は変異していない／野生型逆方向反復である、第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖（方向）に対して（配列が）反転している第２のプロモーター、
－コード鎖（方向）に対して（配列が）反転している第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－コード鎖（方向）に対して（配列が）反転しており、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメントに作動可能に連結されている第１のオープンリーディングフレーム、
－第１のリコンビナーゼ認識配列とはそれぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆向き／相反の向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－第２のオープンリーディングフレーム、
－第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された第２のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメントを含むことを特徴とする。
本発明の１つの独立した態様は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、以下を含む二本鎖ＤＮＡエレメントである。
－５’から３’方向／正の向きである第１のプロモーター、
－逆方向反復の一方、すなわち、左逆方向反復又は右逆方向反復のいずれかに変異を含む、第１のリコンビナーゼ認識配列、
－３’から５’方向／負の向きである第２のプロモーター、
－３’から５’方向／負の向きである第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－３’から５’方向／負の向きである第１のオープンリーディングフレームであって、任意に、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメントに作動可能に連結された第１のオープンリーディングフレーム、
－第１のリコンビナーゼ認識配列とはそれぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－５’から３’方向／正の向きである第２のオープンリーディングフレーム、
－第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された第２のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント。
特定の従属する実施形態において、二本鎖ＤＮＡエレメントと、前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列と機能的なリコンビナーゼとのインキュベーションは、
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間に位置する配列の反転を生じさせ（その後、第１のプロモーターが第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、第２のプロモーターが第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結される）、及び
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間のＤＮＡ配列のリコンビナーゼ媒介反転後、第１のプロモーターと第１のオープンリーディングフレームとの間又は第２のプロモーターと第２のオープンリーディングフレームとの間の（第３の）リコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせ、（（第３の）リコンビナーゼ認識配列）は、前記リコンビナーゼともはや機能しない。
本発明の１つの独立した態様は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、以下を含む二本鎖アデノウイルスＶＡ ＲＮＡエレメントである。
－５’から３’方向／正の向きであるプロモーター、
－逆方向反復の一方、すなわち、左逆方向反復又は右逆方向反復のいずれかに変異を含む、第１のリコンビナーゼ認識配列、
－３’から５’方向／負の向きであるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子、
－第１のリコンビナーゼ認識配列とはそれぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列。
特定の従属する実施形態において、二本鎖ＶＡ ＲＮＡエレメントと、前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列と機能的なリコンビナーゼとのインキュベーションは、
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間の配列の反転を生じさせ（その後、プロモーターがＶＡ ＲＮＡ遺伝子に作動可能に連結される）、及び
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間のＤＮＡ配列のリコンビナーゼ媒介反転後、プロモーターとＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間又はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の下流の（第３の）リコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせ、（（第３の）リコンビナーゼ認識配列）は、前記リコンビナーゼともはや機能しない。
本発明の１つの独立した態様は、以下を含む、（二本鎖）ＤＮＡ（分子）である。
－本発明による第１の二本鎖ＤＮＡエレメント、
－本発明による第２の二本鎖ＤＮＡエレメント、
－任意に、本発明による第３の二本鎖ＤＮＡエレメント又は本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡエレメント、及び
－ｒｅｐ又は／及びｃａｐオープンリーディングフレーム（エレメント）。
特定の従属する実施形態では、
１）
－第１の二本鎖ＤＮＡエレメントにおいて、第１のオープンリーディングフレームはＥ１Ａオープンリーディングフレームであり、第２のオープンリーディングフレームはＥ１Ｂオープンリーディングフレームであり、又はその逆であり；かつ
－第２の二本鎖ＤＮＡエレメントにおいて、第１のオープンリーディングフレームはＥ２Ａオープンリーディングフレームであり、第２のオープンリーディングフレームはＥ４オープンリーディングフレーム若しくはＥ４ｏｒｆ６（オープンリーディングフレーム）であり、又はその逆であるか、
又は
２）
－第１の二本鎖ＤＮＡエレメントにおいて、第１のオープンリーディングフレームはＥ２Ａオープンリーディングフレームであり、第２のオープンリーディングフレームはＥ４オープンリーディングフレーム若しくはＥ４ｏｒｆ６（オープンリーディングフレーム）であり、又はその逆であり；かつ
－第２の二本鎖ＤＮＡエレメントにおいて、第１のオープンリーディングフレームはＥ１Ａオープンリーディングフレームであり、第２のオープンリーディングフレームはＥ１Ｂオープンリーディングフレームであり、又はその逆である。
本発明の１つの独立した態様は、本発明による少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡエレメント若しくは分子又はその（配列）反転形態を含む哺乳動物細胞又は昆虫細胞である。
本発明による１つの独立した態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター又は粒子を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法である。
－本発明による細胞を（細胞***に適した条件下で）培養／増殖させる工程、
－本発明によるリコンビナーゼ媒介オープンリーディングフレーム反転によるｒＡＡＶベクター又は粒子産生の活性化する工程（タンパク質として、又はｍＲＮＡとして、又はＤＮＡとしてリコンビナーゼを本発明による細胞に導入することによって、リコンビナーゼは、本発明によるＤＮＡエレメント又は分子中のリコンビナーゼ認識配列と機能的である）、
－任意に、前の工程で得られたｒＡＡＶベクター又は粒子産生活性化細胞を（ｒＡＡＶベクター又は粒子産生に適した条件下で）培養する工程、
－細胞又は／及び培養培地からｒＡＡＶベクター又は粒子を回収する工程。
したがって、本発明の１つの独立した態様は、（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生のための）（二本鎖）ＤＮＡ（分子）であって、
ａ）Ｅ１Ａオープンリーディングフレーム及びＥ１Ｂオープンリーディングフレーム；及び
ｂ）Ｅ２Ａオープンリーディングフレーム及びＥ４又はＥ４ｏｒｆ６オープンリーディングフレームを含み、
ａ）又はｂ）の第１及び第２のオープンリーディングフレームが、（正に配向された）コード鎖及び（負に配向された）鋳型鎖を含む二本鎖ＤＮＡエレメントに含まれる／含有されることを特徴とし、
コード鎖は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、以下を含む。
－第１のプロモーター（正の配向）、
－逆方向反復の１つに変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖（方向）に対して（配列が）反転している（すなわち、反転／負の配向にある）第２のプロモーター、
－任意に、コード鎖（方向）に対して（配列が）反転しており（すなわち、反転／負の配向にある）、第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－コード鎖方向に対して（配列が）反転している（すなわち、反転／負の配向にある）（ａ）又はｂ）の）第１のオープンリーディングフレーム、
－それぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－第１のオープンリーディングフレームがａ）のものである場合はａ）の第２のオープンリーディングフレーム、又は第１のオープンリーディングフレームがｂ）のものである場合はｂ）の第２のオープンリーディングフレーム（正の配向）、
－第２のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント（正の配向にあり、任意に第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている）。
したがって、本発明の１つの独立した態様は、（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生のための）（二本鎖）ＤＮＡ（分子）であって、
ａ）Ｅ１Ａオープンリーディングフレーム及びＥ１Ｂオープンリーディングフレーム；及び
ｂ）Ｅ２Ａオープンリーディングフレーム及びＥ４又はＥ４ｏｒｆ６オープンリーディングフレームを含み、
ａ）の第１及び第２のオープンリーディングフレーム並びにｂ）の第１及び第２のオープンリーディングフレームが、それぞれ（正に配向された）コード鎖及び（負に配向された）鋳型鎖を含む二本鎖ＤＮＡエレメントに含まれることを特徴とし（すなわち、ＤＮＡ分子は、前記ＤＮＡエレメントのうちの２つを含む）、
コード鎖は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、以下を含む。
－第１のプロモーター（正の配向）、
－逆方向反復の１つに変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖（方向）に対して（配列が）反転している（すなわち、反転／負の配向にある）第２のプロモーター、
－任意に、コード鎖（方向）に対して（配列が）反転しており（すなわち、反転／負の配向にある）、第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－コード鎖方向に対して（配列が）反転している（すなわち、反転／負の配向にある）（ａ）又はｂ）の）第１のオープンリーディングフレーム、
－それぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－第１のオープンリーディングフレームがａ）のものである場合はａ）の第２のオープンリーディングフレーム、又は第１のオープンリーディングフレームがｂ）のものである場合はｂ）の第２のオープンリーディングフレーム（正の配向）、
－第２のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント（正の配向にあり、任意に第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている）。
したがって、本発明の一態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む（少なくとも１つの）二本鎖ＤＮＡエレメントを含む（二本鎖）ＤＮＡ（分子）（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生用）であり、
コード鎖は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、以下を含む。
－第１のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ５又はその機能的断片又はそのバリアント、
－逆方向反復の１つに変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質の発現のためのさらなるプロモーターを含むｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームであって、コード鎖（方向）に対して（配列が）反転された（すなわち、逆向きである）、オープンリーディングフレーム、
－それぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列と相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－ポリアデニル化シグナル、１つの好ましい実施形態では、ｒｅｐ及びｃａｐのオープンリーディングフレームの自己ポリアデニル化シグナル。
特定の従属する実施形態において、（二本鎖）ＤＮＡ（分子）と、前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列と機能的なリコンビナーゼとのインキュベーションは、
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間の配列の反転を生じさせ（その後、第１のプロモーターがｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームに作動可能に連結される）、及び
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間のＤＮＡ配列のリコンビナーゼ媒介反転後、第１のプロモーターとｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームとの間、又はｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームとポリアデニル化シグナルとの間の（第３の）リコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる（第１のオープンリーディングフレーム及び第２のオープンリーディングフレームは、前記リコンビナーゼともはや機能しない）。
本発明の別の独立した態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む二本鎖ＤＮＡエレメントを含む（二本鎖）ＤＮＡ（分子）（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生用）であり、
コード鎖は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、以下を含む。
－第１のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ５又はその機能的断片又はそのバリアント、
－逆方向反復の１つに変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖に対して反転された（逆向きである）第２のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ１９又はその機能的断片又はそのバリアント、
－任意に、コード鎖（方向）に対して（配列が）反転しており（すなわち、反転／負の配向にある）、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列に作動可能に連結されている、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－Ｒｅｐ７８タンパク質のみ又はＲｅｐ６８タンパク質のみのいずれかをコードするが両方はコードしない、コード配列であって、
（ｉ）任意に、内部Ｐ４０プロモーターが不活性化されている、且つ／又は
（ｉｉ）Ｒｅｐ５２／４０の開始コドンが非開始コドンに変異している、且つ／又は
（ｉｉｉ）スプライスドナー部位及びアクセプター部位が除去されており、
及び、コード鎖に対して反転されている（逆向きである）、
－第１のリコンビナーゼ認識配列とはそれぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－共通のポリアデニル化シグナル配列を含むＲｅｐ５２／Ｒｅｐ４０オープンリーディングフレーム及びＣａｐオープンリーディングフレーム（すなわち、ポリアデニル化シグナルが前記オープンリーディングフレームに作動可能に連結される）。
本発明の別の独立した態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む二本鎖ＤＮＡエレメントを含む（二本鎖）ＤＮＡ（分子）（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生用）であり、
コード鎖は、５’から３’方向に、すなわち以下の順序で、以下を含む。
－第１のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ５又はその機能的断片又はそのバリアント、
－逆方向反復の１つに変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖に対して反転された（逆向きである）第２のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ１９又はその機能的断片又はそのバリアント、
－任意に、コード鎖（方向）に対して（配列が）反転しており（すなわち、反転／負の配向にある）、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列に作動可能に連結されている、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－Ｒｅｐ７８タンパク質のみ又はＲｅｐ６８タンパク質のみのいずれかをコードするが両方はコードしない、コード配列であって、
（ｉ）任意に、内部Ｐ４０プロモーターが不活性化されている、且つ／又は
（ｉｉ）Ｒｅｐ５２／４０オープンリーディングフレームの開始コドンが非開始コドンに変異している、且つ
（ｉｉｉ）スプライスドナー部位及びアクセプター部位が除去されており、
及び、コード鎖に対して反転されている（逆向きである）、
－第１のリコンビナーゼ認識配列とはそれぞれの他の逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－任意に、スプライスドナー部位及びアクセプター部位が除去されたＲｅｐ５２オープンリーディングフレーム、又はポリアデニル化シグナル配列を含むＲｅｐ４０オープンリーディングフレーム（すなわち、ポリアデニル化シグナルが前記オープンリーディングフレームに作動可能に連結される）、
－任意に、第３のプロモーター、ｃａｐオープンリーディングフレーム並びにポリアデニル化及び／又はターミネーター配列（すべて作動可能に連結されている）。
本発明の１つの独立した態様は、機能的プロモーターに作動可能に連結されたアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子であり、正確な転写開始部位が付加されており、Ｃｒｅリコンビナーゼ認識配列がアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子内／その中に操作されている。
本発明の一態様は、元の形態又は（リコンビナーゼ）反転形態の本発明のＤＮＡエレメント又はＤＮＡ（分子）又はアデノウイルスＶＡ ＲＮＡの少なくとも１つを含む単離された（哺乳動物又は昆虫）細胞である。
本発明の一態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター又は粒子を生成／作製する方法であって、その方法は以下を含む：
－以下を含む哺乳動物懸濁増殖細胞を提供すること、
－２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に置かれた導入遺伝子発現カセット；
－アデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４又はＥ４ｏｒｆ６タンパク質及びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレーム；
－アデノ随伴Ｒｅｐ／Ｃａｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム；
－非適合リコンビナーゼ認識配列の１つ又は複数の異なる対；
個々に又は組み合わせて、Ｅ１Ａオープンリーディングフレーム、Ｅ１Ｂオープンリーディングフレーム、Ｅ２Ａオープンリーディングフレーム、Ｅ４オープンリーディングフレーム、Ｅ４オープンリーディングフレーム６、Ｒｅｐ７８オープンリーディングフレーム、Ｒｅｐ６８オープンリーディングフレーム、Ｒｅｐ５２オープンリーディングフレーム、Ｒｅｐ４０オープンリーディングフレーム、Ｒｅｐ／Ｃａｐオープンリーディングフレーム及びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子からなる群からの１つ又は複数がそれぞれ、作動可能に連結されたプロモーターなしで配置されるが、前記非適合リコンビナーゼ認識配列の対の間に作動可能に連結されたポリアデニル化及び／又は転写終結シグナルを含み、１つのリコンビナーゼ認識配列が左逆方向反復に変異を含み、１つのリコンビナーゼ認識配列が右逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列の上流に位置するプロモーターを有し、オープンリーディングフレームは、その上流に位置するプロモーターに対して逆方向であり；
リコンビナーゼ認識配列は、（例えば、ｒＡＡＶベクター又は粒子産生によって）検出可能なリコンビナーゼ依存性変化の生成を可能にするように編成され、特定の実施形態では、１つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列がＣｒｅリコンビナーゼ認識部位であり（すなわち、リコンビナーゼ認識配列は互いに相反／逆方向であり、リコンビナーゼの作用は、リコンビナーゼ認識配列間の配列の反転と、反転した配列への上流に位置するプロモーターへの付随する操作可能な連結とをもたらす）、特定の実施形態では、１つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列は、Ｆｌｐ認識部位である（すなわち、リコンビナーゼ認識配列は互いに相反／逆方向であり、リコンビナーゼの作用は、リコンビナーゼ認識配列間の配列の反転と、反転した配列への上流に位置するプロモーターへの付随する操作可能な連結とをもたらす）；
－リコンビナーゼ発現プラスミド又はリコンビナーゼｍＲＮＡで前記細胞をトランスフェクトすることによって、又は前記哺乳動物細胞内の条件付きリコンビナーゼ発現を活性化することによって、前記哺乳動物細胞におけるリコンビナーゼの発現を誘導すること（それにより、リコンビナーゼの発現が、リコンビナーゼ媒介カセット反転をもたらし、ｒＡＡＶベクター又は粒子産生をもたらし、リコンビナーゼ媒介カセット反転は、リコンビナーゼ認識配列に隣接する配列の反転である）；
－細胞又は／及び培養培地からｒＡＡＶベクター又は粒子を単離し、それによってｒＡＡＶベクター又は粒子を作製すること。
本発明の一態様は、哺乳動物細胞において目的のＤＮＡの部位特異的置換を得る方法であって、
ａ）本発明によるＤＮＡエレメントを含む哺乳動物細胞を提供することと、
ｂ）ａ）の前記ＤＮＡエレメントのリコンビナーゼ認識配列と機能的なリコンビナーゼを細胞に導入するか、又は細胞において活性化することとを含み、
リコンビナーゼは、リコンビナーゼ認識配列間の配列の反転を触媒し、それによって哺乳動物細胞における目的のＤＮＡの部位特異的置換が得られる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ認識配列は、左逆方向反復に変異を含み、第２のリコンビナーゼ認識配列は、右逆方向反復に変異を含む。この配置は、リコンビナーゼ媒介反転の後に、上流の、すなわち５’に位置するリコンビナーゼ認識配列が、両方の逆方向反復に変異を含み、それによって非機能性である、すなわちそれぞれのリコンビナーゼによって認識され得ないという結果をもたらす。下流の、すなわち３’に位置するリコンビナーゼ認識配列は、両方の逆方向反復に関して野生型であり、それによって機能的である、すなわちそれぞれのリコンビナーゼによって認識され得る。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ認識配列は、右逆方向反復に変異を含み、第２のリコンビナーゼ認識配列は、左逆方向反復に変異を含む。この配置は、リコンビナーゼ媒介反転の後に、下流の、すなわち３’に位置するリコンビナーゼ認識配列が、両方の逆方向反復に変異を含み、それによって非機能性である、すなわちそれぞれのリコンビナーゼによって認識され得ないという結果をもたらす。上流の、すなわち５’に位置するリコンビナーゼ認識配列は、両方の逆方向反復に関して野生型であり、それによって機能的である、すなわちそれぞれのリコンビナーゼによって認識され得る。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、第１のプロモーターは正の配向にあり、及び／又は、第２のオープンリーディングフレームは正の配向にある。
発明の態様の詳細な説明
本明細書には、新規ＤＮＡ構築物及びそれを使用する方法が報告される。本発明による新規ＤＮＡ構築物は、部位特異的リコンビナーゼ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）を使用した少なくとも２つのオープンリーディングフレーム又は遺伝子の同時転写活性化に有用である。本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子のコード鎖及び鋳型鎖上のプロモーター及びオープンリーディングフレームの意図的な非生産的配置を使用し、これらは部位特異的リコンビナーゼとの相互作用（すなわち、反転）によってそれらの生産的な、すなわち作動可能に連結された形態に変換される。
定義
本発明を実施するための有用な方法及び技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ巻及びＩＩ巻（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
組換えＤＮＡ技術を使用することにより、核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失又は挿入によって、個々の又はいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾又は誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照）。
デオキシリボ核酸は、コード鎖及び非コード鎖を含む。用語「５’」及び「３’」は、本明細書において使用される場合、コード鎖上の位置を指す。
用語「３’隣接配列」は、塩基配列の３’末端（下流、下方）に位置する配列を意味する。
用語「５’隣接配列」は、塩基配列の５’末端（下流、下方）に位置する配列を意味する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において特に明白な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞、及び当業者に公知であるその等価物を含み、他も同様である。同様に、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数の」、及び「少なくとも１つの」も、本明細書において同義的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が同義的に使用され得ることにも留意すべきである。
「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、産生ＡＡＶ複製及びパッケージングのためにトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物及びＡＡＶ粒子を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列（タンパク質）を表す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能には、ｒｅｐ及びｃａｐ、並びに特定のＡＡＶ血清型に対するＡＡＰなどの他のものを含むＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれる。ｒｅｐ遺伝子発現産物は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。キャップ遺伝子発現産物（キャプシド）は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターゲノムから欠けているトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
「ＣＡＳタンパク質」という用語は、リボヌクレアーゼ活性を有し、特定のＲＮＡ配列に結合することができるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を表す。
「ＣＡＳ９」という用語は、エンドヌクレアーゼＣａｓ９を表す。この酵素は、ＲＮＡ配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵ（Ａ／Ｇ）ＵＧ（Ｃ／Ｕ）ＵＧＵＵＵＵＧ（ｃｒＲＮＡリピート）（配列番号２６）に結合し、そこで関連ＤＮＡを切断する。
用語「Ｃｒｅリコンビナーゼ」は、ＬｏｘＰ部位間でトポイソメラーゼＩ様機構を使用して部位特異的組換えを触媒するチロシンリコンビナーゼを意味する。酵素の分子量は約３８ｋＤａであり、３４３アミノ酸残基からなる。これはインテグラーゼファミリーのメンバーである。例示的なＣｒｅリコンビナーゼは、以下のアミノ酸配列を有し：
ＭＳＮＬＬＴＶＨＱＮ ＬＰＡＬＰＶＤＡＴＳ ＤＥＶＲＫＮＬＭＤＭ ＦＲＤＲＱＡＦＳＥＨ ＴＷＫＭＬＬＳＶＣＲ
ＳＷＡＡＷＣＫＬＮＮ ＲＫＷＦＰＡＥＰＥＤ ＶＲＤＹＬＬＹＬＱＡ ＲＧＬＡＶＫＴＩＱＱ ＨＬＧＱＬＮＭＬＨＲ
ＲＳＧＬＰＲＰＳＤＳ ＮＡＶＳＬＶＭＲＲＩ ＲＫＥＮＶＤＡＧＥＲ ＡＫＱＡＬＡＦＥＲＴ ＤＦＤＱＶＲＳＬＭＥ
ＮＳＤＲＣＱＤＩＲＮ ＬＡＦＬＧＩＡＹＮＴ ＬＬＲＩＡＥＩＡＲＩ ＲＶＫＤＩＳＲＴＤＧ ＧＲＭＬＩＨＩＧＲＴ
ＫＴＬＶＳＴＡＧＶＥ ＫＡＬＳＬＧＶＴＫＬ ＶＥＲＷＩＳＶＳＧＶ ＡＤＤＰＮＮＹＬＦＣ ＲＶＲＫＮＧＶＡＡＰ
ＳＡＴＳＱＬＳＴＲＡ ＬＥＧＩＦＥＡＴＨＲ ＬＩＹＧＡＫＤＤＳＧ ＱＲＹＬＡＷＳＧＨＳ ＡＲＶＧＡＡＲＤＭＡ
ＲＡＧＶＳＩＰＥＩＭ ＱＡＧＧＷＴＮＶＮＩ ＶＭＮＹＩＲＮＬＤＳ ＥＴＧＡＭＶＲＬＬＥ ＤＧＤ
（配列番号０７）；
１つの対応するＣｒｅ ｍＲＮＡは、以下の配列を有する：
ＡＵＧＡＧＣＡＡＣＣ ＵＧＣＵＧＡＣＣＧＵ ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＣ ＣＵＧＣＣＣＧＣＣＣ ＵＧＣＣＣＧＵＧＧＡ
ＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣ ＧＡＣＧＡＧＧＵＧＡ ＧＧＡＡＧＡＡＣＣＵ ＧＡＵＧＧＡＣＡＵＧ ＵＵＣＡＧＧＧＡＣＡ
ＧＧＣＡＧＧＣＣＵＵ ＣＡＧＣＧＡＧＣＡＣ ＡＣＣＵＧＧＡＡＧＡ ＵＧＣＵＧＣＵＧＡＧ ＣＧＵＧＵＧＣＡＧＧ
ＡＧＣＵＧＧＧＣＣＧ ＣＣＵＧＧＵＧＣＡＡ ＧＣＵＧＡＡＣＡＡＣ ＡＧＧＡＡＧＵＧＧＵ ＵＣＣＣＣＧＣＣＧＡ
ＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣ ＧＵＧＡＧＧＧＡＣＵ ＡＣＣＵＧＣＵＧＵＡ ＣＣＵＧＣＡＧＧＣＣ ＡＧＧＧＧＣＣＵＧＧ
ＣＣＧＵＧＡＡＧＡＣ ＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧ ＣＡＣＣＵＧＧＧＣＣ ＡＧＣＵＧＡＡＣＡＵ ＧＣＵＧＣＡＣＡＧＧ
ＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣ ＵＧＣＣＣＡＧＧＣＣ ＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣ ＡＡＣＧＣＣＧＵＧＡ ＧＣＣＵＧＧＵＧＡＵ
ＧＡＧＧＡＧＧＡＵＣ ＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡ ＡＣＧＵＧＧＡＣＧＣ ＣＧＧＣＧＡＧＡＧＧ ＧＣＣＡＡＧＣＡＧＧ
ＣＣＣＵＧＧＣＣＵＵ ＣＧＡＧＡＧＧＡＣＣ ＧＡＣＵＵＣＧＡＣＣ ＡＧＧＵＧＡＧＧＡＧ ＣＣＵＧＡＵＧＧＡＧ
ＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡ ＧＧＵＧＣＣＡＧＧＡ ＣＡＵＣＡＧＧＡＡＣ ＣＵＧＧＣＣＵＵＣＣ ＵＧＧＧＣＡＵＣＧＣ
ＣＵＡＣＡＡＣＡＣＣ ＣＵＧＣＵＧＡＧＧＡ ＵＣＧＣＣＧＡＧＡＵ ＣＧＣＣＡＧＧＡＵＣ ＡＧＧＧＵＧＡＡＧＧ
ＡＣＡＵＣＡＧＣＡＧ ＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣ ＧＧＣＡＧＧＡＵＧＣ ＵＧＡＵＣＣＡＣＡＵ ＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣ
ＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧ ＵＧＡＧＣＡＣＣＧＣ ＣＧＧＣＧＵＧＧＡＧ ＡＡＧＧＣＣＣＵＧＡ ＧＣＣＵＧＧＧＣＧＵ
ＧＡＣＣＡＡＧＣＵＧ ＧＵＧＧＡＧＡＧＧＵ ＧＧＡＵＣＡＧＣＧＵ ＧＡＧＣＧＧＣＧＵＧ ＧＣＣＧＡＣＧＡＣＣ
ＣＣＡＡＣＡＡＣＵＡ ＣＣＵＧＵＵＣＵＧＣ ＡＧＧＧＵＧＡＧＧＡ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＵ ＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣ
ＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＣＡＧＣＵＧＡＧ ＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣ ＣＵＧＧＡＧＧＧＣＡ ＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣ
ＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧ ＣＵＧＡＵＣＵＡＣＧ ＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡ ＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣ ＣＡＧＡＧＧＵＡＣＣ
ＵＧＧＣＣＵＧＧＡＧ ＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣ ＧＣＣＡＧＧＧＵＧＧ ＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧ ＧＧＡＣＡＵＧＧＣＣ
ＡＧＧＧＣＣＧＧＣＧ ＵＧＡＧＣＡＵＣＣＣ ＣＧＡＧＡＵＣＡＵＧ ＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧ ＧＣＵＧＧＡＣＣＡＡ
ＣＧＵＧＡＡＣＡＵＣ ＧＵＧＡＵＧＡＡＣＵ ＡＣＡＵＣＡＧＧＡＡ ＣＣＵＧＧＡＣＡＧＣ ＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧ
ＣＣＡＵＧＧＵＧＡＧ ＧＣＵＧＣＵＧＧＡＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＣ
（配列番号０８）又は同様に異なるコドン使用頻度を有するそのバリアント。
「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓの略語であり；規則的な間隔でグループ化された短い回文反復である。
「ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連システムを表す。Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓは、複数の短い直接リピートを含む遺伝子座であり、細菌及び古細菌に対して獲得免疫を提供する。ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入する外来ＤＮＡの配列特異的サイレンシングのためにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡに依存する。３つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムが存在する：ＩＩ型システムでは、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ標的認識時にＤＮＡを切断するＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼとして働く。
「ｃｒＲＮＡ」という用語は、ｃｒＲＮＡ反復配列と、ｃｒＲＮＡスペーサー配列とからなるＲＮＡを表し；特定の二次構造を有し；ｃｒＲＮＡはＣａｓ９に結合し、Ｃａｓ９の構造変化を誘導し、それにより、標的ＤＮＡは、ｃｒＲＮＡスペーサー（標的ＤＮＡに相補的）によって結合でき；ｃｒＲＮＡスペーサー配列を交換することにより、標的ＤＮＡを変更することができ（標的ＤＮＡの相補的ＲＮＡ配列に）；ｃｒＲＮＡ反復は２０ヌクレオチドで構成され；ＰＡＭモチーフに隣接する１２ヌクレオチドは、結合特異性に極めて重要である。
「ドナープラスミド」という用語は、ドナー配列を含むプラスミドを表す。
「ドナー配列」という用語は、５’フランキング配列－標的配列－３’フランキング配列を含む配列を表す。
「ＤＳＢ」という用語は、二本鎖切断を表す。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９作用の産物、二本鎖切断は、両方のＤＮＡ鎖が切断されたときに起こるＤＮＡ損傷の形態である。
「空のキャプシド」及び「空の粒子」という用語は、ＡＡＶタンパク質シェルを有するが、タンパク質をコードするか又はＡＡＶ ＩＴＲ、すなわちベクターに隣接する目的の転写産物に転写される核酸の全体又は一部を欠くＡＡＶ粒子を指す。したがって、空のキャプシドは、タンパク質をコードする、又は目的の転写産物に転写される核酸を宿主細胞に移入するように機能しない。
「内在性」という用語は、細胞内で自然に発生し；細胞によって自然に生成されるものを表わす。同様に、「内在性遺伝子座／細胞内在性遺伝子座」は、細胞内に自然に発生する遺伝子座である。
本明細書において使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又はウイルスベクターによる形質転換によって前記細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である）から、又は配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列若しくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失若しくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一であるが、例えば組換えＤＮＡ技術を介した細胞への導入によって配列が「外因性」配列になりつつある「内因性」対応物を有することができる。
本明細書において使用される場合、用語「隣接する」は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端のいずれか、又は両末端に位置していることを意味する。隣接ヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の隣に存在するか、又はそれから所定の距離の位置にあってよい。実際の要件以外に、隣接ヌクレオチド配列の長さに特定の制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対又は数千塩基対であってよい。「隣接ヌクレオチド配列」という用語は、挿入される配列（＝標的配列）の前後にある核酸の配列セグメントを意味する。
「遺伝子座」という用語は、染色体上の遺伝子の位置、すなわちゲノム内の遺伝子の位置、すなわち遺伝子位置を意味する。
「ＨＲ」という用語は相同組換えを意味する。相同組換え修復は、ＤＳＢ修復のための鋳型依存性経路である。相同性含有ドナー鋳型を部位特異的ヌクレアーゼと共に供給することによって、ＨＤＲは、ドナー分子を標的遺伝子座に忠実に挿入する。このアプローチは、単一又は複数の導入遺伝子の挿入、並びに単一ヌクレオチド置換を可能にする。
「単離された」組成物とは、その天然環境の１つ又は複数の成分から分離された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）又はクロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ又はイオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）によって測定した場合に９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
「単離された」核酸は、その天然環境の１つ又は複数の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、又は天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。
「単離された」ポリペプチド又は抗体とは、その天然環境の１つ又は複数の成分から分離されたポリペプチド分子又は抗体分子を意味する。
「組込み部位」という用語は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される／挿入されている、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチドのストレッチを含む。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
「ＬｏｘＰ部位」という用語は、末端の二つのパリンドローム１３ｂｐ配列（逆方向反復）（それぞれ、ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ（配列番号１４）及びＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１５）と、中央の８ｂｐコア（対称ではない）スペーサー配列とからなる長さが３４ｂｐのヌクレオチド配列を表す。スペーサー配列は、ＬｏｘＰ部位の配向を決定する。２つのＬｏｘＰ部位の互いに対する相対的な配向及び位置に応じて、介在するＤＮＡは、切り取られる（同じ方向に配向されたＬｏｘＰ部位）か、又は反転される（反対方向に配向されたＬｏｘＰ部位）。用語「ｆｌｏｘｅｄ」は、２つのＬｏｘＰ部位の間に位置するＤＮＡ配列を意味する。２つのｆｌｏｘｅｄ配列、すなわちゲノム中の標的ｆｌｏｘｅｄ配列及びドナー核酸中のｆｌｏｘｅｄ配列が存在する場合、両方の配列を互いに交換することができる。これは「リコンビナーゼ媒介カセット交換」と呼ばれる。
例示的なＬｏｘＰ部位を以下の表に示す：
Figure 2023546113000002
用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、そのような細胞の子孫を含めて、１つ又は複数の外因性核酸が導入された細胞を包含する。これらは、さらなる遺伝子改変の出発点となり得る。したがって、用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、前記哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を包含し、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する、少なくとも１つの第１及び少なくとも１つの第２の組換え認識部位（これらの組換え認識部位は異なる）を含む。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、前記細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列及び第２の組換え認識配列、並びに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なっている。
「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」及び「組換え細胞」はどちらも、「トランスフェクト細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代トランスフェクト細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもいが、突然変異を含んでもよい。最初にトランスフェクトされた細胞と同じ機能又は生物活性を有している突然変異子孫は、包含される。
「ＮＨＥＪ」という用語は、非相同末端結合を表す。これは、２つの切断された末端を一緒にライゲーション又は連結するＤＳＢ修復経路である。ＮＨＥＪは、修復のために相同鋳型を使用せず、したがって、典型的には、切断部位に小さな挿入及び欠失の導入をもたらし、遺伝子機能をノックアウトするフレームシフトを誘発することが多い。
本明細書で使用される「非適合」という用語は、別のリコンビナーゼ認識部位、例えばスペーサー領域相同性を共有しない第２のＬｏｘＰ部位と再結合しない、リコンビナーゼ認識部位、例えば第１のＬｏｘＰ部位を表す。特定の実施形態では、非適合ＬｏｘＰ部位は、スペーサー領域相同性を１％未満、１つの好ましい実施形態では０．５％以下で共有しない別のＬｏｘＰ部位と再結合する。これは、シスで連結された２つの非適合ＬｏｘＰ部位が、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で安定であること、すなわち最大１％の部位交換、好ましい実施形態では０．５％以下の部位交換であることを意味する。
本明細書で使用される用語「核局在化配列」は、正に荷電したアミノ酸残基のアルギニン又は／及びリジンの複数のコピーを含むアミノ酸配列を表す。前記配列を含むポリペプチドは、細胞核に導入するために細胞によって同定される。例示的な核局在化配列は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号０９；ＳＶ４０ラージＴ抗原）、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号１０、ＳＶ４０ヌクレオプラスミン）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１１；線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ＥＧＬ－１３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１２、ヒトｃ－ｍｙｃ）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１３、大腸菌末端利用物質タンパク質）である。他の核局在化配列は、当業者によって容易に同定され得る。
「ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸」は、一般に、形質導入適格性組換えＡＡＶ粒子を産生するために使用される、ＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む１つ又は複数の核酸分子を指す。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶ複製に必要な欠損ＡＡＶ機能を補完するためにＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の発現を提供するために一般的に使用される。しかしながら、核酸構築物はＡＡＶ ＩＴＲを欠き、複製もパッケージングもできない。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス又は粒子の形態であり得る。多くの核酸構築物、例えば、ｒｅｐ遺伝子発現産物及びｃａｐ遺伝子発現産物の両方をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ ２９＋４５が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６－２９４５を参照のこと。ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子発現産物をコードするいくつかのプラスミドが記載されている（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び米国特許第６，３７６，２３７号）。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードするこれらの核酸のいずれか１つは、本発明によるＤＮＡエレメント又は核酸を含むことができる。
「ヘルパータンパク質をコードする核酸」という用語は、一般に、アデノウイルスヘルパー機能（複数可）を提供するタンパク質及び／又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ又は複数の核酸分子を指す。ヘルパータンパク質をコードする核酸を有するプラスミドを適切な細胞にトランスフェクトすることができ、その結果、プラスミドは前記細胞におけるＡＡＶ粒子産生を支援することができる。ヘルパータンパク質をコードするこれらの核酸のいずれか１つは、本発明によるＤＮＡエレメント又は核酸を含むことができる。アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルス粒子などの自然界に存在する感染性ウイルス粒子は、この用語から特に除外される。
本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、２つ以上の成分の近接した配置を意味する。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーがコード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーター及び／又はエンハンサーはコード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は連続している。特定の実施形態では、例えば、１つの分泌リーダーと１つのポリペプチドといった２つのタンパク質のコード領域を結合する必要があるとき、これら配列は連続しており、かつ同じリーディングフレームに存在する。特定の実施形態では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子の上流に位置しており、かつコード配列に隣り合うことができる。特定の実施形態では、例えば、コード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣り合ってはいないが、作動可能に連結され得る。エンハンサーがコード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子に作動可能に連結されている。作動可能に連結されエンハンサーは、コード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子の上流、その中、又は下流に位置し得、またコード配列／オープンリーディングフレーム／遺伝子のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。
「パッケージングタンパク質」という用語は、ＡＡＶがその複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／又は細胞機能を指す。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶキャプシドアセンブリの活性化に関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質及びＲＮＡを捕捉する。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスウイルス以外）及びワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶパッケージングタンパク質」は、産生ＡＡＶ複製のためにトランスで機能するＡＡＶ由来配列を指す。したがって、ＡＡＶパッケージングタンパク質は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐによってコードされる。ｒｅｐタンパク質は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。キャップ（キャプシド）タンパク質は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶパッケージングタンパク質は、本明細書において、ＡＡＶベクターから欠けているトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
「ＰＡＭモチーフ」という用語は、プロトスペーサー隣接モチーフ；プロトスペーサーに隣接するモチーフを表わす。配列ＮＧＧ；標的ＤＮＡ内；標的ＤＮＡの切断は、ＰＡＭの３ヌクレオチド前に行われる。
「プラスミド」は、典型的には、プラスミドの発現（例えば、転写、複製など）又は増殖（複製）のための追加のエレメントを有する核酸又はポリヌクレオチドの形態である。本明細書で使用されるプラスミドはまた、そのような核酸又はポリヌクレオチド配列を参照するために使用することができる。したがって、すべての態様において、本発明の組成物及び方法は、例えば、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を産生するため、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を産生するため、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を含む細胞培養培地を産生するためなどに、核酸、ポリヌクレオチド、並びにプラスミドに適用可能である。
本明細書で使用され「タンパク質性化合物」という用語は、哺乳動物細胞において機能的形態で産生された少なくとも１つのポリペプチドを含むヘテロ多量体分子を意味する。例示的なタンパク質性化合物は、キャプシドポリペプチドから形成されたキャプシド及び非ポリペプチド成分である一本鎖ＤＮＡ分子を含むアデノ随伴ウイルス粒子（ＡＡＶ粒子）である。
本明細書において使用される場合、用語「組換え細胞」は、最終的な遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的のポリペプチドを発現するか又は目的のｒＡＡＶ粒子を産生し、前記目的のポリペプチド又は目的のｒＡＡＶ粒子の任意の規模での産生のために使用できる細胞を意味する。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、「組換え細胞」である。この細胞は、さらにＲＭＣＥ反応を行うことが依然としてできるが、そうすることは目的ではない。
「組換えＡＡＶベクター」は、分子生物学的方法を使用してウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去し、それを非天然核酸、例えば転写産物に転写された核酸又はタンパク質をコードする核酸で置き換えることによって、ＡＡＶ等のウイルスの野生型ゲノムから得られる。典型的には、ＡＡＶについては、野生型ＡＡＶゲノムの一方又は両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が組換えＡＡＶベクターに保持される。「組換え」ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノムの全部又は一部が、ウイルスゲノム核酸に関して非天然（すなわち、異種）配列で置き換えられているため、野生型ウイルスＡＡＶゲノムとは区別される。したがって、非天然配列の組み込みは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を「組換え」ベクターと定義し、これはＡＡＶの場合は「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。
組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）は、エクスビボ、インビトロ又はインビボでの細胞のその後の感染（形質導入）のために、パッケージングされ、本明細書では「粒子」と呼ばれ得る。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子に封入又はパッケージングされる場合、粒子は「ｒＡＡＶ」とも呼ばれ得る。そのような粒子は、ベクターゲノムをカプセル化又はパッケージ化するタンパク質を含む。特定の例としては、ウイルスエンベロープタンパク質が挙げられ、ＡＡＶの場合、キャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３が挙げられる。
「組換え認識部位」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳを用いて、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めることができる。
本明細書において使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブ又はネガティブに特異的に選択されることを可能にする遺伝子を意味する。例えば、限定するわけではないが、選択マーカーにより、その選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、各選択剤の存在下（選択的培養条件下）で、ポジティブに選択されることが可能になり得る；形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖することも生存することもできないと考えられる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、又は二機能性であってよい。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、又は代謝若しくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号及び国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出又は不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、血清学的に異なるＡＡＶキャプシドに基づく区別である。血清学的特異性は、他のＡＡＶと比較して、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の差異は、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列の差異に起因する）の差異によるものである。キャプシドバリアントを含むＡＡＶバリアントは、参照ＡＡＶ又は他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別できない可能性があるにもかかわらず、参照又は他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。
従来の定義の下では、血清型は、中和活性について既存の及び特徴付けられたすべての血清型に特異的な血清に対して目的のウイルスが試験され、目的のウイルスを中和する抗体が見出されていないことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス分離株が発見され、及び／又はキャプシド変異体が生成されるにつれて、現在存在する血清型のいずれとも血清学的差異があってもなくてもよい。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差異を有しない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又はバリアントである。多くの場合、中和活性についての血清学的試験は、それらが血清型の従来の定義に従って他の血清型であるかどうかを決定するために、キャプシド配列改変を有する変異ウイルスに対してまだ行われていない。したがって、便宜上、及び繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、広義には、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）並びに所与の血清型のサブグループ又はバリアント内にあり得る血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を指す。
「ｓｇＲＮＡ」という用語は、シングルガイドＲＮＡ；ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｅｒＲＮＡとを含む単一のＲＮＡ鎖を表わす。
「ＴＡＬＥＮ」という用語は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを表す。これらは、ＦｏｋＩ切断ドメインと、ＴＡＬＥタンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインとの融合物である。ＴＡＬＥは、各々が単一の塩基対を認識する複数の３３～３５アミノ酸反復ドメインを含む。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ損傷応答経路を活性化し、カスタム変更を可能にする標的ＤＳＢを誘導する。
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という用語は、トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを表わし；非コードＲＮＡ；ｃｒＲＮＡに部分的に相補的であり；ＲＮＡ二重らせんを形成し；ｃｒＲＮＡプロセシングを促進し；ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる活性化；標的ＤＮＡに結合し；エンドヌクレアーゼ機能が結合部位付近で切断し；ＣＡＳ９によるＲＮＡガイド型切断の活性化に必要である。
「形質導入」及び「トランスフェクト」という用語は、核酸（ウイルスベクター、プラスミド）などの分子の細胞への導入を指す。外因性核酸が細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「形質導入」又は「トランスフェクト」されている。したがって、「形質導入細胞」は、「核酸」若しくは「ポリヌクレオチド」が導入された細胞、又は外因性核酸が導入されたその子孫である。特定の実施形態において、「形質導入」細胞（例えば、哺乳動物、例えば、細胞又は組織又は器官細胞において）は、外因性分子、例えば核酸（例えば導入遺伝子）の組み込み後に遺伝的変化を有する。「形質導入」細胞を増殖させ、導入された核酸を転写及び／又はタンパク質を発現させることができる。
「形質導入」又は「トランスフェクト」した細胞では、核酸（ウイルスベクター、プラスミド）はゲノム核酸に組み込まれても組み込まれなくてもよい。導入された核酸がレシピエント細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれると、これは前記細胞又は生物内で安定的に維持され、さらにレシピエント細胞又は生物の子孫細胞又は生物に渡されるか又は子孫細胞又は生物によって継承され得る。最後に、導入された核酸は、染色体外に、又は一過性にのみレシピエント細胞又は宿主生物に存在し得る。いくつかの技術が知られており、例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓら（１９８６）、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及びＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
「導入遺伝子」という用語は、本明細書では、意図された又は細胞又は生物に導入された核酸を好都合に指すために使用される。導入遺伝子には、任意の核酸、例えば、転写産物に転写されるか、又はポリペプチド若しくはタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
「ベクター」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成するために、直接又は一本鎖若しくはＲＮＡの形態で、最終的にパッケージング又は封入された組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドを使用して組換えウイルス粒子を構築又は製造する場合、ウイルス粒子は、組換えプラスミドのベクター配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクター部分は「プラスミド骨格」と呼ばれ、これは増殖及び組換えウイルス産生に必要なプロセスであるプラスミドのクローニング及び増幅にとって重要であるが、それ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にパッケージング又は封入されていない。したがって、「ベクター」は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージング又は封入された核酸を指す。
「ＺＦＮ」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを表す。これらは、ジンクフィンガータンパク質とＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的ＤＮＡ切断ドメインとの融合物である。ＺＦＮ二量体は、ＤＮＡ損傷応答経路を刺激する標的ＤＮＡ ＤＳＢを誘導する。設計されたジンクフィンガードメインの結合特異性は、ＺＦＮを特定のゲノム部位に向かわせる。
用語「ＺＦＮｉｃｋａｓｅｓ」は、ジンクフィンガーニッカーゼを意味する。これらのＺＦＮは、２つのＦｏｋＩ切断ドメインのうちの１つに不活性化変異を含有する。ＺＦＮｉｃｋａｓｅは、一本鎖ＤＮＡ切断のみを行い、変異原性ＮＨＥＪ経路を活性化することなくＨＤＲを誘導する。
遺伝子編集方法
多様な細胞型及び生物における実質的に任意の遺伝子の操作を可能にするアプローチは、過去数十年の間に進化してきた。このような技術は、一般に「ゲノム編集」と呼ばれる。
ヌクレアーゼ
ゲノム編集を行う１つの方法は、操作されたヌクレアーゼの使用に基づく。これらは、非特異的ＤＮＡ切断モジュールに融合された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインから構成される。そのようなキメラヌクレアーゼは、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＲ）を含む細胞ＤＮＡ修復機構を刺激する標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによって、効率的かつ正確な遺伝子改変を可能にする。これらの方法の汎用性は、実質的に任意の配列を認識するようにＤＮＡ結合ドメインをカスタマイズする能力から生じる。
したがって、遺伝子変化を実行する能力は、設計されたタンパク質のＤＮＡ結合特異性及び親和性に大きく依存する（Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２０１３）３９７－４０５）。
標的化核酸置換は、染色体核酸配列と外因性ドナー核酸配列部位特異的核酸交換との間の相同組換えによって導入する。指向性遺伝子変化を行うことは、しばしば「遺伝子ターゲティング」と呼ばれる（例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８８（２０１１）７７３－７８２を参照のこと）。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）並びにＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳは、標的化核酸置換のためのツールである。Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＡＳベースのＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの配列特異的改変のためにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡに依存する。３つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムが存在する。ＩＩ型システムでは、例えば、ＣＡＳ９は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ標的認識時にＤＮＡを切断するＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼとして働く。
部位特異的ヌクレアーゼを遺伝子座特異的相同アームを有するドナープラスミドと共送達することにより、単一又は複数の導入遺伝子、すなわち発現カセットを含む外因性核酸を染色体標的遺伝子座に効率的に組み込むことができる。大きな導入遺伝子（最大１４ｋｂｐ）が、ドナーＤＮＡのヌクレアーゼ媒介性切断を染色体標的と同期させることによるＮＨＥＪ媒介性ライゲーションを介して様々な内因性遺伝子座に導入されている（Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２０１３）３９７－４０５）。
二本鎖ＤＮＡ「ドナー鋳型」が供給される場合、ヌクレアーゼ誘導ＤＳＢのＨＲを使用して、切断部位又はその近くに最大７．６ｋｂｐの正確な核酸置換又は挿入を導入することができる。オリゴヌクレオチドをＺＦＮと共に使用して、正確な変化、小さな挿入、及び大きな欠失を導入することができる。ＺＦＮは、ＮＨＥＪ又はＨＲ媒介性の遺伝子変化を導入するために使用されている（Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４（２０１３）４９－５５）。
典型的には、ヌクレアーゼコード遺伝子は、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、又はインビトロ転写ｍＲＮＡによって細胞に送達される。プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡのトランスフェクションは、エレクトロポレーション又はカチオン性脂質ベースの試薬によって行うことができる。インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）は、ヌクレアーゼをトランスフェクション耐性細胞型に送達するために使用することができる。ＡＡＶをヌクレアーゼ送達に使用することもできる。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン（Ｎ）をジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と組み合わせるジンクフィンガーヌクレアーゼは、ゲノムに部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する一般的な方法を提供する。
ジンクフィンガー（ＺＦ）モチーフのモジュール構造及びＺＦドメインによるモジュール認識は、それらを人工ＤＮＡ結合タンパク質を設計するための多用途ＤＮＡ認識モチーフにする。各ＺＦモチーフは、約３０個のアミノ酸からなり、保存されたＣｙｓ２Ｈｉｓ２残基による亜鉛イオンのキレート化によって安定化されるββａ構造に折り畳まれる。ＺＦモチーフは、ＤＮＡ二重らせんの主溝にａらせんを挿入することによってＤＮＡに結合する。各フィンガーは、ＤＮＡ基質内のトリプレットに主に結合する。各ＺＦモチーフのａヘリックスの開始点に対して－１、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５及び＋６の位置の重要なアミノ酸残基は、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用の大部分に寄与する。これらのアミノ酸は、異なるトリプレット配列特異性を有するＺＦモチーフを生成するためにコンセンサス骨格として残りのアミノ酸を維持しながら変更することができる。より長いＤＮＡ配列への結合は、これらのＺＦモチーフのいくつかをタンデムに連結してＺＦＰを形成することによって達成される。設計されたＺＦＰは、非特異的ＦｏｋＩ切断ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写リプレッサードメイン（Ｒ）及びメチラーゼ（Ｍ）などの他の機能性をＺＦＰに融合して、それぞれＺＦＮ、ジンクフィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、ジンクフィンガー転写リプレッサー（ＺＦＲ）及びジンクフィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）を形成することができるので、強力な技術を提供する。
細菌ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩ制限酵素は、二本鎖ＤＮＡ中の非パリンドローム性ペンタデオキシリボヌクレオチド５’－ＧＧＡＴＧ－３’：５’－ＣＡＴＣＣ－３’（配列番号２７）を認識し、認識部位の下流の９／１３ｎｔを切断する。Ｄｕｒａｉらは、ＦｏｋＩ認識ドメインを、より長いＤＮＡ配列又は他の設計されたＤＮＡ結合モチーフを認識する他の天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質と交換して、キメラヌクレアーゼを作製することが可能であることを示唆した（Ｄｕｒａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）５９７８－５９９０）。
ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体として機能するため、各標的部位に対して２つのジンクフィンガーアレイを設計しなければならない。偏性ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメインの使用は、望ましくないホモ二量体種の形成を減少させ、したがって、改善された特異性を有する（Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４（２０１３）４９－５５）。したがって、ＺＦＮ標的部位は、ＦｏｋＩ切断ドメインによって認識される５～７ｂｐのスペーサー配列によって分離された２つのジンクフィンガー結合部位からなる（Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２０１３）３９７－４０５）。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＦｏｋＩヌクレアーゼへの植物病原性Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターの融合は、ＴＡＬＥＮをもたらした。これらはＤＮＡに結合して対をなして切断する。結合特異性は、ＴＡＬエフェクターにおける多型アミノ酸反復のカスタマイズ可能なアレイによって決定される。
ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）は核に入り、宿主遺伝子プロモーター中のエフェクター特異的配列に結合し、転写を活性化する。それらの標的化特異性は、タンデムの３３～３５アミノ酸反復の中央ドメインと、それに続く２０アミノ酸の単一の切断型反復によって決定される。天然に存在する認識部位には、ＴＡＬエフェクター活性に必要なＴが均一に先行する（Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２０１１）ｅ８２）。
ＴＡＬＥ特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られている２つの超可変アミノ酸によって決定される。ジンクフィンガーと同様に、モジュールＴＡＬＥ反復は、互いに連結されて、隣接するＤＮＡ配列を認識する（Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２０１３）３９７－４０５）。
ＴＡＬエフェクターをＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒ドメインに融合して、ゲノム編集のためにインビボで標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製することができる。ＦｏｋＩは二量体として切断するため、これらのＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は対で機能し、スペーサーを横切って反対側の標的に結合し、その上でＦｏｋＩドメインが一緒になって切断する。ＤＳＢは、遺伝子挿入又は置換に使用することができる２つの高度に保存されたプロセス、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）のうちの１つによってほぼすべての細胞で修復される。
ＴＡＬＥＮ又はＴＡＬエフェクター構築物の組み立ては、２つの工程を含む：（ｉ）１～１０反復の中間アレイへの反復モジュールのアセンブリ、及び（ｉｉ）最終構築物を作製するための骨格への中間アレイの結合（Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２０１１）ｅ８２）。
ＴＡＬＥＮ標的部位は、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された２つのＴＡＬＥ結合部位からなる（Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２０１３）３９７－４０５）。
典型的なヘテロ二量体標的部位（すなわち、天然のＤＮＡ配列において典型的に生じるであろうようなもの）については、対になったＴＡＬＥＮ構築物を一緒に標的細胞に形質転換する。
標的核酸に向けられたＴＡＬＥＮの対の一方を、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して哺乳動物発現プラスミドにサブクローニングする。得られたプラスミドを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用してトランスフェクションによって標的細胞に導入する。トランスフェクションの７２時間後に細胞を回収する（Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２０１１）ｅ８２）。
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９）
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ＩＩ型システムは、真核細胞のための強力な遺伝子編集ツールに開発されている。特に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に組み合わせることができるという実証は、この開発のための道を開いた。Ｃａｓ９は、ＤＮＡ内に一本鎖切断をもたらす。この方法は、真核細胞におけるＤＮＡ修復経路を利用して、遺伝子改変を行う２つの方法を提供する。第１の方法は、切断末端を結合する非相同末端接合（ＮＨＥＪ）に依存する。第２に、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、標的と相同性を有する別のＤＮＡ片を使用して損傷した対立遺伝子を修復する。組換えによって挿入され得るＤＮＡエレメントを提供することによって、任意のタイプの挿入、欠失又は配列の変化が達成され得る（Ｒａｔｈ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．１１７（２０１５）１１９－１２８）。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムでは、「スペーサー」と呼ばれる外来ＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に組み込まれ、転写され、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。これらのｃｒＲＮＡはトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールし、ＣＡＳタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的切断及びサイレンシングを指示する。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識は、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列及びｃｒＲＮＡ結合領域の上流の保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を必要とすることが示されている。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及び必要なｃｒＲＮＡ成分を発現するプラスミドの同時送達によって、ヒト細胞に直接移植可能であることが示されている（Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２０１３）３９７－４０５）。
組換え細胞株の生成
一般に、目的のタンパク質性化合物、例えばｒＡＡＶ粒子又は治療用ポリペプチドの効率的かつ大規模な産生のためには、前記タンパク質性化合物を安定に発現し、可能であれば分泌する細胞が必要である。そのような細胞は、「組換え細胞」又は「組換え産生細胞」と呼ばれる。そのような組換え細胞を生成するためのプロセスは、「細胞株開発」（ＣＬＤ）と呼ばれる。
第１の工程では、適切な宿主細胞に、前記目的のタンパク質性化合物をコードする必要な核酸配列をトランスフェクトする。追加のヘルパーポリペプチドのトランスフェクションが必要な場合がある。第２の工程では、目的のタンパク質性化合物を安定に発現する細胞を選択する。これは、例えば、目的のタンパク質性化合物をコードする核酸配列と同時トランスフェクトされた選択マーカーの同時発現に基づいて行うことができ、又はタンパク質性化合物自体の発現であり得る。
コード配列、すなわちオープンリーディングフレームの発現には、プロモーター及びポリアデニル化シグナル（配列）などの追加の調節エレメントが必要である。したがって、オープンリーディングフレームは、転写のために前記の追加の調節エレメントに作動可能に連結される。これは、いわゆる発現カセットに組み込むことによって達成することができる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、オープンリーディングフレームの上流、すなわち５’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、及びオープンリーディングフレームの下流、すなわち３’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル（配列）である。さらに、ポリアデニル化シグナル（配列）の３’側にターミネーター配列が存在し得る。発現のために、プロモーター、オープンリーディングフレーム／コード領域及びポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で配置されなければならない。
同様に、非タンパク質コードＲＮＡに転写される核酸は、「ＲＮＡ遺伝子」と呼ばれる。ＲＮＡ遺伝子の発現のためにも、プロモーター及び転写終結シグナル又はポリアデニル化シグナル（配列）などの追加の調節エレメントが必要である。そのようなエレメントの性質及び局在化は、ＲＮＡ遺伝子の発現を駆動することを意図したＲＮＡポリメラーゼに依存する。したがって、ＲＮＡ遺伝子は通常、発現カセットにも組み込まれる。
目的のタンパク質性化合物が、異なる（単量体）ポリペプチドで構成されるヘテロ多量体ポリペプチドである場合、単一の発現カセットが必要とされるだけでなく、異なるポリペプチド、すなわちオープンリーディングフレーム／コード配列、及び存在する場合はＲＮＡ遺伝子のそれぞれに１つが必要である。これらの発現カセットは、少なくとも含まれるオープンリーディングフレーム／コード配列が異なるが、プロモーター及び／又はポリアデニル化シグナル配列も異なり得る。
例えば、目的のタンパク質性化合物が、２コピーの軽鎖及び２コピーの重鎖を含むヘテロ多量体ポリペプチドである完全長抗体である場合、２つの異なる発現カセットが必要であり、１つは軽鎖用であり、１つは重鎖用である。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である場合、すなわち、抗体が２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、軽鎖の各々並びに重鎖の各々もまた互いに異なる。したがって、二重特異性完全長抗体は４つの異なるポリペプチドから構成され、したがって、４つの異なるポリペプチドをコードする４つの異なるオープンリーディングフレームを含む４つの発現カセットが必要である。
目的のタンパク質性化合物が、異なる（単量体）ポリペプチド及び一本鎖ＤＮＡ分子から構成され、さらに産生及びカプセル化のために他の補助因子を必要とするＡＡＶ粒子である場合、含まれるオープンリーディングフレーム／コード配列が異なる多数の発現カセットが必要とされる。この場合、必要なヘルパー機能のための、導入遺伝子、ＡＡＶベクターのキャプシドを形成する異なるポリペプチド、並びにＶＡ ＲＮＡのそれぞれのための少なくとも１つの発現カセットが必要である。したがって、ヘルパーＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＶＡ ＲＮＡ、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子のそれぞれに対する個々の発現カセットが必要である。
前の段落で概説したように、目的のタンパク質性化合物が複雑であるほど、又は追加の必要とされるヘルパーポリペプチド及び／又はＲＮＡの数が多いほど、それぞれ、必要とされる異なる発現カセットの数が多い。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。しかしながら、転送可能な核酸のサイズには実用的な上限があり、約１５ｋｂｐ（キロベース対）の範囲である。この限界を超えると、取り扱い及び処理効率が大幅に低下する。この問題は、２つ以上の別個の核酸を使用することによって対処することができる。これにより、異なる発現カセットが異なる核酸に割り当てられ、各核酸は発現カセットの一部のみを含む。
細胞株の発達のために、目的のタンパク質性化合物のための発現カセットを担持する核酸のランダム組込み（ＲＩ）を使用することができる。一般に、ＲＩを使用することによって、核酸又はその断片は、ランダムに宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
あるいは、ＲＩには、ＣＬＤに標的化組込み（ＴＩ）を使用することができる。ＴＩ ＣＬＤでは、異なる発現カセットを含む１つ又は複数の核酸が、宿主細胞のゲノム内の所定の遺伝子座に導入される。
ＴＩでは、相同組換え又はリコンビナーゼ媒介カセット交換反応（ＲＭＣＥ）のいずれかを、それぞれの発現カセットを含む核酸（ａ）をＴＩ宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に組み込むために用いることができる。
特定の実施形態では、（宿主）哺乳動物細胞のゲノムへの単一デオキシリボ核酸の標的化組込みのための方法（すなわち、組換え哺乳動物細胞を産生するための方法）であって、タンパク質性化合物をコードする核酸をその後に含み、その後に前記タンパク質性化合物を産生する方法が提供され、その方法は、以下の工程：
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の規定された（任意に、単一の）部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え配列を含み、それにより、すべての組換え配列が異なるか、又は／及び適合しない（すなわち、これらは交差交換反応をもたらさない）、哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供される哺乳動物細胞に、２つの異なる組換え配列及び１～８つの発現カセットを含むデオキシリボ核酸を導入する工程であって、
前記デオキシリボ核酸は、５’から３’方向に（以下の順序で）、
－第１の組換え配列と、
－１～８個の発現カセットであって、そのうち１つの発現カセットが１つの第２の選択マーカーをコードする、発現カセットと、
－第２の組換え配列とを含み、
デオキシリボ核酸の第１及び第２の組換え配列が、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第２の組換え配列と一致している、デオキシリボ核酸を導入する工程；
ｃ）任意に、工程ｂ）で得られた前記哺乳動物細胞に、前記第１及び第２の組換え配列と機能的なリコンビナーゼを導入するか又は活性化する工程（第１及び第２の組換え配列の間の前記外因性ヌクレオチド配列の一部を第１及び第２の組換え配列の間の前記デオキシリボ核酸の一部と交換させ、それによって後者を前記哺乳動物細胞のゲノムに組み込ませる）；
ｄ）任意に、前記第２の選択マーカーを発現し、導入されたデオキシリボ核酸によってコードされるタンパク質性化合物を産生する細胞を選択する工程を含み、
それによって、タンパク質性化合物をコードする核酸を含む組換え哺乳動物細胞を産生し、前記タンパク質性化合物を産生する。
特定の実施形態では、（宿主）哺乳動物細胞のゲノムへの２つのデオキシリボ核酸の同時標的化組込みのための方法（すなわち、組換え哺乳動物細胞を産生するための方法）であって、タンパク質性化合物をコードする核酸を含み、前記タンパク質性化合物を任意に発現する方法が提供され、その方法は、以下の工程：
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の規定された（任意に、単一の）部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え配列と、第１及び第２の組換え配列の間に位置する第３の組換え配列とを含み、すべての組換え配列が異なるか、又は／及び適合しない（すなわち、これらは交差交換反応をもたらさない）、哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供される細胞に、３つの異なる組換え配列及び１～８個の発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸は、５’から３’方向に（以下の順序で）、
－第１の組換え配列と、
－１つ又は複数の（１つの好ましい実施形態では最大４つの）発現カセットと、
－１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分と、
－第３の組換え配列の第１のコピーとを含み、
及び
第２のデオキシリボ核酸は、５’から３’方向に（以下の順序で）、
－第３の組換え配列の第２のコピーと、
－１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分と、
－１つ又は複数の（１つの好ましい実施形態では最大４つの）発現カセットと、
－第２の組換え配列とを含み、
第１及び第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え配列が、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の第１～第３の組換え配列と一致しており、
１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分及び３’末端部分が、まとまると、１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；
ｃ）任意に、工程ｂ）で得られた前記哺乳動物細胞に、前記第１、第２及び第３の組換え配列と機能的なリコンビナーゼを導入するか又は活性化する工程（第１及び第３の間の前記外因性ヌクレオチド配列の一部並びに第３及び第２の組換え配列の間の一部を第１及び第３並びに第３及び第２の組換え配列の間の前記デオキシリボ核酸の一部と交換させ、それによって後者を前記哺乳動物細胞のゲノムに組み込ませる）；
ｄ）任意に、第２の選択マーカーを発現し、任意に、導入されたデオキシリボ核酸によってコードされるタンパク質性産物を産生する細胞を選択する工程を含み、
それにより、前記タンパク質性化合物をコードする核酸を含む組換え哺乳動物細胞を産生する。
選択圧を高めるために、第１の選択マーカーは、例えば、特定の実施形態では、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（５－ヨード－２’－フルオロ－２’－デオキシ－１－β－Ｄ－アラビノ－フロノシルウラシル（ＦＩＡＵ）又はガンシクロビルなどのチミジン類似体に対して細胞を感受性にする）又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ由来のジフテリア毒素断片Ａ（タンパク質合成を阻害することによって；例えば、ジフテリア毒素Ａ断片遺伝子のホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）駆動発現によって、毒性を引き起こす）などのネガティブ選択マーカーである。導入されたデオキシリボ核酸との交換中に、ネガティブ選択マーカーが除去される。これにより、正しい標的化組込みと正しくないランダム組込みとを区別することができる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、各発現カセットは、５’から３’方向に、プロモーター、オープンリーディングフレーム／コード配列又はＲＮＡ遺伝子、及びポリアデニル化シグナル配列、及び／又は、ターミネーター配列を含む。特定の実施形態では、オープンリーディングフレームはポリペプチドをコードし、発現カセットは、追加のターミネーター配列を含む又は含まないポリアデニル化シグナル配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットはＲＮＡ遺伝子を含み、プロモーターは２型Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列又はポリＵターミネーターが存在する。例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３２３（２００４）５７３－５７８を参照されたい。特定の実施形態では、発現カセットはＲＮＡ遺伝子を含み、プロモーターは２型Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター及びポリＵターミネーター配列である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、オープンリーディングフレームはポリペプチドをコードし、プロモーターはイントロンＡを含む又は含まないヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリＡシグナル配列であり、ターミネーターはｈＧＴ（ヒトガストリンターミネーター）である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、プロモーターはイントロンＡを有するヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネーターはｈＧＴであり、ＲＮＡ遺伝子の発現カセット及び選択マーカーの発現カセットを除き、選択マーカーについて、プロモーターはＳＶ４０プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネーターは存在せず、ＲＮＡ遺伝子について、プロモーターは野生型２型ポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり、ターミネーターはポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩターミネーターである。
これまでのすべての態様及び実施形態のうちの特定の実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号２８の配列を有する。特定の実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号２９の配列を有する。特定の実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号３０の配列を有する。
これまでのすべての態様及び実施形態のうちの特定の実施形態において、ｂＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３１である。
これまでのすべての態様及び実施形態のうちの特定の実施形態において、ＧＴは、配列番号３２の配列を有する。
これまでのすべての態様及び実施形態のうちの特定の実施形態において、ＳＶ４０プロモーターは、配列番号３３の配列を有する。
これまでのすべての態様及び実施形態のうちの特定の実施形態において、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３４である。
本発明は、アデノウイルス遺伝子機能Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂのための核酸配列と同時にＳＶ４０ラージＴ抗原又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）核抗原１（ＥＢＮＡ－１）のための核酸配列とを含む永久的ヒト細胞株を包含しないことを指摘しなければならない。
相同組換え
特定の実施形態において、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。
相同組換えによる標的化組込みは、当技術分野において確立された技術である。例えば、３０年超にわたって、相同組換えが、マウス胚性幹細胞において部位特異的様式で特異的な遺伝子改変を導入するために使用されてきた（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３０（１９８７）５７６－５７８；Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ ５１（１９８７）５０３－５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５６（１９８９）３１３－３２１；Ｚｉｊｌｓｔｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２（１９８９）４３５－４３８；Ｂｏｕａｂｅ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ，Ｋ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０６４（２０１３）３１５－３３６）。
標的化組込みのための相同組換えの使用の場合、組換え配列は、外因性核酸配列と相同な配列であり、「相同アーム」と呼ばれる。この場合、宿主細胞に導入されたデオキシリボ核酸は、第１の組換え配列として、外因性核酸配列（すなわち、ランディング部位）に対して配列５’（上流）に相同な配列を含み、第２の組換え配列として、外因性核酸配列に対して配列３’（下流）に相同な配列を含む。一般に、標的化組込み頻度は、相同アームの長さ及び等原性と共に増加する。理想的には、相同アームは、それぞれの宿主細胞から調製されたゲノムＤＮＡに由来する。
ヌクレアーゼ
特定の実施形態では、標的化組込みは、部位特異的ヌクレアーゼによって媒介される相同組換えによるものである。
特定の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）システムから選択される。
ヌクレアーゼコード遺伝子は、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、又はインビトロ転写ｍＲＮＡによって細胞に送達することができる。プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡのトランスフェクションは、エレクトロポレーション又はカチオン性脂質ベースの試薬によって行うことができる。インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターは、ヌクレアーゼをトランスフェクション耐性細胞型に送達するために使用することができる。ＡＡＶベクターをヌクレアーゼ送達に使用することもできる。
リコンビナーゼ
Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ又はＦｌｐ／ＦＲＴなどの組換えシステムは、異なる核酸分子間の部分核酸配列の交換、核酸分子からの核酸断片の切除、又は核酸分子内の部分の反転に使用することができる。リコンビナーゼの作用の結果は、単一のオン／オフ事象を使用して永続的であり得、規定されているが限定された期間であり得、規定された特定の細胞型又は組織に調整され得る。
Ｆｌｐリコンビナーゼ
Ｆｌｐ／ＦＲＴ部位特異的組換えシステムは、リコンビナーゼフリッパーゼ（Ｆｌｐ）による、フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位間の配列の組換えを含む。フリッパーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する。Ｆｌｐの配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３８７０から入手可能である。３４ｂｐのＦＲＴ部位は、ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣｔｃｔａｇａａａＧＡＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ（配列番号３６；小文字は中央スペーサ配列）の配列を有し、Ｆｌｐリコンビナーゼは、８ｂｐの中央スペーサー配列に隣接するＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ（フォワード配列番号３７；逆配列番号３８）の逆位１３ｂｐリピートに結合する。
例示的なＦＲＴ部位を以下の表に示す（Ｂｒａｎｄａ ａｎｄ Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ６（２００４）７－２８を参照のこと）：
Figure 2023546113000003
Ｃｒｅリコンビナーゼ
Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ部位特異的組換えシステムは、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介することができる。カノニカルＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐ逆方向反復に隣接する８ｂｐ非パリンドローム性スペーサー配列から構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのスペーサー配列内での組換えを媒介する。Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ媒介組換えは、高い効率で起こり、他の宿主因子を必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ配向に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた環として切り取るであろう。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で互いに逆方向／逆向きに配置される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを反転させる。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列の組込みが生じる。
Ｃｒｅリコンビナーゼは、任意の公知の方法で細胞内に導入するか又は細胞内で活性化することができる。例えば、リポソームベースの遺伝子送達（国際公開第９３／２４６４０号；Ｍａｎｎｉｎｏ ａｎｄ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（１９８８）６８２－６９１；米国特許第５，２７９，８３３号；国際公開第９１／０６３０９号；Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（９８７１）７４１３－７４１４）、又はウイルスベクター、例えばパピローマウイルス、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２（１９９５）９５－１０４；Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１（１９９４）３６７－３８４；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９（１９９５）２９７－３０６；Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（１９９２）２７３１－２７３９；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（１９９２）１６３５－１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６（１９９０）５８－５９；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９）２３７４－２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５（１９９１）２２２０－２２２４；国際公開第９４／２６８７７号；Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｐａｕｌ（ｅｄ．）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）及びその中の参考文献；Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０（１９８７）３８－４７；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１号；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５（１９９４）７９３－８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４（１９９４）１３５１；米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１９８５）３２５１－３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４（１９８４）２０７２－２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６４６６－６４７０；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９）３８２２－３８２８）を使用する。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する血清型２の組換えＡＡＶベクターは、Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７（２０１２）ｅ５００６３）及びＳｃａｍｍｅｌｌ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（２００３）５７６２－５７７０）によって記載されている。このｒＡＡＶ－Ｃｒｅを使用して、標的ＬｏｘＰ部位の非常に完全な組換えを誘導することができた。ｒＡＡＶベクターに基づく送達については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（１９９２）９７－１２９；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９１／１８０８８号；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３（１９９３）７４－８０も参照のこと。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現プラスミドを使用することができる。
例えば、ｍＲＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼを使用することができる。
多数の機能的ＬｏｘＰ部位、例えば、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ６６、Ｌｏｘ１１、Ｌｏｘ７６、Ｌｏｘ７５、Ｌｏｘ４３、Ｌｏｘ４４が知られている（例えば、Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９８６）２２８７－２３００；Ａｌｂｅｒｔ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．７（１９９５）６４９－６５９を参照のこと）。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼが使用される場合、交換される配列は、ゲノム中及びドナー核酸中の２つのＬｏｘＰ部位の位置によって定義される。これらのＬｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される。それ以上は必要なく、すなわちＡＴＰなどは不要である。
Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムは、哺乳動物、植物、細菌、酵母等、様々な種類の細胞で機能する。
リコンビナーゼを使用した標的化組込み
特定の実施形態では、標的化組込みは、リコンビナーゼ媒介カセット交換反応（ＲＭＣＥ）によるものである。
ＲＭＣＥは、ゲノム中の組込み部位の配列がドナー核酸と交換される酵素プロセスである。Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１－インテグラーゼ、ｐＳＲ１－リコンビナーゼ、又はφＣ３１インテグラーゼなどの任意のリコンビナーゼをこのプロセスに使用することができる。
１つの具体的なＴＩ法は、二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（二重ＲＭＣＥ）である。
二重ＲＭＣＥは、目的のタンパク質性化合物をコードするデオキシリボ核酸を含む組換え哺乳動物細胞を、単一遺伝子座での宿主細胞のゲノムへの２つの核酸配列のリコンビナーゼ媒介導入によって産生する方法である。組込み後、２つの核酸配列は互いに作動可能に連結される。
例えば、限定するものではないが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列、すなわちＴＩランディング部位は、２つの組換え認識部位（ＲＲＳ）を含むことができ、（ドナー）核酸配列は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。そのような単一プラスミドＲＭＣＥ戦略は、ＲＲＳの対の間のそれぞれの配列に適切な数の発現カセットを組み込むことによって、複数のオープンリーディングフレームの導入を可能にする。
例えば、限定するものではないが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列、すなわちＴＩランディング部位は、３つの組換え認識部位（ＲＲＳ）、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する並びを含むことができ、第１の（ドナー）核酸は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２の（ドナー）核酸は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。そのような二重ＲＭＣＥ戦略は、ＲＲＳの各対の間のそれぞれの配列に適切な数の発現カセットを組み込むことによって、複数の遺伝子の導入を可能にする。
さらに、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーも必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割される。第１の（フロント）核酸は、プロモーター、続いて翻訳開始コドン及びＲＲＳ３配列を含み得る。第２の（バック）核酸は、対応して、選択マーカーコード配列のＮ末端に融合したＲＲＳ ３配列から翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を差し引いたものを含む。融合遺伝子からのインフレーム翻訳、すなわち動作可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカーコード配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方の核酸（フロント及びバック）が正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。
単一ＲＭＣＥと二重ＲＭＣＥのどちらも、ドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡ配列と組込み部位が存在する哺乳動物細胞ゲノム中のＤＮＡ配列とを正確に交換することにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に１つ又は複数のドナーＤＮＡ分子を組み込むことを可能にする。これらのＤＮＡ配列は、ｉ）少なくとも１つの選択マーカー、若しくは特定の２プラスミドＲＭＣＥの場合のような「分割された選択マーカー」、及び／又はｉｉ）少なくとも１つの目的の外因性遺伝子、に隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを特徴とする。
ＲＭＣＥは、標的ゲノム遺伝子座内の２つのヘテロ特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子との間のリコンビナーゼによって触媒される二重組換え交差事象を伴う。二重ＲＭＣＥは、フロント核酸及びバック核酸からのＤＮＡ配列のコピーを組み合わせて哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返すことができる。
特定の実施形態において、標的化組込みは、二重ＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、目的のタンパク質性化合物の一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、標的化組込みは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数の核酸に由来するＤＮＡ配列がすべて、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、目的のタンパク質性化合物の一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、一部が第１の核酸（フロント）においてコードされ、一部が第２の核酸（バック）においてコードされてよく、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方の核酸が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。
単一ＲＭＣＥ及び二重ＲＭＣＥの場合、レシピエント／標的細胞のゲノムへのドナー核酸の標的化組込みのための方法、並びに上記で概説したレシピエント／標的細胞のゲノムへの２つのドナー核酸の同時標的化組込みのための方法は、リコンビナーゼを導入／活性化する追加の工程を含む。
したがって、特定の実施形態では、組換え配列は組換え認識配列であり、本方法は、以下の工程：
ｃ）
ｉ）ｂ）のデオキシリボ核酸の導入と同時に；又は
ｉｉ）その後に逐次的に、
リコンビナーゼを導入又は活性化する工程であって、
リコンビナーゼは、第１及び第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する（かつ、任意に、１つ又は複数のリコンビナーゼは、リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、工程をさらに含む。
特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、Ｌ３配列、２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｆ３配列、Ｆ５配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｆｌｐリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ｐＳＲ１リコンビナーゼによって認識され得る。
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。
ＲＲＳがＦＲＴ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＦｌｐリコンビナーゼを必要とする。
ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位又はＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である特定の実施形態では、細胞は、組換えを行うためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。
ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ部位又はφＣ３１ａｔｔＢ部位である特定の実施形態では、細胞は、組換えを行うためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。
特定の実施形態では、ＲＲＳがＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉのｐＳＲ１－リコンビナーゼの認識部位である場合、細胞は、組換えを行うためにｐＳＲ１－リコンビナーゼを必要とする。
リコンビナーゼコード遺伝子は、ＤＮＡとして、ウイルスベクターによって、又はｍＲＮＡとして細胞に送達され得る。ＤＮＡ又はｍＲＮＡのトランスフェクションは、エレクトロポレーション又はカチオン性脂質ベースの試薬によって行うことができる。インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターは、リコンビナーゼをトランスフェクション耐性細胞型に送達するために使用することができる。ＡＡＶベクターをリコンビナーゼ送達に使用することもできる。リコンビナーゼタンパク質は、非ベシクルによって導入することもできる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、リコンビナーゼは、ｍＲＮＡとして細胞に導入される。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、リコンビナーゼは、ＤＮＡとして宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、ＤＮＡは、発現カセットに含まれるリコンビナーゼをコードする配列である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼであり、Ｃｒｅリコンビナーゼは、配列番号０７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼとして細胞に導入される。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡは、配列番号０７のアミノ酸配列を含み、そのＮ末端若しくはＣ末端又は両方に核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡは、配列番号０７のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端若しくはＣ末端に、又は両方に、互いに独立して、１～５つの核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ｍＲＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼは、配列番号０８のヌクレオチド配列又は異なるコドン使用頻度を有するそのバリアントを含む。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ｍＲＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼは、配列番号０８のヌクレオチド配列又は異なるコドン使用頻度を有するそのバリアントを含み、その５’末端若しくは３’末端又は両方に、核局在化配列をコードするさらなる核酸をさらに含む。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ｍＲＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼは、配列番号０８のヌクレオチド配列又は異なるコドン使用頻度を有するそのバリアントを含み、その５’末端若しくは３’末端又は両方に、互いに独立して、核局在化配列をコードする１～５個の核酸をさらに含む。
特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、変異体ＬｏｘＰ配列である。変異体ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介組み込み又は置換の効率を高めるために開発された。特定の実施形態では、変異体ＬｏｘＰ配列は、Ｌ３配列、２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、及びＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列は、左の１３ｂｐ反復中で５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列は、右の１３ｂｐ反復中で５ｂｐが変異している。野生型ＬｏｘＰ配列及び変異体ＬｏｘＰ配列の両方は、Ｃｒｅリコンビナーゼ依存性組換えを媒介することができる。
「一致するＲＲＳ」という用語は、２つの一致するＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態において、２つの一致するＲＲＳは、同じである。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異体ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、２つの一致ＲＲＳは、互いに異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、第１の一致するＲＲＳはＬｏｘ７１配列であり、第２の一致ＲＲＳはＬｏｘ６６配列である。特定の実施形態において、第１の一致するＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、第１の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
すべての態様及び実施形態のある特定の実施形態において、二重ＲＭＣＥ中の組換え認識部位は、Ｌ３、２Ｌ及びＬｏｘＦａｓである。特定の実施形態において、Ｌ３は、スペーサー配列として配列番号１７の配列を含み、２Ｌは、スペーサー配列として配列番号１８の配列を含み、ＬｏｘＦａｓは、スペーサー配列として配列番号１９の配列を有する配列を含む。特定の実施形態において、第１の組換え認識部位はＬ３であり、第２の組換え認識部位は２Ｌであり、第３の組換え認識部位はＬｏｘＦａｓである。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識部位に対して部分的に５’及び部分的に３’に位置しており、前記発現カセットの、５’に位置する部分は、プロモーター及び翻訳開始コドンを含み、前記発現カセットの、３’に位置する部分は、翻訳開始コドンのないコード配列及びポリＡシグナル配列を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットの、５’に位置する部分は、翻訳開始コドンに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、これにより、プロモーター配列は、上流でそれぞれ第２、第３又は第４の発現カセットに隣接し（すなわち、第２、第３又は第４の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流で第３の組換え認識配列に隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）、かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの３’に位置する部分は、翻訳開始コドンを欠く選択マーカーをコードする核酸を含み、上流で第３の組換え認識配列に隣接し、下流でポリＡシグナル配列に隣接し、その後、それぞれ第３、第４又は第５の発現カセットに隣接している。
本明細書に記載の外因性核酸（「ランディング部位」）を含む、標的化組込みに適した任意の公知又は今後得られる哺乳動物細胞を、本発明において使用することができる。
すべての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、ハムスター細胞又はヒト細胞であり、特定の実施形態ではＣＨＯ細胞である。
本発明において使用するために適している、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む例示的哺乳動物細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼの媒介カセット交換のための３つの異種特異的ＬｏｘＰ部位を含むランディング部位（＝哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列）を内部に持つ、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞又はＰｅｒ．Ｃ６細胞である。これらの異種特異的ＬｏｘＰ部位は、特定の実施形態において、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、及び２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８～９０８；Ｗｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照されたい）、その際、Ｌ３及び２Ｌはランディング部位の５’末端及び３’末端にそれぞれ隣接しており、又は逆も同様であり、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ランディング部位は、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化すること並びにトランスフェクション及びＣｒｅリコンビナーゼ媒介組換え後に該部位が存在しないものを選択すること（ネガティブ選択）を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。例示的なＧＦＰは、配列番号３５の配列を有する。
前の段落で概説したようなランディング部位のそのような構成は、異なるプラスミドに含まれる２つの核酸、Ｌ３及びＬｏｘＦａｓ部位を有するいわゆるフロント核酸、並びにＬｏｘＦａｓ及び２Ｌ部位を有するバック核酸の同時インテグレーションを可能にする。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方の核酸間に分配されている：プロモーター及び翻訳開始コドンはフロント核酸上に位置しているのに対し、コード化領域及びポリＡシグナルはバック核酸上に位置している。両方の前記核酸の正しいＣｒｅリコンビナーゼ媒介性インテグレーションのみが、それぞれの選択剤に対する耐性を誘導する。
一般に、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、そのゲノムの遺伝子座内に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞であり、その外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え認識部位と、第１及び第２の組換え認識部位の間に位置する第３の組換え認識部位とを含み、すべての組換え認識部位は異なる。前記外因性ヌクレオチド配列は、「ランディング部位」と呼ばれる。
本発明で開示される主題では、外因性ヌクレオチド配列のＴＩに適した哺乳動物細胞を使用する。特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の組込み部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む。ＴＩに適したこのような哺乳動物細胞は、「ＴＩ宿主細胞」と表記することもできる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、ランディング部位を含む、ハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、又はマウス細胞である。特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、それぞれのランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｓ細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、ヒト細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰｅｒ．Ｃ６細胞である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、該外因性ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の組換え認識部位（ＲＲＳ）を含む。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、又はφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ部位、Ｌ３部位、２Ｌ部位、ＬｏｘＦａｓ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＦＲＴ部位、Ｆ３部位、Ｆ５部位、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位、φＣ３１ ａｔｔＰ部位、及びφＣ３１ ａｔｔＢ部位からなる群から選択され得る。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、選択マーカーは、互いに独立に、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ６、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される蛍光性タンパク質であってもよい。
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、形質導入、エレクトロポレーション法、又は形質転換法などによって前記細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の多くの組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の組込み部位に組み込まれる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識部位（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳとも第２のＲＲＳとも異なる。特定の実施形態において、３つのＲＲＳすべてが異なる。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ部位、Ｌ３部位、２Ｌ部位、ＬｏｘＦａｓ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＦＲＴ部位、Ｆ３部位、Ｆ５部位、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位、φＣ３１ ａｔｔＰ部位、及びφＣ３１ ａｔｔＢ部位からなる群から互いに独立して選択され得る。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、及び第３のＲＲＳ、並びに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’（下流）に位置している。特定の実施形態において、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’末端の隣に存在し、かつ第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端の隣に存在する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、選択マーカーは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置しており、かつこれら２つの隣接するＲＲＳは互いに異なる。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳはＬ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは２Ｌ配列である。特定の実施形態では、Ｌ３配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）は、選択マーカーの５’側に位置しており、２Ｌ配列は、選択マーカーの３’側に位置している。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、第１の隣接するＲＲＳは、野生型逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、１つの変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列である。ある特定の実施形態において、第１の隣接するＲＲＳは、第１の変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、第１の変異した逆方向反復と同じ又は異なる第２の変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、第１の隣接するＲＲＳは、野生型逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列であり、第３のＲＲＳは、１つの変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、第２の隣接するＲＲＳは、野生型逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列であり、第３のＲＲＳは、１つの変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、第１の隣接するＲＲＳは、第１の変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列であり、第３のＲＲＳは、第２の変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列である。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、第２の隣接するＲＲＳは、第１の変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列であり、第３のＲＲＳは、第２の変異した逆方向反復を有するＬｏｘＰ配列である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、第１の変異体ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、第２の変異体ＦＲＴ配列である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施態様では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳが隣接する、第１の選択マーカー及び第２の選択マーカーを含み、第１の選択マーカーは第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態において、２つの選択マーカーのどちらも、相互に独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態において、第１の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ蛍光性タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態において、第１の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰ蛍光性タンパク質である。特定の実施形態において、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは、互いに異なる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。
ドナーデオキシリボ核酸の導入に使用される方法とは無関係に、導入された第２の選択マーカーに基づいて、首尾よくトランスフェクトされた細胞を選択することができる。
本発明によるＤＮＡエレメント、ＤＮＡ分子又はＶＡ ＲＮＡ遺伝子がリコンビナーゼ媒介カセット交換反応と組み合わせて使用される場合、ＲＭＣＥ及びＲＭＣＩには異なるリコンビナーゼが使用されることを指摘しなければならない。
例えば、本発明によるＤＮＡエレメント、ＤＮＡ分子又はＶＡ ＲＮＡにおいて、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムはリコンビナーゼ媒介カセット交換反応（ＲＭＣＥ）に使用され、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステムはリコンビナーゼ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）に使用される。同様に、本発明によるＤＮＡエレメント、ＤＮＡ分子又はＶＡ ＲＮＡにおいて、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステムはリコンビナーゼ媒介カセット交換反応（ＲＭＣＥ）に使用され、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムはリコンビナーゼ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）に使用される。
アデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶ及びアデノウイルス又はヘルペスウイルスのヘルパー機能の一般的な総説については、Ｂｅｒｎｓ ａｎｄ Ｂｏｈｅｎｓｋｙ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．，３２（１９８７）２４３－３０６を参照されたい。ＡＡＶのゲノムは、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５（１９８３）５５５－５６４を記載されている。米国特許第４，７９７，３６８号には、組換えＡＡＶベクターを構築するための設計上の考慮事項が記載されている（国際公開第９３／２４６４１号も参照）。ＡＡＶベクターを記載するさらなる参考文献は、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１６０（１９８７）３８－４７；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９４）７９３－８０１；及びＭｕｚｙｃｚｋａ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４（１９９４）１３５１である。米国特許第５，１７３，４１４号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１９８８）３９８８－３９９６；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１９８５）３２５１－３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４（１９９４）２０７２－２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６４６６－６４７０；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９）３８２２－３８２８に記載されている組換えＡＡＶベクターの構築。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスである。それは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及び場合によってはワクシニアなどのポックスウイルスなどの共感染ヘルパーウイルスによって特定のウイルス機能が提供される細胞においてのみ複製することができる。それにもかかわらず、ＡＡＶは、適切なヘルパーウイルス機能が存在するならば、ヒト、サル又はげっ歯類起源の実質的に任意の細胞株において複製することができる。
ヘルパーウイルス遺伝子が存在しない場合、ＡＡＶはその宿主細胞において潜伏期間を確立する。そのゲノムは、アデノ随伴ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）と呼ばれる、１９番染色体の特定の部位［（Ｃｈｒ）１９（ｑ１３．４）］に組み込まれる。ＡＡＶ－２などの特定の血清型については、例えばＡＡＶＳ２と呼ばれる５番染色体［（Ｃｈｒ）５（ｐ１３．３）］上及びＡＡＶＳ３と呼ばれる３番染色体［（Ｃｈｒ）３（ｐ２４．３）］上などの他の組込み部位が見出されている。
ＡＡＶは異なる血清型に分類される。これらは、赤血球凝集、腫瘍形成性及びＤＮＡ配列相同性などのパラメータに基づいて割り当てられている。これまでに、ＡＡＶの異なるクレードに対応する１０を超える異なる血清型及び１００を超える配列が同定されている。
キャプシドタンパク質のタイプ及び対称性は、それぞれのＡＡＶの組織向性を決定する。例えば、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４及びＡＡＶ－５は網膜に特異的であり、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９及びＡＡＶｒｈ－１０は脳に特異的であり、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－８及びＡＡＶ－９は心臓組織に特異的であり、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９及びＡＡＶ－１０は肝臓に特異的であり、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５及びＡＡＶ－９は肺に特異的である。
シュードタイピングは、様々な血清型間のＡＡＶゲノムの交差パッケージングを含むプロセスを示し、すなわちゲノムは異なる起源のキャプシドタンパク質でパッケージングされる。
野生型ＡＡＶゲノムは約４．７ｋｂのサイズを有する。ＡＡＶゲノムは、複数のオープンリーディングフレームを含む、ｒｅｐ及びｃａｐと呼ばれる２つの重複遺伝子をさらに含む（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．，４５（１９８３）５５５－５６４；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．５１（１９８４）３２９－３３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５１（１９８４）６１１－６１９を参照のこと）。オープンリーディングフレームをコードするＲｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０と呼ばれる異なるサイズの４つのタンパク質を提供する。これらは、ＡＡＶの複製、レスキュー及び組込みに関与する。オープンリーディングフレームをコードするＣａｐタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＡＡＰと呼ばれる４つのタンパク質を提供する。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＡＡＶ粒子のタンパク質性キャプシドの一部である。組み合わされたｒｅｐ及びｃａｐのオープンリーディングフレームは、いわゆる逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってそれらの５’末端及び３’末端に隣接している。複製のために、ＡＡＶは、Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質に加えて、アデノウイルスの遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２Ａ及びＶＡの産物又は別のヘルパーウイルスの対応する因子を必要とする。
例えば、血清型２（ＡＡＶ－２）のＡＡＶの場合、ＩＴＲはそれぞれ１４５ヌクレオチドの長さを有し、約４４７０ヌクレオチドのコード配列領域に隣接する。ＩＴＲの１４５ヌクレオチドのうち、１２５ヌクレオチドは回文配列を有し、Ｔ字型ヘアピン構造を形成することができる。この構造は、ウイルス複製中にプライマーの機能を有する。残りの２０個の対になっていないヌクレオチドは、Ｄ配列として示される。
ＡＡＶゲノムは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の発現のための３つの転写プロモーターＰ５、Ｐ１９、及びＰ４０を有する（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６（１９７９）５５６７－５５７１）。
ＩＴＲ配列は、コード領域に対してシスに存在しなければならない。ＩＴＲは、機能的複製起点（ｏｒｉ）、標的細胞のゲノムへの組込みに必要なシグナル、及び宿主細胞染色体又は組換えプラスミドからの効率的な切除及びレスキューを提供する。ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質結合部位（ＲＢＳ）及び末端解離部位（ＴＲＳ）などの複製起点様エレメントをさらに含む。ＩＴＲ自体が、ＡＡＶベクターにおける転写プロモーターの機能を有し得ることが見出されている（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１９９３）３７８１－３７９０；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１９９３）１０１６３－１０１６７）。
ウイルス一本鎖ＤＮＡゲノムの複製及びキャプシド形成にはそれぞれ、ｒｅｐ遺伝子産物及びｃａｐ遺伝子産物のトランス編成が必要である。
ｒｅｐ遺伝子座は、Ｐ５及びＰ１９と呼ばれる２つの内部プロモーターを含む。それは、４つのタンパク質に対するオープンリーディングフレームを含む。プロモーターＰ５は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８（細胞周期を停止させるためのクロマチンニッカーゼ）をコードする非スプライシング型４．２ｋｂ ｍＲＮＡ、及びＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ６８（部位特異的エンドヌクレアーゼ）をコードするスプライシング型３．９ｋｂ ｍＲＮＡを提供する核酸配列に作動可能に連結されている。プロモーターＰ１９は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２をコードする非スプライシング型ｍＲＮＡ及びＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ４０（蓄積及びパッケージングのためのＤＮＡヘリカーゼ）をコードするスプライシング型３．３ｋｂ ｍＲＮＡを提供する核酸配列に作動可能に連結されている。
２つの大きな方のＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ＡＡＶ二重鎖ＤＮＡ複製に必須であるが、小さな方のＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０は、子孫の一本鎖ＤＮＡ蓄積に必須であるようである（Ｃｈｅｊａｎｏｖｓｋｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７３（１９８９）１２０－１２８）。
大きな方のＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ７８は、ＡＡＶ ＩＴＲのヘアピン配座に特異的に結合することができる。それらは、ＡＡＶ末端での複製を分解するために必要とされる所定の酵素活性を示す。Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８の発現は、感染性粒子形成に十分であり得る（Ｈｏｌｓｃｈｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（１９９４）７１６９－７１７７及び６９（１９９５）６８８０－６８８５）。
すべてのＲｅｐタンパク質、主にＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ＡＡＶ遺伝子の誘導及び抑制並びに細胞増殖に対する阻害効果などの調節活性を示すと考えられる（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６（１９８６）２８８４－２８９４；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７（１９８７）１３２０－１３２５；Ｋｈｌｅｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１（１９９１）７３８－７４１）。
Ｒｅｐ７８の組換え過剰発現は、ＤＮＡ損傷の誘導に起因する細胞増殖の減少を伴う表現型をもたらす。これにより、宿主細胞がＳ期で停止し、それにより、ウイルスによる潜伏感染が促進される（Ｂｅｒｔｈｅｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１３６３４－１３６３９）。
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎらは、Ｐ５プロモーターがＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８によって負に自己調節されることを報告した（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６（１９８６）２８８４－２８９４）。Ｒｅｐタンパク質の発現の毒性効果のために、ＡＡＶの安定した組込み後の特定の細胞株については、非常に低い発現しか報告されていない（例えば、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１６６（１９８８）１５４－１６５を参照のこと）。
ｃａｐ遺伝子座は、Ｐ４０と呼ばれる１つのプロモーターを含む。プロモーターＰ４０は、選択的スプライシング及び選択的開始コドンの使用によって、Ｃａｐタンパク質ＶＰ１（８７ｋＤａ、非スプライシング型ｍＲＮＡ転写物）、ＶＰ２（スプライシングされたｍＲＮＡ転写物由来の７２ｋＤａ）及びＶＰ３（選択的開始コドンからの６１ｋＤａ）をコードする２．６ｋｂ ｍＲＮＡを提供する核酸配列に作動可能に連結されている。ＶＰ１～ＶＰ３はウイルスキャプシドの構成要素を構成する。キャプシドは、細胞表面受容体に結合し、ウイルスの細胞内輸送を可能にする機能を有する。ＶＰ３は、全ウイルス粒子タンパク質の約９０％を占める。それにもかかわらず、３つのタンパク質はすべて、効果的なキャプシド産生に必須である。
３つすべてのキャプシドタンパク質ＶＰ１～ＶＰ３の不活性化が一本鎖子孫ＡＡＶ ＤＮＡの蓄積を妨げることが報告されている。ＶＰ１アミノ末端における変異（「脂質ネガティブ」又は「Ｉｎｆネガティブ」）は、依然として、一本鎖ＤＮＡのウイルス粒子への集合を可能にし、それにより、感染力価が大幅に低下する。
ＡＡＰオープンリーディングフレームは、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードしている。これは約２２ｋＤａのサイズを有し、キャプシドのアセンブリのために天然ＶＰタンパク質を核小体領域に輸送する。このオープンリーディングフレームは、ＶＰ３タンパク質コード配列の上流に位置する。
個々のＡＡＶ粒子には、１本鎖ＤＮＡ分子のみが含まれる。これは、「プラス」鎖又は「マイナス」鎖のいずれかであり得る。ＤＮＡ分子を含有するＡＡＶウイルス粒子は感染性である。感染細胞の内部で、親の感染一本鎖は二本鎖に変換され、その後増幅される。増幅は、二本鎖ＤＮＡ分子の大きなプールをもたらし、そこから一本鎖が置換され、キャプシドにパッケージングされる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、***細胞並びに静止細胞に形質導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて標的細胞に導入された導入遺伝子は、長期間発現すると考えられる。ＡＡＶベクターを使用することの１つの欠点は、細胞に導入することができる導入遺伝子のサイズの制限である。
Ｃａｒｔｅｒらは、ｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレーム全体を削除し、導入遺伝子で置き換えることができることを示した（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」，ｅｄ．ｂｙ Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５－１６８（１９９０））。さらに、ＩＴＲは、標的細胞のゲノムへの導入遺伝子の複製、レスキュー、パッケージング、及び組込みの機能を保持するために維持されなければならないことが報告されている。
それぞれのウイルスヘルパー遺伝子を含む細胞がＡＡＶベクターによって形質導入される場合、又はその逆の場合、組み込まれたＡＡＶプロウイルスを含む細胞が適切なヘルパーウイルスによって形質導入される場合、ＡＡＶプロウイルスは活性化され、再び溶菌感染サイクルに入る（Ｃｌａｒｋ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１３２９－１３４１；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３（１９９３）７４－８０）。
Ｅ１Ａは、アデノウイルスＤＮＡが細胞核に入った後に発現される最初のウイルスヘルパー遺伝子である。Ｅ１Ａ遺伝子は、選択的スプライシングによる同じＥ１Ａ ｍＲＮＡに基づく１２Ｓ及び１３Ｓタンパク質をコードする。１２Ｓ及び１３Ｓタンパク質の発現は、他のウイルス機能Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４の活性化をもたらす。さらに、１２Ｓ及び１３Ｓタンパク質の発現は、細胞を細胞周期のＳ期に押しやる。Ｅ１Ａ由来タンパク質のみが発現される場合、細胞は死滅（ｄｙｅ）する（アポトーシス）。
Ｅ１Ｂは、発現される第２のウイルスヘルパー遺伝子である。これは、Ｅ１Ａ由来タンパク質１２Ｓ及び１３Ｓによって活性化される。Ｅ１Ｂ遺伝子由来ｍＲＮＡは、２つの異なる方法でスプライシングされ得、第１の５５ｋＤａ転写物及び第２の１９ｋＤａ転写物をもたらす。Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａタンパク質は、細胞周期の調節、感染の後期段階における細胞ｍＲＮＡの輸送の防止、及びＥ１Ａ誘導性アポトーシスの防止に関与する。Ｅ１Ｂ １９ｋＤａタンパク質は、細胞のＥ１Ａ誘導性アポトーシスの防止に関与する。
Ｅ２遺伝子は、異なるタンパク質をコードする。Ｅ２Ａ転写物は、ＡＡＶ複製に必須である一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）をコードする。
また、Ｅ４遺伝子はいくつかのタンパク質をコードする。Ｅ４遺伝子由来３４ｋＤａタンパク質（Ｅ４ｏｒｆ６）は、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａタンパク質と共に細胞質への細胞ｍＲＮＡの蓄積を防止するが、細胞核から細胞質へのウイルスＲＮＡの輸送も促進する。
一般に、組換えＡＡＶ粒子を産生するために、異なる相補性プラスミドを宿主細胞に同時トランスフェクトする。プラスミドの１つは、２つのシス作用ＡＡＶ ＩＴＲの間に挟まれた導入遺伝子を含む。子孫組換えゲノムの複製及びその後のパッケージングに必要な欠損ＡＡＶエレメント、すなわちＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質のオープンリーディングフレームは、第２のプラスミド上にトランスで含有される。Ｒｅｐタンパク質の過剰発現は、細胞増殖に対する阻害効果をもたらす（Ｌｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１９９７）５２３６－５２４３）。さらに、ヘルパーウイルスの遺伝子、すなわちアデノウイルス由来のＥ１、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２Ａ及びＶＡを含む第３のプラスミドがＡＡＶ複製に必要である。
必要なプラスミドの数を減らすために、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及びアデノウイルスヘルパー遺伝子を単一のプラスミド上で組み合わせてもよい。
あるいは、宿主細胞は、Ｅ１遺伝子産物を既に安定に発現していてもよい。このような細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。２９３として示されるヒト胚性腎臓クローンは、アデノウイルスＤＮＡをヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）に組み込むことによって１９７７年に作製された（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４）。ＨＥＫ２９３細胞株は、アデノウイルス血清型５ゲノムの塩基対１～４３４４を含む。これは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子並びにアデノウイルスパッケージングシグナル（Ｌｏｕｉｓ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３３（１９９７）４２３－４２９）を包含する。
ＨＥＫ２９３細胞を使用する場合、欠けているＥ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＶＡ遺伝子は、アデノウイルスとの同時感染によって、又はＥ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＶＡ発現プラスミドとの同時トランスフェクションによって導入することができる（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９）３８２２－３８２８；Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１９９７）６８１６－６８２２；Ｔａｍａｙｏｓｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１９９６）５０７－５１３；Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２（１９９５）２９－３７；Ｃｏｎｗａｙ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１９９７）８７８０－８７８９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５３１－１５４１；Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｆ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）３２２７－３２３４；Ｓａｌｖｅｔｔｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８）６９５－７０６；Ｘｉａｏ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１９９８）２２２４－２２３２；Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８）２７４５－２７６０；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（１９９９）２５２７－２５３７を参照のこと）。あるいは、アデノウイルス／ＡＡＶ又は単純ヘルペスウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターを使用することができる（例えば、Ｃｏｎｗａｙ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１９９７）８７８０－８７８９；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１９９７）３５９－３７０；Ｔｈｒａｓｈｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２（１９９５）４８１－４８５；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１９９６）２０７９－２０８７；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１９９７）３５９－３７０を参照のこと）。
したがって、ｒｅｐ遺伝子が組み込まれて発現される細胞株は、ゆっくりと増殖するか、Ｒｅｐタンパク質を非常に低いレベルで発現する傾向がある。
大きな安全性の問題は、複製能アデノウイルス（ＲＣＡ）によるｒＡＡＶ粒子調製物の汚染である。ＲＣＡは、宿主細胞に組み込まれたベクターゲノム及びアデノウイルスＤＮＡが相同組換えによってウイルス複製中に組み換わると産生される（Ｌｏｃｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９４）１４８５－１４９１；Ｈｅｈｉｒ Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）８４５９－８４６７）。したがって、ＨＥＫ２９３細胞は、医薬用途のためのアデノウイルスベクターを産生するのに適していない。
導入遺伝子活性を特定の組織に制限するために、すなわち、組込み部位を制限するために、導入遺伝子は、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る（例えば、Ｙａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１２０３－１２１３を参照のこと）。
今日まで、ｒＡＡＶ粒子の産生における主な困難は、ｒＡＡＶベクターの非効率的なパッケージングであり、低力価をもたらす。パッケージングは、以下を含むいくつかの理由で困難であった。
－野生型ＡＡＶゲノムが存在する場合、それらの好ましいキャプシド形成；
－ｒｅｐ遺伝子産物に関連する阻害効果のために、野生型ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子によって提供されるような十分な補完機能を生成することが困難であること；
－プラスミド構築物の同時トランスフェクションの限定された効率。
これらの問題はすべて、Ｒｅｐタンパク質の生物学的特性に基づいている。特に、Ｒｅｐタンパク質の阻害（細胞増殖抑制性及び細胞傷害性）特性、並びに培養細胞の不死化表現型を逆転させる能力は問題がある。さらに、Ｒｅｐタンパク質は、広く使用されているＡＡＶ Ｐ５プロモーターが使用される場合、それら自体の発現を下方制御する（例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６（１９８６）２８８４－２８９４を参照のこと）。
本発明による例示的な化合物及び組成物
本明細書では、新規ＤＮＡ構築物及びそれを使用する方法が報告される。本発明による新規ＤＮＡ構築物は、部位特異的リコンビナーゼ技術を使用した少なくとも２つのオープンリーディングフレームの同時転写活性化に有用である。本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子のコード鎖及び鋳型鎖上のプロモーター及びオープンリーディングフレームの意図的な非生産的配置を使用し、これらは部位特異的リコンビナーゼによる反転によってそれらの生産的な形態に変換される。
本発明の技術的概念の根底にある原理は、ＤＮＡ逆位とプロモーターへの作動可能な連結との組み合わせによる遺伝子発現活性化である。
本発明の１つの独立した態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む二本鎖ＤＮＡエレメントであって、
コード鎖が、正の配向で（すなわち、５’から３’方向に）、
－正の配向の、第１のプロモーター、
－正の配向の、逆方向反復の１つに変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－負の配向の、第２のプロモーター（すなわち、コード鎖に対して負の配向）、
－負の配向の、第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメント（すなわち、コード鎖の５’から３’方向に対して反転している）、
－負の配向にあり、任意に、第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメントに作動可能に連結された、第１のオープンリーディングフレーム（すなわち、コード鎖の５’から３’方向に対して反転している）、
－第１のリコンビナーゼ認識配列以外のそれぞれの他の逆方向反復に変異を含み、負の配向にある第２のリコンビナーゼ認識配列（すなわち、第１リコンビナーゼ認識配列に対して相反の向きであり、コード鎖の５’から３’方向に対して反転している）、
－正の配向の、第２のオープンリーディングフレーム、並びに
－正の配向の、任意に第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された、第２のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメントを、上記の順序で含むことを特徴とする。
本発明の１つの独立した態様は、二本鎖ＤＮＡエレメントであって、５’から３’方向に、
－５’から３’方向の、第１のプロモーター（すなわち、正の配向）、
－逆方向反復の１つに変異を含む、５’から３’方向の、第１のリコンビナーゼ認識配列、
－３’から５’方向の、第２のプロモーター（すなわち、負の配向）、
－３’から５’方向の、第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメント（すなわち、コード鎖の５’から３’への配向に対して反転している）、
－３’から５’方向の、第１のオープンリーディングフレームであって、任意に、第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメントに作動可能に連結された第１のオープンリーディングフレーム、
－第１のリコンビナーゼ認識配列以外のそれぞれの他の逆方向反復に変異を含み、３’から５’方向の、第２のリコンビナーゼ認識配列（すなわち、第１リコンビナーゼ認識配列に対して相反の向きである）、
－５’から３’方向の、第２のオープンリーディングフレーム、並びに
－５’から３’方向の、任意に第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された、第２のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメントを、上記の順序で含む、二本鎖ＤＮＡエレメントである。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、二本鎖ＤＮＡエレメントと、前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列と機能的なリコンビナーゼとのインキュベーションは、
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間の配列の反転を生じさせ（その後、第１のプロモーターが第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、第２のプロモーターが第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結される）、及び
－組換え後の第１のプロモーターと第１のオープンリーディングフレームとの間に、又は第２のプロモーターと第２のオープンリーディングフレームとの間に、前記リコンビナーゼともはや機能しない（第３の）リコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる。
したがって、本発明によるＤＮＡエレメントは、含まれる第１及び第２のオープンリーディングフレームの転写に関して非機能的である。第１及び第２のオープンリーディングフレームの転写に関して非機能的であることにより、本発明によるＤＮＡエレメントは、含まれるオープンリーディングフレームが組込みの直後に既に発現されるリスクなしに、細胞のゲノムに組み込まれ得る。細胞への導入後、ＤＮＡエレメントの組換え認識配列と機能する、すなわち認識配列を認識するリコンビナーゼが細胞内で活性化されるか又は細胞に導入されると、オープンリーディングフレームが転写される。これにより、本発明のゲノムに組み込まれたＤＮＡエレメント中の第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列間のリコンビナーゼ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）が開始される。ＲＭＣＩは、２つの逆方向リコンビナーゼ認識配列の間に位置する本発明によるＤＮＡエレメントのその部分の反転をもたらす。これにより、第１のプロモーターが第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、第２のプロモーターが第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結される。その後に初めて、第１及び第２のオープンリーディングフレームが転写され、それぞれのコードされたタンパク質が発現される。したがって、本発明によるＤＮＡエレメントは、細胞内の２つのオープンリーディングフレームの転写の同時活性化に特に有用である。
転写的に不活性なオープンリーディングフレームを有する本発明によるＤＮＡエレメントを図１の左部分に概略的に示す。作動可能に連結されたプロモーター及びオープンリーディングフレーム、すなわち転写的に活性なオープンリーディングフレームを有するＲＭＣＩから生じる逆位ＤＮＡエレメントを図１の右部分に示す。
したがって、本発明の１つの独立した態様は、二本鎖ＤＮＡエレメントであって、５’から３’方向に、
－５’から３’方向の、第１のプロモーター（すなわち、正の配向）、
－両方の逆方向反復に変異を含む、又はいずれの逆方向反復にも変異を含まない、５’から３’方向の第１のリコンビナーゼ認識配列、
－第１のプロモーターに作動可能に連結された、５’から３’方向の、第１のオープンリーディングフレーム、
－５’から３’方向の、任意に第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された、第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメント、
－５’から３’方向の、第２のプロモーター、
－第１のリコンビナーゼ認識配列が逆方向反復に変異を有しない場合には両方の逆方向反復に変異を含むか、又は第１のリコンビナーゼ認識配列が両方の逆方向反復に変異を有する場合には逆方向反復に変異を有しない、第２のリコンビナーゼ認識配列、
－第２のプロモーターに作動可能に連結された、５’から３’方向の、第２のオープンリーディングフレーム、並びに
－５’から３’方向の、任意に第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された、第２のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写ターミネーターエレメントを、上記の順序で含む、二本鎖ＤＮＡエレメントである。
リコンビナーゼ認識配列は、反転されて活性化された構築物中に維持される。交換反応は酵素反応であるため、リコンビナーゼ認識配列、例えばＬｏｘＰ部位が任意の交換後にそれらの機能性を保持するので、酵素が依然として存在／活性であるか又は再導入されている場合、第２の、すなわち逆位の反転反応が可能である。逆位反転反応は、以前に活性化されたオープンリーディングフレームの転写不活性化をもたらすであろう。リコンビナーゼ媒介カセット反転の可逆性は、使用されるリコンビナーゼ認識配列並びに使用されるリコンビナーゼに依存する。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼによって触媒されるＲＭＣＩ反応は可逆的反応である。したがって、ゲノム中に活性なＣｒｅリコンビナーゼ及びＬｏｘＰ部位を含む細胞は、リコンビナーゼ認識配列が各交換反応後に機能性のままであるため、意図された反転事象が発生する傾向があるが、意図されない反転事象も発生する傾向がある。
したがって、リコンビナーゼシステムの活性又は／及び作用部位及び／又は可逆性を制御して、一次の意図した反転反応が起こった後の二次の意図しない反転反応を防止する必要がある。
したがって、本発明によるＤＮＡエレメントは、片側が変異したリコンビナーゼ認識配列を含む。したがって、リコンビナーゼ認識配列の各々は、１つの野生型及び１つの変異逆方向反復を有する。例えば、第１のリコンビナーゼ認識配列は、変異した左逆方向反復（及び右野生型反復）を有し、第２のリコンビナーゼ認識配列は、変異した右逆方向反復（及び左野生型反復）を有する。ＲＭＣＩの後、活性化され生産的なＤＮＡは、２つの野生型逆方向反復を有する１つのリコンビナーゼ認識配列と、２つの変異逆方向反復を有する１つのリコンビナーゼ認識配列とを含む。二重変異リコンビナーゼ認識配列はもはやリコンビナーゼによって認識されず、それによって、潜在的な逆反応が防止される。この意図的な設計に基づいて、単一の、すなわち１つのＲＭＣＩのみが起こり得、転写が安定して活性化される。
すべての態様及び実施形態の好ましい一実施形態において、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、リコンビナーゼ認識配列はＲＥ及びＬＥ－ＬｏｘＰ部位である。
すべての態様及び実施形態の好ましい一実施形態において、リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、リコンビナーゼ認識配列はＲＥ及びＬＥ－ＦＲＴ部位である。
あるいは、ｐｈｉＣ３１媒介ＲＭＣＩを使用することができる。このような反転反応の間、組換え部位は保存されない。より詳細には、Ｃｒｅ又はＦＬＰシステムとは対照的に、ａｔｔＰとａｔｔＢ部位が組換えて不適合なａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位を生成し、したがって連続的な交換反応を妨げる。したがって、それらは、反転される配列にそれぞれ逆ａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位を隣接させることによって、１回の一方向ＲＭＣＩに使用することができる（例えば、Ｈａｅｃｋｅｒ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（２０１７）４３８８３を参照のこと）。
すべての態様及び実施形態の好ましい一実施形態において、リコンビナーゼはｐｈｉＣ３１－インテグラーゼであり、リコンビナーゼ認識配列はａｔｔＰ及びａｔｔＢである。ＡｔｔＰ及びａｔｔＢは、これらの配列の使用がＲＭＣＩ後にもはや機能しないリコンビナーゼ認識配列をもたらすので、本発明によるリピートの１つに変異を有するリコンビナーゼ認識配列と見なされる。
本発明によるＤＮＡエレメントの有利な効果をさらに高めるために、使用されるプロモーターは、誘導可能／活性化可能であるように選択することもできる。したがって、オープンリーディングフレームの転写は、リコンビナーゼ媒介反転の後に、さらなる特異的プロモーター活性化によってのみオンにすることができる。これは、一方ではオープンリーディングフレームの転写の改善された制御をもたらし、他方では転写を再びオフにする可能性をもたらす。本発明のＤＮＡエレメントと誘導性プロモーターとの組み合わせにより、単離で使用した場合の誘導性プロモーターの潜在的な漏出を抑制することができる。Ｔｅｔオン／オフシステムなどの誘導性システムは、当技術分野で公知である。
本開示の主題は、複数のオープンリーディングフレームの誘導性転写を有する組換え哺乳動物細胞を産生するのに適した遺伝子構築物のための方法だけでなく、それぞれのタンパク質性化合物の安定な大規模産生のための方法も提供する。同様に、目的のタンパク質性化合物の高い生産性を有する組換え安定産生哺乳動物細胞を得ることができる。
本発明による方法は、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ（ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ－ＴＣＴＡＧＡＡＡ－ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ（配列番号３６）などのＦＲＴ部位を認識する）、ｐｈｉＣ３１－インテグラーゼ、及びＤｒｅリコンビナーゼ（ＴＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＡ－ＡＴＧＣＣＡＡＴ－ＴＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡ（配列番号４２）などのｒｏｘＰ部位を認識する；Ｂｅｓｓｅｒｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０（２０１９）１９３７）などの任意の部位特異的リコンビナーゼ、又はＴｒｅ、Ｂｒｅｃ １及びＶＣｒｅとしてのそれらの操作されたバリアント（それぞれのリコンビナーゼ特異的ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位、及びｒｏｘＰ部位をそれぞれ使用して、ＬｏｘＬＴＲ（ＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＡＴＴ－ＡＣＡＣＣＣＴＡ－ＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧ（配列番号４３））及びＬｏｘＢＴＲ（ＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡ－ＡＧＣＣＴＣＡＡ－ＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴ（配列番号４４））、又はＬｏｘＶ（ＴＣＡＡＴＴＴＣＴＧＡＧＡ－ＡＣＴＧＴＣＡＴ－ＴＣＴＣＧＧＡＡＡＴＴＧＡ（配列番号４５）；Ｓａｒｋａｒ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６（２００７）１９１２－１９１５，Ｋａｒｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（２０１６）４０１－４０９，Ｂｅｓｓｅｒｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０（２０１９）１９３７）などのＬｏｘＰバリアントを認識する）と共に用いることができる。唯一の前提条件は、使用されるリコンビナーゼ認識配列が非適合性であること、すなわち、それらが第２の同一のコピーとのみ相互作用し、密接に関連する配列との検出可能な無差別性を有しないことである。
それぞれ部位特異的リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼであり組換え認識部位がＬｏｘＰ部位であるＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムを使用する、本発明による方法を以下に例示する。これは、本発明の概念を例示するために行われる。Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムで示される本発明の概念は、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステム、又はｐｈｉＣ３１／ａｔｔシステム、又はＤｒｅ／ｒｏｘＰシステムなどの上記の他の部位特異的リコンビナーゼシステムにも同様に適用することができることが当業者によって直ちに分かる。したがって、以下に提供される例示及び定義において、用語「Ｃｒｅ－リコンビナーゼ」は、「Ｆｌｐ－リコンビナーゼ」又は「ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ」又は「Ｄｒｅインテグラーゼ」でそれぞれ置き換えることができ、用語「ＬｏｘＰ部位」は、用語「ＦＲＴ部位」又は「ａｔｔ部位」又は「ｒｏｘＰ部位」でそれぞれ置き換えることができる。
ＬｏｘＰ部位の配向及び同一性／非同一性に応じて、リコンビナーゼは、介在するＤＮＡ配列を反転、切除又は置換する。したがって、第１のモードでは、２つのＬｏｘＰ部位が同じ方向に配向される。これにより、Ｃｒｅリコンビナーゼとの相互作用時に介在ＤＮＡ配列が欠失し、孤立したＬｏｘＰ部位が残る。第２のモードでは、２つのＬｏｘＰ部位は、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ方向に配向され、すなわち、２つのＬｏｘＰ部位は、互いに対して相反／逆向きである。この配向では、Ｃｒｅリコンビナーゼとの相互作用は、介在するＤＮＡ配列の反転をもたらし、２つのＬｏｘＰ部位を残す。第２のモードでのＤＮＡ配列の反転の間、ＬｏｘＰ部位間のコード鎖及び鋳型鎖は互いに交換され、すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼとの相互作用前のコード鎖がＣｒｅリコンビナーゼとの相互作用後の鋳型鎖になり、逆もまた同様である。このプロセスは、リコンビナーゼ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）と呼ばれる。第３のモードでは、各々が同じ方向に配向された第１及び第２のＬｏｘＰ部位に隣接するＤＮＡ配列を含み、それにより、第１の分子上の１つのＬｏｘＰ部位及び第２の分子上の１つのＬｏｘＰ部位が同一であり、第１の分子上の第２のＬｏｘＰ部位が第２の分子上のそれぞれの他のＬｏｘＰ部位と同一である２つの分子がＣｒｅリコンビナーゼと相互作用する。この相互作用は、２つの分子間のＬｏｘＰ部位間のＤＮＡ配列の交換をもたらす。このプロセスは、リコンビナーゼ媒介カセット交換又は短縮してＲＭＣＥと呼ばれる。
野生型ＬｏｘＰ部位と適合しないバリアントＬｏｘＰ部位は、当技術分野で公知である。しかしながら、これらの非適合ＬｏｘＰ部位の数は限られている。無差別性のない、すなわち非特異的相互作用のないＬｏｘＰ適合部位ではないこれらの部位のいくつかを以下の表１ａに列挙する。
（表１ａ）非適合ＬｏｘＰ部位。
Figure 2023546113000004
野生型ＦＲＴ部位と適合しないＦＲＴ部位は、当技術分野で公知である。しかしながら、これらの非適合ＦＲＴ部位の数は限られている。無差別性のない、すなわち非特異的相互作用のないＦＲＴに適合しない部位のいくつかを以下の表１ｂに列挙する。
（表１ｂ）非適合ＦＲＴ部位。
Figure 2023546113000005
単一の特異的な非適合ＬｏｘＰ部位を容易に見出すことができる（上記の表１ａを参照）。１つよりも多くのＣｒｅ－ｌｏｘベースの交換を単一の核酸において行わなければならない場合、１つよりも多くの非適合ＬｏｘＰ部位、すなわち２つ以上の非適合ＬｏｘＰ部位を含むセットが必要とされる。これは、前記セット中の各ＬｏｘＰ部位が、前記セットに含まれる他のすべてのＬｏｘＰ部位と非適合性でなければならないことを意味する。そのようなセットは、１つよりも多くのオープンリーディングフレームが選択的に活性化される場合に特に必要とされる。
例えば、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ（Ｇｅｎｅ ２１６（１９９８）５５－６５）は、一塩基置換を有する２４個のＬｏｘＰスペーサー変異体及び二塩基置換を有する３０個のＬｏｘＰスペーサー変異体の完全なセットを合成した。これらのうち、２つのＬｏｘＰスペーサー変異体、すなわち変異体Ｌｏｘ５１７１及びＬｏｘ２２７２が同定され、これらは同一の変異体と効率的に組み換わるが、他の変異体又は野生型ＬｏｘＰとは組み換わらない。
同様に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２００２）３０６７－３０７７）は、カノニカルＬｏｘＰ部位との非適合性の増強を示す新規変異体スペーサー含有ＬｏｘＰ部位を同定するように設計された遺伝子スクリーニングを行った。Ｌａｎｇｅｒらの表１から、互いに非適合であるＬｏｘＰセットを識別することが可能であることが分かる。
（表２）Ｌａｎｇｅｒらの表１
Figure 2023546113000006
小文字は、ｌｏｘＰスペーサー配列とは異なるヌクレオチドを示す。
（配列番号１６、２０、２３、２４、２５、４９）
Ｍｉｓｓｉｒｌｉｓ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７（２００６）７３，Ａ１３）は、Ｃｒｅ－リコンビナーゼ媒介組換えにおけるＬｏｘＰスペーサー領域の配列及び無差別特性を特定するハイスループットのスクリーニングを行った。彼らは、３１個のユニークで新規な自己組換え配列を同定し、そのうち２つは単一の組換えパートナーしか有していなかった。
例示的な非適合ＬｏｘＰ部位セットを表３に列挙する。
（表３）非適合ＬｏｘＰ部位セット。
Figure 2023546113000007
太字のヌクレオチドは、それぞれの刊行物とＬｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏとの間の配列差を示す。
Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｊ．らは、相補的変異逆方向反復（Ｌｏｘ６６及びＬｏｘ７１）を有するＬｏｘＰ部位の使用がトランスでの効率的な組換えを可能にし、それによって野生型ＬｏｘＰ部位及び両方の逆方向反復が変異した欠損部位が生成されることを報告した。両方の逆方向反復が変異したＬｏｘＰ部位はもはやリコンビナーゼにとって効率的な基質ではないので、反応は一方向に駆動される。
これらの相補的変異体逆方向反復は、反復配列の末端の１つに改変された塩基ペンテットを含む。左逆方向反復の末端に変異を有する変異体は、ＬＥ変異体と呼ばれる。同様に、右逆方向反復の末端に変異を有するものは、ＲＥ変異体と呼ばれる。ＬＥ変異体Ｌｏｘ７１は、左逆方向反復の５’末端に５ｂｐが野生型配列からＴＡＣＣＧ（配列番号５０）に変化し、ＲＥ変異体Ｌｏｘ６６は、５つの最も３’の塩基がＣＧＧＴＡ（配列番号５１）に変化している。Ｌｏｘ７１とシスに位置する反転Ｌｏｘ６６部位との間のリコンビナーゼ反応の後、結果として生じるＬｏｘＰ部位は依然として標的ＤＮＡ配列を取り囲むシスに位置するが、結果として生じるＬｏｘＰ部位の１つは二重変異部位であり、すなわち各末端配列に変異があり、したがって、ＬＥ逆方向反復変異とＲＥ逆方向反復変異の両方を含む。それぞれの他の生じたＬｏｘＰ部位は、野生型配列に対応する。前記二重変異ＬｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えにおいてもはや機能的ではない（例えば、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｓｓｉｒｌｉｓ ｅｔ ａｌ．を参照のこと。両方とも上掲）。
様々なＬｏｘＰ ＲＥ変異体配列及びＬＥ変異体配列が知られている。いくつかを以下の表４ａに示す。
（表４ａ）ＬｏｘＰ ＲＥ変異体配列及びＬＥ変異体配列。
Figure 2023546113000008
＊：交換反応後に最も高い安定性を有する；Ｈｏｅｓｓら（１９８２）によって定義されている逆方向のスペーサー。
例えば、ＲＥ変異体配列及びＬＥ変異体配列のＬｏｘ７１及びＬｏｘ６６、又はＬｏｘＪＴ１５及びＬｏｘＪＴＺ１７を対として使用することができる。
同様に、異なるＦＲＴ ＲＥ変異体配列及びＬＥ変異体配列が知られている。いくつかを以下の表４ｂに示す。
（表４ｂ）ＦＲＴ ＲＥ変異体配列及びＬＥ変異体配列。
Figure 2023546113000009
一般に、いずれかの鎖上の配列中に（機能的）開始コドンを含有する組換え部位（例えば、ＬｏｘＰ、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ５１７１、Ｌｏｘ６６又はＬｏｘ７１）は、組換え後に、開始コドンが活性化される遺伝子の５’ＵＴＲのコード鎖上に位置するように配置されてはならない。そうでなければ、開始コドンはオープンリーディングフレームの翻訳を抑制し得る。そのような場合、組換え部位は、開始コドンが転写されないように、プロモーターのＴＡＴＡエレメントの（すぐ）３’側又はＴＡＴＡエレメントと転写開始部位との間に配置され得る（開始コドンのサイレンシング）。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、本発明のＤＮＡエレメントは、使用されるリコンビナーゼ認識部位が非適合性である限り、二量体、三量体及びアレイに組み合わされる。これは、本発明による異なるＤＮＡエレメントを組み合わせて使用する場合の唯一の要件である。それにより、同じリコンビナーゼが使用される場合、又は異なるリコンビナーゼの非適合リコンビナーゼ認識部位が本発明による各ＤＮＡエレメントにおいて使用される場合は順次、２つ、４つ、６つ、さらにはそれ以上のオープンリーディングフレーム／遺伝子の転写を一度に活性化することが可能である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、２つ、４つ、６つ、及びさらに多くのオープンリーディングフレーム／遺伝子の連続的な活性化は、本発明による２つ以上のＤＮＡエレメントが組み合わされ、各ＤＮＡエレメントがＲＭＣＩに異なるリコンビナーゼを必要とする場合に達成される。これは、例えばＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムとＦｌｐ／ＦＲＴシステムとの組み合わせ、又はＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムとＤｒｅ／ｒｏｘＰシステム）との組み合わせ（例えば、Ｃｈｕａｎｇ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍ．Ｇｅｎｅｔ．６（２０１６）５５９－５７１を参照）、又はＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムとｐｈｉＣ３１－インテグラーゼ／ａｔｔシステムとの組み合わせ、又はＦｌｐ／ＦＲＴシステムとｐｈｉＣ３１インテグラーゼ／ａｔｔシステムとの組み合わせなど、先に概説した異なる部位特異的リコンビナーゼシステムの２つの組み合わせによって達成することができる。
すべての態様及び実施形態の一定の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ及びそれ以上のオープンリーディングフレーム／遺伝子の連続的な活性化が達成され、本発明による１つのＤＮＡエレメントが使用されるか（１つ又は２つのオープンリーディングフレームの連続的な活性化）、又は本発明による２つ以上のＤＮＡエレメントが組み合わされ（２つ、３つ、４つ又はそれ以上のオープンリーディングフレームの連続的な活性化）、それにより、２つ以上のＤＮＡエレメントの場合、各ＤＮＡエレメントはＲＭＣＩに異なるリコンビナーゼを必要とし、第１又は第２のプロモーターのいずれかが誘導性プロモーターである（２つのオープンリーディングフレームの連続的な活性化の場合）か、又は各々の第２のプロモーターが誘導性プロモーターである（２つ以上のオープンリーディングフレームの連続的な活性化の場合）。
したがって、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、第１のプロモーター又は第２のプロモーターのいずれかが誘導性プロモーターである。特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン制御プロモーター、クメート制御プロモーター、ＦＫＢＰ１２－ｍＴＯＲ制御プロモーター、ラパマイシン制御プロモーター、ＦＫＣｓＡ制御プロモーター、アブシシン酸制御プロモーター、タモキシフェン制御プロモーター、及びリボスイッチ制御プロモーターを含む誘導性プロモーターの群から選択される（ＦＫＣｓＡ＝ＦＫ５０６及びシクロスポリンＡのヘテロ二量体）。
誘導性プロモーターの総説については、例えば、Ｋａｌｌｕｎｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ ８（２０１９）７９６を参照のこと。
すべての態様及び実施形態の一定の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ及びそれ以上のオープンリーディングフレーム／遺伝子の連続的な活性化が達成され、本発明による１つのＤＮＡエレメントが使用されるか（１つ又は２つのオープンリーディングフレームの連続的な活性化）、又は本発明による２つ以上のＤＮＡエレメントが組み合わされ（２つ、３つ、４つ又はそれ以上のオープンリーディングフレームの連続的な活性化）、それにより、２つ以上のＤＮＡエレメントの場合、各ＤＮＡエレメントはＲＭＣＩに異なるリコンビナーゼを必要とし、第１又は第２のプロモーターのいずれかが抑制性プロモーターである（２つのオープンリーディングフレームの連続的な活性化の場合）か、又は各々の第２のプロモーターが抑制性プロモーターである（２つ以上のオープンリーディングフレームの連続的な活性化の場合）。
したがって、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、第１のプロモーター又は第２のプロモーターのいずれかが抑制性プロモーターである。特定の実施形態では、抑制性プロモーターは、テトラサイクリン制御プロモーター、ＧＡＬ４／ＵＡＳ制御プロモーター、及びＬｅｘＡ／ｌｅｘＡｏｐ制御プロモーターを含む抑制性プロモーターの群から選択される。
さらに多くの組み合わせを可能にするために、構成的、誘導性、及び抑制性プロモーターを組み合わせることができる。例えば、テトラサイクリン依存性の誘導性プロモーターと抑制性プロモーターとを組み合わせる場合、テトラサイクリンの添加により、一方のプロモーターはサイレンシングされ、他方は活性化され、異なるオープンリーディングフレームの転写の切り替えを可能にする。
図２には、本発明による２つのＤＮＡエレメントの組み合わせが示されている。第１のＤＮＡエレメントは、順方向の左逆方向反復に変異を有する第１のリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ１）、逆方向の第１のポリアデニル化シグナル配列に作動可能に連結された逆方向の第１のオープンリーディングフレーム（ＳＧ１）、ＲＲＳ１と適合する逆方向の右逆方向反復に変異を有する第２のリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ２）、及び第２のポリアデニル化シグナル配列に作動可能に連結された順方向のオープンリーディングフレーム（ＳＧ２）を含む。第２のＤＮＡエレメントは、ＲＲＳ１及びＲＲＳ２と適合しない順方向の左逆方向反復に変異を有する第３のリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ３）、第３のポリアデニル化シグナル配列に作動可能に連結された逆方向の第３のオープンリーディングフレーム（ＳＧ３）、ＲＲＳ１及びＲＲＳ２と適合せずＲＲＳ３と適合する逆方向の右逆方向反復に変異を有する第４のリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ４）、及び第４のポリアデニル化シグナル配列に作動可能に連結された第４のオープンリーディングフレーム（ＳＧ４）とを含む。
すべてのＲＲＳが単一の、すなわち同じリコンビナーゼによって認識される場合、それとのインキュベーション時に２つの反転反応が起こり、すなわちＲＲＳ１とＲＲＳ２との間のＤＮＡ断片及びＲＲＳ３とＲＲＳ４との間のＤＮＡ断片が反転される。それにより、４つすべてのオープンリーディングフレームがそれぞれのプロモーターに作動可能に連結され、転写される。それぞれの交換反応を図３に示す。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用する場合、非適合ＲＲＳ対であるＬｏｘ７１／Ｌｏｘ６６及びＬ３－ＬＥ／Ｌ３－ＲＥをそれぞれ使用することができる。
ＲＲＳ１及びＲＲＳ２が第１のリコンビナーゼによって認識され、ＲＲＳ３及びＲＲＳ４が第２のリコンビナーゼによって認識される場合、第１のリコンビナーゼとのインキュベーション時に１つの反転反応のみが起こる、すなわち、ＲＲＳ１とＲＲＳ２との間のＤＮＡ断片は反転されるが、ＲＲＳ３とＲＲＳ４との間のＤＮＡ断片は維持される。それにより、２つのオープンリーディングフレームのみがそれぞれのプロモーターに作動可能に連結され、転写される。第１のリコンビナーゼの後にそれぞれの第２のリコンビナーゼがそれぞれの細胞に導入されると、ＲＲＳ３とＲＲＳ４との間のＤＮＡ断片も反転し、それぞれのオープンリーディングフレームが活性化される。それぞれの交換反応を図４に示す。例えば、第１のリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり得、ＲＲＳ１／ＲＲＳ２はＬｏｘＰ部位であり、第２のリコンビナーゼはｐｈｉＣ３１－インテグラーゼであり得、ＲＲＳ３／ＲＲＳ４はａｔｔＰ及びａｔｔＢである。
プロモーターの少なくとも１つが誘導性プロモーターである場合、作動可能に連結されたオープンリーディングフレームの転写は、ＲＭＣＩの後にそれぞれの誘導因子の存在をさらに必要とするか、又はプロモーターの少なくとも１つが抑制性プロモーターである場合、作動可能に連結されたオープンリーディングフレームの転写は、それぞれのリプレッサーの添加によってＲＭＣＩの後に抑制され得る。
組換えＡＡＶ粒子
組換えＡＡＶ粒子の産生には、単一の哺乳動物細胞におけるＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質、ヘルパータンパク質Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６、並びにアデノウイルスＶＡ ＲＮＡの発現が必要である。特に、Ｒｅｐタンパク質の発現は、哺乳動物細胞の成長及び生存率に悪影響を及ぼす。これらの欠点は、本発明によるＤＮＡエレメントを使用することによって克服することができる。例示的な設計を以下に概説し、本発明による１つ又は２つのＤＮＡエレメントを組み合わせて使用したものを図５、図６及び図７に示す。ヘルパータンパク質Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６は、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９８）９３８－９４５）によって示された任意のプロモーター、特にＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用して発現させることができる。したがって、以下では、任意のプロモーターを使用することができる。
Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６オープンリーディングフレーム
したがって、本発明の１つの独立した態様は、（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生のための）（二本鎖）ＤＮＡ（分子）であって、
ａ）Ｅ１Ａオープンリーディングフレーム及びＥ１Ｂオープンリーディングフレーム；及び
ｂ）Ｅ２Ａオープンリーディングフレーム及びＥ４ｏｒｆ６オープンリーディングフレームを含み、
ａ）又はｂ）の第１及び第２のオープンリーディングフレームが、（正に配向された）コード鎖及び（負に配向された）鋳型鎖を含む（本発明による）二本鎖ＤＮＡエレメントに含有されることを特徴とし、
コード鎖は、以下の順序で５’から３’方向に、
－第１のプロモーター、
－左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖に対して反転している第２のプロモーター（逆向きである）、
－－コード鎖に対して反転しており、第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメント、
－コード鎖に対して反転しているａ）又はｂ）の第１のオープンリーディングフレーム（逆向きである）、
－右逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反の向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、
－第１のオープンリーディングフレームがａ）のものである場合はａ）の第２のオープンリーディングフレーム、又は第１のオープンリーディングフレームがｂ）のものである場合はｂ）の第２のオープンリーディングフレーム、
－第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された第２のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメントを含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、それぞれの他のオープンリーディングフレームは発現カセット内にあり、すなわちプロモーター並びにポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメントに作動可能に連結されている。
図９及び図１０は、ＲＭＣＩ前（図９）及びＲＭＣＩ後（図１０）の上記態様ａ）のスキームを示す。
図１１及び図１２は、ＲＭＣＩ前（図１１）及びＲＭＣＩ後（図１２）の上記態様ｂ）のスキームを示す。
本発明のＤＮＡエレメントにおける組換え認識部位の配列は、互いに対して特異的な配向を有する必要がある。第１の組換え認識部位は正の配向にあり、第２の組換え認識部位は、第１の組換え認識部位に対して反転された／逆方向にある。
例えば、コード鎖／正鎖／フォワード鎖上のように５’から３’方向に以下の配列を有するＬｏｘＰ部位の場合：
５’－ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａ－ａｔｇｔａｔｇｃ－ｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ－３’
コード鎖に、すなわち５’から３’方向に配置されるべき反転された配列は、各ヌクレオチドをその相補的塩基で置換し、元の配列の３’末端から開始することによって得られ、それにより、以下の反転されたコード鎖配列が得られる：
５’－ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａ－ｇｃａｔａｃａｔ－ｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ－３’。
同様に、本発明のＤＮＡエレメントにおいて組み合わされる他の反転された配列を得ることができる。したがって、本発明による例示的なＤＮＡエレメントは、コード鎖上に以下の配列を有する。
正常な配向にある第１のプロモーター－
５’－ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａ－ａｔｇｔａｔｇｃ－ｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ－３’（正常な配向にある第１のリコンビナーゼ認識配列）－
逆向きである第２のプロモーター－
逆向きである第１のポリＡ／ターミネーター配列－
逆向きである第１のオープンリーディングフレーム－
５’－ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａ－ｇｃａｔａｃａｔ－ｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ－３’（逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列）－
第２のオープンリーディングフレーム（正常な配向にある）－
正常な配向にある第２のポリＡ／ターミネーター配列。
さらに、本発明の１つの独立した態様は、（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生のための）（二本鎖）ＤＮＡ（分子）であって、
ａ）Ｅ１Ａオープンリーディングフレーム及びＥ１Ｂオープンリーディングフレーム；及び
ｂ）Ｅ２Ａオープンリーディングフレーム及びＥ４ｏｒｆ６オープンリーディングフレームを含み、
ａ）の第１及び第２のオープンリーディングフレームが（本発明による）二本鎖ＤＮＡエレメントに含まれ、ｂ）の第１及び第２のオープンリーディングフレームが（本発明による）二本鎖ＤＮＡエレメントに含まれ（すなわち、ＤＮＡは、本発明による前記ＤＮＡエレメントのうちの２つを含む）、各二本鎖ＤＮＡエレメントが（正に配向された）コード鎖及び（負に配向された）鋳型鎖を含むことを特徴とし、
コード鎖は、５’から３’方向に、
－第１のプロモーター、
－左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖に対して反転している第２のプロモーター（逆向きである）、
－コード鎖に対して反転しており、第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－コード鎖に対して反転しているａ）又はｂ）の第１のオープンリーディングフレーム（逆向きである）、
－右逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反の向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、
－第１のオープンリーディングフレームがａ）のものである場合はａ）の第２のオープンリーディングフレーム、又は第１のオープンリーディングフレームがｂ）のものである場合はｂ）の第２のオープンリーディングフレーム、及び
－第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された第２のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメントを、上記の順序で含む。
いずれの場合においても、二本鎖ＤＮＡ分子と、前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列と機能的なリコンビナーゼとのインキュベーションは、
－第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列との間の配列の反転を生じさせ（その後、第１のプロモーターが第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、第２のプロモーターが第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結される）、及び
－組換え後の第１のプロモーターと第１のオープンリーディングフレームとの間に位置する、前記リコンビナーゼともはや機能しない（第３の）リコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる。
上記の２つの態様において、同様に、第１のリコンビナーゼ認識配列は、右逆方向反復に変異を含むことができ、第２のリコンビナーゼ認識配列は、左逆方向反復に変異を含むことができる。これにより、組換え後の第２のプロモーターと第２のオープンリーディングフレームとの間に位置する、前記リコンビナーゼともはや機能しないリコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる。
リコンビナーゼ、例えばＣｒｅリコンビナーゼの時間的発現は、リコンビナーゼ遺伝子の発現を駆動する誘導性プロモーターを使用することによって、又はｍＲＮＡをコードするリコンビナーゼなどの導入によって達成することができる。例示的な誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ発現システムは、Ｃａｒｔｅｒ，Ｚ．ａｎｄ Ｄｅｌｎｅｒｉ，Ｄ．（Ｙｅａｓｔ ２７（２０１０）７６５－７７５）によって報告された。そこで、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が、形質転換体において、ガラクトース（ＹＰＧａｌ）に数時間曝露することによって誘導された。
Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ（オープンリーディングフレーム）のコード配列は、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、例えば、特にヒトアデノウイルス血清型２又は血清型５などのヒトアデノウイルスに由来する。ヒトＡｄ５（アデノウイルス血清型５）の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＸ０２９９６、ＡＣ＿０００００８に見出すことができ、例示的なヒトＡｄ２の配列はＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＣ＿０００００７に見出すことができる。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ヌクレオチド５０５～３５２２は、ヒトアデノウイルス血清型５のＥ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする核酸配列を含む。ＥＰ １ ２３０ ３５４ Ｂ１に報告されているプラスミドｐＳＴＫ１４６、並びに国際公開第２００７／０５６９９４号に報告されているプラスミドｐＧＳ１１９及びｐＧＳ１２２も、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂオープンリーディングフレームの供給源として使用することができる。
Ｒｅｐ／Ｃａｐオープンリーディングフレーム
ＤＮＡ反転とプロモーターへの作動可能な連結との組み合わせによる遺伝子活性化の原理を使用して、ｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームを条件付きで活性化することもできる。
Ｐ５プロモーターを除いて、ｒｅｐ及びｃａｐのオープンリーディングフレーム発現を駆動しているプロモーターは、Ｒｅｐポリペプチドコード配列内に位置する。したがって、リコンビナーゼ媒介配列反転及びプロモーターへの同時の作動可能な連結によるｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームの条件付き活性化のために、非適合リコンビナーゼ認識配列の一方は、Ｐ５プロモーターとｒｅｐオープンリーディングフレームとの間に位置しなければならず、他方の非適合リコンビナーゼ認識配列は、ｃａｐオープンリーディングフレームとポリアデニル化シグナルとの間に位置しなければならない。これは、図７の左側の略図に概略的に示されている。
したがって、本発明の１つの独立した態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む（本発明による）二本鎖ＤＮＡエレメントを含む（二本鎖）ＤＮＡ（分子）（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生用）であり、
コード鎖は、５’から３’方向に、
－第１のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ５又はその機能的断片又はそのバリアント、
－左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質の発現のためのさらなるプロモーターを含むｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームであって、コード鎖に対して反転された（逆向きである）、オープンリーディングフレーム、
－右逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆方向／相反の向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、並びに
－ポリアデニル化シグナルを、上記の順序で含む。
本発明の別の独立した態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む（本発明による）二本鎖ＤＮＡエレメントを含む（二本鎖）ＤＮＡ（分子）（組換えアデノ随伴ウイルスベクター又は粒子の産生用）であり、
コード鎖は、５’から３’方向に、
－第１のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ５又はその機能的断片又はそのバリアント、
－左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖に対して反転された（逆向きである）第２のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ１９又はその機能的断片又はそのバリアント、
－コード鎖に対して反転している第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－Ｒｅｐ７８タンパク質のみをコードするか、又はＲｅｐ６８タンパク質のみをコードするが、両方はコードしないコード配列であって、内部Ｐ４０プロモーターが不活性化され、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位が除去され、コード鎖に対して反転されている（逆向きの配向にある）、コード配列、
－右逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆方向／相反の向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、並びに
－共通のポリアデニル化シグナルを含むＲｅｐ５２／Ｒｅｐ４０遺伝子及びＣａｐ遺伝子を、上記の順序で含む。
図１３及び図１４は、ＲＭＣＩ前（図１３）及びＲＭＣＩ後（図１４）の上記態様のスキームを示す。図７の中央の略図も参照されたい。
本発明の別の独立した態様は、（正に配向した）コード鎖及び（負に配向した）鋳型鎖を含む（本発明による）二本鎖ＤＮＡエレメントを含む（二本鎖）ＤＮＡ（分子）（組換えアデノ随伴ウイルスベクター及び粒子の産生用）であり、
コード鎖は、５’から３’方向に、
－第１のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ５又はその機能的断片又はそのバリアント、
－左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
－コード鎖に対して反転された（逆向きである）第２のプロモーター、１つの好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスプロモーターＰ１９又はその機能的断片又はそのバリアント、
－コード鎖（方向）に対して（配列が）反転しており（すなわち、反転／負の配向にある）、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列に作動可能に連結されている、第１のポリアデニル化シグナル及び／又は転写終結エレメント、
－Ｒｅｐ７８タンパク質のみをコードするか、又はＲｅｐ６８タンパク質のみをコードするが、両方はコードしないコード配列であって、内部Ｐ４０プロモーターが不活性化され、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位が除去され、コード鎖に対して反転されている（逆向きである）、コード配列、
－右逆方向反復に変異を含み、第１のリコンビナーゼ認識配列に対して相反／逆向きである第２のリコンビナーゼ認識配列、
－ポリアデニル化シグナル配列を含むＲｅｐ５２オープンリーディングフレーム（すなわち、ポリアデニル化シグナルが前記オープンリーディングフレームに作動可能に連結される）、及び
－任意に、第３のプロモーター、ｃａｐオープンリーディングフレーム並びにポリアデニル化及び／又はターミネーター配列を、上記の順序で含む（すべて作動可能に連結されている）。
図７の右略図も参照されたい。
上記の各態様において、前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列及び／又は前記第３及び第４のリコンビナーゼ認識配列と共に機能するリコンビナーゼとの二本鎖ＤＮＡ分子のインキュベーションは、それぞれ、
－第１／第３のリコンビナーゼ認識配列と第２／第４のリコンビナーゼ認識配列との間に配列の反転を生じさせ（その後、第１／第３のプロモーターが第１／第３のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、第２／第４のプロモーターが第２／第４のオープンリーディングフレームに作動可能に連結される）、及び
－組換え後の第１／第３のプロモーターと第１／第３のオープンリーディングフレームとの間に、前記リコンビナーゼともはや機能しないリコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる。
上記の３つの態様において、同様に、第１のリコンビナーゼ認識配列は、右逆方向反復に変異を含むことができ、第２のリコンビナーゼ認識配列は、左逆方向反復に変異を含むことができる。これにより、組換え後の第２のプロモーターと第２のオープンリーディングフレームとの間に位置する、前記リコンビナーゼともはや機能しないリコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる。
リコンビナーゼ、例えばＣｒｅリコンビナーゼの時間的発現は、リコンビナーゼ遺伝子の発現を駆動する誘導性プロモーターを使用することによって、又はｍＲＮＡをコードするリコンビナーゼなどの導入によって達成することができる。例示的な誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ発現システムは、Ｃａｒｔｅｒ，Ｚ．ａｎｄ Ｄｅｌｎｅｒｉ，Ｄ．（Ｙｅａｓｔ ２７（２０１０）７６５－７７５）によって報告された。そこで、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が、形質転換体において、ガラクトース（ＹＰＧａｌ）に数時間曝露することによって誘導された。
アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子
ＤＮＡ反転とプロモーターへの作動可能な連結との組み合わせによる遺伝子活性化の原理を使用して、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子転写を条件付きで活性化することもできる。
アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、２つの遺伝子内エレメント、Ａボックス及びＢボックスを含む２型ポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動される。Ｓｎｏｕｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１９８７）８２９３－８３０３）は、プロモーター活性を完全に無効にするＶＡ ＲＮＡＩ Ｂボックスの変異体を同定した。これらの変異は、ＶＡ ＲＮＡＩのＰＫＲへの結合及び関連する機能に影響を及ぼす可能性が低い（Ｃｌａｒｋ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１３２９－１３４１）。
本発明のさらなる態様は、新規アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子である。本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、逆位によるＣｒｅリコンビナーゼ媒介遺伝子活性化を可能にする。本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡでは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡの非コードエレメント、すなわち調節エレメントに導入されたＬｏｘＰ部位と共に正確な転写開始部位を有する任意のプロモーターによって駆動され得る。
本発明者らは、ＬｏｘＰ部位の８ｂｐスペーサーにＴＡＴＡボックスを組み込み、特異的に操作された新規ＬｏｘＰ部位をもたらすことができることを見出した。前記新規ＬｏｘＰスペーサー配列ＡＧＴＴＴＡＴＡ（配列番号０１）は、Ｌｘとして示される。この新規なスペーサー配列は、任意の公知の逆方向反復配列、例えば、配列番号１４及び１５の野生型ＬｏｘＰ逆方向反復配列（＝配列番号１４＋配列番号０１＋配列番号１５）、並びに、配列番号５０及び５１のＬＥ－及びＲＥ－変異体配列を含む逆方向反復配列（＝配列番号０３及び０５）と、順方向及び逆方向（ｉｎｖ）の形態（＝配列番号１４＋配列番号０２＋配列番号１５）で組み合わせることができる。
Ｌｘ ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａ－ａｇｔｔｔａｔａ－ｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ
Ｌｘ（ｉｎｖ）ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａ－ｔａｔａａａｃｔ－ｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ
Ｌｘ－ＬＥ ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａ－ａｇｔｔｔａｔａ－ｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ
Ｌｘ－ＲＥ ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａ－ａｇｔｔｔａｔａ－ｔａｔａｃｇａａｃｇｇｔａ
ＬｏｘＰ部位（１）の配列アラインメントの下に、本発明によるＬｘ－ＬＥ部位（変異した左逆方向反復を有する）（２）、及び例示的なＴＡＴＡボックス（３）を示す（下線はＴＡＴＡボックス、太字はスペーサー配列）：
Figure 2023546113000010
本発明によるＬｘ－ＬＥ部位は、ＴＡＴＡボックスを変化させずに残し、変異左反復（ＬＥ）、野生型右反復及び新規Ｌｘスペーサー配列を含むことが分かる。
したがって、本発明の一態様は、配列番号３０（ＴＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡ Ｔ）のＣｒｅリコンビナーゼ認識配列Ｌｘ－ＬＥである。
したがって、本発明の独立した態様は、ＬｏｘＰ部位ＡＧＴＴＴＡＴＡ（配列番号０１順方向；配列番号０２逆方向）である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、配列番号０１又は配列番号０２のスペーサー配列は、野生型左逆方向反復配列及び野生型右逆方向反復配列と組み合わされる。このＣｒｅリコンビナーゼ認識配列は、順方向では配列番号１４＋配列番号０１＋配列番号１５の配列の直接の組み合わせを有し、逆方向では配列番号１４＋配列番号０２＋配列番号１５の配列の直接の組み合わせを有する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、配列番号０１又は配列番号０２のスペーサー配列は、変異した左逆方向反復配列及び野生型右逆方向反復配列と組み合わされる。このＣｒｅリコンビナーゼ認識配列はＬｘ－ＬＥとして示され、順方向では配列番号０３の配列を有し、逆方向では配列番号０４の配列を有する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、配列番号０１又は配列番号０２のスペーサー配列は、変異した右逆方向反復配列及び野生型左逆方向反復配列と組み合わされる。このＣｒｅリコンビナーゼ認識配列はＬｘ－ＲＥして示され、順方向では配列番号０５の配列を有し、逆方向では配列番号０６の配列を有する。
本発明のさらなる独立した態様は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子の転写における配列番号０３のＣｒｅリコンビナーゼ認識配列の使用である。
本発明のさらなる独立した態様は、新規アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子である。本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、逆位によるＣｒｅリコンビナーゼ媒介遺伝子活性化を可能にする。本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡでは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子の転写は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡの非コードエレメント、すなわち調節エレメントに導入されたＬｏｘＰ部位と共に正確な転写開始部位を有する任意のプロモーターによって駆動され得る。
本発明のこの態様を図１６に示す。
ウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）は、翻訳を調節するアデノウイルス（Ａｄ）の非コードＲＮＡである。アデノウイルスゲノムは、２つの独立したコピーを含む：ＶＡＩ（ＶＡ ＲＮＡＩ）及びＶＡＩＩ（ＶＡ ＲＮＡＩＩ）。両方ともＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される（例えば、Ｍａｃｈｉｔａｎｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．１５４（２０１１）２８５－２８９）。
系統発生的アプローチを使用したアデノウイルス関連ＲＮＡの構造、機能及び進化は、Ｍａ，Ｙ．ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｂ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５０８３－５０９９）によって調査された。それらは、４７の既知のヒトアデノウイルス血清型に基づいて、アライメント及びコンセンサスＶＡ ＲＮＡ配列を提供した。前記開示は、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
ＶＡ ＲＮＡ、ＶＡＩ及びＶＡＩＩは、１５７～１６０ヌクレオチド（ｎｔ）からなる。
血清型に応じて、アデノウイルスは１つ又は２つのＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含有する。ＶＡ ＲＮＡＩは、支配的なプロウイルスの役割を果たすと考えられているが、ＶＡ ＲＮＡＩＩは、ＶＡ ＲＮＡＩの非存在を部分的に補償することができる（Ｖａｃｈｏｎ，Ｖ．Ｋ．ａｎｄ Ｃｏｎｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２１２（２０１６）３９－５２）。
ＶＡ ＲＮＡは必須ではないが、細胞の抗ウイルス機構を克服することによって効率的なウイルス増殖に重要な役割を果たす。すなわち、ＶＡ ＲＮＡはウイルス増殖に必須ではないが、ＶＡ ＲＮＡ欠失アデノウイルスは、おそらく細胞の抗ウイルス機構を遮断するＶＡ ＲＮＡ以外のウイルス遺伝子が十分に発現されない可能性があるため（Ｍａｅｋａｗａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３（２０１３）１１３６を参照）、細胞あたりわずか数コピーのウイルスゲノムしか存在しないベクター生成の初期段階中に増殖することができない。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの内部制御領域（又はプロモーター）を構成するＡボックス及びＢボックスは、アデノウイルス血清型２（Ａｄ２）ＶＡ ＲＮＡＩについて実験的に定義されている。これらはよく保存されている。すべてのＶＡ ＲＮＡは、同様の位置に両ボックスを有する。Ｂボックス相同性は非常に高い。Ｂボックスの３４～４０ｎｔ上流に位置するＡボックスは、いくつかのＶＡ ＲＮＡにおいてわずかに相同性が低い。ＶＡ ＲＮＡの頂端ステムの一部を形成する一対の相互に相補的なテトラヌクレオチド、ＣＣＧＧ（配列番号７７）及び（Ｕ／Ｃ）ＣＣＧＧ（配列番号７８）は、ＶＡ ＲＮＡ配列においてかなりよく保存されている。Ｂボックスの最初の２つの塩基を含む最初のＣＣＧＧは不変である。１つを除くすべてのＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、ｔＲＮＡ転写開始エレメント、Ａボックス及びＢボックスコンセンサス配列ＲＲＹＮＮＡＲＹＧＧ（配列番号７９）及びＧＷＴＣＲＡＮＮＣ（配列番号８０）にそれぞれ５’半相同な配列を有する。ＶＡ ＲＮＡＩＩ遺伝子におけるＡボックス相同性は、一般に、ＡボックスがＢボックスよりもＶＡ ＲＮＡ転写にとって重要ではないという発見と一致して、ＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子における相同性よりも弱い。ＶＡ ＲＮＡコード配列の末端には、ポリメラーゼＩＩＩ終結部位に典型的なヌクレオチドＣ及びＧに隣接するＴ残基の連なりがある。チミジンの数は、最低４個から１０個超まで変動し、Ａ残基は、Ｔリッチラン（非常に長いＴランの中央にＡ残基を有するＡｄ １２及びＡｄ １８を除く）の両側に少なくとも３ｎｔ存在しない（Ｍａ，Ｙ．ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｂ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５０８３－５０９９）。
ＶＡ ＲＮＡＩ及びＶＡ ＲＮＡＩＩのＢボックス配列は、内部ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの活性に必須であることが分かっている。
Ｍａｅｋａｗａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３（２０１３）１１３６）は、細胞ＲＮＡｉ機構を乱すウイルス関連ＲＮＡの遺伝子を欠くアデノウイルスベクターの効率的な産生を報告し、ここで、フリッパーゼリコンビナーゼを構成的かつ高発現するＨＥＫ２９３細胞を感染させて、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子座のＦＬＰリコンビナーゼ媒介切除によってＶＡ ＲＮＡ欠失アデノウイルスを得た。
ヒトアデノウイルス２ ＶＡ ＲＮＡＩ（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＣ＿０００００７のヌクレオチド１０５８６～１０８１０）配列を配列番号８１に示す；Ｇ５８Ｔ／Ｇ５９Ｔ／Ｃ６８Ａ（連続残基ナンバリング）のものを配列番号８２に示す。ヒトアデノウイルス５ ＶＡ ＲＮＡＩ（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＣ＿０００００８のヌクレオチド１０５７９～１０８２０）配列を配列番号８３に示す；ヒトアデノウイルス５ ＶＡ ＲＮＡＩ及びＶＡ ＲＮＡＩＩのものを配列番号８４に示す。
Ｈａｈｎ，Ｓ．（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１（２００４）３９４－４０３）及びＲｅｖｙａｋｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎ．Ｄｅｖｅｌ．２６（２０１２）１６９１－１７０２）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写機構の構造及び機構について報告し、Ｎｉｋｉｔｉｎａ，Ｔ．Ｖ．ａｎｄ Ｔｉｓｈｃｈｅｎｋｏ，Ｌ．Ｉ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９（２００５）１６１－１７２）はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写機構を概説した。これらを以下にまとめる。
転写、すなわちＤＮＡ鋳型上でのＲＮＡ合成は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌｓ，［ＥＣ ２．７．７．６］）によって行われる。ＲＮＡポリメラーゼの他に、基本転写因子（ＧＴＦ）と呼ばれるさらなる因子が関与する。これらは、プロモーター配列の認識、調節因子に対する応答、及び転写中のポリメラーゼの活性に必要な立体構造変化に必要である。
コアプロモーター（非調節転写又は基礎転写を特定するのに必要な最小ＤＮＡ配列）は、前開始複合体（ＰＩＣ）と呼ばれる状態でＰｏｌを配置するのに役立つ。この状態では、Ｐｏｌ及びＧＴＦはすべてプロモーターに結合しているが、転写を開始するために活性な立体配座にはなっていない。
真核細胞は、サブユニット組成が異なるＩ、ＩＩ、及びＩＩＩとして示される３つのＰｏｌを含む。
特定のＰｏｌによって転写される遺伝子は、クラスＩ、ＩＩ又はＩＩＩに対応して割り当てられる。
Ｐｏｌ Ｉはｐｒｅ－ｒＲＮＡの遺伝子を転写する。Ｐｏｌ ＩＩは、Ｕ６ ｓｎＲＮＡ以外のすべてのタンパク質コード遺伝子及びｓｎＲＮＡの遺伝子を転写する。Ｐｏｌ ＩＩＩは、５Ｓ ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、Ｕ６ ｓｎＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、７ＳＬ ＲＮＡの遺伝子；Ａｌｕ反復；いくつかのウイルス遺伝子；及び小さな安定した非翻訳ＲＮＡの遺伝子を転写する。
異なるクラスの遺伝子は、基礎（基本）転写因子及びＰＩＣの形成に関与するＰｏｌを決定するプロモーター構造が異なる。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）は、真核細胞におけるＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝情報の流れを担う。研究により、ＧＴＦ－ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ及びＴＦＩＩＨが同定されており、これはＰｏｌ ＩＩと一緒にプロモーター部位でＰＩＣへと集合し、基礎活性レベルで転写開始を指示する。転写活性のさらなる調節は、共活性化因子によって補助される配列特異的活性化因子／抑制因子によって認識されるＤＮＡ鋳型中のシス制御エレメントに依存する。
Ｐｏｌ ＩＩコアプロモーターに見られる配列エレメントとしては、ＴＡＴＡエレメント（ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）結合部位）、ＢＲＥ（ＴＦＩＩＢ認識エレメント）、Ｉｎｒ（開始因子エレメント）及びＤＰＥ（下流プロモーターエレメント）が挙げられる。ほとんどのプロモーターは、これらのエレメントのうちの１つ又は複数を含有するが、プロモーター機能に絶対的に必須であるエレメントは１つも存在しない。プロモーターエレメントは、転写機構のサブユニットの結合部位であり、一方向の転写を指示するためにプロモーターにおいて転写機構を非対称に配向させるのに役立つ。
ＴＢＰのコアドメインは、８ｂｐのＴＡＴＡエレメントでＤＮＡに結合する分子を形成する２つの不完全な反復からなる。ＴＡＴＡ含有プロモーターにおいて、このタンパク質－ＤＮＡ複合体の形成は、転写機構のアセンブリにおける最初の工程である。ＴＡＴＡ様配列は、転写開始部位の約３０ｂｐ上流に位置する。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）は、すべての真核生物Ｐｏｌの中で最も複雑な構造を有する：酵素は、約１０ｋＤａ～約１６０ｋＤａの範囲の１７個のサブユニットからなり、６００～６８０ｋＤａの総分子量を有する。
Ｐｏｌ ＩＩＩによって転写されるクラスＩＩＩ遺伝子は、主に遺伝子内位置を有する３つの構造的に変化するプロモーターを含む。Ｐｏｌ ＩＩＩ機構の基本転写因子は、ＴＦＩＩＩＡ、ＴＦＩＩＩＢ、ＴＦＩＩＩＣ、及び低分子核内ＲＮＡ活性化タンパク質複合体（ＳＮＡＰｃ）である。
クラスＩＩＩ遺伝子（タイプ１、２、３）の異なるプロモーター上のＰＩＣのアセンブリは、Ａボックス、Ｂボックス及びＣボックスの１つ又は複数；内部制御領域（ＩＣＲ）；ＴＡＴＡボックス；遠位（ＤＳＥ）及び近位（ＰＳＥ）配列エレメントを必要とする。タイプ１の遺伝子は、＋１での転写開始に対して、＋５７の位置にＡボックス及び＋９０の位置にＣボックスを含む。タイプ２の遺伝子は、Ａボックス及びＢボックスを含む。タイプ３の遺伝子は、＋１での転写開始に対して、－２５０の位置にＤＳＥ、－６０の位置にＰＳＥ、及び－２７の位置にＴＡＴＡボックスを含む。Ａボックスが存在してもよいが、必須ではない。
３種類すべてのプロモーターでのＰｏｌ ＩＩＩの動員及び転写開始は、転写因子ＩＩＩＢ（ＴＦＩＩＩＢ）の作用を必要とし、高度に調節されている。ＴＦＩＩＩＢ結合部位は、ＴＡＴＡボックスの周囲の＋／－８ｎｔである。さらに、ＴＢＰは、３つすべてのポリメラーゼによる転写に必要である（Ｈａｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒ．４（２０１８）４０）。
３つのタイプのＰｏｌ ＩＩＩ遺伝子に関して、Ｏｌｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７（２０１０）６２０－６２８）は、１）シス調節エレメントの存在及び位置、並びに２）特定の基礎又は副転写因子の必要性に基づいて、ヒトにおいてＰｏｌ ＩＩＩを標的遺伝子及び３つの「タイプ」のＰｏｌ ＩＩＩ遺伝子に向けるために必要な因子を概説した。簡潔には、５Ｓ ｒＲＮＡは唯一のタイプ１遺伝子であり、ＴＦＩＩＩＡを独自に必要とする。タイプ１及びタイプ２の遺伝子の両方とも、タイプ１の遺伝子ではなくタイプ２の遺伝子内部Ａボックス及びＢボックスエレメントを認識する、基礎因子及び標的化複合体であるＴＦＩＩＩＣを必要とする。ＴＦＩＩＩＢ複合体は、ＴＡＴＡ／プロモーター認識及びＰｏｌ ＩＩＩ開始に必要なＴＢＰを含む。タイプ２及びタイプ３の遺伝子は、ＴＦＩＩＩＢの代替アセンブリを利用する。タイプ２の遺伝子についてはＢＲＦ１（ＴＦＩＩＩＢ関連因子１）、及びタイプ３の遺伝子についてはＢＲＦ２（ＴＦＩＩＩＢ関連因子２）。タイプ３の遺伝子は、内部Ａボックス又はＢボックスを欠き、ＴＦＩＩＩＣに依存せず、代わりに上流ＰＳＥ及びＤＳＥ並びに標的化のための特定の因子（ＯＣＴ１、ＳＮＡＰｃ、その他）に依存する。特に、３型Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、遺伝子内部エレメントではなく上流調節エレメントを利用するそれらの構造において、Ｐｏｌ ＩＩ遺伝子に似ている。
本発明による新規アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、特定の実施形態では、５’から３’方向に、
－転写開始部位（ＴＳＳ）を含むアデノウイルスＶＡ ＲＮＡＩの少なくとも６つの５’末端ヌクレオチド（後続のポリメラーゼＩＩＩ（ポリＩＩＩ）ターミネーターのバイパスを防ぐため）；
－機能的ポリメラーゼＩＩＩターミネーター（任意に存在する構成的に活性な上流プロモーターからの逆相補的ＶＡ ＲＮＡの転写を防止するため）、
－反転形態（３’から５’方向）のアデノウイルスＶＡ ＲＮＡＩ配列を、上記の順序で含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、その５’末端に融合したポリメラーゼプロモーターをさらに含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、直接又はその５’末端に融合したヌクレオチドリンカーを介して配列番号０３のＣｒｅ組換え部位をさらに含む。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、その５’末端に直接又はヌクレオチドリンカーを介して融合した配列番号０３のＣｒｅリコンビナーゼ部位、及び、その３’末端に直接又はヌクレオチドリンカーを介して融合した配列番号０６のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ配列は、配列番号６２又は配列番号８１又は配列番号８３の野生型配列の全部又は一部を含む：
ｇｇｇｃａｃｔｃｔｔ ｃｃｇｔｇｇｔｃｔｇ ｇｔｇｇａｔａａａｔ ｔｃｇｃａａｇｇｇｔ ａｔｃａｔｇｇｃｇｇ ａｃｇａｃｃｇｇｇｇ ｔｔｃｇａａｃｃｃｃ ｇｇａｔｃｃｇｇｃｃ ｇｔｃｃｇｃｃｇｔｇ ａｔｃｃａｔｇｃｇｇ ｔｔａｃｃｇｃｃｃｇ ｃｇｔｇｔｃｇａａｃ ｃｃａｇｇｔｇｔｇｃ ｇａｃｇｔｃａｇａｃ ａａｃｇｇｇｇｇａｇ ｃｇｃｔｃｃｔｔｔｔ ｇｇｃｔｔｃｃｔｔｃ ｃａｇｇｃｇｃｇｇｃ ｇｇｃｔｇｃｔｇｃｇ ｃｔａｇｃｔｔｔｔｔ ｔ．
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ配列は、変異Ｇ５８Ｔ、Ｇ５９Ｔ及びＣ６８Ａ（配列ナンバリング）（配列番号６２）を有する野生型配列の全部又は一部を含む：
ｇｇｇｃａｃｔｃｔｔ ｃｃｇｔｇｇｔｃｔｇ ｇｔｇｇａｔａａａｔ ｔｃｇｃａａｇｇｇｔ ａｔｃａｔｇｇｃｇｇ ａｃｇａｃｃｇｔｔｇ ｔｔｃｇａａｃａｃｃ ｇｇａｔｃｃｇｇｃｃ ｇｔｃｃｇｃｃｇｔｇ ａｔｃｃａｔｇｃｇｇ ｔｔａｃｃｇｃｃｃｇ ｃｇｔｇｔｃｇａａｃ ｃｃａｇｇｔｇｔｇｃ ｇａｃｇｔｃａｇａｃ ａａｃｇｇｇｇｇａｇ ｃｇｃｔｃｃｔｔｔｔ ｇｇｃｔｔｃｃｔｔｃ ｃａｇｇｃｇｃｇｇｃ ｇｇｃｔｇｃｔｇｃｇ ｃｔａｇｃｔｔｔｔｔ ｔ．
図１５は、配列番号６２及び６３の上記配列を含むアラインメントを示す。
５’末端で配列番号０３に融合し３’末端で配列番号０６に融合した本発明による前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子を、図１６（ＲＭＣＩ前）及び図１７（ＲＭＣＩ後）に示す。
特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡは、５’から３’方向に以下の配列を以下の順序で含む：
（１）ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａａｇｔｔｔａｔ ａｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔ（配列番号０３）
（１ａ）任意に、スタッファー配列ｇｇａｃｇａａａｃａ ｃｃ（配列番号６８）
（２）ｇｇｇｃａｃ（配列番号６４）
（３）ｔｔｔｔｔｔ（配列番号６５）
（４）ａｇｇａｇｃｇｃｔｃ ｃｃｃｃｇｔｔｇｔｃ ｔｇａｃｇｔｃｇｃａ ｃａｃｃｔｇｇｇｔｔ ｃｇａｃａｃｇｃｇｇ ｇｃｇｇｔａａｃｃｇ ｃａｔｇｇａｔｃａｃ ｇｇｃｇｇａｃｇｇｃ ｃｇｇａｔｃｃｇｇｔ ｇｔｔｃｇａａｃａａ ｃｇｇｔｃｇｔｃｃｇ ｃｃａｔｇａｔａｃｃ ｃｔｔｇｃｇａａｔｔ ｔａｔｃｃａｃｃａｇ ａｃｃａｃｇｇａａｇ ａｇｔｇｃｃｃ
（配列番号６６）
（５）ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａｔａｔａａａｃ ｔｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔ（配列番号０６）
特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、以下の配列を含む：
ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａａｇｔｔｔａｔ ａｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔｇｇａｃｇａ ａａｃａｃｃｇｇｇｃ ａｃｔｔｔｔｔｔｃａ ｇｔｇｇｃｃａａａａ ａａｇｃｔａｇｃｇｃ ａｇｃａｇｃｃｇｃｃ ｇｃｇｃｃｔｇｇａａ ｇｇａａｇｃｃａａａ ａｇｇａｇｃｇｃｔｃ ｃｃｃｃｇｔｔｇｔｃ ｔｇａｃｇｔｃｇｃａ ｃａｃｃｔｇｇｇｔｔ ｃｇａｃａｃｇｃｇｇ ｇｃｇｇｔａａｃｃｇ ｃａｔｇｇａｔｃａｃ ｇｇｃｇｇａｃｇｇｃ ｃｇｇａｔｃｃｇｇｔ ｇｔｔｃｇａａｃａａ ｃｇｇｔｃｇｔｃｃｇ ｃｃａｔｇａｔａｃｃ ｃｔｔｇｃｇａａｔｔ ｔａｔｃｃａｃｃａｇ ａｃｃａｃｇｇａａｇ ａｇｔｇｃｃｃｇｇｔ ｇｔｔｔｃｇｔｃｃｔ ａｃｃｇｔｔｃｇｔａ ｔａｔａｔａａａｃｔ ｔａｔａｃｇａａｇｔ ｔａｔ
（配列番号６７）。
特定の実施形態では、本発明によるＬｘ－ＬＥ部位は、適切な間隔のためのスタッファー配列を含む以下の配列を含む：
ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａａｇｔｔｔａｔ ａｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔｇｇａｃｇａ ａａｃａｃｃ
（配列番号６９）。
本発明の別の態様は、本発明によるアデノウイルスＶＡ ＲＮＡを元の形態又は反転形態のいずれかで含む細胞である。
本発明によるＤＮＡエレメント及びＤＮＡ分子を含む例示的な使用及び方法
本発明による二本鎖ＤＮＡエレメント又は分子並びに任意の核酸は、組換えＡＡＶベクター及びそれを含む組換えＡＡＶ粒子の産生に使用することができる。
ｒＡＡＶ粒子を生成するための当技術分野で公知の様々な方法。例えば、１つのＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）との同時感染と併せてＡＡＶプラスミド及びＡＡＶヘルパー配列を使用するトランスフェクション、又は組換えＡＡＶプラスミド、ＡＡＶヘルパープラスミド、及びヘルパー機能プラスミドによるトランスフェクション。ｒＡＡＶ粒子を生成するための非限定的な方法は、例えば、米国特許第６，００１，６５０号、米国特許第６，００４，７９７号、国際公開第２０１７／０９６０３９号及び国際公開第２０１８／２２６８８７号に記載されている。組換えｒＡＡＶ粒子産生（すなわち、細胞培養系における粒子生成）後、ｒＡＡＶ粒子を宿主細胞及び細胞培養上清から得て精製することができる。
本発明の態様は、本発明による核酸（例えば、プラスミド）などの分子を細胞に形質導入する方法及びそれぞれの遺伝子産物の産生である。さらに、そのような細胞は、ウイルスパッケージングタンパク質及び／又はヘルパータンパク質をコードするプラスミドなどの配列で形質導入された場合、目的のタンパク質をコードする核酸を含むか、又は目的の転写産物に転写される配列を含む組換えウイルス粒子を産生することができ、そのうちの少なくとも１つは本発明によるＤＮＡエレメント又は核酸を含み、それは次に組換えウイルス粒子を高収率で産生する。
本発明は、本発明による核酸又はＤＮＡ（エレメント）を使用することによって現在の「業界標準」ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子製造プロセスから区別される特徴を含むウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子製造プラットフォームを提供する。
核酸（プラスミド）を議論する際に、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造を、５’から３’方向に配列を提供する慣例に従って本明細書に記載することができる。
より一般的には、本発明によるＤＮＡエレメント又は核酸でトランスフェクト又は形質導入されたそのような細胞は、「組換え細胞」と呼ぶことができる。そのような細胞は、例えば、ＡＡＶパッケージングタンパク質などのパッケージングタンパク質をコードする核酸（プラスミド）、ヘルパータンパク質をコードする核酸（プラスミド）、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸（プラスミド）、すなわち２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に配置された導入遺伝子、又は他の導入核酸（プラスミド）のレシピエントとして使用されている酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞であり得、そのうちの少なくとも１つは本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む。この用語は、形質導入又はトランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、天然、偶発的又は意図的な変異のために、元の親と形態又はゲノム若しくは全核酸相補体が必ずしも完全に同一ではない場合があることが理解される。
細胞生存性を維持するため、又は細胞の成長及び／又は増殖を提供するために適切な多数の細胞成長培地が市販されているか、又は容易に製造することができる。そのような培地の例としては、生存率を維持するための培地又は哺乳動物（例えば、ヒト）細胞の成長を提供するための培地などの無血清真核生物成長培地が挙げられる。非限定的な例としては、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２又はＦ１２Ｋ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（ＦＳ）Ｆ１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びそれらの混合物が挙げられる。そのような培地には、ビタミン及び／又は微量ミネラル及び／又は塩及び／又はアミノ酸、例えば哺乳動物（例えば、ヒト）細胞のための必須アミノ酸が補充され得る。
ヘルパータンパク質プラスミドは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態であり得る。特に、アデノウイルス遺伝子の完全相補体はヘルパー機能に必要ではないことが実証されている。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成が不可能なアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製を許容することが示されている。Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９（１９７０）２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５（１９７１）３１７。
Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体はＡＡＶ複製を支持することが示されており、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域がおそらくヘルパー機能の提供に関与しないことを示している。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６（１９８３）５０５。しかしながら、Ｅ１領域に欠陥がある、又はＥ４領域が欠失しているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支援することができない。したがって、アデノウイルスヘルパータンパク質の場合、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接的又は間接的のいずれかでＡＡＶ複製に必要とされる可能性が高い（例えば、Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１（１９８２）８６８；Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（１９８１）１９２５；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６（１９８３）５０５を参照）。他の特徴的なアデノウイルス変異体としては、以下のものが挙げられる：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）、前出；Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９８１）、前出；Ｏｓｔｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４（１９８０）５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９（１９７５）２３９；Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７（１９７６）１４０；Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５（１９８０）６６５；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（１９８１）２９２７；Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（１９８１）５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｉｎ Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．，１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）、前出）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）、前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。
Ｅ１Ｂに変異を有するアデノウイルスによって提供されるヘルパータンパク質の研究は、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａタンパク質がＡＡＶ粒子産生に必要であるが、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａタンパク質は必要ではないことを報告している。さらに、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５（１９９８）９３８－９４５）は、様々なアデノウイルス遺伝子をコードするヘルパー機能プラスミドを記載した。ヘルパープラスミドの例は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤａコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及びインタクトＥ１Ｂ ５５ｋＤａコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む（例えば、国際公開第０１／８３７９７号を参照のこと）。
したがって、本明細書では、本発明によるＤＮＡエレメント又は核酸若しくはＤＮＡを使用して、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を産生する方法が提供される。
本発明の一態様は、タンパク質をコードする核酸又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又は前記組換えＡＡＶベクターを含むＡＡＶ粒子を産生する方法であって、
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドを提供する工程であって、その少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む、１つ又は複数のプラスミドを提供する工程；
（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする、又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドを提供する工程；
（ｉｉｉ）１つ又は複数の哺乳動物細胞又は昆虫細胞を提供されたプラスミドと接触させる工程；
（ｉｖ）トランスフェクション試薬をさらに添加し、任意に、プラスミド／トランスフェクション試薬／細胞混合物をインキュベートする工程；又は電流などの物理的手段を提供して、核酸を細胞に導入する工程；
（ｖ）トランスフェクトされた細胞を培養し、培養中のある時点／培養時間でＲＭＣＩを誘導する工程；
（ｖｉ）培養された細胞及び／又は培養培地を培養された細胞から回収して、細胞及び／又は培養培地の回収物を生成する工程；及び
（ｖｉｉ）組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を細胞及び／又は培養培地回収物から単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードするか、又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を産生する工程を含む方法である。
本発明の一態様は、タンパク質をコードする核酸又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又は前記組換えＡＡＶベクターを含むＡＡＶ粒子を産生する方法であって、
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドを提供する工程であって、その少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む、１つ又は複数のプラスミドを提供する工程；
（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする、又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドを提供する工程；
（ｉｉｉ）１つ又は複数の哺乳動物細胞又は昆虫細胞を（ｉ）の提供されたプラスミドと接触させる工程；
（ｉｖ）トランスフェクション試薬をさらに添加し、任意に、プラスミド／トランスフェクション試薬／細胞混合物をインキュベートする工程；又は電流などの物理的手段を提供して、核酸を細胞に導入する工程；
（ｖ）安定にトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（ｖｉ）（ｖ）の選択された細胞を（ｉｉ）の提供されたプラスミドと接触させる工程；
（ｖｉｉ）トランスフェクション試薬をさらに添加し、任意に、プラスミド／トランスフェクション試薬／細胞混合物をインキュベートする工程；又は電流などの物理的手段を提供して、核酸を細胞に導入する工程；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉｉ）のトランスフェクトされた細胞を培養し、培養中のある時点／培養時間でＲＭＣＩを誘導する工程；
（ｉｘ）培養された細胞及び／又は培養培地を培養された細胞から回収して、細胞及び／又は培養培地の回収物を生成する工程；及び
（ｘ）組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を細胞及び／又は培養培地回収物から単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードするか、又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を産生する工程を含む方法である。
本発明の一態様は、タンパク質をコードする核酸又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又は前記組換えＡＡＶベクターを含むＡＡＶ粒子を産生する方法であって、
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞又は昆虫細胞を提供する工程であって、その少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む、哺乳動物細胞又は昆虫細胞を提供する工程；
（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする、又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉ）の細胞を（ｉｉ）の提供されたプラスミドと接触させる工程；
（ｉｖ）トランスフェクション試薬をさらに添加し、任意に、プラスミド／トランスフェクション試薬／細胞混合物をインキュベートする工程；又は電流などの物理的手段を提供して、核酸を細胞に導入する工程；
（ｖ）安定にトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（ｖｉ）（ｖ）の安定にトランスフェクトされた細胞を培養し、培養中のある時点／培養時間でＲＭＣＩを誘導する工程；
（ｖｉｉ）培養された細胞及び／又は培養培地を培養された細胞から回収して、細胞及び／又は培養培地の回収物を生成する工程；及び
（ｖｉｉｉ）組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を細胞及び／又は培養培地回収物から単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードするか、又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を産生する工程を含む方法である。
本発明のＤＮＡエレメント又はＤＮＡ分子を含む核酸の細胞への導入は、複数の方法で行うことができる。
哺乳動物細胞へのＤＮＡ移入のための多様な方法が当技術分野で報告されている。これらはすべて、本発明による方法において有用である。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、核酸移入／トランスフェクションのためのエレクトロポレーション、ヌクレオフェクション又はマイクロインジェクションが使用される。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、無機物質（例えばリン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿など）、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ＤＥＡＥ－デキストランなど）又はカチオン性脂質（リポフェクション）が核酸移入／トランスフェクションに使用される。リン酸カルシウム及びポリエチレンイミンは、より大きな規模での核酸移入のためのトランスフェクションのために最も一般的に使用される試薬であり（例えば、Ｂａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９（２００７）６７７－６８４を参照）、ポリエチレンイミンが好ましい。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明によるＤＮＡエレメント又はＤＮＡ分子を含む核酸は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と組み合わせて、任意に細胞と組み合わせて、組成物において提供される。特定の実施形態では、組成物は、以下の複数の成分を有するプラスミド／ＰＥＩ混合物を含む：（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドであって、その少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む、１つ又は複数のプラスミド；（ｂ）タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミド；（ｃ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液。特定の実施形態では、プラスミドは、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲にあるか、又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲にあり、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の混合物は、任意に、約１０秒～約４時間の期間インキュベートされている。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、組成物は細胞をさらに含む。特定の実施形態では、細胞は、成分（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）のプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触している。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、組成物は、任意に細胞と組み合わせて、遊離ＰＥＩをさらに含む。特定の実施形態では、細胞は遊離ＰＥＩと接触している。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、細胞は、成分（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の混合物と少なくとも約４時間、又は約４時間～約１４０時間、又は約４時間～約９６時間接触している。好ましい一実施形態では、細胞は、成分（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）、並びに任意に遊離ＰＥＩの混合物と少なくとも約４時間接触している。
本発明によるＤＮＡエレメント又はＤＮＡ分子を含む核酸に加えて、組成物はさらなるプラスミドを含み得る。そのようなプラスミド及び細胞は、遊離ＰＥＩと接触していてもよい。特定の実施形態では、プラスミド及び／又は細胞は、少なくとも約４時間、又は約４時間～約１４０時間、又は約４時間～約９６時間、遊離ＰＥＩと接触している。
本発明はまた、本発明のＤＮＡエレメント又はＤＮＡ分子を含む核酸を使用してトランスフェクト細胞を作製する方法を提供する。この方法は、本発明のＤＮＡエレメント又はＤＮＡ分子と、任意に１つ又は複数のさらなるプラスミドとを含む核酸を提供する工程；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を提供する工程；及び、核酸と任意にプラスミドをＰＥＩ溶液と混合して、核酸／プラスミド／ＰＥＩ混合物を生成する工程を含む。特定の実施形態では、そのような混合物は、約１０秒～約４時間の範囲の期間インキュベートされる。そのような方法では、次いで、細胞を核酸／プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、核酸／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生成する。次いで、遊離ＰＥＩを、遊離ＰＥＩ／核酸／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するために産生された核酸／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に添加する。次いで、産生された遊離ＰＥＩ／核酸／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートし、それによりトランスフェクト細胞を産生する。特定の実施形態では、プラスミドは、タンパク質をコードするか、又は目的の転写産物に転写される核酸を含む。
組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を産生するトランスフェクト細胞を産生する方法であって、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドを提供することであって、その少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む、１つ又は複数のプラスミドを提供すること；タンパク質をコードする、又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドを提供すること；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を提供すること；前述のプラスミドをＰＥＩ溶液と混合することであって、プラスミドが、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲にあるか、又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲にあり、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生成すること（及び任意に、プラスミド／ＰＥＩ混合物を約１０秒～約４時間の範囲の期間インキュベートすること）；細胞をプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生すること；産生されたプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生すること；及び、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートし、それにより、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又は粒子を産生するトランスフェクト細胞を産生することを含む、方法がさらに提供される。
タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を産生する方法であって、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドを提供することであって、その少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む、１つ又は複数のプラスミドを提供すること；目的のタンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドを提供すること；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を提供すること；前述のプラスミドをＰＥＩ溶液と混合することであって、プラスミドが、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲にあるか、又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲にあり、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生成すること（及び任意に、プラスミド／ＰＥＩ混合物を約１０秒～約４時間の範囲の期間インキュベートすること）；細胞を、記載されるように産生されたプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生すること；記載されるように産生されたプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生すること；プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又は産生された遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートして、トランスフェクトされた細胞を産生すること；産生されたトランスフェクト細胞から、産生されたトランスフェクト細胞及び／又は培養培地を回収して、細胞及び／又は培養培地回収物を産生すること；及び、産生された細胞及び／又は培養培地回収物から組換えＡＡＶベクター又は粒子を単離及び／又は精製し、それにより、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又は粒子を産生することを含む、方法がさらに提供される。
本発明によるＤＮＡエレメントを使用して組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を作製する方法は、１つ又は複数のさらなる工程又は特徴を含むことができる。例示的な工程又は特徴には、産生された培養細胞を回収して、及び／又は産生された培養細胞から培養培地を回収して、細胞及び／又は培養培地回収物を産生する工程が含まれるが、これらに限定されない。更なる例示的な工程又は特徴としては、限定されないが、組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を細胞及び／又は培養培地回収物から単離及び／又は精製し、それにより、タンパク質をコードするか、又は目的の転写産物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクター又はＡＡＶ粒子を産生する工程が挙げられる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＰＥＩは、様々な時点でプラスミド及び／又は細胞に添加される。特定の実施形態では、遊離ＰＥＩは、プラスミド／ＰＥＩ混合物を細胞と接触させる前、それと同時に、又はその後に細胞に添加される。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触した場合及び／又は遊離ＰＥＩと接触した場合に、特定の密度及び／又は細胞増殖期及び／又は生存率である。好ましい一実施形態では、細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触した場合及び／又は遊離ＰＥＩと接触した場合、約１×１０Ｅ５細胞／ｍＬ～約１×１０Ｅ８細胞／ｍＬの範囲の密度である。特定の実施形態では、プラスミド／ＰＥＩ混合物又は遊離ＰＥＩと接触させた場合の細胞の生存率が約６０％又は６０％超であるか、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させた場合に細胞が対数増殖期にあるか、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物又は遊離ＰＥＩと接触させた場合の細胞の生存率が約９０％又は９０％超であるか、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物又は遊離ＰＥＩと接触させた場合に細胞が対数増殖期にある。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質にはＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ ｃａｐが含まれる。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、そのようなＡＡＶパッケージングタンパク質には、任意のＡＡＶ血清型のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ ｃａｐタンパク質が含まれる。
コードされたヘルパータンパク質には、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、アデノウイルスＥ２及び／又はＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質、及び／又は非ＡＡＶヘルパータンパク質が含まれる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、核酸（プラスミド）は、特定の量又は比で使用される。特定の実施形態では、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドであって、そのうちの少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含むプラスミドの総量は、細胞ｍＬあたり約０．１μｇ～約１５μｇの範囲である。特定の実施形態では、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドであって、そのうちの少なくとも１つが本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含むプラスミドのモル比は、約１：５～約１：１の範囲内、又は約１：１～約５：１の範囲内である。
プラスミドは、異なる又は同じプラスミド上の核酸を含むことができる。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、第１のプラスミドはＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含み、第２のプラスミドはヘルパータンパク質をコードする核酸を含む。これらの核酸の少なくとも１つは、本発明によるＤＮＡエレメント又は分子を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミドと、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２のプラスミドとのモル比は、同時トランスフェクションにおいて約１～５：１：１、又は１：１～５：１、又は１：１：１～５の範囲である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、細胞は真核細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。１つの好ましい実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞である。
培養は、真核細胞の培養に一般的に使用される約３７°Ｃ、９５％湿度及び８体積％ＣＯ２の条件を使用して行うことができる。培養は、血清含有培地又は無血清培地、接着培養又は懸濁培養で行うことができる。懸濁培養は、例えば撹拌タンクリアクタ、ウェーブリアクタ、シェーカー容器若しくはスピナ容器、又はいわゆるローラーボトルなどの任意の発酵容器で行うことができる。トランスフェクションは、それぞれハイスループット形式及びスクリーニングで、例えば９６又は３８４ウェル形式で行うことができる。
本発明による方法は、任意の血清型のＡＡＶ粒子又はそのバリアントを含む。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１～１２、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシドタンパク質、又は改変若しくはバリアントＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシドタンパク質、又は野生型ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシドタンパク質のいずれかを含む。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型又はＡＡＶシュードタイプを含み、ＡＡＶシュードタイプは、ＩＴＲ血清型とは異なるＡＡＶキャプシド血清型を含む。
ＡＡＶベクター又は粒子を提供又は含む本発明による方法はまた、他のエレメントを含むことができる。そのようなエレメントの例としては、イントロン、発現制御エレメント、１つ又は複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び／又はフィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエレメントは、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸内に存在し得るか又は隣接し得るか、又は発現制御エレメントは、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸に作動可能に連結され得るか、又はＡＡＶ ＩＴＲは、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸の５’末端又は３’末端に隣接し得るか、又はフィラーポリヌクレオチド配列は、タンパク質をコードするか又は目的の転写産物に転写される核酸の５’末端又は３’末端に隣接し得る。
発現制御エレメントには、組織特異的発現制御エレメント又はプロモーター（例えば、肝臓における発現を提供する）などの構成的又は調節可能な制御エレメントが含まれる。
ＩＴＲは、以下のいずれかであり得る：ＡＡＶ２若しくはＡＡＶ６若しくはＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９血清型、又はそれらの組み合わせ。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ－２ｉ８又はＡＡＶ ｒｈ７４ ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシドタンパク質のいずれかに対して７５％以上の配列同一性を有する任意のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシドタンパク質を含むことができ、あるいは下記のいずれかから選択される改変又はバリアントＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシドタンパク質を含む：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ－２ｉ８及びＡＡＶ ｒｈ７４ ＡＡＶ血清型。
本明細書に記載の組換えウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子の産生後、所望であれば、ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）粒子は、様々な従来の方法を用いて宿主細胞から精製及び／又は単離することができる。そのような方法としては、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配などが挙げられる。例えば、陰イオン交換カラム、アフィニティーカラム及び／又は陽イオン交換カラムによる精製などの複数のカラム精製工程を使用することができる。（例えば、ＷＯ ０２／１２４５５及びＵＳ ２００３／０２０７４３９を参照されたい）。代替的又は追加的に、ＣｓＣｌ勾配工程を使用することができる（例えば、ＵＳ ２０１２／０１３５５１５；及びＵＳ ２０１３／００７２５４８を参照されたい）。さらに、感染性ウイルスの使用を使用してパッケージング及び／又はヘルパータンパク質を発現させる場合、様々な方法を使用して、残留ウイルスを不活性化することができる。例えば、アデノウイルスは、約６０°Ｃの温度に例えば２０分以上加熱することによって不活性化することができる。ＡＡＶは熱安定性であるが、ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるので、この処理はヘルパーウイルスを効果的に不活性化する。
ＡＡＶ血清型及びそのバリアントを含むパルボウイルス粒子などのウイルスベクターは、細胞がコードされたタンパク質を発現するようにタンパク質をコードする、エクスビボ、インビトロ及びインビボでの細胞への核酸の送達手段を提供する。ＡＡＶは、核酸／遺伝物質が細胞内で安定に維持され得るように、細胞に浸透し、核酸／遺伝物質を導入することができるので、遺伝子治療ベクターとして有用なウイルスである。さらに、これらのウイルスは、例えば、核酸／遺伝物質を特定の部位に導入することができる。ＡＡＶはヒトにおける病原性疾患に関連しないので、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶの病因又は疾患を引き起こすことなく、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質及び薬剤）をヒト患者に送達することができる。
使用され得るウイルスベクターには、複数の血清型（例えば、ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２など）のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子及びハイブリッド／キメラＡＡＶ粒子が含まれるが、これらに限定されない。
ＡＡＶ粒子は、効果的な遺伝子送達のためのビヒクルとして有利に使用され得る。そのような粒子は、***細胞及び非***細胞に対する指向性を含む、そのような用途のためのいくつかの望ましい特徴を有する。これらのベクターを用いた初期の臨床経験でも、持続的な毒性は示されず、免疫応答は最小限であるか、又は検出不可能であった。ＡＡＶは、受容体媒介性エンドサイトーシス又はトランスサイトーシスによってインビボ及びインビトロで多種多様な細胞型に感染することが知られている。これらのベクター系は、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節及び造血幹細胞を標的とするヒトにおいて試験されている。
組換えＡＡＶ粒子は、典型的には、病因に関連するウイルス遺伝子を含まない。そのようなベクターは、典型的には、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子など、全体的又は部分的に欠失された野生型ＡＡＶ遺伝子の１つ又は複数を有するが、組換えベクターのＡＡＶ粒子へのレスキュー、複製及びパッケージングのために必要に応じて、少なくとも１つの機能的隣接ＩＴＲ配列を保持する。例えば、ベクターの必須部分、例えば、それぞれＩＴＲエレメント及びＬＴＲエレメントのみが含まれる。したがって、ＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングのためにシスに必要な配列（例えば、機能的ＩＴＲ配列）を含むであろう。
組換えＡＡＶベクター、並びにその方法及び使用には、任意のウイルス株又は血清型が含まれる。非限定的な例として、組換えＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶゲノム、例えばＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、２ｉ８、又はＡＡＶ ｒｈ７４に基づくことができる。そのようなベクターは、同じ株若しくは血清型（又はサブグループ若しくはバリアント）に基づくことができ、又は互いに異なることができる。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく組換えＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングするキャプシドタンパク質の１つ又は複数と同一であり得る。さらに、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするＡＡＶキャプシドタンパク質の１つ又は複数とは異なるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づくことができる。例えば、ＡＡＶベクターゲノムはＡＡＶ２に基づくことができるが、３つのキャプシドタンパク質の少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、又はＡＡＶ ｒｈ７４又はそのバリアントであり得る。ＡＡＶバリアントには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８及びＡＡＶ ｒｈ７４キャプシドのバリアント及びキメラが含まれる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターには、例えば、国際公開第２０１３／１５８８７９号、国際公開第２０１５／０１３３１３号及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書（ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３などを開示）に記載されているように、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、及びＡＡＶ ｒｈ７４、並びにそれらのバリアント（例えば、キャプシドバリアント、例えばアミノ酸の挿入、付加、置換及び欠失）が含まれる。
ＡＡＶ及びＡＡＶバリアント（例えば、キャプシドバリアント）血清型（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列）は、例えばＡＡＶ１～ＡＡＶ１２を含む他のＡＡＶ血清型と区別されてもされなくてもよい（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２血清型のいずれかのＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列とは異なる）。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、参照血清型に関連するＡＡＶ粒子は、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８又はＡＡＶ ｒｈ７４（例えば、ＩＴＲ配列、あるいは、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列など）と少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など）同一の配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチド、ポリペプチド又はその部分配列を有する。
本発明の組成物、方法及び使用には、ＡＡＶ配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）、並びにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、又はＡＡＶ ｒｈ７４などの参照ＡＡＶ血清型に対して１００％未満の配列同一性を示すが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、又はＡＡＶ ｒｈ７４遺伝子又はタンパク質などの既知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質とは区別され、同一ではないその部分配列が含まれる。すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＡＡＶポリペプチド又はその部分配列は、任意の参照ＡＡＶ配列又はその部分配列、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、又はＡＡＶ ｒｈ７４（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシド又はＩＴＲ）と少なくとも７５％以上同一の配列、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大１００％同一の配列を含むか又はこれからなる。特定の実施形態では、ＡＡＶバリアントは、１、２、３、４、５、５～１０、１０～１５、１５～２０又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、又はＡＡＶ ｒｈ７４、並びにバリアント、関連、ハイブリッド及びキメラ配列を含む組換えＡＡＶ粒子は、１つ又は複数の機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する１つ又は複数の核酸配列（導入遺伝子）を含むように、当業者に公知の組換え技術を使用して構築することができる。
組換え粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、とりわけ、インビボ又はエクスビボでの対象への投与及び送達に有用である。特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体又は賦形剤を含有する。そのような賦形剤には、それ自体が組成物を受ける個体に有害な免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品が含まれる。
アデノウイルスベクターの生成のためのプロトコルは、米国特許第５，９９８，２０５号；米国特許第６，２２８，６４６号；米国特許第６，０９３，６９９号；米国特許第６，１００，２４２号；国際公開第９４／１７８１０号及び国際公開第９４／２３７４４号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヒトに対する病原性にもかかわらず、ｒＡＡＶベクター産生及び精製システムの目的は、野生型／偽野生型ＡＡＶ種（ｗｔＡＡＶ）及びＡＡＶ封入残留ＤＮＡ不純物を含むタンパク質、核酸及びベクター関連不純物などの産生関連不純物の生成を最小限に抑える／制御する戦略を実施することである。
ｒＡＡＶ粒子がバイオマスのごくわずかな画分を表すことを考慮すると、ｒＡＡＶ粒子は、臨床ヒト遺伝子治療製品として使用することができる純度のレベルまで精製する必要がある（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｐ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７（２００３）８３４８；Ｃｈａｄｅｕｆ Ｇ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏ．Ｔｈｅｒａｐｙ １２（２００５）７４４；ＣＨＭＰ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｅｘｐｅｒｔ ｇｒｏｕｐ ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ ２００５，１８３９８９／２００４からの報告を参照のこと）。
最初の工程として、典型的には、ｒＡＡＶ粒子を産生する培養細胞を、任意に、ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞（懸濁液又は接着）が培養された回収細胞培養上清（培地）と組み合わせて回収する。回収された細胞及び任意に細胞培養上清は、必要に応じてそのまま、又は濃縮して使用され得る。さらに、ヘルパー機能を発現するために感染が使用される場合、残留ヘルパーウイルスは不活性化され得る。例えば、アデノウイルスは、約６０°Ｃの温度に例えば２０分以上加熱することによって不活性化することができ、これは、ＡＡＶが熱安定性である一方でヘルパーアデノウイルスが熱不安定性であるので、ヘルパーウイルスのみを不活性化する。
細胞及び／又は回収物の上清を、細胞を破壊することによって、例えば、洗剤、マイクロ流動化及び／又は均質化などの化学的又は物理的手段によって溶解して、ｒＡＡＶ粒子を放出する。細胞溶解中又はその後の細胞溶解後に、ヌクレアーゼ、例えばベンゾナーゼを添加して汚染ＤＮＡを分解する。典型的には、得られた溶解物は、例えば濾過又は遠心分離によって細胞破片を除去するために清澄化され、清澄化された細胞溶解物を与える。特定の例では、溶解物をミクロン直径の孔径フィルタ（例えば０．１～１０．０μｍの孔径のフィルタ、例えば０．４５μｍ及び／又は０．２μｍの孔径のフィルタ）で濾過して、清澄化された溶解物を生成する。
溶解物（任意に清澄化される）は、ＡＡＶ粒子（ｒＡＡＶベクター並びに空のキャプシドを含む）並びに産生／プロセス関連不純物、例えばとりわけ細胞タンパク質、脂質及び／又は核酸を含み得る宿主細胞からの可溶性細胞成分、並びに細胞培養培地成分を含有する。次いで、任意に清澄化された溶解物を精製工程に供して、クロマトグラフィーを使用して不純物からＡＡＶ粒子（ｒＡＡＶベクターを含む）を精製する。清澄化された溶解物は、第１のクロマトグラフィー工程の前に適切な緩衝液で希釈又は濃縮され得る。
細胞溶解、任意の清澄化、及び任意の希釈又は濃縮の後、複数のその後の連続的なクロマトグラフィー工程を使用してｒＡＡＶ粒子を精製することができる。
第１のクロマトグラフィー工程は、陽イオン交換クロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。第１のクロマトグラフィー工程が陽イオン交換クロマトグラフィーである場合、第２のクロマトグラフィー工程は陰イオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）であり得る。したがって、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子精製は、陽イオン交換クロマトグラフィーによるものであり、その後、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製が続く。
あるいは、第１のクロマトグラフィー工程が陽イオン交換クロマトグラフィーである場合、第２のクロマトグラフィー工程はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）であり得る。したがって、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子精製は、陽イオン交換クロマトグラフィーによるものであり、その後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製が続く。
さらに代替的には、第１のクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィーであってもよい。第１のクロマトグラフィー工程がアフィニティークロマトグラフィーである場合、第２のクロマトグラフィー工程は陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。したがって、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子精製は、アフィニティークロマトグラフィーによるものであり、その後、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製が続く。
任意に、第３のクロマトグラフィーを前述のクロマトグラフィー工程に追加することができる。典型的には、任意の第３のクロマトグラフィー工程は、陽イオン交換、陰イオン交換、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーに続く。
したがって、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子精製は、陽イオン交換クロマトグラフィーによるものであり、引き続いて陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製が行われる。
さらに、すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、さらなるｒＡＡＶ粒子精製は、陽イオン交換クロマトグラフィーによるものであり、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製、引き続いて陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製が行われる。
すべての態様及び実施形態のさらなるの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子精製は、アフィニティークロマトグラフィーによるものであり、引き続いて陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製が行われる。
すべての態様及び実施形態のさらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子精製は、アフィニティークロマトグラフィーによるものであり、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製、引き続いて陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製が行われる。
陽イオン交換クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーから清澄化された溶解物及び／又はカラム溶出液中に存在する細胞成分及び他の成分からＡＡＶ粒子を分離するように機能する。広いｐＨ範囲にわたってｒＡＡＶ粒子に結合することができる強カチオン交換樹脂の例としては、限定されないが、スルホプロピル又はスルホエチル樹脂などのアリール及びアルキル置換スルホネートを含む、スルホネート官能基の存在によって示される任意のスルホン酸系樹脂が挙げられる。代表的なマトリックスには、ＰＯＲＯＳ ＨＳ、ＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、ＰＯＲＯＳ ＳＰ、及びＰＯＲＯＳ Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能な強カチオン交換体）が含まれるが、これらに限定されない。さらなる例としては、Ｃａｐｔｏ Ｓ，Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ，Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能な強カチオン交換体）、並びにＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｌｉｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手可能な市販のＤＯＷＥＸ（登録商標）、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）、及びＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）樹脂ファミリーが挙げられる。弱いカチオン交換樹脂としては、限定されないが、任意のカルボン酸系樹脂が挙げられる。例示的な陽イオン交換樹脂としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、ホスホ（ホスフェート官能基に基づく）、スルホン酸メチル（Ｓ）及びスルホプロピル（ＳＰ）樹脂が挙げられる。
陰イオン交換クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーから清澄化された溶解物及び／又はカラム溶出液中に存在するタンパク質、細胞成分及び他の成分からＡＡＶ粒子を分離するように機能する。陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、溶出液中の空のキャプシドの量を減少させ、それによって制御することもできる。例えば、ｒＡＡＶ粒子が結合した陰イオン交換カラムを、中程度の濃度（例えば、約１００～１２５ｍＭ、例えば１１０～１１５ｍＭ）のＮａＣｌを含む溶液で洗浄することができ、ｒＡＡＶ粒子を実質的に溶出することなく、空のキャプシドの一部をフロースルーで溶出することができる。続いて、陰イオン交換カラムに結合したｒＡＡＶ粒子を、より高い濃度（例えば、約１３０～３００ｍＭ ＮａＣｌ）のＮａＣｌを含む溶液を用いて溶出させることにより、減少又は枯渇した量の空キャプシド及び比例して増加した量のｒＡＡＶベクター含有ｒＡＡＶ粒子を有するカラム溶出液を生成することができる。
例示的な陰イオン交換樹脂としては、限定されないが、ポリアミン樹脂及び他の樹脂に基づくものが挙げられる。強陰イオン交換樹脂の例としては、限定されないが、トリアルキルベンジルアンモニウム樹脂などの第４級アンモニウム塩樹脂を含む、一般に第４級化窒素原子に基づくものが挙げられる。適切な交換クロマトグラフィー材料としては、限定されないが、ＭＡＣＲＯ ＰＲＥＰ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な強アニオン交換体）；ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な強アニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な強アニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ＸＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な強アニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ＳＯＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な弱アニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な弱アニオン交換体）；Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＸＱ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、及びＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能な強力なアニオン交換体）；ＤＥＡＥセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手可能な弱アニオン交換体）；Ｑセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手可能な強力なアニオン交換体）が挙げられる。さらなる例示的な陰イオン交換樹脂としては、アミノエチル（ＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジエチルアミノプロピル（ＤＥＰＥ）及び第四級アミノエチル（ＱＡＥ）が挙げられる。
ヒト疾患を処置するための製品として意図された組換えＡＡＶ粒子を精製するための製造プロセスは、以下の目的を達成すべきである。１）一貫した粒子純度、効力及び安全性；２）製造プロセスのスケーラビリティ；３）許容され得る製造コスト。
組換えＡＡＶ粒子精製の例示的なプロセスは、国際公開第２０１９／００６３９０号に報告されている。
以下に概説する組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）の精製及び製造方法は、大規模にまで拡大可能である。例えば、５、１０、１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～２００又はそれよりも多くのリットル容積の懸濁培養物まで。組換えアデノ随伴ウイルス粒子の精製及び産生方法は、多種多様なＡＡＶ血清型／キャプシドバリアントに適用可能である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の精製は以下の工程を含む：
（ａ）細胞及び／又はｒＡＡＶ粒子を含む細胞培養上清を回収して回収物を生成する工程；
（ｂ）任意に、工程（ａ）で生成された回収物を濃縮して、濃縮された回収物を生成する工程；
（ｃ）工程（ａ）で生成された回収物又は工程（ｂ）で生成された濃縮回収物を溶解して溶解物を生成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で生成された溶解物を処理して、溶解物中の汚染核酸を減少させ、それにより核酸減少溶解物を生成する工程；
（ｅ）任意に、工程（ｄ）で生成された核酸減少溶解物を濾過して清澄化溶解物を生成し、任意に、清澄化溶解物を希釈して希釈清澄化溶解物を生成する工程；
（ｆ）工程（ｄ）の核酸減少溶解物、工程（ｅ）の清澄化溶解物又は工程（ｅ）で生成された希釈清澄化溶解物を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、ｒＡＡＶ粒子を含むカラム溶出液を生成し、それにより、タンパク質不純物又は他の製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意にカラム溶出液を希釈して希釈カラム溶出液を生成する工程；
（ｇ）工程（ｆ）で生成されたカラム溶出液又は希釈カラム溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーに供してｒＡＡＶ粒子を含む第２のカラム溶出液を生成し、それによってタンパク質不純物又は製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意に第２のカラム溶出液を濃縮して、濃縮された第２のカラム溶出液を生成する工程；
（ｈ）工程（ｇ）で生成された第２のカラム溶出液又は濃縮された第２のカラム溶出液をサイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供して、ｒＡＡＶ粒子を含む第３のカラム溶出液を生成し、それによってタンパク質不純物又は製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意に第３のカラム溶出液を濃縮して、濃縮された第３のカラム溶出液を生成する工程；及び
（ｉ）工程（ｈ）で生成された第３のカラム溶出液又は濃縮された第３のカラム溶出液を濾過し、それにより、精製されたｒＡＡＶ粒子を生成する工程。
特定の実施形態では、工程（ａ）～（ｆ）は維持され、以下の工程と組み合わされる。
（ｇ）工程（ｆ）で生成されたカラム溶出液又は濃縮されたカラム溶出液をサイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供して、ｒＡＡＶ粒子を含む第２のカラム溶出液を生成し、それによってタンパク質不純物又は他の製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意に第２のカラム溶出液を希釈して、濃縮された第２のカラム溶出液を生成する工程；
（ｈ）工程（ｇ）で生成された第２のカラム溶出液又は希釈された第２のカラム溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ｒＡＡＶ粒子を含む第３のカラム溶出液を生成し、それによってタンパク質不純物の製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意に第３のカラム溶出液を希釈して、希釈された第３のカラム溶出液を生成する工程；及び
（ｉ）工程（ｈ）で生成された第３のカラム溶出液又は濃縮された第３のカラム溶出液を濾過し、それにより、精製されたｒＡＡＶ粒子を生成する工程。
特定の実施形態では、工程（ａ）～（ｇ）は維持され、以下の工程と組み合わされる。
（ｈ）工程（ｇ）で生成された第２のカラム溶出液又は濃縮された第２のカラム溶出液を濾過し、それにより、精製されたｒＡＡＶ粒子を生成する工程。
実施形態では、工程（ａ）～（ｅ）は維持され、以下の工程と組み合わされる。
（ｆ）工程（ｄ）の核酸減少溶解物、又は工程（ｅ）で生成された清澄化溶解物若しくは希釈清澄化溶解物を、ＡＡＶアフィニティークロマトグラフィーに供して、ｒＡＡＶ粒子を含むカラム溶出液を生成し、それにより、タンパク質不純物又は他の製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意にカラム溶出液を濃縮して、濃縮されたカラム溶出液を生成する工程；
（ｇ）工程（ｆ）で生成されたカラム溶出液又は濃縮されたカラム溶出液をサイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供して、ｒＡＡＶ粒子を含む第２のカラム溶出液を生成し、それによってタンパク質不純物又は他の製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意に第２のカラム溶出液を希釈して、希釈された第２のカラム溶出液を生成する工程；
（ｈ）任意に、工程（ｇ）で生成された第２のカラム溶出液又は希釈された第２のカラム溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ｒＡＡＶ粒子を含む第３のカラム溶出液を生成し、それによってタンパク質不純物又は他の製造／プロセス関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離し、任意に第３のカラム溶出液を希釈して、希釈された第３のカラム溶出液を生成する工程；及び
（ｉ）工程（ｇ）で生成した第２のカラム溶出液若しくは希釈された第２のカラム溶出液を濾過するか、又は工程（ｈ）で生成した第３のカラム溶出液若しくは濃縮された第３のカラム溶出液を濾過して、それにより、精製されたｒＡＡＶ粒子を生成する工程。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｂ）及び／又は工程（ｆ）及び／又は工程（ｇ）及び／又は工程（ｈ）の濃縮は、限外濾過／透析濾過、例えば接線流濾過（ＴＦＦ）によるものである。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｂ）の濃縮は、回収された細胞及び細胞培養上清の体積を約２～２０倍減少させる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｆ）及び／又は工程（ｇ）及び／又は工程（ｈ）の濃縮は、カラム溶出液の体積を約５～２０倍減少させる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ａ）で生成された回収物又は工程（ｂ）で生成された濃縮回収物の溶解は、物理的又は化学的手段によるものである。物理的手段の非限定的な例としては、マイクロ流動化及び均質化が挙げられる。化学的手段の非限定的な例には、洗剤が含まれる。洗剤には、非イオン性洗剤及びイオン性洗剤が含まれる。非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が挙げられる。洗剤濃度の非限定的な例は、約０．１～１．０％（ｖ／ｖ）又は（ｗ／ｖ）（両端を含む）である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｄ）は、ヌクレアーゼで処理し、それによって汚染核酸を減少させることを含む。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ベンゾナーゼが挙げられる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｅ）の清澄化溶解物又は希釈清澄化溶解物の濾過はフィルタによるものである。フィルタの非限定的な例は、約０．１ミクロン～１０．０ミクロン（両端を含む）の孔径を有するものである。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｅ）の清澄化された溶解物の希釈は、緩衝リン酸、酢酸又はトリス水溶液によるものである。溶液ｐＨの非限定的な例は、約ｐＨ４．０～ｐＨ７．４（両端を含む）である。Ｔｒｉｓ溶液のｐＨの非限定的な例は、ｐＨ７．５超、例えば約ｐＨ８．０～ｐＨ９．０（両端を含む）である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｆ）のカラム溶出液又は工程（ｇ）の第２のカラム溶出液の希釈は、緩衝リン酸、酢酸又はトリス水溶液によるものである。溶液ｐＨの非限定的な例は、約ｐＨ４．０～ｐＨ７．４（両端を含む）である。Ｔｒｉｓ溶液のｐＨの非限定的な例は、ｐＨ７．５超、例えば約ｐＨ８．０～ｐＨ９．０（両端を含む）である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｉ）から得られるｒＡＡＶ粒子を界面活性剤と共に製剤化して、ｒＡＡＶ粒子製剤を生成する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｆ）、（ｇ）及び／又は（ｈ）の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）調節カラムクロマトグラフィーを含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｇ）及び／又は（ｈ）の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを、カラムからのｒＡＡＶ粒子の溶出の前にＰＥＧ溶液で洗浄する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００ｇ／ｍｏｌ～８０，０００ｇ／ｍｏｌ（両端を含む）の範囲の平均分子量を有する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＰＥＧは、約４％～約１０％（ｗ／ｖ）（両端を含む）の濃度である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｇ）及び／又は（ｈ）の陰イオン交換カラムを、カラムからのｒＡＡＶ粒子の溶出の前に界面活性剤水溶液で洗浄する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｆ）の陽イオン交換カラムを、カラムからのｒＡＡＶ粒子の溶出の前に界面活性剤溶液で洗浄する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＰＥＧ溶液及び／又は界面活性剤溶液は、水性Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝液、水性リン酸／ＮａＣｌ緩衝液、又は水性酢酸／ＮａＣｌ緩衝液を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、緩衝液又は溶液中のＮａＣｌ濃度は、約２０～３００ｍＭのＮａＣｌ（両端を含む）又は約５０～２５０ｍＭのＮａＣｌ（両端を含む）の範囲内である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、界面活性剤は、カチオン性又はアニオン性界面活性剤を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、界面活性剤は、１２炭素鎖界面活性剤を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、界面活性剤は、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣ）又はサルコシルを含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を、工程（ｆ）、（ｇ）及び／又は（ｈ）の陰イオン交換カラムから水性Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝液で溶出する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝液は、１００～４００ｍＭのＮａＣｌ（両端含む）を、任意に約ｐＨ７．５～約ｐＨ９．０（両端含む）の範囲のｐＨで含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｆ）、（ｇ）及び／又は（ｈ）の陰イオン交換カラムを水性Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝液で洗浄する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、水性Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約７５～１２５ｍＭ（両端を含む）の範囲内である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、水性Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝液は、約ｐＨ７．５～約ｐＨ９．０（両端を含む）のｐＨを有する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｆ）、（ｇ）及び／又は（ｈ）の陰イオン交換カラムを１回又は複数回洗浄して、第２又は第３のカラム溶出液中の空のキャプシドの量を減少させる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、陰イオン交換カラム洗浄は、ｒＡＡＶ粒子溶出の前に及び／又はｒＡＡＶ粒子溶出の代わりにカラムから空のキャプシドを除去し、それによって第２又は第３カラム溶出液中の空のキャプシドの量を減少させる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、陰イオン交換カラム洗浄は、ｒＡＡＶ粒子溶出の前に及び／又はｒＡＡＶ粒子溶出の代わりにカラムから空のキャプシド全体の少なくとも約５０％を除去し、それによって第２又は第３カラム溶出液中の空のキャプシドの量を約５０％減少させる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、水性Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約１１０～１２０ｍＭ（両端を含む）の範囲内である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、溶出されるｒＡＡＶ粒子及び空のキャプシドの比及び／又は量は、洗浄緩衝液によって制御される。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、水性リン酸／ＮａＣｌ緩衝液又は水性酢酸／ＮａＣｌ緩衝液中で工程（ｆ）の陽イオン交換カラムから溶出される。緩衝液中の非限定的なＮａＣｌ濃度は、約１２５～５００ｍＭ ＮａＣｌ（両端を含む）の範囲である。緩衝液ｐＨの非限定的な例は、約ｐＨ５．５～約ｐＨ７．５（両端を含む）である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、工程（ｆ）、（ｇ）及び／又は（ｈ）の陰イオン交換カラムは、四級化ポリエチレンイミンなどの四級アンモニウム官能基を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、工程（ｇ）及び／又は（ｈ）のサイズ排除カラム（ＳＥＣ）は、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ～約６００，０００ｇ／ｍｏｌ（両端を含む）の分離／分画範囲（分子量）を有する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、工程（ｆ）の陽イオン交換カラムは、スルホン酸又はスルホプロピルなどの官能基を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ＡＡＶアフィニティーカラムは、ＡＡＶキャプシドタンパク質に結合するタンパク質又はリガンドを含む。タンパク質の非限定的な例としては、ＡＡＶキャプシドタンパク質に結合する抗体が挙げられる。より具体的な非限定的な例としては、ＡＡＶキャプシドタンパク質に結合する一本鎖ラマ抗体（Ｃａｍｅｌｉｄ）が挙げられる。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本方法は、塩化セシウム勾配超遠心分離の工程を除外する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本方法は、工程（ａ）で生成された回収物又は工程（ｂ）で生成された濃縮回収物から全ｒＡＡＶ粒子の約５０～９０％を回収する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本方法は、単一ＡＡＶアフィニティーカラム精製によって生成又は精製されたｒＡＡＶ粒子よりも高い純度を有するｒＡＡＶ粒子を生成する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、工程（ｃ）及び（ｄ）は実質的に同時に実行される。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＮａＣｌ濃度は、工程（ｃ）の後であるが工程（ｆ）の前に、約１００～４００ｍＭ ＮａＣｌの範囲（両端を含む）、又は約１４０～３００ｍＭ ＮａＣｌの範囲（両端を含む）になるように調整される。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、Ｒｈ１０及びＲｈ７４からなる群から選択されるＡＡＶに由来する。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、配列番号７５、又は配列番号７６のキャプシド配列と７０％以上の配列同一性を有するキャプシド配列を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、Ｒｈ１０、又はＲｈ７４のＩＴＲ配列と７０％以上の配列同一性を有するＩＴＲ配列を含む。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、細胞は、懸濁増殖細胞又は接着増殖細胞である。
すべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。非限定的な例としては、ＨＥＫ－２９３細胞などのＨＥＫ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ細胞が挙げられる。
導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ粒子の感染力価を決定する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｚｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５（２００４）７０９を参照のこと）。空のキャプシド及び導入遺伝子がパッケージングされたｒＡＡＶ粒子をアッセイするための方法は公知である（例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６（１９９９）１３２２－１３３０；Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．７（２００３）１２２－１２８を参照のこと）。
分解／変性したキャプシドの存在又は量を決定するために、精製されたｒＡＡＶ粒子を、３つのキャプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル、例えば勾配ゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いで、試料が分離されるまでゲルを泳動し、ゲルをナイロン又はニトロセルロースメンブランにブロットすることができる。次いで、抗ＡＡＶキャプシド抗体は、変性キャプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用される（例えば、Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．７４（２０００）９２８１－９２９３を参照のこと）。一次抗体に結合する二次抗体は、一次抗体を検出する手段を含む。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に検出して、キャプシドの量を決定する。別の方法は、ＳＥＣカラム又は分析超遠心分離機を用いた分析ＨＰＬＣである。
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組合せられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
本明細書で言及されるすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例、配列及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
ＲＭＣＩの前（左の略図）及び後（右の略図）の本発明によるＤＮＡエレメントのスキーム。 本発明による２つのＤＮＡエレメントを含む本発明によるＤＮＡのスキーム ＲＭＣＩの前（上の略図）及び後（下の略図）の本発明によるＤＮＡのスキーム。 本発明によるＤＮＡにおける逐次転写活性化のスキーム。 Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ及びＥ４（ＯＲＦ６）に対する４つのオープンリーディングフレームの同時転写活性化のための本発明によるＤＮＡの例示的な使用。 Ｅ２Ａ及びＥ４（ＯＲＦ６）に対する２つのオープンリーディングフレームの同時転写活性化のための本発明によるＤＮＡエレメントの例示的な使用。 ｒｅｐとｃａｐ（左）、ｒｅｐ７８とｒｅｐ５２／４０（中央）、及び、ｒｅｐ７８とｒｅｐ５２（右）の２つのオープンリーディングフレームの同時転写活性化のための本発明によるＤＮＡエレメントの例示的な使用。 ＶＡ ＲＮＡ遺伝子に対する１つのオープンリーディングフレームの転写活性化のための本発明によるＤＮＡエレメントの例示的な使用。 ＲＭＣＩの前のＥ１Ａ及びＥ１Ｂに対するオープンリーディングフレームの同時転写活性のための本発明によるＤＮＡエレメントの例示的な略図。クローニングの制限部位を示す。 ＲＭＣＩ後のＥ１Ａ及びＥ１Ｂに対する転写的に活性なオープンリーディングフレームを有する本発明による反転ＤＮＡエレメントの例示的な略図。クローニングの制限部位を示す。 ＲＭＣＩの前のＥ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６に対するオープンリーディングフレームの同時転写活性のための本発明によるＤＮＡエレメントの例示的な略図。クローニングの制限部位を示す。 ＲＭＣＩ後のＥ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６に対する転写的に活性なオープンリーディングフレームを有する本発明による反転ＤＮＡエレメントの例示的な略図。クローニングの制限部位を示す。 ＲＭＣＩの前のＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２／４０に対するオープンリーディングフレームの同時転写活性のための本発明によるＤＮＡエレメントの例示的な略図。クローニングの制限部位を示す。 ＲＭＣＩ後のＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２／４０に対する転写的に活性なオープンリーディングフレームを有する本発明による反転ＤＮＡエレメントの例示的な略図。クローニングの制限部位を示す。 ＶＡ ＲＮＡ及びＶＡ ＲＮＡ Ｇ５８Ｔ／Ｇ５９Ｔ／Ｃ６８Ａバリアントのアラインメント。 ＲＭＣＩ前の本発明によるＶＡ ＲＮＡ。 ＲＭＣＩ後の本発明によるＶＡ ＲＮＡ。 ＲＭＣＩ前のｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰに対するオープンリーディングフレームの同時転写活性化のための本発明による例示的な転写不活性ＤＮＡエレメントの略図。クローニングの制限部位を示す。 ＲＭＣＩ後のｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰに対する転写的に活性なオープンリーディングフレームを有する図１８の本発明による反転ＤＮＡエレメントの略図。クローニングの制限部位を示す。 一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＭＣＩのサイトメトリー分析。ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の平均パーセンテージを標準偏差（エラーバー）と共に示す。各条件を生物学的に三連で試験した。表５によるナンバリング。
一般的技術
１）組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）において説明されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作する。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用する。
２）ＤＮＡ及びタンパク質配列解析及び配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアパッケージ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ及びＧｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅを、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション及び図示に使用する。
３）遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（レーゲンスブルク、ドイツ）での化学合成によって調製する。合成した遺伝子断片を増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングする。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。代替的に、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、又はＰＣＲを介して構築する。それぞれのオリゴヌクレオチドを、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製する。
４）試薬
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、及びキットを、製造元のプロトコルに従って提供されたとおりに使用する。
５）ＴＩ宿主細胞株の培養
ＴＩ ＣＨＯ宿主細胞を、湿度８５％、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養する。それらを、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢと４μｇ／ｍｌの第２の選択マーカーを含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で培養する。細胞を３日又は４日ごとに０．３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総量３０ｍｌに分割する。培養には、１２５ｍｌの非バッフル三角フラスコを使用する。細胞を１５０ｒｐｍで５ｃｍの振とう振幅で振とうする。細胞数は、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）によって決定する。細胞は６０日齢に達するまで培養を続ける。
６）クローニング
一般
Ｒ部位でのクローニングは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の隣にあるＤＮＡ配列に依存し、これは次の断片にある配列と等しい配列である。このように、断片の組立ては、等しい配列の重なりと、それに続く、組み立てられたＤＮＡのニックのＤＮＡリガーゼによる封鎖によって可能になる。したがって、単一遺伝子、特に適切なＲ部位を含む予備プラスミドのクローニングが必要である。これらの予備プラスミドのクローニングが成功した後、Ｒ部位で挟まれている目的の遺伝子は、Ｒ部位のすぐ隣を切断する酵素による制限消化を介して切り出される。最後の工程は、すべてのＤＮＡ断片を１つの工程で組み立てることである。より詳細には、５’－エキソヌクレアーゼは重複領域（Ｒ部位）の５’末端を除去する。その後、Ｒ部位のアニーリングを行なうことができ、ＤＮＡポリメラーゼが３’末端を伸長して配列のギャップを埋める。最後に、ＤＮＡリガーゼはヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼのような異なる酵素を含むアセンブリマスターミックスを添加し、その後反応ミックスを５０℃でインキュベートすると、単一の断片の１つのプラスミドへの組み立てをもたらす。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
一部のプラスミドでは、制限酵素を介したクローニング戦略を使用した。適切な制限酵素を選択することにより、望みの目的の遺伝子を切り出し、その後、ライゲーションによって別のプラスミドに挿入することができる。したがって、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）で切断する酵素を使用し、スマートな方法で選択して、正しいアレイ内の断片のライゲーションを実行できるようにすることが好ましい。プラスミドと断片が以前に同じ制限酵素で切断されている場合、断片とプラスミドの粘着末端は完全に適合し、その後ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることができる。ライゲーション後、コンピテント大腸菌細胞を新しく作製されたプラスミドで形質転換する。
制限消化によるクローニング
制限酵素によるプラスミドの消化のために、以下の成分を氷上で一緒にピペッティングする。
表：制限消化反応ミックス
Figure 2023546113000011
１回の消化でより多くの酵素を使用する場合は、各酵素１μｌを使用し、多かれ少なかれＰＣＲグレードの水を添加して容量を調整する。すべての酵素は、ニューイングランドバイオラボのＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（１００％活性）での使用に適格であり、同じインキュベーション温度（すべて３７℃）であるという前提条件で選択される。
サーモミキサー又はサーマルサイクラーを使用してインキュベーションを行い、試料を一定温度（３７℃）でインキュベートできるようにする。インキュベーション中、試料は攪拌されない。インキュベーション時間は６０分に設定する。その後、試料をローディング色素と直接混合し、アガロース電気泳動ゲルにロードするか、さらなる使用のために４℃／氷上で保存する。
ゲル電気泳動用に１％アガロースゲルを調製する。そのため、１．５ｇの多目的アガロースを１２５三角フラスコに量り取り、１５０ｍｌのＴＡＥ緩衝液で満たす。アガロースが完全に溶解するまで、混合物を電子レンジで加熱する。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムをアガロース溶液に加える。その後、ゲルを型に流し込む。アガロースが固まった後、型を電気泳動チャンバーに入れ、チャンバーをＴＡＥ緩衝液で満たす。その後、試料をロードする。（左から）最初のポケットに、適切なＤＮＡ分子量マーカーをロードし、続いて試料をロードする。ゲルは＜１３０Ｖで約６０分間泳動する。電気泳動後、ゲルをチャンバーから取り出し、ＵＶ－Ｉｍａｇｅｒで分析する。
標的バンドを切断し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移す。ゲルの精製には、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造元の指示に従って使用する。ＤＮＡ断片を、さらに使用するために－２０ °Ｃで保存する。
ライゲーション用の断片は、挿入断片とプラスミド断片の長さ、及びそれらの相互の相関関係に応じて、１：２、１：３、又は１：５のプラスミド対挿入断片のモル比で一緒にピペッティングする。プラスミドに挿入する必要のある断片が短い場合は、１：５の比率を使用する。挿入断片がより長ければ、プラスミドとの相関関係で使用される挿入断片の量はより少なくなる。各ライゲーションで５０ｎｇのプラスミド量を使用し、特定の挿入断片量をＮＥＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒで計算する。ライゲーションには、ＮＥＢのＴ４ ＤＮＡライゲーションキットを使用する。ライゲーション混合物の例を次の表に示す。
表：ライゲーション反応ミックス
Figure 2023546113000012
ＤＮＡと水の混合から始めて、バッファーの添加、最後に酵素の添加は、すべての成分を氷上で一緒にピペッティングする。反応物を上下にピペッティングすることにより穏やかに混合し、短時間マイクロ遠心分離し、次に室温で１０分間インキュベートする。インキュベーション後、Ｔ４リガーゼを６５℃で１０分間熱失活させる。試料を氷上で冷却する。最後の工程で、１０ベータコンピテント大腸菌細胞を２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換する（以下を参照）。
形質転換１０ベータ・コンピテント大腸菌細胞
形質転換のために、１０ベータコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で解凍する。その後、２μｌのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に直接ピペットで移す。チューブをはじき、氷上に３０分間置く。その後、細胞を４２℃のサーマルブロックに入れ、正確に３０秒間熱ショックを与える。その直後に、細胞を氷上で２分間冷却する。９５０μｌのＮＥＢ１０ベータ増殖培地を細胞懸濁液に添加する。細胞を３７℃で１時間振盪しながらインキュベートする。次に、５０～１００μｌを事前に温めた（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレートにピペットで移し、使い捨てスパチュラで広げる。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。プラスミドの組み込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、これらのプレート上で増殖可能である。翌日、単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにＬＢ－Ａｍｐ培地で培養する。
細菌培養
大腸菌の培養は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略であるＬＢ培地で行い、１ｍｌ／Ｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度にする。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種する。
表：大腸菌の培養の容量
Figure 2023546113000013
Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐのために、９６ウェル２ｍｌディープウェルプレートにウェルあたり１．５ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填する。コロニーを拾い、つまようじを培地に押し込む。すべてのコロニーを採取したら、プレートを粘着性の空気多孔質膜で閉じる。プレートを３７℃のインキュベーター中で２００ｒｐｍの振盪速度で２３時間インキュベートする。
ミニプレップの場合、１５ｍｌのチューブ（換気された蓋付き）に３．６ ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填し、細菌コロニーを均等に接種する。つまようじは取り除かずに、インキュベーションのあいだチューブ内に残す。９６ウェルプレートと同様に、チューブを３７℃、２００ｒｐｍで２３時間インキュベートする。
マキシプレップの場合、２００ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地をオートクレーブ処理したガラス製の１Ｌ三角フラスコに充填し、約５時間経過した１ｍｌの細菌の日中培養物を接種する。三角フラスコを紙栓で閉じ、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートする。
プラスミドの調製
ミニプレップの場合、５０μｌの細菌懸濁液を１ｍｌのディープウェルプレートに移す。その後、細菌細胞をプレート内で３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。上澄みを除去し、細菌ペレットを含むプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎに入れる。およそ９０分後、分析を行い、溶出されたプラスミドＤＮＡを更なる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから取り出すことができる。
ミニプレップの場合、１５ ｍｌのチューブをインキュベーターから取り出し、３．６ｍｌの細菌培養物を２つの２ｍｌのエッペンドルフチューブに分割する。チューブを卓上マイクロ遠心機で６，８００ｘｇで室温で３分間遠心分離する。その後、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップ・キットを使用して、製造元の指示に従ってミニプレップを実行する。プラスミドＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定する。
マキシプレップは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦキットを使用して、製造元の指示に従って実行する。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定する。
エタノール沈殿
ＤＮＡ溶液の体積を２．５倍体積のエタノール１００％と混合する。混合物を、－２０℃で１０分間インキュベートする。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離する。上澄みを注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄する。この場合も、チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。上澄みをピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させる。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加える。ＤＮＡを４℃で一晩、水に再溶解する時間を与える。少量のアリコートを採取し、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定する。
発現カセットの組成
オープンリーディングフレームの発現のために、以下の機能的エレメントを含む転写ユニットが使用される：
－イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－必要に応じて、シグナル配列を含むそれぞれのオープンリーディングフレームを含む核酸、
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、及び
－任意に、ヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットのほかに、基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこのプラスミドの複製を可能にするプラスミドｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用する。
ＨＥＫ２９３系における一時的なトランスフェクション
本発明によるＤＮＡエレメントを含む細胞は、ＨＥＫ２９３システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、それぞれのプラスミド（以下の実施例１～４を参照）での一過性トランスフェクションによって生成される。簡潔に述べれば、シェークフラスコ又は撹拌発酵槽のいずれかにおいて無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で懸濁状態で生育させたＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に各々のプラスミド及び２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）又はｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のミックスをトランスフェクトする。２Ｌシェークフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＨＥＫ２９３細胞を６００ｍＬ中１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、１２０ｒｐｍ、８％のＣＯ２でインキュベートする。後日、約１．５＊１０６細胞／ｍＬの細胞密度の細胞にＡ）計６００μｇのプラスミドＤＮＡ（１μｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びにＢ）２０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋１．２ｍＬの２９３ ｆｅｃｔｉｎ又はｆｅｃｔｉｎ（２μＬ／ｍＬ）の約４２ｍＬのミックスをトランスフェクトする。グルコース消費に従って発酵の経過の間にグルコース溶液を加える。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＬＤＳ試料緩衝液、４倍濃縮物（４×）：４ｇのグリセロール、０．６８２ｇのＴＲＩＳ－塩基、０．６６６ｇのＴＲＩＳ－塩酸塩、０．８ｇのＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酸）、０．７５ｍｌのＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ２５０の１％重量（ｗ／ｗ）水溶液、０．７５ｍｌのフェノールレッドの１％重量（ｗ／ｗ）溶液、水を添加して総体積を１０ｍｌにする。
培養液中の細胞を溶解する。その後、溶液を遠心分離して細胞残屑を除去した。清澄化された上清のアリコートを、１／４体積（ｖ／ｖ）の４ ｘＬＤＳ試料緩衝液及び１／１０体積（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ １，４－ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と混合する。次いで、試料を７０°Ｃで１０分間インキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質を分離する。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を、製造業者の説明書に従って、使用した。特に、１０％ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ泳動緩衝液を使用した。
ウエスタンブロット
トランスファー緩衝液３９ｍＭグリシン、４８ｍＭ ＴＲＩＳ－塩酸塩、０．０４％重量（ｗ／ｗ）ＳＤＳ、及び２０％体積メタノール（ｖ／ｖ）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、分離したポリペプチドを、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの「Ｓｅｍｉｄｒｙ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ－Ｍｅｔｈｏｄ」（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，Ｗ．Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２（１９８１）１９５－２０３）に従ってニトロセルロースフィルタ膜（孔径：０．４５μｍ）に電気泳動的に移した。
実施例１
本発明による、ＲＭＣＩによるＥ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６オープンリーディングフレームの同時Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介活性化のためのＤＮＡ構築物の作製
６０８ｂｐのＣＭＶ前初期プロモーター及びエンハンサー（配列番号２８）がヒト免疫グロブリン５’ＵＴＲと組み合わされる、第１のＤＮＡ断片が生成される。このような２つのエレメントを、変異した左逆方向反復を有する介在Ｌ３エレメントとｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄで融合し（Ｌ３－ＬＥ；ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａａａｇｔｃｔｃ ｃｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔ；配列番号７０）、ＸｂａＩ（５’末端）及びＫｐｎＩ（３’末端）制限部位に隣接させる。対応するＤＮＡ断片をＤＮＡ合成によって生成し、適切なシャトルプラスミドにクローニングする。
同様に、そのコード鎖に関して５’から３’方向に：ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、変異した右逆方向反復を有するＬ３部位（Ｌ３－ＲＥ；ａｔａａｃｔｔｃｇｔ ａｔａａａｇｔｃｔｃ ｃｔａｔａｃｇａａｃ ｇｇｔａ；配列番号７１）、コザック配列、アデノウイルスＥ２Ａタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿０００００７）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨポリＡ；配列番号３１）、ヒトガストリン転写ターミネーター配列（ＨＧＴ；配列番号３２）及びＫｐｎＩ制限部位を含む第２のＤＮＡ断片が生成及びクローニングされる。
第３の断片も生成され、クローニングされ、そのコード鎖に関して５’から３’方向に：ＭｆｅＩ制限部位、コザック配列、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿０００００７）、ＢＧＨポリＡ、ＨＧＴ配列及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む。
３つの断片を、それぞれの制限酵素を使用してそれらのシャトルプラスミドから切り出す。切り出された断片を、ＭｆｅＩ－及びＸｂａＩ－適合性オーバーハングを有するプラスミド骨格及びピューロマイシン選択マーカーと四方向ライゲーション反応で組み合わせ、哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためのプラスミドを得る。
図１１は、ライゲーション中の粘着末端の適合性によって決定される、このＤＮＡ断片内のエレメントの順序及び配向を示す。
実施例２
本発明による、ＲＭＣＩによるＥ１Ａ及びＥ１Ｂオープンリーディングフレームの同時Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介活性化のためのＤＮＡ構築物の作製
ＴＡＴＡボックスと転写開始部位との間の配列を除く、６０８ｂｐ ＣＭＶプロモーター及びエンハンサーエレメントの２コピーは、介在Ｌｏｘ７１部位とｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄで融合される。得られた断片には、５’末端にＸｂａＩ制限部位が、３’末端にＫｐｎＩ制限部位が提供される。完全なＤＮＡ断片をＤＮＡ合成によって生成し、適切なシャトルプラスミドにクローニングする。
同様に、そのコード鎖に関して５’から３’方向のに：ＳａｃＩ制限部位、Ｌｏｘ６６部位、変異／不活性化ＳａｃＩ部位を有するＴＡＴＡボックスと転写開始部位との間のＣＭＶプロモーター断片、ヒト免疫グロブリン重鎖５’ＵＴＲ、コザック配列、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿０００００８）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨポリＡ）、ヒトガストリン転写ターミネーター配列（ＨＧＴ）及びＫｐｎＩ制限部位を含む第２のＤＮＡ断片が合成及びクローニングされる。
５’から３’方向のに：ＳａｃＩ制限部位、ＴＡＴＡボックスと転写開始部位との間のＣＭＶプロモーター断片、ヒト免疫グロブリン重鎖５’ＵＴＲ、コザック配列、アデノウイルスＥ１Ｂ（１９ｋＤａ）及びＥ１Ｂ（５５ｋＤａ）タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿０００００８）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨポリＡ）、ヒトガストリン転写ターミネーター配列（ＨＧＴ）及びＭｆｅＩ制限部位を含む第３の断片も合成及びクローニングされる。
３つの断片を、それぞれの制限酵素を使用してそれらのシャトルプラスミドから切り出す。断片を、ＭｆｅＩ－及びＸｂａＩ－適合性オーバーハングを有するプラスミド骨格及びピューロマイシン選択マーカーと四方向ライゲーション反応で組み合わせ、哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためのプラスミドを得る。
図９は、ライゲーション中の粘着末端の適合性によって決定される、このＤＮＡ断片内のエレメントの順序及び配向を示す。
実施例３
本発明による、ＲＭＣＩによるＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２／４０転写の同時Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介活性化のためのＤＮＡ構築物の作製
転写開始部位の２１ｂｐ下流を含むＡＡＶ２ Ｐ５プロモーター及び転写開始部位の１０３ｂｐ下流を含むＡＡＶ２ Ｐ１９プロモーターは、変異した左逆方向反復を有する介在ＬｏｘＦａｓ部位とｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄで融合される（ＬｏｘＦａｓ－ＬＥ；ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａｔａｃｃｔｔｔ ｃｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔ；配列番号７２）。得られた断片には、５’末端にＸｂａＩ制限部位が、３’末端にＫｐｎＩ制限部位が提供される。完全なＤＮＡ断片をＤＮＡ合成によって生成し、適切なシャトルプラスミドにクローニングする。
同様に、３’から５’方向に、すなわちコード鎖に対して反転して：ＳａｌＩ制限部位、変異した右逆方向反復を有するＬｏｘＦａｓ部位（ＬｏｘＦａｓ－ＲＥ；ａｔａａｃｔｔｃｇｔ ａｔａｔａｃｃｔｔｔ ｃｔａｔａｃｇａａｃ ｇｇｔａ；配列番号７３）、Ｒｅｐ７８／６８ ５’ＵＴＲからの１３ｂｐ配列、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）、ヒトガストリン転写ターミネーター（ＨＧＴ）及びＫｐｎＩ制限部位を含む第２のＤＮＡ断片が生成及びクローニングされる。
５’から３’方向に：ＳａｌＩ制限部位、Ｒｅｐ５２／４０開始コドンの１３ｂｐ上流で開始し、ＶＰ遺伝子の停止コドンの１２４ｂｐ下流で終了するＡＡＶ２ Ｒｅｐ５２／４０－Ｃａｐ遺伝子、及びＭｆｅ制限部位を含む第３の断片も生成される。
３つの断片を、それぞれの制限酵素を使用してそれらのシャトルプラスミドから切り出す。断片を、ＭｆｅＩ－及びＸｂａＩ－適合性オーバーハングを有するプラスミド骨格及びピューロマイシン選択マーカーと四方向ライゲーション反応で組み合わせ、哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためのプラスミドを得る。
図１３は、ライゲーション中の粘着末端の適合性によって決定される、このＤＮＡ断片内のエレメントの順序及び配向を示す。
実施例４
本発明による、ＲＭＣＩによるＶＡ ＲＮＡＩ転写のＣｒｅリコンビナーゼ媒介活性化のためのＤＮＡ構築物の作製
５’から３’方向に：変異した左逆方向反復及び非無差別性を保証するカノニカルＬｏｘＰ部位からの高い分岐（Ｌｘ－ＬＥ；ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａａｇｔｔｔａｔ ａｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔ；配列番号０３）を有するＣｒｅ組換え部位に組み込まれたＴＡＴＡシグナル（ＴＴＴＡＴＡＴＡＴ；配列番号７４）を含む配列番号６９のＬｘ－ＬＥ部位（ＴＡＴＡと転写開始部位との距離は、一般的な距離を反映するようにアライメントされている）、Ａｄ２ ＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子のまさに５’末端からの短い断片、直後にポリメラーゼＩＩＩターミネーター（ヘキサ－ｄＴ）、逆向きのＡｄ２ ＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ＿０００００７）、並びに逆方向の右逆方向反復を有するＬｘ部位を含む３’末端配列（Ｌｘ－ＲＥ反転；ｔａｃｃｇｔｔｃｇｔ ａｔａｔａｔａａａｃ ｔｔａｔａｃｇａａｇ ｔｔａｔ；配列番号０６）を含むＤＮＡ断片を化学合成する。
この断片を、ピューロマイシン選択マーカーを有するプラスミド骨格とライゲーションして、哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためのプラスミドを得る。
図１６は、このＤＮＡ断片内のエレメントの順序及び配向を示す。
実施例５
ＲＭＣＩのためのカセットの安定した組込み
懸濁液中で増殖するように適合されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を、３７°Ｃ及び５～７体積％ＣＯ２で、使い捨て通気１２５ｍＬ振盪フラスコ中の５０ｍＬの化学的に定義された培地中で増殖させる。培養物を１４０～１８０ ｒｐｍ／分の一定の撹拌速度で振盪し、新鮮な培地で３～４日毎に２～３×１０５／ｍＬの密度に希釈する。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンター（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｅｓ ＡＧ，Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、培養物の密度及び生存率を決定する。
ＲＭＣＩカセットの安定した組込みのために、懸濁増殖ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、４×１０５細胞／ｍＬの密度を有する新鮮な化学的に定義された培地に播種する。翌日、トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施する。３×１０７個の細胞を３０μｇの線状化プラスミドＤＮＡでトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍｌの新鮮な化学的に定義された培地に播種する。
トランスフェクションの２日後、細胞を、選択剤として１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬピューロマイシンを含む３８４ウェルプレートに、ウェルあたり３００～５００個の細胞で播種する。３週間後、ＮＹＯＮＥ Ｐｌａｔｅイメージャ（ＳＹＮＥＮＴＥＣＨ ＧｍｂＨ，Ｅｌｍｓｈｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたイメージングにより細胞コロニーを同定する。コロニーを９６ウェルプレートに移し、ＲＭＣＩカセットの組込みについてＰＣＲによって分析する。すべての所望のＲＭＣＩカセットを含む細胞株を、ピューロマイシンを含む化学的に定義された培地中でさらに増殖させ、増殖後に凍結保存する。
実施例６
本発明によるＣｒｅ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）による遺伝子活性化及びＡＡＶ産生
Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介ＲＭＣＩによる遺伝子活性化
カセット反転によるＣｒｅ媒介遺伝子活性化（Ｃｒｅ媒介ＲＭＣＩ）のために、上記の実施例の１つで得られたアデノウイルスヘルパー遺伝子及び／又はｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の不活性ＲＭＣＩカセットのいずれかを有する細胞を、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡで一過性にトランスフェクトする。トランスフェクションの１日前に、細胞を４×１０５細胞／ｍＬの密度で新鮮な培地に播種する。翌日、トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施する。３×１０７個の細胞に、総量３０μｇのＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトする。遺伝子活性化の成功は、逆位ゲノムＤＮＡのＰＣＲ、予想されるｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ又は予想される遺伝子産物のウエスタンブロット分析によって証明される。
ｒＡＡＶベクター産生細胞の作製
組換えＡＶＶベクターの産生のために、上記の実施例の１つで得られたアデノウイルスヘルパー遺伝子及び／又はｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の不活性ＲＭＣＩカセットのいずれかを有する３ ｘ １０７個の細胞を、５μｇのＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含む総量３０μｇの核酸で一過性にトランスフェクトする。残りの２５μｇの核酸は、組換えＡＡＶゲノム（導入遺伝子、例えばＡＡＶ ＩＴＲに隣接するＧＦＰ遺伝子）を提供するプラスミドＤＮＡと、ゲノムに組み込まれていないヘルパー遺伝子及び／又はｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子の発現カセットとで構成される。
あるいは、組換えＡＡＶゲノムは、実施例５に記載されているように、宿主細胞のゲノムへの安定な組込みによって提供される。
細胞のゲノムがすべての必須ヘルパー遺伝子、ｒｅｐ／ｃａｐ及び組換えＡＡＶゲノムを既に含む場合、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡのみのトランスフェクションで十分である。
ＡＡＶ粒子を細胞培養上清又は全細胞溶解物から回収し、ＥＬＩＳＡ、定量的ＰＣＲ及び標的細胞の形質導入によって分析する。
実施例７
本発明による、ＲＭＣＩによるｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰオープンリーディングフレームの同時ＦＲＴリコンビナーゼ媒介活性化のためのＤＮＡ構築物の作製
５２ｂｐの最小ＣＭＶプロモーター（配列番号８５）をその転写方向において以下のエレメントと以下の順序で組み合わせた第１のＤＮＡ断片を生成した：
－ヒト免疫グロブリン５’ＵＴＲ；
－変異した左逆方向反復を有するＦＲＴエレメント（ＦＲＴ－ＬＥ；ＧＡＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ；配列番号６０）；
－逆方向の転写開始（ＴＳ）領域（配列番号８６）を含むＳＶ４０初期プロモーターの４１７ｂｐ断片；
－逆方向であるが、配列番号３２のヒトガストリン転写ターミネーター配列（ＨＧＴ）；
－逆方向であるが、配列番号３１のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨポリＡ）；
－逆方向であるが、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＱＵＷ０４９６３；配列番号８７）をコードするオープンリーディングフレーム；
－逆方向であるが、コザック配列；
－逆方向であるが、変異した右逆方向反復を有するＦＲＴ部位（ＦＲＴ－ＲＥ；ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＴＣ、配列番号６１）；
－順方向の、コザック配列；及び
－順方向の、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ０２５７２．１；配列番号８８；２６ｂｐ）をコードするオープンリーディングフレームの５’部分。
対応するＤＮＡ断片をＳａｌＩ（５’末端）及びＳｇｒＡＩ（３’末端）制限部位に隣接させ、ＤＮＡ合成によって生成し、適切なシャトルプラスミドにクローニングした。
第２の断片も生成及びクローニングされ、そのコード鎖に関して５’から３’方向に以下の順序で以下を含む：ＳａｌＩ制限部位、ＥＧＦＰをコードし内部ＳｇｒＡＩ制限部位を含むオープンリーディングフレーム、ＢＧＨポリＡシグナル配列、ＨＧＴ配列及びＭｆｅＩ制限部位。
ＳａｌＩ及びＳｇｒＡＩ制限酵素を使用して、そのシャトルプラスミドから第１の断片を切り出し、第２の断片を担持するプラスミドのＳａｌＩ部位とＳｇｒＡＩ部位との間に挿入して、哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションに適した最終プラスミドを得た。
図１８は、第１及び第２の断片の組み合わせたＤＮＡ内のエレメントの順序及び配向を示す。
実施例８－比較例
本発明による、ＲＭＣＩによるｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰオープンリーディングフレームの同時ＦＲＴリコンビナーゼ媒介活性化後に得られるＤＮＡ構成を表わすＤＮＡ構築物の作製
５２ｂｐの最小ＣＭＶプロモーター（配列番号８５）をその転写方向において以下の順序で組み合わせた第１のＤＮＡ断片を生成した：
－順方向の、ヒト免疫グロブリン５’ＵＴＲ；
－順方向の、変異した左及び右逆方向反復を有するＦＲＴエレメント（ＦＲＴ－ＬＥ－ＲＥ；ＧＡＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＴＣ；配列番号８９）；
－順方向の、コザック配列；
－順方向の、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＱＵＷ０４９６３；配列番号８７）をコードするオープンリーディングフレーム；
－順方向の、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨポリＡ；配列番号３１）；
－順方向の、ヒトガストリン転写ターミネーター配列（ＨＧＴ；配列番号３２）；
－順方向の転写開始（ＴＳ）領域（配列番号８６）を含むＳＶ４０初期プロモーターの４１７ｂｐ断片；
－逆方向であるが、配列番号３６のＦＲＴ部位；
－順方向の、コザック配列；及び
－順方向の、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ０２５７２．１；配列番号８８；２６ｂｐ）をコードするオープンリーディングフレームの５’部分。
対応するＤＮＡ断片をＳａｌＩ（５’末端）及びＳｇｒＡＩ（３’末端）制限部位に隣接させ、ＤＮＡ合成によって生成し、適切なシャトルプラスミドにクローニングした。
ＳａｌＩ及びＳｇｒＡＩ制限酵素を使用して、そのシャトルプラスミドから第１の断片を切り出し、実施例７に記載のように、第２の断片を担持するプラスミドのＳａｌＩ部位とＳｇｒＡＩ部位との間に挿入して、哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションのためのプラスミドを得た。
図１９は、第１及び第２の断片の組み合わせたＤＮＡ内のエレメントの順序及び配向を示す。
実施例９
本発明による、ＦＬＰ媒介カセット反転（ＲＭＣＩ）による２つの蛍光遺伝子の同時活性化
トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ接着細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ピルビン酸培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７°Ｃ、相対湿度９０％及び５％ ＣＯ２で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、ウェルあたり１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートのウェルに播種した。製造業者の推奨に従って、ＤＮＡ対ＰＥＩ最大比１：２でＰＥＩ ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ウェルあたり１００ｎｇのプラスミドＤＮＡの混合物で細胞をトランスフェクトした。以下の表５に示す各実験条件を三連で試験した。
（表５）トランスフェクションのためのプラスミド混合物の組成。各実験条件（１～１４）について、ＤＮＡ量（ウェルあたりのｎｇ）を示す。
Figure 2023546113000014
本発明によるＦＬＰリコンビナーゼ媒介カセット反転によるｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰ遺伝子の同時活性化を実証するために、８０ｎｇの不活性構築物ｍＣｈｅｒｒｙ＿ＥＧＦＰ＿ｐｒｅ ｒｅｃ（実施例７、図１８）を、ＦＬＰリコンビナーゼの最適化バージョンであるＦＰＬリコンビナーゼＦＬＰｏ（例えば、Ｒａｙｍｏｎｄ，．ＣＳ．ａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（２００７）ｅ１６２を参照）をコードするプラスミドの可変量と混合した。必要に応じて非コード化プラスミド（モックＤＮＡ）を添加して、トランスフェクション混合物中のＤＮＡの総量を１００ｎｇに維持した。ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰの発現がＦＬＰｏの共発現によって影響されるかどうかを試験するために、対応する条件を活性構築物ｍＣｈｅｒｒｙ＿ＥＧＦＰ＿ｐｏｓｔ ｒｅｃ（実施例８、図１９）に適用した。
モックＤＮＡのみを陰性対照としてトランスフェクトしたが、ＥＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ発現単一遺伝子プラスミド（ＥＧＦＰ＿ｏｎｌｙ及びｍＣｈｅｒｒｙ＿ｏｎｌｙ）は陽性対照として機能する。モックＤＮＡと組み合わせたＦＬＰｏプラスミドをトランスフェクトして、ＦＬＰｏ単独による蛍光の直接誘導を排除した。
フローサイトメトリー
一過性トランスフェクションの２日後、細胞内ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの発現を測定するフローサイトメトリーによって、ＦＬＰ媒介カセット反転の成功を確認した。この目的のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン媒介剥離によって９６ウェルプレートから採取した。リン酸緩衝生理食塩水中２％ウシ胎児血清を添加することによって反応を停止した。
フローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。シングレットと細胞凝集体とを区別するために、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＡＳＣ－Ａプロットを選択した。試料あたり１万事象を記録した。両方のゲートは、モックトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、オルテン、スイス）を用いて、すべての試料に適用された。ＧＦＰの蛍光をＦＩＴＣチャネルで定量した（４８８ｎｍで励起、５３０ｎｍで検出）。ｍＣｈｅｒｒｙをＰＥ－ＣＦ５９４チャネル（５６１ｎｍで励起、６１０ｎｍで検出）で測定した。
蛍光細胞集団を正確に同定しレーザーを調整するために、陽性及び陰性対照試料を使用した。ＥＧＦＰ＿ｏｎｌｙプラスミドでトランスフェクトした細胞をＥＧＦＰ陽性対照として使用し、ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｏｎｌｙプラスミドでトランスフェクトした細胞をｍＣｈｅｒｒｙ陽性対照として使用した。非コードプラスミド（モックＤＮＡ）でトランスフェクトした細胞を陰性対照とした。
図２０は、上記の表５に概説されるように、各実験条件１～１４に対するＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の平均パーセンテージを示す。それぞれの標準偏差はエラーバーとして示されている。予想通り、細胞がｍＣｈｅｒｒｙ＿ＥＧＦＰ＿ｐｒｅ ｒｅｃ単独で（条件７）、すなわちリコンビナーゼなしでトランスフェクトされた場合、ほとんど蛍光細胞（＜２％）は検出されなかったが、細胞がｍＣｈｅｒｒｙ＿ＥＧＦＰ＿ｐｏｓｔ ｒｅｃでトランスフェクトされた場合（条件８）、細胞の約６０％がｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰ陽性であった。これは、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰ遺伝子が、リコンビナーゼの非存在下で組換え前の配置では不活性であり、組換え後の配置では活性であることを示す。
ＦＬＰｏ発現プラスミドをｍＣｈｅｒｒｙ＿ＥＧＦＰ＿ｐｒｅ ｒｅｃプラスミドと同時トランスフェクトした場合、ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のパーセンテージは約３０％に増加し（条件９、１０、１１）、ＲＭＣＩの成功及び二重遺伝子活性化を示した。ＦＬＰｏ発現プラスミドのｍＣｈｅｒｒｙ＿ＥＧＦＰ＿ｐｏｓｔ ｒｅｃとの同時トランスフェクションは、ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの発現に影響を及ぼさず（条件８対条件１２、１３及び１４）、カセット反転が組換え後の配置で阻害されることを示した。ＦＬＰｏ発現プラスミドを単独でトランスフェクトした場合、蛍光細胞は検出されなかった。

Claims (11)

  1. コード鎖と鋳型鎖とを含む二本鎖ＤＮＡエレメントであって、
    前記コード鎖が、５’から３’方向に、以下の順序で、
    －第１のプロモーター、
    －左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
    －前記コード鎖に対して反転している第２のプロモーター、
    －前記コード鎖に対して反転している第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメント、
    －前記コード鎖に対して反転しており、かつ前記第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメントに作動可能に連結されている、第１のオープンリーディングフレーム、
    －右逆方向反復に変異を含み、前記第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、
    －第２のオープンリーディングフレーム、並びに
    －前記第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された、第２のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメント
    を含むことを特徴とする、
    二本鎖ＤＮＡエレメント。
  2. コード鎖と鋳型鎖とを含む二本鎖ＤＮＡエレメントであって、
    前記コード鎖が、５’から３’方向に、以下の順序で、
    －第１のプロモーター、
    －左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
    －Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質の発現のためのさらなるプロモーターを含むＲｅｐ／Ｃａｐオープンリーディングフレームであって、前記コード鎖に対して反転された、Ｒｅｐ／Ｃａｐオープンリーディングフレーム、
    －右逆方向反復に変異を含み、かつ前記第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、並びに
    －ポリアデニル化シグナル配列
    を含む、
    二本鎖ＤＮＡエレメント。
  3. コード鎖と鋳型鎖とを含む二本鎖ＤＮＡエレメントであって、
    （ａ）前記コード鎖が、５’から３’方向に、以下の順序で、
    －第１のプロモーター、
    －左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
    －前記コード鎖に対して反転している第２のプロモーター、
    －前記コード鎖に対して反転している第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメント、
    －コード配列であって、
    Ｒｅｐ７８タンパク質のみ又はＲｅｐ６８タンパク質のみのいずれかをコードするが両方はコードせず、
    （ｉ）任意に、内部Ｐ４０プロモーターが不活性化されている、且つ／又は
    （ｉｉ）Ｒｅｐ５２／４０の開始コドンが非開始コドンに変異している、且つ／又は
    （ｉｉｉ）スプライスドナー部位及びアクセプター部位が除去されており、
    前記コード鎖に対して反転しており、且つ
    前記第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメントに作動可能に連結されている、
    コード配列、
    －右逆方向反復に変異を含み、かつ前記第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、並びに
    －Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０オープンリーディングフレーム及びＣａｐオープンリーディングフレームであって、前記これらのオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを含む、Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０オープンリーディングフレーム及びＣａｐオープンリーディングフレーム
    を含むか、或いは
    （ｂ）前記コード鎖が、５’から３’方向に、以下の順序で、
    －第１のプロモーター、
    －左逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
    －前記コード鎖に対して反転している第２のプロモーター、
    －前記コード鎖に対して反転している第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメント、
    －コード配列であって、
    Ｒｅｐ７８タンパク質のみ又はＲｅｐ６８タンパク質のみのいずれかをコードするが両方はコードせず、
    （ｉ）任意に、内部プロモーターが不活性化されている、且つ／又は
    （ｉｉ）前記Ｒｅｐ５２／４０オープンリーディングフレームの開始コドンが非開始コドンに変異している、且つ
    （ｉｉｉ）前記スプライスドナー部位及びアクセプター部位が除去されており、
    前記コード鎖に対して反転しており、且つ
    前記第１のポリアデニル化シグナル配列及び／又は転写終結エレメントに作動可能に連結されている、
    コード配列、
    －右逆方向反復に変異を含み、かつ前記第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、並びに
    －任意にスプライスドナー部位及びアクセプター部位が除去されている前記Ｒｅｐ５２オープンリーディングフレーム、又は前記Ｒｅｐ４０オープンリーディングフレームであって、前記オープンリーディングフレームに作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを含む、前記Ｒｅｐ４０オープンリーディングフレーム
    を含む、
    二本鎖ＤＮＡエレメント。
  4. 前記第１のプロモーターがＰ５プロモーターである、請求項２又は３に記載の二本鎖ＤＮＡエレメント。
  5. 前記第２のプロモーターがＰ１９プロモーターである、請求項３又は４に記載の二本鎖ＤＮＡエレメント。
  6. （ｃ）において、前記コード鎖が、その３’末端に、
    －すべて作動可能に連結されている、第３のプロモーター、ｃａｐオープンリーディングフレーム、並びにポリアデニル化シグナル配列及び／又はターミネーター配列
    をさらに含む、
    請求項３～５のいずれか一項に記載の二本鎖ＤＮＡエレメント。
  7. （ａ）Ｅ１Ａオープンリーディングフレーム及びＥ１Ｂオープンリーディングフレーム；並びに／又は
    （ｂ）Ｅ２Ａオープンリーディングフレーム及びＥ４ｏｒｆ６オープンリーディングフレーム
    を含む、二本鎖ＤＮＡ分子であって、
    （ａ）又は／及び（ｂ）の第１のオープンリーディングフレーム及び第２のオープンリーディングフレームが、コード鎖及び鋳型鎖を含む二本鎖ＤＮＡエレメント内に含まれることを特徴とし、
    前記コード鎖が、５’から３’方向に、以下の順序で、
    －第１のプロモーター、
    －右逆方向反復に変異を含む第１のリコンビナーゼ認識配列、
    －前記コード鎖に対して反転している第２のプロモーター、
    －前記コード鎖に対して反転している（ａ）又は（ｂ）の前記第１のオープンリーディングフレーム、
    －左逆方向反復に変異を含み、前記第１のリコンビナーゼ認識配列に対して逆向きである、第２のリコンビナーゼ認識配列、及び
    －（ａ）又は（ｂ）の前記第２のオープンリーディングフレーム
    を含む、
    二本鎖ＤＮＡ分子。
  8. 請求項１～７から選択される２つ以上の二本鎖ＤＮＡエレメント又は分子を含む、二本鎖ＤＮＡ分子。
  9. 前記二本鎖ＤＮＡエレメント又は分子と、前記第１のリコンビナーゼ認識配列及び前記第２のリコンビナーゼ認識配列に機能的なリコンビナーゼとのインキュベーションが、
    －前記第１のリコンビナーゼ認識配列と前記第２のリコンビナーゼ認識配列との間に配列の反転を生じさせ、その後、前記第１のプロモーターが第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、且つ
    －組換え後の前記第１のプロモーターと第１の遺伝子との間に、前記リコンビナーゼがもはや機能しないリコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる、
    請求項２に記載の二本鎖ＤＮＡエレメント又は二本鎖ＤＮＡ。
  10. 前記二本鎖ＤＮＡエレメント又は分子と、前記第１のリコンビナーゼ認識配列及び前記第２のリコンビナーゼ認識配列に機能的なリコンビナーゼとのインキュベーションが、
    －前記第１のリコンビナーゼ認識配列と前記第２のリコンビナーゼ認識配列との間に配列の反転を生じさせ、その後、前記第１のプロモーターが前記第１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記第２のプロモーターが前記第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、且つ
    －組換え後の前記第１のプロモーターと第１の遺伝子との間に、前記リコンビナーゼがもはや機能しないリコンビナーゼ認識配列の生成を生じさせる、
    請求項１および３～８のいずれか一項に記載の二本鎖ＤＮＡエレメント又は二本鎖ＤＮＡ。
  11. －請求項１に記載の１つ若しくは複数の二本鎖ＤＮＡエレメント、又は
    －請求項２～６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡエレメント、又は
    －請求項２～６のいずれか一項に記載の１つの二本鎖ＤＮＡ分子及び請求項７に記載の１つの二本鎖ＤＮＡ分子、又は
    －請求項７に記載の少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子、又は
    －請求項８に記載の１つ若しくは複数の二本鎖ＤＮＡ
    を含む、哺乳動物細胞。
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