JP2023546103A - Ａｎｇｐｔｌ３を阻害するための新規のｒｎａ組成物および方法 - Google Patents

Ａｎｇｐｔｌ３を阻害するための新規のｒｎａ組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｄｓＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害する方法、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現と関連づけられる１つまたはそれ以上の状態を処置する方法に関する。

Description

配列表
基準として役立つ核酸配列が本明細書に開示されている。同じ配列を特許事項のために標準的な要件に従った形式の配列表に提示する。標準的な配列表といかなる配列の相違がある場合も、本明細書に記載されている配列が基準であるものとする。
発明の分野
本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｄｓＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害する方法、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現に関連する１つまたはそれ以上の状態を処置する方法に関する。
アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）は、脂質およびグルコース代謝ならびに血管形成に関与すると考えられているＡＮＧＰＴＬファミリーメンバーである。アンジオポエチン５、ＡＮＧＰＴ５、ＦＨＢＬ２、およびＡＮＬ３としても知られているＡＮＧＰＴＬ３は、血漿トリグリセリド（ＴＧ）、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）のレベルを含む、血漿脂質レベルを調節する５４ｋＤａの肝臓分泌性タンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ３は、ＴＧおよびリン脂質の加水分解に関係するリポタンパク質リパーゼおよび血管内皮リパーゼを阻害する（非特許文献１）。上昇したレベルの血漿トリグリセリド（例えば、１５０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上）およびＬＤＬ（例えば、１３０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上）、ならびに低下したレベルのＨＤＬ（例えば、６０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以下）は、例えば、肥満、高血圧、高コレステロールレベル、高血糖、糖尿病およびメタボリックシンドロームなどのリスク因子の一因となることによって、心臓疾患、心臓発作、卒中、およびアテローム動脈硬化症などの心血管系疾患のリスクを著しく増加させる。非常に高いレベルの血漿トリグリセリド（例えば、５００ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上）は、膵炎のリスクを著しく増加させる。
特許文献１は、アンジオポエチン様（ＡＮＧＰＴＬ３）ＲＮＡ組成物およびその使用の方法について開示している。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された制御機構において、遺伝子発現をブロックすることが示された。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉＲ、およびａｎｔａｇｏｍｉＲなどの一本鎖オリゴヌクレオチドの作用機序とは異なる作用機構のようである。ＲＮＡ干渉技術において、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）と結合し、ここでは、一方の鎖（「パッセンジャー鎖」または「センス鎖」）が取り除かれ、残りの鎖（「ガイド鎖」または「アンチセンス鎖」）はＲＩＳＣと協働して、相補的なＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と結合する。標的ＲＮＡは、結合を受けると、ＲＩＳＣ中のＲＮＡエンドヌクレアーゼアルゴノート（ＡＧＯ）によって切断された後、ＲＮＡエキソヌクレアーゼによってさらに分解される。ＲＮＡｉは、現在、異常なまたは望ましくない遺伝子の発現が原因となる障害を処置するための新しいクラスの治療用薬剤を開発するために使用されている。
ＷＯ２０１２／１７７７８４
Ｔｉｋｋａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ（２０１６年）５２（２）：１８７～９３頁
トリグリセリドおよび脂質代謝の制御におけるＡＮＧＰＴＬ３の重要性、ならびに上昇したトリグリセリドおよびＬＤＬレベルに関連する疾患の罹患率のため、ＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害剤を特定すること、ならびにそのような阻害剤を効能および細胞傷害性などの望ましくない副作用に関して試験することが継続して必要とされている。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するために有用なｄｓＲＮＡが、本明細書において提供される。本明細書において提供されるｄｓＲＮＡは、上昇したトリグリセリド、ＶＬＤＬおよび／もしくはＬＤＬレベルを正常な範囲に低下させることができるか、または正常なトリグリセリドレベルを維持することができ、結果として全般的に改善された健康状態をもたらす。本開示のＲＮＡ薬剤は、上昇したＴＧおよび／またはＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－ｃ）レベルによって全体または一部特徴づけられる脂質代謝障害などの症状（例えば、高トリグリセライド血症、ならびに高脂血症、例えば、家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症（例えば、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、またはＨｏＦＨ）、および多遺伝子性高コレステロール血症）を処置するために使用することができる。本開示のＲＮＡ薬剤はまた、上昇したＴＧおよびＬＤＬ－ｃレベルを有する患者の心血管リスク（例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、心臓疾患、心臓発作、および卒中）を低下させるために使用することができる。
したがって、ヒトアンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子のＲＮＡ転写物上の標的配列を標的とすることによってＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が本明細書において提供され、ｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス配列は、標的配列と少なくとも９０％同一であり、標的配列は、配列番号１１８１のヌクレオチド１３５～１５３、１４３～１６１、１４３～１６３、１４４～１６２、１４５～１６３、１５０～１６８、１５１～１６９、１５２８～１５４６、１５３０～１５４８、１５３２～１５５０、１５３３～１５５１、１５３５～１５５３、１６０２～１６２０、２６１２～２６３０、または２７７３～２７９１である。いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、１５～２５の連続するヌクレオチドの領域にわたり互いに相補的である。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、３０ヌクレオチド長を超えない。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡの標的配列は、配列番号１１８１のヌクレオチド１３５～１５３、１４３～１６１、１４３～１６３、１４４～１６２、１４５～１６３、１５０～１６８、１５１～１６９、１５２８～１５４６、１５３０～１５４８、１５３２～１５５０、１５３３～１５５１、１５３５～１５５３、１６０２～１６２０、２６１２～２６３０、または２７７３～２７９１である。さらに別の実施形態において、標的配列は、配列番号１１８１のヌクレオチド１３５～１５３、１４３～１６１、１４４～１６２、１４５～１６３、１５０～１６８、または１５３５～１５５３である。さらに別の実施形態において、標的配列は、ヌクレオチド１４３～１６１、１５３５～１５５３および１３５～１５３である。本明細書中で使用される場合、配列番号Ｚの範囲「ｘ～ｙ」と定義される標的配列は、配列番号Ｚの核酸配列の位置ｘのヌクレオチドから開始し、位置ｙのヌクレオチドで終了する標的配列からなる。実例として、明確にするために、範囲「１３５～１５３」と定義される標的配列は、配列番号１１８１の核酸配列の位置１３５のヌクレオチドから開始し、位置１５３のヌクレオチドで終了する標的配列からなる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２２７～２２９、２６１～２６５、２６９、３４３、３５６、３７９、３８５、３８６、および４２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるアンチセンス配列を含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡのセンス配列およびアンチセンス配列は、相補的であり、この場合、ａ）センス配列は、配列番号１３～１５、４７～５１、５５、１２９、１４２、１６５、１７１、１７２、および２１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；またはｂ）アンチセンス配列は、配列番号２２７～２２９、２６１～２６５、２６９、３４３、３５６、３７９、３８５、３８６、および４２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、ａ）配列番号１３（センス鎖）および２２７（アンチセンス鎖）；ｂ）配列番号１４および２２８；ｃ）配列番号１５および２２９；ｄ）配列番号４７および２６１；ｅ）配列番号４８および２６２；ｆ）配列番号４９および２６３；ｇ）配列番号５０および２６４；ｈ）配列番号５１および２６５；ｉ）配列番号５５および２６９；ｊ）配列番号１２９および３４３；ｋ）配列番号１４２および３５６；ｌ）配列番号１６５および３７９；ｍ）配列番号１７１および３８５；ｎ）配列番号１７２および３８６；またはｏ）配列番号２１２および４２６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、ａ）配列番号１３および２２７；ｂ）配列番号１４および２２８；ｃ）配列番号１５および２２９；ｄ）配列番号５１および２６５；ｅ）配列番号１６５および３７９；またはｆ）配列番号１７１および３８５のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、この場合、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチド、または２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドおよび２つまたはそれ以上の２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボヌクレオチドを（例えば、交互のパターンで）含む。いくつかの実施形態において、センス配列およびアンチセンス配列は、交互の２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドおよび２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、そのセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端に反転２’－デオキシリボヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、ａ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハング；および／またはｂ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングをさらに含む。さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡ中のオーバーハングは、２または３つのヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ中のオーバーハングは、１つまたはそれ以上のチミンを含む。
いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号４４１～４４３、４７５～４７９、４８３、５５７、５７０、５９３、５９９、６００、および６４０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；ならびに／またはアンチセンス鎖は、配列番号６５５～６５７、６８９～６９３、６９７、７７１、７８４、８０７、８１３、８１４、および８５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、ａ）配列番号４４１および６５５；ｂ）配列番号４４２および６５６；ｃ）配列番号４４３および６５７；ｄ）配列番号４７５および６８９；ｅ）配列番号４７６および６９０；ｆ）配列番号４７７および６９１；ｇ）配列番号４７８および６９２；ｈ）配列番号４７９および６９３；ｉ）配列番号４８３および６９７；ｊ）配列番号５５７および７７１；ｋ）配列番号５７０および７８４；ｌ）配列番号５９３および８０７；ｍ）配列番号５９９および８１３；ｎ）配列番号６００および８１４；またはｏ）配列番号６４０および８５４のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、リンカーを伴い、または伴わずに１つまたはそれ以上のリガンド（例えば、１つもしくはそれ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖は、
Figure 2023546103000001
 の構造を有する１つまたはそれ以上の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中：
－ Ｂは、複素環式核酸塩基であり、
－ Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分もしくは式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、
－ Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１もしくはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、以下であり：
・ 場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基（式中、
Ｊは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）、
・ 場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
・ 基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３（式中、
ｍは、０もしくは１を意味する整数であり、
ｐは、０から１０の範囲の整数であり、
Ｒ２は、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、もしくは－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、
Ｋは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、
もしくはＲ３は、細胞標的化部分である）、
－ Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
－ Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈもしくは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物を含む本ｄｓＲＮＡ中の、Ｙは、
ａ）Ｒ１が、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
ｂ）Ｒ１が、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基である、ＮＲ１；
ｃ）Ｒ１が、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基である、ＮＲ１；
ｄ）Ｒ１が、シクロヘキシル基である、ＮＲ１；
ｅ）Ｒ１が、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
ｆ）Ｒ１が、フェニル基によって置換されたメチル基である、ＮＲ１；
ｇ）Ｒ１が、場合により、置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１；または
ｈ）Ｒ１が、メチルもしくはペンタデシルである、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１
である。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む本ｄｓＲＮＡ中の、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物を含む本ｄｓＲＮＡ中の、Ｒ３は、式（ＩＩ）：
Figure 2023546103000002
 または薬学的に許容されるその塩であり、
式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、ＯＨであり、
Ａ４は、ＯＨまたはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、式中、Ｒ５は、場合により、ハロゲン原子によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む本ｄｓＲＮＡ中の、Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンである。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡは、表ＡおよびＢの１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡは、２から１０個の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡは、センス鎖上に２から１０個の式（Ｉ）の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡ中の、センス鎖は、５’末端に２から５個の式（Ｉ）の化合物を含み、および／または３’末端に１から３個の式（Ｉ）の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡ中の、
ａ）センス鎖の５’末端にある２から５つの式（Ｉ）の化合物は、ｌｇＴ３および／もしくはｌｇＴ７を含み、場合により、３つの連続したｌｇＴ３ヌクレオチドを含む；ならびに／または
ｂ）センス鎖の３’末端にある１から３つの式（Ｉ）の化合物は、ｌＴ４もしくはｌＴ３を含み、場合により、２つの連続したｌＴ４を含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡは、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル－ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、からなる群から独立して選択される１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基、または薬学的に許容されるその塩を含む。
いくつかの実施形態において、本ｄｓＲＮＡは、表１～３のｄｓＲＮＡから選択される。
いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号８５８、９０２、９０７、９１１、９１５、９３４、９７０、９７９、および９８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；アンチセンス鎖は、配列番号１０２０、１０６４、１０６９、１０７３、１０７７、１０９６、１１３２、１１４１、および１１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、ａ）配列番号８５８および１０２０；ｂ）配列番号９０２および１０６４；ｃ）配列番号９０７および１０６９；ｄ）配列番号９１１および１０７３；ｅ）配列番号９１５および１０７７；ｆ）配列番号９３４および１０９６；ｇ）配列番号９７０および１１３２；ｈ）配列番号９７９および１１４１；またはｉ）配列番号９８８および１１５０のヌクレオチド配列を含む。
本開示は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡまたはＤＮＡベクター、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。本開示は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害することを必要とするヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する際に使用するための、またはＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置もしくは予防することを必要とするヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置もしくは予防する際に使用するための、本ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡベクター、または組成物も本開示において提供される。本開示はまた、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害することを必要とするヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する際に使用するためのｄｓＲＮＡ、またはそれを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、ヒトの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡによって阻害される。本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置または予防することを必要とするヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置または予防する際に使用するためのｄｓＲＮＡ、またはそれを含む組成物をさらに提供する。特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３関連状態は、脂質代謝障害である。特定の実施形態において、脂質代謝障害は、高トリグリセライド血症である。
本ｄｓＲＮＡもしくは組成物を哺乳動物に投与することによって、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害すること、またはＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置もしくは予防することを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）においてＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する方法、またはＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置もしくは予防する方法が、本開示においてさらに提供される。
ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害すること、またはＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置もしくは予防することを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）において、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するため、またはＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置もしくは予防するための薬剤の製造における本ｄｓＲＮＡの使用、ならびに製造品（例えば、キット）が、本開示においてさらに提供される。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、処置方法において哺乳動物（例えば、ヒト）の肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する。特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３関連状態は、脂質代謝障害、例えば、高トリグリセライド血症ならびに関連疾患ならびに状態、例えば、アテローム動脈硬化症、膵炎、および高脂血症、例えば、家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症（例えば、ＨｏＦＨ）、および多遺伝子性高コレステロール血症である。
それぞれ、０．１または１ｎＭの示した１６４個の試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｅｐ３Ｂ細胞溶解物中におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 それぞれ、０．１または１ｎＭの示した１６４個の試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｅｐ３Ｂ細胞溶解物中におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 それぞれ、０．１または１ｎＭの示した１６４個の試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｅｐ３Ｂ細胞溶解物中におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 １８個の選択された試験ｓｉＲＮＡのヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞傷害効果を示すグラフである。生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ）および毒性（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ）に関して分析される前に、細胞を５または５０ｎＭの示したｓｉＲＮＡで処理した。得られた読み取りの比を、非標的化ｓｉＲＮＡ対照に関する結果と比較して示す。エラーバーは、標準偏差を示す。 ３人のドナーから単離され、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡまたは対照をトランスフェクションされたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清に放出されるインターフェロンα（ＩＦＮα）タンパク質の量を示す免疫刺激のグラフである。タンパク質濃度をＥＬＩＳＡによって求めた。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み（ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ）後のヒト初代肝細胞における１１個の選択されたＧａｌＮＡｃコンジュゲート試験ｓｉＲＮＡの細胞傷害効果を示すグラフである。生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ）および毒性（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ）に関して分析される前に、細胞を１、５、または２５μＭの示したｓｉＲＮＡで処理した。得られた読み取りの比を、未処理対照に関する結果に対して、毒性陽性対照および非標的化ｓｉＲＮＡ対照と比較して示す。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＥＬＩＳＡアッセイによって求められるＡＮＧＰＴＬ３を標的とする増加する濃度の１１個の選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ（自然な取り込み）で処理されたヒト初代肝細胞の上清に分泌されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。エラーバーは、標準偏差を示す。 それぞれ、１０、１００、または１０００ｎＭの１１個の選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ（およびヌクレオチド対照）（自然な取り込み）による処理後のヒト初代肝細胞において観察される相対的ｍＲＮＡ発現（ｑＰＣＲによって求められる）とタンパク質発現（ＥＬＩＳＡアッセイによって求められる）との間の相関性を示すグラフである。 ０日目に１２ｍｇ／ｋｇの選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡにより皮下処置されたマウスの血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを示すグラフである。処置マウスは、肝臓特異的なアデノ随伴ウイルスベクターからヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。エラーバーは、標準偏差を示す。 それぞれ０．１または１ｎＭの示した５２個のさらなる試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｅｐ３Ｂ細胞溶解物中におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 それぞれ０．１および１ｎＭの示した５２個のさらなる試験ｓｉＲＮＡによる処理後のカニクイザル初代肝細胞溶解物中におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡ発現は、非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 １１個のさらなる試験ｓｉＲＮＡのヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞傷害効果を示すグラフである。生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ）および毒性（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ）に関して分析される前に、細胞を５または５０ｎＭの示したｓｉＲＮＡで処理した。得られた読み取りの比を、非標的化ｓｉＲＮＡ対照に関する結果と比較して示す。エラーバーは、標準偏差を示す。 ３人のドナーから単離され、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡまたは対照をトランスフェクションされたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清に放出されたインターフェロンα（ＩＦＮα）タンパク質の量を示す免疫刺激のグラフである。タンパク質濃度は、ＥＬＩＳＡによって求めた。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み後のヒト初代肝細胞における６個の選択されたＧａｌＮＡｃコンジュゲート試験ｓｉＲＮＡの細胞傷害効果を示すグラフである。生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ）および毒性（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ）に関する分析の前に示した１、５、または２５μＭのｓｉＲＮＡで細胞を処理した。得られた読み取りの比を、未処理対照に関する結果に対して、毒性陽性対照、非標的化ｓｉＲＮＡ対照、および第１回のスクリーニングから選択された２つのｓｉＲＮＡと比較して示す。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＥＬＩＳＡアッセイによって求められるＡＮＧＰＴＬ３を標的とする増加する濃度の４個の選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ（自然な取り込み）で処理されたヒト初代肝細胞の上清に分泌されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。第１回のスクリーニングから選択された２つのｓｉＲＮＡが基準として含まれた。エラーバーは、標準偏差を示す。 ０日目に１０ｍｇ／ｋｇの両スクリーニング回から選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡにより皮下処置されたマウスの血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを示すグラフである。処置マウスは、肝臓特異的なアデノ随伴ウイルスベクターからヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下で１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの親ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１５Ｅおよび１５Ｆ）に基づく３×５４個の試験ｓｉＲＮＡにより細胞を７２時間処理した後の初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２、非標的化ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下で１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの親ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１５Ｅおよび１５Ｆ）に基づく３×５４個の試験ｓｉＲＮＡにより細胞を７２時間処理した後の初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２、非標的化ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下で１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの親ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１５Ｅおよび１５Ｆ）に基づく３×５４個の試験ｓｉＲＮＡにより細胞を７２時間処理した後の初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２、非標的化ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下で１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの親ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１５Ｅおよび１５Ｆ）に基づく３×５４個の試験ｓｉＲＮＡにより細胞を７２時間処理した後の初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２、非標的化ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下で１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの親ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１５Ｅおよび１５Ｆ）に基づく３×５４個の試験ｓｉＲＮＡにより細胞を７２時間処理した後の初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２、非標的化ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下で１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの親ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１５Ｅおよび１５Ｆ）に基づく３×５４個の試験ｓｉＲＮＡにより細胞を７２時間処理した後の初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２、非標的化ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞と比較して表される。エラーバーは、標準偏差を示す。 ３人のドナーから単離され、１００ｎＭ濃度のそれぞれの親配列（ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ）とともに２４個の選択された修飾ＧａｌＮＡｃ ＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡまたは対照を２４時間トランスフェクションされたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清に放出されたインターフェロンα２ａ（ＩＦＮ－α２ａ）タンパク質の量によって示される免疫刺激を示すグラフである。タンパク質濃度をＥＬＩＳＡによって求めた。エラーバーは、標準偏差を示す。 それぞれの親配列（ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ）とともに２４個の選択された修飾ＧａｌＮＡｃ ＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡのヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞傷害効果を示すグラフである。生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ）および毒性（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ）に関して分析される前に、細胞に、５または５０ｎＭ濃度の示したｓｉＲＮＡを７２時間トランスフェクションした。得られた読み取りの比を、非標的化ｓｉＲＮＡ対照に関する結果と比較して示す。エラーバーは、標準偏差を示す。 ０日目に５ｍｇ／ｋｇの選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡにより１回皮下処置されたマウスにおける経時的な血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを示すグラフである。これらは、親配列ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１８Ａ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１８Ｂ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１８Ｃ）に基づく３×８個のｓｉＲＮＡの結果を示す。処置マウスは、肝臓特異的なアデノ随伴ウイルスベクターからヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。 ０日目に５ｍｇ／ｋｇの選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡにより１回皮下処置されたマウスにおける経時的な血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを示すグラフである。これらは、親配列ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１８Ａ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１８Ｂ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１８Ｃ）に基づく３×８個のｓｉＲＮＡの結果を示す。処置マウスは、肝臓特異的なアデノ随伴ウイルスベクターからヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。 ０日目に５ｍｇ／ｋｇの選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡにより１回皮下処置されたマウスにおける経時的な血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを示すグラフである。これらは、親配列ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ（図１８Ａ）、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ（図１８Ｂ）、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ（図１８Ｃ）に基づく３×８個のｓｉＲＮＡの結果を示す。処置マウスは、肝臓特異的なアデノ随伴ウイルスベクターからヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
本開示は、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の発現を阻害する新規の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｄｓＲＮＡは、脂質代謝障害（例えば、脂質異常症、混合型脂質異常症、高トリグリセライド血症、および膵炎などの関連疾患）などの状態を処置するために使用することができる。別に明記されない限り、「ＡＮＧＰＴＬ３」は、本明細書ではヒトＡＮＧＰＴＬ３を指す。ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１４４９５．３（配列番号１１８１）として入手可能であり、そのポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５３１０．１（配列番号１１８２）として入手可能である。特定の実施形態において、本開示は、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３に言及する。カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＭ＿００５５４３１８５．１（配列番号１１８３）として入手可能であり、そのポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＰ＿００５５４３２４２．１（配列番号１１８４）として入手可能である。
本開示のｄｓＲＮＡ（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分を伴う、または伴わないｄｓＲＮＡ）は、１、２、３、または４つすべての以下の特性を有する場合がある：（ｉ）インビトロにおいて少なくとも２４、２６、２８、３０、３２、４８、５２、５６、６０、７２、９６、または１６８時間の半減期を有する；（ｉｉ）ヒト初代ＰＭＢＣから分泌されるインターフェロンαの産生を増加させない；（ｉｉｉ）インビトロにおいて（例えば、以下の研究例に記載されているとおりのヒトＨｅｐ３Ｂ細胞、ヒト初代肝細胞、もしくはカニクイザル初代肝細胞において）ヒトＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害に関して０．００１、０．０１、０．１、０．３、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎＭを超えないＩＣ５０値を有する；および（ｉｖ）ヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現するＣ５７ＢＬ／６マウス（例えば、５、１０、１５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ以上）においてインビボでＡＮＧＰＴＬ３のタンパク質レベルを少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下させる
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、ＧａｌＮＡｃ部分を含み、１、２、３、または４つすべての以下の特性を有する：（ｉ）インビトロにおいて少なくとも２４、４８、７２、９６、または１６８時間の半減期を有する；（ｉｉ）ヒト初代ＰＭＢＣから分泌されるインターフェロンαの産生を増加させない、（ｉｉｉ）インビトロでヒトまたはカニクイザル初代肝細胞においてヒトＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害に関して９．６８ｎＭを超えないＩＣ５０値を有する；および（ｉｖ）５ｍｇ／ｋｇの単回の皮下用量後のヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてインビボでヒトＡＮＧＰＴＬ３のタンパク質レベルを少なくとも６０％低下させる。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、すべての上記特性を有する。
本明細書に記載のｄｓＲＮＡ（「単離された」ｄｓＲＮＡ）が天然には存在しないことを当業者は理解するであろう。
Ｉ． 二本鎖ＲＮＡ
本開示の特定の態様は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子に関する。本明細書中で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を有する二本鎖構造を含むオリゴリボヌクレオチド分子を指す。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分である場合もあり、またはそれらは別個のＲＮＡ分子にある場合もある。２本の鎖が別個のＲＮＡ分子上にある場合、ｄｓＲＮＡ構造は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として機能することができる。２本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間で連続したヌクレオチドの鎖によって連結されている場合、連結するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と言及され、ＲＮＡ分子は、「短ヘアピンＲＮＡ」、または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる場合もある。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有する場合もある。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上（例えば、１、２もしくは３つ）のヌクレオチドのオーバーハングを含む場合がある。本開示のｄｓＲＮＡは、下でさらに記載されるとおり（リンカーを伴い、または伴わずに）標的化部分をさらに含む場合がある。
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基の、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態のヌクレオチドの高分子形態を指す。この用語は、一および二本鎖形態を含む。
「ｄｓＲＮＡ」は、天然に存在するリボヌクレオチド、および／またはその化学修飾アナログを含むことができる。本明細書中で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」は、リボース含有ヌクレオチドを有するものに限定されない。ｄｓＲＮＡは、本明細書において、その一部またはすべてのヌクレオチド中のリボース部分は、結果として生じた二本鎖分子がＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を阻害することができる限り、別の部分によって置換されている二本鎖ポリヌクレオチド分子を包含する。ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはその化学修飾アナログを含むこともできるが、６０％を超えない（例えば、５０％、４０％、３０％、２０％、もしくは１０％を超えない）。
本開示のｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして、二本鎖構造を形成する程、十分に相補的である。「アンチセンス配列」という用語は、実質的または完全に相補的で、生理的条件下で細胞において標的ＲＮＡ配列と結合する配列を指す。「標的配列」は、標的遺伝子、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、一次ＲＮＡ転写物またはメッセンジャーＲＮＡ転写物）上のヌクレオチド配列を指す。「センス配列」という用語は、アンチセンス配列と実質的または完全に相補的な配列を指す。
本開示のＡＮＧＰＴＬ３標的ｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センスおよびアンチセンス配列は、互いに実質的または完全に相補的である。別に指示がある場合を除いて、「相補的な」という用語は、本明細書においては、特定の条件、例えば、生理的条件下において、第２の連続するヌクレオチド配列を含む別のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する、第１の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの能力を指す。これは、第１または第２の連続するヌクレオチド配列の全長にわたり２つのポリヌクレオチドの塩基対合を含むことができ；この場合、２つのヌクレオチド配列は、互いに「完全に相補的である」と見なされる。例えば、ｄｓＲＮＡが２１ヌクレオチド長の第１のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長の第２のオリゴヌクレオチドを含み、２つのオリゴヌクレオチドが２１の連続的な塩基対を形成する場合、２つのオリゴヌクレオチドは、互いに「完全に相補的である」と言及される。第１のポリヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチド配列と「実質的に相補的である」と言及される場合、２つの配列は、ハイブリダイゼーションの長さの８０％またはそれ以上（例えば、９０％またはそれ以上）にわたり互いに塩基対を作ることができ、ミスマッチ塩基対は２０％を超えない（例えば、１０％を超えない）（例えば、２０ヌクレオチドの二本鎖に対して、４つを超えないまたは２つを超えないミスマッチ塩基対）。２つのオリゴヌクレオチドが、１つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングと二本鎖を形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。２つの配列の相補性は、ワトソン・クリック塩基対および／または非ワトソン・クリック塩基対に基づく場合もある。本明細書中で使用される場合、ｍＲＮＡの「少なくとも一部と実質的に相補的である」ポリヌクレオチドは、目的とするｍＲＮＡ（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡ）の連続的な部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。
いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３標的ｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡであり、この場合、センスおよびアンチセンス鎖が互いに共有結合していない。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３標的ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、例えば、ヘアピンループ（ｓｈＲＮＡの場合など）により、またはヘアピンループ以外の手段によって（「共有結合性リンカー」と呼ばれる結合構造によってなど）互いに共有結合している。
Ｉ．１ 長さ
いくつかの実施形態において、（センス鎖中の）センス配列および（アンチセンス鎖中の）アンチセンス配列のそれぞれは、９～３０ヌクレオチド長である。例えば、各配列は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限および９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、各配列中のヌクレオチドの数は、１５～２５、１５～３０、１６～２９、１７～２８、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、または１９～２１が可能である。
いくつかの実施形態において、各配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、各配列は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、各配列は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス配列はそれぞれ、少なくとも１５であり、２５を超えないヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス配列はそれぞれ、少なくとも１９であり、２５を超えないヌクレオチド長である。例えば、配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
センス配列およびアンチセンス配列は、同じか、または異なる長さの場合もある。例えば、アンチセンス配列は、２１のヌクレオチドを有することができるが、センス配列は、２３のヌクレオチドを有することができる。別の例において、アンチセンス配列およびセンス配列はともに、１９のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３標的ｄｓＲＮＡは、同じ長さまたは異なる長さのセンスおよびアンチセンス鎖を有する。例えば、センス鎖は、アンチセンス鎖よりも１、２、３、４、５、６、または７ヌクレオチド長いこともある。あるいは、センス鎖は、アンチセンス鎖よりも１、２、３、４、５、６、または７ヌクレオチド短いこともある。
いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、９～３６ヌクレオチド長である。例えば、各鎖は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６の上限および９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、各鎖中のヌクレオチドの数は、１５～２５、１５～３０、１６～２９、１７～２８、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、または１９～２１が可能である。
いくつかの実施形態において、各鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、各鎖は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、各鎖は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖はそれぞれ、少なくとも１５であり、２５を超えないヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖はそれぞれ、少なくとも１９であり、２３を超えないヌクレオチド長である。例えば、鎖は、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センス鎖は、任意の修飾ヌクレオチドを含む２１、２２、２３、２４、または２５のヌクレオチドを有すことができるが、アンチセンス鎖は、任意の修飾ヌクレオチドを含む２１、２２、または２３のヌクレオチドを有することができる。特定の実施形態において、センス鎖は、１９、２０、または２１のヌクレオチドを有するセンス配列を有することができるが、アンチセンス鎖は、１９、２０、または２１のヌクレオチドを有するアンチセンス配列を有することができる。
Ｉ．２ オーバーハング
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖の一方または両方の３’末端、５’末端、または両末端に１つまたはそれ以上のオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のオーバーハングは、ｄｓＲＮＡの安定性および／または阻害活性を向上させる。
「オーバーハング」は、本明細書では、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の３’末端が第２の鎖の５’末端を超えて延びる場合、または逆の場合のｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する対になっていないヌクレオチドを指す。「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に対になっていないヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたり二本鎖である、すなわち、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡの３’末端および／または５’末端にコンジュゲートされた化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、ｄｓＲＮＡがオーバーハングを有するか否かを判断する際にここでは考慮されない。
いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。例えば、オーバーハングは、１、２、３、または４つのヌクレオチドを含むこともある。
いくつかの実施形態において、本開示のオーバーハングは、１つまたはそれ以上のヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、その天然に存在するもしくは化学修飾アナログ）を含む。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１つもしくはそれ以上のチミンまたはその化学修飾アナログを含む。特定の実施形態において、オーバーハングは、１つまたはそれ以上のチミンを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置するオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方の５’末端に位置するオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の５’末端にオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の５’末端にオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つの平滑末端を有する。
いくつかの実施形態において、オーバーハングは、センス鎖がアンチセンス鎖よりも長いことの結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、アンチセンス鎖がセンス鎖よりも長いことの結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、ねじれた同じ長さのセンスおよびアンチセンス鎖の結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを生じる。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、標的ｍＲＮＡと相補的である。
特定の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、５’－ＣＣＡ－［センス配列］－ｉｎｖｄＴの配列を有するセンス鎖、および５’－［アンチセンス配列］－ｄＴｄＴ－３’の配列を有するアンチセンス鎖を含み、トリヌクレオチドＣＣＡは、修飾される場合もある（例えば、２’－Ｏ－メチル－Ｃおよび２’－Ｏ－メチル－Ａ）。
Ｉ．３ 標的およびｄｓＲＮＡ配列
本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＡＮＧＰＴＬ３ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）中の１２～３０ヌクレオチド長の標的配列と実質的または完全に相補的なアンチセンス配列を含む。例えば、標的配列は、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限および１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、標的配列中のヌクレオチドの数は、１５～２５、１５～３０、１６～２９、１７～２８、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、または１９～２１が可能である。
いくつかの実施形態において、標的配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、標的配列は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、標的配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的配列は、少なくとも１５であり、２５を超えないヌクレオチド長；例えば、少なくとも１９であり、２３を超えないヌクレオチド長、または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド長である。
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ転写物の５’非コード領域、コード領域、または３’非コード領域にあることもある。標的配列は、非コードおよびコード領域の接合部に位置する場合もある。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡアンチセンス鎖は、標的配列と１つまたはそれ以上のミスマッチ（例えば、１、２、３もしくは４つのミスマッチ）を有するアンチセンス配列を含む。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列中の対応する部分と完全に相補的であり、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列中の対応する部分と完全に相補的または実質的に相補的（例えば、少なくとも１つもしくは２つのミスマッチを含む）である。そのようなｄｓＲＮＡの利点の１つは、カニクイザルなどの非ヒト霊長類におけるｄｓＲＮＡの臨床前インビボ試験を可能にすることである。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡセンス鎖は、（例えば、ヒトまたはカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ中の）標的配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるセンス配列を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列（配列番号１１８１）中の標的配列は、以下のヌクレオチドに、またはそのあたり（例えば、その３ヌクレオチド以内）に開始および終了ヌクレオチド位置を有する：１３５および１５３、１４３および１６１、１４３および１６３、１４４および１６２、１４５および１６３、１５０および１６８、１５１および１６９、１５２８および１５４６、１５３０および１５４８、１５３２および１５５０、１５３３および１５５１、１５３５および１５５３、１６０２および１６２０、２６１２および２６３０、ならびに２７７３および２７９１。いくつかの実施形態において、標的配列は、１３５から１５１の間に開始ヌクレオチド位置および１５３から１６９の間に終了ヌクレオチド位置、または１５２８から１５３５の間に開始ヌクレオチド位置および１５４６から１５５３の間に終了ヌクレオチド位置を有する。特定の実施形態において、標的配列は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１３５～１５３、１４３～１６１、１４４～１６２、１４５～１６３、１５０～１６８、または１５３５～１５５３に対応し、開始および終了位置は、番号を付けた位置の３ヌクレオチド以内で変動する場合がある。いくつかの実施形態において、標的配列は、表１にセンス配列として列挙されている配列、または列挙されている配列の少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％）のヌクレオチドを含む配列である。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、表１に示されるセンス配列を含むセンス鎖を含む。例えば、センス鎖は、配列番号１３～１５、４７～５１、５５、１２９、１４２、１６５、１７１、１７２、および２１２から選択される配列、または上記の選択された配列由来の少なくとも１５、１６、１７、もしくは１８の連続するヌクレオチドを有する配列を含む。特定の実施形態において、センス鎖は、配列番号１３～１５、５１、１６５、および１７１から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、表１に示されるアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号２２７～２２９、２６１～２６５、２６９、３４３、３５６、３７９、３８５、３８６、および４２６から選択される配列、または上記の選択された配列由来の少なくとも１５、１６、１７、もしくは１８の連続するヌクレオチドを有する配列を含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号２２７～２２９、２６５、３７９、および３８５から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、表１に示されるセンス配列を含むセンス鎖および表１に示されるアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ、以下の配列を含む：
配列番号１３および２２７；
配列番号１４および２２８；
配列番号１５および２２９；
配列番号４７および２６１；
配列番号４８および２６２；
配列番号４９および２６３；
配列番号５０および２６４；
配列番号５１および２６５；
配列番号５５および２６９；
配列番号１２９および３４３；
配列番号１４２および３５６；
配列番号１６５および３７９；
配列番号１７１および３８５；
配列番号１７２および３８６；または
配列番号２１２および４２６。
特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ、以下の配列を含む：
配列番号１３および２２７；
配列番号１４および２２８；
配列番号１５および２２９；
配列番号５１および２６５；
配列番号１６５および３７９；または
配列番号１７１および３８５。
いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号１３～１５、４７～５１、５５、１２９、１４２、１６５、１７１、１７２、および２１２から選択される配列と完全に相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号１３～１５、４７～５１、５５、１２９、１４２、１６５、１７１、１７２、および２１２から選択される配列と実質的に相補的であり、アンチセンス配列は、選択された配列に対して少なくとも１つのミスマッチ（例えば、１、２、３または４つのミスマッチ）を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号１３～１５、５１、１６５、および１７１から選択される配列と完全に相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号１３～１５、５１、１６５、および１７１から選択される配列と実質的に相補的であり、アンチセンス配列は、選択された配列に対して少なくとも１つのミスマッチ（例えば、１、２、３または４つのミスマッチ）を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３標的ｄｓＲＮＡのアンチセンス配列は、標的配列に対して１つまたはそれ以上のミスマッチを含む（例えば、一般集団における個体間の対立遺伝子の差のため）。例えば、アンチセンス配列は、標的配列に対して１つまたはそれ以上のミスマッチ（例えば、１、２、３または４つのミスマッチ）を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性の領域の中心に位置しない。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性の領域の５’および／または３’末端の５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド以内に位置する。例えば、１９のヌクレオチドのアンチセンス配列を含むｄｓＲＮＡに関して、いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、それとＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ中のその標的配列の間の相補性の領域の中心の９ヌクレオチド以内にいかなるミスマッチも含まない。
下記表１は、例となるｓｉＲＮＡコンストラクト（ＣＮＳＴ）のセンスおよびアンチセンス配列を列挙する。ＮＭ＿０１４４９５．３（配列番号１１８１）の開始（ＳＴ）および終了（ＥＤ）ヌクレオチド位置を示す。「ＳＥＱ」は、配列番号を指す。
Figure 2023546103000003
Figure 2023546103000004
Figure 2023546103000005
Figure 2023546103000006
Figure 2023546103000007
Ｉ．４ ヌクレオチド修飾
本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、細胞取り込み、標的配列に対する親和性、阻害活性、および／または安定性を向上させるために１つまたはそれ以上の修飾を含むことができる。修飾としては、例えば、末端修飾、塩基修飾、糖修飾／置換、および骨格修飾を含む、当該技術分野において既知の任意の修飾を挙げることができる。末端修飾としては、例えば、５’末端修飾（例えば、リン酸化、コンジュゲーション、および反転結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ））ならびに３’末端修飾（例えば、コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、および反転結合）を挙げることができる。塩基修飾としては、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは広範なレパートリーのパートナーと塩基対を作る塩基による置換、塩基の除去（ヌクレオチドの脱塩基修飾）、またはコンジュゲートされた塩基を挙げることができる。糖修飾または置換としては、例えば、糖部分の２’もしくは４’位における修飾、または糖部分の置換を挙げることができる。骨格修飾としては、例えば、１つまたはそれ以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、ならびにホスホルアミダートによる、例えば、リン酸ジエステル結合の修飾または置換を挙げることができる。
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在するもしくは修飾ヌクレオチド、または代替置換部分を含む。修飾ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドであり、本明細書において、「ヌクレオチドアナログ」とも呼ばれる。当業者は、ヌクレオチドのグアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、またはチミンを、修飾ヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく他の部分によって置換することができることを理解するであろう。例えば、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を作ることができる。したがって、本開示のヌクレオチド配列中のウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示の実施形態として含まれる。修飾ヌクレオチドは、リボース部分が非リボース部分により置換されたヌクレオチドも可能である。
本開示のｄｓＲＮＡとしては、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、チオホスフェートおよびホスホロチオアートなどの代替ヌクレオチド間結合を含む修飾ヌクレオチド、リン酸トリエステル修飾ヌクレオチド、末端でコレステロール誘導体または親油性部分と連結された修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）２５４：１４９７～５００頁を参照）、拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ）（ｃＥｔ）修飾ヌクレオチド、反転デオキシ修飾ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、反転ジデオキシ修飾ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｉｄｅｏｘｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドの脱塩基修飾、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノ修飾ヌクレオチド、ホスホルアミダート修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位に修飾を含む修飾ヌクレオチド、ならびに非天然塩基含有修飾ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、５’－ホスホロチオアートヌクレオチド、またはコレステロール誘導体、親油性もしくはその他の標的化部分と連結された末端ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドのヌクレオシド中への２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－Ｏ－プロピル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アミノアルキル、または２’－デオキシ－２’－フルオロ（すなわち、２’－フルオロ）基の組み込みにより、オリゴヌクレオチドに向上したハイブリダイゼーション特性および／または向上したヌクレアーゼ安定性を付与することができる。さらに、ホスホロチオアート骨格を含むオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡの１つまたはそれ以上の位置の隣接する２つのヌクレオチド間のホスホロチオアート結合）は、向上したヌクレアーゼ安定性を有する場合もある。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位などの修飾リボースを有するヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよび１つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよび２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（ＯＭｅ）および２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチド（Ｆ）を交互のパターン、例えば、パターンＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ－ＦまたはパターンＦ－ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅで含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、それぞれ２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである最大１０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、それぞれが２’－フルオロヌクレオチドである最大１０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’または３’末端に２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホロチオアート基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上のホスホロチオアート基を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、いかなるホスホロチオアート基も含まない。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のリン酸トリエステル基を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上のリン酸トリエステル基を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、いかなるリン酸トリエステル基も含まない。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分内に、例えば、デオキシリボヌクレオシドオーバーハングを含む、デオキシリボヌクレオシドなどの修飾リボヌクレオシド、および１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドを含む。ただし、いかなる状況でも、「ｄｓＲＮＡ」という用語に二本鎖のＤＮＡ分子が包含されることは自明のことである。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上の本明細書に記載されている異なる修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、最大２つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大３つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大４つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大５つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大６つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大７つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大８つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大９つの連続的な修飾ヌクレオチド、または最大１０個の連続的な修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、連続的な修飾ヌクレオチドは、同じ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、連続的な修飾ヌクレオチドは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上の異なる修飾ヌクレオチドである。
下記表２は、修飾ヌクレオチドを含む例となるｓｉＲＮＡコンストラクト（ＣＮＳＴ）の配列を列挙する。ＮＭ＿０１４４９５．３（配列番号１１８１）の開始（ＳＴ）および終了（ＥＤ）ヌクレオチド位置を示す。略語は以下のとおりである：ＳＥＱ＝配列番号；ｍＸ＝２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチド；ｆＸ＝２’－Ｆヌクレオチド；ｄＸ＝ＤＮＡヌクレオチド；ｉｎｖｄＸ＝反転ｄＸ；ＰＯ＝リン酸ジエステル結合；およびＨｙ＝ヒドロキシル基。これらのコンストラクトにおいて、それらのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、（１）修飾ヌクレオチドｍＸおよびｆＸ、（２）両鎖の５’および３’末端に「Ｈｙ」、（３）センス鎖ヌクレオチド配列の５’末端にｍＣ－ｍＣ－ｍＡ、（４）センス鎖ヌクレオチド配列の３’末端にｉｎｖｄＴ、および（５）アンチセンス鎖ヌクレオチド配列の３’末端にｄＴ－ｄＴを含むことを別にすれば、同じコンストラクト番号を有する表１のコンストラクトのセンスおよびアンチセンス配列と対応する。これらのコンストラクトにおいて、ヌクレオチドの塩基対は、いくつかの実施形態では、異なるように修飾することができ、例えば、塩基対の一方のヌクレオチドが２’－Ｏ－Ｍｅリボヌクレオチドであり、他方が２’－Ｆヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端に２つの２’－Ｆヌクレオチドを含む。
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いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、国際公開第２０１９／１７０７３１号に記載されている１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、その開示の全体を本明細書に組み入れる。そのような修飾ヌクレオチドにおいて、リボース環は、六員複素環によって置換されている。そのような修飾ヌクレオチドは、式（Ｉ）：
Figure 2023546103000033
 の構造を有するか、または薬学的に許容されるその塩であり、式中：
－ Ｂは、複素環式核酸塩基であり；
－ Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分もしくは式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、
－ Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１もしくはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、以下であり：
・ 場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基（式中、
Ｊは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）、
・ 場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
・ 基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３（式中、
ｍは、０もしくは１を意味する整数であり、
ｐは、０から１０の範囲の整数であり、
Ｒ２は、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、もしくは－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、
Ｋは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、もしくはＲ３は、細胞標的化部分である）、
－ Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
－ Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈもしくは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、ヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む、非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１である、Ｒ１は、シクロヘキシル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、フェニル基によって置換されたメチル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、場合により置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、メチルおよびペンタデシルを含む群から選択され、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリン、または薬学的に許容されるその塩を含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ中のヌクレオシド間連結基は、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル－ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、または薬学的に許容されるその塩からなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２から１０個の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む。
さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の標的ヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、式（ＩＩ）：
Figure 2023546103000034
 であり、式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、ＯＨであり、
Ａ４は、ＯＨまたはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、式中、Ｒ５は、場合により、ハロゲン原子によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンである。
式（Ｉ）のヌクレオチドを有する修飾ｓｉＲＮＡを生成するために使用することができる前駆体を、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホラミダイトヌクレオチドアナログの例を示す、表Ａに例示する。（２Ｓ，６Ｒ）ジアステレオマーシリーズにおいて、ヌクレオチド前駆体としてのホスホラミダイトは、「ｐｒｅ－ｌ」で略記され、ヌクレオチドアナログは、式（Ｉ）中の基Ｙを指定する核酸塩基および数が続く「ｌ」で略記される。両方の立体化学を区別するために、アナログ（２Ｒ，６Ｒ）－ジアステレオ異性体を、追加の「ｂ」で示す。標的ヌクレオチド前駆体、標的ヌクレオチドアナログおよび固相担体は、上記のとおり略記されるが、「ｌ」の代わりに「ｌｇ」を用いる。
Figure 2023546103000035
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式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドを、ｄｓＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’、３’、または両末端に組み込むことができる。例として、１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、もしくは５つまたはそれ以上）の修飾ヌクレオチドを、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）の修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端に位置し、この場合、修飾ヌクレオチドは、アンチセンス配列とぴったりとは合わないが、場合により、アンチセンス鎖の対応する３’末端で等しい数またはそれより小さい数の相補的なヌクレオチドと対を形成する場合もある。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１７、１８、または１９ヌクレオチド長のセンス配列を有するセンス鎖を含む場合もあり、この場合、３から５つの式（Ｉ）のヌクレオチド（例えば、式（Ｉ）の追加のヌクレオチドを伴い、もしくは伴わず３つの連続的なｌｇＴ３またはｌｇＴ７）がセンス配列の５’末端に配置され、センス鎖は２０、２１、または２２ヌクレオチド長になる。そのような実施形態において、センス鎖は、センス配列の３’末端に式（Ｉ）の２つの連続的なヌクレオチド（例えば、１Ｔ４またはｌＴ３）をさらに含み、センス鎖が２２、２３、または２４ヌクレオチド長になる場合もある。ｄｓＲＮＡは、１９ヌクレオチド長のアンチセンス配列を含む場合もあり、この場合、アンチセンス配列は、３’末端に２つの修飾ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＴ）とさらに連結され、アンチセンス鎖が２１ヌクレオチド長になることもある。さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、天然に存在するヌクレオチド間結合（リン酸ジエステル結合）のみを含み、この場合、アンチセンス鎖は、場合により、天然に存在しないヌクレオチド間結合を含むこともある。例えば、アンチセンス鎖は、骨格中の５’および／もしくは３’末端付近または５’および／もしくは３’末端にホスホロチオアート結合を含む場合もある。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドの使用は、天然に存在しないヌクレオチド間結合の使用などの他のＲＮＡ修飾の必要性を回避し、それによりｄｓＲＮＡの化学合成を簡単にする。さらに、式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドは、（ＧａｌＮＡｃ自体を含む）ＧａｌＮＡｃ誘導体などの細胞へと標的化された部分を含むよう容易に生成することができ、そのようなヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡの送達効率を向上させる。さらに、例えば、センス鎖に式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの安定性および治療効力を著しく向上させることが示された。
下記表３は、表２に列挙されているコンストラクトｓｉＲＮＡ＃０１３、ｓｉＲＮＡ＃０５１、およびｓｉＲＮＡ＃１６５から誘導される例となる修飾ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンストラクトの配列を列挙する。この表では、ｍＸ＝２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチド；ｆＸ＝２’－Ｆヌクレオチド；ｄＸ＝ＤＮＡヌクレオチド；ｌｘ＝ロックド核酸（ＬＮＡ）；ＰＯ＝リン酸ジエステル結合；ＰＳ＝ホスホロチオアート結合；およびＨｙ＝ヒドロキシル基である。
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表２および３に示される例となるｓｉＲＮＡはヌクレオチド修飾を含むが、同じ、または実質的に同じ配列であるが、異なる数、パターン、および／またはタイプの修飾を有するｓｉＲＮＡも考えられる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、片方または両方の末端にヌクレオチド（もしくはその修飾型）が付加された表１に示されるセンス鎖を含む。例えば、ｄｓＲＮＡは、５’ＣＣＡおよび／または３’ｉｎｖｄＴが付加された表１に示されるセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、片方または両方の末端にヌクレオチド（もしくはその修飾型）が付加された表１に示されるアンチセンス鎖を含む。例えば、ｄｓＲＮＡは、３’ｄＴｄＴが付加された表１に示されるアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖に５’ＣＣＡおよび３’ｉｎｖｄＴが付加され、アンチセンス鎖に３’ｄＴｄＴが付加された、表１に示されるとおりのセンスおよびアンチセンス鎖の組を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖に５’ｌｇＴ７－ｌｇＴ７－ｌｇＴ７および３’ｌＴ４－ｌＴ４が付加された、表２に示されるとおりのセンスおよびアンチセンス鎖の組を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、配列において表１に示されるセンス配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、配列において表１に示されるアンチセンス配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアンチセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、配列において表１に示されるセンスおよびアンチセンス配列それぞれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるセンスおよびアンチセンス配列を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２に示される配列を有するセンスおよびアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表３に示される配列を有するセンスおよびアンチセンス鎖を含む。
２つのヌクレオチド配列間の「同一性パーセンテージ」は、２つの最適にアライメントされた配列を比較することによって求められ、この場合、比較するための核酸配列は、２つの配列間の最適なアライメントのための参照配列と比較して、付加または欠失を有することがある。「同一性パーセンテージ」は、ヌクレオチド残基が２つの配列間、好ましくは、２つの完全な配列間で同一である位置の数を求め、同一の位置の数をアライメントウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって計算して、２つの配列間の同一性パーセンテージを得る。本明細書における目的で、２つのヌクレオチド配列間の「同一性パーセンテージ」を求めるとき、ヌクレオチドに対する修飾は考慮されない。例えば、５’－ｍＣ－ｆＵ－ｍＡ－ｆＧ－３’の配列は、５’－ＣＵＡＧ－３’の配列と１００％の配列同一性を有すると見なされる。
Ｉ．５ ｄｓＲＮＡコンジュゲート
本ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のリガンドまたは部分と共有結合的または非共有結合的に連結させることができる。そのようなリガンドおよび部分の例は、例えば、Ｊｅｏｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２００９年）２０：５～１４頁およびＳｅｂｅｓｔｙｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１５年）１２１８：１６３～８６頁に見出すことができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のリガンドとリンカーを介してコンジュゲートされる／結びつけられる。例えば、多価（例えば、二価、三価、または四価）の分岐リンカーを含む、当該技術分野において既知の任意のリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能または切断不可能な場合もある。リガンドをｄｓＲＮＡとコンジュゲートすることは、その分布を変え、その細胞の吸収および／もしくは特定の組織に対する標的化および／もしくは１つもしくはそれ以上の特定の細胞タイプ（例えば、肝臓細胞）による取り込みを増大させ、ならびに／またはｄｓＲＮＡの存続期間もしくは半減期を増大させることもある。いくつかの実施形態において、疎水性リガンドは、ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされ、細胞膜の直接的な浸透および／または細胞（例えば、肝臓細胞）を超えた取り込みを促進する。ＡＮＧＰＴＬ３標的ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に関して、標的組織は、肝臓の実質細胞（例えば、肝細胞）を含む、肝臓である場合もある。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、細胞標的リガンドとコンジュゲートされる。細胞標的リガンドは、ｄｓＲＮＡの標的細胞への送達を促進する分子部分を指し、これは、（ｉ）選択された標的受容体（例えば、標的タンパク質）を発現する細胞と結合するｄｓＲＮＡの特異度の増加；（ｉｉ）標的細胞によるｄｓＲＮＡの取り込みの増加；および（ｉｉｉ）例えば、輸送ベシクルから細胞質へのｓｉＲＮＡの移行を促進することによるｓｉＲＮＡの細胞内放出の増加など、それが標的細胞に入ったら適切に処理されるｄｓＲＮＡの能力の向上を包含する。リガンドは、例えば、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、ペプチド、脂質、炭水化物、または共リガンドに対して特異親和性を有する分子が可能である。
リガンドの特定の例としては、抗体または肝臓細胞上の特定の受容体と結合するその抗原結合フラグメント、チロトロピン、メラノトロピン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、多価マンノース、多価フコース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、トランスフェリン、ビスホスホナート、ステロイド、胆汁酸、リポ多糖、組み換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、ポリアミノ酸、アルファヘリカルペプチド、ポリグルタマート、ポリアスパルタート、レクチン、および補因子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リガンドは、１つまたはそれ以上の色素、クロスリンカー、多環式芳香族炭化水素、ペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、酵素、ハプテン、輸送／吸収促進剤、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、もしくはイミダゾールクラスター）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＬＤＬである。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコレステロール誘導体もしくは親油性部分、例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体；コール酸；ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ（トコフェロール）、ビオチン、もしくはピリドキサール）；飽和および非飽和の両方を含む胆汁酸コンジュゲートもしくは脂肪酸コンジュゲート（例えば、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）およびドコサニル（Ｃ２２）、リトコール酸および／もしくはリトコール酸オレイルアミンコンジュゲート（リトコール酸オレイル（ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ－ｏｌｅｙｌ）、Ｃ４３））；ポリマー骨格もしくは足場（例えば、ＰＥＧ、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ラクチド・グリコリドコポリマー（ＰＬＧ）、流体力学的ポリマー（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ））；ステロイド（例えば、ジヒドロテストステロン）；テルペン（例えば、トリテルペン）；カチオン性脂質もしくはペプチド；ならびに／または脂質もしくは脂質ベースの分子と結合させられる。そのような脂質または脂質ベースの分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することができる。脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの標的組織との結合を調節する（例えば、制御する）ために使用することができる。例えば、ＨＳＡとより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に導かれる可能性が低いため、体から除去される可能性が低い。
いくつかの実施形態において、細胞標的化部分またはリガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合させられる。結合は、１つまたはそれ以上のリンカー（例えば、２、３、４つまたはそれ以上のリンカー）を介する場合もある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているリンカーは、多価（例えば、二価、三価、または四価）の分岐リンカーである。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と二価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、３つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と三価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、３つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体とリンカーを用いて、または用いずに結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、４つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と４つの別々のリンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、４つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と四価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端と結合させられる。例となる、非限定的コンジュゲートおよびリンカーは、例えば、Ｂｉｅｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２００２年）１３（２）：２９５～３０２頁；Ｃｅｄｉｌｌｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１７年）２２（８）：Ｅ１３５６；Ｇｒｉｊａｌｖｏら、Ｇｅｎｅｓ（２０１８年）９（２）：Ｅ７４；Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１７年）６：１１６～３２頁；Ｎａｉｒら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．（２０１４年）１３６：１６９５８～６１頁；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２０１５年）２６：１４５１～５頁；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１８年）２８（３）：１０９～１８頁；ならびに米国特許第８，１０６，０２２号、同第９，１２７，２７６号、および同第８，９２７，７０５号に記載されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲーションは、当該技術分野において周知の方法によって容易に行うことができる（例えば、上の文書に記載されているとおり）。
ＩＩ． ｄｓＲＮＡを生成する方法
本開示のｄｓＲＮＡは、当該技術分野において既知の任意の方法によって合成することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、自動合成機の使用によって、（例えば、市販のインビトロＲＮＡ合成キットを使用した）インビトロ転写および精製によって、細胞（例えば、ｄｓＲＮＡをコードする発現カセット／ベクターを含む細胞）からの転写および精製などによって合成することができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々に合成された後、アニーリングされて、ｄｓＲＮＡを形成する。いくつかの実施形態において、場合により、細胞標的化部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ）とコンジュゲートされた式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、国際公開第２０１９／１７０７３１号の開示に従って調製することができる。
リガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡおよび本開示の配列特異的な連結されたヌクレオシドを有するリガンド分子は、例えば、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または既に連結部分を有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド・ヌクレオチド、またはリガンド分子を既に有するヌクレオシドコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有する基本単位を利用した、適したポリヌクレオチド合成機における構築を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって構築することができる。
本開示のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡは、例えば、連結分子のｄｓＲＮＡへの結合から誘導されたものなどのペンダント反応性官能基を有するｄｓＲＮＡの使用を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって合成することができる。いくつかの実施形態において、この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、任意のさまざまな保護基を有する合成されたリガンド、またはリガンドに結合した連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。いくつかの実施形態において、方法は、適切にリガンドとコンジュゲートされ、固相担体材料とさらに結合させることもできるヌクレオシドモノマーの使用によってリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡの合成を容易にする。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合したアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、まずモノマー基本単位をコントロールドポアグラス担体と長鎖アミノアルキル基により共有結合させ；その後、ヌクレオチドを標準的な固相合成技術により固相担体と結合したモノマー基本単位に結合させることによって調製される。モノマー基本単位は、ヌクレオシドまたは固相合成に適合したその他の有機化合物が可能である。
いくつかの実施形態において、５’末端にアミノ基を有する本開示の官能化ヌクレオシド配列は、ポリヌクレオチド合成機を使用して調製され、その後、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させられる。活性エステル誘導体は、当業者によく知られている。アミノ基と活性エステルの反応は、選択されたリガンドが連結基により５’位に結合したオリゴヌクレオチドを生成する。５’末端にあるアミノ基は、５’－ａｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を利用して作製することができる。いくつかの実施形態において、リガンド分子は、リガンド－ヌクレオシドホスホラミダイトの使用によってオリゴヌクレオチドと５’位においてコンジュゲートされ、この場合、リガンドは、５’－ヒドロキシ基に直接、またはリンカーを介して間接的に連結される。そのようなリガンド－ヌクレオシドホスホラミダイトは、一般に自動合成手順の終わりに使用されて、５’末端にリガンドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドをもたらす。
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを合成するためにクリックケミストリーが使用される。例えば、Ａｓｔａｋｈｏｖａら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．（２０１８年）１５（８）：２８９２～９頁；Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２０１１年）２２（１）：１０８～１４頁を参照。
ＩＩＩ． ｄｓＲＮＡの組成物および送達
本開示の特定の態様は、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡを含む組成物（例えば、医薬組成物）に関する。いくつかの実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有するか、またはそれを有するリスクがある患者を処置するのに有用である。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現に関連する疾患または障害は、脂質代謝障害（例えば、高トリグリセライド血症および高脂血症（家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症（例えば、ＨｏＦＨ）、および多遺伝子性高コレステロール血症など）ならびに上昇したＴＧおよび／もしくはＬＤＬ－ｃに関連する状態および疾患（例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、心臓疾患、心臓発作、卒中、および膵炎）、ならびに／または本明細書および当該技術分野において示されている任意のその他の関連状態および疾患である。本開示の組成物は、送達の様式に基づいて製剤化することができ、例えば、非経口投与による肝臓への送達のために製剤化された組成物を含む。
本ｄｓＲＮＡは、薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤は、液体または固体が可能であり、所望の容積、粘度、ならびにその他の関連する輸送および化学的特性をもたらすよう、計画される投与様式を念頭において選択することができる。例えば、水、生理食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、ラクトースおよびその他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、カルシウム塩（例えば、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、およびヒドロキシアパタイト）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を含む、任意の既知の薬学的に許容される賦形剤を使用することができる。
本ｄｓＲＮＡは、他の分子、分子構造体、または核酸の混合物と混合された、カプセル化された、コンジュゲートされた、または代わりに会合しているｄｓＲＮＡを含有する組成物（例えば、医薬組成物）に製剤化することができる。例えば、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含む組成物は、他の脂質低下薬（例えば、スタチン）などの他の治療用薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、本組成物（例えば、医薬組成物）は、本明細書に記載される送達ビヒクルをさらに含む。
本開示のｄｓＲＮＡは、直接または間接的に送達することができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を対象に投与することによって直接送達される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、下に記載される１つまたはそれ以上のベクターを投与することによって間接的に送達される。
本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、核酸分子を送達する方法をｄｓＲＮＡとの使用に適合させることを含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって（例えば、Ａｋｈｔａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９２年）２（５）：１３９～４４頁；国際公開第９４／０２５９５号を参照）、または当該技術分野において既知のさらなる方法により（例えば、Ｋａｎａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１３年）１２：９６７～７７頁；ＷｉｔｔｒｕｐおよびＬｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１５年）１６：５４３～５２頁；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ８：１２９～３８頁；Ｇａｒｙら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００７年）１２１（１－２）：６４～７３頁；Ｗａｎｇら、ＡＡＰＳ Ｊ．（２０１０年）１２（４）：４９２～５０３頁；Ｄｒａｚら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ（２０１４年）４（９）：８７２～９２頁；Ｗａｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ．（２０１３年）４（１）：７４～８３頁；ＥｒｄｍａｎｎおよびＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ（編）（２０１０年）“ＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＤＯＩ １０．１００７／９７８－３－６４２－１２１６８－５；ＸｕおよびＷａｎｇ、Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１５年）１０（１）：１～１２頁を参照）送達することができる。インビボ送達に関して、ｄｓＲＮＡは、組織部位に注射するか、または全身投与（例えば、吸入によるナノ粒子形態）することができる。インビボ送達は、ベータ・グルカン送達系を介して行うこともできる（例えば、Ｔｅｓｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１１年）４３６（２）：３５１～６２頁を参照）。細胞へのインビトロ導入としては、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当該技術分野において既知の方法が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含む送達ビヒクルによって送達される。いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、リポソーム、リポプレックス、複合体、またはナノ粒子である。
ＩＩＩ．１ リポソーム製剤
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層または多重膜ベシクルである。いくつかの実施形態において、リポソームは、球状の二重膜または複数の二重膜中に配置された両親媒性脂質から構成されるベシクルである。水性部分は、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合できるという利点をもつ。リポソームの利点としては、例えば、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性であり、生分解性であること；リポソームが広い範囲の水溶性および脂溶性薬物を含むことができること；ならびにリポソームがその内部区画にカプセル化された薬物を代謝および分解から保護することができることが挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８年、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁）。リポソーム製剤の調製において重要な考慮すべき事項は、リポソームの脂質表面電荷、ベシクルサイズおよび水様液の体積である。例えば、ｄｓＲＮＡを送達するために設計されたカチオン性リポソームおよび立体的に安定化されたリポソームを使用することができる。例えば、Ｐｏｄｅｓｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２００９年）４６４：３４３～５４頁；米国特許第５，６６５，７１０号を参照。
ＩＩＩ．２ 核酸・脂質粒子
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えば、以下に限定されない、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、またはＳＮＡＬＰなどの核酸・脂質粒子を形成する。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む、安定な核酸・脂質粒子を指す。本明細書中で使用される場合、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質ベシクル内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸・脂質粒子を指す。核酸・脂質粒子、例えば、ＳＮＡＬＰは、一般にカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ・脂質コンジュゲート）を含む。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈（ｉ．ｖ．）注射後に長い循環存続期間を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用に有用である。ＳＰＬＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含み、これらとしては、国際公開第００／０３６８３号に記載されているカプセル化された凝縮剤・核酸複合体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、核酸・脂質粒子中に存在するとき、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗力がある。核酸・脂質粒子およびそれらの製造の方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；および同第６，８１５，４３２号；ならびに国際公開第９６／４０９６４号に開示されている。
いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、カチオン性脂質を含む。当該技術分野において既知の任意のカチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、非カチオン性脂質を含む。当該技術分野において既知の任意の非カチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、（例えば、凝集を防ぐために）コンジュゲートされた脂質を含む。当該技術分野において既知の任意のコンジュゲートされた脂質を使用することができる。
ＩＩＩ．３ さらなる製剤
インビボでｄｓＲＮＡ分子を首尾よく送達するために検討する重要な要素としては、（１）送達分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の予防、および（３）標的組織における送達分子の蓄積が挙げられる。ｄｓＲＮＡの非特異的効果は、例えば、組織への直接注射もしくは挿入による局部投与によって、または調製物を局所投与することによって最小限にすることができる。疾患の処置のためのｄｓＲＮＡの全身投与では、ｄｓＲＮＡを、修飾するか、あるいは薬物送達系を使用して送達することができ；いずれの方法も、インビボにおけるエンドおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を妨げるよう働く。ＲＮＡの修飾または医薬賦形剤も、ｄｓＲＮＡ組成物の標的組織に対する標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することができる。上記のとおり、ｄｓＲＮＡ分子を、コレステロールなどの親油性基との化学的コンジュゲーションによって修飾して、細胞取り込みを増大させ、分解を防ぐことができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ナノ粒子（例えば、リン酸カルシウムナノ粒子）、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達系を使用して送達される。正の電荷をもつカチオン性送達系は、（負の電荷をもつ）ｄｓＲＮＡ分子の結合を促進し、負の電荷をもつ細胞膜における相互作用も増大させて、細胞によるｄｓＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｄｓＲＮＡと結合させるか、またはｄｓＲＮＡを入れるベシクルもしくはミセルを形成させることができる（例えば、Ｋｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００８年）１２９（２）：１０７～１６頁を参照）。ベシクルまたはミセルの形成は、全身投与されたときにｄｓＲＮＡの分解をさらに妨げる。カチオン性ｄｓＲＮＡ複合体を生成および投与する方法は、当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、全身投与のためのサイクロデキストリンと複合体を形成することができる。
ＩＩＩ．４ ベクターにコードされるｄｓＲＮＡ
本開示のｄｓＲＮＡは、標的細胞にｄｓＲＮＡをコードする組み換えベクター（ＤＮＡもしくはＲＮＡベクター）を導入することによって標的細胞に間接的に送達することができる。ｄｓＲＮＡは、細胞内のベクターから、例えば、ｓｈＲＮＡの形態で発現されることになり、ｓｈＲＮＡは、その後、ｓｉＲＮＡに細胞内でプロセシングされる。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、原核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、真核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、酵母菌細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、脊椎動物細胞における発現に適合している。例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど）、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス（例えば、オルソポックスまたはアビポック）など由来のベクターを含む、当該技術分野において既知のｄｓＲＮＡをコードすることが可能な任意の発現ベクターを使用することができる。ウイルスベクターまたはウイルス由来のベクターの指向性は、必要に応じて１つもしくはそれ以上の他のウイルスのエンベロープタンパク質もしくはその他の表面抗原でベクターをシュードタイプすることによって、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることによって改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、Ｍｏｋｏｌａウイルスなどの表面タンパク質でシュードタイプすることができる。ＡＡＶベクターは、異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するようベクターを操作することによって異なる細胞を標的とするように作製することができる。例えば、血清型２のゲノムに基づいて血清型２のカプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２のカプシド遺伝子を、血清型５のカプシド遺伝子によって置き換えて、ＡＡＶ２／５ベクターを生成することができる。異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、以前に示されている（例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（２００２年）７６：７９１～８０１頁を参照）。
組み換えベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現するためにベクターに核酸配列を挿入するための方法、および１つまたはそれ以上の目的の細胞にベクターを送達する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｄｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．（１９９５年）２：３０１～１０頁；Ｅｇｌｉｔｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８年）６：６０８～１４頁；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．（１９９０年）１：５～１４頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８年）３９２：２５～３０頁；Ｘｉａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２年）２０：１００６～１０頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．（２００３年）３３：４０１～６頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９８７年）６１：３０９６～１０１頁；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９６年）７０：５２０～３２頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９８９年）６３：３８２２～６頁；米国特許第５，２５２，４７９号および同第５，１３９，９４１号；ならびに国際公開第９４／１３７８８号および同第９３／２４６４１号を参照。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織におけるｄｓＲＮＡの発現に十分な調節エレメント（例えば、異種プロモーター、エンハンサーなど）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つまたはそれ以上の異種プロモーターと連結されたｄｓＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上の配列を含む。例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む、ｄｓＲＮＡを発現することができる当該技術分野において既知の任意の異種プロモーターを使用することができる。１つまたはそれ以上の異種プロモーターは、誘導性プロモーター、抑制可能なプロモーター、調節可能なプロモーター、および／または組織特異的なプロモーターが可能である。さらなるプロモーターの選択は、当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、構成的発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、調節された／誘導可能な／抑制可能な発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、組織特異的な発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントおよびｄｓＲＮＡをコードする配列は、転写単位を形成する。
本開示のｄｓＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら、ＴＩＧ（１９９６年）１２：５～１０頁；国際公開第００／２２１１３号および同第００／２２１１４号；ならびに米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞タイプにより、一過性（およそ数時間から数週間）の場合も、または持続性（数週から数か月もしくはそれ以上）の場合もある。これらの導入遺伝子は、直線的なコンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これは、組み込みもしくは非組み込みベクターが可能である。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように構築される（Ｇａｓｓｍａｎｎら、ＰＮＡＳ（１９９５年）９２：１２９２頁）。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々の発現ベクターにコードされる。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）同じ標的細胞に共導入された２つの別々の発現ベクターにおいて発現される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターにコードされる。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターに配置された別々のプロモーターから転写される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターの同じプロモーターから転写される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、ｄｓＲＮＡがステムおよびループ構造を有するよう、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆向き反復配列として同じプロモーターから転写される。
ＩＶ． ｄｓＲＮＡ療法
本開示の特定の態様は、対象（例えば、ヒトなどの霊長類対象）におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための方法であって、治療有効量の１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡ、１つもしくはそれ以上の本開示のベクター、または１つもしくはそれ以上の本開示の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。本開示の特定の態様は、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されている状態（例えばＡＮＧＰＴＬ３関連状態）を処置する方法および／または予防する方法であって、１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡおよび／または１つもしくはそれ以上の本開示のベクターおよび／または１つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているｄｓＲＮＡを含む１つもしくはそれ以上の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３発現のダウンレギュレートは、対象における高脂血症、家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症（例えば、ＨｏＦＨ）、および多遺伝子性高コレステロール血症などの脂質代謝障害；または上昇したＴＧおよびＬＤＬ－ｃに関連する疾患もしくは状態（例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈性心疾患、心臓発作、卒中、悪液質、膵炎、ならびにアルツハイマー病および多発性硬化症などの中枢神経系の疾患）の１つまたはそれ以上の症状を軽減する。
本開示の医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡの適した用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ受け手の体重の範囲である。特定の実施形態において、適した用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ受け手の体重の範囲、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ受け手の体重の範囲である。治療有効量の医薬組成物による対象の処置は、１回の処置または一連の処置を含むことがある。
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という用語は、ＡＮＧＰＴＬ３発現が関係する病理学的過程の処置、予防、もしくは維持、またはＡＮＧＰＴＬ３発現が関係する病理学的過程の明白な症状に治療上の利益をもたらす量を指す。
本明細書中で使用される場合、「ＡＮＧＰＴＬ３関連状態」という用語は、ＡＮＧＰＴＬ３の活性を阻害することが有益なあらゆる状態を含むことが意図される。そのような状態は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の過剰な産生によって、ＡＮＧＰＴＬ３活性もしくは発現を高めるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子変異によって、活性を高めるか、もしくは分解を低減するＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の異常な切断によって、および／またはＡＮＧＰＴＬ３活性が高められるか、もしくは分解が低減されるようなＡＮＧＰＴＬ３と、他のタンパク質もしくは他の内因性もしくは外因性物質との間の異常な相互作用によって引き起こされる場合がある。ＡＮＧＰＴＬ３関連状態は、高トリグリセライド血症ならびに関連疾患ならびに状態、例えば、アテローム動脈硬化症、膵炎、ならびに家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症（例えば、ＨｏＦＨ）、および多遺伝子性高コレステロール血症などの高脂血症から選択される場合がある。ＡＮＧＰＴＬ３関連状態は、例えば、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害である場合がある。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害または高トリグリセライド血症に関連する任意の症状もしくは状態を有する対象を処置するために使用される。特定の実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、薬物誘発性高トリグリセライド血症、利尿誘発性高トリグリセライド血症、アルコール誘発性高トリグリセライド血症、β－アドレナリン遮断薬誘発性高トリグリセライド血症、エストロゲン誘発性高トリグリセライド血症、グルココルチコイド誘発性高トリグリセライド血症、レチノイド誘発性高トリグリセライド血症、シメチジン誘発性高トリグリセライド血症、家族性高トリグリセライド血症、高トリグリセライド血症に関連する急性膵炎、および／または高トリグリセライド血症に関連する肝脾腫の患者を処置するために使用される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、以下から選択される１つまたはそれ以上の状態を有する対象を処置するために使用される：脂血症（ｌｉｐｉｄｅｍｉａ）（例えば、高脂血症）、脂質異常症（例えば、アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症、または混合型脂質異常症）、高リポタンパク血症、高コレステロール血症（例えば、欠損または不活性ＬＤＬＲにするＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）における機能喪失型遺伝子変異が原因となる、例えば、ＨｏＦＨ）、高コレステロール血症に関連する痛風、カイロミクロン血症、リポジストロフィー、脂肪萎縮症、メタボリックシンドローム、糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）、糖尿病前症、クッシング症候群、先端巨大症、全身性エリテマトーデス、異常グロブリン血症、多のう胞性卵巣症候群、アジソン病、糖原病１型、甲状腺機能低下症、***、アドリアマイシン心筋症、リポタンパク質リパーゼ欠損症、リソソーム酸リパーゼ欠損症、黄色腫症、発疹性黄色腫、および網膜脂血症。
さらにまたはあるいは、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、心臓および循環の状態（例えば、アテローム動脈硬化症、アンギナ、高血圧、うっ血性心不全、冠動脈疾患、再狭窄、心筋梗塞、卒中、動脈瘤、脳血管疾患、および末梢血管疾患）、肝疾患、腎疾患、ネフローゼ症候群、ならびに慢性腎疾患（例えば、***、ネフローゼ症候群、維持透析、および腎移植）などの本明細書に記載されている任意の障害に関連する１つまたはそれ以上の病的状態を有する対象を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、任意の遺伝子プロファイル（例えば、家族性高トリグリセライド血症、家族性複合型脂血症、家族性低βリポタンパク血症、もしくは家族性異常βリポタンパク血症）、処置（例えば、チアジド系利尿薬、経口避妊薬および他のエストロゲン、特定のベータ－アドレナリン遮断薬、プロポフォール、ＨＩＶ薬剤、イソトレチノイン、もしくはプロテアーゼ阻害剤の使用）、または高血中トリグリセリドまたは脂質をもたらすか、もしくはそれに起因するライフスタイル（例えば、喫煙、過度のアルコール摂取、高炭水化物食、もしくは高脂肪食）に関連する１つまたはそれ以上の状態を有する対象を処置するために使用することができる。１５０ｍｇ／ｄＬを超えるトリグリセリドレベル（例えば、血清トリグリセリドレベル）は、心血管系疾患のリスクが高いと考えられる。５００ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上のトリグリセリドレベル（例えば、血清トリグリセリドレベル）は、膵炎のリスクが高いと考えられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、体重を管理するため、または対象の脂肪量を減少させるために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはヒトおよびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の両方の発現を阻害する。治療前のレベルと比較して処置後に、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害することができるか、および／または対象におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを低下させることができる。いくつかの実施形態において、治療前のレベルと比較して処置後に、少なくとも約２分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約１５分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約２５分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約７５分の１、または少なくとも約１００分の１に、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するか、および／または対象におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを低下させることができる。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子が、阻害されるか、またはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルが、対象の肝臓において低減される。
いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、約１２もしくはそれ以上、２４もしくはそれ以上、または３６もしくはそれ以上の時間、ｄｓＲＮＡによって低減される。いくつかの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、長い時間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、もしくは６日間またはそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、またはそれ以上低減される。
本明細書中で使用される場合、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に言及する限りにおいて、「～の発現を阻害する」または「～の発現を阻害すること」という用語は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現が阻害されるよう処理された第１の細胞または細胞群における、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較した場合のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量の減少によってはっきりと示されるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。そのような阻害は、例えば、ノーザン分析、インサイツハイブリダイゼーション、Ｂ－ＤＮＡ分析、発現プロファイリング、レポーターコンストラクトの転写、および当該技術分野において既知のその他の技術によって評価することができる。本明細書中で使用される場合、「阻害すること」という用語は、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「ダウンレギュレートすること」、「抑制すること」およびその他の類似の用語と同義に使用され、任意のレベルの阻害を含む。阻害の程度は、通常、（（（対照細胞中のｍＲＮＡ）－（処理細胞中のｍＲＮＡ））／（対照細胞中のｍＲＮＡ））×１００％に換算して表される。
あるいは、阻害の程度は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子転写と機能的に結びつけられるパラメーター、例えば、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされるタンパク質の量（例えば、ウエスタン分析、レポータータンパク質の発現、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、もしくは当該技術分野において既知のその他の技術によって評価される）、または特定の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞の数の減少に換算して得ることができる。原則として、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム操作によって、および任意の適切なアッセイによってのいずれかで標的を発現する任意の細胞において判断することができる。しかしながら、所与のｄｓＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現をある一定の程度阻害するかどうか判断するために基準が必要とされ、したがって、本開示に包含される場合、下記の実施例において示されるアッセイは、そのような基準の役割を果たすものとする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている任意の方法によってＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害する効果は、対象（例えば、対象の血液および／または血清中）のトリグリセリドレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態において、トリグリセリドレベルは、以下のレベルのうちの１つよりも低くまで低減される：５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、または５０ｍｇ／ｄＬ。いくつかの実施形態において、ＬＤＬレベルは、以下のレベルのうちの１つよりも低くまで低減される：１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、または７０ｍｇ／ｄＬ。
対象のトリグリセリドレベルは、当該技術分野において既知の任意の数々の方法において求めることができる。いくつかの実施形態において、対象のトリグリセリドレベルは、血液、血清、または血漿などの対象からのサンプルを使用して求められる。
本明細書に記載されているｄｓＲＮＡまたは医薬組成物は、経口または静脈内、筋肉内、皮下、経肺、経皮、および気道（エアロゾル）投与を含む、非経口経路を含むが、それらに限定されない当該技術分野において既知の任意の手段によって投与することができる。一般に、高トリグリセライド血症の患者を処置する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、非経口手段により全身投与される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、静脈内投与によって投与される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、経肺投与によって投与される。
本明細書中で使用される場合、ＡＮＧＰＴＬ３発現の文脈において、「処置する」「処置」などという用語は、標的遺伝子発現が関係する病理学的過程からの解放または軽減を指す。本開示の文脈において、本明細書において挙げられた任意の状態に関する限りにおいて、「処置する」、「処置」などという用語は、上記状態に関連する１つもしくはそれ以上の症状を軽減することまたは緩和することを指す。例えば、高トリグリセライド血症の文脈において、処置は、血清トリグリセリドレベルの低下を伴う場合もある。本明細書中で使用される場合、疾患、障害もしくは状態を「緩和する」ことは、疾患、障害、もしくは状態の症状の重症度および／または発生頻度を低減することを意味する。さらに、本明細書における「処置」に対する言及は、治療的、対症的および予防的処置に対する言及を含む。
本明細書中で使用される場合、状態に関する「予防する」または「～の進行を遅らせる」という用語（およびその文法的変形）は、例えば、状態を有するか、またはそれを発症するリスクがあることが疑われる個体における状態の予防的処置に関する。予防としては、以下に限定されるものではないが、状態の発症もしくは進行を予防することもしくは遅らせること、および／または疾患の１つもしくはそれ以上の症状を所望のレベルもしくは病理学的なレベル未満に維持することを挙げることができる。例えば、高トリグリセライド血症の文脈において、予防は、高トリグリセライド血症であるか、もしくはそれを発症するリスクがある疑いがある個体において血清トリグリセリドレベルを所望のレベルに維持することを含む場合もある。
当然のことながら、本開示のｄｓＲＮＡは、本明細書に記載されている処置に使用するためのものである場合もあり、本明細書に記載されている処置の方法に使用される場合もあり、および／または本明細書に記載されている処置のための薬剤の製造に使用するためのものである場合もある。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、その他のｓｉＲＮＡ治療用薬剤、モノクローナル抗体、および小分子などの１つまたはそれ以上の追加の治療用薬剤と組み合わせて投与されて、患者の状態にｄｓＲＮＡの単独投与よりも大きな改善をもたらす。特定の実施形態において、追加の治療用薬剤は、抗炎症効果をもたらす。特定の実施形態において、追加の治療用薬剤は、脂質低下薬などの高トリグリセライド血症を処置する薬剤である。
いくつかの実施形態において、追加の薬剤は、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、スタチン）、フィブラート、胆汁酸捕捉剤（ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）、ニコチン酸、抗血小板薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（例えば、ロサルタンカリウム）、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、オメガ－３脂肪酸（例えば、魚油もしくはアマニ油）、およびインスリンもしくはインスリンアナログのうちの１つまたはそれ以上が可能である。特定の例としては、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、エゼチミブ、ベザフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム、およびナイアシンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、脂質低下、体重減少、食事の変更、および／または適度の運動などの別の治療的介入と組み合わせて投与することができる。
遺伝的素因が標的遺伝子関連疾患、例えば、高トリグリセライド血症の発症に影響を及ぼす。したがって、１つまたはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡによる処置を必要とする対象は、家族歴を得ること、または、例えば、１つもしくはそれ以上の遺伝子マーカーもしくはバリアントに関してスクリーニングすることによって特定することができる。高トリグリセライド血症に関与する遺伝子の例としては、ＬＰＬ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＭＦ１、ＧＣＫＲ、ＧＰＩＨＢＰ１、およびＧＰＤ１を挙げることができるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、１つまたはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡによる処置を必要とする対象は、任意のこれらの遺伝子または任意のその組み合わせにおけるバリアントまたは機能喪失型変異に関してスクリーニングすることによって特定することができる。
医師、看護師、または家族などの健康管理の提供者は、本開示のｄｓＲＮＡを処方または投与前に家族歴を得ることできる。さらに、遺伝子型または表現型を決定するために試験を実施することができる。例えば、ｄｓＲＮＡが対象に投与される前にＡＮＧＰＴＬ３遺伝子型および／または表現型を特定するために、対象からのサンプル、例えば、血液サンプルに対してＤＮＡ試験を実施することができる。
Ｖ． キットおよび製造品
本開示の特定の態様は、ＡＮＧＰＴＬ３関連状態（例えば、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害）の処置および／もしくは予防に有用な１つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているｄｓＲＮＡ、ベクター、もしくは組成物（例えば、医薬組成物）を含む製造品またはキットに関する。製造品またはキットは、容器と、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書とをさらに含む場合もある。適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成することができる。容器は、単独で、もしくは疾患を処置もしくは予防するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌した入り口を有することもできる（例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能な栓を有する静注液バッグもしくはバイアルが可能である）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡである。ラベルまたは添付文書は、組成物がＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置するために使用されることを示す。いくつかの実施形態において、状態は、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害および／または本明細書に記載されている別の状態である。さらに、製造品またはキットは、（ａ）中に入れられた本明細書に記載されているｄｓＲＮＡを含む組成物を有する第１の容器；および（ｂ）中に入れられた第２の治療用薬剤を含む組成物を有する第２の容器（例えば、本明細書に記載されている追加の薬剤）を含む。本開示のこの態様における製造品またはキットは、組成物が特定の疾患を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（または第３の）容器をさらに含むことができる。それは、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジを含む、商業的および／または使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
本明細書において別に定義されていない限り、本開示に関連して使用される科学および技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有するものとする。例となる方法および材料を以下に示すが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料も本開示の実務または試験に使用することができる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されることになる。
一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、心臓病学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医薬および製薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当該技術分野において周知のものであり、一般的に使用される。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に遂行されるとおり、または本明細書に記載されるとおり、製造業者の仕様書に従って実施される。
さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むものとし、複数の用語は、単数を含むものとする。本明細書および実施形態全体をとおして、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語または「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、指定される整数または整数の群を含むが、その他のいかなる他の整数または整数の群も排除しないことを意味することが理解されるであろう。
本明細書において言及されるすべての刊行物およびその他の参考文献の全体を参照によって組み入れる。多くの文献が本明細書中で引用されるが、この引例は、これらのいかなる文献も当該技術分野において通常の一般知識の一部を構成することを認めるものではない。
本開示がさらによく理解されるために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明のためのものに過ぎず、いかなる方法によっても本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
ｓｉＲＮＡ合成および精製
非標的化対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴ対照）を含む、ｓｉＲＮＡを、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して作製した。
方法
ｓｉＲＮＡ生成
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、２’－ＯＭｅもしくは２’－Ｆ修飾を有する市販のウリジンの５’－Ｏ－ＤＭＴ－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホラミダイトモノマー（ＳＡＦＣ）、４－Ｎ－アセチルシチジン（ＣＡｃ）、６－Ｎ－ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）および２－Ｎ－イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）、ならびに固相担体５’－Ｏ－ＤＭＴ－チミジン－ＣＰＧおよび３’－Ｏ－ＤＭＴ－チミジン－ＣＰＧ（ｉｎｖｄＴ、Ｌｉｎｋ）を使用して、固相合成および脱保護に関する標準的なプロトコルに従って、１μｍｏｌ（インビトロ）もしくは１０μｍｏｌ（インビボ）のスケールでＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｅｒＭａｄｅ １２合成機において合成した（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．（２００８年）１１：２０３～１６頁；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｒｇ Ｓｙｎｔｈ（２００４年）１：２９３～３０７頁）。
ホスホラミダイト基本単位を、アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液として使用し、５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール（アクチベーター４２、アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により活性化した。ホスホラミダイトカップリングのために３００秒の反応時間を使用した。キャッピング試薬として、ＴＨＦ中の無水酢酸（ＣａｐＡ ｆｏｒ ＡＢＩ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴＨＦ中のＮ－メチルイミダゾール（ＣａｐＢ ｆｏｒ ＡＢＩ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。酸化試薬として、ＴＨＦ／ピリジン／水中のヨウ素（０．０２Ｍ；ＡＢＩ用オキシダイザー、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。ＤＭＴ－保護基の脱保護を、ＤＣＭ中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ脱保護、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。固相担体からの最終的な切断および脱保護（アシル－およびシアノエチル－保護基）を、ＮＨ３（３２％水溶液／エタノール、ｖ／ｖ ３：１）により達成した。
粗製オリゴヌクレオチドを、ＩＥＸおよびＬＣ－ＭＳによって分析し、３０分の１０～６５％バッファーＢの直線グラジエントを使用したアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によって精製した。ＡＫＴＡ精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００セミ分取イオン交換カラム、８μｍ粒子、幅２２ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）。
バッファーＡ：１．５０ｌ Ｈ２Ｏ、２．１０７ｇ ＮａＣｌＯ４、４３８ｍｇ ＥＤＴＡ、１．８１８ｇ ＴＲＩＳ、５４０．５４ｇ 尿素、ｐＨ７．４。
バッファーＢ：１．５０ｌ Ｈ２Ｏ、１０５．３４ｇ ＮａＣｌＯ４、４３８ｍｇ ＥＤＴＡ、１．８１８ｇ ＴＲＩＳ、５４０．５４ｇ 尿素、ｐＨ７．４。
オリゴヌクレオチドの単離は、４倍容量のエタノールの添加により引き起こされる沈殿および－２０℃における保管によって達成した。
データの高い正確さを確保するために、すべての一本鎖をＨＰＬＣ精製して、＞８５％の純度にした。オリゴヌクレオチドの純度および正体を、それぞれ、イオン交換クロマトグラフィーおよびＬＣ－ＭＳによって確認した。
二本鎖アニーリング
インビトロ実験（１００μＭ溶液）およびインビボ実験（１０ｍｇ／ｍｌ）のために、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡの保存液を、等モル量の相補的なセンスおよびアンチセンス鎖を１×ＰＢＳバッファー中で混合することによって調製した。その溶液を９０℃に１０分間加熱し、室温にゆっくりと冷まして、アニーリングプロセスを完了させた。ｓｉＲＮＡを、ＨＰＬＣによってさらに特徴づけ、使用まで凍結保存した。
ｓｉＲＮＡ配列
各ｓｉＲＮＡの配列、およびヌクレオチド修飾を含む配列を上記表１および２に示す。
マウス血清中におけるｓｉＲＮＡの安定性
表２に列挙されている修飾ｓｉＲＮＡを、５０％マウス血清中でヌクレアーゼ安定性に関して試験した。１×ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０－０９４）中の２．５μＭのｓｉＲＮＡ １６０μＬおよびマウス血清１６０μＬ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ５９０５）を、３７℃で最大７２ｈインキュベートした。各時点（０ｈ、８ｈ、２４ｈ、３２ｈ、４８ｈ、５６ｈ、および７２ｈ）において、反応の２１μＬを採取し、停止液２３μＬ（Ｔｉｓｓｕｅ ＆ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＭＴＣ０９６Ｈ）、２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ１８３μＬ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ２３０８）、水１６９４μＬ）で６５℃において３０分間クエンチした。Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅおよび２４８７ Ｄｕａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ＤｅｔｅｃｔｏｒにおけるＨＰＬＣ分析に先立って、ＲＮアーゼフリー水３３μＬを各サンプルに添加した。その溶液５０μＬを、ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００分析カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号０６３０００）および以下のグラジエントを使用したＨＰＬＣによって分析した：
Figure 2023546103000063
ｓｉＲＮＡの両鎖に関する血清半減期を推定した。
ヒトＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害のためのｓｉＲＮＡの特定
方法
細胞および組織培養
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％相対湿度（ＲＨ）で増殖させ、１０％ ＦＢＳを加えたＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－２００３）中で培養した。
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるノックダウン実験のために、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５１８０）に２０，０００細胞／ウェルを使用した。その細胞に、リバーストランスフェクション設定において製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を０．２μＬ／ウェル使用して０．１ｎＭおよび１ｎＭのＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、培地を変えずに４８ｈインキュベートした。通常、試験サンプル毎にＮ＝４の技術的反復を行った。
ｍＲＮＡ発現分析
ｓｉＲＮＡトランスフェクションまたは自然なｓｉＲＮＡ取り込みの４８または７２時間後、細胞のＲＮＡを、手順中のＤＮアーゼステップを含む、製造業者のプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａのＳＶ９６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ｚ３５００）の使用によって回収した。
ｃＤＮＡ合成のために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（カタログ番号Ｎ８０８０２３４）を使用した。１２μＬの総体積で１０×ＲＴバッファー１．２μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）２．６４μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）２．４μＬ、ランダムヘキサマー（５０μＭ）０．６μＬ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１６（配列番号１１８５）（５０μＭ）０．６μＬ、ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ／μＬ）０．２４μＬおよびＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ（５０Ｕ／μＬ）０．３μＬを使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡ３０ｎｇから合成した。サンプルを、２５℃で１０分間および４２℃で６０分間インキュベートした。９５℃に５分間加熱することによって反応を停止させた。
ヒトおよびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３０５７１９）および以下のＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイを使用したｑＰＣＲによって定量した：
Figure 2023546103000064
ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００システムにより以下のＰＣＲ条件下で２回の技術的反復で実施した：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル。一反応において標的遺伝子および並行反応において正規化のためのハウスキーピング遺伝子（ヒト／カニクイザルＲＰＬ３７Ａ）を検出するシンプレックスＰＣＲとしてＰＣＲを設定した。ＰＣＲ反応の最終体積は、１×ＰＣＲマスターミックス中の１２．５μＬであり；ＲＰＬ３７Ａプライマーを５０ｎＭの最終濃度で使用し、プローブを２００ｎＭの最終濃度で使用した。標的転写物の相対発現量を計算するためにΔΔＣｔ法を利用した。標的遺伝子発現のパーセンテージを、非標的化ｓｉＲＮＡ対照処理細胞のレベルに基づく正規化によって計算した。
ＩＣ５０測定
ＩＣ５０測定のために、９６ウェルプレートの２０，０００のヒトＨｅｐ３Ｂ細胞に、５～８倍希釈段階を使用して２５ｎＭから開始する７つの濃度の示したＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いて４８時間トランスフェクションした。各ｓｉＲＮＡに関する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を、Ｂｉｏｓｔａｔ－Ｓｐｅｅｄ統計計算ツールを利用することによって計算した。ＲａｔｋｏｖｓｋｙおよびＲｅｅｄｙ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ４２（３）：５７５～５８２頁（１９８６年））による４パラメーターロジスティックモデルを使用して結果を得た。ＳＡＳ ｖ９．１．３ソフトウェアにおいてＬｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用した非線形回帰によって補正を得た。
細胞傷害性
９６ウェルプレートの各ウェル当たり１０，０００のＨｅｐ３Ｂ細胞の培養物の５ｎＭおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に、各サンプル中の細胞生存率／毒性の比を求めることによって細胞傷害性を測定した。細胞生存率を、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用した細胞内ＡＴＰ含有量の決定によって測定した。細胞毒性を、製造業者のプロトコルに従ってＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＬＴ０７－２１７）を使用して上清において測定した。１０ｎＭのＡｌｌＳｔａｒｓ Ｈｓ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号ＳＩ０４３８１０４８）、２５μＭのケトコナゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号４２０６００）および１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９２８４）を毒性の陽性対照として使用した。
結果
ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とする際に有用なｓｉＲＮＡを特定するために、コンピュータでのライブラリー生成のために以下の基準を適用した：まず、１８ヌクレオチドの重なる部分を有する、ＮＭ＿０１４４９５．３に示されているヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列からの１９塩基長をコンピュータで特定した。２９３３配列のこの一覧から、５５％よりも大きいＧ／Ｃ含量またはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列と１つもしくはそれ以上のミスマッチを有する場合に分子をさらに除去した。
残りの配列に関して、その後、ヒトトランスクリプトーム（ＲｅｆＳｅｑ ＲＮＡバージョン２０１５－１１－２４）中のいずれかのｓｉＲＮＡ鎖（センス／アンチセンス）と対応する可能性のあるあらゆるオフターゲット転写物を特定するためにコンピュータによる分析を行った。肝臓組織においてＦＰＫＭ＜０．５のＲＮＡｓｅｑ発現（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｂｏｄｙ Ａｔｌａｓ）を有するヒトオフターゲット配列は考慮しなかった。目的とするすべてのｓｉＲＮＡ配列は、ＡＮＧＰＴＬ３以外の肝臓で発現される任意のヒト転写物に対して３個を超えるミスマッチを有したか、または４個もしくはそれ以下のヒト遺伝子について２個のミスマッチを有したかのいずれかであり；これらの２つの基準の１つも満たさなかった配列は除去した。この除去後、１６２個の可能性のあるｓｉＲＮＡが残った（表１を参照、コンストラクト００１～１６２）。
上記のとおり、１６２個のｓｉＲＮＡを、固定パターンを有するヌクレオチドを用いて作製した（表２を参照、コンストラクト００１～１６２）。これらの１６２個のｓｉＲＮＡのＡＮＧＰＴＬ３の発現を低下させる能力を試験するために、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞に０．１ｎＭまたは１．０ｎＭの各ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプル中のＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定し、非標的化ｓｉＲＮＡで処理した陰性対照と比較した（図１Ａ～１Ｃ）。１．０ｎＭの濃度で少なくとも８０％、または０．１ｎＭの濃度で少なくとも７０％のｍＲＮＡ発現の低下を示した１５個のｓｉＲＮＡ、および離れた配列領域と結合する３個のｓｉＲＮＡを、さらなる特徴づけのために選択した。
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞において選択された１８個のｓｉＲＮＡに関してＩＣ５０測定（表４）および細胞傷害性アッセイ（図２）を行った。（５０ｎＭにおいて）＜４０％のＮＴ対照生存率／毒性比を示した３個のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃０２９、＃０３６、および＃１４５）の除去後、ＧａｌＮＡｃとのコンジュゲーションに関するＩＣ５０値に基づいて１１個のｓｉＲＮＡを選択した（表４）。
Figure 2023546103000065
まとめると、これらの結果は、ヒト細胞において顕著な細胞傷害性がなく、ヒトＡＮＧＰＴＬ３発現の強い阻害が可能なｓｉＲＮＡの特定を示す。
ヒトおよびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害に関して活性なＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡの特定
方法
非標的化対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴ対照）を含む、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、示された配列に基づいて生成した（上の配列表を参照）。
細胞培養およびアッセイ
ヒト（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号Ｍ００９９５－Ｐ）およびカニクイザル（Ｐｒｉｍａｃｙｔ、カタログ番号ＣＨＣＰ－Ｉ－Ｔ）初代肝細胞を以下のとおり培養した：播種および解凍キット（Ｐｒｉｍａｃｙｔ、カタログ番号ＰＴＫ－１）を使用して、凍結保存細胞を解凍し、播種し、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨでインキュベートした。播種の６時間後、培地を１％ ＦＢＳを加えた維持培地（ＫａＬｙ－Ｃｅｌｌ、カタログ番号ＫＬＣ－ＭＭ）に変えた。
ｍＲＮＡ発現分析を、実施例２において上で記載したとおりに実施した。
ＩＣ５０測定
自然な取り込み条件下におけるヒトおよびカニクイザル初代肝細胞の用量・活性関係およびＩＣ５０測定を示すために、９６ウェルプレートの５０，０００～７０，０００細胞を、培地を変えずに、１０倍希釈段階を使用して１０μＭ～０．０１ｎＭの範囲の濃度のｓｉＲＮＡとともに７２時間インキュベートした。各ｓｉＲＮＡに関する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を、Ｂｉｏｓｔａｔ－Ｓｐｅｅｄ統計計算ツールを利用することによって計算した。ＲａｔｋｏｖｓｋｙおよびＲｅｅｄｙ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ（１９８６年）４２（３）：５７５～８２頁）による４パラメーターロジスティックモデルを使用して結果を得た。ＳＡＳ ｖ９．１．３ソフトウェアにおいてＬｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用した非線形回帰によって補正を得た。
結果
上記のとおり強力なｓｉＲＮＡの選択後、本発明者らは、選択した分子がインビボにおける肝臓特異的なｓｉＲＮＡ送達に適したＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈において活性を保持するかどうかを実証することに着手した。本発明者らは、この活性がカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）の細胞において持続するかどうかも評価した。
ＩＣ５０測定の結果は、ヒト初代肝細胞に自然な取り込みによって送達された場合に、２つを除く試験したすべてのｓｉＲＮＡコンジュゲートが活性を保持することを示し（表５）、ＩＣ５０値は１．９５から９．２ｎＭに及ぶ。しかしながら、驚くべきことに、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの自然な取り込み後の性能の順位付けは、測定可能なノックダウン活性をもたらす２つの分子の完全な破壊を含む、コンジュゲートされていないｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより補助された取り込み後に得られるものと著しく異なる（表４）。これは、ｓｉＲＮＡがその配列に基づく固有の特性を有し、それが、結果として得られるノックダウン能力に関してＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈においてこれらｓｉＲＮＡを適用に対して異なるかたちで適合させるようである。
Figure 2023546103000066
さらに一層驚くべきことに、一部の試験ｓｉＲＮＡは、カニクイザル配列ＸＭ＿００５５４３１８５．１に対する予測される配列相同性にもかかわらず、カニクイザル肝細胞において活性がないことを示している（表６）。この予想外の観察結果は、活性検出のための機能アッセイの必要性およびｓｉＲＮＡの有効性が生物情報学的情報に基づいて簡単に予測できないことを強調する。
Figure 2023546103000067
ヒトＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害に関するＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡのインビトロおよびインビボにおける特徴づけ
方法
細胞および組織培養
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨで増殖させ、１０％ ＦＢＳを加えたＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－２００３）中で培養した。
ヒト（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号Ｍ００９９５－Ｐ）およびカニクイザル（Ｐｒｉｍａｃｙｔ、カタログ番号ＣＨＣＰ－Ｉ－Ｔ）初代肝細胞を以下のとおり培養した：播種および解凍キット（Ｐｒｉｍａｃｙｔ、カタログ番号ＰＴＫ－１）を使用して、凍結保存細胞を解凍し、播種し、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨでインキュベートした。播種の６時間後、培地を１％ ＦＢＳを加えた維持培地（ＫａＬｙ－Ｃｅｌｌ、カタログ番号ＫＬＣ－ＭＭ）に変えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の説明書に従ってヘパリンナトリウムでコーティングされたバキュテナーチューブ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）中に採取した健康な３人のドナーからの血液およそ１６ｍＬから単離した。
ヒトＰＢＭＣのトランスフェクションのために、１００ｎＭのｓｉＲＮＡを、１×１０５のＰＢＭＣに、９６ウェルプレートの１ウェル当たりＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｎ＝２）を０．３μＬ用いて１５０μＬの無血清ＲＰＭＩ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１８７５）の総体積として２４時間リバーストランスフェクションした。一本鎖ＲＮＡ（「Ｒ－０００６」）およびＤＮＡ（「ＣｐＧ ＯＤＮ」）オリゴヌクレオチド、ならびに二本鎖無修飾および２’－Ｏ－メチル修飾ｓｉＲＮＡ（「１３２／１６１」）を対照として利用した。
ＡＮＧＰＴＬ３ ＥＬＩＳＡアッセイ
選択されたｓｉＲＮＡ濃度に関するＩＣ５０実験の上清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質濃度を、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＡＮＧＰＴＬ３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０）を利用することによって定量した。製造業者のプロトコルに従ってヒトＨｅｐ３Ｂ細胞、ヒト初代肝細胞、またはカニクイザル初代肝細胞の予め１：２～１：８希釈した上清５０μｌを使用してＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現のパーセンテージを、非標的化ｓｉＲＮＡ対照配列で処理された細胞の平均ＡＮＧＰＴＬ３レベルに基づく正規化によって計算した。
ＩＦＮα測定
ヒトＰＢＭＣの上清中のＩＦＮαタンパク質濃度を以下のとおり定量した：細胞培養上清２５μＬを、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの技術に基づくそれ自体が確立された電気化学発光アッセイを利用し、ｐａｎ ＩＦＮαモノクローナル捕捉抗体（ＭＴ１／３／５、Ｍａｂｔｅｃｈ）を使用したＩＦＮα濃度の測定のために使用した。あるいは、ヒトＩＦＮα２ａアイソフォーム特異的アッセイ（カタログ番号Ｋ１５１ＶＨＫ）を、ＭｅｓｏＳｃａｌｅのＵ－ＰＬＥＸプラットフォームに基づいて、供給業者のプロトコルに従って利用した。
細胞傷害性
ヒト初代肝細胞におけるｓｉＲＮＡの細胞傷害性を、自然な取り込み条件下における１μＭ、５μＭおよび２５μＭのｓｉＲＮＡとの９６ウェルプレートの１ウェル当たり４５，０００～５０，０００細胞のインキュベーションの７２時間後に、各サンプル中の細胞生存率／毒性の比を求めることによって測定した。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用して細胞内ＡＴＰ含有量を求めることによって測定し、上清中の細胞毒性を、製造業者のプロトコルに従ってＬＤＨアッセイ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１１６４４７９３００１）を使用して測定した。２５μＭのケトコナゾールおよび１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を、陽性対照として使用した。
ヌクレアーゼ安定性
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを、実施例１に記載されている方法を使用してヌクレアーゼ安定性に関して試験した。
インビボアッセイ
インビボにおけるヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの効果を評価するために、マウスにおいてアデノ随伴ウイルスベクターに基づく導入遺伝子発現系を利用した。この目的を達成するために、ＡｐｏＡ２プロモーター（Ｖｅｃｔａｌｙｓ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）からヒトＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡの肝臓特異的な発現を伴うＡＡＶ８ベクターを、ｓｉＲＮＡ投薬前に雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に静脈内投与した。ＡＡＶベクターから発現されたヒトＡＮＧＰＴＬ３の血清レベルが十分に高い血清レベルに達した後、（非標的化対照を含む）ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを１２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）で皮下投与した。ｓｉＲＮＡの活性を、ＥＬＩＳＡを使用してヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質血清を測定することによって定量した。
ＡＮＧＰＴＬ３ ＥＬＩＳＡアッセイ
ｓｉＲＮＡで処置したマウスにおける血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＡＮＧＰＴＬ３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０）を利用することによって定量した。ＡＮＧＰＴＬ３血清レベルを、非標的化対照ｓｉＲＮＡで処置した群と比較して計算した。
結果
（上記のとおり選択された）ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１１個のＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに対する免疫応答を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションに応じて、健康な３人の異なるドナーから単離したヒト初代ＰＭＢＣから分泌されるインターフェロンαの産生を調べることによってインビトロでヒト初代細胞において測定した（図３）。いかなる試験ｓｉＲＮＡに関してもヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激のサインは確認されなかった。
ＡＮＧＰＴＬ３ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、５０％マウス血清中におけるインビトロでのヌクレアーゼ安定性に関しても、相対的安定性および半減期を求めることによって試験した（表７）。半減期は、＜３２ｈから７２ｈの間の範囲であった。
Figure 2023546103000068
さらなる選択物からあらゆる毒性の可能性を有するＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを除外するためにヒト初代肝細胞において細胞傷害性アッセイを行った（図４）。いかなる分子に関しても明らかな毒性効果は確認されなかった。
用量依存的なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質ノックダウンを、３つの異なる濃度（１０、１００、および１０００ｎＭ）のＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで処理されたヒト初代肝細胞の上清中のＡＮＧＰＴＬ３レベルの定量によって確認した（図５）。標的タンパク質の減少は、ｑＰＣＲによって定量したｍＲＮＡノックダウンと良好な相関性を示した（図６）。これには、タンパク質レベルに変換される、ｑＰＣＲによって確認されたｍＲＮＡノックダウン活性を示さなかった２個のＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡが含まれた。これらのデータは、本発明者らのｓｉＲＮＡを用いて得られる成功したｍＲＮＡノックダウンが確実に対応する標的タンパク質の低下につながることを裏付ける。
最後に、３個の選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ分子を、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを発現する上記のヒト化マウスモデルを使用してインビボにおいて試験した（図７）。１２ｍｇ／ｋｇの選択した化合物の皮下投与後、標的タンパク質レベルが非標的化対照で処置した動物と比較して７５％から９０％（ＫＤｍａｘ）の間で低下した。化合物により、処置後約２０日目から約３５日目の間にレベルが最大ノックダウンの５０％（ＫＤ５０）に戻った。すべての群が５５日目までにベースラインに戻った。
要約すると、本発明者らは、インビボおよびインビトロにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈においてヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡおよびそれから翻訳されるタンパク質の発現を強力に低下させるｓｉＲＮＡの特定に成功したことを証明した。
ヒトＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害のためのさらなるｓｉＲＮＡの特定
方法
使用した方法は、実施例２で使用したものと同じであった。
結果
ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とする際に有用なさらなるｓｉＲＮＡを特定するために、実施例２に記載されている設計および選択基準をカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）に対して１個のミスマッチを許容するよう調節した。さらに、目的とするすべてのｓｉＲＮＡ配列は、ＡＮＧＰＴＬ３以外の肝臓で発現する任意のヒト転写物に対して３個を超えるミスマッチを有しているか、または１つのヒト遺伝子の最大２個のミスマッチを有しているかのいずれかであった；これらの２つの基準の１つも満たさなかった配列は除去した。これにより、４９個のさらなるｓｉＲＮＡの一覧がもたらされた（表１を参照、コンストラクト１６３～２１１）。さらに、分析には、ｓｉＲＮＡ＃０１３、ｓｉＲＮＡ＃０１４およびｓｉＲＮＡ＃０１５の拡張されたバリアントである３個のｓｉＲＮＡが含まれた（表１を参照、コンストラクト２１２～２１４）。
上記のとおり、５２個のｓｉＲＮＡを、固定パターンを有するヌクレオチドを用いて作製した（表２を参照、コンストラクト１６３～２１４）。これら５２個のｓｉＲＮＡのＡＮＧＰＴＬ３の発現を低下させる能力を試験するために、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞およびカニクイザル初代肝細胞に０．１ｎＭまたは１．０ｎＭの各ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプル中のＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定し、非標的化対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較した（図８および９）。１．０ｎＭの濃度でヒトＨｅｐ３Ｂにおいて少なくとも７５％、またはカニクイザル肝細胞において少なくとも７０％のｍＲＮＡ発現の低下を示した１１個のｓｉＲＮＡを、さらなる特徴づけのために選択した。驚くべきことに、ヒト細胞において活性な大半のｓｉＲＮＡは、単一のヌクレオチドミスマッチにもかかわらず、カニクイザル肝細胞においても機能する。
選択された１１個のｓｉＲＮＡに関してヒトＨｅｐ３Ｂ細胞においてＩＣ５０測定（表８）および細胞傷害性アッセイ（図１０）を行った。（５０ｎＭにおける）ＮＴ対照の生存／毒性比の＜３０％を示した１個のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１７３）を除去後、ＧａｌＮＡｃとのコンジュゲーションに関するヒトＩＣ５０値に基づいて４個のｓｉＲＮＡを選択した（表８）。
Figure 2023546103000069
まとめると、これらの結果は、カニクイザルにおける単一のヌクレオチドミスマッチにもかかわらず、ヒトおよびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現の強い阻害が可能なｓｉＲＮＡが特定されたことを示す。
ヒトおよびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害に関して活性なＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡの特定
方法
使用した方法は、実施例３で使用したものと同じであった。
結果
実施例５に記載されているとおりの強力なさらなるｓｉＲＮＡの選択後、本発明者らは、選択した分子がインビボにおける肝臓特異的なｓｉＲＮＡ送達に適したＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈において活性を保持するかどうかを実証することに着手した。本発明者らは、この活性が重要な前臨床種であるカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）の細胞において持続するかどうかも評価した。
ＩＣ５０測定の結果は、ヒト初代肝細胞に自然な取り込みによって送達された場合に、試験したすべてのｓｉＲＮＡコンジュゲートが活性を保持することを示し（表９；第１回のスクリーニングから得られた２個のｓｉＲＮＡを基準として含めた）、ＩＣ５０値は１．９１から９．６８ｎＭに及ぶ。しかしながら、驚くべきことに、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの自然な取り込み後の性能の順位付けは、コンジュゲートされていないｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより補助された取り込み後に得られたものと異なる（表８）。これも、ｓｉＲＮＡがその配列に基づく固有の特性を有し、それが、結果として得られるノックダウン能力に関してＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈においてこれらｓｉＲＮＡを適用に対して異なるかたちで適合させるようである。
Figure 2023546103000070
カニクイザル肝細胞において測定されたＩＣ５０活性（表１０）は、ヒト肝細胞で観察された（０．４０６から０．９８７ｎＭ）よりも不均一でなかった一方で、Ｉｍａｘは、同様に多様であった（カニクイザルにおける０．６０５から０．８９２対ヒトにおける０．６２０から０．９０４）が、異なるｓｉＲＮＡが最高のＩｍａｘを示した（ヒトのｓｉＲＮＡ＃１７１－ｃ、カニクイザルのｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ）。
Figure 2023546103000071
これらの予想外の観察結果も、活性定量および分子選択のために機能インビトロアッセイを使用する必要性を強調する。
ヒトＡＮＧＰＴＬ３発現の阻害に関するさらなるＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡのインビトロおよびインビボにおける特徴づけ
方法
使用した方法は、実施例４で使用したものと同じであった。
結果
（実施例５に記載されているとおりに選択された）ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする４個のさらなるＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに対する免疫応答を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションに応じて、健康な３人の異なるドナーから単離したヒト初代ＰＭＢＣから分泌されたインターフェロンα２ａの産生を調べることによってインビトロでヒト細胞において測定した（図１１）。いかなる試験ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに関してもヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激のサインは確認されなかった。
さらなるＡＮＧＰＴＬ３ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、５０％マウス血清中におけるインビトロでのヌクレアーゼ安定性に関しても、相対的安定性および半減期を求めることによって試験した（表１１）。半減期は、２４ｈから７２ｈの間の範囲であった。
Figure 2023546103000072
さらなる選択物から毒性の可能性のあるＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを除外するために、ヒト初代肝細胞において細胞傷害性アッセイを行った（図１２）。いかなる分子に関しても明らかな用量依存的な毒性効果は確認されなかった。これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈において本発明者らが選択したｓｉＲＮＡの適用が一般に細胞傷害性を付与しないことを示す。
用量依存的なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質ノックダウンを、３つの異なる濃度（０．１、１、および１０００ｎＭ）のＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで処理されたヒト初代肝細胞の上清中のＡＮＧＰＴＬ３レベルの定量によって確認した（図１３）。これらのデータは、本発明者らのＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを用いて得られる成功したｍＲＮＡノックダウンが確実に対応する標的タンパク質の低下につながることを裏付ける。
最後に、２個のさらに選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、第１回のスクリーニング作戦で得られた３個のＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ（実施例２～４）を用いて並行して、ヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現するインビボマウスモデルにおいて試験した（図１４）。１０ｍｇ／ｋｇの選択された化合物の皮下投与後、標的タンパク質レベルは、非標的化対照で処置した動物と比較して６０％から８０％（ＫＤｍａｘ）の間で低下した。化合物により、処置後約２０日目から約４５日目の間にレベルが最大ノックダウンの５０％（ＫＤ５０）に戻った。すべての群が９０日目までにベースラインに戻った。
要約すると、本発明者らは、インビボおよびインビトロにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈においてヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡおよびそれから翻訳されるタンパク質の発現を強力に低下させるさらなるｓｉＲＮＡの特定に成功したことを証明した。
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡ配列の最適化
方法
修飾ＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡ配列の生成
式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドを有するさらに最適化されたＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡ配列を、国際公開第２０１９／１７０７３１号に記載されているとおりに合成した。すべてのオリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ ３９４合成機において合成した。市販の（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）標準的な保護基を有するＤＮＡ－、ＲＮＡ－、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ、および２’－デオキシ－Ｆ－ＲＮＡ－ホスホラミダイト、例えば、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－チミジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－ウラシル－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－Ｎ４－シチジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－Ｎ６－ベンゾイル－アデノシン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－Ｎ２－イソブチリル－グアノシン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－ウラシル－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－シチジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－Ｎ６－ベンゾイル－アデノシン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト，５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－Ｎ２－イソブチリル－グアノシン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト，５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－デスオキシ－フルオロ－ウラシル－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－デオキシ－フルオロ－Ｎ４－シチジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－デオキシ－フルオロ－Ｎ６－ベンゾイル－アデノシン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイト、および５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－デオキシ－フルオロ－Ｎ２－イソブチリル－グアノシン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－２－シアノエチル）－ホスホラミダイトならびに対応する固相担体材料（ＣＰＧ－５００Å、ローディング４０μｍｏｌ／ｇ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を、自動オリゴヌクレオチド合成のために使用した。
ホスホラミダイト基本単位を、アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液として使用し、５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール（アクチベーター４２、アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により活性化した。標準的なホスホラミダイトカップリングに対して２００秒の反応時間を使用した。本明細書に記載されているホスホラミダイトの場合、３００秒のカップリング時間を利用した。キャッピング試薬として、ＴＨＦ中の無水酢酸（ＣａｐＡ ｆｏｒ ＡＢＩ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴＨＦ中のＮ－メチルイミダゾール（ＣａｐＢ ｆｏｒ ＡＢＩ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。酸化試薬として、ＴＨＦ／ピリジン／水中のヨウ素（０．０２Ｍ；ＡＢＩ用オキシダイザー、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。あるいは、ピリジン／アセトニトリル（１：１）中の３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチル－アミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）の０．０５Ｍ溶液によりＰＳ酸化を達成した。ＤＭＴ－保護基の脱保護を、ＤＣＭ中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ ｄｅｂｌｏｃｋ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。固相担体からの最終的な切断および脱保護（アシル－およびシアノエチル－保護基）を、ＮＨ３（３２％水溶液／エタノール、ｖ／ｖ ３：１）により達成した。ＮＭＰ／ＮＥｔ３／ＨＦ（３：１．５：２）による処理を、ＴＢＤＭＳ－脱保護のために利用した。
３’末端に本明細書に記載の基本単位を有するオリゴヌクレオチドを、固相担体材料またはユニバーサルリンカー－固相担体（ＣＰＧ－５００Å、ローディング ３９μｍｏｌ／ｇ、ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＬＬＣ）および表Ａに示される対応するホスホラミダイト上に合成した。
粗生成物を、ＨＰＬＣによって分析し、一本鎖精製をイオン交換または分取ＨＰＬＣ法を使用して実施した。
イオン交換：ＡＫＴＡ精製装置、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００セミ分取イオン交換カラム、８μｍ粒子、幅２２ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）。
バッファーＡ：１．５Ｌ Ｈ２Ｏ、２．１０７ｇ ＮａＣｌＯ４、４３８ｍｇ ＥＤＴＡ、１．８１８ｇ ＴＲＩＳ、５４０．５４ｇ 尿素、ｐＨ７．４。
バッファーＢ：１．５Ｌ Ｈ２Ｏ、１０５．３４ｇ ＮａＣｌＯ４、４３８ｍｇ ＥＤＴＡ、１．８１８ｇ ＴＲＩＳ、４０．５４ｇ 尿素、ｐＨ７．４。
オリゴヌクレオチドの単離を、４倍容量のエタノールの添加および－２０℃における保管により引き起こされる沈殿によって達成した。
分取ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ ＯＢＤ（商標）分取カラム１３０Å、５μｍ、１０ｍｍ×１００ｍｍ）；溶離液：トリエチルアンモニウムアセタート（アセトニトリル／水中０．１Ｍ）。凍結乾燥後、生成物を、２．５ＭのＮａＣｌ溶液１．０ｍＬおよびＨ２Ｏ ４．０ｍＬに溶解させた。対応するＮａ＋塩を、エタノールを２０ｍＬ添加し、－２０℃において１８ｈ保管することによる沈殿後に単離させた。
一本鎖の最終的な分析は、ＬＣ／ＭＳ－ＴＯＦ法によって行った。二本鎖形成のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳバッファー中で混合し、８５℃に１０分間加熱した。その後、それを、ゆっくりと室温に冷ました。ｓｉＲＮＡ二本鎖の最終的な分析は、ＬＣ／ＭＳ－ＴＯＦ法によって行った。
ｓｉＲＮＡ二本鎖のアニーリングを、実施例１に記載されているとおりに行った。ヌクレオチド修飾を含む、各ｓｉＲＮＡの配列を、表３に示す。
マウス血清中におけるｓｉＲＮＡの安定性
表３に列挙されている最適化されたＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡの安定性を、以下を除いて実施例１に記載されているとおりに判定した：ｓｉＲＮＡを３７℃で０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ、および１６８ｈインキュベートした。プロテイナーゼＫをＱｉａｇｅｎ（カタログ番号１９１３３）から購入し、ＨＰＬＣ分析を、１２６０ ＤＡＤ検出器を使用したＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ機器において行った。
細胞培養および細胞ベースのアッセイ
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞、ヒト初代肝細胞、および初代ヒトＰＢＭＣを、単離し、実施例２～７に記載されているとおりに培養した。ｍＲＮＡの分析を、実施例２に記載されているとおりに行った。細胞傷害性を、実施例２に記載されているとおりにヒトＨｅｐ３Ｂ細胞の５ｎＭおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に測定した。ヒトＰＢＭＣの上清中のＩＦＮαタンパク質濃度を、実施例４に記載されているとおりに定量した。
インビボアッセイ
修飾ＧａｌＮＡｃ－ＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡのインビボ活性を、ＡｐｏＡ２プロモーターからヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡをコードするＡＡＶ８ベクターにより形質導入されたマウスにおいて実施例４に記載されているとおりに測定した。実施例４とは対照的に、５ｍｇ／ｋｇの単回のｓｉＲＮＡ用量を、各処置群当たり５匹の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。
ＡＮＧＰＴＬ３ ＥＬＩＳＡアッセイ
修飾ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで処置したマウスにおける血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを、実施例４に記載されているとおりに定量した。
結果
５４個の異なるｓｉＲＮＡ修飾パターンを、設計し、３個の予め選択されたｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ＃０１３、ｓｉＲＮＡ＃０５１、およびｓｉＲＮＡ＃１６５）に適用した。３×５４個のｓｉＲＮＡ分子のライブラリー（ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ－０１からｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ－５４、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ－０１からｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ－５４、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ－０１からｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃ－５４、表３）を、それぞれのｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端にある３個の連続した修飾ＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドを使用して合成した。
１６２個の修飾ＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡのすべてを、５０％マウス血清中においてヌクレアーゼ安定性に関して試験した。表１２に示されるとおり、固定パターンの２’Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有するそれぞれの親配列と比較して著しく改善された安定性を有するいくつかの分子を特定した。ｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃおよびｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃから誘導されたコンストラクトに関して、血清半減期が、親コンストラクトパターンのおよそ７２ｈから修飾コンストラクトの１６８ｈまたはそれ以上に向上した。ｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃから誘導されたコンストラクトに関して、血清半減期が、およそ２４ｈから９６ｈまたはそれ以上に向上した。
Figure 2023546103000073
Figure 2023546103000074
次に、１６２個の修飾ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡのすべてを、自然な取り込み条件下で、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭ濃度の修飾ｓｉＲＮＡを使用して、ヒト初代肝細胞におけるノックダウン能力に関して評価した。親コンストラクトｓｉＲＮＡ＃０１３－ｃ、ｓｉＲＮＡ＃０５１－ｃ、およびｓｉＲＮＡ＃１６５－ｃを、陽性対照として使用した。データを、図１５Ａ～Ｆに示す。
インビトロノックダウン活性およびヌクレアーゼ安定性データに基づいて、３つの親コンストラクトのそれぞれに対して８個の修飾バリアントを選択した。インビボ活性試験に先立って、３×８個の修飾コンストラクトを、ヒトＰＢＭＣにおいて自然免疫を刺激する能力（図１６）およびヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における一般的な細胞傷害性（図１７）に関して調査した。両方のアッセイにおいて、明白な悪影響は、確認されなかった。
最後に、３×８個の選択された修飾ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンストラクトを、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを発現する上記のヒト化マウスモデルを使用してインビボにおいて試験した（図１８Ａ～Ｃ）。５ｍｇ／ｋｇの用量の選択した化合物の単回皮下投与後、標的タンパク質レベルが、ＰＢＳで処置した動物と比較して最大約９５％（ＫＤｍａｘ）低下した。最も長く継続した最適化分子は、６３日目でもまだ最大ノックダウンの５０％（ＫＤ５０）に戻らなかったが、３つすべての親コンストラクトは、その時点で＜１５％の残存する活性を示した。
要約すると、本発明者らは、インビボおよびインビトロにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈においてヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡおよびそれから翻訳されるタンパク質の発現を強力に低下させるｓｉＲＮＡの特定に成功したことを証明した。本発明者らはまた、予想外にも、修飾ヌクレオチドを使用した最適化した修飾パターンの導入によるｓｉＲＮＡのインビボにおける有効性が大きく向上することも証明した。安定性とインビトロ性能の間のゆるい相関性にもかかわらず、特定の修飾ｓｉＲＮＡのインビボにおける効力は、非インビボデータに基づいて体系的に予測することができなかった。
ＡＮＧＰＴＬ３配列
ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列（配列番号１１８１）
1 atatatagag ttaagaagtc taggtctgct tccagaagaa aacagttcca cgttgcttga
61 aattgaaaat caagataaaa atgttcacaa ttaagctcct tctttttatt gttcctctag
121 ttatttcctc cagaattgat caagacaatt catcatttga ttctctatct ccagagccaa
181 aatcaagatt tgctatgtta gacgatgtaa aaattttagc caatggcctc cttcagttgg
241 gacatggtct taaagacttt gtccataaga cgaagggcca aattaatgac atatttcaaa
301 aactcaacat atttgatcag tctttttatg atctatcgct gcaaaccagt gaaatcaaag
361 aagaagaaaa ggaactgaga agaactacat ataaactaca agtcaaaaat gaagaggtaa
421 agaatatgtc acttgaactc aactcaaaac ttgaaagcct cctagaagaa aaaattctac
481 ttcaacaaaa agtgaaatat ttagaagagc aactaactaa cttaattcaa aatcaacctg
541 aaactccaga acacccagaa gtaacttcac ttaaaacttt tgtagaaaaa caagataata
601 gcatcaaaga ccttctccag accgtggaag accaatataa acaattaaac caacagcata
661 gtcaaataaa agaaatagaa aatcagctca gaaggactag tattcaagaa cccacagaaa
721 tttctctatc ttccaagcca agagcaccaa gaactactcc ctttcttcag ttgaatgaaa
781 taagaaatgt aaaacatgat ggcattcctg ctgaatgtac caccatttat aacagaggtg
841 aacatacaag tggcatgtat gccatcagac ccagcaactc tcaagttttt catgtctact
901 gtgatgttat atcaggtagt ccatggacat taattcaaca tcgaatagat ggatcacaaa
961 acttcaatga aacgtgggag aactacaaat atggttttgg gaggcttgat ggagaatttt
1021 ggttgggcct agagaagata tactccatag tgaagcaatc taattatgtt ttacgaattg
1081 agttggaaga ctggaaagac aacaaacatt atattgaata ttctttttac ttgggaaatc
1141 acgaaaccaa ctatacgcta catctagttg cgattactgg caatgtcccc aatgcaatcc
1201 cggaaaacaa agatttggtg ttttctactt gggatcacaa agcaaaagga cacttcaact
1261 gtccagaggg ttattcagga ggctggtggt ggcatgatga gtgtggagaa aacaacctaa
1321 atggtaaata taacaaacca agagcaaaat ctaagccaga gaggagaaga ggattatctt
1381 ggaagtctca aaatggaagg ttatactcta taaaatcaac caaaatgttg atccatccaa
1441 cagattcaga aagctttgaa tgaactgagg caaatttaaa aggcaataat ttaaacatta
1501 acctcattcc aagttaatgt ggtctaataa tctggtatta aatccttaag agaaagcttg
1561 agaaatagat tttttttatc ttaaagtcac tgtctattta agattaaaca tacaatcaca
1621 taaccttaaa gaataccgtt tacatttctc aatcaaaatt cttataatac tatttgtttt
1681 aaattttgtg atgtgggaat caattttaga tggtcacaat ctagattata atcaataggt
1741 gaacttatta aataactttt ctaaataaaa aatttagaga cttttatttt aaaaggcatc
1801 atatgagcta atatcacaac tttcccagtt taaaaaacta gtactcttgt taaaactcta
1861 aacttgacta aatacagagg actggtaatt gtacagttct taaatgttgt agtattaatt
1921 tcaaaactaa aaatcgtcag cacagagtat gtgtaaaaat ctgtaataca aatttttaaa
1981 ctgatgcttc attttgctac aaaataattt ggagtaaatg tttgatatga tttatttatg
2041 aaacctaatg aagcagaatt aaatactgta ttaaaataag ttcgctgtct ttaaacaaat
2101 ggagatgact actaagtcac attgacttta acatgaggta tcactatacc ttatttgtta
2161 aaatatatac tgtatacatt ttatatattt taacacttaa tactatgaaa acaaataatt
2221 gtaaaggaat cttgtcagat tacagtaaga atgaacatat ttgtggcatc gagttaaagt
2281 ttatatttcc cctaaatatg ctgtgattct aatacattcg tgtaggtttt caagtagaaa
2341 taaacctcgt aacaagttac tgaacgttta aacagcctga caagcatgta tatatgttta
2401 aaattcaata aacaaagacc cagtccctaa attatagaaa tttaaattat tcttgcatgt
2461 ttatcgacat cacaacagat ccctaaatcc ctaaatccct aaagattaga tacaaatttt
2521 ttaccacagt atcacttgtc agaatttatt tttaaatatg attttttaaa actgccagta
2581 agaaatttta aattaaaccc atttgttaaa ggatatagtg cccaagttat atggtgacct
2641 acctttgtca atacttagca ttatgtattt caaattatcc aatatacatg tcatatatat
2701 ttttatatgt cacatatata aaagatatgt atgatctatg tgaatcctaa gtaaatattt
2761 tgttccagaa aagtacaaaa taataaaggt aaaaataatc tataattttc aggaccacag
2821 actaagctgt cgaaattaac gctgattttt ttagggccag aataccaaaa tggctcctct
2881 cttcccccaa aattggacaa tttcaaatgc aaaataattc attatttaat atatgagttg
2941 cttcctctat t
ヒトＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチド配列（配列番号１１８２）
MFTIKLLLFI VPLVISSRID QDNSSFDSLS PEPKSRFAML DDVKILANGL LQLGHGLKDF
VHKTKGQIND IFQKLNIFDQ SFYDLSLQTS EIKEEEKELR RTTYKLQVKN EEVKNMSLEL
NSKLESLLEE KILLQQKVKY LEEQLTNLIQ NQPETPEHPE VTSLKTFVEK QDNSIKDLLQ
TVEDQYKQLN QQHSQIKEIE NQLRRTSIQE PTEISLSSKP RAPRTTPFLQ LNEIRNVKHD
GIPAECTTIY NRGEHTSGMY AIRPSNSQVF HVYCDVISGS PWTLIQHRID GSQNFNETWE
NYKYGFGRLD GEFWLGLEKI YSIVKQSNYV LRIELEDWKD NKHYIEYSFY LGNHETNYTL
HLVAITGNVP NAIPENKDLV FSTWDHKAKG HFNCPEGYSG GWWWHDECGE NNLNGKYNKP
RAKSKPERRR GLSWKSQNGR LYSIKSTKML IHPTDSESFE
カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列（配列番号１１８３）
1 tagagttaag aagtctaggt ctgcttccag aagaacacag ttccacgctg cttgaaattg
61 aaaatcagga taaaaatgtt cacaattaag ctccttcttt ttattgttcc tctagttatt
121 tcctccagaa ttgaccaaga caattcatca tttgattctg tatctccaga gccaaaatca
181 agatttgcta tgttagacga tgtaaaaatt ttagccaatg gcctccttca gttgggacat
241 ggtcttaaag actttgtcca taagactaag ggccaaatta atgacatatt tcaaaaactc
301 aacatatttg atcagtcttt ttatgatcta tcactgcaaa ccagtgaaat caaagaagaa
361 gaaaaggaac tgagaagaac tacatataaa ctacaagtca aaaatgaaga ggtaaagaat
421 atgtcacttg aactcaactc aaaacttgaa agcctcctag aagaaaaaat tctacttcaa
481 caaaaagtga aatatttaga agagcaacta actaacttaa ttcaaaatca acctgcaact
541 ccagaacatc cagaagtaac ttcacttaaa agttttgtag aaaaacaaga taatagcatc
601 aaagaccttc tccagactgt ggaagaacaa tataagcaat taaaccaaca gcatagtcaa
661 ataaaagaaa tagaaaatca gctcagaatg actaatattc aagaacccac agaaatttct
721 ctatcttcca agccaagagc accaagaact actccctttc ttcagctgaa tgaaataaga
781 aatgtaaaac atgatggcat tcctgctgat tgtaccacca tttacaatag aggtgaacat
841 ataagtggca cgtatgccat cagacccagc aactctcaag tttttcatgt ctactgtgat
901 gttgtatcag gtagtccatg gacattaatt caacatcgaa tagatggatc acaaaacttc
961 aatgaaacgt gggagaacta caaatatggt ttcgggaggc ttgatggaga attctggttg
1021 ggcctagaga agatatactc catagtgaag caatctaatt acgttttacg aattgagttg
1081 gaagactgga aagacaacaa acattatatt gaatattctt tttacttggg aaatcacgaa
1141 accaactata cgctacatgt agttaagatt actggcaatg tccccaatgc aatcccggaa
1201 aacaaagatt tggtgttttc tacttgggat cacaaagcaa aaggacactt cagctgtcca
1261 gagagttatt caggaggctg gtggtggcat gatgagtgtg gagaaaacaa cctaaatggt
1321 aaatataaca aaccaagaac aaaatctaag ccagagcgga gaagaggatt atcctggaag
1381 tctcaaaatg gaaggttata ctctataaaa tcaaccaaaa tgttgatcca tccaacagat
1441 tcagaaagct ttgaatgaac tgaggcaaat ttaaaaggca ataaattaaa cattaaactc
1501 attccaagtt aatgtggttt aataatctgg tattaaatcc ttaagagaag gcttgagaaa
1561 tagatttttt tatcttaaag tcactgtcaa tttaagatta aacatacaat cacataacct
1621 taaagaatac catttacatt tctcaatcaa aattcttaca acactatttg ttttatattt
1681 tgtgatgtgg gaatcaattt tagatggtcg caatctaaat tataatcaac aggtgaactt
1741 actaaataac ttttctaaat aaaaaactta gagactttaa ttttaaaagt catcatatga
1801 gctaatatca caattttccc agtttaaaaa actagttttc ttgttaaaac tctaaacttg
1861 actaaataaa gaggactgat aattatacag ttcttaaatt tgttgtaata ttaatttcaa
1921 aactaaaaat tgtcagcaca gagtatgtgt aaaaatctgt aatataaatt tttaaactga
1981 tgcctcattt tgctacaaaa taatctggag taaatttttg ataggattta tttatgaaac
2041 ctaatgaagc aggattaaat actgtattaa aataggttcg ctgtctttta aacaaatgga
2101 gatgatgatt actaagtcac attgacttta atatgaggta tcactatacc ttaacatatt
2161 tgttaaaacg tatactgtat acattttgtg tattttaata cttaatacta tgaaaacaag
2221 taattgtaaa cgtatcttgt cagattacaa taggaatgaa catattggtg acatcgagtt
2281 aaagtttata tttcccctaa atatgctgcg attccaatat attcatgtag gttttcaagc
2341 agaaataaac cttgtaacaa gttactgact aaaca
カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチド配列（配列番号１１８４）
MFTIKLLLFI VPLVISSRID QDNSSFDSVS PEPKSRFAML DDVKILANGL LQLGHGLKDF
VHKTKGQIND IFQKLNIFDQ SFYDLSLQTS EIKEEEKELR RTTYKLQVKN EEVKNMSLEL
NSKLESLLEE KILLQQKVKY LEEQLTNLIQ NQPATPEHPE VTSLKSFVEK QDNSIKDLLQ
TVEEQYKQLN QQHSQIKEIE NQLRMTNIQE PTEISLSSKP RAPRTTPFLQ LNEIRNVKHD
GIPADCTTIY NRGEHISGTY AIRPSNSQVF HVYCDVVSGS PWTLIQHRID GSQNFNETWE
NYKYGFGRLD GEFWLGLEKI YSIVKQSNYV LRIELEDWKD NKHYIEYSFY LGNHETNYTL
HVVKITGNVP NAIPENKDLV FSTWDHKAKG HFSCPESYSG GWWWHDECGE NNLNGKYNKP
RTKSKPERRR GLSWKSQNGR LYSIKSTKML IHPTDSESFE

Claims (40)

  1. ヒトアンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子のＲＮＡ転写物上の標的配列を標的とすることによってＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス配列は、標的配列と少なくとも９０％同一であり、標的配列は、配列番号１１８１のヌクレオチド１４３～１６１、１３５～１５３、１５３５～１５５３、１４３～１６３、１４４～１６２、１４５～１６３、１５０～１６８、１５１～１６９、１５２８～１５４６、１５３０～１５４８、１５３２～１５５０、１５３３～１５５１、１６０２～１６２０、２６１２～２６３０、または２７７３～２７９１である、ｄｓＲＮＡ。
  2. センス鎖およびアンチセンス鎖は、１５～２５の連続するヌクレオチドの領域にわたり互いに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. センス鎖およびアンチセンス鎖は、３０ヌクレオチド長を超えない、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. 標的配列は、配列番号１１８１のヌクレオチド１４３～１６１、１３５～１５３、１５３５～１５５３、１４３～１６３、１４４～１６２、１４５～１６３、または１５０～１６８である、請求項１～３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. ｄｓＲＮＡは、配列番号２２７～２２９、２６１～２６５、２６９、３４３、３５６、３７９、３８５、３８６、および４２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるアンチセンス配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. センス配列およびアンチセンス配列は、相補的であり、
    ａ）センス配列は、配列番号１３～１５、４７～５１、５５、１２９、１４２、１６５、１７１、１７２、および２１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；または
    ｂ）アンチセンス配列は、配列番号２２７～２２９、２６１～２６５、２６９、３４３、３５６、３７９、３８５、３８６、および４２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
    請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号１３および２２７；
    ｂ）配列番号５１および２６５；
    ｃ）配列番号１６５および３７９；
    ｄ）配列番号１４および２２８；
    ｅ）配列番号１５および２２９；
    ｆ）配列番号４７および２６１；
    ｇ）配列番号４８および２６２；
    ｈ）配列番号４９および２６３；
    ｉ）配列番号５０および２６４；
    ｊ）配列番号５５および２６９；
    ｋ）配列番号１２９および３４３；
    ｌ）配列番号１４２および３５６；
    ｍ）配列番号１７１および３８５；
    ｎ）配列番号１７２および３８６；または
    ｏ）配列番号２１２および４２６
    のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号１３および２２７；
    ｂ）配列番号５１および２６５；
    ｃ）配列番号１６５および３７９；
    ｄ）配列番号１４および２２８
    ｅ）配列番号１５および２２９；または
    ｆ）配列番号１７１および３８５
    のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、該１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチド、または２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  10. ｄｓＲＮＡは、そのセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端に反転２’－デオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、
    （ａ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハング；および／または
    （ｂ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハング
    をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. ｄｓＲＮＡ中のオーバーハングは、２または３つのヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. ｄｓＲＮＡ中のオーバーハングは、１つまたはそれ以上のチミンを含む、請求項１１または１２に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. センス配列およびアンチセンス配列は、交互の２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドおよび２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチドを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. ａ）センス鎖は、配列番号４４１～４４３、４７５～４７９、４８３、５５７、５７０、５９３、５９９、６００、および６４０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；ならびに／または
    ｂ）アンチセンス鎖は、配列番号６５５～６５７、６８９～６９３、６９７、７７１、７８４、８０７、８１３、８１４、および８５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
    請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号４４１および６５５；
    ｂ）配列番号４７９および６９３；
    ｃ）配列番号５９３および８０７；
    ｄ）配列番号４４２および６５６；
    ｅ）配列番号４４３および６５７；
    ｆ）配列番号４７５および６８９；
    ｇ）配列番号４７６および６９０；
    ｈ）配列番号４７７および６９１；
    ｉ）配列番号４７８および６９２；
    ｊ）配列番号４８３および６９７；
    ｋ）配列番号５５７および７７１；
    ｌ）配列番号５７０および７８４；
    ｍ）配列番号５９９および８１３；
    ｎ）配列番号６００および８１４；または
    ｏ）配列番号６４０および８５４
    のヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. ｄｓＲＮＡは、リンカーを用いて、または用いずに１つまたはそれ以上のリガンドとコンジュゲートされている、請求項１～１６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされている、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. ｄｓＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１～１８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖は、１つまたはそれ以上の、
    Figure 2023546103000075
     の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中：
    － Ｂは、複素環式核酸塩基であり、
    － Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分もしくは式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、
    － Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１もしくはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、以下であり：
    ・ 場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基（式中、
    Ｊは、ＯもしくはＳであり、
    Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）、
    ・ 場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
    ・ 基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３（式中
    ｍは、０もしくは１を意味する整数であり、
    ｐは、０から１０の範囲の整数であり、
    Ｒ２は、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、もしくは－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、
    Ｋは、ＯもしくはＳであり、
    Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
    Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、もしくは
    Ｒ３は、細胞標的化部分である）、
    － Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
    － Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈもしくは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、
    請求項１～１９のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  21. １つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｙは、
    ａ）Ｒ１が、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
    ｂ）Ｒ１が、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基である、ＮＲ１；
    ｃ）Ｒ１が、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基である、ＮＲ１；
    ｄ）Ｒ１が、シクロヘキシル基である、ＮＲ１；
    ｅ）Ｒ１が、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
    ｆ）Ｒ１が、フェニル基によって置換されたメチル基である、ＮＲ１；
    ｇ）Ｒ１が、場合により置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１；または
    ｈ）Ｒ１が、メチルまたはペンタデシルである、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１
    である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ。
  22. １つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリンからなる群から選択される、請求項２０または２１に記載のｄｓＲＮＡ。
  23. Ｒ３は、式（ＩＩ）：
    Figure 2023546103000076
     または薬学的に許容されるその塩であり、式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、ＯＨであり、
    Ａ４は、ＯＨもしくはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、式中、Ｒ５は、場合により、ハロゲン原子によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  24. Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、または薬学的に許容されるその塩である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  25. 表Ａの１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、請求項２０～２４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  26. ２から１０個の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項２０～２５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  27. ２から１０個の式（Ｉ）の化合物は、センス鎖上にある、請求項２６に記載のｄｓＲＮＡ。
  28. センス鎖は、５’末端に２から５つの式（Ｉ）の化合物を含み、および／または３’末端に１から３つの式（Ｉ）の化合物を含む、請求項２０～２７のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  29. ａ）センス鎖の５’末端にある２から５つの式（Ｉ）の化合物は、ｌｇＴ３および／もしくはｌｇＴ７を含み、場合により、３つの連続したｌｇＴ３ヌクレオチドを含む；ならびに／または
    ｂ）センス鎖の３’末端にある１から３つの式（Ｉ）の化合物は、ｌＴ４もしくはｌＴ３を含み、場合により、２つの連続したｌＴ４を含む、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ。
  30. リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル－ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、または薬学的に許容されるその塩からなる群から独立して選択される１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  31. 表１～３のｄｓＲＮＡから選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  32. ａ）センス鎖は、配列番号８５８、９０２、９０７、９１１、９１５、９３４、９７０、９７９、および９８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；または
    ｂ）アンチセンス鎖は、配列番号１０２０、１０６４、１０６９、１０７３、１０７７、１０９６、１１３２、１１４１、および１１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  33. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号８５８および１０２０；
    ｂ）配列番号９０２および１０６４；
    ｃ）配列番号９０７および１０６９；
    ｄ）配列番号９１１および１０７３；
    ｅ）配列番号９１５および１０７７；
    ｆ）配列番号９３４および１０９６；
    ｇ）配列番号９７０および１１３２；
    ｈ）配列番号９７９および１１４１；または
    ｉ）配列番号９８８および１１５０
    のヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載のｄｓＲＮＡ。
  34. 請求項１～３３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  35. ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害することを必要とするヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する際に使用するための、請求項１～３３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項３４に記載の組成物。
  36. ヒトの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡによって阻害される、請求項３５に記載の使用するためのｄｓＲＮＡまたは組成物。
  37. ＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置または予防することを必要とするヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置または予防する際に使用するための、請求項１～３６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項３４に記載の組成物。
  38. ＡＮＧＰＴＬ３関連状態は、脂質代謝障害である、請求項３７に記載の使用するためのｄｓＲＮＡまたは組成物。
  39. 脂質代謝障害は、高トリグリセライド血症である、請求項３８に記載の使用するためのｄｓＲＮＡまたは組成物。
  40. １つまたはそれ以上のＡＮＧＰＴＬ３関連状態を処置および／または予防する方法であって、請求項１～３３のいずれか１項に記載の１つもしくはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／または請求項３４に記載の１つもしくはそれ以上の医薬組成物を投与することを含む方法。
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