JP2023546103A - Angptl3を阻害するための新規のrna組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ANGPTL3を標的とするdsRNA、ANGPTL3遺伝子発現を阻害する方法、およびANGPTL3遺伝子発現と関連づけられる1つまたはそれ以上の状態を処置する方法に関する。
Description
配列表
基準として役立つ核酸配列が本明細書に開示されている。同じ配列を特許事項のために標準的な要件に従った形式の配列表に提示する。標準的な配列表といかなる配列の相違がある場合も、本明細書に記載されている配列が基準であるものとする。
基準として役立つ核酸配列が本明細書に開示されている。同じ配列を特許事項のために標準的な要件に従った形式の配列表に提示する。標準的な配列表といかなる配列の相違がある場合も、本明細書に記載されている配列が基準であるものとする。
発明の分野
本開示は、ANGPTL3を標的とするdsRNA、ANGPTL3遺伝子発現を阻害する方法、およびANGPTL3遺伝子発現に関連する1つまたはそれ以上の状態を処置する方法に関する。
本開示は、ANGPTL3を標的とするdsRNA、ANGPTL3遺伝子発現を阻害する方法、およびANGPTL3遺伝子発現に関連する1つまたはそれ以上の状態を処置する方法に関する。
アンジオポエチン様タンパク質3(ANGPTL3)は、脂質およびグルコース代謝ならびに血管形成に関与すると考えられているANGPTLファミリーメンバーである。アンジオポエチン5、ANGPT5、FHBL2、およびANL3としても知られているANGPTL3は、血漿トリグリセリド(TG)、超低比重リポタンパク質(VLDL)、低比重リポタンパク質(LDL)、および高比重リポタンパク質(HDL)のレベルを含む、血漿脂質レベルを調節する54kDaの肝臓分泌性タンパク質である。ANGPTL3は、TGおよびリン脂質の加水分解に関係するリポタンパク質リパーゼおよび血管内皮リパーゼを阻害する(非特許文献1)。上昇したレベルの血漿トリグリセリド(例えば、150mg/dLまたはそれ以上)およびLDL(例えば、130mg/dLまたはそれ以上)、ならびに低下したレベルのHDL(例えば、60mg/dLまたはそれ以下)は、例えば、肥満、高血圧、高コレステロールレベル、高血糖、糖尿病およびメタボリックシンドロームなどのリスク因子の一因となることによって、心臓疾患、心臓発作、卒中、およびアテローム動脈硬化症などの心血管系疾患のリスクを著しく増加させる。非常に高いレベルの血漿トリグリセリド(例えば、500mg/dLまたはそれ以上)は、膵炎のリスクを著しく増加させる。
特許文献1は、アンジオポエチン様(ANGPTL3)RNA組成物およびその使用の方法について開示している。
二本鎖RNA分子(dsRNA)は、RNA干渉(RNAi)として知られている高度に保存された制御機構において、遺伝子発現をブロックすることが示された。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、antimiR、およびantagomiRなどの一本鎖オリゴヌクレオチドの作用機序とは異なる作用機構のようである。RNA干渉技術において、小分子干渉RNA(siRNA)などの二本鎖RNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(「RISC」)と結合し、ここでは、一方の鎖(「パッセンジャー鎖」または「センス鎖」)が取り除かれ、残りの鎖(「ガイド鎖」または「アンチセンス鎖」)はRISCと協働して、相補的なRNA(標的RNA)と結合する。標的RNAは、結合を受けると、RISC中のRNAエンドヌクレアーゼアルゴノート(AGO)によって切断された後、RNAエキソヌクレアーゼによってさらに分解される。RNAiは、現在、異常なまたは望ましくない遺伝子の発現が原因となる障害を処置するための新しいクラスの治療用薬剤を開発するために使用されている。
Tikkaら、Endocrine(2016年)52(2):187~93頁
トリグリセリドおよび脂質代謝の制御におけるANGPTL3の重要性、ならびに上昇したトリグリセリドおよびLDLレベルに関連する疾患の罹患率のため、ANGPTL3発現の阻害剤を特定すること、ならびにそのような阻害剤を効能および細胞傷害性などの望ましくない副作用に関して試験することが継続して必要とされている。
ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するために有用なdsRNAが、本明細書において提供される。本明細書において提供されるdsRNAは、上昇したトリグリセリド、VLDLおよび/もしくはLDLレベルを正常な範囲に低下させることができるか、または正常なトリグリセリドレベルを維持することができ、結果として全般的に改善された健康状態をもたらす。本開示のRNA薬剤は、上昇したTGおよび/またはLDLコレステロール(LDL-c)レベルによって全体または一部特徴づけられる脂質代謝障害などの症状(例えば、高トリグリセライド血症、ならびに高脂血症、例えば、家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症(例えば、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、またはHoFH)、および多遺伝子性高コレステロール血症)を処置するために使用することができる。本開示のRNA薬剤はまた、上昇したTGおよびLDL-cレベルを有する患者の心血管リスク(例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、心臓疾患、心臓発作、および卒中)を低下させるために使用することができる。
したがって、ヒトアンジオポエチン様タンパク質3(ANGPTL3)遺伝子のRNA転写物上の標的配列を標的とすることによってANGPTL3遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸(dsRNA)が本明細書において提供され、dsRNAは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス配列は、標的配列と少なくとも90%同一であり、標的配列は、配列番号1181のヌクレオチド135~153、143~161、143~163、144~162、145~163、150~168、151~169、1528~1546、1530~1548、1532~1550、1533~1551、1535~1553、1602~1620、2612~2630、または2773~2791である。いくつかの実施形態において、本dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、15~25の連続するヌクレオチドの領域にわたり互いに相補的である。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、30ヌクレオチド長を超えない。
いくつかの実施形態において、本dsRNAの標的配列は、配列番号1181のヌクレオチド135~153、143~161、143~163、144~162、145~163、150~168、151~169、1528~1546、1530~1548、1532~1550、1533~1551、1535~1553、1602~1620、2612~2630、または2773~2791である。さらに別の実施形態において、標的配列は、配列番号1181のヌクレオチド135~153、143~161、144~162、145~163、150~168、または1535~1553である。さらに別の実施形態において、標的配列は、ヌクレオチド143~161、1535~1553および135~153である。本明細書中で使用される場合、配列番号Zの範囲「x~y」と定義される標的配列は、配列番号Zの核酸配列の位置xのヌクレオチドから開始し、位置yのヌクレオチドで終了する標的配列からなる。実例として、明確にするために、範囲「135~153」と定義される標的配列は、配列番号1181の核酸配列の位置135のヌクレオチドから開始し、位置153のヌクレオチドで終了する標的配列からなる。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、配列番号227~229、261~265、269、343、356、379、385、386、および426からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一であるアンチセンス配列を含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNAのセンス配列およびアンチセンス配列は、相補的であり、この場合、a)センス配列は、配列番号13~15、47~51、55、129、142、165、171、172、および212からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか;またはb)アンチセンス配列は、配列番号227~229、261~265、269、343、356、379、385、386、および426からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、a)配列番号13(センス鎖)および227(アンチセンス鎖);b)配列番号14および228;c)配列番号15および229;d)配列番号47および261;e)配列番号48および262;f)配列番号49および263;g)配列番号50および264;h)配列番号51および265;i)配列番号55および269;j)配列番号129および343;k)配列番号142および356;l)配列番号165および379;m)配列番号171および385;n)配列番号172および386;またはo)配列番号212および426のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、a)配列番号13および227;b)配列番号14および228;c)配列番号15および229;d)配列番号51および265;e)配列番号165および379;またはf)配列番号171および385のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、1つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、この場合、1つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、2’-デオキシ-2’-フルオロ-リボヌクレオチド、2’-デオキシリボヌクレオチド、または2’-O-メチル-リボヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、dsRNAは、2つまたはそれ以上の2’-O-メチル-リボヌクレオチドおよび2つまたはそれ以上の2’-デオキシ-2’-フルオロ-リボヌクレオチドを(例えば、交互のパターンで)含む。いくつかの実施形態において、センス配列およびアンチセンス配列は、交互の2’-O-メチルリボヌクレオチドおよび2’-デオキシ-2’-フルオロリボヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、そのセンスまたはアンチセンス鎖の3’末端に反転2’-デオキシリボヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、a)1つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む5’オーバーハング;および/またはb)1つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む3’オーバーハングをさらに含む。さらに別の実施形態において、dsRNA中のオーバーハングは、2または3つのヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、dsRNA中のオーバーハングは、1つまたはそれ以上のチミンを含む。
いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号441~443、475~479、483、557、570、593、599、600、および640からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み;ならびに/またはアンチセンス鎖は、配列番号655~657、689~693、697、771、784、807、813、814、および854からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、a)配列番号441および655;b)配列番号442および656;c)配列番号443および657;d)配列番号475および689;e)配列番号476および690;f)配列番号477および691;g)配列番号478および692;h)配列番号479および693;i)配列番号483および697;j)配列番号557および771;k)配列番号570および784;l)配列番号593および807;m)配列番号599および813;n)配列番号600および814;またはo)配列番号640および854のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、リンカーを伴い、または伴わずに1つまたはそれ以上のリガンド(例えば、1つもしくはそれ以上のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc))とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、リガンドは、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)であり、dsRNAは、1つまたはそれ以上のGalNAcとコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、dsRNAは、小分子干渉RNA(siRNA)である。
いくつかの実施形態において、dsRNAの一方または両方の鎖は、
の構造を有する1つまたはそれ以上の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中:
- Bは、複素環式核酸塩基であり、
- L1およびL2の一方は、式(I)の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、L1およびL2の他方は、H、保護基、リン部分もしくは式(I)の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、
- Yは、O、NH、NR1もしくはN-C(=O)-R1であり、式中、R1は、以下であり:
・ 場合により、ハロゲン原子、(C1~C6)アルキル基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基、(C5~C14)ヘテロアリール基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(=J)-O-Z1、-O-C(=J)-Z1、-C(=J)-N(Z1)(Z2)、および-N(Z1)-C(=J)-Z2から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C20)アルキル基(式中、
Jは、OもしくはSであり、
Z1およびZ2のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基である)、
・ 場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基、
・ 基-[C(=O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3(式中、
mは、0もしくは1を意味する整数であり、
pは、0から10の範囲の整数であり、
R2は、場合により、(C1~C6)アルキル基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(=K)-O-Z3、-O-C(=K)-Z3、-C(=K)-N(Z3)(Z4)、もしくは-N(Z3)-C(=K)-Z4によって置換された(C1~C20)アルキレン基であり、
Kは、OもしくはSであり、
Z3およびZ4のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基であり、
R3は、水素原子、(C1~C6)アルキル基、(C1~C6)アルコキシ基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基もしくは(C5~C14)ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、
もしくはR3は、細胞標的化部分である)、
- X1およびX2はそれぞれ、独立して水素原子、(C1~C6)アルキル基であり、
- Ra、Rb、RcおよびRdのそれぞれは、独立して、Hもしくは(C1~C6)アルキル基である。
- Bは、複素環式核酸塩基であり、
- L1およびL2の一方は、式(I)の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、L1およびL2の他方は、H、保護基、リン部分もしくは式(I)の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、
- Yは、O、NH、NR1もしくはN-C(=O)-R1であり、式中、R1は、以下であり:
・ 場合により、ハロゲン原子、(C1~C6)アルキル基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基、(C5~C14)ヘテロアリール基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(=J)-O-Z1、-O-C(=J)-Z1、-C(=J)-N(Z1)(Z2)、および-N(Z1)-C(=J)-Z2から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C20)アルキル基(式中、
Jは、OもしくはSであり、
Z1およびZ2のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基である)、
・ 場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基、
・ 基-[C(=O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3(式中、
mは、0もしくは1を意味する整数であり、
pは、0から10の範囲の整数であり、
R2は、場合により、(C1~C6)アルキル基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(=K)-O-Z3、-O-C(=K)-Z3、-C(=K)-N(Z3)(Z4)、もしくは-N(Z3)-C(=K)-Z4によって置換された(C1~C20)アルキレン基であり、
Kは、OもしくはSであり、
Z3およびZ4のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基であり、
R3は、水素原子、(C1~C6)アルキル基、(C1~C6)アルコキシ基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基もしくは(C5~C14)ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、
もしくはR3は、細胞標的化部分である)、
- X1およびX2はそれぞれ、独立して水素原子、(C1~C6)アルキル基であり、
- Ra、Rb、RcおよびRdのそれぞれは、独立して、Hもしくは(C1~C6)アルキル基である。
いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の式(I)の化合物を含む本dsRNA中の、Yは、
a)R1が、非置換(C1~C20)アルキル基である、NR1;
b)R1が、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換(C1~C16)アルキル基である、NR1;
c)R1が、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基である、NR1;
d)R1が、シクロヘキシル基である、NR1;
e)R1が、(C6~C14)アリール基によって置換された(C1~C20)アルキル基である、NR1;
f)R1が、フェニル基によって置換されたメチル基である、NR1;
g)R1が、場合により、置換された(C1~C20)アルキル基である、N-C(=O)-R1;または
h)R1が、メチルもしくはペンタデシルである、N-C(=O)-R1
である。
a)R1が、非置換(C1~C20)アルキル基である、NR1;
b)R1が、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換(C1~C16)アルキル基である、NR1;
c)R1が、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基である、NR1;
d)R1が、シクロヘキシル基である、NR1;
e)R1が、(C6~C14)アリール基によって置換された(C1~C20)アルキル基である、NR1;
f)R1が、フェニル基によって置換されたメチル基である、NR1;
g)R1が、場合により、置換された(C1~C20)アルキル基である、N-C(=O)-R1;または
h)R1が、メチルもしくはペンタデシルである、N-C(=O)-R1
である。
いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の式(I)の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む本dsRNA中の、Bは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の式(I)の化合物を含む本dsRNA中の、R3は、式(II):
または薬学的に許容されるその塩であり、
式中、A1、A2およびA3は、OHであり、
A4は、OHまたはNHC(=O)-R5であり、式中、R5は、場合により、ハロゲン原子によって置換された(C1~C6)アルキル基である。
式中、A1、A2およびA3は、OHであり、
A4は、OHまたはNHC(=O)-R5であり、式中、R5は、場合により、ハロゲン原子によって置換された(C1~C6)アルキル基である。
いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の式(I)の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む本dsRNA中の、R3は、N-アセチル-ガラクトサミンである。
いくつかの実施形態において、本dsRNAは、表AおよびBの1つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNAは、2から10個の式(I)の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNAは、センス鎖上に2から10個の式(I)の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNA中の、センス鎖は、5’末端に2から5個の式(I)の化合物を含み、および/または3’末端に1から3個の式(I)の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNA中の、
a)センス鎖の5’末端にある2から5つの式(I)の化合物は、lgT3および/もしくはlgT7を含み、場合により、3つの連続したlgT3ヌクレオチドを含む;ならびに/または
b)センス鎖の3’末端にある1から3つの式(I)の化合物は、lT4もしくはlT3を含み、場合により、2つの連続したlT4を含む。
a)センス鎖の5’末端にある2から5つの式(I)の化合物は、lgT3および/もしくはlgT7を含み、場合により、3つの連続したlgT3ヌクレオチドを含む;ならびに/または
b)センス鎖の3’末端にある1から3つの式(I)の化合物は、lT4もしくはlT3を含み、場合により、2つの連続したlT4を含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNAは、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル-ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、からなる群から独立して選択される1つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基、または薬学的に許容されるその塩を含む。
いくつかの実施形態において、本dsRNAは、表1~3のdsRNAから選択される。
いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号858、902、907、911、915、934、970、979、および988からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み;アンチセンス鎖は、配列番号1020、1064、1069、1073、1077、1096、1132、1141、および1150からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、a)配列番号858および1020;b)配列番号902および1064;c)配列番号907および1069;d)配列番号911および1073;e)配列番号915および1077;f)配列番号934および1096;g)配列番号970および1132;h)配列番号979および1141;またはi)配列番号988および1150のヌクレオチド配列を含む。
本開示は、本明細書に記載のdsRNAまたはDNAベクター、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。本開示は、本明細書に記載されるdsRNA、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
ANGPTL3発現を阻害することを必要とするヒトにおいてANGPTL3発現を阻害する際に使用するための、またはANGPTL3関連状態を処置もしくは予防することを必要とするヒトにおいてANGPTL3関連状態を処置もしくは予防する際に使用するための、本dsRNA、DNAベクター、または組成物も本開示において提供される。本開示はまた、ANGPTL3発現を阻害することを必要とするヒトにおいてANGPTL3発現を阻害する際に使用するためのdsRNA、またはそれを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、ヒトの肝臓におけるANGPTL3遺伝子の発現は、dsRNAによって阻害される。本開示は、ANGPTL3関連状態を処置または予防することを必要とするヒトにおいてANGPTL3関連状態を処置または予防する際に使用するためのdsRNA、またはそれを含む組成物をさらに提供する。特定の実施形態において、ANGPTL3関連状態は、脂質代謝障害である。特定の実施形態において、脂質代謝障害は、高トリグリセライド血症である。
本dsRNAもしくは組成物を哺乳動物に投与することによって、ANGPTL3発現を阻害すること、またはANGPTL3関連状態を処置もしくは予防することを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)においてANGPTL3発現を阻害する方法、またはANGPTL3関連状態を処置もしくは予防する方法が、本開示においてさらに提供される。
ANGPTL3発現を阻害すること、またはANGPTL3関連状態を処置もしくは予防することを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)において、ANGPTL3発現を阻害するため、またはANGPTL3関連状態を処置もしくは予防するための薬剤の製造における本dsRNAの使用、ならびに製造品(例えば、キット)が、本開示においてさらに提供される。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、処置方法において哺乳動物(例えば、ヒト)の肝臓におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害する。特定の実施形態において、ANGPTL3関連状態は、脂質代謝障害、例えば、高トリグリセライド血症ならびに関連疾患ならびに状態、例えば、アテローム動脈硬化症、膵炎、および高脂血症、例えば、家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症(例えば、HoFH)、および多遺伝子性高コレステロール血症である。
本開示は、アンジオポエチン様タンパク質3(ANGPTL3)遺伝子の発現を阻害する新規の二本鎖RNA(dsRNA)を提供する。いくつかの実施形態において、dsRNAは、小分子干渉RNA(siRNA)である。dsRNAは、脂質代謝障害(例えば、脂質異常症、混合型脂質異常症、高トリグリセライド血症、および膵炎などの関連疾患)などの状態を処置するために使用することができる。別に明記されない限り、「ANGPTL3」は、本明細書ではヒトANGPTL3を指す。ヒトANGPTL3タンパク質のmRNA配列は、NCBI参照配列番号NM_014495.3(配列番号1181)として入手可能であり、そのポリペプチド配列は、NCBI参照配列番号NP_055310.1(配列番号1182)として入手可能である。特定の実施形態において、本開示は、カニクイザルANGPTL3に言及する。カニクイザルANGPTL3タンパク質のmRNA配列は、NCBI参照配列番号XM_005543185.1(配列番号1183)として入手可能であり、そのポリペプチド配列は、NCBI参照配列番号XP_005543242.1(配列番号1184)として入手可能である。
本開示のdsRNA(例えば、GalNAc部分を伴う、または伴わないdsRNA)は、1、2、3、または4つすべての以下の特性を有する場合がある:(i)インビトロにおいて少なくとも24、26、28、30、32、48、52、56、60、72、96、または168時間の半減期を有する;(ii)ヒト初代PMBCから分泌されるインターフェロンαの産生を増加させない;(iii)インビトロにおいて(例えば、以下の研究例に記載されているとおりのヒトHep3B細胞、ヒト初代肝細胞、もしくはカニクイザル初代肝細胞において)ヒトANGPTL3発現の阻害に関して0.001、0.01、0.1、0.3、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、または10nMを超えないIC50値を有する;および(iv)ヒトANGPTL3を発現するC57BL/6マウス(例えば、5、10、15mg/kgもしくはそれ以上)においてインビボでANGPTL3のタンパク質レベルを少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下させる
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、GalNAc部分を含み、1、2、3、または4つすべての以下の特性を有する:(i)インビトロにおいて少なくとも24、48、72、96、または168時間の半減期を有する;(ii)ヒト初代PMBCから分泌されるインターフェロンαの産生を増加させない、(iii)インビトロでヒトまたはカニクイザル初代肝細胞においてヒトANGPTL3発現の阻害に関して9.68nMを超えないIC50値を有する;および(iv)5mg/kgの単回の皮下用量後のヒトANGPTL3を発現するC57BL/6マウスにおいてインビボでヒトANGPTL3のタンパク質レベルを少なくとも60%低下させる。特定の実施形態において、dsRNAは、すべての上記特性を有する。
本明細書に記載のdsRNA(「単離された」dsRNA)が天然には存在しないことを当業者は理解するであろう。
I. 二本鎖RNA
本開示の特定の態様は、ANGPTL3を標的とする二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子に関する。本明細書中で使用される場合、「二本鎖RNA」または「dsRNA」という用語は、2本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を有する二本鎖構造を含むオリゴリボヌクレオチド分子を指す。二本鎖構造を形成する2本の鎖は、1つのより大きなRNA分子の異なる部分である場合もあり、またはそれらは別個のRNA分子にある場合もある。2本の鎖が別個のRNA分子上にある場合、dsRNA構造は、短鎖干渉RNA(siRNA)として機能することができる。2本の鎖が1つのより大きな分子の一部であり、第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端との間で連続したヌクレオチドの鎖によって連結されている場合、連結するRNA鎖は、「ヘアピンループ」と言及され、RNA分子は、「短ヘアピンRNA」、または「shRNA」と呼ばれる場合もある。RNA鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有する場合もある。二本鎖構造に加えて、dsRNAは、1つまたはそれ以上(例えば、1、2もしくは3つ)のヌクレオチドのオーバーハングを含む場合がある。本開示のdsRNAは、下でさらに記載されるとおり(リンカーを伴い、または伴わずに)標的化部分をさらに含む場合がある。
本開示の特定の態様は、ANGPTL3を標的とする二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子に関する。本明細書中で使用される場合、「二本鎖RNA」または「dsRNA」という用語は、2本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を有する二本鎖構造を含むオリゴリボヌクレオチド分子を指す。二本鎖構造を形成する2本の鎖は、1つのより大きなRNA分子の異なる部分である場合もあり、またはそれらは別個のRNA分子にある場合もある。2本の鎖が別個のRNA分子上にある場合、dsRNA構造は、短鎖干渉RNA(siRNA)として機能することができる。2本の鎖が1つのより大きな分子の一部であり、第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端との間で連続したヌクレオチドの鎖によって連結されている場合、連結するRNA鎖は、「ヘアピンループ」と言及され、RNA分子は、「短ヘアピンRNA」、または「shRNA」と呼ばれる場合もある。RNA鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有する場合もある。二本鎖構造に加えて、dsRNAは、1つまたはそれ以上(例えば、1、2もしくは3つ)のヌクレオチドのオーバーハングを含む場合がある。本開示のdsRNAは、下でさらに記載されるとおり(リンカーを伴い、または伴わずに)標的化部分をさらに含む場合がある。
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも10塩基の、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態のヌクレオチドの高分子形態を指す。この用語は、一および二本鎖形態を含む。
「dsRNA」は、天然に存在するリボヌクレオチド、および/またはその化学修飾アナログを含むことができる。本明細書中で使用される場合、「dsRNA」は、リボース含有ヌクレオチドを有するものに限定されない。dsRNAは、本明細書において、その一部またはすべてのヌクレオチド中のリボース部分は、結果として生じた二本鎖分子がRNA干渉によって標的遺伝子の発現を阻害することができる限り、別の部分によって置換されている二本鎖ポリヌクレオチド分子を包含する。dsRNAは、1つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはその化学修飾アナログを含むこともできるが、60%を超えない(例えば、50%、40%、30%、20%、もしくは10%を超えない)。
本開示のdsRNAは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして、二本鎖構造を形成する程、十分に相補的である。「アンチセンス配列」という用語は、実質的または完全に相補的で、生理的条件下で細胞において標的RNA配列と結合する配列を指す。「標的配列」は、標的遺伝子、例えば、ANGPTL3遺伝子から転写されたRNA分子(例えば、一次RNA転写物またはメッセンジャーRNA転写物)上のヌクレオチド配列を指す。「センス配列」という用語は、アンチセンス配列と実質的または完全に相補的な配列を指す。
本開示のANGPTL3標的dsRNAは、センス配列を含むセンス鎖およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センスおよびアンチセンス配列は、互いに実質的または完全に相補的である。別に指示がある場合を除いて、「相補的な」という用語は、本明細書においては、特定の条件、例えば、生理的条件下において、第2の連続するヌクレオチド配列を含む別のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する、第1の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの能力を指す。これは、第1または第2の連続するヌクレオチド配列の全長にわたり2つのポリヌクレオチドの塩基対合を含むことができ;この場合、2つのヌクレオチド配列は、互いに「完全に相補的である」と見なされる。例えば、dsRNAが21ヌクレオチド長の第1のオリゴヌクレオチドおよび23ヌクレオチド長の第2のオリゴヌクレオチドを含み、2つのオリゴヌクレオチドが21の連続的な塩基対を形成する場合、2つのオリゴヌクレオチドは、互いに「完全に相補的である」と言及される。第1のポリヌクレオチド配列が、第2のポリヌクレオチド配列と「実質的に相補的である」と言及される場合、2つの配列は、ハイブリダイゼーションの長さの80%またはそれ以上(例えば、90%またはそれ以上)にわたり互いに塩基対を作ることができ、ミスマッチ塩基対は20%を超えない(例えば、10%を超えない)(例えば、20ヌクレオチドの二本鎖に対して、4つを超えないまたは2つを超えないミスマッチ塩基対)。2つのオリゴヌクレオチドが、1つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングと二本鎖を形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。2つの配列の相補性は、ワトソン・クリック塩基対および/または非ワトソン・クリック塩基対に基づく場合もある。本明細書中で使用される場合、mRNAの「少なくとも一部と実質的に相補的である」ポリヌクレオチドは、目的とするmRNA(例えば、ANGPTL3をコードするmRNA)の連続的な部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。
いくつかの実施形態において、ANGPTL3標的dsRNAはsiRNAであり、この場合、センスおよびアンチセンス鎖が互いに共有結合していない。いくつかの実施形態において、ANGPTL3標的dsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は、例えば、ヘアピンループ(shRNAの場合など)により、またはヘアピンループ以外の手段によって(「共有結合性リンカー」と呼ばれる結合構造によってなど)互いに共有結合している。
I.1 長さ
いくつかの実施形態において、(センス鎖中の)センス配列および(アンチセンス鎖中の)アンチセンス配列のそれぞれは、9~30ヌクレオチド長である。例えば、各配列は、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の上限および9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、各配列中のヌクレオチドの数は、15~25、15~30、16~29、17~28、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、または19~21が可能である。
いくつかの実施形態において、(センス鎖中の)センス配列および(アンチセンス鎖中の)アンチセンス配列のそれぞれは、9~30ヌクレオチド長である。例えば、各配列は、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の上限および9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、各配列中のヌクレオチドの数は、15~25、15~30、16~29、17~28、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、または19~21が可能である。
いくつかの実施形態において、各配列は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、各配列は、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、または31ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、各配列は、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス配列はそれぞれ、少なくとも15であり、25を超えないヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス配列はそれぞれ、少なくとも19であり、25を超えないヌクレオチド長である。例えば、配列は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長である。
センス配列およびアンチセンス配列は、同じか、または異なる長さの場合もある。例えば、アンチセンス配列は、21のヌクレオチドを有することができるが、センス配列は、23のヌクレオチドを有することができる。別の例において、アンチセンス配列およびセンス配列はともに、19のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、ANGPTL3標的dsRNAは、同じ長さまたは異なる長さのセンスおよびアンチセンス鎖を有する。例えば、センス鎖は、アンチセンス鎖よりも1、2、3、4、5、6、または7ヌクレオチド長いこともある。あるいは、センス鎖は、アンチセンス鎖よりも1、2、3、4、5、6、または7ヌクレオチド短いこともある。
いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、9~36ヌクレオチド長である。例えば、各鎖は、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36の上限および9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、各鎖中のヌクレオチドの数は、15~25、15~30、16~29、17~28、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、または19~21が可能である。
いくつかの実施形態において、各鎖は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、各鎖は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または37ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、各鎖は、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖はそれぞれ、少なくとも15であり、25を超えないヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖はそれぞれ、少なくとも19であり、23を超えないヌクレオチド長である。例えば、鎖は、19、20、21、22、または23ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センス鎖は、任意の修飾ヌクレオチドを含む21、22、23、24、または25のヌクレオチドを有すことができるが、アンチセンス鎖は、任意の修飾ヌクレオチドを含む21、22、または23のヌクレオチドを有することができる。特定の実施形態において、センス鎖は、19、20、または21のヌクレオチドを有するセンス配列を有することができるが、アンチセンス鎖は、19、20、または21のヌクレオチドを有するアンチセンス配列を有することができる。
I.2 オーバーハング
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、センスおよびアンチセンス鎖の一方または両方の3’末端、5’末端、または両末端に1つまたはそれ以上のオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上のオーバーハングは、dsRNAの安定性および/または阻害活性を向上させる。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、センスおよびアンチセンス鎖の一方または両方の3’末端、5’末端、または両末端に1つまたはそれ以上のオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上のオーバーハングは、dsRNAの安定性および/または阻害活性を向上させる。
「オーバーハング」は、本明細書では、dsRNAの第1の鎖の3’末端が第2の鎖の5’末端を超えて延びる場合、または逆の場合のdsRNAの二本鎖構造から突出する対になっていないヌクレオチドを指す。「平滑末端」とは、dsRNAのその末端に対になっていないヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」dsRNAは、その全長にわたり二本鎖である、すなわち、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないdsRNAである。dsRNAの3’末端および/または5’末端にコンジュゲートされた化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、dsRNAがオーバーハングを有するか否かを判断する際にここでは考慮されない。
いくつかの実施形態において、オーバーハングは、1つもしくはそれ以上、2つもしくはそれ以上、3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。例えば、オーバーハングは、1、2、3、または4つのヌクレオチドを含むこともある。
いくつかの実施形態において、本開示のオーバーハングは、1つまたはそれ以上のヌクレオチド(例えば、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、その天然に存在するもしくは化学修飾アナログ)を含む。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、1つもしくはそれ以上のチミンまたはその化学修飾アナログを含む。特定の実施形態において、オーバーハングは、1つまたはそれ以上のチミンを含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の5’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、センス鎖の3’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、センス鎖の5’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、センス鎖の3’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の5’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、dsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖の両方の3’末端に位置するオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の3’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、センス鎖の5’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、センス鎖の3’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、センス鎖の5’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の3’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、dsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖の両方の5’末端に位置するオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の5’末端にオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、センス鎖の3’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の5’末端にオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、2つの平滑末端を有する。
いくつかの実施形態において、オーバーハングは、センス鎖がアンチセンス鎖よりも長いことの結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、アンチセンス鎖がセンス鎖よりも長いことの結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、ねじれた同じ長さのセンスおよびアンチセンス鎖の結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、標的mRNAとのミスマッチを生じる。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、標的mRNAと相補的である。
特定の実施形態において、本開示のdsRNAは、5’-CCA-[センス配列]-invdTの配列を有するセンス鎖、および5’-[アンチセンス配列]-dTdT-3’の配列を有するアンチセンス鎖を含み、トリヌクレオチドCCAは、修飾される場合もある(例えば、2’-O-メチル-Cおよび2’-O-メチル-A)。
I.3 標的およびdsRNA配列
本開示のdsRNAのアンチセンス鎖は、ANGPTL3 RNA(例えば、mRNA)中の12~30ヌクレオチド長の標的配列と実質的または完全に相補的なアンチセンス配列を含む。例えば、標的配列は、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の上限および12、13、14、15、16、17、18、または19の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、標的配列中のヌクレオチドの数は、15~25、15~30、16~29、17~28、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、または19~21が可能である。
本開示のdsRNAのアンチセンス鎖は、ANGPTL3 RNA(例えば、mRNA)中の12~30ヌクレオチド長の標的配列と実質的または完全に相補的なアンチセンス配列を含む。例えば、標的配列は、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の上限および12、13、14、15、16、17、18、または19の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、標的配列中のヌクレオチドの数は、15~25、15~30、16~29、17~28、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、または19~21が可能である。
いくつかの実施形態において、標的配列は、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、標的配列は、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、標的配列は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的配列は、少なくとも15であり、25を超えないヌクレオチド長;例えば、少なくとも19であり、23を超えないヌクレオチド長、または15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド長である。
標的配列は、ANGPTL3 mRNA転写物の5’非コード領域、コード領域、または3’非コード領域にあることもある。標的配列は、非コードおよびコード領域の接合部に位置する場合もある。
いくつかの実施形態において、dsRNAアンチセンス鎖は、標的配列と1つまたはそれ以上のミスマッチ(例えば、1、2、3もしくは4つのミスマッチ)を有するアンチセンス配列を含む。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、ヒトANGPTL3 mRNA配列中の対応する部分と完全に相補的であり、カニクイザルANGPTL3 mRNA配列中の対応する部分と完全に相補的または実質的に相補的(例えば、少なくとも1つもしくは2つのミスマッチを含む)である。そのようなdsRNAの利点の1つは、カニクイザルなどの非ヒト霊長類におけるdsRNAの臨床前インビボ試験を可能にすることである。特定の実施形態において、dsRNAセンス鎖は、(例えば、ヒトまたはカニクイザルANGPTL3 mRNA中の)標的配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるセンス配列を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトANGPTL3 mRNA配列(配列番号1181)中の標的配列は、以下のヌクレオチドに、またはそのあたり(例えば、その3ヌクレオチド以内)に開始および終了ヌクレオチド位置を有する:135および153、143および161、143および163、144および162、145および163、150および168、151および169、1528および1546、1530および1548、1532および1550、1533および1551、1535および1553、1602および1620、2612および2630、ならびに2773および2791。いくつかの実施形態において、標的配列は、135から151の間に開始ヌクレオチド位置および153から169の間に終了ヌクレオチド位置、または1528から1535の間に開始ヌクレオチド位置および1546から1553の間に終了ヌクレオチド位置を有する。特定の実施形態において、標的配列は、ヒトANGPTL3 mRNA配列のヌクレオチド位置135~153、143~161、144~162、145~163、150~168、または1535~1553に対応し、開始および終了位置は、番号を付けた位置の3ヌクレオチド以内で変動する場合がある。いくつかの実施形態において、標的配列は、表1にセンス配列として列挙されている配列、または列挙されている配列の少なくとも80%(例えば、少なくとも90%)のヌクレオチドを含む配列である。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、表1に示されるセンス配列を含むセンス鎖を含む。例えば、センス鎖は、配列番号13~15、47~51、55、129、142、165、171、172、および212から選択される配列、または上記の選択された配列由来の少なくとも15、16、17、もしくは18の連続するヌクレオチドを有する配列を含む。特定の実施形態において、センス鎖は、配列番号13~15、51、165、および171から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、表1に示されるアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号227~229、261~265、269、343、356、379、385、386、および426から選択される配列、または上記の選択された配列由来の少なくとも15、16、17、もしくは18の連続するヌクレオチドを有する配列を含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号227~229、265、379、および385から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、表1に示されるセンス配列を含むセンス鎖および表1に示されるアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ、以下の配列を含む:
配列番号13および227;
配列番号14および228;
配列番号15および229;
配列番号47および261;
配列番号48および262;
配列番号49および263;
配列番号50および264;
配列番号51および265;
配列番号55および269;
配列番号129および343;
配列番号142および356;
配列番号165および379;
配列番号171および385;
配列番号172および386;または
配列番号212および426。
配列番号13および227;
配列番号14および228;
配列番号15および229;
配列番号47および261;
配列番号48および262;
配列番号49および263;
配列番号50および264;
配列番号51および265;
配列番号55および269;
配列番号129および343;
配列番号142および356;
配列番号165および379;
配列番号171および385;
配列番号172および386;または
配列番号212および426。
特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ、以下の配列を含む:
配列番号13および227;
配列番号14および228;
配列番号15および229;
配列番号51および265;
配列番号165および379;または
配列番号171および385。
配列番号13および227;
配列番号14および228;
配列番号15および229;
配列番号51および265;
配列番号165および379;または
配列番号171および385。
いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号13~15、47~51、55、129、142、165、171、172、および212から選択される配列と完全に相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号13~15、47~51、55、129、142、165、171、172、および212から選択される配列と実質的に相補的であり、アンチセンス配列は、選択された配列に対して少なくとも1つのミスマッチ(例えば、1、2、3または4つのミスマッチ)を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号13~15、51、165、および171から選択される配列と完全に相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号13~15、51、165、および171から選択される配列と実質的に相補的であり、アンチセンス配列は、選択された配列に対して少なくとも1つのミスマッチ(例えば、1、2、3または4つのミスマッチ)を含む。
いくつかの実施形態において、ANGPTL3標的dsRNAのアンチセンス配列は、標的配列に対して1つまたはそれ以上のミスマッチを含む(例えば、一般集団における個体間の対立遺伝子の差のため)。例えば、アンチセンス配列は、標的配列に対して1つまたはそれ以上のミスマッチ(例えば、1、2、3または4つのミスマッチ)を含む。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性の領域の中心に位置しない。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性の領域の5’および/または3’末端の5、4、3、2、もしくは1ヌクレオチド以内に位置する。例えば、19のヌクレオチドのアンチセンス配列を含むdsRNAに関して、いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、それとANGPTL3 mRNA中のその標的配列の間の相補性の領域の中心の9ヌクレオチド以内にいかなるミスマッチも含まない。
下記表1は、例となるsiRNAコンストラクト(CNST)のセンスおよびアンチセンス配列を列挙する。NM_014495.3(配列番号1181)の開始(ST)および終了(ED)ヌクレオチド位置を示す。「SEQ」は、配列番号を指す。
I.4 ヌクレオチド修飾
本開示のdsRNAは、例えば、細胞取り込み、標的配列に対する親和性、阻害活性、および/または安定性を向上させるために1つまたはそれ以上の修飾を含むことができる。修飾としては、例えば、末端修飾、塩基修飾、糖修飾/置換、および骨格修飾を含む、当該技術分野において既知の任意の修飾を挙げることができる。末端修飾としては、例えば、5’末端修飾(例えば、リン酸化、コンジュゲーション、および反転結合(inverted linkage))ならびに3’末端修飾(例えば、コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、および反転結合)を挙げることができる。塩基修飾としては、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは広範なレパートリーのパートナーと塩基対を作る塩基による置換、塩基の除去(ヌクレオチドの脱塩基修飾)、またはコンジュゲートされた塩基を挙げることができる。糖修飾または置換としては、例えば、糖部分の2’もしくは4’位における修飾、または糖部分の置換を挙げることができる。骨格修飾としては、例えば、1つまたはそれ以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、ならびにホスホルアミダートによる、例えば、リン酸ジエステル結合の修飾または置換を挙げることができる。
本開示のdsRNAは、例えば、細胞取り込み、標的配列に対する親和性、阻害活性、および/または安定性を向上させるために1つまたはそれ以上の修飾を含むことができる。修飾としては、例えば、末端修飾、塩基修飾、糖修飾/置換、および骨格修飾を含む、当該技術分野において既知の任意の修飾を挙げることができる。末端修飾としては、例えば、5’末端修飾(例えば、リン酸化、コンジュゲーション、および反転結合(inverted linkage))ならびに3’末端修飾(例えば、コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、および反転結合)を挙げることができる。塩基修飾としては、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは広範なレパートリーのパートナーと塩基対を作る塩基による置換、塩基の除去(ヌクレオチドの脱塩基修飾)、またはコンジュゲートされた塩基を挙げることができる。糖修飾または置換としては、例えば、糖部分の2’もしくは4’位における修飾、または糖部分の置換を挙げることができる。骨格修飾としては、例えば、1つまたはそれ以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、ならびにホスホルアミダートによる、例えば、リン酸ジエステル結合の修飾または置換を挙げることができる。
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在するもしくは修飾ヌクレオチド、または代替置換部分を含む。修飾ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドであり、本明細書において、「ヌクレオチドアナログ」とも呼ばれる。当業者は、ヌクレオチドのグアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、またはチミンを、修飾ヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく他の部分によって置換することができることを理解するであろう。例えば、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を作ることができる。したがって、本開示のヌクレオチド配列中のウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示の実施形態として含まれる。修飾ヌクレオチドは、リボース部分が非リボース部分により置換されたヌクレオチドも可能である。
本開示のdsRNAとしては、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-デオキシ修飾ヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、チオホスフェートおよびホスホロチオアートなどの代替ヌクレオチド間結合を含む修飾ヌクレオチド、リン酸トリエステル修飾ヌクレオチド、末端でコレステロール誘導体または親油性部分と連結された修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA;例えば、Nielsenら、Science(1991年)254:1497~500頁を参照)、拘束エチル(constrained ethyl)(cEt)修飾ヌクレオチド、反転デオキシ修飾ヌクレオチド(inverted deoxy modified nucleotide)、反転ジデオキシ修飾ヌクレオチド(inverted dideoxy modified nucleotide)、ロックド核酸(locked nucleic acid)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドの脱塩基修飾、2’-アミノ修飾ヌクレオチド、2’-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノ修飾ヌクレオチド、ホスホルアミダート修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位に修飾を含む修飾ヌクレオチド、ならびに非天然塩基含有修飾ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の1つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、2’-O-メチルヌクレオチド、5’-ホスホロチオアートヌクレオチド、またはコレステロール誘導体、親油性もしくはその他の標的化部分と連結された末端ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドのヌクレオシド中への2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-プロピル、2’-O-アルキル、2’-O-アミノアルキル、または2’-デオキシ-2’-フルオロ(すなわち、2’-フルオロ)基の組み込みにより、オリゴヌクレオチドに向上したハイブリダイゼーション特性および/または向上したヌクレアーゼ安定性を付与することができる。さらに、ホスホロチオアート骨格を含むオリゴヌクレオチド(例えば、dsRNAの1つまたはそれ以上の位置の隣接する2つのヌクレオチド間のホスホロチオアート結合)は、向上したヌクレアーゼ安定性を有する場合もある。いくつかの実施形態において、dsRNAは、ロックド核酸(LNA)単位などの修飾リボースを有するヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、1つまたはそれ以上の2’-O-メチルヌクレオチドおよび1つまたはそれ以上の2’-フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、2つまたはそれ以上の2’-O-メチルヌクレオチドおよび2つまたはそれ以上の2’-フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、2つまたはそれ以上の2’-O-メチルヌクレオチド(OMe)および2つまたはそれ以上の2’-フルオロヌクレオチド(F)を交互のパターン、例えば、パターンOMe-F-OMe-FまたはパターンF-OMe-F-OMeで含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、それぞれ2’-O-メチルヌクレオチドである最大10の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、それぞれが2’-フルオロヌクレオチドである最大10の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、アンチセンス鎖の5’または3’末端に2つまたはそれ以上の2’-フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、1つまたはそれ以上のホスホロチオアート基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、2つもしくはそれ以上、3つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、5つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、7つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上、9つもしくはそれ以上、または10個もしくはそれ以上のホスホロチオアート基を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、いかなるホスホロチオアート基も含まない。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、1つまたはそれ以上のリン酸トリエステル基を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、2つもしくはそれ以上、3つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、5つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、7つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上、9つもしくはそれ以上、または10個もしくはそれ以上のリン酸トリエステル基を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、いかなるリン酸トリエステル基も含まない。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、dsRNAの二本鎖部分内に、例えば、デオキシリボヌクレオシドオーバーハングを含む、デオキシリボヌクレオシドなどの修飾リボヌクレオシド、および1つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドを含む。ただし、いかなる状況でも、「dsRNA」という用語に二本鎖のDNA分子が包含されることは自明のことである。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、2つもしくはそれ以上、3つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、5つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、7つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上、9つもしくはそれ以上、または10個もしくはそれ以上の本明細書に記載されている異なる修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、最大2つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大3つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大4つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大5つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大6つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大7つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大8つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大9つの連続的な修飾ヌクレオチド、または最大10個の連続的な修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、連続的な修飾ヌクレオチドは、同じ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、連続的な修飾ヌクレオチドは、2つもしくはそれ以上、3つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、5つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、7つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上、9つもしくはそれ以上、または10個もしくはそれ以上の異なる修飾ヌクレオチドである。
下記表2は、修飾ヌクレオチドを含む例となるsiRNAコンストラクト(CNST)の配列を列挙する。NM_014495.3(配列番号1181)の開始(ST)および終了(ED)ヌクレオチド位置を示す。略語は以下のとおりである:SEQ=配列番号;mX=2’-O-Meヌクレオチド;fX=2’-Fヌクレオチド;dX=DNAヌクレオチド;invdX=反転dX;PO=リン酸ジエステル結合;およびHy=ヒドロキシル基。これらのコンストラクトにおいて、それらのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、(1)修飾ヌクレオチドmXおよびfX、(2)両鎖の5’および3’末端に「Hy」、(3)センス鎖ヌクレオチド配列の5’末端にmC-mC-mA、(4)センス鎖ヌクレオチド配列の3’末端にinvdT、および(5)アンチセンス鎖ヌクレオチド配列の3’末端にdT-dTを含むことを別にすれば、同じコンストラクト番号を有する表1のコンストラクトのセンスおよびアンチセンス配列と対応する。これらのコンストラクトにおいて、ヌクレオチドの塩基対は、いくつかの実施形態では、異なるように修飾することができ、例えば、塩基対の一方のヌクレオチドが2’-O-Meリボヌクレオチドであり、他方が2’-Fヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、5’末端に2つの2’-Fヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、国際公開第2019/170731号に記載されている1つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、その開示の全体を本明細書に組み入れる。そのような修飾ヌクレオチドにおいて、リボース環は、六員複素環によって置換されている。そのような修飾ヌクレオチドは、式(I):
の構造を有するか、または薬学的に許容されるその塩であり、式中:
- Bは、複素環式核酸塩基であり;
- L1およびL2の一方は、式(I)の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、L1およびL2の他方は、H、保護基、リン部分もしくは式(I)の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、
- Yは、O、NH、NR1もしくはN-C(=O)-R1であり、式中、R1は、以下であり:
・ 場合により、ハロゲン原子、(C1~C6)アルキル基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基、(C5~C14)ヘテロアリール基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(=J)-O-Z1、-O-C(=J)-Z1、-C(=J)-N(Z1)(Z2)、および-N(Z1)-C(=J)-Z2から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C20)アルキル基(式中、
Jは、OもしくはSであり、
Z1およびZ2のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基である)、
・ 場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基、
・ 基-[C(=O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3(式中、
mは、0もしくは1を意味する整数であり、
pは、0から10の範囲の整数であり、
R2は、場合により、(C1~C6)アルキル基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(=K)-O-Z3、-O-C(=K)-Z3、-C(=K)-N(Z3)(Z4)、もしくは-N(Z3)-C(=K)-Z4によって置換された(C1~C20)アルキレン基であり、
Kは、OもしくはSであり、
Z3およびZ4のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基であり、
R3は、水素原子、(C1~C6)アルキル基、(C1~C6)アルコキシ基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基もしくは(C5~C14)ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、もしくはR3は、細胞標的化部分である)、
- X1およびX2はそれぞれ、独立して水素原子、(C1~C6)アルキル基であり、
- Ra、Rb、RcおよびRdのそれぞれは、独立して、Hもしくは(C1~C6)アルキル基である。
- Bは、複素環式核酸塩基であり;
- L1およびL2の一方は、式(I)の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、L1およびL2の他方は、H、保護基、リン部分もしくは式(I)の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、
- Yは、O、NH、NR1もしくはN-C(=O)-R1であり、式中、R1は、以下であり:
・ 場合により、ハロゲン原子、(C1~C6)アルキル基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基、(C5~C14)ヘテロアリール基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(=J)-O-Z1、-O-C(=J)-Z1、-C(=J)-N(Z1)(Z2)、および-N(Z1)-C(=J)-Z2から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C20)アルキル基(式中、
Jは、OもしくはSであり、
Z1およびZ2のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基である)、
・ 場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基、
・ 基-[C(=O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3(式中、
mは、0もしくは1を意味する整数であり、
pは、0から10の範囲の整数であり、
R2は、場合により、(C1~C6)アルキル基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(=K)-O-Z3、-O-C(=K)-Z3、-C(=K)-N(Z3)(Z4)、もしくは-N(Z3)-C(=K)-Z4によって置換された(C1~C20)アルキレン基であり、
Kは、OもしくはSであり、
Z3およびZ4のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基であり、
R3は、水素原子、(C1~C6)アルキル基、(C1~C6)アルコキシ基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基もしくは(C5~C14)ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、もしくはR3は、細胞標的化部分である)、
- X1およびX2はそれぞれ、独立して水素原子、(C1~C6)アルキル基であり、
- Ra、Rb、RcおよびRdのそれぞれは、独立して、Hもしくは(C1~C6)アルキル基である。
いくつかの実施形態において、Yは、NR1であり、R1は、非置換(C1~C20)アルキル基であり、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、NR1であり、R1は、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、ヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む、非置換(C1~C16)アルキル基であり、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、NR1であり、R1は、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つまたはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基であり、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、NR1である、R1は、シクロヘキシル基であり、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、NR1であり、R1は、(C6~C14)アリール基によって置換された(C1~C20)アルキル基であり、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、NR1であり、R1は、フェニル基によって置換されたメチル基であり、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、N-C(=O)-R1であり、R1は、場合により置換された(C1~C20)アルキル基であり、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、N-C(=O)-R1であり、R1は、メチルおよびペンタデシルを含む群から選択され、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3およびBは、一般式(I)または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Bは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリン、または薬学的に許容されるその塩を含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、dsRNA中のヌクレオシド間連結基は、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル-ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、または薬学的に許容されるその塩からなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、2から10個の式(I)の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む。
さらに別の実施形態において、dsRNAは、1つまたはそれ以上の標的ヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む。
いくつかの実施形態において、R3は、式(II):
であり、式中、A1、A2およびA3は、OHであり、
A4は、OHまたはNHC(=O)-R5であり、式中、R5は、場合により、ハロゲン原子によって置換された(C1~C6)アルキル基である。
A4は、OHまたはNHC(=O)-R5であり、式中、R5は、場合により、ハロゲン原子によって置換された(C1~C6)アルキル基である。
いくつかの実施形態において、R3は、N-アセチル-ガラクトサミンである。
式(I)のヌクレオチドを有する修飾siRNAを生成するために使用することができる前駆体を、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホラミダイトヌクレオチドアナログの例を示す、表Aに例示する。(2S,6R)ジアステレオマーシリーズにおいて、ヌクレオチド前駆体としてのホスホラミダイトは、「pre-l」で略記され、ヌクレオチドアナログは、式(I)中の基Yを指定する核酸塩基および数が続く「l」で略記される。両方の立体化学を区別するために、アナログ(2R,6R)-ジアステレオ異性体を、追加の「b」で示す。標的ヌクレオチド前駆体、標的ヌクレオチドアナログおよび固相担体は、上記のとおり略記されるが、「l」の代わりに「lg」を用いる。
式(I)の修飾ヌクレオチドを、dsRNAのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の5’、3’、または両末端に組み込むことができる。例として、1つまたはそれ以上(例えば、1、2、3、4、もしくは5つまたはそれ以上)の修飾ヌクレオチドを、dsRNAのセンス鎖の5’末端に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上(例えば、1、2、3、またはそれ以上)の修飾ヌクレオチドは、センス鎖の5’末端に位置し、この場合、修飾ヌクレオチドは、アンチセンス配列とぴったりとは合わないが、場合により、アンチセンス鎖の対応する3’末端で等しい数またはそれより小さい数の相補的なヌクレオチドと対を形成する場合もある。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、17、18、または19ヌクレオチド長のセンス配列を有するセンス鎖を含む場合もあり、この場合、3から5つの式(I)のヌクレオチド(例えば、式(I)の追加のヌクレオチドを伴い、もしくは伴わず3つの連続的なlgT3またはlgT7)がセンス配列の5’末端に配置され、センス鎖は20、21、または22ヌクレオチド長になる。そのような実施形態において、センス鎖は、センス配列の3’末端に式(I)の2つの連続的なヌクレオチド(例えば、1T4またはlT3)をさらに含み、センス鎖が22、23、または24ヌクレオチド長になる場合もある。dsRNAは、19ヌクレオチド長のアンチセンス配列を含む場合もあり、この場合、アンチセンス配列は、3’末端に2つの修飾ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド(例えば、dT)とさらに連結され、アンチセンス鎖が21ヌクレオチド長になることもある。さらに別の実施形態において、dsRNAのセンス鎖は、天然に存在するヌクレオチド間結合(リン酸ジエステル結合)のみを含み、この場合、アンチセンス鎖は、場合により、天然に存在しないヌクレオチド間結合を含むこともある。例えば、アンチセンス鎖は、骨格中の5’および/もしくは3’末端付近または5’および/もしくは3’末端にホスホロチオアート結合を含む場合もある。
いくつかの実施形態において、式(I)の修飾ヌクレオチドの使用は、天然に存在しないヌクレオチド間結合の使用などの他のRNA修飾の必要性を回避し、それによりdsRNAの化学合成を簡単にする。さらに、式(I)の修飾ヌクレオチドは、(GalNAc自体を含む)GalNAc誘導体などの細胞へと標的化された部分を含むよう容易に生成することができ、そのようなヌクレオチドを含むdsRNAの送達効率を向上させる。さらに、例えば、センス鎖に式(I)の修飾ヌクレオチドを含むdsRNAは、dsRNAの安定性および治療効力を著しく向上させることが示された。
下記表3は、表2に列挙されているコンストラクトsiRNA#013、siRNA#051、およびsiRNA#165から誘導される例となる修飾GalNAc-siRNAコンストラクトの配列を列挙する。この表では、mX=2’-O-Meヌクレオチド;fX=2’-Fヌクレオチド;dX=DNAヌクレオチド;lx=ロックド核酸(LNA);PO=リン酸ジエステル結合;PS=ホスホロチオアート結合;およびHy=ヒドロキシル基である。
表2および3に示される例となるsiRNAはヌクレオチド修飾を含むが、同じ、または実質的に同じ配列であるが、異なる数、パターン、および/またはタイプの修飾を有するsiRNAも考えられる。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、片方または両方の末端にヌクレオチド(もしくはその修飾型)が付加された表1に示されるセンス鎖を含む。例えば、dsRNAは、5’CCAおよび/または3’invdTが付加された表1に示されるセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、片方または両方の末端にヌクレオチド(もしくはその修飾型)が付加された表1に示されるアンチセンス鎖を含む。例えば、dsRNAは、3’dTdTが付加された表1に示されるアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、dsRNAは、センス鎖に5’CCAおよび3’invdTが付加され、アンチセンス鎖に3’dTdTが付加された、表1に示されるとおりのセンスおよびアンチセンス鎖の組を含む。特定の実施形態において、dsRNAは、センス鎖に5’lgT7-lgT7-lgT7および3’lT4-lT4が付加された、表2に示されるとおりのセンスおよびアンチセンス鎖の組を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、配列において表1に示されるセンス配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、配列において表1に示されるアンチセンス配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアンチセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、配列において表1に示されるセンスおよびアンチセンス配列それぞれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるセンスおよびアンチセンス配列を含む。特定の実施形態において、dsRNAは、表2に示される配列を有するセンスおよびアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、dsRNAは、表3に示される配列を有するセンスおよびアンチセンス鎖を含む。
2つのヌクレオチド配列間の「同一性パーセンテージ」は、2つの最適にアライメントされた配列を比較することによって求められ、この場合、比較するための核酸配列は、2つの配列間の最適なアライメントのための参照配列と比較して、付加または欠失を有することがある。「同一性パーセンテージ」は、ヌクレオチド残基が2つの配列間、好ましくは、2つの完全な配列間で同一である位置の数を求め、同一の位置の数をアライメントウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果に100を掛けることによって計算して、2つの配列間の同一性パーセンテージを得る。本明細書における目的で、2つのヌクレオチド配列間の「同一性パーセンテージ」を求めるとき、ヌクレオチドに対する修飾は考慮されない。例えば、5’-mC-fU-mA-fG-3’の配列は、5’-CUAG-3’の配列と100%の配列同一性を有すると見なされる。
I.5 dsRNAコンジュゲート
本dsRNAは、1つまたはそれ以上のリガンドまたは部分と共有結合的または非共有結合的に連結させることができる。そのようなリガンドおよび部分の例は、例えば、Jeongら、Bioconjugate Chem.(2009年)20:5~14頁およびSebestyenら、Methods Mol Biol.(2015年)1218:163~86頁に見出すことができる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、1つまたはそれ以上のリガンドとリンカーを介してコンジュゲートされる/結びつけられる。例えば、多価(例えば、二価、三価、または四価)の分岐リンカーを含む、当該技術分野において既知の任意のリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能または切断不可能な場合もある。リガンドをdsRNAとコンジュゲートすることは、その分布を変え、その細胞の吸収および/もしくは特定の組織に対する標的化および/もしくは1つもしくはそれ以上の特定の細胞タイプ(例えば、肝臓細胞)による取り込みを増大させ、ならびに/またはdsRNAの存続期間もしくは半減期を増大させることもある。いくつかの実施形態において、疎水性リガンドは、dsRNAとコンジュゲートされ、細胞膜の直接的な浸透および/または細胞(例えば、肝臓細胞)を超えた取り込みを促進する。ANGPTL3標的dsRNA(例えば、siRNA)に関して、標的組織は、肝臓の実質細胞(例えば、肝細胞)を含む、肝臓である場合もある。
本dsRNAは、1つまたはそれ以上のリガンドまたは部分と共有結合的または非共有結合的に連結させることができる。そのようなリガンドおよび部分の例は、例えば、Jeongら、Bioconjugate Chem.(2009年)20:5~14頁およびSebestyenら、Methods Mol Biol.(2015年)1218:163~86頁に見出すことができる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、1つまたはそれ以上のリガンドとリンカーを介してコンジュゲートされる/結びつけられる。例えば、多価(例えば、二価、三価、または四価)の分岐リンカーを含む、当該技術分野において既知の任意のリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能または切断不可能な場合もある。リガンドをdsRNAとコンジュゲートすることは、その分布を変え、その細胞の吸収および/もしくは特定の組織に対する標的化および/もしくは1つもしくはそれ以上の特定の細胞タイプ(例えば、肝臓細胞)による取り込みを増大させ、ならびに/またはdsRNAの存続期間もしくは半減期を増大させることもある。いくつかの実施形態において、疎水性リガンドは、dsRNAとコンジュゲートされ、細胞膜の直接的な浸透および/または細胞(例えば、肝臓細胞)を超えた取り込みを促進する。ANGPTL3標的dsRNA(例えば、siRNA)に関して、標的組織は、肝臓の実質細胞(例えば、肝細胞)を含む、肝臓である場合もある。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、細胞標的リガンドとコンジュゲートされる。細胞標的リガンドは、dsRNAの標的細胞への送達を促進する分子部分を指し、これは、(i)選択された標的受容体(例えば、標的タンパク質)を発現する細胞と結合するdsRNAの特異度の増加;(ii)標的細胞によるdsRNAの取り込みの増加;および(iii)例えば、輸送ベシクルから細胞質へのsiRNAの移行を促進することによるsiRNAの細胞内放出の増加など、それが標的細胞に入ったら適切に処理されるdsRNAの能力の向上を包含する。リガンドは、例えば、タンパク質(例えば、糖タンパク質)、ペプチド、脂質、炭水化物、または共リガンドに対して特異親和性を有する分子が可能である。
リガンドの特定の例としては、抗体または肝臓細胞上の特定の受容体と結合するその抗原結合フラグメント、チロトロピン、メラノトロピン、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、多価マンノース、多価フコース、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン、トランスフェリン、ビスホスホナート、ステロイド、胆汁酸、リポ多糖、組み換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、ポリアミノ酸、アルファヘリカルペプチド、ポリグルタマート、ポリアスパルタート、レクチン、および補因子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リガンドは、1つまたはそれ以上の色素、クロスリンカー、多環式芳香族炭化水素、ペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、ポリエチレングリコール(PEG)、酵素、ハプテン、輸送/吸収促進剤、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、もしくはイミダゾールクラスター)、ヒト血清アルブミン(HSA)、またはLDLである。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、1つまたはそれ以上のコレステロール誘導体もしくは親油性部分、例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体;コール酸;ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンA、ビタミンE(トコフェロール)、ビオチン、もしくはピリドキサール);飽和および非飽和の両方を含む胆汁酸コンジュゲートもしくは脂肪酸コンジュゲート(例えば、ラウロイル(C12)、ミリストイル(C14)、パルミトイル(C16)、ステアロイル(C18)およびドコサニル(C22)、リトコール酸および/もしくはリトコール酸オレイルアミンコンジュゲート(リトコール酸オレイル(lithocholic-oleyl)、C43));ポリマー骨格もしくは足場(例えば、PEG、トリエチレングリコール(TEG)、ヘキサエチレングリコール(HEG)、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ラクチド・グリコリドコポリマー(PLG)、流体力学的ポリマー(hydrodynamic polymer));ステロイド(例えば、ジヒドロテストステロン);テルペン(例えば、トリテルペン);カチオン性脂質もしくはペプチド;ならびに/または脂質もしくは脂質ベースの分子と結合させられる。そのような脂質または脂質ベースの分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)と結合することができる。脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの標的組織との結合を調節する(例えば、制御する)ために使用することができる。例えば、HSAとより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に導かれる可能性が低いため、体から除去される可能性が低い。
いくつかの実施形態において、細胞標的化部分またはリガンドは、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)誘導体である。いくつかの実施形態において、dsRNAは、1つまたはそれ以上(例えば、2、3、4つまたはそれ以上)のGalNAc誘導体に結合させられる。結合は、1つまたはそれ以上のリンカー(例えば、2、3、4つまたはそれ以上のリンカー)を介する場合もある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているリンカーは、多価(例えば、二価、三価、または四価)の分岐リンカーである。いくつかの実施形態において、dsRNAは、2つまたはそれ以上のGalNAc誘導体と二価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、3つまたはそれ以上のGalNAc誘導体と三価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、3つまたはそれ以上のGalNAc誘導体とリンカーを用いて、または用いずに結合させられる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、4つまたはそれ以上のGalNAc誘導体と4つの別々のリンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、4つまたはそれ以上のGalNAc誘導体と四価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上のGalNAc誘導体は、dsRNAのセンス鎖の3’末端、アンチセンス鎖の3’末端、センス鎖の5’末端、および/またはアンチセンス鎖の5’末端と結合させられる。例となる、非限定的コンジュゲートおよびリンカーは、例えば、Biessenら、Bioconjugate Chem.(2002年)13(2):295~302頁;Cedilloら、Molecules(2017年)22(8):E1356;Grijalvoら、Genes(2018年)9(2):E74;Huangら、Molecular Therapy:Nucleic Acids(2017年)6:116~32頁;Nairら、J Am Chem Soc.(2014年)136:16958~61頁;Ostergaardら、Bioconjugate Chem.(2015年)26:1451~5頁;Springerら、Nucleic Acid Therapeutics(2018年)28(3):109~18頁;ならびに米国特許第8,106,022号、同第9,127,276号、および同第8,927,705号に記載されている。GalNAcコンジュゲーションは、当該技術分野において周知の方法によって容易に行うことができる(例えば、上の文書に記載されているとおり)。
II. dsRNAを生成する方法
本開示のdsRNAは、当該技術分野において既知の任意の方法によって合成することができる。例えば、dsRNAは、自動合成機の使用によって、(例えば、市販のインビトロRNA合成キットを使用した)インビトロ転写および精製によって、細胞(例えば、dsRNAをコードする発現カセット/ベクターを含む細胞)からの転写および精製などによって合成することができる。いくつかの実施形態において、dsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々に合成された後、アニーリングされて、dsRNAを形成する。いくつかの実施形態において、場合により、細胞標的化部分(例えば、GalNAc)とコンジュゲートされた式(I)の修飾ヌクレオチドを含むdsRNAは、国際公開第2019/170731号の開示に従って調製することができる。
本開示のdsRNAは、当該技術分野において既知の任意の方法によって合成することができる。例えば、dsRNAは、自動合成機の使用によって、(例えば、市販のインビトロRNA合成キットを使用した)インビトロ転写および精製によって、細胞(例えば、dsRNAをコードする発現カセット/ベクターを含む細胞)からの転写および精製などによって合成することができる。いくつかの実施形態において、dsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々に合成された後、アニーリングされて、dsRNAを形成する。いくつかの実施形態において、場合により、細胞標的化部分(例えば、GalNAc)とコンジュゲートされた式(I)の修飾ヌクレオチドを含むdsRNAは、国際公開第2019/170731号の開示に従って調製することができる。
リガンドコンジュゲートdsRNAおよび本開示の配列特異的な連結されたヌクレオシドを有するリガンド分子は、例えば、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または既に連結部分を有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド・ヌクレオチド、またはリガンド分子を既に有するヌクレオシドコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有する基本単位を利用した、適したポリヌクレオチド合成機における構築を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって構築することができる。
本開示のリガンドコンジュゲートdsRNAは、例えば、連結分子のdsRNAへの結合から誘導されたものなどのペンダント反応性官能基を有するdsRNAの使用を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって合成することができる。いくつかの実施形態において、この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、任意のさまざまな保護基を有する合成されたリガンド、またはリガンドに結合した連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。いくつかの実施形態において、方法は、適切にリガンドとコンジュゲートされ、固相担体材料とさらに結合させることもできるヌクレオシドモノマーの使用によってリガンドコンジュゲートdsRNAの合成を容易にする。いくつかの実施形態において、dsRNAの3’末端に結合したアラルキルリガンドを有するdsRNAは、まずモノマー基本単位をコントロールドポアグラス担体と長鎖アミノアルキル基により共有結合させ;その後、ヌクレオチドを標準的な固相合成技術により固相担体と結合したモノマー基本単位に結合させることによって調製される。モノマー基本単位は、ヌクレオシドまたは固相合成に適合したその他の有機化合物が可能である。
いくつかの実施形態において、5’末端にアミノ基を有する本開示の官能化ヌクレオシド配列は、ポリヌクレオチド合成機を使用して調製され、その後、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させられる。活性エステル誘導体は、当業者によく知られている。アミノ基と活性エステルの反応は、選択されたリガンドが連結基により5’位に結合したオリゴヌクレオチドを生成する。5’末端にあるアミノ基は、5’-amino-modifier C6試薬を利用して作製することができる。いくつかの実施形態において、リガンド分子は、リガンド-ヌクレオシドホスホラミダイトの使用によってオリゴヌクレオチドと5’位においてコンジュゲートされ、この場合、リガンドは、5’-ヒドロキシ基に直接、またはリンカーを介して間接的に連結される。そのようなリガンド-ヌクレオシドホスホラミダイトは、一般に自動合成手順の終わりに使用されて、5’末端にリガンドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドをもたらす。
いくつかの実施形態において、siRNAコンジュゲートを合成するためにクリックケミストリーが使用される。例えば、Astakhovaら、Mol Pharm.(2018年)15(8):2892~9頁;Mercierら、Bioconjugate Chem.(2011年)22(1):108~14頁を参照。
III. dsRNAの組成物および送達
本開示の特定の態様は、本明細書に記載されているdsRNAを含む組成物(例えば、医薬組成物)に関する。いくつかの実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、ANGPTL3遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有するか、またはそれを有するリスクがある患者を処置するのに有用である。いくつかの実施形態において、ANGPTL3遺伝子の発現に関連する疾患または障害は、脂質代謝障害(例えば、高トリグリセライド血症および高脂血症(家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症(例えば、HoFH)、および多遺伝子性高コレステロール血症など)ならびに上昇したTGおよび/もしくはLDL-cに関連する状態および疾患(例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、心臓疾患、心臓発作、卒中、および膵炎)、ならびに/または本明細書および当該技術分野において示されている任意のその他の関連状態および疾患である。本開示の組成物は、送達の様式に基づいて製剤化することができ、例えば、非経口投与による肝臓への送達のために製剤化された組成物を含む。
本開示の特定の態様は、本明細書に記載されているdsRNAを含む組成物(例えば、医薬組成物)に関する。いくつかの実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、ANGPTL3遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有するか、またはそれを有するリスクがある患者を処置するのに有用である。いくつかの実施形態において、ANGPTL3遺伝子の発現に関連する疾患または障害は、脂質代謝障害(例えば、高トリグリセライド血症および高脂血症(家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症(例えば、HoFH)、および多遺伝子性高コレステロール血症など)ならびに上昇したTGおよび/もしくはLDL-cに関連する状態および疾患(例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、心臓疾患、心臓発作、卒中、および膵炎)、ならびに/または本明細書および当該技術分野において示されている任意のその他の関連状態および疾患である。本開示の組成物は、送達の様式に基づいて製剤化することができ、例えば、非経口投与による肝臓への送達のために製剤化された組成物を含む。
本dsRNAは、薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤は、液体または固体が可能であり、所望の容積、粘度、ならびにその他の関連する輸送および化学的特性をもたらすよう、計画される投与様式を念頭において選択することができる。例えば、水、生理食塩水、結合剤(例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、増量剤(例えば、ラクトースおよびその他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム)、滑沢剤(例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム)、崩壊剤(例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)、カルシウム塩(例えば、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、およびヒドロキシアパタイト)、ならびに湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)を含む、任意の既知の薬学的に許容される賦形剤を使用することができる。
本dsRNAは、他の分子、分子構造体、または核酸の混合物と混合された、カプセル化された、コンジュゲートされた、または代わりに会合しているdsRNAを含有する組成物(例えば、医薬組成物)に製剤化することができる。例えば、1つまたはそれ以上の本明細書に記載されるdsRNAを含む組成物は、他の脂質低下薬(例えば、スタチン)などの他の治療用薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、本組成物(例えば、医薬組成物)は、本明細書に記載される送達ビヒクルをさらに含む。
本開示のdsRNAは、直接または間接的に送達することができる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、dsRNAを含む医薬組成物を対象に投与することによって直接送達される。いくつかの実施形態において、dsRNAは、下に記載される1つまたはそれ以上のベクターを投与することによって間接的に送達される。
本開示のdsRNAは、例えば、核酸分子を送達する方法をdsRNAとの使用に適合させることを含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって(例えば、Akhtarら、Trends Cell Biol.(1992年)2(5):139~44頁;国際公開第94/02595号を参照)、または当該技術分野において既知のさらなる方法により(例えば、Kanastyら、Nature Materials(2013年)12:967~77頁;WittrupおよびLieberman、Nature Reviews Genetics(2015年)16:543~52頁;Whiteheadら(2009年)Nature Reviews Drug Discovery 8:129~38頁;Garyら、J Control Release(2007年)121(1-2):64~73頁;Wangら、AAPS J.(2010年)12(4):492~503頁;Drazら、Theranostics(2014年)4(9):872~92頁;Wanら、Drug Deliv Transl Res.(2013年)4(1):74~83頁;ErdmannおよびBarciszewski(編)(2010年)“RNA Technologies and Their Applications”、Springer-Verlag Berlin Heidelberg、DOI 10.1007/978-3-642-12168-5;XuおよびWang、Asian Journal of Pharmaceutical Sciences(2015年)10(1):1~12頁を参照)送達することができる。インビボ送達に関して、dsRNAは、組織部位に注射するか、または全身投与(例えば、吸入によるナノ粒子形態)することができる。インビボ送達は、ベータ・グルカン送達系を介して行うこともできる(例えば、Teszら、Biochem J.(2011年)436(2):351~62頁を参照)。細胞へのインビトロ導入としては、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当該技術分野において既知の方法が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、dsRNAを含む送達ビヒクルによって送達される。いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、リポソーム、リポプレックス、複合体、またはナノ粒子である。
III.1 リポソーム製剤
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層または多重膜ベシクルである。いくつかの実施形態において、リポソームは、球状の二重膜または複数の二重膜中に配置された両親媒性脂質から構成されるベシクルである。水性部分は、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合できるという利点をもつ。リポソームの利点としては、例えば、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性であり、生分解性であること;リポソームが広い範囲の水溶性および脂溶性薬物を含むことができること;ならびにリポソームがその内部区画にカプセル化された薬物を代謝および分解から保護することができることが挙げられる(Rosoff、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、RiegerおよびBanker(編)、1988年、Marcel Dekker, Inc.、New York、N.Y.、第1巻、245頁)。リポソーム製剤の調製において重要な考慮すべき事項は、リポソームの脂質表面電荷、ベシクルサイズおよび水様液の体積である。例えば、dsRNAを送達するために設計されたカチオン性リポソームおよび立体的に安定化されたリポソームを使用することができる。例えば、Podestaら、Methods Enzymol.(2009年)464:343~54頁;米国特許第5,665,710号を参照。
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層または多重膜ベシクルである。いくつかの実施形態において、リポソームは、球状の二重膜または複数の二重膜中に配置された両親媒性脂質から構成されるベシクルである。水性部分は、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合できるという利点をもつ。リポソームの利点としては、例えば、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性であり、生分解性であること;リポソームが広い範囲の水溶性および脂溶性薬物を含むことができること;ならびにリポソームがその内部区画にカプセル化された薬物を代謝および分解から保護することができることが挙げられる(Rosoff、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、RiegerおよびBanker(編)、1988年、Marcel Dekker, Inc.、New York、N.Y.、第1巻、245頁)。リポソーム製剤の調製において重要な考慮すべき事項は、リポソームの脂質表面電荷、ベシクルサイズおよび水様液の体積である。例えば、dsRNAを送達するために設計されたカチオン性リポソームおよび立体的に安定化されたリポソームを使用することができる。例えば、Podestaら、Methods Enzymol.(2009年)464:343~54頁;米国特許第5,665,710号を参照。
III.2 核酸・脂質粒子
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えば、以下に限定されない、SPLP、pSPLP、またはSNALPなどの核酸・脂質粒子を形成する。本明細書中で使用される場合、「SNALP」という用語は、SPLPを含む、安定な核酸・脂質粒子を指す。本明細書中で使用される場合、「SPLP」という用語は、脂質ベシクル内にカプセル化されたプラスミドDNAを含む核酸・脂質粒子を指す。核酸・脂質粒子、例えば、SNALPは、一般にカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質(例えば、PEG・脂質コンジュゲート)を含む。SNALPおよびSPLPは、静脈(i.v.)注射後に長い循環存続期間を示し、遠位部位(例えば、投与部位から物理的に離れた部位)に蓄積するため、全身適用に有用である。SPLPは、「pSPLP」を含み、これらとしては、国際公開第00/03683号に記載されているカプセル化された凝縮剤・核酸複合体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えば、以下に限定されない、SPLP、pSPLP、またはSNALPなどの核酸・脂質粒子を形成する。本明細書中で使用される場合、「SNALP」という用語は、SPLPを含む、安定な核酸・脂質粒子を指す。本明細書中で使用される場合、「SPLP」という用語は、脂質ベシクル内にカプセル化されたプラスミドDNAを含む核酸・脂質粒子を指す。核酸・脂質粒子、例えば、SNALPは、一般にカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質(例えば、PEG・脂質コンジュゲート)を含む。SNALPおよびSPLPは、静脈(i.v.)注射後に長い循環存続期間を示し、遠位部位(例えば、投与部位から物理的に離れた部位)に蓄積するため、全身適用に有用である。SPLPは、「pSPLP」を含み、これらとしては、国際公開第00/03683号に記載されているカプセル化された凝縮剤・核酸複合体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、dsRNAは、核酸・脂質粒子中に存在するとき、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗力がある。核酸・脂質粒子およびそれらの製造の方法は、例えば、米国特許第5,976,567号;同第5,981,501号;同第6,534,484号;同第6,586,410号;および同第6,815,432号;ならびに国際公開第96/40964号に開示されている。
いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、カチオン性脂質を含む。当該技術分野において既知の任意のカチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、非カチオン性脂質を含む。当該技術分野において既知の任意の非カチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、(例えば、凝集を防ぐために)コンジュゲートされた脂質を含む。当該技術分野において既知の任意のコンジュゲートされた脂質を使用することができる。
III.3 さらなる製剤
インビボでdsRNA分子を首尾よく送達するために検討する重要な要素としては、(1)送達分子の生物学的安定性、(2)非特異的効果の予防、および(3)標的組織における送達分子の蓄積が挙げられる。dsRNAの非特異的効果は、例えば、組織への直接注射もしくは挿入による局部投与によって、または調製物を局所投与することによって最小限にすることができる。疾患の処置のためのdsRNAの全身投与では、dsRNAを、修飾するか、あるいは薬物送達系を使用して送達することができ;いずれの方法も、インビボにおけるエンドおよびエキソヌクレアーゼによるdsRNAの急速な分解を妨げるよう働く。RNAの修飾または医薬賦形剤も、dsRNA組成物の標的組織に対する標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することができる。上記のとおり、dsRNA分子を、コレステロールなどの親油性基との化学的コンジュゲーションによって修飾して、細胞取り込みを増大させ、分解を防ぐことができる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、ナノ粒子(例えば、リン酸カルシウムナノ粒子)、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達系を使用して送達される。正の電荷をもつカチオン性送達系は、(負の電荷をもつ)dsRNA分子の結合を促進し、負の電荷をもつ細胞膜における相互作用も増大させて、細胞によるdsRNAの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、dsRNAと結合させるか、またはdsRNAを入れるベシクルもしくはミセルを形成させることができる(例えば、Kimら、Journal of Controlled Release(2008年)129(2):107~16頁を参照)。ベシクルまたはミセルの形成は、全身投与されたときにdsRNAの分解をさらに妨げる。カチオン性dsRNA複合体を生成および投与する方法は、当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、dsRNAは、全身投与のためのサイクロデキストリンと複合体を形成することができる。
インビボでdsRNA分子を首尾よく送達するために検討する重要な要素としては、(1)送達分子の生物学的安定性、(2)非特異的効果の予防、および(3)標的組織における送達分子の蓄積が挙げられる。dsRNAの非特異的効果は、例えば、組織への直接注射もしくは挿入による局部投与によって、または調製物を局所投与することによって最小限にすることができる。疾患の処置のためのdsRNAの全身投与では、dsRNAを、修飾するか、あるいは薬物送達系を使用して送達することができ;いずれの方法も、インビボにおけるエンドおよびエキソヌクレアーゼによるdsRNAの急速な分解を妨げるよう働く。RNAの修飾または医薬賦形剤も、dsRNA組成物の標的組織に対する標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することができる。上記のとおり、dsRNA分子を、コレステロールなどの親油性基との化学的コンジュゲーションによって修飾して、細胞取り込みを増大させ、分解を防ぐことができる。いくつかの実施形態において、dsRNAは、ナノ粒子(例えば、リン酸カルシウムナノ粒子)、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達系を使用して送達される。正の電荷をもつカチオン性送達系は、(負の電荷をもつ)dsRNA分子の結合を促進し、負の電荷をもつ細胞膜における相互作用も増大させて、細胞によるdsRNAの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、dsRNAと結合させるか、またはdsRNAを入れるベシクルもしくはミセルを形成させることができる(例えば、Kimら、Journal of Controlled Release(2008年)129(2):107~16頁を参照)。ベシクルまたはミセルの形成は、全身投与されたときにdsRNAの分解をさらに妨げる。カチオン性dsRNA複合体を生成および投与する方法は、当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、dsRNAは、全身投与のためのサイクロデキストリンと複合体を形成することができる。
III.4 ベクターにコードされるdsRNA
本開示のdsRNAは、標的細胞にdsRNAをコードする組み換えベクター(DNAもしくはRNAベクター)を導入することによって標的細胞に間接的に送達することができる。dsRNAは、細胞内のベクターから、例えば、shRNAの形態で発現されることになり、shRNAは、その後、siRNAに細胞内でプロセシングされる。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、原核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、大腸菌(E.coli)における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、真核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、酵母菌細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、脊椎動物細胞における発現に適合している。例えば、アデノウイルス(AV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(LV)、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど)、ヘルペスウイルス、SV40ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス(例えば、オルソポックスまたはアビポック)など由来のベクターを含む、当該技術分野において既知のdsRNAをコードすることが可能な任意の発現ベクターを使用することができる。ウイルスベクターまたはウイルス由来のベクターの指向性は、必要に応じて1つもしくはそれ以上の他のウイルスのエンベロープタンパク質もしくはその他の表面抗原でベクターをシュードタイプすることによって、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることによって改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、Mokolaウイルスなどの表面タンパク質でシュードタイプすることができる。AAVベクターは、異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するようベクターを操作することによって異なる細胞を標的とするように作製することができる。例えば、血清型2のゲノムに基づいて血清型2のカプシドを発現するAAVベクターは、AAV2/2と呼ばれる。AAV2/2ベクター中のこの血清型2のカプシド遺伝子を、血清型5のカプシド遺伝子によって置き換えて、AAV2/5ベクターを生成することができる。異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するAAVベクターを構築するための技術は、以前に示されている(例えば、Rabinowitzら、J. Virol.(2002年)76:791~801頁を参照)。
本開示のdsRNAは、標的細胞にdsRNAをコードする組み換えベクター(DNAもしくはRNAベクター)を導入することによって標的細胞に間接的に送達することができる。dsRNAは、細胞内のベクターから、例えば、shRNAの形態で発現されることになり、shRNAは、その後、siRNAに細胞内でプロセシングされる。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、原核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、大腸菌(E.coli)における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、真核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、酵母菌細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、脊椎動物細胞における発現に適合している。例えば、アデノウイルス(AV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(LV)、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど)、ヘルペスウイルス、SV40ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス(例えば、オルソポックスまたはアビポック)など由来のベクターを含む、当該技術分野において既知のdsRNAをコードすることが可能な任意の発現ベクターを使用することができる。ウイルスベクターまたはウイルス由来のベクターの指向性は、必要に応じて1つもしくはそれ以上の他のウイルスのエンベロープタンパク質もしくはその他の表面抗原でベクターをシュードタイプすることによって、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることによって改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、Mokolaウイルスなどの表面タンパク質でシュードタイプすることができる。AAVベクターは、異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するようベクターを操作することによって異なる細胞を標的とするように作製することができる。例えば、血清型2のゲノムに基づいて血清型2のカプシドを発現するAAVベクターは、AAV2/2と呼ばれる。AAV2/2ベクター中のこの血清型2のカプシド遺伝子を、血清型5のカプシド遺伝子によって置き換えて、AAV2/5ベクターを生成することができる。異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するAAVベクターを構築するための技術は、以前に示されている(例えば、Rabinowitzら、J. Virol.(2002年)76:791~801頁を参照)。
組み換えベクターの選択、dsRNAを発現するためにベクターに核酸配列を挿入するための方法、および1つまたはそれ以上の目的の細胞にベクターを送達する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Domburg、Gene Therap.(1995年)2:301~10頁;Eglitis、Biotechniques(1998年)6:608~14頁;Miller、Hum Gene Therap.(1990年)1:5~14頁;Anderson、Nature(1998年)392:25~30頁;Xiaら、Nat Biotech.(2002年)20:1006~10頁;Robinsonら、Nat Genet.(2003年)33:401~6頁;Samulskiら、J Virol.(1987年)61:3096~101頁;Fisherら、J Virol.(1996年)70:520~32頁;Samulskiら、J Virol.(1989年)63:3822~6頁;米国特許第5,252,479号および同第5,139,941号;ならびに国際公開第94/13788号および同第93/24641号を参照。
本明細書に記載されるdsRNAの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織におけるdsRNAの発現に十分な調節エレメント(例えば、異種プロモーター、エンハンサーなど)を含むことができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、1つまたはそれ以上の異種プロモーターと連結されたdsRNAをコードする1つまたはそれ以上の配列を含む。例えば、U6またはH1 RNA pol IIIプロモーター、T7プロモーター、およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む、dsRNAを発現することができる当該技術分野において既知の任意の異種プロモーターを使用することができる。1つまたはそれ以上の異種プロモーターは、誘導性プロモーター、抑制可能なプロモーター、調節可能なプロモーター、および/または組織特異的なプロモーターが可能である。さらなるプロモーターの選択は、当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、構成的発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、調節された/誘導可能な/抑制可能な発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、組織特異的な発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントおよびdsRNAをコードする配列は、転写単位を形成する。
本開示のdsRNAは、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写単位から発現される(例えば、Coutureら、TIG(1996年)12:5~10頁;国際公開第00/22113号および同第00/22114号;ならびに米国特許第6,054,299号を参照)。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞タイプにより、一過性(およそ数時間から数週間)の場合も、または持続性(数週から数か月もしくはそれ以上)の場合もある。これらの導入遺伝子は、直線的なコンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これは、組み込みもしくは非組み込みベクターが可能である。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように構築される(Gassmannら、PNAS(1995年)92:1292頁)。
いくつかの実施形態において、dsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々の発現ベクターにコードされる。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、(例えば、トランスフェクションまたは感染によって)同じ標的細胞に共導入された2つの別々の発現ベクターにおいて発現される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターにコードされる。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターに配置された別々のプロモーターから転写される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターの同じプロモーターから転写される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、dsRNAがステムおよびループ構造を有するよう、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆向き反復配列として同じプロモーターから転写される。
IV. dsRNA療法
本開示の特定の態様は、対象(例えば、ヒトなどの霊長類対象)におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害するための方法であって、治療有効量の1つもしくはそれ以上の本開示のdsRNA、1つもしくはそれ以上の本開示のベクター、または1つもしくはそれ以上の本開示の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。本開示の特定の態様は、1つまたはそれ以上の本明細書に記載されている状態(例えばANGPTL3関連状態)を処置する方法および/または予防する方法であって、1つもしくはそれ以上の本開示のdsRNAおよび/または1つもしくはそれ以上の本開示のベクターおよび/または1つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているdsRNAを含む1つもしくはそれ以上の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、対象におけるANGPTL3発現のダウンレギュレートは、対象における高脂血症、家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症(例えば、HoFH)、および多遺伝子性高コレステロール血症などの脂質代謝障害;または上昇したTGおよびLDL-cに関連する疾患もしくは状態(例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈性心疾患、心臓発作、卒中、悪液質、膵炎、ならびにアルツハイマー病および多発性硬化症などの中枢神経系の疾患)の1つまたはそれ以上の症状を軽減する。
本開示の特定の態様は、対象(例えば、ヒトなどの霊長類対象)におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害するための方法であって、治療有効量の1つもしくはそれ以上の本開示のdsRNA、1つもしくはそれ以上の本開示のベクター、または1つもしくはそれ以上の本開示の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。本開示の特定の態様は、1つまたはそれ以上の本明細書に記載されている状態(例えばANGPTL3関連状態)を処置する方法および/または予防する方法であって、1つもしくはそれ以上の本開示のdsRNAおよび/または1つもしくはそれ以上の本開示のベクターおよび/または1つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているdsRNAを含む1つもしくはそれ以上の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、対象におけるANGPTL3発現のダウンレギュレートは、対象における高脂血症、家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症(例えば、HoFH)、および多遺伝子性高コレステロール血症などの脂質代謝障害;または上昇したTGおよびLDL-cに関連する疾患もしくは状態(例えば、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈性心疾患、心臓発作、卒中、悪液質、膵炎、ならびにアルツハイマー病および多発性硬化症などの中枢神経系の疾患)の1つまたはそれ以上の症状を軽減する。
本開示の医薬組成物は、ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているdsRNAの適した用量は、0.001mg/kg~200mg/kg受け手の体重の範囲である。特定の実施形態において、適した用量は、0.001mg/kg~50mg/kg受け手の体重の範囲、例えば、0.001mg/kg~20mg/kg受け手の体重の範囲である。治療有効量の医薬組成物による対象の処置は、1回の処置または一連の処置を含むことがある。
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という用語は、ANGPTL3発現が関係する病理学的過程の処置、予防、もしくは維持、またはANGPTL3発現が関係する病理学的過程の明白な症状に治療上の利益をもたらす量を指す。
本明細書中で使用される場合、「ANGPTL3関連状態」という用語は、ANGPTL3の活性を阻害することが有益なあらゆる状態を含むことが意図される。そのような状態は、例えば、ANGPTL3タンパク質の過剰な産生によって、ANGPTL3活性もしくは発現を高めるANGPTL3遺伝子変異によって、活性を高めるか、もしくは分解を低減するANGPTL3タンパク質の異常な切断によって、および/またはANGPTL3活性が高められるか、もしくは分解が低減されるようなANGPTL3と、他のタンパク質もしくは他の内因性もしくは外因性物質との間の異常な相互作用によって引き起こされる場合がある。ANGPTL3関連状態は、高トリグリセライド血症ならびに関連疾患ならびに状態、例えば、アテローム動脈硬化症、膵炎、ならびに家族性複合型高脂血症、家族性高コレステロール血症(例えば、HoFH)、および多遺伝子性高コレステロール血症などの高脂血症から選択される場合がある。ANGPTL3関連状態は、例えば、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害である場合がある。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているdsRNAは、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害または高トリグリセライド血症に関連する任意の症状もしくは状態を有する対象を処置するために使用される。特定の実施形態において、本明細書に記載されているdsRNAは、薬物誘発性高トリグリセライド血症、利尿誘発性高トリグリセライド血症、アルコール誘発性高トリグリセライド血症、β-アドレナリン遮断薬誘発性高トリグリセライド血症、エストロゲン誘発性高トリグリセライド血症、グルココルチコイド誘発性高トリグリセライド血症、レチノイド誘発性高トリグリセライド血症、シメチジン誘発性高トリグリセライド血症、家族性高トリグリセライド血症、高トリグリセライド血症に関連する急性膵炎、および/または高トリグリセライド血症に関連する肝脾腫の患者を処置するために使用される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているdsRNAは、以下から選択される1つまたはそれ以上の状態を有する対象を処置するために使用される:脂血症(lipidemia)(例えば、高脂血症)、脂質異常症(例えば、アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症、または混合型脂質異常症)、高リポタンパク血症、高コレステロール血症(例えば、欠損または不活性LDLRにするLDL受容体(LDLR)における機能喪失型遺伝子変異が原因となる、例えば、HoFH)、高コレステロール血症に関連する痛風、カイロミクロン血症、リポジストロフィー、脂肪萎縮症、メタボリックシンドローム、糖尿病(I型またはII型)、糖尿病前症、クッシング症候群、先端巨大症、全身性エリテマトーデス、異常グロブリン血症、多のう胞性卵巣症候群、アジソン病、糖原病1型、甲状腺機能低下症、***、アドリアマイシン心筋症、リポタンパク質リパーゼ欠損症、リソソーム酸リパーゼ欠損症、黄色腫症、発疹性黄色腫、および網膜脂血症。
さらにまたはあるいは、本明細書に記載されているdsRNAは、心臓および循環の状態(例えば、アテローム動脈硬化症、アンギナ、高血圧、うっ血性心不全、冠動脈疾患、再狭窄、心筋梗塞、卒中、動脈瘤、脳血管疾患、および末梢血管疾患)、肝疾患、腎疾患、ネフローゼ症候群、ならびに慢性腎疾患(例えば、***、ネフローゼ症候群、維持透析、および腎移植)などの本明細書に記載されている任意の障害に関連する1つまたはそれ以上の病的状態を有する対象を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているdsRNAは、任意の遺伝子プロファイル(例えば、家族性高トリグリセライド血症、家族性複合型脂血症、家族性低βリポタンパク血症、もしくは家族性異常βリポタンパク血症)、処置(例えば、チアジド系利尿薬、経口避妊薬および他のエストロゲン、特定のベータ-アドレナリン遮断薬、プロポフォール、HIV薬剤、イソトレチノイン、もしくはプロテアーゼ阻害剤の使用)、または高血中トリグリセリドまたは脂質をもたらすか、もしくはそれに起因するライフスタイル(例えば、喫煙、過度のアルコール摂取、高炭水化物食、もしくは高脂肪食)に関連する1つまたはそれ以上の状態を有する対象を処置するために使用することができる。150mg/dLを超えるトリグリセリドレベル(例えば、血清トリグリセリドレベル)は、心血管系疾患のリスクが高いと考えられる。500mg/dLまたはそれ以上のトリグリセリドレベル(例えば、血清トリグリセリドレベル)は、膵炎のリスクが高いと考えられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているdsRNAは、体重を管理するため、または対象の脂肪量を減少させるために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるdsRNAは、ヒトANGPTL3遺伝子、またはヒトおよびカニクイザルANGPTL3遺伝子の両方の発現を阻害する。治療前のレベルと比較して処置後に、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または約100%、対象におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害することができるか、および/または対象におけるANGPTL3タンパク質レベルを低下させることができる。いくつかの実施形態において、治療前のレベルと比較して処置後に、少なくとも約2分の1、少なくとも約5分の1、少なくとも約10分の1、少なくとも約15分の1、少なくとも約20分の1、少なくとも約25分の1、少なくとも約50分の1、少なくとも約75分の1、または少なくとも約100分の1に、ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するか、および/または対象におけるANGPTL3タンパク質レベルを低下させることができる。いくつかの実施形態において、ANGPTL3遺伝子が、阻害されるか、またはANGPTL3タンパク質レベルが、対象の肝臓において低減される。
いくつかの実施形態において、ANGPTL3遺伝子の発現は、約12もしくはそれ以上、24もしくはそれ以上、または36もしくはそれ以上の時間、dsRNAによって低減される。いくつかの実施形態において、ANGPTL3遺伝子の発現は、長い時間、例えば、少なくとも約2、3、4、5、もしくは6日間またはそれ以上、例えば、約1週間、2週間、3週間、4週間、1か月、2か月、またはそれ以上低減される。
本明細書中で使用される場合、ANGPTL3遺伝子に言及する限りにおいて、「~の発現を阻害する」または「~の発現を阻害すること」という用語は、ANGPTL3遺伝子の発現が阻害されるよう処理された第1の細胞または細胞群における、第1の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第2の細胞または細胞群(対照細胞)と比較した場合のANGPTL3遺伝子から転写されるmRNAの量の減少によってはっきりと示されるANGPTL3遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。そのような阻害は、例えば、ノーザン分析、インサイツハイブリダイゼーション、B-DNA分析、発現プロファイリング、レポーターコンストラクトの転写、および当該技術分野において既知のその他の技術によって評価することができる。本明細書中で使用される場合、「阻害すること」という用語は、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「ダウンレギュレートすること」、「抑制すること」およびその他の類似の用語と同義に使用され、任意のレベルの阻害を含む。阻害の程度は、通常、(((対照細胞中のmRNA)-(処理細胞中のmRNA))/(対照細胞中のmRNA))×100%に換算して表される。
あるいは、阻害の程度は、ANGPTL3遺伝子転写と機能的に結びつけられるパラメーター、例えば、細胞中のANGPTL3遺伝子によってコードされるタンパク質の量(例えば、ウエスタン分析、レポータータンパク質の発現、ELISA、免疫沈降、もしくは当該技術分野において既知のその他の技術によって評価される)、または特定の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞の数の減少に換算して得ることができる。原則として、ANGPTL3遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム操作によって、および任意の適切なアッセイによってのいずれかで標的を発現する任意の細胞において判断することができる。しかしながら、所与のdsRNAがANGPTL3遺伝子の発現をある一定の程度阻害するかどうか判断するために基準が必要とされ、したがって、本開示に包含される場合、下記の実施例において示されるアッセイは、そのような基準の役割を果たすものとする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている任意の方法によってANGPTL3遺伝子発現を阻害する効果は、対象(例えば、対象の血液および/または血清中)のトリグリセリドレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態において、トリグリセリドレベルは、以下のレベルのうちの1つよりも低くまで低減される:500、450、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、または50mg/dL。いくつかの実施形態において、LDLレベルは、以下のレベルのうちの1つよりも低くまで低減される:190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、または70mg/dL。
対象のトリグリセリドレベルは、当該技術分野において既知の任意の数々の方法において求めることができる。いくつかの実施形態において、対象のトリグリセリドレベルは、血液、血清、または血漿などの対象からのサンプルを使用して求められる。
本明細書に記載されているdsRNAまたは医薬組成物は、経口または静脈内、筋肉内、皮下、経肺、経皮、および気道(エアロゾル)投与を含む、非経口経路を含むが、それらに限定されない当該技術分野において既知の任意の手段によって投与することができる。一般に、高トリグリセライド血症の患者を処置する場合、dsRNA分子は、非経口手段により全身投与される。いくつかの実施形態において、dsRNAおよび/または組成物は、皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態において、dsRNAおよび/または組成物は、静脈内投与によって投与される。いくつかの実施形態において、dsRNAおよび/または組成物は、経肺投与によって投与される。
本明細書中で使用される場合、ANGPTL3発現の文脈において、「処置する」「処置」などという用語は、標的遺伝子発現が関係する病理学的過程からの解放または軽減を指す。本開示の文脈において、本明細書において挙げられた任意の状態に関する限りにおいて、「処置する」、「処置」などという用語は、上記状態に関連する1つもしくはそれ以上の症状を軽減することまたは緩和することを指す。例えば、高トリグリセライド血症の文脈において、処置は、血清トリグリセリドレベルの低下を伴う場合もある。本明細書中で使用される場合、疾患、障害もしくは状態を「緩和する」ことは、疾患、障害、もしくは状態の症状の重症度および/または発生頻度を低減することを意味する。さらに、本明細書における「処置」に対する言及は、治療的、対症的および予防的処置に対する言及を含む。
本明細書中で使用される場合、状態に関する「予防する」または「~の進行を遅らせる」という用語(およびその文法的変形)は、例えば、状態を有するか、またはそれを発症するリスクがあることが疑われる個体における状態の予防的処置に関する。予防としては、以下に限定されるものではないが、状態の発症もしくは進行を予防することもしくは遅らせること、および/または疾患の1つもしくはそれ以上の症状を所望のレベルもしくは病理学的なレベル未満に維持することを挙げることができる。例えば、高トリグリセライド血症の文脈において、予防は、高トリグリセライド血症であるか、もしくはそれを発症するリスクがある疑いがある個体において血清トリグリセリドレベルを所望のレベルに維持することを含む場合もある。
当然のことながら、本開示のdsRNAは、本明細書に記載されている処置に使用するためのものである場合もあり、本明細書に記載されている処置の方法に使用される場合もあり、および/または本明細書に記載されている処置のための薬剤の製造に使用するためのものである場合もある。
いくつかの実施形態において、本開示のdsRNAは、その他のsiRNA治療用薬剤、モノクローナル抗体、および小分子などの1つまたはそれ以上の追加の治療用薬剤と組み合わせて投与されて、患者の状態にdsRNAの単独投与よりも大きな改善をもたらす。特定の実施形態において、追加の治療用薬剤は、抗炎症効果をもたらす。特定の実施形態において、追加の治療用薬剤は、脂質低下薬などの高トリグリセライド血症を処置する薬剤である。
いくつかの実施形態において、追加の薬剤は、HMG-CoA還元酵素阻害剤(例えば、スタチン)、フィブラート、胆汁酸捕捉剤(bile acid sequestrant)、ニコチン酸、抗血小板薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンII受容体拮抗薬(例えば、ロサルタンカリウム)、アシルCoAコレステロールアセチルトランスフェラーゼ(ACAT)阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル転送タンパク質(CETP)阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質(MTTP)阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体(PPAR)作動薬、オメガ-3脂肪酸(例えば、魚油もしくはアマニ油)、およびインスリンもしくはインスリンアナログのうちの1つまたはそれ以上が可能である。特定の例としては、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、エゼチミブ、ベザフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム、およびナイアシンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書に記載されているdsRNAは、脂質低下、体重減少、食事の変更、および/または適度の運動などの別の治療的介入と組み合わせて投与することができる。
遺伝的素因が標的遺伝子関連疾患、例えば、高トリグリセライド血症の発症に影響を及ぼす。したがって、1つまたはそれ以上の本開示のdsRNAによる処置を必要とする対象は、家族歴を得ること、または、例えば、1つもしくはそれ以上の遺伝子マーカーもしくはバリアントに関してスクリーニングすることによって特定することができる。高トリグリセライド血症に関与する遺伝子の例としては、LPL、APOB、APOC2、APOA5、APOE、LMF1、GCKR、GPIHBP1、およびGPD1を挙げることができるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、1つまたはそれ以上の本開示のdsRNAによる処置を必要とする対象は、任意のこれらの遺伝子または任意のその組み合わせにおけるバリアントまたは機能喪失型変異に関してスクリーニングすることによって特定することができる。
医師、看護師、または家族などの健康管理の提供者は、本開示のdsRNAを処方または投与前に家族歴を得ることできる。さらに、遺伝子型または表現型を決定するために試験を実施することができる。例えば、dsRNAが対象に投与される前にANGPTL3遺伝子型および/または表現型を特定するために、対象からのサンプル、例えば、血液サンプルに対してDNA試験を実施することができる。
V. キットおよび製造品
本開示の特定の態様は、ANGPTL3関連状態(例えば、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害)の処置および/もしくは予防に有用な1つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているdsRNA、ベクター、もしくは組成物(例えば、医薬組成物)を含む製造品またはキットに関する。製造品またはキットは、容器と、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書とをさらに含む場合もある。適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成することができる。容器は、単独で、もしくは疾患を処置もしくは予防するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌した入り口を有することもできる(例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能な栓を有する静注液バッグもしくはバイアルが可能である)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本明細書に記載されるdsRNAである。ラベルまたは添付文書は、組成物がANGPTL3関連状態を処置するために使用されることを示す。いくつかの実施形態において、状態は、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害および/または本明細書に記載されている別の状態である。さらに、製造品またはキットは、(a)中に入れられた本明細書に記載されているdsRNAを含む組成物を有する第1の容器;および(b)中に入れられた第2の治療用薬剤を含む組成物を有する第2の容器(例えば、本明細書に記載されている追加の薬剤)を含む。本開示のこの態様における製造品またはキットは、組成物が特定の疾患を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第2の(または第3の)容器をさらに含むことができる。それは、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジを含む、商業的および/または使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
本開示の特定の態様は、ANGPTL3関連状態(例えば、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害)の処置および/もしくは予防に有用な1つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているdsRNA、ベクター、もしくは組成物(例えば、医薬組成物)を含む製造品またはキットに関する。製造品またはキットは、容器と、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書とをさらに含む場合もある。適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成することができる。容器は、単独で、もしくは疾患を処置もしくは予防するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌した入り口を有することもできる(例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能な栓を有する静注液バッグもしくはバイアルが可能である)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本明細書に記載されるdsRNAである。ラベルまたは添付文書は、組成物がANGPTL3関連状態を処置するために使用されることを示す。いくつかの実施形態において、状態は、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害および/または本明細書に記載されている別の状態である。さらに、製造品またはキットは、(a)中に入れられた本明細書に記載されているdsRNAを含む組成物を有する第1の容器;および(b)中に入れられた第2の治療用薬剤を含む組成物を有する第2の容器(例えば、本明細書に記載されている追加の薬剤)を含む。本開示のこの態様における製造品またはキットは、組成物が特定の疾患を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第2の(または第3の)容器をさらに含むことができる。それは、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジを含む、商業的および/または使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
本明細書において別に定義されていない限り、本開示に関連して使用される科学および技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有するものとする。例となる方法および材料を以下に示すが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料も本開示の実務または試験に使用することができる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されることになる。
一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、心臓病学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医薬および製薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当該技術分野において周知のものであり、一般的に使用される。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に遂行されるとおり、または本明細書に記載されるとおり、製造業者の仕様書に従って実施される。
さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むものとし、複数の用語は、単数を含むものとする。本明細書および実施形態全体をとおして、「有する(have)」および「含む(comprise)」という単語または「有する(has)」、「有すること(having)」、「含む(comprises)」もしくは「含むこと(comprising)」などの変形は、指定される整数または整数の群を含むが、その他のいかなる他の整数または整数の群も排除しないことを意味することが理解されるであろう。
本明細書において言及されるすべての刊行物およびその他の参考文献の全体を参照によって組み入れる。多くの文献が本明細書中で引用されるが、この引例は、これらのいかなる文献も当該技術分野において通常の一般知識の一部を構成することを認めるものではない。
本開示がさらによく理解されるために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明のためのものに過ぎず、いかなる方法によっても本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
siRNA合成および精製
非標的化対照siRNA(NT対照)を含む、siRNAを、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して作製した。
非標的化対照siRNA(NT対照)を含む、siRNAを、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して作製した。
方法
siRNA生成
RNAオリゴヌクレオチドを、2’-OMeもしくは2’-F修飾を有する市販のウリジンの5’-O-DMT-3’-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホラミダイトモノマー(SAFC)、4-N-アセチルシチジン(CAc)、6-N-ベンゾイルアデノシン(ABz)および2-N-イソブチリルグアノシン(GiBu)、ならびに固相担体5’-O-DMT-チミジン-CPGおよび3’-O-DMT-チミジン-CPG(invdT、Link)を使用して、固相合成および脱保護に関する標準的なプロトコルに従って、1μmol(インビトロ)もしくは10μmol(インビボ)のスケールでABI 394 DNA/RNAまたはBioAutomation MerMade 12合成機において合成した(Beaucage、Curr Opin Drug Discov Devel.(2008年)11:203~16頁;Muellerら、Curr Org Synth(2004年)1:293~307頁)。
siRNA生成
RNAオリゴヌクレオチドを、2’-OMeもしくは2’-F修飾を有する市販のウリジンの5’-O-DMT-3’-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホラミダイトモノマー(SAFC)、4-N-アセチルシチジン(CAc)、6-N-ベンゾイルアデノシン(ABz)および2-N-イソブチリルグアノシン(GiBu)、ならびに固相担体5’-O-DMT-チミジン-CPGおよび3’-O-DMT-チミジン-CPG(invdT、Link)を使用して、固相合成および脱保護に関する標準的なプロトコルに従って、1μmol(インビトロ)もしくは10μmol(インビボ)のスケールでABI 394 DNA/RNAまたはBioAutomation MerMade 12合成機において合成した(Beaucage、Curr Opin Drug Discov Devel.(2008年)11:203~16頁;Muellerら、Curr Org Synth(2004年)1:293~307頁)。
ホスホラミダイト基本単位を、アセトニトリル中の0.1M溶液として使用し、5-(ビス-3,5-トリフルオロメチルフェニル)-1H-テトラゾール(アクチベーター42、アセトニトリル中0.25M、Sigma Aldrich)により活性化した。ホスホラミダイトカップリングのために300秒の反応時間を使用した。キャッピング試薬として、THF中の無水酢酸(CapA for ABI、Sigma Aldrich)およびTHF中のN-メチルイミダゾール(CapB for ABI、Sigma Aldrich)を使用した。酸化試薬として、THF/ピリジン/水中のヨウ素(0.02M;ABI用オキシダイザー、Sigma Aldrich)を使用した。DMT-保護基の脱保護を、DCM中のジクロロ酢酸(DCA脱保護、Sigma Aldrich)を使用して行った。固相担体からの最終的な切断および脱保護(アシル-およびシアノエチル-保護基)を、NH3(32%水溶液/エタノール、v/v 3:1)により達成した。
粗製オリゴヌクレオチドを、IEXおよびLC-MSによって分析し、30分の10~65%バッファーBの直線グラジエントを使用したアニオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX)によって精製した。AKTA精製装置(Thermo Fisher Scientific DNAPac PA200セミ分取イオン交換カラム、8μm粒子、幅22mm×長さ250mm)。
バッファーA:1.50l H2O、2.107g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、540.54g 尿素、pH7.4。
バッファーB:1.50l H2O、105.34g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、540.54g 尿素、pH7.4。
バッファーA:1.50l H2O、2.107g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、540.54g 尿素、pH7.4。
バッファーB:1.50l H2O、105.34g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、540.54g 尿素、pH7.4。
オリゴヌクレオチドの単離は、4倍容量のエタノールの添加により引き起こされる沈殿および-20℃における保管によって達成した。
データの高い正確さを確保するために、すべての一本鎖をHPLC精製して、>85%の純度にした。オリゴヌクレオチドの純度および正体を、それぞれ、イオン交換クロマトグラフィーおよびLC-MSによって確認した。
二本鎖アニーリング
インビトロ実験(100μM溶液)およびインビボ実験(10mg/ml)のために、PBS中のsiRNAの保存液を、等モル量の相補的なセンスおよびアンチセンス鎖を1×PBSバッファー中で混合することによって調製した。その溶液を90℃に10分間加熱し、室温にゆっくりと冷まして、アニーリングプロセスを完了させた。siRNAを、HPLCによってさらに特徴づけ、使用まで凍結保存した。
インビトロ実験(100μM溶液)およびインビボ実験(10mg/ml)のために、PBS中のsiRNAの保存液を、等モル量の相補的なセンスおよびアンチセンス鎖を1×PBSバッファー中で混合することによって調製した。その溶液を90℃に10分間加熱し、室温にゆっくりと冷まして、アニーリングプロセスを完了させた。siRNAを、HPLCによってさらに特徴づけ、使用まで凍結保存した。
siRNA配列
各siRNAの配列、およびヌクレオチド修飾を含む配列を上記表1および2に示す。
各siRNAの配列、およびヌクレオチド修飾を含む配列を上記表1および2に示す。
マウス血清中におけるsiRNAの安定性
表2に列挙されている修飾siRNAを、50%マウス血清中でヌクレアーゼ安定性に関して試験した。1×DPBS(Life Technologies、カタログ番号14190-094)中の2.5μMのsiRNA 160μLおよびマウス血清160μL(Sigma、カタログ番号M5905)を、37℃で最大72hインキュベートした。各時点(0h、8h、24h、32h、48h、56h、および72h)において、反応の21μLを採取し、停止液23μL(Tissue & Cell Lysis Solution(Epicentre、カタログ番号MTC096H)、20mg/mLのプロテイナーゼK183μL(Sigma、カタログ番号P2308)、水1694μL)で65℃において30分間クエンチした。Waters 2695 Separation Moduleおよび2487 Dual Absorbance DetectorにおけるHPLC分析に先立って、RNアーゼフリー水33μLを各サンプルに添加した。その溶液50μLを、DNAPac PA200分析カラム(Thermo Scientific、カタログ番号063000)および以下のグラジエントを使用したHPLCによって分析した:
表2に列挙されている修飾siRNAを、50%マウス血清中でヌクレアーゼ安定性に関して試験した。1×DPBS(Life Technologies、カタログ番号14190-094)中の2.5μMのsiRNA 160μLおよびマウス血清160μL(Sigma、カタログ番号M5905)を、37℃で最大72hインキュベートした。各時点(0h、8h、24h、32h、48h、56h、および72h)において、反応の21μLを採取し、停止液23μL(Tissue & Cell Lysis Solution(Epicentre、カタログ番号MTC096H)、20mg/mLのプロテイナーゼK183μL(Sigma、カタログ番号P2308)、水1694μL)で65℃において30分間クエンチした。Waters 2695 Separation Moduleおよび2487 Dual Absorbance DetectorにおけるHPLC分析に先立って、RNアーゼフリー水33μLを各サンプルに添加した。その溶液50μLを、DNAPac PA200分析カラム(Thermo Scientific、カタログ番号063000)および以下のグラジエントを使用したHPLCによって分析した:
siRNAの両鎖に関する血清半減期を推定した。
ヒトANGPTL3発現の阻害のためのsiRNAの特定
方法
細胞および組織培養
ヒトHep3B細胞を、37℃、5% CO2および95%相対湿度(RH)で増殖させ、10% FBSを加えたEMEM培地(ATCC、カタログ番号30-2003)中で培養した。
方法
細胞および組織培養
ヒトHep3B細胞を、37℃、5% CO2および95%相対湿度(RH)で増殖させ、10% FBSを加えたEMEM培地(ATCC、カタログ番号30-2003)中で培養した。
siRNAトランスフェクション
Hep3B細胞におけるノックダウン実験のために、96ウェルプレート(Greiner、カタログ番号655180)に20,000細胞/ウェルを使用した。その細胞に、リバーストランスフェクション設定において製造業者のプロトコルに従って、Lipofectamine RNAiMAXトランスフェクション試薬(ThermoFisher)を0.2μL/ウェル使用して0.1nMおよび1nMのANGPTL3 siRNAをトランスフェクションし、培地を変えずに48hインキュベートした。通常、試験サンプル毎にN=4の技術的反復を行った。
Hep3B細胞におけるノックダウン実験のために、96ウェルプレート(Greiner、カタログ番号655180)に20,000細胞/ウェルを使用した。その細胞に、リバーストランスフェクション設定において製造業者のプロトコルに従って、Lipofectamine RNAiMAXトランスフェクション試薬(ThermoFisher)を0.2μL/ウェル使用して0.1nMおよび1nMのANGPTL3 siRNAをトランスフェクションし、培地を変えずに48hインキュベートした。通常、試験サンプル毎にN=4の技術的反復を行った。
mRNA発現分析
siRNAトランスフェクションまたは自然なsiRNA取り込みの48または72時間後、細胞のRNAを、手順中のDNアーゼステップを含む、製造業者のプロトコルに従ってPromegaのSV96 total RNA isolation system(カタログ番号Z3500)の使用によって回収した。
siRNAトランスフェクションまたは自然なsiRNA取り込みの48または72時間後、細胞のRNAを、手順中のDNアーゼステップを含む、製造業者のプロトコルに従ってPromegaのSV96 total RNA isolation system(カタログ番号Z3500)の使用によって回収した。
cDNA合成のために、ThermoFisher Reverse Transcriptaseキット(カタログ番号N8080234)を使用した。12μLの総体積で10×RTバッファー1.2μL、MgCl2(25mM)2.64μL、dNTP(10mM)2.4μL、ランダムヘキサマー(50μM)0.6μL、Oligo(dT)16(配列番号1185)(50μM)0.6μL、RNアーゼ阻害剤(20U/μL)0.24μLおよびMultiscribe(50U/μL)0.3μLを使用して、cDNAをRNA30ngから合成した。サンプルを、25℃で10分間および42℃で60分間インキュベートした。95℃に5分間加熱することによって反応を停止させた。
ヒトおよびカニクイザルANGPTL3 mRNAレベルを、ThermoFisher TaqMan Universal PCR Master Mix(カタログ番号4305719)および以下のTaqMan Gene Expressionアッセイを使用したqPCRによって定量した:
PCRは、ABI Prism 7900システムにより以下のPCR条件下で2回の技術的反復で実施した:50℃で2分間、95℃で10分間、95℃で15秒間および60℃で1分間を40サイクル。一反応において標的遺伝子および並行反応において正規化のためのハウスキーピング遺伝子(ヒト/カニクイザルRPL37A)を検出するシンプレックスPCRとしてPCRを設定した。PCR反応の最終体積は、1×PCRマスターミックス中の12.5μLであり;RPL37Aプライマーを50nMの最終濃度で使用し、プローブを200nMの最終濃度で使用した。標的転写物の相対発現量を計算するためにΔΔCt法を利用した。標的遺伝子発現のパーセンテージを、非標的化siRNA対照処理細胞のレベルに基づく正規化によって計算した。
IC50測定
IC50測定のために、96ウェルプレートの20,000のヒトHep3B細胞に、5~8倍希釈段階を使用して25nMから開始する7つの濃度の示したANGPTL3 siRNAを、Lipofectamine RNAiMAXを用いて48時間トランスフェクションした。各siRNAに関する半数阻害濃度(IC50)を、Biostat-Speed統計計算ツールを利用することによって計算した。RatkovskyおよびReedy(Biometrics 42(3):575~582頁(1986年))による4パラメーターロジスティックモデルを使用して結果を得た。SAS v9.1.3ソフトウェアにおいてLevenberg-Marquardtアルゴリズムを使用した非線形回帰によって補正を得た。
IC50測定のために、96ウェルプレートの20,000のヒトHep3B細胞に、5~8倍希釈段階を使用して25nMから開始する7つの濃度の示したANGPTL3 siRNAを、Lipofectamine RNAiMAXを用いて48時間トランスフェクションした。各siRNAに関する半数阻害濃度(IC50)を、Biostat-Speed統計計算ツールを利用することによって計算した。RatkovskyおよびReedy(Biometrics 42(3):575~582頁(1986年))による4パラメーターロジスティックモデルを使用して結果を得た。SAS v9.1.3ソフトウェアにおいてLevenberg-Marquardtアルゴリズムを使用した非線形回帰によって補正を得た。
細胞傷害性
96ウェルプレートの各ウェル当たり10,000のHep3B細胞の培養物の5nMおよび50nMのsiRNAトランスフェクションの72時間後に、各サンプル中の細胞生存率/毒性の比を求めることによって細胞傷害性を測定した。細胞生存率を、製造業者のプロトコルに従ってCellTiter-Gloアッセイ(Promega、カタログ番号G7570)を使用した細胞内ATP含有量の決定によって測定した。細胞毒性を、製造業者のプロトコルに従ってToxiLightアッセイ(Lonza、カタログ番号LT07-217)を使用して上清において測定した。10nMのAllStars Hs Cell Death siRNA(Qiagen、カタログ番号SI04381048)、25μMのケトコナゾール(Calbiochem、カタログ番号420600)および1%のTriton X-100(Sigma、カタログ番号T9284)を毒性の陽性対照として使用した。
96ウェルプレートの各ウェル当たり10,000のHep3B細胞の培養物の5nMおよび50nMのsiRNAトランスフェクションの72時間後に、各サンプル中の細胞生存率/毒性の比を求めることによって細胞傷害性を測定した。細胞生存率を、製造業者のプロトコルに従ってCellTiter-Gloアッセイ(Promega、カタログ番号G7570)を使用した細胞内ATP含有量の決定によって測定した。細胞毒性を、製造業者のプロトコルに従ってToxiLightアッセイ(Lonza、カタログ番号LT07-217)を使用して上清において測定した。10nMのAllStars Hs Cell Death siRNA(Qiagen、カタログ番号SI04381048)、25μMのケトコナゾール(Calbiochem、カタログ番号420600)および1%のTriton X-100(Sigma、カタログ番号T9284)を毒性の陽性対照として使用した。
結果
ヒトANGPTL3を標的とする際に有用なsiRNAを特定するために、コンピュータでのライブラリー生成のために以下の基準を適用した:まず、18ヌクレオチドの重なる部分を有する、NM_014495.3に示されているヒトANGPTL3 mRNA配列からの19塩基長をコンピュータで特定した。2933配列のこの一覧から、55%よりも大きいG/C含量またはカニクイザル(Macaca fascicularis)(カニクイザル)のANGPTL3 mRNA配列と1つもしくはそれ以上のミスマッチを有する場合に分子をさらに除去した。
ヒトANGPTL3を標的とする際に有用なsiRNAを特定するために、コンピュータでのライブラリー生成のために以下の基準を適用した:まず、18ヌクレオチドの重なる部分を有する、NM_014495.3に示されているヒトANGPTL3 mRNA配列からの19塩基長をコンピュータで特定した。2933配列のこの一覧から、55%よりも大きいG/C含量またはカニクイザル(Macaca fascicularis)(カニクイザル)のANGPTL3 mRNA配列と1つもしくはそれ以上のミスマッチを有する場合に分子をさらに除去した。
残りの配列に関して、その後、ヒトトランスクリプトーム(RefSeq RNAバージョン2015-11-24)中のいずれかのsiRNA鎖(センス/アンチセンス)と対応する可能性のあるあらゆるオフターゲット転写物を特定するためにコンピュータによる分析を行った。肝臓組織においてFPKM<0.5のRNAseq発現(Illumina Body Atlas)を有するヒトオフターゲット配列は考慮しなかった。目的とするすべてのsiRNA配列は、ANGPTL3以外の肝臓で発現される任意のヒト転写物に対して3個を超えるミスマッチを有したか、または4個もしくはそれ以下のヒト遺伝子について2個のミスマッチを有したかのいずれかであり;これらの2つの基準の1つも満たさなかった配列は除去した。この除去後、162個の可能性のあるsiRNAが残った(表1を参照、コンストラクト001~162)。
上記のとおり、162個のsiRNAを、固定パターンを有するヌクレオチドを用いて作製した(表2を参照、コンストラクト001~162)。これらの162個のsiRNAのANGPTL3の発現を低下させる能力を試験するために、ヒトHep3B細胞に0.1nMまたは1.0nMの各siRNAをトランスフェクションし、48時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプル中のANGPTL3のmRNA発現を測定し、非標的化siRNAで処理した陰性対照と比較した(図1A~1C)。1.0nMの濃度で少なくとも80%、または0.1nMの濃度で少なくとも70%のmRNA発現の低下を示した15個のsiRNA、および離れた配列領域と結合する3個のsiRNAを、さらなる特徴づけのために選択した。
ヒトHep3B細胞において選択された18個のsiRNAに関してIC50測定(表4)および細胞傷害性アッセイ(図2)を行った。(50nMにおいて)<40%のNT対照生存率/毒性比を示した3個のsiRNA(siRNA#029、#036、および#145)の除去後、GalNAcとのコンジュゲーションに関するIC50値に基づいて11個のsiRNAを選択した(表4)。
まとめると、これらの結果は、ヒト細胞において顕著な細胞傷害性がなく、ヒトANGPTL3発現の強い阻害が可能なsiRNAの特定を示す。
ヒトおよびカニクイザルANGPTL3発現の阻害に関して活性なGalNAcコンジュゲートsiRNAの特定
方法
非標的化対照siRNA(NT対照)を含む、GalNAc-siRNAを、示された配列に基づいて生成した(上の配列表を参照)。
方法
非標的化対照siRNA(NT対照)を含む、GalNAc-siRNAを、示された配列に基づいて生成した(上の配列表を参照)。
細胞培養およびアッセイ
ヒト(BioreclamationIVT、カタログ番号M00995-P)およびカニクイザル(Primacyt、カタログ番号CHCP-I-T)初代肝細胞を以下のとおり培養した:播種および解凍キット(Primacyt、カタログ番号PTK-1)を使用して、凍結保存細胞を解凍し、播種し、37℃、5% CO2および95% RHでインキュベートした。播種の6時間後、培地を1% FBSを加えた維持培地(KaLy-Cell、カタログ番号KLC-MM)に変えた。
ヒト(BioreclamationIVT、カタログ番号M00995-P)およびカニクイザル(Primacyt、カタログ番号CHCP-I-T)初代肝細胞を以下のとおり培養した:播種および解凍キット(Primacyt、カタログ番号PTK-1)を使用して、凍結保存細胞を解凍し、播種し、37℃、5% CO2および95% RHでインキュベートした。播種の6時間後、培地を1% FBSを加えた維持培地(KaLy-Cell、カタログ番号KLC-MM)に変えた。
mRNA発現分析を、実施例2において上で記載したとおりに実施した。
IC50測定
自然な取り込み条件下におけるヒトおよびカニクイザル初代肝細胞の用量・活性関係およびIC50測定を示すために、96ウェルプレートの50,000~70,000細胞を、培地を変えずに、10倍希釈段階を使用して10μM~0.01nMの範囲の濃度のsiRNAとともに72時間インキュベートした。各siRNAに関する半数阻害濃度(IC50)を、Biostat-Speed統計計算ツールを利用することによって計算した。RatkovskyおよびReedy(Biometrics(1986年)42(3):575~82頁)による4パラメーターロジスティックモデルを使用して結果を得た。SAS v9.1.3ソフトウェアにおいてLevenberg-Marquardtアルゴリズムを使用した非線形回帰によって補正を得た。
自然な取り込み条件下におけるヒトおよびカニクイザル初代肝細胞の用量・活性関係およびIC50測定を示すために、96ウェルプレートの50,000~70,000細胞を、培地を変えずに、10倍希釈段階を使用して10μM~0.01nMの範囲の濃度のsiRNAとともに72時間インキュベートした。各siRNAに関する半数阻害濃度(IC50)を、Biostat-Speed統計計算ツールを利用することによって計算した。RatkovskyおよびReedy(Biometrics(1986年)42(3):575~82頁)による4パラメーターロジスティックモデルを使用して結果を得た。SAS v9.1.3ソフトウェアにおいてLevenberg-Marquardtアルゴリズムを使用した非線形回帰によって補正を得た。
結果
上記のとおり強力なsiRNAの選択後、本発明者らは、選択した分子がインビボにおける肝臓特異的なsiRNA送達に適したGalNAcコンジュゲートの文脈において活性を保持するかどうかを実証することに着手した。本発明者らは、この活性がカニクイザル(M.fascicularis)(カニクイザル)の細胞において持続するかどうかも評価した。
上記のとおり強力なsiRNAの選択後、本発明者らは、選択した分子がインビボにおける肝臓特異的なsiRNA送達に適したGalNAcコンジュゲートの文脈において活性を保持するかどうかを実証することに着手した。本発明者らは、この活性がカニクイザル(M.fascicularis)(カニクイザル)の細胞において持続するかどうかも評価した。
IC50測定の結果は、ヒト初代肝細胞に自然な取り込みによって送達された場合に、2つを除く試験したすべてのsiRNAコンジュゲートが活性を保持することを示し(表5)、IC50値は1.95から9.2nMに及ぶ。しかしながら、驚くべきことに、GalNAc-siRNAの自然な取り込み後の性能の順位付けは、測定可能なノックダウン活性をもたらす2つの分子の完全な破壊を含む、コンジュゲートされていないsiRNAのトランスフェクションにより補助された取り込み後に得られるものと著しく異なる(表4)。これは、siRNAがその配列に基づく固有の特性を有し、それが、結果として得られるノックダウン能力に関してGalNAcコンジュゲートの文脈においてこれらsiRNAを適用に対して異なるかたちで適合させるようである。
さらに一層驚くべきことに、一部の試験siRNAは、カニクイザル配列XM_005543185.1に対する予測される配列相同性にもかかわらず、カニクイザル肝細胞において活性がないことを示している(表6)。この予想外の観察結果は、活性検出のための機能アッセイの必要性およびsiRNAの有効性が生物情報学的情報に基づいて簡単に予測できないことを強調する。
ヒトANGPTL3発現の阻害に関するGalNAcコンジュゲートsiRNAのインビトロおよびインビボにおける特徴づけ
方法
細胞および組織培養
ヒトHep3B細胞を、37℃、5% CO2および95% RHで増殖させ、10% FBSを加えたEMEM培地(ATCC、カタログ番号30-2003)中で培養した。
方法
細胞および組織培養
ヒトHep3B細胞を、37℃、5% CO2および95% RHで増殖させ、10% FBSを加えたEMEM培地(ATCC、カタログ番号30-2003)中で培養した。
ヒト(BioreclamationIVT、カタログ番号M00995-P)およびカニクイザル(Primacyt、カタログ番号CHCP-I-T)初代肝細胞を以下のとおり培養した:播種および解凍キット(Primacyt、カタログ番号PTK-1)を使用して、凍結保存細胞を解凍し、播種し、37℃、5% CO2および95% RHでインキュベートした。播種の6時間後、培地を1% FBSを加えた維持培地(KaLy-Cell、カタログ番号KLC-MM)に変えた。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、製造業者の説明書に従ってヘパリンナトリウムでコーティングされたバキュテナーチューブ(BD、Heidelberg Germany)中に採取した健康な3人のドナーからの血液およそ16mLから単離した。
ヒトPBMCのトランスフェクションのために、100nMのsiRNAを、1×105のPBMCに、96ウェルプレートの1ウェル当たりLipofectamine 2000(N=2)を0.3μL用いて150μLの無血清RPMI培地(ThermoFisher、カタログ番号11875)の総体積として24時間リバーストランスフェクションした。一本鎖RNA(「R-0006」)およびDNA(「CpG ODN」)オリゴヌクレオチド、ならびに二本鎖無修飾および2’-O-メチル修飾siRNA(「132/161」)を対照として利用した。
ANGPTL3 ELISAアッセイ
選択されたsiRNA濃度に関するIC50実験の上清中のANGPTL3タンパク質濃度を、R&D SystemsのヒトANGPTL3 Quantikine ELISAキット(カタログ番号DANL30)を利用することによって定量した。製造業者のプロトコルに従ってヒトHep3B細胞、ヒト初代肝細胞、またはカニクイザル初代肝細胞の予め1:2~1:8希釈した上清50μlを使用してELISAアッセイを実施した。ANGPTL3タンパク質発現のパーセンテージを、非標的化siRNA対照配列で処理された細胞の平均ANGPTL3レベルに基づく正規化によって計算した。
選択されたsiRNA濃度に関するIC50実験の上清中のANGPTL3タンパク質濃度を、R&D SystemsのヒトANGPTL3 Quantikine ELISAキット(カタログ番号DANL30)を利用することによって定量した。製造業者のプロトコルに従ってヒトHep3B細胞、ヒト初代肝細胞、またはカニクイザル初代肝細胞の予め1:2~1:8希釈した上清50μlを使用してELISAアッセイを実施した。ANGPTL3タンパク質発現のパーセンテージを、非標的化siRNA対照配列で処理された細胞の平均ANGPTL3レベルに基づく正規化によって計算した。
IFNα測定
ヒトPBMCの上清中のIFNαタンパク質濃度を以下のとおり定量した:細胞培養上清25μLを、MesoScale Discoveryの技術に基づくそれ自体が確立された電気化学発光アッセイを利用し、pan IFNαモノクローナル捕捉抗体(MT1/3/5、Mabtech)を使用したIFNα濃度の測定のために使用した。あるいは、ヒトIFNα2aアイソフォーム特異的アッセイ(カタログ番号K151VHK)を、MesoScaleのU-PLEXプラットフォームに基づいて、供給業者のプロトコルに従って利用した。
ヒトPBMCの上清中のIFNαタンパク質濃度を以下のとおり定量した:細胞培養上清25μLを、MesoScale Discoveryの技術に基づくそれ自体が確立された電気化学発光アッセイを利用し、pan IFNαモノクローナル捕捉抗体(MT1/3/5、Mabtech)を使用したIFNα濃度の測定のために使用した。あるいは、ヒトIFNα2aアイソフォーム特異的アッセイ(カタログ番号K151VHK)を、MesoScaleのU-PLEXプラットフォームに基づいて、供給業者のプロトコルに従って利用した。
細胞傷害性
ヒト初代肝細胞におけるsiRNAの細胞傷害性を、自然な取り込み条件下における1μM、5μMおよび25μMのsiRNAとの96ウェルプレートの1ウェル当たり45,000~50,000細胞のインキュベーションの72時間後に、各サンプル中の細胞生存率/毒性の比を求めることによって測定した。細胞生存率を、CellTiter-Gloアッセイ(Promega、カタログ番号G7570)を使用して細胞内ATP含有量を求めることによって測定し、上清中の細胞毒性を、製造業者のプロトコルに従ってLDHアッセイ(Sigma、カタログ番号11644793001)を使用して測定した。25μMのケトコナゾールおよび1%のTriton X-100を、陽性対照として使用した。
ヒト初代肝細胞におけるsiRNAの細胞傷害性を、自然な取り込み条件下における1μM、5μMおよび25μMのsiRNAとの96ウェルプレートの1ウェル当たり45,000~50,000細胞のインキュベーションの72時間後に、各サンプル中の細胞生存率/毒性の比を求めることによって測定した。細胞生存率を、CellTiter-Gloアッセイ(Promega、カタログ番号G7570)を使用して細胞内ATP含有量を求めることによって測定し、上清中の細胞毒性を、製造業者のプロトコルに従ってLDHアッセイ(Sigma、カタログ番号11644793001)を使用して測定した。25μMのケトコナゾールおよび1%のTriton X-100を、陽性対照として使用した。
ヌクレアーゼ安定性
GalNAcコンジュゲートsiRNAを、実施例1に記載されている方法を使用してヌクレアーゼ安定性に関して試験した。
GalNAcコンジュゲートsiRNAを、実施例1に記載されている方法を使用してヌクレアーゼ安定性に関して試験した。
インビボアッセイ
インビボにおけるヒトANGPTL3を標的とするGalNAc-siRNAの効果を評価するために、マウスにおいてアデノ随伴ウイルスベクターに基づく導入遺伝子発現系を利用した。この目的を達成するために、ApoA2プロモーター(Vectalys、Toulouse、France)からヒトANGPTL3をコードするmRNAの肝臓特異的な発現を伴うAAV8ベクターを、siRNA投薬前に雌のC57BL/6マウス(Charles River、Germany)に静脈内投与した。AAVベクターから発現されたヒトANGPTL3の血清レベルが十分に高い血清レベルに達した後、(非標的化対照を含む)GalNAcコンジュゲートsiRNAを12mg/kg(n=8)で皮下投与した。siRNAの活性を、ELISAを使用してヒトANGPTL3タンパク質血清を測定することによって定量した。
インビボにおけるヒトANGPTL3を標的とするGalNAc-siRNAの効果を評価するために、マウスにおいてアデノ随伴ウイルスベクターに基づく導入遺伝子発現系を利用した。この目的を達成するために、ApoA2プロモーター(Vectalys、Toulouse、France)からヒトANGPTL3をコードするmRNAの肝臓特異的な発現を伴うAAV8ベクターを、siRNA投薬前に雌のC57BL/6マウス(Charles River、Germany)に静脈内投与した。AAVベクターから発現されたヒトANGPTL3の血清レベルが十分に高い血清レベルに達した後、(非標的化対照を含む)GalNAcコンジュゲートsiRNAを12mg/kg(n=8)で皮下投与した。siRNAの活性を、ELISAを使用してヒトANGPTL3タンパク質血清を測定することによって定量した。
ANGPTL3 ELISAアッセイ
siRNAで処置したマウスにおける血清ANGPTL3タンパク質レベルを、R&D SystemsのヒトANGPTL3 Quantikine ELISAキット(カタログ番号DANL30)を利用することによって定量した。ANGPTL3血清レベルを、非標的化対照siRNAで処置した群と比較して計算した。
siRNAで処置したマウスにおける血清ANGPTL3タンパク質レベルを、R&D SystemsのヒトANGPTL3 Quantikine ELISAキット(カタログ番号DANL30)を利用することによって定量した。ANGPTL3血清レベルを、非標的化対照siRNAで処置した群と比較して計算した。
結果
(上記のとおり選択された)ANGPTL3を標的とする11個のGalNAc-siRNAに対する免疫応答を、siRNAのトランスフェクションに応じて、健康な3人の異なるドナーから単離したヒト初代PMBCから分泌されるインターフェロンαの産生を調べることによってインビトロでヒト初代細胞において測定した(図3)。いかなる試験siRNAに関してもヒトPBMCにおける免疫刺激のサインは確認されなかった。
(上記のとおり選択された)ANGPTL3を標的とする11個のGalNAc-siRNAに対する免疫応答を、siRNAのトランスフェクションに応じて、健康な3人の異なるドナーから単離したヒト初代PMBCから分泌されるインターフェロンαの産生を調べることによってインビトロでヒト初代細胞において測定した(図3)。いかなる試験siRNAに関してもヒトPBMCにおける免疫刺激のサインは確認されなかった。
ANGPTL3 GalNAc-siRNAを、50%マウス血清中におけるインビトロでのヌクレアーゼ安定性に関しても、相対的安定性および半減期を求めることによって試験した(表7)。半減期は、<32hから72hの間の範囲であった。
さらなる選択物からあらゆる毒性の可能性を有するGalNAc-siRNAを除外するためにヒト初代肝細胞において細胞傷害性アッセイを行った(図4)。いかなる分子に関しても明らかな毒性効果は確認されなかった。
用量依存的なANGPTL3タンパク質ノックダウンを、3つの異なる濃度(10、100、および1000nM)のGalNAc-siRNAで処理されたヒト初代肝細胞の上清中のANGPTL3レベルの定量によって確認した(図5)。標的タンパク質の減少は、qPCRによって定量したmRNAノックダウンと良好な相関性を示した(図6)。これには、タンパク質レベルに変換される、qPCRによって確認されたmRNAノックダウン活性を示さなかった2個のGalNAc-siRNAが含まれた。これらのデータは、本発明者らのsiRNAを用いて得られる成功したmRNAノックダウンが確実に対応する標的タンパク質の低下につながることを裏付ける。
最後に、3個の選択されたGalNAc-siRNA分子を、ヒトANGPTL3 mRNAを発現する上記のヒト化マウスモデルを使用してインビボにおいて試験した(図7)。12mg/kgの選択した化合物の皮下投与後、標的タンパク質レベルが非標的化対照で処置した動物と比較して75%から90%(KDmax)の間で低下した。化合物により、処置後約20日目から約35日目の間にレベルが最大ノックダウンの50%(KD50)に戻った。すべての群が55日目までにベースラインに戻った。
要約すると、本発明者らは、インビボおよびインビトロにおけるGalNAcコンジュゲートの文脈においてヒトANGPTL3 mRNAおよびそれから翻訳されるタンパク質の発現を強力に低下させるsiRNAの特定に成功したことを証明した。
ヒトANGPTL3発現の阻害のためのさらなるsiRNAの特定
方法
使用した方法は、実施例2で使用したものと同じであった。
方法
使用した方法は、実施例2で使用したものと同じであった。
結果
ヒトANGPTL3を標的とする際に有用なさらなるsiRNAを特定するために、実施例2に記載されている設計および選択基準をカニクイザル(M.fascicularis)(カニクイザル)に対して1個のミスマッチを許容するよう調節した。さらに、目的とするすべてのsiRNA配列は、ANGPTL3以外の肝臓で発現する任意のヒト転写物に対して3個を超えるミスマッチを有しているか、または1つのヒト遺伝子の最大2個のミスマッチを有しているかのいずれかであった;これらの2つの基準の1つも満たさなかった配列は除去した。これにより、49個のさらなるsiRNAの一覧がもたらされた(表1を参照、コンストラクト163~211)。さらに、分析には、siRNA#013、siRNA#014およびsiRNA#015の拡張されたバリアントである3個のsiRNAが含まれた(表1を参照、コンストラクト212~214)。
ヒトANGPTL3を標的とする際に有用なさらなるsiRNAを特定するために、実施例2に記載されている設計および選択基準をカニクイザル(M.fascicularis)(カニクイザル)に対して1個のミスマッチを許容するよう調節した。さらに、目的とするすべてのsiRNA配列は、ANGPTL3以外の肝臓で発現する任意のヒト転写物に対して3個を超えるミスマッチを有しているか、または1つのヒト遺伝子の最大2個のミスマッチを有しているかのいずれかであった;これらの2つの基準の1つも満たさなかった配列は除去した。これにより、49個のさらなるsiRNAの一覧がもたらされた(表1を参照、コンストラクト163~211)。さらに、分析には、siRNA#013、siRNA#014およびsiRNA#015の拡張されたバリアントである3個のsiRNAが含まれた(表1を参照、コンストラクト212~214)。
上記のとおり、52個のsiRNAを、固定パターンを有するヌクレオチドを用いて作製した(表2を参照、コンストラクト163~214)。これら52個のsiRNAのANGPTL3の発現を低下させる能力を試験するために、ヒトHep3B細胞およびカニクイザル初代肝細胞に0.1nMまたは1.0nMの各siRNAをトランスフェクションし、48時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプル中のANGPTL3のmRNA発現を測定し、非標的化対照siRNAで処理した細胞と比較した(図8および9)。1.0nMの濃度でヒトHep3Bにおいて少なくとも75%、またはカニクイザル肝細胞において少なくとも70%のmRNA発現の低下を示した11個のsiRNAを、さらなる特徴づけのために選択した。驚くべきことに、ヒト細胞において活性な大半のsiRNAは、単一のヌクレオチドミスマッチにもかかわらず、カニクイザル肝細胞においても機能する。
選択された11個のsiRNAに関してヒトHep3B細胞においてIC50測定(表8)および細胞傷害性アッセイ(図10)を行った。(50nMにおける)NT対照の生存/毒性比の<30%を示した1個のsiRNA(siRNA#173)を除去後、GalNAcとのコンジュゲーションに関するヒトIC50値に基づいて4個のsiRNAを選択した(表8)。
まとめると、これらの結果は、カニクイザルにおける単一のヌクレオチドミスマッチにもかかわらず、ヒトおよびカニクイザルANGPTL3 mRNA発現の強い阻害が可能なsiRNAが特定されたことを示す。
ヒトおよびカニクイザルANGPTL3発現の阻害に関して活性なGalNAcコンジュゲートsiRNAの特定
方法
使用した方法は、実施例3で使用したものと同じであった。
方法
使用した方法は、実施例3で使用したものと同じであった。
結果
実施例5に記載されているとおりの強力なさらなるsiRNAの選択後、本発明者らは、選択した分子がインビボにおける肝臓特異的なsiRNA送達に適したGalNAcコンジュゲートの文脈において活性を保持するかどうかを実証することに着手した。本発明者らは、この活性が重要な前臨床種であるカニクイザル(M.fascicularis)(カニクイザル)の細胞において持続するかどうかも評価した。
実施例5に記載されているとおりの強力なさらなるsiRNAの選択後、本発明者らは、選択した分子がインビボにおける肝臓特異的なsiRNA送達に適したGalNAcコンジュゲートの文脈において活性を保持するかどうかを実証することに着手した。本発明者らは、この活性が重要な前臨床種であるカニクイザル(M.fascicularis)(カニクイザル)の細胞において持続するかどうかも評価した。
IC50測定の結果は、ヒト初代肝細胞に自然な取り込みによって送達された場合に、試験したすべてのsiRNAコンジュゲートが活性を保持することを示し(表9;第1回のスクリーニングから得られた2個のsiRNAを基準として含めた)、IC50値は1.91から9.68nMに及ぶ。しかしながら、驚くべきことに、GalNAc-siRNAの自然な取り込み後の性能の順位付けは、コンジュゲートされていないsiRNAのトランスフェクションにより補助された取り込み後に得られたものと異なる(表8)。これも、siRNAがその配列に基づく固有の特性を有し、それが、結果として得られるノックダウン能力に関してGalNAcコンジュゲートの文脈においてこれらsiRNAを適用に対して異なるかたちで適合させるようである。
カニクイザル肝細胞において測定されたIC50活性(表10)は、ヒト肝細胞で観察された(0.406から0.987nM)よりも不均一でなかった一方で、Imaxは、同様に多様であった(カニクイザルにおける0.605から0.892対ヒトにおける0.620から0.904)が、異なるsiRNAが最高のImaxを示した(ヒトのsiRNA#171-c、カニクイザルのsiRNA#013-c)。
これらの予想外の観察結果も、活性定量および分子選択のために機能インビトロアッセイを使用する必要性を強調する。
ヒトANGPTL3発現の阻害に関するさらなるGalNAcコンジュゲートsiRNAのインビトロおよびインビボにおける特徴づけ
方法
使用した方法は、実施例4で使用したものと同じであった。
方法
使用した方法は、実施例4で使用したものと同じであった。
結果
(実施例5に記載されているとおりに選択された)ANGPTL3を標的とする4個のさらなるGalNAc-siRNAに対する免疫応答を、siRNAのトランスフェクションに応じて、健康な3人の異なるドナーから単離したヒト初代PMBCから分泌されたインターフェロンα2aの産生を調べることによってインビトロでヒト細胞において測定した(図11)。いかなる試験GalNAc-siRNAに関してもヒトPBMCにおける免疫刺激のサインは確認されなかった。
(実施例5に記載されているとおりに選択された)ANGPTL3を標的とする4個のさらなるGalNAc-siRNAに対する免疫応答を、siRNAのトランスフェクションに応じて、健康な3人の異なるドナーから単離したヒト初代PMBCから分泌されたインターフェロンα2aの産生を調べることによってインビトロでヒト細胞において測定した(図11)。いかなる試験GalNAc-siRNAに関してもヒトPBMCにおける免疫刺激のサインは確認されなかった。
さらなるANGPTL3 GalNAc-siRNAを、50%マウス血清中におけるインビトロでのヌクレアーゼ安定性に関しても、相対的安定性および半減期を求めることによって試験した(表11)。半減期は、24hから72hの間の範囲であった。
さらなる選択物から毒性の可能性のあるGalNAc-siRNAを除外するために、ヒト初代肝細胞において細胞傷害性アッセイを行った(図12)。いかなる分子に関しても明らかな用量依存的な毒性効果は確認されなかった。これらの結果は、GalNAcコンジュゲートの文脈において本発明者らが選択したsiRNAの適用が一般に細胞傷害性を付与しないことを示す。
用量依存的なANGPTL3タンパク質ノックダウンを、3つの異なる濃度(0.1、1、および1000nM)のGalNAc-siRNAで処理されたヒト初代肝細胞の上清中のANGPTL3レベルの定量によって確認した(図13)。これらのデータは、本発明者らのGalNAc-siRNAを用いて得られる成功したmRNAノックダウンが確実に対応する標的タンパク質の低下につながることを裏付ける。
最後に、2個のさらに選択されたGalNAc-siRNAを、第1回のスクリーニング作戦で得られた3個のGalNAc-siRNA(実施例2~4)を用いて並行して、ヒトANGPTL3を発現するインビボマウスモデルにおいて試験した(図14)。10mg/kgの選択された化合物の皮下投与後、標的タンパク質レベルは、非標的化対照で処置した動物と比較して60%から80%(KDmax)の間で低下した。化合物により、処置後約20日目から約45日目の間にレベルが最大ノックダウンの50%(KD50)に戻った。すべての群が90日目までにベースラインに戻った。
要約すると、本発明者らは、インビボおよびインビトロにおけるGalNAcコンジュゲートの文脈においてヒトANGPTL3 mRNAおよびそれから翻訳されるタンパク質の発現を強力に低下させるさらなるsiRNAの特定に成功したことを証明した。
GalNAcコンジュゲートANGPTL3 siRNA配列の最適化
方法
修飾GalNAc siRNA配列の生成
式(I)の修飾ヌクレオチドを有するさらに最適化されたGalNAc siRNA配列を、国際公開第2019/170731号に記載されているとおりに合成した。すべてのオリゴヌクレオチドを、ABI 394合成機において合成した。市販の(Sigma Aldrich)標準的な保護基を有するDNA-、RNA-、2’-OMe-RNA、および2’-デオキシ-F-RNA-ホスホラミダイト、例えば、5’-O-ジメトキシトリチル-チミジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-ウラシル-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-N4-シチジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-N6-ベンゾイル-アデノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-N2-イソブチリル-グアノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-ウラシル-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-N4-シチジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-N6-ベンゾイル-アデノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト,5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-N2-イソブチリル-グアノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト,5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デスオキシ-フルオロ-ウラシル-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-フルオロ-N4-シチジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-フルオロ-N6-ベンゾイル-アデノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-フルオロ-N2-イソブチリル-グアノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイトならびに対応する固相担体材料(CPG-500Å、ローディング40μmol/g、ChemGenes)を、自動オリゴヌクレオチド合成のために使用した。
方法
修飾GalNAc siRNA配列の生成
式(I)の修飾ヌクレオチドを有するさらに最適化されたGalNAc siRNA配列を、国際公開第2019/170731号に記載されているとおりに合成した。すべてのオリゴヌクレオチドを、ABI 394合成機において合成した。市販の(Sigma Aldrich)標準的な保護基を有するDNA-、RNA-、2’-OMe-RNA、および2’-デオキシ-F-RNA-ホスホラミダイト、例えば、5’-O-ジメトキシトリチル-チミジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-ウラシル-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-N4-シチジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-N6-ベンゾイル-アデノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tert-ブチルジメチルシリル-N2-イソブチリル-グアノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-ウラシル-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-N4-シチジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-N6-ベンゾイル-アデノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト,5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-N2-イソブチリル-グアノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト,5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デスオキシ-フルオロ-ウラシル-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-フルオロ-N4-シチジン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-フルオロ-N6-ベンゾイル-アデノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-フルオロ-N2-イソブチリル-グアノシン-3’-O-(N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル)-ホスホラミダイトならびに対応する固相担体材料(CPG-500Å、ローディング40μmol/g、ChemGenes)を、自動オリゴヌクレオチド合成のために使用した。
ホスホラミダイト基本単位を、アセトニトリル中の0.1M溶液として使用し、5-(ビス-3,5-トリフルオロメチルフェニル)-1H-テトラゾール(アクチベーター42、アセトニトリル中0.25M、Sigma Aldrich)により活性化した。標準的なホスホラミダイトカップリングに対して200秒の反応時間を使用した。本明細書に記載されているホスホラミダイトの場合、300秒のカップリング時間を利用した。キャッピング試薬として、THF中の無水酢酸(CapA for ABI、Sigma Aldrich)およびTHF中のN-メチルイミダゾール(CapB for ABI、Sigma Aldrich)を使用した。酸化試薬として、THF/ピリジン/水中のヨウ素(0.02M;ABI用オキシダイザー、Sigma Aldrich)を使用した。あるいは、ピリジン/アセトニトリル(1:1)中の3-((N,N-ジメチル-アミノメチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン(DDTT)の0.05M溶液によりPS酸化を達成した。DMT-保護基の脱保護を、DCM中のジクロロ酢酸(DCA deblock、Sigma Aldrich)を使用して行った。固相担体からの最終的な切断および脱保護(アシル-およびシアノエチル-保護基)を、NH3(32%水溶液/エタノール、v/v 3:1)により達成した。NMP/NEt3/HF(3:1.5:2)による処理を、TBDMS-脱保護のために利用した。
3’末端に本明細書に記載の基本単位を有するオリゴヌクレオチドを、固相担体材料またはユニバーサルリンカー-固相担体(CPG-500Å、ローディング 39μmol/g、AM Chemicals LLC)および表Aに示される対応するホスホラミダイト上に合成した。
粗生成物を、HPLCによって分析し、一本鎖精製をイオン交換または分取HPLC法を使用して実施した。
イオン交換:AKTA精製装置、(Thermo Fisher Scientific DNAPac PA200セミ分取イオン交換カラム、8μm粒子、幅22mm×長さ250mm)。
バッファーA:1.5L H2O、2.107g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、540.54g 尿素、pH7.4。
バッファーB:1.5L H2O、105.34g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、40.54g 尿素、pH7.4。
オリゴヌクレオチドの単離を、4倍容量のエタノールの添加および-20℃における保管により引き起こされる沈殿によって達成した。
イオン交換:AKTA精製装置、(Thermo Fisher Scientific DNAPac PA200セミ分取イオン交換カラム、8μm粒子、幅22mm×長さ250mm)。
バッファーA:1.5L H2O、2.107g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、540.54g 尿素、pH7.4。
バッファーB:1.5L H2O、105.34g NaClO4、438mg EDTA、1.818g TRIS、40.54g 尿素、pH7.4。
オリゴヌクレオチドの単離を、4倍容量のエタノールの添加および-20℃における保管により引き起こされる沈殿によって達成した。
分取HPLC:Agilent 1100シリーズ分取HPLC(Waters XBridge(登録商標)BEH C18 OBD(商標)分取カラム130Å、5μm、10mm×100mm);溶離液:トリエチルアンモニウムアセタート(アセトニトリル/水中0.1M)。凍結乾燥後、生成物を、2.5MのNaCl溶液1.0mLおよびH2O 4.0mLに溶解させた。対応するNa+塩を、エタノールを20mL添加し、-20℃において18h保管することによる沈殿後に単離させた。
一本鎖の最終的な分析は、LC/MS-TOF法によって行った。二本鎖形成のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、1×PBSバッファー中で混合し、85℃に10分間加熱した。その後、それを、ゆっくりと室温に冷ました。siRNA二本鎖の最終的な分析は、LC/MS-TOF法によって行った。
siRNA二本鎖のアニーリングを、実施例1に記載されているとおりに行った。ヌクレオチド修飾を含む、各siRNAの配列を、表3に示す。
マウス血清中におけるsiRNAの安定性
表3に列挙されている最適化されたANGPTL3 siRNAの安定性を、以下を除いて実施例1に記載されているとおりに判定した:siRNAを37℃で0h、24h、48h、72h、96h、および168hインキュベートした。プロテイナーゼKをQiagen(カタログ番号19133)から購入し、HPLC分析を、1260 DAD検出器を使用したAgilent Technologies 1260 Infinity II機器において行った。
表3に列挙されている最適化されたANGPTL3 siRNAの安定性を、以下を除いて実施例1に記載されているとおりに判定した:siRNAを37℃で0h、24h、48h、72h、96h、および168hインキュベートした。プロテイナーゼKをQiagen(カタログ番号19133)から購入し、HPLC分析を、1260 DAD検出器を使用したAgilent Technologies 1260 Infinity II機器において行った。
細胞培養および細胞ベースのアッセイ
ヒトHep3B細胞、ヒト初代肝細胞、および初代ヒトPBMCを、単離し、実施例2~7に記載されているとおりに培養した。mRNAの分析を、実施例2に記載されているとおりに行った。細胞傷害性を、実施例2に記載されているとおりにヒトHep3B細胞の5nMおよび50nMのsiRNAトランスフェクションの72時間後に測定した。ヒトPBMCの上清中のIFNαタンパク質濃度を、実施例4に記載されているとおりに定量した。
ヒトHep3B細胞、ヒト初代肝細胞、および初代ヒトPBMCを、単離し、実施例2~7に記載されているとおりに培養した。mRNAの分析を、実施例2に記載されているとおりに行った。細胞傷害性を、実施例2に記載されているとおりにヒトHep3B細胞の5nMおよび50nMのsiRNAトランスフェクションの72時間後に測定した。ヒトPBMCの上清中のIFNαタンパク質濃度を、実施例4に記載されているとおりに定量した。
インビボアッセイ
修飾GalNAc-ANGPTL3 siRNAのインビボ活性を、ApoA2プロモーターからヒトANGPTL3 mRNAをコードするAAV8ベクターにより形質導入されたマウスにおいて実施例4に記載されているとおりに測定した。実施例4とは対照的に、5mg/kgの単回のsiRNA用量を、各処置群当たり5匹の雄のC57BL/6マウスに皮下注射した。
修飾GalNAc-ANGPTL3 siRNAのインビボ活性を、ApoA2プロモーターからヒトANGPTL3 mRNAをコードするAAV8ベクターにより形質導入されたマウスにおいて実施例4に記載されているとおりに測定した。実施例4とは対照的に、5mg/kgの単回のsiRNA用量を、各処置群当たり5匹の雄のC57BL/6マウスに皮下注射した。
ANGPTL3 ELISAアッセイ
修飾GalNAc-siRNAで処置したマウスにおける血清ANGPTL3タンパク質レベルを、実施例4に記載されているとおりに定量した。
修飾GalNAc-siRNAで処置したマウスにおける血清ANGPTL3タンパク質レベルを、実施例4に記載されているとおりに定量した。
結果
54個の異なるsiRNA修飾パターンを、設計し、3個の予め選択されたsiRNA配列(siRNA#013、siRNA#051、およびsiRNA#165)に適用した。3×54個のsiRNA分子のライブラリー(siRNA#013-c-01からsiRNA#013-c-54、siRNA#051-c-01からsiRNA#051-c-54、およびsiRNA#165-c-01からsiRNA#165-c-54、表3)を、それぞれのsiRNAセンス鎖の5’末端にある3個の連続した修飾GalNAcコンジュゲートヌクレオチドを使用して合成した。
54個の異なるsiRNA修飾パターンを、設計し、3個の予め選択されたsiRNA配列(siRNA#013、siRNA#051、およびsiRNA#165)に適用した。3×54個のsiRNA分子のライブラリー(siRNA#013-c-01からsiRNA#013-c-54、siRNA#051-c-01からsiRNA#051-c-54、およびsiRNA#165-c-01からsiRNA#165-c-54、表3)を、それぞれのsiRNAセンス鎖の5’末端にある3個の連続した修飾GalNAcコンジュゲートヌクレオチドを使用して合成した。
162個の修飾ANGPTL3 siRNAのすべてを、50%マウス血清中においてヌクレアーゼ安定性に関して試験した。表12に示されるとおり、固定パターンの2’O-メチルおよび2’-フルオロ修飾ヌクレオチドを有するそれぞれの親配列と比較して著しく改善された安定性を有するいくつかの分子を特定した。siRNA#013-cおよびsiRNA#051-cから誘導されたコンストラクトに関して、血清半減期が、親コンストラクトパターンのおよそ72hから修飾コンストラクトの168hまたはそれ以上に向上した。siRNA#165-cから誘導されたコンストラクトに関して、血清半減期が、およそ24hから96hまたはそれ以上に向上した。
次に、162個の修飾GalNAc-siRNAのすべてを、自然な取り込み条件下で、1nM、10nM、および100nM濃度の修飾siRNAを使用して、ヒト初代肝細胞におけるノックダウン能力に関して評価した。親コンストラクトsiRNA#013-c、siRNA#051-c、およびsiRNA#165-cを、陽性対照として使用した。データを、図15A~Fに示す。
インビトロノックダウン活性およびヌクレアーゼ安定性データに基づいて、3つの親コンストラクトのそれぞれに対して8個の修飾バリアントを選択した。インビボ活性試験に先立って、3×8個の修飾コンストラクトを、ヒトPBMCにおいて自然免疫を刺激する能力(図16)およびヒトHep3B細胞における一般的な細胞傷害性(図17)に関して調査した。両方のアッセイにおいて、明白な悪影響は、確認されなかった。
最後に、3×8個の選択された修飾GalNAc-siRNAコンストラクトを、ヒトANGPTL3 mRNAを発現する上記のヒト化マウスモデルを使用してインビボにおいて試験した(図18A~C)。5mg/kgの用量の選択した化合物の単回皮下投与後、標的タンパク質レベルが、PBSで処置した動物と比較して最大約95%(KDmax)低下した。最も長く継続した最適化分子は、63日目でもまだ最大ノックダウンの50%(KD50)に戻らなかったが、3つすべての親コンストラクトは、その時点で<15%の残存する活性を示した。
要約すると、本発明者らは、インビボおよびインビトロにおけるGalNAcコンジュゲートの文脈においてヒトANGPTL3 mRNAおよびそれから翻訳されるタンパク質の発現を強力に低下させるsiRNAの特定に成功したことを証明した。本発明者らはまた、予想外にも、修飾ヌクレオチドを使用した最適化した修飾パターンの導入によるsiRNAのインビボにおける有効性が大きく向上することも証明した。安定性とインビトロ性能の間のゆるい相関性にもかかわらず、特定の修飾siRNAのインビボにおける効力は、非インビボデータに基づいて体系的に予測することができなかった。
ANGPTL3配列
ヒトANGPTL3 mRNA配列(配列番号1181)
1 atatatagag ttaagaagtc taggtctgct tccagaagaa aacagttcca cgttgcttga
61 aattgaaaat caagataaaa atgttcacaa ttaagctcct tctttttatt gttcctctag
121 ttatttcctc cagaattgat caagacaatt catcatttga ttctctatct ccagagccaa
181 aatcaagatt tgctatgtta gacgatgtaa aaattttagc caatggcctc cttcagttgg
241 gacatggtct taaagacttt gtccataaga cgaagggcca aattaatgac atatttcaaa
301 aactcaacat atttgatcag tctttttatg atctatcgct gcaaaccagt gaaatcaaag
361 aagaagaaaa ggaactgaga agaactacat ataaactaca agtcaaaaat gaagaggtaa
421 agaatatgtc acttgaactc aactcaaaac ttgaaagcct cctagaagaa aaaattctac
481 ttcaacaaaa agtgaaatat ttagaagagc aactaactaa cttaattcaa aatcaacctg
541 aaactccaga acacccagaa gtaacttcac ttaaaacttt tgtagaaaaa caagataata
601 gcatcaaaga ccttctccag accgtggaag accaatataa acaattaaac caacagcata
661 gtcaaataaa agaaatagaa aatcagctca gaaggactag tattcaagaa cccacagaaa
721 tttctctatc ttccaagcca agagcaccaa gaactactcc ctttcttcag ttgaatgaaa
781 taagaaatgt aaaacatgat ggcattcctg ctgaatgtac caccatttat aacagaggtg
841 aacatacaag tggcatgtat gccatcagac ccagcaactc tcaagttttt catgtctact
901 gtgatgttat atcaggtagt ccatggacat taattcaaca tcgaatagat ggatcacaaa
961 acttcaatga aacgtgggag aactacaaat atggttttgg gaggcttgat ggagaatttt
1021 ggttgggcct agagaagata tactccatag tgaagcaatc taattatgtt ttacgaattg
1081 agttggaaga ctggaaagac aacaaacatt atattgaata ttctttttac ttgggaaatc
1141 acgaaaccaa ctatacgcta catctagttg cgattactgg caatgtcccc aatgcaatcc
1201 cggaaaacaa agatttggtg ttttctactt gggatcacaa agcaaaagga cacttcaact
1261 gtccagaggg ttattcagga ggctggtggt ggcatgatga gtgtggagaa aacaacctaa
1321 atggtaaata taacaaacca agagcaaaat ctaagccaga gaggagaaga ggattatctt
1381 ggaagtctca aaatggaagg ttatactcta taaaatcaac caaaatgttg atccatccaa
1441 cagattcaga aagctttgaa tgaactgagg caaatttaaa aggcaataat ttaaacatta
1501 acctcattcc aagttaatgt ggtctaataa tctggtatta aatccttaag agaaagcttg
1561 agaaatagat tttttttatc ttaaagtcac tgtctattta agattaaaca tacaatcaca
1621 taaccttaaa gaataccgtt tacatttctc aatcaaaatt cttataatac tatttgtttt
1681 aaattttgtg atgtgggaat caattttaga tggtcacaat ctagattata atcaataggt
1741 gaacttatta aataactttt ctaaataaaa aatttagaga cttttatttt aaaaggcatc
1801 atatgagcta atatcacaac tttcccagtt taaaaaacta gtactcttgt taaaactcta
1861 aacttgacta aatacagagg actggtaatt gtacagttct taaatgttgt agtattaatt
1921 tcaaaactaa aaatcgtcag cacagagtat gtgtaaaaat ctgtaataca aatttttaaa
1981 ctgatgcttc attttgctac aaaataattt ggagtaaatg tttgatatga tttatttatg
2041 aaacctaatg aagcagaatt aaatactgta ttaaaataag ttcgctgtct ttaaacaaat
2101 ggagatgact actaagtcac attgacttta acatgaggta tcactatacc ttatttgtta
2161 aaatatatac tgtatacatt ttatatattt taacacttaa tactatgaaa acaaataatt
2221 gtaaaggaat cttgtcagat tacagtaaga atgaacatat ttgtggcatc gagttaaagt
2281 ttatatttcc cctaaatatg ctgtgattct aatacattcg tgtaggtttt caagtagaaa
2341 taaacctcgt aacaagttac tgaacgttta aacagcctga caagcatgta tatatgttta
2401 aaattcaata aacaaagacc cagtccctaa attatagaaa tttaaattat tcttgcatgt
2461 ttatcgacat cacaacagat ccctaaatcc ctaaatccct aaagattaga tacaaatttt
2521 ttaccacagt atcacttgtc agaatttatt tttaaatatg attttttaaa actgccagta
2581 agaaatttta aattaaaccc atttgttaaa ggatatagtg cccaagttat atggtgacct
2641 acctttgtca atacttagca ttatgtattt caaattatcc aatatacatg tcatatatat
2701 ttttatatgt cacatatata aaagatatgt atgatctatg tgaatcctaa gtaaatattt
2761 tgttccagaa aagtacaaaa taataaaggt aaaaataatc tataattttc aggaccacag
2821 actaagctgt cgaaattaac gctgattttt ttagggccag aataccaaaa tggctcctct
2881 cttcccccaa aattggacaa tttcaaatgc aaaataattc attatttaat atatgagttg
2941 cttcctctat t
ヒトANGPTL3ポリペプチド配列(配列番号1182)
MFTIKLLLFI VPLVISSRID QDNSSFDSLS PEPKSRFAML DDVKILANGL LQLGHGLKDF
VHKTKGQIND IFQKLNIFDQ SFYDLSLQTS EIKEEEKELR RTTYKLQVKN EEVKNMSLEL
NSKLESLLEE KILLQQKVKY LEEQLTNLIQ NQPETPEHPE VTSLKTFVEK QDNSIKDLLQ
TVEDQYKQLN QQHSQIKEIE NQLRRTSIQE PTEISLSSKP RAPRTTPFLQ LNEIRNVKHD
GIPAECTTIY NRGEHTSGMY AIRPSNSQVF HVYCDVISGS PWTLIQHRID GSQNFNETWE
NYKYGFGRLD GEFWLGLEKI YSIVKQSNYV LRIELEDWKD NKHYIEYSFY LGNHETNYTL
HLVAITGNVP NAIPENKDLV FSTWDHKAKG HFNCPEGYSG GWWWHDECGE NNLNGKYNKP
RAKSKPERRR GLSWKSQNGR LYSIKSTKML IHPTDSESFE
カニクイザルANGPTL3 mRNA配列(配列番号1183)
1 tagagttaag aagtctaggt ctgcttccag aagaacacag ttccacgctg cttgaaattg
61 aaaatcagga taaaaatgtt cacaattaag ctccttcttt ttattgttcc tctagttatt
121 tcctccagaa ttgaccaaga caattcatca tttgattctg tatctccaga gccaaaatca
181 agatttgcta tgttagacga tgtaaaaatt ttagccaatg gcctccttca gttgggacat
241 ggtcttaaag actttgtcca taagactaag ggccaaatta atgacatatt tcaaaaactc
301 aacatatttg atcagtcttt ttatgatcta tcactgcaaa ccagtgaaat caaagaagaa
361 gaaaaggaac tgagaagaac tacatataaa ctacaagtca aaaatgaaga ggtaaagaat
421 atgtcacttg aactcaactc aaaacttgaa agcctcctag aagaaaaaat tctacttcaa
481 caaaaagtga aatatttaga agagcaacta actaacttaa ttcaaaatca acctgcaact
541 ccagaacatc cagaagtaac ttcacttaaa agttttgtag aaaaacaaga taatagcatc
601 aaagaccttc tccagactgt ggaagaacaa tataagcaat taaaccaaca gcatagtcaa
661 ataaaagaaa tagaaaatca gctcagaatg actaatattc aagaacccac agaaatttct
721 ctatcttcca agccaagagc accaagaact actccctttc ttcagctgaa tgaaataaga
781 aatgtaaaac atgatggcat tcctgctgat tgtaccacca tttacaatag aggtgaacat
841 ataagtggca cgtatgccat cagacccagc aactctcaag tttttcatgt ctactgtgat
901 gttgtatcag gtagtccatg gacattaatt caacatcgaa tagatggatc acaaaacttc
961 aatgaaacgt gggagaacta caaatatggt ttcgggaggc ttgatggaga attctggttg
1021 ggcctagaga agatatactc catagtgaag caatctaatt acgttttacg aattgagttg
1081 gaagactgga aagacaacaa acattatatt gaatattctt tttacttggg aaatcacgaa
1141 accaactata cgctacatgt agttaagatt actggcaatg tccccaatgc aatcccggaa
1201 aacaaagatt tggtgttttc tacttgggat cacaaagcaa aaggacactt cagctgtcca
1261 gagagttatt caggaggctg gtggtggcat gatgagtgtg gagaaaacaa cctaaatggt
1321 aaatataaca aaccaagaac aaaatctaag ccagagcgga gaagaggatt atcctggaag
1381 tctcaaaatg gaaggttata ctctataaaa tcaaccaaaa tgttgatcca tccaacagat
1441 tcagaaagct ttgaatgaac tgaggcaaat ttaaaaggca ataaattaaa cattaaactc
1501 attccaagtt aatgtggttt aataatctgg tattaaatcc ttaagagaag gcttgagaaa
1561 tagatttttt tatcttaaag tcactgtcaa tttaagatta aacatacaat cacataacct
1621 taaagaatac catttacatt tctcaatcaa aattcttaca acactatttg ttttatattt
1681 tgtgatgtgg gaatcaattt tagatggtcg caatctaaat tataatcaac aggtgaactt
1741 actaaataac ttttctaaat aaaaaactta gagactttaa ttttaaaagt catcatatga
1801 gctaatatca caattttccc agtttaaaaa actagttttc ttgttaaaac tctaaacttg
1861 actaaataaa gaggactgat aattatacag ttcttaaatt tgttgtaata ttaatttcaa
1921 aactaaaaat tgtcagcaca gagtatgtgt aaaaatctgt aatataaatt tttaaactga
1981 tgcctcattt tgctacaaaa taatctggag taaatttttg ataggattta tttatgaaac
2041 ctaatgaagc aggattaaat actgtattaa aataggttcg ctgtctttta aacaaatgga
2101 gatgatgatt actaagtcac attgacttta atatgaggta tcactatacc ttaacatatt
2161 tgttaaaacg tatactgtat acattttgtg tattttaata cttaatacta tgaaaacaag
2221 taattgtaaa cgtatcttgt cagattacaa taggaatgaa catattggtg acatcgagtt
2281 aaagtttata tttcccctaa atatgctgcg attccaatat attcatgtag gttttcaagc
2341 agaaataaac cttgtaacaa gttactgact aaaca
カニクイザルANGPTL3ポリペプチド配列(配列番号1184)
MFTIKLLLFI VPLVISSRID QDNSSFDSVS PEPKSRFAML DDVKILANGL LQLGHGLKDF
VHKTKGQIND IFQKLNIFDQ SFYDLSLQTS EIKEEEKELR RTTYKLQVKN EEVKNMSLEL
NSKLESLLEE KILLQQKVKY LEEQLTNLIQ NQPATPEHPE VTSLKSFVEK QDNSIKDLLQ
TVEEQYKQLN QQHSQIKEIE NQLRMTNIQE PTEISLSSKP RAPRTTPFLQ LNEIRNVKHD
GIPADCTTIY NRGEHISGTY AIRPSNSQVF HVYCDVVSGS PWTLIQHRID GSQNFNETWE
NYKYGFGRLD GEFWLGLEKI YSIVKQSNYV LRIELEDWKD NKHYIEYSFY LGNHETNYTL
HVVKITGNVP NAIPENKDLV FSTWDHKAKG HFSCPESYSG GWWWHDECGE NNLNGKYNKP
RTKSKPERRR GLSWKSQNGR LYSIKSTKML IHPTDSESFE
ヒトANGPTL3 mRNA配列(配列番号1181)
1 atatatagag ttaagaagtc taggtctgct tccagaagaa aacagttcca cgttgcttga
61 aattgaaaat caagataaaa atgttcacaa ttaagctcct tctttttatt gttcctctag
121 ttatttcctc cagaattgat caagacaatt catcatttga ttctctatct ccagagccaa
181 aatcaagatt tgctatgtta gacgatgtaa aaattttagc caatggcctc cttcagttgg
241 gacatggtct taaagacttt gtccataaga cgaagggcca aattaatgac atatttcaaa
301 aactcaacat atttgatcag tctttttatg atctatcgct gcaaaccagt gaaatcaaag
361 aagaagaaaa ggaactgaga agaactacat ataaactaca agtcaaaaat gaagaggtaa
421 agaatatgtc acttgaactc aactcaaaac ttgaaagcct cctagaagaa aaaattctac
481 ttcaacaaaa agtgaaatat ttagaagagc aactaactaa cttaattcaa aatcaacctg
541 aaactccaga acacccagaa gtaacttcac ttaaaacttt tgtagaaaaa caagataata
601 gcatcaaaga ccttctccag accgtggaag accaatataa acaattaaac caacagcata
661 gtcaaataaa agaaatagaa aatcagctca gaaggactag tattcaagaa cccacagaaa
721 tttctctatc ttccaagcca agagcaccaa gaactactcc ctttcttcag ttgaatgaaa
781 taagaaatgt aaaacatgat ggcattcctg ctgaatgtac caccatttat aacagaggtg
841 aacatacaag tggcatgtat gccatcagac ccagcaactc tcaagttttt catgtctact
901 gtgatgttat atcaggtagt ccatggacat taattcaaca tcgaatagat ggatcacaaa
961 acttcaatga aacgtgggag aactacaaat atggttttgg gaggcttgat ggagaatttt
1021 ggttgggcct agagaagata tactccatag tgaagcaatc taattatgtt ttacgaattg
1081 agttggaaga ctggaaagac aacaaacatt atattgaata ttctttttac ttgggaaatc
1141 acgaaaccaa ctatacgcta catctagttg cgattactgg caatgtcccc aatgcaatcc
1201 cggaaaacaa agatttggtg ttttctactt gggatcacaa agcaaaagga cacttcaact
1261 gtccagaggg ttattcagga ggctggtggt ggcatgatga gtgtggagaa aacaacctaa
1321 atggtaaata taacaaacca agagcaaaat ctaagccaga gaggagaaga ggattatctt
1381 ggaagtctca aaatggaagg ttatactcta taaaatcaac caaaatgttg atccatccaa
1441 cagattcaga aagctttgaa tgaactgagg caaatttaaa aggcaataat ttaaacatta
1501 acctcattcc aagttaatgt ggtctaataa tctggtatta aatccttaag agaaagcttg
1561 agaaatagat tttttttatc ttaaagtcac tgtctattta agattaaaca tacaatcaca
1621 taaccttaaa gaataccgtt tacatttctc aatcaaaatt cttataatac tatttgtttt
1681 aaattttgtg atgtgggaat caattttaga tggtcacaat ctagattata atcaataggt
1741 gaacttatta aataactttt ctaaataaaa aatttagaga cttttatttt aaaaggcatc
1801 atatgagcta atatcacaac tttcccagtt taaaaaacta gtactcttgt taaaactcta
1861 aacttgacta aatacagagg actggtaatt gtacagttct taaatgttgt agtattaatt
1921 tcaaaactaa aaatcgtcag cacagagtat gtgtaaaaat ctgtaataca aatttttaaa
1981 ctgatgcttc attttgctac aaaataattt ggagtaaatg tttgatatga tttatttatg
2041 aaacctaatg aagcagaatt aaatactgta ttaaaataag ttcgctgtct ttaaacaaat
2101 ggagatgact actaagtcac attgacttta acatgaggta tcactatacc ttatttgtta
2161 aaatatatac tgtatacatt ttatatattt taacacttaa tactatgaaa acaaataatt
2221 gtaaaggaat cttgtcagat tacagtaaga atgaacatat ttgtggcatc gagttaaagt
2281 ttatatttcc cctaaatatg ctgtgattct aatacattcg tgtaggtttt caagtagaaa
2341 taaacctcgt aacaagttac tgaacgttta aacagcctga caagcatgta tatatgttta
2401 aaattcaata aacaaagacc cagtccctaa attatagaaa tttaaattat tcttgcatgt
2461 ttatcgacat cacaacagat ccctaaatcc ctaaatccct aaagattaga tacaaatttt
2521 ttaccacagt atcacttgtc agaatttatt tttaaatatg attttttaaa actgccagta
2581 agaaatttta aattaaaccc atttgttaaa ggatatagtg cccaagttat atggtgacct
2641 acctttgtca atacttagca ttatgtattt caaattatcc aatatacatg tcatatatat
2701 ttttatatgt cacatatata aaagatatgt atgatctatg tgaatcctaa gtaaatattt
2761 tgttccagaa aagtacaaaa taataaaggt aaaaataatc tataattttc aggaccacag
2821 actaagctgt cgaaattaac gctgattttt ttagggccag aataccaaaa tggctcctct
2881 cttcccccaa aattggacaa tttcaaatgc aaaataattc attatttaat atatgagttg
2941 cttcctctat t
ヒトANGPTL3ポリペプチド配列(配列番号1182)
MFTIKLLLFI VPLVISSRID QDNSSFDSLS PEPKSRFAML DDVKILANGL LQLGHGLKDF
VHKTKGQIND IFQKLNIFDQ SFYDLSLQTS EIKEEEKELR RTTYKLQVKN EEVKNMSLEL
NSKLESLLEE KILLQQKVKY LEEQLTNLIQ NQPETPEHPE VTSLKTFVEK QDNSIKDLLQ
TVEDQYKQLN QQHSQIKEIE NQLRRTSIQE PTEISLSSKP RAPRTTPFLQ LNEIRNVKHD
GIPAECTTIY NRGEHTSGMY AIRPSNSQVF HVYCDVISGS PWTLIQHRID GSQNFNETWE
NYKYGFGRLD GEFWLGLEKI YSIVKQSNYV LRIELEDWKD NKHYIEYSFY LGNHETNYTL
HLVAITGNVP NAIPENKDLV FSTWDHKAKG HFNCPEGYSG GWWWHDECGE NNLNGKYNKP
RAKSKPERRR GLSWKSQNGR LYSIKSTKML IHPTDSESFE
カニクイザルANGPTL3 mRNA配列(配列番号1183)
1 tagagttaag aagtctaggt ctgcttccag aagaacacag ttccacgctg cttgaaattg
61 aaaatcagga taaaaatgtt cacaattaag ctccttcttt ttattgttcc tctagttatt
121 tcctccagaa ttgaccaaga caattcatca tttgattctg tatctccaga gccaaaatca
181 agatttgcta tgttagacga tgtaaaaatt ttagccaatg gcctccttca gttgggacat
241 ggtcttaaag actttgtcca taagactaag ggccaaatta atgacatatt tcaaaaactc
301 aacatatttg atcagtcttt ttatgatcta tcactgcaaa ccagtgaaat caaagaagaa
361 gaaaaggaac tgagaagaac tacatataaa ctacaagtca aaaatgaaga ggtaaagaat
421 atgtcacttg aactcaactc aaaacttgaa agcctcctag aagaaaaaat tctacttcaa
481 caaaaagtga aatatttaga agagcaacta actaacttaa ttcaaaatca acctgcaact
541 ccagaacatc cagaagtaac ttcacttaaa agttttgtag aaaaacaaga taatagcatc
601 aaagaccttc tccagactgt ggaagaacaa tataagcaat taaaccaaca gcatagtcaa
661 ataaaagaaa tagaaaatca gctcagaatg actaatattc aagaacccac agaaatttct
721 ctatcttcca agccaagagc accaagaact actccctttc ttcagctgaa tgaaataaga
781 aatgtaaaac atgatggcat tcctgctgat tgtaccacca tttacaatag aggtgaacat
841 ataagtggca cgtatgccat cagacccagc aactctcaag tttttcatgt ctactgtgat
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961 aatgaaacgt gggagaacta caaatatggt ttcgggaggc ttgatggaga attctggttg
1021 ggcctagaga agatatactc catagtgaag caatctaatt acgttttacg aattgagttg
1081 gaagactgga aagacaacaa acattatatt gaatattctt tttacttggg aaatcacgaa
1141 accaactata cgctacatgt agttaagatt actggcaatg tccccaatgc aatcccggaa
1201 aacaaagatt tggtgttttc tacttgggat cacaaagcaa aaggacactt cagctgtcca
1261 gagagttatt caggaggctg gtggtggcat gatgagtgtg gagaaaacaa cctaaatggt
1321 aaatataaca aaccaagaac aaaatctaag ccagagcgga gaagaggatt atcctggaag
1381 tctcaaaatg gaaggttata ctctataaaa tcaaccaaaa tgttgatcca tccaacagat
1441 tcagaaagct ttgaatgaac tgaggcaaat ttaaaaggca ataaattaaa cattaaactc
1501 attccaagtt aatgtggttt aataatctgg tattaaatcc ttaagagaag gcttgagaaa
1561 tagatttttt tatcttaaag tcactgtcaa tttaagatta aacatacaat cacataacct
1621 taaagaatac catttacatt tctcaatcaa aattcttaca acactatttg ttttatattt
1681 tgtgatgtgg gaatcaattt tagatggtcg caatctaaat tataatcaac aggtgaactt
1741 actaaataac ttttctaaat aaaaaactta gagactttaa ttttaaaagt catcatatga
1801 gctaatatca caattttccc agtttaaaaa actagttttc ttgttaaaac tctaaacttg
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1921 aactaaaaat tgtcagcaca gagtatgtgt aaaaatctgt aatataaatt tttaaactga
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2041 ctaatgaagc aggattaaat actgtattaa aataggttcg ctgtctttta aacaaatgga
2101 gatgatgatt actaagtcac attgacttta atatgaggta tcactatacc ttaacatatt
2161 tgttaaaacg tatactgtat acattttgtg tattttaata cttaatacta tgaaaacaag
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2281 aaagtttata tttcccctaa atatgctgcg attccaatat attcatgtag gttttcaagc
2341 agaaataaac cttgtaacaa gttactgact aaaca
カニクイザルANGPTL3ポリペプチド配列(配列番号1184)
MFTIKLLLFI VPLVISSRID QDNSSFDSVS PEPKSRFAML DDVKILANGL LQLGHGLKDF
VHKTKGQIND IFQKLNIFDQ SFYDLSLQTS EIKEEEKELR RTTYKLQVKN EEVKNMSLEL
NSKLESLLEE KILLQQKVKY LEEQLTNLIQ NQPATPEHPE VTSLKSFVEK QDNSIKDLLQ
TVEEQYKQLN QQHSQIKEIE NQLRMTNIQE PTEISLSSKP RAPRTTPFLQ LNEIRNVKHD
GIPADCTTIY NRGEHISGTY AIRPSNSQVF HVYCDVVSGS PWTLIQHRID GSQNFNETWE
NYKYGFGRLD GEFWLGLEKI YSIVKQSNYV LRIELEDWKD NKHYIEYSFY LGNHETNYTL
HVVKITGNVP NAIPENKDLV FSTWDHKAKG HFSCPESYSG GWWWHDECGE NNLNGKYNKP
RTKSKPERRR GLSWKSQNGR LYSIKSTKML IHPTDSESFE
Claims (40)
- ヒトアンジオポエチン様タンパク質3(ANGPTL3)遺伝子のRNA転写物上の標的配列を標的とすることによってANGPTL3遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、dsRNAは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス配列は、標的配列と少なくとも90%同一であり、標的配列は、配列番号1181のヌクレオチド143~161、135~153、1535~1553、143~163、144~162、145~163、150~168、151~169、1528~1546、1530~1548、1532~1550、1533~1551、1602~1620、2612~2630、または2773~2791である、dsRNA。
- センス鎖およびアンチセンス鎖は、15~25の連続するヌクレオチドの領域にわたり互いに相補的である、請求項1に記載のdsRNA。
- センス鎖およびアンチセンス鎖は、30ヌクレオチド長を超えない、請求項1または2に記載のdsRNA。
- 標的配列は、配列番号1181のヌクレオチド143~161、135~153、1535~1553、143~163、144~162、145~163、または150~168である、請求項1~3のいずれか1項に記載のdsRNA。
- dsRNAは、配列番号227~229、261~265、269、343、356、379、385、386、および426からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一であるアンチセンス配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のdsRNA。
- センス配列およびアンチセンス配列は、相補的であり、
a)センス配列は、配列番号13~15、47~51、55、129、142、165、171、172、および212からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか;または
b)アンチセンス配列は、配列番号227~229、261~265、269、343、356、379、385、386、および426からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
請求項1に記載のdsRNA。 - dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
a)配列番号13および227;
b)配列番号51および265;
c)配列番号165および379;
d)配列番号14および228;
e)配列番号15および229;
f)配列番号47および261;
g)配列番号48および262;
h)配列番号49および263;
i)配列番号50および264;
j)配列番号55および269;
k)配列番号129および343;
l)配列番号142および356;
m)配列番号171および385;
n)配列番号172および386;または
o)配列番号212および426
のヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載のdsRNA。 - dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
a)配列番号13および227;
b)配列番号51および265;
c)配列番号165および379;
d)配列番号14および228
e)配列番号15および229;または
f)配列番号171および385
のヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載のdsRNA。 - dsRNAは、1つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、該1つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、2’-デオキシ-2’-フルオロ-リボヌクレオチド、2’-デオキシリボヌクレオチド、または2’-O-メチル-リボヌクレオチドである、請求項1~8のいずれか1項に記載のdsRNA。
- dsRNAは、そのセンスまたはアンチセンス鎖の3’末端に反転2’-デオキシリボヌクレオチドを含む、請求項1~9のいずれか1項に記載のdsRNA。
- センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、
(a)1つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む5’オーバーハング;および/または
(b)1つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む3’オーバーハング
をさらに含む、請求項1~10のいずれか1項に記載のdsRNA。 - dsRNA中のオーバーハングは、2または3つのヌクレオチドを含む、請求項11に記載のdsRNA。
- dsRNA中のオーバーハングは、1つまたはそれ以上のチミンを含む、請求項11または12に記載のdsRNA。
- センス配列およびアンチセンス配列は、交互の2’-O-メチルリボヌクレオチドおよび2’-デオキシ-2’-フルオロリボヌクレオチドを含む、請求項1~13のいずれか1項に記載のdsRNA。
- a)センス鎖は、配列番号441~443、475~479、483、557、570、593、599、600、および640からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み;ならびに/または
b)アンチセンス鎖は、配列番号655~657、689~693、697、771、784、807、813、814、および854からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
請求項1に記載のdsRNA。 - dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
a)配列番号441および655;
b)配列番号479および693;
c)配列番号593および807;
d)配列番号442および656;
e)配列番号443および657;
f)配列番号475および689;
g)配列番号476および690;
h)配列番号477および691;
i)配列番号478および692;
j)配列番号483および697;
k)配列番号557および771;
l)配列番号570および784;
m)配列番号599および813;
n)配列番号600および814;または
o)配列番号640および854
のヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載のdsRNA。 - dsRNAは、リンカーを用いて、または用いずに1つまたはそれ以上のリガンドとコンジュゲートされている、請求項1~16のいずれか1項に記載のdsRNA。
- リガンドは、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)であり、dsRNAは、1つまたはそれ以上のGalNAcとコンジュゲートされている、請求項18に記載のdsRNA。
- dsRNAは、小分子干渉RNA(siRNA)である、請求項1~18のいずれか1項に記載のdsRNA。
- dsRNAの一方または両方の鎖は、1つまたはそれ以上の、
- Bは、複素環式核酸塩基であり、
- L1およびL2の一方は、式(I)の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、L1およびL2の他方は、H、保護基、リン部分もしくは式(I)の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、
- Yは、O、NH、NR1もしくはN-C(=O)-R1であり、式中、R1は、以下であり:
・ 場合により、ハロゲン原子、(C1~C6)アルキル基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基、(C5~C14)ヘテロアリール基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(=J)-O-Z1、-O-C(=J)-Z1、-C(=J)-N(Z1)(Z2)、および-N(Z1)-C(=J)-Z2から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C20)アルキル基(式中、
Jは、OもしくはSであり、
Z1およびZ2のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基である)、
・ 場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基、
・ 基-[C(=O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3(式中
mは、0もしくは1を意味する整数であり、
pは、0から10の範囲の整数であり、
R2は、場合により、(C1~C6)アルキル基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(=K)-O-Z3、-O-C(=K)-Z3、-C(=K)-N(Z3)(Z4)、もしくは-N(Z3)-C(=K)-Z4によって置換された(C1~C20)アルキレン基であり、
Kは、OもしくはSであり、
Z3およびZ4のそれぞれは、独立して、H、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくそれ以上の基によって置換された(C1~C6)アルキル基であり、
R3は、水素原子、(C1~C6)アルキル基、(C1~C6)アルコキシ基、(C3~C8)シクロアルキル基、(C3~C14)ヘテロ環、(C6~C14)アリール基もしくは(C5~C14)ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、もしくは
R3は、細胞標的化部分である)、
- X1およびX2はそれぞれ、独立して水素原子、(C1~C6)アルキル基であり、
- Ra、Rb、RcおよびRdのそれぞれは、独立して、Hもしくは(C1~C6)アルキル基である、
請求項1~19のいずれか1項に記載のdsRNA。 - 1つまたはそれ以上の式(I)の化合物を含み、式中、Yは、
a)R1が、非置換(C1~C20)アルキル基である、NR1;
b)R1が、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換(C1~C16)アルキル基である、NR1;
c)R1が、場合により、ハロゲン原子および(C1~C6)アルキル基から選択される1つもしくはそれ以上の基によって置換された(C3~C8)シクロアルキル基である、NR1;
d)R1が、シクロヘキシル基である、NR1;
e)R1が、(C6~C14)アリール基によって置換された(C1~C20)アルキル基である、NR1;
f)R1が、フェニル基によって置換されたメチル基である、NR1;
g)R1が、場合により置換された(C1~C20)アルキル基である、N-C(=O)-R1;または
h)R1が、メチルまたはペンタデシルである、N-C(=O)-R1
である、請求項20に記載のdsRNA。 - 1つまたはそれ以上の式(I)の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中、Bは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリンからなる群から選択される、請求項20または21に記載のdsRNA。
- R3は、N-アセチル-ガラクトサミン、または薬学的に許容されるその塩である、請求項20~23のいずれか1項に記載のdsRNA。
- 表Aの1つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、請求項20~24のいずれか1項に記載のdsRNA。
- 2から10個の式(I)の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項20~25のいずれか1項に記載のdsRNA。
- 2から10個の式(I)の化合物は、センス鎖上にある、請求項26に記載のdsRNA。
- センス鎖は、5’末端に2から5つの式(I)の化合物を含み、および/または3’末端に1から3つの式(I)の化合物を含む、請求項20~27のいずれか1項に記載のdsRNA。
- a)センス鎖の5’末端にある2から5つの式(I)の化合物は、lgT3および/もしくはlgT7を含み、場合により、3つの連続したlgT3ヌクレオチドを含む;ならびに/または
b)センス鎖の3’末端にある1から3つの式(I)の化合物は、lT4もしくはlT3を含み、場合により、2つの連続したlT4を含む、請求項28に記載のdsRNA。 - リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル-ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、または薬学的に許容されるその塩からなる群から独立して選択される1つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基を含む、請求項1~29のいずれか1項に記載のdsRNA。
- 表1~3のdsRNAから選択される、請求項1に記載のdsRNA。
- a)センス鎖は、配列番号858、902、907、911、915、934、970、979、および988からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか;または
b)アンチセンス鎖は、配列番号1020、1064、1069、1073、1077、1096、1132、1141、および1150からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のdsRNA。 - dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
a)配列番号858および1020;
b)配列番号902および1064;
c)配列番号907および1069;
d)配列番号911および1073;
e)配列番号915および1077;
f)配列番号934および1096;
g)配列番号970および1132;
h)配列番号979および1141;または
i)配列番号988および1150
のヌクレオチド配列を含む、請求項32に記載のdsRNA。 - 請求項1~33のいずれか1項に記載のdsRNAおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- ANGPTL3発現を阻害することを必要とするヒトにおいてANGPTL3発現を阻害する際に使用するための、請求項1~33のいずれか1項に記載のdsRNAまたは請求項34に記載の組成物。
- ヒトの肝臓におけるANGPTL3遺伝子の発現は、dsRNAによって阻害される、請求項35に記載の使用するためのdsRNAまたは組成物。
- ANGPTL3関連状態を処置または予防することを必要とするヒトにおいてANGPTL3関連状態を処置または予防する際に使用するための、請求項1~36のいずれか1項に記載のdsRNAまたは請求項34に記載の組成物。
- ANGPTL3関連状態は、脂質代謝障害である、請求項37に記載の使用するためのdsRNAまたは組成物。
- 脂質代謝障害は、高トリグリセライド血症である、請求項38に記載の使用するためのdsRNAまたは組成物。
- 1つまたはそれ以上のANGPTL3関連状態を処置および/または予防する方法であって、請求項1~33のいずれか1項に記載の1つもしくはそれ以上のdsRNAおよび/または請求項34に記載の1つもしくはそれ以上の医薬組成物を投与することを含む方法。
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