JP2023544449A - コラーゲンハイブリダイジングペプチドを使用してコラーゲン含有量を決定するための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、コラーゲンハイブリダイジングペプチドを使用してコラーゲン含有量を決定するための方法を提供する。本開示は、破壊されたコラーゲン（例えば、トリプルヘリックス性が破壊されたコラーゲン）及び／又は総コラーゲンの量を定量するための方法を提供する。本開示は、破壊されたコラーゲン（例えば、トリプルヘリックス性が破壊されたコラーゲン）の量を総コラーゲンの一部分として定量するための方法を提供する。【選択図】 図１

Description

［連邦政府資金による研究に関する記載］
[0001]本発明は、アメリカ合衆国保健福祉省のアメリカ国立衛生研究所によって付与された２Ｒ４４ＯＤ０２１９８６－０２の下での政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。

［分野］
[0002]本開示は、ダメージを受けたコラーゲン及びコラーゲンの含有量を定量するための方法に関する。

［背景］
[0003]細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、正常なプロセス及び病理学的プロセスの調節において基本的な役割を有する。ＥＣＭで見られる、最も多く発現される構成要素は、コラーゲンである。コラーゲンのトリプルヘリックス構造は高度に保存されていることが知られているが、しかし、ある特定の病的状態では、コラーゲンのトリプルヘリックス構造は破壊されている場合がある。多くの場合、状態の重症度は、コラーゲン破壊の程度又は量と相関し得る。コラーゲン破壊を定量するための既存の技術は、数日若しくは数週間を要し得るか、又は複雑な染色手順を伴う。さらに、この技術が正確に行われたとしても、結果の分析には訓練された病理学者又は技術者が必要であり得、このことは、個人間又は個人内の変動性を分析に導入する可能性がある。したがって、試料中のダメージを受けたコラーゲン又は総コラーゲンの含有量を決定し得る、迅速で、信頼性があり、及び／又は自動化された技術が必要とされている。

［参照による組み込み］
[0004]本明細書における全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照によって組み込まれることが具体的且つ個別に示されたのと同程度に、参照によって組み込まれる。本明細書における用語と組み込まれた参考文献における用語との間で矛盾がある場合には、本明細書における用語が優先される。

図１は、コラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）で処置した組織試料中の変性した（ダメージを受けた／リモデリング）コラーゲンの相対的含有量の計算を可能にする、変性したコラーゲンの含有量（左）及び総コラーゲン（右）を決定するための典型的なプロセスを示す図である。 図２Ａ～Ｃは、線維性のヒト肝臓組織の免疫組織化学画像を示す図である。（Ａ）熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）を伴わず、その後、５０ｍｓの曝露時間でＣＨＰでの処置を行った、健康な肝臓組織の画像を示しており、この場合、観察可能なコラーゲンシグナルは得られていない。（Ｂ）ＨＩＥＲを伴い（左）、及びＨＩＥＲを伴わず（右、ネイティブ）、その後、ＣＨＰでの処置を行った、線維性の肝臓組織の１倍倍率の画像を示している。（Ｃ、上部）ＨＩＥＲを伴い（左）、及びＨＩＥＲを伴わず（右）、その後、ＣＨＰでの処置を行った、パネルＢで同定されている線維性の肝臓組織のはめ込み領域の５倍倍率の画像を示している。（Ｃ、下部）ＨＩＥＲを伴い（左）、及びＨＩＥＲを伴わず（右）、その後、ＣＨＰでの処置を行った、パネルＣの上列で同定されている線維性の肝臓組織のはめ込み領域の２０倍倍率の画像を示している。ＨＩＥＲで処理された試料は、変性コラーゲンに対応するＣｙ５シグナルの増大を示している。 図３Ａ～Ｂは、ヒトの線維性肝臓組織の免疫組織化学画像を示す図である。（Ａ）ＨＩＥＲ（上部）とその後のＣＨＰでの処置とを伴う線維性の肝臓組織、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で染色された線維性の肝臓組織、並びにマッソントリクローム（マッソン）で染色された線維性の肝臓組織の１倍倍率の画像を示している。（Ｂ、上部）ＨＩＥＲとその後のＣＨＰでの処置とを伴う（左）、ＨＥ染色を伴う（中央）、及びマッソントリクロームを伴う（右）、パネルＡで同定されている線維性の肝臓組織のはめ込み領域の５倍倍率の画像を示している。（Ｂ、下部）ＨＩＥＲとその後のＣＨＰでの処理とを伴う（左）、ＨＥ染色を伴う（中央）、及びマッソントリクロームを伴う（右）、パネルＢの上列で同定されている線維性の肝臓組織のはめ込み領域の２０倍の倍率画像を示している。 図４は、誘導エピトープ賦活化後に２０μＭのＲ－ＣＨＰで染色した、異なる厚さの正常なウサギの皮膚切片を示す図である。組織切片の厚さが増大するにつれ、より大きなＣＨＰ強度が見られる。ＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩを使用するシグナル定量は、組織の厚さとシグナル強度との間のほぼ線形の相関を示している。 図５は、マッソントリクローム（ＭＴ）、ヘロビチ（Ｈｅｒｏｖｉｃｉ’ｓ）染色、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩＩ抗体カクテル（Ｃｏｌ Ｉ／ＩＩＩ）、並びにビオチン標識されたＣＨＰ（Ｂ－ＣＨＰ）を含む５つの異なる方法を使用して染色されたマウス肝臓の代表的な顕微鏡写真を示す図である。いくつかの切片が、健康な（コントロール）マウス肝臓（Ａ～Ｅ）から、及びＣＣｌ_４の注射の８週間後の線維性のマウス肝臓から（Ｆ～Ｊ）採取された。全ての写真において矢印によって同定されているコラーゲンは、ＭＴでは青に、ＰＳＲではピンク／赤に、ヘロビチでは成熟コラーゲンでピンク／赤に、若いコラーゲンは青に、Ｃｏｌ Ｉ／ＩＩＩカクテルでは濃い茶色から薄い茶色に、そしてＣＨＰ染色（総コラーゲン）では濃い茶色に染色されている。目的の他の特徴は、Ｃ－中心静脈、Ｈ－肝細胞、Ｐ－門脈三つ組として標識されている。倍率は４０倍であり、スケールバー＝２００μＭであった。 図６は、画像分析ソフトウェアによるコラーゲンの定量を示す図である。コラーゲンは全ての試料において検出され、ナイーブ試料では検出された全コラーゲンは少なく、疾患を有する試料では非常に多くの量のコラーゲンが検出された。 図７は、自動画像分析を使用する、線維性肝臓試料（ＣＣｌ４、８週間）において検出されたコラーゲンの代表的な顕微鏡写真を示す図である。全ての画像において、緑色の点線は組織の外縁を表しており、黒の点線は分析から除外された区域を示している。上列の画像は分析前の画像であり、下列の画像は、画像分析によって強調されたコラーゲンを示している（ＰＳＲは赤、全ての他のものは明るい緑色）。 図８は、ビオチン標識されたＣＨＰ（Ｂ－ＣＨＰ）を使用して染色されたヒト肝臓生検対の代表的な写真を示す図である。対象は、病理学者によって、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のスコア付けをされた。Ｂ－ＣＨＰは、集められた、ＮＡＦＬＤの全ステージにわたる、進行が中程度の又は遅い患者と比較した、進行が速い人における疾患のリモデリングに起因する変性コラーゲンの含有量の差を検出することができた。これらの差は、区域の陽性度×強度の乗算を利用する修正Ｈスコアを使用する半定量的評価で、統計的に有意であることが分かった。 図９は、Ｂ－ＣＨＰで処置されたヒト肝臓生検における、総コラーゲン（上列）及び疾患進行から生じたリモデリングされたコラーゲン（下列）を示す代表的な写真を示す図である。肝臓生検対を、ＮＡＦＬＤスペクトルにわたる対象から得、病理学者の評価に基づいてスコア付けした。ＣＨＰを介する総コラーゲン染色を使用して、病理学者は、ステージ１とステージ４と（ｐ値＝０．００００１）、及びステージ２とステージ４と（ｐ値＝０．２３７）、及びステージ３とステージ４と（ｐ値＝０．０１９７）で、総コラーゲンとリモデリングされたコラーゲンとの間の比率を計算することによって、ステージ１、２、３、及びステージ４の間を区別することができた。

[0014]上記で同定された図面は本明細書において開示されている実施形態を示しているが、考察において記載されているように、他の実施形態もまた検討される。本開示は、限定ではなく代表の提示によって、実例となる実施形態を示している。本明細書において開示されている実施形態の原理の範囲及び趣旨に含まれる多くの他の修正及び実施形態が、当業者によって案出され得る。

［詳細な説明］
概説
[0015]総コラーゲン含有量の評価は、既存の方法によって、例えば、トリプシン－ヒドロキシプロリンアッセイを使用することによって行われ得る。しかし、この方法は完了までに最大数日間を要し得、（例えば、結果を損なわせる可能性がある複数回のピペッティングに起因して）誤差を生じやすい傾向があるため、取り扱いが難しい。さらに、この方法は試料を完全に破壊するため、試料内での変性コラーゲンの分布についての空間的情報を得るために使用することができない。逆に、本明細書において記載されるある特定の方法は、コラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を使用して、組織の破壊も限定しながら、組織試料内の総コラーゲン含有量を迅速且つ容易に決定する。ＣＨＰは、例えば、参照によってその全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１６４２２０号において開示されている。Ｌｉｎら、「Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８年１１月２６日において示されているように、ＣＨＰは、トリプシン－ヒドロキシプロリンアッセイに等しい能力で、ダメージを受けた又は変性したコラーゲンの濃度を検出することができる。

[0016]非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）などの疾患における線維症の重症度を判定するための現在のゴールドスタンダードは、生検を採取し、組織病理学的又は免疫組織化学的（ＩＨＣ）技術を使用して組織を評価することである。組織生検内のコラーゲンを同定するために、いくつかの染色を使用することができる（例えば、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）／ファストグリーン、マッソントリクローム、及びヘロビチ染色）。ダメージを受けたコラーゲンは、染色の不存在によって又は訓練された病理学者による比色分析の評価によって同定され得る。コラーゲンのダメージの間接的指標である前述の染色に加えて、これらの染色もまた、多くのステップを伴う複雑な染色手順を要し、一部は特別な画像化装置（偏光）の使用を要し、そして、コラーゲン含有量を評価するための客観的画像分析方法は存在していない。トリクローム染色（マッソン又はマロリー）は、コラーゲン含有量を過小評価することが分かっている。この方法は、３つの異なる色素を利用して、細胞核、コラーゲン性タンパク質、及び細胞質を染色する。無傷のコラーゲンは青又は緑色に染色され、ケラチン及び筋肉線維は赤に染色され、細胞質はピンクに染色され、そして細胞核は茶色又は黒に染色される。ダメージを受けたコラーゲンは、構造がダメージを受けているために、利用可能な色の間の混在となるため、区別するのがより困難であり、したがって、客観的画像分析方法では、正確な領域を同定することは困難である。シリウスレッド／ファストグリーン染色は、トリクローム染色での課題を克服するために開発され、偏光によって、より良い可視化をもたらすことができた。シリウスレッド／ファストグリーン染色はコラーゲン線維及び線維束を赤く染色するが、非コラーゲン性タンパク質（すなわち、フィブロネクチン、ラミニン）は緑／黄色に染色される。この染色手順は、特異性、感度、及び解像度を増大させるために偏光を利用する。しかし、ダメージを受けたコラーゲンは、無傷のコラーゲン原線維の方向を失っているため、ダメージを受けたコラーゲンは暗い領域として現れる。ピクロシリウスレッドは長い複屈折分子であり、組織において、ピクロシリウスレッドは、コラーゲンだけではなく様々な分子に結合する。しかし、コラーゲンに結合すると、ピクロシリウスレッドはコラーゲン原線維と平行の方向となり、これによって、コラーゲン原線維の天然の複屈折を大きく増強させる。したがって、原線維性コラーゲン／シリウスレッド複合体は、シリウスレッド及び他のタンパク質で作られた複合体よりも複屈折性である。シリウスレッドが結合した原線維性コラーゲンはこうして偏光の下で検出され得、偏光の下で当該原線維性コラーゲンは明るく見え、暗い／黒いままである組織の残り部分と比較して鮮明なコントラストがある。コラーゲンがダメージを受けている場合、コラーゲンは複屈折を有さない。最後に、ヘロビチ染色は、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとを、また、若いコラーゲン又は古いコラーゲンを区別することができる。若いコラーゲンは青く染色され、成熟コラーゲンは赤く染色され、細胞核は青／黒に染色される。しかし、この染色は、コラーゲンが変性している組織では非常に変化しやすく、染色用の色を多く使用することで、不定の結果が生じ得る。

[0017]これらの染色の評価は、組織の呈色を評価するために目が訓練された病理学者を必要とし、各染色の着色は誤って解釈されやすく、観察者間及び観察者内の変動をもたらす。これは一部には、ダメージを受けたコラーゲンが非構造化タンパク質であり、また、ほとんどの染色又は抗体が非構造化３Ｄエピトープを標的化することが困難であり、これによって、部分的に染色された又は不完全な染色を有する領域が生じるという事実に起因する。したがって、これらの染色方法を使用する場合には、病理学者は、染色を有さない区域に基づいてダメージコラーゲンの領域を同定する（例えば、マッソントリクローム染色を使用して）。

[0018]組織を染色するための別の方法は、ＩＨＣのために抗体を利用することによる。抗体は非常に特異的であることは知られているが、主な困難の１つは、特異的な又は非特異的なバックグラウンドを取り除くことであり、これは多くの場合、適用の前に、複数回のブロックステップ、洗浄ステップ、及び抗原賦活化ステップを必要とする。さらに、抗体は、うまく結合するために、規定された無傷の３Ｄエピトープを必要とし、そのため、変性コラーゲンなどのダメージを受けた非構造化タンパク質への結合を試みることは、多くの場合、不可能である。１つの市販されている抗体は、切断されたＩ型又はＩＩ型コラーゲンセグメントを検出し得る、Ｃ１，２Ｃ抗体（Ｃｏｌ ２ ３／４Ｃ短鎖抗体）ウサギポリクローナル抗体（Ｉｂｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、モントリオール、ＣＡ）である。より詳細には、当該抗体は、ＩＩ型コラーゲンのコラーゲナーゼ（ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－１３）切断によって生じる４分の３片のカルボキシ末端におよそ８個のアミノ酸からなる配列（ＧＰＰＧＰＱＧ）を有するα鎖断片を認識する。しかし、いずれかのＭＭＰによるさらなる切断の機会、又は、酵素の切断反応速度が速いことを理由に他の酵素が、抗体が結合し得る前に当該ペプチドを切断し得ることに起因して、及びその区域からの短い断片のクリアランスに起因して、この断片の検出は一貫しておらず、ダメージを完全に伝えるわけではない。本開示の方法におけるＣＨＰはα鎖の二次構造モチーフを認識するため、これらＣＨＰは、（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３の配列又はそれよりも長い（例えば（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_４）配列を有するあらゆる切片にハイブリダイズすることができる。加えて、本明細書において記載されるＣＨＰは、ダメージのメカニズム（すなわち、熱による、機械的な、化学的な、又は酵素による）に関わらず、あらゆるコラーゲン型（すなわち、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型など）とハイブリダイズすることができ、これによってＣＨＰは、組織切片内のコラーゲンダメージの検出のために特に優れたものとなっている。

[0019]ＣＨＰの使用は、既存の技術に伴う問題に直接対処する。一態様では、本開示は、（あらゆるタイプの）ダメージを受けたコラーゲンを単一のステップで単一の染色として高い特異性で直接染色する、ＣＨＰに基づく方法を提供し、また、組織染色の呈色を評価する必要性を伴わずに、ダメージを受けたコラーゲンの領域を定量するため又は総コラーゲン含有量を決定するための、客観的画像化分析方法を提供する。ビオチン標識されたＣＨＰを、光学顕微鏡（例えば、染色された試料を画像化及びスコアリングするために病理学者によって使用される現在の器具）又は蛍光強度を読み取るための蛍光顕微鏡と共に使用することができる。さらに、ＣＨＰに基づく方法は、他の染色方法が複数のステップ及び染色（例えば、マッソントリクローム）を必要とすることに対し、単一の染色試薬を使用し得る。

[0020]別の態様では、本開示の方法は、熱を介する染色プロセスにおいて、ダメージを受けたコラーゲン及び総コラーゲンの両方を染色し、これによって、代替的な染色方法（例えば、ピクロシリウスレッド）で見られるような、無傷のコラーゲンとダメージを受けたコラーゲンとの境界面での不完全な又は部分的な染色を避ける。本開示の方法は、組織切片中の総コラーゲン含有量を染色するため、及びソフトウェア（例えば、ＩｍａｇｅＪ）を使用してＣＨＰの蛍光強度を評価するために、どのようにＣＨＰが使用され得るかを示している。ある特定の実施形態では、医師は、疾患の進行の間の様々な時点での総コラーゲン含有量を比較することによって、線維性の状態の進行をモニタリングすることができる。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＣＨＰ染色技術を使用して組織切片内の全てのコラーゲン型を完全に定量する方法を記載している。ある特定の実施形態では、ＣＨＰは、組織切片内のダメージを受けたコラーゲンの含有量を迅速且つ正確に同定し、組織内のダメージのパーセントを決定する（例えば、総コラーゲン含有量を、ダメージを受けたものの１００％として使用することによって）ために使用される。

定義
[0021]本明細書において使用される場合、「コラーゲン」は、あらゆる組織型（例えば、骨、真皮、腱、靭帯など）に由来し得る。コラーゲンは、ポリプロリンＩＩ様構造の３つのアルファ鎖が共にフォールディングしてトリプルヘリックスとなっている分子を指し得る。加えて、コラーゲンという用語は、Ｉ型～ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲン及び細菌コラーゲンを含むトリプルヘリックス領域を有するあらゆるタンパク質に適用され得る。用語「コラーゲン」は、本明細書において使用される場合、人工コラーゲン及び処理されているか又は他の方法で修飾されているコラーゲンを含む、全ての形態のコラーゲンを指し得る。一部の実施形態では、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＸ型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲン、及びこれらの組合せから選択される。

[0022]本明細書において使用される場合、「コラーゲン含有量」は、コラーゲン含有試料（例えば、組織）中のコラーゲンの量を指し得る。コラーゲン含有量は、試料中のコラーゲンの重量、試料中のコラーゲンの容積、試料中のコラーゲンの総量に対する試料中の特定のタイプのコラーゲン（例えば、破壊された又は変性したコラーゲン）の割合を指し得る。一部の実施形態では、コラーゲン含有量の決定は、試料中の総コラーゲンの量の決定を含み得る（例えば、ネイティブコラーゲンを意図的に変性させることによる）。他の実施形態では、コラーゲン含有量の決定は、試料中の破壊されたコラーゲンの量の決定（例えば、試料中の総コラーゲンに対する割合として）を含み得る。「変性した」コラーゲンは、もはやトリプルヘリックス形態ではないコラーゲンを指す。

[0023]本明細書において使用される場合、「試料」は、生物学的生命体の一部を指し得る。試料は、細胞、組織、臓器、又は身体の一部であり得る。試料は、生物学的生命体から（すなわち、エクスビボで）採取又は単離され得、例えば、対象から除去された腫瘍試料であり得る。典型的な生体試料には、限定はしないが、皮膚試料、筋肉試料、骨格試料（骨）、ニューロン試料、結合組織試料、臓器組織試料（例えば、脳、肺、肝臓、膀胱、腎臓、心臓、胃、腸など）、腫瘍試料、がん性試料、生体液（例えば、血清試料又は尿試料）、又はこれらに類するものが含まれる。用語「試料」としてはまた、上記の試料の混合物も含まれる。用語「試料」としてはまた、未処置の又は前処置された（又は前処理された）生体試料も含まれる。一部の実施形態では、試料は、対象に由来する１つ又は複数の細胞を含み得る。一部の実施形態では、試料は、実質的に又は完全に無傷である（例えば、インビボでの組織に類似している形態学）。他の実施形態では、試料は、処理されていてよい（例えば、溶液中に砕かれている又はホモジナイズされていてよい）。さらに別の実施形態では、試料は、人工又は合成のものであり得る。

[0024]本明細書において使用される場合、「コラーゲン含有試料」又は「コラーゲン含有組織」は、コラーゲンを含有する、哺乳動物の身体から単離され得る皮膚、筋肉、及びこれらに類するものを指し得る。用語「コラーゲン含有試料」はまた、それが有するコラーゲン又はコラーゲン含有材料が身体の外側で組み立てられた又は製造された、「合成的に」産生された組織（例えば、人工組織）も包含する。「コラーゲン含有試料」はまた、均質な溶液にホモジナイズされている試料（例えば、組織試料又は血清若しくは尿などの生体液）も指し得る。

[0025]本明細書において使用される場合、「破壊されたコラーゲン」は、コラーゲンタンパク質の３つのアルファ鎖が、これら３つのアルファ鎖がフォールディングするべきであることが配列から示唆されている領域においてトリプルヘリックスを少なくとも部分的に形成していないコラーゲン分子又はそのマトリクスを指し得る。「破壊されたコラーゲン」は、コラーゲンタンパク質の３つのアルファ鎖が少なくとも部分的にほどけている、コラーゲン分子又はそのマトリクスを指し得る。破壊されたコラーゲンは、破壊された完全長コラーゲン又はコラーゲンの断片であり得る。コラーゲンの断片は、完全長コラーゲン配列よりも短いあらゆるコラーゲン配列であり得る。断片はまた、当該断片が顕著なネイティブ構造を有さなくなるか又は顕著なネイティブなトリプルヘリックス形態を伴わない領域を有するようになるサイズのものであり得る。

[0026]本明細書において使用される場合、「変性コラーゲン」は、熱による、機械的な、化学的な、酵素による、酸による、又は他の影響によって生じる、そのネイティブなトリプルヘリックス形態ではもはやないコラーゲンを指し得る。変性コラーゲンは、変性した完全長コラーゲン又はコラーゲンの断片であり得る。コラーゲンの断片は、完全長コラーゲン配列よりも短いあらゆるコラーゲン配列であり得る。断片はまた、当該断片が顕著なネイティブ構造を有さなくなるか又は顕著なネイティブなトリプルヘリックス形態を伴わない領域を有するようになるサイズのものであり得る。

[0027]本明細書において使用される場合、「コラーゲンハイブリダイジングペプチド」又はＣＨＰは、配列Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３～２０を有するペプチドであって、式中、Ｓがペーサー分子であり、ｍが０～１０の整数であり、Ｇｌｙがグリシンであり、そしてＸ及びＹの少なくとも１つがプロリン、修飾プロリン、及び／又はヒドロキシプロリンである、ペプチドを指し得る。一実施例では、ＣＨＰは、式中、Ｓがスペーサー分子であり、ｍが０～１０の整数であり、Ｘがプロリン又は修飾プロリンであり、Ｇｌｙがグリシンであり、そしてＨｙｐがヒドロキシプロリンである、Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｈｙｐ）_９であり得る。

[0028]本明細書において使用される場合、「スペーサー分子」は、検出可能な部分及び／又はＣＨＰに結合している１つ又は複数の分子又はアミノ酸を指し得る。一実施形態では、スペーサーは、Ｓ_ｍと呼ばれる任意の１つ又は複数のアミノ酸又はそれらの誘導体であり、ここで、ｍは０～１０の整数である。

[0029]一態様では、ＣＨＰは、検出可能な部分で標識されていてよい。本明細書において使用される場合、「検出可能な部分」は、ＣＨＰが標的に結合すると検出可能なシグナルを生じさせ得る、ＣＨＰに結合している分子を指し得る。検出可能なシグナルは、光学画像化システムを使用して画像化され得る光学的シグナルであり得る。光学的シグナルは、１つ又は複数の光波長の光強度の変化によって生じ得る。検出可能な部分は、ＣＨＰに直接的に若しくは間接的に結合し得るか、ハイブリダイズし得るか、コンジュゲートし得るか、又は共有結合し得る。一部の実施形態では、検出可能な部分は、蛍光分子又は化学発光分子である。ＣＨＰは、検出可能な部分を介して光学的に検出することができる。結合は、共有結合又は非共有結合（例えば、イオン相互作用、ファンデルワールス力などを介する）であり得る。共有結合が生じているところでは、検出可能な部分はリンカーを介してＣＨＰに結合することができる。一部のケースにおいて、リンカーは切断可能であり、例えば、光切断可能である（例えば、紫外線の下で切断可能である）か、化学的に切断可能であるか（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤を介して）、又は酵素によって切断可能である（例えば、エステラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、又はプロテアーゼを介して）。一部の実施形態では、標識されたＣＨＰは、以下の式Ｉ：
Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３～２０（式Ｉ）
を含み得、式中、Ｌは１つ又は複数の検出可能な部分であり、Ｓはスペーサー分子であり、そしてｍは０～１０の整数であり、Ｇｌｙはグリシンであり、そしてＸ及びＹの少なくとも１つはプロリン、修飾プロリン、及び／又はヒドロキシプロリンである。一部の実施形態では、ｍは０ではない。一部の実施形態では、ｍは１である。一部の実施形態では、ｍは２である。一部の実施形態では、ｍは３である。

[0030]本明細書において使用される場合、用語「抗原」は、特異的な液性又は細胞性免疫の産物、例えば抗体分子又はＴ細胞受容体が特異的に結合し得る化合物、組成物、又は物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、及びホルモン、並びに、複雑な炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、核酸、及びタンパク質などの高分子を含む、あらゆるタイプの分子であり得る。

[0031]本明細書において使用される場合、用語「固定された試料」は、細胞の形態学的及び／又は生化学的特徴並びに構造を、試料が生命体から得られる前に当該特徴及び構造が存在していた通りに保存することを促進するように処置されている試料を指す。固定された試料は、試料をホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又はグルタルアルデヒドなどのアルデヒド系固定液と接触させることによって準備され得る。固定された試料は、試料をメタノール、エタノール、又は酢酸を含むものなどのアルコールベースの固定液と接触させることによって準備され得る。或いは、固定された試料は、試料を四酸化オスミウム若しくは過マンガン酸カリウムなどの酸化剤と接触させることによって準備され得るか、又は固定された試料は、塩化第二水銀若しくはピクリン酸などの金属ベースの固定液を使用して準備され得る。特定の実施形態では、固定された試料は、細胞を含む試料を中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）溶液と接触させることによって準備され、前記溶液は、約２％～約６％、又は約３．７％のホルマリン（１０％ホルムアルデヒド及び１％メタノール）である溶液として典型的には使用される。

[0032]本明細書において使用される場合、用語「スライド」は、生物学的標本が分析のために置かれる、あらゆる適切な寸法のあらゆる基板（例えば、全体が又は部分的にガラス、クオーツ、プラスチック、シリコンなどで作製されている基板）を、またより詳細には、標準的な３インチ（７．６２ｃｍ）×１インチ（２．５４ｃｍ）の顕微鏡スライド、又は標準的な７５ｍｍ×２５ｍｍの顕微鏡スライドなどの「顕微鏡スライド」を指す。

[0033]本明細書において使用される場合、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されていない限り、複数形の言及を含む。同様に、「又は」という語は、文脈から別段のことが明らかに示されていない限り、「及び」を含むものである。

[0034]本発明の明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、１つ又は複数の要素の列挙への参照における「少なくとも１つ」という表現は、要素の列挙内の要素のうちの任意の１つ又は複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素の列挙内の具体的に列挙されているそれぞれの及び全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、また、要素の列挙内の要素のいかなる組合せも排除しないと理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも１つ」という表現が指す、要素の列挙内で具体的に同定されている要素以外にも要素が任意選択で存在し得ることを許容し、後者の要素は、具体的に同定されている前記要素に関係していてもしていなくてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は同等に「Ａ若しくはＢのうちの少なくとも１つ」、又は同等物に「Ａ及び／若しくはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない（及び、Ｂ以外の要素を任意選択で含む）、２つ以上のＡを任意選択で含む少なくとも１つのＡを指し得、別の実施形態では、Ａが存在しない（及び、Ａ以外の要素を任意選択で含む）、２つ以上のＢを任意選択で含む少なくとも１つのＢを指し得、さらに別の実施形態では、２つ以上のＡを任意選択で含む少なくとも１つのＡ、及び２つ以上のＢを任意選択で含む少なくとも１つのＢ（及び他の要素を任意選択で含む）を指す、などである。

[0035]用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びこれらに類するものは、区別せずに使用され、同一の意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、及びこれらに類するものは、区別せずに使用され、同一の意味を有する。具体的には、これら用語の各々は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の米国特許法上の一般的な定義と一致するように定義され、したがって、「少なくとも以下のもの」を意味するオープンタームであると解釈され、また、追加の特徴、限定、態様などを排除するものではないと解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、及びｃを有する装置」は、装置が少なくとも構成要素ａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。同様に、「ステップａ、ｂ、及びｃを伴う方法」という表現は、方法が少なくともステップａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。さらに、ステップ及びプロセスは本明細書において特定の順序で概説され得るが、当業者には、文脈によって特定の順序が明らかに示されていない限り、順序付けられているステップ及びプロセスが変化し得ることが認識されよう。

[0036]本明細書において使用される場合、用語「約」は、明確に示されていてもいなくても、例えば整数、割合、及びパーセンテージを含む数値を指す。用語「約」は一般に、言及された値に等しい（例えば、同一の機能又は結果を有する）と当業者が考えるであろう様々な数値（例えば、言及された値の＋／－５、６、７、８、９、又は１０％）を指す。一部の場合において、用語「約」は、最も近い有効数字に四捨五入されている数値を含み得る。

[0037]本明細書において使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性の全て又はほぼ全ての規模又は程度を示す定性的条件を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約２０％以内を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約１５％以内を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約１０％以内を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約５％以内を意味する。

コラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）及びこれを使用する方法
[0038]コラーゲンは、ほとんど全てのヒト組織で見られる主要な構造タンパク質である。コラーゲンのターンオーバーは天然組織のホメオスタシスに必要であり、したがって、変性コラーゲンは基底レベルで存在する。しかし、過剰なコラーゲンリモデリング（分解又は合成の両方）は、多くのヒト疾患及び損傷と関係していることが多い。ある特定の実施形態では、ＣＨＰは、変性した、分解した、リモデリングしている、又はほどけているコラーゲンに特異的に結合することができ、無傷のコラーゲン分子に対する親和性は有していない、短鎖反復トリペプチドを含む。ＣＨＰは、無傷のコラーゲン分子では利用できない構造的モチーフ（例えば、アルファ鎖のポリプロリンＩＩ様ヘリックス）を認識することによって、ダメージを受けたコラーゲンを区別し得、こうして、ＣＨＰは、非常に安定で長持ちする結合を形成することによって、ハイブリダイゼーションを介してコラーゲンのトリプルヘリックスを再形成する。ある特定の実施形態では、本開示は、総コラーゲン含有量、及び組織の総コラーゲン含有量に基づく組織内のダメージを受けたコラーゲンのパーセントを直接決定するためにＣＨＰを使用する方法を提供する。

[0039]図１は、ＣＨＰを使用する、病理学的組織標本中の分解したコラーゲンの含有量を推定するための本開示の典型的な方法を示している。図１は、どのようにＣＨＰを使用して、熱変性を有するコラーゲンの総量を明らかにし（右）、そしてその後、試料中の分解したコラーゲンの割合をコラーゲンの総量の関数として決定することができるかについての、典型的なプロセスの略図を示している。簡潔に述べると、破壊されたコラーゲンの量を決定するために、組織試料をガラス上に準備し、破壊されたコラーゲンの領域に局在するＣＨＰで染色する。組織試料を、蛍光顕微鏡法を例えば使用して画像化し、蛍光強度を測定する（図１、左）。総コラーゲンの量を決定するために、一連の組織切片又は試料をガラス上に準備し、熱変性及び／又は抗原賦活化（例えば、熱誘導エピトープ賦活化、ＨＩＥＲ）する。その後、試料を、破壊されたコラーゲンを測定する試料と同様に処理する。具体的には、試料をＣＨＰで染色し、画像化する（図１、右）。試料はＨＩＥＲを使用して処理されているため、試料中のコラーゲンは全体的に破壊されており、ＣＨＰの結合を可能にし、試料中の総コラーゲンに対応する光学的シグナルを生じさせる。

[0040]図２Ａ～Ｃは、線維性のヒト肝臓組織の免疫組織化学画像を示している。状態がより重度であるほど、より多くの総コラーゲンが存在することになるため、本開示の方法は、線維性の状態を評価する研究者にとって有用であり得、本方法は、疾患の進行を理解する上での手掛かりとなり得るか、又は診断のためのさらなるバイオマーカーとして機能し得る。コラーゲンの総量は、ＨＩＥＲ後のＣＨＰでの染色によって明らかになり得る。１５０ｍｓの曝露でのネイティブ（非加熱、非ＨＩＥＲ）試料よりも、５０ｍｓでのＨＩＥＲ試料において、顕著に大きいシグナルがある。（Ａ）は、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）を伴わず、その後、５０ｍｓの曝露時間でのＣＨＰでの処置を行った、健康な肝臓組織の画像を示しており、この場合、観察可能なコラーゲンシグナルは得られていない。（Ｂ）は、ＨＩＥＲを伴い（左、ＨＩＥＲ）、及びＨＩＥＲを伴わず（右、ネイティブ）、その後、ＣＨＰでの処置を行った、線維性の肝臓組織の１倍倍率の画像を示している。（Ｃ、上部）は、ＨＩＥＲを伴い（左）、及びＨＩＥＲを伴わず（右）、その後、ＣＨＰでの処置を行った、パネルＢで同定されている線維性の肝臓組織のはめ込み領域の５倍倍率の画像を示している。（Ｃ、下部）は、ＨＩＥＲを伴い（左）、及びＨＩＥＲを伴わず（右）、その後、ＣＨＰでの処置を行った、パネルＣの上列で同定されている線維性の肝臓組織のはめ込み領域の２０倍倍率の画像を示している。ＨＩＥＲで処理された試料は、変性コラーゲンに対応するＣｙ５シグナルの増大を示している。

[0041]図３Ａ～Ｂは、本開示の方法（ＨＩＥＲ）、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）、又はマッソントリクローム（マッソン）を使用して染色された線維性の肝臓組織の免疫組織化学画像の比較を示している。（Ａ）は、ＨＩＥＲ（上部）とその後のＣＨＰでの処置とを伴う線維性の肝臓組織、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で染色された線維性の肝臓組織、並びにマッソントリクローム（マッソン）で染色された線維性の肝臓組織の１倍倍率の画像を示している。（Ｂ、上部）は、ＨＩＥＲとその後のＣＨＰでの処置とを伴うパネルＡで同定されている線維性の肝臓組織（左）、ＨＥ染色を伴うパネルＡで同定されている線維性の肝臓組織（中央）、及びマッソントリクロームを伴うパネルＡで同定されている線維性の肝臓組織（右）のはめ込み領域の５倍倍率の画像を示している。（Ｂ、下部）は、ＨＩＥＲとその後のＣＨＰでの処置とを伴うパネルＢの上列で同定されている線維性の肝臓組織（左）、ＨＥ染色を伴うパネルＡで同定されている線維性の肝臓組織（中央）、及びマッソントリクロームを伴うパネルＡで同定されている線維性の肝臓組織（右）のはめ込み領域の２０倍倍率の画像を示している。ＣＨＰ染色（ＨＩＥＲ）をＨ＆Ｅ及びマッソントリクローム染色と比較すると、肝臓における線維性コラーゲンは、ＣＨＰ染色（ＨＩＥＲ）で、より明らかに且つより容易に視覚化され得る。

[0042]ある特定の実施形態では、本開示の方法は、組織切片中のコラーゲンを完全に変性させる、熱を介する抗原賦活化／熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）方法の際の、ＣＨＰの適用を含む。この方法は、様々な厚さの健康なウサギの皮膚組織を使用して成功したことが示されており、結果は、コラーゲン含有量とＣＨＰシグナル強度との間のほぼ線形の相関を示している（図４）。

[0043]ある特定の態様では、本開示は、試料中の総コラーゲン含有量を測定する方法を提供する。一般に、総コラーゲン含有量は、コラーゲン含有試料（例えば、組織）中のコラーゲンの総量を指し得る。コラーゲン含有量は、試料中のコラーゲンの重量、試料中のコラーゲンの容積、試料中のコラーゲンの総量に対する試料中の特定のタイプのコラーゲン（例えば、破壊された又は変性したコラーゲン）の割合を指し得る。一部の実施形態では、コラーゲン含有量の決定は、試料中の総コラーゲンの量の決定を含み得る（例えば、ネイティブなコラーゲンを意図的に変性させることによる）。他の実施形態では、コラーゲン含有量の決定は、試料中の破壊されたコラーゲンの量の決定（例えば、試料中の総コラーゲンに対する割合として）を含み得る。

[0044]一部の実施形態では、組織試料は、状態を有する対象から得られる。一部の実施形態では、状態は、ＩＩＩ型糖原病（ＧＳＤ ＩＩ）、ＩＶ型糖原病（ＧＳＤ ＶＩ）、ＩＸ型糖原病（ＧＳＤ ＩＸ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝炎、強皮症、アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、アテローム性動脈硬化症、喘息、線維症、心臓線維症、臓器移植線維症、筋肉線維症、膵臓線維症、骨髄線維症、肝線維症、肝臓及び胆嚢の硬変、脾臓の線維症、腎臓線維症、肺線維症、特発性肺線維症、びまん性実質性肺疾患、特発性間質性線維症、びまん性間質性線維症、間質性肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎、間質性肺疾患、慢性間質性肺疾患、急性間質性肺炎、過敏性肺炎、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、リンパ球性間質性肺炎、塵肺、珪肺症、気腫、間質性線維症、サルコイドーシス、縦隔線維症、心臓線維症、心房性線維症、心内膜心筋線維症、心筋梗塞、腎臓線維症、慢性腎臓病、ＩＩ型糖尿病、黄斑変性、加齢性黄斑変性、ケロイド病変、肥厚性瘢痕、腎性全身性線維症、注射線維症、外科手術の合併症、線維性の慢性同種移植血管障害及び／若しくは移植臓器における慢性拒絶反応、虚血性再灌流障害に伴う線維症、精管結紮後疼痛症候群、関節リウマチに伴う線維症、関節線維化、デュピュイトラン病、皮膚筋炎－多発性筋炎、混合性結合組織病、口腔の線維性の増殖性病変、線維化性腸狭窄、クローン病、グリア性瘢痕、軟膜線維症、髄膜炎、全身性エリテマトーデス、放射線被爆に起因する線維症、***嚢胞破裂に起因する線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、創傷、創傷治癒、加齢皮膚、変形性関節症、又はこれらの症候若しくは後遺症、又は細胞外マトリクス構成要素の破壊（例えば、コラーゲンのトリプルヘリックス性の破壊）をもたらす他の疾患若しくは状態からなる群から選択される。

[0045]一部の実施形態では、試料は組織試料を含み、組織試料は、約１マイクロメートル（μｍ）～約１００μｍの間の厚さを有する。一部の実施形態では、試料は組織試料を含み、組織試料は、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、約１ミリメートル（ｍｍ）、約１．２ｍｍ、約１．４ｍｍ、約１．６ｍｍ、約１．８ｍｍ、約２ｍｍ、約２．２ｍｍ、約２．４ｍｍ、約２．６ｍｍ、約２．８ｍｍ、約３ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、又はこれらのうちの任意の２つの値の範囲の厚さを有する。

[0046]本明細書において使用される場合、「生物学的生命体」又は「対象」は、ヒト若しくは動物若しくは細菌、又は前述の群のいずれかに由来する細胞培養物を指し得る。動物の非限定的な例には、霊長類、齧歯動物、家畜動物、又は狩猟動物などの脊椎動物が含まれる。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、スパイダーモンキー、及びマカク（例えば、アカゲザル）が含まれる。齧歯動物には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが含まれる。家畜動物及び狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ヘラジカ、ネコ種（例えば、家ネコ）、及びイヌ種（例えば、イヌ、キツネ、オオカミ）が含まれる。魚類には、軟骨魚綱（軟骨魚類）及び硬骨魚類（硬骨魚）が含まれる。ある特定の実施形態では、生物学的生命体又は対象は、ゼブラフィッシュを指し得る。対象は、哺乳動物であり得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。加えて、本明細書において記載されている方法は、家畜動物又はペットを診断及び／又は処置するために使用され得る。この用語は、特定の年齢又は性別を示さない。したがって、オスであってもメスであっても、成体及び産まれたばかりの対象、並びに胎児が、この用語の範囲内に含まれる。

[0047]対象は、処置を必要とする状態（例えば、線維症、創傷／創傷治癒、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、加齢皮膚、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）、腎臓線維症、心筋梗塞（ＭＩ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、変形性関節症（ＯＡ）、円錐角膜、若しくはこれらに類するもの）、又は当該状態に関連する１つ若しくは複数の合併症を有すると事前に診断されている、前記状態又は合併症に罹患していると同定されている、及び／或いは前記状態又は合併症を有することが分かっている人であり得る。一部の実施形態では、状態は、肝線維症である。一部の実施形態では、状態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。一部の実施形態では、状態は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。一部の実施形態では、状態は、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）である。対象は、状態又は状態に関連する１つ若しくは複数の合併症のための処置を任意選択で既に受けていてよい。

[0048]一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、患者における状態の存在又は進行を決定するために使用され得る。一部の実施形態では、総コラーゲン含有量及びダメージを受けたコラーゲンの含有量は、特定の試料群に対して正規化されたダメージを受けたコラーゲンの客観的尺度のための比率として組み合わされる。一部の実施形態では、比率は、病態の進行又は回復の予測バイオマーカーとして使用される。

[0049]一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、患者に由来する別の試料における総コラーゲン含有量を検出することをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、標識されたＣＨＰを非トリプルヘリックスコラーゲンに接触させることによって、患者に由来する同一の試料又は別の試料中の非トリプルヘリックスコラーゲンを検出することをさらに含み得る。非トリプルヘリックスコラーゲンは、コラーゲンの変性に熱を加えないことを除いて、トリプルヘリックスコラーゲンの検出と同一の手順によって検出される。さらなる実施形態において、本方法は、試料中の検出されたコラーゲン含有量（例えば、総コラーゲン、非トリプルヘリックスコラーゲン、又は両方）を、前記別の試料中の検出されたコラーゲン含有量と、又はコントロール含有量値と比較することをさらに含む。

[0050]或いは、対象は、状態又は当該状態に関連する１つ若しくは複数の合併症を有すると事前に診断されていない人であり得る。例えば、対象は、状態又は当該状態に関連する１つ若しくは複数の合併症についての１つ又は複数の危険因子を示す人であり得る。対象は、危険因子を示さなくてもよい。特定の状態のための処置を「必要とする対象」は、その状態を有する疑いがある、その状態を有すると診断された、その状態を既に処置された若しくは処置されているところである、その処置を処置されていない、又はその状態を発症するリスクがある対象であり得る。

[0051]本明細書において記載される方法及びシステムは、限定はしないが、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー並びに他の類人猿及びサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラット、モルモット、及びゼブラフィッシュなどの、齧歯動物を含む実験動物；並びにこれらに類するものを含む、様々な対象に由来する試料を画像化するために使用され得る。試料は、対象から単離され得る（すなわち、エクスビボ）。他の実施形態では、試料は対象全体であり得る（すなわち、インビボ又はインサイチュ）。

[0052]一部の実施形態では、本方法は、試料中のコラーゲンを変性させるステップを含む。当業者に公知の任意の方法が試料の変性に使用され得ることが理解されよう。試料中のコラーゲンの変性は、試料中のコラーゲンのトリプルヘリックス性を破壊し得る。

[0053]一部の実施形態では、本方法は、抗原賦活化によって試料中のコラーゲンを変性させて、変性した試料を作製するステップを含む。一部の実施形態では、賦活化剤は、水、緩衝液、酵素、カオトロピック試薬、キレート剤、求核剤、酸化剤、有機酸／塩基対、ルイス酸などの電子不足化合物、及び界面活性剤のうちの１つ又は複数を含む、抗原賦活化剤である。一部の実施形態では、抗原賦活化剤は、水、緩衝液、酵素、カオトロピック試薬、キレート剤、求核剤、酸化剤、有機酸／塩基対、ルイス酸などの電子不足化合物、及び界面活性剤のうちの少なくとも２つを含む。一部の実施形態では、抗原賦活化剤は、水、緩衝液、酵素、カオトロピック試薬、キレート剤、求核剤、酸化剤、有機酸／塩基対、ルイス酸などの電子不足化合物、及び界面活性剤のうちの少なくとも３つを含む。一部の実施形態では、抗原賦活化剤は緩衝液（例えば、ＴＲＩＳ）を含み、約６～約９の範囲のｐＨを有する。

[0054]一部の実施形態では、本方法は、試料を熱に曝露させることによって試料中のコラーゲンを変性させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料をマイクロ波に曝露させることによって試料中のコラーゲンを変性させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を超音波に曝露させることによって試料中のコラーゲンを変性させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、摂氏約５０度（℃）～約１６０℃の間に加熱される。一部の実施形態では、試料は、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１５℃、約１２０℃、約１２５℃、約１３０℃、約１３５℃、約１４０℃、約１４５℃、約１５０℃、約１５５℃、約１６０℃、又はこれらのうちの任意の２つの値の間の範囲まで加熱される。一部の実施形態では、試料が加熱されるとき、試料は、抗原賦活化剤の蒸発を最小にする、又は抗原賦活化剤の沸騰を和らげる若しくは防ぐような圧力下で保持され得る。

[0055]一部の実施形態では、本方法は、試料を熱に曝露させることによって試料中のコラーゲンを変性させるステップを含み、試料は、約１０秒～約４５分の間にわたり加熱される。一部の実施形態では、本方法は、試料を熱に曝露させることによって試料中のコラーゲンを変性させるステップを含み、試料は、約１０秒（ｓ）、約２０ｓ、約３０ｓ、約４０ｓ、約５０ｓ、約１分（ｍｉｎ）、約１．５ｍｉｎ、約２ｍｉｎ、約２．５ｍｉｎ、約３ｍｉｎ、約３．５ｍｉｎ、約４ｍｉｎ、約４．５ｍｉｎ、約５ｍｉｎ、約５．５ｍｉｎ、約６ｍｉｎ、約６．５ｍｉｎ、約７ｍｉｎ、約７．５ｍｉｎ、約８ｍｉｎ、約８．５ｍｉｎ、約９ｍｉｎ、約９．５ｍｉｎ、約１０ｍｉｎ、約１１ｍｉｎ、約１２ｍｉｎ、約１３ｍｉｎ、約１４ｍｉｎ、約１５ｍｉｎ、約１６ｍｉｎ、約１７ｍｉｎ、約１８ｍｉｎ、約１９ｍｉｎ、約２０ｍｉｎ、約２１ｍｉｎ、約２２ｍｉｎ、約２３ｍｉｎ、約２４ｍｉｎ、約２５ｍｉｎ、約２６ｍｉｎ、約２７ｍｉｎ、約２８ｍｉｎ、約２９ｍｉｎ、約３０ｍｉｎ、約３１ｍｉｎ、約３２ｍｉｎ、約３３ｍｉｎ、約３４ｍｉｎ、約３５ｍｉｎ、約３６ｍｉｎ、約３７ｍｉｎ、約３８ｍｉｎ、約３９ｍｉｎ、約４０ｍｉｎ、約４１ｍｉｎ、約４２ｍｉｎ、約４３ｍｉｎ、約４４ｍｉｎ、約４５ｍｉｎ、又はこれらのうちの任意の２つの値の範囲にわたり加熱される。

[0056]一部の実施形態では、本方法は、試料を電磁放射線に曝露させることによって試料中のコラーゲンを変性させるステップを含む。一部の実施形態では、電磁放射線は、約１０ｎｍ～約４００ｎｍの間の波長を有する（ＵＶ照射）。一部の実施形態では、電磁放射線は、約２００ｎｍ～約４００ｎｍの間の波長を有する。一部の実施形態では、電磁放射線は、約２５０ｎｍ～約４００ｎｍの間の波長を有する。一部の実施形態では、電磁放射線には、ＵＶＡ放射線（約３１５ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の波長を有する）、ＵＶＢ放射線（約２８０ｎｍ～約３１５ｎｍの範囲の波長を有する）、及びＵＶＣ放射線（約１００ｎｍ～約２８０ｎｍの範囲の波長を有する）のうちの１つ又は複数が含まれる。曝露時間は、約１０分～約２時間、約１０分～約１時間、又は約２０分～約４５分であり得る。電力は、ＵＶＡでは約１Ｊ／ｃｍ^２～最大約２５Ｊ／ｃｍ^２、約５Ｊ／ｃｍ^２～最大約１５Ｊ／ｃｍ^２、又は約９Ｊ／ｃｍ^２～最大約１２Ｊ／ｃｍ^２であり得、ＵＶＢでは約１００ｍＪ／ｃｍ^２～約１Ｊ／ｃｍ^２、約２００ｍＪ／ｃｍ^２～約５００ｍＪ／ｃｍ^２、又は約２５０ｍＪ／ｃｍ^２～約３５０ｍＪ／ｃｍ^２であり得る。

[0057]一部の実施形態では、本方法は、上記の方法を使用してコラーゲンを変性させるステップを含み、本方法はまた、抗原賦活化も含む。一部の実施形態では、変性及び抗原賦活化は、同時に行われる。一部の実施形態では、変性及び抗原賦活化は、連続して行われる。一部の実施形態では、変性は、抗原賦活化の前に行われる。一部の実施形態では、変性は、抗原賦活化の後に行われる。

[0058]一部の実施形態では、本方法は、上記の方法を使用してコラーゲンを変性させるステップを含み、本方法はまた、標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を変性コラーゲンに接触させるステップも含む。一部の実施形態では、変性させるステップ、及び変性コラーゲンへ標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を接触させるステップは、同時に行われる。一部の実施形態では、変性させるステップ、及び変性コラーゲンへ標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を接触させるステップは、連続して行われる。一部の実施形態では、変性させるステップは、変性コラーゲンへ標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を接触させる前に行われる。一部の実施形態では、変性させるステップは、試料への標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）の接触（例えば、ＣＨＰを含む溶液中で試料をインキュベートし、次いで、試料を加熱してコラーゲンを変性させること）の後に行われる。一実施形態では、本開示の方法は、未変性の試料を、標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）と接触させるステップ、並びに、試料を同時に画像化及び加熱して、ネイティブな試料中の破壊されたコラーゲンの量とコラーゲンの総量との間の差に対応する蛍光強度の変化を得るステップ（例えば、リアルタイムで）を含み得る。

[0059]一部の実施形態では、試料中の総コラーゲン含有量を決定する場合、本方法は、標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を変性したコラーゲンに接触させるステップ（例えば、試料中のコラーゲンを変性させた後に、試料をＣＨＰと接触させること）を含む。一部の実施形態では、ネイティブ試料中の破壊されたコラーゲンの量を決定する場合、本方法は、標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）をネイティブ試料中のコラーゲンに接触させるステップ（例えば、試料中のコラーゲンの変性を伴わずに、試料をＣＨＰと接触させること）を含む。

[0060]コラーゲン含有量（例えば、ネイティブ試料中の総コラーゲン含有量又は破壊されたコラーゲンの量）は、ＣＨＰ上の標識から放出される、光学的に検出可能なシグナルの強度（又は強度の変化）を検出することによって測定され得る。

[0061]本明細書において開示されている方法及び組成物は、検出可能な部分（例えば、標識又はタグ）を含むＣＨＰを使用する。標識又はタグによって、標識された又はタグ付けされたＣＨＰの検出が可能となる。標識又はタグによって、標識された又はタグ付けされたＣＨＰに結合している場合の、試料中の破壊されたコラーゲン（例えば、ＣＨＰの標的）の検出が可能となる。標識は、直接的に（すなわち、一次標識）又は間接的に（すなわち、二次標識）検出され得る分子を意味する。例えば、標識は、視覚化及び／若しくは測定することができるか、又はそれ以外の方法で同定することができ、これによって、標識の存在又は不存在が分かる。標識された又はタグ付けされたＣＨＰによって、試料中の破壊されたコラーゲン（例えば、ＣＨＰの標的）の検出が可能となる。化合物は、検出可能なシグナルを生じさせる標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア、酵素、抗体、磁気粒子などの粒子、化学発光化合物、又は特異的結合分子、及びこれらに類するものに直接的に又は間接的にコンジュゲートさせることができる。標識の例には、限定はしないが、標識、標識酵素、及び放射性同位体を含む、光学的蛍光及び色素生成性の色素が含まれる。

[0062]標識の非限定的な例には、ａ）放射性同位体又は重同位体であり得る、同位体標識、ｂ）磁気標識、電気的標識、熱標識、ｃ）着色標識、発光を含む光学的標識、リン性の及び蛍光性の色素又は部分、並びにｄ）結合パートナーが含まれる。標識としてはまた、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、及びこれに類するもの）及び磁気粒子も含まれる。

[0063]標識には、蛍光色素又は蛍光部分などの光学的標識が含まれる。フルオロフォアは、「低分子」蛍光体又はタンパク性の蛍光体（例えば、緑色蛍光タンパク質及びその全てのバリアント）のいずれかである。

[0064]適切な蛍光標識には、限定はしないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ）（商標）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、及びオレゴングリーンが含まれる。適切な光学的色素は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄによる、１９９６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋにおいて記載されている。適切な蛍光標識としてはまた、限定はしないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３（５１４８）：８０２～８０５、１９９４、及びＥＧＦＰ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ－Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ：Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｒ．Ｈ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（３）：４６２～４７１（１９９８）；Ｈｅｉｍ，Ｒ．及びＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８～１８２（１９９６））、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１２）：５４０８～５４１７（１９９３））、β－ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（８）：２６０３～２６０７（１９８８年４月））、及びウミシイタケ（国際公開第９２／１５６７３号、国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９８／１４６０５号、国際公開第９８／２６２７７号、国際公開第９９／４９０１９号、米国特許第５，２９２，６５８号、米国特許第５，４１８，１５５号、米国特許第５，６８３，８８８号、米国特許第５，７４１，６６８号、米国特許第５，７７７，０７９号、米国特許第５，８０４，３８７号、米国特許第５，８７４，３０４号、米国特許第５，８７６，９９５号、及び米国特許第５，９２５，５５８号）も含まれる。

[0065]一部の実施形態では、標識には、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー、及びＲ－フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ユージーン、オレゴン州）、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）、シアニン３（Ｃｙ３）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）、スルホシアニン３、スルホシアニン５、スルホシアニン５．５、スルホシアニン７、スルホシアニン７．５（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ、ハント・バレー、メリーランド州）が含まれる。Ｃｙ５ＰＥ、Ｃｙ５．５ＰＥ、Ｃｙ７ＰＥ、Ｃｙ５．５ＡＰＣ、Ｃｙ７ＡＰＣのためのタンデムコンジュゲートプロトコルが公知である。さらなる標識が、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＡｎａＳｐｅｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｂｃａｍ、ＬｉＣｏｒ、及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどの商業的供給源から入手可能である。

[0066]ＣＨＰに付着される蛍光標識は、１つの波長の光（例えば、青又は緑）の光によって励起され、可視スペクトル内の異なる波長の光を放出する、免疫蛍光のために選択された色素を含み得る。最も一般的な蛍光色素は、緑色光を放出するフルオレセイン、赤色光を放出するテキサスレッド及びペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、並びにオレンジ／赤色の光を放出するローダミン及びフィコエリスリン（ＰＥ）である。選択的フィルターを使用することによって、使用した色素又は蛍光色素から出る光のみが蛍光顕微鏡で検出される。この技術は、試料中の破壊されたコラーゲン（例えば、ＣＨＰの標的）を検出するために使用することができる。

[0067]細胞又は組織の極薄の光学切片を得るためにコンピュータを利用した技術を使用する、共焦点蛍光顕微鏡法は、緻密な試料準備の必要性を伴わない、非常に高解像度の免疫蛍光顕微鏡法を提供する。共焦点顕微鏡の解像度は、強度の低い照明を使用してさらに増大し得、そのため、蛍光色素を励起させるために２つの光子が必要である。パルスレーザービームが使用され、このビームが顕微鏡の焦点面にフォーカスされた場合のみ、強度は蛍光を励起させるために十分となる。この方法で、蛍光発光自体が光学切片に限定され得る。一実施形態では、共焦点蛍光顕微鏡の使用によって、いかなる試料の準備も伴わずに試料の分析が可能となる。

[0068]本開示のＣＨＰのための標識として使用され得るフルオロフォアの１つの群はキサンテン色素であり、この色素には、３，６－ジヒドロキシ－９－フェニルキサントヒドロール及びレザミンに由来するフルオレセイン、並びに３，６－ジアミノ－９－フェニルキサントヒドロール及びリサニム（ｌｉｓｓａｎｉｍｅ）ローダミンＢに由来するローダミンが含まれる。９－ｏ－カルボキシフェニルキサントヒドロールのローダミン及びフルオレセイン誘導体は、９－ｏ－カルボキシフェニル基を有する。アミノ基及びイソチオシアネート基などの反応性結合基を有するフルオレセイン化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート及びフルオレスカミンは、入手が容易である。蛍光化合物の別の基は、α位又はβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。一態様では、ＣＨＰは、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８３）２０８～２４９頁）によって記載されている手順によって、蛍光色素又は発色団で標識される。

[0069]一部の実施形態では、ルシフェリンなどの化学発光物質がＣＨＰに付着させられる（例えば、合成及び検出方法については、米国特許第５，０９８，８２８号を参照されたい）。

[0070]一部の実施形態では、ＣＨＰは、検出可能な二次標識を含む。二次標識は、間接的に検出される標識である。例えば、二次標識は、検出対象の一次標識と結合又は反応し得、一次標識（例えば、酵素）を作製するための追加の産物に作用し得、またこれらに類することが可能である。二次標識には、限定はしないが、結合パートナー対の一方、化学修飾可能な部分、ヌクレアーゼ阻害剤、酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、及びこれらに類するものが含まれる。

[0071]一部の実施形態では、二次標識は、結合パートナー対である。一態様では、標識は、その結合パートナーを結合するハプテン又は抗原である。例えば、適切な結合パートナー対には、限定はしないが、抗原（タンパク質（ペプチドを含む）及び低分子など）及び抗体（その断片（ＦＡｂ及びそれに類するもの）を含む）；ビオチン／ストレプトアビジンを含むタンパク質及び低分子；酵素及び基質又は阻害剤；他のタンパク質－タンパク質相互作用対；受容体－リガンド；並びに炭水化物及びそれらの結合パートナーが含まれる。核酸－核酸結合タンパク質対が検討される。結合パートナー対には、限定はしないが、ビオチン（又はイミノビオチン）及びストレプトアビジン、並びにジゴキシゲニン及び抗体（Ａｂ）が含まれる。

[0072]一部の実施形態では、二次標識は、化学修飾可能な部分である。この実施形態では、反応性の官能基を含む標識が、標識対象の分子に組み込まれる。官能基はこうしてその後、一次標識で標識される（例えば、アッセイの前又は後に）。適切な官能基には、限定はしないが、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基、及びチオール基が含まれる。公知のリンカー、例えば、ホモ又はヘテロ二官能性のリンカーを例えば使用して、例えば、アミノ基を有する一次標識が、アミノ基を有する二次標識に付着させられる。

[0073]一部の実施形態では、複数の蛍光標識が、本明細書において開示されている方法及び組成物において利用される。一部の実施形態では、各標識は異なっており、他の標識と区別可能である。

[0074]一部の実施形態では、ＣＨＰは、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ｐｏｌｙｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２、９７２～９７７（２００６）によって開示されている量子ドットで標識されている。

[0075]一部の実施形態では、ＣＨＰは、Ｔａｎｎｅｒら、Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ Ｐａｒｔ Ｂ：Ａｔｏｍｉｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、２００７年３月、６２（３）：１８８～１９５；Ｏｒｎａｔｓｋｙら、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００６）：１、１～９；Ｏｒｎａｔｓｋｙら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＩＣＰ－ＭＳ、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０８（２００６）６８～７６；及びＬｏｕら、Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ｔａｇｓ ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、（２００７）４６、６１１１～６１１４において開示されている、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）に適したタグで標識されている。

[0076]一態様では、ＣＨＰは、酵素標識を含む。酵素標識は、検出可能な産物を産生する標識酵素基質の存在下で反応し得る酵素を意味する。酵素標識には、限定はしないが、ＣＨＰに共有結合しているホスファターゼ又はペルオキシダーゼが含まれる。適切な酵素標識には、限定はしないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼが含まれる。酵素標識の存在は、検出及び測定される同定可能な産物を生産する標識酵素基質との反応の酵素による触媒作用を介して、一般に明らかにされる。同定可能な産物は、肉眼で若しくは分光光度的な技術によって検出される色の変化であり得るか、又は、シグナルは、蛍光によって検出される産物への基質の転換であり得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼとテトラメチルベンジジンとの反応などの、このような産物は不透明であり得、様々な色を有し得る。蛍光反応産物を産生するルミノール（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能である）などの他の標識酵素基質が開発されている。標識酵素と標識酵素基質とを同定するための方法は、当技術分野において周知であり、多くの市販のキットが利用可能である。様々な標識酵素の使用についての例及び方法は、Ｓａｖａｇｅら、Ｐｒｅｖｉｅｗｓ ２４７：６～９（１９９８）、Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２２７～２３６（１９８９）において記載されている。

[0077]一態様では、ＣＨＰは、放射性同位体／放射性標識を含む。放射性同位体は、あらゆる放射性分子を意味する。適切な放射性同位体には、限定はしないが、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、５７Ｃｏ、９９ｍＴｃ、及び５１Ｃｒが含まれる。放射性標識は、共有結合によってＣＨＰに付着する。一態様では、ＣＨＰは放射性標識を含む。このようなケースでは、シンチレーションカウンティングが使用される。このようなケースでは、放射性標識されたＣＨＰに曝露された試料は単離され、結合したリガンドの放射能が測定される。

[0078]一部の実施形態では、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーによって検出可能な陽電子放出同位体が、リガンドに付着している。陽電子放出同位体の例には、半減期が短い放射性同位体、例えば^１１Ｃ（約２０分）、^１３Ｎ（約１０分）、^１５Ｏ（約２分）、及び^１８Ｆ（約１１０分）が含まれる。放射性同位体でペプチドを標識するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、このような方法は、Ｏｈｔａら、（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ ３：５３５～５４１で見られる。一部の実施形態では、ＣＨＰは、^１９Ｆ原子、又は^１５Ｎ原子、又は複数のこのような原子などのＮＭＲ活性な同位体標識で標識されている。

[0079]一部の実施形態では、本開示の方法は、ＣＨＰの使用を含む。全般的に、ＣＨＰは、式Ｉ：
Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３～２０（式Ｉ）
によって表される配列を含み、式中、Ｌが１つ又は複数の検出可能な部分であり（例えば、標識）、Ｓがスペーサー分子であり、ｍが０～１０の整数であり、（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３～２０が、Ｇｌｙがグリシンである反復部分を表しており、そしてＸ及びＹの少なくとも１つが、プロリン、修飾プロリン、及び／又はヒドロキシプロリンである。一部の実施形態では、本開示の方法は、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_４によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_５によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_６によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_７によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_８によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_９によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１０によって表される配列_、Ｌ－Ｓｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１１によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１２によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１３によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１４によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１５によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１６によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１７によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１８によって表される配列、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_１９によって表される配列、又はＬ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_２０によって表される配列を含むＣＨＰの使用を含み、式中、Ｌが１つ又は複数の検出可能な部分であり（例えば、標識）、Ｓがスペーサー分子であり、ｍが０～１０の整数であり、Ｇｌｙがグリシンであり、そしてＸ及びＹの少なくとも１つが、プロリン、修飾プロリン、及び／又はヒドロキシプロリンである。一部の実施形態では、ｍは０ではない。一部の実施形態では、ｍは１である。一部の実施形態では、ｍは２である。一部の実施形態では、ｍは３である。

[0080]一部の実施形態では、本開示の方法は、試料を、配列番号１～３３７（例えば、表１を参照されたい）から選択される配列を有するＣＨＰと接触させるステップを含み得る。

[0081]上記の表１で示されているある特定の配列において、「ＧＧＧ」は、トリプルグリシンリンカーを表している。上記の表１で示されているある特定の配列において、「ＮＨ_２」は、アミド化されたＣ末端を表している。上記の表１で示されているある特定の配列において、「ＧｆＯ」配列中の「ｆ」は、２Ｓ，４Ｓ－４－フルオロプロリン（シスコンフォメーション）を表している。上記の表１で示されているある特定の配列において、「Ａｈｘ」は、６－アミノヘキサン酸リンカーを表している。上記の表１で示されているある特定の配列において、「ＧｃＯ」配列中の「ｃ」は、２Ｓ，４Ｓ－４－クロロプロリン（シスコンフォメーション）を表している。上記の表１で示されているある特定の配列において、「ＧＰＦ」配列中の「Ｆ」は、２Ｓ，４Ｒ－４－フルオロプロリン（トランスコンフォメーション）を表している。

[0082]一部の実施形態では、本開示の方法は、試料を、ＧＧＧ又はＡＨＸスペーサー分子を有さない、上記の表１において列挙されている配列番号１～３３７から選択される配列を有するＣＨＰと接触させるステップを含み得る。一部の実施形態では、配列は、式中、Ｓがスペーサー分子であり、ｍが０である、式１、Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３～２０のＣＨＰを含む。

[0083]一部の実施形態では、本開示の方法は、試料をＣＨＰと接触させるステップを含み得、ここでＣＨＰ配列は（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３～２０反復部分を含み、ＣＨＰの反復部分は、配列番号３３８～３４９から選択される配列を有する（例えば、表２を参照されたい）。

[0084]他の実施形態及び同等物には、限定はしないが、二量体型の、表１及び表２において列挙されている各配列が含まれる。ある特定の実施形態では、二量体の配列は、表１及び表２のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列と、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、又は１０を超えるアミノ酸と異なり得る。ある特定の実施形態では、二量体の配列は、グリシンオフセット及び／又はリジン分岐点を含み得る。

[0085]別の態様では、本開示は、標識されたＣＨＰを非トリプルヘリックスコラーゲンに接触させることによって、患者に由来する試料中の非トリプルヘリックスコラーゲン含有量を検出するステップを含む、患者における状態の存在又は進行を決定する方法に関する。一部の実施形態では、状態は、線維症、創傷治癒、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、加齢皮膚、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患状態（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）、腎臓線維症、心筋梗塞（ＭＩ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、変形性関節症（ＯＡ）、及び円錐角膜における進行又は回復からなる群から選択される１つ又は複数である。一部の実施形態では、状態は、肝線維症である。一部の実施形態では、状態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。一部の実施形態では、状態は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。一部の実施形態では、状態は、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）である。一部の実施形態では、本方法は、患者に由来する別の試料中の非トリプルヘリックスコラーゲン含有量を検出するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、本方法は、試料中の検出された非トリプルヘリックスコラーゲン含有量を、前記別の試料中の含有量と、又はコントロール含有量値と比較するステップをさらに含む。

[0086]本明細書において使用される節の見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されるものではない。

[0087]本明細書において記載される方法は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコル、対象、及びシーケンシング技術に限定されず、したがって変化し得ることが理解される。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、本明細書において記載される方法及び組成物の範囲を限定するものとは解釈されるものではないことも理解され、本明細書において記載される方法及び組成物の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書において、本開示の一部の実施形態が示されており、記載されているが、当業者には、このような実施形態が例示としてのみ提供されていることは明らかであろう。多くの変形、変更、及び置換が、本開示から逸脱することなく、当業者に想起されるであろう。本明細書において記載される本開示の実施形態に対する様々な代替物が本開示の実施において利用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を規定しており、また、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造並びにこれらの同等物は、特許請求の範囲によって網羅されている。

[0088]いくつかの態様が、説明のために、例となる適用を参照して記載されている。別段の指示がない限り、あらゆる実施形態を、あらゆる他の実施形態と組み合わせることができる。多くの具体的な詳細、関係、及び方法が、本明細書において記載される特徴を完全に理解するために示されていることが理解されるべきである。当業者には、しかし、本明細書において記載される特徴が、具体的な詳細のうちの１つ若しくは複数を伴わずに又は他の方法を伴って実施され得ることが、容易に認識されよう。一部の作業は異なる順序で及び／又は他の作業若しくは事象と同時に行われ得るため、本明細書において記載される特徴は、記載されている作業又は事象の順序によっては限定されない。さらに、説明されている作業又は事象の全てが、本明細書において記載される特徴に従った方法論の実行に必要であるわけではない。さらに、本開示の方法が、本明細書において示されている特定のステップ順序に従わない限りにおいては、当該特定のステップ順序は、特許請求の範囲での限定であると解釈されるべきではない。本開示の方法を対象としたいかなる請求項も、記載された順序での当該方法のステップの実行に限定されるべきではなく、当業者には、ステップが変化し得、それでも本開示の趣旨及び範囲に含まれることを依然として維持し得ることが、容易に理解され得る。

[0089]一部の実施形態が本明細書において示されており、記載されているが、当業者には、このような実施形態が例としてのみ提供されていることは明らかであろう。本開示の実施形態は、本明細書内で提供される具体的な実施例によって限定されるとは解釈されない。本開示のある特定の実施形態が、前述の明細書を参照して記載されているが、本明細書における実施形態の記載及び説明は、限定の意味で解釈されるものではない。多くの変型、変更、及び置換が、本開示から逸脱することなく、当業者に想起されるであろう。

[0090]さらに、本開示の実施形態の全ての態様は、本明細書において示されている具体的な描写、立体配置、又は相対的比率に限定されず、これらは様々な条件及び変数に応じるということが理解されるべきである。本明細書において記載されている本開示の実施形態に対する様々な代替物が本発明の実施において利用され得ることが理解されるべきである。したがって、本開示があらゆるこのような代替物、修正、変型、又は同等物も網羅することが検討される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を少なくとも部分的に規定しており、また、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造並びにこれらの同等物は、特許請求の範囲によって網羅されている。

[0091]上記で示されており記載されている典型的な実施形態に、これら実施形態の広い発明概念から逸脱することなく変更が加えられ得ることは当業者に理解されよう。したがって、本開示は、示されている及び記載されている典型的な実施形態に限定されないが、特許請求の範囲によって規定されている本開示の趣旨及び範囲内の修正を網羅するものであることが理解される。例えば、典型的な実施形態の具体的な特徴は、特許請求の範囲に記載の発明の一部であってもなくてもよく、開示されている実施形態の様々な特徴を組み合わせることができる。「右側」、「左側」、「下方」、及び「上方」という語は、参照している図面中の方向を指す。本明細書において具体的に示されていない限り、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、１つの要素に限定されず、むしろ、「少なくとも１つの」を意味すると解釈されるべきである。

[0092]本明細書において言及されている範囲は、言及されているエンドポイントを含む、当該範囲内の値の全てについての省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群のあらゆる数、数の組合せ、又は部分範囲を含むと理解される。

[0093]本開示の図面及び説明の少なくとも一部は、本開示の明確な理解に関連する要素に焦点を当てて単純化されており、一方、明確性を目的として、本開示の一部をやはり構成し得ることが当業者に理解される他の要素を排除していることが理解される。しかし、このような要素は当技術分野において周知であり、これら要素は本開示のより良い理解を必ずしも促進するわけではないため、このような要素の記載は本明細書において提供されていない。

［実施例］
[0094]実施例１－ＣＨＰを使用する、組織中の分解したコラーゲンの相対的含有量の決定
[0095]一方は十分な熱変性（例えば、凍結切片の９０℃の水浴での１０分間のインキュベーション、又は２ラウンドの９５℃での５分間の熱を介する抗原賦活化）で処置されており、他方は全く処置されていない、同一の疾患を有するマウス心臓組織の２つの隣接する切片を、同一の条件下で、５－ＦＡＭ－二量体ＣＨＰ又はビオチン二量体ＣＨＰ（ｄｉＣＨＰ）で染色する。完全に変性した切片からのｄｉＣＨＰシグナルは総コラーゲン含有量を表し、一方、未処置切片におけるシグナルは、疾患状態の天然に分解したコラーゲンに由来する。２つのスライド内の目的の同一領域で検出される蛍光シグナルの間の比率は、その区域で分解しているコラーゲンのパーセンテージの推定を示す。

[0096]蛍光シグナルは、ＩｍａｇｅＪに基づくプロトコルを使用して定量することができる。ＭＩ後の早期及び後期（１週間と３週間）に採取した心臓についての分解したコラーゲンの含有量を、ネガティブコントロールとしての正常な心臓と比較する。各時点の各群について、５つの心臓を分析する。各心臓で、１０個の凍結切片及び１０個のパラフィン切片を統計分析のために染色する。このアッセイの精度を確認するために、ＭＩ心臓組織の分解したコラーゲンのレベルを、凍結切片及びトリプシン－ヒドロキシプロリンアッセイを使用して定量する。切片を、分解したフォールディングしていないコラーゲンを選択的に可溶化するトリプシン溶液で処置する。トリプシン溶液及び残りの組織切片中のコラーゲン含有量を、標準的なヒドロキシプロリンアッセイによって定量し、これによって、プロテアーゼ分解した、組織中に元々存在するコラーゲンのパーセンテージを計算することができる。トリプシンアッセイは、固定されていない凍結切片でのみ機能し、切片全体の平均パーセンテージを測定するだけであるため、トリプシンアッセイの結果は、ｄｉ－ＣＨＰで染色された凍結スライドの切片全体のスキャンから定量されるパーセンテージと比較される。

[0097]実施例２－他の染色技術と比較した、ＣＨＰを使用する総コラーゲン含有量の決定
[0098]線維性のマウス肝臓モデルにおける総コラーゲンを検出して、これをビオチン標識されたＣＨＰ（Ｂ－ＣＨＰ）と比較するために、ＰＳＲ、ＭＴ、ヘロビチ染色、並びにコラーゲンＩ抗体及びコラーゲンＩＩＩ抗体を使用して直接染色比較研究を行った。全ての染色及び画像分析は、評価におけるバイアスを避けるため、及び全ての染色が確実に正確に行われるようにするために、第三者の開発業務受託機関であるＨｉｓｔｏＴｏｘ Ｌａｂｓによって行われた。各スライドにおける線維症の重症度が、獣医学病理学者によってスコア付けされた。

[0099]図５Ａ～５Ｊは、５つの異なる方法を使用して染色されたマウス肝臓の代表的な顕微鏡写真を示している。一連の切片は、健康な（コントロール）マウス肝臓（図５Ａ～５Ｅ）、及びＣＣｌ_４の注射の８週間後の線維性のマウス肝臓（図５Ｆ～５Ｊ）から採取された。全ての写真において矢印によって同定されているコラーゲンは、ＭＴでは青に、ＰＳＲではピンク／赤に、ヘロビチでは成熟コラーゲンでピンク／赤に、若いコラーゲンで青に、Ｃｏｌ Ｉ／ＩＩＩカクテルでは濃い茶色から薄い茶色に、そしてＣＨＰ染色では濃い茶色に染色されている。目的の他の特徴は、Ｃ－中心静脈、Ｈ－肝細胞、Ｐ－門脈三つ組として標識されている。倍率は４０倍であり、スケールバー＝２００μＭであった。

[00100]図５Ａ～５Ｊの写真から明らかであるように、Ｂ－ＣＨＰは、全ての他の染色より良好とは言わないまでも、丁度同じ程度に機能した。ＣＨＰの空間染色パターンを、抗体Ｃｏｌ Ｉ／ＩＩＩカクテルを含む全ての他の染色と比較すると、ＣＨＰはコラーゲンのより容易な可視化を可能にし、病理学者は、色の濃淡を判断する必要なく、コラーゲンを容易に同定することができた。さらに、Ｂ－ＣＨＰは、レチクリン線維を同定した唯一の染色であり、このことは、ＣＨＰもまた、レチクリン線維の銀染色（例えば、ゴモリのレチクリン染色、ゴードン及びスウィートのレチクリン染色、又はモバットペンタクローム染色）の代わりに使用され得ることを示している。レチクリン染色は、肝臓の構造の変化（肝細胞の喪失、肝細胞索の肥厚、分葉の変化、線維症／肝硬変など）の同定に最も有用である。

[00101]標準的な組織学的評価に加えて、スライドのそれぞれを、自動画像分析を使用して評価して、各試料において染色されたコラーゲンの区域を定量した。全ての画像で、目的の領域は肝臓組織を含むように、しかしアーチファクト（ひだ、裂け目など）、大きい血管、及び非肝臓組織は排除するように作製された。目的の領域を次いでいくつかのイメージングフィルターにかけて、染色が陽性の区域を陰性の区域から分けた。陽性区域を定量し、次いで、目的の領域の総区域と比較した。

[00102]ＰＳＲ染色では、コラーゲンは明るい赤になり、残りの組織は淡い黄色である。これらの画像は、陽性領域と陰性領域との間の大きなコントラストを理由に、自動画像分析を使用して問題なく容易に特徴付けすることができた。マッソントリクロームでは、コラーゲンは青くなり、細胞は赤くなる。しかし、一部の内皮細胞はその細胞質において弱い青色の染色を示し、その結果、慎重な閾値決定の後でも、自動画像分析によって断続的に検出された。このことにより、定量の際のコラーゲンの過検出がもたらされた可能性が高い。ヘロビチ染色された切片は、成熟コラーゲンではピンク／赤の染色を示し、若いコラーゲンでは淡い青を示した。肝細胞の細胞質は淡いピンクから、ピンクがかった紫に染色され、無機物領域は濃い紫から黒に染色された。全体的に、ヘロビチ染色された組織ではコントラストは非常に小さく、その結果、若いコラーゲンは染色が陰性の領域から区別できないため、画像分析は成熟コラーゲン（ピンク／赤）にのみ行うことができた。

[00103]ＣＨＰ染色された切片は、コラーゲン線維の薄い茶色の染色を示した（Ｂ－ＣＨＰのＤＡＢ染色）。陰性領域は、細胞質では水色から灰色に染色され、核では濃い青に染色された（ヘマトキシリン対比染色による）。画像分析はＣＨＰ標識されたコラーゲン原線維に対して全体的に特異的であったが、バックグラウンド染色が強まった一部の区域では、ＣＨＰ染色された領域をわずかに過小検出するためのアルゴリズムが必要であった。

[00104]図６は、画像分析によるコラーゲンの定量を示している。コラーゲンは全ての試料において検出され、ナイーブ試料では検出された全体的なコラーゲンは少なく、疾患を有する試料では非常に多くのコラーゲンが検出された。ナイーブ試料において、総コラーゲンは、全ての試料及び染色方法で低かった。しかし、疾患を有する組織に由来する試料における染色の間で、かなりの差が観察された。マッソントリクロームを使用して、ほとんどのコラーゲンが検出された。しかし、上記のように、肝細胞細胞質の弱い青色の染色は特異的分析に干渉し、コラーゲンの量は過剰に示されている可能性が高い。

[00105]ＰＳＲとＨＩＥＲを伴うＣＨＰとは非常に類似しており、総コラーゲン含有量の正確な評価を表している可能性が高い。ヘロビチ染色は、画像分析を使用して正確に評価することが困難であり、検出されたコラーゲンの区域が最も小さかった。加えて、全てのコラーゲンよりも変性コラーゲンに対する特異性をＣＨＰが有すること一致して、ＨＩＥＲを受けていない組織切片は、検出されたコラーゲンの量がより少なく、このことは、無傷のコラーゲン及び変性コラーゲンの両方が線維性の組織において上昇していることを示している。線維性の試料の代表的な画像及び分析を図７に示す。

[00106]実施例３－ヒト肝臓生検における総コラーゲン及びダメージを受けたコラーゲンの検出
[00107]（ｉ）ＣＨＰが、慢性的な肝臓損傷において、既存の組織化学的アプローチ及びコラーゲン比率区域に代わる信頼性のある標識として使用され得るかどうか、並びに（ｉｉ）ＣＨＰが肝臓に関する転帰を予測し得る追加の臨床的に重要な情報を提供し得るかどうかを評価するための実験を行った。

[00108]方法
[00109]７６人の良く特徴付けされたＮＡＦＬＤ患者の経皮的生検を、架橋壊死及び非活動性肝硬変と活動性肝硬変との両方を有するものを含む一連の外植片組織として使用した。切片を、ビオチン化されたＣＨＰと室温でインキュベートして、ダメージを受けたコラーゲンを検出した。８０℃で予熱した切片を使用して、総コラーゲン含有量を分析した。（ｉ）半定量的指標を使用して、及び（ｉｉ）ＱｕＰａｔｈを使用してスキャンされたスライドにおいて、標識の強度及び区域を評価した。ダメージを受けたコラーゲン：総コラーゲンの比率を計算した。臨床的パラメータとの、並びに疾患の悪性度及びステージとの相関を探した（ＮＩＨ ＣＲＮスコアリングシステム）。

[00110]結果及び考察
[00111]ＣＨＰは、通常の処理をされたヒト肝臓生検におけるダメージを受けたコラーゲン及び総コラーゲンの検出のための、並びに従来の組織化学的アプローチよりも一貫性があり得る検出のための、信頼性のあるツールを提供する。ＮＡＦＬＤにおいて、ダメージを受けたコラーゲンの総コラーゲンに対する比率は、疾患のＣＲＮステージと有意に相関している（ステージ１とステージ４でｐ＜０．００００１）。有利には、ダメージを受けたリモデリングされたコラーゲンの量は、進行の速い人と比較して、進行が遅い／中程度であると考えられる人において有意に少なく（ｐ＝０．０２３）、このことは、これらが、予後予測及び臨床試験において高い価値を有する可能性があることを示唆している。

[00112]図８は、全てのＮＡＦＬＤステージにわたる（ステージ２及びステージ４のＮＡＦＬＤが示されている）対象から得られた、Ｂ－ＣＨＰで処置された外植片組織の代表的な写真を示している。進行が遅い／中程度の人の修正Ｈスコアは１５．１６（平均）であり、進行の速い人では２９．２９（平均）であり、t値は－２．３３９７、ｐ値は０．０２３であった。したがって、リモデリングコラーゲンのＣＨＰ染色は、ＮＡＦＬＤの進行の予後予測に有用である。

[00113]図９は、全てのＮＡＦＬＤステージにわたる（ステージ１、ステージ２、及びステージ４のＮＡＦＬＤが示されている）対象から得られた、Ｂ－ＣＨＰで処置された外植片組織における総コラーゲン及びダメージを受けたコラーゲンを示す代表的な写真を示している。画像から決定された、総コラーゲンの、ダメージを受けたコラーゲンに対する比率（Ｔｏｔａｌ ｔｏ Ｄａｍａｇｅｄ Ｒａｔｉｏｓ）（ＴＤＲ）は、以下の通りである：ステージ１は１７．１４（平均）、ステージ２は８．３（平均）、及びステージ４は１１．１２（平均）。ステージ１とステージ４との間の（ｐ＜０．００００１）、及びステージ２とステージ４との間の（ｐ＝０．２３７）、及びステージ３とステージ４との間の（示されていない）（ｐ＝０．０１９７）ＴＤＲの比較は、ＴＤＲが、異なる疾患ステージ間の統計的に有意なマーカーを提供することを示している。ＴＤＲは、ＨＩＥＲを介するＣＨＰ染色及びＨＩＥＲを介さないＣＨＰ染色を使用して計算される。

[00114]さらに、他の慢性的な線維性の状態におけるＣＨＰプローブの探求は、類似の診断／予後の見通しを提供し得た。

[00115]実施例４－ＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩを使用する、ホルマリン固定パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織切片における総コラーゲン含有量の決定
[00116]総コラーゲン含有量
[00117]ＦＦＰＥ組織切片内の総コラーゲン含有量の評価にＣＨＰを使用するために、コラーゲンは、全ての利用可能なコラーゲンへのＣＨＰ結合を可能にするために完全に変性されなければならない。脱パラフィン後、組織切片を加熱して、コラーゲンを熱変性させる。試験は、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）方法において使用される長い加熱時間が、試料中のコラーゲンを完全に変性させるために十分である（使用する緩衝液に関わらず）ことを示している。本明細書において示される組織切片を、９５～１００℃の組織スチーマー内のクエン酸緩衝液５０ｍＬ中に４５分間置いた。或いは、凍結された組織スライド中のコラーゲン含有量を変性させるために、水浴を使用して、ＤＩ水を有する密閉された５０ｍＬの試験管を、８５℃を超える温度まで加熱してよい。加熱した後、熱いＤＩ水を組織試料にピペットで移し、５分間放置してよい（１０回反復する）。

[00118]実験プロトコル
[00119]ＦＦＰＥ切片：ＣＨＰ染色の前に、２×５分間の洗浄のために、キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、５０％エタノール、及びＤＩ水の中にこの順序で切片を浸すことによって、脱パラフィンを行う。

[00120]総コラーゲン含有量の決定のために、ＨＩＥＲを行うか又は組織を意図的に熱変性させる。

[00121]１×ＰＢＳ中にＣＨＰ粉末を溶解することによって、ＣＨＰ染色のための溶液を作製し、濃度を５～２０μＭの範囲内とする。正確な濃度は、必要な組織切片及び容積の最適化されたパラメータに応じる。

[00122]ＣＨＰ溶液を８０℃に加熱する。ＣＨＰは溶液中で経時的に（例えば、４℃での保管の間に）ホモ三量体に自己組織化し得、コラーゲンハイブリダイゼーションのためのその駆動力を失うため、三量体ＣＨＰを、８０℃で軽く加熱することによって一本鎖に熱解離する必要がある。

[00123]熱いＣＨＰ溶液を氷水浴中で素早く冷まし（約３０～９０秒間）、その後、これを、組織中のフォールディングしていないコラーゲンに結合させるために使用する。

[00124]冷却したＣＨＰ溶液を組織切片にアプライする。組織切片をＣＨＰ染色溶液で完全に覆い、湿度チャンバー内で、４℃で一晩結合させる。

[00125]１×ＰＢＳ又は１×Ｔｗｅｅｎ－２０での３×５分間の洗浄を使用して、切片を洗浄する。

[00126]カバースリップを載せ、画像化する。

[00127]過剰なＣＨＰ溶液を洗い流した後、組織を画像化し、蛍光シグナル定量のためにＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩに移してよい。シグナル強度は、試料中のコラーゲン量と相関している。組織切片が厚くなるにつれ、組織切片はより多くのコラーゲンを含有しており、したがって、本発明者らは、変性コラーゲン鎖に結合しているＣＨＰから、より強いシグナル強度が見られると予想する。図４に示すように、ＣＨＰシグナルは、組織が厚みを増すほど強力であり、このことは、ＣＨＰシグナルが総コラーゲン含有量と相関していることを裏付けている。バックグラウンドを差し引いた後に、画像化した全区域の平均ピクセル強度を測定することによって、強度を決定した。この方法によって、研究者は、組織切片内の総コラーゲン含有量を容易に可視化し、定量することが可能となる。

[00128]考察
[00129]一度、適切な画像化設定が見出されたら、ＣＨＰ染色によって、異なる組織試料における総コラーゲン含有量の容易な決定が可能となる。ＣＨＰ染色は、線維性の組織における総コラーゲン含有量を調べるために有益であり、コラーゲンリモデリングが多くの病理学的疾患及び健康な臓器の維持と関連するため、ＣＨＰ染色は、創傷治癒又は疾患の進行の評価に有益であることが明らかとなり得る。蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩプラットフォームを使用して定量することができる。

Claims (24)

1. 熱又は抗原賦活化によって試料中のコラーゲンを変性させて、変性した試料を作製するステップ、
   標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を前記変性したコラーゲンに接触させるステップ、及び
   前記標識されたＣＨＰからのシグナルを測定して、前記試料中の総コラーゲン含有量を決定するステップ
   を含む、試料中の総コラーゲン含有量を測定する方法。
2. 前記変性させることが、６０℃～１６０℃の温度で前記試料を加熱することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 事前のコラーゲン変性を行わずに、標識されたコラーゲンハイブリダイジングペプチド（ＣＨＰ）を試料に接触させるステップ、及び
   標識されたＣＨＰからのシグナルを測定して、前記試料中の総変性コラーゲン含有量を決定するステップ
   をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＣＨＰが、蛍光又はビオチン色素で標識されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記試料が溶液（例えば、ホモジナイズされている組織試料、ＥＣＭなど）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記試料が組織切片（例えば、骨切片）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記試料が人工組織切片である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記組織切片が、少なくとも１～１００μｍの厚さを有する、請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記標識されたＣＨＰの各々が、式Ｉ：
   Ｌ－Ｓ_ｍ－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_３～２０（式Ｉ）
   によって表される配列を含み、
   式中、Ｌが１つ又は複数の検出可能な部分であり、Ｓがスペーサー分子であり、ｍが０～１０の整数であり、Ｇｌｙがグリシンであり、且つＸ及びＹの少なくとも１つがプロリン、修飾プロリン、及び／又はヒドロキシプロリンである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ＣＨＰの各々が、配列番号１～１１８のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記試料が、肝線維症を有する患者に由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. トリプシン－ヒドロキシプロリンアッセイを含まない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 偏光を伴うピクロシリウスレッドを含まない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記方法にかかる時間が３日間未満である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記方法にかかる時間が２日間未満である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法によって、患者に由来する試料中の総コラーゲン含有量を検出するステップ
    を含む、患者における状態の存在又は進行を決定する方法であって、
    前記状態が、線維症、創傷治癒、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、加齢皮膚、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）、腎臓線維症、心筋梗塞（ＭＩ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、変形性関節症（ＯＡ）、及び円錐角膜からなる群から選択される１つ又は複数である、方法。
17. 総コラーゲン含有量及びダメージを受けたコラーゲンの含有量が、特定の試料群に対して正規化されたダメージを受けたコラーゲンの客観的尺度のための比率として組み合わされる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記比率が、病態の進行又は回復の予測バイオマーカーとして使用される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記状態が、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記患者に由来する別の試料中の総コラーゲン含有量を検出するステップをさらに含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 標識されたＣＨＰを非トリプルヘリックスコラーゲンに接触させることによって、前記患者に由来する別の試料中の非トリプルヘリックスコラーゲンを検出するステップをさらに含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 標識されたＣＨＰを非トリプルヘリックスコラーゲンに接触させることによって、患者に由来する試料中の非トリプルヘリックスコラーゲン含有量を検出するステップ
    を含む、患者における状態の存在又は進行を決定する方法であって、
    前記状態が、線維症、創傷治癒、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、加齢皮膚、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患状態（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）、腎臓線維症、心筋梗塞（ＭＩ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、変形性関節症（ＯＡ）、及び円錐角膜における進行又は回復からなる群から選択される１つ又は複数である、方法。
23. 前記状態が、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記患者に由来する別の試料中の非トリプルヘリックスコラーゲン含有量を検出するステップをさらに含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

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