JP2023544347A - リガンドの浸出の低減 - Google Patents

Abstract

流体から成分を除去するためのカラムが開示されている。カラムは、断面積を有する区画を有する。区画は、直径を有するビーズを含有している。成分に結合するように選択されているリガンドが、ビーズに連結している。断面積及びビーズ直径は、区画内の流体の流速を第１の閾値未満に維持するように選択されており、これによって、流体中へのリガンドの浸出が低減する。アミン結合によって基質に結び付いているリガンドであって、基質からの解離に対して抵抗性があるリガンドを含む吸着剤もまた、本明細書において記載されている。【選択図】 図２

Description

［関連出願の相互参照］
[0001]本願は、２０２０年１０月１日に出願された米国実用特許出願第１７／０６１，２４６号への優先権を主張するものであり、当該出願の全内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

［配列表］
[0002]本願は、配列表を伴って出願されている。配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで、テキストファイルの形式で電子的に提出されている。２０２０年１０月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ＩＭＭＵＮＩＣＯＭ－０５１５５１４－ＰＣＴ．ｔｘｔ」という名称であり、１０．２ＫＢのサイズであり、その内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

［導入］
[0003]アフェレーシスは、１つ又は複数の特定の構成要素を分離して残り部分を循環系に戻す装置に患者の血液を通す、医学的技術である。したがって、アフェレーシスは体外での治療法である。この技術は、献血センターで血小板を回収するために一般に使用される。

[0004]炎症及び細胞アポトーシスという身体の制御は、多数の調節タンパク質によって管理される複雑なプロセスである。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）は、抗腫瘍剤として特徴付けされている強力なサイトカインである。ＴＮＦアルファの影響の天然の制御は、血漿中の抑制分子、例えば、ｓＴＮＦ－Ｒ１及びｓＴＮＦ－Ｒ２などの可溶性ＴＮＦアルファ受容体（ｓＴＮＦ－Ｒ）の存在に依る。可溶性受容体はＴＮＦアルファに結合し、これを中和し得る。

[0005]血液からｓＴＮＦ－Ｒを除去するための試みでは、患者の血流への潜在的に危険な量のカラム材料の浸出、ｓＴＮＦ－Ｒの除去量の変動性、副作用、及び合併症が報告されており、当該報告は、現状のアフェレーシスが実用的な治療アプローチであるかどうかについての疑問を投げかけている。

［概要］
[0006]患者の循環から抑制分子を除去し、これによって、処理された血液成分内へのカラム材料の浸出を避けながら身体の自然感染免疫応答を可能にするように設計された「減法」免疫療法を提供することが望ましい。ある特定の実施形態では、患者の循環からｓＴＮＦ－Ｒを除去し、これによって、新生細胞に対するＴＮＦアルファの活性をブーストすることが望ましい。

[0007]流体から成分を除去するためのカラムが開示される。カラムは、断面積（ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ａｒｅａ）を有する区画と、直径を有し、上記区画内に配置されているビーズと、ビーズに連結されており、成分に結合するように選択されているリガンドとを含む。断面積及びビーズ直径は、区画内の流体の流速を第１の閾値未満で維持するように選択されている。

[0008]患者の血液から成分を除去する方法が開示される。本方法は、患者から血液を受け取るステップ、血液を少なくとも２つの血液成分に分離するステップ、及び、成分のうちの１つの一部を、断面積を有し、且つ複数のビーズを含有する区画に通すステップであって、上記ビーズが、直径を有し、且つ成分に結合するように選択されているリガンドが結合している、ステップを含む。断面積及びビーズ直径は、区画内の血液成分の流速を第１の閾値未満で維持するように選択されている。本方法はまた、少なくとも２つの血液成分を共に混合するステップ、及び混合した血液成分を患者に戻すステップも含む。

[0009]流体から成分を除去するためのリガンドが開示される。リガンドは、成分に連結する部位を各々が有する少なくとも２つのモノマーと、モノマーのうちの２つの間の第１のリンカーと、モノマーの１つに連結されており、化学結合によって基質に連結される、第２のリンカーとを含む。

[0010]流体からの成分の除去において使用するための基質が開示される。基質は、基質に連結しているリガンドを有する。リガンドは、成分に連結する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマーと、モノマーのうちの２つの間で連結されている第１のリンカーと、モノマーのうちの１つに連結されており、化学結合によって基質に連結されている、第２のリンカーとを含み得る。

[0011]流体からの成分の除去において使用するためのカラムが開示される。カラムは、区画、及び区画内に配置されている基質を有する。基質は、基質に連結されたリガンドを有する。リガンドは、成分に連結する部位を各々が有する少なくとも２つのモノマーを含み得る。リガンドはまた、モノマーのうちの２つの間で連結されている第１のリンカーと、モノマーのうちの１つに結合され、化学結合によって基質に結合されている、第２のリンカーとを含む。

[0012]患者の血液から標的成分を除去する方法が開示される。本方法は、患者から血液を受け取るステップ、血液を少なくとも２つの血液成分に分離するステップ、及び血液成分のうちの１つの一部をリガンドに近接して通すステップを含む。リガンドは、成分に連結する部位を各々が有する少なくとも２つのモノマーを有する。リガンドはまた、モノマーのうちの２つの間で結合されている第１のリンカーと、モノマーの１つに結合しており、化学結合によって基質に結合している、第２のリンカーとを有する。本方法はまた、少なくとも２つの血液成分を共に混合するステップ、及び混合した血液成分を患者に戻すステップも含む。

[0013]アフェレーシスにおいて使用するためのビーズを調製する方法が開示される。本方法は、基質を酸化させるステップ、ＴＮＦアルファの一部を含むリガンドと酸化された基質との間でシッフ塩基を形成させるステップ、及びシッフ塩基を第２級アミンの結合に変換するステップを含む。

[0014]本明細書において開示されている装置及び方法は、現在利用可能なシステムで見られるように、血漿からｓＴＮＦ－Ｒを効率的に除去し、それによって、患者に戻された血漿中にカラムから浸出するＴＮＦアルファの負の影響を避けながら、ある特定のがん腫瘍に対して正の臨床的効果をもたらすことが、インビボ及びインビトロで示されている。同一の装置及び方法は、他の標的成分及び他の状態の処置に適用可能である。

[0015]一部の態様では、本明細書において、対象の血液から標的成分を除去するための吸着剤が提示され、当該吸着剤は、表層を含む基質、アミン結合を含むリンカー、及びＴＮＦαを含むリガンドを含み、上記リンカーは、基質及びリガンドに結び付いている。

[0016]一部の態様では、本明細書において、対象の血液からＴＮＦ受容体を除去するための吸着剤が提示され、当該吸着剤は、基質表層を含む基質、及び一本鎖ＴＮＦαを含むリガンドを含み、上記基質表層は、アミン結合（例えば、第２級アミンの結合）によって一本鎖ＴＮＦαに結び付いている。一部の実施形態では、基質表層は多糖を含む。

典型的なアフェレーシスカラムを示す図である。 図１のアフェレーシスカラムの典型的な部分の拡大図を示す図である。 リガンド及び基質を含む吸着剤の一部の典型的な略図を示す図である。 リガンドを流れ去った流体によって吸着剤に与えられた力の概念的説明を示す図である。 吸着剤からのリガンド又はその一部の解離の概念的説明を示す図である。 吸着剤からのリガンド又はその一部の解離の概念的説明を示す図である。 カラムの流出物中に存在するリガンドの定常量の例示的なプロットを示す図である。 起動の際のカラムの流出物中に存在するリガンドの量の例示的なプロットを示す図である。 本開示のある特定の態様に従った、トリマーを含むリガンドの概略的な例を示す図である。 本開示のある特定の態様に従った、トリマーを含むリガンドの概略的な例を示す図である。 本開示のある特定の態様に従った２段式カラムを示す図である。 アガロース基質の調製に臭化シアンを使用するプロセスを示す図である。 ＣＮＢｒによって形成されるシアン酸エステルをアミンＲ－ＮＨ２と反応させてリガンドをアガロースに結び付けるための化学反応式である。 リガンドを、Ｎ－ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）で事前に活性化されたアガロースに結び付けるための、化学反応式である。 アガロースの表層に事前に形成されたアシルイミダゾールにアミン結合を形成することによってリガンドをアガロースに結び付けるための化学反応式である。 ２つの塩基性タイプの生化学的結合化学の結合エネルギーを示す棒グラフである。 シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）を使用して、リガンドの第１級アミンを基質に結び付けるための典型的な化学反応式である。 アミド結合によってアクリルアミド基質に結び付いているＴＮＦリガンド（各対の左側の棒）及びアミン結合によってアガロース基質に結び付いているＴＮＦリガンド（各対の右側の棒）の浸出速度のベンチテストの典型的な比較を示す図である。各流量でのアクリルアミドの浸出速度とアガロースの浸出速度との間の差は有意であった（ｐ＜０．０５）。 アミド結合で基質に結び付いている一本鎖ＴＮＦリガンド（ｓｃＴＮＦ）（Ｔｘ１、Ｔｘ２、及びＴｘ３）、及びアミン結合で基質に結び付いているｓｃＴＮＦリガンド（Ｔｘ４、Ｔｘ５、Ｔｘ６、及びＴｘ７）の浸出を比較する実験データのプロットを示す図である。

［詳細な説明］
[0034]以下の記載は、アフェレーシスカラム及びその部分の実施形態を開示している。ある特定の実施形態では、カラムは、アフェレーシス機器、例えば、血液ドナーセンターで現在使用されている機器の１つと併せて使用される。典型的な機器は、患者から全血を抽出し、血液を血液成分、例えば、赤血球、血小板及び白血球、並びに血漿に分離する。血液成分のうちの１つ、例えば血漿を、標的材料を除去するためにカラムに通してもよい。処理された血液成分及び残りの血液成分は次いでまとめられ、患者の血流内に再導入される。

[0035]以下に示す詳細な説明は、対象技術の様々な構成を説明するためのものであり、対象技術が実施され得る構成のみを表すことを目的としているわけではない。添付の図面が本明細書に組み込まれており、詳細な説明の一部を構成している。詳細な説明には、対象技術の完全な理解を提供する目的の具体的な詳細を含む。しかし、当業者には、対象技術がこれらの具体的な詳細を伴わずに実施され得ることが明らかであろう。一部の場合において、周知の構造及び成分が、対象技術の概念を曖昧にすることを避けるために、ブロック図の形態で示されている。理解を容易にするために、同様の又はほぼ類似の成分は同一の要素番号で標識されている。

[0036]本開示内で使用される場合、用語「患者」は、循環系を有するあらゆる脊椎動物を意味する。患者は、人間であり得る。患者はまた、イヌ又はネコ又はあらゆる他の哺乳動物などの動物であり得る。

[0037]本開示内で使用される場合、用語「流体」は、１つ又は複数の混和性の及び／又は非混和性の液体成分、１つ又は複数の溶解した気体成分、並びに１つ又は複数の固体又は半固体成分を含み得る、組成物を意味する。流体は、細胞、抗体、サイトカイン、ペプチド、タンパク質、及びｓＴＮＦ－Ｒなどの分子のうちの１つ又は複数を含有し得る生体液、例えば、血液、血液成分、又はこれらの一部、例えば血漿又は血清であり得る。

[0038]本開示内で使用される場合、「血液成分」という表現は、例えば遠心分離によってそこから血液を分離することができる流体のうちの１つを意味する。例えば、血液は、主に赤血球である第１の血液成分、主に血小板及び白血球である第２の血液成分、並びに主に血漿である第３の成分に分離することができるが、他のタイプの分離も可能であり、この定義に含まれる。

[0039]本開示内で使用される場合、用語「カラム」は、患者に由来する流体を通す装置を意味し、当該カラムは、流体と相互作用する材料を含有している。カラムは、サイズ及び形状において様々な構成であり得、１つ又は複数の吸着剤、基質、又はリガンドを含み得る。

[0040]本開示内で使用される場合、用語「基質」は、構造をもたらすが、基質に近接している材料と必ずしも相互作用しなくてよい、物体を意味する。基質又は基質の表層は、多糖などの１つ又は複数の有機材料を含み得、また、金属、プラスチック、セラミック、又は水などの１つ又は複数の無機材料も含み得る。基質は、物質、処置、及び／又は環境への曝露によって異なる形態、例えばオキシドに変換されている部分を含み得る。基質は、１つ又は複数の層、例えばコーティング又はめっきを含み得る。基質はまた、「支持体」とも呼ばれ得る。

[0041]ある特定の実施形態では、基質は、粒子（例えばビーズ）を含む。本開示内で使用される場合、用語「粒子」は、他の幾何学的な形状又は構造を排除することなく、基質の典型的な構造の実施形態を説明するために使用される。粒子（例えばビーズ）は、固体球体などの固体形態であり得るか、又は中空の要素若しくはオープンセルフォームなどの構造を有し得る。粒子は、単純な幾何学的形態、例えば球体若しくは棒状、又は、例えば子供用玩具のジャックスのような「多腕の星型」などの、より複雑な形態を含み得る。ある特定の実施形態では、粒子は、粒子に近接している材料と相互作用させるための他の材料、例えばリガンド又は触媒を含み得る。ある特定の実施形態では、粒子は、ビーズを含む。

[0042]ある特定の実施形態では、粒子は、球体を含む。ある特定の実施形態では、球体を含む粒子は、約１～６００μｍの範囲の平均直径、アベレージ直径、又は絶対直径を有する。ある特定の実施形態では、球体を含む粒子は、約４５～１６５μｍの範囲の又は約６０～２００μｍの範囲の平均直径、アベレージ直径、又は絶対直径を有する。粒子は、多孔性又であっても非多孔性であってもよい。一部の実施形態では、粒子は多孔性であり、約１０ｎｍ～１００ｎｍの範囲の平均直径、アベレージ直径、又は絶対直径を有する孔を含む。一部の実施形態では、粒子は、セルロース、例えばアガロース粒子である。一部の実施形態では、粒子は、セファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（商標）粒子である。

[0043]本明細書において示されているように、基質又は粒子（例えばビーズ）は、表層を含むことが多い。一部の実施形態では、表層は、１つ又は複数の炭素を含む。ある特定の実施形態では、表層は、リガンドに結び付く前に、１つ又は複数の多糖を含んでいる。ある特定の実施形態では、表層は、リガンドに結び付く前に、１つ又は複数の反応性炭素を含んでいる。ある特定の実施形態では、表層は、リガンドに結び付く前に、１つ又は複数の酸化型多糖を含んでいる。ある特定の実施形態では、表層は、リガンドに結び付く前に、１つ又は複数のアルデヒド部分を含んでいる。

[0044]ある特定の実施形態では、基質又は基質表層は、多糖を含む。ある特定の実施形態では、基質又は基質表層は、架橋型多糖を含む。ある特定の実施形態では、基質又は基質表層は、中性の又は荷電した多糖を含む。一部の実施形態では、基質又は基質表層は、セルロース（例えばアガロース）、キシラン、デキストラン、プルラン、デンプンなど、又はこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、基質又は基質表層は、リガンド分子と相互作用して安定な化学結合を形成することができる化学的に活性な連結基を有するように修飾されている。この修飾の一例は、前記基質表層をメタ過ヨウ素酸ナトリウムに曝露することによる表層活性化であり、これは、アミンを有するリガンドでの還元的アミノ化処理に関与し得るホルミル基を形成させる［表２を参照されたい］。

[0045]本開示内で使用される場合、用語「表層」には、従来の３Ｄ形態の物理的周縁と、通過しており基質に近接している流体に曝露される又は上記流体と接触し得、またリガンドが結び付いていてよい、基質の任意の部分（例えば、不溶性マトリクス）とが含まれる。

[0046]本開示内で使用される場合、用語「直径」は、構造要素の１つ又は複数の実体を含有する体積を通る液体の流れに影響する、構造の実施形態の主要な寸法を同定するために使用される。単純な構造を有する一実施形態、例えば、固体の球状のビーズでは、直径は、中心を通過する、一方の表層から他方の表層への線の長さの、一般的な定義であり得る。内部構造を有する一実施形態、例えば、単一の実体が体積を満たし得るオープンセルフォームでは、直径は、フォームを通る通路のアベレージ幅であり得る。複雑な構造を有する一実施形態、例えば、多腕の星では、直径は、実体が互いに積み重なっている場合、構造の実体の中心間のアベレージ距離であり得る。

[0047]本開示内で使用される場合、「標的成分」という表現は、リガンドを相互作用させようとしている化学物質、化合物、及び／又は有機構造を意味する。例となる相互作用としては、標的成分の捕捉が含まれ得る。特に、標的成分は、カラムを通過している流体から除去されることが望ましい有機構造であり得る。一部の実施形態では、標的成分は、可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ受容体である。

[0048]用語「リガンド」は、標的成分に結合するための親和性を有する材料を意味する。一例は、標的成分の全て又は一部へのリガンドの一部位の結合である。ある特定の実施形態では、リガンドは、基質に着脱不可能に結合している。着脱不可能に結合したリガンドへの標的成分の結合は、標的成分を基質上に保持することを目的としている。

[0049]本開示内で使用される場合、用語「着脱可能」及び「着脱不可能」は、処理の間に分子を基質に結び付けるという目的の機能を指し、これは、分子を基質から放出し得る容易性に関連する。結び付きは、化学的、物理的、又は機械的手段によって破壊することができる。結び付いている分子を処理の間に放出することを目的とした破壊が容易な結び付きを有する分子は、着脱可能であると考えられる。結び付いている分子を処理の間に保持することを目的とした比較的強い結び付きを有する分子は、着脱不可能であると考えられる。不可逆的な化学的変化を例えば介する結び付きの変更は、分子の他の特徴に影響することなく、着脱可能な分子を着脱不可能な分子に変換し得る。

[0050]本開示内で使用される場合、用語「リガンド」は、標的成分への結合親和性を有する１つ又は複数の要素を含む有機構造、例えばポリペプチド又はペプチドを意味する。要素は、組換え一本鎖ＴＮＦアルファ（ｓｃＴＮＦアルファ）などの、有機構造のうちの１つ又は複数を含み得る。要素は、一続きに、又は多腕の分枝として接続され得る。要素は、共有結合、イオン結合、疎水性結合、及びファンデルワールス力を含む様々な結合メカニズムを介して互いに連結し得、中間位置又は末端位置に化学物質、有機化合物若しくは無機化合物、又は他の要素を含み得る。リガンドは、天然のリガンドなどの生物学的リガンド、合成リガンド（例えば、人工的に作製された、例えば化学合成された）、及び／又は組換えによって産生されたリガンドであり得る。

[0051]一部の実施形態では、リガンドは、生物学的受容体に特異的に結合する。一部の実施形態では、リガンドは、可溶性リガンド（例えば、非膜結合型）である。一部の実施形態では、リガンドは、リガンドの細胞外部分を含む。一部の実施形態では、リガンドは、リガンドの受容体結合部分を含む。

[0052]ある特定の実施形態では、リガンドは、ＴＮＦα（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０１３７５）、その受容体結合部分、その受容体結合バリアント、その受容体結合融合タンパク質など、及びこれらの組み合わせを含む。天然のＴＮＦαは、ホモトリマーに組み立てられた３つの実質的に同一なモノマーを含み、これは、膜結合型又は可溶性であり得る。可溶性ＴＮＦαは、ＴＮＦαモノマーの膜貫通部分を細胞表層から切断することによって天然に生じる。膜結合型ＴＮＦα及び可溶性ＴＮＦαの両方とも、その同族受容体（すなわち、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ受容体１型、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ、ｐ５５／６０）及びＴＮＦＲ２（ＴＮＦ受容体２型、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５／８０）に結合し得る。したがって、ＴＮＦαの膜貫通部分は、受容体の結合に不要である。ＴＮＦαダイマー及びＴＮＦαトリマーの両方とも、ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２が可溶性形態又は膜結合型形態のいずれで存在しているかに関わらず、これら受容体に特異的に結合し得る。ＴＮＦαダイマーは、ＴＮＦモノマーを例えば抗体のＦｃ部分との融合タンパク質として組換え発現させることによって作製することができ、この場合、Ｆｃ部分は安定なダイマーを形成し、これが次に、ＴＮＦ分子のダイマー立体構造を安定化させる。

[0053]一部の実施形態では、ＴＮＦαは、ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２に効率的に結合し得る一本鎖ダイマー又は一本鎖トリマーとして、組換えによって産生される。一本鎖（ｓｃ）ＴＮＦαの非限定的な例としては、米国特許第８，９２７，２０５号、米国特許出願公開第２０１１／０１６２０９５号、及び米国特許出願公開第２０１４／００５６８４３号などにおいて記載されている一本鎖（ｓｃ）ＴＮＦα、その受容体結合誘導体、並びにその受容体結合部分が含まれ、これら特許及び特許出願公報の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。

[0054]一部の実施形態では、リガンドは、以下に示す配列番号１、２、及び／又は３のうちの１つ又は複数のヒトＴＮＦα配列、そのダイマー、そのトリマー、又はその受容体結合部分若しくは誘導体を含む。

[0055]
（ＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ、配列番号１）－［処理されたＴＮＦモノマー、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＱＹ７７１５０．１から］、

[0056]典型的なトリマー形態のＴＮＦα
（ＭＣＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＡＳＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ、配列番号２）；及び

[0057]別の典型的なトリマー形態のＴＮＦα
（ＧＳＡＳＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ、配列番号３）

[0058]一本鎖ＴＮＦαは、構造ＮＨ２－Ｔ_１－Ｌ_１－Ｔ_２－Ｌ_２－Ｔ_３－ＣＯＯＨを含み得、式中、Ｔ_１、Ｔ_２、及びＴ_３は、ダイマー又はトリマー立体構造に組み立てるとＴＮＦ受容体に結合し得る、ＴＮＦモノマーのポリペプチド配列、その誘導体、又はその一部を含み、Ｌ_１及びＬ_２はモノマー連結領域を含み、ＮＨ２はリガンドのＮ末端を表し、ＣＯＯＨはＣ末端を表す。

[0059]一部の実施形態では、ＴＮＦモノマーの誘導体は、ＴＮＦモノマーの誘導体が、ＴＮＦ受容体に特異的に、且つ、ネイティブなＴＮＦモノマーと比較してより高い親和性で結合する能力を保持するような、１つ又は複数の保存的なアミノ酸置換を含む。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸類似体を含み得る。

[0060]一部の実施形態では、リガンドは、リンカー又は連結要素を含む。本開示内で使用される場合、「リンカー」又は「連結要素」という表現は、２つの異なる構造（例えば、リガンド及び基質、リガンド及び基質表層、など）の間を結合する化合物又は構造を意味する。

[0061]一部の実施形態では、リンカーは、適切なペプチドリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）及び／又はＳｅｒ（Ｓ）アミノ酸を含むペプチドリンカーを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、１つ又は複数の単位（例えば、１～２０単位）のＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳ及びこれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である。一部の実施形態では、モノマー連結領域の一方又は両方は存在していないか、又は一重共有結合を含む。

[0062]一部の実施形態では、リンカーは、互いに共有結合している１つ又は複数の炭素を含む。

[0063]ある特定の実施形態では、ＴＮＦαリガンド又はそのモノマーは、ＴＮＦαリガンド又はそのモノマーの受容体結合部分を含む。ＴＮＦαリガンドの誘導体又はモノマーの受容体結合能力は、適切な方法を使用して判定することができ、当該方法の非限定的な例としては、プレートコーティングされた組換えＴＮＦ受容体（例えば、Ｆｃ受容体）及びタグ付けされた（例えば、ヒスチジンタグ付けされた、Ｆｌａｇタグ付けされた）組換えＴＮＦαリガンドを使用するＥＬＩＳＡ、又は、細胞をタグ付けされた組換えＴＮＦαと接触させることを含む、ＴＮＦ受容体を発現する細胞を使用するフローサイトメトリーに基づくアプローチが含まれる。結合のその後の検出及び／又は定量は、タグ付けされたリガンドに対する、標識された抗体を使用して行うことができる。このような方法は、当技術分野において通常のものであると考えられる。このような古典的な方法を使用して、保存的なアミノ酸置換、添加、又は欠失を含む組換えＴＮＦαリガンドの受容体結合能力は、不要な実験を必要とすることなく試験することができる。

[0064]したがって、一部の実施形態では、ＴＮＦαリガンド、又はその受容体結合誘導体若しくはバリアントは、少なくとも約１×１０^－６、１×１０^－７、１×１０^－８、又は１×１０^－９の親和性（Ｋｄ）でその同族受容体に結合するリガンドである。ある特定の実施形態では、リガンドは、少なくとも約１×１０^－６、１×１０^－７、１×１０^－８、又は１×１０^－９の親和性（Ｋｄ）でその同族受容体（例えば、ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２）に特異的に結合する、ＴＮＦα、その受容体結合ダイマー、その受容体結合トリマー、又はその受容体結合誘導体若しくは部分を含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、少なくとも約１×１０^－６、１×１０^－７、１×１０^－８、又は１×１０^－９Ｍの親和性（Ｋｄ）でその同族受容体（例えば、ヒトＴＮＦＲＳＦ１Ａ又はヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）に特異的に結合する、ヒトＴＮＦα、その受容体結合ダイマー、その受容体結合トリマー、又はその受容体結合誘導体若しくは部分を含む。

[0065]用語「特異的に結合する」は、例えば適切なインビトロアッセイ（例えば、Ｅｌｉｓａ、イムノブロット、フローサイトメトリー、及びこれらに類するもの）によって決定すると、他の分子又は他のペプチドの結合よりも優先して標的成分（例えば受容体）に結合する、リガンドに言及している。特異的結合は、非特異的結合よりも、約２倍以上、約１０倍以上、約１００倍以上、１０００倍以上、１万倍以上、１０万倍以上、又は１００万倍以上識別する。

[0066]本開示内で使用される場合、表現「結合」又は「結合要素」は、標的成分に結び付く化合物又は化学構造（例えば、リガンド又はリガンド）を意味する。ＴＮＦ－Ｒ標的成分の例では、結合要素は、ＴＮＦ－Ｒへの親和性を有する、したがってＴＮＦ－Ｒに結合する部位を含む、ＴＮＦの一部であり得る。

[0067]本開示内で使用される場合、用語「浸出」は、吸着剤又は基質からのリガンド又はその部分の喪失又は分離（例えば解離）を意味する。

[0068]本開示内で使用される場合、用語「毒性」は、カラムのアウトレットから出ていく流体が、許容できないリスクを示すと考えられる物質量を含有していることを意味する。血液が患者から受け取られ、処理され、次いで患者に戻されるケースでは、処理された血液中の材料のレベルは、患者に戻された場合に患者にとってリスクであると考えられる、患者から受け取られた血液中の材料のレベルよりも、はるかに高くなるであろう。

[0069]図１は、本開示のある特定の態様に従った典型的なアフェレーシスカラム１００を示している。カラム１００は、インレット１３０及びアウトレット１３４を有する区画１２０を含む本体１１０を含む。図１の例において、区画１２０は全体的に直円柱であり、インレット１３０及びアウトレット１３４は共に、平らな円板である。ある特定の実施形態では、区画１２０の断面の形状は、楕円形、長方形、又は他の規則的な若しくは不規則な又は平らではない幾何学的形状であり得る。ある特定の実施形態では、インレット１３０及びアウトレット１３４のうちの一方又は両方のサイズ及び形状は、区画１２０の通常の断面のサイズ及び形状と異なり得る。

[0070]区画１２０は、インレット１３０からアウトレット１３４までの理想的な流路１４０を有し、当該流路は、図１の例において直線である。ある特定の実施形態では、流路１４０は、カーブした部分、コーナー、又は他の幾何学的特徴を有し得る。区画１２０は、流路１４０に沿った１つのポイントで、流路１４０に垂直な１つの断面積を有する。ある特定の実施形態では、区画１２０は、流路１４０に沿った異なるポイントで、異なる断面積を有し得る。

[0071]ある特定の実施形態では、流体は、入口ポート１３２に入り、インレット１３０に運ばれる。同様に、ある特定の実施形態では、アウトレット１３４から出てきた流体は、出口ポート１３６に運ばれる。使用の際には、カラムは、上下逆さまを含む、いかなる方向に向いていてもよく、その結果、図１における重力の方向は、いかなる方向であってもよい。

[0072]ある特定の実施形態では、インレット１３０及びアウトレット１３４のうちの一方又は両方は、ポリエチレンビーズを共に溶融することによって製造される、「フリット」と一般に呼ばれる多孔性の薄片を含む。ビーズの直径及び圧縮の程度は、アベレージ孔サイズとなるように選択される。ある特定の実施形態では、アベレージ孔サイズは２０ミクロンである。ある特定の実施形態では、フリットは、金属又はセラミックを含むビーズを、同一の効果で焼結することによって形成される。

[0073]流入してくる流体中に存在する最も大きな要素がインレット１３０及びアウトレット１３４を通過することを可能にし、これによってカラム１００の閉塞を避ける、フリットのアベレージ孔サイズを選択することが一般に望ましい。図２のビーズ１５０などの基質を区画１２０内に保持するようにアベレージ孔サイズを選択することがさらに望ましい。

[0074]図２は、本開示のある特定の態様に従った、図１において「Ａ」と同定されている図１のアフェレーシスカラム１００の典型的な部分の拡大図を示している。ある特定の実施形態では、区画１２０は、基質、例えば図２に示される複数のビーズ１５０で、少なくとも部分的に満たされている。ある特定の実施形態では、ビーズ１５０は、１０～１００００ミクロン、２０～１０００ミクロン、３０～５００ミクロン、４０～２５０ミクロン、４５～１６５ミクロン、７５～１２５ミクロンの範囲、又は他の直径範囲であり得る直径を有する球状である。ある特定の実施形態では、ビーズ１５０は、２５、５０、７５、１００、１２５、若しくは１５０ミクロンの共通の呼び径、又は他の呼び径を有し得る。ある特定の実施形態では、ビーズ１５０は、複数の呼び径を含み得る。

[0075]流体はインレット１３０からアウトレット１３４まで流れるため、流体の実際の流路は、曲がった経路、例えば、ビーズ１５０層を通る経路１４２となる。経路１４２の長さは、理想的な流路１４０の長さよりも一般に長くなる。経路１４２の長さは、計算又は推定することができる。

[0076]ある特定の実施形態では、区画１２０は、オープンセルフォームを含む基質を含有し得る。基質の単一の実体は、区画１２０、又は区画１２０の全断面積、及び長さの一部を満たし得る。このケースにおいて、基質の「直径」は、フォームを通る通路のアベレージ幅であり得、それは、この通路幅が、基質を通過する液体の流速を、ビーズ１５０で満たされた区画１２０を通過する液体の流速を球状のビーズの直径が決定するのと類似の様式で決定するためである。同様に、オープンセルフォームを通る実際の流路は曲がり、ビーズ１５０の例で記載されている理想的な経路１４０と同一の関係を通常は有する。

[0077]カラム１００の流速は、真の経路１４２又は理想的な流路１４０のいずれかを使用して計算することができる。長さにおけるこの差の１つの影響は、経路１４２に沿ったアベレージ速度が、理想的な経路１４０を使用して計算されるアベレージ流体速度よりも速くなることである。第２に、経路１４２に沿った瞬間速度は変化し得る。経路１４２は、ビーズ１５０の局所的な充填配置に基づいて可変の空き区域を有するチャネルを通過する。カラム１００の区画１２０を通る実際の多くの流路１４２の全てのポイントに沿った実際の流体速度を正確に予測することは、不可能ではないまでも、困難である。速度に依存する特徴、例えばリガンドの浸出を決定するための実験は、図６に関してさらに論じられているように行わなければならない。

[0078]図３は、吸着剤１５１の一部の、典型的な略図を示している。この実施例では、吸着剤１５１は、基質１５２及び基質表層１５４を含んでいる。ある特定の実施形態では、基質表層１５４は、基質１５２を形成している材料の酸化型形態である。他の実施形態では、基質表層１５４は存在しておらず、基質１５２の材料が表層に露出している。他の実施形態では、基質表層１５４は、基質１５２の材料と異なる材料を含むコーティングに置き換えられている。

[0079]ある特定の実施形態では、基質表層１５４は、流体から除去しようとしている標的成分に結合するように選択されているリガンドに結び付いている。ある特定の実施形態では、流体は、血液又はその一部、例えば血漿であり、除去しようとする標的成分はＴＮＦ受容体であり、そしてリガンドが、ＴＮＦ受容体の一部に結合する。

[0080]カラム１００の寸法は、流体とリガンドとの間の所望の接触時間をもたらすような経路長さ（図２の１４０又は１４２）の選択に一部基づき得る。複数の実際の流路１４２が存在するならば、各流路は異なる長さを有している可能性があり、各経路１４２に沿った実際の接触時間は、それに応じて異なり得る。所望の接触時間は、典型的には最短接触時間である。流量及び断面積と組み合わせた、理想的な経路１４０の長さの使用は、カラム１００の最短接触時間をもたらす。

[0081]ある特定の実施形態では、リガンドは、基質表層１５４に連結している１つ又は複数のリガンド３００を含む。この実施例では、標的成分は可溶性ＴＮＦ受容体であり、リガンド３００は、ＴＮＦαトリマー３１０を含む。ある特定の実施形態では、リガンド３００は、トリマー３１０と基質表層１５４との間を結合しているリンカー３２０を含む。ある特定の実施形態では、官能基３３０がリガンド３００内に配置されていてよい。

[0082]図３の例となるリガンド３００において、トリマー３１０とリンカー３２０との間の結合３５０、リンカー３２０と官能基３３０との間の結合３５２、及び官能基３３０と表層コーティング１５４との間の結合３５４が存在する。一部のリガンドはさらなる内部構造を有し得るが、他のリガンドはこれらの構造の一部を省いていてよい。リガンド３００のこの構造は、概念を説明するための例としてのみ提供されており、概念は特定の構造に限定されない。ある特定の実施形態では、結合３５４は直接、リンカー３２０と表層コーティング１５４との間であり得る。結合３５０、３５２、３５４は、一重又は二重のイオン結合又は共有結合であり得る。結合３５０、３５２、３５４の各々は、当該結合強度を超える力がかかると結合が破壊される、結合強度を有している。

[0083]異なるタイプの結合は、異なる強度を有する。表１（出典：Ｔ．Ｌ．Ｃｏｔｔｒｅｌｌ、Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｎｇｔｈｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｏｎｄｓ、第２版、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９５８；Ｂ．ｄｅＢ．Ｄａｒｗｅｎｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、第３１号、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、１９７０；Ｓ．Ｗ．Ｂｅｎｓｏｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．４２：５０２（１９６５）；及びＪ．Ａ．Ｋｅｒｒ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．６６：４６５（１９６６））は、様々な要素間の選択された結合強度値を列挙している。結合強度は、結合のタイプ及び末梢の化学構造の両方によって、予想外であり得る様式で影響を受ける。例えば、表１の１行目は、炭素－窒素結合が、炭素に第２の窒素が結び付いており窒素に１つの酸素が結び付いている場合の同一の結合の強度よりも大きい結合強度を有することを示している。同様に、炭素と酸素との間の二重結合（５行目）は、一重結合（４行目）よりも弱い。したがって、浸出は、結合強度のみに基づいては予測することができない。

[0084]図３に戻ると、結合３５４の強度は、リガンドの浸出に関する限定的側面であり得る。結合３５４を強めると、浸出が低減し得る。基質へのリガンドの結合の強化の一例では、多糖基質が使用され、基質の表層が、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）などの無機塩を例えば使用して酸化される。基質は次いでリガンドに曝露され、このとき、リガンドの第１級アミンが、酸化された基質表層の層とシッフ塩基を形成する。これは比較的弱く、可逆的な二重結合である。この結合は、穏やかな還元剤、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_３ＣＮ）への曝露によって、一重の不可逆的結合、例えばアミン結合に変換される。

[0085]図４は、本開示のある特定の態様に従った、リガンド３００を流れ去った流体によって、例となるリガンド、すなわちリガンド３００に与えられた力の、概念的な説明を示している。流体の流れの特徴は、多くの因子、例えば、流体の粘度、流体中に懸濁された固体又は半固体の成分、及び流体と基質表層１５４との間の接着に依存する。ある特定の実施形態では、流体の流れは、基質表層１５４からの距離に関連する速度勾配を有する、特に基質表層１５４のすぐそばの層流であり得る。ある特定の実施形態では、流体の流れは、部分的に乱流であり得る。

[0086]流体の流れの特徴に応じて、力は、リガンド３００の構造のいずれか、例えば、トリマー３１０、リンカー３２０、又は官能基３３０にかけられる。これらの力は次いで、リガンド３００の結合においてせん断力及びモーメントを生じさせ得る。図４の概念的構造において、せん断力Ｆｓ１及びモーメントＭ１が結合３５４で生じ、せん断力Ｆｓ２及びモーメントＭ２が結合３５２で生じ、そしてせん断力Ｆｓ３及びモーメントＭ３が結合３５０で生じる。

[0087]図５Ａは、本開示のある特定の態様に従った、リガンド３００の内部結合の破壊の概念的な説明を示している。この実施例では、図４に示されているせん断力Ｆｓ３又はモーメントＭ３の一方が、結合３５０において、当該特定の結合の強度を超える応力を生じさせている。これが生じると、結合３５０は「破壊」され、トリマー３１０の一部を含むリガンド断片３０１が、リガンド３００の残り部分から分離された。ある特定の実施形態では、破壊３５０Ａはリンカー３２０の境界面にあり得るが、他の実施形態では、破壊は、トリマー３１０の境界面又は中間位置で生じ得る。通常、例となるリガンド（リガンド３００）に近接している流体の速度の低減は、流体中へのリガンドの浸出を低減させる。

[0088]結合３５０の破壊の前に図４のせん断力Ｆｓ２及びＭ２が結合３５２の強度を超えるケースでは、結合３５２がまず破壊される。これはほぼ同様の状況をもたらし、この場合、切り離された断片３０１は、元のリガンド３００の大部分を含む。いずれのケースにおいても、切り離された部分３０２は、トリマー３１０の一部を含む。

[0089]図５Ｂは、本開示のある特定の態様に従った、リガンド３００と基質表層１５４との間の結合の破壊の概念的な説明を示している。この実施例では、破壊３５４Ａは、官能基３３０と基質表層１５４との間にあり得る。他のシナリオでは、基質表層１５４の一部が破壊されて、基質表層１５４の残り部分から離脱し得るか、又は、官能基３３０内の結合が分離点であり得る。全てのケースにおいて、リガンド３００全体が、部分３０２として、ビーズ１５０から分離されていると考えられる。ＴＮＦアルファを含むリガンド３００のケースでは、切り離された断片３０１、３０２は、ｓｃＴＮＦアルファであると考えられ得る。

[0090]図６は、本開示のある特定の態様に従った、カラムを通る液体の流量に基づいた、流出物中に存在するリガンドの定常量、すなわち、カラムからの「浸出」の、例示的なプロット６００を示している。このタイプの実験は、カラムの特定の設計態様、例えば、区画の断面積、並びに粒子のタイプ、幾何学、及びサイズ（例えば、ビーズ直径）を決定するために使用することができる。リガンドの最も弱い結合の強度は、リガンドの構造、及びリガンドがどのように基質に結合しているかに依存し、また、区画内の局所的な流体速度は基質のタイプに応じて変化するため、リガンドを基質から切り離すための標準的な速度の閾値は存在しない。流出流体中のリガンドの量の決定は、浸出したリガンドの一部を検出するために選択される適切な実験プロセス、例えば分析クロマトグラフィーを使用して決定することができる。図３の例となるリガンドでは、トリマー３１０を検出することが好ましく、それは、トリマー３１０が、基質１５２から解離するリガンド３００の全ての断片に存在するためである。

[0091]概念的に、また理論に拘束されずに、図６は、様々な流量でカラムに流れる、リガンドを全く含有しない流体を示しており、リガンドのレベルは、カラムから流出する流体において測定される。流量Ｖ_１までは、測定可能な量のリガンドは流出流体中に存在しない。この流量を超えると、流出物中のリガンドの量は増大し始め、このことは、カラム区画内の一部の位置での局所的流体速度が、リガンドの結合の１つで生じる力がその結合の強度を超える閾値を超え、これによって、リガンド又はリガンド又はその一部が基質から解離することを示している。

[0092]概念上、流出物中のリガンドの量は、直線的に増大し得るか、又は、局所的な流体速度が、増大する区画体積において閾値を超えるため、図６に示すように指数関数的速度で増大し得る。ある特定の状況では、流路を変更し、同一の全流量でより速い局所的速度を生じさせる、基質の機械的圧縮によって例えば生じる、曲線６１０における不連続点（図６では示されていない）が存在し得る。

[0093]この実施例では、流量Ｖ_２以上の流出流体中に存在するリガンドの量は、「毒性」であると考えられる。測定可能であるが毒性レベルを下回るリガンド量、例えば、Ｖ_１を上回るがＶ_２を下回る流量で流体中に存在する量は、許容可能であり得る。ある特定の実施形態では、流出流体中のリガンドの許容可能な所定のレベルが選択される。

[0094]図７は、本開示のある特定の態様に従った、起動の際のカラムの流出物中に存在するリガンド量の例示的なプロット７００を示す図である。曲線７１０は、ポンプが時間Ｔ_１で開始する場合の、カラムを通る流量を示している。この実施例のポンプは、目的の流量まで急上昇している、ほぼ階段関数の流量プロファイルをもたらしている（右側のｙ軸）。カラムが流体で事前に充填されていても、この流れのプロファイルはカラム内で一時的な圧力波を生じさせ得、この圧力波は、定常状態の程度よりも大きな、図４を参照して記載されているようなリガンドに対するせん断力及びモーメントを生じさせ得る。その結果、リガンドの結合強度は、定常状態の流れの際よりも、カラムの区画のほとんどの部分において超えられ、その結果、曲線７２０によって示されているように、最初の流出物において、分離したリガンド断片の急上昇が生じる。流出流体中のリガンドの量が曲線７２０で示されており、これは左側のｙ軸に対応し、時間Ｔ_２でピークとなり、そして、曲線７１０の定常状態の流量に見合った定常状態レベルに低下する。この実施例では、毒性レベル７３０は定常状態値を上回っているが、曲線７２０の急上昇は毒性値を超えている。

[0095]この急上昇の影響は、ポンプの加速を制御して、流出物中のリガンドのレベルを急上昇させることなく目的の流量までゆっくりと上昇させることによって、避けることができる。許容可能な上昇速度は、いくつかの因子、例えば、流体の粘度、インレット及びアウトレットの孔サイズ、カラムの断面積、並びにビーズのサイズに応じる。ある特定の実施形態では、この急上昇は、リガンドのレベルが増大している最初の流体が転送され、患者に戻らない場合には、許容可能であり得る。

[0096]起動の際の圧力又は流れの急上昇に照らして図１のカラム１００を再び考慮すると、ある特定の特徴が、影響を軽減するか又は避けるために望ましい場合がある。ある特定の実施形態では、インレット１３０、及び同様にアウトレット１３４は、カラム１００の本体１１０に対して移動してもよい。ある特定の実施形態では、スプリング（図１では示されていない）が、インレット１３０にバイアス力をかける。ある特定の実施形態では、インレット１３０の周囲と本体１１０の内壁との間に、流体がインレット１３０を迂回することを防ぐスライディングシールがある。ある特定の実施形態では、インレット１３０の周囲のシールに近接してチャネル（図１では示されていない）が存在し、当該チャネルは、本体１１０に対するインレット１３０の移動によって覆われず、そのため、インレット１３０の周りの流体の迂回流を可能にする。この迂回流は、圧力の急激な急上昇を低減させ得、これは図７に関してさらに論じられる。

[0097]ある特定の実施形態では、区画１２０を通る流体の流れの方向は、「上方」であり、すなわち重力と反対であり、流れている流体は、図２のビーズ１５０の一部が互いに分離する、例えば「浮動する」原因となり得る。アウトレット１３４にかけられた十分なバイアス力は、この分離を防ぐことができ、「反転した」位置でのカラム１００の適正な操作を容易にし得る。

[0098]ある特定の実施形態では、起動の際の流体の急上昇は、区画１２０において、図２のビーズ１５０を圧縮する圧力波を生じさせ、カラム１００の性能の永続的な低下を生じさせ得る。流れの方向へのインレット１３０の移動は、インレット１３０を、流れ制御（図１では示されていない）と接触させ得、このことによって、インレット１３０の多孔性区域の一部が隠され、その結果、インレット１３０を通る流れが制限される。最初の流量における急上昇のケースでは、この制限は、区画１２０内での流体速度の上昇率を制限し得、これによって、ビーズ１５０の圧縮が避けられる。或いは、流れの方向へのアウトレット１３４の移動は、圧力の急上昇の際のビーズ１５０の分離を可能にすることによってビーズの圧縮を避けることができる。いずれのケースにおいても、スプリングが、圧力の急上昇が消えた後に、インレット１３０又はアウトレット１３４を元の位置に戻す。

[0099]図８Ａは、本開示のある特定の態様に従った、トリマー８１０を含むリガンド８００の概略的な例を示している。トリマー８１０は、互いに近接して配置された、有機構造の３つのモノマー８１２、例えばＴＮＦアルファを有している。各モノマー８１２は、モノマー８１２に近接している流体の標的成分の一部、例えば血漿中のＴＮＦＲ１に連結する構造を有する、１つ又は複数の部位を含む。モノマー８１２Ａは、モノマー８１２Ａ及び基質８３２の各々への化学結合、例えばイオン結合又は共有結合を形成するリンカー構造８３２によって、基質８３０に連結される。モノマー８１２Ｂ及び８１２Ｃは、電磁吸引、例えばファンデルワールス力、又は水素結合を介して、モノマー８１２Ａに連結される。イオン結合又は共有結合とは異なり、電磁吸引は、化学結合の結果によって生じず、比較的弱く、したがって、妨害をより受けやすい。その結果、モノマー８１２Ｂ及び８１２Ｃは、モノマー８１２Ａを基質８３２から分離するために必要な力よりも低いレベルの力を加えることで、モノマー８１２Ａから分離することができる。

[00100]図８Ｂは、本開示のある特定の態様に従った、トリマー８６０を含むリガンド８５０の概略的な例を示している。トリマー８６０は、有機構造の３つのモノマー８１２、例えばＴＮＦアルファを有しており、当該モノマーは、リンカー８３３を介して互いに連結して、モノマー８１２のうちの１つの一方の末端でリンカー構造８３２によって基質８３０に連結された一本鎖構造を形成している。リンカー８３２、８３３は、両側で構造への化学結合を形成しているため、リガンド８６０の任意の部分、例えばモノマー８１２の１つを基質８３０から切り離すためには、リンカー８３２、８３３に、リガンド８００の一部、例えばモノマー８１２Ｂ又は８１２Ｃを基質８３０から分離するために必要な力よりも高いレベルの力を加える必要がある。したがって、この形態でトリマー８６０を形成すると、同一の条件下での、例えば、流体の粘度及び相対速度、温度、基質の組成、及びモノマー構造の下での、リガンド８００の一部の浸出と比較して、基質８３２に近接して通過する流体へのリガンド８５０の一部の浸出への抵抗力が増大する。

[00101]図９は、本開示のある特定の態様に従った２段式カラム９００を示している。ある特定の実施形態では、１段目９０１は一般に、ハウジング１１０、第１の基質９１０、例えば、入口ポート１３２に流入する流体の成分を捕捉するリガンドを含有する区画１２０を有する、図１のカラムである。出口ポート１３６は、２段目９０２の入口ポート１３２Ｂに連結されており、当該２段目は、第２の効果、例えば基質９１０から分離したリガンドの断片の捕捉を有する第２の基質９２０を含有する区画１２０Ｂを有する。２段目９０２は、出口ポート１３６Ｂから流出する流体中に基質９１０のリガンドが存在するリスクを低減させるためのものである。

[00102]表２（出典：Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２、Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）は、電気泳動による高分子の分離のために分子生物学において頻繁に使用される多糖ポリマーであるアガロースを含む支持体に結び付けられている抗体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の漏出又は「浸出」を列挙している。ＩｇＧは、ラジオイムノアッセイ及び体外のタンパク質を伴う他のガンマカウンティング手順における抗体のタグ付けに一般に使用される放射性同位体であるヨウ素１２５（^１２５Ｉ）でタグ付けされた。タグ付けされたＩｇＧは、図１０Ａ～図１０Ｄにおいて記載されているように、異なる方法を使用してアガロースに結び付けられた。カウント毎分（ｃｐｍ）で測定された最初の放射能量、及び２８日間の期間にわたり基質から浸出したＩｇＧを標本について測定し、次いで、標準化された比較を得るように比較した。

[00103]表２から、標準化された漏出が、アミンを使用してリガンドを基質に結び付ける様々な方法において、１桁以上変化することが分かる。この表における最初の項目は、図１０Ａ～図１０Ｂで示されているプロセスに関連している。ＣＮＢｒ－アガロース、ＣＤＩ－アガロース、及び還元的アミノ化の漏出率は、特に、これらが標準偏差範囲を本質的に有する実験的測定値であることを考慮すると、全て同様である。このタイプの、ベンチテストでの特徴付けに基づくと、結合タイプの間のこの小さな差からは、還元的アミノ化が他の結び付き方法よりも浸出を有意に少なくすることは予測されない。このことは、図１４のデータで見られる及び以下でさらに論じられる浸出の大きな（２桁の）低減と対照的である。

[00104]図１０Ａは、本開示のある特定の態様に従った、アガロース基質の調製に臭化シアン（ＣＮＢｒ）が使用されるプロセスを示している。アガロースは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）に曝露され、水酸化ナトリウムは、アガロースのヒドロキシル基と反応してシアン酸エステルＭ－Ｏ－Ｃ－Ｎ≡Ｃを形成する。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、シッフ塩基の形成、及びそれに次ぐ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでの処置による還元的アミノ化での変換は、より強度の強い結合をもたらし得る。

[00105]図１０Ｂは、ＣＮＢｒによって形成されたシアン酸エステルとアミンＲ－ＮＨ_２とを反応させて、イソ尿素誘導体を形成させることによってタンパク質リガンドをアガロースに結び付けるための化学式であり、これは、表２の最初の項目に関連する。

[00106]図１０Ｃは、ＮＨＳエステルへのアミン結合を形成することによって、タンパク質リガンドを、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で事前に活性化されたアガロースに結び付けるための化学式であり、これは、表２の４番目の項目に関連する。

[00107]図１０Ｄは、アガロースの表層に事前に形成されたアシルイミダゾールへのアミド結合を形成することによって、タンパク質リガンドをアガロースに結び付けるための化学式である。

[00108]図１１は、本開示のある特定の態様に従った、２つの塩基性タイプの生化学的結合化学、すなわちアミン及びアミドの、１ｍｏｌ当たりのキロジュール（ｋＪ／ｍｏｌ）で測定された結合エネルギーのプロット１０００である。データは、Ｉ．Ｉ．Ｍａｒｏｃｈｋｉｎら、Ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｅｎｔｈａｌｐｉｅｓ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｎ ＮＡＣ ｂｏｎｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈ、Ｃｏｍｐ ａｎｄ Ｔｈｅｏ Ｃｈｅｍ ９９１（２０１２）１８２～１９１、及びＪ．Ｌａｌｅｖｅｅら、Ｎ－Ｈ ａｎｄ ｒ（Ｃ－Ｈ） Ｂｏｎｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｅｎｔｈａｌｐｉｅｓ ｏｆ Ａｌｉｐｈａｔｉｃ Ａｍｉｎｅｓ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２、１２４、９６１３～９６２１のものである。アミンのアベレージ結合エネルギーはアミドの結合エネルギーよりも低いが、アミドの分散１０２０はアミンの分散１０１０よりも大幅に広い。その結果、２つの化学の実際の結合エネルギーが異なるとは予想されない。

[00109]その例が表１及び図１１で示されている既存の実験データに基づくと、基質へのリガンドの結び付きの強度を化学又は調製シーケンスに基づいて予測することは不可能である。図１１の模範的なデータに基づくと、アミン結合はアミド結合よりも弱いと予想される。

[00110]図１２は、本開示のある特定の態様に従った、基質へのタンパク質リガンドの結び付きについての典型的な化学式である。多糖を例えば含む基質表層は酸化されて、基質の表層にホルミル基を形成している。第１級アミンへの曝露によって表層にシッフ塩基が形成されるが、これは非常に可逆的であり、したがって、基質への取り外し不可能な結合としては不適切である。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_３ＣＮ又はＮａＣＮＢＨ_３）へのその後の曝露は、シッフ塩基を強力な不可逆的な第２級アミンの結合に変換する。

[00111]図１３は、本開示のある特定の態様に従った、基質と結合タイプとの２つの組み合わせのベンチテストでの浸出速度の典型的な比較１３００を示している。縦棒の左側のセットは、アミド結合がＴＮＦアルファリガンドをビーズに結び付けているアクリルアミドビーズを使用するカラムで得られた測定値である。縦棒の右側のセットは、図１２の方程式によって形成されたもののような、アミン結合がＴＮＦアルファリガンドをビーズに結び付けているアガロースビーズを使用する同一のカラムから得られた測定値である。「ひげ」の棒は、それぞれのカラムのデータセットの複数の測定値の統計上の分散を表している。図１１によって示差されている傾向とは対照的に、アミン結合が少ない浸出を可能にすること、すなわち、基質へのリガンドのより強力な結び付きを形成したことが分かる。２つ以上の連結を基質表層に配している個々のポリペプチドへの複数の連結が全体的な結合強度を増大させ得ることは、本発明者らの注目を引いた。この可能性は、全体的な能力がアミン連結では結合リガンドのモル量を７倍超えており（データは示されていない）、それに対してアミド連結では１０倍超えているため、この例では低くなっている。したがって、各ケースにおけるリガンド密度は、利用可能な活性部位よりもかなりの程度で低い。２つのシステムの間の差は、全ての流量で統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。浸出は様々な流量で測定され、結合タイプ及び基質のいずれの組み合わせも、より少ない流量で、浸出速度の異なる低減を示した。

[00112]図１４は、本開示のある特定の態様に従った、２つのシステムの浸出を比較する実験データのプロット１１００を示している。ｓＴＮＦ－Ｒを除去するための処置を、単一の患者に６回の連続する期間で繰り返し投与し、当該期間のデータを、時間的順序でＴｘ１～Ｔｘ６群によって示す。処置は、本明細書において開示されているカラム内のリガンドとしてＴＮＦアルファを使用し、したがって、流出物中のｓｃＴＮＦアルファが浸出の指標である。各期間の間に、処置された血漿（カラムからの流出物）中のｓｃＴＮＦアルファのレベルを３０分間隔でサンプリングし（処置当たり５回）、測定し、そして縦棒１１１０としてプロットした。１１２０群における最初の３つの期間（Ｔｘ１～Ｔｘ３）は、アミド結合で基質に結合したリガンドを含むカラムシステムＡで行った。Ｔｘ１～Ｔｘ３の間の流出物中のｓｃＴＮＦアルファの最初のレベル（Ｄ１）が１マイクロリットル当たり２５０～３５０ピコグラム（ｐｇ／ｍｌ）の範囲であり、その後のレベルは、各処置の過程で２０～４０ｍｇ／ｐｌの範囲の最終レベルまで単調な様式で低下していることが分かる。１１３０群の期間Ｔｘ４～Ｔｘ７は、本明細書において記載されるカラムシステムＢで行われ、システムＢは、酸化された表層と、不可逆的な第２級アミンの結合で基質に結合している同一のリガンドとを有する基質を含んでいた。各期間Ｔｘ４～Ｔｘ７の流出物中におけるｓｃＴＮＦアルファの測定値の５つ全てが、２０ｐｇ／ｍｌを下回っており、ほとんどは５ｐｇ／ｍｌを下回っている。

[00113]浸出速度は、吸着剤を含むカラムを血液成分が流れる一定期間にわたる、基質から解離するリガンドの量である。浸出速度は、一定期間後にカラム通過画分において検出されるリガンドの量によって決定されることが多い。初回浸出速度は、所定の流量（例えば、１０ｍｌ／分）での所定の時間（例えば、１～１０分間）にわたるリガンドと血液生成物との最初の接触後に測定される浸出速度である。浸出速度は、リガンドを含むカラムを含む適切なアフェレーシスシステムを使用して測定することができ、患者の血液又は血液成分（例えば、血漿又は血清）がカラムに流される。浸出速度又は初回浸出速度は、適切な検出方法を使用して決定することができる。

[00114]ある特定の実施形態では、吸着剤は、基質表層からの解離に対して抵抗性があるリガンドを含む。基質からのリガンドの解離は、浸出速度又は初回浸出速度を測定することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、リガンドは、リガンドを基質に結び付ける結合（例えば、アミン結合）を含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、リガンドを基質に結び付けるリンカーを含む。一部の実施形態では、アミン結合によって又はアミン結合を含むリンカーによって基質に結び付いているリガンドは、別のタイプの結合によって基質に結び付いているリガンドよりも解離に対して抵抗性がある。ある特定の実施形態では、リガンドは、アミド結合、二重結合、三重結合、ＮＣ－ＮＯ、Ｃ－Ｏ、Ｃ＝Ｏ、ＯＣ＝Ｏ、ＯＣ－Ｎ、Ｎ－Ｎ、Ｎ＝Ｎ、Ｓ－Ｓなど、又はこれらの組み合わせから選択される結合によって同一の基質に結び付いている同一のリガンドと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、基質からの解離に対して抵抗性がある。ある特定の実施形態では、リガンドは、アミド結合によって又はアミド結合を含むリンカーによって同一の基質に結び付いている同一のリガンドを含む別のリガンドと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、基質からの解離に対して抵抗性がある。

[00115]ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるリガンドは、１０ｍｌ／分の流量で約５０ｐｇ／ｍｌ未満、約１０ｐｇ／分未満、約７ｐｇ／ｍｌ未満、約５ｐｇ／分未満、又は約２ｐｇ／ｍｌ未満の、基質からのリガンドの初回浸出速度を示している。一部の実施形態では、本明細書において記載されるリガンドは、１０ｍｌ／分の流量で、約１～１０分間、１～５分間、又は約２～３分間の一定時間にわたり測定した場合、約５０ｐｇ／ｍｌ未満、約２５ｐｇ／ｍｌ未満、約２０ｐｇ／ｍｌ未満、約１０ｐｇ／ｍｌ未満、又は約５ｐｇ／ｍｌ未満の、基質からのリガンドの初回浸出速度を示している。

[00116]血液濾過カラムの開示されている例は、特定の血液成分、例えばｓＴＮＦ－Ｒを血液から除去することによって患者を処置し、これによって、ｓＴＮＦ－Ｒによってマスキングされているある特定の腫瘍を患者の免疫系が認識し、攻撃することを可能にする文脈で提示されている。リガンド、特にこの実施例のＴＮＦアルファの浸出のこれまでの制限的副作用は、リガンドへの機械的ダメージを避けるようにカラム内での流体速度を慎重に制御することによって予防される。この従来型のリスクを除去することで、この形態のアフェレーシスの使用は、他の治療法では治りにくいとされている状態を処置するための、実行可能で安全な方法となる。

[00117]本願は、当業者が本明細書において記載される様々な態様を実施することを可能にするために提供されている記載を含む。これまでの記載は、最良の態様及び／又は他の例であると考えられるものを記載しているが、これらの態様に対する様々な修正が当業者には容易に明らかとなること、及び本明細書において定義される一般的原理が他の態様にも適用され得ることが理解される。開示されているプロセスにおけるステップ又はブロックの具体的な順序又は階層が典型的なアプローチの説明であることが理解される。設計の優先傾向に基づいて、プロセスにおけるステップ又はブロックの具体的な順序又は階層が並べ替え可能であることが理解される。添付の方法クレームは、様々なステップの要素をサンプルとなる順序で提示しており、提示されている具体的な順序又は階層に限定されるものではない。したがって、特許請求の範囲は、本明細書において示されている態様に限定されるものではなく、記載されている特許請求の範囲と一致する全範囲である。

［典型的な実施形態］
[00118]一実施形態では、カラムは、断面積を有する区画と、直径を有し、上記区画内に配置されているビーズと、ビーズに連結されており、成分に結合するように選択されているリガンドとを有する。断面積及びビーズ直径は、区画内の流体の流速を第１の閾値未満で維持するように選択されている。リガンドは１つのリガンドを含み得、リガンドは、ＴＮＦアルファ、又はその部分若しくは機能的断片若しくは機能的バリアント、又はＴＮＦアルファのトリマーを含み得る。第１の閾値は、アウトレットから流出する流体におけるリガンドの量を所定のレベル未満に維持するように選択され得る。第１の閾値は、流体によってリガンドに与えられる力を第２の閾値未満に維持するように選択され得、これによって、流体中へのリガンドの浸出が低減する。リガンドは強度を有する結合を含み得、力を第２の閾値未満に維持することで、結合の破壊を回避することができる。ビーズはアガロースを含み得、結合はアミン結合を含み得る。力は、せん断力及びモーメントのうちの１つ又は複数を含み得、第２の閾値は、せん断力に関連する第３の閾値及びモーメントに関連する第４の閾値のうちの１つ又は複数を含み得る。区画は、インレット、アウトレット、及びインレットからアウトレットへの流路をさらに含み得、流路は、流体とリガンドとの間の接触時間をもたらすように選択され得る長さを有し得る。ビーズは、複数のビーズを含み得る。リガンドは、複数のビーズの各々にそれぞれ連結されているその複数の部分を含み得る。リガンドは、取り外し不可能にビーズに連結されていてよい。

[00119]一実施形態では、方法は、患者から血液を受け取るステップ、血液を少なくとも２つの血液成分に分離するステップ、血液成分のうちの１つの一部を、断面積を有し、且つ複数のビーズを含有する区画に通すステップであって、上記ビーズが、直径を有し、且つ成分に結合するように選択されているリガンドを結合しており、上記断面積及びビーズ直径が、区画内の血液成分の流速を第１の閾値未満で維持するように選択されている、ステップ、少なくとも２つの血液成分を共に混合するステップ、並びに混合した血液成分を患者に戻すステップのうちの１つ又は複数を含む。第１の閾値は、流体によってリガンドに与えられる力を第２の閾値未満に維持するように選択され得る。リガンドは強度を有する結合を含み得、力を第２の閾値未満に維持することで、結合の破壊を回避することができる。力は、せん断力及びモーメントのうちの１つ又は複数を含み得、第２の閾値は、せん断力に関連する第３の閾値及びモーメントに関連する第４の閾値のうちの１つ又は複数を含み得る。リガンドは、取り外し不可能にビーズに連結されていてよい。

[00120]ある特定の実施形態では、リガンドは、１つ又は複数のリンカー又はリンカー要素を含む。

[00121]リンカーは、基質の表層に及びリガンドに共有結合によって結び付いていてよい。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの炭素（例えば、基質表層の炭素）及び少なくとも１つの窒素（例えば、リガンドの窒素）を含む。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも１つの炭素は、基質の表層に由来する。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも１つの炭素は、基質表層のホルミル基に由来する。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも１つの窒素は、リガンドに由来する。ある特定の実施形態では、リンカーの窒素は、リガンドの第１級アミンに由来する。ある特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも２つの炭素及び１つの窒素を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、１つの炭素及び１つの窒素を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、基質の表層に由来する炭素をリガンドの第１級アミンに由来する窒素に結合する一重共有結合を含む。一部の実施形態では、リンカーは酸素を含まない。ある特定の実施形態では、リンカーは、二重結合も三重結合も含まない。ある特定の実施形態では、リンカーはカルボニル基を含まない。ある特定の実施形態では、リンカーは硫黄を含まない。ある特定の実施形態では、吸着剤は、１つ又は複数のリンカー（例えば、複数のリンカー）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、以下に示す構造（Ｉ）：

であって、式中、Ｍが基質又は基質表層（例えば、アガロースビーズ）であり、Ｒがリガンド（例えば、ｓｃＴＮＦα）であり、且つＲ_２が、不在、アルキル、置換されたアルキル、単糖、又はＣＨ_２である、構造を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、構造Ｍ－Ｒ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｒ_３－Ｒ又はＭ－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｒを含み、式中、Ｍは基質又は基質表層（例えば、アガロースビーズ）であり、Ｒはリガンド（例えば、ｓｃＴＮＦα）であり、且つＲ_２及びＲ_３の各々は、独立して、不在、アルキル、又は置換されたアルキルである。一部の実施形態では、Ｍ（上記の構造（Ｉ）の）又はＲ_２は、単糖、多糖、又はセルロースを含む。ある特定の実施形態では、Ｒ_２は、存在する場合、Ｏ（酸素）ではない。一部の実施形態では、Ｒ_３は、アミノ酸又はアミノ酸側鎖を含む。ある特定の実施形態では、基質又は基質表層は、アミン（例えば、第２級アミン）によってリガンドに結び付いている。

[00122]一実施形態では、吸着剤は、基質、リンカー、及びリガンドを含み、リンカーは基質及びリガンドに結び付いており、これによって、基質がリガンドに結合している。

[00123]一実施形態では、カラムは、粒子がその内部に配置されている区画、基質及び基質に結合しているリガンドを含む粒子、標的成分に結合する部位をそれぞれが含む少なくとも２つのモノマーを含むリガンド、モノマーのうちの２つの間の第１のリンカー、並びにモノマーの１つと基質との間の第２のリンカーを含む。

[00124]一実施形態では、方法は、患者から血液を受け取るステップ、血液を少なくとも２つの血液成分に分離するステップ、血液成分のうちの１つの一部をリガンドに近接して通すステップであって、リガンドが、成分に連結する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマー、及びモノマーのうちの２つの間の化学結合によって結合されている第１のリンカー、及びモノマーの１つと基質との間の化学結合によって結合されている第２のリンカーを含む、ステップ、少なくとも２つの血液成分を共に混合するステップ、並びに混合した血液成分を患者に戻すステップのうちの１つ又は複数を含む。

[00125]一実施形態では、方法は、基質を酸化させるステップ、ＴＮＦアルファの一部を含むリガンドと酸化された基質との間でシッフ塩基を形成させるステップ、及びシッフ塩基を第２級アミンの結合に変換するステップのうちの１つ又は複数を含む。

[00126]見出し及び小見出しは、存在している場合、利便性のためのみに使用されており、本発明を限定しない。

[00127]単数形の要素への言及は、具体的にそのように言及されていない限り、「ただ１つ」を意味するものではなく、むしろ「１つ又は複数」を意味する。冠詞「ａ」及び「ａｎ」の使用は、「少なくとも１つ」という表現と同等であると解釈される。別段のことが具体的に言及されていない限り、用語「１セット」及び「一部の」は、１つ又は複数を指す。

[00128]本開示において使用される「一番上」、「一番下」、「上部」、「下部」、「左側」、「右側」、「前側」、「後ろ側」、及びこれらに類するものなどの用語は、通常の重力基準系よりむしろ、任意の基準系を参照していると理解されるべきである。したがって、上面、下面、前面、及び後面は、重力基準系では上方に、下方に、斜めに、又は水平に広がり得る。

[00129]男性代名詞（例えば、ｈｉｓ）は女性及び中性（例えば、ｈｅｒ及びｉｔｓ）を含み、また逆の場合も同様である。当業者に公知の又は後に公知となる、本開示を通して記載されている様々な態様の要素に対する全ての構造的及び機能的同等物は、参照によって本明細書に明確に組み込まれ、特許請求の範囲に包含されるものである。さらに、本明細書において開示されているもののいずれも、このような開示が特許請求の範囲において明確に記載されているかどうかに関わらず、公衆に提供されることを意図したものではない。特許請求の範囲のいずれの要素も、その要素が「～のための手段」という表現を使用して明確に記載されていない限り、又は、方法クレームのケースではその要素が「～のための操作」という表現を使用して記載されていない限り、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第６項の規定の下にあると解釈されない。

[00130]「態様」などの表現は、このような態様が対象技術に必須であること、又はこのような態様が対象技術の全ての構成に適用されることを意味するわけではない。１つの態様に関連する開示は、全ての構成、又は１つ若しくは複数の構成に適用され得る。態様などの表現は１つ又は複数の態様を指し得、また逆の場合も同様である。「態様」などの表現は、このような態様が対象技術に必須であること、又はこのような態様が対象技術の全ての構成に適用されることを意味するわけではない。１つの態様に関連する開示は、全ての実施形態、又は１つ若しくは複数の実施形態に適用され得る。態様などの表現は１つ又は複数の態様を指し得、また逆の場合も同様である。

[00131]「典型的な」という語は、「例又は説明として機能する」ことを意味するために本明細書において使用される。本明細書において「典型的な」と記載されるあらゆる態様又は設計は、他の態様又は設計よりも好ましい又は有利であると必ずしも解釈されない。

[00132]当業者に公知の又は後に公知となる、本開示を通して記載されている様々な態様の要素に対する全ての構造的及び機能的同等物は、参照によって本明細書に明確に組み込まれ、特許請求の範囲に包含されるものである。さらに、本明細書において開示されているもののいずれも、このような開示が特許請求の範囲において明確に記載されているかどうかに関わらず、公衆に提供されてはいない。特許請求の範囲のいずれの要素も、その要素が「～のための手段」という表現を使用して明確に記載されていない限り、又は、方法クレームのケースではその要素が「～のためのステップ」という表現を使用して記載されていない限り、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第６項の規定の下にあると解釈されない。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、又はこれらに類する用語が明細書又は特許請求の範囲において使用される限りにおいて、このような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が特許請求の範囲において移行語として利用される場合に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が解釈される様式と類似の様式で包括的なものある。

[00133]本開示の実施形態を詳細に記載し、説明してきたが、当該実施形態は説明及び例示のためのものにすぎず、限定するためのものではないことが明らかに理解され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。

追加の実施形態
Ａ１．流体から成分を除去するためのカラムであって、上記カラムは、
断面積を含む区画と、
直径を有し、上記区画内に配置されているビーズと、及び
上記ビーズに連結されており、前記成分に結合するように選択されているリガンドと、
を含み、
上記断面積及びビーズ直径が、上記区画内の上記流体の流速を第１の閾値未満に維持するように選択されている、カラム。

Ａ２．上記ビーズが複数のリガンドを含む、実施形態Ａ１に記載のカラム。

Ａ３．上記リガンドが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）の一部を含む、実施形態Ａ１又はＡ２に記載のカラム。

Ａ４．上記リガンドが、ＴＮＦアルファの部分のトリマーを含む、実施形態Ａ１～Ａ３のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ５．上記第１の閾値が、アウトレットから流出する流体におけるリガンドの量を所定のレベル未満に維持するように選択されている、実施形態Ａ１～Ａ４のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ６．上記第１の閾値が、流体によってリガンドに与えられる力を第２の閾値未満に維持し、これによって、流体中へのリガンドの浸出が低減するように選択されている、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ７．上記リガンドが、強度を有する結合を含み、且つ
上記力を第２の閾値未満に維持することで、結合の破壊が回避される、
実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ８．上記ビーズがアガロースを含み、且つ
上記結合がアミン結合を含む、
実施形態Ａ１～Ａ７のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ９．上記力が、せん断力及びモーメントのうちの１つ又は複数を含み、且つ
上記第２の閾値が、せん断力に関連する第３の閾値及びモーメントに関連する第４の閾値のうちの１つ又は複数を含む、
実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ１０．上記区画が、インレット、アウトレット、及びインレットからアウトレットへの流路をさらに含み、
上記流路が長さを有し、且つ
上記長さが、流体とリガンドとの間の接触時間をもたらすように選択されている、
実施形態Ａ１～Ａ９のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ１１．上記ビーズが、複数のビーズを含み、且つ
上記リガンドが、複数のビーズの各々にそれぞれ結合しているリガンドの複数の部分を含む、
実施形態Ａ１～Ａ１０のいずれか一項に記載のカラム。

Ａ１２．上記リガンドが、取り外し不可能にビーズに結合している、実施形態Ａ１～Ａ１１のいずれか一項に記載のカラム。

Ｂ１．患者の血液から標的成分を除去する方法であって、
患者から血液を受け取るステップ、
血液を少なくとも２つの血液成分に分離するステップ、
血液成分のうちの１つの一部を、断面積を有し、且つ複数のビーズを含有する区画に通すステップであって、上記ビーズが、直径を有し、且つ成分に結合するように選択されているリガンドを連結しており、上記断面積及びビーズ直径が、区画内の血液成分の流速を第１の閾値未満で維持するように選択されている、ステップ、
少なくとも２つの血液成分を共に混合するステップ、並びに
混合した血液成分を患者に戻すステップ
を含む、患者の血液から標的成分を除去する方法。

Ｂ２．上記第１の閾値が、流体によってリガンドに与えられる力を第２の閾値未満に維持するように選択されている、実施形態Ｂ１に記載の方法。

Ｂ３．上記リガンドが、強度を有する結合を含み、且つ
上記力を第２の閾値未満に維持することで、結合の破壊が回避される、
実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。

Ｂ４．上記力が、せん断力及びモーメントのうちの１つ又は複数を含み、且つ
上記第２の閾値が、せん断力に関連する第３の閾値及びモーメントに関連する第４の閾値のうちの１つ又は複数を含む、
実施形態Ｂ１～Ｂ３のいずれか一項に記載の方法。

Ｂ５．上記リガンドが、着脱不可能にビーズに結合している、実施形態Ｂ１～Ｂ４のいずれか一項に記載の方法。

Ｃ１．流体から成分を除去するためのリガンドであって、
上記成分に結合する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマー、
上記モノマーのうちの２つの間の化学結合によって連結された第１のリンカー、及び
上記モノマーのうちの１つと基質との間の化学結合によって連結された第２のリンカー
を含む、リガンド。

Ｃ２．上記リガンドが、３つのみのモノマーを含む、実施形態Ｃ１に記載のリガンド。

Ｃ３．上記リガンドが、２つのみの第１のリンカーを含む、実施形態Ｃ１又はＣ２に記載のリガンド。

Ｃ４．上記リガンドが、ただ１つの第２のリンカーを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３のいずれか一項に記載のリガンド。

Ｃ５．上記第２のリンカーがアミン結合を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか一項に記載のリガンド。

Ｃ６．上記モノマーが、サイトカイン受容体に結合する部位を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５のいずれか一項に記載のリガンド。

Ｃ７．上記モノマーが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか一項に記載のリガンド。

Ｄ１．流体からの成分の除去において使用するためのビーズであって、
基質、及び
基質に連結しているリガンド、を含み、前記リガンドが、
成分に連結する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマー、
モノマーのうちの２つの間で連結されている第１のリンカー、及び
モノマーのうちの１つに連結されており、化学結合によって基質に連結されている、第２のリンカー
を含む、ビーズ。

Ｄ２．上記基質が部分的に酸化されている、実施形態Ｄ１に記載のビーズ。

Ｄ３．上記基質が多糖を含む、実施形態Ｄ１又はＤ２に記載のビーズ。

Ｄ４．上記第２のリンカーの上記化学結合がアミン結合を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ３のいずれか一項に記載のビーズ。

Ｅ１．流体からの成分の除去において使用するためのカラムであって、
区画、
区画内に配置されているビーズ
を含み、上記ビーズが、
基質、及び
前記基質に連結されているリガンドを含み、上記リガンドが、
上記成分に連結する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマー、
上記モノマーのうちの２つの間の化学結合によって連結されている第１のリンカー、及び
モノマーのうちの１つと基質との間の化学結合によって連結されている第２のリンカー
を含む、カラム。

Ｆ１．患者の血液から標的成分を除去する方法であって、
上記患者から血液を受け取るステップ、
上記血液を少なくとも２つの血液成分に分離するステップ、
上記血液成分のうちの１つの一部をリガンドに近接して通すステップ
であって、上記リガンドが、
成分に連結する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマー、
モノマーのうちの２つの間の化学結合によって連結している第１のリンカー、及び
モノマーのうちの１つと基質との間の化学結合によって連結されている第２のリンカーを含む、ステップ、
少なくとも２つの血液成分を共に混合するステップ、並びに
混合した血液成分を患者に戻すステップ
を含む、方法。

Ｇ１．アフェレーシス粒子を調製する方法であって、
基質を酸化させるステップ、
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）の一部を含むリガンドと酸化された基質との間でシッフ塩基を形成させるステップ、及び
シッフ塩基を第２級アミンの結合に変換するステップ
を含む、方法。

Ｇ２．基質を酸化させる上記ステップが、基質を無機塩に曝露することを含む、実施形態Ｇ１に記載の方法。

Ｇ３．上記無機塩が、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む、実施形態Ｇ２に記載の方法。

Ｇ４．シッフ塩基を第２級アミンの結合に変換する上記ステップが、基質を還元剤に曝露することを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ３のいずれか一項に記載の方法。

Ｇ５．上記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ４のいずれか一項に記載の方法。

Ｈ１．対象の血液から標的成分を除去するための吸着剤であって、前記吸着剤が、
表層を含む基質、
アミン結合を含むリンカー、及び
ＴＮＦαを含むリガンド
を含み、
上記リンカーが、基質及びリガンドに結び付いている、吸着剤。

Ｈ２．構造（Ｉ）

を含む、実施形態Ｈ１に記載の吸着剤であって、
式中、Ｍが基質であり、Ｒがリガンドであり、且つリンカーが－Ｒ_２－ＣＨ２－ＮＨであり、Ｒ_２が不在、アルキル、又は置換されたアルキルである、吸着剤。

Ｈ３．上記Ｒ_２がＣＨ_２である、実施形態Ｈ２に記載の吸着剤。

Ｈ４．上記基質が複数のリガンドを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ３のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ５．上記基質が、粒子又はビーズを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ４のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ６．上記基質が多糖を含む、実施形態Ｈ１～Ｈ５のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ７．上記基質がセルロースを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ６のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ８．上記基質が、約６０～２００μｍの範囲の平均直径、アベレージ直径、又は絶対直径を有する、実施形態Ｈ１～Ｈ７のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ９．上記基質が、約４５～１６５μｍの範囲の平均直径、アベレージ直径、又は絶対直径を有する、実施形態Ｈ１～Ｈ８のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１０．上記基質が多孔性である、実施形態Ｈ１～Ｈ９のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１１．上記リガンドが、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドの少なくとも３つのモノマーを含むトリマーを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ１０のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１２．上記３つのモノマーのうちの少なくとも２つが同一である、実施形態Ｈ１１に記載の吸着剤。

Ｈ１３．上記リガンドが一本鎖ＴＮＦαを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ１２のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１４．上記リンカーのＮが、リガンドの第１級アミンに由来する、実施形態Ｈ１～Ｈ１３のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１５．上記リンカーのＣＨ_２が基質に由来する、実施形態Ｈ１～Ｈ１４のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１６．上記リガンドと上記基質との比が少なくとも５０：１である、実施形態Ｈ１～Ｈ１５のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１７．上記リガンドが、アミド結合、二重結合、三重結合、ＮＣ－ＮＯ、Ｃ－Ｏ、Ｃ＝Ｏ、ＯＣ＝Ｏ、ＯＣ－Ｎ、Ｎ－Ｎ、Ｎ＝Ｎ、及びＳ－Ｓから選択される結合によって第２の基質に結び付いている第２のリガンドと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、基質からの解離に対して抵抗性がある、実施形態Ｈ１～Ｈ１１のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１８．上記基質からの上記リガンドの初回浸出速度が、１０ｍｌ／分の流量で約１０ｎｇ／分未満又は約５ｎｇ／分未満である、実施形態Ｈ１～Ｈ１７のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｈ１９．前記基質からの前記リガンドの初回浸出速度が、１０ｍｌ／分の流量で、約２分間の一定期間にわたり測定した場合、約５０ｐｇ／ｍｌ未満、約２５ｐｇ／ｍｌ未満、約２０ｐｇ／ｍｌ未満、約１０ｐｇ／ｍｌ未満、又は約５ｐｇ／ｍｌ未満である、実施形態Ｈ１～Ｈ１８のいずれか一項に記載の吸着剤。

Ｉ１．リガンド及び基質表層を含む混合物を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムと接触させるステップを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ１９のいずれか一項に記載の吸着剤を作製する方法であって、上記リガンドが少なくとも１つの第１級アミンを含み、且つ上記基質表層が少なくとも１つのアルデヒド部分を含み、当該接触によって、実施形態Ｈ１～Ｈ１９のいずれか一項に記載の吸着剤が作製される、方法。

Ｉ２．上記接触ステップの前に、基質表層を酸化させるステップをさらに含む、実施形態Ｉ１に記載の方法であって、当該酸化によって、少なくとも１つのアルデヒド部分が形成される、方法。

Ｊ１．対象の血液からＴＮＦ受容体を除去するための吸着剤であって、前記吸着剤が、
基質表層を含む基質、及び
一本鎖ＴＮＦαを含むリガンド
を含み、
上記基質表層がアミン結合によって上記一本鎖ＴＮＦαに結び付いている、吸着剤。

Ｊ２．上記アミン結合が第２級アミン結合である、実施形態Ｊ１に記載の吸着剤。

Claims (25)

1. 流体から成分を除去するためのカラムであって、前記カラムは、
   断面積を含む区画と、
   直径を有し、前記区画内に配置されているビーズと、及び
   前記ビーズに連結されており、前記成分に結合するように選択されているリガンドと、
   を含み、
   前記断面積及びビーズ直径が、前記区画内の前記流体の流速を第１の閾値未満に維持するように選択されている、カラム。
2. 前記ビーズが複数のリガンドを含む、請求項１に記載のカラム。
3. 前記リガンドが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）の部分を含む、請求項２に記載のカラム。
4. 前記リガンドが、ＴＮＦアルファの前記部分のトリマーを含む、請求項３に記載のカラム。
5. 前記第１の閾値が、アウトレットから流出する流体におけるリガンドの量を所定のレベル未満に維持するように選択されている、請求項１に記載のカラム。
6. 前記第１の閾値が、流体によってリガンドに与えられる力を第２の閾値未満に維持し、これによって、流体中へのリガンドの浸出が低減するように選択されている、請求項１に記載のカラム。
7. 前記リガンドが、強度を有する結合を含み、且つ
   前記力を第２の閾値未満に維持することで、前記結合の破壊が回避される、
   請求項６に記載のカラム。
8. 前記ビーズがアガロースを含み、且つ
   前記結合がアミン結合を含む、
   請求項７に記載のカラム。
9. 前記力が、せん断力及びモーメントのうちの１つ又は複数を含み、且つ
   前記第２の閾値が、せん断力に関連する第３の閾値及びモーメントに関連する第４の閾値のうちの１つ又は複数を含む、
   請求項６に記載のカラム。
10. 前記区画が、インレット、アウトレット、及び前記インレットから前記アウトレットへの流路をさらに含み、
    前記流路が長さを有し、且つ
    前記長さが、前記流体と前記リガンドとの間の接触時間をもたらすように選択されている、
    請求項１に記載のカラム。
11. 前記ビーズが、複数のビーズを含み、且つ
    前記リガンドが、前記複数のビーズの各々にそれぞれ連結しているリガンドの複数の部分を含む、
    請求項１に記載のカラム。
12. 前記リガンドが、取り外し不可能にビーズに連結している、請求項１に記載のカラム。
13. 流体から成分を除去するためのリガンドであって、
    前記成分に連結する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマー、
    前記モノマーのうちの２つの間の化学結合によって連結された第１のリンカー、及び
    前記モノマーのうちの１つと基質との間の化学結合によって連結された第２のリンカー
    を含む、リガンド。
14. 前記リガンドが、３つのみのモノマーを含む、請求項１３に記載のリガンド。
15. 前記リガンドが、２つのみの第１のリンカーを含む、請求項１３に記載のリガンド。
16. 前記リガンドが、ただ１つの第２のリンカーを含む、請求項１３に記載のリガンド。
17. 前記第２のリンカーがアミン結合を含む、請求項１６に記載のリガンド。
18. 前記モノマーが、サイトカイン受容体に結合する部位を含む、請求項１３に記載のリガンド。
19. 前記モノマーが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）を含む、請求項１３に記載のリガンド。
20. 流体からの成分の除去において使用するためのカラムであって、前記カラムが、
    区画、
    前記区画内に配置されているビーズ、を含み、前記ビーズが、
    基質と、及び
    前記基質に連結されたリガンドと、を含み、前記リガンドが、
    前記成分に連結する部位を各々が含む少なくとも２つのモノマーと、
    前記モノマーのうちの２つの間の化学結合によって連結された第１のリンカーと、及び
    前記モノマーのうちの１つと前記基質との間の化学結合によって連結された第２のリンカーと、を含む、カラム。
21. アフェレーシス粒子を調製する方法であって、
    基質を酸化させるステップと、
    腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）の部分を含むリガンドと前記酸化された基質との間でシッフ塩基を形成させるステップと、及び
    前記シッフ塩基を第２級アミン結合に変換するステップと
    を含む、方法。
22. 基質を酸化させる前記ステップが、前記基質を無機塩に曝露することを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記無機塩が、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む、請求項２２に記載の方法。
24. シッフ塩基を第２級アミン結合に変換する前記ステップが、前記基質を還元剤に曝露することを含む、請求項２１に記載の方法。
25. 前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む、請求項２４に記載の方法。

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