JP2023541040A - 筋ジストロフィーを処置するための組成物及び方法 - Google Patents

筋ジストロフィーを処置するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、サルコスパン発現を増加させる化合物に関する。本開示はさらに、ジストロフィン関連複合体の減少または機能不全に関連する疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２０年９月１１日に出願された米国仮出願第６３／０７７，３２９号、及び２０２１年２月１２日に出願された米国仮出願第６３／１４８，８２３号の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に十分に組み込まれる。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金番号ＨＬ１２６２０４、ＡＲ０４８１７９、及びＡＲ０６５９７２下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
筋ジストロフィーは、神経組織の破壊を伴うまたは伴わない、筋肉組織の虚弱及び衰弱によって特性化されるおよそ３０の遺伝性障害に及ぶ。９種の主なタイプの筋ジストロフィーが存在し、その各々は、物理的変形の可能性、最終的な体力喪失、及び障害の増加を伴う。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、最もよく知られているタイプの筋ジストロフィーであり、世界で５，７００人の男児の出生当たりおよそ１人に発症する。ＤＭＤは、細胞外マトリックスへの筋鞘接着の喪失によって引き起こされる。
ＤＭＤのための療法の開発は、２０１６年のエテプリルセンの最近の早期承認及び希少疾患プログラムの増加した民間セクターの資金援助と伴って勢いを増している。しかしながら、ＤＭＤのためのＦＤＡが承認した既存の薬物は、疾患進行を実質的に減速させるには十分ではない。コルチコステロイドは、炎症を抑え、歩行を数年延長させるが、それらは、接着複合体及び膜安定性欠損に対処しない。アンチセンスオリゴヌクレオチドエクソンスキッピング療法エテプリルセンは、切断型ジストロフィンタンパク質生成を増加させるが、エクソン５１スキッピングに従う変異を有するＤＭＤ患者のおよそ１４％にしか適用可能ではない。筋ジストロフィー及び他の筋肉衰弱疾患のためのより強力な処置を同定する必要性が依然として存在する。
所定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）によって表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
Figure 2023541040000001
 （式中、
Ｘは、ＣＲ７またはＮであり；
Ｙは、Ｓ、ＯまたはＳＯ２であり；
Ｚは、ＮまたはＣＲ６であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、アミノまたはアミノアルキルであり；
Ｒ６は、Ｈまたはアルキルであり；
Ｑは、Ｃ＝Ｏ、ＳＯまたはＳＯ２であり；
Ｃｙは、アリールまたはヘテロアリールであり；
ｍは、１～３である）を提供する。
所定の実施形態では、本開示は、式（ＩＩ）によって表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
Figure 2023541040000002
 （式中、
Ｘは、Ｏ、ＮまたはＮＲ９であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、アミノまたはアミノアルキルであり；
Ｒ６は、Ｈ、＝Ｏまたはアルキルであり；
Ｃｙは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈまたはアルキルであり、またはそれらが結合したＮ原子と一緒にヘテロシクリルを形成し；
Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである）を提供する。
所定の実施形態では、本開示は、ジストロフィン関連複合体の機能不全に関連する疾患を処置または予防する方法を提供する。
サルコスパン（ＳＳＰＮ）調節剤のためのハイスループットスクリーニングのためのパイプライン。ｈＳＳＰＮ－ＥＧＦＰ Ｃ２Ｃ１２レポーター細胞株（ｎ＝１）を使用して大規模化学的ライブラリをスクリーニングした。上位１０００ヒットを、ｈＳＳＰＮ－ＥＧＦＰ及びｈＳＳＰＮ－ルシフェラーゼＣ２Ｃ１２レポーター細胞株（各ｎ＝３）の両方において再スクリーニングした。１０００種の化合物のうち６３種が、両方の細胞株においてレポーター発現を増加させたので、確認されたヒットとみなした。確認されたヒットを共通の構造的特徴に基づいて３つの群に選別した：ファーマコフォア１（ＰＣ１）、ファーマコフォア２（ＰＣ２）、及び統一的構造テーマを有さなかった他のもの。 ジストロフィン欠損Ｈ２Ｋ ｍｄｘ細胞を５．５μＭのファーマコフォア１（ＰＣ１）で４８時間処置した。すべての細胞を分化の２日目に処置し、処置の４８時間後に採取した。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子β－アクチン及びビヒクル処置細胞（０．５％ＤＭＳＯ）に対して正規化した。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｎ＝３～８。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ジストロフィン欠損Ｈ２Ｋ ｍｄｘ細胞を５．５μＭの他の化合物で４８時間処置した。すべての細胞を分化の２日目に処置し、処置の４８時間後に採取した。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子β－アクチン及びビヒクル処置細胞（０．５％ＤＭＳＯ）に対して正規化した。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｎ＝３～８。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 確認されたヒットは、ｍｄｘ筋管におけるサルコスパン遺伝子及びタンパク質発現を増加させる。（ａ）０．５～５０μＭのファーマコフォア１または他の化合物で４８時間処置されたジストロフィン欠損Ｈ２Ｋ ｍｄｘ細胞における相対的サルコスパン遺伝子発現。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子β－アクチン及びビヒクル処置細胞（０．２％ＤＭＳＯ）に対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表していた。ｎ＝３～６。（ｂ～ｃ）２．５～１０μＭの化合物で４８時間処置されたジストロフィン欠損Ｈ２Ｋ ｍｄｘ細胞のサルコスパンイムノブロット。すべての細胞を分化の２日目に処置し、処置の４８時間後に採取した。サルコスパンタンパク質レベルをＩｍａｇｅＪにおいて定量し、ＧＡＰＤＨ及びビヒクル処置細胞（０．２％ＤＭＳＯ）に対して正規化した。細胞ライセートを、独立したウェスタンブロットにおいて２～４回の間でプローブした。代表的なブロットが示されている。以下のイムノブロットに示される定量には、すべての実験が含まれる。データは、個々の再現及び平均値を表す。濃度当たりｎ＝３。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＯＴ－９は、マウスＷＴ筋管におけるサルコスパン遺伝子発現を増加させる。５μＭのＯＴ－９及びＰＣ１－３６で４８時間処置されたＣ２Ｃ１２筋管は、サルコスパン遺伝子発現の増加を示す。遺伝子発現をβ－アクチン及びビヒクル処置細胞（０．１％ＤＭＳＯ）に対して正規化した。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｎ＝３～２７。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＯＴ－９は、細胞表面におけるラミニン結合接着複合体を増加させる。ビヒクルまたは５μＭのＯＴ－９で４８時間処置されたＣ２Ｃ１２筋管を、アミン反応性ビオチン中でインキュベートして細胞表面タンパク質を標識した。アビジンを使用して標識タンパク質をアフィニティー精製してから、（ａ）アルファ－ジストログリカンのラミニン結合糖エピトープ（α－ＤＧ（グリカン））またはコアアルファ－ジストログリカンを認識する抗体でイムノブロット分析した。（ｂ）ＯＴ－９で処置された細胞において、グリコシル化アルファ－ジストログリカン及びコアアルファ－ジストログリカンの両方が細胞表面で増加した。（ｃ～ｄ）イムノブロットの定量。（ｅ）ビヒクルまたは５μＭのＯＴ－９で４８時間処置されたｍｄｘ筋管をビオチン中でインキュベートして細胞表面タンパク質を標識し、アビジンでアフィニティー精製した。イムノブロット分析は、ビオチン標識細胞表面タンパク質に関連するユートロフィンの上方制御を示している。（ｆ）ユートロフィンイムノブロットの定量。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｎ＝３。α－ＤＧ、アルファ－ジストログリカン；ＵＴＲＮ、ユートロフィン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５。 ＯＴ－９は、部分的にサルコスパンの上方制御を介してジストロフィン欠損筋管の膜安定性を改善する。（ａ）クレアチンキナーゼ（ＣＫ）放出アッセイは、筋管を浸透圧ショックに供することを伴い、これは、細胞の腫れ及び膜損傷を引き起こし、細胞内ＣＫを細胞から周囲の培地に放出させる。ＣＫ放出は、ＣＫ細胞外／（ＣＫ細胞外＋ＣＫ細胞内）の比を取ることによって計算される。２日目（ｂ）処置されたｍｄｘを５μＭのＯＴ－９で４８時間処置し、２８．５～２２４．５ミリオスモル（ｍｏｓｍｏｌ）の範囲の溶液を用いた浸透圧ショックに供した。（ｃ）ｍｄｘ筋管を２４または４８ｎＭのスクランブルｓｉＲＮＡまたはサルコスパンを標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。４８時間後、筋管を４５ｍｏｓｍｏｌ溶液を用いて浸透圧ショックに供した。２４ｎＭのＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、スクランブル対照と比べてＣＫ放出に影響を及ぼさなかった。４８ｎＭの濃度サルコスパンｓｉＲＮＡは、スクランブル対照と比べてＣＫ放出を増加させ、サルコスパンが処置にかかわらず膜安定性に寄与することを示している（ｄ）２４ｎＭのサルコスパンｓｉＲＮＡ及び１０μＭのＯＴ－９で並行して処置されたｍｄｘ筋管は、サルコスパンの枯渇がＯＴ－９の能力を減少させて膜安定性を改善したことを実証している。データは、平均＋ＳＥＭを表す。ｎ＝３。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＯＴ－９及びＯＴ－９ｍは、ｍｄｘ筋肉においてｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでサルコスパンｍＲＮＡを増加させる。（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでサルコスパンｍＲＮＡの安定性を試験するための実験設定の概略図。Ｃ２Ｃ１２筋管を５μＭのＯＴ－９で分化の２日目に処置した。４時間後、ＯＴ－９を含有する培地を除去し、化合物を有しない新鮮な培地に変更した。培地交換直後（０時間）、ならびに４時間、２４時間、及び４８時間後に細胞を遺伝子発現分析のために採取した。（ｂ）ＯＴ－９は、処置（０時間）の４時間後にサルコスパン遺伝子発現を誘導した。延長した化合物の除去（４～４８時間）の後、サルコスパンｍＲＮＡレベルは、ビヒクル及びＯＴ－９で処置された細胞において同じであった。（ｃ）２０週齢の雄ｍｄｘ同腹子に両方の前脛骨筋筋肉においてビヒクル（５％ＤＭＳＯ、９５％ＰＢＳ）または３ｍｇ／ｋｇ μｇのＯＴ－９を注射した。４時間後、筋肉を採取し、遺伝子発現分析のために処理した。（ｄ）１９～２２週齢のｍｄｘの雄に両方の前脛骨筋筋肉においてビヒクル（５％ＤＭＳＯ、９５％ＰＢＳ）または３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９ｍを注射した。４時間後、筋肉を採取し、遺伝子発現分析のために処理した。（ｅ）１３週齢のｍｄｘの雄にビヒクル（ヒドロキシプロピル－ｂ－シクロデキストリン中の４％ＰＥＧ－２００）または２０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＴ－９ｍを皮下注射した。処置の１３日後、筋肉を採取し、遺伝子発現分析のために処理した。遺伝子発現をβ－アクチン及びビヒクル処置細胞に対して正規化した。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合ｎ＝３及びｉｎ ｖｉｖｏ研究の場合ｎ＝２。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊＊ｐ＜０．０１。 プレート品質。プレート品質を評価するために及びヒット選択のためにロバスト厳密標準化平均差（ＳＳＭＤ＊）を使用した。 図７－１の続き。 図７－１、７－２の続き。 ＯＴ－９は、ｍｄｘ筋管において分化を増加させた。ｍｄｘ筋管を２日目に１、５、及び１０μＭのＯＴ－９で処置し、分化の４日目にアッセイした。（ａ～ｂ）ＯＴ－９は、融合指数によって測定されるＨ２Ｋ ｍｄｘ筋管分化のわずかな増加を誘導し、（ｃ）ミオゲニン遺伝子発現を誘導した。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｎ＝３。目盛り棒＝２００μｍ。ＭＹＯＧ、ミオゲニン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＯＴ－９は、複数の筋芽細胞株において有効である。（ａ）Ｃ２Ｃ１２、（ｂ）Ｈ２Ｋ ＷＴ、及び（ｃ）Ｈ２Ｋ ｍｄｘ筋芽細胞は、ＯＴ－９に対して反応性であるが、ＰＣ１－３６に対して反応性ではない。筋芽細胞を１、５、及び１０μＭのＯＴ－９またはＰＣ１－３６で２４時間処置した。遺伝子発現をβ－アクチン及びビヒクル処置細胞（０．１％ＤＭＳＯ）に対して正規化した。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｎ＝３～６。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 Ｃ２Ｃ１２ ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴタンパク質レポーターアッセイの作成及び検証。 １０（ａ）サルコスパンのＮ末端に融合した１１アミノ酸ＨｉＢｉＴを有する筋鞘におけるサルコスパンのトポロジーの概略。１０（ｂ）ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴタンパク質レベルは、分化と共に増加する。１０（ｃ）ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ筋管は、陽性対照、ＧＷ５０７４、ｃ－ｒａｆ阻害剤に対して反応性である。ロバスト厳密標準化平均偏差（ＳＳＭＤ＊）を使用した陽性対照としてのＧＷ５０７４を使用したプレート品質の計算は、２．４８のＳＳＭＤ＊をもたらし、それが優れた適度な対照であることを示している。１０（ｄ）ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴの１２ウェル及び３８４ウェル形式アッセイは、ＯＴ－９での処置後のレポーター発現の増加を検出する。ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ細胞を２日目に処置し、分化の４日目に採取した。Ｒ．Ｕ．＝ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）、１２ウェルアッセイについてのタンパク質濃度、または３８４ウェルアッセイについての核カウントに対して正規化された相対単位。示されたデータは、平均±ＳＥＭ値を表す。ｎ＝６。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＯＴ－９は、総ライセートにおけるラミニン結合接着タンパク質を増加させる。 Ｃ２Ｃ１２筋管をビヒクルまたは５μＭのＯＴ－９で４８時間処置してからイムノブロット分析した。（ａ）ＯＴ－９で処置された細胞は、十分にグリコシル化されたラミニン結合アルファ－ジストログリカン（α－ＤＧ（グリカン））の増加を示さなかったが、コアアルファ－ジストログリカンの増加を示した。ＧＡＰＤＨは、搭載対照として示されている。（ｂ－ｃ）イムノブロットの定量。データは、個々の再現及び平均値を表す。ｎ＝３。Ｒ．Ｕ．、ＧＡＰＤＨ及びビヒクル対照に対して正規化された相対単位。 ＳＳＰＮのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、７６％のノックダウン効率をもたらす。 ｍｄｘ筋管を１、５、及び１０μＭのＯＴ－９及び２４ｎＭのスクランブル対照ｓｉＲＮＡまたはＳＳＰＮ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで並行して処置した。遺伝子発現をβ－アクチン及びビヒクル及びスクランブルｓｉＲＮＡ処置細胞に対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。ｎ＝３。ＳＳＰＮ、サルコスパン；Ｒ．Ｕ．、相対単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＣＤ－１マウス血漿における１μＭのＯＴ－９及びＰＣ１－３６の半減期。 ＰＢＳ ｐＨ７．４におけるにおける１μＭのＯＴ－９及びＰＣ１－３６の半減期。
変異の不均一性及び筋肉への送達の困難性は、ＤＭＤを処置するための療法の開発にとって主要な課題である。これらの課題を克服し得る改善された療法に対する緊急の必要性が存在する。サルコスパン（ＳＳＰＮ）は、ユートロフィン－糖タンパク質べ複合体（ＵＧＣ）及びα７β１Ｄ－インテグリン接着複合体の膜局在化を増加させることによってＤＭＤネズミモデルにおける筋ジストロフィーの病理を減少させ、ラミニン結合を有効に増加させてジストロフィンの喪失を補う。
ＳＳＰＮ発現を増加させる小分子療法の開発は、ＤＭＤ及び膜タンパク質における欠陥によって引き起こされる筋ジストロフィーの他の形態を処置するための独立型またはコンビナトリアル療法をもたらし得る。小分子療法は、ウイルス及び細胞ベースの方法で見られる送達及び免疫反応の制限を回避するそれらの能力のため理想的である。
所定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）によって表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
Figure 2023541040000003
 （式中、
Ｘは、ＣＲ７またはＮであり；
Ｙは、Ｓ、ＯまたはＳＯ２であり；
Ｚは、ＮまたはＣＲ６であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、アミノまたはアミノアルキルであり；
Ｒ６は、Ｈまたはアルキルであり；
Ｑは、Ｃ＝Ｏ、ＳＯまたはＳＯ２であり；
Ｃｙは、アリールまたはヘテロアリールであり；
ｍは、１～３である）を提供する。
所定の実施形態では、本開示は、式（ＩＩ）によって表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
Figure 2023541040000004
 （式中、
Ｘは、Ｏ、ＮまたはＮＲ９であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、アミノまたはアミノアルキルであり；
Ｒ６は、Ｈ、＝Ｏまたはアルキルであり；
Ｃｙは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈまたはアルキルであり、またはそれらが結合したＮ原子と一緒にヘテロシクリルを形成し；
Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである）を提供する。
所定の実施形態では、化合物は、
、または薬学的に許容可能な塩から選択される。
別の態様では、本開示は、本開示の化合物及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、ジストロフィン関連複合体の機能不全に関連する疾患の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、本開示の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、方法を提供する。
所定の実施形態では、ジストロフィン関連複合体の機能不全に関連する疾患は、筋ジストロフィーである。
薬学的組成物
本発明の組成物及び方法は、それを必要とする個体を処置するために利用され得る。所定の実施形態では、個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、または非ヒト哺乳動物である。動物、例えば、ヒトに投与される場合、組成物または化合物は、好ましくは、例えば、本発明の化合物及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物として投与される。薬学的に許容可能な担体は、当該技術分野でよく知られており、例えば、水溶液、例えば、水または生理的緩衝生理食塩水または他の溶媒またはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、油、例えば、オリーブ油、または注射可能な有機エステルを含む。好ましい実施形態では、そのような薬学的組成物がヒト投与、特に侵襲的投与経路（すなわち、上皮障壁を介する輸送または拡散を回避する経路、例えば、注射または埋込）のためのものである場合、水溶液は、パイロジェンを含有せず、または実質的にパイロジェンを含有しない。賦形剤は、例えば、薬剤の遅延放出をもたらすようにまたは１つ以上の細胞、組織または器官を選択的に標的とするように選択され得る。薬学的組成物は、投薬単位形態、例えば、錠剤、カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、顆粒、再構成のための凍結乾燥物、粉末、溶液、シロップ、座剤、注射等であり得る。組成物はまた、経皮送達システム、例えば、皮膚パッチに存在し得る。組成物はまた、局所投与に好適な溶液、例えば、ローション、クリーム、または軟膏に存在し得る。
薬学的に許容可能な担体は、化合物、例えば、本発明の化合物を安定化し、その溶解性を増加させ、またはその吸収を増加させるように作用する生理的に許容可能な薬剤を含有し得る。そのような生理的に許容可能な薬剤には、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストラン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤または賦形剤が含まれる。生理的に許容可能な薬剤を含む薬学的に許容可能な担体の選択は、例えば、組成物の投与経路に依存する。調製物または薬学的組成物は、自己乳化薬物送達システムまたは自己マイクロ乳化薬物送達システムであり得る。薬学的組成物（調製物）はまた、リポソームまたは他のポリマーマトリックスであり得、これらは、その中に、例えば、本発明の化合物を組み込んでいる場合がある。例えば、リン脂質または他の脂質を含むリポソームは、作製及び投与することが比較的簡易である非毒性であり、生理的に許容可能であり、代謝可能な担体である。
語句「薬学的に許容可能な」は、合理的な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適なそれらの化合物、物質、組成物、及び／または投薬形態を指すために本明細書で用いられる。
語句「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容可能な物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入物質を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、かつ患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として機能し得る物質のいくつかの例には、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；（３）セルロース、及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテート；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバター及び座剤ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェン非含有水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；及び（２１）薬学的製剤において用いられる他の非毒性適合性物質が含まれる。
薬学的組成物（調製物）は、例えば、経口（例えば、水性または非水性溶液または懸濁液中のドレンチ、錠剤、カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト）；経口粘膜を介する吸収（例えば、舌下）；皮下；経皮（例えば、皮膚に適用されるパッチとして）；及び局所（例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏またはスプレーとして）を含む多数の投与経路のいずれかによって対象に投与され得る。化合物はまた、吸入のために製剤化され得る。所定の実施形態では、化合物は、滅菌水に単純に溶解または懸濁され得る。適切な投与経路及びそれに好適な組成物の詳細は、例えば、米国特許第６，１１０，９７３号、第５，７６３，４９３号、第５，７３１，０００号、第５，５４１，２３１号、第５，４２７，７９８号、第５，３５８，９７０号及び第４，１７２，８９６号、ならびにその中で引用された特許で見ることができる。
製剤は、単位投薬形態で好都合に提供され得、薬学の分野でよく知られている任意の方法によって調製され得る。単一投薬形態を生成するために担体物質と組み合わされ得る活性成分の量は、処置されているホスト、特定の投与様式に依存して変わる。単一投薬形態を生成するために担体物質と組み合わされ得る活性成分の量は通常、治療効果をもたらす化合物のその量である。通常、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント～約９９パーセント、好ましくは約５パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント～約３０パーセントの活性成分の範囲である。
これらの製剤または組成物を調製する方法には、活性化合物、例えば、本発明の化合物を、担体及び、任意に、１つ以上の補助成分と会合させる工程が含まれる。通常、製剤は、本発明の化合物を液体担体、または微細化固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
経口投与に好適な本発明の製剤は、既定量の本発明の化合物を活性成分の形態としてそれぞれ含有するカプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味付けされたベース、通常はスクロース及びアカシアまたはトラガカントを使用する）、凍結乾燥物、粉末、顆粒の形態で、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水液体エマルションとして、またはエリキシルもしくはシロップとして、またはトローチ（不活性基材、例えば、ゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシアを使用する）として及び／または口洗浄剤としてであり得る。組成物または化合物はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与され得る。
経口投与のための固体投薬形態（カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒等）を調製するために、活性成分は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、及び／または以下のいずれかと組み合わされる：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／またはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／またはアカシア等；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、所定のシリケート、及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収加速剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート等；（８）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレイ；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物；（１０）錯化剤、例えば、修飾及び未修飾シクロデキストリン；及び（１１）着色剤。カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、錠剤及び丸剤の場合、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固体組成物もまた、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等を使用して軟及び硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。
錠剤は、任意に１つ以上の補助成分を用いて、圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化した化合物の混合物を好適な機械で成形することによって作製され得る。
錠剤、及び薬学的組成物の他の固体投薬形態、例えば、糖衣錠、カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、丸剤及び顆粒は、コーティング及びシェル、例えば、腸溶性コーティング及び薬学的製剤化の分野でよく知られている他のコーティングを用いて任意に印がつけられ、または調製され得る。それらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／またはマイクロスフィアを使用してその中の活性成分の減速または制御放出を提供するように製剤化され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過によって、または使用直前に滅菌水、またはいくつかの他の注射可能な滅菌媒体に溶解され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。これらの組成物はまた、不透明化剤を任意に含有し得、それらが放出活性成分（複数可）を、消化管の所定部分でのみ、または優先的に、任意に遅延様式で放出する組成物のものであり得る。使用され得る埋封組成物の例には、ポリマー性物質及びワックスが含まれる。活性成分はまた、適切な場合、上述した賦形剤の１つ以上を有するマイクロカプセル化形態であり得る。
経口投与に有用な液体投薬形態には、薬学的に許容可能なエマルション、再構成のための凍結乾燥物、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分に加えて、液体投薬形態は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、シクロデキストリン及びその誘導体、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実、塊根、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有し得る。
不活性希釈剤に加えて、経口組成物にはまた、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤及び防腐剤が含まれ得る。
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、ならびにそれらの混合物を含有し得る。
局所または経皮投与のための投薬形態には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性化合物は、無菌条件下で薬学的に許容可能な担体、及び必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝液、または推進剤と混合され得る。
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、活性化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物及び植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含有し得る。
粉末及びスプレーは、活性化合物に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーは、慣用の推進剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素及び揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタン及びプロパンを追加的に含有し得る。
経皮パッチは、身体への本発明の化合物の制御送達を提供する付加された利点を有する。そのような投薬形態は、適切な媒体に活性化合物を溶解または分散させることによって作製され得る。吸収向上剤はまた、皮膚を通した化合物の流動を増加させるために使用され得る。そのような流動の速度は、速度コントロール膜を提供することまたは化合物をポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることによってコントロールされ得る。
語句「非経口投与」及び「非経口で投与される」は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、腸内及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内及び胸骨内注射及び注入を含む。非経口投与に好適な薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な無菌の等張性水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用の直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて１つ以上の活性化合物を含み、これらは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁もしくは増粘剤を含有し得る。
本発明の薬学的組成物において用いられ得る好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、コーティング物質、例えば、レシチンの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
これらの組成物はまた、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有し得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の包含によって確保され得る。等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム等を組成物を含めることも所望であり得る。また、注射可能な薬学的形態の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの包含によってもたらされ得る。
いくつかの場合では、薬物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を減速させることが所望である。これは、不十分な水溶解性を有する結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで薬物の吸収の速度は、溶解のその速度に依存し、これはひいては、結晶サイズ及び結晶形態に依存し得る。代替的には、非経口で投与される薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。
注射可能なデポ形態は、生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸－ポリグリコリドにおいて対象化合物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比、及び用いられる特定のポリマーの特質に応じて、薬物放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。注射可能なデポ製剤はまた、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を捕捉することによって調製される。
本発明の方法において使用するため、活性化合物は、それ自体でまたは薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、例えば、０．１～９９．５％（より好ましくは、０．５～９０％）の活性成分を含有する薬学的組成物として与えられ得る。
導入の方法はまた、再補充可能なまたは生分解性のデバイスによって提供され得る。タンパク質性バイオ医薬品を含む、様々な減速放出ポリマーデバイスが薬物の制御送達のために近年開発されており、ｉｎ ｖｉｖｏで試験されている。生分解性ポリマー及び非分解性ポリマーの両方を含む多様な生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）が、特定の標的部位での化合物の持続放出のための埋込物を形成するために使用され得る。
薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療的反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変更され得る。
選択される投薬量レベルは、用いられる特定の化合物もしくは化合物の組み合わせ、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、用いられている特定の化合物（複数可）の***の速度、処置の継続期間、用いられる特定の化合物（複数可）と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康状態及び既往歴、ならびに医学の分野でよく知られている同様の要素を含む多様な要素に依存する。
当該技術分野における通常の技能を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の治療的有効量を容易に決定及び処方し得る。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも少ないレベルで薬学的組成物または化合物の投薬を開始させ、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させ得る。「治療的有効量」は、所望の治療効果を引き起こすために十分な化合物の濃度を意味する。化合物の有効量は、対象の体重、性別、年齢、及び既往歴に従って変更されることが通常理解される。有効量に影響を及ぼす他の要素には、患者の病態の重症度、処置されている障害、化合物の安定性、及び、所望の場合、本発明の化合物と共に投与されている別のタイプの治療剤が含まれ得るがこれらに限定されない。より多い総用量は、薬剤の複数の投与によって送達され得る。有効性及び投薬量を決定するための方法は、当業者に知られている（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３ ｅｄ．，１８１４－１８８２（参照により本明細書に組み込まれる））。
通常、本発明の組成物及び方法において使用される活性化合物の好適な１日用量は、治療効果をもたらすために有効な最も少ない用量である化合物のその量となる。そのような有効な用量は通常、上述した要素に依存する。
所望の場合、活性化合物の有効な１日用量は、１日を通して適切な間隔で、任意に、単位投薬形態で、別々に投与される１、２、３、４、５、６またはそれ以上の副次的用量として投与され得る。本発明の所定の実施形態では、活性化合物は、１日２回または３回投与され得る。好ましい実施形態では、活性化合物は、１日１回投与される。
この処置を受ける患者は、通常、霊長類、特にヒト；及び他の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、及びイヌ；家禽；及びペットを含む、必要とする任意の動物である。
所定の実施形態では、本発明の化合物は、単独で使用され、または別のタイプの治療剤と共同して投与され得る。
本開示には、本発明の組成物及び方法における本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩の使用が含まれる。所定の実施形態では、企図される本発明の塩には、アルキル、ジアルキル、トリアルキルまたはテトラ－アルキルアンモニウム塩が含まれるがこれらに限定されない。所定の実施形態では、企図される本発明の塩には、Ｌ－アルギニン、ベネンタミン、ベンザチン、ベタイン、水酸化カルシウム、コリン、デアノール、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、２－（ジエチルアミノ）エタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、ヒドラバミン、１Ｈ－イミダゾール、リチウム、Ｌ－リジン、マグネシウム、４－（２－ヒドロキシエチル）モルホリン、ピペラジン、カリウム、１－（２－ヒドロキシエチル）ピロリジン、ナトリウム、トリエタノールアミン、トロメタミン、及び亜鉛塩が含まれるがこれらに限定されない。所定の実施形態では、企図される本発明の塩には、Ｎａ、Ｃａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｚｎまたは他の金属塩が含まれるがこれらに限定されない。所定の実施形態では、企図される本発明の塩には、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、２，２－ジクロロ酢酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－オキソグルタル酸、４－アセトアミド安息香酸、４－アミノサリチル酸、酢酸、アジピン酸、ｌ－アスコルビン酸、ｌ－アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、（＋）－ショウノウ酸、（＋）－カンファー－１０－スルホン酸、カプリン酸（デカン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、ｄ－グルコヘプトン酸、ｄ－グルコン酸、ｄ－グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、ｌ－リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、リン酸、プロプリオン酸、ｌ－ピログルタミン酸、サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、ｌ－酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、及びウンデシレン酸塩が含まれるがこれらに限定されない。
薬学的に許容可能な酸付加塩はまた、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド等との様々な溶媒和物として存在し得る。そのような溶媒和物の混合物も調製され得る。そのような溶媒和物の源は、結晶化の溶媒に由来し、調製もしくは結晶化の溶媒に内在し、またはそのような溶媒に偶発的であり得る。
湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤もまた、組成物に存在し得る。
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ－トコフェロール等；及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が含まれる。
定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願において使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。通常、本明細書に記載の化学、細胞及び組織培養、分子生物学、細胞及びがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、薬理学、遺伝学ならびにタンパク質及び核酸化学と組み合わせて使用される命名法、及びその技術は、当該技術分野においてよく知られており、一般的に使用されるものである。
本開示の方法及び技術は通常、別途示されない限り、当該技術分野でよく知られている従来の方法に従って、また、本明細書を通して引用及び論述される様々な一般的な及びより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，“Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ”，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）；Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，７ｔｈ ｅｄ．”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９９）；及びＧｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．”，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）を参照されたい。
本明細書で使用される化学用語は、本明細書で別途定義されない限り、“Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ”，Ｐａｒｋｅｒ Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ．Ａ．（１９８５）によって例示されるように、当該技術分野における従来の使用法に従って使用される。
本出願で言及される上記の、及び任意の他の刊行物、特許及び公開された特許出願のすべては、本明細書に参照により具体的に組み込まれる。矛盾する場合、その特定の定義を含む本明細書が優先する。
用語「薬剤」は、化学的化合物（例えば、有機または無機化合物、化学的化合物の混合物）、生物学的マクロ分子（例えば、核酸、抗体（その一部ならびにヒト化、キメラ及びヒト抗体及びモノクローナル抗体を含む）、タンパク質またはその一部、例えば、ペプチド、脂質、炭水化物）、または生物学的物質、例えば、細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）細胞または組織から作製された抽出物を示すために本明細書で使用される。薬剤には、例えば、構造が知られている薬剤、及び構造が知られていないものが含まれる。そのような薬剤がＡＲを阻害し、またはＡＲ分解を促進する能力は、それらを本開示の方法及び組成物において「治療剤」として好適なものとし得る。
「患者」、「対象」、または「個体」は、互換的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語には、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタ等を含む）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ等）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。
病態または患者を「処置すること」は、臨床的結果を含む有益なまたは所望の結果を得るための工程を取ることを指す。本明細書で使用される場合、また、当該技術分野でよく理解されているように、「処置」は、臨床的結果を含む有益なまたは所望の結果を得るのためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床的結果には、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらない１つ以上の症状または病態の軽減または好転、疾患の程度の減弱、疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の広がりを防止すること、疾患進行を遅延または減速させること、疾患状態の改善または緩和、及び寛解（部分的であるかまたは全体的であるかにかかわらない）が含まれ得るがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予期される生存期間と比較して生存期間を延長させることを意味し得る。
用語「予防すること」は、当該技術分野で認識されており、病態、例えば、局所再発（例えば、疼痛）、疾患、例えば、がん、複合症候群、例えば、心不全または任意の他の医学的病態に関連して使用される場合、当該技術分野でよく理解されており、組成物を摂取しない対象と比べた、対象における医学的病態の症状の頻度を減少させ、またはその発症を遅延させる組成物の投与を含む。よって、がんの予防には、例えば、統計的及び／または臨床的に有意な量だけ、未処置の対照集団と比べて予防処置を受けている患者の集団における検出可能ながん増殖の数を減少させること、及び／または未処置の対照集団に対して処置された集団における検出可能ながん増殖の出現を遅延させることが含まれる。
対象に物質、化合物または薬剤を「投与すること」またはその「投与」は、当業者に知られている多様な方法の１つを使用して行われ得る。例えば、化合物または薬剤は、静脈内に、動脈に、皮内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、眼に、舌下に、経口で（摂取によって）、鼻腔内に（吸入によって）、髄腔内に、大脳内に、及び経皮的に（例えば、皮膚管を介した吸収によって）投与され得る。化合物または薬剤はまた、再補充可能なまたは生分解性のポリマーデバイスまたは他のデバイス、例えば、パッチ及びポンプ、または化合物もしくは薬剤の延長、減速、または制御放出を提供する製剤によって適切に投与され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回、及び／または１つ以上の延長期間にわたって実施され得る。
対象に物質、化合物または薬剤を投与する適切な方法はまた、例えば、対象の年齢及び／または身体的状態及び化合物または薬剤の化学的及び生物学的特性（例えば、溶解性、消化性、バイオアベイラビリティ、安定性及び毒性）に依存する。いくつかの実施形態では、化合物または薬剤は、経口で、例えば、摂取によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、経口で投与される化合物または薬剤は、延長放出または減速放出製剤にあるか、またはそのような減速または延長放出のためのデバイスを使用して投与される。
本明細書で使用される場合、語句「共同投与」は、先行投与された治療剤が身体において依然として有効である間に第２の薬剤が投与されるような、２つ以上の異なる治療剤の投与の任意の形態を指す（例えば、２つの薬剤は、患者において同時に有効であり、これは２つの薬剤の相乗効果を含み得る）。例えば、異なる治療的化合物は、同じ製剤または別の製剤で、付随してまたは順次に投与され得る。よって、そのような処置を受ける個体は、異なる治療剤の組み合わせた効果から利益を受け得る。
薬物または薬剤の「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、対象に投与された場合に意図された治療効果を有する薬物または薬剤の量である。十分な治療効果が１つの用量の投与によってかならずしも生じるわけではなく、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。よって、治療的有効量は、１回以上の投与で投与され得る。対象に必要とされる正確な有効量は、例えば、対象のサイズ、健康及び年齢、ならびに処置されている病態、例えば、がんまたはＭＤＳの特質及び程度に依存する。当業者は、慣用の実験によって所与の状況のための有効量を容易に決定し得る。
本明細書で使用される場合、用語「任意の」または「任意に」は、その後に記載される事象または状況が生じる場合があり、または生じない場合があること、及びその記載には、事象または状況が生じる場合及びそれが生じない場合が含まれることを意味する。例えば、「任意に置換されたアルキル」は、アルキルが置換されていてもよい場合及びアルキルが置換されていない場合を指す。
本発明の化合物上の置換基及び置換パターンは、容易に利用可能な出発物質から、当該技術分野で知られている技術、ならびに以下に示されるそれらの方法によって容易に合成され得る化学的に安定な化合物をもたらすように当業者によって選択され得ることが理解される。置換基がそれ自体、複数の基で置換される場合、これらの複数の基は、安定な構造が生じる限り、同じ炭素または異なる炭素上に存在し得ることが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「任意に置換された」は、所与の構造における１～６個の水素ラジカルの、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シリル、アシル、アシルオキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アミノ、アミノアルキル、シアノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、－ＯＣＯ－ＣＨ２－Ｏ－アルキル、－ＯＰ（Ｏ）（Ｏ－アルキル）２または－ＣＨ２－ＯＰ（Ｏ）（Ｏ－アルキル）２を含むがこれらに限定されない特定された置換基のラジカルでの置換を指す。好ましくは、「任意に置換された」は、所与の構造における１～４個の水素ラジカルの上記の置換基での置換を指す。より好ましくは、１～３個の水素ラジカルが上記の置換基によって置換される。置換基は、さらに置換されていてもよいことが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、Ｃ１－Ｃ１０直鎖アルキル基またはＣ１－Ｃ１０分岐鎖アルキル基を含むがこれらに限定されない飽和脂肪族基を指す。好ましくは、「アルキル」基は、Ｃ１－Ｃ６直鎖アルキル基またはＣ１－Ｃ６分岐鎖アルキル基を指す。最も好ましくは、「アルキル」基は、Ｃ１－Ｃ４直鎖アルキル基またはＣ１－Ｃ４分岐鎖アルキル基を指す。「アルキル」の例には、メチル、エチル、１－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、１－ペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、１－ヘキシル、２－ヘキシル、３－ヘキシル、１－ヘプチル、２－ヘプチル、３－ヘプチル、４－ヘプチル、１－オクチル、２－オクチル、３－オクチルまたは４－オクチル等が含まれるがこれらに限定されない。「アルキル」基は、任意に置換されていてもよい。
用語「アシル」は、当該技術分野で認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）－、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）－によって表される基を指す。
用語「アシルアミノ」は、当該技術分野で認識されており、アシル基で置換されたアミノ基を指し、例えば、式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）ＮＨ－によって表され得る。
用語「アシルオキシ」は、当該技術分野で認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）Ｏ－、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）Ｏ－によって表される基を指す。
用語「アルコキシ」は、アルキル基に結合した酸素を有するそのアルキル基を指す。代表的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ等が含まれる。
用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を指し、一般式アルキル－Ｏ－アルキルによって表され得る。
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキルで置換されたシクロアルキル基、及びシクロアルキルで置換されたアルキル基を含む飽和脂肪族基を指す。好ましい実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に３０個以下、より好ましくは２０個以下の炭素原子（例えば、直鎖の場合Ｃ１－３０、分岐鎖の場合Ｃ３－３０）を有する。
その上、明細書、実施例、及び特許請求の範囲を通して使用される用語「アルキル」には、非置換アルキル基及び置換アルキル基の両方が含まれ、その後者は、ハロアルキル基、例えば、トリフルオロメチル及び２，２，２－トリフルオロエチル等を含む、炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置き換える置換基を有するアルキル部位を指す。
用語「Ｃｘ－ｙ」または「Ｃｘ－Ｃｙ」は、化学的部位、例えば、アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシと併せて使用される場合、鎖にｘ～ｙ個の炭素を含有する基を含むことを意味する。Ｃ０アルキルは、基が末端位置にある場合は水素、内部の場合は結合を示す。Ｃ１－６アルキル基は、例えば、鎖に１～６個の炭素原子を含有する。
用語「アルキルアミノ」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのアルキル基で置換されたアミノ基を指す。
用語「アルキルチオ」は、本明細書で使用される場合、アルキル基で置換されたチオール基を指し、一般式アルキルＳ－によって表され得る。
用語「アミド」は、本明細書で使用される場合、基
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表し、またはＲ９及びＲ１０は、それらが結合したＮ原子と一緒に、環構造に４～８個の原子を有する複素環を完成させる）を指す。
用語「アミン」及び「アミノ」は、当該技術分野で認識されており、置換されていない及び置換されたアミン及びその塩、例えば、
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１０’は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表し、またはＲ９及びＲ１０は、それらが結合したＮ原子と一緒に、環構造に４～８個の原子を有する複素環を完成させる）によって表され得る部位を指す。
用語「アミノアルキル」は、本明細書で使用される場合、アミノ基で置換されたアルキル基を指す。
用語「アラルキル」は、本明細書で使用される場合、アリール基で置換されたアルキル基を指す。
用語「アリール」には、本明細書で使用される場合、環の各原子が炭素である置換されたまたは置換されていない単環芳香族基が含まれる。好ましくは、環は、５～７員環、より好ましくは６員環である。用語「アリール」にはまた、２つ以上の炭素が２つの隣接環に共通している２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、環の少なくとも１つが芳香族であり、例えば、他の環式環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリルであり得るものが含まれる。アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリン等が含まれる。
用語「カルバメート」は、当該技術分野で認識されており、基
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素またはヒドロカルビル基を表す）を指す。
用語「カルボシクリルアルキル」は、本明細書で使用される場合、炭素環基で置換されたアルキル基を指す。
用語「炭素環」には、５～７員単環式及び８～１２員二環式環が含まれる。二環式炭素環の各環は、飽和、不飽和及び芳香族環から選択され得る。炭素環には、１、２または３個以上の原子が２つの環の間で共有された二環式分子が含まれる。用語「縮合炭素環」は、環の各々が他の環と２つの隣接原子を共有する二環式炭素環を指す。縮合炭素環の各環は、飽和、不飽和及び芳香族環から選択され得る。例示的な実施形態では、芳香族環、例えば、フェニルは、飽和または不飽和環、例えば、シクロヘキサン、シクロペンタン、またはシクロヘキサンに縮合されていてもよい。飽和、不飽和、及び芳香族二環式環の任意の組み合わせは、原子価が許す場合、炭素環式の定義に含まれる。例示的な「炭素環」には、シクロペンタン、シクロヘキサン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、１，５－シクロオクタジエン、１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン、ビシクロ［４．２．０］オクト－３－エン、ナフタレン及びアダマンタンが含まれる。例示的な縮合炭素環には、デカリン、ナフタレン、１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン、ビシクロ［４．２．０］オクタン、４，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－インデン及びビシクロ［４．１．０］ヘプト－３－エンが含まれる。「炭素環」は、水素原子を保有することが可能な任意の１つ以上の位置で置換され得る。
用語「カルボシクリルアルキル」は、本明細書で使用される場合、炭素環基で置換されたアルキル基を指す。
用語「カルボネート」は、当該技術分野で認識されており、基－ＯＣＯ２－を指す。
用語「カルボキシ」は、本明細書で使用される場合、式－ＣＯ２Ｈによって表される基を指す。
用語「エステル」は、本明細書で使用される場合、基－Ｃ（Ｏ）ＯＲ９（式中、Ｒ９は、ヒドロカルビル基を表す）を指す。
用語「エーテル」は、本明細書で使用される場合、別のヒドロカルビル基に酸素を介して連結されたヒドロカルビル基を指す。したがって、ヒドロカルビル基のエーテル置換基は、ヒドロカルビル－Ｏ－であり得る。エーテルは、対称または非相称のいずれかであり得る。エーテルの例には、複素環－Ｏ－複素環及びアリール－Ｏ－複素環が含まれるがこれらに限定されない。エーテルには、一般式アルキル－Ｏ－アルキルによって表され得る「アルコキシアルキル」基が含まれる。
用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含む。
用語「ヘテラルキル」及び「ヘテロシクロアラルキル」は、本明細書で使用される場合、ヘトアリール基で置換されたアルキル基を指す。
用語「ヘテロアリール」及び「ヘトアリール」には、置換されたまたは置換されていない芳香族単環構造、好ましくは５～７員環、より好ましくは５～６員環が含まれ、その環構造には、少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは１～４個のヘテロ原子、より好ましくは１または２個のヘテロ原子が含まれる。用語「ヘテロアリール」及び「ヘトアリール」にはまた、２つ以上の炭素が２つの隣接環に共通している２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、環の少なくとも１つがヘテロ芳香族であり、例えば、他の環式環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリルであり得るものが含まれる。ヘテロアリール基には、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、及びピリミジン等が含まれる。
用語「ヘテロ原子」は、本明細書で使用される場合、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄である。
用語「ヘテロシクリルアルキル」は、本明細書で使用される場合、複素環基で置換されたアルキル基を指す。
用語「ヘテロシクリル」、「複素環」、及び「複素環式」は、置換されたまたは置換されていない非芳香族環構造、好ましくは３～１０員環、より好ましくは３～７員環であって、環構造が少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは１～４個のヘテロ原子、より好ましくは１または２個のヘテロ原子を含むものを指す。用語「ヘテロシクリル」及び「複素環式」にはまた、２つ以上の炭素が隣接環と共通する２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、環の少なくとも１つが複素環式であり、例えば、他の環式環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリルであり得るものが含まれる。ヘテロシクリル基には、例えば、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン、ラクトン、ラクタム等が含まれる。
用語「ヒドロカルビル」は、本明細書で使用される場合、＝Ｏまたは＝Ｓ置換基を有さない炭素原子を介して結合され、典型的には少なくとも１つの炭素－水素結合及び主に炭素の骨格を有するが、任意にヘテロ原子を含み得る基を指す。よって、メチル、エトキシエチル、２－ピリジル、及びさらにトリフルオロメチルのような基は、本出願の目的のためにヒドロカルビルとみなされるが、アセチル（連結炭素上に＝Ｏ置換基を有する）及びエトキシ（炭素ではなく酸素を介して連結される）等の置換基はヒドロカルビルとみなされない。ヒドロカルビル基には、アリール、ヘテロアリール、炭素環、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
用語「ヒドロキシアルキル」は、本明細書で使用される場合、ヒドロキシ基で置換されたアルキル基を指す。
用語「低級」は、化学的部位、例えば、アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシと併せて使用される場合、置換基に１０個以下、好ましくは６個以下の原子が存在する基を含むことを意味する。「低級アルキル」は、例えば、１０個以下、好ましくは６個以下の炭素原子を含有するアルキル基を指す。所定の実施形態では、本明細書で定義されるアシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシ置換基は、それぞれ、それらが単独で現れるか、またはヒドロキシアルキル及びアラルキル（その場合、例えば、アリール基内の原子は、アルキル置換基内の炭素原子を計数する場合に計数されない）という記述のように他の置換基と組み合わせて現れるかにかかわらず、低級アシル、低級アシルオキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、または低級アルコキシである。
用語「ポリシクリル」、「多環」、及び「多環式」は、２つ以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリル）であって、２個以上の原子が２つの隣接環（例えば、環は「縮合環」である）と共通しているものを指す。多環の環の各々は、置換または非置換であり得る。所定の実施形態では、多環の各環は、環に３～１０個、好ましくは５～７個の原子を含有する。
用語「スルフェート」は、当該技術分野で認識されており、基－ＯＳＯ３Ｈ、またはその薬学的に許容可能な塩を指す。
用語「スルホンアミド」は、当該技術分野で認識されており、一般式
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素またはヒドロカルビルを表す）によって表される基を指す。
用語「スルホキシド」は、当該技術分野で認識されており、基－Ｓ（Ｏ）－を指す。
用語「スルホネート」は、当該技術分野で認識されており、基ＳＯ３Ｈ、またはその薬学的に許容可能な塩を指す。
用語「スルホン」は、当該技術分野で認識されており、基－Ｓ（Ｏ）２－を指す。
用語「置換された」は、骨格の１つ以上の炭素上の水素を置き換える置換基を有する部位を指す。「置換」または「で置換された」には、そのような置換が置換された原子及び置換基の許容される原子価に従い、置換が例えば、転位、環化、脱離等によって変換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという黙示的な条件を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、用語「置換された」は、有機化合物のすべての許容可能な置換基を含むことが企図される。広い態様では、許容可能な置換基には、有機化合物の非環式及び環式、分岐状及び非分岐状、炭素環式及び複素環式、芳香族及び非芳香族置換基が含まれる。許容可能な置換基は、適切な有機化合物について１つ以上であり、同じまたは異なる場合がある。本発明の目的のため、窒素等のヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす、本明細書に記載の有機化合物の水素置換基及び／または任意の許容可能な置換基を有し得る。置換基には、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部位が含まれ得る。炭化水素鎖上で置換された部位は、適切な場合、それら自体が置換され得ることが当業者によって理解される。
用語「チオアルキル」は、本明細書で使用される場合、チオール基で置換されたアルキル基を指す。
用語「チオエステル」は、本明細書で使用される場合、基－Ｃ（Ｏ）ＳＲ９または－ＳＣ（Ｏ）Ｒ９（式中、Ｒ９は、ヒドロカルビルを表す）を指す。
用語「チオエーテル」は、本明細書で使用される場合、酸素が硫黄で置き換えられたエーテルと同等である。
用語「尿素」は、当該技術分野で認識されており、一般式
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素またはヒドロカルビルを表す）によって表され得る。
用語「調節する」は、本明細書で使用される場合、機能または活性（例えば、細胞増殖）の阻害または抑制ならびに機能または活性の向上が含まれる。
語句「薬学的に許容可能な」は、当該技術分野で認識されている。所定の実施形態では、その用語には、合理的な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物と接触させて使用するのに好適である組成物、賦形剤、アジュバント、ポリマー及び他の物質及び／または投薬形態が含まれる。
「薬学的に許容可能な塩」または「塩」は、患者の処置に好適でありまたは適合性がある酸付加塩または塩基付加塩を指すために本明細書で使用される。
用語「薬学的に許容可能な酸付加塩」は、本明細書で使用される場合、式Ｉによって表される任意の塩基化合物の任意の非毒性有機または無機塩を意味する。好適な塩を形成する例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸、ならびに金属塩、例えば、オルトリン酸一水素ナトリウム及び硫酸水素カリウムが含まれる。好適な塩を形成する例示的な有機酸には、モノ、ジ、及びトリカルボン酸、例えば、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸及びサリチル酸が含まれる。一または二酸塩が形成され得、そのような塩は、水和形態、溶媒和形態または実質的に無水の形態で存在し得る。通常、式Ｉの化合物の酸付加塩は、水及び様々な親水性有機溶媒においてより可溶性であり、通常、それらの遊離塩基形態と比較してより高い融点を実証する。適切な塩の選択は、当業者に知られている。他の非薬学的に許容可能な塩、例えば、シュウ酸塩は、例えば、実験室での使用のための式Ｉの化合物の単離、またはその後の薬学的に許容可能な酸付加塩への変換のために使用され得る。
用語「薬学的に許容可能な塩基付加塩」は、本明細書で使用される場合、式Ｉによって表される任意の酸化合物またはそれらの中間体のいずれかの任意の非毒性有機または無機塩基付加塩を意味する。好適な塩を形成する例示的な無機塩基には、水酸化リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、またはバリウムが含まれる。好適な塩を形成する例示的な有機塩基には、脂肪族、脂環式、または芳香族有機アミン、例えば、メチルアミン、トリメチルアミン及びピコリンまたはアンモニアが含まれる。適切な塩の選択は、当業者に知られている。
本開示の方法及び組成物において有用な化合物の多くは、それらの構造に少なくとも１つの立体中心を有する。この立体中心は、ＲまたはＳ構成で存在し得、前記Ｒ及びＳの表記は、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６），４５，１１－３０に記載の規則に従って使用される。本開示は、化合物、その塩、プロドラッグまたは混合物（すべての可能性のある立体異性体の混合物を含む）のエナンチオマー及びジアステレオマー異性形態等のすべての立体異性体を企図する。例えば、ＷＯ０１／０６２７２６を参照されたい。
さらに、アルケニル基を含有する所定の化合物は、Ｚ（同じ（ｚｕｓａｍｍｅｎ））またはＥ（逆（ｅｎｔｇｅｇｅｎ））異性体として存在し得る。各場合において、本開示には、混合物及び別々の個々の異性体の両方が含まれる。
化合物の一部はまた、互変異性形態で存在し得る。そのような形態は、本明細書に記載の式において明確に示されていないものの、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。
「プロドラッグ」または「薬学的に許容可能なプロドラッグ」は、本開示の化合物（例えば、式Ｉの化合物）を形成するために投与後にホストにおいて代謝、例えば、水和または酸化される化合物を指す。プロドラッグの典型的な例には、活性化合物の機能的部位上に生物学的に不安定なまたは切断可能な（保護）基を有する化合物が含まれる。プロドラッグには、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、ヒドロキシル化、脱ヒドロキシル化、加水分解、脱加水分解、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、または脱リン酸化されて活性化合物を生成し得る化合物が含まれる。生物学的に不安定なまたは切断可能な（保護）基としてエステルまたはホスホルアミデートを使用したプロドラッグの例は、米国特許６，８７５，７５１、７，５８５，８５１、及び７，９６４，５８０（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。本開示のプロドラッグは、式Ｉの化合物を生成するように代謝される。本開示には、その範囲内で、本明細書に記載の化合物のプロドラッグが含まれる。好適なプロドラッグの選択及び調製のための従来の手順は、例えば、“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ” Ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載されている。
語句「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容可能な物質、組成物またはビヒクル、例えば、医薬的または治療的使用のための薬物を製剤化するために有用な液体または固体フィルター、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入物質を意味する。
用語「溶解性のｌｏｇ」、「ＬｏｇＳ」または「ｌｏｇＳ」は、本明細書で使用される場合、化合物の水溶解性を定量するために当該技術分野で使用される。化合物の水溶解性は、その吸収及び分布特性に有意に影響を及ぼす。低い溶解性はしばしば、不十分な吸収を伴う。ＬｏｇＳ値は、ｍｏｌ／リットルで測定される溶解性の単位が除かれた対数（底１０）である。
これより本発明は一般的に説明されるが、単に本発明の所定の態様及び実施形態の例示の目的で含まれ、本発明を限定することが意図されていない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
方法
レポーター細胞株
ヒトサルコスパンＥＧＦＰレポーターＣ２Ｃ１２細胞株（ｈＳＳＰＮ－ＥＧＦＰ）を、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ．２０１９；９（１）：３２によって記載されているように使用した。同一アプローチを使用して、ヒトサルコスパンルシフェラーゼ（ｈＳＳＰＮ－ｌｕｃ）Ｃ２Ｃ１２細胞株を作成し、二次スクリーニングにおいて使用した。
小分子
スクリーニングライブラリは、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓのｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅによって提供された。追跡研究において使用された市販の化合物は、Ａｓｉｎｅｘ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃから購入した。
ハイスループットスクリーニング
Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ３８４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３８４ウェルの黒色透明底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）における５０μｌの成長培地に１ウェル当たり５００細胞でｈＳＳＰＮ－ＥＧＦＰ筋芽細胞を播種し、３日間インキュベートして細胞をコンフルエンスに到達させた。コンフルエンスに到達した後、成長培地を、ＥＬ４０６コンビネーションウォッシャーディスペンサー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して２％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を有するＤＭＥＭからなる５０μｌの分化培地に置き換えた。分化の２日目に、細胞上の培地を吸引し、１０μｌの残留体積を残し、３０μｌの新鮮な分化培地に置き換えた。ＤＭＳＯ中の０．５μｌの小分子またはＤＭＳＯ単独（ビヒクル及び陽性対照ウェルのため）をＢｉｏｍｅｋ Ｆｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して各ウェルに添加した。ＤＭＳＯの適切な混合を確保するために、５０μｌの追加の分化培地を、１％ＩＴＳの最終濃度に到達させるためのインスリントランスフェリンセレン（ＩＴＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を含有する５０μｌの培地を代わりに受けた陽性対照処置ウェルを除き、すべてのウェルに添加した。各々の処置されたウェルにおける化合物の最終濃度は、０．５５％ＤＭＳＯ中に５．５μＭであり、ビヒクル及び陽性対照処置ウェルについては０．５５％ＤＭＳＯのみであった。４８時間のインキュベート後、培地をＦｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に置き換え、各プレートをＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して画像化した。画像化した細胞の蛍光強度を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）においてカスタムモジュール分析を使用して決定した。分析設定は以下のとおりであった：トップハット（サイズ：１２、フィルター形状：丸）、適応閾値（ソース：トップハット、最小幅：１０、最大幅：８００、ローカルバックグラウンドを上回る強度：５００）、フィルターマスク（フィルタータイプ：最小領域フィルター、最小値：５００）。
ルシフェラーゼアッセイ
ｈＳＳＰＮ－ルシフェラーゼ筋芽細胞を上述したように培養した。４８時間の処置後、プレートを室温に平衡化させた。各ウェルにおける細胞培地をＥＬ４０６コンビネーションウォッシャーディスペンサーを使用して吸引した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び分化培地をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ３８４を使用して１：２の希釈率で細胞に添加した。室温で３分インキュベートした後、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量した。相対的発光単位を分析して、ビヒクル処置細胞に対して処置された倍率変化を決定した。
細胞培養
Ｃ２Ｃ１２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、２０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する成長培地中で３７℃で５％ＣＯ２で増殖させた。９０～１００％のコンフルエンスに到達した後、筋芽細胞を、培地を２％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を有するＤＭＥＭからなる分化培地に置き換えることによって分化するように誘導した。条件付きで不死化されたＨ２Ｋ ＷＴ及びｍｄｘ筋芽細胞（ジストロフィンのエクソン２３におけるナンセンス変異を有する）は、Ｔｅｒｒａｎｃｅ Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｐｈ．Ｄ．（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）からのギフトであった。Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１９９４；１６２（２）：４８６－９８を参照されたい。ＤＭＥＭ、２０％ＨＩ－ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２％Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２％ニワトリ胚抽出物（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２０Ｕ／ｍｌの新鮮なインターフェロンガンマ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する成長培地を用いて３３℃で５％ＣＯ２で０．０１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティングプレート上で筋芽細胞を増殖させた。分化のため、Ｈ２Ｋ筋芽細胞をＤＭＥＭに希釈された０．１ｍｇ／ｍｌマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされたプレートに播種し、増殖条件で成長させた。９０～１００％コンフルエンスに到達した後、確立されたプロトコルを使用して５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有する分化培地中で３７℃で５％ＣＯ２で細胞を成長させた。
遺伝子発現分析
４８時間処置された筋管からのＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌに基づく（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）相分離（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９３；１５（３）：５３２－４，６－７）を使用して細胞から抽出した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定し、２０μｌの反応物中の７５０ｎｇのＲＮＡを以下のサイクル条件：５分間２５℃、３０分間４２℃、５分間８５℃を用いてｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して逆転写した。マウスｑＰＣＲのため、ＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、４００ｎＭの各々の最適化されたフォワード及びリバースプライマー（ＳＳＰＮ Ｆ：５’ＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＣＣＧＴＴＣ３’、ＳＳＰＮ Ｒ：５’ＧＴＣＣＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＧＴＡＴＧ３’、ＢＡＣＴ Ｆ：５’ＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＧ３’、ＢＡＣＴ Ｒ：５’ＣＡＡＴＧＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＡ３’）、ならびに３７．５ｎｇのＲＮＡに対応するｃＤＮＡを使用して、以下の反応条件：２分間５５℃、２分間９５℃、１０秒間９５℃及び３０秒間６２℃の４０サイクル、ならびに解離段階を用いてＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定されるｃＤＮＡを増幅した。ヒトサンプルのｑＰＣＲのため、ＴａｑＭａｎアッセイを使用して以下の反応条件でＳＳＰＮ（アッセイＩＤ Ｈｓ０１０２５５２０ｍ＿１）及びＡＣＴＢ（アッセイＩＤ Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１）を定量した：２分間５０℃、１０分間９５℃、１５秒間９５℃及び１分間６２℃の４０サイクル。各サンプルを３連で実行した。データをｄｄＣＴ法を使用して分析し、キャリブレータとして機能するビヒクル処置サンプルを用いて参照遺伝子に対して正規化した（ビヒクル対照＝１の相対発現）。
イムノブロット
４８時間処置された筋管を、Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶解した。ＲＩＰＡ緩衝液における細胞ライセートを１時間４℃で揺動させ、４℃で１，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離した。上清を収集し、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してタンパク質濃度について定量し、水中に２ｍｇ／ｍｌ及び１０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５％ベータ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、３％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．０５％ブロモフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の最終濃度を有する水及びレムリーサンプル緩衝液に対して正規化した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥのため、サンプルを９５℃に２分間加熱してから４０μｇを４～１２％トリス－グリシンまたはビス－トリスポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）に搭載し、１００ボルトで室温で２時間電気泳動し、１００ボルトで４℃で２時間ニトロセルロース膜に移行させた。ポンソーＳ染色を実施してタンパク質搭載を可視化し、タンパク質移行を確認した。膜を０．１％のｔｗｅｅｎ－２０を有するトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＴＢＳＴ）中の５％非脂肪乾燥ミルクで室温で１時間ブロッキングし、５％非脂肪乾燥ミルクを含有するブロッキング緩衝液に希釈された以下の一次抗体：別途記述されない限り：ＳＳＰＮ（ｓｃ－３９３１８７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：２００）、グリコシル化アルファ－ジストログリカン（ＩＩＨ６ Ｃ４， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、１％ミルク中に１：１００、コアアルファ－ジストログリカン（Ｂｅａｄｌｅ Ｌａｂ、１％ミルク中に１：１０００）、ＵＴＲＮ（ＭＡＮＣＨＯ３、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、１：１００）、及びＧＡＰＤＨ（Ｍａｂ３７４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１０，０００）と４℃で一晩インキュベートした。３回の１０分のＴＢＳＴ洗浄の後、膜をヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（ａｂ６７８９、Ａｂｃａｍ、５％ミルク中にすべてについて１：５０００、ＧＡＰＤＨについては１：１０，０００）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（ａｂ６７２１、Ａｂｃａｍ、１％ミルク中に１：１０，０００）中で室温で１時間インキュベートした。次いで膜を３回１０分間それぞれＴＢＳＴで洗浄し、オービタルシェーカー上でＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で室温で５分間インキュベートし、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｇｆａ）に曝露した。オートラジオグラフィーフィルムを、ＳＲＸ－１０１Ａ卓上プロセッサ（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ）を使用して現像し、デジタルファイルにスキャンし、ＩｍａｇｅＪバージョン１．５１ｓを使用してバンドの密度測定によって分析した。標的タンパク質バンドをキャリブレータサンプルとして機能するビヒクル処置サンプルを用いて搭載対照ＧＡＰＤＨに対して正規化した（ビヒクル対照＝１の相対タンパク質レベル）。
１２ウェルプレート形式でのＣ２Ｃ１２ ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴアッセイ
Ｃ２Ｃ１２ ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ筋芽細胞を１２ウェルプレートにおいて２ｍｌの成長培地中で１ウェル当たり２５，０００細胞で播種し、３日間インキュベートした。コンフルエンスに到達した後、成長培地を２ｍｌの分化培地に置き換えた。分化の２日目に、細胞上の培地を、０．０６％ＤＭＳＯ中に５．５μＭの最終濃度で化合物を含有する２ｍｌの分化培地に置き換えた。ビヒクル対照処置細胞について、０．０６％ＤＭＳＯを細胞に添加した。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２～２４時間凍結した。細胞を含有するプレートを氷上で解凍し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．０５％ＤＯＣ、０．０５％ＳＤＳ、及びＨａｌｔプロテアーゼ阻害剤を含有する１００μｌの氷冷改変ＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに添加した。細胞を擦り、１．５ｍｌチューブに移し、１６，０００ｘｇで４℃で２０分間遠心分離した。細胞ライセートを新たなチューブに移した。細胞ライセートに対してＤＣアッセイを実施してタンパク質濃度を決定した。白色壁の白色底３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を１５μｌのＰＢＳで事前充填し、１５μｌの細胞ライセートを各ウェルに３連で添加した。次いで３０μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ作用溶液を各ウェルに添加し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。発光をＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定し、シグナルをビヒクル処置対照からのタンパク質濃度及びシグナルに対して正規化した。
３８４ウェルマイクロプレート形式でのＣ２Ｃ１２ ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴアッセイ
Ｃ２Ｃ１２ ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ筋芽細胞を３８４ウェルの白色透明底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）において５０μｌの成長培地に１ウェル当たり５００細胞で播種し、３日間インキュベートした。コンフルエンスに到達した後、成長培地を、ＥＬ４０６コンビネーションウォッシャーディスペンサー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して２％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を有するフェノールレッド非含有ＤＭＥＭからなる５０μｌの分化培地に置き換えた。分化の２日目に、細胞上の培地を吸引し、１０μｌの残留体積を残し、３０μｌの新鮮な分化培地に置き換えた。ＤＭＳＯ中の０．５μｌの小分子またはＤＭＳＯ単独（ビヒクル及び陽性対照ウェル用）をＢｉｏｍｅｋ Ｆｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して各ウェルに添加した。ＤＭＳＯの適切な混合を確保するために、５０μｌの追加の分化培地を、陽性対照処置ウェルを除きすべてのウェルに添加した。各々の処置されたウェルにおける化合物の最終濃度は、０．５５％ＤＭＳＯ中に０．５～１０μＭであり、ビヒクルについては０．５５％ＤＭＳＯのみであった。インキュベートの４８時間後、プレートをフェノールレッド非含有ＤＭＥＭで洗浄し、吸引し、ＥＬ４０６コンビネーションウォッシャーディスペンサーを使用して５μｌの残留体積を残した。洗浄後、１２μＭのＤＲＡＱ５核染色を含有する２５μｌの分化培地を各ウェル中で最終濃度１０μＭに到達するように添加し、３７℃で５％ＣＯ２で１５分間インキュベートした。細胞をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して画像化した。画像化した細胞の核カウントを、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）においてカスタムモジュール分析を使用して決定した。画像化及び分析の後、プレートを吸引し、５μｌの残留体積を残し、－８０℃で２～２４時間放置した。プレートを室温で解凍し、２５μｌのＰＢＳを添加し、続いて製造業者の推奨に従って調製された３０μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ作用溶液を添加した。発光をＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して測定し、各ウェルのシグナルをビヒクル処置対照からの核カウント及びシグナルに対して正規化した。
細胞表面タンパク質の分析
４８時間の処置後、筋管を０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ２（０．９ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（１．０５ｍＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の両方を含有する氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌのＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で４℃で穏やかに回転させながら３０分間インキュベートして細胞表面タンパク質を標識した。別途言及されない限り、すべての工程を４℃で実施した。細胞を穏やかに回転させながらＰＢＳ中の氷冷した１００ｍＭグリシンで５分間３回洗浄して未反応ビオチンを除去した。ＰＢＳ洗浄の後、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１％ジギトニン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）、ならびにＨａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤から構成される可溶化緩衝液中で細胞を溶解した。サンプルを４℃で１０分間回転させ、４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してペレットデブリとした。ＤＣアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して上清のタンパク質濃度（総ライセート）を決定した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ビーズを可溶化緩衝液で洗浄してから等濃度の総ライセートと組み合わせ、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。ビーズを４℃で２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．１％ジギトニンを含有する可溶化緩衝液で洗浄した。これを合計で４回の洗浄について繰り返した。ビオチン化細胞表面タンパク質を、５０ｍＭのＤＴＴを有する２ｘＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（ＬＳＢ）を使用してビオチン－アビジンから切断し、室温で６０分間回転させ、９５℃で５分間加熱した。サンプルを２，５００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離し、上清（膜画分）をイムノブロット分析のために収集した。
膜安定性アッセイ
膜安定性アッセイを先行記載された方法［３２］から改変した。浸透圧ショックのための溶液を５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、及び１ｍＭのグルコースを含有するベース溶液から調製した。スクロースをベース溶液に添加して５０、８０、１００、２８０、及び３００ｍｏｓｍｏｌのオスモル濃度に到達させた。実際のオスモル濃度をＶＡＰＲＯ蒸気圧浸透圧計（Ｗｅｓｃｏｒ Ｉｎｃ）を使用して決定した。筋管を４８時間処置し、分化の４日目に２８．５～２２３．５ミリオスモル（ｍｏｓｍｏｌ）の溶液を使用して３７℃で２０分の浸透圧ショックに供した。上清を収集し、遠心分離して細胞デブリを分離した。接着細胞をトリプシン処理し、ペレット化してから、水及び３回の凍結解凍サイクルで溶解した。上清及びライセート画分の両方におけるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを測定するためにクレアチンキナーゼアッセイ（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用した。９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり４μｌの各サンプル及び１４０μｌの試薬を３連で搭載した。ＣＫのＵ／Ｌを以下のように計算した：（ｍＯＤ／分）（総体積（ｍＬ））（希釈倍率）／（６．２２Ｍ－１ｃｍ－１）（光路（ｃｍ））（サンプル体積（ｍＬ））。ＣＫ放出率を以下のように計算した：ＣＫ細胞外／（ＣＫ細胞外＋ＣＫ細胞内）＊１００。
ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に希釈された２４または４８ｎＭのＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＩＤ ｓ６８９３２、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＭＩＳＳＩＯＮ ｓｉＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１、Ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でＨ２Ｋ ｍｄｘ筋管をトランスフェクションした。トランスフェクション試薬及び希釈したｓｉＲＮＡを２４ウェル細胞培養プレートにおいて１ウェル当たり１ｍｌの成長培地に添加した。
筋管融合指数
９６ウェルプレートにおける筋芽細胞を分化の２日目に開始して７２時間処置し、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ）で１０分間透過処理し、１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ｍｌのＭＦ－２０（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｂａｎｋ）を一晩及び１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ５９４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１時間使用してミオシン重鎖（ＭＨＣ）を検出した。ＰＢＳ洗浄を上記各工程の間に実施した。核を５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２０分間染色してから画像化した。各処置を３つのウェルにおいて実施し、１ウェル当たり３つのフィールドを記録した。ＩｍａｇｅＪを使用して総核及びＭＨＣ陽性細胞内の核の数をカウントした。ＭＨＣ陽性細胞中の核／総核として融合指数を計算した。
半減期分析
０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度を有する１μＭの化合物を使用してＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｐａｎｌａｂｓ Ｉｎｃ．によって半減期分析を実施した。ＰＢＳまたはＣＤ－１マウスからの血漿を３７℃に５分間事前に温めてから、試験化合物を添加し、３７℃でインキュベートし続けた。０、３０、６０、１２０、２４０、及び１４４０分の時点で、化合物を含有する溶液のアリコートをアセトニトリル／メタノールと混合し、混合し、遠心分離した。上清をＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために使用した。
ｉｎ ｖｉｖｏ処置
ＯＴ－９の事前安全性評価のため、我々は、６ヶ月齢のＣ５７／Ｂｌ６の雄においてＩＰ注射を実施した。マウスに１００μｌのビヒクル（５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）、９５％ＰＢＳ）、１００μｌのビヒクル中の３０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９、または１００μｌのビヒクル中の５０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９を注射した（処置当たりｎ＝１マウス）。マウスを７２時間観察し、次いで注射部位及び内部器官の視覚評価のために犠牲にした（データは示されていない）。活性の評価のため、２０週齢の雄のｍｄｘ同腹子に両方の前脛骨筋筋肉においてビヒクル（５％ＤＭＳＯ、９５％ＰＢＳ）または８６μｇのＯＴ－９を注射した。２匹マウスに両方のＴＡにおいてビヒクルを注射し、３匹のマウスに両方のＴＡにおいて２０μｌのＯＴ－９（８６μｇのＯＴ－９を含有する９．４ｍＭの溶液）を注射した。４時間後、筋肉を採取し、遺伝子発現分析のために処理した。局所投与後のＯＴ－９ｍの活性の評価のため、１９～２２週齢のｍｄｘの雄にビヒクル（５％ＤＭＳＯ、９５％ＰＢＳ）または３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９ｍを両方の前脛骨筋筋肉に注射した。４時間後、筋肉を採取し、遺伝子発現分析のために処理した。全身性投与後のＯＴ－９ｍの活性の評価のため、１３週齢のｍｄｘの雄にビヒクル（ヒドロキシプロピル－ｂ－シクロデキストリン中の４％ＰＥＧ－２００）または２０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＴ－９ｍを皮下注射した。処置の１３日後、筋肉を採取し、遺伝子発現分析のために処理した。
データ分析
プレート品質を評価するために及びヒット選択のためにロバスト厳密標準化平均差（ＳＳＭＤ＊）を使用した。
（式中、ＸＰ、ＸＮ、ＳＰ、及びＳＮは、それぞれ、陽性及び陰性対照の中央値及び中央値絶対偏差である）［３３］。プレート品質について、ＳＳＭＤ＊≧１は、良好な品質の適度な陽性対照を示す。初期ヒット選択のため、ビヒクルに対して１．４倍の増加及びＳＳＭＤ＊＞０．２５をヒットとみなした。両側ノンパラメトリックコルモゴロフ・スミルノフ検定を使用してＭａｃ ＯＳ Ｘ用のＰｒｉｓｍバージョン７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計的分析を実施した。データは、平均＋ＳＥＭとして報告されている。＜０．０５のｐ値を統計的に有意とみなした。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
結果
我々は、ヒトＳＳＰＮ遺伝子発現の小分子向上剤を同定するために筋肉細胞ベースのハイスループットアッセイを先行して作成し、検証した。Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ．２０１９；９（１）：３２。そのアッセイを使用して、我々は、臨床的化合物をスクリーニングし、アッセイが、野生型及びジストロフィン欠損筋管の両方においてＳＳＰＮ遺伝子及びタンパク質発現を増加させる小分子を同定することが可能であることを実証した。同書。この現行の研究において、我々は、ＳＳＰＮの新たな化学的実体向上剤へと開発され得る化合物を同定することを目標として大規模化学的ライブラリをスクリーニングした。キュレートされたライブラリを、ヒトにおける最適な経口バイオアベイラビリティを予測するために使用され得るパラメータを定義するリピンスキーの５の法則に基づいて薬物類似性を最大化するように開発した。
２００，０００種の小分子のハイスループットスクリーニング
キュレートされたライブラリからの２００，０００種の小分子のハイスループットスクリーニングを、ヒトＳＳＰＮ遺伝子発現のための細胞ベースのアッセイを使用して行った。アッセイにおいて使用されたレポーター細胞は、ヒトＳＳＰＮプロモーター領域と、それ続いて向上した緑色蛍光タンパク質のためのコード配列（ｈＳＳＰＮ－ＥＧＦＰ）を含有するコンストラクトで安定的にトランスフェクションされたＣ２Ｃ１２ネズミ筋芽細胞であった。ｈＳＳＰＮ－ＥＧＦＰアッセイを使用して、我々は、５．５μＭの濃度で化合物をスクリーニングした（ｎ＝１）（図１ａ）。ロバスト厳密標準化平均差（ＳＳＭＤ＊）を使用してプレート品質を計算した（図７）。アッセイ特異的偽陽性を除外するために、我々は、ヒトＳＳＰＮプロモーター活性のためのルシフェラーゼレポーターを含有する安定的にトランスフェクションされたレポーター細胞株（ｈＳＳＰＮ－ｌｕｃ）を使用してカウンタースクリーニングした。上位１０００ヒットをｈＳＳＰＮ－ＥＧＦＰ（ｎ＝３）及びｈＳＳＰＮ－ルシフェラーゼプロモーターレポーター筋管（ｎ＝３）の両方において再スクリーニングした。１０００ヒットのうち、６３種の化合物が、両方のレポーター細胞株においてレポーター発現を増加させ、そのため、確認されたヒットとみなした。確認されたヒットを共通の構造的特徴に基づいて３つの群に選別した：ファーマコフォア１、ファーマコフォア２、及び統一的構造的特徴を有さなかった他のカテゴリ。ファーマコフォア２の化合物は、ＤＮＡにインターカレートすることが知られている平坦な多環構造からなり、これは不利であると考えられた。そのため、我々は、ファーマコフォア１及び他のクラスの化合物に焦点を当てた。
ジストロフィン欠損ネズミ筋肉細胞を使用したヒット・トゥ・リード選択
初期ヒット・トゥ・リード選択のため、すべての市販の確認されたヒットを、化合物が関連疾患モデルにおいて活性であるかどうかを決定するために、ジストロフィン欠損ｍｄｘ筋管において５．５μＭの濃度で試験した。ファーマコフォア１群内で、１６ヒットのうち９種が、ビヒクル対照と比べて１．１～１．８倍の間でＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させた（図１ｂ）。他の群では、２３種の他のヒットのうち８種が、１．２～２．０倍の間でＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させた（図１ｃ）。初期ヒット・トゥ・リード選択は、２つの別のレポーター細胞株での逐次スクリーニングにより、野生型及びジストロフィン欠損ネズミ筋肉細胞の両方においてＳＳＰＮ ｍＲＮＡレベルを増加させる化合物の同定が可能になることを実証した。
溶液中で不安定であったまたは非常にばらつきのある結果をもたらした化合物を除外した後、９種の化合物が残った。これらの９種の化合物を、ｍｄｘ筋管において０．５～５０μＭの６種の異なる濃度で試験して、広い濃度範囲にわたる活性を決定した。ＰＣ１－４１を除くすべての化合物は、少なくとも１つの濃度で活性を実証した（図２ａ）。ＰＣ１－３６、ＰＣ１－４２、及びＯＴ－９は、５．５μＭでピークとなった濃度依存的反応を誘導した。ＳＳＰＮ ｍＲＮＡの増加がまたタンパク質レベルで明らかであるかどうかを決定するために、我々は、ｍｄｘ筋管を２．５～１０μＭのＯＴ－９、ＰＣ１－３６、及びＰＣ１－４２で処置し、ＳＳＰＮ抗体を用いたイムノブロットによって総タンパク質ライセートを分析した。我々は、ＰＣ１－４２が、ＳＳＰＮタンパク質の増加を誘導しなかったことを見出した（データは示されていない）。本発明の化合物ＯＴ－９及びＰＣ１－３６は、ｍｄｘ筋管においてＳＳＰＮタンパク質レベルを１．５倍増加させ、これらの化合物が、ジストロフィン欠損筋肉細胞においてＳＳＰＮ遺伝子及びタンパク質存在量の両方を増加させたことを実証している（図２ｂ～ｃ）。
先行して、我々は、分化する筋管においてＳＳＰＮ遺伝子発現をプロファイル化し、ＳＳＰＮ ｍＲＮＡが３日目に増加し始め、分化の５日目に１０倍増加したレベルに到達し、細胞が分化するにつれてＳＳＰＮレベルが増加することを示唆していることを見出した［２６］。化合物が誘導したＳＳＰＮ発現の増加が向上した分化によるものであったかどうかを決定するために、我々は、ｍｄｘ筋管をＯＴ－９で処置し、融合指数及び分化のマーカーである筋原性転写因子ＭＹＯＧの発現を評価した。ＯＴ－９は、ｍｄｘ筋管における融合指数及びＭＹＯＧ遺伝子発現のわずかな増加を誘導し、ＳＳＰＮの増加が分化の速度を増加させ得ることまたはＯＴ－９が、部分的に、分化経路を介して機能し得ることを示唆している（図８）。
確認されたヒットが、細胞株特異的様式でジストロフィン細胞株においてのみ作用していなかったかどうかを検証するために、我々は、野生型Ｃ２Ｃ１２筋管においてＯＴ－９及びＰＣ１－３６を試験した。我々は、両方の化合物がＣ２Ｃ１２筋管においてＳＳＰＮ ｍＲＮＡレベルを増加させたことを見出した。（図３）。Ｃ２Ｃ１２、Ｈ２Ｋ ＷＴ、及びＨ２Ｋ ｍｄｘネズミ筋芽細胞の処置は、ＰＣ１－３６ではなくＯＴ－９が、すべての筋芽細胞株においてＳＳＰＮ ｍＲＮＡレベルを増加させたことを明らかにした。筋芽細胞においてＯＴ－９がＳＳＰＮを増加させる独自の能力は、ＯＴ－９及びＰＣ１－３６が、異なる生物学的標的を有し得ることを示唆している（図９）。
新たなアナログを有効に試験するために、我々は、細胞においてＳＳＰＮタンパク質を検出するための方法、例えば、ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴを作成した。ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴは、ルシフェラーゼ酵素の１１アミノ酸サブユニットであるＨｉＢｉＴと呼ばれるＮ末端融合タンパク質を有する内因性ＳＳＰＮタンパク質を発現するネズミＣ２Ｃ１２細胞株に基づいていた（図１０ａ）。ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴタンパク質は、発光シグナルの形成を触媒するためのルシフェラーゼ酵素の基質及びより大きなサブユニットの添加を介して定量される。Ｃ２Ｃ１２ ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ細胞は、分化を通して増加するレベルでレポータータンパク質を発現し、これは、ＳＳＰＮ ｍＲＮＡが分化と共に増加するという我々の先行の知見によって支持される（図１０ｂ）。我々は、アッセイのための陽性対照として使用するためのｃ－ｒａｆ阻害剤であるＧＷ５０７４を同定した。５μＭのＧＷ５０７４で処置されたＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ Ｃ２Ｃ１２筋管は、ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴレベルの１．３５倍の増加を示す（図１０ｃ）。レポーターが我々のリード化合物での処置後のＳＳＰＮタンパク質レベルの変化を検出する能力を検証するために、我々は、ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ細胞を１２ウェル及び３８４ウェルプレート形式の両方で０．５～１０μＭのＯＴ－９で処置した。アッセイは、ＳＳＰＮの用量依存的増加を検出した（図１０ｄ）。これらの結果は、ＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴ Ｃ２Ｃ１２アッセイが、我々のリード化合物のＳＡＲ分析において有用なツールであることを実証している。
ＯＴ－９化合物は、細胞表面でラミニン結合接着複合体を増加させる
横紋筋において、ＳＳＰＮは、細胞膜（筋鞘）を細胞外マトリックスに接続させる３つの主要なラミニン結合接着複合体：ＤＧＣ、ＵＧＣ、及びα７β１Ｄ－インテグリンのための骨格である。ｍｄｘ筋肉におけるＳＳＰＮの過剰発現は、ＵＧＣ及びα７β１Ｄ－インテグリン複合体の局在化を増加させる。ＯＴ－９が筋管において細胞膜でＳＳＰＮ局在化に影響を及ぼすかどうかを決定するために、我々は、細胞表面タンパク質をアミン反応性ビオチンで標識した。ＯＴ－９で処置されたＣ２Ｃ１２筋管を細胞不透過性ビオチン中でインキュベートし、溶解してタンパク質を可溶化し、アビジンでアフィニティー精製し、ＬＳＢで溶出させて細胞表面タンパク質を得た。α－ＤＧのラミニン結合糖エピトープ（グリカン）及びコアα－ＤＧタンパク質を認識する抗体を使用して（図４ａ）、我々は、ビオチン化細胞表面タンパク質及び総ライセートのイムノブロット分析を実施した。ＯＴ－９は、グリコシル化α－ＤＧを１．８倍及びコアα－ＤＧを１．６倍細胞表面において増加させた（図４ｂ～ｄ）。総タンパク質ライセートのイムノブロット分析は、ＯＴ－９がグリコシル化α－ＤＧのレベルを増加させなかったが、コアα－ＤＧを１．５倍増加させたことを明らかにした（図１１）。グリコシル化α－ＤＧの細胞表面及び総ライセートレベルにおける差は、ＯＴ－９がラミニン結合α－ＤＧの膜局在化を増加させたことを示唆している。
ＳＳＰＮを過剰発現するｍｄｘマウスにおいて、ジストロフィンパラログであるユートロフィンは、筋鞘で上方制御され、膜のＥＣＭへの接着の増加に寄与する。同じビオチン化実験アプローチを使用して、我々は、ＯＴ－９が細胞表面膜でユートロフィン発現に影響を及ぼしたかどうかを評価した。ユートロフィンは細胞内にあるので、直接的にビオチン化されないが、可溶化緩衝液は、ユートロフィン、β－ジストログリカン、及び細胞表面α－ＤＧのもの含め、接着複合体内の相互作用を保存した穏やかな洗浄剤を含有していた。ＯＴ－９で処置されたｍｄｘ筋管は、膜結合ユートロフィンタンパク質の１．６倍の増加を示した（図４ｅ～ｆ）。まとめると、我々の知見は、ＯＴ－９がα－ＤＧ及びユートロフィンの両方の筋鞘局在化を増加させたことを実証し、ラミニン結合ユートロフィン糖タンパク質複合体の上方制御を示唆している。
ＯＴ－９は、サルコスパンの上方制御を介してジストロフィン欠損筋管における膜安定性を改善する
細胞膜でのユートロフィン及びジストログリカンの増加が、膜安定性における機能的改善をもたらしたかどうかを決定するために、我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏクレアチンキナーゼ（ＣＫ）放出アッセイのための改変プロトコルを使用した［３２］。そのアッセイは、筋管を浸透圧ショックに供することを伴い、これは、細胞の腫れ及び膜損傷を引き起こし、細胞内ＣＫを細胞から周囲の培地に放出させる（図５ａ）。ＣＫ放出の検出可能な変化をもたらす浸透圧ショックのための最適な条件を決定するために、我々は、ｍｄｘをビヒクルまたは５μＭのＯＴ－９で４８時間処置し、次いで２８．５～２２３．５ミリオスモル（ｍｏｓｍｏｌ）の範囲の溶液を使用して浸透圧ショックを誘導した（２２３．５ｍｏｓｍｏｌは生理的オスモル濃度（２８０ｍｏｓｍｏｌ）と近い）。ｍｄｘ筋管は、より低く、より損傷させるオスモル濃度でより高いＣＫ放出を示した（図５ｂ）。２８．５ｍｏｓｍｏｌ溶液での浸透圧ショックは、３０～４０％のＣＫ放出をもたらしたのに対し、４５及び６３ｍｏｓｍｏｌ溶液は、１０～１５％のＣＫ放出を引き起こし、比較的少ない膜損傷を示した。４５、６３、及び２２３．５ｍｏｓｍｏｌ溶液での浸透圧ショックに供された細胞において、ＯＴ－９は、ＣＫ放出を有意に減少させ、ＯＴ－９が膜を安定化し、それを浸透圧ショック誘導損傷から保護したことを示唆している。ＯＴ－９での処置は、２８．５ｍｏｓｍｏｌ溶液での浸透圧ショックに供された細胞におけるＣＫ放出を減少させず、ＯＴ－９が、おそらく極端に低いオスモル濃度によって引き起こされる重度の膜損傷に起因して、膜を安定化することができなかったことを示している。
ＯＴ－９によって誘導される膜安定化効果がＳＳＰＮに依存性であったかどうかを決定するために、我々は、化合物処置と並行してＳＳＰＮのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを実施した。ノックダウン効率を評価するために、我々はまず、ｍｄｘ筋管を１、５、または１０μＭのＯＴ－９及び２４ｎＭのスクランブルｓｉＲＮＡまたはＳＳＰＮ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（ＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡ）で処置した。ビヒクル対照で処置された細胞では、ＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡは、スクランブル対照と比べてＳＳＰＮ ｍＲＮＡを７６％減少させた（図１２）。スクランブルｓｉＲＮＡ及びＯＴ－９で処置された細胞では、ＳＳＰＮ ｍＲＮＡは、ビヒクル対照と比べて最大で１．４倍増加した。ＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡ及びＯＴ－９で処置された細胞では、ＳＳＰＮレベルは、それらのそれぞれのスクランブルｓｉＲＮＡ対照と比べて減少した。しかしながら、ＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡを用いた場合でも、ＯＴ－９は、不完全なノックダウンのためにＳＳＰＮ ｍＲＮＡレベルを増加させたので、我々は、後の実験においてより高いｓｉＲＮＡ濃度を使用することになった。
任意の化合物処置の非存在下で膜安定性に対するＳＳＰＮノックダウンの効果を評価するために、我々は、ｍｄｘ筋管を２４及び４８ｎＭのスクランブル及びＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、細胞を４５ｍｏｓｍｏｌの溶液を用いて浸透圧ショックに供した。２４ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞では、ＳＳＰＮのノックダウンは、ＣＫ放出に影響を及ぼさなかった（図５ｃ）。しかしながら、４８ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞では、ＳＳＰＮのノックダウンは、ＣＫ放出を９％から１３％まで増加させ、ＳＳＰＮ自体の喪失が、筋鞘を膜損傷に対してより敏感なものにすることを示している。そのデータをＳＳＰＮノックダウンによって誘導されるベースラインＣＫ放出の変化と混同することを防止するために、我々は、次の研究のために２４ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を選択したが、その理由はそれがベースラインＣＫ放出に影響を及ぼさなかったからである。我々は、ｍｄｘ筋管を浸透圧ショック前に４８時間、２４ｎＭのスクランブルまたはＳＳＰＮ ｓｉＲＮＡと並行して１０μＭのＯＴ－９で処置し、ＳＳＰＮの枯渇が、ＣＫ放出を６．５％から８％まで増加させたことを発見した（図５ｄ）。結果は、ＳＳＰＮのノックダウンが、ＯＴ－９が筋鞘を安定化する能力を減少させることを明らかにし、ＳＳＰＮ発現が、ＯＴ－９の十分な膜安定化効果に必要とされることを示している。
ＯＴ－９及びＯＴ－９ｍは、ｍｄｘマウスにおけるＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させる
ＯＴ－９がＳＳＰＮタンパク質及びラミニン結合接着複合体を増加させ、ひいてはジストロフィン欠損筋管における改善した膜安定性をもたらす能力を実証した後、我々は次に、ＯＴ－９がｉｎ ｖｉｖｏでＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させる能力を詮索した。ＯＴ－９安定性の推定は、マウス血漿（７．７時間）対ＰＢＳ（４９分）における化合物の半減期の大きな差を明らかにした（図１３及び１４）。細胞培地は両方の溶液とは区別されるので、我々は、５μＭのＯＴ－９で４時間処置されたＣ２Ｃ１２筋管におけるＳＳＰＮ ｍＲＮＡの安定性を定量して、短期間処置がＳＳＰＮ発現を誘導し得るかどうかを決定した。ＯＴ－９での処置の４時間後、化合物を含有する培地を除去し、新鮮な培地に変更した。化合物除去から０、４、２４、及び４８時間後に細胞を採取した（図６ａ）。化合物除去の直後（０時間）、ＳＳＰＮ ｍＲＮＡレベルは、ビヒクル対照に対して１．５倍上昇し、ＯＴ－９が処置のわずか４時間後にＳＳＰＮ遺伝子発現を誘導することを実証している（図６ｂ）。しかしながら、化合物除去の４、２４、及び４８時間後、ＳＳＰＮ ｍＲＮＡレベルは、ベースラインレベルに戻り、これは、ＳＳＰＮ ｍＲＮＡが、ＯＴ－９による誘導後に最大で４時間上方制御されたことを示唆していた。
ＯＴ－９のｉｎ ｖｉｖｏ安全性及び活性を評価するために、我々は、野生型Ｃ５７／Ｂｌ６及びｍｄｘマウスにおいて２つの試験的な研究を実施した。ＯＴ－９の事前安全性評価のため、我々は、６ヶ月齢のＣ５７／Ｂｌ６の雄においてＩＰ注射を実施した。マウスにビヒクル、３０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９、または５０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９を注射した（ｎ＝１）。注射部位で炎症、壊死または化合物蓄積の兆候は観察されなかった。肝臓、腎臓、膵臓、及び腸は、正常な重量及びサイズのものであるようであった。いくつかの不溶性粒子が５０ｍｇ／ｋｇの溶液ＯＴ－９において観察されたので、３０ｍｇ／ｋｇの濃度をｉｎ ｖｉｖｏ活性の評価のために選択した。
予備安全性評価の後、我々は、ＯＴ－９がｉｎ ｖｉｖｏでＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させる能力を試験した。我々は、図８ｂに示される知見に基づいて処置の４時間後に活性を評価することを選択し、これは、ＯＴ－９での４時間の処置がｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＳＰＮ ｍＲＮＡレベルを有意に増加させるのに十分であったことを実証した。５匹の２０週齢の雄ｍｄｘ同腹子を両方の前脛骨筋（ＴＡ）筋肉において筋肉内注射に供した。２匹のマウスに両方のＴＡにおいてビヒクルを注射し、２匹のマウスに３ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９（安全性評価において使用された９．４ｍＭのモル当量）を注射した。処置の４時間後、ＴＡを採取し、遺伝子発現分析のために処理した。マウスにおける局所ＯＴ－９注射後に有害作用は観察されなかった。ＯＴ－９は、ビヒクル対照処置群と比べてＳＳＰＮ遺伝子発現の１．７倍の増加を誘導し、Ｔ－９が、ｍｄｘマウスにおいてＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させることが可能であることを実証している（図６ｃ）。ＯＴ－９がｉｎ ｖｉｖｏでＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させることが可能であるという決定の後、我々は、その誘導体の１つであるＯＴ－９ｍを、ｍｄｘマウスにおけるＳＳＰＮ発現を増加させるその能力について評価した。ＯＴ－９ｍは、ＯＴ－９と比較してｉｎ ｖｉｔｒｏでのその改善した活性に基づいて選択された（表１のエントリ１及び１４を比較されたい）。局所投与後のｉｎ ｖｉｖｏでのＯＴ－９ｍの活性を評価するために、１１匹の１９～２２週齢の雄ｍｄｘマウスを両方の前脛骨筋（ＴＡ）筋肉における筋肉内注射に供した。４匹のマウスに両方のＴＡにおいてビヒクルを注射し、３匹のマウスに３ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９ｍを注射し、４匹のマウスに１０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９ｍを注射した。処置の４時間後、ＴＡを採取し、遺伝子発現分析のために処理した。マウスにおける局所ＯＴ－９ｍ注射後に有害作用は観察されなかった。ＯＴ－９と同様に、ｍｄｘマウスにおけるＯＴ－９ｍの筋肉内注射は、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量でのＯＴ－９ｍが、４時間もの少ない時間でＳＳＰＮ遺伝子発現を増加させたことを実証した（図６ｄ）。
局所投与に続いて、我々は、ＯＴ－９ｍが全身処置後にｍｄｘマウスにおけるＳＳＰＮ発現を向上させる能力を評価した。１３週齢のｍｄｘの雄にビヒクル（ヒドロキシプロピル－ｂ－シクロデキストリン中の４％ＰＥＧ－２００）または１日２０ｍｇ／ｋｇのＯＴ－９ｍを皮下注射した。処置の１３日後、大腿四頭筋、ＴＡ、及び心臓筋肉を採取し、大腿四頭筋を遺伝子発現分析のために処理した。ＯＴ－９ｍによる全身性処置は、ＳＳＰＮ転写産物の２倍増加をもたらす（図６ｅ）。我々は、様々なレベルのサルコスパンを発現するマウス系統の利用性を介してｍｄｘマウスにおける疾患病理を回復するために必要なサルコスパンのレベルを先行して調査した。我々は、サルコスパンを１．５倍過剰発現するマウスが回復しなかったのに対し、サルコスパンを３倍過剰発現するマウスが回復したことを決定した。これは、ｍｄｘマウスを回復させるのに必要とされるサルコスパン過剰発現のレベルが、１．５～３倍の間のどこかであることを実証した。ＯＴ－９及びＯＴ－９ｍでのｍｄｘマウスの処置は、両方の化合物が、ｍｄｘマウスにおいてＳＳＰＮ遺伝子発現を所望の１．５～３倍の増加に近いレベルで増加させることが可能であることを実証した。
実施例１：例示的な化合物の調製
合成スキームＡ
合成スキームＢ
１．１ ２－クロロ－６，７－ジメチルキノリン－３－カルバルデヒド。工程１．ＰＯＣｌ３（１３．７ｍＬ、１４７ｍｍｏｌ、６ｅｑ）をＤＭＦ（５．７ｍＬ、７３．５ｍｍｏｌ、３ｅｑ）に０℃で滴下して添加し、室温で３０分間撹拌した。次いで、Ｎ－（３，４－ジメチルフェニル）アセトアミド（４ｇ、２４．５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を室温で添加し、次いで反応物を８０℃に加熱し、１６時間撹拌した。完了後、混合物を室温に冷却し、次いで冷水に注いだ。次いで水性層をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層をブラインで洗浄し、濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで濃縮した。次いで粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＥｔＯＡｃ：クロロホルム）を使用して精製して純粋な生成物を白色の固体として（２．８５ｇ、５２％）得た。
１．２ （Ｅ）－２－クロロ－６，７－ジメチルキノリン－３－カルバルデヒドオキシム。工程２． ０℃の塩酸ヒドロキシルアミン（６０９ｍｇ、８．７７ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）及びメタノール（１５ｍＬ）の溶液に水酸化ナトリウム溶液（５．３７ｍＬの水中に４０９ｍｇ、１０．２３ｍｍｏｌ、１．４ｅｑ）を添加し、続いて化合物２（１．６０５ｇ、７．３１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を１０分の期間にわたって滴下して添加した。反応混合物を６５℃で１時間還流した。出発物質消費がＴＬＣによって確認されたとき、反応混合物を室温に冷却し、濾過し、氷冷水及びヘキサンで洗浄した。ヘキサン層を真空下で蒸発させて所望の生成物をオフホワイト色の固体（１．６ｇ、９４％）として得た。残存する１．２ｇの出発物質を、生成物を生成するための条件に供した（１．１９ｇ、９４％）。
１．３ ２－クロロ－６，７－ジメチルキノリン－３－カルボニトリル。工程３．無水酢酸（１７ｍＬ）中の化合物３を１３０℃で３時間還流した。反応の完了をＴＬＣ（１０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって確認したら、混合物を室温に冷却し、余剰の溶媒を蒸発させた。残存固体をＥｔＯＡｃ中で１時間撹拌し、次いで固体を濾過し、ＥｔＯＡｃ（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。次いで固体をカラムクロマトグラフィー（０～１００％ＤＣＭ：ヘキサン）を使用して精製して純粋な生成物を白色の固体として生成した。濾液をまた４０ｍＬの氷冷水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて粗物質を得た。次いでこの物質をカラムクロマトグラフィー（０～１００％ＤＣＭ：ヘキサン）によって精製して純粋な生成物を白色の固体として生成した。２つの固体を組み合わせた（４６１ｍｇ、３１％）。追加の１．１９ｇの化合物３を反応に供して生成物を白色の固体（６２０ｍｇ、５６％）として生成した。
１．４ ６，７－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボニトリル。工程４．メタノール（１２．６ｍＬ）中の化合物４（２７４ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）及び濃縮塩酸（２５．４ｍＬ）の混合物を４時間還流した。反応の完了後、混合物を室温に冷却し、生成物を混合物から破砕した。生成物を濾過し、アセトン（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して生成物をオフホワイト色の固体（１００ｍｇ、４０％）として生成した。追加の６２０ｍｇの化合物４を反応に供して生成物をふんわりしたオフホワイト色の固体（２６７ｍｇ、４７％）として生成した。
１．５ ２－（２－（４－メトキシフェニル）－２－オキソエトキシ）－７－メチルキノリン－３－カルボニトリルを得るための手順。工程５．ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物５（５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の溶液に無水炭酸カリウム（５２．３ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加し、続いてケトン（５８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を添加した。次いで生じた混合物を６０℃で一晩撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって確認した後、反応混合物を室温に冷却し、水で希釈した。次いで水性層を酢酸エチルで抽出した。次いで有機層を冷水及びブラインで洗浄した。次いで有機層を濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。次いで粗物質をカラムクロマトグラフィー（４０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して純粋な生成物を生成した。
１．６ ２－（２－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）－２－オキソエトキシ）－６，７－ジメチルキノリン－３－カルボニトリルを得るための手順。工程５．ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物５（７５ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の溶液に無水炭酸カリウム（７８．４ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加し、続いてケトン（９１．６ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を添加した。次いで生じた混合物を６０℃で一晩撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって確認した後、反応混合物を室温に冷却し、水で希釈した。次いで水性層を酢酸エチルで抽出した。次いで有機層を冷水及びブラインで洗浄した。次いで有機層を濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。次いで粗物質をカラムクロマトグラフィー（４０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）及びｐｒｅｐ－ＨＰＬＣによって精製して純粋な生成物を生成した。
１．７ ２－（（２－（４－フルオロフェニル）－２－オキソエチル）チオ）－６，７－ジメチルキノリン－３－カルボニトリルを得るための手順。工程５．化合物５（１６９ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を無水ＤＭＦ（６．７６ｍＬ）に６０℃で溶解し、次いで室温に冷却した。次いで、酢酸カリウム（１５５ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）及び２－ブロモ－１－（４－フルオロフェニル）エタン－１－オン（３４２ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（１００％ＤＣＭ）によって確認した後、２０ｍＬの水を反応に添加した。次いで破砕した淡黄色の固体を濾過した。次いで固体をＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１０％）に再溶解し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。次いで固体を４０ｍＬのＤＣＭ：ＭｅＯＨ（５％）に溶解し、ＤＣＭを使用してプラグを通過させて生成物を淡黄色の固体（１８５ｍｇ、６９％）として生成した。［Ｍ＋Ｈ］＋＝３５１．４。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ＝ ８．２３ （ｓ， １Ｈ）， ８．２０ － ８．１２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．７５ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， ６Ｈ）。
合成スキームＣ：
２．１ ジメチル２－（２，４－ジニトロベンジリデン）マロネート。工程１．無水酢酸（１．０９ｍＬ）中の２，４－ジニトロベンズアルデヒド（５００ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の混合物にジメチルマロネート（３３６．８ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を添加し、続いて無水炭酸カリウム（５２８．５ｍｇ、３．８２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加した。生じた反応混合物を８０℃に加熱し、４時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（１００％ＤＣＭ）によって確認した後、冷水を混合物に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。次いで有機層をブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して粗生成物を生成した。次いで生成物をカラムクロマトグラフィー（９０％ＤＣＭ：ヘキサン）によって精製して純粋な生成物（５７５ｍｇ、７３％）を生成した。
２．２ メチル７－アミノ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキシレート。工程２．ＡｃＯＨ（５．８ｍＬ）中の化合物２（５４０ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）に鉄粉末（１．９４ｇ、３４．８１ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）を室温で添加した。生じた混合物を８０℃に加熱し、４時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって確認した後、反応混合物をセライトを通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を重炭酸ナトリウムを使用して塩基性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層をブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて生成物（２０７ｍｇ、５４％）を生成し、これを精製をせずに次の工程に供した。
２．３ メチル７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキシレート。工程３．メタノール（２．３７ｍＬ）中の化合物３（２００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）にアセトアルデヒド（０．４６ｍＬ、８．３ｍｍｏｌ、８．７５ｅｑ）を室温で添加し、続いて酢酸（０．４６ｍＬ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（４６．５ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ、０．７８ｅｑ）を添加した。生じた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって確認した後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、冷水及びブライン溶液で洗浄した。有機層を濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて粗生成物を生成し、次いでこれをカラムクロマトグラフィー（３０％ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ）によって精製して生成物（３０ｍｇ、１３％）を生成した。
２．４ ７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボン酸。工程４．０℃のＥｔＯＨ（０．９ｍＬ）中の化合物４（３０ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）にＮａＯＨ溶液（０．６ｍＬの水に２１．９ｍｇ、０．５４７ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）を添加した。次いで反応物を８０℃で２時間撹拌した。反応完了後、混合物を冷水に注ぎ、ｐＨを５％クエン酸溶液を使用して５に調整した。形成した固体を濾過によって収集し、水及びジエチルエーテルで洗浄して生成物（１８ｍｇ、４８％）を生成した。
２．５ 最終生成物を得るための手順。工程５．１０℃の無水ＤＭＦ（０．５４ｍＬ）中の出発物質（１８ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）及び（４－アミノフェニル）（１，４－オキサゼパン－４－イル）メタノン（１８．３ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）にＨＡＴＵ（３９．４ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）及びトリエチルアミン（０．１１５ｍＬ、０．０８３ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。出発物質の消費後、反応混合物を冷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。次いで有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗物質をｐｒｅｐ－ＨＰＬＣを使用して精製して純粋な生成物（１７．９ｍｇ、５６％）を生成した。［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６３．５。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝ １２．３３ （ｓ， １Ｈ）， １１．９６ （ｓ， １Ｈ）， ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．８， １１．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．３， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５４ （ｓ， １Ｈ）， ３．６６ （ｂｒ ｓ， ６Ｈ）， ３．５１ － ３．３６ （ｍ， ６Ｈ）， １．７２ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， １．１４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ６Ｈ）。
合成スキームＤ：
３．１ エチル７－ブロモキノリン－３－カルボキシレート。工程１．エタノール（８０．８ｍＬ）中の４－ブロモ－３－ニトロベンズアルデヒド（２．４２ｇ、１０．５１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の混合物にエチル３，３－ジエトキシプロパノエート（４ｇ、２１．０２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を添加し、続いて塩化スズ水和物（１０．６８ｇ、４７．３ｍｍｏｌ、４．５ｅｑ）を添加した。反応物を８０℃で１２時間還流した。反応の完了後、エタノールを加圧下で濃縮除去した。次いで混合物をＥｔＯＡｃ及び重炭酸ナトリウムで希釈し、３０分間撹拌した。次いで混合物をセライトで濾過して未溶解塩を除去した。有機層を分離し、次いで水性層をＥｔＯＡｃ（２ｘ）で抽出した。組み合わせた有機層を濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。次いで粗生成物をヘキサンで洗浄し、濾過し、減圧下で乾燥させて純粋な生成物（１．５ｇ、５１％）を生成した。
３．２ エチル７－（ジエチルアミノ）キノリン－３－カルボキシレート。工程２．トルエン（１３９ｍＬ）中の化合物２（１．４ｇ、４．９９８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の溶液にジエチルアミン（１．８ｍＬ、１７．５ｍｍｏｌ、３．５ｅｑ）を添加した。混合物をアルゴンで１５分間パージし、続いてＰｄ２（ｄｂａ）３（４５８ｍｇ、０．４９９８ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）、ＲｕＰｈｏｓ（４６６ｍｇ、０．９９９６ｍｍｏｌ、０．２ｅｑ）、及び炭酸セシウム（５．９４ｇ、１８．２４ｍｍｏｌ、３．６５ｅｑ）を添加した。生じた混合物を加熱して還流し、２時間撹拌した。反応の完了の後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、濾過した。濾液を水及びブラインで洗浄した。次いで有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて粗物質を生成した。次いで粗物質をカラムクロマトグラフィー（０～２０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して純粋な生成物（７７９ｍｇ、５７％）を生成した。
３．３ ７－（ジエチルアミノ）キノリン－３－カルボン酸。工程３．ＴＨＦ（７．６ｍＬ）中の化合物３（７７９ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液にＮａＯＨ溶液（７．６ｍＬの水中に６２９ｍｇ、１５．７ｍｍｏｌ、５．５ｅｑ）を室温で添加した。生じた混合物を還流下で４時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって確認した後、余剰のＴＨＦを蒸発させ、残存する残渣を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄した。水性層のｐＨを１０％クエン酸水溶液を使用して５に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層をブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して生成物を黄色の固体（４３１ｍｇ、６２％の収率）として生成した。
３．４ 最終生成物を得るための一般的手順。工程４．ＤＣＭ（２．１ｍＬ）中の化合物４（５０ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の溶液にアミン（０．１８４ｍｍｏｌ、０．９ｅｑ）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．０７１ｍＬ、０．４０９ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（３４．５ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、及びＥＤＣＩ（４３．２ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加した。生じた混合物を室温で３時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって確認した後、混合物をＤＣＭで希釈し、冷水、ブライン溶液で洗浄し、濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて粗化合物を得た。生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ）によって精製した。
スキーム１．Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）－４－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキサミドのための合成スキーム
Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）－４－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキサミド：無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の化合物－１．１（５０．０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－１．２（４２．６ｍｇ、０．２２１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣＩ（５１．９ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３６．６ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０８５７ｍＬ、０．４９２ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、生じた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。水層を酢酸エチルで抽出し、組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた粗化合物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０から１０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製して所望の生成物を白色の固体（６３ｍｇ、６７．８％）として得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３７８．２。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝ １２．００ （ｓ， １Ｈ）， １０．５５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８２ （ｄ， Ｊ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７３ （ｄ， Ｊ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６２－７．５２ （ｍ， １Ｈ）， ７．３９－７．１５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４２－３．１４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， １．０９ （ｂｒ ｓ， ６Ｈ）。
スキーム２．Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）－７－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキサミドのための合成スキーム
Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）－７－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキサミド：無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の化合物－２．１（５０ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－１．２（４１．８ｍｇ、０．２１７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣＩ（５０．９ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３５．９ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０８４１ｍＬ、０．４８３ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、生じた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。水層を酢酸エチルで抽出し、組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた粗化合物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０から１０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製していくらかの不純物を伴って所望の生成物を得た。最後に、化合物をＤＣＭ中の３０％ヘキサンでトリチュレートして所望の生成物をオフホワイト色の固体（３２ｍｇ、３５％）として得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３８２．２。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝ １２．７４ （ｓ， １Ｈ）， １２．１１ （ｓ， １Ｈ）， ８．９９ （ｓ， １Ｈ）， ８．１２ （ｄｄ， Ｊ＝ ６．４， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７６ （ｄ， Ｊ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３６ （ｄ， Ｊ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２８－７．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４７－３．１６ （ｍ， ４Ｈ）， １．０９ （ｂｒ ｓ， ６Ｈ）。
スキーム－３．化合物Ｎ－（４－（１，４－オキサゼパン－４－カルボニル）フェニル）－６－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキサミドのための合成スキーム
Ｎ－（４－（１，４－オキサゼパン－４－カルボニル）フェニル）－６－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキサミド：無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の化合物－３．１（５０ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－３．２（４５．２ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣＩ（４８．１ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３３．９ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０７９５ｍＬ、０．４５６ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、生じた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応の完了の後、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。水層を酢酸エチルで抽出し、組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗化合物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０から５％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製していくらかのアニリン（３．２）を伴って所望の生成物を得た。最後にＤＣＭ：アセトン：ヘキサン（４０：４０：２０）を使用してＰＬＣによって精製し、乾燥させて所望の生成物を淡黄色の固体（４９ｍｇ、５１％）として得た、（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝４２２．２。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝ １２．６４ （ｓ， １Ｈ）， １２．４２ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ７．７７ （ｂｒ ｄ， Ｊ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ＝ ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４６－７．２８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．８１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．７３－３．４１ （ｍ， ８Ｈ）， １．９２－１．６６ （ｍ， ２Ｈ）。
スキーム４．化合物Ｎ－（４－（１，４－オキサゼパン－４－カルボニル）フェニル）－６－メトキシ－２－メチルキノリン－３－カルボキサミドのための合成スキーム
Ｎ－（４－（１，４－オキサゼパン－４－カルボニル）フェニル）－６－メトキシ－２－メチルキノリン－３－カルボキサミド：無水ジクロロメタン（２．１２ｍＬ）中の化合物－４．１（５３．０ｍｇ、０．２４４ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－３．２（４８．４ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣＩ（５１．４ｍｇ、０．２６８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３６．３ｍｇ、０．２６８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０８５ｍＬ、０．４８８ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、生じた反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ及びＬＣＭＳは、いかなる生成物形成の兆候も示さなかった。そのため、ＨＡＴＵ（１３９ｍｇ、０．３６６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加し、室温で一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。水層を酢酸エチルで抽出し、組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗化合物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０から３０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製し、所望の画分を濃縮し、ＤＣＭに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。化合物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０から１０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって再度精製して所望の生成物を淡黄色の固体（３７ｍｇ、３６％）として得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝ ４２０．２。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ＝ ８．１４ （ｓ， １Ｈ）， ７．９５ （ｄ， Ｊ＝ ９．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０４ － ７．８３ （ｍ， １Ｈ）， ７．７０ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２－７．２８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．０３ （ｄ， Ｊ＝ ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８７ － ３．５３ （ｍ， ９Ｈ）， ２．８４ （ｓ， ３Ｈ）， １．９４ － １．５５ （ｍ， ２Ｈ）。
スキーム５．化合物７－アミノ－Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）キノリン－３－カルボキサミドのための合成スキーム
エチル７－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）キノリン－３－カルボキシレート。工程－１：テトラヒドロフラン（１ｍＬ）及びＨ２Ｏ（８．３３ｍｇ、０．４６２ｍｍｏｌ）中の化合物－５．１（１００ｍｇ、０．４６２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に炭酸カリウムセスキ水和物（１２８ｍｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）を添加した。約５分後、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート（１１８ｍｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３時間室温で撹拌した。混合物を水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィ（０～２０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して化合物－５．２を、５０ｍｇの未反応出発物質を伴って淡黄色の固体（２５ｍｇ、１７％）として得た。
７－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）キノリン－３－カルボン酸。工程－２： テトラヒドロフラン（２ｍＬ）中の化合物－５．２（１０５ｍｇ、３３２ｍｍｏｌ）の溶液に水酸化ナトリウム（２６．６ｍｇ、０．６６５ｍｍｏｌ）を添加し、生じた反応混合物を室温で５６時間撹拌した。余剰の溶媒を減圧下で蒸留によって除去し、残渣のｐＨを０．１ＭのＨＣｌを使用して４に調整し、化合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて化合物－５．３（６２ｍｇ、６４％）を生成した。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝２８９．２。
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）カルバモイル）キノリン－７－イル）カルバメート。工程－３：ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中の化合物－５．３（６２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－１．２（４１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（８３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１２０ｍｇ、３２０ｍｍｏｌ）を添加し、生じた反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、冷水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて粗化合物を得、それをコンビフラッシュによって精製して純粋な化合物－５．４を黄色の固体（４６ｍｇ、４６％）として得た、（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６３．３。
７－アミノ－Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）キノリン－３－カルボキサミド。工程－４：４Ｍの水性ＨＣｌ（１ｍＬ）を化合物－５．４（４６ｍｇ）に添加し、室温で５～１０分撹拌し、続いて２０分間超音波処理した。ＬＣＭＳ分析は、未反応の出発物質を伴って生成物の形成を示している。反応混合物にメタノール（２ｍＬ）を添加し、超音波処理し、続いてメタノールを除去した。残渣を凍結乾燥して吸湿性の黄色の粉末（３．２ｍｇ、９％）を得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３６３．２。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ＝ ９．２０ （ｓ， １Ｈ）， ９．１６ （ｄ， Ｊ＝ １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０４ （ｄ， Ｊ＝ ９．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８９ （ｄ， Ｊ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４４ （ｄ， Ｊ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３６ （ｄｄ， Ｊ＝ ２．１， ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｄ， Ｊ＝ １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６７－３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４５－３．３３ （ｍ， ２Ｈ）， １．３４－１．１０ （ｍ， ６Ｈ）。
スキーム６．化合物Ｎ－（４－（１，４－オキサゼパン－４－カルボニル）フェニル）－６－アミノキノリン－３－カルボキサミド塩酸塩のための合成スキーム
メチル６－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）キノリン－３－カルボキシレート。工程－１：乾燥テトラヒドロフラン（６．０ｍＬ）中の化合物－６．１（１５０ｍｇ、０．７４２ｍｍｏｌ）の溶液にチオウレア（５．６５ｍｇ、０．０７４２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０６４６ｍＬ、０．３７１ｍｍｏｌ）を添加し、生じた反応混合物を室温で５分間撹拌し、次いでＢｏｃ無水物（１７８ｍｇ、０．８１６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳによってモニターし、２５％のみの変換を示した。この反応混合物を濃縮し、さらに５ｅｑのＢｏｃ無水物及び１．５ｍＬの乾燥ＴＨＦを添加し、反応混合物を７０℃に加熱し、３時間撹拌し、ＬＣＭＳは、生成物への９５％の変換を示した。余剰のＴＨＦを蒸発させ；水（５ｍＬ）を混合物に添加し、酢酸エチル（３Ｘ１０ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。酢酸エチル中のヘキサン（０から５０％）で溶出される事前充填されたシリカゲルカラム（１２ｇ）によって精製して所望の化合物－６．２を白色の粉末（１８０ｍｇ、８０％）として得た。
６－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）キノリン－３－カルボン酸。工程－２：密封チューブにテトラヒドロフラン（１．８０ｍＬ）及び水（１．８０ｍＬ）中の化合物－６．２（１８０ｍｇ、０．５９５ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（１３１ｍｇ、３．２７ｍｍｏｌ）を入れ、７０℃で３時間撹拌した。ＬＣＭＳは、５１％の所望の生成物及び４５％の脱ｂｏｃ生成物を示した。次いでＴＨＦを減圧下で除去し、粗製物を水で希釈し、酢酸エチル（２Ｘ５ｍＬ）で洗浄した。水性層のｐＨを１０％クエン酸溶液で５に調整し、次いで酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗化合物をＭｅＯＨ中のＤＣＭ（０から１０％）で溶出される事前充填されたシリカゲルカラム（１２ｇ）によって精製して所望の化合物－６．３（１３２ｍｇ、３９％）を得た。
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（（４－（１，４－オキサゼパン－４－カルボニル）フェニル）カルバモイル）キノリン－６－イル）カルバメート。工程－３：火炎乾燥した密封チューブに無水ジメチルホルムアミド（１．９５ｍＬ）中の化合物－６．３（６５ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）及び化合物－３．２（５９．６ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）を入れた。次いでＨＡＴＵ（１２９ｍｇ、０．３３８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０４７１ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出し、次いで有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗化合物をＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３で溶出される２４ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製して所望の化合物－６．４を得、次の工程のために使用した。
Ｎ－（４－（１，４－オキサゼパン－４－カルボニル）フェニル）－６－アミノキノリン－３－カルボキサミド塩酸塩。工程－４：４Ｍの水性ＨＣｌ（１ｍＬ）を工程－３から得られた化合物－６．４に添加し、２０分間超音波処理し、続いて凍結乾燥させて所望の生成物のＨＣｌ塩を黄色の固体（４６ｍｇ；４８％（２工程から））として生成した。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３９１．２。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ９．２７ （ｄ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ９．１７ （ｄ， Ｊ＝ １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９２ （ｄ， Ｊ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７１ （ｄｄ， Ｊ＝ ９．１， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５２ （ｄ， Ｊ＝ ７．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３１ （ｄ， Ｊ＝ ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８－３．６３ （ｍ， ８Ｈ）， ２．０５－２．００ （ｍ， １Ｈ）， １．８８－１．８３ （ｍ， １Ｈ）。
スキーム７．化合物６－アミノ－Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）キノリン－３－カルボキサミドＨＣｌ塩のための合成スキーム
メチル６－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）キノリン－３－カルボキシレート。工程－１：テトラヒドロ－フラン（４ｍＬ）中の化合物－７．１（１５０ｍｇ、０．７４２ｍｍｏｌ）の溶液にチオウレア（５．６ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４７．９ｍｇ、０．３７１ｍｍｏｌ）及びｂｏｃ無水物（１７７ｍｇ、０．８１６ｍｍｏｌ）を添加し、生じた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳによってモニターし、２５％の生成物形成を示した。溶媒を反応混合物から除去し、さらに５ｅｑのｂｏｃ無水物及び１．５ｍＬのＴＨＦを添加し、反応混合物を７０℃に加熱し、３時間撹拌し、ＬＣＭＳ分析は、生成物の９５％の形成を示す。次いで溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて粗化合物を生成し、それを生成物を溶出させるための０～５０％ＥＡ：Ｈｅｘ、次いで未反応出発物質を溶出させるための１００％ＥＡでの１２ｇのフラッシュカラムによって精製した。生成物画分を減圧下で蒸留して純粋な化合物を白色の化合物－７．２（１８０ｍｇ、８０％）として生成した。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３０３．２。
６－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）キノリン－３－カルボン酸。工程－２： テトラヒドロフラン（１．８ｍＬ）中の化合物－７．２（１８０ｍｇ、０．５９５ｍｍｏｌ）の溶液に水酸化ナトリウム（１３０ｍｇ、３．２７ｍｍｏｌ）及び水（１．８ｍＬ）を添加し、生じた反応混合物を７０℃で３時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳによってモニターし、５１％の所望の生成物及び４５％の脱ｂｏｃ生成物の形成を示す。この段階で反応を停止させ、余剰のテトラヒドロフランを減圧下で除去し、粗残渣を水に溶解し、水で洗浄した。次いで水性層を１０％クエン酸溶液を使用してｐＨ５に酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層をブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して化合物－７．３（１３２ｍｇ、３９．２％；５１％純度）を生成した。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝２８９．２。
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）カルバモイル）キノリン－６－イル）カルバメート。工程－３：無水ＤＭＦ（１．９５ｍＬ）中の化合物－７．３（６５ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－１．２（５２ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１２９ｍｇ、０．３３８ｍｍｏｌ）を添加し、生じた反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗化合物を生成し、それをクロロホルム及びメタノールで溶出させることによって２４ｇのシリカゲルカラムによって精製して化合物－７．４を得、次の工程のために使用した。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６３．４。
６－アミノ－Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）キノリン－３－カルボキサミドＨＣｌ塩。工程－４：４Ｍの水性ＨＣｌ（１ｍＬ）を工程－３から得られた化合物－７．４に添加し、２０分間超音波処理した。ＬＣＭＳは、反応の完了を示す。余剰の試薬を凍結乾燥によって除去し、得られた固体をエーテルで洗浄し、乾燥させて所望の生成物を黄色の固体（１８ｍｇ、２５％（２工程から））として生成した。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３６３．３（－ＨＣｌ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ＝ ９．２８ （ｓ， １Ｈ）， ９．１８ （ｓ， １Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ＝ ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９１ （ｄ， Ｊ＝ ８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７１ （ｄｄ， Ｊ＝ ２．１， ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４５ （ｄ， Ｊ＝８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ （ｄ， Ｊ＝ ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．３７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， １．２７ （ｂｒ ｓ， ３Ｈ）， １．１８ （ｂｒ ｓ， ３Ｈ）。
スキーム８．化合物Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）－２－メチルキノリン－３－カルボキサミドのための合成スキーム
２－メチルキノリン－３－カルボン酸。工程－１：密封チューブにテトラヒドロフラン（１ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中の化合物－８．１（１００ｍｇ、０．４６５ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（１０２ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を入れ、１００℃で４時間撹拌した。ＴＬＣは、ＳＭの生成物への完全な変換を示した。次いでテトラヒドロフランを減圧下で除去し、粗製物を水で希釈し、酢酸エチル（２Ｘ５ｍＬ）で洗浄した。水性層のｐＨを１０％クエン酸溶液で５に調整し、次いで酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗化合物－８．２をさらなる精製をせずに次の工程のために使用した。
Ｎ－（４－（ジエチルカルバモイル）フェニル）－２－メチルキノリン－３－カルボキサミド。工程－２：無水ジクロロメタン（２．８ｍＬ）中の化合物－８．２（７０．０ｍｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－２（６４．７ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣＩ（７８．９ｍｇ、０．４１１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（５５．６ｍｇ、０．４１１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１３０ｍＬ、０．７４８ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、生じた反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ及びＬＣＭＳは、いかなる生成物形成の兆候も示さなかった。そのため、ＨＡＴＵ（２１３ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。ＬＣＭＳは、６％のみの変換を示した。慣用の後処理後、得られた粗化合物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０から１０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製して非純粋な所望の生成物を得た。この非純粋な生成物を分取ＨＰＬＣによって再度精製して純粋な化合物を白色の固体（６ｍｇ、３．５％（２工程から））として得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３６２．２。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ＝ ８．６４ （ｓ， １Ｈ）， ８．１２ － ８．０３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９０ （ｔ， Ｊ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄ， Ｊ＝ ８．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７５－７．６６ （ｍ， １Ｈ）， ７．４４ （ｄ， Ｊ＝ ８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．３７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．８９ （ｓ， ３Ｈ）， １．２７ （ｂｒ ｓ， ３Ｈ）， １．１８ （ｂｒ ｓ， ３Ｈ）。
スキーム９．化合物Ｎ－（４－（アゼパン－１－カルボニル）フェニル）－６－メトキシ－２－メチルキノリン－３－カルボキサミドのための合成スキーム
６－メトキシ－２－メチルキノリン－３－カルボン酸。工程－１：密封チューブにテトラヒドロフラン（２．００ｍＬ）及び水（２．００ｍＬ）中の化合物－９．１（２００ｍｇ、０．８１５ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（１７９ｍｇ、４．４８ｍｍｏｌ）を入れ、１００℃で５時間撹拌した。ＴＬＣは、ＳＭの生成物への完全な変換を示した。次いでＴＨＦを減圧下で除去し、粗製物を水で希釈し、酢酸エチル（２Ｘ５ｍＬ）で洗浄した。水性層のｐＨを１０％クエン酸溶液で５に調整し、次いで酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗化合物－９．２（１６３ｍｇ、９２％）をさらなる精製をせずに次の工程のために使用した。
Ｎ－（４－（アゼパン－１－カルボニル）フェニル）－６－メトキシ－２－メチルキノリン－３－カルボキサミド。工程－２：無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の化合物－９．２（５０．０ｍｇ、０．２３０ｍｍｏｌ）の溶液に化合物－９．３（４５．２ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣＩ（４８．５ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３４．２ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０８０２ｍＬ、０．４６０ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、生じた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。水層を酢酸エチルで抽出し、組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗化合物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０から１０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製して所望の生成物を淡黄色の固体（５１ｍｇ、５３％）として得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１８．２．１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ８．１４ （ｓ， １Ｈ）， ８．０１－７．９０ （ｍ， １Ｈ）， ７．６８ （ｂｒ ｄ， Ｊ＝８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４８－７．３３ （ｍ， ４Ｈ）， ７．０４ （ｄ， Ｊ＝２．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６８－３．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．８４ （ｓ， ３Ｈ）， １．８７－１．７３ （ｍ， ２Ｈ）， １．６０ （ｂｒ ｓ， ６Ｈ）。
スキーム１０．化合物２－（２－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）－２－オキソエトキシ）－４，６－ジメチルニコチノニトリルのための合成スキーム
２－（２－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）－２－オキソエトキシ）－４，６－ジメチルニコチノニトリル：火炎乾燥したバイアルに無水ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中の化合物－１０．１（２００ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を入れ、炭酸カリウム（２０５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（２４６ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１５分間撹拌し、化合物－１０．２（３２７ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を上記反応混合物に添加し、１５０℃で３０分間及び室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ及びＬＣＭＳは、生成物形成への完全な変換を示した。反応混合物を水（１０ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３Ｘ１０ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗化合物を酢酸エチル中のヘキサン（０から３０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製し、所望の画分を濃縮し、ジエチルエーテルでトリチュレートした。最後に、化合物をＰｒｅｐ ＨＰＬＣによって精製して所望の生成物（７０ｍｇ、１７％）を得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３１０．２．１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ７．８８ （ｄ， Ｊ＝８．７９ Ｈｚ， ２ Ｈ） ６．６４ － ６．７１ （ｍ， ３ Ｈ） ５．５９ － ５．６５ （ｍ， ２ Ｈ） ３．０７ （ｓ， ６ Ｈ） ２．４５ （ｓ， ３ Ｈ） ２．３０ （ｓ， ３ Ｈ）。
スキーム１１．化合物２－（２－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）－２－オキソエトキシ）－６，８－ジメチルキノリン－３－カルボニトリルのための合成スキーム
（Ｅ）－６，８－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルバルデヒドオキシム。工程－１：水（０．１５ｍＬ）中の塩酸ヒドロキシルアミン（５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液に４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（０．２ｍＬ）を１０℃で添加し、１０分間室温で撹拌し、エタノール（１．１６ｍＬ）中の化合物－１１．１（５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に室温で添加し、生じた反応混合物を９０℃に加熱し、３時間撹拌した。反応の完了（ＴＬＣ；５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ；Ｒｆ約０．２によって確認した）の後、反応混合物を室温に冷却し、冷水に注いだ。溶液のｐＨを４Ｎの塩酸水溶液を使用して２に調整した。分離した固体を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて化合物－１１．２（５４ｍｇ、１００％）を生成した。
６，８－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボニトリル。工程－２：無水酢酸（１．８ｇ、１８ｍｍｏｌ）を化合物－１１．２（５４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）に添加し、１４０℃に加熱し、３時間撹拌した。反応の完了（ＴＬＣ；５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭによって確認した）の後、反応混合物を室温に冷却し、水で希釈した。次いで混合物を４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を使用してｐＨ＝１０に塩基性化した。分離した固体を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて化合物－１１．３（５０ｍｇ；定量的収率）を生成した。
２－（２－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）－２－オキソエトキシ）－６，８－ジメチルキノリン－３－カルボニトリル。工程－３：火炎乾燥したバイアルに無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中の化合物－１１．３（５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を入れ、炭酸カリウム（３８ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（４２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１５分間撹拌し、化合物－１１．４（６０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を上記反応混合物に添加し、１５０℃で３０分間及び室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ及びＬＣＭＳは、生成物形成への完全な変換を示した。反応混合物を水（５ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３Ｘ１０ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗化合物を酢酸エチル中のヘキサン（０から３０％）で溶出される１２ｇのシリカフラッシュカラムを使用することによって精製し、所望の画分を濃縮し、ジエチルエーテルでトリチュレートした。最後に、化合物をＰｒｅｐ ＨＰＬＣによって精製して所望の生成物を固体（４０ｍｇ、４４％）として得た。（＋ｅｓｉ）［Ｍ＋Ｈ］＋＝３６０．２。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ２Ｃｌ２） δ ８．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８７－７．８３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３３－７．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７５－６．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ２．９９ （ｓ， ６Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサルコスパンタンパク質レベルの増加
本発明の化合物を、上述したＳＳＰＮ－ＨｉＢｉＴアッセイを用いてビヒクルに対するＳＳＰＮタンパク質レベルの増加（ビヒクルに対する倍数変化）についてアッセイした（＊ｐ＜０．０５）。

Figure 2023541040000032
Figure 2023541040000033
Figure 2023541040000034
参照による組み込み
本明細書で挙げられたすべての刊行物及び特許は、各々の個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書におけるいかなる定義をも含む本出願が優先する。
均等物
対象発明の特定の実施形態が論じられたが、上記明細書は例証的であって制限的ではない。本発明の多くの変型は、本明細書及び下記特許請求の範囲を考慮すれば当業者に明らかとなるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を、それらの同等物の全範囲とともに、及び明細書をそのような変型とともに参照することによって決定されるべきである。

Claims (23)

  1. 式（Ｉ）によって表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
    Figure 2023541040000035
     （式中、
    Ｘは、ＣＲ７またはＮであり
    Ｙは、Ｓ、ＯまたはＳＯ２であり；
    Ｚは、ＮまたはＣＲ６であり；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、アミノまたはアミノアルキルであり；
    Ｒ６は、Ｈまたはアルキルであり；
    Ｑは、Ｃ＝Ｏ、ＳＯまたはＳＯ２であり；
    Ｃｙは、アリールまたはヘテロアリールであり；
    ｍは、１～３である）。
  2. Ｘは、Ｎである、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｙは、Ｏである、請求項１または２に記載の化合物。
  4. Ｚは、Ｎである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  5. Ｃｙは、アリールである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  6. Ｃｙは、アミノアルキル、ハロ、アルコキシまたはＯＨで置換されている、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  7. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈまたはアルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  8. Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７は、Ｈである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  9. Ｒ２及びＲ３は、メチルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  10. ｍは、１である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  11. Ｑは、Ｃ＝Ｏである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  12. 式（ＩＩ）によって表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
    Figure 2023541040000036
     （式中、
    Ｘは、Ｏ、ＮまたはＮＲ９であり；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、アミノまたはアミノアルキルであり；
    Ｒ６は、Ｈ、＝Ｏまたはアルキルであり；
    Ｃｙは、アリールまたはヘテロアリールであり；
    Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈまたはアルキルであり、またはそれらが結合したＮ原子と一緒にヘテロシクリルを形成し；
    Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである）。
  13. Ｃｙは、アリールである、請求項１２に記載の化合物。
  14. 前記化合物は、式（ＩＩａ）：
    Figure 2023541040000037
     によって表される、請求項１２または１３に記載の化合物。
  15. Ｘは、Ｎである、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の化合物。
  16. Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、Ｈである、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の化合物。
  17. Ｒ７及びＲ８は、一緒にヘテロシクリルを形成する、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の化合物。
  18. 前記化合物は、式（ＩＩｂ）：
    Figure 2023541040000038
     （式中、
    Ｙは、ＯまたはＮＲ１０であり、
    Ｒ１０は、Ｈ、アルキルまたはアシルであり；
    ｍは、１または２である）
    によって表される、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の化合物。
  19. から選択される化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩。
  20. から選択される化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩。
  21. 先行請求項のいずれか１項に記載の化合物及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
  22. ジストロフィン関連複合体の機能不全に関連する疾患の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  23. ジストロフィン関連複合体の機能不全に関連する前記疾患は、筋ジストロフィーである、請求項２２に記載の方法。
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