JP2023537943A - ＭＡＲＣ１発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクト及び方法 - Google Patents

ＭＡＲＣ１発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクト及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＭＡＲＣ１遺伝子の発現を低減するためのＲＮＡｉコンストラクトに関する。肝線維症及び脂肪肝疾患、例えば非アルコール性脂肪肝疾患及び非アルコール性脂肪性肝炎を治療又は予防するために、こうしたＲＮＡｉコンストラクトを使用する方法も記載される。本発明は、ＭＡＲＣ１遺伝子を標的化し、且つ肝細胞におけるその発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。ＭＡＲＣ１遺伝子発現を配列特異的に阻害することは、心血管疾患及び脂肪肝疾患などの高い脂質レベル及び肝臓脂肪と関連する病態を治療又は予防するのに有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１３日出願の米国仮特許出願第６３／０６５，１９０号明細書及び２０２１年６月２３日出願の米国仮特許出願第６３／２１４，０１６号明細書の利益を主張し、これらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年８月３日作成のコンピュータ読み取り可能フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２６６４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５であり、サイズが１，０６４キロバイトである。
本発明は、ミトコンドリアアミドキシム還元構成要素１（ｍＡＲＣ１）タンパク質の肝臓での発現を調節するための組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、ＲＮＡ干渉を介してＭＡＲＣ１遺伝子発現を低減するための核酸ベースの治療薬並びに循環脂質レベルを低下させ、且つ脂肪肝疾患及び肝線維症を治療又は予防するためにこうした核酸ベースの治療薬を使用する方法に関する。
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、様々な肝臓病理を含む、世界で最も一般的な慢性肝疾患であり、その有病率は、過去２０年間で倍増し、現在では世界人口の約２０～３０％が罹患していると推定される。一部の個体では、脂肪症と呼ばれる肝臓への異所性脂肪の蓄積により、炎症及び肝細胞損傷が誘発され、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれるより進行した段階の疾患が引き起こされる。ＮＡＳＨは、細胞損傷、炎症及び様々な程度の瘢痕化又は線維化の証拠を伴う脂質蓄積として定義される。２０１５年の時点で７５００万～１億人のアメリカ人がＮＡＦＬＤを有すると推定される一方、ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤ診断の約１０～３０％を占める。
ｍＡＲＣ１タンパク質は、Ｎ－酸化分子の還元を触媒するミトコンドリア外膜中のモリブデン含有タンパク質である（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２８７（５１）：４２７９５－４２８０３，２０１２；Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２０（２）：２６５－２７５，２０１５）。これは、最も優れた生体内変換酵素の１つであるＣＹＰ４５０に対する非常に有効な対応物であり、アミドキシムプロドラッグの活性化及びＮ－水酸化官能基を含有する他の薬物の非活性化に関与する（Ｎｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．１０（９）：ｅ０１３８４８７，２０１５；Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５（上述））。近年、ＭＡＲＣ１遺伝子中の予測される機能喪失バリアントは、コレステロール及び肝臓酵素の血中レベルの低下、肝臓脂肪の低減並びに肝硬変の予防に関連することが報告された。Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ５９４５２３；／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／５９４５２３，２０１９；及びＥｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１６（４）：ｅ１００８６２９，２０２０を参照されたい。特に、ｍＡＲＣ１コード領域中のＡ１６５Ｔミスセンス変異体は、１２，３６１件のあらゆる原因の肝硬変事例及び８つのコホートからの７９０，０９５件の対照の分析において、あらゆる原因の肝硬変の予防、コンピュータ断層撮影上での肝脂肪レベルの低下及び医師の診断による脂肪肝の確率の低下並びにアラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、総コレステロール及びＬＤＬコレステロールレベルの血中レベルの低下に関連していた（Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０（上述））。コレステロール濃度、肝臓酵素濃度の低下及び肝硬変リスクの低減に関連する追加のＭＡＲＣ１対立遺伝子（Ｍ１８７Ｋミスセンス変異及びＲ２００Ｔｅｒトランケーション変異）も同定された（Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０（上述））。これらのデータは、ｍＡＲＣ１酵素の欠如により、慢性の肝疾患及び肝硬変が予防されることを示唆する。したがって、ｍＡＲＣ１機能を標的化する治療薬は、コレステロール濃度（例えば、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロール濃度）及び肝線維症の低減並びに肝疾患、特にＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの治療又は予防に対する新規なアプローチを示す。
Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２８７（５１）：４２７９５－４２８０３，２０１２ Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２０（２）：２６５－２７５，２０１５ Ｎｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．１０（９）：ｅ０１３８４８７，２０１５ Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ５９４５２３；／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／５９４５２３，２０１９ Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１６（４）：ｅ１００８６２９，２０２０
本発明は、ＭＡＲＣ１遺伝子を標的化し、且つ肝細胞におけるその発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。ＭＡＲＣ１遺伝子発現を配列特異的に阻害することは、心血管疾患及び脂肪肝疾患などの高い脂質レベル及び肝臓脂肪と関連する病態を治療又は予防するのに有用である。したがって、一実施形態では、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、アンチセンス鎖は、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヒトｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列（配列番号１）の領域の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を含み、ミスマッチは、１、２又は３つ以下である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するために、アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。これらの及び他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１９～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ又は２つの平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ又は２つのヌクレオチドオーバーハングを含む。このようなヌクレオチドオーバーハングは、１～６つの不対ヌクレオチドを含み得、且つセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２つの不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２つの不対ヌクレオチドのオーバーハングを含み、且つセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リボース環、核酸塩基又はホスホジエステル骨格に対する修飾を有するヌクレオチドを含む、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－修飾ヌクレオチドを含む。このような２’－修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含み得る。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。本発明のＲＮＡｉコンストラクトには、例えばセンス鎖の３’末端、５’末端又は３’末端及び５’末端の両方において、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを組み込み得る。このような実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、逆位であり得、例えば３’－３’ヌクレオチド間結合又は５’－５’ヌクレオチド間結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端に配置され得る。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかのこうした実施形態では、センス鎖は、その３’末端の末端ヌクレオチド間に１つ又は２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列及びセンス配列由来の配列を含むか又はそれからなり得る。特定のこうした実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１～２４のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１０４４、Ｄ－１０６１、Ｄ－１０６２、Ｄ－１０６７、Ｄ－１０８３、Ｄ－１０９０、Ｄ－１０９２、Ｄ－１０９３、Ｄ－１０９５、Ｄ－１１３８、Ｄ－１１３９、Ｄ－１１４３、Ｄ－１１７０、Ｄ－１１７７、Ｄ－１１８０、Ｄ－１１９１、Ｄ－１２４５、Ｄ－２０００、Ｄ－２００２、Ｄ－２００３、Ｄ－２００４、Ｄ－２０１１、Ｄ－２０２６、Ｄ－２０２８、Ｄ－２０３２、Ｄ－２０３３、Ｄ－２０３４、Ｄ－２０３５、Ｄ－２０３６、Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４４、Ｄ－２０４５、Ｄ－２０４６、Ｄ－２０５０、Ｄ－２０７８、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１８２、Ｄ－２１９６、Ｄ－２２３８、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２４３、Ｄ－２２４６、Ｄ－２２５５、Ｄ－２３５６、Ｄ－２２５８、Ｄ－２３０１、Ｄ－２３１６、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３２９、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３４１、Ｄ－２３４４、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３９９又はＤ－２５１０である。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１９６、Ｄ－２２３８、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２５５、Ｄ－２２５８、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３５７又はＤ－２３９９である。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ヒトｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ転写産物の特定の領域（例えば、配列番号１に記載されるヒトｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ転写産物配列）を標的化し得る。例えば、特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２０５～１２５０の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２０９～１２３９の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１３４５～１３７５の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。また他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０３９～２０７８の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。特定の他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０４８～２０７４の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。上記の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス鎖の配列は、ヒトｍＡＲＣ１転写産物（配列番号１）の特定の領域の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的であり得、アンチセンス鎖の配列とヒトｍＡＲＣ１転写産物の特定の領域の配列との間のミスマッチは、１、２又は３つ以下である。アンチセンス鎖の配列と標的ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列の配列との間にミスマッチが生じるいくつかのこうした実施形態では、ミスマッチは、標的ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列と、アンチセンス鎖の５’末端から６位及び／又は８位のヌクレオチドとの間に位置し得る。他の実施形態では、アンチセンス鎖の配列は、ヒトｍＡＲＣ１転写産物（配列番号１）の特定の領域の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と完全に相補的であり得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、肝細胞などの特定の組織又は細胞へのＲＮＡｉコンストラクトの送達又は取り込みを促進するリガンドを更に含み得る。特定の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトの肝細胞への送達を標的化する。これら及び他の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン又はＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。特定の実施形態では、リガンドは、三価又は四価のガラクトース又はＧａｌＮＡｃ部分などの多価ガラクトース又は多価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。リガンドは、任意選択によりリンカーを介してＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端又は３’末端に共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載の式Ｉ～ＩＸのいずれか１つの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＶＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＩＶの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。
本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれかとを含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、ＭＡＲＣ１遺伝子の発現の低減を、それを必要とする患者の細胞（例えば、肝細胞）において行うために特に有用である。本発明の医薬組成物を投与され得る患者としては、心血管疾患、脂肪肝疾患、肝線維症若しくは肝硬変と診断されたか又はそのリスクがある患者及びコレステロール（例えば、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロール）血中レベルが高い患者を挙げることができる。したがって、本発明は、脂肪肝疾患（例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪肝疾患又はアルコール性脂肪性肝炎）、肝線維症又は心血管疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物を投与することを含む方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、コレステロール（例えば、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロール）の血中レベル（血清又は血漿）の低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
本明細書に記載の方法のいずれかにおける又は本明細書に記載の方法による投与のための医薬を調製するための、ｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用が具体的に検討される。例えば、本発明は、脂肪肝疾患（例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪肝疾患又はアルコール性脂肪性肝炎）、肝線維症又は心血管疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトを含む。本発明は、コレステロール（例えば、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロール）の血中レベル（血清又は血漿）の低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトも含む。
本発明は、脂肪肝疾患（例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪肝疾患又はアルコール性脂肪性肝炎）、肝線維症又は心血管疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、ｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用も包含する。特定の実施形態では、本発明は、コレステロール（例えば、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロール）の血中レベル（血清又は血漿）の低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、ｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。
ヒトＭＡＲＣ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物番号ＥＮＳＴ０００００３６６９１０．９；配列番号１）の転写産物のヌクレオチド配列を示す。転写産物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ヒトＭＡＲＣ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物番号ＥＮＳＴ０００００３６６９１０．９；配列番号１）の転写産物のヌクレオチド配列を示す。転写産物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ヒトＭＡＲＣ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物番号ＥＮＳＴ０００００３６６９１０．９；配列番号１）の転写産物のヌクレオチド配列を示す。転写産物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ６週間にわたり２週間に１回、緩衝液、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を投与したｏｂ／ｏｂマウスにおける、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ（図２Ａ）及びｍＡＲＣ２のｍＲＮＡ（図２Ｂ）の肝臓発現を示す棒グラフである。ｍＲＮＡレベルを６週間の時点でｑＰＣＲによって評価し、緩衝液のみの注射を受けた動物のｍＲＮＡレベルと比較して表した。 ６週間にわたり２週間に１回、緩衝液、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を受けたｏｂ／ｏｂマウスにおける、総コレステロール（ＣＨＯＬ；図３Ａ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ；図３Ｂ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ；図３Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ；図３Ｄ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図３Ｅ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図３Ｆ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ；図３Ｇ）及びメタロプロテイナーゼ－１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－１；図３Ｈ）の血清中レベルを示すグラフである。様々な分析物の血清中レベルを、６週間の時点で臨床分析機器を用いて測定した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１対緩衝液対照群。 ６週間にわたり２週間に１回、緩衝液、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を受けたｏｂ／ｏｂマウスにおける、総コレステロール（ＣＨＯＬ；図３Ａ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ；図３Ｂ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ；図３Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ；図３Ｄ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図３Ｅ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図３Ｆ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ；図３Ｇ）及びメタロプロテイナーゼ－１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－１；図３Ｈ）の血清中レベルを示すグラフである。様々な分析物の血清中レベルを、６週間の時点で臨床分析機器を用いて測定した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１対緩衝液対照群。 ６週間にわたり２週間に１回、緩衝液、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を受けたｏｂ／ｏｂマウスにおける、総コレステロール（ＣＨＯＬ；図３Ａ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ；図３Ｂ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ；図３Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ；図３Ｄ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図３Ｅ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図３Ｆ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ；図３Ｇ）及びメタロプロテイナーゼ－１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－１；図３Ｈ）の血清中レベルを示すグラフである。様々な分析物の血清中レベルを、６週間の時点で臨床分析機器を用いて測定した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１対緩衝液対照群。 ６週間にわたり２週間に１回、緩衝液、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を受けたｏｂ／ｏｂマウスにおける、総コレステロール（ＣＨＯＬ；図３Ａ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ；図３Ｂ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ；図３Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ；図３Ｄ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図３Ｅ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図３Ｆ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ；図３Ｇ）及びメタロプロテイナーゼ－１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－１；図３Ｈ）の血清中レベルを示すグラフである。様々な分析物の血清中レベルを、６週間の時点で臨床分析機器を用いて測定した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１対緩衝液対照群。 ６週間にわたり２週間に１回、緩衝液、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を受けたｏｂ／ｏｂマウスにおける、６週間時点におけるトリグリセリド（肝臓ＴＧ；図４Ａ）又は総コレステロール（肝臓ＴＣ；図４Ｂ）の肝臓レベルを示すグラフである。平均値±ＳＥＭを示す。＊＊＊＝ｐ＜０．００１対緩衝液対照群。 標準固形飼料食餌（固形飼料対照）又は０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３）を与えられたｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡ（図５Ａ）及びｍＡＲＣ２ ｍＲＮＡ（図５Ｂ）の肝臓発現を示す棒グラフである。０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスに２４週間にわたり２週間に１回、緩衝液（ＴＤ１９０８８３対照）、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を投与した。ｍＲＮＡレベルを２４週間の時点でｑＰＣＲによって評価し、固形飼料対照動物のｍＲＮＡレベルと比較して表した。 標準固形飼料食餌（固形飼料対照）又は０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３）を与えられたｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図６Ａ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図６Ｂ）、総コレステロール（図６Ｃ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ；図６Ｄ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ；図６Ｅ）及びトリグリセリド（図６Ｆ）の血清中レベルを示すグラフである。０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスに２４週間にわたり２週間に１回、緩衝液（ＴＤ１９０８８３対照）、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を投与した。様々な分析物の血清中レベルを、投与後の指定された時点で臨床分析機器を用いて測定した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１対ＴＤ１９０８８３対照群。 標準固形飼料食餌（固形飼料対照）又は０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３）を与えられたｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図６Ａ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図６Ｂ）、総コレステロール（図６Ｃ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ；図６Ｄ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ；図６Ｅ）及びトリグリセリド（図６Ｆ）の血清中レベルを示すグラフである。０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスに２４週間にわたり２週間に１回、緩衝液（ＴＤ１９０８８３対照）、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を投与した。様々な分析物の血清中レベルを、投与後の指定された時点で臨床分析機器を用いて測定した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１対ＴＤ１９０８８３対照群。 標準固形飼料食餌（固形飼料対照）又は０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３）を与えられたｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図６Ａ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図６Ｂ）、総コレステロール（図６Ｃ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ；図６Ｄ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ；図６Ｅ）及びトリグリセリド（図６Ｆ）の血清中レベルを示すグラフである。０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスに２４週間にわたり２週間に１回、緩衝液（ＴＤ１９０８８３対照）、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を投与した。様々な分析物の血清中レベルを、投与後の指定された時点で臨床分析機器を用いて測定した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１対ＴＤ１９０８８３対照群。 標準固形飼料食餌（固形飼料対照）又は０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３）を与えられたｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、２４週時点における体重（図７Ａ）、肝重量（図７Ｂ）、トリグリセリドの肝臓レベル（図７Ｃ）及び総コレステロールの肝臓レベル（図７Ｄ）を示すグラフである。０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスに２４週間にわたり２週間に１回、緩衝液（ＴＤ１９０８８３対照）、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を投与した。平均値±ＳＥＭを示す。 標準固形飼料食餌（固形飼料対照）又は０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３）を与えられたｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、２４週時点における体重（図７Ａ）、肝重量（図７Ｂ）、トリグリセリドの肝臓レベル（図７Ｃ）及び総コレステロールの肝臓レベル（図７Ｄ）を示すグラフである。０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスに２４週間にわたり２週間に１回、緩衝液（ＴＤ１９０８８３対照）、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）の皮下注射を投与した。平均値±ＳＥＭを示す。 ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子Ｄ－２２４１（図８Ａ及び８Ｂ）、Ｄ－２０８１（図８Ｃ及び８Ｄ）及びＤ－２２５８（図８Ｅ及び８Ｆ）を単回で３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．投与した後のカニクイザルにおけるアンチセンス鎖及びセンス鎖の血清濃度－時間プロファイルである。図８Ａ、８Ｃ及び８Ｅは、投与後０．０８３～２４時間の濃度－時間プロファイルを示し、図８Ｂ、８Ｄ及び８Ｆは、投与後０．０８３～１０５６時間の濃度－時間プロファイルを示す。 ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子Ｄ－２２４１（図８Ａ及び８Ｂ）、Ｄ－２０８１（図８Ｃ及び８Ｄ）及びＤ－２２５８（図８Ｅ及び８Ｆ）を単回で３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．投与した後のカニクイザルにおけるアンチセンス鎖及びセンス鎖の血清濃度－時間プロファイルである。図８Ａ、８Ｃ及び８Ｅは、投与後０．０８３～２４時間の濃度－時間プロファイルを示し、図８Ｂ、８Ｄ及び８Ｆは、投与後０．０８３～１０５６時間の濃度－時間プロファイルを示す。 ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子Ｄ－２２４１（図８Ａ及び８Ｂ）、Ｄ－２０８１（図８Ｃ及び８Ｄ）及びＤ－２２５８（図８Ｅ及び８Ｆ）を単回で３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．投与した後のカニクイザルにおけるアンチセンス鎖及びセンス鎖の血清濃度－時間プロファイルである。図８Ａ、８Ｃ及び８Ｅは、投与後０．０８３～２４時間の濃度－時間プロファイルを示し、図８Ｂ、８Ｄ及び８Ｆは、投与後０．０８３～１０５６時間の濃度－時間プロファイルを示す。
本発明は、細胞又は哺乳動物においてＭＡＲＣ１遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＭＡＲＣ１遺伝子、特にヒトＭＡＲＣ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡを標的化し、且つ細胞又は哺乳動物においてｍＡＲＣ１タンパク質の発現を低減させるＲＮＡｉコンストラクトを含む。こうしたＲＮＡｉコンストラクトは、血清脂質レベル（例えば、総コレステロール及びＬＤＬコレステロールレベル）を低減させ、様々な形態の心血管疾患並びにＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨなどの脂肪肝疾患を治療又は予防し、且つ肝線維症及び肝硬変へと進行するリスクを低減するのに有用である。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡｉコンストラクト」という用語は、細胞に導入されるとＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子（例えば、ＭＡＲＣ１遺伝子）の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む薬剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的な様式で標的ＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するのに十分に互いに十分に相補的な、連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した相補的なポリヌクレオチドの対合を指す。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」と称される。「センス鎖」又は「パッセンジャー鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。
二本鎖ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のもの又は当技術分野で知られるものなど、リボース糖、塩基又はリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）で使用されるような任意のそのような修飾は、本開示の目的のための用語「二本鎖ＲＮＡ」によって包含される。
本明細書で使用する場合、生理的条件などのある種の条件下において、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。他のそのような条件は、当業者に知られる中程度の又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができる。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドと、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたっていかなるミスマッチもなく塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％標的配列と相補的である場合、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列又は標的配列の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列の塩基の数を第１の配列の全体長で割ることによって計算することができる。２つの配列がハイブリダイズするとき、３０塩基対の二重鎖領域にわたって５、４、３又は２つ以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列に対して実質的に相補的であると言うこともできる。一般に、本明細書に定義される任意のヌクレオチドオーバーハングが存在する場合、このようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度の決定において考慮されない。例として、ハイブリダイズして各鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対の二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖及び２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされることになる。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的ＲＮＡ配列（例えば、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列）の領域と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこのような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域に１、２、３、４又は５つのミスマッチを有する配列を含み得る。ある特定の実施形態では、任意のミスマッチが末端領域内（例えば、鎖の５’末端及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２つのヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域中の任意のミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３又は２つのヌクレオチド以内に生じる。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、そうでなければ分離している別々の２つの分子であり得る。２つの別々の鎖から形成されるこうした二本鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトはｓｉＲＮＡを含む。
他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の一部であり得、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一ＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）及びループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、不対ヌクレオチドの隣接配列によりアンチセンス鎖の５’末端に接続されており、これによりループ領域が形成されることになる。ループ領域は、典型的には、アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対を形成して二重鎖又はステム領域を形成し得るように、ＲＮＡ分子それ自体が再度折り畳まれることが可能なほど十分に長い。ループ領域は、約３～約２５、約５～約１５又は約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含むことができる。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するこのようなＲＮＡ分子は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド又は約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドであり得、本明細書に列記される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ｍＡＲＣ１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書で使用する場合、「ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列」は、任意の種（例えば、非ヒト霊長類、ヒト）由来のｍＡＲＣ１タンパク質のバリアント又はアイソフォームを含む、ｍＡＲＣ１タンパク質をコードする対立遺伝子バリアント及びスプライスバリアントを含む任意のメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。ＭＡＲＣ１遺伝子（別名：ＭＴＡＲＣ１又はＭＯＳＣ１）は、ミトコンドリアアミドキシム還元構成要素１酵素（別名：ＭＯＣＯスルファラーゼＣ末端ドメイン含有１酵素）をコードする。ヒトの場合、ＭＡＲＣ１遺伝子は、遺伝子座１ｑ４１の１番染色体に見られる。
ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列は、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現される転写産物配列も含む。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミン及びシトシン）として表されるｍＲＮＡ転写産物の配列を指す。したがって本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的のｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列又はｍＡＲＣ１のｃＤＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列としては、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムデータベース又は全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベース中の任意のｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列、例えばヒト配列：Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物番号ＥＮＳＴ０００００３６６９１０．９（図１、配列番号１）及びＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２２７４６．４；カニクイザル配列：ＮＣＢＩ参照配列ＸＲ＿００１４９０７２２．１、ＸＲ＿００１４９０７２２．１、ＸＲ＿００１４９０７２３．１、ＸＲ＿００１４９０７２６．１、ＸＲ＿２７３２８５．２、ＸＭ＿００５５４０９０１．２、ＸＲ＿２７３２８６．２、ＸＭ＿００５５４０８９８．２及びＸＭ＿００５５４０８９９．２；アカゲザル配列：ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿０１５１１５８０９．２、ＸＭ＿０１５１１５８１５．２、ＸＭ＿００１１０２１９２．４及びＸＭ＿００１１０２２８４．３；チンパンジー配列：ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿００９４４１５１９．３、ＸＭ＿００１１７２９２６．４及びＸＭ＿００９４４１５２１．３；ラット配列：ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿０１７５９８９３８．１；並びにマウス配列：ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿００６４９７１９２．４が挙げられ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列は、図１に示すヒト転写産物である（配列番号１）。
アンチセンス鎖の領域は、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に相補的又は完全に相補的であり得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列（例えば、ヒトｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列（配列番号１））の一領域の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を含み、ミスマッチは、１、２又は３つ以下である。関連する実施形態では、アンチセンス鎖は、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列の領域の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含み、ミスマッチは、１以下である。アンチセンス鎖の配列が、標的のｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列と完全に相補的ではなく、ミスマッチを含む実施形態では、ミスマッチは、標的ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列と、アンチセンス鎖の５’末端から６位及び／又は８位のヌクレオチドとの間に生じ得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖が相補性領域を含むｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列の標的領域は、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１９～約３０個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチド又は約１９～約２１個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。特定の実施形態では、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、アンチセンス鎖の配列は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、通常、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対合又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対形成して、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する２つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチドの領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体が結合することにより、ＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対又は約１９～約２１塩基対も好適である。特定の実施形態では、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。他の実施形態では、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。一実施形態では、二重鎖領域は、約１９塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約２１塩基対長である。
センス鎖及びアンチセンス鎖が２つの別々の分子である（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む）実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方又は両方の鎖は、二重鎖領域よりも長く、二重鎖領域に隣接する１つ以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端における不対ヌクレオチド又は二重鎖領域を越えて延在するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、典型的には、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在するか、又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６つのヌクレオチド、１～５つのヌクレオチド、１～４つのヌクレオチド、１～３つのヌクレオチド、２～６つのヌクレオチド、２～５つのヌクレオチド又は２～４つのヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５又は６つのヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４つのヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、２つのヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、単一のヌクレオチドを含む。
オーバーハング中のヌクレオチドは、本明細書に記載されるリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチド（例えば、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位ヌクレオチド（例えば、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド）又はこれらの組み合わせである。例えば、一実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－ウリジン－ウリジン－３’（５’－ＵＵ－３’）ジヌクレオチドを含む。このような実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖に存在する場合、オーバーハング内のヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的である場合もあり、標的遺伝子配列とミスマッチを形成するか、又は何らかの他の配列を含み得る（例えば、ポリピリミジン又はポリプリン配列、例えばＵＵ、ＴＴ、ＡＡ、ＧＧなど）。
ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の５’末端又は３’末端に存在し得る。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端でヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及び３’末端でヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端でヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端でヌクレオチドオーバーハングを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の末端に単一のヌクレオチドオーバーハングを含み、且つ他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、センス鎖及びアンチセンス鎖が分子の末端で完全に塩基対を形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドがないことを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端でヌクレオチドオーバーハングを含み、且つセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端で平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端でヌクレオチドオーバーハングを含み、且つアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端で平滑末端を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の両末端で平滑末端を含む。こうした実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さを有し、二重鎖領域はセンス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二本鎖である）。
本発明のＲＮＡｉコンストラクト中のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１９～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約１９～約２１ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長又は約２１～約２３ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４又は約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、その全長にわたって二重鎖領域を形成する。こうした一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり（例えば、２つの平滑末端を有し）、且つ（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、及び（ｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域を含む。別のこうした実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり（例えば、２つの平滑末端を有し）、且つ（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、及び（ｉｉ）２３塩基対長の二重鎖領域を含む。更に別のこうした実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり（例えば、２つの平滑末端を有し）、且つ（ｉ）それぞれ１９ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、及び（ｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域を含む。
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、センス鎖又はアンチセンス鎖がもう一方の鎖よりも長く、この２本の鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長のセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長のセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長のアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、表１若しくは表２に列記されるアンチセンス配列のいずれか１つの配列、これらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９の配列又はこれらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド２～１９の配列を含むか又はそれからなり得る。したがって、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６７１～１３３９、２０７２～２８０３、２９０６～３０６１又は３３２１～３６５５から選択される配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６７１～１３３９、２０７２～２８０３、２９０６～３０６１又は３３２１～３６５５のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含むか又はそれからなる。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６７１～１３３９、２０７２～２８０３、２９０６～３０６１又は３３２１～３６５５のいずれか１つのヌクレオチド２～１９の配列を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７１５、配列番号７２５、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４５、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７７０、配列番号７８２、配列番号７８４、配列番号８０１、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１４、配列番号８１８、配列番号８２１、配列番号８３７、配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８４５、配列番号８４７、配列番号８４８、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６５、配列番号８７５、配列番号８８４、配列番号８８６、配列番号８９１、配列番号８９９、配列番号９０１、配列番号９０７、配列番号９１４、配列番号９１６、配列番号９２０、配列番号９２７、配列番号９３７、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０７８、配列番号２９１７、配列番号２９１９、配列番号２９２６、配列番号２９４６、配列番号２９４９、配列番号２９５１、配列番号２９５３及び配列番号２９５６から選択される配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７１５、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４５、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７８４、配列番号８０１、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１４、配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８４５、配列番号８４８、配列番号８５１、配列番号８５６、配列番号８６０、配列番号８６２、配列番号９１４、配列番号９１６、配列番号９２７、配列番号９３７、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０７８、配列番号２９１７、配列番号２９１９、配列番号２９２６、配列番号２９４６、配列番号２９４９、配列番号２９５１、配列番号２９５３及び配列番号２９５６から選択される配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７１５、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３８、配列番号７５４、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８１４、配列番号８４１、配列番号８４８、配列番号８５１、配列番号８６２、配列番号９１６、配列番号１０５７、配列番号１０７８、配列番号２９１９、配列番号２９２６、配列番号２９４６、配列番号２９４９、配列番号２９５３及び配列番号２９５６から選択される配列を含むか又はそれからなる。
これら及び他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、表１若しくは表２に列記されるセンス配列のいずれか１つの配列、これらのセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９の配列又はこれらのセンス配列のいずれかのヌクレオチド２～１９の配列を含むか又はそれからなり得る。したがって、いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号２～６７０、１３４０～２０７１、２８０４～２９０５又は３０６２～３３２０から選択される配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、センス鎖は、配列番号２～６７０、１３４０～２０７１、２８０４～２９０５又は３０６２～３３２０のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含むか又はそれからなる。更に他の実施形態では、センス鎖は、配列番号２～６７０、１３４０～２０７１、２８０４～２９０５又は３０６２～３３２０のいずれか１つのヌクレオチド２～１９の配列を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、センス鎖は、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１３２、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５２、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９６、配列番号２０６、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２２２、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３８、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号４０９、配列番号２８０８及び配列番号２８２０から選択される配列を含むか又はそれからなる。特定の他の実施形態では、センス鎖は、配列番号４６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１５、配列番号１３２、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８２、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号４０９、配列番号２８０８及び配列番号２８２０から選択される配列を含むか又はそれからなる。更に他の実施形態では、センス鎖は、配列番号４６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６９、配列番号８５、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１７２、配列番号１７９、配列番号１８２、配列番号１９３、配列番号２４７、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号４０９、配列番号２８０８及び配列番号２８２０から選択される配列を含むか又はそれからなる。
本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２～６７０、１３４０～２０７１、２８０４～２９０５又は３０６２～３３２０から選択される配列を含むか又はそれからなるセンス鎖、及び（ｉｉ）配列番号６７１～１３３９、２０７２～２８０３、２９０６～３０６１又は３３２１～３６５５から選択される配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号４６、配列番号５６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１３２、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５２、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９６、配列番号２０６、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２２２、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３８、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号４０９、配列番号２８０８及び配列番号２８２０から選択される配列を含むか又はそれからなるセンス鎖、並びに（ｉｉ）配列番号７１５、配列番号７２５、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４５、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７７０、配列番号７８２、配列番号７８４、配列番号８０１、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１４、配列番号８１８、配列番号８２１、配列番号８３７、配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８４５、配列番号８４７、配列番号８４８、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６５、配列番号８７５、配列番号８８４、配列番号８８６、配列番号８９１、配列番号８９９、配列番号９０１、配列番号９０７、配列番号９１４、配列番号９１６、配列番号９２０、配列番号９２７、配列番号９３７、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０７８、配列番号２９１７、配列番号２９１９、配列番号２９２６、配列番号２９４６、配列番号２９４９、配列番号２９５１、配列番号２９５３及び配列番号２９５６から選択される配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号４６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１５、配列番号１３２、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８２、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号４０９、配列番号２８０８及び配列番号２８２０から選択される配列を含むか又はそれからなるセンス鎖、並びに（ｉｉ）配列番号７１５、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４５、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７８４、配列番号８０１、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１４、配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８４５、配列番号８４８、配列番号８５１、配列番号８５６、配列番号８６０、配列番号８６２、配列番号９１４、配列番号９１６、配列番号９２７、配列番号９３７、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０７８、配列番号２９１７、配列番号２９１９、配列番号２９２６、配列番号２９４６、配列番号２９４９、配列番号２９５１、配列番号２９５３及び配列番号２９５６から選択される配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、を含む。更に他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号４６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６９、配列番号８５、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１７２、配列番号１７９、配列番号１８２、配列番号１９３、配列番号２４７、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号４０９、配列番号２８０８及び配列番号２８２０から選択される配列を含むか又はそれからなるセンス鎖、並びに（ｉｉ）配列番号７１５、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３８、配列番号７５４、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８１４、配列番号８４１、配列番号８４８、配列番号８５１、配列番号８６２、配列番号９１６、配列番号１０５７、配列番号１０７８、配列番号２９１９、配列番号２９２６、配列番号２９４６、配列番号２９４９、配列番号２９５３及び配列番号２９５６から選択される配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、を含む。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号４６の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７１５の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉ）配列番号６３の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７３２の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）配列番号６４の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７３３の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｖ）配列番号６９の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７３８の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖ）配列番号８５の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７５４の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉ）配列番号９２の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７６１の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉ）配列番号９４の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７６３の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉｉ）配列番号９５の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７６４の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｘ）配列番号９７の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号７６６の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘ）配列番号１４０の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号８０９の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉ）配列番号１４１の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号８１０の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉ）配列番号１４５の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号８１４の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉｉ）配列番号１７２の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号８４１の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｖ）配列番号１７９の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号８４８の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖ）配列番号１８２の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号８５１の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖｉ）配列番号１９３の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号８６２の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、又は（ｘｖｉｉ）配列番号２４７の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号９１６の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖を含む。
特定の他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号４０９の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号１０７８の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉ）配列番号３８８の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号１０５７の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）配列番号２８０８の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２９２６の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｖ）配列番号２８２０の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２９４６の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖ）配列番号３９１の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２９４９の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉ）配列番号３９０の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２９５６の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉ）配列番号１７９の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２９１９の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉｉ）配列番号３８８の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２９５３の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、又は（ｉｘ）配列番号３８８の配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号１０５７の配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号２００９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７４１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉ）配列番号２０１１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７４３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）配列番号２０１２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７４４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｖ）配列番号２０１３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７４５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖ）配列番号２０２０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７５２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉ）配列番号２０３５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７６７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉ）配列番号２０３７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７６９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉｉ）配列番号２０４１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７７３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｘ）配列番号２０４２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７７４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘ）配列番号２０４３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７７５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉ）配列番号２０４４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７７６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉ）配列番号２０４５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７７７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉｉ）配列番号２０５１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７８３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｖ）配列番号２０５３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７８５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖ）配列番号２０５４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７８６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖｉ）配列番号２０５５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７８７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、又は（ｘｖｉｉ）配列番号２０５９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号２７９１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖を含む。
他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号３０７８による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３３３７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉ）配列番号３０８０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３３３９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）配列番号３１６３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３４４１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｖ）配列番号３１８３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３４６９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖ）配列番号３０７６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３４７２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉ）配列番号３０７７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３４８４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉ）配列番号２０５１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３５４５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉｉ）配列番号３０８０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３４８１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｘ）配列番号３１８８による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３３３９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、（ｘ）配列番号３０８０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３４７６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖、又は（ｘｉ）配列番号３２２３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるセンス鎖及び配列番号３５１７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなるアンチセンス鎖を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、表１～２４に列記される二重鎖化合物（化合物の未修飾ヌクレオチド配列及び／又は修飾ヌクレオチド配列を含む）のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１に列記される二重鎖化合物のいずれかである。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表２に列記される二重鎖化合物（化合物の未修飾ヌクレオチド配列及び／又は修飾ヌクレオチド配列を含む）のいずれかである。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－１０４４、Ｄ－１０６１、Ｄ－１０６２、Ｄ－１０６７、Ｄ－１０８３、Ｄ－１０９０、Ｄ－１０９２、Ｄ－１０９３、Ｄ－１０９５、Ｄ－１１３８、Ｄ－１１３９、Ｄ－１１４３、Ｄ－１１７０、Ｄ－１１７７、Ｄ－１１８０、Ｄ－１１９１、Ｄ－１２４５、Ｄ－２０００、Ｄ－２００２、Ｄ－２００３、Ｄ－２００４、Ｄ－２０１１、Ｄ－２０２６、Ｄ－２０２８、Ｄ－２０３２、Ｄ－２０３３、Ｄ－２０３４、Ｄ－２０３５、Ｄ－２０３６、Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４４、Ｄ－２０４５、Ｄ－２０４６、Ｄ－２０５０、Ｄ－２０７８、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１８２、Ｄ－２１９６、Ｄ－２２３８、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２４３、Ｄ－２２４６、Ｄ－２２５５、Ｄ－２２５８、Ｄ－２３０１、Ｄ－２３１６、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３２９、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３４１、Ｄ－２３４４、Ｄ－２３５６、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３９９又はＤ－２５１０である。特定の他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１９６、Ｄ－２２３８、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２５５、Ｄ－２２５８、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３５７又はＤ－２３９９である。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ヒトｍＡＲＣ１転写産物配列の特定の領域を標的化し得る。実施例４で説明し、表２３で要約したように、ヒトｍＡＲＣ１転写産物の特定の領域に相補的な配列（配列番号１）を有するように設計されたアンチセンス鎖を備える特定のＲＮＡｉコンストラクトは、転写産物の他の領域に相補的なアンチセンス鎖を備えるＲＮＡｉコンストラクトと比較して、インビボでより優れたヒトｍＡＲＣ１のｍＲＮＡのノックダウン活性を示した。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、細胞中でヒトＭＡＲＣ１遺伝子の発現を阻害するのに特に好適なＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここでアンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２０５～１２５０の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２０９～１２３９の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２１１～１２３６の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。いくつかのこうした実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２０５～１２５０、ヌクレオチド１２０９～１２３９又はヌクレオチド１２１１～１２３６の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と、ミスマッチが１、２又は３つ以下の実質的に相補的な配列を有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２０５～１２５０、ヌクレオチド１２０９～１２３９又はヌクレオチド１２１１～１２３６の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と完全に相補的な配列を有する。ヒトｍＡＲＣ１転写産物のヌクレオチド１２０５～１２５０を標的化するＲＮＡｉコンストラクトとしては、Ｄ－２０６３、Ｄ－２０６６、Ｄ－２０７６、Ｄ－２０７７、Ｄ－２０７８、Ｄ－２０８０、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１０８、Ｄ－２１１３、Ｄ－２１４２、Ｄ－２２４０、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２４３、Ｄ－２２４５、Ｄ－２２４６、Ｄ－２２４８、Ｄ－２２５０、Ｄ－２２５１、Ｄ－２２５３、Ｄ－２２５５、Ｄ－２２５６、Ｄ－２２５８、Ｄ－２２５９、Ｄ－２２６１、Ｄ－２２６４、Ｄ－２２６５、Ｄ－２２６８、Ｄ－２２６９、Ｄ－２２７０、Ｄ－２２７１、Ｄ－２３０１、Ｄ－２３０９、Ｄ－２３１１、Ｄ－２３１２、Ｄ－２３１４、Ｄ－２３１６、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３１９、Ｄ－２３２１、Ｄ－２３２２、Ｄ－２３２４、Ｄ－２３２６、Ｄ－２３２７、Ｄ－２３２９、Ｄ－２３３１、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３３４、Ｄ－２３３６、Ｄ－２３３７、Ｄ－２３３９、Ｄ－２３４１、Ｄ－２３４２、Ｄ－２３４４、Ｄ－２３４６、Ｄ－２３４７、Ｄ－２３４９、Ｄ－２３５１、Ｄ－２３５２、Ｄ－２３５４、Ｄ－２３５６、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３７６、Ｄ－２３８０、Ｄ－２３９３、Ｄ－２３９５、Ｄ－２３９６、Ｄ－２４３１、Ｄ－２４３６、Ｄ－２４３７、Ｄ－２４４０、Ｄ－２４４１、Ｄ－２４４４、Ｄ－２４４５、Ｄ－２４４７、Ｄ－２４５３、Ｄ－２５１８、Ｄ－２５１９、Ｄ－２５２０、Ｄ－２５２１、Ｄ－２５２２、Ｄ－２５２３、Ｄ－２５２４、Ｄ－２５２５、Ｄ－２５２６、Ｄ－２５２７、Ｄ－２５２８、Ｄ－２５２９、Ｄ－２５３０、Ｄ－２５３１、Ｄ－２５３２、Ｄ－２５３３、Ｄ－２５３４及びＤ－２５３５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヒトｍＡＲＣ１転写産物のヌクレオチド１２０５～１２５０を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２０６３、Ｄ－２０６６、Ｄ－２０７６、Ｄ－２０７７、Ｄ－２０７８、Ｄ－２０８０、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１０８、Ｄ－２１１３、Ｄ－２１４２又はＤ－２３０１である。特定の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド１２０５～１２５０、特にヌクレオチド１２１１～１２３６を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、５－ＣＡＵＣＵＡＡＵＡＵＵＣＣＡＧ－３’の配列（配列番号３６５６）を含むアンチセンス鎖を含む。
他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここでアンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１３４５～１３７５の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１３４５～１３７５の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と、ミスマッチが１、２又は３つ以下の実質的に相補的な配列を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１３４５～１３７５の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と完全に相補的な配列を含む。ヒトｍＡＲＣ１転写産物のヌクレオチド１３４５～１３７５を標的化する例示的なＲＮＡｉコンストラクトとしては、Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４３、Ｄ－２０４７、Ｄ－２０５２、Ｄ－２１５８、Ｄ－２１６２、Ｄ－２１６９、Ｄ－２１８２、Ｄ－２１８３、Ｄ－２１８４、Ｄ－２１８５、Ｄ－２１８６、Ｄ－２１８７、Ｄ－２１８９、Ｄ－２２１１、Ｄ－２２１３、Ｄ－２３０４、Ｄ－２３０５、Ｄ－２３０６、Ｄ－２３０７、Ｄ－２３０８、Ｄ－２３８４、Ｄ－２３８５、Ｄ－２３８６、Ｄ－２３８７、Ｄ－２３８８、Ｄ－２３８９、Ｄ－２３９０、Ｄ－２３９１、Ｄ－２３９２、Ｄ－２３９９、Ｄ－２４００、Ｄ－２４０１、Ｄ－２４０２、Ｄ－２４０３、Ｄ－２４８８、Ｄ－２４９４、Ｄ－２５００、Ｄ－２５０６、Ｄ－２５１２、Ｄ－２５３８、Ｄ－２５３９、Ｄ－２５４０及びＤ－２５４１が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヒトｍＡＲＣ１転写産物のヌクレオチド１３４５～１３７５を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４３、Ｄ－２０４７、Ｄ－２０５２、Ｄ－２３０４、Ｄ－２３０５、Ｄ－２３０６、Ｄ－２３０７又はＤ－２３０８である。特定の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド１３４５～１３７５、特にヌクレオチド１３５０～１３７５を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、５－ＵＧＧＧＡＣＡＵＵＧＡＡＧＣＡ－３’の配列（配列番号３６５７）を含むアンチセンス鎖を含む。
更に他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここでアンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０３９～２０７８の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０４８～２０７４の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む。いくつかのこうした実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０３９～２０７８又はヌクレオチド２０４８～２０７４の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と、ミスマッチが１、２又は３つ以下の実質的に相補的な配列を有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０３９～２０７８又はヌクレオチド２０４８～２０７４の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と完全に相補的な配列を有する。ヒトｍＡＲＣ１転写産物のヌクレオチド２０３９～２０７８を標的化するＲＮＡｉコンストラクトとしてはＤ－２０４５、Ｄ－２０６５、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８２、Ｄ－２１０５、Ｄ－２１０６、Ｄ－２１３７、Ｄ－２１４３、Ｄ－２１６６、Ｄ－２１７３、Ｄ－２１９３、Ｄ－２２４２、Ｄ－２２４７、Ｄ－２２５２、Ｄ－２２５７、Ｄ－２２６０、Ｄ－２２６２、Ｄ－２２６６、Ｄ－２２７２、Ｄ－２２７３、Ｄ－２３０２、Ｄ－２３０３、Ｄ－２３１０、Ｄ－２３１３、Ｄ－２３１５、Ｄ－２３１８、Ｄ－２３２０、Ｄ－２３２３、Ｄ－２３２５、Ｄ－２３２８、Ｄ－２３３０、Ｄ－２３３３、Ｄ－２３３５、Ｄ－２３３８、Ｄ－２３４０、Ｄ－２３４３、Ｄ－２３４５、Ｄ－２３４８、Ｄ－２３５０、Ｄ－２３５３、Ｄ－２３５５、Ｄ－２３５８、Ｄ－２３９４、Ｄ－２３９７、Ｄ－２４５４、Ｄ－２４５５、Ｄ－２４５６、Ｄ－２４５７、Ｄ－２４５８、Ｄ－２４５９、Ｄ－２４６０、Ｄ－２４６３、Ｄ－２４６５、Ｄ－２４６８、Ｄ－２４７０、Ｄ－２４７２、Ｄ－２４７３、Ｄ－２４７７、Ｄ－２４８７、Ｄ－２４９３、Ｄ－２４９９、Ｄ－２５０５、Ｄ－２５１１、Ｄ－２５５２、Ｄ－２５５３、Ｄ－２５５４、Ｄ－２５５５、Ｄ－２５５６及びＤ－２５５７が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ヒトｍＡＲＣ１転写産物のヌクレオチド２０３９～２０７８を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、Ｄ－２０４５、Ｄ－２０６５、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８２、Ｄ－２１０５、Ｄ－２１０６、Ｄ－２１３７、Ｄ－２１４３、Ｄ－２３０２又はＤ－２３０３である。特定の他の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド２０３９～２０７８、特にヌクレオチド２０４８～２０７４を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、５－ＡＵＣＡＧＡＵＣＵＵＡＧＡＧＵ－３’の配列（配列番号３６５８）を含むアンチセンス鎖を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はリン酸基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用するとき、修飾ヌクレオチドは、アデノシンモノホスフェート、グアノシンモノホスフェート、ウリジンモノホスフェート及びシチジンモノホスフェートを含有するリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖への修飾ヌクレオチドの組み込みは、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることにより、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。修飾ヌクレオチドの組み込みにより、標的遺伝子の発現を低減させるためのＲＮＡｉコンストラクトの効力を増強させることもできる。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖修飾として、ペントース環の２’位及び／又は５’位での修飾並びに二環式糖修飾が挙げられ得る。２’－修飾ヌクレオチドは、ＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。こうした２’修飾としては、２’－Ｈ（例えば、デオキシリボヌクレオチド）、２’－Ｏ－アルキル（例えば、－Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０又は－Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ又は２’－フルオロとも称される）、２’－Ｏ－メチル（－ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（－Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えば、ＮＨ２）、２’－Ｏ－エチルアミン及び２’－アジドが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース環の５’位における修飾としては、５’－メチル（Ｒ又はＳ配置）、５’－ビニル及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
「二環式糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２つの原子を接続して、二環式糖構造をもたらす第２の環を形成する。いくつかの実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’炭素と２’炭素との間の架橋を含む。二環式糖修飾を備える糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書中で二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾としては、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）二環式核酸（ＢＮＡ）、β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロック核酸又はＬＮＡとも称される）、エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’（式中、ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル又は保護基である））ＢＮＡ、オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル又は保護基である））ＢＮＡ、メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル又はｃＥｔとも称される）、メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’（式中、ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル又は保護基である））ＢＮＡ、メチル炭素環４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ、プロピレン炭素環（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載され、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。特定の他の実施形態では、センス鎖内の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせであり得る。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの鎖の一方又は両方に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書では「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成又は天然の修飾であり得、これとしては、ユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡの天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は、当業者に知られており、イノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド並びに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール及び６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基としては、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７－３１０，２０００及びＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５－７３００，２０１１に記載されているものが挙げられ、これらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン及びウラシルは、上述の修飾核酸塩基などの他の核酸塩基により、こうした置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変えることなく置換され得ることを当業者は十分に認識している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、１つ以上の脱塩基ヌクレオチドを含み得る。「脱塩基ヌクレオチド」又は「脱塩基ヌクレオシド」は、リボース糖の１’位に核酸塩基がないヌクレオチド又はヌクレオシドである。特定の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の末端に組み込まれる。一実施形態では、センス鎖は、その３’末端、その５’末端又はその３’末端及び５’末端の両方で、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、その３’末端、その５’末端又はその３’末端及び５’末端の両方で、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。脱塩基ヌクレオチドが末端ヌクレオチドであるそのような実施形態では、末端ヌクレオチドは、逆位ヌクレオチドであり得、すなわち天然の３’－５’ヌクレオチド間結合ではなく、３’－３’ヌクレオチド間結合（鎖の３’末端上にある場合）を介して又は５’－５’ヌクレオチド間結合（鎖の５’末端上にある場合）を介して、隣接するヌクレオチドに連結され得る。脱塩基ヌクレオチドは、上記で説明されている糖修飾のいずれか等の糖修飾も含み得る。ある特定の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、２’－修飾を含み、例えば、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾又は２’－Ｈ（デオキシ）修飾を含む。一実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。別の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、２’－Ｈ修飾を含む（すなわちデオキシ脱塩基ヌクレオチド）。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０２０／１２３４１０号パンフレットに記載されるパターンなどの特定のパターンでセンス及びアンチセンス鎖に組み込まれた、修飾ヌクレオチドを含み得る。こうした化学修飾パターンを有するＲＮＡｉコンストラクトは、インビボで改善した遺伝子サイレンシング活性を有することが示されている。一実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１５塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的な配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、
・アンチセンス鎖中の２、７及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
・アンチセンス鎖中の８～１１及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
・センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有しない。
他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１９塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的な配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、
・アンチセンス鎖中の２、７及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、４、６、１０及び１２位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、任意選択により、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の他の全てのヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチドであり、
・アンチセンス鎖中の８～１１及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の３及び５位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、任意選択により、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖中の他の全てのヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチドである。
こうした実施形態では、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択され得る。これら及び他の実施形態では、センス鎖の３’末端、５’末端又は３’末端及び５’末端の両方における末端ヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであり得る。こうした実施形態では、脱塩基ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドは逆位（すなわち天然の３’－５’ヌクレオチド間結合ではなく、３’－３’ヌクレオチド間結合（鎖の３’末端上にある場合）を介して又は５’－５’ヌクレオチド間結合（鎖の５’末端上にある場合）を介して、隣接するヌクレオチドに結合される）であり得る。
上記の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス鎖中の２、７、１２及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、７、１２及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、６、７、１２及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、６、７、１０、１２及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の２、７、１０、１２及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ある種の他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、７、１０、１２及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。
上記の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス鎖中の３、８～１１及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖中の５、８～１１及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の３、５、８～１１及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ａ）によって表される構造を含む。
式（Ａ）では、５’から３’への方向で列記される上鎖はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖はアンチセンス鎖であり、各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表す。ｘが１、２、３又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドの１つ以上が、独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件として、ｘは、０～４の整数であり得る。ＮＡヌクレオチドの１つ以上は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり得る。ｙが１、２、３又は４であるとき、１つ以上のｎヌクレオチドが、アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対しない修飾又は未修飾のオーバーハングヌクレオチドであることを条件として、ｙは、０～４の整数であり得る。ｚが１、２、３又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドの１つ以上が、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件として、ｚは、０～４の整数であり得る。ＮＢヌクレオチドの１つ以上は、センス鎖中に存在するときＮＡヌクレオチドに相補的であり得るか、又はセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対しないオーバーハングヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含むいくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングが存在する（すなわち、ｙは、１、２、３又は４である）。１つのこうした実施形態において、ｙは２である。センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングが存在する（すなわちｙが２である）実施形態では、ｘは、０であり、及びｚは、２であるか、又はｘは、１であり、及びｚは、２である。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含む他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む（すなわちｙが０である）。センス鎖の３’末端にヌクレオチドのオーバーハングが存在しない（すなわちｙが０である）こうした実施形態では、（ｉ）ｘは２であり、且つｚは４であるか、（ｉｉ）ｘは、３であり、及びｚは、４であるか、（ｉｉｉ）ｘは、０であり、及びｚは、２であるか、（ｉｖ）ｘは、１であり、及びｚは、２であるか、又は（ｖ）ｘは、２であり、及びｚは、２である。ｘが０超である実施形態のいずれにおいても、センス鎖の５’末端の末端ヌクレオチドであるＮＡヌクレオチドは、逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドなどの逆位ヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含む特定の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６、１０及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含む代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて１０及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。関連する実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、１０及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含む他の代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６及び１０位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて１２位のＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含むいくつかの実施形態では、センス鎖中の各ＮＭは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、センス鎖中の各ＮＭは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含む更に他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方における各ＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。
ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ａ）によって表される構造を含む上記の実施形態のいずれにおいても、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。これらの実施形態及び上記の実施形態のいずれにおいても、式（Ａ）中のＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。
本発明の他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｂ）によって表される構造を含む。
式（Ｂ）では、５’から３’への方向で列記される上鎖はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖はアンチセンス鎖であり、各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表す。ｘが１、２、３又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドの１つ以上が、独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件として、ｘは、０～４の整数であり得る。ＮＡヌクレオチドの１つ以上は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり得る。ｙが１、２、３又は４であるとき、１つ以上のｎヌクレオチドが、アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対しない修飾又は未修飾のオーバーハングヌクレオチドであることを条件として、ｙは、０～４の整数であり得る。ｚが１、２、３又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドの１つ以上が、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件として、ｚは、０～４の整数であり得る。ＮＢヌクレオチドの１つ以上は、センス鎖中に存在するときＮＡヌクレオチドに相補的であり得るか、又はセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対しないオーバーハングヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ｂ）によって表される構造を含むいくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングが存在する（すなわちｙが１、２、３又は４である）。１つのこうした実施形態において、ｙは２である。センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングが存在する（すなわちｙが２である）実施形態では、ｘは、０であり、及びｚは、２であるか、又はｘは、１であり、及びｚは、２である。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ｂ）によって表される構造を含む他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む（すなわちｙが０である）。センス鎖の３’末端にヌクレオチドのオーバーハングが存在しない（すなわちｙが０である）こうした実施形態では、（ｉ）ｘは、２であり、及びｚは、４であるか、（ｉｉ）ｘは、３であり、及びｚは、４であるか、（ｉｉｉ）ｘは、０であり、及びｚは、２であるか、（ｉｖ）ｘは、１であり、及びｚは、２であるか、又は（ｖ）ｘは、２であり、及びｚは、２である。ｘが０超である実施形態のいずれにおいても、センス鎖の５’末端の末端ヌクレオチドであるＮＡヌクレオチドは、逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドなどの逆位ヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ｂ）によって表される構造を含む特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、８、９及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から数えて４及び６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７～９位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、８、９及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ｂ）によって表される構造を含む代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６、８、９及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて７及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ｂ）によって表される構造を含む特定の他の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて７、８、９及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ｂ）によって表される構造を含むこれら及び他の実施形態では、センス鎖中のＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。代替的な実施形態では、センス鎖中のＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。
ＲＮＡｉコンストラクトが、式（Ｂ）によって表される構造を含む上記の実施形態のいずれにおいても、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。これらの実施形態及び上記の実施形態のいずれにおいても、式（Ｂ）中のＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書中で使用する場合、「修飾されたヌクレオチド間結合」という用語は、天然の３’から５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、２’～５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、したがって、修飾されたヌクレオシド間結合と呼ばれ得る。このようなリン非含有結合としては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホン酸及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、同第５，７１４，３３１号明細書及び同第５，７１９，２６２号明細書に記載されているものなど、ペプチド核酸又はＰＮＡを生成させるためのペプチドに基づく結合（例えば、アミノエチルグリシン）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクト中に採用され得る他の好適な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、全て全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されている。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に他の実施形態では、両方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端、５’末端又は３’末端及び５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、約１つ～約６つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６つ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端に約１つ～約６つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６つ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の一実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも１つであるが６つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、少なくとも１つであるが４つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも１つであるが４つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、少なくとも１つであるが２つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわちアンチセンス鎖の３’末端の第１及び第２のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわちアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートヌクレオチド間結合並びにセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一方又は両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかでは、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートである。
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング内の不対ヌクレオチドの２つ以上がホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結され得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハング内の全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハング内の全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。更に他の実施形態では、あらゆるヌクレオチドオーバーハング内の全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み込みは、オリゴヌクレオチドのリン原子において更なるキラル中心を導入し、したがって各ホスホロチオエートヌクレオチド間結合でジアステレオマー対（Ｒｐ及びＳｐ）を生じさせる。ジアステレオマー又はジアステレオ異性体は、結合される原子の同じ分子式及び配列を有するが、空間でのそれらの原子の３次元配向が異なる化合物の異なる立体配置である。エナンチオマーとは異なり、ジアステレオマーは、互いに鏡像ではない。各キラルリン酸の原子は、「Ｒ」配置（Ｒｐ）又は「Ｓ」配置（Ｓｐ）であり得る。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、キラルリン酸が、主にＲｐ又はＳｐ配置のいずれかであるように選択された、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトが１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するいくつかの実施形態では、キラルリン酸の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％がＳｐ配置である。ＲＮＡｉコンストラクトが１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する他の実施形態では、キラルリン酸の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％がＲｐ配置である。ＲＮＡｉコンストラクト中の全てのキラルリン酸は、Ｓｐ配置又はＲｐ配置のいずれかであり得る（すなわち、ＲＮＡｉコンストラクトは、立体純粋である）。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクト中の全てのキラルリン酸はＳｐ配置である。別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクト中の全てのキラルリン酸はＲｐ配置である。
特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクト中のキラルリン酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖中の異なる位置で異なる配置を有し得る。ＲＮＡｉコンストラクトがアンチセンス鎖の５’末端に１つ又は２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む１つのこうした実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端におけるキラルリン酸はＲｐ配置であり得る。ＲＮＡｉコンストラクトがアンチセンス鎖の３’末端に１つ又は２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む別のこうした実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端におけるキラルリン酸はＳｐ配置であり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合と、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合とを含み、アンチセンス鎖の５’末端におけるキラルリン酸はＲｐ配置であり、アンチセンス鎖の３’末端におけるキラルリン酸はＳｐ配置であり、センス鎖の３’末端におけるキラルリン酸はＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかであり得る。特定の他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合と、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合とを含み、アンチセンス鎖の５’末端におけるキラルリン酸はＲｐ配置であり、アンチセンス鎖の３’末端におけるキラルリン酸はＳｐ配置であり、センス鎖の３’末端におけるキラルリン酸はＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかであり得る。オリゴヌクレオチド合成中にホスホロチオエート結合の立体化学を制御する方法は、当業者に既知であり、これとしては、Ｎａｗｒｏｔ ａｎｄ Ｒｅｂｏｗｓｋａ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．２００９，Ｃｈａｐｔｅｒ ４：．ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７００．ｎｃ０４３４ｓ３６２００９；Ｊａｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ，Ｖｏｌ．６：６３１７，２０１５；Ｋｎｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３６１：１２３４－１２３８，２０１８；及びＳａｋａｍｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２１（９）：１３０４－１３０８，２０２０に記載される方法が挙げられ得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の５’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書で使用する場合、「ホスフェート部分」という用語は、未修飾ホスフェート（－Ｏ－Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）及び修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。修飾ホスフェートは、Ｏ及びＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）又はアルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ１２）で置換されており、ＲがＨ、アミノ保護基又は非置換若しくは置換アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ１２）であるホスフェートを含む。例示的なホスフェート部分としては、５’－モノホスフェート；５’－ジホスフェート；５’－トリホスフェート；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化若しくは非メチル化）；５’－アデノシンキャップ又は任意の他の修飾若しくは未修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート）；５’－α－チオトリホスフェート；５’－γ－チオトリホスフェート；５’－ホスホロアミダート；５’－ビニルホスフェート；５’－アルキルホスホネート（例えば、アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）；及び５’－アルキルエーテルホスホネート（例えば、アルキルエーテル＝メトキシメチル、エトキシメチルなど）を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載される２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾及び核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロ又は２’－Ｏ－メチル）を含み得、且つ修飾塩基（例えば、５－メチルシトシン又はプソイドウラシル）を含み得る。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたときに、修飾ヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合を生成することになる、５’ホスフェートに対する修飾と組み合わされた糖修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾又は二環式糖修飾及び５’ホスホロチオエート基などの糖修飾を含み得る。したがっていくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方の鎖は、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の鎖は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド間結合を含む例示的なＲＮＡｉコンストラクトを表２に示す。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当技術分野において公知の技術を用いて、例えば従来の核酸固相合成法を用いて容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を使用して、好適な核酸合成装置で構築することができる。自動核酸合成装置が、いくつかのベンダーによって市販されており、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトを合成するための例示的な方法を実施例２で説明する。
２’シリル保護基を、リボヌクレオシドの５’位で酸に不安定なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）と共に使用して、ホスホラミダイト化学によりオリゴヌクレオチドを合成し得る。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、大規模、中規模又は小規模で任意の自動又は手動合成装置において行うことができる。合成は、複数のウェルプレート、カラム又はスライドガラスにおいて実行することもできる。
２’－Ｏ－シリル基は、フッ素イオンへの曝露を介して除去され得、フッ素イオンは、フッ素イオンの何らかの供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ素イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム又は有機対イオンと対になるフッ素イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウム、を含み得る。クラウンエーテル触媒は、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用され得る。例示的なフッ化物イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミンヒドロフルオライド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミド中でトリエチルアミンと水性ＨＦとを組み合わせる）である。
亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに対して使用するための保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化し、プロセス収率を向上させることができる。
リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有することから、ＲＮＡ中の反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基（例えば、酸処理に対して安定な保護基）で保護することが望ましい可能性がある。シリル保護基は、この条件を満たしており、最終的なフッ化物脱保護工程において容易に除去され得、これにより、ＲＮＡ分解を最小減に抑えることが可能となる。
テトラゾール触媒は、標準的なホスホラミダイトカップリング反応において使用することができる。例示的な触媒は、例えば、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ－ニトロフェニルテトラゾールを含む。
当業者によって理解され得るように、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを合成する更なる方法が当業者に明らかであろう。加えて、様々な合成工程を代替の順番又は順序で実施して、所望の化合物を得ることができる。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの合成において有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）及び保護基の手法（保護及び脱保護）は、当技術分野で知られており、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）並びにそれらの後続版に記載のものなどを含む。ＲＮＡｉコンストラクトのカスタム合成も、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むいくつかの商業的ベンダーから入手可能である。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子を指す。別の化合物又は分子とリガンドとの相互作用は、生物学的応答を誘発し得るか（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する）、又はまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二本鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えばＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞内取り込み、電荷及び／又はクリアランス特性を修飾することができる。
リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質又は抗体若しくはその結合断片（例えば、肝臓などの特定の細胞型に対するＲＮＡｉコンストラクトを標的化する抗体若しくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばアダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ポリアミノ酸及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）を含む。
特定の実施形態では、リガンドは、エンドソーム不安定化特性を有する。エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム不安定化リガンドは、ｐＨ依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型コンフォメーションを取る。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム不安定化リガンドが、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム不安定化リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６：２９６４－２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１－１５８６，１９９６）及びこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６－６８，２００２）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム不安定化構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷又はプロトン化に変化を起こすことになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム不安定化構成要素は、直鎖状又は分枝状であり得る。
いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、それらの非コンジュゲート型の対応物よりも活性であると報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子へのコンジュゲーションのためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；米国特許第７，７４５，６０８号明細書；及び米国特許第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの特許は全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態において、リガンドは、フォラート部分を含む。葉酸部分にコンジュゲートしているポリヌクレオチドは、受容体依存性エンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。このような葉酸－ポリヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを肝細胞に特異的に送達して、肝臓中のｍＡＲＣ１タンパク質の発現を特異的に減少させることが望ましい。したがって特定の実施形態では、リガンドは、以下でより詳細に記載するように、様々な手段を用いてＲＮＡｉコンストラクトの肝細胞（例えば、肝細胞）への特異的な送達を標的化する。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表面に発現したアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）又はその構成成分（例えば、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２）に結合するリガンドにより、肝細胞に標的化される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝細胞の表面に発現されるタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを採用することにより、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、特定の実施形態では、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体及びＬＤＬ受容体などの肝細胞で発現される受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））含み得る。特定の一実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はその結合断片を含む。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む。「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（すなわち軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）から構成される。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体の単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ断片）を含む。「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在し、任意選択により、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨ領域とＶＬ領域との間のペプチドリンカーを含む。本発明のＲＮＡｉコンストラクトを肝臓に標的化するためのリガンドとして使用することができる、ＡＳＧＲ１に特異的に結合する例示的な抗体及びその結合断片は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０５８９４４号パンフレットに記載される。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるリガンドとしての使用に好適である、ＡＳＧＲ１、ＬＤＬ受容体又は他の肝臓の表面に発現されるタンパク質に特異的に結合する他の抗体又はその結合断片は、市販されている。
特定の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、各炭素原子に結合される酸素、窒素又は硫黄原子を伴う少なくとも６つの炭素原子（直鎖状、分岐鎖状又は環状であり得る）を有する１つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物は、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖及び約４、５、６、７、８又は９つの単糖単位を含有するオリゴ糖）並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖類ガムなどの多糖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース又はヘプトースから選択される単糖並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれている炭水化物は、アミノ糖であり、例えば、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン及びＮ－アセチルグルコサミンである。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン又はマンノサミンから選択され得る。特定の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン又はＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース及びＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、このようなリガンドが肝細胞の表面に発現されるＡＳＧＲに結合するため、化合物を肝細胞に標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５を参照されたい。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるＧａｌＮＡｃ又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；及び同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合又は相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子又は同じ分子の２つ以上の異なる部位に結合することができる炭水化物で構成される２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を示す。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」及び「四価」は、それぞれ１、２、３及び４つの結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価又は四価であり得る。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むための例示的な三価又は四価ＧａｌＮＡｃ含有リガンドを以下に詳述する。
リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分又はヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内及び環外の原子を含む任意の位置で起こり得る。特定の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合も任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位及び６位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、任意の炭素原子で起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子としては、２’、３’及び５’炭素原子が挙げられる。例えば、脱塩基ヌクレオチドでは、１’位もリガンドに結合することができる。ヌクレオチド間結合もリガンドの結合を支援することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）の場合、リガンドは、リン原子に直接結合することができるか、又はリン原子に結合しているＯ原子、Ｎ原子若しくはＳ原子に結合することができる。アミン含有ヌクレオシド間結合又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）では、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合することができる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’末端又は５’末端に結合され得る。特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合されている。そのような実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドに付着している。これらの実施形態及び他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’－末端ヌクレオチドの５’位で付着している。逆位脱塩基ヌクレオチドがセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、５’－５’ヌクレオチド間結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合される実施形態では、リガンドは、逆位脱塩基ヌクレオチドの３’位に結合され得る。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合的に付着している。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’－末端ヌクレオチドに付着している。ある特定のそのような実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で付着している。逆位脱塩基ヌクレオチドがセンス鎖の３’末端ヌクレオチドであり、３’－３’ヌクレオチド間結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合される実施形態では、リガンドは、逆位脱塩基ヌクレオチドの５’位に結合され得る。代替実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍であるが１つ又は複数の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３又は４つの末端ヌクレオチドの前）で付着している。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で付着している。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの糖の２’位で付着している。
特定の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子又は原子の基である。リンカーは、約１～約３０の原子長、約２～約２８の原子長、約３～約２６の原子長、約４～約２４の原子長、約６～約２０の原子長、約７～約２０の原子長、約８～約２０の原子長、約８～約１８の原子長、約１０～約１８の原子長及び約１２～約１８の原子長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、一般に、２つの官能基を有するアルキル部分を含む二官能性結合部分を含み得る。官能基の一方は、目的の化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖）に結合するように選択され、他方は、本明細書に記載されるようなリガンドなどの任意の選択された基に実質的に結合するように選択される。特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール単位又はアミノ酸単位などの繰返し単位からなる鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分に通常用いられる官能基の例としては、求核性基と反応させるための求電子剤及び求電子性基と反応させるための求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分としては、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール及び不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）などが挙げられる。
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用され得るリンカーは、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルケニル又は置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルキニルを含むが、これらに限定されない。こうしたリンカーに好適な置換基としては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能リンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞内への進入後に切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下において、対象の血液中又は第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清に見出される条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下よりも少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍以上又は少なくとも１００倍速く切断される。
切断可能なリンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で優勢であるか、又は高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例としては、例えば、細胞内に存在し、還元によって酸化還元切断可能リンカーを分解することができるメルカプタンなどの酸化酵素若しくは還元酵素又は還元剤を含む、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性のない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を生成することができる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することによって酸切断可能リンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びホスファターゼが挙げられる。
切断可能リンカーは、ｐＨに感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０の更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それによってリガンドから細胞内部又は細胞の所望の区画にＲＮＡ分子を放出する切断可能な基を有する。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能となる切断可能な基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでおり、したがって、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型よりも肝細胞において効率的に切断されることとなる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質及び精巣の細胞が挙げられる。肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合、ペプチド結合を含有するリンカーを用いることができる。
一般に、切断可能リンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤の能力（又は条件）を試験することによって評価することができる。また、血液中又は他の非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力について、切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。したがって標的細胞内で切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は体液、例えば血液又は血清内で切断を示すように選択される第２の条件との間で切断に対する相対的感受性を判断することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養物、臓器若しくは組織培養物中において又は動物全体で実行することができる。無細胞又は培養条件で初期評価を行い、更に動物全体で評価することによって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、細胞において（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く切断される。
他の実施形態では、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能リンカーは、還元又は酸化されると切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるかどうか、又は例えば特定のＲＮＡｉコンストラクト及び特定のリガンドと共に使用するのに好適であるかどうかを判定するために、本明細書に記載の１つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は例えば標的細胞などの細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野で知られる他の還元剤と共にインキュベーションすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液条件又は血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中で最大１０％切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く分解される。
更に他の実施形態では、ホスフェート基を分解又は加水分解する剤によって切断されるホスフェート系切断可能リンカーを用いて、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリガンドを共有結合する。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の一例は、細胞内におけるホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系切断可能基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－であり、ここで、Ｒｋは、水素又はＣ１～Ｃ１０アルキルであり得る。特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－を含む。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０又はそれを下回る）の酸性環境において又は一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが、酸切断可能な基に切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル及びアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基又はジメチル、ペンチル若しくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断されるエステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
更なる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断されるペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じるような、アミノ酸間で形成されたペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含む。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、一般に、ペプチド及びタンパク質を産生するアミノ酸間に形成されるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定される。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸の側鎖である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するのに好適な他の種類のリンカーが当技術分野で知られており、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；及び同第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーを含むことができ、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は三価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は三価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の５’末端に結合される。更に他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の３’末端に結合される。更に他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の５’末端に結合される。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは以下の構造（［構造１］）を有するリガンドを含む。
好ましい実施形態では、この構造を有するリガンドは、本明細書に記載されるリンカーなどのリンカーを介してセンス鎖の５’末端に（例えば、センス鎖の５’末端ヌクレオチドに）共有結合される。一実施形態では、リンカーはアミノヘキシルリンカーである。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおける二本鎖ＲＮＡ分子に結合することができる三価及び四価のＧａｌＮＡｃ部分並びにリンカーの例が以下の構造式Ｉ～ＩＸにおいて提供される。本明細書に列記される式中の「Ａｃ」はアセチル基を表す。
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｉの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、ｍは１又は２であり、ｊは１又は２であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、ｍは１又は２であり、ｊは１又は２であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＶの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｖの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、Ｘ＝Ｏ又はＳであり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＸの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
ホスホロチオエート結合は、リガンド及びリンカーを核酸鎖と共有結合させるために、式Ｉ～ＩＸのいずれか１つに示すホスホジエステル結合と置き換えることができる。
本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物及び製剤も含む。こうした組成物及び製剤は、ＭＡＲＣ１遺伝子の発現の低減を、それを必要とする患者において行うために有用である。臨床上の用途が想定される場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で調製される。一般に、このことは、パイロジェンだけでなく、ヒト又は動物に有害となる可能性のある他の不純物も実質的に含まない組成物の調製を伴う。
語句「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」は、動物又はヒトに投与される場合の有害なアレルギー性の又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤」は、ヒトへの投与に好適な薬剤などの薬剤の製剤化における使用に許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で知られている。従来のあらゆる媒体又は薬剤が、本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療組成物に使用されることが意図される。補助的な活性成分は、それらが組成物のＲＮＡｉコンストラクトを不活性化しないという条件で組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物の製剤の組成及び方法は、投与経路、治療される疾患若しくは障害の種類及び程度又は投与される用量を含むがこれらに限定されない、いくつかの条件に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、意図する送達経路に基づいて製剤化される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に製剤化される。非経口の送達形態としては、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入が挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達用に製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含み得る。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達用に製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ含有又は抗体含有リガンド）を含み得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効量の本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを含む。「有効量」は、有利な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、患者の特定の組織又は細胞型（例えば、肝臓又は肝細胞）においてＭＡＲＣ１遺伝子の発現を低減させるのに十分な量である。有効量の本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得、毎日、毎週、毎月又はそれよりも長い間隔で投与され得る。有効な投与量及び投与頻度と考えられるものを正確に決定することは、患者の身長、年齢及び全身状態、治療対象の障害の種類（例えば、脂肪肝疾患、肝線維症又は心血管疾患）、使用される特定のＲＮＡｉコンストラクト並びに投与経路を含むいくつかの要因に基づき得る。
本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の一般的な経路を介するものであり得る。このような経路としては、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮及び舌下経路又は肝臓組織への直接注射若しくは肝門脈を介する送達が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与される。
水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び脂質ベースの系などのコロイド分散系は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのための送達ビヒクルとして使用され得る。本発明の核酸を送達するのに好適な市販の脂肪エマルションは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）及び他の類似の脂質エマルションを含む。送達ビヒクルとしてインビボで用いるための例示的なコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リポソーム内に封入され得るか、又はリポソーム、特にカチオン性リポソームに対して複合体を形成し得る。これ以外にも、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質に対して複合体形成され得る。好適な脂質及びリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））並びにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。このようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野でよく知られている。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書、米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許第６，７４７，０１４号明細書；及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにも開示されている。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、例えば脂質製剤に完全に封入されて、ＳＮＡＬＰ又は他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は安定な核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質及び粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身投与のために極めて有用である。核酸－脂質粒子は、通常、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸－脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書、同第５，９８１，５０１号明細書、同第６，５３４，４８４号明細書、同第６，５８６，４１０号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。適切な溶媒又は分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合液及び植物油を含有し得る。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散体の場合に必要とされる粒径を維持し、且つ界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及びチメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらすことができる。
滅菌注射溶液は、活性化合物を適切な量において、必要に応じて（例えば、上記に列挙したような）他の任意の成分と共に溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散体は、塩基性分散媒体及び所望の他の成分、例えば上記で列挙された成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法としては、それらの予め滅菌濾過した溶液から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥技術が挙げられる。
本発明の組成物は、一般に、中性又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマンデル酸など）から誘導される酸付加塩（遊離アミノ基と共に形成される）を含む。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン及びプロカインなど）から誘導されることも可能である。薬学的に許容される塩は、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６：１－１９，１９７７で詳細に説明されている。
水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は、通常、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば、十分な生理食塩水又はグルコースにより最初に等張にされる。このような水溶液を例えば静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用し得る。特に本開示を考慮して、当業者に知られているような滅菌水性媒体を使用することが好ましい。実例として、単回用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解し、皮下注入液１０００ｍｌに添加し得るか、又は提示された注入部位に注射し得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ基準に要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たさなければならない。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水及び本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含むか又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか又はそれらからなる。更に他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスでパッケージ化されるか又はその中に保存される。注射用製剤のためのデバイスは、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、装着型注射器及び注射ペンを含むが、これらに限定されない。エアロゾル化又は粉末製剤のためのデバイスは、インヘラー、吸入器、吸引器などを含むが、これらに限定されない。したがって本発明は、本明細書に記載される障害又は疾患の１つ以上を治療又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
本発明は、細胞を本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれか１つと接触させることにより、細胞（例えば、肝細胞）におけるＭＡＲＣ１遺伝子の発現、したがってｍＡＲＣ１タンパク質の生成を低減又は阻害する方法を提供する。細胞は、インビトロ又はインビボであり得る。ｍＡＲＣ１発現は、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ、ｍＡＲＣ１のタンパク質又はコレステロール、ＬＤＬコレステロール若しくは肝臓酵素、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルなど、ｍＡＲＣ１発現に関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置された細胞又は動物におけるｍＡＲＣ１発現の低減は、ＲＮＡｉコンストラクトで処置されていないか又は対照ＲＮＡｉコンストラクトで処置された細胞又は動物におけるｍＡＲＣ１発現と比較して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｍＡＲＣ１発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置された肝細胞におけるｍＡＲＣ１のｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝細胞中で発現しないＲＮＡ分子を対象とするＲＮＡｉコンストラクト又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）又はコンストラクトなしで処置された肝細胞におけるｍＡＲＣ１のｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処置された細胞から測定されたｍＡＲＣ１のｍＲＮＡレベルと、（ｂ）において対照細胞から測定されたｍＡＲＣ１のｍＲＮＡレベルとを比較することによって評価される。比較前に、処置された細胞及び対照細胞におけるｍＡＲＣ１のｍＲＮＡレベルを、対照遺伝子（例えば、１８ＳリボソームＲＮＡ又はハウスキーピング遺伝子）のＲＮＡレベルに対して正規化することができる。ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ドロップレットデジタルＰＣＲなどを含む様々な方法によって測定することができる。
他の実施形態では、ｍＡＲＣ１発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置された肝細胞におけるｍＡＲＣ１タンパク質の量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝細胞中で発現しないＲＮＡ分子を対象とするＲＮＡｉコンストラクト又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）又はコンストラクトなしで処置された肝細胞におけるｍＡＲＣ１タンパク質の量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処置された細胞から測定されたｍＡＲＣ１タンパク質レベルと、（ｂ）において対照細胞から測定されたｍＡＲＣ１タンパク質レベルとを比較することによって評価される。ｍＡＲＣ１タンパク質レベルを測定する方法は、当業者に知られており、例えばウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリーが挙げられる。ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ又はｍＡＲＣ１タンパク質を測定することができる任意の方法を使用して、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効性を評価することができる。
いくつかの実施形態では、ｍＡＲＣ１の発現レベルを評価する方法は、ｍＡＲＣ１を自然に発現する細胞（例えば、肝細胞）又はｍＡＲＣ１を発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。特定の実施形態では、本方法は、肝細胞においてインビトロで実施される。好適な肝細胞としては、初代肝細胞（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類の肝細胞）、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ－６細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨｕＨ－５－２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞又はＨｅｐＧ２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、肝細胞は、ＨｕＨ－７細胞である。別の実施形態では、肝細胞は、ヒト初代肝細胞である。更に別の実施形態では、肝細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞である。
他の実施形態では、ｍＡＲＣ１の発現レベルを評価する方法は、インビボで実施される。ＲＮＡｉコンストラクト及び任意の対照ＲＮＡｉコンストラクトを動物に投与し得、処置後の動物から採取した肝臓組織中でｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ又はｍＡＲＣ１タンパク質レベルを評価することができる。代わりに又は加えて、ｍＡＲＣ１発現と関連するバイオマーカー又は機能的表現型を、処置された動物で評価することができる。例えば、ＭＡＲＣ１の機能喪失バリアントは、血清中の総コレステロール、ＬＤＬコレステロール及び肝臓酵素レベルの低下に関連している（Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１６（４）：ｅ１００８６２９，２０２０を参照されたい）。したがって、コレステロール、ＬＤＬコレステロール又は肝臓酵素（例えば、ＡＬＴ）の血清又は血漿レベルを本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置した動物で測定して、ｍＡＲＣ１発現の低減の機能的有効性を評価することができる。血清又は血漿コレステロール又は酵素レベルの例示的な測定方法は、実施例１、４及び５に記載されている。
特定の実施形態では、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝細胞中で少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％低減する。いくつかの実施形態では、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝細胞中で少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又は少なくとも８５％低減する。他の実施形態では、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝細胞中で約９０％以上、例えば約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上低減する。ｍＡＲＣ１発現の低減率は、本明細書に記載の方法のいずれか及び当技術分野で知られる他の方法によって測定することができる。
本発明は、ＭＡＲＣ１遺伝子の発現、したがってｍＡＲＣ１タンパク質の生成の低減又は阻害を、それを必要とする患者において行う方法及びｍＡＲＣ１発現又は活性に関連する病態、疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。「ｍＡＲＣ１発現と関連する病態、疾患又は障害」は、ｍＡＲＣ１の発現レベルが変化するか、又はｍＡＲＣ１の上昇した発現レベルがその病態、疾患又は障害の増大した発症リスクと関連する病態、疾患又は障害を指す。ｍＡＲＣ１発現と関連する病態、疾患又は障害は、コレステロール、脂質、トリグリセリドなどの異常な若しくは高いレベルをもたらす変化又はこれらの分子のクリアランス障害をもたらす変化など、リポタンパク質代謝の異常な変化に起因する病態、疾患又は障害も含むことができる。最近の遺伝学研究では、ＭＡＲＣ１遺伝子中の機能喪失バリアントと、コレステロール及び肝臓酵素の血中レベルの低下、肝臓脂肪の低減並びに肝硬変の予防との間の関連が報告されている（Ｓｐｒａｃｋｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２６（９）：１７７０－１７８，２０１７；Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ５９４５２３；／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／５９４５２３，２０１９；及びＥｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１６（４）：ｅ１００８６２９，２０２０））。Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ５９４５２３；／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／５９４５２３，２０１９；及びＥｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１６（４）：ｅ１００８６２９，２０２０を参照されたい。このため、特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂肪肝疾患（例えば、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ）及び心血管疾患（例えば、冠動脈疾患及び心筋梗塞）の治療又は予防並びに肝線維症及び血清コレステロールレベルの低減に特に有用である。
本発明の方法に従って治療又は予防することができる、ｍＡＲＣ１発現に関連する病態、疾患及び障害としては、脂肪肝疾患、例えばアルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ；慢性肝臓病；肝硬変；心血管疾患、例えば心筋梗塞、心不全、脳卒中（虚血性及び出血性）、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）、脳血管疾患、脆弱性プラーク及び大動脈弁狭窄症；家族性高コレステロール血症；静脈血栓症；高コレステロール血症；高脂血症；並びに脂質異常症（例えば、総コレステロールの上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の上昇、トリグリセリドの上昇及び／又は低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）として顕在化する）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明は、ｍＡＲＣ１タンパク質の発現の低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を指し、用語「対象」と互換的に使用することができる。好ましくは、患者の肝細胞におけるｍＡＲＣ１の発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトを受けていない患者のｍＡＲＣ１発現レベル又はＲＮＡｉコンストラクトを投与する前の患者のｍＡＲＣ１発現レベルと比較して、ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に低減される。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与した後、患者におけるｍＡＲＣ１の発現は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％低減する。ｍＡＲＣ１発現の低減率は、本明細書に記載の方法のいずれか及び当技術分野で知られる他の方法によって測定することができる。特定の実施形態では、ｍＡＲＣ１発現の低減の割合は、本明細書に記載の方法に従って、患者の総コレステロール、ＬＤＬコレステロール又は肝臓酵素（例えば、ＡＬＴ）レベルなど、血清又は血漿バイオマーカーのレベルを評価することによって決定される。
いくつかの実施形態では、ｍＡＲＣ１発現の低減を必要とする患者は、心筋梗塞を有するリスクのある患者である。心筋梗塞を有するリスクのある患者は、心筋梗塞の病歴を有する患者であり得る（例えば、以前に心筋梗塞に罹患したことがある）。心筋梗塞を有するリスクのある患者は、心筋梗塞の家族性の病歴を有するか、又は心筋梗塞の１つ以上のリスク因子を有する患者でもあり得る。このようなリスク因子は、高血圧、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベル、トリグリセリドの上昇したレベル、糖尿病、肥満症又は自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、狼瘡）の病歴を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、心筋梗塞を有するリスクのある患者は、冠動脈疾患を有するか、又は冠動脈疾患と診断される患者である。これら及び他の患者における心筋梗塞のリスクは、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することによって低減することができる。したがって、本発明は、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、心筋梗塞のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
特定の実施形態では、ｍＡＲＣ１発現の低減を必要とする患者は、心血管疾患と診断されるか、又は心血管疾患のリスクを有する患者である。したがって、本発明は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを投与することにより、心血管疾患の治療又は予防を、それを必要とする患者において行う方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、心血管疾患の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、心血管疾患の治療又は予防を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。心血管疾患としては、心筋梗塞、心不全、脳卒中（虚血性及び出血性）、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）、脳血管疾患、脆弱性プラーク及び大動脈弁狭窄症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、冠動脈疾患である。他の実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、心筋梗塞である。更に他の実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、脳卒中である。更に他の実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、末梢動脈疾患である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの投与は、非致死性の心筋梗塞、致死性及び非致死性の脳卒中、特定の種類の心臓手術（例えば、血管形成、バイパス）、心不全のための入院、心疾患患者における胸痛並びに／又は確定した心疾患患者における心血管事象（例えば、心筋梗塞の既往、心臓手術の既往及び／若しくは動脈閉塞の徴候がある胸痛）のリスクを低減させる。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従った本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの投与は、再発性の心血管イベントのリスクを低減するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って治療される患者は、脆弱性プラーク（不安定プラークとも称される）を有する患者である。脆弱性プラークは、動脈壁の内皮裏層の下にあるマクロファージ及び主にコレステロールを含有する脂質の蓄積である。これらの脆弱性プラークは、破裂して、場合により動脈を通る血流を遮断し、心筋梗塞又は卒中を引き起こす可能性がある血塊の形成をもたらす場合がある。脆弱性プラークは、血管内超音波及びコンピュータ断層撮影を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の方法によって識別することができる（Ｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２５；２０２６－２０３３，２００４；Ｂｕｄｈｏｆｆ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４８；３１９－３２１，２００６；Ｈａｕｓｌｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４８；３１２－３１８，２００６を参照されたい）。
他の実施形態では、ｍＡＲＣ１発現の低減を必要とする患者は、コレステロール（例えば、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロール）の血中レベルが高い患者である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、コレステロールの血中レベル（例えば、血清又は血漿）の低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、コレステロールの血中レベル（例えば、血清又は血漿）の低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、コレステロールの血中レベル（例えば、血清又は血漿）の低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。特定の実施形態では、本発明の方法に従って低減されるコレステロールは、ＬＤＬコレステロールである。他の実施形態では、本発明の方法に従って低減されるコレステロールは、非ＨＤＬコレステロールである。非ＨＤＬコレステロールは、ＬＤＬコレステロール、超低密度リポタンパク質、中間密度リポタンパク質、リポタンパク質（ａ）、カイロミクロン及びカイロミクロンレムナントを含む全てのコレステロール含有のアテローム生成促進的なリポタンパク質の尺度である。非ＨＤＬコレステロールは、心血管リスクの優れた予測因子であると報告されている（Ｒａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．１４：１３０－１３４，２０１２）。非ＨＤＬコレステロールレベルは、総コレステロールレベルからＨＤＬコレステロールレベルを減算することによって計算することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って治療される患者は、非ＨＤＬコレステロールの上昇したレベル（例えば、非ＨＤＬコレステロールの上昇した血清又は血漿レベル）を有する患者である。理想的には、非ＨＤＬコレステロールのレベルは、任意の所与の患者についてのＬＤＬコレステロールの目標値を上回る約３０ｍｇ／ｄＬであるべきである。特定の実施形態では、患者は、その患者が約１３０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。一実施形態では、患者は、その患者が約１６０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。別の実施形態では、患者は、その患者が約１９０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。更に別の実施形態では、患者は、その患者が約２２０ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。特定の実施形態では、患者は、その患者が心血管リスクの評価についての２０１３ ＡＣＣ／ＡＨＡガイドライン（Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＣ／ＡＨＡ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，Ｖｏｌ．６３：２９３５－２９５９，２０１４）に従って高いか又は極めて高い心血管疾患のリスクがあり、且つ約１００ｍｇ／ｄＬ以上の非ＨＤＬコレステロールレベルを有する場合、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。
本発明の方法の特定の実施形態では、患者は、患者が心血管リスクの評価についての２０１３ ＡＣＣ／ＡＨＡガイドライン（本明細書では「２０１３ガイドライン」と称する）に従って中程度以上の心血管疾患のリスクがある場合、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを投与される。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者のＬＤＬコレステロールレベルが約１６０ｍｇ／ｄＬより高い場合、患者に投与される。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者のＬＤＬコレステロールレベルが約１３０ｍｇ／ｄＬより高く、且つ患者が２０１３ガイドラインに従って中程度の心血管疾患のリスクを有する場合、患者に投与される。更に他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者のＬＤＬコレステロールレベルが１００ｍｇ／ｄＬより高く、且つ患者が２０１３ガイドラインに従って高い又は極めて高い心血管疾患のリスクを有する場合、患者に投与される。
他の実施形態では、ｍＡＲＣ１発現の低減を必要とする患者は、脂肪肝疾患と診断されるか又はそのリスクを有する患者である。したがって、本発明は、脂肪肝疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、脂肪肝疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、脂肪肝疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。脂肪肝疾患とは、肝臓に脂肪が蓄積する病態である。脂肪肝疾患には、２つの主要なタイプ：多量のアルコール使用に関連する第１のタイプ（アルコール性脂肪性肝炎）及びアルコールの使用に関連しない第２のタイプ（非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ））が存在する。ＮＡＦＬＤは、典型的には、肝臓に脂肪の蓄積が存在するが、炎症又は肝細胞の損傷がほとんど又は全く存在しないことを特徴とする。ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に進行する場合があり、ＮＡＳＨは肝臓の炎症及び細胞損傷を特徴とし、これらの両方は、それに続いて肝線維症及び最終的には肝硬変又は肝臓癌をもたらす場合がある。特定の実施形態では、本発明の方法に従って治療するか、予防するか又はそれを発症するリスクを低減させる対象となる脂肪肝疾患は、ＮＡＦＬＤである。他の実施形態では、本発明の方法に従って治療するか、予防するか又はそれを発症するリスクを低減させる対象となる脂肪肝疾患は、ＮＡＳＨである。更に他の実施形態では、本発明の方法に従って治療するか、予防するか又はそれを発症するリスクを低減させる対象となる脂肪肝疾患は、アルコール性脂肪性肝炎である。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って脂肪肝疾患を治療若しくは予防することが必要な患者又は脂肪肝疾患を発症するリスクがある患者は、２型糖尿病と診断されているか、代謝障害と診断されているか又は肥満である（例えば、≧３０．０の肥満度指数）。他の実施形態では、本発明の方法に従って脂肪肝疾患を治療若しくは予防することが必要な患者又は脂肪肝疾患を発症するリスクがある患者は、高いレベルの非ＨＤＬコレステロール又はトリグリセリドを有する。特定の患者及び患者が有し得る他のリスク因子に応じて、高いレベルの非ＨＤＬコレステロールは、約１３０ｍｇ／ｄＬ以上、約１６０ｍｇ／ｄＬ以上、約１９０ｍｇ／ｄＬ以上又は約２２０ｍｇ／ｄＬ以上であり得る。高いトリグリセリドレベルは、約１５０ｍｇ／ｄＬ以上、約１７５ｍｇ／ｄＬ以上、約２００ｍｇ／ｄＬ以上又は約２５０ｍｇ／ｄＬ以上であり得る。
特定の実施形態では、ｍＡＲＣ１発現を低減させることが必要な患者は、肝線維症若しくは肝硬変と診断されるか又はそれを発症するリスクがある患者である。したがって、本発明は、肝線維症の治療、予防又は低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、肝線維症の治療、予防又は低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、肝線維症の治療、予防又は低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのｍＡＲＣ１標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。いくつかの実施形態では、肝線維症又は肝硬変を発症するリスクがある患者は、ＮＡＦＬＤと診断されている。他の実施形態では、肝線維症又は肝硬変を発症するリスクがある患者は、ＮＡＳＨと診断されている。更に他の実施形態では、肝線維症又は肝硬変を発症するリスクがある患者は、アルコール性脂肪性肝炎と診断されている。また他の実施形態では、肝線維症又は肝硬変を発症するリスクがある患者は、肝炎と診断されている。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与することで、患者における肝硬変の発症が予防又は遅延される。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１．Ｏｂ／Ｏｂ動物におけるｍＡＲＣ１発現の阻害が、脂質レベルを調節する
遺伝学研究では、ＭＡＲＣ１遺伝子におけるＡ１６５Ｔミスセンス変異と、血清低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール及び総コレステロールレベルの低下との間の関連が報告されている（Ｓｐｒａｃｋｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２６（９）：１７７０－１７８，２０１７；Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ５９４５２３；／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／５９４５２３，２０１９；及びＥｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１６（４）：ｅ１００８６２９，２０２０））。この変異及びＭＡＲＣ１遺伝子の他の機能喪失バリアントは、最近になり、低レベルの肝脂肪、肝臓酵素レベルの低減及び肝硬変リスクの低減と関連付けられた（Ｅｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９及びＥｍｄｉｎ ｅｔ ａｌ，２０２０）。ＭＡＲＣ１のＡ１６５Ｔバリアント対立遺伝子のヒト保菌者で観察されるように、ｍＡＲＣ１発現の阻害が血清コレステロールレベルを低減し得るかどうかを評価するために、老齢肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）に、マウスＭａｒｃ１遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ分子又は対照ｓｉＲＮＡ分子を投与した。ｏｂ／ｏｂマウスは肥満であり、高い脂質レベルを有するため、これらのマウスは、ＩＩ型糖尿病及び他の代謝障害のモデルとして使用されることが多い。
１８～２０週齢の雄ｏｂ／ｏｂ動物（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、標準固形飼料（Ｈａｒｌａｎ、２０２０×Ｔｅｋｌａｄ ｇｌｏｂａｌ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ）を与えた。マウスに、６週間にわたり２週間に１回、皮下注射で、０．２ｍｌ緩衝液中の緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）のみ（ｎ＝８）、ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００；ｎ＝８）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２；ｎ＝８）を体重１ｋｇあたり３ｍｇで投与した。下記の実施例２で説明するように、ｓｉＲＮＡ分子を合成して、三価ＧａｌＮＡｃ部分（下記の式ＶＩＩに示す構造）にコンジュゲートさせた。ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの構造を、下記の表１及び２に示す。動物を絶食させ、第６週に捕獲して更に分析した。捕獲された動物由来の肝臓の全ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために処理し、血清のパラメータを臨床分析装置（ＡＵ４００ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって測定した。ｍＲＮＡレベルを、最初に各肝臓試料中の１８ＳリボソームＲＮＡレベルに正規化し、続いて緩衝液のみの群の発現レベルと比較した。データは、緩衝液のみの群における発現に対する相対的倍数として示した。肝臓組織を均質化し、イソプロパノールによって抽出して、総コレステロール及び総トリグリセリドを測定した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｉｎｆｉｎｉｔｙコレステロール試薬及びＩｎｆｉｎｉｔｙトリグリセリド試薬）。全ての動物の飼育条件及び研究プロトコルが、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。マウスを、換気マイクロアイソレーター内の無菌ＡＡＡＬＡＣ国際認可施設で飼育した。手順及び飼育部屋は陽圧にし、１２：１２の暗：明サイクルで調節した。自動給水システムを介して全ての動物に逆浸透精製水を自由に与えた。
ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡで処置した動物は、緩衝液のみの注射を投与された動物と比較して、肝臓中のｍＡＲＣ１発現が約８０％低減した（図２Ａ）。ｍＡＲＣ２のｍＲＮＡの肝臓発現は影響を受けなかったため、ｓｉＲＮＡ分子によるｍＡＲＣ１発現の低減は特異的であった（図２Ｂ）。ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡでの処置は、血清の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、ＬＤＬ及び総コレステロールレベル並びにアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血清中レベルを低減させた（図３Ａ～３Ｈ）。ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡを投与されたｏｂ／ｏｂ動物では肝臓中のトリグリセリドレベルも低減した（図４Ａ及び４Ｂ）。この動物モデルでは、ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡを投与された動物の線維症遺伝子の肝臓発現は、緩衝液を注射された動物と比較して有意に変化しなかった（データ示さず）。
この一連の実験の結果は、ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡ分子で肝臓中のｍＡＲＣ１発現を特異的に阻害すると、血清コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＡＬＴレベル及び肝臓トリグリセリドが低減することを示し、肝細胞中の脂質調節におけるｍＡＲＣ１の因果的効果を実証する。ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡで処置されたｏｂ／ｏｂ動物における血清コレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＡＬＴレベルの観察される低減は、ＭＡＲＣ１のＡ１６５Ｔバリアント対立遺伝子のヒト保菌者で観察されるこれらの分析物のレベルの低減と一致する。かくして、本明細書に記載されるものなどのｓｉＲＮＡ分子でｍＡＲＣ１発現を阻害することは、高コレステロール血症又は高脂質血症を患う患者のコレステロール及びトリグリセリドのレベルを低減させるのに有用となり得、また、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症及び肝硬変などの他の肝疾患に対して治療的となり得る。
実施例２．ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の設計及び合成
ヒトＭＡＲＣ１転写産物のバイオインフォマティクス解析を用いて、ヒトＭＡＲＣ１遺伝子を標的化する治療用ｓｉＲＮＡ分子の設計のための候補配列を同定し、その配列を配列番号１として本明細書に示す（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物番号ＥＮＳＴ０００００３６６９１０．９；図１を参照されたい）。インハウスのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用して配列を分析し、特定の基準を満たす場合には選択した。バイオインフォマティクス解析は２つの段階で実施した。第１の段階では、カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；ＮＣＢＩ参照配列ＸＲ＿００１４９０７２２．１、ＸＲ＿００１４９０７２２．１、ＸＲ＿００１４９０７２３．１、ＸＲ＿００１４９０７２６．１、ＸＲ＿２７３２８５．２、ＸＭ＿００５５４０９０１．２、ＸＲ＿２７３２８６．２、ＸＭ＿００５５４０８９８．２及びＸＭ＿００５５４０８９９．２）由来のＭＡＲＣ１転写産物との交差反応性、他のヒト、カニクイザル及び齧歯類遺伝子配列との配列同一性並びに既知のヒト単一ヌクレオチド多型との重複を含む配列の様々な機能を評価した。第２の段階では、ヒトＭＡＲＣ１転写産物のみに特異性がある配列を含め、ヒトマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列に対するシード領域の一致に関して配列を評価してオフターゲット効果を予測するように、選択基準を調節した。バイオインフォマティクス解析の結果に基づいて、最初の合成及びインビトロ検査のために６６５個の配列を選択した。
固相ホスホラミダイト化学を用いてＲＮＡｉコンストラクトを合成した。合成は、ＭｅｒＭａｄｅ１２又はＭｅｒＭａｄｅ１９２Ｘ（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）機器で実施した。２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む種々の化学修飾を分子に組み込んだ。ＲＮＡｉコンストラクトは、一般に、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端にオーバーハングがない状態（二重鎖ブラントマー又は２ヌクレオチドの１つ若しくは２つのオーバーハングを有する状態のいずれかでアニーリングした場合、１９～２１塩基対の二重鎖に形式化される。インビボ研究のために、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖を、下記でより詳細に説明される三価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分にコンジュゲートした。
材料
アセトニトリル（ＤＮＡ合成等級、ＡＸＯ１５２－２５０５、ＥＭＤ）
キャッピング試薬Ａ（８０：１０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン／ルチジン／無水酢酸、ＢＩＯ２２１／４０００、ＥＭＤ）
キャッピング試薬Ｂ（１６％１－メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン、ＢＩＯ３４５／４０００、ＥＭＤ）
活性剤溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍの５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、ＢＩＯ１５２／０９６０、ＥＭＤ）
脱トリチル化試薬（ジクロロメタン中３％ジクロロ酢酸、ＢＩＯ８３０／４０００、ＥＭＤ）
酸化試薬（７０：２０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン／ピリジン／水中０．０２Ｍヨウ素、ＢＩＯ４２０／４０００、ＥＭＤ）
ジエチルアミン溶液（アセトニトリル中２０％ＤＥＡ、ＮＣ００１７－０５０５、ＥＭＤ）
チオール化試薬（ピリジン中０．０５Ｍの５－Ｎ－［（ジメチルアミノ）メチレン］アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＢＩＯＳＵＬＩＩ／１６０Ｋ））
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｐ Ｐａｃｋ（３０ｍＬあたり０．５ｇ、Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上のアセトニトリル中０．１０Ｍのアデノシン、グアノシン及びシトシンの５’－アミノヘキシルリンカーホスホラミダイト並びに２’－メトキシ及び２’－フルオロホスホラミダイト（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｐ Ｐａｃｋ（３０ｍＬあたり０．５ｇ、Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上の９０：１０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／ＤＭＦ中０．１０Ｍの２’－メトキシ－ウリジンホスホラミダイト（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｐ Ｐａｃｋ（３０ｍＬあたり０．５ｇ、Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上のアセトニトリル中０．１０Ｍの２’－デオキシ－逆脱塩基ホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）
ＣＰＧ支持体（高負荷ユニバーサル支持体、５００Ａ（ＢＨ５－３５００－Ｇ１）、７９．６μｍｏｌ／ｇ、０．１２６ｇ（１０μｍｏｌ））又は１μｍｏｌユニバーサル合成カラム、５００Ａ、ピペット型ボディ（ＭＭ５－３５００－１、Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）
水酸化アンモニウム（高濃度、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）
合成
試薬溶液、ホスホラミダイト溶液及び溶媒をＭｅｒＭａｄｅ１２又はＭｅｒＭａｄｅ１９２Ｘ機器に接続した。各カラム（１０μｍｏｌ用の上下フリットを備える４ｍＬのＳＰＥ管）に固体支持体を添加し、カラムを機器に固定した。カラムをアセトニトリルで２回洗浄した。ホスホラミダイト及び試薬溶液ラインをパージした。Ｐｏｓｅｉｄｏｎソフトウェアを使用して合成を開始した。合成は、脱保護／カップリング／酸化／キャッピングの合成サイクルの反復によって行われた。具体的には、固体支持体に脱トリチル化試薬を添加し、５’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を除去した。固体支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体にホスホラミダイト及び活性剤溶液を添加し、続いてインキュベートして、入ってくるヌクレオチドを遊離５’－ヒドロキシル基に結合した。支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体に酸化又はチオール化試薬を添加して亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステル又はホスホロチオエートに変換した。支持体にキャッピング試薬Ａ及びＢを添加して任意の未反応オリゴヌクレオチド鎖を終端させた。支持体をアセトニトリルで洗浄した。最終反応サイクル後、レジンをジエチルアミン溶液で洗浄して２－シアノエチル保護基を除去した。支持体をアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。
ＧａｌＮＡｃコンジュゲーション
５’－アミノヘキシルリンカーを用いて、三価ＧａｌＮＡｃ部分（下記の式ＶＩＩに示す構造）にコンジュゲートするためのセンス鎖を調製した。自動合成後、機器からカラムを取り出し、フード内で真空マニホールドに移した。５’－モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護基を、真空濾過を用いてジクロロメタン（ＤＣＭ）中の１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の２ｍＬアリコートで連続的に処理することにより固体支持体から除去した。溶出液中で橙色／黄色がこれ以上観察されなくなったら、レジンをジクロロメタンで洗浄した。レジンを５ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１０％ジイソプロピルエチルアミンで洗浄した。別のバイアル中で、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中ＧａｌＮＡｃ３－Ｌｙｓ２－Ａｈｘ（６７ｍｇ、４０μｍｏｌ）の溶液（その構造及び合成は下記で説明する）を、１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＡＴＵ、１２．８３ｍｇ、４０μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１３．９μＬ、８０μｍｏｌ）を用いて調製した。活性化されたカップリング溶液をレジンに添加し、カラムに蓋をして室温で終夜インキュベートした。レジンをＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。
切断
合成カラムを、合成装置又は真空マニホールドから除去して、切断装置に移した。固体支持体に、４×１ｍＬ（１０μｍｏｌ用）又は４×２５０μＬ（１μｍｏｌ用）の高濃度水酸化アンモニウムを添加した。溶出液を、重力又は軽減圧濾過によってそれぞれ２４又は９６ウェルのディープウェルプレートに採取した。プレートを密封し、劈開チャック（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）内にボルト止めし、混合物を５５℃で４時間加熱した。プレートを冷凍庫に移し、２０分間冷却してからフード内で劈開チャックを開けた。
分析及び精製
切断溶液の一部を分析し、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。プールした分画をサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、イオン対逆相高速液体クロマトグラフ質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）によって分析した。プールした分画を凍結乾燥して白色の非晶質粉末を得た。
分析的アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００ＲＳ（４．６×５０ｍｍ、４μｍ）
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：４０℃で１ｍＬ／分
勾配：６．２分で２０～６５％Ｂ
分取アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：東ソー株式会社 ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１×１５０ｍｍ、１３μｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：８ｍＬ／分
注入量：５ｍＬ
勾配：センス鎖は４０分間にわたって３５～５５％Ｂ、アンチセンス鎖は４０分間にわたって５０～１００％Ｂ
分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：
カラム：３×ＧＥ Ｈｉ－Ｐｒｅｐ ２６／１０、直列
機器：ＧＥ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ
緩衝液：２０％エタノール水溶液
流速：１０ｍＬ／分
注入量：試料負荷ポンプを用いて４５ｍＬ
イオン対逆相（ＩＰ－ＲＰ）ＨＰＬＣ：
カラム：Ｗａｔｅｒ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＯＳＴ Ｃ１８、２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：水中の１５．７ｍＭのＤＩＥＡ、５０ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）
緩衝液Ｂ：５０：５０の水／アセトニトリル中の１５．７ｍＭ ＤＩＥＡ、５０ｍＭ ＨＦＩＰ
流速：０．５ｍＬ／分
勾配：６分にわたって１０～３０％Ｂ
アニーリング
少量のセンス鎖及びアンチセンス鎖を個々のバイアル内に量り取った。バイアルにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）を添加し、乾燥重量を基準として約２ｍＭの濃度にした。実際の試料濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（ｓｓＤＮＡ、吸光係数＝３３μｇ／ＯＤ２６０）上で測定した。次に、２つの鎖を等モル比で混合し、試料を９０℃のインキュベーター内で５分間加熱し、室温までゆっくりと冷却した。試料をＡＥＸによって分析した。二重鎖を登録し、下記の実施例３及び４でより詳細に説明するようにインビトロ及びインビボ試験に供した。
ＧａｌＮＡｃ３－Ｌｙｓ２－Ａｈｘの調製
式中、Ｘ＝Ｏ又はＳである。波線は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに対する結合点を表す。ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’炭素に結合したが、但し、逆位脱塩基（ｉｎｖＡｂ）デオキシヌクレオチドが５’末端ヌクレオチドであり、５’－５’ヌクレオチド間結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合していた場合を除き、この場合、ＧａｌＮＡｃ部分は、逆位脱塩基デオキシヌクレオチドの３’炭素に結合した。
５０ｍＬのｆａｌｃｏｎ管にＤＣＭ（３０ｍＬ）中Ｆｍｏｃ－Ａｈｘ－ＯＨ（１．１３ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（２．２３ｍＬ、１２．７８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を５０ｍＬ遠心分離管中の２－Ｃｌ塩化トリチルレジン（３．０３ｇ、４．７９ｍｍｏｌ）に添加し、振とう器上に２時間投入した。溶媒を排出し、レジンを１７：２：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（３０ｍｌ×２）、ＤＣＭ（３０ｍＬ×４）で洗浄してから乾燥させた。２９０ｎｍのＵＶ分光光度検出で、投入量は、０．７６ｍｍｏｌ／ｇであると決定された。
３ｇの投入された２－Ｃｌトリチルレジンを、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中２０％の４－メチルピペリジンに懸濁させ、３０分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に１回繰り返し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ（３．４５ｇ、６ｍｍｏｌ）溶液にＴＡＴＵ（１．９４ｇ、６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（１．８３ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。続いて溶液を上記の脱保護されたレジンに添加し、懸濁液を振とう器上に終夜置いた。溶媒を排出し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
レジンをＤＭＦ（１５ｍＬ）の２０％４－メチルピペリジンで処理し、１０分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に１回繰り返し、レジンをＤＭＦ（１５ｍＬ×４）及びＤＣＭ（１５ｍＬ×４）で洗浄した。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ（３．５４ｇ、６ｍｍｏｌ）溶液にＴＡＴＵ（１．９４ｇ、６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（１．８３ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。続いて溶液を上記の脱保護されたレジンに添加し、懸濁液を振とう器上に終夜置いた。溶媒を排出し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
レジンをＤＭＦ（２０ｍＬ）の５％ヒドラジンで処理し、５分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に４回繰り返し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×４）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×４）で洗浄した。
ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の５－（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ペンタン酸（４．４７ｇ、１０ｍｍｏｌ）溶液にＴＡＴＵ（３．２２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を５分間攪拌した。ＤＩＥＡ（２．９６ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、続いて混合物を上記のレジンに添加した。懸濁液を室温で終夜保持し、溶媒を排出した。レジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）及びＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で洗浄した。
レジンをＤＣＭ（３０ｍＬ、３％トリイソプロピルシランを含む）中１％ＴＦＡで処理し、５分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に３回繰り返し、合わせた濾液を減圧下で濃縮した。残滓をジエチルエーテル（５０ｍＬ）で粉砕し、懸濁液を濾過し、乾燥させて粗生成物を得た。粗生成物を逆相クロマトグラフィーで精製し、水中０～２０％のＭｅＣＮで溶出した。分画を合わせ、凍結乾燥することによって白色固体として生成物を得た。
下記の表１には、バイオインフォマティクス解析から優先順位を付けられた分子の未修飾のセンス配列及びアンチセンス配列が列記されている。ヒトＭＡＲＣ１転写産物（配列番号１）内の各配列ファミリーのｓｉＲＮＡ分子によって標的化されるヌクレオチドの範囲も表１に示される。二重鎖番号Ｄ－１０００～Ｄ－１００３は、Ｍａｒｃ１マウス転写産物を標的化するように設計されており、ヒトＭＡＲＣ１転写産物と交差反応しない。表２は、化学修飾を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を提供する。それぞれ実施例３及び４に記載されるインビトロ細胞ベースアッセイ及びインビボマウス試験の活性に基づき、ヒトＭＡＲＣ１転写産物の特定の領域を標的化する配列を構造活性相関（ＳＡＲ）試験用に選択した。ヌクレオチド配列を以下の表記法に従って列挙する：ａ、ｕ、ｇ及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；並びにｉｎｖＡｂ＝逆位脱塩基デオキシヌクレオチド（すなわち鎖の３’末端上にあるときにはその３’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合するか（３’－３’結合）又は鎖の５’末端上にあるときにはその５’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合した（５’－５’ヌクレオチド間結合）脱塩基デオキシヌクレオチド）。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって連結されることを示す。別段の指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって連結される。［ＧａｌＮＡｃ３］は、式ＶＩＩに示されるＧａｌＮＡｃ部分を表し、「ｓ」が［ＧａｌＮＡｃ３］表記に続く場合、センス鎖の５’末端でホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合を介して５’末端ヌクレオチドに共有結合されている。ｉｎｖＡｂヌクレオチドがセンス鎖の５’末端の５’末端ヌクレオチドであった場合、これは５’－５’連結を介して隣接するヌクレオチドに連結し、ＧａｌＮＡｃ部分はｉｎｖＡｂヌクレオチドの３’炭素に共有結合した。一方で、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’炭素に共有結合した。
実施例３．細胞ベースアッセイにおけるｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子のインビトロ評価
実施例２に記載されるバイオインフォマティクス解析から優先順位を付けられた様々な配列を有するｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子を、ＲＮＡ ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）アッセイを用いてヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡを低減させる有効性に関してスクリーニングした。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣより購入した）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＡＴＣＣ ３０－２００３）中で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたリバーストランスフェクションによってｓｉＲＮＡを細胞内にトランスフェクトした。ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子を、１０点用量反応フォーマット、３倍希釈、５００ｎＭ～２５ｐＭ（実施１）、２５ｎＭ～１ｐＭ（実施２）又は１００ｎＭ～５ｐＭ（実施３）の範囲、最終濃度で試験した。１μＬの試験ｓｉＲＮＡ分子又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル及び４μＬのベースＥＭＥＭ（補充なし）を、Ｂｒａｖｏ自動液体処理プラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってＰＤＬコーティングしたＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－３８４ Ｕｌｔｒａアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に添加した。続いて、補充なしのベースＥＭＥＭに前希釈した５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（５μＬのＥＭＥＭ中０．０３５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ試薬分注器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってアッセイプレート中に分注した。室温（ＲＴ）でｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉＭＡＸ混合物を２０分インキュベートした後、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ－Ｓを補充したＥＭＥＭ中の３０μＬのＨｅｐ３Ｂ細胞（１ウェルあたり２０００個の細胞）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ試薬分注器を使用してトランスフェクション複合体に添加した。アッセイプレートを、インキュベーターに入れる前にＲＴで２０分間インキュベートした。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイを、自社内で組み立てた自動ＦＩＳＨアッセイプラットフォーム上で、製造者のアッセイ試薬及びプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）ＶｉｅｗＲＮＡ ＨＣ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ）を用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクションから７２時間後に実施した。簡潔に言えば、細胞を４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＲＴにおいて１５分間固定して、界面活性剤によりＲＴにおいて３分間透過処理してから、プロテアーゼ溶液によりＲＴで１０分間処理した。標的特異的プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はビヒクル（陰性対照として標的プローブを含まない標的プローブ希釈剤）を３時間インキュベートし、一方でプリアンプリファイアー、アンプリファイアー及び標識プローブを各１時間インキュベートした。全てのハイブリダイゼーション工程を、Ｃｙｔｏｍａｔ ２ Ｃ－ＬＩＮ自動インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で４０℃において実施した。ハイブリダイゼーション反応後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ及びＣｅｌｌＭａｓｋ Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色してから、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントスクリーニングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化した。画像を、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ｉｍａｇｅ ｄａｔａ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析して、１細胞あたりの平均スポット数を得た。高（標的プローブを含むＰＢＳ）及び低（標的プローブを含まないＰＢＳ）対照ウェルを用いて、１細胞あたりの平均スポット数を正規化した。総ｓｉＲＮＡ濃度に対して正規化された値をプロットして、データを、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒデータ分析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｄａｔａ）を用いて４パラメータのシグモイドモデルに当てはめて、ＩＣ５０及び最大活性値を得た。データをモデルに当てはめることができなかった場合、ＩＣ５０値は計算されず、最大活性値のみが報告された。
最初に、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子を、１回目の実施で５００ｎＭ～２５ｐＭにわたる１０種類の異なる濃度でスクリーニングした。１回目の実施で有意な活性を示したｓｉＲＮＡ分子を、２回目及び３回目の実施で、より狭い濃度範囲にわたる１０種類の異なる濃度（実施２：２５ｎＭ～１ｐＭ；実施３：１００ｎＭ～５ｐＭ）でスクリーニングした。３回の実施の全てのアッセイの結果を下記の表３に示す。
ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイで評価した最初の２５７種類のｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子のうち、７４種類の分子が、アッセイ実施２及び３において平均で８０％以上のヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡのノックダウンを示し、少なくとも１桁のナノモル範囲のＩＣ５０値を有した。特に３２種類の分子（二重鎖番号Ｄ－１０９２；Ｄ－１０９３；Ｄ－１１３９；Ｄ－１０６１；Ｄ－１１３８；Ｄ－１０９５；Ｄ－１１９１；Ｄ－１１８０；Ｄ－１０９０；Ｄ－１０６２；Ｄ－１１７７；Ｄ－１０８３；Ｄ－１２４５；Ｄ－１０６７；Ｄ－１１４３；Ｄ－１１７０；Ｄ－１０４４；Ｄ－１０９６；Ｄ－１１１３；Ｄ－１０８６；Ｄ－１２５６；Ｄ－１１８９；Ｄ－１０９１；Ｄ－１１７４；Ｄ－１１８５；Ｄ－１０６６；Ｄ－１１７１；Ｄ－１１４０；Ｄ－１１３０；Ｄ－１０６８；Ｄ－１２４３；Ｄ－１０７４）は、アッセイ実施２及び３の１つ又は両方でヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡを少なくとも８５％減少させた。
第２の一連の実験では、追加のｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子をＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイにおいて１００ｎＭ～５ｐＭの範囲内の１０種類の異なる濃度で評価し、ＩＣ５０及び最大活性値を上記の通りに計算した。この第２の一連の実験からのアッセイの結果を下記の表４に示す。アッセイを、分子のサブセットに対して繰り返した。こうした分子に関し、両方の実施のＩＣ５０及び最大活性値を示す。
ヒトｍＡＲＣ１転写産物の異なる領域を標的化する追加の４０６種類のｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子のうち、１２８種類の分子が、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中でヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡを８５％以上低減させた。４６種類の分子（二重鎖番号Ｄ－１０６１；Ｄ－１０９３；Ｄ－１２２０；Ｄ－１２７６；Ｄ－１２８４；Ｄ－１２９８；Ｄ－１３１０；Ｄ－１３１１；Ｄ－１３３８；Ｄ－１３６３；Ｄ－１３６７；Ｄ－１３７５；Ｄ－１３８１；Ｄ－１３８２；Ｄ－１３８３；Ｄ－１３８６；Ｄ－１３８７；Ｄ－１３８８；Ｄ－１３８９；Ｄ－１３９０；Ｄ－１３９６；Ｄ－１４００；Ｄ－１４０１；Ｄ－１４０２；Ｄ－１４０５；Ｄ－１４０７；Ｄ－１４１６；Ｄ－１４２０；Ｄ－１４２１；Ｄ－１４４１；Ｄ－１４５１；Ｄ－１４８７；Ｄ－１４８９；Ｄ－１４９１；Ｄ－１５０３；Ｄ－１５０４；Ｄ－１５１５；Ｄ－１５４９；Ｄ－１５７６；Ｄ－１５８１；Ｄ－１５９５；Ｄ－１５９６；Ｄ－１６０６；Ｄ－１６２６；Ｄ－１６３３；及びＤ－１６６２）が、ヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡを少なくとも９０％減少させ、分子の大半が１ｎＭ未満のＩＣ５０値を有した。
実施例４．ＡＡＶヒトｍＡＲＣ１マウスモデルにおけるｓｉＲＮＡ分子のインビボ有効性
インビボでのｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の有効性を評価するために、実施例２に記載される方法によって各ｓｉＲＮＡ分子中のセンス鎖を式ＶＩＩに示す三価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートし、ヒトＭＡＲＣ１遺伝子を発現するマウスにｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子を投与した。１０～１２週齢のｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、標準固形飼料（Ｈａｒｌａｎ、２０２０×Ｔｅｋｌａｄ ｇｌｏｂａｌ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ）を与えた。マウスに、ヒトＭＡＲＣ１遺伝子をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ＡＡＶ－ｈｍＡＲＣ１）を１動物あたり１×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＡＶ－ｈｍＡＲＣ１の注射から１週間後、マウスに、緩衝液又は緩衝液中に体重１ｋｇあたり０．５ｍｇ、１ｍｇ又は３ｍｇの用量のｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の単回皮下（ｓ．ｃ．）注射を投与した（各群でｎ＝３）。動物を絶食させ、ｓｉＲＮＡの投与から４週間後に捕獲して更に分析した。捕獲された動物由来の肝臓の全ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために処理し、血清のパラメータを臨床分析装置（ＡＵ４００ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって測定した。各動物の肝臓中のヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡのパーセンテージ変化を、ヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡを発現し、且つ緩衝液のみの注射を投与された対照動物（すなわちＡＡＶ－ｈｍＡＲＣ１のみ動物）中のヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡ肝臓レベルと比較して計算した。
実施例３に記載されるインビトロ活性アッセイから最も性能の高いｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子を、このモデルにおけるインビボ有効性に関して評価した。化学修飾パターンを変えることによりインビボ効力及び耐性を更に改善するために、有意なインビボノックダウン活性を示したｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子をＳＡＲ研究で更に評価した。異なるｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子を有するＡＡＶ－ｈｍＡＲＣ１マウスモデルにおける１８種類の個別の研究結果を、下記の表５～２２に示す。データは、各処置群の研究の５週目における（ｓｉＲＮＡ注射から４週間後）対照からの平均パーセント変化として表す（ｎ＝３動物／群）。ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子が別のｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子と同じトリガファミリー指定を有する場合、２つの分子は同じコア配列を有する（すなわちｍＡＲＣ１転写産物の同じ領域を標的化する）が、化学修飾パターンが異なる。
早期のインビボ研究で有意なサイレンシング活性を示した２つのｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号Ｄ－２０４２及びＤ－２０８１）を、後期のインビボ研究でベンチマーク化合物として使用した。７０種類のｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子は、１ｍｇ／ｋｇの用量で単回ｓ．ｃ．注射してから４週間後、ＡＡＶ－ｈｍＡＲＣ１マウスにおけるヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡを７５％以上低減させた。Ｄ－２０８１、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２５５及びＤ－２２５８を含む、試験されたｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子のいくつかは、特に効力が高く、これは、単なる０．５ｍｇ／ｋｇの単回ｓ．ｃ．注射から４週間後、ヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡが８５％以上低減したことによって証明される通りである。更に、ヒトｍＡＲＣ１転写産物の特定の領域を標的化するｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子は、転写産物の他の領域を標的化するｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子と比較して、インビボでヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡを更に大きく低減させることが観察された。例えば、ヌクレオチド１２０５～１２５０、ヌクレオチド１３４５～１３７５又はヌクレオチド２０３９～２０７８にヒトｍＡＲＣ１転写産物の領域に相補的な配列（配列番号１）を有するアンチセンス鎖を含むｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子は、１ｍｇ／ｋｇの単回ｓ．ｃ．注射から４週間後に有意なノックダウン活性を示した（表２３）。表２３は、同じ化学修飾パターンを有し、指定されたヌクレオチド範囲においてヒト転写産物を標的化するｓｉＲＮＡ分子に関する上記の研究からのヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡ肝臓レベルの平均パーセント変化を要約する。ヌクレオチド１２１１～１２３６のヒト転写産物を標的化するｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子は、１ｍｇ／ｋｇのこうしたｓｉＲＮＡ分子の単回ｓ．ｃ．用量の投与により、投与後少なくとも４週間でヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルが８０％超低下したため、特に効果的であった。
実施例５．マウスモデルでのＮＡＳＨの治療におけるｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡの有効性
ｍＡＲＣ１発現の阻害が脂肪肝疾患に対して治療的となり得るかどうかを判断するために、０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３食餌）が与えられたマウスに、マウスＭａｒｃ１遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ分子又は対照ｓｉＲＮＡ分子を投与した。ＴＤ１９０８８３食餌は、０．２％のコレステロール、２０％のフルクトース、１２％のスクロース及び２２％の硬化植物油（ＨＶＯ）を含有する。類似する食餌が、その食餌を数週間にわたり与えられたマウスにおけるＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの特徴を誘導することが示されている（例えば、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１０１：５２２－５３５，２０２０及びＫｒｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ．Ｖｏｌ．２０２０：７３４７０６８，２０２０，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０２０／７３４７０６８を参照されたい）。
６週齢の雄ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、標準固形飼料（Ｈａｒｌａｎ、２０２０×Ｔｅｋｌａｄ ｇｌｏｂａｌ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ）又は０．２％コレステロール食餌（ＴＤ１９０８８３，Ｅｎｖｉｇｏ）を与えた。０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスに、２４週間にわたり２週間に１回、皮下注射で、０．２ｍｌ緩衝液中の緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）のみ、ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１０００）又は対照ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号Ｄ－１００２）を、体重１ｋｇあたり３ｍｇで投与した。実施例２で説明するように、ｓｉＲＮＡ分子を合成して、三価ＧａｌＮＡｃ部分（下記の式ＶＩＩに示す構造）にコンジュゲートさせた。ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの構造を表１及び２に示す。動物を絶食させ、第２４週に捕獲して更に分析した。捕獲された動物由来の肝臓の全ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために処理し、血清のパラメータを臨床分析装置（ＡＵ４００ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって測定した。ｍＲＮＡレベルを、最初に各肝臓試料中の１８ＳリボソームＲＮＡレベルに正規化し、続いて固形飼料対照群の発現レベルと比較した。データは、固形飼料対照群における発現に対する相対的倍数として示した。肝臓組織を均質化し、イソプロパノールによって抽出して、総コレステロール及び総トリグリセリドを測定した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｉｎｆｉｎｉｔｙコレステロール及びＩｎｆｉｎｉｔｙトリグリセリド）。全ての動物の飼育条件及び研究プロトコルが、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。マウスを、換気マイクロアイソレーター内の無菌ＡＡＡＬＡＣ国際認可施設で飼育した。手順及び飼育部屋は陽圧にし、１２：１２の暗：明サイクルで調節した。自動給水システムを介して全ての動物に逆浸透精製水を自由に与えた。
０．２％コレステロール食餌を供給されたマウスでは、ｍＡＲＣ１及びｍＡＲＣ２の両方の肝臓発現が低減した。ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡで処置した動物では、ｍＡＲＣ１発現は更に低減したが、ｍＡＲＣ２発現は更に低減しなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。予期された通り、０．２％コレステロール食餌を与えられたマウスは、研究中、肝臓酵素（ＡＳＴ及びＡＬＴ）、コレステロール、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）及びＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）の血清中レベルが増加した（図６Ａ～６Ｅ）。ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡでの処置は、食餌誘発性の血清コレステロール、ＬＤＬ－Ｃ及びＨＤＬ－Ｃ増加を低減させた（図６Ｃ～６Ｅ）。ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ処置は、更に、食餌誘発性の肝臓酵素の血清中レベルを減少させる傾向を示した（図６Ａ～６Ｂ）。０．２％コレステロール食餌を与えられた動物は、２４週間後に体重及び肝重量が増加した（図７Ａ及び７Ｂ）。０．２％コレステロール食餌を与えられた動物では、２４週間で肝臓中のトリグリセリド及びコレステロールレベルも増加した（図７Ｃ及び７Ｄ）。ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ処置は、食餌誘導性の体重、肝重量、肝トリグリセリドレベル又は肝コレステロールレベルの増加を有意には低減させなかった（図７Ａ～７Ｄ）。
要約すると、この研究の結果は、ｍＡＲＣ１標的化ｓｉＲＮＡ分子でｍＡＲＣ１肝臓発現を阻害することにより、ＮＡＳＨのマウスモデルにおける血清コレステロール、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及び肝臓酵素が低減することを示し、これは、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子がこの疾患及び他の脂肪肝障害を治療するための新規な治療的アプローチになり得ることを示唆する。
実施例６．ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の効力に対するミスマッチの影響
ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の効力に対する塩基対ミスマッチの影響を評価するために、最も効力の高いｓｉＲＮＡ分子のサブセットの類似体をアンチセンス鎖の５’末端から６又は８位において異なるヌクレオチドを有して、アンチセンス鎖がｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡ転写産物のその標的領域にハイブリダイズされると、その位置に塩基対ミスマッチが生成されるように合成した。しかし、各類似体において、センス鎖の配列は、アンチセンス鎖の配列に完全に相補的となるように設計されていたため、ｓｉＲＮＡ二重鎖中のセンス鎖とアンチセンス鎖との間にミスマッチが生成されなかった。各ミスマッチ類似体（二重鎖番号Ｄ－２５１４～Ｄ－２５６１）及び親ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号Ｄ－２０５２、Ｄ－２０７２、Ｄ－２０７６、Ｄ－２０７７、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１０５、Ｄ－２１０８、Ｄ－２１１１、Ｄ－２１１３、Ｄ－２１１５、Ｄ－２１１８、Ｄ－２１４２、Ｄ－２１３６、Ｄ－２１８９、Ｄ－２１９６、Ｄ－２２３８、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２５４、Ｄ－２２５８、Ｄ－２３０１、Ｄ－２４６２、Ｄ－２４６５及びＤ－２５１０）の未修飾配列及び修飾配列を、表１及び２にそれぞれ提供する。上記の実施例３に記載されるインビトロＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイを用いて、ヒトｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルの低減におけるミスマッチ類似体及び親ｓｉＲＮＡ分子の有効性を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中で評価した。ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの１００ｎＭ～５ｐＭの範囲にわたる１０種類の異なる濃度を試験し、実施例３に記載される用量反応曲線からＩＣ５０及び最大活性値を計算した。これらのアッセイの結果を下の表２４に示す。
大半の分子では、アンチセンス鎖のシード領域内に位置する６位又は８位におけるミスマッチは、アンチセンス鎖が標的のｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡ配列に対して完全に相補的であった親分子と比較して、ｓｉＲＮＡ分子の最大のノックダウン活性又は効力に有意な影響を及ぼさなかった。アンチセンス鎖のシード領域（すなわち５’末端からヌクレオチド２～８）は、オンターゲット有効性に重要であると考えられているため、これらの結果は、いくらか驚くべきものである。
実施例７．非ヒト霊長類におけるｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子のインビボ有効性
３つの異なるｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号Ｄ－２２４１、Ｄ－２０８１又はＤ－２２５８）の有効性及び薬物動態プロファイルを、カニクイザルにおいて評価した。３つの異なるｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれは、カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＭＡＲＣ１遺伝子と交差反応したアンチセンス鎖配列を有した。モーリシャス国生まれの雌の治療未経験カニクイザル、２２～４８月齢を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した。動物（ｎ＝３／処置群）の肩甲部及び背中中央部に、１×リン酸緩衝生理食塩水中に配合した二重鎖番号Ｄ－２２４１、Ｄ－２０８１又はＤ－２２５８のいずれかのＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の単回３ｍｇ／ｋｇ皮下（ｓ．ｃ．）注射を投与した。以下の投与後の時点で採取した全血から血清を調製した：０．０８３、０．２５、１、２、４、２４、２８、９６、１６８、２６４、３３６、４５６、５２８、５７６、７２０、８６４及び１０５６時間。処置前（１３日前又は７日前のいずれか）並びに投与後１４日及び３０日に、外科的肝生検（左右の１肝葉あたり約１００ｍｇの組織）を麻酔下で採取した。投与後４４日目に肝試料を解剖採取した。
血清及び肝臓の薬物動態
各ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の血清及び肝臓の薬物動態プロファイルを決定するために、単回の３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子で処置した後の様々な時点で採取した血清及び肝臓の試料を、Ｔｈａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．１０（１）：１０４２５，２０２０に記載されるものと類似したプレートベースのオリゴヌクレオチド電気化学発光（ＰＯＥ）イムノアッセイを用いて、各ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子（アンチセンス鎖及びセンス鎖）に関して分析した。オリゴヌクレオチド捕捉（ビオチン）及び検出（ジゴキシゲニン）プローブは、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からカスタム合成した。その配列を下記の表２５に列挙する。肝臓試料を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１００ｎＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００及びＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（１１８３６１７０００１）を含有する溶解緩衝液中で、最終濃度が２００ｍｇ／ｍＬになるまで均質化した。生物分析のために、ＧａｌＮＡｃ－ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ標準を、０．１３～２５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって血清又は肝臓ホモジェネート中にスパイクした。続いて、標準及び生体試料を９６ウェルのＰＣＲプレート中で１：１０に希釈して、最終体積を５０μＬにした。オリゴヌクレオチド捕捉及び検出プローブを、６０ｍＭのＮａ２ＰＯ４（ｐＨ７．０、二塩基性）、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０からなるハイブリダイゼーション緩衝液中で調製した。プローブを合わせ、最終濃度１０ｎＭでＰＣＲプレートに添加し、合計試料体積を１ウェルあたり１００μＬにした。ハイブリダイゼーションを、サーマルサイクラーを用いて以下の条件下で実施した：９０℃で５分間、４０℃で３０分間及び１２℃で最終保持。ハイブリダイゼーション後、４５μＬの試料を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のＬＬＣ ＭＳＤ Ｇｏｌｄ ９６－ｗｅｌｌ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＳＥＣＴＯＲ ｐｌａｔｅ（Ｌ１５ＳＡ）に移し、振盪させながら室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＳｅｒＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １Ｘ ＫＰＬイムノアッセイ洗浄液（５１５０－００１１）で洗浄した。洗浄後、プレートを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０ ＴＢＳブロッキング緩衝液（３７５３６）中に希釈した５０μＬの０．５μｇ／ｍＬのルテニウム標識化抗ジゴキシゲニン抗体と共に１時間インキュベートした。最終洗浄を実施した後、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製ＬＬＣ １Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔ（Ｒ９２ＴＣ；１５０μＬ）を添加し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製ＬＬＣ Ｍｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ ６００計器上で読み取った。Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ生物学的分析ソフトウェアのバージョン７．５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で、４パラメータロジスティックモデル及び１／Ｙ２の重み付け係数を用いて、ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子の血清及び肝臓濃度を標準曲線から補間した。肝臓濃度は、２００ｍｇ／ｍＬで割ることによってｎｇ／ｍＬ単位からｎｇ／ｍｇ単位に変換した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアのバージョン８．３．２．１１６（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）内でノンコンパートメント解析を用いて、投与から０．０８３～２４時間後の血清薬物動態パラメータを決定した。
３つの異なるｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれに関するアンチセンス鎖及びセンス鎖濃度の血清濃度－時間プロファイルを図８Ａ～８Ｆに示す。表２６に要約される通り、血清中の平均最大観察アンチセンス鎖濃度（Ｃｍａｘ）は、投与から２．０～４．０時間後にＤ－２２４１、Ｄ－２２５８及びＤ－２０８１でそれぞれ５１１、４９６及び３２１ｎｇ／ｍＬであった。血清アンチセンス鎖の用量投与開始から投与後２４時間までの濃度時間曲線下平均面積（ＡＵＣ０～２４時間）は、Ｄ－２２５８、Ｄ－２２４１及びＤ－２０８１でそれぞれ６３９９、５０４０及び４１３７ｈ＊ｎｇ／ｍＬであった。二重鎖番号Ｄ－２２５８のセンス鎖対アンチセンス鎖の血清濃度の比は、注射部位において又は体循環中で生じる可能性のある、鎖分離を有する二重鎖の潜在的な不安定性を示す。投与後１４、３０及び４４日目のアンチセンス鎖及びセンス鎖のｓｉＲＮＡ肝臓濃度を表２７で報告する。１４日目の肝臓アンチセンス鎖濃度は、二重鎖番号Ｄ－２０８１で最も高く、続いてＤ－２２４１、その次がＤ－２２５８である。血清薬物動態プロファイルと一致して、二重鎖番号Ｄ－２２５８のセンス鎖及びアンチセンス鎖の肝臓濃度の比は、鎖分離を示す。
肝臓ｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡサイレンシング
３つのＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号Ｄ－２２４１、Ｄ－２０８１及びＤ－２２５８）を、カニクイザルの肝臓中の３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量後のｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルのノックダウンにおける有効性に関して評価した。ＲＮＡを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭａｇＭＡＸ－９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＭ１８３０）を用いて急速冷凍した肝臓から精製し、その試料完全性（２６０／２８０比）及びＲＮＡ濃度を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（ＮＤ－２０００）で決定した。ワンステップ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（４３９２９３８）を用いて実施した。５０ｎｇのＲＮＡテンプレートを、２×ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍｉｘ、４０×ＴａｑＭａｎ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、２０×ｍＡＲＣ１プライマー／プローブ（ＩＤＴ、フォワードプライマー５’－ＴＴＣＡＧＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴ ＣＴＡＴＧＣ－３’（配列番号３６７１）、リバースプライマー５’－ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＴＴ－３’（配列番号３６７２）、プローブ５’－／５６－ＦＡＭ／ＡＧＣＣＧＣＴＧＧ（配列番号３６７３）／ＺＥＮ／ＡＡＡＣＡＣＴ ＧＡＡＧＡＧＴＴ（配列番号３６７４）／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’）及び２０×グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプライマー／プローブ（ＧＡＰＤＨ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｆ０４３９２５４６＿ｇ１ ＶＩＣ－ＭＧＢ）と混合することにより、反応を９６ウェルＰＣＲプレート中で組み合わせた。ＲＴ－ＰＣＲを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（４４８５７０１）を用いて、以下の条件下で実施した：４８℃で３０分間及び９０℃で１０分間、続いて９０℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクル。ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の濃度にわたる目的の遺伝子（ｍＡＲＣ１）の濃度の比を取ることによって各試料のｍＲＮＡ発現を正規化した。続いて、１処置群あたりの各動物複製に関して処置前（－１３又は－７日目）の時点と比較したｓｉＲＮＡ投与後（１４、３０及び４４日目）のｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現の割合（％）を計算し、これを処置前の残存％として表した。最終的に、ｍＡＲＣ１ ｍＲＮＡ転写産物のサイレンシング割合（％）を、１００％から処置前の残存％値を減算することによって計算した。ｍＲＮＡの処置前の残存％値及びサイレンシング％値の両方を下記の表２８に要約する。二重鎖番号Ｄ－２２４１が、試験された最も効力の高いＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子であり、これは、単回皮下注射後１４、３０及び４４日目にカニクイザルのｍＡＲＣ１肝臓ｍＲＮＡを、処置前の＜２０％残存まで減少させた（＞８０％サイレンシング）。
肝臓ｍＡＲＣ１タンパク質サイレンシング
３つのＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｍＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号Ｄ－２２４１、Ｄ－２０８１及びＤ－２２５８）の、カニクイザルの肝臓中の３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量後のｍＡＲＣ１タンパク質レベルのノックダウンにおける有効性も評価した。急速冷凍した肝臓組織を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ａ３２９６３）を含有するＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ製ＮＰ－４０溶解緩衝液（ＢＰ－１１９）中で、２００ｍｇ／ｍＬで均質化した。続いて、ホモジェネートを、４℃で１０分間、１０，０００×ｇでスピンダウンし、上清を、２ｍＬの９６ディープウェルプレートに移した。上清を、室温で１５分間インキュベートし、１４００ｒｐｍで振盪しながら、メタノール中１％トリフルオロ酢酸で処理した。沈殿したタンパク質を４，０００ｒｐｍで１５分間かけてペレット化し、ここから上清を吸引し、ペレットをメタノールで２回洗浄した。得られたタンパク質を、１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，７７７２０）及び８Ｍの尿素を含有する溶液中で、３７℃で３０分間還元して変性させた。続いて、ヨードアセトアミド（２０ｍＭ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３９２７１）を、２０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液中の試料に添加し、室温で３０分間インキュベートした。３０μｇのトリプシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ９００５８）及び１０ｐｍｏｌの安定な同位体標識（ＳＩＬ）ペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製カスタムペプチド；
）を添加して、トリプシン消化３７℃で終夜を実施した。２０％のギ酸で消化反応を停止させ、試料を固相抽出（ＳＰＥ）脱塩用に調製した（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，１８６００８０５２）。試料を投入する前に、ＳＰＥプレートをメタノールでコンディショニングし、１％アセトニトリルで１回洗浄した。コンディショニング化したＳＰＥプレートに試料を添加し、７０％アセトニトリルを用いて分析物を溶出した。溶出液を、ｐＨ１０で１０ｍＭギ酸アンモニウム中に再懸濁し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏ－ｉｎｅｒｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ－ｓｃａｌｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｇ５６６４Ａ）に注入した。分画した試料（１１回目の分画）を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（ＭＳ）に接続したＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００超高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）システム上で分析するために、０．１％ギ酸溶液中に再懸濁した。ＬＣ法は、以下の通り実施した：４５℃のカラム温度で、３％アセトニトリル／水（８μＬ／分）及び１．０～１２．１分間にわたる３．０～３６％アセトニトリル／水の分析的勾配（３５０ｎＬ／分）でトラッピングする。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ計器上で並発反応監視実験を実施し、軽標識ペプチド及び重標識ペプチドのＳＰＬＦＧＱＹＦＶＬＥＮＰＧＴＩＫ（配列番号３６７５）（ｍ／ｚ＝９５５．５０６６で）、及び
（ｍ／ｚ＝９５９．５１３７で）をそれぞれ監視した。続いて、データをＳｋｙｌｉｎｅ ２１．１ソフトウェアにインポートし（Ｐｉｎｏ ＬＫ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｓｋｙｌｉｎｅ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ．２０２０ Ｍａｙ；３９（３）：２２９－２４４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍａｓ．２１５４０．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｌ ９）、ここで各試料からのＳＰＬＦＧＱＹＦＶＬＥＮＰＧＴＩＫ（配列番号３６７５）ペプチドのピーク面積を、スパイクインしたＳＩＬペプチド
のピーク面積に対して正規化した。ＧＡＰＤＨハウスキーピングタンパク質の測定を、同じ開始組織ホモジェネートを用いて実施し、氷冷アセトンで沈殿させ、続いて１２５０ｒｐｍで１０分間混合し、３２２０×ｇで１５分間遠心分離した。上清を吸引して、タンパク質のペレットをメタノールで洗浄し、１０μｇのトリプシンを含有する５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液に溶解し、１０００ｒｐｍで混合しながら３７℃で終夜消化した。２０％のギ酸で消化反応を停止させ、５８８．６１及び７４３．３５ｍ／ｚでＧＡＰＤＨペプチド：ＬＩＳＷＹＤＮＥＦＧＹＳＮＲ（配列番号３６７６）を監視するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注入した。ＧＡＰＤＨペプチドのピーク面積を、ＳＣＩＥＸ Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを用いて積分した。ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の濃度にわたる、ＳＩＬペプチドに対して決定した目的の遺伝子（ｍＡＲＣ１）の濃度の比を取ることによって各試料のタンパク質発現を正規化した。続いて、１処置群あたりの各動物複製に関して処置前（－１３又は－７日目）の時点と比較したｓｉＲＮＡ投与後（１４、３０及び４４日目）のｍＡＲＣ１タンパク質発現の割合（％）を計算し、これを処置前の残存％として表した。最終的に、ｍＡＲＣ１タンパク質発現のサイレンシング割合（％）を、１００％から処置前の残存％値を減算することによって計算した。タンパク質の処置前の残存％値及びサイレンシング％値の両方を表２９に要約する。二重鎖番号Ｄ－２０８１は、投与後１４日目にカニクイザルｍＡＲＣ１肝臓タンパク質発現の低減が最も大きく、単回の皮下注射後にサイレンシングが８９±０．７１％であった。投与後３０日目に、二重鎖番号Ｄ－２０８１及びＤ－２２４１は、タンパク質発現を処置前の＜２０％残存まで低減させ、サイレンシングはそれぞれ８２±７．８％及び８７±１１％であり、これは投与後４４日目までに維持されたか又は増加した。
本明細書において論じ、引用してきた全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは、変化し得ることが理解される。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
当業者は、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、単なる日常的な実験を使用して認識するか又は確認可能であろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (97)

  1. センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、ｍＡＲＣ１のｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含み、前記領域は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉコンストラクト。
  2. 前記センス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するために、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  3. 前記二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である、請求項２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  4. 前記二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である、請求項２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  5. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１９～約３０ヌクレオチド長である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  6. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１９～約２３ヌクレオチド長である、請求項５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  7. １つ又は２つの平滑末端を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  8. １～４つの不対ヌクレオチドの１つ又は２つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  9. 前記ヌクレオチドオーバーハングは、２つの不対ヌクレオチドを有する、請求項８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  10. 前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項８又は９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  11. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  12. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチドである、請求項１１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  13. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド又はこれらの組み合わせである、請求項１１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  14. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全ては、修飾ヌクレオチドである、請求項１１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  15. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである、請求項１４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  16. 前記センス鎖は、その３’末端、その５’末端又はその３’末端及び５’末端の両方において、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  17. 前記脱塩基ヌクレオチドは、３’－３’ヌクレオチド間結合又は５’－５’ヌクレオチド間結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合されている、請求項１６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  18. 前記センス鎖、前記アンチセンス鎖又は前記センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  19. 前記アンチセンス鎖は、３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  20. 前記センス鎖は、３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１８又は１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  21. 前記センス鎖は、３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１８又は１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  22. 前記アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列から選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  23. 前記アンチセンス鎖は、配列番号７１５、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３８、配列番号７５４、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８１４、配列番号８４１、配列番号８４８、配列番号８５１、配列番号８６２、配列番号９１６、配列番号１０５７、配列番号１０７８、配列番号２９１９、配列番号２９２６、配列番号２９４６、配列番号２９４９、配列番号２９５３及び配列番号２９５６から選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  24. 前記センス鎖は、表１又は表２に列記されるセンス配列から選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  25. 前記センス鎖は、配列番号４６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６９、配列番号８５、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１７２、配列番号１７９、配列番号１８２、配列番号１９３、配列番号２４７、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号４０９、配列番号２８０８及び配列番号２８２０から選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項２４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  26. （ｉ）前記センス鎖は、配列番号４６の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７１５の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｉ）前記センス鎖は、配列番号６３の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７３２の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｉｉ）前記センス鎖は、配列番号６４の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７３３の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｖ）前記センス鎖は、配列番号６９の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７３８の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖ）前記センス鎖は、配列番号８５の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７５４の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉ）前記センス鎖は、配列番号９２の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７６１の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉｉ）前記センス鎖は、配列番号９４の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７６３の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉｉｉ）前記センス鎖は、配列番号９５の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７６４の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｘ）前記センス鎖は、配列番号９７の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号７６６の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘ）前記センス鎖は、配列番号１４０の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号８０９の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘｉ）前記センス鎖は、配列番号１４１の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号８１０の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘｉｉ）前記センス鎖は、配列番号１４５の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号８１４の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘｉｉｉ）前記センス鎖は、配列番号１７２の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号８４１の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘｉｖ）前記センス鎖は、配列番号１７９の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号８４８の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘｖ）前記センス鎖は、配列番号１８２の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号８５１の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘｖｉ）前記センス鎖は、配列番号１９３の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号８６２の配列を含むか又はそれからなるか、又は
    （ｘｖｉｉ）前記センス鎖は、配列番号２４７の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号９１６の配列を含むか又はそれからなる、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  27. （ｉ）前記センス鎖は、配列番号４０９の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号１０７８の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｉ）前記センス鎖は、配列番号３８８の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号１０５７の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｉｉ）前記センス鎖は、配列番号２８０８の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号２９２６の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｖ）前記センス鎖は、配列番号２８２０の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号２９４６の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖ）前記センス鎖は、配列番号３９１の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号２９４９の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉ）前記センス鎖は、配列番号３９０の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号２９５６の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉｉ）前記センス鎖は、配列番号１７９の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号２９１９の配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉｉｉ）前記センス鎖は、配列番号３８８の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号２９５３の配列を含むか又はそれからなるか、又は
    （ｉｘ）前記センス鎖は、配列番号３８８の配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号１０５７の配列を含むか又はそれからなる、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  28. （ｉ）前記センス鎖は、配列番号３０７８による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３３３７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｉ）前記センス鎖は、配列番号３０８０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３３３９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｉｉ）前記センス鎖は、配列番号３１６３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３４４１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｖ）前記センス鎖は、配列番号３１８３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３４６９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖ）前記センス鎖は、配列番号３０７６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３４７２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉ）前記センス鎖は、配列番号３０７７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３４８４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉｉ）前記センス鎖は、配列番号２０５１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３５４５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｖｉｉｉ）前記センス鎖は、配列番号３０８０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３４８１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｉｘ）前記センス鎖は、配列番号３１８８による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３３３９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、
    （ｘ）前記センス鎖は、配列番号３０８０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３４７６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるか、又は
    （ｘｉ）前記センス鎖は、配列番号３２２３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなり、及び前記アンチセンス鎖は、配列番号３５１７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなる、請求項２７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  29. 表１～２４に列記される二重鎖化合物のいずれか１つである、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  30. Ｄ－２０７８、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１８２、Ｄ－２１９６、Ｄ－２２３８、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２４３、Ｄ－２２４６、Ｄ－２２５５、Ｄ－２２５８、Ｄ－２３０１、Ｄ－２３１６、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３２９、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３４１、Ｄ－２３４４、Ｄ－２３５６、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３９９又はＤ－２５１０である、請求項２９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  31. Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１９６、Ｄ－２２３８、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２５５、Ｄ－２２５８、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３５７又はＤ－２３９９である、請求項３０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  32. 細胞中でヒトＭＡＲＣ１遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクトであって、ハイブリダイズして約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１２０５～１２５０の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクト。
  33. 前記アンチセンス鎖の前記領域は、配列番号１のヌクレオチド１２０９～１２３９の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を含む、請求項３２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  34. 前記アンチセンス鎖の前記領域は、ＣＡＵＣＵＡＡＵＡＵＵＣＣＡＧ（配列番号３６５６）の配列を含む、請求項３２又は３３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  35. Ｄ－２０６３、Ｄ－２０６６、Ｄ－２０７６、Ｄ－２０７７、Ｄ－２０７８、Ｄ－２０８０、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１０８、Ｄ－２１１３、Ｄ－２１４２、Ｄ－２２４０、Ｄ－２２４１、Ｄ－２２４３、Ｄ－２２４５、Ｄ－２２４６、Ｄ－２２４８、Ｄ－２２５０、Ｄ－２２５１、Ｄ－２２５３、Ｄ－２２５５、Ｄ－２２５６、Ｄ－２２５８、Ｄ－２２５９、Ｄ－２２６１、Ｄ－２２６４、Ｄ－２２６５、Ｄ－２２６８、Ｄ－２２６９、Ｄ－２２７０、Ｄ－２２７１、Ｄ－２３０１、Ｄ－２３０９、Ｄ－２３１１、Ｄ－２３１２、Ｄ－２３１４、Ｄ－２３１６、Ｄ－２３１７、Ｄ－２３１９、Ｄ－２３２１、Ｄ－２３２２、Ｄ－２３２４、Ｄ－２３２６、Ｄ－２３２７、Ｄ－２３２９、Ｄ－２３３１、Ｄ－２３３２、Ｄ－２３３４、Ｄ－２３３６、Ｄ－２３３７、Ｄ－２３３９、Ｄ－２３４１、Ｄ－２３４２、Ｄ－２３４４、Ｄ－２３４６、Ｄ－２３４７、Ｄ－２３４９、Ｄ－２３５１、Ｄ－２３５２、Ｄ－２３５４、Ｄ－２３５６、Ｄ－２３５７、Ｄ－２３７６、Ｄ－２３８０、Ｄ－２３９３、Ｄ－２３９５、Ｄ－２３９６、Ｄ－２４３１、Ｄ－２４３６、Ｄ－２４３７、Ｄ－２４４０、Ｄ－２４４１、Ｄ－２４４４、Ｄ－２４４５、Ｄ－２４４７、Ｄ－２４５３、Ｄ－２５１８、Ｄ－２５１９、Ｄ－２５２０、Ｄ－２５２１、Ｄ－２５２２、Ｄ－２５２３、Ｄ－２５２４、Ｄ－２５２５、Ｄ－２５２６、Ｄ－２５２７、Ｄ－２５２８、Ｄ－２５２９、Ｄ－２５３０、Ｄ－２５３１、Ｄ－２５３２、Ｄ－２５３３、Ｄ－２５３４又はＤ－２５３５である、請求項３２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  36. Ｄ－２０６３、Ｄ－２０６６、Ｄ－２０７６、Ｄ－２０７７、Ｄ－２０７８、Ｄ－２０８０、Ｄ－２０８１、Ｄ－２１０８、Ｄ－２１１３、Ｄ－２１４２又はＤ－２３０１である、請求項３５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  37. 細胞中でヒトＭＡＲＣ１遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクトであって、ハイブリダイズして約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１３４５～１３７５の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクト。
  38. 前記アンチセンス鎖の前記領域は、ＵＧＧＧＡＣＡＵＵＧＡＡＧＣＡ（配列番号３６５７）の配列を含む、請求項３７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  39. Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４３、Ｄ－２０４７、Ｄ－２０５２、Ｄ－２１５８、Ｄ－２１６２、Ｄ－２１６９、Ｄ－２１８２、Ｄ－２１８３、Ｄ－２１８４、Ｄ－２１８５、Ｄ－２１８６、Ｄ－２１８７、Ｄ－２１８９、Ｄ－２２１１、Ｄ－２２１３、Ｄ－２３０４、Ｄ－２３０５、Ｄ－２３０６、Ｄ－２３０７、Ｄ－２３０８、Ｄ－２３８４、Ｄ－２３８５、Ｄ－２３８６、Ｄ－２３８７、Ｄ－２３８８、Ｄ－２３８９、Ｄ－２３９０、Ｄ－２３９１、Ｄ－２３９２、Ｄ－２３９９、Ｄ－２４００、Ｄ－２４０１、Ｄ－２４０２、Ｄ－２４０３、Ｄ－２４８８、Ｄ－２４９４、Ｄ－２５００、Ｄ－２５０６、Ｄ－２５１２、Ｄ－２５３８、Ｄ－２５３９、Ｄ－２５４０又はＤ－２５４１である、請求項３７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  40. Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４３、Ｄ－２０４７、Ｄ－２０５２、Ｄ－２３０４、Ｄ－２３０５、Ｄ－２３０６、Ｄ－２３０７又はＤ－２３０８である、請求項３９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  41. 細胞中でヒトＭＡＲＣ１遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクトであって、ハイブリダイズして約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０３９～２０７８の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクト。
  42. 前記アンチセンス鎖の前記領域は、配列番号１のヌクレオチド２０４８～２０７４の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの配列と実質的に相補的な配列を含む、請求項４１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  43. 前記アンチセンス鎖の前記領域は、ＡＵＣＡＧＡＵＣＵＵＡＧＡＧＵ（配列番号３６５８）の配列を含む、請求項４１又は４２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  44. Ｄ－２０４５、Ｄ－２０６５、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８２、Ｄ－２１０５、Ｄ－２１０６、Ｄ－２１３７、Ｄ－２１４３、Ｄ－２１６６、Ｄ－２１７３、Ｄ－２１９３、Ｄ－２２４２、Ｄ－２２４７、Ｄ－２２５２、Ｄ－２２５７、Ｄ－２２６０、Ｄ－２２６２、Ｄ－２２６６、Ｄ－２２７２、Ｄ－２２７３、Ｄ－２３０２、Ｄ－２３０３、Ｄ－２３１０、Ｄ－２３１３、Ｄ－２３１５、Ｄ－２３１８、Ｄ－２３２０、Ｄ－２３２３、Ｄ－２３２５、Ｄ－２３２８、Ｄ－２３３０、Ｄ－２３３３、Ｄ－２３３５、Ｄ－２３３８、Ｄ－２３４０、Ｄ－２３４３、Ｄ－２３４５、Ｄ－２３４８、Ｄ－２３５０、Ｄ－２３５３、Ｄ－２３５５、Ｄ－２３５８、Ｄ－２３９４、Ｄ－２３９７、Ｄ－２４５４、Ｄ－２４５５、Ｄ－２４５６、Ｄ－２４５７、Ｄ－２４５８、Ｄ－２４５９、Ｄ－２４６０、Ｄ－２４６３、Ｄ－２４６５、Ｄ－２４６８、Ｄ－２４７０、Ｄ－２４７２、Ｄ－２４７３、Ｄ－２４７７、Ｄ－２４８７、Ｄ－２４９３、Ｄ－２４９９、Ｄ－２５０５、Ｄ－２５１１、Ｄ－２５５２、Ｄ－２５５３、Ｄ－２５５４、Ｄ－２５５５、Ｄ－２５５６又はＤ－２５５７である、請求項４１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  45. Ｄ－２０４５、Ｄ－２０６５、Ｄ－２０７９、Ｄ－２０８２、Ｄ－２１０５、Ｄ－２１０６、Ｄ－２１３７、Ｄ－２１４３、Ｄ－２３０２又はＤ－２３０３である、請求項４４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  46. 前記二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である、請求項３２～４５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  47. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１９～約３０ヌクレオチド長である、請求項３２～４６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  48. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１９～約２３ヌクレオチド長である、請求項４７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  49. １つ又は２つの平滑末端を含む、請求項３２～４８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  50. １～４つの不対ヌクレオチドの１つ又は２つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項３２～４８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  51. 前記ヌクレオチドオーバーハングは、２つの不対ヌクレオチドを有する、請求項５０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  52. 前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項５０又は５１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  53. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項３２～５２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  54. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチドである、請求項５３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  55. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、デオキシリボヌクレオチド又はこれらの組み合わせである、請求項５４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  56. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全ては、修飾ヌクレオチドである、請求項５３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  57. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである、請求項５６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  58. 前記センス鎖は、その３’末端、その５’末端又はその３’末端及び５’末端の両方において、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む、請求項３２～５７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  59. 前記脱塩基ヌクレオチドは、３’－３’ヌクレオチド間結合又は５’－５’ヌクレオチド間結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合されている、請求項５８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  60. 前記センス鎖、前記アンチセンス鎖又は前記センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３２～５９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  61. 前記アンチセンス鎖は、３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項６０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  62. 前記センス鎖は、３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項６０又は６１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  63. 前記センス鎖は、３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項６０又は６１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  64. リガンドを更に含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  65. 前記リガンドは、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシド又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項６４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  66. 前記リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む、請求項６４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  67. 前記リガンドは、多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む、請求項６６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  68. 前記多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である、請求項６７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  69. 前記リガンドは、任意選択によりリンカーを介して前記センス鎖に共有結合されている、請求項６４～６８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  70. 前記リガンドは、前記センス鎖の５’末端に共有結合されている、請求項６９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  71. 請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
  72. ｍＡＲＣ１タンパク質の発現の低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項７１に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
  73. 肝細胞におけるｍＡＲＣ１の発現レベルは、前記ＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物の投与後、前記患者において、前記ＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物を受けていない患者のｍＡＲＣ１発現レベルと比較して低減される、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記患者は、心血管疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎又は肝硬変と診断されているか又はそのリスクがある、請求項７２に記載の方法。
  75. 血清コレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項７１に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
  76. 前記血清コレステロールは、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロールである、請求項７５に記載の方法。
  77. 脂肪肝疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項７１に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
  78. 前記脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記患者は、２型糖尿病と診断されているか、代謝障害と診断されているか又は肥満である、請求項７７又は７８に記載の方法。
  80. 前記患者は、高いレベルの非ＨＤＬコレステロール又はトリグリセリドを有する、請求項７７又は７８に記載の方法。
  81. 肝線維症の治療、予防又は低減を、それを必要とする患者において行う方法であって、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項７１に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
  82. 前記ＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物を前記患者に投与することは、肝硬変を予防するか又は遅延させる、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記患者は、非アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎と診断されている、請求項８１又は８２に記載の方法。
  84. 前記ＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物は、非経口の投与経路を介して前記患者に投与される、請求項７２～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記非経口の投与経路は、静脈内又は皮下である、請求項８４に記載の方法。
  86. 血清コレステロールの低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのものである、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  87. 前記血清コレステロールは、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロールである、請求項８６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  88. 脂肪肝疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのものである、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  89. 前記脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項８８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  90. 肝線維症の治療、予防又は低減を、それを必要とする患者において行う方法で使用するためのものである、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  91. 前記患者は、非アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎と診断されている、請求項９０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  92. 血清コレステロールの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトの使用。
  93. 前記血清コレステロールは、非ＨＤＬコレステロール又はＬＤＬコレステロールである、請求項９２に記載の使用。
  94. 脂肪肝疾患の治療、予防又はその発症のリスクの低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトの使用。
  95. 前記脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項９４に記載の使用。
  96. 肝線維症の治療、予防又は低減を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、請求項１～７０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトの使用。
  97. 前記患者は、非アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎と診断されている、請求項９６に記載の使用。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220264823A1 (en) * 2021-02-24 2022-08-25 Syngenta Crop Protection Ag Soybean variety
US20230240241A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean variety 5pryl83
US20230240232A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean variety 5psym14
WO2024023262A2 (en) * 2022-07-27 2024-02-01 E-Therapeutics Plc Nucleic acid compounds

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5981505A (en) 1993-01-26 1999-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for delivery of genetic material
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US5840710A (en) 1994-12-09 1998-11-24 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing ester or ether-linked lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
IL122290A0 (en) 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US6217900B1 (en) 1997-04-30 2001-04-17 American Home Products Corporation Vesicular complexes and methods of making and using the same
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US6693187B1 (en) 2000-10-17 2004-02-17 Lievre Cornu Llc Phosphinoamidite carboxlates and analogs thereof in the synthesis of oligonucleotides having reduced internucleotide charge
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20030130186A1 (en) 2001-07-20 2003-07-10 Chandra Vargeese Conjugates and compositions for cellular delivery
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003093449A2 (en) 2002-05-06 2003-11-13 Nucleonics, Inc. Methods for delivery of nucleic acids
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
US8017762B2 (en) 2003-04-17 2011-09-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
WO2004094595A2 (en) 2003-04-17 2004-11-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
WO2008131419A2 (en) 2007-04-23 2008-10-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of rna interference agents
EP3705125B1 (en) 2007-12-04 2023-07-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
WO2009099991A2 (en) * 2008-01-31 2009-08-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of cancer
AR090905A1 (es) 2012-05-02 2014-12-17 Merck Sharp & Dohme Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica
SG10201801813YA (en) * 2013-05-01 2018-04-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulating apolipoprotein c-iii expression
JP6694382B2 (ja) 2013-06-21 2020-05-13 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 標的核酸を調節するための組成物および方法
US10358497B2 (en) 2015-09-29 2019-07-23 Amgen Inc. Methods of treating cardiovascular disease with an ASGR inhibitor
US20220049252A1 (en) 2018-12-10 2022-02-17 Amgen Inc. CHEMICALLY-MODIFIED RNAi CONSTRUCTS AND USES THEREOF
US20230183707A1 (en) * 2020-05-21 2023-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting marc1 gene expression

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