JP2023537237A - チゾキサニドおよび２－ヒドロキシ－ｎ－（５－クロロ－１，３－チアゾル－２－イル）ベンズアミド（ｒｍ－４８４８）とエタノールアミン、モルホリン、プロパノールアミン、ピペラジン、およびｎ－メチルピペラジンの結晶塩 - Google Patents

Abstract

本発明は、チゾキサニドの結晶化したアミン塩（例えばエタノールアミン塩、モルホリン塩、プロパノールアミン塩、ピペラジン塩、およびN-メチルピペラジン塩など）、例えば2-ヒドロキシ-N-(5-ハロ-1,3-チアゾル-2-イル)ベンズアミド誘導体（例えば2-ヒドロキシ-N-(5-クロロ-1,3-チアゾル-2-イル)ベンズアミド（RM-4848）など）の結晶化したアミン塩、チゾキサニドアミン塩をそのプロドラッグであるニタゾキサニド（NTZ）から調製する方法、チゾキサニドアミン塩を含む医薬組成物、抗ウイルス剤または抗寄生虫剤として利用するためのチゾキサニドアミン塩に関する。

Description

関連する出願
本出願は、2020年7月20日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願第63/054,072号の優先権を主張するものであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

本開示は、チアゾリド化合物（より具体的にはチアゾリド化合物の塩）、およびその製造方法と利用方法に関する。

1つの実施形態は、式：
を持つ化合物（ただしRはNO₂またはハロゲンである）の塩を含有するアミンである。

別の一実施形態は、チゾキサニドの塩と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物であり、その組成物は、哺乳類に投与されたとき、哺乳類の血漿中でチゾキサニドの最大濃度を1時間以下で提供する。

さらに別の一実施形態は、別の実施形態は、チゾキサニドの塩と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物であり、その組成物は、哺乳類に投与されたとき、その哺乳類の血漿中で、ニタゾキサニドを含む医薬組成物よりも早く前記化合物の最大濃度を提供する。

さらに別の一実施形態は、別の実施形態は、チゾキサニドの塩と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物であり、その組成物は、哺乳類に投与されたとき、その哺乳類の血漿中で、チゾキサニドとグルコロノチゾキサニドのAUC_0-12h濃度を、ニタゾキサニドを含む医薬組成物のAUC_0-12h濃度以上で提供する。

さらに別の一実施形態は、チアゾリド化合物のアミン含有塩を製造する方法であり、この方法は、式：
のチアゾリド化合物（ただしRはNO₂またはClである）をアミン含有化合物と反応させてチアゾリド化合物のアミン含有塩を生成させることを含む。

さらに別の一実施形態は、チゾキサニドのエタノールアミンである。

図1は、RM-5071、RM-5072、およびニタゾキサニド（NTZ）について血漿中のチゾキサニド（T）の濃度（μg/mL）の中央値を12時間にわたって示すプロットである。 図2は、RM-5071m、RM-5072、およびNTZについて血漿中のチゾキサニドグルクロニド（TG）の濃度（μg/mL）の中央値を12時間にわたって示すプロットである。 図3は、RM-5071、RM-5072、およびニタゾキサニド（NTZ）について血漿中の遊離チゾキサニドとグルクロニド化チゾキサニドの濃度（μg/mL）の中央値を12時間にわたって示すプロットである。 図4は、チアゾリドアミン含有塩の例を示す。 図5は、RM-5071のバッチ内の潜在的な不純物を示す。 図6は、RM-5071のバッチを500倍（上図）と1000倍（下図）に拡大した走査電子顕微鏡（SEM）画像を示す。 図7は、デスアセチルNTZ（チゾキサニド）のバッチを500倍（上図）と1000倍（下図）に拡大したSEM画像を示す。 図8は、粒子分析のためのサンプル調製物の超音波処理前の一次粒子（左）と超音波処理後（右）のディジタル画像（倍率10倍）を示す。 図9は、異なる印加圧0バール（緑色）、1バール（青色）、2バール（紫色＝灰青色）、4バール（灰色）の粒子測定結果と、液体分散物の平均（赤色）の重ね合わせを示す。圧力3と4が重なっている。 図10は、液体分析（赤色）と、分散前・高エネルギーベンチャー分析をした4バール（緑色）と1バール（青色）の重ね合わせを示す。 図11A～Bは、RM-5071（A）とデスアセチル-NTZA（B）の熱重量分析（TGA）サーモグラムを示す。 図12A～Bは、RM-5071（A）とデスアセチル-NTZA（B）の示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを示す。 図13は、0.01NのHClを用いたRM-5071の1 mg/mL溶液の滴定曲線を示す。 図14は、0.02NのNaOHを用いたRM-5071の1 mg/mL溶液の滴定曲線を示す。 図15は、メタノールに溶かしたRM-5071のUV-Vis吸収スペクトルを表わす。 図16は、水-上清の中の溶液濃度の関数としてのRM-5071の吸光度（λmax＝409 nm）である。 図17はRM-5071のH-NMRスペクトルであるは、400 MHz装置を用いたNMR法（¹H）で得られた。 図18は、RM-5071の芳香族官能基のスペクトルの領域に対応するH-NMRスペクトルである。 図19は、RM-5071の脂肪族プロトンに対応するH-NMRスペクトルである。 図20は、RM-5071に関する陽（上）と陰（下）エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）スペクトルを示す。 図21は、RM-5071に関する別の陽（上-青色）と陰（下-黒色）エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）スペクトルを示す。 図22は、RM-5071（赤色）とデスアセチル-NTZA（青色）のフーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルの重ね合わせである。 図23は、RM-5071に関する共鳴構造を模式的に示す。 図24は、RM-5071（赤色）、デスアセチル-NTZA（緑色）、およびデスアセチル-NTZAとエタノールアミンの1：1混合物（黒色）の減衰全反射フーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルを示す。 図25A～Bは、RM-5071（A）とデスアセチル-NTZA（B）のX線ディフラクトグラムを示す。 図25A～Bは、RM-5071（A）とデスアセチル-NTZA（B）のX線ディフラクトグラムを示す。

本明細書と請求項では、単数形「1つの」、「1つの」、および「その」は、文脈が明らかにそうでないことを示しているのでなければ複数を含む。本明細書全体を通じ、特に断わらない限り、「含む」と「含んでいる」は排他的というよりは包含的であるため、記載されている整数または整数群は、1つ以上の他の記載されていない整数または整数群を含むことができる。「または」という用語は、例えば「いずれか」で修飾されているのでなければ包含的である。したがって文脈がそうでないことを示しているのでなければ、「または」という用語は、具体的なリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。実施例の中、または異なることが示されている場合を除き、本明細書で利用される成分または反応条件の量を表現するあらゆる数は、あらゆる場合に「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。

見出しは便宜上提供されているだけであり、いかなる意味でも本発明を制限すると解釈されることはない。特に断わらない限り、本明細書で用いられているあらゆる科学技術用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を持つ。本明細書で用いられている用語法は、具体的な実施態様を記述することだけが目的であり、本発明の範囲を制限する意図はなく、その範囲は請求項によってだけ規定される。本開示がより容易に理解されるようにするため、いくつかの用語を最初に定義する。

あらゆる数値の指定（例えばpH、温度、時間、濃度、および分子量）は大まかであり、1、5、または10％の増分だけ（＋）または（－）に変化する。常に明示されているわけではないが、指定されているあらゆる数値の前に「約」という用語があると理解すべきである。常に明示されているわけではないが、本明細書に記載されている試薬は単なる例示であることと、それと同等なものが本分野で知られているは詳細な記述全体の中に示されていることも理解すべきである。

「NMR」は核磁気共鳴を意味する。

「Veq」はEQuivalence点の体積を意味する。

「AUC_0-12h」は、投与後の時間ゼロ（すなわち投与の時点）から12時間までの、血漿濃度よりも下の全面積を意味する。

C_maxは、投与後に薬が到達する最大血漿濃度または最大血清濃度を意味する。

「FTIR」はフーリエ変換赤外分光法を意味する。

「UV」は紫外線と可視光の分光法を意味する。

「DMF」はジメチルホルムアミドを意味する。

「DMA」はジメチルアセトアミドを意味する。

「PO」は経口を意味する。

NTZまたはNTZAはニタゾキサニド（2-(アセトリルオキシ)-N-(5-ニトロ-2-チアゾリル)ベンズアミドとしても知られる）を意味し、以下の構造：
を持つ化合物である。

TIZ、デスアセチル-NTZA、デスアセチル-NTZ、またはデスアセチルニタゾキサニドは、チゾキサニドを意味するはニタゾキサニドの循環している活性な代謝産物である。チゾキサニドは以下の式：
を持つ。

ニタゾキサニドの別の代謝産物はグルコロノチゾキサニドであり、以下の式：
を持つ。

ニタゾキサニドは、アメリカ合衆国において、クリプトスポリジウム・パルバムとランブル鞭毛虫によって起こる下痢の治療に関して承認されている。

RM-4848は置換されたチアゾリドであり、チゾキサニドと同じ構造を持つが、ニトロ基の代わりにクロロ基を持つため、化合物N-(5-クロロチアゾル-2-イル)-2-ヒドロキシベンズアミドになる。RM-4848は以下の式：
を持つ。

チアゾリド化合物は、例えばアメリカ合衆国特許第3,950,351号と第6,020,353号、PCTWO2006042195A1、およびUS2009/0036467Aに公開されている手続きに従って合成することができる。

ニタゾキサニドとその代謝産物であるチゾキサニドを含有する医薬組成物は、元々は腸寄生虫感染症を治療するために開発されて市場化された。ニタゾキサニド、チゾキサニド、および他のチアゾリド化合物（RM-4848など）のさまざまな応用は、例えばアメリカ合衆国特許第RE47,786号、第10,383,855号、第10,363,243号、第10,358,428号、第10,336,058号、第RE47,404号、第10,100,023号、第RE46,724号、第9,827,227号、第9,820,975号、第9,351,937号、第9,345,690号、第9,126,992号、第9,107,913号、第9,023,877号、第8,895,752号、第8,846,727号、第8,772,502号、第8,633,230号、第8,524,278号、第8,124,632号、第7,645,783号、第7,550,493号、第7,285,567号、第6,117,894号、第6,020,353号、第5,968,961号、第5,965,590号、第5,935,591号、第5,886,013号、第5,859,038号、第5,856,348号のほか、アメリカ合衆国特許出願公開第20200038377号、第20190321338号、第20190307730号、第20190291404号、第20190276417号、第20190040026号、第20180126722号、第20180085353号、第2018078533号、第20170334868号、第20170281603号、第20160243087号、第20160228415号、第2015025768号、第20140341850号、第20140112888号、第20140065215号、第20120294831号、第20120122939号、第20120108592号、第20120108591号、第20100330173号、第20100292274号、第20100209505号、第20090036467号、第20080097106号、第20080097106号、第20080096941号、第20070167504号、第20070015803号、第20060194853号、第20060089396号、第20050171169号に開示されており、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

発明者らは、以下の式：
のチアゾリド化合物（ただしRはNO₂またはハロゲン（ClまたはBrなど）である）の新規な塩を開発した。

いくつかの実施形態では、チアゾリド化合物の塩としてアミン含有塩が可能である。本明細書では、アミン含有塩という用語は、対イオンを持ち、1つ以上のアミン基（第一級アミン基、第二級アミン基、または第三級アミン基など）を含有する塩を意味する。

いくつかの実施形態では、アミン含有塩として、アルキルアミン塩、オキサアルキルアミン塩、またはシクロアルキルアミン塩が可能である。

本明細書では、「アルキルアミン」として、1つ以上のアミン基（第一級アミン基、第二級アミン基、または第三級アミン基など）を持つアルキル基が可能である。

本明細書では、「アルキル」という用語は、本明細書では、単独で、または組み合わせで、1～10個、1～6個、または1～4個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。「アルキル基」という用語は、その最も広い意味で用いることができる。アルキル基は場合により置換されていてもよい。アルキル基の例に含まれるのは、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、s-ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソ-アミル、ヘキシルである。

いくつかの実施形態では、アルキルアミンとして、1つ以上の末端アミノ基を含有するアルキルが可能である。そのようなアルキルアミンの例に含まれるのは、エチルアミン、n-プロピルアミン、n-ブチルアミン、s-ブチルアミン、t-ブチルアミン、およびイソブチルアミンである。

いくつかの実施形態では、アルキルアミンとして、NHで置換された1つ以上のCH₂基を持つアルキルが可能である。

本明細書では、オキサアルキルは、Oで置換された1つ以上のCH₂、および／またはOHで置換されたCH₃基を持つアルキルを意味する。

いくつかの実施形態では、オキサアルキルアミンとして、末端OH基と末端アミノ基を持つアルキルが可能である。そのようなアミンの例に含まれるのは、エタノールアミン、プロパノールアミン、n-ブタノールアミンである。

「シクロアルキル」という用語は、本明細書では、単独で、または組み合わせで、各環部分が3～12個、3～8個、または3～6個の炭素原子環メンバーを含有し、それが場合により場合により置換されていてもよい飽和単環基を意味する。そのようなシクロアルキル基の例に含まれるのは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、オクタヒドロナフチル、2,3-ジヒドロ-lH-インデニル、アダマンチルなどである。

シクロアルキルアミンは、NHで置換された1つ以上のCH₂基を持つシクロアルキルを意味する。いくつかの実施形態では、シクロアルキルアミンとして、NHで置換された1つのCH₂基を持つシクロアルキルが可能である。さらにいくつかの実施形態では、シクロアルキルアミンとして、NHで置換された1つ超、すなわち2つ以上のCH₂基を持つシクロアルキルが可能である。

いくつかの実施形態では、シクロアルキルアミンの中の1つ以上のCH₂基はOまたはCH₃Nでさらに置換されていてもよい。

シクロアルキルアミンの例に含まれるのは、モルホリンとN-メチルピペラジンである。

いくつかの実施形態では、アミン含有塩として、エタノールアミン塩、モルホリン塩、プロパノールアミン塩、またはN-メチルピペラジン塩が可能である。

いくつかの実施形態では、チアゾリド化合物のアミン含有塩として、塩基を含有する液体アミンの塩が可能であり、塩基は、アンモニア、メチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N-メチルモルホリン、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアニリン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、N,N-ジベンジルフェネチルアミン、1-エフェナミン、およびN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジンなどである。

いくつかの実施形態では、アミン含有塩として結晶塩が可能である

いくつかの実施形態では、アミン含有塩として、少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも94％、または少なくとも95％、または少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、または少なくとも98.5％、または少なくとも99％、または少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％の純度を持つ純粋な塩が可能である。その純粋なアミン含有塩は、少なくとも10 g、または少なくとも20 g、または少なくとも30 g、または少なくとも40 g、または少なくとも50 g、または少なくとも60 g、または少なくとも70 g、または少なくとも80 g、または少なくとも90 g、または少なくとも100g、または少なくとも150 g、または少なくとも200 g、または少なくとも250 g、または少なくとも300 g、または少なくとも350 g、または少なくとも400 g、または少なくとも450 g、または少なくとも500 g、または少なくとも600 g、または少なくとも700 g、または少なくとも800 g、または少なくとも900 g、または少なくとも1000 g、または少なくとも1200 g、または少なくとも1400 g、または少なくとも1500 gの塩、または少なくとも2000 gの塩、または少なくとも4000 gの塩、または少なくとも5000 gの塩、または少なくとも8000 gの塩、または少なくとも10000 gの塩、または少なくとも15000 gの塩、または少なくとも20000 gの塩、または少なくとも25000 gの塩、または少なくとも30000 gの塩、または少なくとも35000 gの塩、または少なくとも40000 gの塩を含有するバッチの中に存在することができる。

いくつかの実施形態では、チアゾリド化合物の塩（アミン含有チアゾリド化合物の塩など）は医薬組成物の一部として投与することができる。医薬組成物はチアゾリド化合物の塩に加えて含むことができるは基剤（医薬として許容可能な基剤など）を含むことができる。「基剤」という用語は、その最も広い意味で用いることができる。例えば「基剤」という用語は、任意の基剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、ビヒクル、送達系、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香味剤、および甘味剤を意味する。いくつかの実施形態では、基剤として、基剤よりも狭い用語である医薬として許容可能な基剤が可能である。なぜなら医薬として許容可能な基剤」という用語は、医薬組成物で用いるのに適していると考えられる非毒性物質を意味するからである。医薬組成物の中の活性成分の実際の投与レベルは、その活性化合物を特定の患者にとって望む治療応答を実現するのに有効な量で投与するために変動する可能性がある。

選択される用量レベルは、チアゾリド化合物の活性、投与経路、治療中の状態の重症度、および治療中の患者の状態と以前の病歴に依存する可能性がある。しかし化合物の用量を望む治療効果の実現に必要であるよりも低いレベルから開始し、望む効果が実現するまで徐々に増やすことは本分野の技術の範囲内である。望むのであれば、例えば1日に2～4回投与するため有効な1日用量を複数の用量に分割することができる。しかし任意の特定の患者のための具体的な用量レベルは、多彩な因子（体重、全体的な健康、食事、他の治療剤の投与と組み合わせの時刻と経路、および治療中の状態または疾患の重症度が含まれる）に依存する可能性があることが理解されよう。

医薬組成物は例えば経口製剤（固体経口製剤など）にして全身投与することができる。それは例えば粉末、錠剤、カプセル、ロゼンジ、ゲル、溶液、懸濁液、シロップなどの物理的形態にすることができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アメリカ合衆国特許第8,524,278号と第9,351,937号に開示されている製剤の形態にすることができる。このような製剤は例えば制御放出部分と即時放出部分を含んでいて、その制御放出部分と即時放出部分の少なくとも一方がチアゾリド化合物の塩（チアゾリド化合物のそのようなアミン含有塩）を含むようにすることができる。例えばいくつかの実施形態では、制御放出部分がチアゾリド化合物の塩（チアゾリド化合物のそのようなアミン含有塩）を含むことができるのに対し、即時放出部分は、チアゾリド化合物の塩（制御放出部分の中の塩と同じでも異なっていてもよい）、および／またはチアゾリド化合物そのものを含むことができる。さらにいくつかの実施形態では、即時放出部分がチアゾリド化合物の塩（チアゾリド化合物のそのようなアミン含有塩）を含むことができるのに対し、制御放出部分は、チアゾリド化合物の塩（即時放出部分の中の塩と同じでも異なっていてもよい）、および／またはチアゾリド化合物そのものを含むことができる。これら組成物は、単回用量にして、または異なる時刻に投与される多数回用量にして投与することができる。

いくつかの実施形態では、チアゾリド化合物の塩（チアゾリド化合物のアミン含有塩など）を含有する組成物の中のチアゾリド化合物の総量は、組成物の重量の約20％～約95％、または約30％～約90％、または約35％～約85％、または約60％～約75％が可能である。組成物は、即時放出、制御放出、または持続放出のための製剤にすることができる。組成物は、医薬として許容可能な1つ以上の追加の添加剤または賦形剤を含有することができる。これら賦形剤は、本分野で周知であって評価されている治療上不活性な成分である。本明細書では、「不活性成分」という用語は、医薬製造の分野で周知の治療上不活性な成分を意味することができ、それは単独で、またはさまざまな組み合わせで使用することが可能であり、その中に含まれるのは例えば希釈剤、崩壊剤、結合剤、懸濁剤、流動促進剤、潤滑剤、充填剤、被覆剤、可溶剤、甘味剤、着色剤、香味剤、および抗酸化剤である。例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 1995、E. W. Martin編、Mack Publishing Company、第19版、イーストン、ペンシルヴェニア州を参照されたい。

希釈剤または充填剤の非限定的な例に含まれるのは、デンプン、ラクトース、キシリトール、ソルビトール、アイシング用粉砂糖、圧縮糖、デキストレート、デキストリン、デキストロース、フルクトース、ラクチトール、マンニトール、スクロース、タルク、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムまたは第三リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム脱水物、硫酸カルシウムなどである。希釈剤または充填剤の量は組成物全体の重量の約2％～約15％の範囲が可能である。

崩壊剤の非限定的な例に含まれるのは、アルギン酸、メタクリル酸DVB、架橋されたPVP、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、デンプン（コーンスターチまたはトウモロコシのデンプン、あらかじめゼラチン化されたデンプンなどが含まれる）である。崩壊剤は典型的には組成物全体の重量の約2％～約15％を占める。

結合剤の非限定的な例に含まれるのは、デンプン（ジャガイモのデンプン、コムギのデンプン、コーンスターチなど）；微結晶セルロース；セルロース（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）；天然ゴム（アラビアゴム、アルギン酸、グアルゴムなど）；液体グルコース、デキストリン、ポビドン、シロップ、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリ-N-ビニルアミド、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ポリプロピレングリコール、トラガカントゴムなどである。結合剤の量は組成物全体の重量の約0.2％～約14％を占める。

流動促進剤の非限定的な例に含まれるのは、二酸化ケイ素、コロイド状無水シリカ、三ケイ酸マグネシウム、第三リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、粉末セルロース、デンプン、タルクなどである。流動促進剤の量は組成物全体の重量の約0.01％～約0.3％である。

潤滑剤の非限定的な例に含まれるのは、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ベヘン酸グリセリル、鉱物油、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、水素化植物油などである。潤滑剤の量は組成物全体の重量の約0.2％～約1.0％である。

組成物は、低粘性ポリマーである結合剤を含有することができる。低粘性ポリマーの非限定的な例に含まれるのは、低粘性ヒドロキシプロピルメチルセルロースポリマー（Dow Chemicalによって商品名「MethoceLTM」で販売されているもの（例えばMethocel E50LVTM、Methocel K100LVRTM、およびMethocel F50LVRTM）など）と、低粘性ヒドロキシエチルセルロースポリマーである。低粘性ポリマーは、典型的には組成物全体の全重量の約10％～約20％、または約10％～約15％、または好ましくは約12％のレベルで存在する。あるいは制御放出部分と即時放出部分を持つ実施形態では、制御放出部分の中の低粘性ポリマーは、典型的には制御放出部分の重量の約15％～約20％、好ましくは約18％のレベルで存在する。

組成物は被覆材料をさらに含むことができる。被覆材料は、典型的には剤型の表面の外側層として存在し、その製剤を完全に覆う。例えばいくつかの実施形態では、剤型は経口錠剤であり、その中の制御放出部分が錠剤の第1の層を形成し、即時放出部分が、第1の層の上に堆積される第2の層を形成してコア錠剤を形成する。このような実施形態では、例えば被覆材料は、コア錠剤の表面に堆積される外側被覆層の形態にすることができる。被覆材料は、典型的には組成物の重量の約1％～約5％であり、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび／またはポリエチレングリコールを含むとともに、被覆剤、乳白剤、矯味剤、充填剤、研磨剤、着色剤、固化防止剤などからなるグループから選択される1つ以上の賦形剤を含むことができる。フィルム被覆物質とそのような被覆物質の利用法の例は当業者に周知である。

いくつかの実施形態では、チアゾリド化合物の塩、またはそのような塩を含む医薬組成物は、哺乳類（ヒトなど）に投与されたとき、投与してから2時間以下、または1.5時間以下、または1時間以下、または50分以下、または40分以下、または30分以下、または25分以下、または20分以下、または15分以下、または10分以下、または5分以下でその哺乳類の血漿中にその化合物の最大濃度を提供することができる。例えばチゾキサニドの塩（チゾキサニドのアミン含有塩などであり、例えばチゾキサニドのエタノールアミン塩またはチゾキサニドのモルホリン塩が可能である）、またはそのような塩を含む医薬組成物は、哺乳類（ヒトなど）に投与されたとき、投与してから2時間以下、または1.5時間以下、または1時間以下、または50分以下、または40分以下、または30分以下、または25分以下、または20分以下、または15分以下、または10分以下、または5分以下でその哺乳類の血漿中にチゾキサニドの最大濃度を提供することができる。いくつかの実施形態では、チゾキサニドの塩（チゾキサニドのアミン含有塩などであり、例えばチゾキサニドのエタノールアミン塩またはチゾキサニドのモルホリン塩が可能である）、またはそのような塩を含む医薬組成物は、哺乳類（ヒトなど）に経口投与されたとき、投与してから2時間以下、または1.5時間以下、または1時間以下、または50分以下、または40分以下、または30分以下、または25分以下、または20分以下、または15分以下、または10分以下、または5分以下でその哺乳類の血漿中にチゾキサニドの最大濃度を提供することができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドの塩（チゾキサニドのアミン含有塩などであり、例えばチゾキサニドのエタノールアミン塩またはチゾキサニドのモルホリン塩が可能である）は、哺乳類（ヒトなど）に投与されたとき、その哺乳類の血漿中に、ニタゾキサニドよりも速く、またはチゾキサニドの塩の代わりにニタゾキサニドを含む以外は同じ医薬組成物よりも速くチゾキサニドの最大濃度を提供することができる。いくつかの実施形態では、チゾキサニドの塩（チゾキサニドのアミン含有塩などであり、例えばチゾキサニドのエタノールアミン塩またはチゾキサニドのモルホリン塩が可能である）は、哺乳類（ヒトなど）に経口投与されたとき、その哺乳類の血漿中に、ニタゾキサニドよりも速く、またはチゾキサニドの塩の代わりにニタゾキサニドを含むこと以外は同じ医薬組成物よりも速くチゾキサニドの最大濃度を提供することができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドの塩（チゾキサニドのアミン含有塩などであり、例えばチゾキサニドのエタノールアミン塩が可能である）は、哺乳類（ヒトなど）に投与されたとき、その哺乳類の血漿中に、チゾキサニドとグルコロノチゾキサニドのAUC_0-12h濃度を、ニタゾキサニドのAUC_0-12h濃度以上で、またはチゾキサニドの塩の代わりにニタゾキサニドを含む以外は同じ医薬組成物のAUC_0-12h濃度以上で提供することができる。いくつかの実施形態では、チゾキサニドの塩（チゾキサニドのアミン含有塩などであり、例えばチゾキサニドのエタノールアミン塩が可能である）は、哺乳類（ヒトなど）に経口投与されたとき、その哺乳類の血漿中に、チゾキサニドとグルコロノチゾキサニドのAUC_0-12h濃度を、ニタゾキサニドのAUC_0-12h濃度以上で、またはチゾキサニドの塩の代わりにニタゾキサニドを含む以外は同じ医薬組成物のAUC_0-12h濃度以上で提供することができる。

チアゾリド化合物のアミン含有塩は、式：
のチアゾリド化合物（ただしRはNO₂またはClである）をアミン含有化合物（液体アミン含有化合物が可能である）と反応させることによって調製でき、チアゾリド化合物のアミン含有塩が生成する。

このような反応のため、チアゾリド化合物（チゾキサニドなど）を溶媒（例えばアルコール（メタノールまたはエタノールなど）が可能である）に分散させることができる。アミン含有化合物（液体アミン含有化合物（エタノールアミン、プロパノールアミン、モルホリン、またはN-メチルピペラジンなど）が可能である）を分散液に添加することができる。いくつかの実施形態では、この混合物の温度を30℃未満、または25℃未満に維持することができる。いくつかの実施形態では、この混合物を撹拌することができる。反応時間はさまざまである可能性がある。いくつかの実施形態では、反応時間は30分間～4時間、または1時間～3時間（約2時間など）が可能である。混合物を濾過し、アミン含有チアゾリド化合物の塩を含有する生成物を溶媒（アルコール（メタノールまたはエタノールなど）および／または酢酸エステル（酢酸エチルなど）を含むことができる）を用いて洗浄することができる。アミン含有チアゾリド化合物の塩を含有する生成物は、真空（約100ミリバール未満、例えば0.2～50ミリバール、または0.5～20ミリバール、または1～10ミリバールの圧力が可能である）と上昇した温度（50C～80C、または50C～70C、または55C～65C、またはこれらの範囲の任意の下位範囲または値が可能である）の1つ以上を利用して乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、アミン含有チアゾリド化合物の塩を含有する生成物は真空下で約15C～約30 C（20Cなど）の温度にて乾燥させることができる。アミン含有チアゾリド化合物の塩のこの乾燥固体生成物は粉砕すること、および／または潰すことができる。

いくつかの実施形態では、生成したアミン含有塩のバッチがチアゾリド化合物と比べてアミン含有化合物を過剰に含有しているとき、そのバッチを精製してアミン含有化合物の過剰を解消することができる。このような精製は、アルコール（メタノールまたはエタノールなど）および／または水を含むことのできる溶媒の中で生成物を再度スラリーにすることによって実施できる。チアゾリド化合物と比べたアミン含有化合物の過剰は、バッチ内のアミン含有化合物とチアゾリド化合物のモル比を定量技術（HPLCまたはLC-MSなど）によって測定することによって判断できる。

例えば生成したチゾキサニドのエタノールアミン塩のバッチがチアゾリドに対してエタノールアミンを過剰に含有しているとき、そのバッチを精製してエタノールアミンの過剰を解消することができる。バッチ内のチゾキサニドに対するエタノールアミンの過剰は、生成したバッチの中のエタノールアミンとチゾキサニドのモル比を定量技術（HPLCまたはLC-MなどS）によって測定することによって判断できる。例えばバッチは、エタノールアミンとチゾキサニドの間のモル比が1.00超、または1.05超である場合に、チゾキサニドに対してエタノールアミンが過剰である可能性がある。過剰であると判断された場合には、精製の後、生成されたバッチは、エタノールアミンとチゾキサニドの間のモル比が0.9～1.00、または0.95～1.00、または0.96～1.00、または0.97～1.00、または0.98～1.00、または0.99～1.00である可能性がある。

チアゾリド化合物（チゾキサニドなど）はそのそれぞれのプロドラッグから生成させることができる。例えばチゾキサニドは、ニタゾキサニドを含む溶液を第1の上昇した温度（少なくとも50℃、または少なくとも55℃、または少なくとも60℃、または少なくとも65℃、または少なくとも70℃、または少なくとも75℃）まで加熱することによって調製することができる。溶液中の溶媒として、極性溶媒（例えばジメチルアセトアミドまたはジメチルホルムアミドなど）が可能である。いくつかの実施形態では、ニタゾキサニドを溶媒の中に分散させて溶液を形成することができる。いくつかの実施形態では、酸（HClなどであり、約0.5M～3M（1Mなど）の希酸（HClなど）が可能である）を溶液に添加することができる。酸の添加後、いくつかの実施形態では、混合物の温度を第2の上昇した温度（少なくとも65℃、または少なくとも70℃、または少なくとも75℃など）までさらに上昇させることができる。いくつかの実施形態では、第1と第2の上昇した温度のそれぞれとして、100℃以下、または95℃以下、または90℃以下、または85℃以下、または80℃以下が可能である。第2の上昇した温度での加熱は、少なくとも10時間、または少なくとも15時間、または少なくとも20時間、または少なくとも25時間、または少なくとも30時間にわたって続けることができる。いくつかの実施形態では、第2の上昇した温度での加熱は、10時間～70時間、または15時間～65時間、または20時間～60時間、または30時間～50時間、またはこれらの範囲内の任意の値または下位範囲にわたって続けることができる。ニタゾキサニドからチゾキサニドに変換した後、溶液を例えば室温（約25℃など）まで冷却し、塩基（例えばKOHまたはNaOHであり、約1MのNaOHなど）で中和することができる。中和の間、温度は30℃未満、または25℃未満に維持することができる。ニタゾキサニドから形成されたチゾキサニドは、乾燥させることなくその後の塩形成に使用することができる。

いくつかの実施形態では、ニタゾキサニドからチゾキサニドへの変換は、濃酸および／または濃塩基を使用することなく；任意のパラメータに基づく強い酸性またはアルカリ性の混合物を取り扱うことなく）；および／または揮発性溶媒（100℃未満の沸点を持つ溶媒など）を使用することなく、実施することができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドはニタゾキサニドから調製することができ、テトラヒドロフランの中でアンモニアの水溶液を調製した後、蒸発させ、冷たい酸（冷たいHCl水溶液など）の中に懸濁させ、濾過することによって調製する。

ニタゾキサニドをチゾキサニドに変換する方法は、例えばRossignol and Stachulski, J. Chem. Res. (S), 1999, 44-45にも開示されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

チアゾリド化合物の塩（チゾキサニドまたはRM-4848など）と、そのような塩を含む医薬組成物は、ニタゾキサニド、チゾキサニド、および／またはRM-4848が有用であることが知られているのと同じ1つ以上の目的で有用である可能性がある。例えばその塩または医薬組成物は、ニタゾキサニドまたはチゾキサニドで治療できる可能性のある疾患または障害を治療するため対象（ヒトなど）に投与するのに使用でき、その疾患または障害は、例えばインフルエンザ感染症、インフルエンザ様の病気、呼吸器感染症、エンテロウイルス属に属するウイルス（ライノウイルスおよび／またはエンテロウイルスなど）によって起こる疾患または状態、コロナウイルス科に属するウイルス（コロナウイルスなど）によって起こる疾患または状態、パラミクソウイルス科に属するウイルス（呼吸器多核体ウイルス、センダイウイルス、またはヘンドラウイルスなど）によって起こる疾患または状態、C型肝炎、B型肝炎（慢性B型肝炎が含まれる）、腸寄生虫感染症、クリプトスポリジウム・パルバムとランブル鞭毛虫によって起こる下痢などである。治療目的では、チゾリド化合物の塩（チゾキサニドなど）を対象（ヒトなど）に治療に有効な量（疾患の量が可能であり、それはニタゾキサニドおよび／またはチゾキサニドで治療できる可能性のある疾患または障害の1つ以上の症状を改善するのに十分な量である）で投与することができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのアミン含有塩としてチゾキサニドのエタノールアミン塩が可能である。いくつかの実施形態では、そのような塩は、平均サイズが50ミクロン以下、または45ミクロン以下、または40ミクロン以下、または30ミクロン以下、または25ミクロン以下、または20ミクロン以下の粒子の形態にすることができる。いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は微粒子を含有することができ、粒子の少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％が、約1ミクロン～約60ミクロン、または約2ミクロン～約50ミクロン、または約3ミクロン～約45ミクロン、または約4ミクロン～約40ミクロン、または約4ミクロン～約35ミクロン、または約4ミクロン～約30ミクロン、またはこれらの範囲内の任意の値または下位範囲のサイズを持つ。いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、場合によりさらに、少なくとも約100ミクロンのサイズ（約100ミクロン～約2000ミクロン、または約100～約1500ミクロン、または約100～約1000ミクロンなど）を持つ粗粒子を30％以下、または20％以下、または10％以下含有することができる。いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩のバッチをチゾキサニドのバッチから調製し、チゾキサニドのエタノールアミン塩のバッチがチゾキサニドのバッチと識別される平均粒子サイズおよび／または粒子分布を持つようにすることができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、約144C～約150Cまたは約146C～約148Cの融点を持つことができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は結晶形態であることが可能である。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、図12Aのような示差走査熱量測定（DSC）曲線を持つことができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、図11Aのような熱重量分析（TGA）サーモグラムを持つことができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、図25Aのように、1.39222 Åの波長のCu-Kβ線を用いて回折計で求めたX線粉末ディフラクトグラムを持つことができる。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、波長が1.39222 ÅのCu-Kβ線を用いて回折計で求めたX線粉末ディフラクトグラムを持つことができ、そのディフラクトグラムは、1つ以上のピークを約8.5°、約11.2°、約16.8°、約19.5°、約20.9°、約25.6°、約27.0°、および約36.1° 2θの位置に持つ。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、波長が1.39222 ÅのCu-Kβ線を用いて回折計で求めたX線粉末ディフラクトグラムを持つことができ、そのディフラクトグラムは、1つ以上のピークを8.5°±0.2°、11.2°±0.2°、16.8°±0.2°、19.5°±0.2°、20.9°±0.2°、25.6°±0.2°、27.0°±0.2°、および36.1°±0.2° 2θの位置に持つ。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、波長が1.39222 ÅのCu-Kβ線を用いて回折計で求めたX線粉末ディフラクトグラムを持つことができ、そのディフラクトグラムは、ピークを8.5°±0.2°、11.2°±0.2°、16.8°±0.2°、19.5°±0.2°、20.9°±0.2°、25.6°±0.2°、27.0°±0.2°、および36.1°±0.2° 2θの位置に持つ。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩はバッチの形態にすることができる。そのようなバッチは、少なくとも0.1 kg、または少なくとも0.2 kg、または少なくとも0.3 kg、または少なくとも0.4 kg、または少なくとも0.5 kg、または少なくとも0.6 kg、または少なくとも0.7 kg、または少なくとも0.8 kg、または少なくとも0.9 kg、または少なくとも1.0 kg、または少なくとも1.2kg、または少なくとも1.5 kg、または少なくとも2.0 kg、または少なくとも2.3 kg、または少なくとも2.5 kg、または少なくとも3.0 kg、または少なくとも4 kg、または少なくとも5 kg、または少なくとも7 kg、または少なくとも10 kg、または少なくとも15 kg、または少なくとも20 kg、または少なくとも25 kg、または少なくとも30 kg、または少なくとも35 kg、または少なくとも40 kgのチゾキサニドのエタノールアミン塩を含有することができる。いくつかの実施形態では、そのようなバッチ内のエタノールアミンとチゾキサニドの間のモル比は、0.9と1.00の間、または0.95と1.00の間、または0.96と1.00の間、または0.97と1.00の間、または0.98と1.00の間、または0.99と1.00の間が可能である。エタノールアミン塩のバッチ内のエタノールアミンとチゾキサニドのモル比は多数の技術によって求めることができ、その技術に含まれるのは高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）と液体クロマトグラフィ-質量分析（LC-MS）である。

いくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩はチゾキサニドをエタノールアミンと反応させることによって調製することができる。エタノールアミンと反応させるチゾキサニドは、ニタゾキサニドから前もって調製することができる。したがっていくつかの実施形態では、チゾキサニドのエタノールアミン塩は、2工程を含む方法、すなわち工程1：ニタゾキサニドからのチゾキサニドの調製と、工程2：工程1で生成したチゾキサニドからのチゾキサニドのエタノールアミン塩の調製を含む方法によって調製することができる。

本明細書に記載されている実施形態を以下の実施例によってさらに説明するが、それらに限定されることはない。

実施例1．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、エタノール塩。（RM-5071）

チゾキサニド（すなわち2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、0.53 g、2ミリモル）を、エタノールアミン（0.15 mL）を含有するメタノール（MeOH、20 ml）に懸濁させた。この懸濁液を数分間かけて50℃まで温めると、実質的に透明な黄色の溶液が得られ、それを濾過して5 mLまで濃縮したとき、結晶化が容易に始まった。ジエチルエーテル（Et₂O、5 mL）を添加し、この混合物を0℃まで冷却して完全に結晶化させた。濾過し、少量のMeOH を含有するEt₂Oで洗浄すると、表題の塩1（0.49 g、75％）が黄色の結晶性固体として得られた；融点：158～160℃（分解）；実測値：C, 44.1；H, 4.2；N, 17.35；S, 9.8。C₁₂H₁₄N₄O₅SはC, 44.2；H, 4.3；N, 17.2；S, 9.8％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ 2.86 (2H, t, CH₂CH₂)、3.57 (2H, t, CH₂CH₂)、5.20 (1H, br s, OH)、6.81 (2H, m, ArH)、7.32 (1H, m, ArH)、7.67 (3H, br s, NH₃ ⁺)、7.91 (1H, m, ArH)、8.51 (1H, s, 4´-H)、および14.71 (1H, br s, NH)；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ 41.6、57.9、117.5、118.2、119.9、130.1、133.4、137.9、145.9、161.3、171.6、および172.2；m/z（-veイオンエレクトロスプレーモード）264 [(M-H)^？]。実測値：m/z, 264.0092。C₁₀H₆N₃O₄Sはm/z, 264.0085を要求する。

実施例2．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-クロロ)チアゾル-2-イル]アミド、エタノール塩2

この塩は、RM4848、すなわち2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-クロロ) チアゾル-2-イル]アミド（0.51 g、2ミリモル）を用いて実施例1の塩と同様にして調製し、生成物2が得られた（0.48 g、76％）；実測値：C, 45.7；H, 4.5；N, 13.35；S, 10.15。C₁₂H₁₄ClN₃O₃SはC, 45.6；H, 4.5；N, 13.3；S, 10.15％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ 2.86 (2 H, t, CH₂CH₂)、3.58 (2H, t, CH₂CH₂)、5.20 (1 H, br s, OH)、6.67-6.73 (2 H, 2m, ArH)、7.20 (1 H, m, ArH)、7.23 (1 H, s, 4´-H)、および7.83 (1 H, dd, ArH)；NH₃ ⁺はδ 7.65を中心とする非常に広いシグナルとして現われる；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ 41.7、58.0、114.3、116.8、117.4、120.4、129.4、132.1、135.3、162.4、164.5、および169.5；m/z（-ve イオンエレクトロスプレーモード）253 [(M-H)^？]。実測値：m/z, 252.9849。C₁₀H₆ ³⁵ClN₂O₂Sはm/z, 252.9844を要求する。

実施例3．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、モルホリン塩3（RM-5072）

この塩は実施例1の塩と同様にして調製し、チゾキサニド（2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド；0.53 g、2ミリモル）とモルホリン（0.24 mL）から3が黄色の微結晶性固体として得られた（0.66 g、94％）；実測値：C, 47.7；H, 4.6；N, 16.0；S, 9.2。C₁₄H₁₆N₄O₅SはC, 47.7；H, 4.6；N, 15.9；S, 9.1％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ 3.11、3.75 (8 H, 2m, 2xCH₂CH₂)、6.82 (2 H, m, ArH)、7.31 (1 H, t, ArH)、7.91 (1 H, m, ArH)、および8.51 (1 H, s, 4´-H)；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ 43.4、63.8、117.5、118.2、119.8、130.1、133.4、138.0、145.9、161.3、171.5、および172.1。

実施例4．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-クロロ)チアゾル-2-イル]アミド、モルホリン塩4

この塩は、RM4848（2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-クロロ) チアゾル-2-イル]アミド；0.51 g、2ミリモル）とモルホリン（0.24 mL）から実施例1の塩と同様にして調製した。この場合、分離した第1の固体は変化していないRM4848であった；母液の濃縮によって望む塩4が得られた（0.198 g、29％）；実測値：C, 49.4；H, 4.9；N, 12.2；S, 9.2。C₁₄H₁₆ClN₃O₃SはC, 49.2；H, 4.7；N, 12.3；S, 9.4％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ 3.04 (4 H, m)、3.71 (4 H, m)、6.70 (2 H, 2m, ArH)、7.21 (1 H, t, ArH)、7.24 (1 H, s, 4´-H)、および7.83 (1 H, d, ArH)；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ 43.9、64.5、114.4、116.9、117.4、120.3、129.5、132.2、135.3、162.2、164.2、および169.3。

実施例5．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、プロパノール塩

これは、チゾキサニド（0.53 g、2ミリモル）と3-アミノ-1-プロパノール（0.19 mL）から実施例1の塩と同様にして調製し、望む塩5がオレンジ色の結晶として得られた（0.395 g、58％）。実測値：C, 5.9；H, 4.7；N, 16.4：S, 9.5。C₁₃H₁₆N₄O₅SはC, 45.9；H, 4.7；N, 16.5；S, 9.4％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ_H 1.68 (2 H, m, CH₂CH₂CH₂)、2.86 (2 H, t, CH₂CH₂)、3.30 (1 H, br s, OH)、3.49 (2 H, t, CH₂CH₂)、6.81 (2 H, m, ArH)、7.30 (1 H, t, ArH)、7.55 (3 H, br s, NH₃ ⁺)、7.90, (1 H, d, ArH)、8.51 (1 H, s, 4´-H)、および14.71 (1 H, s)；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ_C 30.5、37.3、58.4、117.5、118.2、119.9、130.1、133.3、137.9、145.9、161.3、171.6、および172.2。

実施例6．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-クロロ)チアゾル-2-イル]アミド、3-アミノ-1-プロパノール塩

これは、RM4848 (2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド；0.51 g、2ミリモル）と3-アミノ-1-プロパノール（0.16 mL）から1と同様にして調製した。最終メタノール溶液を濃縮し、Et₂Oで希釈すると、結晶化した；この混合物を冷却して完全に結晶化させた後、固体を濾過し、Et₂Oで洗浄し、乾燥させると、望む塩6が得られた（0.51 g、77％）。実測値：C, 47.5；H, 5.0；N, 12.7；S, 9.6。C₁₃H₁₆ClN₃O₃SはC, 47.3；H, 4.9；N, 12.7；S, 9.7％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ_H 1.68 (2 H, m, CH₂CH₂CH₂)、2.86 (2 H, t, CH₂CH₂)、3.49 (2 H, t, CH₂CH₂)、6.70 (2 H, m, ArH)、7.19 (1 H, dt, ArH)、7.22 (1 H, s, 4´-H)、および7.83 (1 H, dd, ArH)；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ_C 30.5、37.3、58.4、114.2、116.8、117.3、120.4、129.4、132.0、135.3、162.3、164.5、および169.5。

実施例7．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、ジエタノールアミン塩

チゾキサニド（すなわち2-ヒドロキシベンゾイルN-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、0.53 g、2ミリモル）を、ジエタノールアミン（0.20 mL）を含有するメタノール（MeOH、70 ml）に懸濁させ、ほぼ完全な溶液が得られるまで温めた後、濾過した。透明な濾液を冷却した後、濃縮し、次いで0℃まで冷却して完全に結晶化させた。濾過後、少量のMeOHを含有するEt₂Oで洗浄し、乾燥させ、望む生成物が2つの集団で得られ、表題の塩7が黄色の結晶性固体として生じた（0.36 g、49％）。実測値：C, 45.35；H, 4.9；N, 15.25；S, 8.7。C₁₄H₁₈N₄O₆SはC, 45.4；H, 4.9；N, 15.25；S, 8.7％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ_H 3.02 (4H, t, 2xCH₂CH₂)、3.66 (4H, t, 2xCH₂CH₂)、5.18 (2H, br s, OH)、6.81 (2H, m, ArH)、7.31 (1H, m, ArH)、7.91 (1H, m, ArH)、8.34 (2H, br s, NHs)、8.50 (1 H, s, 4´-H)、および14.70 (1H, br s, NH)；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ_C 49.3、56.7、117.5、118.2、119.9、130.1、133.4、137.9、145.9、161.3、171.6、および172。

実施例8．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-クロロ)チアゾル-2-イル]アミド、ジエタノールアミン塩

これは、RM4848（2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-クロロ)チアゾル-2-イル]アミド；0.51 g、2ミリモル）とジエタノールアミン（0.24 mL）を含む加熱したMeOH（30 mL）から1と同様にして調製した。少量の不溶性材料を濾過によって除去した後、濾液を濃縮し、Et₂Oを添加した。この混合物を冷却して完全に結晶化させた後、固体を濾過して除去し、少量のMeOHを含有するEt₂Oで洗浄し、乾燥させると、表題の塩8がほぼ白色の固体として得られた（0.545 g、76％）。実測値：C, 46.9；H, 5.1；N, 11.8；S, 8.85。C₁₄H₁₈ClN₃O₄SはC, 46.7；H, 5.0；N, 11.7；S, 8.9％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ_H 3.00 (4 H, t, 2xCH₂CH₂)、3.65 (4 H, t, 2xCH₂CH₂)、6.70 (2 H, m, ArH)、7.20 (1 H, m, ArH)、7.23 (1 H, s, 4´-H)、および7.84 (1 H, dd, ArH)；δ 5.17 (2 H)とδ 8.2に広い交換可能なピーク；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] δ_C 49.4、56.8、114.4、116.9、117.4、120.3、129.5、132.2、135.3、162.2、164.2、および169.3。

実施例9．2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、N-メチルピペラジン塩

チゾキサニド（0.50 g、1.90ミリモル、1.0当量）をN-メチルピペラジン（0.90 mL）とともにメタノール（10 mL）に懸濁させた。この混合物にメタノール（10 mL）をさらに添加して加熱すると透明な溶液が生成した。その後この混合物を一晩放置した。得られた沈殿物を濾過して除去し、黄色の結晶性固体としての最終生成物を得た（0.13 g、収率19％）。実測値：C, 49.0; H, 5.2; N, 19.0; S, 9.0。C₁₅H₁₉N₅O₄SはC, 49.3；H, 5.2；N, 19.2；S, 8.8％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ_H 2.23 (3H, s)、2.50-2.51 (4H, m)、3.06-3.09 (4H, m)、6.80-6.84 (2H, m)、7.32 (1H, t, J = 7.7 Hz)、7.92 (1H, d, J = 8.1 Hz)、8.52 (1H, s)；13C NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] δ_C 43.36、45.79、51.66、117.48、118.20、119.85、130.07、133.38、137.95、145.91、161.29、171.50、および172.16。

実施例10．ラットに経口投与したRM-5071とRM-5072の生物学的利用能薬物動態研究

まとめ

4匹の雄と4匹の雌のスプラーグ-ドーリーラットに強制経口投与によって単回用量の90 mg/kgのRM-5071、RM-5072、およびニタゾキサニドを経口投与した後の血漿中のチゾキサニド（T）とチゾキサニドグルクロニド（TG）の生物学的利用能を評価する研究を実施した。投与してから0.083、0.167、0.25、0.5 1、2、6、12、および24時間後の時点で血漿サンプルを回収した。質量分析を利用してTとTGの濃度を求めた。3つの群のどのラットでも有害な臨床徴候は観察されなかった。RM-5071とRM-5072の両方とも、血漿中のTとTGの利用速度をNTZと比べて劇的に改善する。これら化合物は経口投与後に急速に吸収され、5分以内にC_maxに到達する。RM-5071は、RM-5072またはNTZと比べ、TとTGのより大きい血漿濃度、および吸収のより小さな変動性と関係していた。

緒言

TとTGのためのプロドラッグであるニタゾキサニド（NTZ）は、動物とヒトに経口投与した後の吸収が悪い。吸収は食事による影響を顕著に受けるとともに、TとTGの濃度には有意な対象内変動性と対象間変動性が存在する。Tの2つの新たな塩、すなわちRM-5071とRM-5072を調製し、経口投与後のTとTGの生物学的利用能を改善する可能性を評価した。この研究を実施し、スプラーグ-ドーリーラットに強制経口投与によって単回用量の90 mg/kgのRM-5071、RM-5072、およびNTZを経口投与した後の血漿中のTとTGの生物学的利用能を評価した。

材料と方法

RM-5071は2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、エタノールアミン塩である。RM-5072は2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、モルホリン塩である。RM-5071とRM-5072は上に開示してある通りであった。

動物と治療。下記の表に詳しく記載されているように、4匹の雄と4匹の雌のスプラーグ-ドーリーラットからなる3つの群に、RM-5071、RM-5072、またはNTZを単回強制経口投与用量として投与した。

投与してから0.083、0.167、0.25、0.5 1、2、6、12、および24時間後の時点で一連の9つの血液サンプルを各動物から取得した。導出された血漿サンプルは、質量分析によるTとTGの濃度の分析のために翌日配達便によってドライアイスに載せて送り出すまで、ヘパリンナトリウムで処理したチューブの中に-70℃以下で保管した。

結果

有害臨床徴候は3つの群のどのラットでも観察されなかった。

RM-5071、RM-5072、およびNTZの投与後、T（中央値）の最大濃度（Cmax）は、それぞれ4.7、3.1、および1.7 μg/mLであった。RM-5071とRM-5072では、最初の血漿サンプリングの時点である投与5分後にCmaxに到達していた。NTZの場合には、2時間後に血漿中のTのC_max（わずか1.7 μg/mL）に到達した。

何匹かの動物は他の動物よりも速くグルクロニド化Tになるため、各時点での遊離Tとグルクロニド化Tの濃度の和を用いてこれら3つの化合物の吸収の程度、速さ、および変動性を評価した。グルクロニド化Tの濃度に到達させるため、TGの濃度に61％を掛けた（TGの分子量＝441で割ったTの分子量＝270）。

投与後12時間にわたる血漿中の遊離T＋グルクロニド化Tの濃度の中央値の和が図3に示されている。

遊離Tとグルクロニド化Tの和に関する平均C_max値と平均AUC_0-12h値が、相対標準偏差（RSD）とともに表2に示されている。RM-5071の平均C_maxは、RM-5072とNTZよりもそれぞれ33％と47％高く、RSDは、RM-5072とNTZの両方が44％であったのと比べて31％であった。

1相対標準偏差

RM-5071に関する平均AUC_0-12hはRM-5072の平均のほとんど2倍であったが、NTZの平均とほぼ同じであった。NTZとのAUC_0-12hの比較は、2時間と12時間の間に1つの血漿サンプル（6時間サンプル）だけを回収することと、NTZは他の化合物よりもゆっくりと吸収されるという事実による影響を受ける。NTZに関する実際のAUC_0-12h値は、追加のサンプルが特に投与後6時間と12時間の間の時点で回収されていればはるかに小さかった可能性が大きい。

注目すべきことに、RM-5071に関する平均AUC_0-12hに付随するRSDはわずか16％であったのと比べ、RM-5072とNTZでは36％であった。これは、NTZに付随する吸収の対象間変動性がRM-5071によって有意に改善されることを示す。

結論：

RM-5071とRM-5072は両方とも、血漿中のTを利用できる速度をNTZと比べて劇的に改善する。これら化合物は迅速に吸収され、経口投与から5分以内にCmaxに到達する。RM-5071は、RM-5072またはNTZのいずれかと比べ、遊離TとグルクロノTのより大きい血漿濃度、および吸収のより小さい変動性と関係している。この研究は、吸収の速度、程度、および変毒性が、RM-5071ではRM-5072またはNTZと比べて改善されることを示している。

実施例11．チアゾリドのアミン塩

合計10種類のアミン塩（チゾキサニドとRM4848のそれぞれについて5種類）を作製した。
1：エタノールアミン：
2：3-アミノプロパン-1-オール（プロパノールアミン）：
3：モルホリン：
4：ピペラジン：
5：N-メチルピペラジン：
チゾキサニド：
RM-4848：

一般的な手続き

適切なアミンをメタノールの中で同じモル量のチゾキサニドまたはRM4848とともに、透明な溶液が得られるまで加熱する。少量の溶けなかった固体はすべて濾過によって除去する。冷却すると、望む塩が直ちに結晶化する可能性がある；（チゾキサニド塩については）同体積の溶媒（ジエチルエーテルなど）の添加、または（RM4848の塩については）小体積に濃縮した後の過剰なエーテルの添加を利用して固体生成物を得ることができる。一般に、RM4848の塩は上記の条件下でより溶けやすい。すべての塩が、親チアゾリドよりも水に溶けやすい。

1：チゾキサニドとRM-4848の両方とも、エタノールアミンとの結晶塩（RM5071とRM5072）を容易に生じさせた。これらは良好な結晶形態かつ微量分析的に純粋な状態で得られた。「微量分析的に純粋」という表現は、合成された分子内の各原子の量の各理論値からのずれが、理論値の±0.3％以内であることを意味することができる。

2：エタノールアミンの場合と本質的に同じ。両方のプロパノールアミン塩で優れた収率、結晶形態、および化学的純度。

3：チゾキサニドのモルホリン塩が容易に高純度で得られた。RM4848の場合、固体として分離される最初の化合物は、変化していないRM4848であった。母液を濃縮して小体積にすると、望む塩が、約30％の収率だが高純度で得られた。

4：チゾキサニドとRM4848両方のピペラジン塩が標準的な方法によって得られたが、それらを満足な純度で得ることは難しかった。過剰なピペラジンは塩とともに結晶化するように見える。本発明がその動作原理によって制限されることはないが、これはピペラジン自体が固体であるという事実に起因する可能性がある。

5：液体であるN-メチルピペラジンを使用すると、チゾキサニド塩が非常に良い収率と純度で得られた。RM4848の対応する塩が固体として得られたが、純度はより低かった。

ニタゾキサニドからのRM-5071の合成

工程1：ニタゾキサニドからのチゾキサニドの調製

ニタゾキサニドを極性溶媒（例えば3VeqのDMFなど）に溶かした。溶液を上昇した温度（50℃など）に加熱した。酸（HCl 1Mなど）を例えば1 Veqで添加した。溶液をさらに第2の上昇した温度（70℃など）まで加熱して完全に変換させた。それには約36時間～約48時間の期間かかる可能性がある。溶液を室温まで冷却し、塩基（例えば1MのNaOHなど）で中和した。溶液を濾過し、生成したケークを溶媒（水および／またはアルコール（メタノールなど）など）で洗浄した。この反応により、チゾキサニドを良い純度で90～100％回収することができる。この反応はアップスケーリングに適している。

工程2：チゾキサニドからのRM-5071の調製

チゾキサニドを室温で例えば5Veqの溶媒（メタノールなどのアルコールが可能である）に分散させた。エタノールアミンを例えば1.1当量でゆっくりと添加した。発熱。この混合物を例えば約2時間撹拌した。次いでこの混合物を濾過し、生成したケークを溶媒（メタノールと酢酸エチルなどであり、約1：1の体積比にすることができる）で洗浄した。ケークを真空（約100ミリバール未満など）下で上昇した温度（約60℃など）にて乾燥させて固体にした。乾燥したその固体は、粉砕すること、および／または潰すことができる。この反応により、RM-5071を良い純度で80～90％回収することができる。この反応はアップスケーリングに適している。

まとめ

RM-5071はニタゾキサニドから合成することができるは2工程合成である。RM-5071を製造するための条件は、製造設備でのアップスケーリングに適合させることができる。なぜなら製造設備は、限界希釈、穏やかな条件、および遠心分離による生成物回収を利用するからである。生成物は通常は良い純度で得られる。純度が悪い場合には2つの精製の可能性。収量は、100 gのニタゾキサニドから80～85 gのRM5071が可能である。代表的なアップスケーリング条件は以下のようなものが可能であろう：

RM-5071に関する分析情報

実施例12

要約

ニタゾキサニド（NTZ）、すなわち2-[(アセチルオキシ)-N-(5-ニトロ-2-チアゾリル)]ベンズアミドを典型とするチアゾリドは多重薬理剤の1つの重要なクラスであり、広範囲の抗感染活性を持つ可能性がある。元々は特にクリプトスポリジウム属の種に対する抗寄生虫剤として市販されたプロトタイプNTZがその後ウイルスの数に対して有効であることが示された。しかし効率的な全身循環が必要とされる場合には、NTZの薬物動態パラメータは、その低い溶解度と吸収が原因で理想的ではない。この研究は、チゾキサニドの一連のアミン塩、NTZの活性なデアセチル代謝産物、および対応する5-ClチアゾリドRM4848の調製と評価を報告する。生体内測定によって示されるようにチアゾリド塩は水溶性と吸収の改善が実際に実証されたため、最近、臨床試験に向けてスケールアップされた。

緒言

ニタゾキサニド［NTZ；2-[(アセチルオキシ)-N-(5-ニトロ-2-チアゾリル)]ベンズアミド］1aはRossignolとCavierによって1976年に最初に報告された¹；これは既知の抗感染剤であるニクロサミド2に基づいてモデル化され²、アニリドがニトロチアゾリルアミドで置換されているため、インビトロと生体内で有望な抗寄生虫活性を示した。そもそもNTZ 1aは原生動物と蠕虫による寄生虫感染症の治療のために開発された^3-5が、後にその最も重要な用途はクリプトスポリジウム属の種の感染症の治療になり^{6, 7}：今日まで、それが、クリプトスポリジウム・パルバムに関してFDAが承認した唯一の治療薬である。その抗寄生虫活性の研究から、NTZ 1aの1つの重要な作用様式は、折り畳みシャペロンであるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの阻害であることが確立している。⁸ NTZ 1aは好気性の種と嫌気性の種の両方に対する貴重な抗菌活性も持ち、嫌気性細菌の場合にはピルビン酸オキシドレダクターゼを阻害することによって作用する^{9, 10}。

NTZ 1aはエイズ患者のクリストポリジウム症を治療している間に抗ウイルス活性を持つことが見いだされた¹¹。抗ウイルス剤としてNTZ 1aを用いた最初の臨床試験はロタウイルスによって誘導される下痢に対するものであり¹²、その中には患者としての小児が含まれる。NTZ 1aはウイルスの数に対する抗ウイルス活性を持つことが証明された^13-16

ニトロ基は活性にとって不可欠でない可能性がある：5'-Cl類似体3aは小さなマイクロモル値でほぼ同様の活性スペクトルを持つ可能性があり¹⁸、4'-エタンスルホニル類似体4はA型インフルエンザウイルスのH1N1株に対する優れたインビトロ活性を示す、IC₅₀＝0.14 μM^19-21。

NTZ 1aは通常は経口投与されるが、胃腸管から吸収されるのはほんの一部である²²。それは実際にはデアセチル誘導体チゾキサニド1bのプロドラッグであり、吸収された直後に形成された後、大半はO-グルクロニド5として身体から排出される²³：1aは1.3時間の血漿半減期を持つ。このような体内動態（biodisposition）は腸感染症で受け入れられる可能性があるが、ウイルス感染症（A型インフルエンザなど）のために1a/1bの十分な全身循環を実現することは困難である可能性がある。1aの絶対経口生物学的利用能を6の場合には約20％改善できる可能性があるプロドラッグアミノ酸エステル（6など）²⁴。

1a/1bの薬物動態パラメータを改善する別のアプローチは、活性剤をアミン塩として投与するというものである。

この研究は、チアゾリド1bとRM4848 3bの一連のアミン塩の合成、それらの特徴づけ、および選択された薬物動態データを報告する。一般に、われわれが選択したすべてのアミンが満足する結果を与えたわけではなく、1bと3bの挙動はいくつかの場合に異なっていた。

考察

チゾキサニド1bをメタノールの中でわずかに過剰なエタノールアミンとともに約0.25時間加熱すると、ほぼ透明な溶液が得られた。濾過の後に濃縮すると、望む塩8が結晶化した；ジエチルエーテルで希釈し、冷却し、濾過した後、8が、良い収率と良い微量分析的純度で得られた。1H NMRはアリールのプロトンの特徴的な高磁場シフトを示した。これは、チアゾリドのアニオン的な性質に合致する。同様に、RM4848 3bから塩9が得られた。図4に、ヒドロキシアミン、モルホリン、およびN-Meピペラジンを用いて同様に作製された合計9つの塩がまとめられている。

いくつかの有意な差が、特定のチアゾリド／アミンの組み合わせで見られた。例えばモルホリン塩10は通常のやり方で1bから得られたが、RM4848 3bを使用したときには、沈殿した最初の固体は、反応しなかった3bであった。濾液を濃縮すると望む塩11が得られ、それはどちらかと言えば低収率であることが不可避であったが、それでも微量分析的に純粋であった。塩12～15が、 1-アミノプロパノールの使用（12、13）とジエタノールアミンの使用（14、15）によって同様に得られた。ジアミンは取り扱いがより難しいことが証明されているため、ピペラジンから純粋な塩を容易に得ることはできなかった；ピペラジンは固体であり、再結晶化による除去は難しい。しかしN-Meピペラジン（液体）と1bから、低収率だが塩16を得ることができた；この場合、プロトン化の部位は明確にならなかった。アミノ酸L-リシンは1bまたは3bから分離可能な塩を生じさせなかった。

アップスケーリング

エタノールアミン塩8の合成を工業的プロセスへとスケールアップすることに成功した。それは、FDA承認薬であるニタゾキサニド1aから出発する2工程合成（収率80％）である。40 kgの純粋な材料になる前技術的バッチを用意した。生産プラント設備を利用して、このプロセスが大規模な製造に関して信頼できることを実証した。

薬物動態

薬物動態データは実施例10に提示されている。

実験

一般的な実験法

塩を実施例1～9に概説されているようにして調製した。

1Hと13Cのスペクトルは、多核5-mm BBFOプローブを備えたBruker 400MHz装置で取得した（13Cのスペクトルについては100MHz）。（400.13 MHzでの）1Hのスペクトルと（100.61Mhzでの）13C（1H）のスペクトルを標準的なパラメータセットを用いて周囲温度で取得した；溶媒の共鳴を参照目的で使用した。

示されているように+veイオンまたは-veイオンによるエレクトロスプレーモードで作動するMicromass LCT質量分析器（Micromass LCT Waters Micromass UK Ltd、マンチェスター、連合王国）にサンプル溶液を直接注入することにより、低分解能と高分解能の質量スペクトルを取得した。

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実施例13

RM5071は、チゾキサニド（TIZ）のプロドラッグ、すなわちFDAによって承認されたAliniaと呼ばれる抗原生動物薬であるニタゾキサニド（NTZA）の活性な代謝産物である。RM5071は、チゾキサニドとエタノールアミン（ETAM）という2つの部分からなる有機塩である。NTZAと活性が似ているが、経口体内動態と代謝がより大きくて血流にチゾキサニドを放出する化合物が必要とされている。スプラーグ-ドーリーラットで実施した薬物動態（PK）研究から、RM5071は最大濃度の意味でNTZAよりも生物学的利用能が大きいことがわかった。RM5071について、アップスケーリングが可能な合成プロセスを開発する必要があろう。

1．考察

1.1. 最初のアプローチ

RM5071は当初は以下のプロトコルによって調製された（付録1も参照されたい）：

2ミリモルのチゾキサニドを、0.15 mLのエタノールアミンを含有する20 mLのメタノールに懸濁させた。この懸濁液を数分間かけて+50℃まで温め、濾過し、濾液を濃縮して5 mLにした。結晶化が容易に始まり、ジエチルエーテル（5 mL）を添加し、混合物を0℃まで冷却した後、濾過した。ケークを、少量のメタノールを含有するジエチルエーテルで洗浄した。乾燥させると、RM5071が黄色の結晶性固体として得られる（0.49 g）。

核磁気共鳴NMR（NMR 1Hと13C）、元素組成、およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（MS-ESI負）により、予想された構造が確認された。融点が158℃と160℃（分解）の間であることが測定された。

RM5071のこのバッチを最初に毒物学／PK研究のために使用し、後にプロセス開発のための基準として使用した。

1.2. 拡張可能な方法の開発

薬物質（DS）合成の開発を3工程で実施した。初期合成から開始し、実験室スケールの試験をいくつか実施した。それら試験が拡張可能な方法につながり、その方法をパイロット実験室試験においてより大きなスケールで試験した。パイロット実験室試験の間に問題が報告されなかったため、技術試作バッチを用意した。このより大きなバッチの意図は、現在の製造装置を用いて方法を有効に実行できるかどうかを確認することであった。

RM5071の合成をスケールアップする基準には、以下の項目：
・収率
・時間
・安全性
・純度（比ETAM/TIZなど）
の1つ以上が含まれる可能性がある。

制約には、作業温度（-5℃と+80℃の間）が含まれる可能性がある

1.2.1. 理論的検討事項と合成戦略

RM5071はチゾキサニド（TIZ）のエタノールアミン塩である。TIZからのアルコール部位（フェノール）はわずかに酸性である。この特徴を利用し、TIZをアルカリ性分子である2-エタノールアミン（ETAM）と組み合わせることによって有機塩を形成する。反応性の観点からはエタノールアミンは（他の有機塩基と比べて）強力な塩基ではないが、TIZのわずかに酸性のフェノール基と相互作用するには十分な強度である可能性がある。したがってこの塩は両方の分子を混合することによって形成することができる。

エタノールアミンとチゾキサニドの間のこの強い相互作用が理由で、RM5071の化学的特性はチゾキサニドの化学的特性とは異なる。したがって融点（分解）の変化のほか、FTIR スペクトルの変化が観察された。このような差は、おそらく分子内配置と結びついている可能性がある。

RM5071の合成計画はニタゾキサニド（NTZA）から始まる2工程合成として考えることができ、第2の工程は、RM5071を生成させる塩形成である。

1.2.2. 小スケールの試験

1.2.2.1 工程1

NTZAからのチゾキサニドの調製はすでに以前に研究されていた。方法の1つのプロトコルとして以下のものが可能である：

NTZAをRT で10 VeqのHCl 37％に分散させると、非常に粘性のある黄色の懸濁液が形成される。この混合物を（完全に変換されるまで）24時間の間+50℃まで加熱する。スラリーは粘土が低下し、より撹拌しやすくなる。それをRTまで冷却した後、水（10 Veq）で2回希釈し、濾過した。ケークを大量の水で洗浄した後、メタノールで洗浄する。黄色のケークを真空下で乾燥させると、かなりの収量の純粋なチゾキサニドが得られる。

この方法は2つの問題を持つ可能性があるため、スケールアップは容易でない。第1に、この方法は濃HClを利用している。これは、大スケールにするには安全性を理由として回避する方がよい。第2に、この方法は大きな反応装置を必要とする可能性がある。というのも水で希釈した後に合計で20 Veqが必要とされるからである。これは、6000Lの反応装置だと最大で300 kgのNTZAを1つのバッチで使用する可能性があることを意味しよう。

以前のプロジェクトの間、有機媒体の中での反応、すなわちNTZAをTHFに溶かして水性アンモニアと反応させることが試みられた。この反応は数分間で終了し、加熱は必要なかった。しかしワークアッププロセス（濃縮して乾燥させ（アンモニアの蒸発）、水の中で再スラリー化し、HClで酸性化した後、濾過する）をスケールアップすることは容易でなかった。方法のいくつかのバリエーションを試験した；しかしこの方法は放棄された。

HClを用いた加水分解に注力された。純粋な水性媒体の中では改善ができないことがすぐに判明する。すなわちHClの濃度をより低くして作業すると、温度を上げても長い反応時間がかかり、より低い希釈度で作業すると、撹拌できない混合物になる。

並行して、DMFの中での反応も調べられた。というのもNTZAはDMFに溶け、ゆっくりと分解されてチゾキサニドになるからである。しかし温度を上げ、触媒として水を過剰に添加したときでさえ、反応速度は本当に遅かった。逆に、かなりの量の水性HClを添加して加熱すると、合理的な変換速度になる。このプロトコルの簡単な説明を以下に示す：

NTZAをRTでDMF（3 Veq）に分散させ、水性HCl（2 Veq 1M）を添加し、完全に変換されるまで+70℃に加熱する。濾過と洗浄（水、次いでメタノール）により、乾燥させた後にかなりの収量が得られる。

NTZAは作業濃度と室温でDMFにほぼ溶ける；しかし水性媒体を添加すると、この混合物は内部温度が約+50℃になるまで撹拌が非常に難しくなる。この混合物の撹拌可能性はNTZAをチゾキサニドに変換すると増大した。最後に、この方法を変化させ、出発溶液を+50℃に加熱した後に酸を添加した。反応中にHClを添加している間、撹拌の問題は観察されなかった。

プラント内での酸性混合物の取り扱いを回避するとともに遠心分離の腐食を阻止するため、実験室内で濾過するがプラント内で遠心分離することにより、中和工程を付加した後に固体チゾキサニドを回収した。反応の終了後に同量のNaOH 1M（水性）を混合物に添加すると、反応混合物の中の遊離HClを中和することができる。しかし反応によって1当量の酢酸が生成するため、反応混合物は酸性にとどまる。

得られたスラリーは問題なく濾過された；濾過は焼結ガラス漏斗で容易になされた。ケークを水（3×2 Veq）とメタノール（3×2 Veq）で洗浄した。中和工程と水性洗浄を組み合わせると、ケークの中にHClが残らない。生成物の中の残留HClを回避することは重要である可能性がある。なぜならそれは、工程2の間にエタノールアミンと反応する可能性があるからである。ケークをメタノールで洗浄すると水の除去が可能になる。しかしNTZAとチゾキサニドは、水のほかメタノールにかなり溶けにくい。こうするとチゾキサニドがケークの洗浄中に失われることはないが、残留NTZAも除去されない。

結論として、NTZAからチゾキサニドを調製するためのスケールアップ可能な方法が得られた。

NTZAをRTで3 VeqのDMFに分散させる。+50℃まで加熱し、2 VeqのHCl 1M（aq.）を添加する。その後、完全に変換されるまで+70℃に加熱する。RTまで冷却し、2 VeqのNaOH 1M（aq.）を添加し、濾過し、3×2Veqの水と3×2Veqのメタノールでケークを洗浄する。ケークを真空下で乾燥させると、チゾキサニドが灰白色の粉末として得られる。

収量は多く、純度は良好である（HPLCによると100％UV領域）。方法はロバストだが、反応時間は別で、16時間と40時間の間で変動する。反応混合物の温度は変換速度にとって重要である可能性がある。+70℃（内部温度）未満では反応時間がより長い。パイロット実験室でのスケールアップの間はその点に特に注意する。他の注意点は、反応混合物の撹拌可能性と濾過可能性である。というのもそれらはスケールアップが影響する可能性のある既知のパラメータだからである。

1.2.2.2 工程2

この以前の方法を方法最適化のための出発点として再現した。この以前の方法は生成物を良い純度で生じさせるが低収率である（36％）。この方法からのいくつかの工程、すなわち加熱濾過、蒸留、ジエチルエーテルの使用のほか、大きな希釈（作業濃度0.1 Mまたは38 Veq）は、大スケールの製造には適していない。いくらかの遊離チゾキサニドが懸濁液の中に残留する場合は別にして加熱工程と濾過工程は必要でない可能性があるが、高希釈であることを考慮するとその可能性は小さかろう。そこで新たなプロトコルを設計し、加熱工程と濾過工程のほか、濃縮と共溶媒結晶化の工程を回避した。

チゾキサニドを有機溶媒に分散させ、エタノールアミンを添加し、得られたスラリーを濾過し、溶媒で洗浄した。いくつかの試験から、メタノールがそのプロセスにとって優れた溶媒であり、0.75 Mの作業濃度（または5 Veq）で使用できることがわかった。しかし最終生成物はメタノールにわずかに溶けるため、ケークをメタノールと酢酸エチル（1/1 v/v）の混合物で洗浄すると良好な結果が得られることが見いだされた。

RM5071は酢酸エチルに溶けないが、粘着性材料を形成する傾向がある。これは純粋な酢酸エチルの中での試験反応の間にも観察された。それに加え、RM5071は5 mg/mLの濃度でメタノールにほぼ溶けることが観察された。

合成の工程2の開発中に最終材料の分析にも時間を費やした。最終材料としての有機塩はその工程からの2つの出発材料からなり、それを分析することは古典的有機反応におけるほど容易ではない可能性がある。この話題については後述する。

精製の必要性は観察されなかったが、それでもそれを研究した。2つの方法、すなわちスラリーと溶解／結晶化を試験した。

スラリーを水とメタノールの中で調べた。なぜなら両方とも、エタノールアミン.HCl塩のほか遊離エタノールアミンの可能な痕跡を除去することが期待されるからである。残留チゾキサニドをこのようにして除去することはできなかった。両方の溶媒が、純度（ETAM/TIZ比）の増大と良好な収率を示した：

溶解／結晶化をDMFの中で再試験したが、メタノールの中ではしなかった：

RM5071をRTで最少量のDMF（2.5 Veq）に溶かした。最終的な固体は濾過することができるが、固体は観察されない。25 Veqの酢酸エチルを添加するとRM5071をRTで沈殿させることができる。濾過後、生成物をメタノール／酢酸エチル（1/1）で洗浄する。

精製率は約70％であった。過剰なエタノールアミンが除去されるが、さもないと、他の精製法、それどころか無精製と比べて利得は観察されない。

反応をDMFの中でも試し、酢酸エチルを用いた共結晶化により生成物を回収した。結晶化のためには高希釈の他のバッチと比べた最終材料の分析が必要とされるため、この方法は利点をまったく示さない可能性がある。

結論として、メタノール懸濁液反応とそれに続く単純な濾過を工程2で維持した：

チゾキサニドをRTでメタノール（5 Veq）に分散させる。エタノールアミン（1.1当量）を添加すると、発熱が限定される。混合物を2時間撹拌した後に濾過し、メタノール／酢酸エチルの混合物（1/1 V/V）で洗浄する。

収率は約80％である。分析から良い純度であることがわかり、ETAM／TIZ比は0.90と1.00の間である。

最終材料が過剰なエタノールアミンまたは別の塩を含有する場合には、それをメタノールおよび／または水の中で再スラリー化することによって精製することができる

遊離チゾキサニドが最終材料の中に検出されたため、より過剰なエタノールアミンも試した。最終材料に違いは観察されなかった。非限定的な1つの仮説は、エタノールアミンの痕跡が洗浄工程（濾過）の間にチゾキサニドから解離し、この少し過剰なチゾキサニドになった可能性があるというものであろう。

1.2.2.3 結論

アップスケーリングが可能なNTZAからRM5071への2工程プロセスを開発した。

工程1：NTZAからのチゾキサニドの調製

ニタゾキサニドを3 VeqのDMFに分散させた後、混合物を+50℃まで加熱する。HCl 1M（水溶液、2 Veq）をゆっくりと添加する。混合物が黄色の溶液から白色の溶液に変わる。それを、変換が完了するまで+70℃に加熱する（一般に36～48時間）。

混合物をRTまで冷却し、NaOH 1M（水溶液、2 Veq）をゆっくりと添加してHClを中和する。温度を制御する必要があり、冷却は大規模である必要があろう。

この懸濁液を濾過し、固体を2 Veqの水で3回、次いで2 Veqのメタノールで3回洗浄する。固体を真空下で乾燥させると純粋なチゾキサニドが得られる。

工程2：チゾキサニドからのRM5071の調製

チゾキサニドをRTで5 Veqのメタノールに分散させる。内部温度を+30℃未満に維持しながらエタノールアミン（1.1当量）をゆっくりと添加する。冷却は大規模である必要がある可能性がある。この懸濁液は灰白色から黄色に変化した。この混合物をRTで2時間撹拌した後、濾過し、固体を2 Veqのメタノールと酢酸エチルの混合物（1/1 V/V）で3回洗浄する。黄色の粉末を真空下で乾燥させる（炉）。

固体を粉砕すると素晴らしい黄色の粉末が得られる。

アップスケーリングの基準に合致した：
収率：2工程で80～90％
時間：
工程1：反応時間は20～46時間の加熱になる可能性がある。このパラメータはさらに改善できる可能性がある。
工程2：反応時間は2時間に設定できるが、化学的にはRM5071の形成は瞬時である
安全性
濃縮酸／塩基を使用しない
強い酸性またはアルカリ性の混合物を取り扱わない
制御すべきいくらかの発熱
揮発性溶媒を使用しない
純度
HPLC-UV、HPLC-MSは良い純度を示した
qNMRは受け入れ可能な比ETAM/TIZを示した
粒子のサイズ分布は優れているように見えた
作業温度（-5℃と+80℃の間）
いくらかの発熱が加わっている間、RT付近の温度を維持するため冷却が必要とされる可能性がある
o +70℃（内部）までの加熱を実現できる可能性がある。

この選択された方法に従い、以下の量を用意することができた：

1.2.3 パイロット実験室試験

方法開発の第2部として、選択された方法をパイロット実験室のスケールで試験した。2つのバッチを用意した：1つは古典的ガラス製品を、1つはガラス製パイロット反応装置を使用した。

以下は、合成法の最適化に関する主な結論である：
・試薬（HCl、NaOH、およびETAM）の添加によって問題のある温度上昇は起こらなかった。しかしNaOHとETAMを添加するとき十分な冷却を必要とする可能性がある（内部温度の冷却を+10℃に設定する）。
・工程1の間の反応時間は約45時間になる可能性がある。この反応時間を実現するのに+70℃という反応装置内部の最低温度が必要とされる可能性がある。このレベル未満の温度だとより長い反応時間になろう。
・50 μmの濾布を遠心分離機での濾過に使用できる。
・撹拌（158 rpm、Buchi反応装置）に関する困難は見当たらなかった。決定的に重要な部分は、工程1の間にほぼ完全な変換に到達するときである可能性がある。
・生成物は両方の工程の後に容易に取り出すことができ、残留物はあまり残らない。反応装置は清掃が容易である。
・中間体（チゾキサニド）を乾燥させずに反応装置に戻して工程2を実施する。乾燥減量（LOD）を測定する。LODの結果に応じてメタノールの量を調節した後、工程2にロードすることができる。

1.5 kgの出発材料というスケールでは収率は88％であり、純度は他の開発バッチと合致していた。決定的に重要なパラメータは改変する必要がなかったため、この方法をより大きなスケール（50 kgの出発材料）で直接試験することにした。

1.2.4. エンジニアリングバッチ

エンジニアリングバッチの主な目的は、この方法がRM5071の製造に適していることを調べることであった。チェックすべきパラメータは、工程1の反応混合物を効率的な温度（+75℃内部）で加熱する能力と、遠心分離の間にチゾキサニド（工程1）とRM5071（工程2）を回収する能力であった。

合成開発に関する結論は以下の通りである
・収率：2工程で78％。
・時間：
・工程1：20時間の加熱；32時間の全製造時間。
・工程2：2時間の反応時間；7時間の全製造時間。
・安全性
・発熱反応は容易に制御され
・純度
・以前のバッチと比べて違いは観察されなかった
・作業温度（-5℃と+80℃の間）
・冷却力は十分であった
・+75℃の加熱が実現された。十分な加熱力を利用した。

結論として、パイロット実験室スケールで開発した合成法に従い、エンジニアリングバッチとして41 kgのRM5071薬物質が調製された。

1.3. 分析での考慮事項

最終RM5071の分析は困難であった。RM5071はチゾキサニドとエタノールアミンからなる有機塩である。したがって最終生成物の評価に古典的分析技術を直接利用することはできない。遊離試薬（ETAMとTIZ）を最終生成物（RM5071）から識別することのできる方法が必要とされている。合成開発の間、その目的で比ETAM／TIZを明らかにすることを選択した：

このモル値はRM5071の化学構造によれば1.00になるべきである。遊離したチゾキサニドまたはエタノールアミンが最終生成物の中に存在する場合には、5に示されているように観察される比が変化し、残留出発材料の定量が可能になろう。他の有機不純物は特定がより容易である（HPLC、NMR）。無機不純物は最終生成物の中に予想されていない。

工程1の間の変換をモニタすることと、最終工程を純粋な材料で始めることの両方のためには、最終生成物に加えて中間体（チゾキサニド）を分析することも重要であった。LC-MS法を利用すると、結果をよく信頼できるほか、迅速な結果取得と容易なサンプル調製が可能になる。

合成開発の間、チアゾリドに関する1つの重要なパラメータである粒子のサイズ分布もレーザー回折によってチェックし、方法の変化がこの分布に影響しないことを保証した。

2．結論

結論として、以下の合成プロトコルを利用して、実験室スケールから製造スケールまでRM5071薬物質を調製することができる：

NTZAからのチゾキサニドの調製（工程1）

チゾキサニドを3Veq DMFに分散させた後、混合物を+50℃まで加熱する。HCl 1M（水溶液、2 Veq）をゆっくりと添加する。混合物は黄色の溶液から白色の懸濁液に変わる。変換が完了するまでそれを+75℃に加熱する。

混合物を+10/+15℃まで冷却した後、内部温度を+25℃未満に維持しながらNaOH 1M（水性、2 Veq）をゆっくりと添加してHClを中和する。

この懸濁液を50 μmの濾布上で遠心分離（または小スケールでは濾過）し、固体を2Veqの水で3回、次いで2Veqのメタノールで3回洗浄する。固体をさらに乾燥させることなく次の工程で直接使用する。

チゾキサニドからのRM5071の調製（工程2）

チゾキサニドをRTで5 Veqのメタノールに分散させる。混合物を+10/+15℃まで冷却する。内部温度を+25℃未満に維持しながらエタノールアミン（1.1当量）をゆっくりと添加する。この懸濁液は灰白色から黄色に変わった。RTで2時間撹拌した後、混合物は50 μmの濾布上の遠心分離機であり（実験室スケールでは濾過し）、固体を2 Veqのメタノールと酢酸エチルの混合物（1/1 V/V）で3回洗浄する。黄色の粉末を真空下で乾燥させる（+50℃、＜100ミリバール）。必要な場合には固体を粉砕すると、RM5071が良質な黄色の粉末として得られる。

付録1：原初のプロトコルRM5071

2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、エタノール塩

チゾキサニド（すなわち2-ヒドロキシベンゾイル-N-[(5-ニトロ)チアゾル-2-イル]アミド、0.53 g、2ミリモル）を、エタノールアミン（0.15 mL）を含有するメタノール（MeOH、20 ml）に懸濁させた。この懸濁液を数分間かけて50℃まで温めると、実質的に透明な黄色の溶液が得られ、それを濾過して5 mLに濃縮したとき、結晶化が容易に始まった。ジエチルエーテル（Et₂O、5 mL）を添加し、この混合物を0℃まで冷却して完全に結晶化させる。濾過し、少量のMeOHを含有するEt₂Oで洗浄すると、表題の塩が黄色の結晶性固体として得られた（0.49 g、75％）；融点158～160℃（分解）；実測値：C, 44.1；H, 4.2；N, 17.35；S, 9.8。C₁₂H₁₄N₄O₅SはC, 44.2；H, 4.3；N, 17.2；S, 9.8％を要求する；1H NMR [400 MHz, (CD₃)₂SO] 2.86 (2H, t, CH₂CH₂)、3.57 (2H, t, CH₂CH₂)、5.20 (1H, br s, OH)、6.81 (2H, m, ArH)、7.32 (1H, m, ArH)、7.67 (3H, br s, NH₃ ⁺)、7.91 (1H, m, ArH)、8.51 (1H, s, 4´-H)、および14.71 (1H, br s, NH)；13C NMR [100 MHz, (CD₃)₂SO] 41.6、57.9、117.5、118.2、119.9、130.1、133.4、137.9、145.9、161.3、171.6、および172.2。；m/z（-veイオンエレクトロスプレーモード）264 [(M-H)^？]。実測値：m/z, 264.0092。C₁₀H₆N₃O₄Sはm/z, 264.0085を要求する。

実施例14

RM5071はチゾキサニド（TIZ、デスアセチル-ニタゾキサニドまたはデスアセチル-NTZAとしても知られる）のプロドラッグであり、ニタゾキサニド（NTZA）の活性な代謝産物であり、FDAによって子供（経口懸濁液）と成人（錠剤）におけるクリストポリジウム・パルバムまたはランブル鞭毛虫の処置に関して承認された抗原虫薬（Alinia）である。

RM5071は、2つのイオン性部分、すなわちチゾキサニドアルコキシドとエタノールアンモニウムからなる有機塩である。エタノールアンモニウムチゾキサニドアルコキシドの化学構造（今後はRM-5071と呼ぶ）を下に示す。RM-5071の実験室スケールの合成は、 NTZAを出発材料として用いる本質的に2工程の合成である。第1の工程は、塩酸（HCl）の存在下で温かい（70℃）ジメチルホルムアミド（DMF）の中に溶かすことによってNTZAのアセチル基を除去した後、室温で水酸化ナトリウム（NaOH）によって中和するというものである。得られた生成物を、次の工程の前に濾過する。第2の工程は、濾過された粉末をメタノールの中に分散させた後、その懸濁液を、エタノールアミンをゆっくりと添加しながら冷却して塩を形成することを必要とする。この固体を濾過し、洗浄し、Rotavaporの中で乾燥させる。最終生成物は黄色の粉末であり、RM-5071と同定される。

RM5071（ヒドロキシエチルアンモニウムチゾキサニドアルコキシド）の化学構造。

この報告は、上記の合成生成物について現在までに得られた物理的特徴づけと化学的特徴づけのデータをまとめている。物理的特徴づけの目的は、特徴（融点、粒子サイズ分布、結晶性、形態、および熱刺激のもとでの性能など）に関する情報を得ることである。化学的特徴づけのデータは、分子の化学的挙動に関する知識を得るため、溶解性、酸-塩基特性、化学的機能、分子量、およびスペクトルの特徴に関する情報を提供する。

1．考察

このセクションは、下に列挙するさまざまな物理的特徴づけと化学的特徴づけの技術からの実施済み分析試験、データ、および結果を記述する：
物理的特徴づけ
・目視検査
・走査電子顕微鏡法（SEM）による粒子の形態
・レーザー回折による粒子サイズの分析
・熱重量分析（TGA）と示差走査熱量測定（DSC）によってモニタした熱量測定転移
化学的特徴づけ
・溶解性
・酸-塩基滴定
・UV-Vis分光法（UV）
・プロトン核磁気共鳴（¹H-NMR）
・エレクトロスプレー-質量分析（ESI-MS）
・フーリエ変換-赤外分光法（FT-IR）
・X線回折（XRD）

RM-5071のサンプルとデスアセチル-NTZA（チゾキサニド）のサンプルを比較目的で提出した。

1.1. 物理的特徴づけ

1.1.1. 目視検査

RM-5071の目視検査では、凝集して容易に壊せる塊になった微粒子を含む明るい黄色の粉末に見える。比較すると、デスアセチル-NTZAのサンプルは、微粒子を含むばらばらの骨白色の粉末に見える。

1.1.2. 走査電子顕微鏡法

走査電子顕微鏡法（SEM）は、サンプルの形態の拡大画像を得るのに利用される分析技術である。これは、電子ビームをサンプルに収束させ、加速電圧を制御して、したがって入射電子の侵入深度と運動エネルギーを制御して後方散乱と二次電子両方のシグナルを獲得することによって実現される。エネルギー分散型分光法（EDS）システムをSEMシステムと組み合わせて利用してサンプルの元素組成を得る。

1.1.2.1 材料と装置

MCCによるSEM/EDS分析で使用した装置は、EDAX X線蛍光検出ユニットを備えた JEOL 6480 LV走査電子顕微鏡であった。

1.1.2.2 手続き

この顕微鏡法はMaterial Characterization Center（MCC）によって実施された。特徴づけと比較のため2つのサンプルをMaterials Characterization Center（MCC）、サン・フアン、プエルト・リコに提出した。材料をへらの助けを借りて分離し、あらかじめアルミニウム片に接着させておいた両面カーボンテープに固定した。後方散乱電子画像（BEI顕微鏡写真）を1500倍の倍率で取得した。粒子サイズの分析を、サンプルを約30 nmの薄膜の金で被覆することによって実施した。両者の分析を高真空の中で20 kVにて実施した。サンプルの二次電子画像（SEI）を500倍と1000倍の倍率の間で取得した。図2と3は、RM 5071とデスアセチル-NTZAの両方に関する2つの異なる倍率での電子顕微鏡画像を示す。図6に示されているように、RM-5071粒子は、層および／または段によって形成されているように見える形態を示す。単一粒子の形の大半は細長い；それでも調べた両方の領域に、不規則な形の粒子と丸い縁部の粒子を含む凝集体を見ることができる。逆に、図7のデスアセチル-NTZA SEM画像は、鋭い縁部を持つ細長い粒子を示している。

RM-5071からのSEM画像（図6）とデスアセチル-NTZAからのSEM画像（図7）を同じ倍率で目視比較すると、RM-5071はデスアセチル-NTZAよりもサイズがわずかに小さい粒子を含有するように見える。さらに、スポット1つ当たり粒子10個のサンプルを測定することによるSEM画像からの情報を利用して、粒子サイズの予備的分析をMCCで実施した。RM-5071サンプルは、粒径がほぼ4.16～26.30 μmで、平均が13 μmであった。デスアセチル-NTZAの粒子サイズはほぼ3.45～34.30 μmで、平均が15.1 μmであった。これらの結果が表5に示されている。それに加え、EDSの結果は、元素組成がRM-5071とデスアセチル-NTZAの両方で似ていた：主要元素としての炭素；ある程度含まれる元素としての酸素と硫黄；および微量元素としての窒素。さらに、サンプルを顕微鏡の中に導入するためのサンプル台の上にカーボンテープを保持するのに用いたアルミニウム片が原因で、アルミニウムの痕跡が、RM-5071とデスアセチル-NTZAの両方のサンプルに存在している。

1.1.3. 粒子のサイズ分布の分析

レーザー回折を0.5～1000ミクロンの範囲の粒子サイズ測定法として利用する。これは、光ビーム（レーザー）が一群の粒子によって散乱されるとき、光散乱の角度が粒子サイズに反比例するという原理に基づく。

1.1.3.1. 方法

レーザー回折を利用したRM-5071サンプルに関する粒子のサイズ分布（PSD）のための適切な方法を、ISO 13320-2009に規定されているガイドライン：粒子サイズ分析-レーザー回折法と、USP＜429＞粒子サイズの光回折測定に基づいて開発した。

1.1.3.2. 材料と装置

粒子のサイズ分布の分析に使用した装置はMalvern Mastersizer 3000であった。ベンチュリ型分散装置を用いて乾式分散を実施した。液体式分散のため、粒子分析サンプルの調製を、2％レシチンを含むIPG（Isopar G、イソパラフィン系炭化水素）の中に固体を分散させ、Elmasonic S超音波浴を用いて15秒間超音波処理することによって実施した。

1.1.3.3. 手続き

方法開発の段階1の目的は、サンプル調製条件と、レーザー回折によるRM-5071の粒子サイズ分析の装置設定を評価することである。

1.1.3.4. 結果

RM-5071サンプルを最初に光学顕微鏡で観察して一般的な粒子のサイズと形を明らかにした後、評価に進んだ。粒子は不規則な形であり、一次粒子は典型的には40 μm以下であることが観察された。柔らかい～半堅固な凝集体がミリメートルのサイズ範囲の粉末に見られる。これら凝集体は、圧力（例えば凝集体をへらの先端で押すこと）によってかなり容易に分散させることができる。

デフォルト設定を用い、分散剤と基剤を変えながら液体分散粒子のサイズ分布の分析を実施して適切な分散液を明らかにした。サンプル材料を十分に分散させて一次粒子にするのにいくらか分散エネルギーを必要とした。デフォルト設定を用いて調製物を15秒間超音波処理した後に分析した。図8は、15秒間の超音波処理の前と後のサンプル調製物分散液のディジタル画像を示す、凝集体は超音波処理の後に分散される。基剤および分散剤として2％レシチンを含むIPG（Isopar G、イソパラフィン系炭化水素）を用いる調製物は、微視的観察によると、最も均一な分散液を生成させるように見えた。これらの条件を乾式分散分析との比較分析で利用した。

乾式分散粒子のサイズ分布を分析するため、圧力滴定を実施してRM-5071粒子に対する圧力の効果を評価した。この分析からの粒子サイズの結果が表3にまとめられている。レーザー回折によるPSD分析の結果から、個々の粒子の大まかなサイズが3～40 μmであり、そして一次粒子の凝集体も観察されるというSEMによる予備的観察結果が確認されることに注意されたい。

各圧力で生じた分布の重ね合わせが、平均液体分布と比較して図9に示されている。湿式分散（赤色で示す）に最もよく似た結果を生じさせる圧力が、分析のために選択するのに最適な圧力であり、それは、図9に青色の線で示されているように1バールである。粒子サイズの分布結果から、サンプルの中に存在する凝集体は試みた乾式分散設定によって十分に分散されていないことが明らかになる。その理由は、100～1200 μmのサイズの粗粒子の小集団が観察されることにある。さらに、圧力が大きくなるにつれて、分布の主要ピークは予想通りより小さな粒子サイズにシフトする。なぜならより高い圧力は一次粒子を破壊する可能性があるからである。最高圧力（4バール）では、乾式分散分析において相変わらず少量の粗粒子が存在する。これは、このより高いエネルギー設定でさえ、少量の凝集体が相変わらず観察されることを示す。

供給速度とホッパーの高さの設定は、最初は、サンプルの安定かつ完全な流れが可能になるように選択したが、圧力滴定分析の終了時には、最初に選択した設定は粉末を十分に一定に装置に供給するには不十分であることが明らかになった。理想的でないサンプル流が凝集体の不完全な分散に寄与した可能性があるため、装置設定を調節してサンプルの流れを改善した。新たな供給率（65％）とホッパーの高さ（1.5 mm）を用いて4バールで分析する圧力滴定、粒子サイズ分布は改善されたサンプル流にもかかわらず同様のままであった。

分散を助けるため、分析するアリコート内の凝集体をへらを用いて分散させた後、装置に添加した。これがうまくいって分析では粗粒子のピークは存在しなかった（図10）が、液体分析と比べてピークはより小さな粒子サイズにシフトする。これらの分析に基づき、方法開発のための予備的因子を表4に示されているように選択した。それは、最適にすべきさらなる方法開発を必要とするであろうが、今回は材料を特徴づけるのに十分である。

1.1.4. 融点

物質は、液相の最初の検出可能な変化が検出される温度から、固相が見られなくなる温度までにわたって融解転移を示す。この転移は、非常に純粋な材料だと瞬時に見える可能性があるが、通常は、プロセスの最初から最後までという範囲が観察される。この転移に影響する因子に含めることができるのは、他の変数もある中で、サンプルのサイズ、粒子サイズ、サンプル内の熱拡散の効率、および加熱速度であり、これらは手続きの指示によって制御される。

1.1.4.1. 方法

融点は、「融点装置BUCHI B-540」という表題の標準的な操作手続きBEL-SOP-000152に従って測定した。

1.1.4.2. 材料と装置

融点分析に使用した装置はBuchi B-540であった。

1.1.4.3. 手続き

融点毛細管の中で4～6 mmの高さに相当する量のRM-5071とデスアセチル-NTZAをBuchi B-540に挿入した。

1.1.4.4. 結果

構造が似た有機分子の融点の違いは属性を識別するのに有用である。RM-5071とデスアセチル-NTZAの両方とも室温で固体である。RM-5071とデスアセチル-NTZAの融点を測定した。結果を表に示す。

これらの結果から、融点の温度がRM-5071（146～148℃）はその前駆体であるデスアセチル-NTZA（240～250℃）と異なることがわかる。この差は、新たな化学物質としてのRM-5071の有用な物理的特性を識別する因子である。それは、合成プロセスの間にRM-5071をデスアセチル-NTZAから識別する手段を提供する。

1.1.5. 乾燥減量

乾燥減量（LOD）はサンプルの含水量を求める試験法だが、場合によりサンプルからの任意の揮発性材料の減量を意味することができる。

1.1.5.1. 材料と装置

LODの測定は認定されていない装置で実施し、加熱は、真空ポンプVacuubrand MD4C（Pmin＝1.5ミリバール）を備えたBinder真空炉で±0.1℃の精度で実施した。サンプルの質量は化学天秤Mettler AG285（d＝0.01 mg）を用いて測定した。

1.1.5.2. 手続き

RM-5071サンプルをへらで軽く押してあらゆる凝集粒子を潰した後、この試験試料を計量した。サンプルを計量ボトルに入れ、その質量を、真空炉の中で2時間にわたって60℃に加熱する前と後の差によって測定した。2回の連続した計量で、採取した物質1 g当たりの差が0.50 mg以下になるまで乾燥を継続し、2回目の計量の後、さらに1時間乾燥させた。この手続きは、USP＜741＞乾燥減量に従って実施する。

1.1.5.3. 結果

USP法によるRM-5071のLOD測定は0.2％である。サンプルの重量は、第2の乾燥ラウンドの後は安定していた。乾燥減量の割合が少ないというのは、合成プロセスから残留していた可能性のある揮発性物質が固体RM-5071に吸着していないことを示唆する。この結果は、次のセクションで論じる熱重量分析（TGA）から得られたデータに合致しており、TGAではRM-5071は100℃まで有意な重量損失をまったく示さない。

1.1.6. 熱量測定分析

示差走査熱量測定（DSC）は、基準に対してサンプルの温度を上昇させるのに必要な熱量の差を温度の関数として測定する1つの熱分析技術である。基準サンプルは、走査すべき温度範囲で熱容量がよく規定されている必要がある。DSCの1つの応用は、相転移（融解、ガラス転移、および／または発熱分解など）の研究である。このような測定は、分子の物理的変化と化学的変化に関する定性的情報と定量的情報を提供する。

熱重量分析（TGA）は、物質の加熱時に起こる重量変化をモニタすることにより、材料の熱安定性と揮発成分の割合を明らかにするのに利用される分析技術である。多くの重量損失曲線は同様に見えるため、結果を解釈できるようになる前にそれらの曲線を変換せねばならない可能性がある。微分重量損失曲線を用いて重量損失が最も明確な点を見分けることができる。分析は、通常は大気中、または不活性雰囲気（窒素など）中で実施される。

1.1.6.1. 材料と装置

DSCとTGAで使用した装置は、それぞれ、TA universal Analysis 2000プログラムを備えたTA装置DSC Q2000とTA TGA Q500装置であった。

1.1.6.2. 手続き

熱量測定分析はMCCによって実施された。DSC分析のため、2.34～2.46 mgの量のサンプルRM-5071とデスアセチル-NTZAを個別にアルミニウム製気密パンの中に入れ、アルミニウム製の蓋で覆った。温度法は、工程1：25℃に10分間保持する、そして工程2：25℃から400まで10.00℃/分で加熱するであった。追加DSC実験を実施し、RM-5071に対して加熱-冷却-加熱サイクリング実験を実施することによりさらなる結晶化の挙動を明らかにした。約1.69 mgのRM-5071サンプルをアルミニウム製気密パンの中に入れ、アルミニウム製の蓋で覆った。温度法は、工程1：25℃に5分間保持する、工程2：25から350℃まで10.00℃/分で加熱する、工程3：350から25℃まで10.00℃/分で冷却する；そして工程4：25から350℃まで10.00℃/分で加熱するであった。両方の分析を窒素下で実施した。

TGA分析のため、2.0～2.6 mgの量のRM-5071サンプルとデスアセチル-NTZAサンプルの両方を個別に白金製パンの中に入れた。温度法は、工程1：25℃で平衡させる、工程2：25℃から700℃まで10.00℃/分で加熱する、工程3：700℃に5分間保持するであった。分析は窒素下で実施した。

1.1.6.3. 結果

図11A（左）はRM-5071のサーモグラムを含んでおり、第1段階の重量損失が85～160℃の温度範囲で約20％であり、3回の別々の熱転移の後の全重量損失が77％であることを示す。約20％という最初の重量損失は、損失がエタノールアンモニウム（平均分子量＝62.09 amu）であり、RM-5071の全重量（平均分子量＝326.33 amu）の19.03％であるという仮説に合致する。デスアセチル-NTZAは199～280℃の温度範囲で第1段階の重量損失が36％であり、2回の転移の後の全重量損失は約67％であった。これらの結果に基づくと、RM-5071とデスアセチル-NTZAの熱特性は、特に両方の分子が起こした熱転移の数と温度に関して有意に異なっている。したがってエタノールアンモニウムの存在により、デスアセチル-NTZA前駆体とそのエタノールアンモニウム塩の間で熱安定性の挙動が異なる結果になる。

図12のRM-5071のDSCは、163℃の位置に1つのピーク転移を示す。この転移温度は、デスアセチル-NTZAに関してDSCサーモグラムで観察された286℃という転移温度よりも低い。両方の分子が発熱転移を示す。RM-5071に関する加熱-冷却-加熱サイクリング実験の結果は、163℃の転移は不可逆的であるためその転移がエタノールアンモニウムの損失と分子の分解の一方または両方に起因する可能性があることを示している。結論として、前駆体デスアセチル-NTZAはそのエタノールアンモニウム塩よりも熱に対して安定である。

1.2. 化学的特徴づけ

1.2.1. 溶解性

USPによれば、溶解性は溶媒が溶質を溶かす能力であり、濃度の単位で定義される。固体の溶解性は極性と温度の関数である。見かけの溶解性は、溶媒中での溶質の経験的に決定された溶解性であり、系が平衡に到達するまでの時間が不十分であることが許される。それに対して平衡溶解性は熱力学的平衡での溶解性限界であり、過剰な固体が存在するときにはそこに向かって溶媒の中に溶質を均一に溶かすことができる。RM-5071の溶解性を理解することは、分析物とその関連物質を定量するための検証済み分析法を開発するために重要である可能性がある。それに加え、溶解性の研究から導出された知識は、最終的な薬製品を製造するための基礎である。

1.2.1.1. 方法

RM-5071の見かけの溶解性を、いくつかの溶媒（具体的には、DMF、DMSO、アセトニトリル（ACN）、水、ACN／水の混合物、メタノール、イソプロパノール、およびエタノール）を用いて調べた。アメリカ合衆国薬局方（USP）は、使用する溶媒とは関係なく、表10にまとめられている定義の基準に単純に従って溶解性を分類している。溶質は、最初にそれぞれの溶媒または溶媒系に1 mg/mLの濃度で溶かした。溶質が溶けずに残った場合には、その後、固体が完全に溶けるのが観察されるまで、濃度がより低い新たな溶液を調製した。この濃度限界を見かけの溶解性と見積もった。

1.2.1.2. 材料と装置

溶解性試験で使用したすべての化学物質が表11に具体的に記載されている。

1.2.1.3. 手続き

溶媒の体積を10 mLから100 mL、1000 mLまで増やしていきながら各溶媒の中にRM-5071を10 mg溶かしてRM-5071の溶液を調製した。目視検査と観察に従い、RM-5071の見かけの溶解性は、USPによって定義されているようにその10に従って分類した。

1.2.1.4. 結果

RM-5071の溶解性の研究を、表11に具体的に示されているいくつかの溶媒の中で室温にて実施した。この化学的特徴づけ報告の目的のため、表10に具体的に示した用語を用いて表12の異なる溶媒中でのRM 5071の溶解性を記述した。

RM-5071は、0.005 mg/mLという低い濃度では水に完全に溶けなかった。実際的な制約（10 mg未満を計量する能力と、1 L超のフラスコを入手できないこと）を理由として、より低い濃度は試さなかった。それでも溶液の黄色と、上清の中でのUV-visスペクトルの観察によって証明されるように、いくらかの量の溶質が水に溶ける。これについてはセクション5.2.3でさらに論じる。1 mg/mLの濃度で調製したRM-5071溶液は明るい黄色であり、時（時間）の経過とともにオレンジ色になった。これは、水中で分子が分解するか不安定である可能性があることを示している可能性がある。

RM-5071はACN：水（65：35）混合物の中に非常に溶けやすい（＞1 mg /mL）。この知見はいくらか驚くべきことである。というのも純粋なアセトニトリルと水の中での溶解性ははるかに小さいからである（それぞれ≦0.033mg/mLと＜0.005 mg/mL）。しかしQiu, et al. Organic Process Research & Development 2019, 23 (7), 1343-1351によれば、調べられたいくつかの帯電した溶質（API）に関し、少量の水に有機溶媒を混合すると、APIの溶解性は、個々の純粋な溶媒の中での溶質の溶解性と比べて増大する。この挙動は相乗的溶媒和効果として知られている（放物線的溶解性としても知られる）。同じ効果が、25：75および50：50の水：アルコール（イソプロパノールとエタノール）の混合物の中のRM-5071で観察された。

1.2.2. 酸-塩基滴定曲線

直接的な滴定は、適切な容器の中の溶液（被滴定物質）に含まれる可溶性物質（被滴定物質）を適切な標準化溶液（滴定剤）で処理し、装置によって、または目視で、適切な指標の助けを借りて反応の終点を明らかにすることである。酸-塩基滴定のため、一連のpH測定値を、被滴定物質に添加された滴定剤の体積（mL）の関数としてプロットするとき、平衡点の近傍に急激に変化する部分を持つシグモイド曲線が得られる。化学的情報（pKa（酸／塩基平衡定数）など）をそのような曲線から導出することができる。

1.2.2.1 材料と装置

滴定剤を添加している間に測定で使用したpH計はMettler-Toledo Seven Excellenceであった。表13に、実験中に使用した全材料が含まれている。

1.2.2.2. 手続き

ビーカーに1 mg/mLのRM-5071溶液（被滴定物質）を20 mL注いで添加することにより酸滴定を実施した、滴定剤として0.01NのHCl溶液を用いている間に溶液のpHを測定した。ビーカーに1 mg/mLのRM-5071溶液を20 mL注いで添加することによりアルカリ滴定を実施し、滴定剤として0.02 NのNaOH溶液を添加している間に溶液のpHを測定した。滴定の間は溶液を磁性攪拌器で撹拌し、pH測定の間は撹拌を停止した。

1.2.2.3. 結果

0.01 NのHClをRM-5071溶液に添加することによって酸性滴定が進行しているとき、20 mLのRM-5071溶液の色彩と溶解性の変化を観察した。最初は、1 mg/mLのRM-5071溶液はpHが9.44である。酸がビーカーに添加されて滴定されるため、pHは予想通り低下する。それに加え、pHが低下するにつれて溶液はますます濁っていき、固体が沈殿する。pHが3.80のとき、ビーカーの内容物の物理的外観は、淡い黄色の溶液の中に懸濁されたベージュ色の粉末である。懸濁されて沈殿した粉末の外観はデスアセチル-NTZAと似ている。これは、分子内のフェノールのヒドロキシル基がプロトン化され、したがってその極性が減少し、その帰結として水への溶解性も低下して溶液から沈殿したことを示唆する。

図13の滴定曲線は、RM-5071の酸-塩基滴定の変曲点を示す。実験曲線の二次微分を用いて変曲点を計算した、当量点の体積は、pH＝5.99の位置で5.83 mLの0.01 N HClである。この情報とRM-5071の質量を用いて計算した酸-塩基反応の化学量論はRM-5071分子1個当たり1個のプロトンになった。変曲点の体積の半分の位置の点は2.92 mLであり、RM-5071についてはpKaが8.8になる。フェノールのプロトンのpKaは9.9である（Vollhardt, K. P. C.; Schore, N. E., Organic Chemistry; Palgrave Version: Structure and Function. Macmillan International Higher Education: 2014による）。したがってpKa推定値が8.8の酸で滴定したプロトンは下記のフェノールの円で囲んだプロトン：
であると結論することは合理的である。

0.01NのNaOH溶液としてのRM-5071溶液を収容したビーカーの画像は、pHが大きくなるにつれて濁った黄色の懸濁液から透明なオレンジ色へと徐々に変化する溶液を示した。pHが大きくなるにつれてRM-5071がますます多く溶け、pH＝10.63で固体の完全な溶解が達成されたことが観察される。滴定曲線が図14にあり、明確な変曲点を見いだすことはできないため、酸性pHの範囲でpKaの情報をこの滴定曲線から引き出すことはできない。滴定曲線に明確な変曲点が不在であることの可能な1つの、だがそれに限定されない説明は、RM-5071分子がアミドの窒素の脱プロトン化後にさまざまな共鳴化学種になりうるというものである可能性があろう。このような説明は、溶液の吸収が、より大きい波長（赤方偏位）で観察されることと整合する可能性がある。

1.2.3. UV-Vis分光法

吸収の波長（λ）は、基底状態と励起状態の間のエネルギー差に対応する。分子がUV-可視光のエネルギーを吸収すると、電子は被占軌道から位置エネルギーがより大きい空軌道へと移る。電子はエネルギーの異なるいくつかの可能な遷移をする可能性がある。RM-5071の場合には、可能性が大きい遷移はσ→π^*とπ→π^*であり、これらはそれぞれ、化学官能基カルボニルと共役炭素二重結合に特徴的である。スペクトルのUV-Vis領域で電磁波が吸収される遷移は電子のエネルギーレベル間の遷移であり、吸収の波長と直接関係している。

吸収の強度は溶液中の化学種の濃度に関係する。ベール-ランベルトの法則は、特定の波長（λ）における可視UV線の強度と分析物の中に存在する物質の濃度の間の関係を規定する。ベール-ランベルトの法則：A＝εlc（ただしAはλでの吸収であり、εはλでのモル吸収係数であり、lは光路長であり、cは種の濃度である）。実施した特徴づけ実験からのUV-可視光の分光結果は、2つの側面、すなわち、さまざまな溶媒中の電子吸収スペクトルと、水中におけるλ_maxでの吸収に基づく上清溶液の中の分子の定量に関する化学的情報を提供する。

1.2.3.1 材料と装置

UV-Vis 分光法の間に使用した材料のリストが表11に示されている。この研究で使用した装置はShimadzu UV-1800シリーズである。

1.2.3.2. 手続き

1.0 Lのメスフラスコの中でほぼ1.00 mgのRM-5071の溶液を調製し、容積まで溶媒を満たすことによってUV-Vis分析を実施した。得られた溶液（固体が相変わらず存在している場合には上清）を、10 mmの標準的な経路長を持つ石英製キュベットに移した。RM-5071のUV-Visスペクトルを以下の溶媒、すなわちDMF、DMSO、水、ACN／水、メタノール、イソプロパノール、およびエタノールで実施した。装置に特異的な条件が表14に掲載されている。

.2.3.3. 結果

異なる溶媒中のRM-5071のλ_maxが表12にまとめられている。色が濃い（可視光領域に吸収を持つ）化合物は、長鎖共役系または多環芳香族発色団を含有する可能性が大きい、図15は、メタノールの中のRM-5071に関する代表的なUV-Vis吸収スペクトルを示しており、異なる溶媒は似たスペクトルを示すが、表15に示されているλ_maxに従ってわずかにシフトしている。ベンゼノイド化合物は、十分な共役置換基を持つ場合に発色する可能性がある；これは、表15に示されている溶液の目視観察に合致する。

特定のλでの吸収と溶液中の分析物の濃度の間の線形関係を利用し、ベール-ランベルトの法則を用いて分析物を定量する。RM-5071の水溶液を0.051、0.025、0.010、0.0075、および0.0051 mg/mLで調製した。これら溶液では固体の小さな塊がフラスコの底部に残るため、超音波処理を利用して固体の溶解を助けた。5分間の超音波処理の後、0.05 mg/mlの溶液を除いて固体粒子はもはや観察されなかった。これら溶液を調製してから1時間にわたって沈殿させた後に上清の吸光度を測定した。これら溶液を後で遠心分離し、上清溶液のスペクトルも取得した。UV-Visの吸収をλmax＝409 nmで測定した。

図16は吸光度と水中のRM-5071の理論的濃度の関係を含む。赤色の曲線は、沈殿後の上清の吸光度の測定値を表わし、青色の線は、遠心分離後の上清の吸光度の測定値を表わす。吸光度と濃度の関係を示すこれら2つの曲線の比較から、r2（相関係数）は青色の線（0.99）が赤色の線（0.97）よりも1に近いことがわかる。これは、RM-5071の濃度が遠心分離の後に平衡に到達することを示す。なぜならこのプロットの線形性はベール-ランベルトの法則に合致することを示すからである。したがってこれは、遠心分離が固体の溶解を助けたことを示す。

1.2.4. 核磁気共鳴

プロトン核磁気共鳴（¹HNMR）は、有機分子の化学構造情報を提供することのできる技術である。この技術は、強磁場におけるプロトン原子核のラジオ周波数（λ＝1～5m）での低エネルギー吸収に基づく。¹HNMRの基礎は、異なる化学的環境内のプロトン原子が外部磁場の存在下でわずかに異なるエネルギーレベルを持つ結果としてその¹HNMRスペクトルにおけるラジオ周波数のエネルギー吸収が異なることにある。NMRスペクトルは、水素原子が周囲の磁場に対してどのように遮蔽されるかに基づいてある分子の官能基を導出するのに使用できる情報を含有する。例えば¹HNMRスペクトルでは、異なるタイプの水素原子核の数を求めることと、各タイプを取り囲む直近の環境の性質に関する情報を得ることが可能である。この化学的情報は貴重である。というのもそれを、他の化学的特徴づけ技術から得られた情報と組み合わせて利用し、ある合成分子について提案される化学構造の導出および／または確認ができるからである。それに加え、スペクトルのピーク下の面積の積分を用い、RM-5071塩の成分間のモル比に関する相対的定量情報を導出することができる。

1.2.4.1. 材料と装置

NMR実験はルーヴェン・カトリック大学、ベルギー国（KUL）で400 MHz Brucker NMRを用いて実施された。

1.2.4.2 手続き

500 μLのDMSO-d6に5 mgのサンプルを溶かすことによってNMR測定を実施した。RM-5071のスペクトルは、D1＝30秒の400 MHzの装置を用いた専用のNMR法（¹H）で取得したため、8.5と2.8 ppmの位置のピークの積分を定量することが可能になった。

1.2.4.3. 結果

図17はRM-5071分子の¹HNMRスペクトルを含み、図18と図19は、ピークパターンの詳細を評価するためスペクトルのさまざまな領域の拡大図を含む。化学シフト（ppm）は、特定の水素原子を取り囲む化学的環境の情報を提供する。ピーク下の領域の積分は、どれだけ多くのプロトンが同じ化学的環境を感知しているかの情報を提供するのに対し、ピーク分割パターンは、その分子内の近傍のプロトンに関する情報を提供する。

全部で14個のプロトンを含有するRM-5071に関して提案される塩分子構造に基づいて割り当てられたスペクトルのピークが以下である。

ピークの割り当ては、予想される両方の対イオン、すなわちエタノールアンモニウムとチゾキサニドアルコキシド（デスアセチル-NTZA）の存在を示す。17.701 ppmの最大化学シフトに位置する一重項のピークは、負電荷の原子に隣接するチゾキサニドアルコキシドの中のアミド基内のプロトン（H-13）に割り当てられる。8.503 ppmに位置する次の一重項のピークは、デスアセチル-NTZAのチアゾール環の中の水素原子（H-14）に属する。7.8～7.9 ppmの範囲にある二重項の二重項は、H-9と呼ばれる芳香族プロトンのプロトンに割り当てられ、酸素原子に最も近いプロトンである。7.673 ppmに位置するピークは、エタノールアンモニウムイオン内の窒素に隣接する3個の同等な「交換可能な」H原子（H-1,2,3）に割り当てられる。というのもシグナルの積分は2.6で約3個のプロトンに対応し、「広い」一重項だからである。すべての特徴が、不安定なアミンのプロトンで予想されることに合致している。約7.3 ppmに位置する複雑な分割パターンは、10位に位置する芳香族水素（H-10）に割り当てられる。それは、一見してそれが、各ピークがさらに分割されていてより大きなシフトに位置するように見える三重項に似ており、2個の同等でない近傍の水素を持つフェノールの酸素原子により近い水素に合致しているからである。約6.8 ppmに位置する多重項の複雑な分割パターンは、水素11と12に割り当てられる2個の水素からのシグナルとしてまとめられる。5.129 ppmに位置する一重項は、エタノールアンモニウムのアルコールプロトンに割り当てられる。3.5と2.8 ppmに位置する三重項は、エタノールアンモニウムイオンの中の酸素に近い脂肪族水素H-6,7と、窒素に近いH-4,5にそれぞれ割り当てられる。

¹HNMRスペクトルからの積分値は、厳密な定量を可能にするには十分に正確でない可能性がある。しかしNMRのピークの積分データを用いてRM-5071塩の中のエタノールアンモニウムイオンとチゾキサニドアルコキシドイオンの間のモル比を推定することはできる。例えば8.50 ppm（チアゾール環のH-14）に位置するピークの面積を1.00（基準）に設定する。次に、約2.8 ppmと2.3 ppm（エタノールアミンの脂肪族H）に位置するピークで観察された領域の積分はそれぞれ1.956と1.952である。これは、それらイオン間のモル比が1：1である場合にこれら2個の水素の間で予想されるモル比であることに合致する。

1.2.5. 質量スペクトル

エレクトロスプレーイオン化（ESI）は1つのタイプのイオン化技術であり、分析物分子が帯電した液滴を形成することによって気相にされた後、質量分析（MS）される。これらの帯電した液滴は、分子イオンの断片化を回避する真空に導入されたときに脱溶媒のプロセスを経る。ESIは大きな有機分子からイオンを生成させるのに有用である可能性がある。なぜならESIは、イオン化されたときにこれら分子が断片になる傾向に打ち勝つからである。ESI-MSスペクトルから得られる情報は特徴づけの目的で有用である。なぜなら完全な分子の分子量を、得られた質量スペクトルから導出できるからである。有機分子の陽イオン質量スペクトルは、典型的には、プロトン化された種（[M+H]⁺、[M+2H]²⁺など）と、ナトリウム、カリウム、または他のカチオンの付加物（[M+Na]⁺、[M+K]⁺ など）に対応する。陰イオン質量スペクトルは、典型的には脱プロトン化された種（[M-H]^-、[M-2H]^2-など）からなる。

1.2.5.1. 材料と装置

MCCで直接注入エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）に使用した装置は、Mass Lynxデータ取得ソフトウエアを備える研究装置Xevo G2-S QToF（四重極-飛行時間）である。ランデン（ベルギー国）でのHPLC-DAD-ESI-MS実験で使用した装置はAgilent 1100 HPLCであり、同時に、ダイオードアレイ検出（DAD）と、エレクトロスプレーイオン化（ESI）とOpen Labデータ取得ソフトウエア付きInfinityLab MSD G6100四重極質量分析（MS）検出がなされる。HPLCからの流れは、DADに2/3、ESI-MSに1/3と分割される。

1.2.5.2. 手続き

約6 mgのRM-5071のサンプル調製物を計量した。RM-5071サンプルを10 mLのメスフラスコに移し、正-ESIのためにはジメチルスルホキシド（DMSO）を、負ESIのためにはメタノールを印まで満たした。両方のサンプルをさらに希釈した後、これらサンプルをシステムに直接注入した。装置の設定と装置の仕様は表16に詳しく示されている。

ベルギー国での手続きは、ジメチルホルムアミド（DMF）の中の0.61 mg/mLの間の濃度のRM-5071のサンプルを分析するというものであった。この混合物をAgilent InfinityLab MSD G6100の中に以下のクロマトグラフィ条件で注入した：

吸光度のクロマトグラム（DAD）と全イオンクロマトグラム（MD）を時間の関数として生成させた。吸光度クロマトグラムの中で基準として同定されるチゾキサニドアルコキシドのピークの質量スペクトルを正モードと負モードで取得した。

1.2.5.3. 結果

正と負のイオン化ESI-MSに関するイオンm/z（電荷に対する質量の比）の主要なシグナルのまとめが、エラー！参照元が見つからない18に示されている。エラー！参照元が見つからないは、DMSOに溶かしたRM-5071の正ESI-MSスペクトルを含む。メタノール中のRM-5071のマイナスイオンESI-MSスペクトルもエラー！参照元が見つからないに示されており、そこではm/z 264に位置する基本ピークが観察され、チゾキサニドアルコキシドの[M-H]^-1イオンに対応している。

クロマトグラフィで分離した後にベルギー国で実施した実験から、全イオンクロマトグラムが得られた。全イオンクロマトグラムからのチゾキサニドアルコキシドのピークのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルが図21に示されている。正と負のESI-MS [M+1]+1両方で観測された分子イオンはそれぞれm/z 266.10と[M-1]-1 m/z 264.10であり、これらのピークはチゾキサニドアルコキシドのマイナス分子イオンの予想質量と一致する。

1.2.6. FT-IR

フーリエ変換赤外分光法（FTIR）は、有機分子の特徴づけにとって価値がある可能性のある分析技術である。FTIRでは、分子内の特定の結合の伸縮と変角に関係する振動モードによる赤外エネルギーの吸収が記録される。得られるスペクトルは、分子内の結合と官能基の別々の吸収特性の組み合わせである。したがってFTIRスペクトルは、既知のスペクトルを基準にして同定または比較するための分子の「指紋」になる。RM-5071の場合には、スペクトルをデスアセチル-NTZAのスペクトルと比較することができる。

1.2.6.1. 材料と装置

RM-5071とデスアセチル-NTZAのFT-IR分析を実施するためにMCCで使用した装置は、Continuum IR顕微鏡を備えるThermo iS50分光計である。ランデン（ベルギー国）でFTIR分析のために使用したFTIR装置は、減衰全反射アクセサリーを取り付けたShimadzu IRafinityである。

1.2.6.2. 手続き

へらを用いてサンプルを分離した。RM-5071サンプルとデスアセチルNTZAサンプルは、分離されると、（個別に）2つのダイヤモンド顕微鏡法セルに取り付けられて圧縮され、薄膜が得られる。顕微鏡法フィルムをContinuum IR顕微鏡の台の上に載せた。

1.2.6.3. 結果

FTIR技術は通常、既知の化合物またはコンピュータデータ検索からの化合物のスペクトルを基準にして同定または比較するためのサンプルの特別な「指紋」を得るのに利用される。RM-5071とデスアセチル-NTZAのFTIRスペクトルがエラー！参照元が見つからないにある。両方のサンプルについて同定された官能基のまとめが表19に示されている。エラー！参照元が見つからないは、ランデン（ベルギー国）で得られたFTIRスペクトルを含む。

RM-5071とデスアセチル-NTZAのFTIRスペクトルの重ね合わせを一瞥すると類似性と顕著な差が見られ、それを分析してRM-5071塩に関する重要な情報を得ることができる。スペクトルの差はRM-5071の中のエタノールアンモニウムイオンの存在、したがってチゾキサニドアルコキシド対イオンを取り囲む異なる化学的環境に起因する可能性が大きい。両方のスペクトルが、典型的には両方の分子に共通するO-HとN-Hの伸縮モードに特徴的な3000 cm^-1の領域に広いピーク吸収を示す。デスアセチル-NTZAのスペクトルは、約3250cm^-1の位置の鋭く強いピークと、約3100 cm^-1の位置の鋭いが強度がより小さいピークを示すが、これらはRM-5071のスペクトルには存在しない。それに加え、約1670 cm^-1の位置に鋭く強いバンドが存在し、これは典型的にはデスアセチル-NTZAのスペクトルに存在するカルボニル伸縮モードに特徴的だが、RM-5071のスペクトルではこのバンドが完全に消失している。1672 cm^-1周辺のアミドカルボニルピークと、3100と3250 cm^-1の位置のピーク（おそらくN-HまたはOHのシグナル）の消失は、図23に示されているフェノラート-アンモニウム-アミド分子内配位錯体が共鳴に強く寄与していることを示唆する。

スペクトルの約1500cm^-1未満の「指紋」領域は、エタノールアンモニウムイオンの官能基の寄与に起因すると予想され、両方の分子の間で異なっている。アミドカルボニルのピークの消失は、ベルギー国でのFT-IR実験の結果によっても確認された。FT-IR分析も、減衰全反射（ATR）アクセサリーを用いて粉末として実施した。結果は、RM-5071とデスアセチル-NTZAの間でカルボニルのピークとN-H伸縮のピークに明確な差をやはり示した。それに加え、分析したデスアセチル-NTZAとエタノールアミンの1：1混合物は、RM-5071のスペクトルとは異なるカルボニルのピーク1672 cm^-1を示したため、このピークは塩でだけ消失し、個々の分子の混合物では消失しないことが確認される。これは、塩錯体の形成を支持する。

1.2.7. XRD

X線回折は、単色X線と結晶サンプルの間の強め合う干渉に基づく。ブラッグの法則（nλ＝2d sin θ）の条件が満たされるとき、入射線とサンプルの相互作用によって強め合う干渉（と回折されたX線）が生じる。この法則は、電磁波の波長を回折角および結晶サンプル内の格子の間隔と関係づける。X線結晶学は、結晶の原子構造と分子構造を同定するのに利用されるツールであり、結晶内では結晶原子が入射X線のビームを多くの特定の方向に回折させる。

1.2.7.1. 材料と装置

分析を実行するためMCCによって使用された装置はRigaku SmartLab X線回折計である。

1.2.7.2. 手続き

XRD分析を、密封された銅陰極管、Cu-Kベータフィルタ、およびD/teX Ultra検出器を備えるRigaku SmartLab X線回折計システムで実施した。

温度試験を実施し、加熱したときにサンプルRM-5071に何らかの物理的変化と結晶性の変化が起こるかどうかを明らかにした。何らかの変化が起こるかどうかを調べるため、2セットの実験を以下のように実施した：

実験A - 2枚のペトリ皿を「速い」と「遅い」と名づけた。各ペトリ皿にへら約2杯分のサンプルRM-5071を添加した。その後、炉のスイッチを入れ、温度をほぼ160～165℃に設定した。この温度に到達した後、ペトリ皿を炉の中に15分間入れた。時間が来たとき、炉のスイッチを切って「速い」サンプルを取り出し、フードの中に放置して室温（RT）に到達させた。「遅い」サンプルは炉の中に残してよりゆっくりとRTに到達させた。「遅い」サンプルはRTに到達したとき炉から取り出した。サンプルをXRDによって分析した。

実験B - ほぼ110～120℃の温度範囲で上記の手続きに従った。その温度に到達した後、ペトリ皿を炉の中に10分間入れた。炉からのサンプルの取り出しは、前に記載したようにした。その後、サンプルをXRDによって分析した。

1.2.7.3. 結果

X線回折によって生じた回折されたこれらビームの角度と強度を測定することにより、結晶内の電子の密度の三次元画像を作成することができる。RM-5071サンプルは識別可能なXRDパターンを示し、回折シグナルは2θ角が8～37°であった。これは、この材料が結晶形態を示すことを示唆する。デスアセチル-NTZAサンプルは識別可能なXRDパターンを示し、回折シグナルは2θ角が6～44°であった。これは、この材料が結晶形態を示すことを示唆する。RM-5071とデスアセチル-NTZAは異なるXRDパターンを示した。これは、これらが異なる結晶形態を示すことを示唆する（エラー！参照元が見つからないA～B）。

温度試験を実施し、加熱時にRM-5071になんらかの物理的変化と結晶性の変化が起こるかどうかを明らかにした。これら加熱実験の温度は、図11で同定されたTGA転移に基づいて選択した、実験Aは160～165℃まで加熱し、実験Bは110～120℃まで加熱した。この加熱実験の結果が表20にまとめられている。結果は、実験Aにおいて、サンプルの外観が、明るい黄色から、ベージュ色の部分を持つ黒色の粉末へと変化したことを示す。ベージュ色の部分のXRDパターンはデスアセチル-NTZAのパターンと似ている。黒色粉末のXRDディフラクトグラムはデスアセチル-NTZAのディフラクトグラムにもRM-5071のディフラクトグラムにも似ておらず、アモルファス材料に特徴的であった。実験Bの結果は、110～120℃で材料は有意に変化しないことを示しており、それは加熱の前と後で粉末とXRDパターンに物理的変化がないことによって証明される。

2．結論

この報告では、RM-5071に関して集積された化学的、物理的特徴づけデータについて論じた。それに加え、RM-5071の化学的特性と物理的特性をその前駆体デスアセチル-NTZAのそれと比較した。

RM-5071は約11 μmの平均粒子サイズを持つ黄色の粉末であることが、レーザー回折分析によって明らかになり、走査電子顕微鏡画像によって確認される。RM-5071は凝集体を形成し、ベンチュリ型分散装置の中で力学的作用、超音波処理、または空気圧によって分散させることができる。融点は146～148℃の範囲である。熱重量分析と示差走査熱量測定によって調べた材料の熱特性は、固体が163℃まで安定であり、そこで不可逆的な転移を起こすことを示す。この温度はデスアセチル-NTZAの第1の転移温度よりも低い。XRDは、RM-5071がデスアセチル-NTZAとはさらに異なる結晶構造を持つことを反映している。

RM-5071は、USPの定義によると、DMF、DMSO、ACN：水には非常に溶けやすいが、水にはわずかに溶けるにさえ至らない。RM-5071は、メタノール、エタノール、およびイソプロパノールに溶け（＜0.033 mg/mL）、水：エタノールまたはイソプロパノールの二元混合物25：75と50：50には非常に溶けやすい。RM-5071のフェノールのプロトンのpKaは、酸塩基滴定によって8.8と求まる。UV-Visによる特徴づけは、すべての溶媒について409～431 nmの範囲の可視光領域にピークを示した。エレクトロスプレー質量分析の結果は、溶液中にデスアセチル-NTZAが存在する証拠を示しており、負モードと、RM-5071サンプルのクロマトグラフィの後の負モードと正モードの両方で最も簡単に検出され、予想される質量／電荷比が確認される。FTIRデータは、互変異性体の間に提案されている平衡が存在することを示唆している可能性があり、その理由は、RM-5071のIRスペクトルにおいて、純粋なデスアセチル-NTZAのスペクトル、およびデスアセチル-NTZAとエタノールアミンの1：1混合物のスペクトルと比べて特徴的なカルボニルのバンドが消失していることにある。FTIRスペクトルを用いてRM-5071をその前駆体から識別することができる。

ここまで特定の好ましい実施形態に言及しているが、本発明がそのように限定されはしないことが理解されよう。当業者は、開示されている実施形態に対するさまざまな改変が可能であること、そしてそのような改変は本発明の範囲に入ると想定されることに思い至るであろう。

本明細書で引用されている刊行物、特許出願、および特許のすべては、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

Claims (46)

1. 式：
   を持つ化合物（ただしRはNO₂またはハロゲンである）のアミン含有塩。
2. RがNO₂である、請求項1のアミン含有塩。
3. RがClである、請求項1のアミン含有塩。
4. アルキルアミン塩、アルコキシアミン塩、またはシクロアルキルアミン塩である、請求項1～3のいずれか1項のアミン含有塩。
5. 前記化合物のエタノールアミン塩である、請求項1～4のいずれか1項のアミン含有塩。
6. 前記化合物のモルホリン塩である、請求項1～4のいずれか1項のアミン含有塩。
7. 前記化合物のプロパノールアミン塩である、請求項1～4のいずれか1項のアミン含有塩。
8. 前記化合物のN-メチルピペラジン塩である、請求項1～4のいずれか1項のアミン含有塩。
9. 結晶塩である、請求項1～8のいずれか1項のアミン含有塩。
10. 少なくとも90％の純度を持つ請求項1～9のいずれか1項のアミン含有塩のバッチ。
11. 少なくとも100 gのアミン含有塩を含有する、請求項10のバッチ。
12. 請求項1～9のいずれか1項のアミン含有塩と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
13. 経口医薬組成物である、請求項12の医薬組成物。
14. 哺乳類に投与されたとき、哺乳類の血漿中で前記化合物の最大濃度を1時間以下で提供する、請求項12または13の医薬組成物。
15. RがNO₂であり、哺乳類に投与されたとき、前記哺乳類の血漿中で、ニタゾキサニドを含む医薬組成物よりも早く前記化合物の最大濃度を提供する、請求項12または13の医薬組成物。
16. RがNO₂であり、哺乳類に投与されたとき、前記哺乳類の血漿中で、前記化合物のAUC_0-12h濃度を、ニタゾキサニドを含む医薬組成物のAUC_0-12h濃度以上で提供する、請求項12または13の医薬組成物。
17. RがNO₂であり、哺乳類に投与されたとき、前記哺乳類の血漿中で、前記化合物とグルコロノ形態のその化合物のAUC_0-12h濃度を、ニタゾキサニドを含む医薬組成物のAUC_0-12h濃度以上で提供する、請求項12または13の医薬組成物。
18. チゾキサニドの塩と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物であって、その組成物が哺乳類に投与されたとき、哺乳類の血漿中でチゾキサニドの最大濃度を1時間以下で提供する、医薬組成物。
19. チゾキサニドの塩と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物であって、その組成物が哺乳類に投与されたとき、前記哺乳類の血漿中で、ニタゾキサニドを含む医薬組成物よりも早くチゾキサニドの最大濃度を提供する、医薬組成物。
20. チゾキサニドの塩と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物であって、その組成物が哺乳類に投与されたとき、前記哺乳類の血漿中で、チゾキサニドとグルコロノチゾキサニドのAUC_0-12h濃度を、ニタゾキサニドを含む医薬組成物のAUC_0-12h濃度以上で提供する、医薬組成物。
21. 経口組成物である、請求項18～20のいずれか1項の医薬組成物。
22. 前記塩がチゾキサニドのエタノールアミン塩である、請求項18～21のいずれか1項の医薬組成物。
23. チアゾリド化合物のアミン含有塩を製造する方法であって、
    式：
    のチアゾリド化合物（ただしRはNO₂またはClである）をアミン含有化合物と反応させてチアゾリド化合物のアミン含有塩を生成させることを含む方法。
24. RがNO₂である、請求項23の方法。
25. RがClである、請求項23の方法。
26. 前記アミン含有化合物が液体アミン含有化合物である、請求項23～25のいずれか1項の方法。
27. 前記アミン含有化合物が、アルキルアミン、アルコキシアミン、またはシクロアルキルアミンである、請求項26の方法。
28. 前記アミン含有化合物がエタノールアミンであり、前記アミン含有塩がチアゾリド化合物のエタノールアミン塩である、請求項27の方法。
29. 前記アミン含有化合物がモルホリンであり、前記アミン含有塩が前記化合物のモルホリン塩である、請求項27の方法。
30. 前記アミン含有化合物がプロパノールアミンであり、前記アミン含有塩が前記化合物のプロパノールアミン塩である、請求項27の方法。
31. 前記アミン含有化合物がN-メチルピペラジンであり、前記アミン含有塩が前記化合物のN-メチルピペラジン塩である、請求項27の方法。
32. 生成した前記アミン含有塩が少なくとも90％の純度を持つ、請求項23～31のいずれか1項の方法。
33. 前記アミン含有塩が少なくとも100 gの量で生成する、請求項32の方法。
34. 前記反応をアルコール溶液の中で実施する、請求項23～33のいずれか1項の方法。
35. 生成した前記アミン含有塩を結晶化させることをさらに含む、請求項34の方法。
36. 式：
    のプロドラッグチアゾリド化合物を変換して式：
    のチアゾリド化合物を生成させることをさらに含む、請求項23～35のいずれか1項の方法。
37. 前記プロドラッグチアゾリド化合物を加熱することを含む、請求項36の方法。
38. チゾキサニドのエタノールアミン塩。
39. 約4ミクロン～約40ミクロンの粒子サイズを持つ、請求項38の塩。
40. 約146℃～約148℃の融解温度を持つ、請求項38または39の塩。
41. 結晶形態である、請求項38～40のいずれか1項の塩。
42. 図12Aのような示差走査熱量測定（DSC）曲線を持つ、請求項38～41のいずれか1項の塩。
43. 波長1.39222 ÅのCu-Kβ線を用いて回折装置で求めたX線粉末ディフラクトグラムを持ち、そのディフラクトグラムが、8.5°±0.2°、11.2°±0.2°、16.8°±0.2°、19.5°±0.2°、20.9°±0.2°、25.6°±0.2°、27.0°±0.2°、および36.1°±0.2° 2θの位置にピークを持つ、請求項38～42のいずれか1項の塩。
44. 波長1.39222 ÅのCu-Kβ線を用いて回折計で求めた図25AのようなX線粉末ディフラクトグラムを持つ、請求項38～42のいずれか1項の塩。
45. 請求項38～44のいずれか1項のエタノールアミン塩を少なくとも0.8 kg含むバッチ。
46. 中に含まれるエタノールアミンとチゾキサニドの間のモル比が0.9と1.00の間である、請求項45のバッチ。