JP2023532429A - Antipathogen device and method for antifungal applications - Google Patents

Antipathogen device and method for antifungal applications Download PDF

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Abstract

抗真菌用途のための抗病原体デバイスおよびその方法のための様々な実施形態が本明細書に開示される。Various embodiments for anti-pathogen devices and methods thereof for anti-fungal applications are disclosed herein.

Description

本開示は、一般に、抗病原体デバイスのためのシステムおよび方法に関し、特に、ヒトに対する毒性または環境に対する有害作用を有しないＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ病原体に対する抗真菌特性を有する窒化ケイ素バイオセラミックに関する。 TECHNICAL FIELD This disclosure relates generally to systems and methods for antipathogen devices, and more particularly to silicon nitride bioceramics having antifungal properties against Plasmopara viticola pathogens without toxicity to humans or adverse effects on the environment.

農薬の適用は、ブドウのつるの感染症を予防し、収穫量を改善する最も一般的な方法である。しかし、卵菌Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａによって引き起こされ得るうどんこ病およびべと病は、大量の抗真菌剤の頻繁な適用を必要とする。欧州連合において施用されるすべての合成殺真菌剤の約２／３が、これらの種類の植物病原体を防除するために使用されている。北米原産であり、前世紀の終わりに偶然にヨーロッパにもたらされたＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａは、複数の天候調節された年間の施用によってのみ防除することができる。健康上のリスクおよびそれらの環境への影響の両方を最小限に抑えるために、最低濃度の限られた数の殺真菌剤のみが使用されているが、両方の要因は、病原体が耐性を発達させるリスクを高める。これらの理由から、環境に優しい抗真菌製品の開発を含む、化学処理の代替物を見出す努力がかなりの注目を集めている。新しい概念のいくつかには、植物病原体に対する全身的耐性を付与する微生物が含まれる。集団遺伝学を使用した宿主－病原体の相互作用の操作による感染に対する増殖耐性は、別の好ましい技術である。これは、しばしば化学的防除と並行して行われる。これらの後者のアプローチは、トランスクリプトーム法および分析法に起源を有する。農薬の代替品の探索は、健康、安全、および環境問題に対して公衆が敏感であることを考慮して、現代社会の優先事項となっている。 Application of pesticides is the most common method of preventing grape vine infections and improving yields. However, powdery mildew and downy mildew, which can be caused by the oomycete Plasmopara viticola, require frequent application of large doses of antifungal agents. About two-thirds of all synthetic fungicides applied in the European Union are used to control these types of plant pathogens. Native to North America and accidentally brought to Europe at the end of the last century, Plasmopara viticola can only be controlled by multiple, climate-controlled, annual applications. Only a limited number of fungicides at minimal concentrations are used to minimize both health risks and their environmental impact, both factors contributing to the development of resistance by pathogens. increase the risk of For these reasons, efforts to find alternatives to chemical treatments, including the development of environmentally friendly antifungal products, have received considerable attention. Some of the new concepts involve microbes that confer systemic resistance to plant pathogens. Growth resistance to infection through manipulation of host-pathogen interactions using population genetics is another preferred technique. This is often done in parallel with chemical control. These latter approaches have their origins in transcriptomic and analytical methods. The search for alternatives to pesticides has become a priority of modern society given the public's sensitivity to health, safety, and environmental issues.

Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａは、葉および未熟成の果実を含む植物のすべての部分を攻撃する。無性胞子嚢は、穏やかで湿気のある天候に助けられて遊走子を放出し、遊走子は最終的に気孔に付着してこれに包まれ、気孔下腔まで貫通した発芽管を形成する。発芽管は最終的に感染小胞に変わる。一次菌糸は分枝を出現させ、迅速に発達させ、その吸根は、養分を引き込むために植物組織に侵入する。数日間の感染インキュベーションの後、胞子嚢柄が出現して新たな胞子嚢を形成する。多数の殺真菌剤が成長期に施用されるが、それらの種類、量および時期は、疾患の性質およびブドウのつるの品種に依存する。ほとんどの地理的地域では、べと病の管理には、成長サイクルの非常に早い時期から始まるいくつかの施用が必要である。殺真菌剤の頻繁な使用、それらの高いコスト、および環境に対するそれらの長期的な害は、より効果的で長期的で環境に優しい代替物の開発を必要とする。これらの新しい概念および物質の可能性を考えると、従来型の殺真菌化合物は、真に必要とされる条件に制限されるはずである。 Plasmopara viticola attacks all parts of the plant including leaves and unripe fruits. The asexual sporangia, aided by mild, moist weather, release zoospores that eventually attach to and become encased in the stomata, forming germ tubes that penetrate to the substomatal space. The germ tube eventually transforms into an infectious vesicle. The primary hyphae emerge and develop branches rapidly, and their suckers penetrate the plant tissue to draw in nutrients. After several days of infection incubation, sporangiophores emerge and form new sporangia. Many fungicides are applied during the growing season, but their type, amount and timing depend on the nature of the disease and the grapevine variety. In most geographical areas, downy mildew control requires several applications beginning very early in the growth cycle. The frequent use of fungicides, their high cost, and their long-term harm to the environment require the development of more effective, long-term and environmentally friendly alternatives. Given the potential of these new concepts and materials, conventional fungicidal compounds should be restricted to conditions of genuine need.

とりわけ、本開示の様々な態様が考えられ開発されたことは、これらの観察結果を念頭に置いている。 It is with these observations in mind, among other things, that the various aspects of the present disclosure have been conceived and developed.

本明細書では、植物において病原体を処理または予防する方法であって、植物を窒化ケイ素を含む組成物と接触させることを含む方法が開示される。組成物は、窒化ケイ素粒子および水性溶媒のスラリーを含み得る。いくつかの実施形態では、溶媒は水を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．５体積％～約２０体積％の窒化ケイ素を含み得る。接触工程は、噴霧、ミスチング、または浸漬を含むことができる。植物は、農業植物、樹木、またはつるを含み得る。いくつかの特定の実施形態では、植物は、穀物、マメ科植物、塊茎、草、油種子、野菜または果実を含み得る。いくつかの他の特定の実施形態では、樹木は、果樹、ランドスケープの木、または森林樹であり得る。さらに他の特定の実施形態では、つる植物はブドウのつるであり得る。一例では、植物は、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ、ＣａｎｎｏｎａｕまたはＳｕｌｔａｎａを含むＶｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａであり得る。病原体は、べと病、うどんこ病、灰色かび病、フザリウム病、さび病、リゾクトニア病、クレロチニア病、またはスクレロチウム病を含む植物病害を引き起こす病原体を含み得る。病原体は、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａなどの真菌であり得る。 Disclosed herein are methods of treating or preventing pathogens in plants comprising contacting the plants with a composition comprising silicon nitride. The composition may comprise a slurry of silicon nitride particles and an aqueous solvent. In some embodiments, the solvent can include water. In some embodiments, the composition can include from about 0.5% to about 20% by volume silicon nitride. The contacting step can include spraying, misting, or immersion. Plants may include agricultural plants, trees, or vines. In some particular embodiments, plants may include grains, legumes, tubers, grasses, oilseeds, vegetables or fruits. In some other specific embodiments, trees can be fruit trees, landscape trees, or forest trees. In still other particular embodiments, the vine can be a grape vine. In one example, the plant can be Vitis vinifera, including Cabernet Sauvignon, Cannonau or Sultana. Pathogens may include pathogens that cause plant diseases including downy mildew, powdery mildew, gray mold, fusarium, rust, rhizoctonia, clerotinia, or sclerotia. The pathogen can be a fungus such as Plasmopara viticola.

本発明の他の態様および反復は、以下により完全に記載される。 Other aspects and iterations of the invention are described more fully below.

図１Ａ～図１Ｃは、Ｓｉ３Ｎ４水懸濁液中の時間の関数としてのｐＨの測定値を示すグラフ表示であり、図１Ｄは、Ｓｉ３Ｎ４粉末の分散直後に生成された気泡の画像である。FIGS. 1A - 1C are graphical representations showing pH measurements as a function of time in aqueous Si 3 N 4 suspensions, and FIG. is an image of

図２Ａ～２Ｃは、懸濁液中のＳｉ３Ｎ４粉末の顆粒を含む水性環境における胞子嚢の顕微鏡写真である。図２Ｄ～２Ｆは、Ｓｉ３Ｎ４粉末の非存在下で純水に埋め込まれた胞子嚢の顕微鏡写真を示す。図２Ｇ～２Ｋは、徐々にＳｉ３Ｎ４顆粒によって完全に覆われるようになり、遊走子を放出しなかった、それらの胞子嚢を示す顕微鏡写真を示す。Figures 2A-2C are photomicrographs of sporangia in an aqueous environment containing granules of Si 3 N 4 powder in suspension. Figures 2D-2F show micrographs of sporangia embedded in pure water in the absence of Si 3 N 4 powder. Figures 2G-2K show photomicrographs showing those sporangia that gradually became completely covered by Si3N4 granules and did not release zoospores.

図３Ａは、胞子嚢の膜とＳｉ３Ｎ４顆粒との相互作用を経時的に示す画像であり、図３Ｂは、図３Ａの拡大図である。FIG. 3A is an image showing the interaction of sporangia membranes and Si 3 N 4 granules over time, and FIG. 3B is an enlarged view of FIG. 3A.

図４Ａおよび図４Ｂは、Ｓｉ３Ｎ４顆粒を含む（図４Ａ）およびＳｉ３Ｎ４顆粒を含まない（図４Ｂ）で０～２時間水に懸濁させた濃度３．０×１０４ｍｌ－１の生きている胞子嚢の蛍光画像である。図４Ｃは、蛍光画像で直接計数したときに検出された胞子嚢および生きた胞子嚢の総画分の同時の定量化を示す、部分的なプロットのグラフ表示である。Figures 4A and 4B show concentrations of 3.0 x 104 ml with Si3N4 granules ( Figure 4A) and without Si3N4 granules (Figure 4B) suspended in water for 0-2 hours. Fluorescence image of viable sporangia of -1 . FIG. 4C is a graphical representation of a partial plot showing simultaneous quantification of the total fraction of sporangia detected and viable sporangia when counted directly on the fluorescence image.

図５Ａ～５Ｃは、ブドウのつるの種、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの画像であり、対照群（図５Ａ）、前処理群（図５Ｂ）、および共処理群（図５Ｃ）が示されている。Figures 5A-5C are images of the grape vine seed, Cabernet Sauvignon, showing the control (Figure 5A), pre-treated (Figure 5B), and co-treated (Figure 5C) groups.

図６Ａ～６Ｃは、対照群（図６Ａ）、前処理群（図６Ｂ）、および共処理群（図６Ｃ）が示されているブドウのつるの種、Ｃａｎｎｏｎａｕの画像である。Figures 6A-6C are images of the grape vine seed, Cannonau, showing the control (Figure 6A), pre-treated (Figure 6B), and co-treated (Figure 6C) groups.

図７Ａおよび７Ｂは、純水（図７Ａ）および１．５体積％のＳｉ３Ｎ４粉末を含有する水懸濁液（図７Ｂ）に、室温で１０分間浸漬した後の、Ｐ． ｖｉｔｉｃｏｌａの平均ラマンスペクトルのグラフ表示である。 Figures 7A and 7B show the P.E. 2 is a graphical representation of the average Raman spectrum of viticola.

図８Ａは、ＮＨ３およびＮＨ４ ＋の相対濃度を示すグラフ表示であり、図８Ｂは、ｐＨの関数として水に溶出した窒素種の定量的プロットを示すグラフ表示である。FIG. 8A is a graphical representation showing the relative concentrations of NH 3 and NH 4 + and FIG. 8B is a graphical representation showing a quantitative plot of eluted nitrogen species in water as a function of pH.

図９Ａは、主な振動モードが観察された、水にさらされた胞子嚢についてのＤＮＡ核酸塩基の初期構造である。FIG. 9A is the initial structure of the DNA nucleobases for the water-exposed sporangia in which the dominant vibrational modes were observed. 図９Ｂは、受動的に浸透されたＮＨ３の存在に起因するゲノム完全性の喪失を示す、胞子嚢のＤＮＡ核酸塩基である。FIG. 9B is a sporangia DNA nucleobase showing loss of genomic integrity due to the presence of passively percolated NH3 . 図９Ｃは、環内の両方のＮ原子がプロトン化された中性形態のプロトン化イミダゾール環を示す。FIG. 9C shows the protonated imidazole ring in neutral form with both N atoms in the ring protonated. 図９Ｄは、１つのプロトンが失われた脱プロトン化イミダゾール環を示す。FIG. 9D shows a deprotonated imidazole ring with one proton lost.

図１０Ａは、図９Ａに示される構造の荷電イミダゾール環および中性イミダゾール環の振動に関連するスペクトルゾーン１０５０～１１５０ｃｍ－１からの高分解能ラマンシグナルを示すグラフ図である。FIG. 10A is a graphical representation showing high-resolution Raman signals from the spectral zone 1050-1150 cm −1 associated with charged and neutral imidazole ring vibrations of the structure shown in FIG. 9A. 図１０Ｂは、図９Ｂに示される構造の荷電イミダゾール環および中性イミダゾール環の振動に関連するスペクトルゾーン１０５０～１１５０ｃｍ－１からの高分解能ラマンシグナルを示すグラフ図である。FIG. 10B is a graphical representation showing high-resolution Raman signals from the spectral zone 1050-1150 cm −1 associated with charged and neutral imidazole ring vibrations of the structure shown in FIG. 9B.

図１１Ａは、Ｓｉ３Ｎ４顆粒を捕捉する気孔における緩衝効果および関連するアンモニアの溶出を示す概略図であり、図１１Ｂは、病原体／Ｓｉ３Ｎ４界面で活性な抗真菌剤としてのアンモニウムおよびアンモニアの形成を伴う、胞子嚢へのＳｉ３Ｎ４顆粒の電荷誘引を示す概略図である。FIG. 11A is a schematic showing the buffering effect and associated elution of ammonia in the stomata entrapping Si3N4 granules, and FIG. Schematic showing charge attraction of Si 3 N 4 granules to sporangia with formation of ammonia.

図１２Ａは、未処理のＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａを接種したＣａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの葉を示す。FIG. 12A shows leaves of Cabernet Sauvignon inoculated with untreated Plasmopara viticola. 図１２Ｂは、１．５体積％のＳｉ３Ｎ４粉末で１分間処理したＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａを接種したＣａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの葉を示す。FIG. 12B shows a Cabernet Sauvignon leaf inoculated with Plasmopara viticola treated with 1.5 vol % Si 3 N 4 powder for 1 min.

対照および処理されたＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａを含むＣａｂｅｒｎｅｔ ＳａｕｖｉｇｎｏｎおよびＣａｎｎｏｎａｕの葉の感染面積のグラフである。FIG. 2 is a graph of infected area of leaves of Cabernet Sauvignon and Cannonau containing control and treated Plasmopara viticola.

図１４Ａは、未処理の胞子嚢を示す。図１４Ｂは、Ｓｉ３Ｎ４の存在下での胞子嚢を示す。FIG. 14A shows untreated sporangia. FIG. 14B shows sporangia in the presence of Si 3 N 4 .

参照符号は、図面の見え方のうち対応する要素を示す。図面で使用される見出しは、特許請求の範囲を限定するものではない。 Reference numerals indicate corresponding elements of the drawing view. Headings used in the drawings do not limit the scope of the claims.

本開示の様々な実施形態が、以下で詳細に論じられる。具体的な実装形態が論じられるが、これは例示目的のみのために行われることを理解されたい。当業者は、他の構成要素および構成が、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることを認識するであろう。したがって、以下の説明および図面は例示であり、限定として解釈されるべきではない。本開示の完全な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細が記載されている。しかし、特定の例では、説明を不明瞭にすることを避けるために、周知または従来の詳細は説明されていない。 Various embodiments of the disclosure are discussed in detail below. While specific implementations are discussed, it should be understood that this is done for illustrative purposes only. A person skilled in the relevant art will recognize that other components and configurations can be used without departing from the spirit and scope of the present disclosure. Accordingly, the following description and drawings are illustrative and should not be construed as limiting. Numerous specific details are set forth to provide a thorough understanding of the present disclosure. However, in certain instances, well-known or conventional details have not been described to avoid obscuring the description.

本明細書で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の中で、および各用語が使用される特定の文脈の中で、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本明細書で論じられる用語のいずれか１つまたは複数について代替の言語および同義語を使用することができ、用語が本明細書で詳述または議論されるか否かに、特別な重要性は置かれるべきではない。場合によっては、特定の用語の同義語が提示される。１つまたは複数の同義語の列挙は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む本明細書のいずれかの例の使用は、例示にすぎず、本開示または任意の例示的な用語の範囲および意味をさらに限定することを意図するものではない。同様に、本開示は、本明細書で与えられる様々な実施形態に限定されない。 The terms used herein generally have their ordinary meaning in the art within the context of this disclosure and within the specific context in which each term is used. Alternative language and synonyms may be used for any one or more of the terms discussed herein, and whether a term is elaborated or discussed herein is of particular importance. should not be placed. In some cases, synonyms for specific terms are provided. A listing of one or more synonyms does not exclude the use of other synonyms. The use of any examples herein, including examples of any term discussed herein, is illustrative only and is intended to further limit the scope and meaning of the disclosure or any exemplified term. not something to do. Likewise, the disclosure is not limited to the various embodiments provided herein.

「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれ得ることを意味する。本明細書の様々な箇所における「一実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではなく、他の実施形態と相互排他的な別個のまたは代替の実施形態でもない。さらに、いくつかの実施形態によって示され、他の実施形態によって示されない可能性がある様々な特徴が記載される。 References to "one embodiment" or "an embodiment" mean that the particular feature, structure, or property described in connection with the embodiment can be included in at least one embodiment of the present disclosure. The appearances of the phrase "in one embodiment" in various places in this specification are not necessarily all referring to the same embodiment, but to separate or alternative embodiments that are mutually exclusive with other embodiments. not. Moreover, various features are described which may be exhibited by some embodiments and not by others.

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それらのオープンで非限定的な意味で使用される。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、複数および単数を包含すると理解される。したがって、「それらの混合物」という用語はまた、「それらの混合物」に関する。 As used herein, the terms "comprising," "having," and "including" are used in their open, non-limiting sense. The terms "a," "an," and "the" are understood to include the plural and the singular. The term "mixture thereof" therefore also relates to "mixture thereof".

本明細書で使用される場合、「約」は、明示的に示されているか否かにかかわらず、整数、分数、パーセンテージなどを含む数値を指す。「約」という用語は、一般に、人が列挙された値に等しいと考える、例えば、同じ機能または結果を有すると考える数値の範囲、例えば列挙された値の±０．５～１％、±１～５％または±５～１０％を指す。 As used herein, "about" refers to numerical values, including whole numbers, fractions, percentages, and the like, whether or not explicitly indicated. The term “about” generally refers to a range of numbers that one would consider equal to the recited value, eg, to have the same function or result, eg, ±0.5-1%, ±1% of the recited value. Refers to ~5% or ±5-10%.

本明細書で使用される場合、「窒化ケイ素」という用語は、Ｓｉ３Ｎ４、アルファまたはベータ相Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＹＡｌＯＮ、ＳｉＹＯＮ、ＳｉＡｌＯＮ、またはこれらの相または材料の組み合わせを含む。 As used herein, the term "silicon nitride" includes Si3N4 , alpha or beta phase Si3N4 , SiYAlON , SiYON, SiAlON, or combinations of these phases or materials.

本開示は、植物における病原体を処理または予防するための方法に関する。この方法は、植物を窒化ケイ素を含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、接触工程は、噴霧、ミスチング、または浸漬を含み得る。 The present disclosure relates to methods for treating or preventing pathogens in plants. The method includes contacting the plant with a composition comprising silicon nitride. In some embodiments, the contacting step can include spraying, misting, or immersing.

Ｓｉ３Ｎ４の表面は、水性環境でＳｉ－Ｎ共有結合の均一分解解離を受ける。窒素およびケイ素の放出は、Ｓｉ３Ｎ４の生物学的有効性の化学的起源である。加水分解プロセスは、Ｓｉ３Ｎ４表面におけるアミノ基のプロトン化を開始する。隣接するケイ素の部位の求電子性が増加し、これにより、順次これらの部位が水による求核攻撃を受ける傾向が生じる。水がケイ素の部位と相互作用すると、準安定の五配位錯体が最初に形成するが、その後、環境のｐＨに依存する比率で、アンモニア／アンモニウムイオンの遊離と共に直ちに崩壊する。アンモニア（ＮＨ３）またはアンモニウム（ＮＨ４ ＋）のｐＨ依存性溶出は、固体表面の二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の形成と共に起こる。この後者の種の加水分解は、オルトケイ酸、Ｓｉ（ＯＨ）４を生成する。水中のＳｉ３Ｎ４の基本的な化学反応は以下の通りである。
Ｓｉ３Ｎ４＋６Ｈ２Ｏ→３ＳｉＯ２＋４ＮＨ３（１）
Ｈ＋＋ＮＨ３→ＮＨ４ ＋（２）
ＳｉＯ２＋２Ｈ２Ｏ→Ｓｉ（ＯＨ）４（３） Si 3 N 4 surfaces undergo homogeneous decomposition dissociation of Si—N covalent bonds in an aqueous environment. The release of nitrogen and silicon is the chemical origin of the biological effectiveness of Si3N4 . The hydrolysis process initiates protonation of amino groups on the Si3N4 surface. Adjacent silicon sites become more electrophilic, which in turn makes these sites more prone to nucleophilic attack by water. When water interacts with silicon sites, a metastable pentacoordination complex initially forms but then immediately collapses with the liberation of ammonia/ammonium ions in a ratio that depends on the pH of the environment. A pH-dependent elution of ammonia (NH 3 ) or ammonium (NH 4 + ) occurs with the formation of silicon dioxide (SiO 2 ) on the solid surface. Hydrolysis of this latter species produces the orthosilicic acid, Si(OH) 4 . The basic chemical reaction of Si3N4 in water is as follows.
Si3N4 + 6H2O → 3SiO2 + 4NH3 (1)
H + +NH 3 →NH 4 + (2)
SiO2 + 2H2O →Si(OH) 4 (3)

室温では、ＮＨ３の割合は、シグモイド依存性に従ってｐＨと共に変化する。
［ＮＨ３］［Ｈ＋］／［ＮＨ４ ＋］＝５．７ｘ１０－１０（４） At room temperature, the proportion of NH3 changes with pH according to a sigmoidal dependence.
[NH 3 ][H + ]/[NH 4 + ]=5.7×10 −10 (4)

これは、生理学的ｐＨでの遊離ＮＨ３の相対分率が非常に低い（すなわち、溶出したアンモニウム種の総量の１～２％）ことを示している。しかし、約８．３のｐＨでは、約７％に増加する。図８Ａは、式（４）のグラフを提示する。これはＮＨ３およびＮＨ４ ＋の相対濃度を示す。図８Ｂでは、純水でのそれらの濃度について、ｐＨの関数としての定量的プロットが示されている。これらの値は、式（４）を用いて図１Ａのデータから計算し、公開されている比色アンモニアアッセイに従って較正した。アンモニアは、病原体の細胞膜に容易に浸透することができ、そこでリン酸デオキシリボースＤＮＡ骨格を切断する（アルカリエステル交換によるゲノム切断と呼ばれる）。しかし、水中のＳｉ３Ｎ４の別の重要な態様は、フリーラジカルの形成である。これは、以下のように、Ｓｉ－Ｎ結合の破壊、自由電子の放出、および酸素ラジカルの形成から始まる一連の過渡的な非化学量論的反応を伴う。
Ｓｉ－Ｎ→Ｓｉ＋＋Ｎ・＋ｅ－（５）
Ｈ２Ｏ＋ｅ－→Ｈ・＋ＯＨ－（６）
１Ｏ２＋ｅ－→Ｏ２ ・－（７）
Ｏ２ ・－＋Ｈ＋→ＨＯ２ ・－（８）
Ｓｉ－ＯＨ２ ＋ （ｓ）→Ｓｉ－ＯＨ（ｓ）＋Ｈ＋ （ａｑ）（９）
Ｓｉ－ＯＨ（ｓ）→Ｓｉ－Ｏ－ （ｓ）＋Ｈ＋ （ａｑ）（１０）
Ｓｉ－ＮＨ３ ＋ （ｓ）→Ｓｉ－ＮＨ２（ｓ）＋Ｈ＋ （ａｑ）（１１） This indicates that the relative fraction of free NH 3 at physiological pH is very low (ie, 1-2% of the total amount of eluted ammonium species). However, at a pH of about 8.3, it increases to about 7%. FIG. 8A presents a graph of equation (4). This indicates the relative concentrations of NH3 and NH4 + . In FIG. 8B a quantitative plot is shown for their concentration in pure water as a function of pH. These values were calculated from the data in FIG. 1A using equation (4) and calibrated according to published colorimetric ammonia assays. Ammonia can easily penetrate the cell membrane of pathogens, where it cleaves the phosphate-deoxyribose DNA backbone (called genomic cleavage by alkaline transesterification). However, another important aspect of Si3N4 in water is the formation of free radicals. This involves a series of transient, non-stoichiometric reactions beginning with the breaking of Si—N bonds, the release of free electrons, and the formation of oxygen radicals, as follows.
Si-N→Si + +N · +e − (5)
H 2 O+e − →H · +OH − (6)
1 O 2 + e - → O 2 · - (7)
O 2.− + H + →HO 2.− (8)
Si—OH 2 + (s) → Si—OH (s) + H + (aq) (9)
Si—OH (s) → Si—O − (s) + H + (aq) (10)
Si—NH 3 + (s) →Si—NH 2(s) +H + (aq) (11)

これらの反応式（５）～（１１）は、自由電子の放出（式（５））、水分子の***（式（６））、ならびにラジカル酸素アニオンおよび高度に酸化性のプロトン化種の形成（式（７）および（８））を含む化学事象のカスケードを表す。これらの後者の種は、表面シラノールの解離（式（９）～（１１））に寄与し、次いで、追加の酸素ラジカル、すなわち（≡Ｓｉ－Ｏ・）および（≡Ｓｉ－Ｏ２ ・－）の形成をもたらす。自由電子はまた、アンモニア（ＮＨ３）をヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ、すなわちアンモニアモノオキシゲナーゼ）に酸化し、続いて水と反応して亜硝酸ＨＮＯ２を形成し、さらなる自由電子およびプロトンを生成する。
ＮＨ３＋２ｅ－＋２Ｈ＋Ｏ２→ＮＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ
→ＨＮＯ２＋４ｅ－＋４Ｈ＋（１２）
ＮＨ２ＯＨ→ＮＯ＋３Ｈ＋３ｅ－（１３）
２ＨＮＯ２→ＮＯ＋ＮＯ２ －＋Ｈ２Ｏ（１４） These reactions (5)-(11) involve the release of free electrons (equation (5)), the splitting of water molecules (equation (6)), and the formation of radical oxygen anions and highly oxidizing protonated species. Represents the cascade of chemical events involving (equations (7) and (8)). These latter species contribute to the dissociation of surface silanols (Eqs. (9)-(11)), followed by additional oxygen radicals, namely (≡Si—O . ) and (≡Si— O.sub.2.− ) result in the formation of Free electrons also oxidize ammonia ( NH3 ) to hydroxylamine ( NH2OH , i.e. ammonia monooxygenase), which subsequently reacts with water to form nitrite HNO2 , producing additional free electrons and protons. .
NH 3 +2e − +2H+O 2 →NH 2 OH+H 2 O
→HNO 2 +4e − +4H + (12)
NH 2 OH→NO+3H + 3e − (13)
2HNO 2 →NO+NO 2 − +H 2 O (14)

式（１２）（すなわち、アンモニアモノオキシゲナーゼ）は、亜硝酸、追加の自由電子、および水素プロトンの形成と共に、ＮＨ３酸化を触媒するのに必要な自由電子をもたらす。式（１３）（すなわち、ヒドロキシルアミンオキシドレダクターゼ）は、一酸化窒素（ＮＯ）、さらなる自由電子、および水素プロトンを生成する。式（７）からの酸素ラジカル（Ｏ２ ・－）と一緒に、式（１４）による追加のＮＯおよび亜硝酸塩（ＮＯ２ －）の形成は、以下のようにペルオキシ亜硝酸塩、ＯＮＯＯ－の形成をもたらす：
Ｏ２ －・＋・ＮＯ→－ＯＯ－Ｎ＝Ｏ（１５） Equation (12) (i.e., ammonia monooxygenase) provides the free electrons necessary to catalyze NH3 oxidation with the formation of nitrous acid, additional free electrons, and hydrogen protons. Formula (13) (ie, hydroxylamine oxidoreductase) produces nitric oxide (NO), additional free electrons, and hydrogen protons. Formation of additional NO and nitrite (NO 2 − ) according to equation (14) together with the oxygen radical (O 2− ) from equation (7) leads to the formation of peroxynitrite, ONOO−, as follows: yields:
O 2 −・+・NO→ − OO−N=O(15)

これは、最終的に一酸化窒素（ＮＯ）およびペルオキシ亜硝酸塩（ＯＯＮＯ－）ラジカルの形成をもたらす。それらは、病原体にとって最も致死的な因子の１つである。ペルオキシナイトライトの形成は、ペルオキシナイトライトを標的とするニトロ化ストレス感知のための誘導放出枯渇顕微鏡法および特異的蛍光染色キットを使用したＳｉ３Ｎ４とＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ相互作用の最近の研究において実験的に確認されている。逆に、ペルオキシナイトライトは植物細胞に対して毒性ではなく、ＮＯは病原体の感染に対する植物の耐性の誘導における重要なシグナルであり、したがって防御関連遺伝子の植物発現に正の間接的効果を及ぼす。 This ultimately leads to the formation of nitric oxide (NO) and peroxynitrite (OONO − ) radicals. They are among the most lethal agents for pathogens. The formation of peroxynitrite was experimentally explored in a recent study of Si3N4 and Candida albicans interaction using stimulated emission depletion microscopy and a specific fluorescence staining kit for peroxynitrite-targeted nitrative stress sensing. has been definitively confirmed. Conversely, peroxynitrite is not toxic to plant cells and NO is a key signal in inducing plant resistance to pathogen infection, thus exerting positive indirect effects on plant expression of defense-related genes.

Ｉ．組成物
本開示の組成物は、窒化ケイ素を含む。 I. Compositions Compositions of the present disclosure comprise silicon nitride.

いくつかの実施形態では、窒化ケイ素粉末は、スラリー、懸濁液、ゲル、スプレー、またはペーストを含むがこれらに限定されない組成物に組み込まれてもよい。少なくとも１つの例では、組成物は、溶媒に分散した窒化ケイ素粒子のスラリーを含み得る。いくつかの態様では、溶媒は水であり得る。例えば、窒化ケイ素粒子を任意の適切な分散剤およびスラリー安定剤と共に水と混合し、その後、スラリーを様々な農業植物、果樹、つる植物、穀物などに噴霧することによって塗布することができる。少なくとも１つの例において、窒化ケイ素スラリーは、真菌に感染したブドウの葉に噴霧されてもよい。 In some embodiments, silicon nitride powders may be incorporated into compositions including, but not limited to, slurries, suspensions, gels, sprays, or pastes. In at least one example, the composition can include a slurry of silicon nitride particles dispersed in a solvent. In some aspects, the solvent can be water. For example, the silicon nitride particles can be mixed with water, along with any suitable dispersants and slurry stabilizers, and then applied by spraying the slurry onto various agricultural plants, fruit trees, vines, grains, and the like. In at least one example, the silicon nitride slurry may be sprayed onto fungus-infected grape leaves.

例では、抗病原性組成物は、窒化ケイ素粉末および水のスラリーであり得る。窒化ケイ素粉末は、スラリー中に約０．１体積％～約２０体積％の濃度で存在してもよい。様々な実施形態では、スラリーは、約０．１体積％、０．５体積％、１体積％、１．５体積％、２体積％、５体積％、１０体積％、１５体積％、または２０体積％の窒化ケイ素を含み得る。 In an example, the antipathogenic composition can be a slurry of silicon nitride powder and water. Silicon nitride powder may be present in the slurry at a concentration of about 0.1% to about 20% by volume. In various embodiments, the slurry contains about 0.1 vol%, 0.5 vol%, 1 vol%, 1.5 vol%, 2 vol%, 5 vol%, 10 vol%, 15 vol%, or 20 vol% It may contain vol % silicon nitride.

組成物は、約０．５体積％～約２０体積％の窒化ケイ素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．５体積％、１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または約２０体積％の窒化ケイ素を含み得る。いくつかの追加の実施形態では、組成物は、約０．５体積％～約３体積％、約３体積％～約６体積％、約６体積％～約９体積％、約９体積％～約１２体積％、約１２体積％～約１５体積％、約１５体積％～約１８体積％、または約１８体積％～約２０体積％の窒化ケイ素を含み得る。例示的な一実施形態では、組成物は、約１体積％～約３体積％の窒化ケイ素を含む。 The composition may comprise from about 0.5% to about 20% by volume silicon nitride. In some embodiments, the composition contains about 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% by volume, It may contain 9%, 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or about 20% by volume silicon nitride. In some additional embodiments, the composition comprises from about 0.5% to about 3%, from about 3% to about 6%, from about 6% to about 9%, from about 9% to It may contain about 12 vol.%, about 12 vol.% to about 15 vol.%, about 15 vol.% to about 18 vol.%, or about 18 vol.% to about 20 vol.% silicon nitride. In one exemplary embodiment, the composition comprises from about 1% to about 3% by volume silicon nitride.

窒化ケイ素粉末は、約１μｍ～約５μｍの粒径を有してもよい。少なくとも１つの例では、窒化ケイ素粉末は、約２μｍの粒径を有してもよい。 The silicon nitride powder may have a particle size of about 1 μm to about 5 μm. In at least one example, the silicon nitride powder may have a particle size of about 2 microns.

ＩＩ．病原体
本開示の方法は、植物中の多くの既知の病原体を治療または予防するために使用され得る。いくつかの実施形態では、病原体は、べと病、うどんこ病、灰色かび病病、フザリウム病、さび病、リゾクトニア病、スクレロチニア病、スクレロチウム病、および当技術分野で公知の他の病原性植物病害を含む、１つまたは複数の植物病害を引き起こし得る。いくつかのさらなる実施形態では、病原体は、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ、Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉｎａ、および当技術分野で公知の他の真菌を含む真菌であり得る。 II. Pathogens The methods of the present disclosure can be used to treat or prevent many known pathogens in plants. In some embodiments, the pathogen is downy mildew, powdery mildew, gray mold, fusarium, rust, rhizoctonia, sclerotinia, sclerotium, and other pathogenic plants known in the art. It can cause one or more plant diseases, including diseases. In some further embodiments, the pathogen can be a fungus, including Plasmopara viticola, Guignardia bidwellii, Uncinula necator, Botryotinia fuckelina, and other fungi known in the art.

ＩＩＩ．植物
本開示のセクションＩに開示される組成物は、植物に適用することができ、植物は、農業植物、樹木、またはつる植物である。いくつかの実施形態では、農業植物は、穀物、マメ科植物、塊茎、草、油種子、野菜または果実を含み得る。 III. Plants The compositions disclosed in Section I of this disclosure can be applied to plants, where the plants are agricultural plants, trees, or vines. In some embodiments, agricultural plants may include grains, legumes, tubers, grasses, oilseeds, vegetables or fruits.

（ａ）穀物
いくつかの態様では、穀物は、テフ、小麦、オート麦、米、トウモロコシ、大麦、ソルガム、ライ麦、キビ、ライコムギ、アマランス、ソバ、キヌア、ブルグア、ファロ、フリーケ、または当技術分野で公知の他の穀物を含み得る。 (a) Cereals In some embodiments, the cereal is teff, wheat, oats, rice, corn, barley, sorghum, rye, millet, triticale, amaranth, buckwheat, quinoa, bulgur, farro, freeke, or the art. may contain other grains known in

いくつかの追加の態様では、マメ科植物は、ピーナッツ、ヒヨコマメ、マメ、エンドウ豆、レンズマメ、ルピナス、アルファルファ、クローバー、メスキート、イナゴマメ、ダイズ、タマリンド、および当技術分野で公知の他のマメ科植物を含み得る。 In some additional embodiments, the legume is peanut, chickpea, legume, pea, lentil, lupine, alfalfa, clover, mesquite, carob, soybean, tamarind, and other legumes known in the art. can include

さらに別の態様では、塊茎は、ビート、ニンジン、西洋ワサビ、パースニップ、ジャガイモ、ダイコン、サツマイモ、カブ、ルタバガ、サトイモ、ヒシ、ヤマノイモ、および当技術分野で公知の他の塊茎を含み得る。 In yet another aspect, tubers may include beets, carrots, horseradish, parsnips, potatoes, radishes, sweet potatoes, turnips, rutabaga, taro, water chestnuts, yam, and other tubers known in the art.

さらなる付加的な態様では、草は、竹、マラムグラス、メドウグラス、アシ、ライグラス、サトウキビ、および当技術分野で公知の他の草を含むことができる。 In still additional embodiments, the grasses can include bamboo, marram grass, meadowgrass, reeds, ryegrass, sugarcane, and other grasses known in the art.

さらに他の態様では、油種子は、パーム油、ダイズ油、ナタネ油、パーム核油、綿実油、落花生油、オリーブ油、ココナッツ油、トウモロコシ油、ゴマ油、アマニ油、ベニバナ油、ヒマワリ油、ヤトロファ油、カメリナ油、カルドン油、ベニバナ油、および当技術分野で知られている他の油種子を含み得る。 In still other embodiments, the oilseed is palm oil, soybean oil, rapeseed oil, palm kernel oil, cottonseed oil, peanut oil, olive oil, coconut oil, corn oil, sesame oil, linseed oil, safflower oil, sunflower oil, jatropha oil, It may include camelina oil, cardoon oil, safflower oil, and other oilseeds known in the art.

さらに別の態様では、野菜は、アーチチョーク、アスパラガス、ビートの根、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セレリアック、セロリ、フェンネル、ニンニク、ショウガ、ケール、リーキ、レタス、パースニップ、ダイコン、サラダグリーン、シャロット、ホウレンソウ、ネギ、ターメリック、カブ、クレソン、および当技術分野で知られている他の野菜を含み得る。 In yet another aspect, the vegetable is artichoke, asparagus, beetroot, broccoli, Brussels sprouts, cabbage, carrots, cauliflower, celeriac, celery, fennel, garlic, ginger, kale, leeks, lettuce, parsnips, radishes, salad. Greens, shallots, spinach, leeks, turmeric, turnips, watercress, and other vegetables known in the art may be included.

さらに別の態様では、果実は、リンゴ、アボカド、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、パンノキの実、カンタループ、サクランボ、クレメンタイン、ココナッツ、クランベリー、ナツメ、イチジク、グレープフルーツ、グアバ、ハニーデューメロン、ジャックフルーツ、キウイ、キンカン、レモン、ライム、マンダリン、マンゴー、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ナシ、パイナップル、プランテン、プラム、ザクロ、ラズベリー、ダイオウ、イチゴ、タンジェリン、スイカ、または当技術分野で公知の任意の他の果実を含み得る。 In yet another aspect, the fruit is apple, avocado, apricot, banana, blackberry, blueberry, breadfruit, cantaloupe, cherry, clementine, coconut, cranberry, jujube, fig, grapefruit, guava, honeydew melon, jack Fruit, kiwi, kumquat, lemon, lime, mandarin, mango, nectarine, orange, papaya, passion fruit, peach, pear, pineapple, plantain, plum, pomegranate, raspberry, rhubarb, strawberry, tangerine, watermelon, or the art may include any other fruit known in

（ｂ）樹木
いくつかの実施形態では、樹木は、果樹、ランドスケープの木、または森林樹を含むことができる。 (b) Trees In some embodiments, trees can include fruit trees, landscape trees, or forest trees.

いくつかの態様では、果樹は、アーモンドの木、リンゴの木、アンズの木、アボカドの木、カシューの木、サクラの木、ココナッツの木、イチジクの木、グレープフルーツの木、グアバの木、ジャックフルーツの木、レモンの木、ライムの木、マンゴーの木、オリーブの木、オレンジの木、モモの木、ナシの木、ペカンの木、セイヨウスモモの木、ザクロの木、クルミの木、または当技術分野で知られている任意の他の木を含むことができる。 In some embodiments, the fruit tree is almond tree, apple tree, apricot tree, avocado tree, cashew tree, cherry tree, coconut tree, fig tree, grapefruit tree, guava tree, jack fruit trees, lemon trees, lime trees, mango trees, olive trees, orange trees, peach trees, pear trees, pecan trees, plum trees, pomegranate trees, walnut trees, or Any other tree known in the art can be included.

いくつかの追加の態様では、ランドスケープの木は、マグノリアの木、リンゴの木、ハナミズキの木、カエデの木、トウモロコシの毛の木、カツラの木、トウヒの木、アルボルビタエの木、カバノキの木、ヤシの木、サクラの木、ヒイラギの木、ブナの木、および当技術分野で知られている他のランドスケープツリーを含むことができる。 In some additional embodiments, the landscape trees are magnolia trees, apple trees, dogwood trees, maple trees, corn hair trees, katsura trees, spruce trees, arborbitae trees, birch trees , palm trees, cherry trees, holly trees, beech trees, and other landscape trees known in the art.

さらに追加の態様では、森林樹は、トネリコの木、カバノキの木、アスペンの木、シナノキの木、ブナの木、サクラの木、クリの木、ハコヤナギの木、ニレの木、モミの木、ヒッコリの木、ニセアカシアの木、カエデの木、オークの木、マツの木、スギの木、トウヒの木、スズカケの木、ヤナギの木、および当技術分野で知られている他の森林樹を含むことができる。 In a further aspect, the forest tree is an ash tree, a birch tree, an aspen tree, a linden tree, a beech tree, a cherry tree, a chestnut tree, a cottonwood tree, an elm tree, a fir tree, Hickory trees, black locust trees, maple trees, oak trees, pine trees, cedar trees, spruce trees, sycamore trees, willow trees, and other forest trees known in the art. can contain.

（ｃ）つる植物
いくつかの実施形態では、つる植物は、ブドウのつる、スイカのつる、キュウリのつる、ツタ、クリーパー、ホップ、ジャスミン、または当技術分野で公知の他のつる植物であり得る。いくつかの態様では、つる植物はブドウのつるＶｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａである。いくつかの例では、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａは、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ、Ｃａｎｎｏｎａｕ、Ｓｕｌｔａｎａ、Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ、ｗｈｉｔｅ Ｒｉｅｓｌｉｎｇ、Ｐｉｎｏｔ ｂｌａｎｃ、Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ、Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ、Ｍｕｓｃａｔ Ｏｔｔｏｎｅｌ、Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ ｂｌａｎｃ、Ｐｉｎｏｔ ｎｏｉｒ、Ｐｉｎｏｔ Ｍｅｕｎｉｅｒ、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ、Ｍｅｒｌｏｔ、Ｌｉｍｂｅｒｇｅｒ、Ｇａｍａｙ ｎｏｉｒ、Ｔｒｏｌｌｉｎｇｅｒ、Ｐｅｔｉｔｅ Ｖｅｒｄｏｔ、Ｔｒｅｂｂｉａｎｏ Ｔｏｓｃａｎｏ、Ｇａｒｎａｃｈａ、Ｓｙｒａｈ、Ａｉｒｅｎ、Ｔｅｍｐｒａｎｉｌｌｏおよび当技術分野で公知のＶｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａの品種を含み得る。 (c) Vine In some embodiments, the vine can be grape vine, watermelon vine, cucumber vine, ivy, creeper, hops, jasmine, or other vines known in the art. . In some aspects, the vine is the grape vine Vitis vinifera. In some examples, Vitis vinifera is Cabernet Sauvignon, Cannonau, Sultana, Chardonnay, white Riesling, Pinot blanc, Pinot Gris, Gewurztraminer, Muscat Ottonel, Sauvignon blanc c, Pinot noir, Pinot Meunier, Cabernet Franc, Merlot, Limberger, Gamay It may include noir, Trollinger, Petite Verdot, Trebbiano Toscano, Garnacha, Syrah, Airen, Tempranillo and Vitis vinifera varieties known in the art.

ＩＶ．方法
病原体を窒化ケイ素を含む組成物と接触させることによって病原体を不活性化する方法を、本明細書にてさらに提供する。病原体は、真菌または植物ベースの病原体であり得る。組成物は、窒化ケイ素粒子と水とを含むスラリーであってもよい。 IV. Methods Further provided herein are methods of inactivating a pathogen by contacting the pathogen with a composition comprising silicon nitride. Pathogens can be fungal or plant-based pathogens. The composition may be a slurry comprising silicon nitride particles and water.

さらなる実施形態では、方法は、窒化ケイ素スラリーを、植物ベースの病原体に感染した生きている農業植物、樹木、穀物などの表面と接触させることを含み得る。実施形態では、感染した葉に、約１体積％～約４０体積％の水中窒化ケイ素のスラリーを噴霧することができる。葉は、窒化ケイ素のスラリーに少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、または少なくとも１日間曝露され得る。 In further embodiments, the method may include contacting the silicon nitride slurry with a surface of living agricultural plants, trees, grains, etc. infected with a plant-based pathogen. In embodiments, infected leaves can be sprayed with a slurry of about 1% to about 40% by volume silicon nitride in water. The leaves can be exposed to the silicon nitride slurry for at least 1 minute, at least 5 minutes, at least 10 minutes, at least 20 minutes, at least 30 minutes, at least 1 hour, at least 2 hours, at least 5 hours, or at least 1 day.

様々な例では、葉の感染面積は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少し得る。例では、１分間の曝露後、葉の感染面積は約９５％減少し得る。驚くべきことに、窒化ケイ素粒子は、病原体の胞子に電気的に引き付けられ、付着し得ることが見出された。 In various examples, infected leaf area may be reduced by at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%. In an example, the infected area of a leaf can be reduced by about 95% after 1 minute of exposure. Surprisingly, it has been found that silicon nitride particles can be electrically attracted to and attached to spores of pathogens.

実施例１：
ブドウのつるにおけるべと病の感染は、通常、銅および硫黄を含む殺真菌剤（接触殺真菌剤）の集中的な適用によって、または合成広域スペクトル浸透性殺菌剤、例えばベンズイミダゾールもしくはトリアゾールによって予防される。しかし、それらの使用は、環境および人間の健康に悪影響を及ぼす。殺菌剤の残渣は長期の土壌汚染物質であり、無視できない量のこれらの化合物がワインに見られる。厳しい調整でそれらの有害な結果を最小限にしようとしているが、状況は代替の殺真菌戦略の開発を必要としている。これらの例は、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａに対する抗真菌特性を有するが、ヒトに対する毒性または環境に対する有害作用はない、バイオセラミック窒化ケイ素の前例のない事例を提示する。生きている胞子嚢のラマン分光評価は、生体セラミック表面の窒素化学が宿主感染の阻害に関与していることを機構的に示した。 Example 1:
Downy mildew infections on grape vines are usually prevented by intensive application of fungicides containing copper and sulfur (contact fungicides) or by synthetic broad-spectrum systemic fungicides such as benzimidazoles or triazoles. be done. However, their use adversely affects the environment and human health. Fungicide residues are long-term soil contaminants and non-negligible amounts of these compounds are found in wine. Although stringent controls are sought to minimize these detrimental consequences, the situation calls for the development of alternative fungicidal strategies. These examples present an unprecedented example of bioceramic silicon nitride with antifungal properties against Plasmopara viticola, but without toxicity to humans or adverse effects on the environment. Raman spectroscopy evaluation of living sporangia mechanistically implicated the nitrogen chemistry of the bioceramic surface in inhibiting host infection.

これらの実施例は、その感染サイクルの早期に開始するＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａをノックダウンするために、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）を使用した。このセラミックの選択は、水性環境内でのその独特の表面化学に基づいた。それは、やはり真核細胞に優しく支持的でありながら、抗菌、抗ウイルスおよび抗真菌特性を有する。これらの理由から、Ｓｉ３Ｎ４は、ブドウのつるを保護するための環境に優しい代替物と考えることができる。ｉｎ ｓｉｔｕラマン分光法を利用して、ブドウのつるの葉に対するＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａの病原性およびＳｉ３Ｎ４による不活性化を司る分子機構についての洞察をもたらした。ラマン分光法は、マーカーなしで生きている病原体に適用することができる非侵襲的方法であり、したがって微速度の実験がそれらの代謝変動を明らかにすることを可能にする。この方法は、抗病原体剤と化学的に相互作用している間に病原体の構造およびその進化を監視する。 These examples used silicon nitride ( Si3N4 ) to knock down Plasmopara viticola, which begins early in its infectious cycle. The selection of this ceramic was based on its unique surface chemistry in aqueous environments. It has antibacterial, antiviral and antifungal properties while also being gentle and supportive to eukaryotic cells. For these reasons, Si 3 N 4 can be considered an environmentally friendly alternative for protecting grape vines. In situ Raman spectroscopy was utilized to provide insight into the molecular mechanisms governing virulence and inactivation by Si3N4 of Plasmopara viticola on grape vine leaves. Raman spectroscopy is a non-invasive method that can be applied to living pathogens without markers, thus allowing time-lapse experiments to reveal their metabolic variations. This method monitors pathogen structure and its evolution while chemically interacting with antipathogenic agents.

実施例２：
農業的真菌の不活性化に対する窒化ケイ素の効果を示すために、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの葉に３×１０４個の胞子嚢／ｍｌの濃度でＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａを感染させた。処理したＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａを１．５体積％の窒化ケイ素のスラリーに１分間曝露した。 Example 2:
To demonstrate the effect of silicon nitride on the inactivation of agricultural fungi, Cabernet Sauvignon leaves were infected with Plasmopara viticola at a concentration of 3 x 104 sporangia/ml. The treated Plasmopara viticola was exposed to a slurry of 1.5% by volume silicon nitride for 1 minute.

図１２Ａは、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの葉の未処理のＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ真菌を示す。図１２Ｂは、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ葉の処理されたＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ真菌を示す。１．５体積％のＳｉ３Ｎ４粉末で１分間処理したＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａを接種した葉は、葉の表面に菌が少ないことが分かる。これは、対照のおよび処理されたＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａを接種したＣａｂｅｒｎｅｔ ＳａｕｖｉｇｎｏｎとＣａｎｎｏｎａｕの両方の葉の感染した葉の面積の割合を示す図１３によってさらに証明される。図１３は、対照真菌と処理真菌との間の感染葉面積の統計学的有意差を明確に示す。 FIG. 12A shows untreated Plasmopara viticola fungi on Cabernet Sauvignon leaves. FIG. 12B shows treated Plasmopara viticola fungi on Cabernet Sauvignon leaves. It can be seen that leaves inoculated with Plasmopara viticola treated with 1.5% by volume Si 3 N 4 powder for 1 minute have less fungi on the surface of the leaves. This is further evidenced by Figure 13 which shows the percentage of infected leaf area of both control and treated Plasmopara viticola inoculated Cabernet Sauvignon and Cannonau leaves. Figure 13 clearly shows the statistically significant difference in infected leaf area between control and treated fungi.

図１４Ｂに見られるように、窒化ケイ素粒子は、病原体の胞子に電気的に引き付けられ、それに付着するように見える。図１４Ａは、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａの未処理の胞子嚢の顕微鏡画像を示し、図１４Ｂは、Ｓｉ３Ｎ４の存在下でのＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａの胞子嚢の顕微鏡画像を示す。 As seen in FIG. 14B, the silicon nitride particles are electrically attracted to the pathogen spores and appear to adhere to them. FIG. 14A shows a microscopic image of an untreated Plasmopara viticola sporangium and FIG. 14B shows a microscopic image of a Plasmopara viticola sporangium in the presence of Si 3 N 4 .

実施例３：
２０１８年に畑で収穫したＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ（Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａ）分離株を、Ｐｏｌｅｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，’’Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）ａｎｄ ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（Ｖ．ｒｉｐａｒｉａ）ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｓｐｅｃｉｅｓ，’’ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：１１７（２０１０）に記載されているように、軸索成長させた。Ｓｉ３Ｎ４の植物毒性の可能性を評価するために、２つの異なるブドウ品種、Ｃａｂｅｒｎｅｔ ＳａｕｖｉｇｎｏｎおよびＣａｎｎｏｎａｕを使用して処理を行った。Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの葉は、３歳の植物から採取したものであり、Ｃａｎｎｏｎａｕの葉は、制御された条件下で温室内で成長させた幼苗から得たものであった（１６時間明／８時間暗、温度の範囲は１８～２８°Ｃ）。 Example 3:
Field-harvested Plasmopara viticola (P. viticola) isolates from 2018 were prepared by Polesani et al. ,''General and species-specific transcriptional responses to downy mild infection in a suceptible (Vitis vinifera) and a resistant (V. riparia) grapevine spe cies,'' BMC Genomics 11:117 (2010), axonal growth. To assess the phytotoxic potential of Si3N4 , treatments were performed using two different grape varieties, Cabernet Sauvignon and Cannonau. Cabernet Sauvignon leaves were obtained from 3-year-old plants and Cannonau leaves were obtained from seedlings grown in a greenhouse under controlled conditions (16 h light/8 h dark). , temperature ranges from 18 to 28°C).

粒径が約２μｍのＳｉ３Ｎ４粉末を用いた。これは、９０重量％のα－Ｓｉ３Ｎ４、６重量％の酸化イットリウム（Ｙ２Ｏ３）、および４重量％の酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）の公称組成を有する焼結β－Ｓｉ３Ｎ４粉末を粉砕することによって得られた。構成成分を約１７００°Ｃで３時間超焼結し、約１６００°Ｃで２時間熱間静水圧プレスした。調製後、これを１８０°Ｃで２時間加熱滅菌した後、滅菌蒸留水に懸濁した。 Si 3 N 4 powder with a particle size of about 2 μm was used. This is sintered β-Si with a nominal composition of 90 wt% α-Si 3 N 4 , 6 wt% yttrium oxide (Y 2 O 3 ), and 4 wt% aluminum oxide (Al 2 O 3 ). Obtained by grinding 3N4 powder . The components were supersintered at about 1700°C for 3 hours and hot isostatically pressed at about 1600°C for 2 hours. After preparation, it was sterilized by heating at 180°C for 2 hours and then suspended in sterile distilled water.

予防の効力の評価のために、各ブドウ品種に対して滅菌させた葉から、５つのディスク３ロットを切り出した。１ロットをＳｉ３Ｎ４の１．５体積％の水性懸濁液に１分間完全に浸漬することによって処理し、２４時間後に４０μＬの発芽胞子嚢懸濁液（３×１０４／ｍＬ）を接種した（前処理試料）。第２のロットを、１．５体積％のＳｉ３Ｎ４懸濁液と組み合わせた胞子嚢に曝露した。この場合、Ｓｉ３Ｎ４の顆粒は、発芽の間に胞子嚢と直接接触したままであった（共処理試料）。第３のロットにＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａを接種し、感染対照群とした。すべてのディスクを、それぞれ昼１６時間、夜８時間の光周期で、２１～２４°Ｃの増殖チャンバでインキュベートし、対照に胞子形成が現れるまで６日間監視した。 For evaluation of preventive efficacy, 3 lots of 5 discs were cut from the sterilized leaves for each grape variety. One lot was treated by complete immersion in a 1.5 vol. Inoculated (pretreated sample). A second lot was exposed to sporangia combined with a 1.5% by volume Si 3 N 4 suspension. In this case, the Si 3 N 4 granules remained in direct contact with the sporangia during germination (co-treated sample). The third lot contains P.I. Viticola was inoculated and used as an infection control group. All discs were incubated in a growth chamber at 21-24° C. with a photoperiod of 16 h day and 8 h night, respectively, and monitored for 6 days until sporulation appeared in controls.

潜在的な治療効果を評価するために、高感受性Ｓｕｌｔａｎａ品種の滅菌されたブドウのつるの葉から６のディスクの３ロットをそれぞれ切断した。３ロットすべてに４０μＬの胞子嚢懸濁液（３×１０４／ｍｌ）を使用してＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａを接種し、２１～２４°Ｃの増殖チャンバ内で１６／８時間の昼／夜光周期でインキュベートして感染の発症を可能にした。液滴を、先に論じたのと同じ手順で２４時間後に除去した。感染の出現の３日後、２ロットをＳｉ３Ｎ４の１．５体積％水性懸濁液に１分間完全に浸漬することによって処理した。次いで、２つのロットのうちの１つを蒸留水で１分間洗浄して、Ｓｉ３Ｎ４残渣を除去した。第３のロットを対照群として未処理のままにした。 To evaluate potential therapeutic effects, 3 lots of 6 discs each were cut from sterilized grape vine leaves of the highly susceptible Sultana variety. 40 μL of sporangia suspension (3×10 4 /ml) was used for all three lots to infect P. viticola and incubated in a growth chamber at 21-24° C. with a 16/8 hour day/night light cycle to allow development of infection. The droplets were removed after 24 hours with the same procedure discussed above. Three days after the appearance of infection, two lots were treated by complete immersion for 1 minute in a 1.5% by volume aqueous suspension of Si 3 N 4 . One of the two lots was then washed with distilled water for 1 minute to remove Si 3 N 4 residues. A third lot was left untreated as a control.

顕微鏡観察
水に懸濁した胞子嚢または１．５体積％Ｓｉ３Ｎ４懸濁液（３×１０４胞子嚢／ｍＬ）を落射蛍光顕微鏡（励起フィルタＢＰ ３４０～３８０ｎｍ；ダイクロイックミラー４００ｎｍ；抑制フィルタＬＰ＞４３０ｎｍ）下で観察するか、またはフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）で染色し、蛍光顕微鏡を使用して３時間の時間経過の間に胞子嚢の生存率を確認した。細胞計数ビュラーチャンバーで観察を行い、水処理対照と比較して生存胞子嚢の割合を計算した。 Microscopy Sporangia suspended in water or a 1.5 vol.% Si 3 N 4 suspension (3×10 4 sporangia/mL) were subjected to epifluorescence microscopy (excitation filter BP 340-380 nm; dichroic mirror 400 nm; suppression filter). LP>430 nm) or stained with fluorescein diacetate (FDA) and fluorescence microscopy was used to confirm sporangia viability during a 3 hour time course. Observations were made in a cell counting Buehler chamber and the percentage of viable sporangia was calculated compared to water-treated controls.

ｐＨの測定
１５体積％のＳｉ３Ｎ４粉末を添加した後、滅菌させたダブルの蒸留水のｐＨをｐＨメーターで測定した。測定は、最終的なｐＨの安定化まで１０秒間隔で８００秒までの時間の関数として室温で撹拌しながら行った。ｐＨの傾向が再現可能であるかどうかを確認するために、試験した粉末試料を遠心分離（１３×１０３ＲＰＭで３分間）によって分離し、空気中１８０°Ｃで２時間乾燥させた。室温に冷却した後、粉末をさらなるｐＨの測定のために同じ水の濃度（すなわち、１．５体積％）で再懸濁した。同じ粉末を用いて、その後の３サイクルでこの手順を繰り返した。 Measurement of pH After adding 15% by volume Si3N4 powder, the pH of sterilized double distilled water was measured with a pH meter. Measurements were made with stirring at room temperature as a function of time up to 800 seconds at 10 second intervals until final pH stabilization. To confirm whether the pH trends were reproducible, the powder samples tested were separated by centrifugation (13×10 3 RPM for 3 minutes) and dried in air at 180° C. for 2 hours. After cooling to room temperature, the powder was resuspended in the same water concentration (ie, 1.5% by volume) for further pH measurements. This procedure was repeated for three subsequent cycles using the same powder.

ｉｎ ｓｉｔｕラマン分光法
Ｓｉ３Ｎ４粉末を含むおよび含まない水溶液に懸濁した胞子嚢試料について、ｉｎ ｓｉｔｕラマンスペクトルを収集した。５０倍光学レンズを備えたマイクロプローブモードで動作する専用機器を使用して、ラマンスペクトルを得た。分光器には、高効率および高分解能のスペクトル取得を同時に可能にするホログラフィックノッチフィルタが装備されていた。励起は、７８５ｎｍレーザー源を用いて１５ｍＷの出力で行った。ラマン散乱光は、空冷電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器に接続された単一のモノクロメーターを使用してモニターした。一方のスペクトルの取得時間は、典型的には６０秒であった。異なる胞子嚢の試料のスペクトルは、約１０の異なる収集位置で平均した。ラマンスペクトルを、市販のソフトウェア（例えばＬａｂＳｐｅｃ ４．０２）を使用してＧａｕｓｓ－Ｌｏｒｅｎｔｚクロス製品サブバンド成分にデコンボリューションした。スペクトルバンドの割り当ては、公開された文献に従って行った。 In situ Raman Spectroscopy In situ Raman spectra were collected for sporangia samples suspended in aqueous solutions with and without Si 3 N 4 powder. Raman spectra were obtained using a dedicated instrument operating in microprobe mode with a 50x optical lens. The spectrometer was equipped with a holographic notch filter that enabled simultaneous high-efficiency and high-resolution spectral acquisition. Excitation was performed with a 785 nm laser source at a power of 15 mW. Raman scattered light was monitored using a single monochromator connected to an air-cooled charge-coupled device (CCD) detector. Acquisition time for one spectrum was typically 60 seconds. Spectra of different sporangia samples were averaged at approximately 10 different collection positions. Raman spectra were deconvoluted into Gauss-Lorentz cross-product subband components using commercially available software (eg LabSpec 4.02). Spectral band assignments were made according to published literature.

実施例４：
水性懸濁液中のＳｉ３Ｎ４粉末のｐＨ分析
１５体積％のＳｉ３Ｎ４水懸濁液の時間の関数としてのｐＨの変化を図１Ａ～図１Ｃに示す。このｐＨ実験は、ある用量のＳｉ３Ｎ４粉末を噴霧した後のブドウのつるの圃場における周期的な雨の影響をシミュレートするために考えられた。懸濁、測定、および乾燥を含む３回の連続した反復試験を、それぞれ図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃに示す。実行順序とは無関係に、プロットは、初期中性値（ｐＨ約７．５）から最大値（ｐＨ約８．３）へのｐＨの突然の（数秒以内の）増加を示した。第１および第２の実行の曲線が非常に類似していたのに対し、第３の実行は経時的により急な減少を示した、ただしプラトー（ｐＨ約６．３～６．７）はすべての試行で類似していた。ｐＨ顕微鏡法および比色アンモニアアッセイを使用した以前の研究で特徴付けられたこの現象は、Ｓｉ３Ｎ４の表面でのＳｉ－Ｎ結合の切断、およびアンモニア（ＮＨ３）またはアンモニウム（ＮＨ４ ＋）を形成するための溶出窒素と水素との反応に関連する。開放系では、約５分でｐＨが６．３～６．７に徐々に低下する。溶液のＮＨ３の割合はｐＨに反比例するので、時間依存性データは、高揮発性ＮＨ３の割合が増加して水系統を離れることを示唆している。これは、アンモニアの典型的な刺激臭と共に、Ｓｉ３Ｎ４粉末（図１Ｄ）の分散直後に生成された気泡の直接的な観察によって確認された。ｐＨ約８．３では、ＮＨ３の割合は７～１０％であると計算されたが、酸性溶液ではほぼ０であった。これらの結果は、Ｓｉ３Ｎ４粉末の一部が葉の凹凸に付着したままであるか、または葉の気孔空洞に閉じ込められたままであると仮定して、同じＳｉ３Ｎ４粉末が連続降雨事象の間に長時間のｐＨ緩衝をもたらすことができることを示している。 Example 4:
pH Analysis of Si 3 N 4 Powder in Aqueous Suspension The change in pH as a function of time for a 15 vol % Si 3 N 4 aqueous suspension is shown in FIGS. 1A-1C. This pH experiment was designed to simulate the effect of periodic rainfall in a grape vine field after spraying a dose of Si 3 N 4 powder. Three consecutive replicates involving suspension, measurement, and drying are shown in Figures 1A, 1B, and 1C, respectively. Regardless of run order, the plot showed a sudden (within seconds) increase in pH from an initial neutral value (pH ~7.5) to a maximum value (pH ~8.3). While the curves for the first and second runs were very similar, the third run showed a steeper decline over time, although a plateau (pH ~6.3-6.7) was trials were similar. Characterized in previous studies using pH microscopy and colorimetric ammonia assays, this phenomenon is characterized by the breaking of Si—N bonds at the surface of Si 3 N 4 and ammonia (NH 3 ) or ammonium (NH 4 + ) is associated with the reaction of dissolved nitrogen with hydrogen to form In an open system, the pH gradually drops to 6.3-6.7 in about 5 minutes. Since the proportion of NH3 in solution is inversely proportional to pH, the time-dependent data suggest that the proportion of highly volatile NH3 increases and leaves the water system. This was confirmed by direct observation of the bubbles generated immediately after dispersion of the Si3N4 powder (Fig. 1D), along with the typical pungent odor of ammonia. At pH ~8.3, the proportion of NH3 was calculated to be 7-10%, whereas it was nearly zero in acidic solutions. These results suggest that the same Si3N4 powder may be used during continuous rainfall events, assuming that some of the Si3N4 powder remains attached to leaf irregularities or remains trapped in leaf stomatal cavities. It shows that it is possible to provide long-term pH buffering in between.

胞子嚢／Ｓｉ３Ｎ４顆粒相互作用のｉｎ ｓｉｔｕ顕微鏡モニタリング
図２Ａ～２Ｃは、Ｓｉ３Ｎ４粉末の顆粒と相互作用する水性懸濁液中の胞子嚢の顕微鏡写真を示す。純水中の胞子嚢についての同様の顕微鏡写真を図２Ｄ～２Ｆに示す。Ｓｉ３Ｎ４は、胞子嚢の外壁に静電的に引き付けられているように見えた。接触は、懸濁液への胞子嚢の導入のほぼすぐ後に起こった。これにより、１分未満で壁が早期に破裂した（図２Ａ～図２Ｃを参照されたい）。逆に、純水中の胞子嚢は、約１１０分後にのみ成熟した遊走子を放出した（図２Ｄ～図２Ｆを参照されたい）。興味深いことに、Ｓｉ３Ｎ４顆粒と接触したときに破裂しなかった胞子嚢の画分もあった。それらは徐々にＳｉ３Ｎ４顆粒によって覆われたが、数時間後まで遊走子を放出しなかった（図２Ｇ～２Ｋの微速度の顕微鏡写真を参照されたい）。まとめると、これらの顕微鏡写真は、攻撃的な環境が胞子嚢の近傍に発生したことを明らかにした。図１Ａ～１Ｃに示すように、ｐＨの上昇と組み合わせたアンモニア気泡の存在は、胞子嚢の細胞壁に容易に浸透する揮発性分子である気体アンモニアの生成に関連する。同様に、真菌細胞はアンモニアに対して透過性であり、アンモニアは非解離分子の自由な拡散によって細胞に入る。 In situ microscopic monitoring of sporangia/Si 3 N 4 granule interactions Figures 2A-2C show micrographs of sporangia in aqueous suspension interacting with granules of Si 3 N 4 powder. Similar photomicrographs of sporangia in pure water are shown in Figures 2D-2F. Si 3 N 4 appeared to be electrostatically attracted to the outer wall of the sporangia. Contact occurred almost immediately after introduction of the sporangia into the suspension. This resulted in premature rupture of the wall in less than 1 minute (see Figures 2A-2C). Conversely, sporangia in pure water released mature zoospores only after about 110 min (see Figures 2D-2F). Interestingly, there was also a fraction of sporangia that did not burst when in contact with the Si3N4 granules . They were gradually covered by Si 3 N 4 granules but did not release zoospores until several hours later (see time-lapse micrographs in FIGS. 2G-2K). Taken together, these micrographs revealed that an aggressive environment developed near the sporangia. As shown in FIGS. 1A-1C, the presence of ammonia bubbles in combination with elevated pH is associated with the production of gaseous ammonia, a volatile molecule that readily penetrates the cell walls of the sporangia. Similarly, fungal cells are permeable to ammonia, which enters the cell by free diffusion of undissociated molecules.

＜１分の接触時間での胞子嚢の膜とＳｉ３Ｎ４顆粒との間の相互作用の詳細な観察を図３Ａに示す。挿入図の正方形領域の拡大図を図３Ｂに示す。この拡大は、膜の局所的な膨潤（すなわち、凸状の湾曲）を示し、未熟な遊走子の差し迫った破裂および放出を示唆する。Ｓｉ３Ｎ４顆粒と接触した胞子嚢の生存率を光学顕微鏡および蛍光顕微鏡でモニターして、セラミックの抗真菌効果を定量した。図４Ａおよび図４Ｂは、それぞれ１．５体積％のＳｉ３Ｎ４顆粒を用いて、および用いずに、３時間水に懸濁し、次いでフルオレセインジアセテートで染色した、濃度１０５ｍＬ－１の生きている胞子嚢の蛍光画像を示す。胞子嚢の全画分（光学顕微鏡による）および蛍光画像の直接計数によって検出された生きている胞子嚢の同時定量化により、図４Ｃに示す部分プロットが得られた。純水と比較した場合、Ｓｉ３Ｎ４顆粒を含有する懸濁液について明らかな抗真菌効果が観察された。 A detailed observation of the interaction between the sporangia membrane and the Si3N4 granules at <1 min contact time is shown in Fig. 3A. A magnified view of the square area of the inset is shown in FIG. 3B. This enlargement indicates localized swelling of the membrane (ie, convex curvature), suggesting imminent rupture and release of immature zoospores. The viability of sporangia in contact with Si 3 N 4 granules was monitored by light and fluorescence microscopy to quantify the antifungal effect of the ceramic. FIGS. 4A and 4B show 10 5 mL −1 concentrations of granules with and without 1.5 vol % Si 3 N 4 granules, respectively, suspended in water for 3 hours and then stained with fluorescein diacetate. Fluorescent images of live sporangia are shown. Simultaneous quantification of the total fraction of sporangia (by light microscopy) and viable sporangia detected by direct counting of fluorescence images yielded the partial plot shown in FIG. 4C. A clear antifungal effect was observed for the suspension containing Si3N4 granules when compared to pure water.

Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａに対する予防的および治癒的なＳｉ３Ｎ４効力のモニタリング
２つのブドウのつるの種、Ｃａｂｅｒｎｅｔ ＳａｕｖｉｇｎｏｎおよびＣａｎｎｏｎａｕ由来の葉のディスクに関する実験結果を図５Ａ～５Ｃおよび図６Ａ～６Ｃに示す。実体顕微鏡での処理された非感染葉の目視検査では、実験の５日に沿う植物毒性の徴候は明らかにされなかった。両方の場合において、２つの実験の実行の各々について５つの葉ディスク試料を試験し（ｎ＝１０）、両方の実験の実行は同様の結果を示した。対照試料を同時に試験した。すべての対照の葉ディスクは感染を示した。接種の５日後に、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの葉のディスクの病原体胞子形成が起こった（図５Ａ）。Ｃａｎｎｏｎａｕについては、対照の葉のディスクの感染はより重症であり（図６Ａ）、ほとんどの場合、感染スポットの壊死をもたらした。これは、非常に感受性の高い栽培品種または若い柔らかい葉の組織でしばしば観察される。実験の５日間を通して植物毒性は見られなかった。完全な感染防御は、Ｓｉ３Ｎ４で前処理または共処理された試料について観察された（図５Ａおよび図５Ｃにそれぞれ示すパネル）。Ｃａｎｎｏｎａｕ種については、前処理した試料では５枚の葉ディスクのうち３枚でのみ全体の保護が観察されたが（図６Ｂ）、共処理したディスクでは胞子形成の徴候はなかった（図６Ｃ）。 P. Monitoring of Preventive and Curative Si 3 N 4 Efficacy Against Viticola Experimental results for leaf discs from two grape vine species, Cabernet Sauvignon and Cannonau, are shown in FIGS. 5A-5C and 6A-6C. Visual inspection of treated, uninfected leaves under a stereomicroscope revealed no signs of phytotoxicity along the 5 days of the experiment. In both cases, five leaf disc samples were tested (n=10) for each of two experimental runs, and both experimental runs showed similar results. A control sample was tested at the same time. All control leaf discs showed infection. Pathogen sporulation of Cabernet Sauvignon leaf discs occurred 5 days after inoculation (Fig. 5A). For Cannonau, infection of control leaf discs was more severe (Fig. 6A), most often resulting in necrosis of the infected spots. This is often observed in very susceptible cultivars or in young tender leaf tissue. No phytotoxicity was observed during the 5 days of the experiment. Complete protection was observed for samples pretreated or co-treated with Si 3 N 4 (panels shown in FIGS. 5A and 5C, respectively). For Cannonau species, total protection was observed in only 3 out of 5 leaf discs in the pretreated sample (Fig. 6B), whereas no signs of sporulation were observed in the co-treated discs (Fig. 6C). .

Ｓｉ３Ｎ４の潜在的な治療効果は、感染の３日後に非常に感受性の高いＳｕｌｔａｎａ品種を処理することによってさらに評価した。残存するＳｉ３Ｎ４顆粒は気孔内に留まることができるので、この試験は、病原性が比較的進行した感染状態で停止され得るかどうかを調査した。換言すれば、この実験は、Ｓｉ３Ｎ４がどのようにして葉組織内の菌糸体に影響を及ぼすか、または新たな胞子嚢の放出を阻止するかを判定しようとした。Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａは、細胞間空間にコロニーを形成し、葉肉細胞に担子菌を産生したが、検出可能な胞子形成はなかったことが観察された。これは通常なら５～６日で起こったであろう。この場合、湿ったＳｉ３Ｎ４顆粒が部分的に気孔を貫通したようである。その後の顆粒からの窒素の溶出は、おそらくＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａがその菌糸を発達させる細胞内空間に拡散した。この阻害機構は、重炭酸アニオンが病原体を死滅させるのに十分な濃度のＮＨ３を確立するのに必要なアルカリ度を供給する重炭酸アンモニウムの抗真菌効果に似ている。 The potential therapeutic effect of Si3N4 was further evaluated by treating a highly susceptible Sultana cultivar 3 days after infection. Since residual Si 3 N 4 granules can remain in the stomata, this study investigated whether virulence could be stopped at relatively advanced infection states. In other words, this experiment sought to determine how Si 3 N 4 affects the mycelium within the leaf tissue or prevents the release of new sporangia. P. viticola was observed to colonize the intercellular spaces and produce basidiomycetes in the mesophyll cells, but without detectable sporulation. Normally this would have happened in 5-6 days. In this case, it appears that the wet Si 3 N 4 granules partially penetrated the pores. Subsequent elution of nitrogen from the granules is probably due to P. viticola diffused into the intracellular space where it develops its hyphae. This inhibition mechanism resembles the antifungal effect of ammonium bicarbonate, where the bicarbonate anion supplies the alkalinity necessary to establish sufficient concentrations of NH3 to kill pathogens.

生きている胞子嚢のｉｎ ｓｉｔｕラマン分光モニタリング
純水および１．５体積％のＳｉ３Ｎ４粉末を含有する懸濁液に１０分間室温で浸漬した後に収集したＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａのラマンスペクトルを、それぞれ図７Ａおよび７Ｂに示す。スペクトルを、４２４ｃｍ－１で観察された散乱強度に対して正規化した（図示せず）。骨格振動を表すこのシグナルは、すべてのグルカンに共通の非特異的マーカーである。Ｓｉ３Ｎ４粉末を用いた場合と用いない場合とで、水性曝露の強度に顕著な差は示されなかった。次いで、スペクトルをＶｏｉｇｔｉａｎサブバンドにデコンボリューションし、比較した。２つのスペクトル間の明確な差は、卵菌の構造の変化に起因する。各スペクトルのデコンボリューションされたラマンバンドを図７Ａおよび図７Ｂに示し、それらの関連する割り当ておよび参考文献を以下の表１に列挙する。 In situ Raman spectroscopy monitoring of living sporangia P. spp. Raman spectra of viticola are shown in FIGS. 7A and 7B, respectively. Spectra were normalized to the observed scattering intensity at 424 cm −1 (not shown). This signal, representing skeletal oscillations, is a non-specific marker common to all glucans. No significant difference in intensity of aqueous exposure was shown with and without Si 3 N 4 powder. The spectra were then deconvoluted into Voigtian subbands and compared. A clear difference between the two spectra is due to changes in the oomycete structure. The deconvoluted Raman bands of each spectrum are shown in FIGS. 7A and 7B, and their associated assignments and references are listed in Table 1 below.

純水にさらされた胞子嚢のスペクトル
卵菌は最近、更新された分類に従ってＳｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓに再分類されている。主な構造的特徴としては、壁中のセルロースの存在、炭素系エネルギー源としてのグリコーゲンの代わりにミコラミナリン、キチンの顕著な欠如が挙げられる。Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａに密接に関連する卵菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃｉａの炭水化物含有量の最近の分析は、細胞壁がキチンを完全に欠いており、約８５％のβ－グルカンからなり、その約４０％がセルロースによって表されたことを明らかにした。低重合レベルの１，３β－グルカンおよび１，３，６β－グルカンも、グルクロン酸およびマンナンのより低い画分と共に存在した。このような詳細な情報は、Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａについては入手できないが、以前の証拠は、この病原体が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓの他の最もよく知られた生物とわずかに異なる可能性があることを示している。実際、Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａは少なくとも２つの異なるキチンシンターゼを発現することができ、キチンは、植物成長中に胞子嚢、胞子嚢柄および菌糸細胞壁の表面で検出された。 Spectra of sporangia exposed to pure water Oomycetes have recently been reclassified to Stramenopiles according to the updated classification. Major structural features include the presence of cellulose in the walls, mycolaminarin instead of glycogen as a carbon-based energy source, and a pronounced lack of chitin. P. A recent analysis of the carbohydrate content of the oomycete Phytophthora parasiticia, a closely related viticola oomycete, showed that the cell wall was completely devoid of chitin and consisted of about 85% β-glucan, about 40% of which was represented by cellulose. It revealed that. Low polymerized levels of 1,3β-glucan and 1,3,6β-glucan were also present along with lower fractions of glucuronic acid and mannan. Such detailed information can be found in P.M. Although not available for P. viticola, previous evidence indicates that this pathogen may differ slightly from other best-known organisms of Peronosporales. In fact, P.I. viticola can express at least two different chitin synthases, and chitin has been detected on the surface of sporangia, sporangiophores and mycelial cell walls during plant development.

卵胞子が休眠している場合（この場合のように）、胞子嚢の構造は、細胞質全体に分布する大きな脂質小球からなり、細胞内腔全体を満たす。それらは、卵胞子発芽のための貯蔵材料として働く。ミトコンドリアは、脂質小球の間の小さな隙間に存在する。小球（または液胞）は異なるサイズであり、比較的薄い間隙に含まれる。卵菌の全体的な外壁は複雑であり、外側および内側の卵胞子の壁（それぞれＯＯＷおよびＩＯＷ）の２つの層に分けられる。ＯＯＷおよびＩＯＷは、薄いわずかに波打った原形質膜によって互いに分離されている。ＩＯＷは、主に、β－１，３－結合グルカン（約８０％；キチンを含む、Ｎ－アセチルグルコサミンで形成されたホモポリマー）、セルロース（約１０％）、およびタンパク質（壁関連酵素および構造タンパク質に分けられる）からなる。グルカンは、ＩＯＷ構造において優勢な化学種である。それらは、マンノースおよびグルコサミンの少量の画分と共に、直線状の平行なアレイに配向されたセルロース性の原線維を含有する。キチンは、壁の剛性および強度に寄与するため、重要な構造的機能を有する。ＯＯＷは、主にマンナンおよびタンパク質から構成され、これはβ－１，６－グルカンで内壁にそれを連結するが、脂質も含有する。卵原細胞の壁は、外側に設定され、卵胞子から周辺質の腔部によって分離された、より厚い原線維の壁であり、比較的多量の脂質およびタンパク質を含有する。脂質は構造に疎水性を付与し、これは休眠中に病原体を安全に保つために必要である。Ｎｅｇｒｅｌらは最近、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａに特異的な代謝産物を探索し、３種類の非定型脂質、すなわちセラミド、ならびにアラキドン酸およびエイコサペンタエン酸の誘導体を同定した。これらの脂質は、その発達の非常に早い段階からＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａに存在することが報告された。 When the oospore is dormant (as in this case), the sporangia structure consists of large lipid globules distributed throughout the cytoplasm, filling the entire intracellular lumen. They serve as storage material for oospore germination. Mitochondria reside in small spaces between lipid globules. The globules (or vacuoles) are of different sizes and are contained in relatively thin interstices. The overall outer wall of the oomycete is complex and divided into two layers, the outer and inner oospore walls (OOW and IOW, respectively). The OOW and IOW are separated from each other by a thin, slightly undulating plasma membrane. IOWs are primarily composed of β-1,3-linked glucans (about 80%; homopolymers formed of N-acetylglucosamine, including chitin), cellulose (about 10%), and proteins (wall-associated enzymes and structures). divided into proteins). Glucan is the predominant chemical species in the IOW structure. They contain cellulosic fibrils oriented in linear parallel arrays with minor fractions of mannose and glucosamine. Chitin has an important structural function as it contributes to the stiffness and strength of the wall. OOW is composed mainly of mannan and protein, which connects it to the inner wall with β-1,6-glucan, but also contains lipids. The oogonia wall is a thicker fibril wall set outward and separated from the oospore by a periplasmic cavity, and contains relatively large amounts of lipids and proteins. Lipids impart hydrophobicity to the structure, which is necessary to keep pathogens safe during dormancy. Negrel et al. recently searched for Plasmopara-specific metabolites and identified three atypical lipids, namely ceramides, and derivatives of arachidonic and eicosapentaenoic acids. These lipids are present in P . viticola was reported to be present.

これらの構造的特徴は、図７Ａのラマンスペクトルにおいて観察された（表１も参照されたい）。真菌構造の場合、Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａの細胞壁は、主に、分岐ポリマーグルコース含有β－グルカン、非分岐ポリマーＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン含有キチン、および糖／マンノタンパク質と共有結合したポリマーマンノースを含む多糖類からなる。タンパク質および脂質は、多糖類と比較して全体のごく一部のみを表す。したがって、炭水化物振動モードがラマンスペクトルの優勢を占めると予想される。主鎖グルコース環からの累積シグナルは、４８２ｃｍ－１のバンド１で見出された。壁のキチンが寄与するバンドは、６４３、６４９、７１０および８９３ｃｍ－１に見られ、それぞれバンド１４、１５、１９（＝Ｃ－Ｈ屈曲）および３３（Ｃ－Ｈ環延伸）として標識される。これらのバンドはすべてキチンに関連し得るが、キチンは、実際には、試験した卵菌試料の炭水化物の微量の成分であると予想される。バンド１９および３３のより可能性の高い割り当てはセルロースであるが、バンド１４および１５は両方とも直鎖ポリマーセルロース中のβ－Ｄ－グルコースに割り当てることもできる。セルロースおよびアミロペクチンからのフィンガープリントシグナルは、５８３ｃｍ－１で見出された（バンド９；Ｃ－Ｃ－Ｏ屈曲およびＣ－Ｏねじり振動）。壁の構造から予想されるように、顕著なシグナルが８９３ｃｍ－１に見出され（赤道Ｃ－Ｈ屈曲振動）、これはβ－グルカンのマーカーとして機能した。α－グルカンのフィンガープリント振動である５５０ｃｍ－１でのラマンシグナルの欠如（グリコシド結合のＣ－Ｏ－Ｃ屈曲）は、この多糖異性体が真菌の壁の主要成分ではないことを示した。このため、９４２ｃｍ－１でのラマンシグナル（非対称環振動）に対するα－グルカンのいずれの寄与も、図７Ａのスペクトルから除外された。同様の推論を、９２２ｃｍ－１で起こるはずのデキストラン構造からの環振動、および５５０ｃｍ－１でのそのグリコシドシグナルに適用した。これらのいずれも、水にさらされたＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａのスペクトルでは検出されなかった。これらの観察は、本卵菌構造におけるこの複合グルカンのいずれかの優勢な存在を除外する。図７Ａにおける４９０ｃｍ－１と５６０ｃｍ－１との間の狭いスペクトル領域において、バンド２および３（それぞれ５００ｃｍ－１および５５８ｃｍ－１）は、多糖、Ｄ（＋）－マンノースにおけるＣ－Ｃ主鎖延伸からのシグナルであり、一方、バンド４、５および７（それぞれ５１０ｃｍ－１、５３５ｃｍ－１、および５５８ｃｍ－１）は、セルロース、トレハロース（環の変形）およびβ－Ｄ－グルコースにそれぞれ割り当てられる（表Ｓ１を参照）。二糖トレハロースは、６０３ｃｍ－１のバンド１１の主な寄与物質であり、これはまたバンド６および３０にも寄与する（それぞれ５４４ｃｍ－１および８３７ｃｍ－１で）。バンド３１および３４（それぞれ８４６および９０６において）へのトレハロースの寄与は、他の炭水化物構造と比較しておそらく低い重量である（表Ｓ１参照）。より具体的には、バンド３１は、グルコースおよびグルカンからの強い累積シグナルを表すが、トリグリセリドからのいくつかの中／強のシグナルも含む（表Ｓ１参照）。トレハロースは、エネルギー源であり、環境ストレスに対する保護分子であるため、多くの真菌種の代謝において重要な分子である。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓは、非還元性トレハロース二糖の合成を促進し、熱または酸化ストレスに応答してそれを蓄積する。ブドウのつるにおいて、Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａは不可逆的な気孔の開口を誘導することが知られており、これは順次遊走子による宿主感染を支持するものであり、この調節解除はトレハロースの蓄積に関連し、外因的に適用されたトレハロースは気孔の閉鎖に拮抗する。したがって、胞子嚢に高レベルのトレハロースが存在することは、ブドウのつるの葉の感染を促進するシグナルを表し得る。 These structural features were observed in the Raman spectrum of FIG. 7A (see also Table 1). For fungal structures, P. The viticola cell wall consists primarily of branched polymeric glucose-containing β-glucans, unbranched polymeric N-acetyl-D-glucosamine-containing chitin, and polysaccharides containing polymeric mannose covalently bound to sugars/mannoproteins. Proteins and lipids represent only a small part of the total compared to polysaccharides. Therefore, carbohydrate vibrational modes are expected to dominate the Raman spectrum. A cumulative signal from the backbone glucose ring was found in band 1 at 482 cm −1 . Bands contributed by wall chitin are found at 643, 649, 710 and 893 cm −1 , labeled as bands 14, 15, 19 (=CH bending) and 33 (CH ring stretching), respectively. Although all of these bands may be related to chitin, chitin is actually expected to be a minor carbohydrate component of the oomycete samples tested. Bands 19 and 33 are more likely assigned to cellulose, but both bands 14 and 15 can also be assigned to β-D-glucose in the linear polymer cellulose. Fingerprint signals from cellulose and amylopectin were found at 583 cm −1 (band 9; C—C—O bending and C—O torsional vibrations). As expected from the wall structure, a prominent signal was found at 893 cm −1 (equatorial CH bending vibration), which served as a marker for β-glucan. The absence of a Raman signal at 550 cm −1 (C—O—C bends of glycosidic bonds), fingerprint vibration of α-glucan, indicated that this polysaccharide isomer was not a major component of the fungal wall. Therefore, any contribution of α-glucan to the Raman signal (asymmetric ring vibration) at 942 cm −1 was excluded from the spectrum in FIG. 7A. A similar reasoning was applied to the ring vibration from the dextran structure that should occur at 922 cm −1 and its glycosidic signal at 550 cm −1 . Both of these are effective for water-exposed P. It was not detected in the spectrum of viticola. These observations rule out the predominant presence of either of these complex glucans in the present oomycete structure. In the narrow spectral region between 490 cm −1 and 560 cm −1 in FIG. 7A, bands 2 and 3 (500 cm −1 and 558 cm −1 respectively) are C—C main chain extensions in the polysaccharide, D(+)-mannose. while bands 4, 5 and 7 (510 cm −1 , 535 cm −1 and 558 cm −1 respectively) are assigned to cellulose, trehalose (ring modification) and β-D-glucose, respectively ( See Table S1). The disaccharide trehalose is the major contributor to band 11 at 603 cm −1 and it also contributes to bands 6 and 30 (at 544 cm −1 and 837 cm −1 respectively). The contribution of trehalose to bands 31 and 34 (at 846 and 906, respectively) is probably of low weight compared to other carbohydrate structures (see Table S1). More specifically, band 31 represents strong cumulative signals from glucose and glucans, but also contains some moderate/strong signals from triglycerides (see Table S1). Trehalose is an important molecule in the metabolism of many fungal species, as it is an energy source and a protective molecule against environmental stress. For example, Candida albicans promotes synthesis of non-reducing trehalose disaccharide and accumulates it in response to heat or oxidative stress. In grape vines, P. viticola is known to induce irreversible stomatal opening, which favors host infection by sequential zoospores, and this deregulation is associated with the accumulation of trehalose, applied exogenously. Trehalose antagonizes stomatal closure. Therefore, the presence of high levels of trehalose in sporangia may represent a signal promoting infection of grape vine leaves.

核酸に関連するシグナルは、ホスホジエステル結合およびプリン結合の両方から見出された。ＤＮＡのＣ’５－Ｏ－Ｐ－Ｏ－Ｃ’３ホスホジエステル結合対称延伸（７８２ｃｍ－１のバンド２５）は、純水に曝露させたＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａの低周波スペクトルで検出された、最も強いシグナルであった（図７Ａ）。この個々のシグナルとは異なり、８２７ｃｍ－１の対応する反対称延伸バンド２９は、真菌の膜の典型的な分子であるステロールからのいくつかのシグナルと重複した（表１参照）。アデニン（それぞれ５３５、６２３、７３１および９４２ｃｍ－１のバンド５、１２、２１および３６）、シトシン（それぞれ５４４、５５８、５９４、６０３、７１０および７９５ｃｍ－１のバンド６、７、１０、１１、１９および２６）、グアニン（それぞれ５７０、６４３、６８１および８４６ｃｍ－１のバンド８、１４、１７および３１）、チミン（それぞれ６２３、７４６および７５３ｃｍ－１のバンド１２、２２および２３）、およびウラシル（８０７ｃｍ－１のバンド２７）に関連するプリン由来の振動バンドも観察された。研究された周波数範囲（図７Ａおよび図７Ｂを参照されたい）で２番目に強い検出信号である８４６ｃｍ－１のバンド３１は、グアニン環のＣ４－Ｎ９－Ｃ８＋Ｎ１－Ｃ２－Ｎ３およびＮ２－Ｃ２－Ｎ３の面内変形が主に寄与している。 Signals associated with nucleic acids were found from both phosphodiester and purine linkages. C'5-OPO-C'3 phosphodiester bond symmetric stretching of DNA (band 25 at 782 cm -1 ) was observed in P. elegans exposed to pure water. It was the strongest signal detected in the low frequency spectrum of viticola (Fig. 7A). Unlike this individual signal, the corresponding antisymmetric stretching band 29 at 827 cm −1 overlapped with several signals from sterols, typical molecules of fungal membranes (see Table 1). adenine (bands 5, 12, 21 and 36 at 535, 623, 731 and 942 cm −1 respectively), cytosine (bands 6, 7, 10, 11, 19 at 544, 558, 594, 603, 710 and 795 cm −1 respectively) and 26), guanine (bands 8, 14, 17 and 31 at 570, 643, 681 and 846 cm −1 respectively), thymine (bands 12, 22 and 23 at 623, 746 and 753 cm −1 respectively), and uracil (807 cm A purine-derived vibrational band associated with the -1 band 27) was also observed. Band 31 at 846 cm −1 , the second strongest detected signal in the frequency range studied (see FIGS. 7A and 7B), is the C4−N9−C8+N1−C2−N3 and N2−C2− The in-plane deformation of N3 mainly contributes.

細胞膜に通常存在する脂質からの特異的シグナルを探すと、研究したスペクトル領域におけるホスファチジルセリンからの強い発光が約７３４ｃｍ－１で予想された。７３１ｃｍ－１のバンド２１が、純水にさらされた胞子嚢のスペクトルにおいて観察された（図７Ａ）。しかし、このバンドへの寄与は、ＤＮＡアデニンおよびトレハロースにおけるイミダゾール環の環呼吸からも生じ得る。低周波スペクトルにおけるホスファチジルコリン由来の主なバンドは、約７１９および８７５ｃｍ－１であると予想された。しかし、図７Ａでは、純水にさらされた胞子嚢では、これらのシグナルはいずれも観察されなかった。ホスファチジルイノシトールに起因する５１９ｃｍ－１および８６８ｃｍ－１の主な低周波帯域も、水にさらされた胞子嚢のスペクトルにおいて欠けていた。逆に、おそらくそれぞれ５５８ｃｍ－１（バンド７）および６８１ｃｍ－１（バンド１７）のステロールおよびセラミドからの明確なシグナルが検出された。残念ながら、これらのシグナルは、ＤＮＡプリンからのシグナルと強く重複していた。明確なシグナルは、真菌の細胞膜において最も豊富なステロールであるエルゴステロールによってもたらされた。この分子は、５９４、７１０、７２５、８２７および９４２ｃｍ－１（すなわち、それぞれバンド１０、１９、２０、２９、および３６）の顕著な低周波シグナルを含む複雑なラマンスペクトルを特徴とする。 Looking for specific signals from lipids normally present in cell membranes, a strong emission from phosphatidylserine in the spectral region studied was expected at about 734 cm −1 . A band 21 at 731 cm −1 was observed in the spectrum of sporangia exposed to pure water (FIG. 7A). However, a contribution to this band could also arise from ring respiration of the imidazole ring in DNA adenine and trehalose. The major bands from phosphatidylcholine in the low-frequency spectrum were expected to be around 719 and 875 cm −1 . However, none of these signals were observed in sporangia exposed to pure water in FIG. 7A. The main low frequency bands at 519 cm −1 and 868 cm −1 attributed to phosphatidylinositol were also absent in the spectra of water-exposed sporangia. Conversely, distinct signals were detected, presumably from sterols and ceramides at 558 cm −1 (band 7) and 681 cm −1 (band 17), respectively. Unfortunately, these signals strongly overlapped with signals from DNA purines. A clear signal was provided by ergosterol, the most abundant sterol in fungal cell membranes. This molecule is characterized by a complex Raman spectrum containing prominent low frequency signals at 594, 710, 725, 827 and 942 cm −1 (ie bands 10, 19, 20, 29 and 36 respectively).

ステロールは、明確な低周波シグナル（表１参照）を含む複雑なラマンスペクトルを特徴とする。しかし、正確なスクリーニングにより、これらの低周波シグナルのいずれも、他の膜分子からの重複シグナルを含まないことが明らかになった。ステロールは、細胞膜の流動性、透過性、および完全性を調節するのに不可欠な成分である。真菌とは対照的に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓはステロールを合成することができないが、有性生殖と無性生殖の両方のためにステロールを必要とする。Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａでは、植物宿主からのフィトステロールが取り込まれ、いずれのさらなる改変もなしに使用される。 Sterols are characterized by complex Raman spectra containing distinct low frequency signals (see Table 1). However, precise screening revealed that none of these low-frequency signals contained overlapping signals from other membrane molecules. Sterols are essential components in regulating the fluidity, permeability and integrity of cell membranes. In contrast to fungi, Peronosporales are unable to synthesize sterols, but require sterols for both sexual and asexual reproduction. Phytophthora takes up phytosterols from the plant host and uses them without any further modification.

他の脂質化合物に関して、アラキドン酸は、植物内の卵菌によって放出される周知の誘発物質であり、最近の知見は、Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａのアラキドン酸およびエイコサペンタエン酸のセラミドおよび誘導体が感染過程の非常に初期の段階で産生されることを示している。バンド３２（８６１ｃｍ－１）および３５（９３１ｃｍ－１）を、アルファ－リノレン酸におけるＣ－Ｏ振動およびアラキドン酸におけるＣ－Ｈ屈曲に割り当てた。前者のバンドはＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａに特有の脂肪酸のフィンガープリントとして機能するが、後者は残念ながらグルコースおよびヒスチジン由来のバンドと重複する（後述）。脂肪酸は、一般に卵菌病原体による感染時に植物に放出される。グリセロリン脂質レシチン（Ｃ－Ｎ延伸に割り当てられる）の低周波数での最も強いシグナルは、（７１５ｃｍ－１での）バンド２０にも寄与し得る。レシチン由来のさらなるバンドは、７６４および８２７ｃｍ－１に現れる（それぞれバンド２４および２９）。これらは、それぞれＯ－Ｐ－Ｏ対称および反対称の延伸に起因する。図７Ａに示すスペクトルの完全な標識を与える試みを表１に示す。 As for other lipid compounds, arachidonic acid is a well-known inducer released by oomycetes in plants, with recent findings from P. ceramides and derivatives of arachidonic acid and eicosapentaenoic acid of viticola are produced at a very early stage in the infection process. Bands 32 (861 cm −1 ) and 35 (931 cm −1 ) were assigned to the C—O vibrations in alpha-linolenic acid and the C—H bends in arachidonic acid. The former band was P.I. viticola, which unfortunately overlaps bands from glucose and histidine (discussed below). Fatty acids are commonly released into plants upon infection by oomycete pathogens. The strongest signal at low frequencies of glycerophospholipid lecithin (assigned to the CN stretch) may also contribute to band 20 (at 715 cm −1 ). Additional bands from lecithin appear at 764 and 827 cm −1 (bands 24 and 29, respectively). These are due to OPO symmetric and antisymmetric stretching, respectively. An attempt to give a complete label of the spectrum shown in FIG. 7A is shown in Table 1.

１．５体積％のＳｉ３Ｎ４水懸濁液に曝露した胞子嚢のスペクトル
水性懸濁液中のＳｉ３Ｎ４の存在によって誘導される細胞構造Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａ胞子嚢の変化を、図７Ａと図７Ｂとの間のスペクトル変動によって示す。一般的な傾向として、Ｓｉ３Ｎ４懸濁液に曝露された胞子嚢の全ラマンバンドは、純水の中の胞子嚢の対応するバンドと比較した場合、比較的低い強度を示した。主な変形例は以下の通りである。 Spectra of sporangia exposed to 1.5% by volume Si 3 N 4 aqueous suspension . Viticola sporangia changes are shown by the spectral variation between Figures 7A and 7B. As a general trend, all Raman bands of sporangia exposed to Si 3 N 4 suspension exhibited relatively low intensity when compared to the corresponding bands of sporangia in pure water. Main modifications are as follows.

高強度または中強度のいくつかのバンドが消失したか、またはＳｉ３Ｎ４懸濁液中の胞子嚢のスペクトルにおいて有意に減少した強度でのみ生じた。それらは以下を含んでいた：アデニンからのバンド５および１２（それぞれ５３５および６２３ｃｍ－１）；シトシン由来のバンド１０（５９４ｃｍ－１）；ＤＮＡ中のＣ’５－Ｏ－Ｐ－Ｏ－Ｃ’３ホスホジエステル対称延伸からのバンド２５（７８２ｃｍ－１）；グアニン由来のバンド３１（８４６ｃｍ－１）；および、セルロース由来のバンド３３（８９３ｃｍ－１）（おそらくキチンも寄与する）。 Some bands of high or medium intensity disappeared or appeared only at significantly reduced intensity in the spectra of sporangia in Si 3 N 4 suspensions. They included: bands 5 and 12 from adenine (535 and 623 cm −1 respectively); band 10 from cytosine (594 cm −1 ); C′5-OPOC′ in DNA. Band 25 (782 cm −1 ) from 3-phosphodiester symmetric stretching; band 31 (846 cm −1 ) from guanine; and band 33 (893 cm −1 ) from cellulose (possibly also contributed by chitin).

Ｓｉ３Ｎ４懸濁液に曝露された胞子嚢のスペクトルにおいて、３つの新しいバンドが出現した。それらは以下の通りであった：バンド１１＊（６１３ｃｍ－１）、バンド１５＊（６５４ｃｍ－１）、およびバンド３２＊（８７２ｃｍ－１）。これらのラマンシグナルの源は、（後述するように）環境ストレスに応答して胞子嚢によって産生される既存の分子または新しい化学種の化学修飾に起因する。 Three new bands appeared in the spectrum of the sporangia exposed to the Si3N4 suspension . They were: band 11 * (613 cm −1 ), band 15 * (654 cm −1 ), and band 32 * (872 cm −1 ). The sources of these Raman signals result from chemical modifications of existing molecules or new chemical species produced by sporangia in response to environmental stress (as described below).

Ｓｉ３Ｎ４の存在下でのさらなるスペクトル変動は以下の通りであった：多糖におけるＣ－Ｃ骨格延伸からのバンド２およびＤ（＋）－マンノースからのバンド３（それぞれ４９０および５００ｃｍ－１）。これらのシグナルは強度－傾向反転を受け、前者は後者よりも強くなった。セルロース由来のバンド９（５８３ｃｍ－１）も比較的高い強度を示した。バンド１７（６８１ｃｍ－１）についても同様の傾向が観察され、セラミドのＯ＝ＣＮおよびＣＣＯ屈曲に割り当てられたが、グアニン環からの寄与も有していた。チミンを表すバンド２３（７５３ｃｍ－１）、ヒスチジン由来のバンド３５（９３１ｃｍ－１）およびアデニン由来のバンド３６（９４２ｃｍ－１）は、強度の有意な低下を経た。 Further spectral shifts in the presence of Si 3 N 4 were as follows: band 2 from CC backbone stretching in polysaccharide and band 3 from D(+)-mannose (490 and 500 cm −1 respectively). . These signals underwent an intensity-trend reversal, the former becoming stronger than the latter. Cellulose-derived band 9 (583 cm −1 ) also exhibited relatively high intensity. A similar trend was observed for band 17 (681 cm −1 ), assigned to the O=CN and CCO bends of ceramide, but also had a contribution from the guanine ring. Band 23 (753 cm −1 ) representing thymine, band 35 (931 cm −1 ) derived from histidine and band 36 (942 cm −1 ) derived from adenine underwent a significant decrease in intensity.

純水にさらされた胞子嚢と水性Ｓｉ３Ｎ４粉末懸濁液との間の明確なスペクトルの差の理由は、胞子嚢とＳｉ３Ｎ４顆粒との間で生じる化学反応の結果であった。 The reason for the distinct spectral difference between the sporangia exposed to pure water and the aqueous Si3N4 powder suspension is the result of the chemical reaction occurring between the sporangia and the Si3N4 granules. rice field.

実施例５：
Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａとＳｉ３Ｎ４との間の化学的相互作用
直接的な観察により、この研究は、水性懸濁液中のＳｉ３Ｎ４の堅牢なｐＨ緩衝およびガス状アンモニアの放出を確認した（図１Ａ～図１Ｃを参照）。観察されたｐＨ緩衝は、オルトケイ酸によるＳｉ３Ｎ４の表面の緩やかな被覆のため、および開放系を出るガス状窒素のために、過渡的な現象であった（図１Ｄで観察された気泡を参照）。 Example 5:
P. Chemical interaction between viticola and Si3N4 By direct observation, this study confirmed the robust pH buffering and release of gaseous ammonia of Si3N4 in aqueous suspensions (Fig. 1A-1C). The observed pH buffering was a transient phenomenon due to the loose coating of the surface of Si3N4 by orthosilicic acid and due to gaseous nitrogen exiting the open system (bubbles observed in Fig. 1D). ).

図２Ｇ～２Ｋでは、Ｓｉ３Ｎ４顆粒が胞子嚢の壁に静電的に引き付けられているように見えた。Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓの細胞壁は、限られた量のキチンのみからなり、主にグルカン複合体およびマンノタンパク質からなる。後者の構成成分は、５つのマンノース残基を含有するグリコホスフェート基を介してβ－グルカンに連結される。リン酸化マンノシル側鎖は、細胞壁に負電荷を付与する。さらに、胞子嚢の表面の官能基（すなわち、リン酸基、カルボキシル基およびアミノ基）は、高アルカリ環境で脱プロトン化される。それらは、窒素空孔（荷電３＋）およびＮ－Ｎ結合（荷電＋）を含むＳｉ３Ｎ４表面の正電荷部位と相互作用する。接触すると、胞子嚢とＳｉ３Ｎ４顆粒との間の相互作用は、局所的に発生する高アルカリ性ｐＨおよび細胞壁を横切る高揮発性ＮＨ３分子の受動的拡散によって強く影響される。これらのイオン性相互作用は、膜の破裂およびＳｉ３Ｎ４顆粒とのわずか１分の接触後の未成熟な遊走子（図２Ａ～図２Ｃ）の観察される発育不全をもたらす。 In FIGS. 2G-2K, the Si 3 N 4 granules appeared to be electrostatically attracted to the sporangia wall. The cell wall of Peronosporales consists only of limited amounts of chitin and consists mainly of glucan complexes and mannoproteins. The latter component is linked to β-glucan via a glycophosphate group containing five mannose residues. Phosphorylated mannosyl side chains impart a negative charge to the cell wall. In addition, functional groups (ie, phosphate, carboxyl and amino groups) on the sporangia surface are deprotonated in a highly alkaline environment. They interact with positively charged sites on the Si 3 N 4 surface, including nitrogen vacancies (charged 3+) and NN bonds (charged +). Upon contact, the interaction between sporangia and Si3N4 granules is strongly influenced by the locally occurring high alkaline pH and the passive diffusion of highly volatile NH3 molecules across the cell wall. These ionic interactions lead to membrane rupture and the observed underdevelopment of immature zoospores (FIGS. 2A-2C) after only 1 min of contact with Si 3 N 4 granules.

ラマン分析の解釈
核酸のアンモニアによって予想される主な化学反応は加水分解である。核酸は、最初に２つのジヌクレオチドに分解され、一方はアデニンおよびウラシル基を含有し、他方はグアニンおよびシトシン基を保持する。アデニン－ウラシルジヌクレオチドはグアニン－シトシンよりも相対的に安定しているが、両方ともｐＨ値＞８でモノヌクレオチドに分解する。ＮＨ３、アデニンおよびグアニンの存在下では、ホスホジエステル結合が脱プロトン化され、強く不安定化される。任意のアルカリ性ｐＨで、チミン中のＮ（３）の水素も、窒素環の弱い塩基性のために除去される。Ｓｉ３Ｎ４に曝露すると、最も顕著なスペクトル変動は、２つの最も強いシグナル、すなわちバンド２５および３１（すなわち、それぞれ、ＤＮＡのＣ’５－Ｏ－Ｐ－Ｏ－Ｃ’３ホスホジエステル対称延伸およびグアニン環のＣ４－Ｎ９－Ｃ８＋Ｎ１－Ｃ２－Ｎ３の面内変形に関連する）の消失であった。アデニン（バンド５、１２、および３６）およびシトシン（バンド６、１０、１１、１９、および２６）に関連するいくつかのバンドの消失ではないにしても、強度の有意な低下が認められた（図７Ａ～７Ｂを参照されたい）。これらの観察結果は、Ｓｉ３Ｎ４と病原体との間の相互作用に関する以前の研究と一致している。ＮＨ３の拡散および窒素フリーラジカル反応によって作り出される酸化効果の前後のＤＮＡ核酸塩基の概略図をそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに提示する。最も顕著な特徴は、延伸の消失を伴うＤＮＡ中のホスホジエステル結合の切断、バンド２５、ペルオキシ亜硝酸ラジカルとの相互作用によるグアニン環の開環（Ｇ→Ｇｈ）、およびその最も強い環振動の消失、バンド３１である。グアニンにおける環呼吸モードも寄与するバンド１４の著しい強度の低下は、図９Ｂに示されるＧｈ機構を裏付けている。アデニンユニット（Ａ）についても、その構造（Ａ’）の酸化による修飾が観察された。アデノシン酸化は、図９Ｂに示すように、２つの酸素二重結合の形成に起因して、２つの環変形バンド５および１２の消失を担うと考えられる。シトシン核酸塩基（Ｃ）の５－ＯＨ－Ｕ構造への修飾は、バンド６および１０の消失を説明することができる。元のシトシン構造でＮ３＝Ｃ４－Ｎ４およびＣ－Ｃ＝Ｃ屈曲モードを表す前者は、これらの結合が酸化した５－ＯＨ－ＵユニットでそれぞれＮ３－Ｃ＝ＯおよびＣ－Ｃ－ＯＨ結合で置換されているために消失し、後者は元のシトシン構造でのＣ２＝Ｏ屈曲に由来する。これは、酸化された５－ＯＨ－Ｕ構造における対称のＣ４＝Ｏ結合の出現によって相殺された。チミンおよびウラシル（Ｕ）由来のバンドは、それらがただ１つのＣ＝Ｃ二重結合を有するので、より安定的であるようである。最後に、酸化された核酸塩基に関連するいくつかのバンドは、強度のより低い減少を示したことに留意されたい（すなわち、それぞれ５５８、６８１および７３１ｃｍ－１のバンド７、１７、および２１）。しかし、これらのバンドは、脂質が寄与するという特徴を共有していた（それぞれコレステロール、セラミド、およびホスファチジルセリン）。 Interpretation of Raman analysis The main chemical reaction expected by ammonia of nucleic acids is hydrolysis. Nucleic acids are first broken down into two dinucleotides, one containing the adenine and uracil groups and the other bearing the guanine and cytosine groups. Adenine-uracil dinucleotide is relatively more stable than guanine-cytosine, but both degrade to mononucleotides at pH values >8. In the presence of NH 3 , adenine and guanine, the phosphodiester bond is deprotonated and strongly destabilized. At any alkaline pH, the N(3) hydrogen in thymine is also removed due to the weak basicity of the nitrogen ring. Upon exposure to Si 3 N 4 , the most prominent spectral shifts are the two most intense signals, bands 25 and 31 (ie, C′5-OPO—C′3 phosphodiester symmetric stretching of DNA, respectively). and related to in-plane deformation of C4-N9-C8+N1-C2-N3 of the guanine ring). A significant decrease in intensity, if not disappearance, of several bands associated with adenine (bands 5, 12, and 36) and cytosine (bands 6, 10, 11, 19, and 26) was observed ( See Figures 7A-7B). These observations are consistent with previous studies on interactions between Si3N4 and pathogens . Schematic representations of DNA nucleobases before and after oxidative effects produced by NH3 diffusion and nitrogen free radical reactions are presented in Figures 9A and 9B, respectively. The most prominent features are the scission of the phosphodiester bond in DNA with loss of stretch, band 25, the opening of the guanine ring upon interaction with the peroxynitrite radical (G→Gh), and its strongest ring vibration. disappearance, band 31. The marked intensity reduction of band 14, which also contributes to ring breathing modes in guanine, supports the Gh mechanism shown in FIG. 9B. The adenine unit (A) was also observed to be modified by oxidation of its structure (A'). Adenosine oxidation is thought to be responsible for the disappearance of the two ring deformation bands 5 and 12 due to the formation of two oxygen double bonds, as shown in Figure 9B. Modification of the cytosine nucleobase (C) to a 5-OH-U structure can explain the disappearance of bands 6 and 10. The former, which represents the N3=C4-N4 and C-C=C bending modes in the original cytosine structure, indicates that these bonds are oxidized 5-OH-U units at the N3-C=O and C-C-OH bonds, respectively. disappears due to substitution, the latter originating from the C2=O bend in the original cytosine structure. This was offset by the appearance of symmetrical C4=O bonds in the oxidized 5-OH-U structure. Bands from thymine and uracil (U) appear to be more stable as they have only one C=C double bond. Finally, note that several bands associated with oxidized nucleobases showed a lower decrease in intensity (i.e. bands 7, 17 and 21 at 558, 681 and 731 cm −1 respectively). . However, these bands shared features of lipid contributions (cholesterol, ceramide, and phosphatidylserine, respectively).

Ｓｏｎｏｉｓらは、実験および理論計算の両方によっていくつかのアミノ酸のラマン挙動を記載した。ヒスチジンの場合、ｐＨが上昇する環境は、約６１３、６５６および８６０ｃｍ－１に新しいラマンバンドの出現をもたらした。これらの３つのバンドは、Ｓｉ３Ｎ４に曝露された胞子嚢で検出され（図７Ｂを参照されたい）、バンド１１＊、１５＊、および３２＊と標識された新しいバンドに対応する。ヒスチジン分子の側鎖は、６π電子を含む芳香族イミダゾール環である。環境のｐＨに応じて、異なる互変異性型およびイオン型のヒスチジンが存在し得る。ｐＨ＜６では、正に帯電した形態が、プロトン化環の両方のＮ原子について優勢である（図９Ｃ）。逆に、ｐＨの値が上昇すると、ヒスチジンはそのイミダゾール環で１つのプロトンを失い、これが徐々に中性形態を生じる（図９Ｄ）。Ｖａｌｅｒｙらは、自己集合したヒスチジン含有ペプチドの立体配座変化および高いｐＨでのそれらの安定化された球状立体配座を研究した。振動分光評価により、ヒスチジン－セリンＨ結合およびヒスチジン－芳香族相互作用が明らかになった。ｐＨ＝８．５では、ヒスチジン脱プロトン化が起こり、周波数範囲１０５０～１１５０ｃｍ－１のラマンスペクトルのＣ－Ｎ環延伸バンドを変化させた。 Sonois et al. described the Raman behavior of several amino acids both experimentally and theoretically. In the case of histidine, the environment of increasing pH led to the appearance of new Raman bands at approximately 613, 656 and 860 cm −1 . These three bands were detected in sporangia exposed to Si 3 N 4 (see FIG. 7B) and correspond to new bands labeled bands 11 * , 15 * , and 32 * . The side chain of the histidine molecule is an aromatic imidazole ring containing 6 pi electrons. Depending on the pH of the environment, different tautomeric and ionic forms of histidine can exist. At pH<6, the positively charged form predominates for both N atoms of the protonated ring (Fig. 9C). Conversely, as the value of pH increases, histidine loses one proton on its imidazole ring, which gradually gives rise to the neutral form (Fig. 9D). Valery et al. studied the conformational changes of self-assembled histidine-containing peptides and their stabilized globular conformation at high pH. Vibrational spectroscopic evaluation revealed histidine-serine H-bonds and histidine-aromatic interactions. At pH=8.5, histidine deprotonation occurred, changing the CN ring stretching band of the Raman spectrum in the frequency range 1050-1150 cm −1 .

新たに形成されたバンド１１＊、１５＊、および３２＊のヒスチジンの解釈を強化する試みにおいて、周波数範囲１，０５０～１，１５０ｃｍ－１のイミダゾール環のＣ－Ｎ延伸スペクトル領域を監視した。純水（ｐＨ＝６．５）の中の胞子嚢で収集したラマンスペクトルをＳｉ３Ｎ４懸濁液（ｐＨ＝８．３、それぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂ参照）と比較すると、異なる傾向が観察された。Ｐｏｇｏｓｔｉｎらによる最近の論文によれば、図９Ｃおよび図９Ｄに示される環構造を考慮すると、ヒスチジン環の脱プロトン化のための分光フィンガープリントは以下の通りである。 In an attempt to strengthen the interpretation of histidine in the newly formed bands 11 * , 15 * , and 32 * , we monitored the C—N stretched spectral region of the imidazole ring in the frequency range 1,050-1,150 cm −1 . A different trend is observed when comparing Raman spectra collected on sporangia in pure water (pH = 6.5) with Si 3 N 4 suspensions (pH = 8.3, see Figures 10A and 10B, respectively). was done. According to a recent paper by Pogostin et al., given the ring structures shown in Figures 9C and 9D, the spectroscopic fingerprint for deprotonation of the histidine ring is as follows.

新しい強いバンドが約１０７５ｃｍ－１に現れた。これは、強度が著しく弱まっているように見えた約１０９０ｃｍ－１で最初に観察されたバンドに加えてのことである。これらのバンドは、それぞれ（Ｃ２－Ｎ３）＋および（Ｃ２－Ｎ３）結合配置の延伸振動に関連する。前者の構成は、より強い結合（すなわち、Ｎ１－Ｃ２－Ｎ３の電子共有による）を含む。その振動エネルギーはより大きく、それはより高い周波数で現れる。 A new intense band appeared at about 1075 cm −1 . This is in addition to the band first observed at about 1090 cm −1 that appeared to be significantly weakened in intensity. These bands are associated with stretching vibrations of the (C2-N3) + and (C2-N3) bond configurations, respectively. The former configuration involves a stronger bond (ie, due to electron sharing of N1-C2-N3). Its vibrational energy is greater and it appears at higher frequencies.

同様の傾向が、初期状態（Ｃ４－Ｎ３）＋および脱プロトン化（Ｃ４－Ｎ３）結合配置の延伸バンドで観察され、それぞれ約１１２５－１（ショルダーバンド）および約１１１８ｃｍ－１（初期状態のバンド）に現れた。この傾向は、より低い周波数への周波数シフトが前の段落の場合ほど顕著ではない場合でも、前の段落で与えられた同じ推論を使用して説明することができる。この状況は、脱プロトン化リング内の結合強度のバランスに関連する。Ｃ２－Ｎ３結合は、その隣接する二重結合Ｎ１＝Ｃ２がＣ４－Ｎ３に隣接する二重結合Ｃ４＝Ｃ５よりも強いため、Ｃ４－Ｎ３結合よりも弱い（すなわち、ＣよりもＮの電気陰性度が高いことに起因）。 A similar trend was observed in the stretched bands for the pristine (C4-N3) + and deprotonated (C4-N3) bonding configurations, at ~ 1125 (shoulder band) and ~1118 cm (initial band), respectively. ). This trend can be explained using the same reasoning given in the previous paragraph, even if the frequency shift to lower frequencies is not as pronounced as in the previous paragraph. This situation is related to the balance of bond strengths within the deprotonated ring. The C2-N3 bond is weaker than the C4-N3 bond because its adjacent double bond N1=C2 is stronger than the double bond C4=C5 adjacent to C4-N3 (i.e., N is more electronegative than C due to its high degree).

環の構成が脱プロトン化されたとき、（Ｃ２－Ｎ１（Ｈ））＋結合（約１１００ｃｍ－１）に関連する延伸バンドについて、有意なシフトまたは強度変動は観察されなかったが、わずかな広がりだけは観察された。 No significant shift or intensity variation was observed for the stretched band associated with the (C2-N1(H)) + bond (~1100 cm −1 ) when the ring configuration was deprotonated, although a slight broadening only was observed.

また、約１６００ｃｍ－１のＣ＝ＣおよびＣ＝Ｎスペクトルゾーンにおけるヒスチジン残基のイミダゾール環のさらなるラマン分析（図示せず）は、図１０Ａおよび図１０Ｂに示される結果と一致する特徴を示したことにも留意されたい。上記のラマン分析に基づいて、ラマン分光学的な特徴は、高アルカリ環境で起こる脱プロトン化に関連する。これらの反応は、高いｐＨの値でのヒスチジン含有ペプチドに一般的である。 Further Raman analysis (not shown) of the imidazole ring of histidine residues in the C═C and C═N spectral zones at about 1600 cm −1 also showed features consistent with the results shown in FIGS. 10A and 10B. Also note that Based on the Raman analysis described above, the Raman spectroscopic signature is related to the deprotonation that occurs in highly alkaline environments. These reactions are common for histidine-containing peptides at high pH values.

ヒスチジンキナーゼタンパク質は、ほとんどの原核生物および真核生物に存在する。それらは、様々な環境因子に対するいくつかの適応転写応答を調節する。卵菌では、ヒスチジンキナーゼの機能的分析は欠けているが、ヒスチジン部位でのリン酸化は浸透圧ストレスに対する真菌の一般的な代謝応答である。例えば、浸透圧のストレスを環境条件の変化として知覚することに応答して、保存されたヒスチジン残基がアデノシン三リン酸からのリン酸基でリン酸化され、これは図７Ｂで検出されたアデノシンラマンバンドの減少と一致する。保存されたアスパラギン酸残基へのホスホリル基の連続的な移入は、シグナル伝達経路へのシグナル伝達を媒介する調節をもたらす。Ｓｉ３Ｎ４顆粒と胞子嚢壁との間の高度に局在化したアルカリ度のために、かなりの割合のＮＨ３がエンドサイトーシス空間に浸透し、胞子嚢の浸透圧バランスを激しく変化させる。したがって、Ｓｉ３Ｎ４曝露によるラマンデータの変化は、胞子嚢が浸透圧ストレスに反応したこと、およびヒスチジンキナーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて仮定されたものと同様の浸透圧ストレスの増加を認識したことを示唆している。なお、モデル卵菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓでは、タンパク質キナーゼが発芽中の胞子嚢の開裂に関与することが見出されている。 Histidine kinase proteins are present in most prokaryotes and eukaryotes. They regulate several adaptive transcriptional responses to various environmental factors. In oomycetes, functional analysis of histidine kinases is lacking, but phosphorylation at histidine sites is a common metabolic response of fungi to osmotic stress. For example, in response to perceiving osmotic stress as a change in environmental conditions, a conserved histidine residue is phosphorylated with a phosphate group from adenosine triphosphate, the adenosine detected in FIG. 7B. Consistent with the decrease of Raman bands. The sequential transfer of phosphoryl groups to conserved aspartic acid residues results in regulation that mediates signal transduction into signal transduction pathways. Due to the highly localized alkalinity between the Si3N4 granules and the sporangia wall, a significant fraction of NH penetrates into the endocytic space and severely alters the osmotic balance of the sporangia. . Thus, changes in the Raman data with Si3N4 exposure indicated that sporangia responded to osmotic stress and that histidine kinase recognized an increase in osmotic stress similar to that postulated for Saccharomyces cerevisiae. suggesting. In the model oomycete Phytophthora infestans, protein kinases have been found to be involved in sporangia cleavage during germination.

本研究では、この仮説は、キチンの主なシグナル（すなわち、８９３ｃｍ－１のバンド３３）の消失、ならびに細胞壁の構造におけるセルロース（および／またはキチン）および他の線状炭水化物に関連する他のすべてのシグナル（すなわち、それぞれ５００、６４３、６４９および７１０ｃｍ－１のバンド３、１４、１５および１９）の強度の有意な低下によって裏付けられる。セルロースの線状ポリマー鎖は、β－グリコシド結合によって一緒に連結されている。これらの結合は、Ｓｉ３Ｎ４によって誘導されるアルカリ性のｐＨレベルによって、またはＮＨ３とのいずれかの直接的な相互作用によって影響されない。一方、加水分解酵素は、キチンのグリコシド結合を分解し、それによって植物病原体の細胞壁を変化させることができる。ラマン実験がどのように行われたかを考えると、酵素反応は胞子嚢自体に固有のものでしかない可能性がある。植物菌は、その壁の可塑性を酵素的に制御することができることが知られている。真菌壁は「軟化」しており、芽の出現およびその後の成長のために拡大しなければならない。それらはまた、偽菌糸およびフェノール架橋を有する胞子壁の形成中に再構築される。連結されたβ－グルカンおよびキチンの壁の内側マトリックスは、引張強度および剛性をもたらす。しかし、壁組成物は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路を介した環境変化に応答して再構築され得る。細胞壁の弾性は、病原体の生存を浸透圧ショックまで可能にする迅速な構造的再編成によって調節される。図３Ａおよび図３Ｂに示すように、Ｓｉ３Ｎ４顆粒の近傍に芽の出芽が観察され、これは多くの場合、未熟な胞子形成につながる現象である（図２Ａ～図２Ｃを参照されたい）。 In the present study, this hypothesis supports the disappearance of the main chitin signal (i.e., band 33 at 893 cm) and all others associated with cellulose (and/or chitin) and other linear carbohydrates in the structure of the cell wall. signals (ie bands 3, 14, 15 and 19 at 500, 643, 649 and 710 cm −1 , respectively). The linear polymer chains of cellulose are linked together by β-glycosidic bonds. These bonds are not affected by alkaline pH levels induced by Si3N4 or by any direct interaction with NH3 . Hydrolases, on the other hand, can break down the glycosidic bonds of chitin, thereby altering the cell walls of plant pathogens. Given how the Raman experiments were performed, it is possible that the enzymatic reaction is only intrinsic to the sporangia themselves. Plant fungi are known to be able to enzymatically control the plasticity of their walls. The fungal wall has "softened" and must expand for the emergence and subsequent growth of buds. They are also remodeled during the formation of sporules with pseudohyphae and phenolic bridges. The wall inner matrix of linked β-glucan and chitin provides tensile strength and stiffness. However, wall composition can be remodeled in response to environmental changes via the mitogen-activated protein kinase pathway. Cell wall elasticity is regulated by rapid structural rearrangements that allow survival of pathogens up to osmotic shock. As shown in FIGS. 3A and 3B , budding of shoots was observed near the Si3N4 granules, a phenomenon that often leads to premature sporulation (see FIGS. 2A-2C). ).

Ｔｕｒｃｈｉｎｉらは、低オスモル濃度で増殖させたものと比較して、高オスモル濃度培地で増殖させた真菌細胞のキチン含有量の５０％の減少を測定し、真菌のキチンシンターゼ活性が低オスモル濃度培地と高オスモル濃度培地で増殖させた細胞でより高いことを示している以前のデータと一致した。これらの研究者らは、膜の伸張を可能にし、細胞の完全性を維持する確率を高めるレスキュー機構として、高浸透圧媒体中の真菌壁の観察された弱化を解釈した。これらの研究に基づいて、Ｓｉ３Ｎ４に曝露された胞子嚢の主要なキチンバンド３３の消失は、浸透圧のストレスに抵抗する試みにおいて真菌細胞によって活性化される酵素フィンガープリントである。最後に、Ｓｉ３Ｎ４（図２Ａ～図２Ｃ）とのわずか１分の接触後に驚くべきことに観察された未熟な発芽は、発芽を成熟まで維持するために必要とされるキチン質の壁のｄｅ ｎｏｖｏの合成を胞子嚢が生成できないことの結果である可能性が高いことにも留意すべきである。 Turchini et al. measured a 50% reduction in the chitin content of fungal cells grown in high osmolarity medium compared to those grown in low osmolarity medium, demonstrating that fungal chitin synthase activity increased in low osmolarity medium. and higher in cells grown in high osmolality medium, consistent with previous data. These investigators interpreted the observed weakening of the fungal wall in hyperosmotic media as a rescue mechanism that allows membrane stretching and increases the probability of maintaining cell integrity. Based on these studies, the disappearance of the major chitin band 33 of sporangia exposed to Si3N4 is an enzymatic fingerprint activated by fungal cells in an attempt to resist osmotic stress. Finally, the premature germination surprisingly observed after only 1 min of contact with Si 3 N 4 (Figs. 2A-2C) suggests that the chitinous wall required to sustain germination to maturity It should also be noted that the de novo synthesis of is likely a result of the inability of sporangia to produce.

他の環境に優しいアプローチと比較したＳｉ３Ｎ４の効果
Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａは、気孔を通って宿主の葉組織に入り、気孔下の空気空間に留まり、第１のハフニウムを形成するまで１２～１５時間ゆっくりと成長する。この初期期間は、感染の過程全体において最も重要であると考えられる。この期間の開始前に、Ｓｉ３Ｎ４粒子をブドウのつるの葉に予防的に噴霧することができた。気孔に入ると、それらは長期間（例えば、おそらく１つの季節）内部に閉じ込められたままである。降雨事象中、水はアンモニウム部分の溶出およびｐＨの急速な上昇を繰り返し活性化し、それによって胞子嚢にとって厳しい環境を作り出す（図１１Ａ）。対照的に、水酸化銅および硫酸銅に基づく現在利用可能な殺真菌剤は、ブドウのつるに対して予防的保護をもたらすだけである。それらは広域浸透性ではなく、したがって既存の感染を根絶することができない。また、これらは雨により容易に洗い流される。その結果、Ｓｉ３Ｎ４のような固体状態の殺真菌剤の１つの利点は、降雨事象（図１Ａ～図１Ｃを参照されたい）中のその反復活性化および真菌が葉組織に浸透した後でさえもの病原体に対するその有効性である。病原体／Ｓｉ３Ｎ４界面で活性な抗真菌機構を図１１Ｂに概略的に要約する。 Efficacy of Si3N4 compared to other eco-friendly approaches. Viticola enters the host leaf tissue through the stomata, remains in the air space below the stomata, and grows slowly for 12-15 hours before forming the first hafnium. This initial period is believed to be the most critical in the entire course of infection. Before the start of this period, the grape vine leaves could be sprayed prophylactically with Si 3 N 4 particles. Once in the stomata, they remain trapped inside for an extended period of time (eg, perhaps one season). During rainfall events, water repeatedly activates the elution of ammonium moieties and a rapid increase in pH, thereby creating a hostile environment for the sporangia (Fig. 11A). In contrast, currently available fungicides based on copper hydroxide and copper sulfate only provide preventive protection against grape vines. They are not broadly penetrant and therefore unable to eradicate existing infections. Also, they are easily washed away by rain. As a result, one advantage of solid-state fungicides such as Si 3 N 4 is their repeated activation during rainfall events (see FIGS. 1A-1C) and after fungal penetration into leaf tissue. is its effectiveness against even pathogens. The antifungal mechanisms active at the pathogen/ Si3N4 interface are summarized schematically in Figure 11B.

環境に優しいものではない農薬の使用を置き換えるために３つの戦略が追求されてきた。（ｉ）環境に優しい新したな抗真菌製品の開発、（ｉｉ）植物病原体に対する全身的耐性の誘導のための微生物の使用、（ｉｉｉ）集団遺伝事項の制御による宿主－病原体相互作用の操作である。 Three strategies have been pursued to replace the use of environmentally unfriendly pesticides. In (i) the development of new environmentally friendly antifungal products, (ii) the use of microorganisms for the induction of systemic resistance to plant pathogens, (iii) the manipulation of host-pathogen interactions by controlling population genetics. be.

農薬に取って代わることができる効果的な環境に優しい分子は多糖類である。例えば、オリゴ糖キトサンは、寄生生物の成長を阻害する分子の蓄積を誘導する能力を有する植物防御の効率的な促進剤である（すなわち、フィトアレキシン、ならびに強力な酸化防止剤、例えばトランス－およびシス－レスベラトロールおよびそれらの誘導体）。キトサンはまた、病原体を溶解することができるブドウの葉における酵素分子（例えば、キチナーゼおよびα－１，３－グルカナーゼ）の産生を誘発し、それによってべと病感染の可能性を著しく低下させる。低分子量のキトサンはまた、真菌分生子に浸透する能力を有し、膜の崩壊および細胞内容物の喪失を引き起こす。これは、真菌原形質膜の外部アニオン性成分と相互作用し、膜の破裂をもたらす。Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ感染を制御することができる別の多糖は、水溶性β－１，３－グルカンラミナリンであり、これは褐藻類、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから得ることができる。その抗病原性効果の起源は、ブドウのつるの細胞における防御応答の効率的な誘発にある。しかし、キトサンおよびラミナリンの十分に確立された抗真菌効率にもかかわらず、報告は、つる植物の最終的な質における重要なパラメータである必須窒素濃度の変化を伴う、ブドウのつる由来の必須アミノ酸組成に対するこれらの多糖類の望ましくない効果を示している。 Effective green molecules that can replace pesticides are polysaccharides. For example, oligosaccharide chitosans are efficient promoters of plant defense with the ability to induce the accumulation of molecules that inhibit the growth of parasites (i.e., phytoalexins, as well as potent antioxidants such as trans- and cis-resveratrol and their derivatives). Chitosan also induces the production of enzymatic molecules in grape leaves (eg, chitinase and α-1,3-glucanase) that can lyse pathogens, thereby significantly reducing the likelihood of downy mildew infection. Low molecular weight chitosan also has the ability to penetrate fungal conidia, causing membrane disruption and loss of cellular contents. It interacts with the external anionic components of the fungal plasma membrane, resulting in membrane rupture. Another polysaccharide that can control Plasmopara viticola infection is the water-soluble β-1,3-glucan laminarin, which can be obtained from the brown algae, Laminaria digitata. The origin of its antipathogenic effect lies in the efficient induction of protective responses in grape vine cells. However, despite the well-established antifungal efficiencies of chitosan and laminarin, reports indicate that essential amino acids from grape vines are associated with changes in essential nitrogen concentration, a key parameter in the final quality of vines. The undesirable effects of these polysaccharides on composition are shown.

バニリンおよびニンニク抽出物はまた、環境に優しい抗真菌物質として分類されている。前者は、その化学構造中にアルデヒド基を有するが、後者は、アリシンの強力な抗真菌活性、遮断脂質、タンパク質、および真菌酵母における核酸合成を含む。それにもかかわらず、これらの化合物の主な欠点は、それらが水と容易に反応することである。例えば、アリシンは、ジアリルジスルフィド、あまり顕著でない抗菌活性を有する化合物を迅速に形成する。 Vanillin and garlic extracts are also classified as environmentally friendly antifungals. The former has an aldehyde group in its chemical structure, while the latter contains allicin's potent antifungal activity, blocking lipid, protein, and nucleic acid synthesis in fungal yeast. Nevertheless, a major drawback of these compounds is that they readily react with water. For example, allicin rapidly forms diallyl disulfide, a compound with less pronounced antibacterial activity.

試験される他の天然由来化合物としては、加水分解タンパク質、植物抽出物および無機塩が挙げられる。これに関連して、選択されたアプタマーペプチドの使用、具体的にはＰ．ｖｉｔｉｃｏｌａセルロースシンターゼ２を阻害し、したがって非標的生物に対する有害作用なしに感染を予防することに基づいて、最近の有望な戦略が提案されている。 Other naturally occurring compounds tested include hydrolyzed proteins, plant extracts and inorganic salts. In this connection, the use of selected aptamer peptides, specifically P. A recent promising strategy has been proposed based on inhibiting the viticola cellulose synthase 2 and thus preventing infection without adverse effects on non-target organisms.

無機塩の中でも、主に、重炭酸塩、リン酸塩、ケイ酸塩、塩化物、および亜リン酸塩の例が挙げられる。それらの活性は、主にブドウを含む異なる作物のうどんこ病に対して報告されているが、重炭酸ナトリウムのみがブドウのつるのべと病に対して限られた有効性を示した。窒化ケイ素ベースの植物衛生製品の開発は、この最後のカテゴリに含まれる。本文脈において、ケイ酸塩は特に言及する価値がある。いくつかの可溶性ケイ酸塩は、植物の自然防御機構の刺激および植物の細胞壁の強化の両方によって作用する、異なる真菌の感染に対する直接的および間接的な活性を有する。したがって、Ｓｉ３Ｎ４からのＳｉＯ２およびＳｉ（ＯＨ）４の産生（反応（１）～（３）に記載）は、本発明者らの実験で観察された感染過程のほぼ完全な阻害を少なくとも部分的に担うことができる植物耐性を誘導することによって、Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａ胞子嚢および遊走子に対するアンモニアの直接作用を補完することができる。さらに、雨によって容易に洗い流される可溶性塩と比較して、Ｓｉ３Ｎ４は、ヒト病原体に関する以前の研究と一致して、不溶性粉末からのアンモニウム部分の異なる溶出サイクルおよび反応性窒素種の生成を通してより持続的な保護をもたらすことができた。実際、治療時には、Ｓｉ３Ｎ４粒子は気孔の内部に捕捉されたままであり得（図１１Ａ）、雨の事象の間、水は敵対的な化学環境（図１１Ｂ）を繰り返し発生させ、二次感染サイクルにおける胞子嚢の排出を損なう可能性があり、したがってさらなる化学的治療の必要性を低減する。一部の微生物は、植物病原体に対する全身的耐性を提供し、それによって疾患重症度を低下させることができる。耐性は、保護酵素分子の合成をもたらす代謝応答を生じる宿主植物生理学の変化の結果である。市販の生物防除剤であるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ株Ｔ３９は、べと病に対する全身的耐性に適した微生物であり得る。全身的耐性を誘導する際の３つの異なるバイオエリシター（すなわち、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｉｃａｔｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の効率を調べた。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍは、べと病に対する最も強い耐性をもたらし、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｉｃａｔｕｓがこれに続いた。しかし、処理時にクロロフィルおよびカロテンの両方の増加が観察された。３つの生物学的療法の間でタンパク質発現レベルにかなりの多様性が見られた。一般に、全身的耐性を誘導するための微生物の使用は、単一の形態の耐性に対してのみ有効になるという欠点を有する。それらは、最終的に病原体の突然変異を生じ得る多様性に悩まされている。 Among inorganic salts, examples are primarily bicarbonates, phosphates, silicates, chlorides, and phosphites. Their activity has been reported against powdery mildew of different crops, mainly grapes, but only sodium bicarbonate showed limited efficacy against grape vine downy mildew. The development of silicon nitride-based phytosanitary products falls into this last category. In the present context, silicates deserve special mention. Several soluble silicates have direct and indirect activity against different fungal infections, acting both by stimulating the plant's natural defense mechanisms and by strengthening the plant's cell wall. Therefore, the production of SiO 2 and Si(OH) 4 from Si 3 N 4 (described in reactions (1)-(3)) could lead to the nearly complete inhibition of the infectious process observed in our experiments. By inducing plant resistance that can be at least partially responsible, P. Viticola sporangia and zoospores can be complemented by direct action of ammonia. Moreover, compared to soluble salts that are easily washed away by rain, Si3N4 through different elution cycles of ammonium moieties from insoluble powders and generation of reactive nitrogen species, consistent with previous studies on human pathogens . could provide more lasting protection. Indeed , during treatment, Si3N4 particles can remain trapped inside the pores (Fig. 11A), and during rain events water repeatedly creates a hostile chemical environment (Fig. 11B), creating a secondary It may impair the shedding of sporangia in the infectious cycle, thus reducing the need for further chemical treatment. Some microorganisms can provide systemic resistance to plant pathogens, thereby reducing disease severity. Resistance is the result of changes in host plant physiology that produce metabolic responses that lead to the synthesis of protective enzyme molecules. Trichoderma harzianum strain T39, a commercial biocontrol agent, may be a suitable microorganism for systemic resistance to downy mildew. The efficiency of three different bioelicitors (ie, Trichoderma harzianum, Streptomyces plicatus, and Pseudomonas fluorescens) in inducing systemic tolerance was investigated. Trichoderma harzianum provided the strongest resistance to downy mildew, followed by Streptomyces plicatus. However, an increase in both chlorophyll and carotenes was observed upon treatment. Considerable variability in protein expression levels was seen among the three biologic therapies. In general, the use of microorganisms to induce systemic resistance has the drawback of being effective only against a single form of resistance. They are plagued with diversity that can ultimately result in pathogen mutation.

より一般的な観点から、卵菌Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａの病因の背後にある分子機構はほとんど知られていない。感染を引き起こすために、細胞質およびアポプラスチックエフェクタータンパク質が卵菌によって分泌され、これが免疫を抑制し、植物の感受性を高める。配列決定された卵菌ゲノムにおけるエフェクターは、急速に進化し、植物耐性遺伝子に対抗し、植物ＲＮＡサイレンシング機構を抑制する新しい機能を獲得することが見出されている。エフェクタータンパク質の作用に対抗することは、ゲノム配列決定に伴う複雑さのために、従来困難であった。それは、マルチオミクスの手法を義務的に必要とする。比較ゲノミクスを利用して、Ｂｒｉｌｌｉらは最近、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａのゲノムにおいて、その生物栄養学的な生命の様式を説明し得る、欠けている代謝特徴の発見を報告した。彼らは、耐性のあるブドウのつるにおいて免疫を誘発するタンパク質エフェクターを同定した。低分子ＲＮＡとゲノムワイド分解配列決定とを組み合わせたＲＮＡ末端の並行分析のためにＧｅｒｍａｎらによって開発された新しい方法は、感染中に遺伝子を標的化する低分子ＲＮＡの複雑なネットワークを明らかにした。したがって、新しい双方向ＲＮＡサイレンシング戦略が示唆された。近年、病理測定技術は高レベルの高度化に達しているが、それらはまた、病原体－宿主相互作用の複雑さを明らかにしている。研究された系は、「耐性」および「感受性」のタイプの反応しか認識されなかったとしても、限られた数の遺伝子についてしかコード化および解釈され得なかった（多くの遺伝子間相互作用が予想された）。 From a more general point of view, the molecular mechanisms behind the pathogenesis of the oomycete Plasmopara viticola are largely unknown. To cause infection, cytoplasmic and apoplastic effector proteins are secreted by oomycetes, which suppress immunity and increase plant susceptibility. Effectors in sequenced oomycete genomes have been found to evolve rapidly and acquire new functions to counteract plant resistance genes and suppress plant RNA silencing machinery. Counteracting the action of effector proteins has traditionally been difficult due to the complexities associated with genome sequencing. It mandates multi-omics approaches. Using comparative genomics, Brilli et al. recently reported the discovery of missing metabolic features in the genome of Plasmopara viticola that may explain its bionutritional mode of life. They identified a protein effector that induces immunity in resistant grape vines. A new method developed by German et al. for parallel analysis of RNA ends combining small RNAs and genome-wide degradation sequencing reveals a complex network of small RNAs that target genes during infection. . Therefore, a new bidirectional RNA silencing strategy was suggested. Pathology measurement techniques have reached a high level of sophistication in recent years, but they also reveal the complexity of pathogen-host interactions. The systems studied could only encode and interpret for a limited number of genes, even though only 'resistant' and 'susceptible' types of responses were recognized (many intergenic interactions are expected was done).

Ｓｉ３Ｎ４は、環境に優しい農薬への代替アプローチの欠点のいくつかを解決する可能性を有する、興味深い多機構的な抗病原性挙動を示す。Ｓｉ３Ｎ４の広域スペクトルの抗病原性有効性は、その窒素化学に起因する。水は窒素を放出するトリガーとして作用し、病原体の溶解をもたらす反応のカスケードをもたらす。Ｓｉ３Ｎ４の表面に生成された窒素種は、病原体のタンパク質を変化させ、ＤＮＡへのニトロソ損傷を誘導し、病原体の膜の構造を改変する代謝酵素を刺激する。これらの知見は、ヒト病原体に関する以前の研究と一致している。細胞壁を横切るＮＨ３の拡散に起因して病原体の細胞質で生じる多機構溶解反応は、病原体による突然変異の確率を低下させる。さらに、Ｓｉ３Ｎ４は埋め込み可能な生体材料として使用されるため、真核細胞に対して毒性ではない。地球の歴史に内在する環境に優しい要素のみを含む。いくつかの植物種は、特に生物的および非生物的ストレスの緩和において、Ｓｉ施肥から利益を得る。Ｓｉ３Ｎ４の分解によって生成されるアンモニウムは、有機窒素の合成に関与する主要な無機種である。土壌のアンモニウムおよび硝酸イオンは、根に特異的な輸送体を介して直接吸収され、有効に利用される。ブドウのつるの場合、ＮＨ４ ＋は、ヴェレゾンの前の全窒素の最大８０％に相当するが、成熟した後には５～１０％に減少し、発酵後にはさらに低下する。Ｓｉ３Ｎ４から溶出した窒素は、ベリーの品質および発酵条件の改善に寄与し得る。制限要因として、過剰な窒素はフェノール化合物の生成ならびにブドウとワインの両方の味または品質を変える可能性があるため、肥料およびＳｉ３Ｎ４からの窒素の量のバランスをとるように注意する必要がある。いくつかの植物種は、特に生物的および非生物的ストレスの緩和において、Ｓｉ施肥から利益を得る。 Si 3 N 4 exhibits interesting multi-mechanical antipathogenic behavior that has the potential to overcome some of the drawbacks of alternative approaches to environmentally benign pesticides. The broad-spectrum antipathogenic efficacy of Si3N4 is attributed to its nitrogen chemistry . Water acts as a trigger to release nitrogen, resulting in a cascade of reactions that lead to lysis of the pathogen. Nitrogen species generated on the surface of Si 3 N 4 alter pathogen proteins, induce nitroso damage to DNA, and stimulate metabolic enzymes that alter the structure of pathogen membranes. These findings are consistent with previous studies on human pathogens. A multimechanical lytic reaction occurring in the pathogen cytoplasm due to diffusion of NH3 across the cell wall reduces the probability of mutation by the pathogen. Furthermore, Si 3 N 4 is used as an implantable biomaterial and is therefore not toxic to eukaryotic cells. Contains only eco-friendly elements inherent in the history of the earth. Several plant species benefit from Si-fertilization, especially in relieving biotic and abiotic stress. Ammonium, produced by the decomposition of Si3N4 , is the major inorganic species involved in the synthesis of organic nitrogen. Soil ammonium and nitrate ions are directly absorbed and put to good use via root-specific transporters. In the case of grapevine, NH 4 + represents up to 80% of total nitrogen before veraison, but decreases to 5-10% after maturation and even less after fermentation. Nitrogen leached from Si 3 N 4 can contribute to improving berry quality and fermentation conditions. As a limiting factor, care must be taken to balance the amount of nitrogen from fertilizers and Si3N4 , as excess nitrogen can alter the production of phenolic compounds and the taste or quality of both grapes and wine . There is Several plant species benefit from Si-fertilization, especially in relieving biotic and abiotic stress.

実施例６：
これらの例は、Ｐ．ｖｉｔｉｃｏｌａによるブドウのつるの感染症に対するＳｉ３Ｎ４の効果に対する新たな洞察を与える。無機の環境に優しい薬剤として、それは重金属農薬およびより新しい環境に優しい抗病原性分子に取って代わる可能性を有する。Ｓｉ３Ｎ４の使用はまた、ブドウのつるにおける重金属の使用を減らすことを目的とした現在の規制の傾向と一致している。Ｓｉ３Ｎ４の独特の化学的性質は、炭酸水素塩などの農業用途における他の無機塩に使用されるモル濃度範囲内である１．５体積％という低い濃度でさえ、胞子嚢における浸透圧ストレスを誘発し、それらの未熟な遊走子の発育不全を引き起こす。ラマン実験は、リン酸デオキシリボース骨格の切断およびグアニン環の破壊を含む化学的機構に関する重要な情報を提供した。異なるブドウのつるの種の葉に対する実験は、顕微鏡観察によって明らかにされるように、Ｓｉ３Ｎ４が非常に初期の段階で感染の過程を大幅に低減または遮断するのに有効であり、胞子嚢の発芽および遊走子の生存率に影響を及ぼすことを示した。Ｓｉ３Ｎ４の使用は、銅系配合物が環境だけでなくワインの品質にも有害である、高い窒素要件を有するブドウのつるにとって、最も有益であろう。Ｓｉ３Ｎ４は環境に優しい元素のみを含有するので、このセラミックは、有毒な銅および硫黄元素を含む接触殺真菌剤の適切な代替物でもある。Ｓｉ３Ｎ４は、従来の合成製品と比較して複数の利益および他の無機塩に勝る技術的利点を有する有望なバイオ農薬と見なすことができ、統合的な疾患管理における有用な成分であり得る。 Example 6:
Examples of these can be found in P.M. It provides new insight into the effect of Si 3 N 4 on grape vine infection by M. viticola. As an inorganic eco-friendly agent, it has the potential to replace heavy metal pesticides and newer eco-friendly antipathogenic molecules. The use of Si3N4 is also consistent with current regulatory trends aimed at reducing the use of heavy metals in grape vines. The unique chemistry of Si3N4 allows osmotic Induces stress and causes stunted development of those immature zoospores. Raman experiments have provided important information on the chemical mechanism involving cleavage of the deoxyribose phosphate backbone and disruption of the guanine ring. Experiments on leaves of different grape vine seeds show that Si3N4 is effective in greatly reducing or blocking the process of infection at the very early stages, as revealed by microscopy, and spores It was shown to affect bursa germination and zoospore survival. The use of Si3N4 would be most beneficial for grape vines with high nitrogen requirements, where copper-based formulations are detrimental not only to the environment but also to wine quality. Since Si 3 N 4 contains only environmentally friendly elements, this ceramic is also a suitable substitute for contact fungicides containing toxic copper and sulfur elements. Si3N4 can be viewed as a promising biopesticide with multiple benefits compared to conventional synthetic products and technical advantages over other inorganic salts, and is a useful ingredient in integrated disease management. obtain.

上記から、特定の実施形態を図示および説明してきたが、当業者には明らかであるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることを理解されたい。そのような変更および修正は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲および教示内にある。
From the foregoing, while specific embodiments have been illustrated and described, it will be appreciated that various modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention, as will be apparent to those skilled in the art. Such changes and modifications are within the scope and teachings of the invention as defined in the appended claims.

Claims (13)

植物における病原体を処理または予防するための方法であって、
前記植物を窒化ケイ素を含む組成物と接触させることを含む、方法。 A method for treating or preventing pathogens in plants, comprising:
A method comprising contacting the plant with a composition comprising silicon nitride. 前記組成物が、窒化ケイ素粒子と溶媒とのスラリーを含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the composition comprises a slurry of silicon nitride particles and a solvent. 前記溶媒が、水である、請求項２に記載の方法。 3. The method of claim 2, wherein the solvent is water. 前記組成物が、約０．５体積％～約２０体積％の窒化ケイ素を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。 4. The method of any one of claims 1-3, wherein the composition comprises from about 0.5% to about 20% by volume silicon nitride. 前記組成物が約１体積％～約３体積％の窒化ケイ素を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。 5. The method of any one of claims 1-4, wherein the composition comprises from about 1% to about 3% by volume silicon nitride. 前記接触が、噴霧、ミスチング、または浸漬を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。 6. The method of any one of claims 1-5, wherein said contacting comprises spraying, misting or immersing. 前記植物が、農業植物、樹木またはつるである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。 7. A method according to any one of claims 1 to 6, wherein the plant is an agricultural plant, tree or vine. 前記農業植物が穀物、マメ科植物、塊茎、草、油種子、野菜または果実であり、前記樹木は、果樹、ランドスケープの木、または森林樹であり、前記つる植物はブドウのつるである、請求項７に記載の方法。 wherein said agricultural plants are cereals, legumes, tubers, grasses, oilseeds, vegetables or fruits; said trees are fruit trees, landscape trees or forest trees; and said vines are grape vines. Item 7. The method according to Item 7. 前記病原体が、べと病、うどんこ病、灰色かび病、フザリウム病、さび病、リゾクトニア病、スクレロチニア病またはスクレロチウム病から選択される植物病害を引き起こす、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。 9. Any one of claims 1 to 8, wherein the pathogen causes a plant disease selected from downy mildew, powdery mildew, gray mold, fusarium, rust, rhizoctonia, sclerotinia or sclerotium. described method. 前記病原体が真菌である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。 10. The method of any one of claims 1-9, wherein the pathogen is a fungus. 前記真菌がＰｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａである、請求項１０に記載の方法。 11. The method of claim 10, wherein the fungus is Plasmopara viticola. 前記植物がＶｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａである、請求項１１に記載の方法。 12. The method of claim 11, wherein said plant is Vitis vinifera. Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａが、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ、ＣａｎｎｏｎａｕまたはＳｕｌｔａｎａである、請求項１２に記載の方法。
13. The method of claim 12, wherein the Vitis vinifera is Cabernet Sauvignon, Cannonau or Sultana.
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