JP2023526498A - グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）をコードする遺伝子治療用ベクター - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結されている、グルコース－６－ホスファターゼ－ａ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）をコードする核酸配列を含む、細胞内でＧ６Ｐａｓｅ－ａを発現させるための核酸構築物を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、本発明のベクターで形質転換された細胞、本発明のベクターまたは細胞を含む組成物、およびにその使用に関する。
Description
本発明は、細胞内でグルコース－６－ホスファターゼ－ａ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）を発現させるための核酸構築物を含み、糖原病Ｉａ（ＧＳＤ－Ｉａ）の治療に有益なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関し、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結されている。
糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａまたはフォン・ギールケ病）は、主に肝臓、腎臓、および腸で発現される酵素であるグルコース－６－ホスファターゼ－ａ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）の欠乏によって生じる。Ｇ６ＰＣ遺伝子によりコードされるＧ６Ｐａｓｅ－ａは、９個の膜貫通ヘリックスによって小胞体（ＥＲ）に固定された疎水性タンパク質である。この酵素は、グリコーゲン分解および糖新生の末端段階におけるグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）のグルコースおよび無機リン酸への加水分解を触媒する。ＧＳＤ－Ｉａを患う患者はグルコースホメオスタシスを維持することができず、空腹時低血糖、発育遅延、肝腫大、腎肥大、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症を示す。
大抵の場合、低血糖は、患者が正常に近い成長および思春期発育を達成することができるような食事療法を用いて管理することができる。しかしながら、長期的な臨床合併症およびその根本的な病理過程は未修正のままである。最も重大な慢性的なリスクの一つは肝細胞腺腫（ＨＣＡ）であり、２５歳を超えるＧＳＤ－Ｉ患者のうち７０～８０％で発生する。ＧＳＤ－Ｉａ患者のＨＣＡは多発性かつ非被包性で、局所圧迫および腫瘍内出血を含む合併症を伴う。ＧＳＤ－Ｉａ患者の１０％では、ＨＣＡが悪性化して肝細胞癌（ＨＣＣ）になる。
よって、ＧＳＤ－Ｉａおよびその関連する合併症の治療用に改良された治療ベクターが必要とされている。
これまで、ＧＳＤ－Ｉａの動物モデルにおいてＧ６Ｐａｓｅ－ａを保有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いた遺伝子治療研究が行われてきた。特に、従来技術では、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）に作動可能に連結されたＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列を含む核酸構築物の使用が開示されている。
ベクターに対する免疫応答に関連した治療による合併症は、遺伝子治療におけるＡＡＶベクターの使用についての重大な障害を表している。一般に、ＡＡＶベクターの投与量を低減して投与すると、免疫応答の活性化が低下し、導入遺伝子の発現の安定性が良好となる［１５］。従って、ＡＡＶベクターの使用に伴う副作用の発生を低減するために、対象者において治療的に有効な効果が得られるのに十分な最低量のＡＡＶベクターを投与することが好ましい。
よって、遺伝子治療においてＧ６Ｐａｓｅ－ａの発現および活性を高めて、対象者における治療効果を達成するのに必要なＡＡＶベクターの量を低減することができる改良された核酸構築物が必要とされている。
本発明者らは、驚くべきことに、特にＡＡＶ遺伝子治療の設定において、ｈＡＡＴプロモーターの制御下でＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸は、ｈＧＰＥプロモーターと比べて、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ発現およびＧ６Ｐａｓｅ－ａ活性を増加させ、これにより、ＧＳＤＩａマウスにおいて表現型レスキューを可能にすることを示した。これは、ＧＳＤＩａを治療するために様々な種に由来する天然Ｇ６Ｐａｓｅプロモーター（ＧＰＥ）の様々な形態を用いた従来技術の観点からは特に予測されなかったことである。
また、本発明者らは、ｈＡＡＴプロモーターの制御下でＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードする同核酸は、遺伝子治療においてｈＧＰＥプロモーターと比べた場合、ＨＣＡおよびＨＣＣなどの腫瘍形成のリスクを低減することも示した。これも、より高い活性を持つプロモーターほど遺伝子治療後にＨＣＡおよびＨＣＣのリスクを高めやすいと予想する従来技術の観点からは特に予測されなかったことである［１］。
よって、第一の側面では、本発明は、細胞内でグルコース－６－ホスファターゼ－ａ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）を発現させるための核酸構築物を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、上記構築物は、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列を含み、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結されている、ＡＡＶベクターに関する。
第二の側面では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された細胞に関する。
第三の側面では、本発明は、本発明のベクターまたは本発明の細胞を含む組成物に関する。
第四の側面では、本発明は、薬剤として使用するための、特に糖原病Ｉａ（ＧＳＤ－Ｉａ）の治療に使用するための本発明のベクター、細胞、または組成物に関する。
定義
用語「グルコース－６－ホスファターゼα」または「Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ」は、Ｇ６ｐｃ遺伝子によりコードされる酵素に関する。この酵素は、グリコーゲン分解および糖新生の末端段階におけるグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）のグルコースおよび無機リン酸への加水分解を触媒する。本発明によれば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは野生型Ｇ６Ｐａｓｅ－ａまたは改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａであってもよく、特に、ホスホヒドロラーゼ活性が高められた改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａであってもよい。改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａはＷＯ２０１６１０６３０３および［１６］に開示されている。例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、配列番号１、配列番号１２であってもよく、あるいは配列番号２９～配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有する何れかの改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａであってもよい。
用語「グルコース－６－ホスファターゼα」または「Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ」は、Ｇ６ｐｃ遺伝子によりコードされる酵素に関する。この酵素は、グリコーゲン分解および糖新生の末端段階におけるグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）のグルコースおよび無機リン酸への加水分解を触媒する。本発明によれば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは野生型Ｇ６Ｐａｓｅ－ａまたは改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａであってもよく、特に、ホスホヒドロラーゼ活性が高められた改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａであってもよい。改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａはＷＯ２０１６１０６３０３および［１６］に開示されている。例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、配列番号１、配列番号１２であってもよく、あるいは配列番号２９～配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有する何れかの改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａであってもよい。
本発明によれば、「同一性」は比較ウィンドウにおいてアライメントした２つの配列を比較することにより算出される。配列のアライメントによって、比較ウィンドウにおいて２つの配列に共通する位置（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定することができる。従って、共通する位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除して１００を乗じることで同一性の百分率が得られる。配列同一性の百分率は手動で、またはよく知られたコンピュータプログラムを用いて求めることができる。本発明の特定の一実施形態では、同一性または相同性は、相互作用する結合能を大きく失うことがない限り、アミノ酸残基の少なくとも１個の置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個の置換に対応する。好ましくは、上記少なくとも１個の置換は保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸を類似の側鎖を有する他のアミノ酸で置換することができることを意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは当該分野で規定されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
本発明によれば、用語「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖の形態のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、特にＤＮＡを言う。
本発明によれば、用語「Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列」は、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ、すなわち野生型Ｇ６Ｐａｓｅ－ａまたは改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａのいずれかをコードする核酸配列を言う。改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする改変核酸配列は、参考文献［１６］およびＷＯ２０１６１０６３０３に開示されている。例えば、野生型Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４５、または配列番号４６のヌクレオチド配列を有する。例えば、改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド配列を有する。従って、例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号１３～配列番号２８から選択される改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする何れかの核酸配列であってもよい。
用語「核酸構築物」は、導入遺伝子を発現させるための、例えば、細胞内でＧ６Ｐａｓｅ－ａを発現させるための標的細胞に移植される人工的に構築された核酸セグメントを言う。核酸構築物は、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａの発現を向上させる発現制御核酸配列および／若しくは他の核酸配列、並びに／またはＧ６Ｐａｓｅ－ａの分泌を高める核酸配列、並びに／またはＧ６Ｐａｓｅ－ａの組織への取り込みを高める核酸配列を１種以上含んでいてもよく、上記核酸配列は導入遺伝子（例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）をコードする配列に作動可能に連結されていてもよい。本明細書で用いられる用語「作動可能に連結」は、機能的関係でのポリヌクレオチド要素の連結を言う。核酸配列が他の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたは他の転写調節核酸配列は、導入遺伝子（例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）をコードする核酸配列の転写に影響を及ぼすのであれば、該核酸配列に作動可能に連結されている。そのような発現制御核酸配列は当該分野で周知であり、例えば、プロモーター、エンハンサー（例えば、シス調節モジュール（ＣＲＭ））、イントロン、ポリＡシグナルなどが挙げられる。
用語「α－１抗トリプシン」または「ＡＡＴ」は、セルピンスーパーファミリーに属するタンパク質に関する。これは、ヒトにおいてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子によりコードされている。用語「ｈＡＡＴ」はヒトＡＡＴに関する。
用語「プロモーター」は、核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を指示／開始するＤＮＡの領域を言う。プロモーターは転写の開始部位付近に必要な核酸配列を含む。典型的には、プロモーターは、転写する遺伝子の付近に位置している。
用語「ｈＡＡＴプロモーター」は、ｈＡＡＴのプロモーター、すなわち野生型ｈＡＡＴプロモーターまたは改変ｈＡＡＴプロモーターの何れかに関する。
本発明による用語「ベクター」は、遺伝子治療におけるＧ６Ｐａｓｅ－ａの発現など、遺伝子治療において導入遺伝子の発現に好適なベクターを意味する。
本発明の文脈において、用語「遺伝子治療」は、疾患の治療を目的とした遺伝子／核酸の個体の細胞への送達を含む対象者の治療を言う。
本明細書で用いられる場合、用語「対象者」、「患者」、または「個体」は、糖原病Ｉａ（ＧＳＤ－Ｉａ）に罹患しているまたは罹患しやすいヒトまたは非ヒト哺乳類（例えば、げっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ、または霊長類）を言う。好ましくは、対象者はヒト、男性または女性である。
用語「糖原病」または「ＧＳＤ」は、典型的には筋肉内および／または肝臓細胞内での、グリコーゲン合成、グリコーゲン分解、または解糖に影響を及ぼす酵素欠乏により生じる代謝障害を言う。ＧＳＤは、ＧＳＤ ０型からＧＳＤ ＸＶ型まで様々な種類に分類される。ＧＳＤ－Ｉは、２つの常染色体劣性疾患であるＧＳＤ－ＩａおよびＧＳＤ－Ｉｂからなる。ＧＳＤ－Ｉａはグルコース－６－ホスファターゼ－ａの欠乏によって生じる。グルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）の欠乏はＧＳＤ－Ｉｂに関与する。本発明によれば、ＧＳＤはＧＳＤ－Ｉａ（フォン・ギールケ病；ＯＭＩＭ ＃２３２２４０）である。
用語「治療する」または「治療」は、この用語が適用される疾患若しくは異常、または該疾患若しくは異常の１つ以上の症状の進行を反転、軽減、阻害するか、あるいはこれらを予防することを意味する。特に、疾患の治療は、ＧＳＤにおける機能障害を治療すること、好ましくは対象者において血糖制御を向上させることからなっていてもよい。
用語「医薬的に許容可能な」は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、あるいは動物およびヒトに用いるための米国若しくは欧州薬局方または他の一般に認知された薬局方にリストされていることを意味する。
「医薬組成物」は、医薬的に許容可能な担体を含む組成物を意味する。例えば、担体は、治療薬を投与するのに用いられる希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体であってもよい。そのような医薬品担体は無菌液体であってもよく、例えば、水および油（石油、動物、植物、または合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油など）が挙げられる。医薬組成物が静脈内投与される場合、水が好ましい担体である。生理食塩水、ブドウ糖水溶液、およびグリセロール水溶液もまた、液体の担体として、特に注射可能な溶液用に用いることができる。好適な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。医薬組成物が経口投与に適合している場合、錠剤またはカプセルは、結着剤（例えば、トウモロコシα化デンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、またはデンプングリコール酸ナトリウム）；あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬的に許容可能な賦形剤を用いて従来の手段により調製することができる。錠剤は、当該分野でよく知られた方法でコーティングされていてもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取っていてもよく、あるいは使用前に水または他の好適な媒体で構成するための乾燥品として提供されてもよい。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水添食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または植物分別油）；および保存料（例えば、メチル若しくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾアート、またはソルビン酸）などの医薬的に許容可能な添加剤を用いて従来の手段により調製されてもよい。製剤はまた、適宜、緩衝塩、風味剤、着色剤、および甘味剤を含んでいてもよい。本発明による組成物は、好ましくは医薬組成物である。
核酸構築物
本明細書は、細胞内でグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）を発現させるための核酸構築物に関し、上記構築物は、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列を含み、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結されている。
本明細書は、細胞内でグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）を発現させるための核酸構築物に関し、上記構築物は、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列を含み、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結されている。
本明細書によれば、上記核酸配列は、野生型Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ、例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するＧ６Ｐａｓｅ－ａ、または改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ、好ましくはホスホヒドロラーゼ活性が高められた改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ、例えば配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは有するＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードしていてもよい。上記改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、タンパク質が酵素活性を保持する限り、１つ以上のアミノ酸変異（置換または欠失など）を含み得る。実施形態によっては、上記改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、ヒトＧ６Ｐａｓｅ－ａの２９８位のアミノ酸においてセリンのシステインへの置換を含む（本明細書では、野生型ヒトＧ６Ｐａｓｅ－ａのアミノ酸配列を配列番号１と記載する）。上記改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、タンパク質が酵素活性を保持する限り、他の残基に変異を含み得る。例えば、上記改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、他の残基に置換を含むことができ、そのような残基としては、ヒトＧ６Ｐａｓｅ－ａ（配列番号１と記載）の３、５４、１３９、１９６、１９９、２４２、２４７、２９２、３０１、３１８、３２４、３３２、３４７、３４９、３５０、および／または３５３位が挙げられる。改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａはＷＯ２０１６／１０６３０３および［１６］に開示されている。例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、配列番号１、配列番号１２であってもよく、あるいは配列番号２９～配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有する何れかの改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａであってもよい。
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは有していてもよい。
従って、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、野生型Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ（配列番号２、配列番号３、配列番号４５、または配列番号４６、好ましくは配列番号４５）または改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａの何れかをコードしていてもよい。改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号１３～配列番号２８の何れか、配列番号５２、または配列番号５４から選択される何れかの核酸配列であってもよい。
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
従って、例えば、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、またはＷＯ２０１６１０６３０３の番号６～７の何れかの核酸配列であってもよい。
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号４５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号４６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結されている。
上記ｈＡＡＴプロモーターは、野生型ｈＡＡＴプロモーター、例えば配列番号８の核酸配列を有するｈＡＡＴプロモーター、または改変ｈＡＡＴプロモーター、例えば配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むかまたは有するｈＡＡＴプロモーターであってもよい。上記改変ｈＡＡＴプロモーターは、該プロモーターがＧ６Ｐａｓｅ－ａの転写を依然として指示／開始する限り、１つ以上の核酸変異（置換または欠失など）を含むことができる。
上記ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたは有していてもよい。
上記ｈＡＡＴプロモーターは、好ましくは、ＡｐｏＥエンハンサー（例えば、配列番号９）などのエンハンサーが前に配置されている。例えば、上記核酸構築物は配列番号７を含む。
上記核酸構築物は、イントロン、特に、上記ｈＡＡＴプロモーターと上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列との間に置かれたイントロンを含んでいてもよい。イントロンは、ｍＲＮＡの安定性およびＧ６Ｐａｓｅ－ａの産生を高めるために導入されていてもよい。有利には、上記核酸構築物は、上記ｈＡＡＴプロモーターと上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列との間に置かれたヒトβグロビン遺伝子（例えば、ＨＢＢ２）に由来するイントロンを含み、好ましくは上記核酸構築物に含まれるイントロンは配列番号４７で示される配列を有する。配列番号４７の配列を有するイントロンはＷＯ２０１５／１６２３０２に開示されている。あるいは、上記イントロンは、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列の３’末端の後に置かれている。
本明細書の核酸構築物は、５’から３’の方向に、ＡｐｏＥエンハンサー（例えば、配列番号９）などのエンハンサーが前に配置されてもよいｈＡＡＴプロモーター、必要に応じてヒトβグロビン遺伝子のイントロン（例えば、配列番号４７）などのイントロン、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナル（ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＨＢＢ２ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、または他の天然若しくは人工ポリアデニル化シグナル）を含んでいてもよい。有利には、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、ＡｐｏＥエンハンサー（例えば、配列番号９）などのエンハンサーが前に配置されてもよいｈＡＡＴプロモーター、イントロン（特に、上で規定したイントロン）、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸分子、およびポリアデニル化シグナルを含む。
上記核酸構築物は、配列番号１１、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、または配列番号５６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたは有していてもよい。好ましい一実施形態では、上記核酸構築物は、配列番号４８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたは有していてもよい。
用語「核酸構築物」は、上記細胞内でＧ６Ｐａｓｅ－ａを発現させるための標的細胞に導入されるものである。好ましくは、上記標的細胞は肝臓細胞、腎臓細胞、または腸細胞である。
ベクター
用語「本明細書の核酸構築物」または「本明細書による核酸構築物」は、本明細書に開示されている核酸構築物、特に上で開示されている核酸構築物を意味する。
用語「本明細書の核酸構築物」または「本明細書による核酸構築物」は、本明細書に開示されている核酸構築物、特に上で開示されている核酸構築物を意味する。
本明細書はまた、本明細書の核酸構築物を含むベクターに関する。
上記ベクターはプラスミドベクターであってもよい。上記ベクターはまた、本発明の核酸構築物を含むナノ粒子であってもよい。上記ベクターはまた、機能亢進性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポゾンシステムなど、標的細胞のゲノムに本発明の核酸構築物を組み込むことができるトランスポゾンに基づくシステムであってもよい［２］。上記ベクターは遺伝子治療に好適なウイルスベクターであってもよい。上記ベクターは、肝臓細胞、腎臓細胞、または腸細胞など、任意の対象細胞を標的としてもよい。
上記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターであってもよい。
本発明は、本明細書の核酸構築物を含むＡＡＶベクターに関する。特に好ましい実施形態では、本発明の実践において実施されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ８である。
よって、本明細書の核酸構築物はまた、当該分野で十分に開示されているように、効率的なウイルスベクターを得るために好適な配列を含んでいてもよい。
上記核酸構築物は、本明細書によるレンチウイルスベクター、または一本鎖若しくは二本鎖自己相補的ＡＡＶベクターなどの本発明によるＡＡＶベクターなどのベクターに挿入されてもよい。本発明のさらに好ましい実施形態では、上記ＡＡＶベクターは、肝臓細胞に形質導入するのに好適なＡＡＶベクターであり、より具体的には、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２およびＡＡＶ－２変異体（［３］に開示されているＹ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変更を有する遺伝子操作されたカプシドを含む四重変異体カプシド最適化ＡＡＶ－２など）、ＡＡＶ－３およびＡＡＶ－３変異体（Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．［４］に開示されている２つのアミノ酸の変更Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する遺伝子操作されたＡＡＶ－３カプシドを含むＡＡＶ３－ＳＴ変異体など）、ＡＡＶ－３ＢおよびＡＡＶ－３Ｂ変異体、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６およびＡＡＶ－６変異体（［５］に開示されている三重変異ＡＡＶ－６カプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ形態を含むＡＡＶ－６変異体など）、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０（例えば、ＡＡＶ－ｃｙ１０およびＡＡＶ－ｒｈ１０）、ＡＡＶ－ｒｈ７４、ＡＡＶ－ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ－２ｉ８、ブタＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ－ｐｏ４およびＡＡＶ－ｐｏ６）などである。当該分野で知られているように、使用が考慮される特定のウイルスベクターによっては、機能ウイルスベクターを得るために本明細書の核酸構築物に追加の好適な配列が導入されることとなる。好ましい配列としては、ＡＡＶベクターに対してはＡＡＶ ＩＴＲ、あるいはレンチウイルスベクターに対してはＬＴＲが挙げられる。よって、本明細書はまた、それぞれの側でＩＴＲまたはＬＴＲと隣接している上述した核酸構築物に関する。
また、他の非天然の遺伝子操作された変異体およびキメラＡＡＶも有用であり得る。ＡＡＶウイルスは、これら粒子を核酸配列の細胞特異的送達、免疫原性の最小化、安定性および粒子寿命の調節、効率的な分解、核への正確な送達について最適化することができる従来の分子生物学技術を用いて遺伝子操作されていてもよい。ベクターへと組み立てるのに望ましいＡＡＶ断片としては、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３、および超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。これらの断片は、様々なベクターシステムおよび宿主細胞において容易に利用できる。Ｒｅｐタンパク質を欠いたＡＡＶ系組み換えベクターは、低い有効性で宿主のゲノムに組み込まれて、標的細胞内で何年も存続することができる安定した円形エピソームとして主に存在する。ＡＡＶ天然血清型を用いるのに代えて、本発明の文脈において人工ＡＡＶ血清型を用いてもよく、例えば、非天然カプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられるが、これに限定されない。そのような人工カプシドは、任意の好適な技術によって、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、選択された異なるＡＡＶ血清型、同ＡＡＶ血清型の非近接部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる異種配列と組み合わせて生成できる。人工ＡＡＶ血清型は、特に限定されないが、キメラＡＡＶカプシド、組み換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであってもよい。
本発明の文脈において、上記ＡＡＶベクターは、対象の標的細胞、特に肝細胞に形質導入することができるＡＡＶカプシドを含む。さらに特定の一実施形態では、上記ＡＡＶベクターは偽型ベクターである。すなわち、そのゲノムおよびカプシドは異なる血清型のＡＡＶに由来する。例えば、上記偽型ＡＡＶベクターは、ゲノムが上述したＡＡＶ血清型の１つに由来し、カプシドが他の血清型に由来するベクターであってもよい。
特定の一実施形態によれば、上記ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－１、－２、ＡＡＶ－２変異体（Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１６に開示されているＹ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変更を有する遺伝子操作されたカプシドを含む四重変異体カプシド最適化ＡＡＶ－２など）、－３およびＡＡＶ－３変異体（Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６に開示されている２つのアミノ酸の変更Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する遺伝子操作されたＡＡＶ３カプシドを含むＡＡＶ３－ＳＴ変異体など）、－３ＢおよびＡＡＶ－３Ｂ変異体、－４、－５、－６およびＡＡＶ－６変異体（Ｒｏｓａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６に開示されている三重変異ＡＡＶ６カプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ形態を含むＡＡＶ６変異体など）、－７、－８、－９およびＡＡＶ－９変異体（ＡＡＶｈｕ６８など）、－２Ｇ９、－１０（例えば、－ｃｙ１０および－ｒｈ１０）、－ｒｈ３９、－ｒｈ４３、－ｒｈ７４、－ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＰＨＰ、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ（例えば、ＡＡＶｐｏ４およびＡＡＶｐｏ６）、並びにＡＡＶ血清型のチロシン、リジン、およびセリンカプシド変異体から選択される。また、上記ＡＡＶカプシドは、シャッフリング、合理的設計、エラープローンＰＣＲ、および機械学習技術によって得られる他の非天然の遺伝子操作された変異体（ＡＡＶ－ｓｐａｒｋ１００など）、キメラＡＡＶ、またはＡＡＶ血清型から選択される。特定の一実施形態では、Ｃａｐ遺伝子は、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰカプシドタンパク質をコードしているか、あるいは少なくとも２種のＡＡＶ血清型に由来するＶＰタンパク質領域またはドメインを組み合わせた少なくとも１種のキメラＶＰタンパク質をコードしている。例えば、キメラＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８カプシド配列と、ＡＡＶ８血清型とは異なるＡＡＶ血清型（例えば、具体的に上述したものの何れか）の配列とを組み合わせて得ることができる。他の実施形態では、上記ＡＡＶベクターのカプシドは、１種以上の変異体ＶＰカプシドタンパク質、例えばＷＯ２０１５０１３３１３に記載されたもの、特に、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、およびＲＨＭ１５－６カプシド変異体を含む。特定の一実施形態では、上記ＡＡＶベクターのカプシドは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）およびＡＡＶ血清型７４（ＡＡＶｒｈ７４）カプシドタンパク質のハイブリッドである。例えば、上記ＡＡＶ血清型は、ＷＯ２０１９／１９３１１９に開示されている－ｒｈ７４－９血清型（例えば、ＷＯ２０１９／１９３１１９の実施例で記載されているハイブリッドＣａｐ ｒｈ７４－９血清型；本明細書ではｒｈ７４－９血清型は「－ｒｈ７４－９」、「ＡＡＶｒｈ７４－９」、または「ＡＡＶ－ｒｈ７４－９」とも言う）、またはＷＯ２０１９／１９３１１９に開示されている－９－ｒｈ７４血清型（例えば、ＷＯ２０１９／１９３１１９の実施例で記載されているハイブリッドＣａｐ ９－ｒｈ７４血清型；本明細書では－９－ｒｈ７４血清型は「－９－ｒｈ７４」、「ＡＡＶ９－ｒｈ７４」、「ＡＡＶ－９－ｒｈ７４」、または「ｒｈ７４－ＡＡＶ９」とも言う）であってもよい。例えば、上記ＡＡＶベクターのカプシドは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０７６９５８に記載されているようなＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）およびＡＡＶ血清型７４（ＡＡＶｒｈ７４）カプシドタンパク質のペプチド改変ハイブリッドであり、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０７６９５８Ｆの実施例で記載されているＰ１ペプチドで改変したＡＡＶ９－ｒｈ７４ハイブリッドカプシドまたはＡＡＶｒｈ７４－９ハイブリッドカプシドが挙げられる。他の例としては、上記ＡＡＶ血清型は、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１３８０に開示されているようなハイブリッドＡＡＶ２／１３であってもよい。
例えば、上記偽型ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶ２ｉ８血清型に由来するカプシドを有していてもよく、そのゲノムは異なる血清型に由来していてもよい。特定の一実施形態では、上記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４血清型のカプシド、特にＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシド、さらに特にＡＡＶ８血清型のカプシドを有している。
特定の一実施形態では、上記ベクターは「ＡＡＶ８ｍｕｔ５」と言うベクターである。ＡＡＶ８ｍｕｔ５ベクターは、配列番号５７のアミノ酸配列を有し、配列番号５８のポリヌクレオチドによりコードされている。
上記ベクターが導入遺伝子を筋肉細胞に送達するのに用いられる特定の一実施形態では、上記ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ７４からなる群において選択されてもよい。
上記ベクターが導入遺伝子を肝臓細胞に送達するのに用いられる他の特定の実施形態では、上記ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０、およびＡＡＶ３Ｂからなる群において選択されてもよい。
他の実施形態では、上記カプシドは改変カプシドである。本発明の文脈では、「改変カプシド」は、１種以上の野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質に由来する１種以上の変異体ＶＰカプシドタンパク質を含むキメラカプシドまたはカプシドであってもよい。
特定の一実施形態では、上記ＡＡＶベクターはキメラベクターである。すなわち、そのカプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰカプシドタンパク質を含むか、あるいは少なくとも２種のＡＡＶ血清型に由来するＶＰタンパク質領域またはドメインを組み合わせた少なくとも１種のキメラＶＰタンパク質を含む。肝臓細胞に形質導入するのに有用なこのようなキメラＡＡＶベクターの例は、［６］および［７］に記載されている。例えば、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシド配列と、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型とは異なるＡＡＶ血清型（例えば、具体的に上述したものの何れか）の配列とを組み合わせて得ることができる。他の実施形態では、上記ＡＡＶベクターのカプシドは、１種以上の変異体ＶＰカプシドタンパク質、例えばＷＯ２０１５０１３３１３に記載されたもの、特に、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、およびＲＨＭ１５－６カプシド変異体（高い肝臓指向性を示す）を含む。
他の実施形態では、上記改変カプシドは、（例えば、［８］または［９］に記載されているように）エラープローンＰＣＲおよび／またはペプチド挿入によって挿入されたカプシド変異に由来していてもよい。また、カプシド変異体は、（例えば、［１０］に記載されているように）チロシン変異体など、単一のアミノ酸の変更を含んでいてもよい。他の例は、［１１］に記載されているＡＡＶ ＶＰ２カプシドタンパク質のＮ末端へのアントプロイリン－Ｂの融合である。
また、上記ＡＡＶベクターのゲノムは、一本鎖または自己相補的二本鎖ゲノムの何れかであってもよい［１２］。自己相補的二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復の１つから末端解離部位（ｔｒｓ）を削除することによって生成される。これらの改変ベクターは、複製するゲノムが野生型ＡＡＶゲノムの長さの半分であるが、ＤＮＡ二量体をパッケージする傾向がある。
好ましい一実施形態では、本発明の実践において実施されるＡＡＶベクターは一本鎖ゲノムを有し、さらに好ましくは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｍｕｔ５、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶ２ｉ８カプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４カプシド、例えばＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシド、さらに特にＡＡＶ８カプシドを含む。
細胞
用語「本発明のベクター」または「本発明によるベクター」は、本発明で開示されているベクター、特に上で開示されているベクターを意味する。
用語「本発明のベクター」または「本発明によるベクター」は、本発明で開示されているベクター、特に上で開示されているベクターを意味する。
本明細書は、本明細書の核酸分子または本明細書によるベクターで形質転換された細胞に関する。
本発明は、本発明のＡＡＶベクターで形質転換された細胞に関する。
例えば、宿主細胞は、ベクターの産生、例えばＡＡＶの産生に適した細胞（または細胞株）であり得る。実施例によっては、上記宿主細胞は、ＨＥＫ－２９３、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞などの哺乳類細胞である。
上記宿主細胞はまた、肝臓細胞、腎臓細胞、または腸細胞など、遺伝子治療の標的である細胞であり得る。
実施形態によっては、上記細胞は単離細胞である。
組成物
用語「本明細書の細胞」または「本明細書による細胞」は、本明細書で開示されている細胞、特に上で開示されている細胞を意味する。
用語「本明細書の細胞」または「本明細書による細胞」は、本明細書で開示されている細胞、特に上で開示されている細胞を意味する。
本明細書は、本明細書の核酸構築物、本明細書のベクター、または本明細書の細胞を含む組成物に関する。本明細書の組成物は好ましくは医薬組成物である。
本発明は、本発明のベクターまたは本発明の細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は好ましくは医薬組成物である。
上記組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態を取ることができる。
そのような組成物は、対象者に適切に投与できるような形態を提供するように好適な量の担体と共に、治療有効量の本発明の核酸構築物、本発明のベクター、または本発明の細胞を、好ましくは精製された形態で含むこととなる。特定の一実施形態では、本発明の核酸構築物、ベクター、または細胞は、０．２５％のヒト血清アルブミンを補充したリン酸緩衝生理食塩水を含む組成物に製剤化されている。他の特定の実施形態では、本発明の核酸構築物、ベクター、または細胞は、乳酸リンゲル液および非イオン性界面活性剤（プルロニック（登録商標）Ｆ６８など）を最終濃度が組成物全体の０．０１～０．０００１重量％（例えば、０．００１重量％の濃度）で含む組成物に製剤化されている。上記製剤は、さらに血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、例えば０．２５％のヒト血清アルブミンを含んでいてもよい。保存または投与の何れかに適切な他の製剤は当該分野、特にＷＯ２００５／１１８７９２で知られている。
好ましい一実施形態では、上記組成物は、ヒトへの静脈内投与または髄腔内投与に適合した医薬組成物として、通常の手順に従って製剤化されている。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、上記組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを緩和するための局部麻酔薬（リグノカインなど）を含んでいてもよい。
治療法
用語「本明細書の組成物」または「本明細書による組成物」は、本明細書で開示されている組成物、特に上で開示されている組成物を意味する。
用語「本明細書の組成物」または「本明細書による組成物」は、本明細書で開示されている組成物、特に上で開示されている組成物を意味する。
本明細書は、薬剤として使用するための本明細書の核酸構築物、本明細書のベクター、本明細書の細胞、または本明細書の組成物に関する。
本明細書はまた、糖原病Ｉａ（ＧＳＤ－Ｉａ）の治療に使用するための本明細書の核酸構築物、本明細書のベクター、本明細書の細胞、または本明細書の組成物に関する。
本発明は、薬剤として使用するための本発明のベクター、本発明の細胞、または本発明の組成物に関する。
本発明はまた、糖原病Ｉａ（ＧＳＤ－Ｉａ）の治療に使用するための本発明のベクター、本発明の細胞、または本発明の組成物に関する。
本発明の核酸構築物、ベクター、細胞、または組成物は、何れかの有効な経路で対象者に投与できる。投与の例示的な経路としては、注射（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、および静脈内注射など）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、経鼻、膣、および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。
上記核酸構築物、上記ベクター、上記細胞、または上記組成物は、治療有効量、すなわち、治療される対象者または細胞において所望の効果が達成される十分な量で対象者に投与できる。上記核酸構築物、上記ベクター、上記細胞、または上記組成物の有効量は、いくつかの因子に依存することになり、例えば、治療される対象者または細胞、および投与方法が挙げられるが、これらに限定されない。
ＧＳＤ－Ｉａなどの疾患の治療に有効となる治療薬（すなわち、核酸構築物、ベクター、または細胞）の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。また、必要に応じて、インビボおよび／またはインビトロアッセイを用いて最適な投与量範囲を予測する助けとしてもよい。組成物において用いられる正確な投与量は、投与経路および疾患の重篤度にも依存することになり、医師の判断および各患者の状況に応じて決定されなければならない。必要とする対象者に投与される上記核酸、上記ベクター、または上記細胞の投与量は、いくつかの因子に基づいて変化し、例えば、投与経路、治療される具体的な疾患、対象者の年齢、または治療効果を求めるのに必要な発現量が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、この分野の知識に基づき、これらの因子などに基づいて必要とされる投与量範囲を容易に決定することができる。ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを対象者に投与することを含む治療の場合、上記ベクターの典型的な投与量は、体重１キログラム当たり少なくとも１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、例えば、少なくとも１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも１×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
本発明の治療薬（すなわち、核酸構築物、ベクター、または細胞）は、所望の治療結果のために適宜、単回投与または複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の投与）で投与することができる。
コドン最適化されたＧ６Ｐａｓｅ－ａ
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、インビボでのＧ６Ｐａｓｅ－ａの発現が最適化されてもよい。配列の最適化は、コドン最適化、ＧＣ含有量の増加、ＣＧ二量体の減少、ＣｐＧアイランド数の減少、代替のオープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）数の減少、および／またはスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の数の減少を含む核酸配列の多数の変更を含んでいてもよい。遺伝暗号の縮重のため、異なる核酸分子が同じタンパク質をコードしてもよい。また、様々な生物の遺伝暗号が、しばしば、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの１つを他のものよりも用いるようにバイアスされていることがよく知られている。コドン最適化によって、所与の細胞文脈に存在するコドンバイアスを利用して、得られるコドン最適化ヌクレオチド配列が、そのような所与の細胞文脈において、非コドン最適化配列に比べて比較的高いレベルで発現されやすくなる変更をヌクレオチド配列に導入する。もちろん、当業者にはよく知られているように、配列最適化は、これらすべてのパラメータ間のバランスであるので、最適化配列が導入遺伝子の向上（例えば、発現の向上および／またはインビボでの導入遺伝子に対する免疫応答の減少）をもたらす限り、上記パラメータの少なくとも１つが向上し、他のパラメータの１つ以上が向上しなくても、配列は最適化されたとみなされ得ることを意味する。
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、インビボでのＧ６Ｐａｓｅ－ａの発現が最適化されてもよい。配列の最適化は、コドン最適化、ＧＣ含有量の増加、ＣＧ二量体の減少、ＣｐＧアイランド数の減少、代替のオープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）数の減少、および／またはスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の数の減少を含む核酸配列の多数の変更を含んでいてもよい。遺伝暗号の縮重のため、異なる核酸分子が同じタンパク質をコードしてもよい。また、様々な生物の遺伝暗号が、しばしば、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの１つを他のものよりも用いるようにバイアスされていることがよく知られている。コドン最適化によって、所与の細胞文脈に存在するコドンバイアスを利用して、得られるコドン最適化ヌクレオチド配列が、そのような所与の細胞文脈において、非コドン最適化配列に比べて比較的高いレベルで発現されやすくなる変更をヌクレオチド配列に導入する。もちろん、当業者にはよく知られているように、配列最適化は、これらすべてのパラメータ間のバランスであるので、最適化配列が導入遺伝子の向上（例えば、発現の向上および／またはインビボでの導入遺伝子に対する免疫応答の減少）をもたらす限り、上記パラメータの少なくとも１つが向上し、他のパラメータの１つ以上が向上しなくても、配列は最適化されたとみなされ得ることを意味する。
上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、同じＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードする非コドン最適化ヌクレオチド配列に比べてヒト細胞における発現が向上するようにコドン最適化されていてもよい。野生型Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする野生型核酸配列は、配列番号２で示されている通りである。同じＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードするコドン最適化配列の例は、配列番号３、配列番号４５、または配列番号４６に示されている通りである。改変Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする配列最適化核酸の他の例は、配列番号１２の改変Ｇ６Ｐａｓｅをコードする配列番号５、配列番号５２、および配列番号５４であり、いずれも、配列番号４の核酸配列に比べて上記パラメータの１つについて最適化されている。
Ｇ６Ｐａｓｅをコードする本発明の核酸配列は、コドン最適化されていてもよく、かつ／または配列番号１のＧ６Ｐａｓｅ－ａなどの同じＧ６Ｐａｓｅ－ａアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列に比べてＧＣ含有量が低下していてもよく、かつ／またはＣＧ二量体の数が減少していてもよい。上記Ｇ６Ｐａｓｅをコードする核酸配列はまた、コドン最適化されていてもよく、かつ／または配列番号２のヌクレオチド配列に比べてＧＣ含有量が低下していてもよく、かつ／またはＣＧ二量体の数が減少していてもよい。あるいは、そのようなＧ６Ｐａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号４５または配列番号４６、好ましくは配列番号４５の配列を有していてもよい。
本明細書はまた、配列番号４５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列を開示する。
本明細書はまた、細胞内でＧ６Ｐａｓｅ－ａを発現させるための核酸構築物を開示し、上記構築物は、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列を含み、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号４５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、好ましくはプロモーターに作動可能に連結されている。
本明細書はまた、本項（すなわち、「コドン最適化されたＧ６Ｐａｓｅ－ａ」の項）で開示されている核酸構築物を含むベクターを開示する。上記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｍｕｔ５、好ましくはＡＡＶ８であってもよい。
本明細書はまた、本項で開示されている核酸分子または本項で開示されているベクターで形質転換された細胞を開示する。上記細胞は肝臓細胞、腸細胞、または腎臓細胞であってもよい。
本明細書はまた、本項で開示されている核酸構築物、ベクター、または細胞を含む組成物を開示する。
本明細書はまた、薬剤として使用するための本項で開示されている核酸構築物、ベクター、細胞、または組成物を開示する。
本明細書はまた、糖原病Ｉａ（ＧＳＤ－Ｉａ）の治療に使用するための本項で開示されている核酸構築物、ベクター、細胞、または組成物を開示する。
材料および方法
実施例１、２、および３において、以下の各種プロモーターの制御下でＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードするヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）を含む２種類の核酸構築物（以降、「導入遺伝子発現カセット」）を作製した。
・α－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター。この発現カセットの核酸配列は配列番号１１である。
・ヒトＧ６ｐｃ遺伝子の内在性プロモーター（ｈＧＰＥ）。この発現カセットの核酸配列は配列番号１０である。
実施例１、２、および３において、以下の各種プロモーターの制御下でＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードするヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）を含む２種類の核酸構築物（以降、「導入遺伝子発現カセット」）を作製した。
・α－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター。この発現カセットの核酸配列は配列番号１１である。
・ヒトＧ６ｐｃ遺伝子の内在性プロモーター（ｈＧＰＥ）。この発現カセットの核酸配列は配列番号１０である。
これら導入遺伝子発現カセットを図１Ａに示す。
これら２種類の導入遺伝子発現カセットをＡＡＶ９において偽型化して、２つの異なるＡＡＶベクター、すなわちＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣおよびＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣを得た。
肝臓特異的Ｇ６ｐｃノックアウトマウスモデル（Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－、［１３］）、すなわちＧＳＤ－Ｉａマウスにおいて、これら２種類のベクターまたはＰＢＳ（陰性対照）を独立して試験した。陽性対照として、ＷＴマウス（Ｌ．Ｇ６ｐｃ＋／＋）にＰＢＳを注入した。
実施例４では、α－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターの制御下でＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードするヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）を含む核酸構築物（以降、「導入遺伝子発現カセット」）を作製した。この発現カセットの核酸配列は配列番号５６であった。
ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔの発現カセットをＡＡＶ９、ＡＡＶ８、およびＡＡＶｍｕｔ５において偽型化した。
肝臓特異的Ｇ６ｐｃノックアウトマウスモデル（Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－、［１３］）、すなわちＧＳＤ－Ｉａマウスにおいて、これら３種のベクターまたはＰＢＳ（陰性対照）を独立して試験した。陽性対照として、ＷＴマウス（Ｌ．Ｇ６ｐｃ＋／＋）にＰＢＳを注入した。
実施例５では、α－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターの制御下で、それぞれＧ６Ｐａｓｅ－ａをコードするヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）および２種のコドン最適化ヒトＧ６ｐｃ遺伝子（ｃｏ１、ｃｏ２、およびｃｏ３、それぞれ配列番号４５、配列番号４６、および配列番号３）を含む４種の核酸構築物（以降、「導入遺伝子発現カセット」）を作製した。
ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔの発現カセットの核酸配列は、配列番号１１または配列番号５６であった。ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｃｏ１、ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｃｏ２、およびヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｃｏ３の発現カセットの核酸配列は、それぞれ配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０であった。
ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔの発現カセットをＡＡＶ８（配列番号５６）およびＡＡＶ９（配列番号１１）において偽型化した。
ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｃｏ１およびＧ６ｐｃ遺伝子ｃｏ２の発現カセットをＡＡＶ８において偽型化した。
ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｃｏ３の発現カセットをＡＡＶ９において偽型化した。
肝臓特異的Ｇ６ｐｃノックアウトマウスモデル（Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－、［１３］）、すなわちＧＳＤ－Ｉａマウスにおいて、５種のベクターまたはＰＢＳ（陰性対照）を独立して試験した。陽性対照として、ＷＴマウス（Ｌ．Ｇ６ｐｃ＋／＋）にＰＢＳを注入した。
インビボでの研究
マウスに標準固形飼料（Ａ０４飼料、Ｓａｆｅ）、またはＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスにおいて肝腫瘍形成を促進させることが知られている高脂肪高ショ糖飼料（ＩＮＲＡＥ製、ジュイ＝アン＝ジョザス）の何れかを与えた。３６％の脂肪からなる改変した固形飼料（ＩＮＲＡ）をマウスに与えることにより、腫瘍の形成傾向がマウスにおいて誘発された［１４］。
マウスに標準固形飼料（Ａ０４飼料、Ｓａｆｅ）、またはＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスにおいて肝腫瘍形成を促進させることが知られている高脂肪高ショ糖飼料（ＩＮＲＡＥ製、ジュイ＝アン＝ジョザス）の何れかを与えた。３６％の脂肪からなる改変した固形飼料（ＩＮＲＡ）をマウスに与えることにより、腫瘍の形成傾向がマウスにおいて誘発された［１４］。
ＡＡＶベクターをＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスの尾静脈から静脈内投与した。野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ）には尾静脈からＰＢＳを注射した。血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いて、６時間絶食後に末梢血の血糖を測定した。犠牲死時、肝臓を回収し、重さをはかって肝臓重量／体重の比を測定し、さらなる評価のために瞬間凍結した。
犠牲死時のＧＳＤＩａマウスの腫瘍を目視による観察で評価した。２ｍｍより大きい腫瘍のみを計測の対象とした。
ＡＡＶの産生
２５０ｍＬの無血清培地の懸濁液中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を増殖させた。これらの細胞を、ｉ）発現カセットに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲを含む導入遺伝子プラスミド、ｉｉ）ＡＡＶの産生に必要なアデノウイルス配列を含むヘルパープラスミドｐＸＸ６、およびｉｉｉ）ＡＡＶの血清型を規定するＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むプラスミドという３種類のプラスミドで遺伝子導入した。遺伝子導入後２日目に、これら細胞を溶解してＡＡＶ粒子を放出させた。
２５０ｍＬの無血清培地の懸濁液中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を増殖させた。これらの細胞を、ｉ）発現カセットに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲを含む導入遺伝子プラスミド、ｉｉ）ＡＡＶの産生に必要なアデノウイルス配列を含むヘルパープラスミドｐＸＸ６、およびｉｉｉ）ＡＡＶの血清型を規定するＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むプラスミドという３種類のプラスミドで遺伝子導入した。遺伝子導入後２日目に、これら細胞を溶解してＡＡＶ粒子を放出させた。
ウイルス溶解液を親和性クロマトグラフィーで精製した。ＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲに対応するプライマーおよびプローブを用いて、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイによりウイルスゲノムを定量した［１７］。
Ｇ６Ｐａｓｅ酵素活性の測定
既に［１３］に報告されているように、凍結固定された肝臓のホモジネートにおいてＧ６Ｐａｓｅ酵素活性を測定した。つまり、組織ホモジネートをグルコース－６－リン酸（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。トリクロロ酢酸を加えて反応を停止し、放出されたリン酸をモリブデン酸アンモニウムおよびクエン酸亜ヒ酸塩と錯体化することにより測定した。得られた吸光度は７００ｎｍで測定された。
既に［１３］に報告されているように、凍結固定された肝臓のホモジネートにおいてＧ６Ｐａｓｅ酵素活性を測定した。つまり、組織ホモジネートをグルコース－６－リン酸（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。トリクロロ酢酸を加えて反応を停止し、放出されたリン酸をモリブデン酸アンモニウムおよびクエン酸亜ヒ酸塩と錯体化することにより測定した。得られた吸光度は７００ｎｍで測定された。
グリコーゲン含有量の測定
アスペルギルス・ニガーのアミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で全体を消化した後に放出されたグルコースとして組織ホモジネート中のグリコーゲン含有量を間接的に測定した。試料を０．３ＭのＮａＯＨの存在下、９５℃で２０分間インキュベートし、次いで４℃で冷却した。次いで、試料にアミログルコシダーゼを加え、３７℃で９０分間インキュベートした。放出されたグルコースを市販のグルコースアッセイキットで測定した。
アスペルギルス・ニガーのアミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で全体を消化した後に放出されたグルコースとして組織ホモジネート中のグリコーゲン含有量を間接的に測定した。試料を０．３ＭのＮａＯＨの存在下、９５℃で２０分間インキュベートし、次いで４℃で冷却した。次いで、試料にアミログルコシダーゼを加え、３７℃で９０分間インキュベートした。放出されたグルコースを市販のグルコースアッセイキットで測定した。
ベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）の定量
試料中のベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）の定量については、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて試料からＤＮＡを抽出した。上述したＡＡＶベクター滴定のプロトコルを用いて、１μＬのＤＮＡにリアルタイムＰＣＲを行った。ｔｉｔｉｎ遺伝子のエクソンＭｅｘ５をゲノムＤＮＡローディングコントロールとして用いた。
試料中のベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）の定量については、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて試料からＤＮＡを抽出した。上述したＡＡＶベクター滴定のプロトコルを用いて、１μＬのＤＮＡにリアルタイムＰＣＲを行った。ｔｉｔｉｎ遺伝子のエクソンＭｅｘ５をゲノムＤＮＡローディングコントロールとして用いた。
実施例１：ヒトＧ６Ｐａｓｅ－ａを発現するＡＡＶベクターの静脈内注射後１５日目のＧＳＤ－Ｉａマウスにおける肝臓表現型の修正
標準飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスに上記２種類のＡＡＶ９ベクターを独立して１×１０１１ｖｇ／マウスの投与量で注射した（図１Ａ）。
標準飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスに上記２種類のＡＡＶ９ベクターを独立して１×１０１１ｖｇ／マウスの投与量で注射した（図１Ａ）。
ベクター注射後１５日目に、６時間の絶食後に血液中のグルコース濃度を測定した。上記２種類のベクターを注射したマウスにおいて、血糖は完全に正規化された（図１Ｂ）。
次いで、肝臓でＧ６ＰＣ活性を測定した。ＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣベクターと比べた場合、ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣベクターは超生理学的活性を達成し、最も高い活性を示した（図１Ｃ）。
また、グリコーゲン濃度も測定した。ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣでは、グリコーゲン蓄積および肝腫大の完全な修正が得られたが、ｈＧＰＥプロモーターを保有するベクターでは得られなかった（それぞれ、図１Ｄ、図１Ｅ）。これは、ｈＡＡＴプロモーターを保有するＡＡＶ９ベクターで治療したマウスにおいてより高いＧ６Ｐａｓｅ活性が達成されたことを反映している。上記２種類のＡＡＶベクターを注射したマウスで測定された二倍体ゲノム当たりの類似したベクターゲノムコピー数（図１Ｆ）は、肝臓における類似した形質導入の有効性を示している。
実施例２：ヒトＧ６Ｐａｓｅ－ａを発現するＡＡＶベクターの静脈内注射後のＧＳＤ－Ｉａマウスにおける肝臓表現型の長期的な修正
上記２種類のベクターの長期的な有効性を評価するために、７ヶ月の研究を行った。標準飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスに２．５×１０１１ｖｇ／マウスの投与量でベクターを注射した（図２Ａ）。ベクター注射後７ヶ月目に、６時間の絶食後に血液中のグルコース濃度を測定した。Ｇ６ＰＣ発現ベクターを投与された動物はすべて、血糖が修正された（図２Ｂ）。重要なことには、ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣで治療したＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスは、ＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣで治療したＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスで測定された活性よりも著しく高い超生理学的な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ活性を示した（図２Ｃ）。
上記２種類のベクターの長期的な有効性を評価するために、７ヶ月の研究を行った。標準飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスに２．５×１０１１ｖｇ／マウスの投与量でベクターを注射した（図２Ａ）。ベクター注射後７ヶ月目に、６時間の絶食後に血液中のグルコース濃度を測定した。Ｇ６ＰＣ発現ベクターを投与された動物はすべて、血糖が修正された（図２Ｂ）。重要なことには、ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣで治療したＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスは、ＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣで治療したＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスで測定された活性よりも著しく高い超生理学的な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ活性を示した（図２Ｃ）。
上記２種類のベクターを注射された動物においてグリコーゲン蓄積および肝腫大は完全にレスキューされた（図２Ｄ、図２Ｅ）。ＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣベクターを注射されたマウスでは、測定された二倍体ゲノム当たりのベクターゲノムコピー数が高かった（図２Ｆ）。これは、おそらく、ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣベクターで達成された肝臓の形質導入がわずかに低かったことを反映している。
まとめると、これらの結果から、Ｇ６Ｐａｓｅ－ａの発現はｈＡＡＴプロモーターによって増加することが示された。よって、ｈＡＡＴプロモーターは、ｈＧＰＥプロモーターよりも優れた効力を有し、ＧＳＤ－ＩａのＡＡＶ遺伝子治療に好適である。
実施例３：ｈＧＰＥに向けられた遺伝子治療は、高脂肪高ショ糖飼料を与えられたＬ．Ｇ６ｐｃ －／－ マウスでの肝腫瘍形成を促進する
腺腫形成は、１０代、２０代の罹患した個体のほとんどで報告されている、ヒトのＧＳＤ－Ｉａの特徴の１つである。Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスでは、標準飼料を与えたほとんどすべてのマウスが１８月齢までに肝臓腺腫を形成した［１３］。このゆっくりとした過程は、高脂肪／高ショ糖（ＨＦ／ＨＳ）飼料により促進され得る。ＨＦ／ＨＳ飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスの約８５％が、９月齢で複数の肝腫瘍を形成した［１４］。よって、ＨＦ／ＨＳ飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスは、ＧＳＤＩａにおける腫瘍形成の予防において遺伝子置換戦略の有効性および安全性を評価するロバストなモデルを表す。
腺腫形成は、１０代、２０代の罹患した個体のほとんどで報告されている、ヒトのＧＳＤ－Ｉａの特徴の１つである。Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスでは、標準飼料を与えたほとんどすべてのマウスが１８月齢までに肝臓腺腫を形成した［１３］。このゆっくりとした過程は、高脂肪／高ショ糖（ＨＦ／ＨＳ）飼料により促進され得る。ＨＦ／ＨＳ飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスの約８５％が、９月齢で複数の肝腫瘍を形成した［１４］。よって、ＨＦ／ＨＳ飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスは、ＧＳＤＩａにおける腫瘍形成の予防において遺伝子置換戦略の有効性および安全性を評価するロバストなモデルを表す。
従って、ＨＦ／ＨＳ飼料を与えたＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスにおいてＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣおよびＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣベクターを試験した（図３Ａ）。治療後８ヶ月目に、ｈＡＡＴプロモーターを保有するベクターだけが血糖症を完全にレスキューした（図３Ｂ）。ＨＦ／ＨＳ飼料下では、ＡＡＶで治療した動物のＧ６Ｐａｓｅ活性レベルが、Ｌ．Ｇ６ｐｃ＋／＋動物で測定されたものよりも著しく低かった。ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣで治療した動物は高いＧ６Ｐａｓｅ活性レベルを示したが、ＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣベクターで治療したＬ．Ｇ６ｐｃ－／－マウスと比べた場合、統計的有意性には達しなかった（図３Ｃ）。ＡＡＶで治療したマウスにおいて、二倍体ゲノム当たりの類似したベクターゲノムコピー数が測定された（図３Ｄ）。
興味深いことに、マウスの死体解剖によって、ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣを投与されたマウスに比べて、ｈＧＰＥ保有ＡＡＶベクターで治療したマウスの肝臓において腫瘍の数が多いことが分かった（図３Ｅ）。これらの結果は、ＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣに比べて、ＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣの使用は肝細胞の形質転換率を低減し、その結果、腺腫の頻度を低下させ得ることを示唆している。
図３Ａについて得られたデータは、１群当たりのマウスの数を増やして完成させた（図４および表１）。図４は、より大きなコホートにおいて、ｈＡＡＴ駆動ベクターが著しく高いＧ６Ｐａｓｅ活性を達成したことを示している。表１に示されたデータより、ＡＡＶ９－ｈＧＰＥ－ｈＧ６ＰＣに比べてＡＡＶ９－ｈＡＡＴ－ｈＧ６ＰＣを用いると腺腫の頻度が低下したことが確認された。
実施例４：様々なＡＡＶ血清型でのマウス肝臓におけるＧ６Ｐａｓｅ ｗｔの発現
ｈＡＡＴプロモーターの制御下で野生型ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）を発現する３つの異なるＡＡＶベクター、すなわちＡＡＶ９、ＡＡＶ８、ＡＡＶｍｕｔ５を作製した。
ｈＡＡＴプロモーターの制御下で野生型ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）を発現する３つの異なるＡＡＶベクター、すなわちＡＡＶ９、ＡＡＶ８、ＡＡＶｍｕｔ５を作製した。
肝臓特異的Ｇ６ｐｃノックアウトマウスモデル（Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－、［１３］）、すなわちＧＳＤ－Ｉａマウスにおいて、１×１０１２ｖｇ／ｋｇの投与量でこれら３種のベクターまたはＰＢＳ（陰性対照）を独立して試験した。陽性対照として、ＷＴマウス（Ｌ．Ｇ６ｐｃ＋／＋）にＰＢＳを注入した。ベクター注入後１５日目に、肝臓で各ベクターのＧ６Ｐａｓｅ活性を評価した。上記３種のＡＡＶベクターを注射された群は、類似したＧ６Ｐａｓｅ活性を示したが、野生型動物で測定されたものよりも高いレベルであった（図５）。これにより、様々なＡＡＶベクターによってマウス肝臓で導入遺伝子を発現できる可能性が確認された。
実施例５：様々なコドン最適化Ｇ６ｐｃ配列でのマウス肝臓におけるＧ６Ｐａｓｅの発現
２つの独立した実験を行って、マウス肝臓でのＧ６Ｐａｓｅの発現におけるＣＧ二量体の低減とともにコドン最適化の有効性を評価した。
２つの独立した実験を行って、マウス肝臓でのＧ６Ｐａｓｅの発現におけるＣＧ二量体の低減とともにコドン最適化の有効性を評価した。
様々な方法を用いてＧ６ｐｃ ｗｔ配列（配列番号２）をコドン最適化した。Ｇ６ｐｃ ｃｏ１は、ｗｔ配列との類似性が最も高く、ＣＧ二量体の含有量が低い。Ｇ６ｐｃ ｃｏ２は、ＧＣ含有量が最も高く、Ｇ６ｐｃ ｃｏ１と比べてＣＧ二量体の含有量が高い。Ｇ６ｐｃ ｃｏ３は、ｗｔ配列との類似性が低く、ＣＧ二量体の含有量が最も高い（表２）。
野生型ｈＧ６ｐｃ配列（ｗｔ）および３種のコドン最適化配列（ｃｏ１、ｃｏ２、およびｃｏ３）に対して配列分析を行った。
ａスプライシングドナー（ＳＤ）およびスプライシングアクセプター（ＳＡ）は、オンラインツール（ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）を用いて最低スコアを０．８として予測された。
ｂＧＣ含有量は、オンライン分子生物学ツール（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）を用いて算出された。
ｃＧＣ含有量の閾値が６０％である１００ｂｐ未満のＣｐＧアイランドは、オンラインツールＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒＤＢ（ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ）を用いて予測された。
第一の実験では、ｈＡＡＴプロモーターの制御下で以下の導入遺伝子を発現する３種のＡＡＶ８ベクターを作製した。
・ｈＧ６ｐｃ：ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）
・ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ１：コドン最適化されたヒトＧ６ｐｃ遺伝子（配列番号４５）、および
・ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ２：コドン最適化されたヒトＧ６ｐｃ遺伝子（配列番号４６）
・ｈＧ６ｐｃ：ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）
・ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ１：コドン最適化されたヒトＧ６ｐｃ遺伝子（配列番号４５）、および
・ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ２：コドン最適化されたヒトＧ６ｐｃ遺伝子（配列番号４６）
次いで、肝臓特異的Ｇ６ｐｃノックアウトマウスモデル（Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－、［１３］）、すなわちＧＳＤ－Ｉａマウスにおいて１×１０１２ｖｇ／ｋｇの投与量でこれら３種のＡＡＶ８ベクターを試験した。陽性対照として、ＷＴマウス（Ｌ．Ｇ６ｐｃ＋／＋）にＰＢＳを注入した。ベクター注入後１５日目に、肝臓でＧ６Ｐａｓｅ活性を評価した。上記３種のＡＡＶ８ベクターを注射した群は、超生理学的なＧ６Ｐａｓｅ活性を示し、野生型動物で測定されたものよりも高いレベルであった（図６Ａ）。重要な点としては、ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ１を発現するＡＡＶ８ベクターは、ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ２を発現する同じベクターと比べた場合、Ｇ６Ｐａｓｅ活性のレベルが著しく高くなった（図６Ａ）。
第二の実験では、ｈＡＡＴプロモーターの制御下で以下の導入遺伝子を発現する２種のＡＡＶ９ベクターを作製した。
・ｈＧ６ｐｃ：ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）
・ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ３：コドン最適化されたヒトＧ６ｐｃ遺伝子（配列番号３）
・ｈＧ６ｐｃ：ヒトＧ６ｐｃ遺伝子ｗｔ（配列番号２）
・ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ３：コドン最適化されたヒトＧ６ｐｃ遺伝子（配列番号３）
次いで、肝臓特異的Ｇ６ｐｃノックアウトマウスモデル（Ｌ．Ｇ６ｐｃ－／－、［１３］）、すなわちＧＳＤ－Ｉａマウスにおいて１×１０１１ｖｇ／マウスの投与量でこれら２種のＡＡＶ９ベクターを試験した。陽性対照として、ＷＴマウス（Ｌ．Ｇ６ｐｃ＋／＋）にＰＢＳを注入した。ベクター注入後１５日目に、肝臓でＧ６Ｐａｓｅ活性を評価した。重要な点としては、ｈＧ６ｐｃ野生型配列を保有するＡＡＶ９ベクターを注射した動物群のみが、超生理学的なＧ６Ｐａｓｅ活性を示し、野生型動物で測定されたものよりも高いレベルであった（図６Ｂ）。ｈＧ６ｐｃ Ｃｏ３を発現するＡＡＶ９ベクターを注射した動物は、ｈＧ６ｐｃの野生型バージョンを発現するＡＡＶ９ベクターを注射した動物と比べた場合、Ｇ６Ｐａｓｅ活性が低下する傾向を示した（ｐ＝０．０６、図６Ｂ）。
「［参照番号］」の形態で引用された参考文献
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［１４］Ｇｊｏｒｇｊｉｅｖａ Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｄｉｅｔａｒｙ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ Ｉａ，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１８；Ｎｏｖ；６９（５）：１０７４－１０８７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｈｅｐ．２０１８．０７．０１７．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｓｅｐ ５．
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［１６］Ｚｈａｎｇ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－α ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ Ｉａ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．２０１９ Ｍａｙ；４２（３）：４７０－４７９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｉｍｄ．１２０６９．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ｆｅｂ ２２
［１７］Ｒｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，１０６，８１－８８）
［１］Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１５
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［１７］Ｒｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，１０６，８１－８８）
配列リスト
Claims (15)
- 細胞内でグルコース－６－ホスファターゼ－ａ（Ｇ６Ｐａｓｅ－ａ）を発現させるための核酸構築物を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、上記構築物は、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列を含み、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結されている、ＡＡＶベクター。
- 上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａは、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
- 上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１または２の何れかに記載のＡＡＶベクター。
- 上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、コドン最適化されており、好ましくは、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列は、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列中のＧＣ含有量およびＧＣ二量体を低減することによりコドン最適化されている、請求項１～３の何れか一項に記載のＡＡＶベクター。
- 上記ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～４の何れか一項に記載のＡＡＶベクター。
- 上記ｈＡＡＴプロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサー（例えば、配列番号９）などのエンハンサーが前に配置され、好ましくは、上記核酸構築物は配列番号７を含む、請求項１～４の何れか一項に記載のＡＡＶベクター。
- 上記核酸構築物は、配列番号１１、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、または配列番号５６と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号４８と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～６の何れか一項に記載のＡＡＶベクター。
- 上記核酸構築物は５’から３’の方向に
（ｉ）ＡｐｏＥエンハンサー（例えば、配列番号９）などのエンハンサーが前に配置されているｈＡＡＴプロモーター、
（ｉｉ）必要に応じて、ヒトβグロビン遺伝子のイントロン（例えば、配列番号４７）などのイントロン、
（ｉｉｉ）上記Ｇ６Ｐａｓｅ－ａをコードする核酸配列、および
（ｉｖ）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＨＢＢ２ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、または他の天然若しくは人工のポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナル
を含む、請求項１～７の何れか一項に記載のＡＡＶベクター。 - 上記細胞は、肝臓細胞、腎臓細胞、または腸細胞である、請求項１～８の何れか一項に記載のＡＡＶベクター。
- ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶｒｈ７４ベクター、ＡＡＶ２ｉ８ベクター、またはＡＡＶｍｕｔ５ベクター、好ましくはＡＡＶ８ベクターである、請求項１～９の何れか一項に記載のベクター。
- 請求項１～１０の何れか一項に記載のベクターで形質転換された細胞。
- 肝臓細胞、腸細胞、または腎臓細胞である、請求項１１に記載の細胞。
- 請求項１～１０の何れか一項に記載のベクターまたは請求項１１～１２の何れか一項に記載の細胞を含む組成物。
- 薬剤として使用するための請求項１～１０の何れか一項に記載のベクター、請求項１１～１２の何れか一項に記載の細胞、または請求項１３に記載の組成物。
- ＧＳＤ－Ｉａなどの糖原病（ＧＳＤ）の治療に使用するための請求項１～１０の何れか一項に記載のベクター、請求項１１～１２の何れか一項に記載の細胞、または請求項１３に記載の組成物。
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| EP20305540.5 | 2020-05-22 | ||
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