JP2023524994A - 単分散超常磁性粒子およびその製造方法 - Google Patents

単分散超常磁性粒子およびその製造方法 Download PDF

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Abstract

コア－シェル構造を有する単分散超常磁性ビーズおよびその調製方法が、本明細書に開示される。

Description

（発明の分野）
本発明は、体外診断（または、インビトロ診断：in-vitro diagnostic）アッセイおよび他の適用に有用な単分散超常磁性ビーズならびに前記ビーズの製造方法に関する。
（背景）
単分散超常磁性ビーズは、体外診断（ＩＶＤ）およびバイオテクノロジー分野で広く使用されている。例えば、化学発光アッセイにおいて、単分散超常磁性ビーズを適用して、磁気タグを付けた抗体または抗原を介して試料中に存在する抗原または抗体の量を定量する。また、単分散超常磁性ビーズは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）前の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）抽出用診断キットに一般的に使用される材料である。自動化プロセスに容易に適応されるこれらのビーズは、世界中で２５，０００台を超えるルーチンＩＶＤ装置に使用されている。また、単分散超常磁性ビーズは、抗体精製および、広範囲の特定の哺乳動物細胞、バクテリア、ウイルス、細胞内小器官、個々のタンパク質の分離（または、単離；isolation）にも使用されている。単分散超常磁性ビーズは、その超常磁性特性およびその表面上の親和性基（例えば、ストレプトアビジン）で富化する能力のため、抗体の精製および分離の強力なツールである。分離の典型的な手順は、単分散超常磁性ビーズの懸濁液と標的分子（例えば、ビオチン標識抗体）または細胞を含む溶液とを混合することを含む。インキュベーション期間後、標的は親和性リガンドに結合し、次いで、強力な磁石を用いて、磁性ビーズおよびそれらの捕捉された標的分子または細胞を捕捉する。次いで、未結合物質または不純物は、吸引により除去し、結合した物質を下流の適用のために洗浄する。ＩＶＤおよびバイオテクノロジー分野の急速な発展を支援するそれらの能力のため、単分散超常磁性ビーズは近年大きな注目を集めている。
単分散磁性ビーズは、磁性粒子および高分子材料（複数可）の組合せである。ビーズは、これらの成分により固有に提供される特性の組合せから利益を得る。（磁性粒子から生起する）ビーズの磁性特性（または、磁気特性）は、外部磁場の印加により、ビーズの迅速かつ容易な分離を可能にする。高分子材料（複数可）は、磁性粒子を安定化させ、ビーズの密度を低下させ、様々な流体緩衝液中でのビーズのより良好な分散性を提供し、粒子に官能基を付与し、これらの官能基を介して活性部位の付着を通して免疫測定法、核酸配列、細胞および微生物などの分離における望ましい適用を可能にするために使用できる。これらのビーズの適用およびその機能化のレビューについては、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１１，４７，５４２－５５９を参照されたい。
単分散超常磁性ビーズ（典型的には、直径１～５ミクロン）は、体外診断（ＩＶＤ）適用の強力なツールとして一般的に使用されている（これらの適用を論じたレビュー文献につき同文献をご参照）。サイズ、形状および表面積の良好な均一性は、生体系での再現性に非常に重要であり、分離プロセス中の化学的凝集を最小化する。かくして、超常磁性特性を有する単分散ポリマービーズの発見は、この１０年間でＩＶＤ産業をグローバルにかなり促進し、今後１０年間もこの産業は急速に成長を続けると予想される。
磁性（または、磁気）ビーズは通常、３つのタイプの異なる構造を有する（図１、タイプＩ～ＩＩＩ）。タイプＩの構造は、高分子材料マトリックス全体に分布した磁性ナノ粒子（ＮＰ）を有し、タイプＩＩの構造は、ビーズの表面上に磁性ＮＰで形成されたシェルを持ち、高分子コアを持つコア－シェル構造を有し、タイプＩＩＩの構造は、磁性ＮＰを含むコアを持つ高分子シェルを有する。加えて、タイプＩＩＩの構造は、一般的に磁性コアが余りにも大きく、磁性ＮＰが互いに干渉し、それによってビーズの超常磁性特性が低下し得るため、貧弱な超常磁性特性を有する傾向があることが注目される。しかしながら、これらのデザインのうち１つを選択するだけでは、超常磁性特性は得られない。最適な超常磁性特性を得るためには、ビーズに５～１５ｎｍのサイズの磁性ＮＰを担持させる必要がある。かくして、図１に示したタイプＩ～ＩＩＩの複合ビーズは、磁性ＮＰがこのサイズ範囲に入る場合に、まさに超常磁性になるであろう。
前述のタイプＩデザインを達成するために、後述される２つの合成戦略が存在する。
第１の戦略は、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰを合成し、次いで、これをスチレンの乳化重合系に分散させ、ＮＰをポリスチレンビーズに封入することである［例えば、米国特許出願公開第２００９／００９２８３７号， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３， ＤＯＩ： １０．１００２／ＡＰＰ．［３８８５７（１７２６－１７３３）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐａｒｔ Ａ： Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００７， ４５， ５２８５－５２９５を参照］。しかしながら、この合成戦略には２つの課題を有する。第１の課題は、通常１００～２００ｎｍの小さな直径を有する超常磁性ポリスチレンビーズのみが生成できることであり、これはＩＶＤ適用について余りにも小さい。第２の課題は、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰがポリスチレンビーズ全体に均一に分布せず、かくして、種々のビーズが、異なる数の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰを含有することである。その結果、磁性球の磁気応答は広い分布を有することになり、これはＩＶＤ適用には望ましくない。加えて、スチレンエマルジョン重合の性質のため、この２つの課題を克服することはこれまで不可能であった。また、同様の封入戦略は、タイプＩＩＩ磁性ビーズを調製するために適用されている。
タイプＩ単分散超常磁性ビーズを合成するための第２の戦略は、まず超常磁性ＮＰのキャリアとして単分散ポリマービーズを合成し、次いで、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰをアップロードすることである。この合成戦略において、第１のステップは、少なくとも３つの要件：
（１）ポリマービーズが、再現性のある直径、例えば、１．０ミクロンを持つ高度に単分散であること；
（２）ポリマービーズが架橋され、かくして、良好な剛性および有機溶媒に対する耐性を有すること；および
（３）ポリマービーズを機能化して、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のオンサイト(on-site)生成を促進させること
を満たす高度単分散ポリマービーズを合成することである。
上記の要件を実現するために、最先端の合成技術において、複雑でかつ高価な手順が用いられている。例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２１８０９５号（Ｕｇｅｌｓｔａｄプロセス）は、超常磁性ポリマービーズの製造に使用される多孔質な機能化ポリスチレンビーズを製造する３ステップの手順を開示している。第１のステップは、乳化重合法を介する低分子量のポリスチレンシードの合成である。界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、開始剤として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、イオン強度を高めるためにホウ砂を使用した。スチレンを１０重量％水酸化ナトリウムで抽出し，スチレンの重合を阻害しかねない安定剤（４－ｔｅｒｔ－ブチルカテコール）を除去した。得られた単分散ポリスチレンシード粒子は、５０～２００ｎｍの範囲の直径を有する。第２のステップは、活性な膨潤および架橋である。ポリスチレンシードは、ジオクタノイルペルオキシド，ＳＤＳおよびアセトンを含む開始剤エマルジョンを用いて、２５℃で２４時間膨潤させた。次いで、膨潤したシードをトルエン、ＤＶＢ、スチレン、ＰＶＰ、ＳＤＳおよび水を含むモノマーエマルジョンと混合し、温度を６０℃に上げて架橋重合を開始し、２時間実行して、多孔質の架橋されたポリスチレンビーズを得た。第３のステップは、ビーズ中のフェニル環を硫酸および硝酸（６５％）の混合物でニトロ化し、これらのポリスチレン球にＮＯ２基を導入することにより、多孔質の架橋されたビーズを機能化することである（米国特許第４，６５４，２６７号明細書）。ニトロ化したビーズは、アンモニア（２５％）および硫酸鉄（ＩＩ）七水和物で引き続いての磁化工程に使用される。著者らは、第３のステップにおける鉄含有量を増加させるために、第２のステップにおいて種々のモノマーを用いることにより、種々の官能基を導入する、多数の方法を示した。しかしながら、すべてのオプションで磁性含有量は１５％未満である。鉄含有量を１５％を超えるまで改善するための唯一の現実的な方法は、窒化プロセスを用いて、窒化ビーズを生成することである。この合成戦略の問題は、制御性の高い多孔質ポリスチレン担体を生成するための煩雑な操作で、時間がかかることである。最も重要なことは、５ｇ毎の乾燥粒子をニトロ化するために、濃硝酸と１２５ｍＬの濃硫酸との混合物を必要とすることである。かくして、そのプロセスは、酸化性および腐食性の双方である濃厚な酸の大量消費を必要とし、これは、深刻な環境問題を引き起こすであろう。加えて、このプロセスをスケールアップするためには、厳重なリアクターおよびプロセス制御も必要とするであろう。
タイプＩＩ設計は、直径１．５μｍを有する非磁性核粒子を製造する方法を開示する米国特許第７，７１３，６２７号明細書のプロトコルを用いて得ることができる。第１に、ジ（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）パーオキサイドおよびＳＤＳを含む乳化系において、直径０．７７μｍのポリスチレンビーズをシードとして用いて、７５℃、８時間、ＤＶＢとのスチレンのシーズ乳化重合で、一次大型ポリスチレンビーズを生成した。次いで、生成した一次ビーズを遠心により分離し、水で洗浄し、乾燥し、粉砕して平均粒子径１．５ミクロンの非磁性核粒子を得、次いで、これを用いて、疎水化表面を持つフェライト型微細磁性材料粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を担持することにより磁性ビーズを生成した。磁性ＮＰは、疎水性相互作用を介して球体の表面に付着するようになる。このプロセスの欠点は、（１）第２のステップ（粉砕プロセス）は高度単分散ビーズを与えなく、ビーズが球形を有さないかもしれない；（２）この特許に示された最小のビーズは、１．５μｍ直径であり；１．０μｍ以下の直径を有する、より小さなビーズを生成することが難しいようである；および（３）磁性ＮＰはビーズの表面上に単に付着する。したがって、ビーズの外表面積は限られており、ポリマーのコア直径によって決定されるため、高い磁性または鉄分を達成することは難しいであろう。
なお、架橋ポリ（スチレン－ＤＶＢ）ビーズは、ワンポット二段重合プロセスにより生成することができることが注目される必要がある。第１の段階において、ポリスチレンビーズをインサイツ（または、反応混合物中において：in-situ）で形成し、次いで、ＤＶＢを添加してコア－シェル構造を形成する。かかるワンポット二段重合は、乳化重合系または分散重合系において実施することができる。界面活性剤としてスチレンスルホン酸ナトリウムおよび開始剤としてＫＰＳを用いる乳化スチレン重合系において、得られたポリマービーズは、約２００ｎｍの直径を有する（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００８， ５， ３７５－３７８）。他方、エタノール中で安定剤としてＰＶＰおよび開始剤としてＡＩＢＮを用いる分散型スチレン重合系について、得られたポリマービーズは約２．３μｍの直径を有する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１０， １１５， ３０９２－３１０２）。ビーズのサイズの違いにかかわらず、双方の場合において、得られたポリスチレン－ＤＶＢビーズは疎水性であり、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のアップロードに使用できる親水性官能基を欠く。
したがって、調整可能な直径、良好な剛性および有機溶媒に対する良好な耐性を持ち、ならびに超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰの高パーセントのアップロードを促進するのに十分な親水性官能基を含み、ＩＶＤ適用のための直径１～５μｍ範囲の新しい単分散超常磁性ポリマービーズの製造を可能にする、球状単分散ポリマービーズを製造する新しい合成戦略を開発する必要性が残っている。
米国特許出願公開第２００９／００９２８３７号 米国特許出願公開第２０１７／０２１８０９５号 米国特許第４，６５４，２６７号明細書 米国特許第７，７１３，６２７号明細書
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１１，４７，５４２－５５９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３， ＤＯＩ： １０．１００２／ＡＰＰ．［３８８５７（１７２６－１７３３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐａｒｔ Ａ： Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００７， ４５， ５２８５－５２９５ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００８， ５， ３７５－３７８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１０， １１５， ３０９２－３１０２
（発明の概要）
本発明の態様および実施形態は、以下の番号付与された項において説明される。
１． コア－シェル構造を有する単分散超常磁性ビーズであって、前記ビーズは、
ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部であって、前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する（または、被包する、または、カプセル化する；encapsulate）コア部；
前記コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、前記コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；ならびに
第１のシェル部の頂部上に直接的に位置した第２のシェル部
を含み、前記第２のシェル部は、第１の層、第２の層および第３の層として形成され、
前記第１の層が、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子ならびに、共役モノマーおよびバルクモノマーを含む第１の層高分子マトリックス材料を含み；
前記第２の層が、前記第１の層を越えて延在し、バルクモノマーを含む第２の層高分子材料から形成され；および
前記第３の層が、第２の層の頂部上にあり、バルクモノマー、および官能基を有する第２の官能性モノマーを含む第３の層高分子材料から形成され、
前記第１の層の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、前記第１のシェル部の外表面上に存在する官能基と直接的に結合し；
前記第１の層高分子マトリックス材料が、前記第１の層の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を取り囲み；および
前記第２の層高分子マトリックス材料が、前記第１の層高分子マトリックス材料から延在し、各単分散超常磁性ビーズの外表面を形成する、単分散超常磁性ビーズ。
２．前記第２の層および第３の層の高分子マトリックス材料が、前記ビーズを溶媒に入れた場合に超常磁性磁性ナノ粒子が溶出するのを防止するように機能する、第１項に記載のビーズ。
３．前記第１のシェル部および前記第２のシェル部の前記第３の層の官能性モノマー上の官能基が、独立して、アミノ、カルボキシル、エポキシ、およびヒドロキシルの１以上から独立して選択され、任意選択にて、前記第１のシェル部、および前記第２のシェル部の前記第２の層の官能性モノマー上の官能基が、独立して、ヒドロキシル基およびカルボキシル基の組合せ、またはアミノ基およびカルボキシル基の組合せから選択される、第１項または第２項に記載のビーズ。
４．前記ビーズが、１５％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満のそれらの直径に基づく変動係数を有する、第１項～第３項のいずれか１記載のビーズ。
５．前記ビーズが、２％以下のそれらの直径に基づく変動係数を有する第４項に記載のビーズ。
６．前記ビーズが０．２～５．０μｍ、例えば、０．５～４．０μｍの平均直径を有する、第１項～第５項のいずれか１記載のビーズ。
７．前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が、スチレン、スチレン誘導体、およびそれらのコポリマーよりなる群の１以上から形成され、任意選択で、前記スチレン誘導体が、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択される、第１項～第６項のいずれか１記載のビーズ。
８．ビーズ中の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のすべてが、各ビーズの全重量の１０～８０重量％、例えば、２０～７０重量％、例えば、３０～５０重量％を占めている、第１項～第７項のいずれか１記載のビーズ。
９．（ａ）第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、各ビーズの全重量の０．１～５重量％を占め；および／または
（ｂ）第２バッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、各ビーズの全重量の０．５～１０重量％を占め；
（ｃ）第２のシェル部の第１の層中の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、各ビーズの全重量の９．４～７９．４重量％、例えば、１９．４～６９．４重量％、例えば、２９．４～４９．４重量％を占める、第８項に記載のビーズ。
１０．前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群から選択され、任意選択で、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される、第１項～第９項のいずれか１記載のビーズ。
１１． 前記第１の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択される、第１項～第１０項のいずれか１記載のビーズ。
１２．スチレンモノマーが、スチレン、およびスチレン誘導体よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、スチレン誘導体が、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択される、第１項～第１１項のいずれか１記載のビーズ。
１３．前記第１のシェルが、第１の高分子マトリックス組成物の第１の層および第２の高分子マトリックス組成物の第２の層をさらに含み、
前記第１の層が、スチレンモノマーと、架橋性モノマーとのコポリマーから形成され；および
前記第２の層が、スチレンモノマー、架橋性モノマーおよび官能性モノマーのコポリマーから形成される、第１項～第１２項のいずれか１記載のビーズ。
１４．前記超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、５～１５ｎｍの平均直径を有する、第１項～第１３項のいずれか１記載のビーズ。
１５．（ａ）前記コア部および前記第１のシェル部におけるスチレン基－対－架橋基の重量－対－重量比（weight to weight ratio）が、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１であり、および／または
（ｂ）前記コア部および前記第１のシェル部におけるスチレン基－対－官能基の重量－対－重量比が、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１である、第１項～第１４項のいずれか１記載のビーズ。
１６．前記Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、さらにＣｏ３Ｏ４および／またはＭｎ３Ｏ４ナノ粒子を含む、第１項～第１５項のいずれか１記載のビーズ。
１７．前記共役モノマーが、メタクリロイルクロリド、３－エトキシ－アクリロイルクロリド、アクリロイルクロリド、４－ペンテノイルクロリド、無水メタクリル酸、無水４－ペンテン酸、無水クロトン酸、無水吉草酸、１０－ウンデセノイルクロリド、グリシドールメタクリレート、グリシドールおよびアリルグリシジルエーテルよりなる群の１以上から選択される、第１項～第１６項のいずれか１記載のビーズ。
１８．前記バルクモノマーが、ポリエーテルモノマー、ポリエステルモノマー、ポリアクリルアミドモノマー、およびポリアシッドモノマーの１以上から選択され、任意選択で、前記バルクモノマーが、メタクリル酸メチル、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、バルクモノマーが、メタクリル酸および／または２－ヒドロキシエチルメタクリレートから選択される、第１項～第１７項のいずれか１記載のビーズ。
ここで、
１９．前記第２の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上よりなる群の１以上から選択される、第１項～第１８項のいずれか１記載のビーズ。
２０．前記第２のシェル部が、前記第１および／または第２および／または第３の層中に架橋性モノマーをさらに含み、任意選択で、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ビスフェノールＡエポキシアクリレート、ビスフェノールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、プロポキシル化グリセロールジアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択され、例えば、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレートおよびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される、第１項～第１９項のいずれか１記載のビーズ。
２１．前記第２のシェルの第２の層および第３の層の組合せ重量が、各ビーズの全重量の１～３０重量％、好ましくは２～２０重量％を占める、第１項～第２０項のいずれか１記載の超常磁性ビーズ。
２２．コア－シェル構造を有する、単分散超常磁性ビーズを調製する方法であって、
（ａ）ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部を含む、単分散超常磁性前駆体ビーズを提供すること、前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入し；
前記コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、前記コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；および
前記第１のシェル部の頂部上に直接的に位置する第２のシェル部であって、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子および高分子前駆体アンカーポイントを含み、その双方は前記第１のシェル部の表面上の官能基に結合する、第２のシェル部；ならびに
（ｂ）単分散超常磁性前駆体ビーズ上に、ワンポットフリーラジカル重合によって機能性コーティング層を形成すること、
（ｉ）第１のステップにおいて、バルクモノマーを使用し；および
（ｉｉ）第２のステップにおいて、官能基を有する第２の官能性モノマーを用いて単分散超常磁性ビーズを形成し、
前記機能性コーティング層が、高分子前駆体アンカーポイントにより第１のシェル部に結合する、ことを含む、方法（または、プロセス）。
２３．前記バルクモノマーが、ポリエーテルモノマー、ポリエステルモノマー、ポリアクリルアミドモノマー、およびポリアシッドモノマーよりなる群の１以上から選択される、第２２項に記載の方法。
２４．前記バルクモノマーが、メタクリル酸メチル、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、前記バルクモノマーが、メタクリル酸および／または２－ヒドロキシエチルメタクリレートから選択される、第２３項に記載の方法。
２５．前記第１のステップが、前記バルクモノマーおよび開始剤を含む混合物を使用し、任意選択で、前記開始剤が、ターシャリ－アミルヒドロペルオキシド、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニア、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２，２’－アゾビス［２－メチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）プロピオンアミド、２，２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］水和物、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２’’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］、および２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩よりなる群の１以上から選択される、第２２項～第２４項のいずれか１記載の方法。
２６．前記第１のステップにおける混合物が、さらに、
（ａ）架橋剤、任意選択で、前記架橋剤が、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ビスフェノールＡエポキシアクリレート、ビスフェノールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、プロポキシル化グリセロールジアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択され、例えば、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択され、および／または
（ｂ）溶媒、任意選択で、前記溶媒が、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジグライム、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトン、メチルエチルケトン、および水よりなる群の１以上から選択される、
を含む、第２５項に記載の方法。
２７．前記第２の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択される、第２２項～第２６項のいずれか１記載の方法。
２８．（ａ）第１のステップおよび／または第２のステップの重合が、３０～８０℃、例えば、５０～７０℃の温度で行われ；および／または
（ｂ）第１のステップおよび第２のステップの総重合時間が１０時間～３０時間、例えば、１６時間～２４時間である、第２２項～第２７項のいずれか１記載の方法。
２９．前記単分散超常磁性前駆体ビーズが、
（ｉ）ネイキッド（naked）単分散超常磁性ビーズを提供すること、前記ビーズが、
ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部であって、前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、コア部；
コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、前記コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；および
前記第１のシェル部の頂部上に直接的に位置する第２のシェル部であって、前記第１のシェル部の表面上の官能基に結合する超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含む、第２のシェル部を含み；ならびに
（ｉｉ）前記ネイキッド単分散超常磁性ビーズを、メタクリロイルクロリド、３－エトキシ－アクリロイルクロリド、アクリロイルクロリド、４－ペンテノイルクロリド、無水メタクリル酸、無水４－ペンテン酸、無水クロトン酸、無水吉草酸、１０－ウンデセノイルクロリド、グリシドールメタクリレート、グリシドールおよびアリルグリシジルエーテルよりなる群の１以上から選択されるアンカー材料と反応させることにより、前記第１のシェル部上で高分子前駆アンカーポイントを形成させることにより、単分散超常磁性前駆体ビーズを形成することを含むプロセスにより形成される、第２２項～第２８項のいずれか１記載の方法。
３０．前記ネイキッド単分散超常磁性ビーズが、
（ａｉ）単分散ビーズを提供すること、前記単分散ビーズが、ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部；および
前記コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部を含み；ならびに
（ａｉｉ）前記単分散ビーズを、Ｆｅ（ＩＩＩ）塩およびＦｅ（ＩＩ）塩を含む溶液に入れ、塩基を加えることによって、前記ネイキッド単分散超常磁性ビーズを形成すること、
を含むプロセスによって形成される、第２９項に記載の方法。
３１．（ａ）前記鉄（ＩＩＩ）塩が、ＦｅＣｌ３および／またはＦｅ２（ＳＯ４）３から選択される；および／または
（ｂ）前記鉄（ＩＩ）塩が、ＦｅＣｌ２、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＯＡＣ）２よりなる群の１以上から選択される；および／または
（ｃ）前記塩基が、水酸化アンモニア、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、およびアミンよりなる群の１以上から選択される；および／または
（ｄ）前記溶液が、ＣｏＣｌ２および／またはＭｎＣｌ２をさらに含む、
第３０項に記載の方法。
３２．前記単分散ビーズが、「ワンポット３段階」連続プロセスによって形成され、このプロセスが、
（ａ）第１の段階において、水とアルコールとの混合物中でスチレンモノマーを開始剤およびポリマー安定剤で分散重合することによりポリスチレンコアを生成して、核となる（nucleated）ポリスチレンコアを形成する；
（ｂ）第２の段階において、核形成されたポリスチレンコアを含む混合物に架橋性モノマーを加える；および
（ｃ）第３の段階において、前記第２の段階から得られた材料に第１の官能性モノマーを加えて単分散ビーズを提供し、任意選択で、ポリスチレンビーズはインサイツにて生成され、架橋剤および官能性モノマーの引き続いての添加が、第２の核生成を起こさないため、表面上に官能基を担う（スチレン／架橋剤／官能性モノマー）の球状単分散コポリマービーズに導く、
ことを含む、第３０項または第３１項に記載の方法。
３３．（ａ）前記開始剤が、アゾ開始剤から選択され、任意選択で、前記アゾ開始剤が、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）、および２，２’－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）（ＡＭＢＮ）よりなる群の１以上から選択され；および／または
（ｂ）前記ポリマー安定剤が、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＣ）およびキトサンよりなる群の１以上から選択され；および／または
（ｃ）前記スチレンモノマーが、スチレン、およびスチレン誘導体よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、スチレン誘導体が、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択され；および／または
（ｄ）前記アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、またはそれらの混合物よりなる群の１以上から選択され；および／または
（ｅ）アルコール－対－水の体積比が、１：１～４０：１、例えば、２：１～２０：１である、第３２項に記載の方法。
３４．前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択され、任意選択で、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される、第３２項または第３３項に記載の方法。
３５．前記第１の官能性モノマー上の官能基が、独立して、アミノ、カルボキシル、エポキシ、およびヒドロキシルの１つ以上から選択され、任意選択で、第１のシェル部、および第２のシェル部の第２の層の官能性モノマー上の官能基が、独立して、ヒドロキシル基およびカルボキシル基の組合せ、またはアミノ基およびカルボキシル基の組合せから選択される、第３２項～第３４項のいずれか１記載の方法。
３６．前記第１の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択される、第３５項に記載の方法。
３７．前記スチレンモノマー－対－前記架橋剤の重量比が、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１である、第３２項～第３６項のいずれか１記載の方法。
３８．前記スチレンモノマー－対－前記第１の官能性モノマーの重量比が、２０：１～１：２、好ましくは１０：１～１：１である、第３２項～第３７項のいずれか１記載の方法。
３９．前記合成されたままの単分散ビーズが、引き続いてのプロセスステップで使用する前に１つ以上の溶媒で洗浄され、任意選択で、前記溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびＴＨＦよりなる群の１以上から選択される、第３２項～第３７項のいずれか１記載の方法。
４０．得られる単分散超常磁性ビーズが：
（ａ）１５％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満、例えば、２％以下のそれらの直径に基づく変動係数；および／または
（ｂ）０．２～５．０ミクロン、例えば、０．５～４．０ミクロンの平均直径、
を有する、第２２項～第３９項のいずれか１記載の方法。
４１．これらのビーズがＩＶＤアッセイにおいて適用される、第１項～第２１項のいずれか１記載の超常磁性ビーズ。
図１は、３つのタイプの磁性ポリマービーズを模式的に示す。タイプ（Ｉ）：ポリマービーズに分散した磁性ＮＰ、タイプ（ＩＩ）：磁性シェルおよびポリマーコア；タイプ（ＩＩＩ）：ポリマーシェルおよび磁性コア。 図２は、球状単分散超常磁性ビーズの製造プロセスを模式的に示す。 図３は、Ａ－１のＳＥＭ像を示す。 図４は、Ｃ－１のＴＥＭ像を示す。 図５は、Ｃ－１のヒステリシス曲線を示す。 図６は、Ｄ－１のＴＥＭ像を示す。 図７は、Ａ－２のＳＥＭ像を示す。 図８は、Ｃ－２のＴＥＭ像を示す。 図９は、Ｄ－２のＴＥＭ像を示す。 図１０は、ＣＥ－２のＳＥＭ像を示す。 図１１は、ＤＥ－２のＴＥＭ像を示す。 図１２は、十分に形成された単分散超常磁性ビーズの詳細を模式的に示す。
（説明）
上記の課題が、新しいタイプの単分散超常磁性ビーズの導入により、その全体または一部が解決できることを、驚くべきことに見出した。これらの単分散超常磁性ビーズは、ビーズのコアおよびシェル（複数可）全体に分布した超常磁性ＮＰを有する。これらのビーズは、驚くべきことには、上記の問題に苦しむことなく、広範囲の重量パーセンテージ（例えば、ビーズの全重量に対して３０重量％～５０重量％を超える）でＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を負荷（または、担持；load）できることを見出した。これらのビーズは、下流の分離プロセスの効率を向上し、ＩＶＤプロセスの最終的適用を改善するとも考えられる。
かくして、本明細書に開示されるのは、コア－シェル構造を有する、単分散超常磁性ビーズであり、ビーズは、
ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部であって、ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入するコア部；
コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；ならびに
第１のシェル部の頂部上に直接的に位置した第２のシェル部
を含み、第２のシェル部は、第１の層、第２の層および第３の層として形成され、
第１の層が、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子ならびに、共役モノマーおよびバルクモノマーを含む第１の層高分子マトリックス材料を含み；
第２の層が、第１の層を越えて延在し、バルクモノマーを含む第２の層高分子材料から形成され；および
第３の層が、第２の層の頂部上にあり、バルクモノマー、および官能基を有する第２の官能性モノマーを含む第３の層高分子材料から形成され、
第１の層の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、第１のシェル部の外表面上に存在する官能基と直接的に結合し；
第１の層高分子マトリックス材料が、第１の層の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を取り囲み；および
第２の層高分子マトリックス材料が、第１の層高分子マトリックス材料から延在し、各単分散超常磁性ビーズの外表面を形成する。
本明細書で言及する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる語は、言及された特徴を必要とするが、他の特徴の存在を制限するものではないと解釈し得る。また、別法として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる語は、列挙された成分／特徴のみが存在することを意図している状況に関し得る（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる語は、「よりなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「より実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」なる語句により置換し得る）。より広い解釈およびより狭い解釈の双方が、本発明のすべての態様および実施形態に適用できることが明確に考えられる。換言すれば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる用語およびその同義語は、「よりなる」なる語句または「より本質的になる」なる語句またはその同義語に置換でき、その逆もまた同様である。
本明細書で用いる場合の「粒子」なる用語は、「ビーズ」および「マイクロスフィア」なる用語と同義であることが意図される。本明細書で用いる場合の「ポリマー粒子」なる用語は、「ポリマービーズ」および「ポリマーマイクロスフィア」なる用語と同義であることが意図される。本明細書で用いる場合の「超常磁性ポリマー粒子」なる用語は、「超常磁性ポリマービーズ」および「超常磁性ポリマーマイクロスフィア」なる用語と同義であることが意図される。
本明細書で用いる場合の「単分散」なる用語は、特定のパラメータ（例えば、粒子径）の低い変動係数（ＣＶ）、例えば、２０％未満、例えば、１５％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満のＣＶを有する粒子をいう。より詳細には、粒子は、２％以下、例えば、１％以下のＣＶを有し得る。また、「単分散」なる用語は、「高度単分散（highly monodisperse）」なる用語を包含し、「高度単分散」は、本明細書で用いる場合、５％未満、例えば、２％以下、例えば、１％以下のＣＶをいい得る。
本明細書で用いる場合、「変動係数」なる用語は、その統計的な意味をいう。すなわち：
Figure 2023524994000002
をいう。
「標準偏差」および「平均」なる用語は、それらの通常の統計的な意味を有する。
本明細書でいう「平均」直径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）から得られる平均直径をいう。
本明細書に参照される磁性ＮＰは、常磁性ＮＰ、超常磁性ＮＰ、強磁性ＮＰまたはフェリ磁性ＮＰの少なくとも１種を含むことができる。その定義は以下に列記される。
本明細書で用いる場合の「磁性」とは、材料中の磁場に応答する特性を意味する。本明細書で用いる場合の「常磁性」とは、外部磁場が除去された後、材料が示す磁性特性がオフになることを意味する。本明細書で用いる場合の「超常磁性」とは、外部磁界を除去すると瞬時に材料の磁性が消失することを意味する。
本明細書で用いる場合の「強磁性」とは、各ドメイン内のすべての磁性原子が材料全体の純磁化に正の値で寄与し、外部磁界を除去した後も磁性特性が保持されることを意味する。前記材料は、そのキュリー温度を超えると常磁性材料となる。
本明細書で用いる場合の「フェリ磁性」とは、各ドメイン内の磁性原子のいくらかが対向しているが、材料全体としては純磁化（net magnetization）を示すことを意味する。外部磁界を除去後に、前記材料は、その磁性特性を保持する。そのキュリー温度を超えると常磁性材料となる。
図２Ｄは、本発明による十分に形成された（または、完全に形成された：fully-formed）単分散超常磁性ビーズを模式形式で示す。図１２は、十分に形成された単分散超常磁性ビーズをより詳細に示している。図１２は、本発明による単分散超常磁性ビーズ１００の断面を示す。ビーズは、コア１１０、第１のシェル１２０、および第２のシェル１３０を有する。コア１１０は、ポリスチレン高分子マトリックス材料１１１で形成され、コア高分子マトリックス材料は、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子１１５の一部分を封入する孔１１２を含む。
第１のシェル部１２０は、単層（図示せず）または２層（１２１、１２２）の形態で有り得る。単層の形態である場合、第１のシェル部は、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成される架橋性高分子マトリックス材料を有する。２層の形態である場合、第１の層は、スチレンモノマーおよび架橋性モノマーのコポリマーから形成された架橋高分子マトリックス材料１２３であり得、第２の層１２４は、スチレンモノマー、架橋性モノマーおよび官能性モノマーのコポリマーで形成し得る。再度、第１のシェル部の高分子マトリックス材料（複数可）は、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子１２５を封入し得る。
第２のシェル部１３０は、３つの層（１３１、１３２、１３３）から形成される。第１の層は、第１のシェル部１２０の表面上に設けられた官能基に結合するＦｅ３Ｏ４ナノ粒子１３４を含む。また、加えて、第１の層は、共役モノマーおよびバルクモノマーを含む高分子マトリックス材料１３５の第１の層を含む。かくして、高分子マトリックス材料の第１の層は、第１のシェル部の表面からＦｅ３Ｏ４ナノ粒子１３４の頂部付近まで延在する。第２の層１３２は、第１の層を越えて（したがって、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子１３４の頂部を越えて）延在し、この層は、バルクモノマーを含む第２の層高分子材料から形成される。第３の層１３３は第２の層の頂部上に形成され、この第３の層は、バルクモノマー、および官能基を有する第２の官能性モノマーを含む第３の層高分子材料から形成される。
本明細書で用いる場合の「封入する」は、もう一つの材料内への材料の十分な封入をいうか、またはもう一つの材料内への材料の部分的な封入をいい得る。また、この用語は、ある材料が他の材料の孔中に捕捉される状態をいい得る。
第２のシェル部における高分子マトリックス材料の第２の層および第３の層は、ビーズを溶媒に入れた場合に超常磁性磁性（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子が溶出する（leaching out）のを防ぐ機能を有することが注目される。これは、後述のごとく、新生ビーズの第１のシェル（およびコア）の表面上にＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を担持させた後に、第２のシェルのポリマー部分を形成させるため可能である。これは、形成された高分子シェルがバリアとして作用して、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を漏れから保護するのを可能にする。
いずれかの適切な官能基は、第１のシェル部、および第２のシェル部の第３の層に使用される官能性モノマー上に存在し得る。理解されるごとく、第１のシェル部の官能基および第２のシェル部の第３の層の官能基の望ましい機能は異なる。第１のシェル部（の表面）の官能基は、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が第１のシェル部の表面上に結合するようにＦｅ３Ｏ４ナノ粒子と結合することを意図している。この結合は、配位、共有結合、静電気力または水素結合によるもののごとき、いずれかの適切な化学的相互作用によるもので有り得る。第２のシェル部の第３の層における官能基は、いずれかの適切な意図された適用（例えば、十分に形成されたビーズの表面上にリガンドまたは抗体を共有結合すること）のために十分に形成されたビーズの容易な機能化を可能とすることが意図されている。それにもかかわらず、第１のシェル部および第２のシェル部の第３の層の官能性モノマー上の官能基は、独立して、アミノ、カルボキシル、エポキシおよびヒドロキシルの１以上から選択し得る。例えば、第１のシェル部、および第２のシェル部の第２の層の官能性モノマー上の官能基は、独立して、ヒドロキシル基およびカルボキシル基の組合せ、またはアミノ基およびカルボキシル基の組合せから選択し得る。
本発明のビーズは、本明細書で定義のごとく、単分散である。より詳細には、本明細書に開示されたビーズは、１５％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満のそれらの直径に基づく変動係数を有し得る。さらにより詳細には、本明細書に開示されたビーズは、本明細書で定義のごとく、高度に単分散で有り得る。例えば、ビーズは、２％以下のそれらの直径に基づく変動係数を有し得る。
本明細書に開示されたビーズは、意図された適用（例えば、ＩＶＤ）において有用となるいずれかの適切な平均直径を有し得る。適切な平均直径の例は、０．２～５．０μｍ、例えば、０．５～４．０μｍである。
上述のごとく、コアはポリスチレンマトリックス材料から形成される。これは、いずれかの適切なスチレンモノマーのホモポリマーまたは２つ以上（例えば、２、３、４、５または６）のスチレンモノマーのコポリマーから形成し得る。理解されるごとく、本明細書で用いる場合の「スチレンモノマー」なる用語は、一般的にスチレンモノマーのクラス、すなわち、スチレン自体およびそのモノマー誘導体をカバーするものと解釈されるべきである。ポリスチレン高分子マトリックス材料を形成するために用い得る適切なスチレンモノマーの例として、限定されるものではないが、スチレン、スチレン誘導体、およびそのコポリマーが挙げられる。本明細書に言及し得る特定の実施形態において、スチレン誘導体は、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択し得る。コアのポリスチレンマトリックス材料は、架橋されていない材料で有り得る。
上述のごとく、本明細書に開示されたビーズは、従来の設計が遭遇する問題に悩まされることなく、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子につき広範囲の負荷値（または、担持値：loading values）を有し得ることが、驚くべきことに見出された。例えば、ビーズ中の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のすべてが、各ビーズの全重量の１０～８０重量％、例えば、２０～７０重量％、例えば、３０～５０重量％を占め得る。本明細書に言及し得る特定の実施形態において、ビーズ中の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のすべてが、各ビーズの全重量の３０～５０重量％を占め得る。理解されるごとく、ビーズの各部に分布する超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の量は変化する。例えば、以下の負荷（または担持）分布の１以上が適用され得る：
（ａ）第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、各ビーズの全重量の０．１～５重量％を占め得る。
（ｂ）第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、各ビーズの全重量の０．５～１０重量％を占め得る；および
（ｃ）第２のシェル部の第１の層における超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、各ビーズの全重量の９．４～７９．４重量％、例えば、１９．４～６９．４重量％、例えば、２９．４～４９．４重量％を占め得る。
本明細書に前述のごとく、架橋性モノマーは、第１のシェル部において架橋された高分子マトリックス材料を形成するために使用される。ビーズ内の架橋の包含は、ビーズに剛性および／または機械的強度、ならびに溶媒によって引き起こされ得る膨潤に対する耐性を提供し得ると考えられる。ビーズの第１のシェル部の架橋を形成するために、いずれかの適切な架橋性モノマーを使用し得る。適切な架橋性モノマーは、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジメチロールプロパンテロアクリレートジペンタエリスリトールペンタアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択し得る。本明細書に言及し得る本発明の特定の実施形態において、架橋性モノマーは、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択し得る。
上述した官能基と同様に、架橋高分子マトリックス材料中の第１の官能性モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択し得る。理解されるごとく、上述した官能基の特定の組合せは、これらのモノマーからの選択によって得ることもできる。
また、第１のシェル部の架橋高分子マトリックス材料は、スチレンモノマーの使用により形成される。上述のごとく、スチレンモノマーは、スチレン、およびスチレン誘導体よりなる群の１以上から選択し得る。上述のごとく、スチレン誘導体は、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択し得る。
上述のごとく、第１のシェル部は、単層の材料に代えて、２層の材料から形成し得る。すなわち、第１の高分子マトリックス組成物の第１の層と、第２の高分子マトリックス組成物の第２の層とが存在し得る。２層の実施形態において、
第１の層は、スチレンモノマーおよび架橋性モノマーのコポリマーから形成し得る；および
第２の層は、スチレンモノマー、架橋性モノマーおよび官能性モノマーのコポリマーから形成し得る。
スチレンモノマー、架橋性モノマー、官能性モノマーは、前記の通りである。２つの層間の実際の境界が完全に明確でなくてもよいことが理解されるであろう。これは、製造方法が、スチレンモノマーおよび架橋性モノマーのコポリマーを添加して第１の層を形成し、続いて後の段階で官能性モノマーを添加して第２の層を形成することを含むためである。また、したがって、第１の層の一部は官能性モノマーを含み得る。疑念を回避するために、第２の層は、第１のシェル部の外表面を形成することを意図しており、したがって、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子および／または共役モノマーに結合できる官能基（後者が、第２のシェル部の高分子部分の形成を可能にする）を提示することが望まれる。第１のシェル部の製造のさらなる詳細は、後述および実験セクションで提供されるであろう。
上述のごとく、本明細書に記載されたビーズは、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含む。これらの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、「ナノ粒子」の従来の定義に入ることを可能にするいずれかの適切な直径を有し得る。しかしながら、本明細書に言及し得る本発明の特定の実施形態において、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、５～１５ｎｍの平均直径を有し得る。
本明細書で言及する本発明の実施形態において、コア部および第１のシェル部におけるスチレン基－対－架橋基の重量－対－重量比は、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１で有り得る。本明細書に言及し得るさらなるまたは別法の実施形態において、コア部および第１のシェル部におけるスチレン基－対－官能基の重量－対－重量比は、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１で有り得る。コア部および第１のシェル部についての参照は、言及された構成要素の全体的な負荷（または、担持、または、添加）を決定する場合に、これらの部の組合せ重量が考慮されるべきであることを意味することを意図している。例えば、コア部は架橋基または官能基を含まないが、コア部および第１のシェル部におけるスチレン基の総重量に対するこれらの成分の相対重量比を決定する場合には、そのスチレン基の重量を考慮する必要がある。
また、本明細書に言及し得る本発明の特定の実施形態において、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子はＣｏ３Ｏ４および／またはＭｎ３Ｏ４ナノ粒子の一部を含む。いずれかの適切な量のＣｏ３Ｏ４および／またはＭｎ３Ｏ４ナノ粒子は、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子に加えて存在し得る。疑念を回避するために、ビーズの重量と比較したＦｅ３Ｏ４ナノ粒子の重量パーセントが本明細書に提供される場合、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の重量は、存在するいずれかのＣｏ３Ｏ４および／またはＭｎ３Ｏ４ナノ粒子の重量を含む。
第２のシェル部は、上述のごとく、３つの別々の材料層から形成される。第１の層は、第１のシェル部の外表面上に存在する官能基と直接的に結合したＦｅ３Ｏ４ナノ粒子によって部分的に形成される。また、この第１の層は、共役モノマーおよびバルクモノマーを含む第１の層高分子マトリックス材料を含む。共役モノマーは、第１のシェル部の表面上にアンカーポイントとして使用される化合物である。したがって、共役モノマー自体が、第１のシェル部の表面上の官能基と反応できる官能基、ならびに重合反応に用いることができる官能基を含む。本明細書において、いずれの適切な共役モノマーも使用できる。適切な共役モノマーの例として、限定されるものではないが、メタクリロイルクロリド、３－エトキシ－アクリロイルクロリド、塩化アクリロイル、４－ペンテノイルクロリド、無水メタクリル酸、無水４－ペンテン酸、無水クロトン酸、無水吉草酸、１０－ウンデセノイルクロリド、グリシドールメタクリレート、グリシドール、アリルグリシジルエーテルおよびそれらの組合せが挙げられる。
第２のシェル部の第１の層および第２の層の一部を形成するバルクモノマーは、ポリエーテルモノマー、ポリエステルモノマー、ポリアクリルアミドモノマー、およびポリアシッドモノマーの１以上から選択し得る。適切なバルクモノマーの例として、限定されるものではないが、メタクリル酸メチル、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸およびそれらの組合せが挙げられる。本明細書に言及し得る特定の実施形態において、バルクモノマーは、メタクリル酸および／または２－ヒドロキシエチルメタクリレートから選択し得る。
本明細書に前記のごとき第２のシェル部の第３の層は、第２の官能性モノマーから形成し得る。この第２の官能性モノマー上の官能基は、本明細書に前記のもので有り得る。適切な官能性モノマーの例として、限定されるものではないが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーの１以上が挙げられる。
また、第２のシェル部に使用される高分子材料は、架橋されていてもよい。例えば、第１の層は架橋されていてもよく、第２の層は架橋されていてもよく、第３の層は架橋されていてもよく、またはそれらのいずれかの組合せで有り得る。本明細書に言及し得る実施形態において、第１の層および第２の層は架橋されていてもよく、第３の層は他の層に対して架橋を有さないかまたは少ない架橋で有り得る。
第２のシェル部において架橋を形成するために用いられる架橋性モノマーは、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ビスフェノールＡエポキシアクリレート、ビスフェノールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、プロポキシル化グリセロールジアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択でき、例えば、架橋性モノマーは、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレートおよびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される。
本明細書に開示され得る実施形態において、第２のシェルの第２の層および第３の層の組合せ重量は、各ビーズの全重量の１～３０重量％、好ましくは２～２０重量％を占め得る。
本明細書に開示されたビーズに関連する有利さは、以下を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
・３種のモノマーのうち、（ａ）スチレンが核生成テンプレートを提供し、球状単分散ビーズに導く；（ｂ）ＤＶＢのごとき架橋剤が架橋を提供し、ビーズを剛性および有機溶媒に耐性にする；（ｃ）官能性モノマーが超常磁性ナノ粒子（ＮＰ）のアップロードを促進させる。
・３種のモノマー（スチレン、架橋剤、官能性モノマー）の得られたコポリマービーズは球状高度単分散であり、ビーズ直径は、重合開始剤濃度、ＰＶＰ濃度、モノマーの負荷量（または添加量）のごとき重合因子を調節することにより変調することができる。
・ビーズにおいて、第１のシェル表面および第２のシェル表面上の双方で、官能基を担持する種々のモノマーを使用できる。これは、ビーズの表面特性の微調整（fine-tuning）を可能にし、それらが特定の適用においてより容易に使用されるのを可能にする。
・官能性モノマー（すなわち、官能基を担持するモノマー）の負荷量（または、添加量：loading amount）を調整することにより、ビーズ表面上の官能基の密度を微調整できる。
・ビーズへの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰの高負荷化（３０～５０重量％）は、ＮＰのオンサイト生成により達成できる。
・表面上に形成されたＦｅ３Ｏ４ ＮＰのサイズは、ＰＳコアへの官能基のよく制御されたグラフト化により、よく制御される。
理解されるごとく、本明細書に記載されたビーズに関連する構造および多くの有利さは、ビーズの製造方法により生起する。
本発明において、単分散超常磁性ビーズは、４つのステップを介して得られる。
ステップ－１：「ワンポット３段階（one-pot three-stage）」重合を介する３種のモノマー（スチレン、架橋剤、官能性モノマー）の高度単分散コポリマービーズの合成。
ステップ－２：合成したままの（as-synthesized）コポリマービーズの有機溶媒での洗浄および表面改質（または、表面改変：surface modification）。
ステップ－３：コポリマービーズ上での超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰのオンサイト生成およびアップロード（upload）。
ステップ－４：超常磁性ビーズ上への機能性コーティングの作製。
本発明者らは、上記で概説した手順が、単分散超常磁性ビーズを製造するための新しいプロセスであり、かかるビーズを製造するために用いられる従来の合成方法とは根本的に異なるものであると考えている。このプロセスは図２に概説され、図２Ａはステップ１の後に得られた生成物に対応し、図２Ｂはステップ２の後に得られた生成物に対応し、図２Ｃはステップ３の後に得られた生成物に対応し、図２Ｄはステップ４の後に得られた最終生成物に対応する。図２において、３０は孔を表し、４０はＦｅ３Ｏ４ ＮＰを表し、６０は第１のシェル部の高分子部分を表し、８０は第２のシェル部を表す。
各ステップのより詳細が以下に提供される。
ステップ１：３種のモノマー（スチレン、架橋剤、および官能性モノマー）を用いた高度単分散コポリマービーズの「ワンポット３段階」手順を介した合成、この手順は、コアおよび第１のシェル高分子材料（これは、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含んでいないが）を提供する。このプロセスステップの段階は、以下に要約される。
（ａ）第１の段階は、溶媒（例えば、１～２０ｖ％の水を含有するエタノール）中のスチレンの分散重合である。この段階で核生成は完了し、スチレンの大部分（例えば、６０～８０重量％）を消費し、かくして、ビーズ数はこの段階で固定される。溶媒は、１～２０ｖ％の水を含有するアルコールの混合物で有り得る。第１の段階における総重合時間は、２～１２時間、例えば、４～１０時間で有り得る。
（ｂ）第２の段階は、架橋剤の添加による架橋であり、架橋剤と残存するスチレンモノマーとの架橋共重合は、コア－シェル構造を形成する（図２のＡ参照）。スチレンに対する架橋剤の重量パーセンテージは、１～４０重量％、例えば、５～３０％で有り得る。この段階において、重合時間は、１～８時間、例えば、２～６時間で有り得る。
（ｃ）第３のステップにおいて、官能性モノマーを加えて残存量の架橋剤およびスチレンと共重合させ、かくして、ビーズ表面に親水性官能基を導入する。加えて、この段階で１を超える官能性モノマー（例えば、２つまたは３つの官能性モノマー）を一緒に添加でき、１つのステップで多官能基を導入できる。スチレンに対する官能性モノマーの重量パーセンテージは、１～３０重量％、例えば、５～２０重量％で有り得る。この段階において、重合時間は、８～２４時間、例えば、１０～２０時間で有り得る。
この「ワンポット３段階」重合ステップは、いずれかの適切な温度、例えば、４０～８０℃、例えば、５０～７０℃で実施できる。
ステップ２：ステップ１の合成したままのコポリマービーズを有機溶媒で十分に洗浄する。洗浄の目的は、未反応のスチレン、架橋剤および官能性モノマー、ならびにＰＶＰのごとき安定剤（使用時）をビーズから除去することである。加えて、極性溶媒での洗浄は、ポリマーマトリックスからいくらかの線状ポリスチレンを除去でき、ビーズを緩め、ビーズのコアおよび第１のシェル内に超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰの負荷（または担持）を可能にするように、いくつかの孔を生成し得る。洗浄したビーズは、保存のために溶媒（例えば、水）に再分散できる（図２のＢ参照）。
この洗浄工程において、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ＴＨＦ、およびこれらの混合溶媒の１以上でビーズを洗浄することができる。ビーズを溶媒に数時間浸漬し、線状ポリスチレンを除去してビーズを緩め、またはビーズ内部にいくつかの孔を生成させることができる。洗浄または浸漬のプロセス中に、ビーズ表面上の官能基をさらに改変して、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰのアップロードを促進できる。ビーズ表面上にエポキシ基を導入した場合、エポキシ基が、浸漬プロセス中に開環加水分解、または開環アミノ分解、または開環重合を受けて、ビーズ表面をさらに改変（または、改質：modify）し得る。これは、この洗浄ステップのために使用する溶媒または前記溶媒に添加するいずれかの試薬の性質に依存するであろう。
ステップ３：洗浄したビーズを、Ｆｅ３＋イオンおよびＦｅ２＋イオンを適当なモル比（例えば、Ｆｅ３＋：Ｆｅ２＋イオンの２：１のモル比）で含有する溶液（例えば、水および極性溶媒（例えば、ＴＨＦ）の混合溶液のごとき水溶液）中に分散させる。次いで、溶液の温度を撹拌しつつ数時間（例えば、７０℃まで）上昇させ、２つのイオンをビーズ表面上の官能基と相互作用させることができる。いくらかのＦｅ３＋イオンおよびＦｅ２＋イオンはビーズのポリマーマトリックスに浸透し、一方、いくらかは、（形成されたままのビーズの表面、すなわち、第１のシェル表面上の官能基との相互作用を介して）ビーズの表面上に吸着されるであろう。次いで、アンモニア水を加え、Ｆｅ３＋イオンおよびＦｅ２＋イオンをインサイツにてＦｅ３Ｏ４ ＮＰに変換（または、転換：transform）させる。アンモニア水を添加する前に、ポリアクリル酸または酒石酸またはクエン酸のごときＦｅ３Ｏ４ ＮＰを安定化させるリガンドを溶液に添加して、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰの形成を補助し得る。得られた超常磁性ポリマービーズ（図２のＣ参照）を遠心により分離し、水およびメタノールで洗浄して、緩んだＦｅ３Ｏ４ ＮＰを除去する。
Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰの形成を安定化させるのを助ける添加リガンドは、ポリアクリル酸、酒石酸、クエン酸、またはそれらの混合物であることができる。
ステップ４：コーティング層は、Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰの周囲に高分子ネットワークをグラフトすることにより、超常磁性ポリマービーズ上に作製する。ポリマーのグラフト化を達成するために、第１のシェル表面上の官能基と反応できる１以上の化合物を使用する。この材料は、第１のシェル表面上の官能基と反応できる第１官能基および、重合反応に参加できる第２官能基を有するため、２官能性である。この化合物をビーズ表面上に固定すると、バルクモノマーおよび、任意選択で架橋剤を用いてフリーラジカル重合条件に付される。次いで、引き続いて、下流プロセスのための望ましい官能基または望ましい最終官能性を有する１以上のモノマーを重合混合物に添加して、第２のシェルの最終部分を提供する。
上記プロセスのステップ４において、ステップ２の表面からグラフトした機能性高分子ネットワークによって、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰが一緒に結合される。ポリマーのグラフト化を達成するために、ステップ２のビーズ表面上に残された官能基、例えば、過剰なヒドロキシル基またはアミン基との反応を介して、モノマーを表面上で改変する。このステップでは無水溶媒を用い、これは、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジグライム、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトン、メチルエチルケトンの１以上から選択し得る。本明細書の後記のこのステップで用い得る具体的な溶媒は、テトラヒドロフランおよびジグライムで有り得る。反応時間は、不活性ガスパージをしつつ、１２～３６時間で有り得る。得られたビーズを有機溶媒で洗浄して、過剰なモノマーを除去する。
必要に応じて、開始剤を上記のプロセスにおいて使用し得る。開始剤は、ＡＩＢＮ、ＡＭＢＮのごときアゾ開始剤から選択し得る。また、開始剤は、ターシャリ－アミルヒドロペルオキシド、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウムおよび過硫酸アンモニアを含めた過酸化物開始剤および過硫酸塩から選択し得る。
バルクモノマーに対する架橋剤の重量パーセンテージは、５～７０重量％、好ましくは１０～５０重量％で有り得る。ステップ４において、重合時間は、１０～３０時間、例えば、１６～２４時間で有り得る。ステップ４において、フリーラジカル重合は、４０～８０℃、例えば、５０～７０℃の温度で実施することができる。
かくして、コア－シェル構造を有する、単分散超常磁性ビーズを調製する方法も開示され、該方法は、
（ａ）ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部を含む、単分散超常磁性前駆体ビーズを提供すること、ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入し；
コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；および
第１のシェル部の頂部上に直接的に位置する第２のシェル部であって、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子および高分子前駆体アンカーポイントを含み、その双方は第１のシェル部の表面上の官能基に結合する、第２のシェル部；ならびに
（ｂ）単分散超常磁性前駆体ビーズ上に、ワンポットフリーラジカル重合によって機能性コーティング層を形成すること、
（ｉ）第１のステップにおいて、バルクモノマーを使用し；および
（ｉｉ）第２のステップにおいて、官能基を有する第２の官能性モノマーを用いて単分散超常磁性ビーズを形成し、
機能性コーティング層が、高分子前駆体アンカーポイントにより第１のシェル部に結合する、ことを含む。
バルクモノマーは、ポリエーテルモノマー、ポリエステルモノマー、ポリアクリルアミドモノマー、およびポリアシッドモノマーよりなる群の１以上から選択し得る。例えば、バルクモノマーは、メタクリル酸メチル、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸よりなる群の１以上から選択でき、任意選択で、バルクモノマーは、メタクリル酸および／または２－ヒドロキシエチルメタクリレートから選択される。
直上に記載の方法において、第１のステップは、バルクモノマーおよび開始剤を含む混合物を使用し得る。この場合、開始剤は、ターシャリ－アミルヒドロペルオキシド、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニア、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２，２’－アゾビス［２－メチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）プロピオンアミド、２，２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］水和物、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２’’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］、および２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩よりなる群の１以上から選択し得る。また、この混合物は、以下のものを含み得る：
（ａ）架橋剤。例えば、架橋剤は、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ビスフェノールＡエポキシアクリレート、ビスフェノールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、プロポキシル化グリセロールジアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択でき、例えば、架橋性モノマーは、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレートおよびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択され、および／または
（ｂ）溶媒。例えば、溶媒は、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジグライム、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトン、メチルエチルケトン、および水よりなる群の１以上から選択し得る。
上述した第２の官能性モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上よりなる群の１以上から選択し得る。
上記のプロセスにおいて：
（ａ）第１のステップおよび／または第２のステップの重合は、３０～８０℃、例えば、５０～７０℃の温度で実施し得る；および／または
（ｂ）第１のステップおよび第２のステップの総重合時間は、１０時間～３０時間、例えば、１６時間～２４時間で有り得る。
上記のプロセスを実施するために、単分散超常磁性前駆体ビーズを提供する必要がある。これらのビーズは：
（ｉ）ネイキッド単分散超常磁性ビーズを提供すること、ビーズが、
ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部であって、ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、コア部；
コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；および
第１のシェル部の頂部上に直接的に位置する第２のシェル部であって、第１のシェル部の表面上の官能基に結合する超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含む、第２のシェル部を含み；ならびに
（ｉｉ）ネイキッド単分散超常磁性ビーズを、メタクリロイルクロリド、３－エトキシ－アクリロイルクロリド、アクリロイルクロリド、４－ペンテノイルクロリド、無水メタクリル酸、無水４－ペンテン酸、無水クロトン酸、無水吉草酸、１０－ウンデセノイルクロリド、グリシドールメタクリレート、グリシドールおよびアリルグリシジルエーテルよりなる群の１以上から選択されるアンカー材料と反応させることにより、第１のシェル部上で高分子前駆アンカーポイントを形成させることにより、単分散超常磁性前駆体ビーズを形成することを含むプロセスにより形成し得る。
ネイキッド単分散超常磁性ビーズは、
（ａｉ）単分散ビーズを提供すること、単分散ビーズが、ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部；および
コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部を含み；ならびに
（ａｉｉ）単分散ビーズを、Ｆｅ（ＩＩＩ）塩およびＦｅ（ＩＩ）塩を含む溶液に入れ、塩基を加えることによって、ネイキッド単分散超常磁性ビーズを形成すること、
を含むプロセスによって形成し得る。
直上に記載のプロセスにおいて、
（ａ）鉄（ＩＩＩ）塩が、ＦｅＣｌ３および／またはＦｅ２（ＳＯ４）３から選択し得る；および／または
（ｂ）鉄（ＩＩ）塩が、ＦｅＣｌ２、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＯＡＣ）２よりなる群の１以上から選択し得る；および／または
（ｃ）塩基が、水酸化アンモニア、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、およびアミンよりなる群の１以上から選択し得る；および／または
（ｄ）溶液が、ＣｏＣｌ２および／またはＭｎＣｌ２をさらに含み得る。
上記の単分散ビーズは、「ワンポット３段階」連続プロセスによって形成でき、このプロセスが、
（ａ）第１の段階において、水とアルコールとの混合物中でスチレンモノマーを開始剤およびポリマー安定剤で分散重合することによりポリスチレンコアを生成して、核となる（nucleated）ポリスチレンコアを形成する；
（ｂ）第２の段階において、核形成されたポリスチレンコアを含む混合物に架橋性モノマーを添加する；および
（ｃ）第３の段階において、第２の段階から得られた材料に第１の官能性モノマーを加えて単分散ビーズを提供し、任意選択で、ポリスチレンビーズはインサイツにて生成され、架橋剤および官能性モノマーの引き続いての添加が、第２の核生成を起こさないため、表面上に官能基を担う（スチレン／架橋剤／官能性モノマー）の球状単分散コポリマービーズに導く、ことを含む。
直上に記載のプロセスにおいて、
（ａ）開始剤が、アゾ開始剤から選択され、任意選択で、アゾ開始剤が、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）、および２，２’－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）（ＡＭＢＮ）よりなる群の１以上から選択され；および／または
（ｂ）ポリマー安定剤が、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＣ）およびキトサンよりなる群の１以上から選択でき；および／または
（ｃ）スチレンモノマーが、スチレン、およびスチレン誘導体よりなる群の１以上から選択でき、任意選択で、スチレン誘導体が、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択され；および／または
（ｄ）アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、またはそれらの混合物よりなる群の１以上から選択でき；および／または
（ｅ）アルコール－対－水の体積比が、１：１～４０：１、例えば、２：１～２０：１で有り得る。
上記で用いられる架橋性モノマーは、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択でき、任意選択で、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される。
第１の官能基を有するモノマーの官能基は、独立して、アミノ、カルボキシル、エポキシ、およびヒドロキシルの１以上から選択し得る。例えば、第１のシェル部、および第２のシェル部の第２の層の官能性モノマー上の官能基は、独立して、ヒドロキシル基およびカルボキシル基の組合せ、またはアミノ基およびカルボキシル基の組合せから選択し得る。より詳細には、第１の官能性モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択し得る。
直上のプロセスにおいて、スチレンモノマー－対－架橋剤の重量比は、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１で有り得る。例えば、スチレンモノマー－対－第１の官能性モノマーの重量比は、２０：１～１：２であり、好ましくは１０：１～１：１である。
単分散ビーズを使用する前に、それらは、１以上の溶媒で洗浄した後、引き続いてのプロセスステップにおいて使用する。洗浄に用いる溶媒は、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびＴＨＦよりなる群の１以上から選択し得る。
上記のプロセスにおいて、得られる単分散超常磁性ビーズは、
（ａ）１５％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満、例えば、２％以下のそれらの直径に基づく変動係数；および／または
（ｂ）０．２～５．０ミクロン、例えば、０．５～４．０ミクロンの平均直径
を有し得る。
本発明は、体外診断（ＩＶＤ）アッセイおよび他の適用に有用な単分散超常磁性ビーズに関する。これらの単分散超常磁性ビーズは、スチレン－架橋剤－官能性モノマーの架橋層で覆われ、さらに超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子層で覆われ、ポリマーマトリックス内に分散した部分が少ない、ポリスチレンコアを有する。最後に、機能性コーティングがビーズ表面上に作製され、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を結合および被覆し、ならびにＩＶＤアッセイ用の官能基を提供する。
かくして、理解されるごとく、本明細書に記載される超常磁性ビーズは、ＩＶＤアッセイに使用し得る。
本発明の有利さについて以下に説明する。
・高度単分散超常磁性ビーズを製造する。
・３種のモノマー［スチレン、架橋剤（例えば、ＤＶＢ）、官能性モノマー］を含む高度単分散コポリマービーズは、「ワンポット３段階」重合手順により製造される。この手順は、煩雑な操作を含み、非常に長い重合時間を消費する多段階の合成プロセスを必要とする最先端（state-of-the-art）の方法と比較して、簡便でかつ実用的である。
・「ワンポット３段階」重合手順において、各モノマーが役割を担っている。（ａ）スチレンが核生成テンプレートを提供し、球状単分散ビーズに導く；（ｂ）ＤＶＢのごとき架橋剤が架橋を提供し、ビーズをより剛性および有機溶媒に耐性にする；および（ｃ）官能性モノマーが超常磁性ナノ粒子（ＮＰ）のアップロードを促進させる。
・３種のモノマー（スチレン、架橋剤、官能性モノマー）の得られたコポリマービーズは球状高度単分散性であり、ビーズ直径は、重合開始剤濃度、ＰＶＰ濃度、モノマーの負荷量（または、添加量）のごとき重合因子を調節することにより変調することができる。
・ビーズに種々の官能性モノマーを共重合でき、ビーズ表面上に官能基を導入できる。かかる官能性モノマーは、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、アリルアミン、１－ビニルイミダゾール、４－ビニルピリジンを含む。加えて、第３の段階で１種類を超える官能性モノマーを一緒に添加し、１プロセスで複数の官能基を導入し得る。
・ビーズ表面上の官能性基の密度は、官能性モノマーの負荷量（または、添加量：loading amount）を調整することにより微調整できる。
・ポリスチレンの核生成完了後、架橋剤（例えば、ＤＶＢ）および官能性モノマーの引き続いての添加は、２次核生成が生じさせず、これは、高度単分散ビーズを製造する理由の一つである。
・ビーズへの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ（例えば、３０～５０重量％）の高負荷（または、高担持）は、ＮＰのオンサイト生成により達成できる。
・表面上に形成されたＦｅ３Ｏ４ ＮＰのサイズは、ＰＳコアへのよく制御された官能基のグラフト化により、よく制御される。
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の非限定例を参照することによって説明される。
（実施例）
本発明は、コア－シェル構造を有する単分散超常磁性ビーズに関する。ビーズは、図２に概略を示した４ステップのプロセスで製造でき、これは単分散超常磁性ビーズの製造についての従来の合成方法とは根本的に異なる。
４ステップの詳細については、図２を参照して、以下にさらに詳しく説明される。
ステップ１：３種のモノマー（スチレン、架橋剤、官能性モノマー）からの「ワンポット３段階」重合手順を介する高度単分散ターポリマー（terpolymer）ビーズの合成
（ａ）第１の段階は、０～２０ｖ％の水を含有するエタノール中でのスチレンの分散重合である。このステップで核形成が完了し、ポリスチレンコア２０を得る。スチレンモノマーの大部分（例えば、６０～８０重量％）が消費され、かくして、この段階でビーズ数は固定される。重合時間は、２～１２時間、好ましくは４～１０時間である。
（ｂ）第２の段階は、架橋剤の添加による架橋である。架橋剤と残存するスチレンとの共重合により、コア－シェル構造（Ａ）を形成する。重合時間は、１～８時間、好ましくは２～６時間である。
（ｃ）第３の段階において、官能性モノマーを添加して、残存する少量の架橋剤とスチレンとを共重合させる。得られたターポリマーシェル４０は、ビーズ表面上に親水性官能基を含む。加えて、この段階で１を超える官能性モノマー（例えば、２つまたは３つの官能性モノマー）を一緒に添加でき、１回の実行で複数の官能基を導入できる。重合時間は、８～２４時間、好ましくは１０～２０時間である。
この「ワンポット３段階」連続プロセスが、３種のモノマー（スチレン、ＤＶＢ、官能性モノマー）から球状高度単分散ターポリマービーズを製造できることを、驚くべきことに見出した。この「ワンポット３段階」連続プロセスは、３つの優れた特徴を有する。
（ａ）スチレンが核生成テンプレートを提供し、球状単分散ビーズに導く。
（ｂ）架橋剤（例えば、ＤＶＢ）が、架橋を提供し、ビーズの剛性および有機溶媒への耐性を決定する。
（ｃ）官能性モノマーが、親水性官能基、例えば、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、エポキシ基、酸無水物基を導入し、さらに改変して、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰのアップロードを促進できる。
また、驚くべきことには、架橋剤および官能性モノマーの添加が、２次核生成を生じないことを見出した。加えて、この段階での官能性モノマーの添加は、表面上に高い官能基密度を達成し、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰのインサイツにての沈殿（または、析出）を可能にする。
ステップ２：合成したままのターポリマービーズの有機溶媒での洗浄および表面改質。
ステップ１で合成したままのターポリマービーズ（Ａ）を、有機溶媒で十分に洗浄する。洗浄の目的は、溶液中の未反応のスチレン、架橋剤、官能性モノマー、ならびにＰＶＰのごとき安定剤を除去することである。加えて、極性溶媒での洗浄（以下の例）は、ポリマーマトリックスに存在する線状ポリスチレンのいくらかを除去することもでき、これによりビーズを緩め、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰのオンサイトローディングに有利ないくつかの孔（３０として示される）を生成できる。洗浄したビーズを再分散させ、水中に保存して、（Ｂ）を得る。
洗浄または浸漬プロセス中に、ビーズ表面上の官能基をさらに改変して、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰのアップロードを促進できる。ビーズ表面上にエポキシ基を導入した場合、エポキシ基は開環加水分解、開環アミノ分解、開環重合を受けて、ビーズ表面をさらに改変し得る。
ステップ３：超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰのターポリマービーズのオンサイツ生成およびアップロード。
洗浄したビーズ（Ｂ）を、Ｆｅ３＋およびＦｅ２＋を２：１のモル比で含む水溶液（水およびＴＨＦのごとき極性溶媒の混合物）に分散させ、分散液を数時間撹拌しつつ加熱（例えば、７０℃まで）して、２つのイオンがビーズの官能基と相互作用するのを可能にする。理論に拘束されることなく、このプロセス中にいくらかのＦｅ３＋イオンおよびＦｅ２＋イオンはビーズのポリマーマトリックスに浸透し、いくらかはビーズ表面上に吸着されると考えられる。次いで、アンモニア水を加えて、Ｆｅ３＋イオンおよびＦｅ２＋イオンをＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ；６０）に変換させる。アンモニア水の添加後、ポリアクリル酸または酒石酸またはクエン酸のごときＦｅ３Ｏ４ ＮＰを安定化するリガンドをビーズ溶液に添加して、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰの形成を補助し得る。得られた超常磁性ポリマービーズ（Ｃ）を遠心により分離し、水およびメタノールで洗浄して、緩いＦｅ３Ｏ４ ＮＰ ６０を除去する。
ステップ４：超常磁性ビーズ上への機能性コーティングの作製。
超常磁性ポリマービーズ（Ｃ）上にコーティング層８０を作製する。コーティング層は、アンカー材料を（Ｃ）と反応させた後、バルクモノマー、第２の官能性モノマー、および任意の架橋剤のフリーラジカル重合によって達成される。さらに、ヒドロキシル基、カルボキシル基のごとき官能基を必要な密度で表面上に導入できる。
具体的な例において、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ ４０は、ステップ２から形成された機能性ポリマーネットワーク内に封入される。ポリマーのグラフト化を達成するために、ステップ２のビーズ表面上に残存する官能基、例えば、ヒドロキシル基またはアミン基との反応を介してアンカー材料を導入する。アンカー材料は、詳細な説明にリストされているものから選択できる。無水溶媒は、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジグライム、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトン、メチルエチルケトンから選択される。好ましくは、テトラヒドロフランおよびジグライムである。反応時間は不活性ガスパージで１２～３６時間である。得られたビーズを有機溶媒で洗浄して、過剰なモノマーを除去する。
さらに、コーティング層は、ビーズ表面上のアンカー基（例えば、不飽和基）を、第１の段階ではバルクモノマー、第２の段階では第２の官能性モノマー、任意には架橋剤と反応させることによりグラフトされる。具体的な材料は詳細な説明にリストしている。この段階において、重合時間は１０～３０時間、好ましくは１６～２４時間である。フリーラジカル重合は、４０～８０℃、好ましくは５０～７０℃の温度で実施することができる。
材料：
材料は、以下に示す供給元から購入した。
スチレン：東京化成工業（ＴＣＩ）、ＴＢＣ（４－ｔｅｒｔ－ブチルカテコール）で安定化、＞９９．０％（ＧＣ）。
アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（アセトン中１２重量％）。
過硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ８、ＳＰＳ）：Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、結晶性、９８％。
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ，Ｋ３０，ＭＷ＝４０，０００）：ＴＣＩ、合計窒素１２．０％～１２．８％（無水物質で計算）；水 最大７．０％、Ｋ値 ２６．０～３４．０。
ジビニルベンゼン（ＤＶＢ，ｍ－およびｐ－混合物）：ＴＣＩ，５０．０％（ＧＣ）（エチルビニルベンゼン、ジエチルベンゼンを含む）（４－ｔｅｒｔ－ブチルカテコールで安定化）。
アクリル酸：ＴＣＩ，＞９９．０％（ＧＣ）（モノメチルエーテルハイドロキノンで安定化）。
メタクリル酸グリシジル：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９７．０％（ＧＣ）。
２－ヒドロキシエチルメタクリレート：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９．０％以上
２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、阻害剤として２０００ｐｐｍのＭＥＨＱ。
エタノール：９９％。
クエン酸：シグマ・アルドリッチ、９８％。
トリメチロールプロパントリアクリレート：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
メタクリル酸メチル：ＴＣＩ
２－（２－アミノエトキシ）エタノール：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９８％。
脱イオン水：ＥＬＧＡ Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｗａｔｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＵＲＥＬＡＢ Ｏｐｔｉｏｎ）から入手。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）撮影はＪＥＯＬ ＪＳＭ６７００Ｆで行った．
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）撮影はＪＥＯＬ ２１００Ｆで行った。
メカニカルスターラー：Ｗｉｇｇｅｎｓ, ＷＢ２０００－Ｍ オーバーヘッドスターラー
熱重量分析（ＴＧＡ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＤＴＧ－６０を用いて行った。約１５ｍｇ（乾燥質量）のビーズを含む試料を７０℃のオーブンで乾燥させた。基準（または、参照：reference）ルツボおよび試料ルツボを含む空ルツボをホルダー上に並列に配置した。基準ルツボと試料ルツボの重量差を解消した。次いで、ビーズ試料を試料ルツボに充填した。温度プロフィールは、室温から７００℃まで２０℃／分間の刻みで、１００℃にて１０分間の保持時間で設定した。全プロセスをＮ２パージ下で行った。磁性含有量は、以下の式で算出した。
Figure 2023524994000003
（式中、Ｗ１は１０分間保持後の１００℃での重量、Ｗ２は７００℃での重量である。）
超常磁性特性の測定は、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｅｓｉｇｎの６０００ＰＰＭＳ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて実施した。約１５ｍｇ（乾燥質量）のビーズを含む試料を、室温下、真空オーブンで乾燥させた。磁化曲線［Ｍ－Ｈ］は、振動試料型磁力計（Ｐ５２５）および振動試料型磁力計（Ｍｉｃｒｏ Ｓｅｎｓｅ，ＥＶ９）を備えた物性測定システム（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｅｓｉｇｎ，ＰＰＭＳ ６０００）を用いて得た。Ｍ－Ｈは３００Ｋにて適切な強さの電界の印加で測定した。
ポリスチレンビーズの変動係数（ＣＶ）％は、ＳＥＭ像（１０，０００倍）測定から算出した。ＩＭＡＧＥ Ｊを使用して１００個のビーズを測定し、平均直径およびＣＶを算出した。
一般的な考慮事項
すべての重合プロセスについて機械的撹拌（２００ｒｐｍ）を使用した。使用前にＤＩ水およびエタノールを窒素で２０分間バブリングして、酸素を除去した。すべての薬品（ＡＩＢＮ、ＳＰＳ、ＰＶＰ、アクリル酸、アリルアミン、ＤＶＢ、スチレン、グリシドール、グリシジルメタクリレート、ビスフェノールＡジグリシジルエーテルおよび２－ヒドロキシエチルメタクリレートを含む）は精製なくして受け取ったままで使用した。すべての重合および反応は、窒素保護下で、標準的なシュレンク線の技法を用いて実施した。
実施例１：
－ＣＯＯＨ基および－ＯＨ基を担持する単分散ビーズの合成
－ＣＯＯＨ基および－ＯＨ基を担持する単分散ビーズを合成するための「ワンポット３段階」重合プロセスについて、以下に説明する。
メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの三つ口丸底ガラス製反応器に、ＡＩＢＮ溶液（２ｇ、アセトン中１２重量％）を加え、一側の口から窒素を導入してアセトン溶媒を除去した。１０分間の窒素流の後、反応器の底に乾燥したＡＩＢＮ粉末を観察した。次いで、ＰＶＰ（０．２ｇ）、エタノール（８０ｍＬ）、およびＤＩ水（２０ｍＬ）を加えた。この混合物を室温にて５分間撹拌して透明な溶液を得、次いで、これをオイルバスで６０℃に加熱した後、スチレン（７．５ｍＬ）を加えた。４時間後に白色コロイド溶液が生成し、スチレンの重合を示した。次いで、ＤＶＢ（７ｍＬのエタノール中の３ｍＬのＤＶＢ）の溶液を定圧滴下ロートで３０分間かけて徐々に添加した。ＤＶＢ溶液の添加完了後、３時間反応（架橋重合）を続けた。次いで、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（５ｍＬのエタノール中０．７５ｇ）および２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー（５ｍＬのエタノール中０．７５ｇ、アンモニア水で中和、２５％Ｗ／Ｗ）のモノマー溶液をシリンジを用いて添加した。反応（重合）を６時間続け、ミルク状のコロイド溶液を得た。ＳＥＭ像は、合成したままのビーズが球状単分散であり、約１．０ミクロンの直径を有することを示した（図３）。得られたビーズを「Ａ－１」と命名した。
実施例２：
ビーズＡ－１の洗浄および表面改質
Ａ－１のビーズ（５０ｍＬ分散液、質量濃度 約８重量％）を遠心により分離し、超音波処理によりエタノールに再分散させた。ビーズをエタノール（５０ｍＬ×２）、ＴＨＦおよび水の混合物（１：１の体積比；５０ｍＬ×２）で洗浄した。得られたビーズを遠心分離し、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に再分散させ、Ｂ－１を得た。ＳＥＭ像は、ビーズが球状単分散であり、約１．０ミクロンの直径を有することを示した。
実施例３：
ビーズＢ－１の磁化
メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの三つ口丸底ガラス製反応器に、ＦｅＣｌ３（８．０ｇ）および水１００ｍＬを加えて撹拌し、茶色溶液を形成した後、ＦｅＣｌ２（３．１ｇ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）を加えた。この混合物を３０分間撹拌して溶液を形成し、これにビーズＢ－１の水溶液（５０ｍＬ、質量濃度 約８重量％）を加えて、７０℃で３時間撹拌した。混合物を室温まで冷却した後、激しい撹拌下でアンモニア水（２５重量％，３０ｍＬ）を加え、直ちに黒色スラリーを得た。クエン酸溶液（０．５ｇ、１０ｍＬの水中）を反応器に加え、黒色スラリーを７０℃に１時間加熱し、反応を完了させた。この超常磁性ビーズは、数回の遠心シフトにより精製して、未結合の超常磁性ＮＰを除去し、最後にＤＩ水（１００ｍＬ、約４重量％）に再分散させた。得られた黒褐色超常磁性ビーズを「Ｃ－１」と命名した。ＴＧＡの結果は、ビーズが４３重量％のＮＰを含むことを示した。得られた磁性ビーズは単分散で、いくらかのＦｅ３Ｏ４ ＮＰがコア内に均一に散在し、表面上には非常に厚い層のふわふわした（fluffy）Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰを有した。Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ層の厚さは、ビーズの周囲で約７０～１００ｎｍである（図４）。超常磁性特性はＱｕａｎｔｕｍ Ｄｅｓｉｇｎの６０００ ＰＰＭＳ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。飽和磁化（ＭＳ）値は、原子吸光法により測定したビーズの質量を用いて正規化（または、規格化：normalized）した。図５は、試料Ｃ－１の室温での典型的なヒステリシス曲線を示す。ヒステリシスループは、磁化ループ上のゼロの保磁力および残留磁化（remanence）により明らかなように、超常磁性的な挙動を示している。
実施例４：
機能性コーティングの作製
結合ステップ：メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬ三つ口丸底ガラス製反応器に、超常磁性ビーズＣ－１（３０ｍＬ，無水ＴＨＦ中の４重量％）、メタクリロイルクロリド（１００ｍｇ、１０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解）を添加した。混合物を窒素パージ下で６０℃に加熱し１８時間維持した後、室温に冷却した。ビーズをＴＨＦで洗浄し、過剰なメタクリロイルクロリドを除去し、次に水で洗浄した。ビーズは窒素保護下で水中に保存した。
乳化重合によるコーティングステップ：前のステップの改質超常磁性ビーズ（１０ｍＬ、水中の４重量％）を、３０ｍＬのＤＩ水を含む５０ｍＬ遠心分離管に加えた。次いで、この混合物を、メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの三つ口丸底ガラス製反応器に加えた。反応器を窒素でフラッシュして酸素を除去し、次いで、ＳＰＳ（３０ｍｇ、２ｍＬの水に溶解）を添加した。混合分散液を６０℃に加熱し、１０分間撹拌した。引き続いて、メチルメタクリレート（４００ｍｇ）、トリメチロールプロパントリアクリレート（２００ｍｇ）を含むモノマーの混合物を、１時間にわたり４バッチに分けて（したがって、２０分間隔にて）添加した。モノマー混合物の添加完了後、６０℃にて６時間反応（コーティング重合）を続けた。室温まで冷却後、コーティングされた超常磁性ビーズを磁気分離器で分離し、エタノール（５０ｍＬ×２）およびＤＩ水（５０ｍＬ×２）で洗浄した。コーティングされた超常磁性ビーズをＤ－１と命名した。図６のＴＥＭ像は、ビーズの構造が図２（Ｄ）で提唱したものに対応していることを明確に示した。ビーズの端は、磁性粒子の溶出を防ぐことができるポリマーの層で十分に覆われていた。
実施例５：
エポキシ基を担持する単分散ビーズの合成
３種類のモノマー（スチレン、ＤＶＢ、ＧＭＡ）から作製された単分散ビーズを合成する「ワンポット３段階」重合プロセス、エポキシ基を担持するビーズについて、以下に説明する。
メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬ三つ口丸底ガラス製反応器に、ＡＩＢＮ溶液（２．０ｇ、アセトン中１２重量％）を加え、一側の口から窒素を導入して、アセトン溶媒を除去した。１０分間の窒素流の後、反応器の底に乾燥したＡＩＢＮ粉末を観察した。次いで、ＰＶＰ（０．３ｇ）、エタノール（８０ｍＬ）、およびＤＩ水（１６ｍＬ）を加えた。この混合物を室温にて５分間撹拌して透明な溶液を得、次いで、これをオイルバスで６０℃に加熱した後、スチレン（７．５ｍＬ）を加えた。
６時間後に白色コロイド溶液が生成し、スチレンの重合を示した。次いで、ＤＶＢ（１．５ｍＬ、エタノール８．５ｍＬに溶解）の溶液を、定圧滴下ロートで３０分かけて徐々に添加した。ＤＶＢ溶液の添加完了後、２時間反応（架橋重合）を続けた。次いで、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）（２．０ｇ、１０ｍＬのエタノールに溶解）の溶液をシリンジで加えた。２４時間反応（重合）を継続し、ミルク状のコロイド溶液を得た。ＳＥＭ像は、合成したままのビーズが球状単分散であり、約１．０ミクロンの直径を有することを示した（図７）。得られたビーズを「Ａ－２」と命名した。
実施例６：
Ａ－２の洗浄および表面改質
Ａ－２のビーズ分散液（５０ｍＬ、質量濃度 約８重量％）を遠心により分離し、超音波処理によりエタノールに再分散させた。ビーズをエタノール（５０ｍＬ×２）ならびにＴＨＦおよび水の混合物（１：１の体積比；５０ｍＬ×２）で洗浄し、ビーズを１ｇの２－（２－アミノエトキシ）エタノールを含むＴＨＦ溶液に再分散させ、室温にて２０時間撹拌した。次いで、ビーズを水で５回洗浄し、水に再分散させ、Ｂ－２を得た。ＳＥＭ像は、ビーズが約１．０ミクロンの直径を有する球状単分散であることを示した。
実施例７：
Ｂ－２ビーズの磁化
メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの三つ口丸底ガラス製反応器に、ＦｅＣｌ３（８．０ｇ）および水１００ｍＬを加えて撹拌し、茶色溶液を形成した後、ＦｅＣｌ２（３．１ｇ）、ＴＨＦ（２０ｍＬ）を加えた。この混合物を３０分間撹拌して溶液を形成し、これにビーズＢ－２の溶液（５０ｍＬ、水中質量濃度 約８重量％）を加えて、６５℃で３時間撹拌した。混合物を室温まで冷却した後、激しい撹拌下でアンモニア水（２５重量％，２５ｍＬ）を加え、直ちに黒色スラリーを得た。クエン酸溶液（０．５ｇ、１０ｍＬの水中）を反応器に加え、黒色スラリーを７０℃に１時間加熱し、反応を完了させた。この超常磁性ビーズは、数回の遠心シフトにより精製して、未結合の超常磁性ＮＰを除去し、最後にＤＩ水（１００ｍＬ、約４重量％）に再分散させた。得られた黒褐色超常磁性ビーズを「Ｃ－２」と命名した。ＴＧＡの結果は、ビーズが４１重量％のＮＰを含むことを示した。Ｃ－２のＴＥＭ像を図８に示す。
実施例８：
機能性コーティングの作製
結合ステップ：メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬ三つ口丸底ガラス反応器に、超常磁性ビーズＣ－２（１０ｍＬ，無水ＴＨＦ中の４重量％）、無水メタクリル酸（１２０ｍｇ、３０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）（２０μＬ、１０ｍＬ無水ＴＨＦに溶解）を添加した。混合物を窒素パージ下で６５℃に加熱し３時間維持した後、室温に冷却した。ビーズをＴＨＦで洗浄し、過剰な無水メタクリル酸を除去し、次いで、水で洗浄した。ビーズは窒素保護下で水中に保存された。
グラフト重合によるコーティングステップ：前のステップの改質超常磁性ビーズ（１０ｍＬ、水中の４重量％）を、３０ｍＬのＤＩ水を含む５０ｍＬ遠心分離管に加えた。この混合物を、メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの三つ口丸底ガラス製反応器に加えた。反応器を窒素でフラッシュして酸素を除去し、次いで、ＳＰＳ（３０ｍｇ、２ｍＬの水に溶解）を添加した。混合分散液を６０℃に加熱し、１０分間撹拌した。引き続いて、メチルメタクリレート（４００ｍｇ）、ビスフェノールＡ型エポキシアクリレート（１５０ｍｇ）を含むモノマーの混合物を、４時間にわたり４バッチ（間隔１時間）で添加した。モノマー混合物の添加完了後、６０℃にて４時間反応（コーティング重合）を続けた。アクリル酸モノマー（１００ｍｇ、水で希釈し、さらにアンモニア水で中和した、２５％（ｗ／ｗ））を加え、反応を６０℃にて１６時間続けた。室温に冷却後、コーティングされた超常磁性ビーズを磁気分離器で分離し、エタノール（５０ｍＬ×２）、ＤＩ水（５０ｍＬ×２）で洗浄した。コーティングされた超常磁性ビーズをＤ－２と命名した。図９のＴＥＭ像は、Ｃ－１と比較して滑らかな外層を示し、ナノ粒子が高分子ネットワーク内に効果的に封入されていることを示した。
比較例１．
官能基を有さない単分散ビーズの合成
官能基を有さない２つのモノマー（スチレン－ＤＶＢ）から単分散ビーズを合成する「ワンポット２段階」重合プロセスについて、以下に説明する。
メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬ三つ口丸底ガラス製反応器に、ＡＩＢＮ溶液（２．２ｇ、アセトン中１２重量％）を加え、一側の口から窒素を導入してアセトンを除去した。１０分間の窒素流の後、反応器の底に乾燥したＡＩＢＮ粉末を観察した。次いで、ＰＶＰ（０．９ｇ）、エタノール（９０ｍＬ）、およびＤＩ水（１０ｍＬ）を加えた。混合物を室温にて５分間撹拌して透明な溶液を得、これをオイルバスで７０℃に加熱した後、スチレン（７．５ｍＬ）を加えた。
６時間後に白色コロイド溶液が生成し、スチレンの重合を示した。次いで、ＤＶＢ（１．５ｍＬ、エタノール８．５ｍＬに溶解）の溶液を、定圧滴下ロートで３０分かけて徐々に添加した。ＤＶＢ溶液の添加完了後、２０時間反応（架橋重合）を続けてミルク状のコロイド溶液を得た。ＳＥＭ像は、合成したままのビーズが球状単分散であり、約０．８ミクロンの直径を有することを示した（図１０）。得られたビーズを「ＣＥ－１」と命名した。官能性モノマーを添加していないため、ビーズＣＥ－１は表面上に官能基を有さず、ビーズは疎水性である。
比較例２：
ＣＥ－１の洗浄および浸漬
ＣＥ－１の合成したままのポリ（スチレン－ＤＶＢ）ビーズ（５０ｍＬ分散液、質量濃度 約８重量％）を遠心により分離し、超音波処理によりエタノールに再分散させた。ビーズをエタノール（５０ｍＬ×２）、ＴＨＦおよび水の混合物（１：１の体積比；５０ｍＬ×２）、ＴＨＦ（５０ｍＬ×２）で洗浄した。洗浄したビーズを「ＣＥ－２」と命名した。ＳＥＭ像は、ビーズが球状単分散であり、約０．８ミクロンの直径を有することを示した。
比較例３：
ＣＥ－２ビーズの磁化
メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの三つ口丸底ガラス製反応器に、ＦｅＣｌ３（８．０ｇ）および水１００ｍＬを加えて撹拌し、茶色溶液を形成した後、ＦｅＣｌ２（３．１ｇ）、クエン酸（８．５ｇ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）を加えた。この混合物を３０分間撹拌して溶液を形成し、これにＴＨＦ中のビーズＣＥ－２の溶液（５０ｍＬ、質量濃度 約８重量％）を加えて、６０℃で３時間撹拌した。混合物を室温まで冷却した後、激しい撹拌下でアンモニア水（２５重量％，３０ｍＬ）を加え、直ちに黒色スラリーを得た。黒色スラリーを６０℃に１時間加熱し、反応を完了させた。この超常磁性ビーズを数回の遠心シフトにより精製して、未結合の超常磁性ＮＰを除去し、最後にＤＩ水（１００ｍＬ、約４重量％）に再分散させた。
得られたビーズは依然として白色であり、「ＣＥ－３」と命名した。ＴＧＡの結果は、ビーズが１重量％のＮＰを含むことを示した。この比較実験は、ポリ（スチレン－ＤＶＢ）ビーズが十分な量の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰを結合できないことを示した。これは、ＴＥＭ像（図１１）によりさらに確認され、ＣＥ－３の表面上には少量の磁性ＮＰが形成されるにすぎないことを示した。磁性ナノ粒子は、マイクロスフェアーの隙間にのみ凝集する。

Claims (41)

  1. コア－シェル構造を有する単分散超常磁性ビーズであって、前記ビーズは、
    ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部であって、前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入するコア部；
    前記コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、前記コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；ならびに
    第１のシェル部の頂部上に直接的に位置した第２のシェル部
    を含み、前記第２のシェル部は、第１の層、第２の層および第３の層として形成され、
    前記第１の層が、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子ならびに、共役モノマーおよびバルクモノマーを含む第１の層高分子マトリックス材料を含み；
    前記第２の層が、前記第１の層を越えて延在し、バルクモノマーを含む第２の層高分子材料から形成され；および
    前記第３の層が、第２の層の頂部上にあり、バルクモノマー、および官能基を有する第２の官能性モノマーを含む第３の層高分子材料から形成され、
    前記第１の層の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、前記第１のシェル部の外表面上に存在する官能基と直接的に結合し；
    前記第１の層高分子マトリックス材料が、前記第１の層の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を取り囲み；および
    前記第２の層高分子マトリックス材料が、前記第１の層高分子マトリックス材料から延在し、各単分散超常磁性ビーズの外表面を形成する、単分散超常磁性ビーズ。
  2. 前記第２の層および第３の層の高分子マトリックス材料が、前記ビーズを溶媒に入れた場合に超常磁性磁性ナノ粒子が溶出するのを防止するように機能する、請求項１に記載のビーズ。
  3. 前記第１のシェル部および前記第２のシェル部の前記第３の層の官能性モノマー上の官能基が、独立して、アミノ、カルボキシル、エポキシ、およびヒドロキシルの１以上から独立して選択され、任意選択にて、前記第１のシェル部、および前記第２のシェル部の前記第２の層の官能性モノマー上の官能基が、独立して、ヒドロキシル基およびカルボキシル基の組合せ、またはアミノ基およびカルボキシル基の組合せから選択される、請求項１または請求項２に記載のビーズ。
  4. 前記ビーズが、１５％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満のそれらの直径に基づく変動係数を有する、請求項１～３のいずれか１記載のビーズ。
  5. 前記ビーズが、２％以下のそれらの直径に基づく変動係数を有する請求項４に記載のビーズ。
  6. 前記ビーズが０．２～５．０μｍ、例えば、０．５～４．０μｍの平均直径を有する、請求項１～５のいずれか１記載のビーズ。
  7. 前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が、スチレン、スチレン誘導体、およびそれらのコポリマーよりなる群の１以上から形成され、任意選択で、前記スチレン誘導体が、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択される、請求項１～６のいずれか１記載のビーズ。
  8. ビーズ中の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のすべてが、各ビーズの全重量の１０～８０重量％、例えば、２０～７０重量％、例えば、３０～５０重量％を占めている、請求項１～７のいずれか１記載のビーズ。
  9. （ａ）第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、各ビーズの全重量の０．１～５重量％を占め；および／または
    （ｂ）第２バッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、各ビーズの全重量の０．５～１０重量％を占め；
    （ｃ）第２のシェル部の第１の層中の超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、各ビーズの全重量の９．４～７９．４重量％、例えば、１９．４～６９．４重量％、例えば、２９．４～４９．４重量％を占める、請求項８に記載のビーズ。
  10. 前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群から選択され、任意選択で、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される、請求項１～９のいずれか１記載のビーズ。
  11. 前記第１の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択される、請求項１～１０のいずれか１記載のビーズ。
  12. スチレンモノマーが、スチレン、およびスチレン誘導体よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、スチレン誘導体が、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択される、請求項１～１１のいずれか１記載のビーズ。
  13. 前記第１のシェルが、第１の高分子マトリックス組成物の第１の層および第２の高分子マトリックス組成物の第２の層をさらに含み、
    前記第１の層が、スチレンモノマーと、架橋性モノマーとのコポリマーから形成され；および
    前記第２の層が、スチレンモノマー、架橋性モノマーおよび官能性モノマーのコポリマーから形成される、請求項１～１２のいずれか１記載のビーズ。
  14. 前記超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、５～１５ｎｍの平均直径を有する、請求項１～１３のいずれか１記載のビーズ。
  15. （ａ）前記コア部および前記第１のシェル部におけるスチレン基－対－架橋基の重量－対－重量比が、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１であり、および／または
    （ｂ）前記コア部および前記第１のシェル部におけるスチレン基－対－官能基の重量－対－重量比が、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１である、請求項１～１４のいずれか１記載のビーズ。
  16. 前記Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が、さらにＣｏ３Ｏ４および／またはＭｎ３Ｏ４ナノ粒子を含む、請求項１～１５のいずれか１記載のビーズ。
  17. 前記共役モノマーが、メタクリロイルクロリド、３－エトキシ－アクリロイルクロリド、アクリロイルクロリド、４－ペンテノイルクロリド、無水メタクリル酸、無水４－ペンテン酸、無水クロトン酸、無水吉草酸、１０－ウンデセノイルクロリド、グリシドールメタクリレート、グリシドールおよびアリルグリシジルエーテルよりなる群の１以上から選択される、請求項１～１６のいずれか１記載のビーズ。
  18. 前記バルクモノマーが、ポリエーテルモノマー、ポリエステルモノマー、ポリアクリルアミドモノマー、およびポリアシッドモノマーの１以上から選択され、任意選択で、前記バルクモノマーが、メタクリル酸メチル、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、バルクモノマーが、メタクリル酸および／または２－ヒドロキシエチルメタクリレートから選択される、請求項１～１７のいずれか１記載のビーズ。
  19. 前記第２の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上よりなる群の１以上から選択される、請求項１～１８のいずれか１記載のビーズ。
  20. 前記第２のシェル部が、前記第１および／または第２および／または第３の層中に架橋性モノマーをさらに含み、任意選択で、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ビスフェノールＡエポキシアクリレート、ビスフェノールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、プロポキシル化グリセロールジアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択され、例えば、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレートおよびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される、請求項１～１９のいずれか１記載のビーズ。
  21. 前記第２のシェルの第２の層および第３の層の組合せ重量が、各ビーズの全重量の１～３０重量％、好ましくは２～２０重量％を占める、請求項１～２０のいずれか１記載の超常磁性ビーズ。
  22. コア－シェル構造を有する、単分散超常磁性ビーズを調製する方法であって、
    （ａ）ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部を含む、単分散超常磁性前駆体ビーズを提供すること、前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入し；
    前記コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、前記コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；および
    前記第１のシェル部の頂部上に直接的に位置する第２のシェル部であって、超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子および高分子前駆体アンカーポイントを含み、その双方は前記第１のシェル部の表面上の官能基に結合する、第２のシェル部；ならびに
    （ｂ）単分散超常磁性前駆体ビーズ上に、ワンポットフリーラジカル重合によって機能性コーティング層を形成すること、
    （ｉ）第１のステップにおいて、バルクモノマーを使用し；および
    （ｉｉ）第２のステップにおいて、官能基を有する第２の官能性モノマーを用いて単分散超常磁性ビーズを形成し、
    前記機能性コーティング層が、高分子前駆体アンカーポイントにより第１のシェル部に結合する、ことを含む、方法。
  23. 前記バルクモノマーが、ポリエーテルモノマー、ポリエステルモノマー、ポリアクリルアミドモノマー、およびポリアシッドモノマーよりなる群の１以上から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記バルクモノマーが、メタクリル酸メチル、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、前記バルクモノマーが、メタクリル酸および／または２－ヒドロキシエチルメタクリレートから選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記第１のステップが、前記バルクモノマーおよび開始剤を含む混合物を使用し、任意選択で、前記開始剤が、ターシャリ－アミルヒドロペルオキシド、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニア、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２，２’－アゾビス［２－メチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）プロピオンアミド、２，２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］水和物、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２’’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］、および２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩よりなる群の１以上から選択される、請求項２２～２４のいずれか１記載の方法。
  26. 前記第１のステップにおける混合物が、さらに、
    （ａ）架橋剤、任意選択で、前記架橋剤が、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ビスフェノールＡエポキシアクリレート、ビスフェノールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、プロポキシル化グリセロールジアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択され、例えば、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択され、および／または
    （ｂ）溶媒、任意選択で、前記溶媒が、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジグライム、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトン、メチルエチルケトン、および水よりなる群の１以上から選択される、
    を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記第２の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択される、請求項２２～２６のいずれか１記載の方法。
  28. （ａ）第１のステップおよび／または第２のステップの重合が、３０～８０℃、例えば、５０～７０℃の温度で行われ；および／または
    （ｂ）第１のステップおよび第２のステップの総重合時間が１０時間～３０時間、例えば、１６時間～２４時間である、請求項２２～２７のいずれか１記載の方法。
  29. 前記単分散超常磁性前駆体ビーズが、
    （ｉ）ネイキッド単分散超常磁性ビーズを提供すること、前記ビーズが、
    ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部であって、前記ポリスチレン高分子マトリックス材料が第１のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、コア部；
    コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部であって、前記コポリマーマトリックス材料が第２のバッチの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を封入する、第１のシェル部；および
    前記第１のシェル部の頂部上に直接的に位置する第２のシェル部であって、前記第１のシェル部の表面上の官能基に結合する超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含む、第２のシェル部を含み；ならびに
    （ｉｉ）前記ネイキッド単分散超常磁性ビーズを、メタクリロイルクロリド、３－エトキシ－アクリロイルクロリド、アクリロイルクロリド、４－ペンテノイルクロリド、無水メタクリル酸、無水４－ペンテン酸、無水クロトン酸、無水吉草酸、１０－ウンデセノイルクロリド、グリシドールメタクリレート、グリシドールおよびアリルグリシジルエーテルよりなる群の１以上から選択されるアンカー材料と反応させることにより、前記第１のシェル部上で高分子前駆アンカーポイントを形成させることにより、単分散超常磁性前駆体ビーズを形成することを含むプロセスにより形成される、請求項２２～２８のいずれか１記載の方法。
  30. 前記ネイキッド単分散超常磁性ビーズが、
    （ａｉ）単分散ビーズを提供すること、前記単分散ビーズが、ポリスチレン高分子マトリックス材料から形成されたコア部；および
    前記コア部の頂部上に直接的に位置し、スチレンモノマー、架橋性モノマー、および官能基を有する第１の官能性モノマーから形成された架橋高分子マトリックス材料から形成された第１のシェル部を含み；ならびに
    （ａｉｉ）前記単分散ビーズを、Ｆｅ（ＩＩＩ）塩およびＦｅ（ＩＩ）塩を含む溶液に入れ、塩基を加えることによって、前記ネイキッド単分散超常磁性ビーズを形成すること、
    を含むプロセスによって形成される、請求項２９に記載の方法。
  31. （ａ）前記鉄（ＩＩＩ）塩が、ＦｅＣｌ３および／またはＦｅ２（ＳＯ４）３から選択される；および／または
    （ｂ）前記鉄（ＩＩ）塩が、ＦｅＣｌ２、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＯＡＣ）２よりなる群の１以上から選択される；および／または
    （ｃ）前記塩基が、水酸化アンモニア、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、およびアミンよりなる群の１以上から選択される；および／または
    （ｄ）前記溶液が、ＣｏＣｌ２および／またはＭｎＣｌ２をさらに含む、
    請求項３０に記載の方法。
  32. 前記単分散ビーズが、「ワンポット３段階」連続プロセスによって形成され、このプロセスが、
    （ａ）第１の段階において、水とアルコールとの混合物中でスチレンモノマーを開始剤およびポリマー安定剤で分散重合することによりポリスチレンコアを生成して、核となるポリスチレンコアを形成する；
    （ｂ）第２の段階において、核形成されたポリスチレンコアを含む混合物に架橋性モノマーを加える；および
    （ｃ）第３の段階において、前記第２の段階から得られた材料に第１の官能性モノマーを加えて単分散ビーズを提供し、任意選択で、ポリスチレンビーズはインサイツにて生成され、架橋剤および官能性モノマーの引き続いての添加が、第２の核生成を起こさないため、表面上に官能基を担う（スチレン／架橋剤／官能性モノマー）の球状単分散コポリマービーズに導く、
    ことを含む、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
  33. （ａ）前記開始剤が、アゾ開始剤から選択され、任意選択で、前記アゾ開始剤が、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）、および２，２’－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）（ＡＭＢＮ）よりなる群の１以上から選択され；および／または
    （ｂ）前記ポリマー安定剤が、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＣ）およびキトサンよりなる群の１以上から選択され；および／または
    （ｃ）前記スチレンモノマーが、スチレン、およびスチレン誘導体よりなる群の１以上から選択され、任意選択で、スチレン誘導体が、４－メチルスチレン、３－メチルスチレン、および４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレンよりなる群の１以上から選択され；および／または
    （ｄ）前記アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、またはそれらの混合物よりなる群の１以上から選択され；および／または
    （ｅ）アルコール－対－水の体積比が、１：１～４０：１、例えば、２：１～２０：１である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、プロポキシル化ネオペンチルジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ／ヘキサアクリレート、トリプロピレンジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレート、ジ（トリメチロールプロパン）テトアクリレート、グリセロールプロポキシレートトリアクリレート、ペンタエリスリトールプロポキシレートトリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、およびトリ（プロピレングリコール）ジアクリレートよりなる群の１以上から選択され、任意選択で、前記架橋性モノマーが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメチルアクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）よりなる群の１以上から選択される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
  35. 前記第１の官能性モノマー上の官能基が、独立して、アミノ、カルボキシル、エポキシ、およびヒドロキシルの１つ以上から選択され、任意選択で、第１のシェル部、および第２のシェル部の第２の層の官能性モノマー上の官能基が、独立して、ヒドロキシル基およびカルボキシル基の組合せ、またはアミノ基およびカルボキシル基の組合せから選択される、請求項３２～３４のいずれか１記載の方法。
  36. 前記第１の官能性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２－カルボキシエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリルアミン、（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－５－ヘキセン、無水マレイン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２－カルボキシエチルアクリレートオリゴマーよりなる群の１以上から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記スチレンモノマー－対－前記架橋剤の重量比が、２０：１～１：２、例えば、１０：１～１：１である、請求項３２～３６のいずれか１記載の方法。
  38. 前記スチレンモノマー－対－前記第１の官能性モノマーの重量比が、２０：１～１：２、好ましくは１０：１～１：１である、請求項３２～３７のいずれか１記載の方法。
  39. 前記合成されたままの単分散ビーズが、引き続いてのプロセスステップで使用する前に１つ以上の溶媒で洗浄され、任意選択で、前記溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびＴＨＦよりなる群の１以上から選択される、請求項３２～３７のいずれか１記載の方法。
  40. 得られる単分散超常磁性ビーズが：
    （ａ）１５％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満、例えば、２％以下のそれらの直径に基づく変動係数；および／または
    （ｂ）０．２～５．０ミクロン、例えば、０．５～４．０ミクロンの平均直径、
    を有する、請求項２２～３９のいずれか１記載の方法。
  41. これらのビーズがＩＶＤアッセイにおいて適用される、請求項１～２１のいずれか１記載の超常磁性ビーズ。
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