JP2023523886A - 新規モグロシド製造システム及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、モグロシド及び低カロリー又はカロリーのないモグロシド系甘味料を製造する解決法を提示する。組換え遺伝子及び植物形質転換技法を使用することにより、モグロシド経路酵素をコードする非天然遺伝子が植物のゲノム中に導入／実装され、それにより遺伝子導入植物を形成し、植物は、その天然のゲノムにより、形質転換前にモグロシドを天然に産生し得ない。そのような遺伝子導入植物及びその子孫は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生することを可能にされる。

Description

本願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０２１年３月１７日に出願されており、２０２０年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９９０，８０２号の利益及びそれに対する優先権を主張し、その開示全体が参照により全体として組み込まれる。

米国特許法施行規則第１．８２１条第（ｃ）項又は第（ｅ）項に従い、ＡＳＣＩＩテキストバージョンの配列表を含むファイルが本願に付随して提出され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

緒言
世界中の国々での健康的な食事並びに肥満及び糖尿病の潜在的なリスクの意識の高まりにより、従来の高カロリー甘味料に代わる低カロリー又はノンカロリー甘味料は、食品及び飲料ビジネス並びに他の産業にとって一層重要になっている。これらの代替天然甘味料は、人工甘味料並びにスクロース、フルクトース及びグルコースを含む高カロリー甘味料の代わりにするために使用される。数種の人工甘味料のように、同等の量のカロリーのある甘味料より高い甘味効果を与えるものもあり；そのため、砂糖の甘味と同等の甘味を達成するために必要とされるこれらの代替物の量は、より少ない。しかし、数種の低カロリー甘味料は、製造に費用がかかり得、及び／又は非限定的に甘味の後残り、甘味の発現の遅れ、嫌な舌触り、苦い、金属のような、冷たい、渋い及び甘草様の味を含む不都合な味特性及び／又は異味を有し得る。

低カロリー又はノンカロリー甘味料を生合成的に産生する天然植物は、あまりない。例えば、重要なクラスの天然甘味料としてのモグロシドは、化学的には、ラカンカ（学名：シライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii））により天然に産生される、一種のトリテルペングリコシド又はモグロールグリコシドである。モグロシドは、カロリーを含まず、スクロースの１００～４００倍甘い。モグロシドが種々の重要な薬理作用を有することも報告されてきた。

モグロシドは、トリテルペン骨格の炭素２４及び／又は炭素３に結合した（図１）１～６の様々な数のグルコース単位で形成されたトリテルペン骨格に基づく非常に安定な分子である。種々のモグロシド及びそれらの構造は、図２に示される。モグロシドは、グロスモモシドＩなどの非グルコース部分も含み得る。

一般に、モグロシドの天然の生合成は、シライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii）でのみ利用可能である。新鮮な及び乾燥された両方のシライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii）が抽出されて、約８０％モグロシドである粉末をもたらし、主成分は、モグロシドＶである。モグロール／モグロシドの生合成経路及びスクアレンからモグロシドＶへのステップに関与する酵素の全ては、果物の各生育段階でのゲノムシーケンシング及びトランスクリプトーム解析により特定された。図１は、モグロシドＶ生合成経路を示す（Seki et al Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2018 VOL. 82, NO. 6, 927-934）。

シライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii）のような植物は、天然の低カロリー及びノンカロリー甘味料を作るが、これらの植物からの甘味料の製造は、これらの植物の限定された天然又は農業生産のために限定される。より重要なことに、植物中で産生される甘味料は、インビトロでの化学又は生化学合成と異なり、消費者により受け入れられやすい傾向がある。また、植物中で産生される甘味料は、種々の理由のために役立ち得る。そのような果実又は植物は、低カロリー及びノンカロリー甘味料だけでなく、カロリー減少及び他の栄養面の利益を有する食品及び飲料に使用するための、香料、抽出物又は飲料のための充填用果汁を含む果汁を製造するためにも使用され得る。

さらに、インビトロ又は微生物でのモグロシドの大量生産は、概念上、証明されているが、大規模な加工を必要とし得、そのため、経済的に有利ではない。モグロシドを産生する生合成経路は、発酵のための微生物中で試みられた。しかし、モグロシドなどの小さい甘味分子は、完全には開発されていない。

Patronの米国特許出願公開第２０１９／００７１７０５号は、特定の条件下で組換え宿主細胞を培地中で培養することを含む、組換え宿主細胞中でモグロシドＩＩＩＥを産生する方法であって、組換え宿主細胞の遺伝子は、モグロシドＩＩＩＥの産生を触媒する酵素を発現する、方法を提供している。

Houghton-Larsonの国際公開第２０１８／２２９２８３号は、細胞培養物中で１種以上のモグロシド化合物を産生することが可能な組換え宿主細胞であって、モグロシドの産生を触媒することが可能な異種又は内因性ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む宿主細胞を提供している。

Itkinの国際公開第２０１６／０３８６１７号は、モグロシド産生酵素を生合成的に製造及び単離する方法並びに組換え宿主細胞中でモグロール前駆体、モグロール及びモグロシドを製造する方法に関する。

いずれもLiuの米国特許第９９３２６１９号及び米国特許第９９２０３４９号は、モグロシド化合物の酵素合成のためのインビトロの方法及び材料並びにシトクロムＰ４５０酵素を使用してモグロールを産生し、ウリジン－５’－ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を使用してモグロールをグリコシル化して、種々のモグロシド化合物を製造する方法に関する。

このように、モグロシドの効率のよい製造のための新たな方法及び生物学的システムが必要とされており、本開示は、上記の背景に対してこの必要性に対処する利点及び進歩を提示する。

新規モグロシド製造システム及び方法
開示の概要
本開示は、モグロール、モグロシド及び低カロリーを有するか又はカロリーがないモグロシド系甘味料を製造する解決法を提示する。組換え遺伝子及び植物形質転換技法を使用することにより、モルゴール産生及びモグロシド産生酵素をコードする非天然遺伝子が天然植物のゲノム中に導入／実装され、それにより遺伝子導入植物を形成し、天然植物は、その天然のゲノムにより、形質転換前にモグロール又はモグロシドを天然に産生し得ない。そのような遺伝子導入植物は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生することを可能にされる。

提供される解決法は、著しい利点を有する。第１に、遺伝子導入植物の栽培及び再生によるモグロール、低カロリー又はノンカロリーモグロシドの製造は、成熟した農業技術のため、より良好な技術経済性を有し得る。さらに、解決法は、単に果実内だけでなく、植物のより多い部分にわたりモグロシド産生を可能にし、それにより遺伝子導入植物の栄養的及び経済的な価値全体が増大され得る。さらに、モグロール及び／又はモグロシド産生導入遺伝子を、成長が速いか又は成熟が速い植物／作物に実装することは、モグロシド製造及び加工の効率を改善し、費用効率の高い利点を与え得る。提供される解決法は、これらの遺伝子導入植物及び材料又はその部分の組込みにより、新規低カロリー又はノンカロリー食品及び飲料を可能にし得る。

以前の開示は、主として、モグロシドを製造するための遺伝子操作された微生物（ほとんどが酵母）に基づく方法に注目したことに留意すべきである。本開示は、モグロール／モグロシドを産生することを可能にされる遺伝子導入植物を明確に記載する。酵母系方法は、概念上、モグロシドを合成することが可能であるが、経済的な利点がほとんどないか又は全くない。より重要なことに、植物由来の甘味料及び食品製品は、消費者の受入れを明確に改善する。本開示による遺伝子導入植物は、より少ない加工により又は好ましい追加の香味特性及びプロファイルと共に使用できる、カロリー及び甘味のより低い比を有する果汁若しくは植物抽出物又は植物材料或いは他の誘導された消耗品の製造を可能にする。

モグロシド産生導入遺伝子を含む遺伝子導入生物は、果実及び／又は種をもたらす能力が稀であることに留意することが重要である。驚くべきことに、本開示による遺伝子導入植物は、果実及び種子を含む種々の組織をもたらし、果実及び種子を含む種々の組織は、全てモグロシドを含む。本遺伝子導入植物のモグロシド含有果実は、種々の食品及び飲料製品の供給源として使用でき、したがって食品及び消耗品産業における技術経済性利点を与える。さらに、本開示の種子生産遺伝子導入植物は、種子の繁殖によるモグロシドの大量で費用効率の高い製造及び種々の植物育種技術を使用する遺伝子導入植物の農業的再生に利益をもたらし得る。

一例としての用途において、スイカ果実は、その大きいサイズ及び人気がある味のため、低カロリー及び／又はノンカロリー甘味料の製造の大きい可能性を有する。パスウェイエンジニアリングのためのゲノム編集又はシスジェニック戦略を設計するために、モグロシド産生配列などの遺伝子ペイロードの最適な発現を可能にするスイカ果実特異的プロモーターを特定することが重要である。これらのプロモーターの特定には、高分解能トランスクリプトームデータセットが必要であり、そこから、スイカ果実の可食部分に特異的に発現される遺伝子のリストを生成することができる。本開示に記載される方法及びシステムは、有利には、異なる生育段階での目的遺伝子の組織特異的発現の有効な手法を与える。

本開示は、一般的に、遺伝子導入植物及びその組織又は部分においてモグロール及び／又はモグロシド産生酵素並びにモグロール／モグロシドを作るための遺伝子導入植物及びその生合成システム並びにそのような遺伝子導入植物を製造する方法を記載する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ゲノム変換事象を含む遺伝子導入植物に関し、ここで、ゲノム変換事象は、モグロール及び／又はモグロシド産生酵素の非天然の発現又は濃度をもたらし、遺伝子導入植物は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する。そのような遺伝子導入植物の特定の実施形態において、ゲノム変換事象は、発現カセットを含み、発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む。他の実施形態において、そのような発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の１つ以上を含む。

他の実施形態において、本開示は、非天然のモグロール前駆体及び／又はモグロールを含む遺伝子導入植物に関し、ここで、遺伝子導入植物は、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する。特定の実施形態において、そのような遺伝子導入植物は、発現カセットを含み、発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む。他の実施形態において、そのような発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の１つ以上を含む。

特定の実施形態において、本開示の遺伝子導入植物は、遺伝子導入植物の器官、組織、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、芽、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、***組織部位、カルス組織、種子、切り枝、細胞若しくは組織培養物又はあらゆる他の部分若しくは産物を含むが、これらに限定されない、その得られる部分を含み、その部分は、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を含む。

他の実施形態において、本開示の遺伝子導入植物は、栽培可能であり、繁殖可能である。遺伝子導入植物の子孫又は祖先は、子孫及び祖先がモグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生することを可能にする非天然の酵素の供給源である。遺伝子導入植物の種子の繁殖は、その生存可能な子孫をもたらし、その子孫は、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生する。

いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物は、二倍体植物である。いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物は、ウリ科（Cucurbitaceae）／ウリ類である。特定の実施形態において、遺伝子導入植物は、遺伝子導入スイカ（シトルルス・ラナツス（Citrullus lanatus））である。

本開示は、モグロール、モグロシド又はモグロシド系甘味料を含む、遺伝子導入植物から得られる食品又は飲料製品にも関する。いくつかの実施形態において、本開示は、本開示による遺伝子導入植物又はその部分から抽出又は精製されたモグロシド系甘味料に関する。特定の実施形態において、遺伝子導入植物からモグロシド系甘味料を抽出及び／又は精製する方法は、浸漬、クロマトグラフィー又は吸収クロマトグラムである。

本開示は、非天然のモグロシドを産生する遺伝子導入植物を製造する方法であって、植物をゲノム変換事象と組み合わせ、それにより遺伝子導入植物を形成することを含み、ゲノム変換事象は、モグロール産生及び／又はモグロシド産生酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす、方法に関する。植物をゲノム変換事象と組み合わせることは、一般的に、以下の方法の１つ以上を使用して実施される：リポソームの使用、電気穿孔の使用、遊離のＤＮＡの取込みを増加させる化学物質の使用、ＤＮＡの直接植物への注入の使用、パーティクルガンボンバードメントの使用、ウイルス若しくは花粉を使用する形質転換の使用、マイクロプロジェクションの使用又はアグロバクテリウム媒介性形質転換の使用。

いくつかの実施形態において、本開示は、非天然のモグロール前駆体、モグロール及びモグロシドを遺伝子導入植物中で産生する生合成方法であって、（ａ）植物をゲノム変換事象と組み合わせ、それにより遺伝子導入植物を形成する工程であって、ゲノム変換事象は、モグロール産生及び／又はモグロシド産生酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす、工程；（ｂ）遺伝子導入植物の集団を栽培及び再生する工程；（ｃ）モグロシドを産生する遺伝子導入植物を選択する工程；及び（ｄ）モグロシドを収集する工程を含む生合成方法に関する。特定の実施形態において、生合成方法は、非天然のモグロール産生及び／又はモグロシド産生酵素を発現する発現カセットを含むプラスミドを調製／提供すること；宿主細胞をプラスミドで形質転換すること；及び植物を複数の形質転換された宿主細胞で形質移入することをさらに含む。

用語の定義及び解釈
技術用語の以下の定義又は解釈が本開示全体で使用される。本明細書に使用される技術用語は、一般的に、植物生物学、分子生物学、バイオインフォマティクス及び植物育種の関連する分野においてそれらに通常適用される意味を与えられているものとする。以下の用語定義の全ては、本願の内容全体に適用される。本明細書及び特許請求の範囲で使用される通り、「１つの（a）」又は「１つの（an）」は、使用される文脈に応じて、１つ以上を含み得ることが理解されるべきである。そのため、例えば、「細胞」への言及は、少なくとも１つの細胞が利用され得ることを意味し得る。

特質又は値と関連する用語「基本的に」、「約」、「およそ」などは、特に、それぞれまさにその特質又はまさにその値も定義する。所与の数値又は範囲に関連して、用語「約」は、詳細には、与えられた値又は範囲の２０％以内、１０％以内又は５％以内である値又は範囲に関連する。本明細書で使用される通り、用語「含む」は、用語「からなる」も包含する。

用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」又は「酵素」は、本明細書において互換的に使用され、本明細書で別様に言及されない限り、ペプチド結合により結合されている、任意の長さの多量体型のアミノ酸を指す。

用語「遺伝子配列」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」は、本明細書において互換的に使用され、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドのいずれか又は両方の組合せである、任意の長さの多量体非分岐型のヌクレオチドを指す。

遺伝子導入／導入遺伝子／組換え遺伝子
本開示の目的では、「遺伝子導入」、「導入遺伝子」又は「組換え」は、例えば、核酸配列、発現カセット、遺伝子コンストラクト若しくは核酸配列を含むベクター又は本開示による核酸配列、発現カセット若しくはベクターにより形質転換された生物に関して、（ａ）核酸若しくはその一部の配列、又は（ｂ）本開示による核酸配列と作動可能に連結された遺伝子制御配列、例えばプロモーター、又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組合せがそれらの天然の遺伝子環境に配置されていないか、又は組換え法により改変、例えば遺伝子操作法により人工的に改変及び／又は挿入されたかのいずれかである組換え法によりもたらされた全ての構築物を意味する。

本明細書で使用される通り、用語「遺伝子導入」は、生物を指し、例えば、遺伝子導入植物は、好ましくは、基本的に生物学的でないプロセスにより、好ましくはアグロバクテリウム媒介性形質転換又はパーティクルボンバードメントにより導入された、本明細書に記載される核酸、コンストラクト、ベクター若しくは発現カセット又はその一部を外因的に含む生物、例えば植物、植物細胞、カルス、植物組織又は植物部分を指す。そのため、本開示の目的の遺伝子導入植物は、上述の通り、本明細書に記載される核酸が前記植物のゲノム中に存在せず、それから生じることもないか、又は前記植物のゲノム中に存在するが、前記植物のゲノム中のその天然の遺伝子環境ではなく、核酸が同種発現も異種発現もされ得ることを意味すると理解される。しかし、上述の通り、遺伝子導入は、本開示による核酸若しくは開示される方法に使用される核酸が植物のゲノム中でその天然の位置にあるが、配列が天然配列に関して改変されたこと及び／又は天然配列の制御配列が改変されたことも意味する。遺伝子導入は、好ましくは、ゲノム中の非天然の遺伝子環境でその植物中に天然に存在する核酸配列の発現、すなわち同種発現又はその植物中に天然に存在しない核酸配列の異種発現が起こることを意味すると理解される。

植物／遺伝子導入植物／天然植物
本明細書で使用される用語「植物」は、植物全体、植物の祖先及び子孫並びに種子、芽、茎、葉、根（塊茎を含む）、花並びに組織及び器官を含む植物部分を包含し、上述のそれぞれは、目的遺伝子／核酸を含む。用語「植物」は、植物細胞、浮遊培養液、カルス組織、胚、***組織部位、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子も包含し、やはり上述のそれぞれは目的遺伝子／核酸を含む。

本明細書での遺伝子導入植物は、別の種由来の１つ以上の導入遺伝子が、遺伝子操作技法を使用して植物のゲノムに導入された植物を指す。導入された導入遺伝子は、非天然のタンパク質又は酵素をコード及び発現し、それにより、遺伝子導入植物が、導入遺伝子の導入前に植物中に天然に存在しない非天然の酵素経路産物を産生するなどの新たな特性を有することを可能にする。遺伝子導入植物は、ヒトによる人工的な干渉がない天然の産物である天然植物と対照的である。本願による天然植物は、野生型植物、ヒトにより遺伝子操作されていない植物又は本開示に従って製造される遺伝子導入植物を特性化する対照として使用される未形質転換／非形質転換植物を指す。

内因性／天然
「内因性」又は「天然の」核酸及び／又はタンパク質は、その天然の形態で植物中に存在する（すなわち組換えＤＮＡ操作技術のようなヒトの介入がない）対象の核酸及び／又はタンパク質を指すが、その後、植物中に（再）導入される（導入遺伝子）、単離された形態の同じ遺伝子（又は実質的に相同な核酸／遺伝子）も指す。そのような導入遺伝子を含む遺伝子導入植物は、導入遺伝子発現の著しい減少及び／又は内因性遺伝子の発現の著しい減少に遭遇することも、遭遇しないこともある。

外因性
用語「外因性」（「内因性」と対照的に）核酸又は遺伝子は、組替えＤＮＡ技術により植物に導入された核酸を指す。「外因性」核酸は、植物中にその天然形態で天然に存在し得ないか、植物中にその天然形態で存在する対象の核酸と異なり得るか、又は植物中にその天然形態で存在する核酸と同一であるが、その天然の遺伝子環境内に一体化されていないもののいずれかであり得る。「外因性」の対応する意味は、タンパク質発現に関連して適用される。例えば、導入遺伝子、すなわち外因性核酸を含む遺伝子導入植物は、内因性遺伝子の発現と比べると、全体としてそれぞれの遺伝子又はタンパク質の発現の著しい増加に遭遇し得る。本開示による遺伝子導入植物は、あらゆる遺伝子座で一体化された１つ以上の外因性核酸を含み、任意選択で、植物は天然の遺伝子的背景内の内因性遺伝子も含み得る。

発現カセット
本明細書で使用される「発現カセット」は、宿主細胞中で発現されることが可能なベクターＤＮＡである。ＤＮＡ、ＤＮＡの一部又は発現カセットを形成する遺伝因子の配置は人工でありうる。当業者は、問題なく発現をもたらすために発現カセット中に存在しなければならない遺伝因子を知っている。発現カセットは、本明細書に記載される通り１つ以上の制御配列に（少なくともプロモーターに）作動可能に連結されている、発現されるべき目的配列を含む。追加の調節エレメントは、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーを含み得る。当業者は、本発明を実施する際の使用に好適であり得るターミネーター及びエンハンサー配列を知っている。イントロン配列も、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）又はコード配列中に加えられて、発現増加／過剰発現の定義セクションに記載される通りサイトゾル中に蓄積する成熟したメッセージの量を増加させ得る。他の制御配列（プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲ領域の他に）は、タンパク質及び／又はＲＮＡ安定化エレメントであり得る。そのような配列は、当業者により知られているか又は当業者により容易に得られ得る。

発現カセットは、宿主細胞のゲノムに一体化されて、前記宿主細胞のゲノムと共に増幅され得る。

ベクター
ベクター又はベクターコンストラクトは、一部分若しくは全体として人工的又は含まれる遺伝因子の配置が人工的で、宿主細胞中で複製することが可能であり、宿主細胞又は宿主生物への目的ＤＮＡ配列の導入に使用されるＤＮＡ（非限定的に、プラスミド、ウイルスＤＮＡ及び染色体ベクターなど）である。ベクターはコンストラクトであり得るか、又は少なくとも１つのコンストラクトを含み得る。ベクター、例えば、細菌宿主細胞中のプラスミドベクターは、宿主細胞のゲノムに一体化せずに複製し得るか、又はそれは、そのＤＮＡの一部若しくは全てを宿主細胞のゲノムに一体化して、そのようにしてそのＤＮＡの複製及び発現をもたらし得る。本発明の宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）種細胞などの細菌細胞、酵母細胞、真菌、藻類若しくはシアノ細菌細胞又は植物細胞から選択された任意の細胞であり得る。当業者は、目的配列を含む宿主細胞を問題なく形質転換し、選択し、増殖させるために、遺伝子コンストラクト上に存在しなくてはならない遺伝因子を知っている。典型的には、ベクターは少なくとも１つの発現カセットを含む。１つ以上の目的配列は、本明細書に記載される１つ以上の制御配列に（少なくともプロモーターに）作動可能に連結されている。追加の調節エレメントは、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーを含み得る。当業者は、本明細書に開示される技法を実施する際の使用に好適であり得るターミネーター及びエンハンサー配列を知っているであろう。

作動可能に連結された
用語「作動可能に連結された」又は「機能的に連結された」は互換的に使用され、本明細書で使用される通り、プロモーター配列が目的遺伝子の転写を指示できるような、プロモーター配列と目的遺伝子との間の機能的連結を指す。

プロモーター／植物プロモーター／強いプロモーター／弱いプロモーター
「プロモーター」又は「植物プロモーター」は、植物細胞中でコード配列セグメントの発現を媒介する調節エレメントを含む。「植物プロモーター」は、植物細胞から、例えば、本システム中で及び本明細書に記載される、発現されるべき核酸配列により形質転換される植物から由来し得る。これは、植物ターミネーターなどの他の「植物」調節シグナルにも適用される。本開示の方法に有用なヌクレオチド配列の上流のプロモーターは、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はターミネーターなどの３’－調節領域若しくはＯＲＦから離れて位置する他の３’調節領域のいずれの機能又は活性にも干渉せずに、１つ以上のヌクレオチド置換、挿入及び／又は欠失により改変され得る。プロモーターの活性がそれらの配列の改変により増加するか、又はそれらが、より活性があるプロモーター、異種生物由来のプロモーターにすら完全に置換されることがさらに可能である。植物中の発現には、核酸分子は、本明細書に記載される通り、正しい時点で及び要求される空間的発現パターンを有する遺伝子を発現する好適なプロモーターに作動可能に連結されるか又はそれを含まなければならない。

本明細書に使用されるプロモーターは、広く、構成的プロモーター、ユビキタスプロモーター、発生学的に制御されたプロモーター、誘導性プロモーター、臓器特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、緑色組織特異的プロモーター、***組織特異的プロモーターなどを包含する。「ユビキタスプロモーター」は、生物の実質的に全ての組織又は細胞中で活性がある。

機能的に均等なプロモーターの特定のために、候補プロモーターのプロモーター強度及び／又は発現パターンが、例えば、プロモーターをレポーター遺伝子に作動可能に連結し、植物の種々の組織中のレポーター遺伝子の発現レベル及びパターンをアッセイすることにより分析され得る。一般的に、「弱いプロモーター」は、コード配列の発現を低レベルで促進するプロモーターであると意図される。「低レベル」は、１細胞あたり約１／１０，０００転写産物、約１／１００，０００転写産物、約１／５００，００００転写産物のレベルと意図される。反対に、「強いプロモーター」は、コード配列の発現を、高レベル又は１細胞あたり約１／１０転写産物、約１／１００転写産物、約１／１０００転写産物で促進する。一般的に、「中強度のプロモーター」は、コード配列の発現を強いプロモーターよりも低いレベルで促進するプロモーターであると意図される。

ターミネーター
用語「ターミネーター」は、一次転写産物の３’プロセシング及びポリアデニル化並びに転写の停止のシグナルを出す転写ユニットの末端のＤＮＡ配列である制御配列を包含する。ターミネーターは、天然の遺伝子から、種々の他の植物遺伝子から又はＴ－ＤＮＡから誘導できる。加えられるターミネーターは、例えば、ノパリンシンターゼ若しくはオクトピンシンターゼ遺伝子から、又は代わりに別の植物遺伝子から、又は好ましさは低下するが、あらゆる他の真核生物の遺伝子から誘導され得る。

レポーター遺伝子
「選択マーカー」、「選択マーカー遺伝子」又は「レポーター遺伝子」は、それが発現される細胞に表現型を与えて、本発明の核酸コンストラクトにより形質移入又は形質転換された細胞の特定及び／又は選択を容易にするあらゆる遺伝子を含む。これらのマーカー遺伝子により、一連の異なる原理による核酸分子の伝播の成功の特定が可能になる。好適なマーカーは、抗生物質若しくは除草剤耐性を付与するマーカー、新たな代謝的特性を導入するマーカー又は視覚による選択を可能にするマーカーから選択され得る。選択マーカー遺伝子の例としては、カナマイシン（ＫＡＮ）又はハイグロマイシン（Ｈｙｇ）などの抗生物質に対する耐性を与える遺伝子がある。視覚的マーカー遺伝子の発現は、蛍光の形成をもたらす（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ；赤色蛍光タンパク質、ＲＦＰ；及びそれらの誘導体）。このリストは、少数の可能性のあるマーカーを表すに過ぎない。当業者はそのようなマーカーを熟知している。生物及び選択方法に応じて、異なるマーカーが好ましい。

発現／遺伝子発現
用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特定の遺伝子又は複数の特定の遺伝子又は特定の遺伝子コンストラクトの転写を意味する。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、詳細には、ＲＮＡの翻訳及びそれによりコードされたタンパク質／酵素の合成、すなわちタンパク質／酵素発現を意味する。

同一性／相同性パーセント
本明細書で使用される通り、配列同一性、相同性又は「同一性パーセント」は、２つの最適にアラインメントされたＤＮＡ又はタンパク質セグメントが、成分の、例えばヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を意味する。試験配列と参照配列のアラインメントされたセグメントの「同一性割合」は、２つのアラインメントされたセグメントの配列により共有される同一な成分の数を、試験配列全体と参照配列全体の小さい方であるアラインメントのウィンドウにわたる参照セグメント中の配列成分の総数で割ったものである。「同一性パーセント」（「同一性％」）は同一性割合を１００倍したものである。

導入／実装／形質転換
本明細書に言及される用語「導入」、「実装」又は「形質転換」は、伝播に使用される方法を問わず、外因性のポリヌクレオチドの宿主細胞への伝搬を包含する。

器官形成によるか又は胚発生によるかに関わらず、その後のクローン増殖が可能である植物組織は、本発明の遺伝子コンストラクト及びそれから再生された植物全体により形質転換され得る。選択される特定の組織は、形質転換されている特定の種に利用可能であり、及び最適なクローン増殖システムに応じて変わるであろう。例示的な組織標的としては、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の***組織（例えば、頂端***組織、腋芽及び根***組織）及び誘導***組織（例えば、子葉***組織及び胚軸***組織）がある。ポリヌクレオチドは、一時的又は安定的に宿主細胞に導入され得、例えばプラスミドとして一体化されずに維持され得る。代わりに、それは宿主ゲノムに一体化され得る。次いで、生じた形質転換された植物細胞は、当業者に公知な方法で形質転換された植物を再生するために使用され得る。代わりに、植物に再生されることができない植物細胞は、宿主細胞として選択され得、すなわち生じた形質転換された植物細胞は植物（全体）に再生する能力がない。

外来遺伝子の植物のゲノムへの伝播は、形質転換と呼ばれる。植物種の形質転換は現在かなり定型的な技法である。有利には、いくつかの形質転換方法のいずれも、目的遺伝子を好適な原細胞に導入するために使用され得る。形質転換及び植物組織又は植物細胞からの植物の再生に関して記載される方法は、一過性又は安定的な形質転換に利用され得る。形質転換方法としては、リポソーム、電気穿孔、遊離のＤＮＡの取込みを増加させる化学物質、ＤＮＡの直接植物への注入、パーティクルガンボンバードメント、ウイルス又は花粉を使用する形質転換及びマイクロプロジェクションの使用がある。遺伝子導入作物を含む遺伝子導入植物は、好ましくは、アグロバクテリウム媒介性形質転換により製造される。有利な形質転換方法は、植物体中の形質転換である。この目的のために、例えば、アグロバクテリアに植物種子に作用させるか、又は植物***組織にアグロバクテリアを植菌することが可能である。形質転換されたアグロバクテリアの懸濁液を完全なままの植物又は少なくとも花原基に作用させることが、本発明に従って特に有利であることが分かった。その後、植物を、処理された植物の種子が得られるまで成長させる（Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743）。発現されるべき核酸又はコンストラクトは、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を形質転換するのに好適であるベクター、例えばpBinl9（Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711）中にクローニングされる。次いで、そのようなベクターにより形質転換されたアグロバクテリアを、例えば、傷つけた葉又はみじん切りにした葉をアグロバクテリア溶液に浸し、次いで、それらを好適な培地中で培養することにより、シロイヌナズナのようなモデルとして使用される植物（アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）は、作物とは考えられず本発明の範囲内にある）又は例としてはタバコ植物などの作物などの植物の形質転換の公知の方法で使用できる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）による植物の形質転換は、例えば、Hofgen and WillmitzerによりNucl. Acid Res. (1988) 16, 9877に記載されるか、又はとりわけTransgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38中のF. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plantsから公知である。

倍数性／倍数性レベル／染色体倍数性／多倍数性
倍数性又は染色体倍数性は、細胞の核に存在する染色体の完全なセットの数を指す。体性細胞、組織及び個別の生物は、存在する染色体のセットの数（「倍数性レベル」）：一倍体（１セット）、二倍体（２セット）、三倍体（３セット）、四倍体（４セット）、五倍体（５セット）、六倍体（６セット）、七倍体（heptaploid）又は七倍体（septaploid）（７セット）などに従って説明され得る。遺伝子用語多倍数性は、３つ以上の染色体セットを有する細胞を説明するように本明細書で使用される。

調節
用語「調節」は、発現又は遺伝子発現に関連して、発現レベルが前記遺伝子発現により対照植物と比べて変化するプロセスを意味し、発現レベルは増加することも減少することもある。元の未調節の発現は、構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）又はその後の翻訳を有するｍＲＮＡのあらゆる種類の発現であり得る。本願の目的では、元の未調節の発現は、発現が全くないこともある。用語「活性を調節すること」又は用語「発現を調節すること」は、増加若しくは減少した種子収量などがあるが、これに限定されない増加若しくは減少した収量関連特質及び／又は増加若しくは減少した植物の成長をもたらす、標的核酸配列及び／又はコードされたタンパク質の発現のあらゆる変化を意味するものとする。発現は、零（無いか又は計測不能な発現）から特定の量に増加することも、特定の量から計測不能な少量又は零に減少することもある。

一般的に、形質転換後、植物細胞又は細胞集団は、目的遺伝子と同時に伝播された、植物に発現可能な遺伝子によりコードされる１種以上のマーカーの存在に関して選択され、その後、形質転換された物質が植物全体に再生される。形質転換された植物を選択するために、形質転換において得られた植物材料は、通例、形質転換された植物を形質転換されていない植物から区別できるように、選択的条件に付される。例えば、上述の方法で得られた種子は、植えられて、初期の成長期後、噴霧により好適な選択に付され得る。さらなる可能性は、形質転換された種子のみが植物に成長できるように、適切な場合滅菌後、好適な選択剤を使用して種子を寒天プレート上で成長させることを含む。代わりに、形質転換された植物は、本明細書に記載されるものなどの選択マーカーの存在に関してスクリーニングされる。

ＤＮＡ伝播及び再生後、形質転換されたと推定される植物は、目的遺伝子の存在、コピー数及び／又はゲノム機構に関しても評価され得る。

生じた形質転換された植物は、クローン増殖又は古典的な繁殖技法によるなど、種々の手段により繁殖され得る。例えば、第一世代（又はＴ１）の形質転換された植物は自家受粉され得、ホモ接合型第二世代（又はＴ２）の形質転換体が選択され、次いで、Ｔ２植物が古典的な繁殖技法によりさらに繁殖され得る。生じた形質転換された生物は、種々の形態をとり得る。例えば、それらは、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞のキメラ；クローン性形質転換体（例えば、全ての細胞が発現カセットを含むように形質転換された）；形質転換された組織と形質転換されていない組織のグラフト（例えば、植物中で、形質転換されていない接ぎ穂にグラフトされた形質転換された台木）であり得る。

本願全体にわたり、コンストラクトと共に形質転換されたか若しくはコンストラクトにより交換可能に形質転換されたか、又は核酸と共に若しくは核酸により形質転換された植物、植物部分、種子又は植物細胞は、バイオテクノロジー手段による前記コンストラクト又は前記核酸の導入の結果のために、導入遺伝子として、前記コンストラクト又は前記核酸を有する植物、植物部分、種子又は植物細胞を意味すると理解されるものとする。したがって、植物、植物部分、種子又は植物細胞は、前記発現カセット、前記組換えコンストラクト又は前記組換え核酸を含む。

モグロシドの生合成経路
図１は、シライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii）からのモグロシド生合成経路を示す（Itkin et al., Proc Nat Acad Sci USA, 2016; 113:E7619-E7628; Seki et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2018 VOL. 82, NO. 6, 927-934）。酵素スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）、ククルビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）及びエポキシヒドロラーゼ（ＥＰＨ）は、モグロール前駆体を産生して、モグロールに転化する連続ステップに関与している。酵素経路の中間生成物としてのモグロール前駆体としては、２，３－オキシドスクアレン、２，３；２２．２３－ジオキシドスクアレン、２４，２５－エポキシククルビタジエノール及び２４，２５－ジヒドロキシククルビタジエノールがあるが、これらに限定されない。モグロシド生合成経路の特性の１つは、オキシドスクアレンシクラーゼであるＣＤＳが、２，３；２２，２３－ジエポキシスクアレンをその基質として使用して、２４，２５－エポキシククルビタジエノールをもたらすことである。ゲノム分析は、Ｓ．グロスベノリイ（S. grosvenorii）が、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）をコードし得る５種の遺伝子を有することを明らかにした。これらのうちの２種は、ＣＤＳ、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８７Ｄ１８）及びエポキシヒドロラーゼ（ＥＰＨ）と同様に、果実発生の初期段階中に強く発現され、その後のステップを触媒し、２，３；２２，２３－ジエポキシスクアレンの産生に関与していると予測される。Ｓ．グロスベノリイ（S. grosvenorii）ゲノムは、２４，２５－エポキシククルビタジエノールの２４，２５－ジヒドロキシククルビタジエノールへの転化を触媒するエポキシドヒドロラーゼをコードする８種の遺伝子を含む。重要なことに、本開示によるモグロシドの酵素経路は、図１ａに示される機構に限定されない。他のテルペン構造、モグロール前駆体、酵素により触媒される反応又は転化機構も可能性がある。特定の酵素は、２種類以上の反応を触媒し得る。例えば、シトクロムＰ４５０酵素は、ククルビタジエノールの１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノール又は１１－オキソ－ククルビタジエノールへの転化、２４，２５－エポキシククルビタジエノールの１１－ヒドロキシ－２４，２５エポキシククルビタジエノールへの転化を触媒する。いくつかの関連する実施形態において、非ラカンカのウリ科の植物は、トリテルペンなどの中間体の少なくとも１つが細胞経路に存在するため、モグロールに類似した四環式トリテルペノイド化合物を作ることができる。さらに、四環式トリテルペノイドを修飾するための関連する経路がレダクターゼなどの関連する酵素を必要とすることを考えると、これらの関連植物は、これらの関連するネットワーク酵素を既に発現されている。他の関連する実施形態において、さらなる遺伝子が、モグロール、モグロシド及びモグロシド系甘味料をもたらすために、中間代謝物産生又は関連酵素を可能にするために上方制御され得る機能性を有する非ウリ科又は天然の酵素に導入され得る。

モグロールの形成後、一連のグリコシル化が起こり、グルコース分子をＣ－３位及びＣ－２４位で付加して、種々のグリコシル化度を有するモグロシドＩ～ＶＩをもたらす。ローマ数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶは、それぞれ対応するグリコシル化されたモグロシド、イソモグロシド又はオキソモグロシド中のグルコース単位の数を表す。２種のウリジンホスホリラーゼ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）が、これらのステップに寄与することが示された。それらの１つはＵＧＴ７２０－２６９－１であり、果実発生の初期段階に強く発現され、１つのグルコース分子をそれぞれモグロールのＣ－２４及びＣ－３位のヒドロキシル基に転移させて、中間体としてのモグロシドＩ－Ａ１（Ｃ－２４グルコシル化）を経てモグロシドＩＩＥ（Ｃ－３及びＣ－２４グルコシル化）をもたらす。第２のＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－３であり、果実発生後の段階で強く発現され、糖を、既にアクセプター分子上に存在する他の糖に付加する。ＵＧＴ９４－２８９－３は、１つのグルコース分子を、ＵＧＴ７２０－２６９－１により先に付加されたモグロシドＩＩＥのＣ－２４グルコースのそれぞれＣ－２’及びＣ－６’位に付加することが示された。ＵＧＴ９４－２８９－３は、モグロシドＩＩＥのＣ－３位に結合したグルコースのＣ－６’位にもグルコース分子を付加し、それにより、３つ以上の糖転移反応を連続的に触媒して、５つ以上のグルコース単位を有するモグロシドをもたらす。

他の天然植物も、その天然のゲノムにより、モグロール前駆体を産生する酵素を発現し得るが、これらの植物が、モグロシドを産生するために要求される組織的な方法で全ての酵素を天然に産生するわけではないことに留意することが重要である。例えば、図１ｂに示されるように、キュウリ、メロン及びスイカなどの植物は、シライティア由来のモグロール又はメロン由来のククルビタシンの共通の前駆体、ククルビタジエノールを産生することが可能なククルビタジエノールシンターゼを天然に発現する。しかし、ククルビタジエノールスキャホールドを変えることが可能なシトクロムＰ４５０酵素のような他の酵素は（Banerjee et al., Phytochem. Rev. 2018, 17:81-111）、この中間体を他のテルペン誘導体に向け直す。これらの非シライティア植物は、他のシトクロムＰ４５０、ヒドロラーゼ、エポキシダーゼ及びグリコシラーゼ遺伝子を有し、その酵素産物が活性において種々雑多であり得、モグロシド経路のための組織化された方法で発現されないこともあるため、そのような植物は、モグロシド経路のための酵素を有し得る。したがって、組換え、遺伝子編集又は他の現代の植物育種技術のいずれかによるこれらの非シライティア植物のゲノムに対する変化は、これらの非シライティア植物がモグロール及びモグロシドを産生し始めることを可能にし得る。

本明細書で使用される通り、用語「モグロシド経路酵素」は、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド並びにその代謝物及び／又は誘導体を産生する生合成反応を触媒又は促進することが可能なあらゆる酵素を包含する。そのようなモグロシド経路酵素としては、ＣＤＳ、ＳＱＥ、ＥＰＨ、シトクロムＰ４５０及びＵＧＴのそれぞれの酵素ファミリーがあるが、これらに限定されない。

モグロール前駆体は、２，３－オキシドスクアレン、２，３；２２．２３－ジオキシドスクアレン、２４，２５－エポキシククルビタジエノール及び２４，２５－ジヒドロキシククルビタジエノール、ククルビタジエノール、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノール、１１－オキソ－ククルビタジエノールなどを含むが、これらに限定されない、図１ａ及び１ｂに示される酵素経路のモグロール生成物の産生に向けた、可能性がある全てのテルペン誘導体及び中間生成物を広く包含する。本開示によるモグロシドは、シアメノシドＩ、シラトース（シアメノシドＩの立体異性体）、モグロシドＶＩ、モグロシドＶ、イソモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＡを含むが、これらに限定されないモグロールのあらゆる可能性のあるグリコシル化生成物を指す。これらの構造の一部は図２に示される。モグロシドの他の例には、モグロシドＩＩＢ、７－オキソモグロシドＩＩＥ、１１－オキソモグロシドＡ１、モグロシドＩＩＩ Ａ２、１１－デオキシモグロシドＩＩＩ、１１－オキソモグロシドＩＶＡ、７－オキソモグロシドＶ及び１１－オキソ－モグロシドＶがあるが、これらに限定されない。本開示によるモグロシドの代謝物及び誘導体は、代謝反応、天然に存在する反応又は天然に存在しない反応によるモグロシドのあらゆる近い変種を指す。モグロシドの誘導体は、標準的なモグロシドと比べて、原子又は官能基の欠失、変更又は付加を含み得る。しかし、モグロシドの代謝物及び誘導体は、標準的なモグロシドの実質的に同じ機能及び特性を保っている。

図面の簡単な説明
シライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii）中のモグロール及びモグロシドの産生の報告された酵素経路を示す。（Seki et al Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2018 VOL. 82, NO. 6, 927-934）。 数種の天然植物中のモグロール前駆体の産生の酵素経路を示す。（Banerjee et al., Phytochem. Rev. 2018, 17:81-111）。 モグロール及びそれから誘導された選択されたモグロシドの構造を示す。 モグロシド経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む種々の発現カセットの設計を示す。 モグロシド標準品の超高速液体クロマトグラフィー－飛行時間質量分析法（ＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ）結果を示す。 それぞれ発現カセットpBing008及びpBing024により形質転換された遺伝子導入植物ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩ検出の、対照植物ｐ０１９と比べたＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（保持時間）分析結果を示す。 発現カセットpBing003及びpBing007により同時形質転換された遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉並びに発現カセットpBing006及びpBing015により同時形質転換された遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩ検出の、対照植物ｐ０１９と比べたＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（保持時間）分析結果を示す。 発現カセットpBing008により形質転換された遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩ検出のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（保持時間）結果を示す。 発現カセットpBing008により形質転換された遺伝子導入植物ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩ検出のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（ＭＳスペクトル）結果を示す。 発現カセットpBing008により形質転換された遺伝子導入植物ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩ検出のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（ＭＳスペクトル）結果を示す。 スイカ及びその種々の果実部分の解剖の写真画像を示す。 実施例４による種々の果実組織中の発色遺伝子ＰＳＹ１の発現を示す。 実施例４によるシュガーベビースイカの種々の組織中の表５の８種の特定された組織特異的遺伝子の発現を示す。 実施例４によるチャールストングレースイカの種々の組織中の表５の８種の特定された組織特異的遺伝子の発現を示す。 種々の遺伝子導入スイカ試料（pBing008により形質転換された）中のタンパク質検出の分析結果を示す。 発現カセットpBing008による形質転換により作られた遺伝子導入スイカ中のタンパク質検出の化学発光結果を示す。 発現カセットpBing008による形質転換により作られた遺伝子導入スイカ試料００８ＳＢＥ４－１の種々の組織中のタンパク質検出の分析結果を示す。 発現カセットpBing008による形質転換により作られた遺伝子導入スイカ試料００８ＳＢＥ５－４の種々の組織中のタンパク質検出の分析結果を示す。 発現カセットpBing008による形質転換により作られた遺伝子導入スイカ試料００８ＣＨＥ４－１３の種々の組織中のタンパク質検出の分析結果を示す。 発現カセットpBing008による形質転換により作られた遺伝子導入スイカ試料００８ＣＨＥ４－１６の種々の組織中のタンパク質検出の分析結果を示す。 発現カセットpBing008を含む遺伝子導入スイカの、対照と比較したＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ結果を示す。 発現カセットpBing008を含む遺伝子導入スイカのＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（ＭＳスペクトル）結果を示す。 遺伝子導入スイカ００８ＣＨ４－１９の果実からの試料抽出物のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ結果を示す。 遺伝子導入スイカ００８ＣＨ４－１９の果実抽出物試料に対する対照試料のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ結果を示し、対照試料は、作られ、１００ｎｇ／ｍｌモグロシドＩＩＥによりスパイクされた野生型で未改変の果実の抽出物である。 いずれも発現カセットpBing008を含む遺伝子導入スイカ試料００８ＳＢＥ５－２及び００８ＣＨＥ４－５からの種皮のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ結果を示す。 いずれも発現カセットpBing008を含む遺伝子導入スイカ試料００８ＳＢＥ５－２及び００８ＣＨＥ４－５からの種皮のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ結果を示す。 ３１個の遺伝子導入スイカ葉、果実中のＣＤＳ遺伝子発現レベルの比較を示す。ＣＤＳの発現レベルは、ＲＴ－ＰＣＲにより分析され、アクチン発現の１０％（１と設定）に対して標準化された。橙色の棒は、果実の発現値を表し、青色の棒は、葉の発現値を表す。 実施例６による３１個の遺伝子導入スイカ葉、果実中のＣＹＰ８７遺伝子発現レベルの比較を示す。ＣＹＰ８７の発現レベルは、ＲＴ－ＰＣＲにより分析され、アクチン発現の１０％（１と設定）に対して標準化された。橙色の棒は、果実の発現値を表し、青色の棒は、葉の発現値を表す。 実施例６による３１個の遺伝子導入スイカ葉、果実中のＳＱＥ遺伝子発現レベルの比較を示す。ＳＱＥの発現レベルは、ＲＴ－ＰＣＲにより分析され、アクチン発現の１０％（１と設定）に対して標準化された。橙色の棒は、果実の発現値を表し、青色の棒は、葉の発現値を表す。 実施例６による３１個の遺伝子導入スイカ葉、果実中のＥＰＨ遺伝子発現レベルの比較を示す。ＥＰＨの発現レベルは、ＲＴ－ＰＣＲにより分析され、アクチン発現の１０％（１と設定）に対して標準化された。橙色の棒は、果実の発現値を表し、青色の棒は、葉の発現値を表す。 実施例６による３１個の遺伝子導入スイカ葉、果実中のＥＰＨ遺伝子発現レベルの比較を示す。ＥＰＨの発現レベルは、ＲＴ－ＰＣＲにより分析され、アクチン発現の１０％（１と設定）に対して標準化された。橙色の棒は、果実の発現値を表し、青色の棒は、葉の発現値を表す。 標準的なモグロシドＩＩＥのＵＰＬＣ－ＭＳ分析による分析結果を示す。左に示されるのは、３つの異なる濃度のモグロシドＩＩＥ：１０００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ及び２５０ｐｇ／ｍｌの３つのクロマトグラムの重ね合わせである。右に示されるのは、フラグメンテーション後のモグロシドＩＩＥ標準品の特徴的イオンピークである。 実施例６によるＴ０スイカ果実試料００８ＣＨＥ４－１９の代謝物抽出物中のモグロシドＩＩＥの検出の分析結果を示す。ＬＣ－ＭＳの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ ４２３．３６）が左に示される。質量分析フラグメントのイオン強度が右に示される。 実施例６によるＴ１遺伝子導入スイカの試料中のＣＤＳ遺伝子発現の結果を示す。３２個の遺伝子導入植物試料からのＤＮＡは、マルチプレックス－ＰＣＲを使用して増幅された。全試料の正体及び遺伝子型決定結論が左右の表に列記された。 実施例６によるＴ１スイカ果実試料００８ＤＬＥ１１－４－Ｓ４の代謝物抽出物中のモグロシドＩＩＥの検出の分析結果を示す。ＬＣ－ＭＳの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ ４２３．３６）が左に示される。質量分析フラグメントのイオン強度が右に示される。 実施例６によるＴ１スイカ果実試料００８ＤＬＥ１１－２－Ｓ１の代謝物抽出物中のモグロシドＩＩＥの検出の分析結果を示す。ＬＣ－ＭＳの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ ４２３．３６）が左に示される。質量分析フラグメントのイオン強度が右に示される。 実施例６によるＴ１スイカ果実試料００８ＤＬＥ１１－９－Ｓ３の代謝物抽出物中のモグロシドＩＩＥの検出の分析結果を示す。ＬＣ－ＭＳの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ ４２３．３６）が左に示される。質量分析フラグメントのイオン強度が右に示される。

詳細な説明
本明細書は、一般的に、モグロール／モグロシド経路酵素及びモグロシドを製造するための遺伝子導入植物及びその生合成システム並びにそのような遺伝子導入植物を製造する方法を記載する。以下の項は、主題を詳細に説明する実施形態を提供する。

発現カセット及びベクターの構築
いくつかの実施形態において、本開示は、ゲノム変換事象を含む遺伝子導入植物であって、ゲノム変換事象は、モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらし、遺伝子導入植物は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する、遺伝子導入植物を説明する。

他の関連実施形態において、本開示は、ゲノム変換事象を含む遺伝子編集された植物であって、ゲノム変換事象は、モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらし、遺伝子導入植物は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する、遺伝子編集された植物を説明する。少なくともこれらの実施形態において、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及びメガヌクレアーゼ（ＭＮ）などの種々のゲノム編集ツールが使用されて、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を有する所望の植物を得ることができる。

本明細書にさらに記載される通り、遺伝子編集された植物は、配列番号１～３１を含み得る。いくつかの例の実施形態において、遺伝子編集された植物は、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の１つ以上を含む発現カセット又は形質転換事象を含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、非天然のモグロール前駆体及び／又はモグロールを含む遺伝子導入植物であって、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する遺伝子導入植物を説明する。

いくつかの実施形態において、本開示による遺伝子導入植物は、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む発現カセットを含むゲノム変換事象を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物の発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の１つ以上を含む。

本明細書での発現カセットは、植物形質転換前に好適な組換え遺伝子技法により設計され、構築された。

遺伝子導入植物のいくつかの実施形態において、発現カセット中の配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；又は配列番号５に示されるヌクレオチド配列は、ＣＤＳ、シトクロムＰ４５０、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＵＧＴ及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードすることが可能である。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、プロモーター、目的ヌクレオチド配列、エピトープタグ、ターミネーター、スペーサー及びこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む。

特定の実施形態において、発現カセットは、１つ以上のプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のプロモーターは、強いプロモーターである。他の実施形態において、１つ以上のプロモーターは、弱いプロモーターである。さらに他の実施形態において、１つ以上のプロモーターは、配列番号６～１７に示される１つ以上のヌクレオチド配列を有する。さらに他の実施形態において、１つ以上のプロモーターは、配列番号６～１７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のヌクレオチド配列を有する。

特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号１８～２２に示される１つ以上のヌクレオチド配列を有する１つ以上のエピトープタグをさらに含む。他の実施形態において、１つ以上のエピトープタグは、配列番号１８～２２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のヌクレオチド配列を有する。

特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号２３～２７に示される１つ以上のヌクレオチド配列を有する１つ以上のターミネーターをさらに含む。他の実施形態において、１つ以上のターミネーターは、配列番号２３～２７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のヌクレオチド配列を有する。

図３は、本開示による発現カセットのいくつかの非限定的な例の設計を示す。目的遺伝子のそれぞれ、例えばＣＤＳをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター配列及びエピトープタグをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、エピトープは、ターミネーター配列に作動可能に連結されており、それによりプロモーター－ＣＤＳ－エピトープタグ－ターミネーターとして発現可能な遺伝子を形成する。そのような「発現可能な遺伝子」は、スペース配列（スペーサー）により作動可能に連結されるものによりさらに改変されて、発現又は「発現カセット」により産生される酵素産物を変更し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物の発現カセットは、１つ以上の発現可能な遺伝子及び１つ以上のスペーサーを含み、各発現可能な遺伝子は、ＣＤＳをコードするヌクレオチド配列、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８７Ｄ１８）をコードするヌクレオチド配列、ＥＰＨをコードするヌクレオチド配列、ＳＱＥをコードするヌクレオチド配列、ＵＧＴ７２０をコードするヌクレオチド配列及びこれらの組合せからなる群から選択される目的遺伝子配列を含む。

いくつかの実施形態において、本開示の発現カセットは、１つ以上のレポータータンパク質をコード及び発現する１つ以上のレポーター遺伝子配列をさらに含む。レポータータンパク質としては、カナマシン耐性タンパク質（ＫＡＮ）、ハイグロマイシン耐性タンパク質（Ｈｙｇ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び緑色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）があるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、１つ以上のレポーター遺伝子は、配列番号２８～３１に示される１つ以上のヌクレオチド配列を有する。他の実施形態において、１つ以上のレポーター遺伝子は、配列番号２８～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列番号２８は、ＫＡＮをコードすることが可能であり、ヌクレオチド配列番号２９は、Ｈｙｇをコードすることが可能であり、ヌクレオチド配列番号３０は、ＧＦＰをコードすることが可能であり、ヌクレオチド配列番号３１は、ＲＦＰコードすることが可能である。特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号２８～３１に示されるヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む。他の実施形態において、遺伝子導入植物の発現カセットは、配列番号２８～３１に示されるヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも２つのレポーター遺伝子を含む。

表１は、本願の発現カセットを表す種々の非限定的な例を示す。表２は、５種のプロモーター配列、５種のプロテインタグ、５種のターミネーター配列及び５種の目的導入遺伝子を含む発現カセットpBing008の成分を示す。

例の実施形態として、発現カセットpBing008は、プロモーター配列、モグロシド経路酵素をコードするヌクレオチド配列、エピトープタグをコードするヌクレオチド配列、ＧＦＰ及びＨｙｇをコードするレポーター遺伝子並びにターミネーター配列を含む。

pBing008において、ヌクレオチド配列番号１はＣＤＳをコードし；ヌクレオチド配列番号２はシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８７Ｄ１８）をコードし；ヌクレオチド配列番号３はＥＰＨをコードし；ヌクレオチド配列番号４はＳＱＥをコードし；配列番号５のヌクレオチドはＵＧＴ７２０をコードし；配列番号６のヌクレオチドはプロモーターＴＣＴＰを表し；配列番号７のヌクレオチドはプロモーターＦｓｇｔ－ＰＦｌｔを表し；配列番号８のヌクレオチドはプロモーターＣｓＶＭＶを表し；配列番号９のヌクレオチドはプロモーターＨＬＶ Ｈ１２を表し；配列番号１０のヌクレオチドはプロモーターＰＣＬＳＶを表し；配列番号１１のヌクレオチドはプロモーターＭＭＶを表し；配列番号１２のヌクレオチドはプロモーターＣａＭＶ ｅ３５Ｓを表し；配列番号１８のヌクレオチドはプロテインタグＭＹＣを表し；配列番号１９のヌクレオチドはプロテインタグＨＳＶを表し；配列番号２０のヌクレオチドはプロテインタグＦＬＡＧを表し；配列番号２１のヌクレオチドはプロテインタグＨＡを表し；配列番号２２のヌクレオチドはプロテインタグＶ５を表し；配列番号２３のヌクレオチドはターミネーターＣａＭＶ ３５Ｓを表し；配列番号２４のヌクレオチドはターミネーターＵＢＱ３を表し；配列番号２５のヌクレオチドはターミネーターＨＳＰ１８．２を表し；配列番号２６のヌクレオチドはターミネーターＰｅａ３Ａを表し；配列番号２７のヌクレオチドはターミネーターＥ９を表し；配列番号２８のヌクレオチドはレポータータンパク質Ｈｙｇをコードし；配列番号２９のヌクレオチドはレポータータンパク質ＧＦＰをコードする。

特に、発現カセットpBing008は、以下の７つの発現可能な遺伝子を含む：
プロモーターＴＣＴＰ－ＣＤＳをコードするヌクレオチド配列－エピトープタグＭＹＣをコードするヌクレオチド配列－ターミネーターＣａＭＶ ３５Ｓ；
プロモーターＦｓｇｔ－ＰＦｌｔ－シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８７Ｄ１８）をコードするヌクレオチド配列－エピトープタグＨＳＶをコードするヌクレオチド配列－ターミネーターＵＢＱ３；
プロモーターＣｓＶＭＶ－ＥＰＨ３をコードするヌクレオチド配列－エピトープタグＦＬＡＧをコードするヌクレオチド配列－ターミネーターＨＳＰ１８．２；
プロモーターＨＬＶ Ｈ１２－ＳＱＥをコードするヌクレオチド配列－エピトープタグＨＡをコードするヌクレオチド配列－ターミネーターＰｅａ３Ａ；
プロモーターＰＣＬＳＶ－ＵＧＴ７２０をコードするヌクレオチド配列－エピトープタグＶ５をコードするヌクレオチド配列－ターミネーターＥ９；
プロモーターＭＭＶ－ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列；
プロモーターＣａＭＶ ｅ３５Ｓ－Ｈｙｇをコードするヌクレオチド配列、
ここで、上記７種の発現可能な遺伝子は、スペーサーにより作動可能に連結されて、一体化された発現カセットpBing008を形成する。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、宿主細胞による酵素産生が可能となるようにプラスミドで運搬される。他の実施形態において、発現カセットは、染色体への一体化を可能にするベクターで運搬され、それにより、酵素が染色体から発現されることが可能になる。

植物系統の構築及び形質転換
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子導入植物を製造する方法は、植物系統を構築すること及び選択された天然植物を、本開示により製造された発現カセットにより形質転換することに関連する。

モグロール／モグロシド経路酵素の天然の発現及び天然のモグロール／モグロシドの天然の産生は、シライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii）中でのみ利用可能であることが一般的に公知である。本願のいくつかの実施形態において、モグロール／モグロシド経路酵素をコードするヌクレオチド配列により形質転換されるように選択された天然植物はシライティア・グロスベノリイ（Siraitia grosvenorii）ではない。詳細には、形質転換前の天然植物は、それらの天然のゲノムにより、モグロール／モグロシド経路酵素の全てを天然に産生するのではなく、モルゴール及びモグロシドを産生しない。いくつかの実施形態において、天然植物ですら、その天然のゲノムにより、モグロール前駆体又はモグロールを産生することが可能な１種以上の酵素を産生し得るが、これらの植物は、非天然のモグロシドを天然に産生しない。特定の実施形態において、形質転換のために選択された天然植物としては、その天然のゲノムにより、検出可能なモグロール又はモグロシドを天然に産生しない野生型若しくは未形質転換又は非形質転換スイカがある。

モグロシドの速い産生を可能にする成長が速い経済的な果実、野菜又は植物の形質転換が、効率及びコストに関してより興味深い。成長が速い植物の非限定的な例は、ブッシュチェリー、モモ及びネクタリン、アプリコット、ダイコン、プラム及びそれらの類縁物、サワー（パイ）チェリー、リンゴ、西洋ナシ、スイートチェリー、柑橘類、キュウリ、ズッキーニ、エンドウ豆、カブなどである。

本開示による遺伝子導入植物は、植物をゲノム変換事象と組み合わせ、それにより遺伝子導入植物を形成することにより製造されるが、ここで、ゲノム変換事象は、モグロール／モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす。いくつかの実施形態において、植物をゲノム変換事象と組み合わせることは、以下の方法の１種以上を使用して実施される：リポソームの使用、電気穿孔の使用、遊離のＤＮＡの取込みを増加させる化学物質の使用、ＤＮＡの直接植物への注入の使用、パーティクルガンボンバードメントの使用、ウイルス若しくは花粉を使用する形質転換の使用、マイクロプロジェクションの使用又はアグロバクテリウム媒介性形質転換の使用。好ましくは、遺伝子導入植物は、アグロバクテリウム媒介性形質転換方法によって製造される。いくつかの実施形態において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）は発現カセットにより形質転換されて、遺伝子導入アグロバクテリウムが作製され、次いでそれが使用されて目的植物が形質移入され、問題なく形質転換された植物が、発現カセット中のレポーター遺伝子の発現に基づいて選択される。

いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物は、一過性形質転換により製造されたニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）である。最初に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）ステインＥＨＡ１０５が、Weigel et. al. (Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method, CSH Protoc. 2006 Dec 1; 2006(7)）により報告されたフリー解凍法を利用して、本願の発現カセットにより形質転換された。簡単に述べると、ケミカルコンピテントなアグロバクテリウムが調製された。発現カセットの添加後、混合物を交互に液体窒素中で凍結し、液体に解凍した。次いで、細胞は、溶原ブロス（ＬＢ）培地中で回復され、選択された抗生物質を有するＬＢプレートに播種された。

第２に、ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物が感染された。簡単に言うと、形質転換されたＥＨＡ１０５アグロバクテリウムを成長させて、ふさわしい集団／培養物が生成された。適切な成熟度を有する選択されたニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物が形質転換のために選択された。適切な量の形質転換されたアグロバクテリウム培養物が、完了のしるしがあるまでニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物の組織にロードされた。形質転換されたアグロバクテリウム培養物がロードされた植物を適切な期間成長させてから、サンプリング及び選択をした。

第３に、問題なく形質転換されたニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物を、発現カセット中のレポーター遺伝子の発現を有する葉に基づいて選択した。

遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物の特定の実施形態において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）ステインＥＨＡ１０５を形質転換し、遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物をもたらすのに使用された発現カセットはpBing008であった。他の実施形態において、使用された発現カセットは、表１に示されるものから選択された。いくつかの実施形態において、発現カセットのレポーター遺伝子はＧＦＰであり、形質転換されたニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物の選択は、ＧＦＰの発現を有するその葉に基づいていた。

他の実施形態において、遺伝子導入植物は遺伝子導入スイカ（シトルルス・ラナツス（Citrullus lanatus））であり、それは、以下の方法によって製造された。簡単に言うと、第１に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）ステインＥＨＡ１０５は、同じフリー解凍法を使用して本願の発現カセットにより形質転換された。第２に、適切な成熟度を有するスイカ苗が、形質転換のための外植片を調製するために使用された。子葉は胚軸から切り取られ、回収され、形質転換のために適切に処理された。次いで、形質転換されたアグロバクテリウム培養物が、これらの外植片に加えられた。感染後、外植片は滅菌されたペーパータオル上で乾かされ、ムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地を有するプレートに移された。プレートは密封され、適切な期間同時培養された。同時培養後、外植片はグロースチェンバーに移され、閾値含量の選択された抗生物質の選択の下で成長した。

特定の遺伝子導入スイカ実施形態において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）ステインＥＨＡ１０５を形質転換し、遺伝子導入スイカを製造するために使用された発現カセットはpBing008であった。他の実施形態において、使用された発現カセットは、表１に示されるものから選択された。いくつかの実施形態において、発現カセットのレポーター遺伝子はＧＦＰであり、形質転換されたスイカ植物の選択は、ＧＦＰの発現を有するその葉に基づいていた。

他の実施形態において、植物は、２つ以上の発現カセットによる感染により同時形質転換されたが、使用された発現カセットは、表１に示されるものから選択された。

遺伝子導入植物及びその組織におけるタンパク質発現
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子導入植物を製造する方法は、遺伝子導入植物に導入された発現カセットによるモグロール／モグロシド経路タンパク質／酵素の発現をモニター及び分析することに関連する。

いくつかの実施形態において、本願に従って製造された遺伝子導入植物の組織又は部分は、サンプリングされ、処理されて、分析の準備が整った試料が得られた。試料はさらに分析に付されて、発現カセット中の目的遺伝子により発現されたタンパク質の存在及び／又は含量が検出された。

いくつかの実施形態において、本願に従って製造された遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物の葉が、タンパク質抽出緩衝液中で粉砕され、次いで遠心分離に付された。生じた上清はさらに希釈され、次いで抗体検出に使用された。標的タンパク質のそれぞれの存在は、対応する抗体の結合により生じた化学発光シグナルの検出並びに各測定において対照として使用されるタンパク質サイズラダーにより示されるタンパク質のサイズにより確認された。いくつかの実施形態において、タンパク質検出は、Jess装置（Bio-Techne）を使用することにより実施されたが、それは、タンパク質分離及びタンパク質検出のための従来のウェスタンブロッティング方法の免疫検出を自動化するものである。特定の実施形態において、３を超えるシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を、分析及び選択の目的に、陽性シグナルのカットオフとして使用した。

いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物は、下記の全５種のモグロール／モグロシド経路酵素／タンパク質：ＣＤＳ、ＳＱＥ、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８７Ｄ１８）、ＵＧＴ７２０及びＥＰＨの存在を、タンパク質検出の結果から示した。特定の実施形態において、遺伝子導入植物は遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）である。他の実施形態において、遺伝子導入植物は遺伝子導入スイカである。

モグロール／モグロシド経路酵素は、遺伝子導入植物の器官、組織、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、芽、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、***組織部位、カルス組織、種子、切り枝、細胞若しくは組織培養物、胎座、室、中果皮、外皮、表皮又はあらゆる他の部分若しくは産物を含むが、これらに限定されない、本願の遺伝子導入植物の種々の組織に検出された。特定の実施形態において、モグロール／モグロシド経路酵素ＣＤＳ、ＳＱＥ、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８７Ｄ１８）、ＵＧＴ７２０及びＥＰＨは、遺伝子導入植物の胎座、室、中果皮、外皮及び表皮に検出された。いくつかの実施形態において、モグロール／モグロシド経路酵素の発現は組織特異的であった。特定の実施形態において、ＣＤＳ及びＵＧＴ７２０の発現レベルは、ＣＹＰ８７、ＳＱＥ及びＥＰＨより低い。他の実施形態において、発現レベルＥＰＨは、特に果実組織中で、他のモグロール／モグロシド経路酵素と比べて、著しく高い。

モグロシドの代謝調節及び酵素産生
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子導入植物を製造する方法は、種々の非天然のモグロシドの産生を分析することに関連する。特定の実施形態において、遺伝子導入植物によるモグロシドの産生は分析され、選択の目的で、対応する対照植物と比較される。

いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物の組織又は部分は、抽出及び／又は精製されて、分析の準備が整った試料が得られた。いくつかの実施形態において、ＴＯＦＭＳと連結されたＵＰＬＣが、遺伝子導入植物の組織中の代謝物を分析するために使用された。モグロシドの存在は、分析結果を、保持時間及びＭＳスペクトルのピークパターンに関して標準的なモグロシドと比較することにより決定された。

いくつかの実施形態において、ＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳにより分析された遺伝子導入植物は、少なくとも１種のモグロシドのシグナルを示した一方、対照植物は、分析結果からモグロシドの存在を示さなかった。

特定の実施形態において、ＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳにより分析された遺伝子導入植物は、シアメノシドＩ、シラトース、モグロシドＶＩ、モグロシドＶ、イソモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＥ２、モグロシドＩ、モグロシドＩＡ、モグロシドＩＥ又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１種のモグロシドを示した一方、対照植物は、分析結果からモグロシドの存在を示さなかった。

他の実施形態において、ＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳにより分析された遺伝子導入植物は、モグロシドＩＡ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＥ２又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１種のモグロシドを示した一方、対照植物は、分析結果からモグロシドの存在を示さなかった。

モグロシドは、遺伝子導入植物の器官、組織、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、芽、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、***組織部位、カルス組織、種子、切り枝、細胞若しくは組織培養物又はあらゆる他の部分若しくは産物を含むが、これらに限定されない、本願の遺伝子導入植物の種々の組織に検出された。遺伝子導入スイカの特定の実施形態において、モグロシドは、果実の種皮に検出された。

いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子導入植物は、栽培可能で、繁殖可能である。遺伝子導入植物の子孫又は祖先は、子孫及び祖先が、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生することを可能にする非天然の酵素の供給源である。遺伝子導入植物の種子の繁殖は、生存可能なその子孫をもたらし、子孫は、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生する。

いくつかの実施形態において、非天然のモグロール／モグロシドを産生する遺伝子導入植物は、二倍体セットの染色体を有する二倍体植物である。特定の実施形態において、二倍体遺伝子導入植物は種子をもたらし、種子は非天然のモグロシドを含み、二倍体遺伝子導入植物の種子の増殖は生存可能なその子孫をもたらし、子孫は、モルゴール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生する。いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物は、ウリ科（Cucurbitaceae）／ウリ類である。いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物は、遺伝子導入スイカ（シトルルス・ラナツス（Citrullus lanatus））である。特定の実施形態において、遺伝子導入スイカは、二倍体である。

遺伝子導入植物から誘導されたモグロシド含有甘味料及び消耗品
いくつかの実施形態において、本開示は、一般的に、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を含む甘味料又は甘味付与組成物に関し、甘味料又は甘味付与組成物は、非天然のモグロール／モグロシドを産生し、及びそれらを含む遺伝子導入植物から誘導される。特定の実施形態において、甘味料又は甘味付与組成物は、本開示に従って製造されたモグロール／モグロシド経路遺伝子導入植物から誘導される。

本開示のモグロール／モグロシド経路遺伝子導入植物は、適切な加工時にモグロシド含有甘味料を誘導できる。生じた甘味料は、多くの目的のために低カロリー又はノンカロリーの甘味を与えるために使用され得る。甘味を与えるそのような用途の例は、茶、コーヒー、フルーツジュース及びフルーツ飲料などの飲料；ジャム及びゼリー、ピーナツバター、パイ、プリン、シリアル、キャンディー、アイスクリーム、ヨーグルト、ベーカリー製品などの食品；歯磨き粉、洗口液、咳止めドロップ、咳止めシロップなどのヘルスケア製品；チューインガム；並びに砂糖代用品である。特定の実施形態において、甘味料は、本願による遺伝子導入植物の果汁中にある。

いくつかの実施形態において、本開示は、非天然のモグロール／モグロシドを産生する遺伝子導入植物から誘導された甘味料を製造する方法にも関する。方法は、一般的に、遺伝子導入植物又はその部分の前処理洗浄及び粉砕、遺伝子導入植物又はその部分の抽出、沈降及び／又は遠心分離、吸着及び／又は分離、濃縮及び回収による粗製の甘味料の製造、さらなる精製、任意選択の濃縮／乾燥並びに製剤を含むが、これらに限定されない工程を包含する。抽出の手段は、室温若しくは加熱温度又は冷蔵温度での水－抽出；アルコールなどの有機溶媒による抽出、その他を包含する。分離及び精製の手段は、遠心分離、浸漬、重力沈降、濾過、マイクロ濾過、ナノ濾過、ウルトラ濾過、逆浸透、クロマトグラフィー、吸収クロマトグラム、交換樹脂精製を包含する。

特定の実施形態において、甘味料は、本開示に従って製造された遺伝子導入植物の葉から得られる。他の実施形態において、甘味料は、本開示に従って製造された遺伝子導入植物の果実から得られる。

いくつかの実施形態において、甘味料は、本開示による遺伝子導入スイカから得られ、甘味料は、遺伝子導入スイカにより産生された非天然のモグロシドを含む。

本明細書に記載されるモグロール／モグロシド経路遺伝子導入植物の形態及びそれを製造する方法は、本開示の好ましい実施形態を構成するが、本開示は、これらの詳細な形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者に明らかである通り、上述の種々の実施形態が組み合わされて、さらなる実施形態を与えることができる。本遺伝子導入植物、方法及びプロセス（その具体的な成分を含む）の態様は、必要に応じて改変されて、本開示のシステム、方法、節及び成分並びに構想を最も良好に利用することができる。これらの態様は、完全に請求項に記載される本発明の範囲内にあると考えられる。例えば、上述の種々の方法は、いくつかの行為を省略し、他の行為を含み、及び／又は説明された実施形態で述べられるのと異なる順序で行為を実行し得る。

さらに、本明細書に教示される遺伝子導入植物及び製造する方法において、種々の行為は、説明及び記載されるのと異なる順序で実施され得る。上記の記載に照らして、本システム、方法及び物品に対するこれらの変更形態及び他の変更形態がなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本開示を、本明細書及び特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、全ての可能な実施形態を、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の完全な範囲と共に含むと解釈されるべきである。したがって、本発明は、本開示により限定されず、代わりに、その範囲は、以下の特許請求の範囲により完全に決定されるものとする。

本明細書に言及される全刊行物、特許及び特許出願は、本開示が関連する技術分野の当業者のレベルを示す。

以下の実施例は、本発明の、好ましいが、非限定的な実施形態を説明する。

実施例
実施例１ － 配列番号１～３１に関連するヌクレオチド配列の特定
配列番号１～３１に関連するヌクレオチド配列（完全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ又はゲノムの）を、モグロシド経路の既報の非特許文献（Itkin et al., Proc Nat Acad Sci USA, 2016; 113:E7619-E7628）並びに公開された特許出願国際公開第２０１４０８６８４２号及び国際公開第２０１３０７６５７７号により特定する。

実施例２ － 配列番号１～３１から選択された１つ以上のヌクレオチド配列を含む発現カセットの構築
表１に示される通り、モグロシド経路酵素をコードするヌクレオチド配列の異なる組合せを有する種々の発現カセットを構築した。これらの発現カセットの構築は、標準的な遺伝子操作方法に従って実施した。

簡単に言うと、発現カセットを遺伝子合成ベンダー（GeneWiz）から取り寄せ、酵素消化及びライゲーションによりアセンブルした。例えば、pBing008は、５つの合成遺伝子断片：１）ＴＣＴＰプロモーター／ＣＤＳコーディング領域／ｃ－ｍｙｃエピトープタグ／ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター；２）Ｎ３スペーサー／ＦＳｇｔ－ＰＦｌｔプロモーター／ＣＹＰ８７Ｄ１８コーディング領域／ＨＳＶエピトープタグ／Ａｔ ＵＢＱ３ターミネーター；３）Ｎ５スペーサー／ＣｓＶＭＶプロモーター／ＥＰＨ３コーディング領域／ＦＬＡＧエピトープタグ／Ａｔ ＨＳＰ１８．２ターミネーター；４）Ｎ８スペーサー／ＨＬＶ Ｈ１２プロモーター／ＳＱＥ１コーディング領域／ＨＡエピトープタグ／ｐｅａ ３Ａターミネーター；５）Ｎ７スペーサー／ＰＣＳＬＶプロモーター／ＵＧＴ７２０コーディング領域／Ｖ５エピトープタグ／Ｅ９ターミネーターを使用してアセンブルした。発現カセット４及び５は、独特なＢｓａＩ制限部位をそれらの５’及び３’末端で使用してｐＣＡＭＢＩＡ系植物バイナリーにアセンブルし、中間ベクターpBING003を作製した。発現カセット１、２及び３は、独特なＢｓａＩ制限部位をそれらの５’及び３’末端で使用してｐＣＡＭＢＩＡ系植物バイナリーベクターにアセンブルし、中間ベクターpBING005を作製した。次いで、発現カセット１、２、３及び中間ベクターpBING005のＭＭＶプロモーター／ｅＧＦＰ遺伝子に及ぶＳｂｆＩ～ＳａｌＩの制限断片を、中間ベクターpBING003のＳｂｆＩ～ＳａｌＩの制限部位にサブクローニングして、最終ベクターpBING008を作製した。このベクターは、酵素ＳｐｈＩ＋ＰｓｔＩを使用する制限消化分析により検証し、次いで、バイナリーベクターのＴ－ＤＮＡ領域全体をカバーするように設計された一連のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してサンガーシーケンシングにより確認した。

実施例３ － 遺伝子導入植物ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）
発現カセットの構築：表１から選択した種々の発現カセットを構築し、ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）を形質転換し、遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物を製造するために使用した。発現カセットpBing008は、モグロシド経路酵素をコードする全５種の導入遺伝子、それぞれＧＦＰ及びＨｙｇをコードする２種のレポーター遺伝子並びにそれぞれエピトープタグ、弱いプロモーター及びターミネーターをコードするヌクレオチド配列を含む。異なる遺伝子組合せを有する発現カセットpBing003、pBing006、pBing007、pBing015及びpBing024を、実施例２の記載と同様に構築した。

形質転換されたアグロバクテリウムの作製：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）ステインＥＨＡ１０５を、フリー解凍法（Weigel, CSH Protoc. 2006 Dec 1; 2006(7)）を使用して、１つ以上の発現カセットプラスミド（表１から選択）により形質転換した。簡単に言うと、ケミカルコンピテントなアグロバクテリウムを調製した。プラスミドの添加後、混合物を交互に液体窒素中で凍結させ、３７℃の水浴内で液体に解凍した。次いで、細胞は、ＬＢ培地中で約１時間回復させ、カナマイシンを有するＬＢプレートに播種した。

植物ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の感染：簡単に言うと、形質転換されたＥＨＡ１０５アグロバクテリウムを一晩成長させ、次いで、ＯＤ６００読取りが０．１２に達するまで希釈した。それぞれ５枚の葉を有する６週齢であるニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物を形質転換のために選択した。希釈した形質転換されたアグロバクテリウム培養物をニードルなしで５ｍＬシリンジにロードし、約１．５ｍＬを、葉が濃緑色になるまで葉の裏面に注射した。形質転換されたアグロバクテリウム培養物をロードされた植物をさらに１０日間成長させてからサンプリング及び選択をした。

４つの例の遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）植物は、それぞれ以下の発現カセットによる形質転換により調製した。
－ pBing008（５遺伝子、弱いプロモーター）
－ pBing024（５遺伝子、強いプロモーター）
－ pBing003＋pBing007（３＋２遺伝子、弱いプロモーター）
－ pBing006＋pBing015（３＋２遺伝子、強いプロモーター）

組織中のタンパク質発現：約５０ｍｇの葉を、１．７ｍＬマイクロ遠心チューブにサンプリングし、５００μｌタンパク質抽出緩衝液（１Ｘ ＲＩＰＡ溶解緩衝液）を加えた。葉の組織を遠心分離前に抽出緩衝液中で粉砕して、破片を除いた。上清を抽出緩衝液によりさらに３倍希釈してから、４．５μｌの抽出物を、Jess装置（Bio-Techne）を使用する抗体検出に使用したが、それは、タンパク質分離及びタンパク質検出のための従来のウェスタンブロッティング方法の免疫検出を自動化するものである。ＭＹＣ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、ＨＡ及びＶ５タグの抗ウサギ抗体をThermo Fisherから購入し、Jessを使用するウェスタン検出に使用するために５０倍希釈し、製造業者のマニュアルに従ってウェスタン検出を実施した。標的タンパク質のそれぞれの存在を、対応する抗体の結合により生じる化学発光シグナルの検出並びに各測定において対照として使用されるタンパク質サイズラダーにより示されるタンパク質のサイズにより確認した。

表３に示される通り、ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）葉を発現カセットpBing008により形質転換した場合、全５種の標的タンパク質が、１０日で、陽性シグナルのカットオフとして使用される３を超えるＳ／Ｎ比で検出できる。

代謝調節：約１００ｍｇの植物組織を５００μｌ抽出緩衝液（８０％メタノール）に抽出した。遠心分離後、残存する粒子を除去するために上清を０．２２μＭフィルターに通した。Waters Xevo Quadrupole Time of Flight Tandem Mass Spectrometerと連結したWaters Acquity UPLCを代謝物分析に使用した。ＵＰＬＣ分離のために、Waters Acquity BEH C18 １．７μｍ、２．１×５０ｍｍカラムを、溶媒としての水及びアセトニトリル（いずれも１％ギ酸を含む）と共に使用した。各分析では、１．５μｌの試料を注入した。ネガティブＥＳＩでのＭＳ／ＭＳをモグロシド化合物の検出に使用した。衝突エネルギーをモグロシドＩＩの検出のために３０Ｖに設定した。

図４は、標準的なモグロシドのＵＰＬＡ分析結果を示す。見て分かる通り、モグロシドＩＩＡ１及びモグロシドＩＩＡは、約５．９分の保持時間で同時に溶出した。結果は、ＵＰＬＣ分離勾配にわたるｍ／ｚ ４２３（モグロシド関連化合物の特徴的ピーク）も示した。モグロシド標準品は、非常に高濃度（０．１ｍｇ／ｍｌ）で示された。

図５は、それぞれ発現カセットpBing008及びpBing024により形質転換された遺伝子導入植物ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩ検出のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（保持時間）分析結果を示す。見て分かる通り、モグロシドピークをもたらさない対照植物ｐ０１９と比較して、pBing008遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）及びpBing024遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の両方は、モグロシドＩＩピークをもたらしたが、それは、モグロシド標準品とオーバーラップした保持時間により確認される。

図６は、発現カセットpBing003及びpBing007により同時形質転換された遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉並びに発現カセットpBing006及びpBing015により同時形質転換された遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩ検出のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ（保持時間）分析結果を示す。見て分かる通り、モグロシドピークをもたらさない対照植物ｐ０１９と比較して、pBing003＋pBing007遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）並びにpBing006及びpBing015遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の両方はモグロシドＩＩピークをもたらし、それは、モグロシド標準品とオーバーラップした保持時間により確認される。

図７及び８は、発現カセットpBing008により形質転換された遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の葉中のモグロシドＩＩＡ検出のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ結果を示す。見て分かる通り、発現カセットpBing008に感染したニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）葉はピークＡをもたらし、保持時間（図６）及び質量スペクトルパターン（図７）に関してモグロシドＩＩＡと同じ特性を共有するが、発現カセットpBing008により形質転換された遺伝子導入植物ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）がモグロシドＩＩを産生し、それを含むことを示す。

実施例４：アセンブルされたスイカ組織特異的トランスクリプトーム
スイカ果実は、その大きいサイズ及び人気のある味のためにノンカロリー甘味料を製造する大きい可能性を有する。パスウェイエンジニアリングのためのゲノム編集又はシスジェニック戦略を設計するために、遺伝子ペイロードの最適な発現を可能にするスイカ果実特異的プロモーターを特定することが重要である。これらのプロモーターの特定には高分解能トランスクリプトームデータセットが必要であり、そこから、スイカ果実の可食部に特異的に発現される遺伝子のリストを生成することができる。今日現在、異なる生育段階にあるスイカ果実の異なる部分を区別できる、一般に利用可能なトランスクリプトームリソースはない。

本研究は、２種のスイカの市販変種、チャールストングレー及びシュガーベビーの種々の果実部分中の内因性遺伝子の発現レベルの検出及び定量化のための生物分析の手法を提供した。スイカを成長させ、組織及びその生育段階特異的試料を収集した。これらの全試料からの質の高いＲＮＡを抽出し、各試料で２０００万を超えるＲＮＡシーケンスリードを生成した。シーケンシング結果及び各試料中の標的遺伝子のそれぞれの標準化されたＲＮＡ発現レベルを分析し、定量化した。スイカ果実の果肉中に高度に濃縮して存在する遺伝子の予備的なリストを作製した。

表４は、ＲＮＡシーケンス解析のために収集した種々のスイカ組織試料をまとめるものである。シュガーベビー種及びチャールストングレー種のそれぞれで、果実の４５個の組織試料（５種×３齢×３反復実験＝４５）、葉の６個の試料（２齢×３反復実験＝６）及び根の３個の試料を収集した。図９は、スイカ及びその種々の部分の解剖を示す。

全ＲＮＡをNanoDrop及びBioAnalyzerによりチェックした。１試料あたりの全ＲＮＡ量は、約１マイクログラム（μｇ）以上である。純度は、ＯＤ２６０／２８０＝１．８～２．２及びＯＤ２６０／２３０≧２．０と設定した。ＲＮＡの完全性ウィルを、BioAnalyzerによる７超であるべきＲＩＮ数によりチェックした。ＲＮＡシーケンス解析の結果として、全試料から得られた最低のリードは２０８０万であり、リードの平均数は、それぞれチャールストングレーで３億６９００万及びシュガーベビーで３７８０万である。

ＲＮＡシーケンスデータ解析のために、質の低いリード（ｑ＝３０）を除去した。クリーンなリードを、チャールストングレー参照ゲノムに対してアラインした（Wu et al., Genome of‘Charleston Gray’, the principal American watermelon cultivar, and genetic characterization of 1,365 accessions in the U.S. National Plant Germplasm System watermelon collection. Plant Biotechnology Journal, 2019）。生じたアラインメント率は８９．７～９３．５８であった。各試料の遺伝子数を計算した。次いで、試料を標準化して、ライブラリー深さの違いを説明した。

チャールストングレー及びシュガーベビーの両方の生育したスイカ果実の１つの顕著な特徴は、ピンク／赤色果肉である。リコペン及びβ－カロテンは果実を担当しており、これらの色素の産生がフィトエンシンターゼ遺伝子ＰＳＹ１により制御されていることは公知である（Wang et al., Developmental Changes in Gene Expression Drive Accumulation of Lycopene and β-Carotene in Watermelon, Journal of the American Society for Horticultural Science, 2016, 141(5), 434-443）。このＲＮＡシーケンスデータセットからは、ＰＳＹ１遺伝子の発現は、ピンク／赤色の蓄積と高度に相関している：最高の発現レベルが、２６日及び４２日齢の果実の中果皮、胎座及び室組織に検出され、それらは、図１０に示されるように目に見えるピンク及び赤色を示すまさにその組織である。ＰＳＹ１遺伝子発現と組織色の相関は、このプロジェクトにより生じたＲＮＡシーケンスデータセットに生物学的に意味があることを立証する。

次の工程として、３６群の試料由来の全２２５４５遺伝子の発現をスクリーニングして、ＰＳＹ１に類似の発現パターンを有するさらなる果実特異的遺伝子を特定した。基準は下記の通り定義する：（１）遺伝子発現が、２６日齢及び４２日齢果実で、中果皮、胎座及び室組織（「標的組織」と称される）中で高度に濃縮されている。発現レベルは、外皮中の発現の５倍超で、根、葉及び果実の表皮中の２０倍超でなければならない；（２）標的組織中の発現レベルは、低存在量であるが、それでも組織特異的遺伝子を除去するために、１００ＦＰＫＭ超（１００万のマッピングされた１リードあたり転写物の１キロ塩基あたりのフラグメント）でなくてはならず；及び（３）発現特性は、両変種において両基準を満たさなければならない。

結果として、８種の遺伝子を、そのような標的組織特異的遺伝子として特定した（Charleston Gray Reference Genome Identifier http://cucurbitgenomics.org/を使用）。興味深いことに、これらの遺伝子のほとんどは植物代謝に関与すると予測されており、表５に示される通り、果実成熟段階中に濃縮されると実際に期待されている。表４によるスイカ試料の種々の組織部分中の遺伝子のそれらの発現濃縮は、図１１～１２に視覚化されている。この試験の遺伝子発現データセットは、遺伝子導入植物の設計及び製造のための組織特異的遺伝子及びプロモーターの発見並びに遺伝子導入植物中の標的遺伝子の発現の分析及び定量化のための独特なリソースになり得る。

実施例５ － 遺伝子導入スイカ
発現カセットの構築：実施例３における遺伝子導入ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana bentamiana）の製造のように、種々の発現カセットを表１に従って調製した。

形質転換されたアグロバクテリウムの作製：実施例３に与えられた同じ手順に従い、形質転換されたアグロバクテリウムを作製した。

スイカの感染：スイカの２つの市販変種、チャールストングレー及びシュガーベビーを宿主として使用した。５日齢のスイカ苗を、形質転換のための外植片を調製するために使用した。子葉を胚軸から切り取り、滅菌水を満たしたペトリ皿に収集した。２つのつながった子葉を、残存する胚軸セグメントを通る切断により分離し、子葉の外植片を、形質転換の準備が整った２ｍｍの小片に切り分けた。形質転換のために、アグロバクテリウム培養物をこれらの外植片に加え、５分間真空にした。感染後、外植片を滅菌されたペーパータオル上で乾かし、ＭＳ培地を有するペトリ皿内のフィルターディスクに移した。プレートを密封し、同時培養のために２５℃で３日間暗所に配置した。

遺伝子導入スイカの例は、以下の発現カセットによる形質転換により調製した。
－ pBing008（５遺伝子、弱いプロモーター）
－ pBing028（５遺伝子、強いプロモーター、Ｈｇｙ及びＧＦＰレポータータンパク質）

遺伝子導入スイカ中のタンパク質発現：実施例３に提供された同じ手順に従い、遺伝子導入スイカ試料中のタンパク質発現をモニターし、分析した。

表７は、遺伝子導入スイカ試料の倍数性、代謝物及び遺伝子発現の結果を示す。発現レベルを、葉のＲＮＡ試料からＱ－ＲＴ－ＰＣＲを使用して定量化した。発現レベルを、事前に定義された基準（１と設定）に対して標準化した。代謝物結果に関して、＊＊＊は豊富を意味し；＊＊は明らかな存在を意味し；＊は存在の可能性を意味する。表７に示される通り、スイカの葉を発現カセットpBing008又はpBing028により形質転換した場合、全５種の標的モグロシド経路タンパク質は、対応する遺伝子導入スイカ植物中に検出できる。特定の遺伝子導入スイカ試料において、葉が明らかな存在又は豊富なモグロシドＩＩＥを有することが示される。二倍体染色体を有する遺伝子導入スイカ００８ＣＨＥ４－１９が種子及び果実をもたらし、００８ＣＨＥ４－１９の葉が、モグロシドＩＩＥの存在の可能性及び代謝物結果に示される豊富なモグロシドＩＩＥを有していたことに留意することが重要である。それに比べて、三倍体（３Ｘ）又は四倍体（４Ｘ）などの多倍数性を有する遺伝子導入スイカは開花のみを示したが、最終的に種子も果実ももたらさず、葉又は他の組織中にモグロシドを産生もしなかった。これらの結果は、驚くべきことに、遺伝子導入スイカが果実及び種子をもたらす能力が予想外であり、染色体倍数性が非天然のモグロシドを産生する遺伝子導入スイカの繁殖性にとって重要な因子であり得ることを示している。

図１３は、種々の遺伝子導入スイカ試料（pBing008により形質転換された）中のタンパク質検出の分析結果を示す。Ｙ軸に、アクチン発現の１０％を値１．０と設定した。ＥＰＨの発現は、範囲より高く、このグラフに示されていない。見て分かる通り、全ての遺伝子導入スイカ試料は、全５種のモグロシド経路導入遺伝子の高い発現を示した。試料００８ＤＬＥ１１クラスターは、全導入遺伝子の高い発現を示した。試料００８ＤＬＥ１１－８果実は最高の発現を有し、５０個の種子ももたらした。

図１４は、発現カセットpBing008による形質転換により作られた遺伝子導入スイカ中のタンパク質検出の化学発光結果を示す。見て分かる通り、全５種の標的モグロシド経路酵素の発現が遺伝子導入スイカ中に見られた。

果実中のモグロシド産生を検出する能力の違いを理解するために、種々の新たに作製された植物系統由来のスイカを収集し、切断して種々の果実部分にした。次いで、ＲＮＡを種々の果実部分試料から抽出し、種々の新たに一体化された経路遺伝子のＲＮＡ発現レベルを、標準的なプロトコルを使用して測定されたＱ－ＲＴ－ＰＣＲを使用して定量化した。測定は、図１５～１８に表される通りいくつかの傾向を示した。見て分かる通り、全導入遺伝子ＣＤＳ、ＣＹＰ８７、ＳＱＥ、ＥＰＨ及びＵＧＴ７２０が、胎座、室、中果皮、外皮及び表皮を含む全果実組織中に発現された。発現パターンが全組織種類にわたり一貫していることが注目に値する。さらに、ＣＤＳ及びＵＧＴ７２０発現は、ＣＹＰ８７、ＳＱＥ及びＥＰＨより低い。ＥＰＨは、モグロシドＩＩＥ含有果実（００８ＣＨＥ４－１３）を含むいくつかの果実部分において飛躍的に高い発現である。これは、導入遺伝子挿入の位置効果による可能性がある。

図１５～１８は、モグロシド経路導入遺伝子の発現に関して、代表的な遺伝子導入スイカ試料の種々の組織の分析結果を示す。見て分かる通り、全導入遺伝子ＣＤＳ、ＣＹＰ８７、ＳＱＥ、ＥＰＨ及びＵＧＴ７２０は、胎座、室、中果皮、外皮及び表皮を含む全果実組織中に発現された。発現パターンが全組織種類にわたり一貫していることが注目に値する。さらに、ＣＤＳ及びＵＧＴ７２０発現は、ＣＹＰ８７、ＳＱＥ及びＥＰＨより低い。ＥＰＨは、いくつかの果実中で飛躍的に高い発現である。

代謝調節：実施例３に与えられた同じ手順に従い、代謝調節をモニターし、遺伝子導入スイカ試料の代謝物を分析した。

図１９～２０に示される通り、対照と比較すると、発現カセットpBing008を含む遺伝子導入スイカはモグロシドＩＩＥの存在を示し、意図された酵素経路を経るモグロシドの産生の成功を示した。

モグロシドＩＩＥを産生する遺伝子導入植物を、果実中にモグロシドＩＩＥを産生するそれらの能力に関して評価した。少なくとも１つの植物は果実をもたらすことができた（００８ＣＨＥ４－１３）。この植物の果実からの抽出物を作り、ＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳにより分析した。果実の抽出物は、モグロシドＩＩＥの特徴的なマスフィンガープリントを示した（図２１ａに示される）。陽性対照として、野生型の未改変果実の抽出物を作製し、１００ｎｇ／ｍｌモグロシドＩＩＥによりスパイクした（図２１ｂに示される）。これらの驚くべき結果は、本開示による遺伝子導入植物が、非天然のモグロシドを含む果実をもたらす予期しない能力を示す。

図２２は、いずれも発現カセットpBing008を含む遺伝子導入スイカ試料００８ＳＢＥ５－２及び００８ＣＨＥ４－５由来の種皮のＵＰＬＣ－ＴＯＦＭＳ結果を示す。見て分かる通り、モグロシドＩＩＥは果実の種皮に検出され、遺伝子導入スイカの、果実に限定されない他の組織又は部分中のモグロシドの産生を示す。これらの驚くべき結果は、本開示の遺伝子導入植物の予期しない繁殖性を示す。

実施例６：モグロシド産生導入遺伝子の発現並びに遺伝子導入スイカＴ０及びＴ１植物中のモグロシドの産生
さらなる調査を実施して、遺伝子導入スイカ（Ｔ０植物）及びその子孫（Ｔ１植物）の両方における標的導入遺伝子の発現並びにモグロシドの産生を分析した。

１．Ｔ０植物中の標的遺伝子の遺伝子発現分析
実施例５に与えられた方法に従い、１００を超える遺伝子導入スイカ系統を製造した。果実をもたらした３１の植物を遺伝子発現分析に使用した。第１に、経路における重要な制限酵素、ＣＤＳの発現レベルを、Ｑ－ＲＴ－ＰＣＲを使用して葉及び果実組織中で試験した。全試料にわたる遺伝子発現を比較するために、全遺伝子発現値を、アクチン発現の１０％（１に設定）に対して標準化した。結果（図２３）は種々の発現レベルを示し、導入遺伝子ＣＤＳの存在及び発現を確認した。発現の変動が葉中ではランダムに見えるが、より一貫したパターンを果実に見ることができ、表６による遺伝子導入系統、００８ＣＨＥ４及び００８ＤＬＥ１１の２ファミリー由来の複数の植物が、最高の発現を示した（図２３）。００８ＣＨＥ４－１９は、果実中に最高の遺伝子発現を示した。元々００８ＤＬＥ１１外殖片から分離された、いくつかの関連した遺伝子導入果実も、果実中に高いＣＤＳ発現を示した。著しい変動が、葉の発現と果実の発現との間に見られた。それに比べて、野生型対照（図２３の右側）は、予測通りＣＤＳ発現を示さなかった。他の４種の標的遺伝子、ＣＹＰ８７、ＳＱＥ、ＥＰＨ及びＵＧＴ７２０の発現レベルを、それぞれ図２４～２７に表した。

２．遺伝子導入事象００８ＣＨＥ４－１９におけるモグロシドＩＩＥの存在を確認する遺伝子導入スイカＴ０果実の代謝スクリーニング
スイカ果実を、モグロール誘導化合物に関してＵＰＬＣ－ＭＳを使用して分析し、結果を図２９に示す。対照として、標準的なモグロシドＩＩＥもＵＰＬＣ－ＭＳを使用して分析し、結果を図２８に示す。比較すると、００８ＣＨＥ４－１９ Ｔ０果実のイオンクロマトグラム及び質量分析フラグメントの両方の結果は、モグロシドＩＩＥ標準品のものと近い一致を示し、この果実中のモグロシドＩＩＥの生合成及び蓄積を示唆した。興味深いことに、００８ＣＨＥ４－１９由来の果実は、Ｔ０において特性化される全果実中で最高レベルのＣＤＳも発現し、Ｔ０スイカ果実中のＣＤＳ発現とＭＩＩＥ生合成との間の可能性のある相関を示した。

３．遺伝子導入スイカの子孫（Ｔ１世代）における事象特性化及び導入遺伝子の遺伝子発現分析
モグロシド産生導入遺伝子の遺伝を試験し、モグロシドＩＩＥが２世代以上の遺伝子導入スイカ中で産生され得ることを確認するために、００８ＣＨＥ４及び００８ＤＬＥ１１果実からの種子を収集し、発芽させた。発芽後、３２のＴ１植物（５つのＧＦＰ遺伝子導入対照を含む）を、葉組織から抽出されたＤＮＡを使用して、ＰＣＲにより遺伝子型検査した。ＰＣＲプローブを、２つの標的：陽性対照としての内因性スイカアクチン遺伝子及び導入遺伝子一体化のしるしとしてのＣＤＳ遺伝子を増幅させるように設計した。図３０に示されるように、アクチン産物バンドの存在は、スイカゲノムＤＮＡからの成功したＰＣＲを示し；ＣＤＳ産物バンドの存在は導入遺伝子の存在を示す。全試料の正体及び遺伝子型決定結論を左側及び右側の表に列記した。予測通り、いくつかの野生型セグレガントも特定した（図３０による試料１３番、１６番、１８番、２７番及び３２番）。これらの遺伝子型決定結果は、導入遺伝子カセットのＴ１世代のスイカ中の存在及び遺伝の成功を確認した。

遺伝子導入Ｔ１植物の葉も、全５種の標的遺伝子のＱ－ＲＴ－ＰＣＲ検出のためにサンプリングした。結果を表８にまとめる。プライマーを、スイカホモログ（陰性対照により示される）ではなく、導入遺伝子を特異的に増幅させるように設計した。値は、３回の独立した生物学的反復実験の平均であり、発現標準として先に設定したアクチン発現の１０％に標準化した。植物００８ＣＨＥ４－１－Ｓ３、００８ＣＨＥ４－１９－Ｓ５、００８ＣＨＥ４－１９－Ｓ１０、００８ＤＬＥ１１－２－Ｓ５及び００８ＤＬＥ１１－７－Ｓ２は野生型セグレガントであることが分かった。遺伝子型決定結果と一致して、全ての野生型セグレガント及び陰性の非遺伝子導入植物は、これらの標的の発現を事実上全く示さなかった。００８ＤＬＥ１１－２ファミリーが、００８ＣＨＥ４－１９を含む他の遺伝子導入系統と比べて、全５種の標的遺伝子の全体的なより高い発現を示すことが分かった。これらの５種の遺伝子のうち、ＣｓＶＭＶプロモーターにより推進されるＥＰＨは、一貫して非常に高い発現（アクチンの約１０倍）を示し、スイカ中のこのプロモーターの強い活性を示唆した。

４．代謝分析は、モグロシドを産生した３つのスイカＴ１果実を特定した
Ｔ１系統からもたらされた果実を代謝分析のために収集した。ＬＣ－ＭＳ結果は、図３１～３３に示される通り、００８ＤＬＥ１１－４－Ｓ４、００８ＤＬＥ１１－２－Ｓ１及び００８ＤＬＥ１１－９－Ｓ３におけるモグロシドＩＩＥの存在を確認したが、その全てが発現カセットpBing008を含むＴ０遺伝子導入スイカの子孫である。定量的には、これらの３つのＴ１試料は、それぞれ約３０ｎｇ、約１７ｎｇ及び約３ｎｇ（乾燥重量の１グラムあたり）のモグロシドＩＩＥを産生した。

以下の番号付けがされた条項は、本開示のさらなる例の態様及び特徴を定義する。

１．ゲノム変換事象を含む植物であって、ゲノム変換事象は、モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらし、植物は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する、植物。

２．非天然のモグロール前駆体及び／又はモグロールを含む植物であって、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する植物。

３．遺伝子導入植物であり、ゲノム変換事象は、発現カセットを含み、発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、条項１の植物。

４．発現カセットを含む遺伝子導入植物であり、発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、条項２の植物。

５．発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の１つ以上を含む、条項３～４のいずれかの遺伝子導入植物。

６．モグロシド経路酵素は、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、条項２の遺伝子導入植物。

７．発現カセットは、プロモーター、スペーサー、エピトープタグ、ターミネーター、レポーター遺伝子又はこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の配列を含む、条項３～６のいずれかの遺伝子導入植物。

８．モグロシド経路酵素は、シルクビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）、エポキシヒドロラーゼ（ＥＰＨ）、シトクロムＰ４５０、ウリジン－５’－ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）又はこれらの組合せからなる群から選択される、条項１の遺伝子導入植物。

９．モグロシドは、シアメノシドＩ、シラトース、モグロシドＶＩ、モグロシドＶ、イソモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＥ２、モグロシドＩ、モグロシドＩＡ、モグロシドＩＥ又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、条項１～８のいずれかの遺伝子導入植物。

１０．モグロシドは、モグロシドＩＡ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＥ２又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、条項１～９のいずれかの遺伝子導入植物。

１１．条項１～１０のいずれかによる植物から得ることができる植物部分であって、植物の器官、組織、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、芽、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、***組織部位、カルス組織、種子、切り枝、細胞若しくは組織培養物又は他の任意の部分若しくは産物を含むが、これらに限定されず、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を含む植物部分。

１２．植物の子孫又は祖先は、子孫及び祖先がモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生することを可能にする非天然の酵素の供給源である、条項１～１１のいずれかによる植物。

１３．二倍体植物である、条項１～１２のいずれかによる植物。

１４．ウリ科（Cucurbitaceae）／ウリ類である、条項１～１３のいずれかによる植物。

１５．シトルルス・ラナツス（Citrullus lanatus）（スイカ）である、条項１～１４のいずれかによる植物。

１６．植物から誘導されたモグロシド甘味料であって、植物又はその部分は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生し、及びそれらを含む、モグロシド甘味料。

１７．植物の抽出物である、条項１６のモグロシド甘味料。

１８．植物又はその部分から精製される、条項１６～１７のいずれかのモグロシド甘味料。

１９．抽出、浸漬、クロマトグラフィー又は吸収クロマトグラムによって精製される、条項１８のモグロシド甘味料。

２０．条項１６～１９のいずれかの甘味料を含む食品、成分、香味料又は飲料。

２１．非天然のモグロール前駆体、モグロール又はモグロシドを産生する生合成方法であって、
（ａ）植物をゲノム変換事象と組み合わせ、それにより遺伝子導入植物を形成する工程であって、ゲノム変換事象は、モグロール／モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす、工程；
（ｂ）（ａ）の遺伝子導入植物の集団を栽培及び再生する工程；
（ｃ）モグロシドを産生する遺伝子導入植物を選択する工程；及び
（ｄ）モグロシドを収集する工程
を含む方法。

２２．非天然のモグロール／モグロシド経路酵素を発現する発現カセットを含むプラスミドを調製／提供すること；
宿主細胞をプラスミドで形質転換すること；及び
植物を複数の形質転換された宿主細胞で形質移入すること
をさらに含む、条項２１の方法。

２３．非天然のモグロール前駆体、モグロール又はモグロシドを産生する植物を製造する方法であって、植物をゲノム変換事象と組み合わせ、それにより遺伝子導入植物を形成することを含み、ゲノム変換事象は、モグロール／モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす、方法。

２４．植物をゲノム変換事象と組み合わせることは、以下の方法：リポソームの使用、電気穿孔の使用、遊離のＤＮＡの取込みを増加させる化学物質の使用、ＤＮＡの直接植物への注入の使用、パーティクルガンボンバードメントの使用、マイクロプロジェクションの使用又はアグロバクテリウム媒介性形質転換の使用の１つ以上を使用して実施される、条項２３の方法。

２５．非天然のモグロール／モグロシド経路酵素を発現する発現カセットを含むプラスミドを調製／提供すること；
宿主細胞をプラスミドで形質転換すること；及び
植物を複数の形質転換された宿主細胞で形質移入すること
をさらに含む、条項２３～２４の方法。

２６．宿主細胞は、微生物である、条項２５の方法。

２７．微生物は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、細菌細胞又はこれらの組合せからなる群から選択される、条項２６の方法。

２８．細菌細胞は、グラム陰性細菌である、条項２７の方法。

２９．グラム陰性細菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）である、条項２８の方法。

３０．宿主細胞は、フリー解凍法を使用してプラスミドで形質転換される、条項２９の生合成方法。

３１．非天然のモグロール前駆体、モグロール又はモグロシドを産生する生合成方法であって、
（ａ）植物をゲノム変換事象と組み合わせ、それにより遺伝子編集された植物を形成する工程であって、ゲノム変換事象は、モグロール／モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす、工程；
（ｂ）（ａ）の遺伝子編集された植物の集団を栽培及び再生する工程；
（ｃ）モグロシドを産生する遺伝子編集された植物を選択する工程；及び
（ｄ）モグロシドを収集する工程
を含む生合成方法。

３２．非天然のモグロール／モグロシド経路酵素を発現する発現カセットを含むプラスミドを調製／提供すること；
宿主細胞をプラスミドで形質転換すること；及び
植物を複数の形質転換された宿主細胞で形質移入すること
をさらに含む、条項３２の方法。

３３．条項２１～３２のいずれかの甘味料を含む食品、成分、香味料又は飲料。

３４．遺伝子編集された植物であり、ゲノム変換事象は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）及びこれらの組合せを含む群から選択される方法によって植物に加えられる、条項１の植物。

上記の本明細書、例及びデータは、本発明の組成物の製造及び使用の完全な説明を与える。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの実施形態がなされ得るため、本発明は、以下に添付される特許請求の範囲に存在する。

Claims (21)

1. ゲノム変換事象を含む植物であって、前記ゲノム変換事象は、モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらし、前記植物は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する、植物。
2. 非天然のモグロール前駆体及び／又はモグロールを含む植物であって、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生する植物。
3. 遺伝子導入植物であり、前記ゲノム変換事象は、発現カセットを含み、前記発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、請求項１に記載の植物。
4. 発現カセットを含む遺伝子導入植物であり、前記発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、請求項２に記載の植物。
5. 前記発現カセットは、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の１つ以上を含む、請求項３又は４に記載の植物。
6. 前記モグロシド経路酵素は、配列番号１～３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の植物。
7. 前記発現カセットは、プロモーター、スペーサー、エピトープタグ、ターミネーター、レポーター遺伝子又はこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の配列を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の植物。
8. 前記モグロシド経路酵素は、シルクビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）、エポキシヒドロラーゼ（ＥＰＨ）、シトクロムＰ４５０、ウリジン－５’－ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の植物。
9. 前記モグロシドは、シアメノシドＩ、シラトース、モグロシドＶＩ、モグロシドＶ、イソモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＥ２、モグロシドＩ、モグロシドＩＡ、モグロシドＩＥ又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の植物。
10. 前記モグロシドは、モグロシドＩＡ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＥ２又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の植物。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の植物から得ることができる植物部分であって、前記遺伝子導入植物の器官、組織、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、芽、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、***組織部位、カルス組織、種子、切り枝、細胞若しくは組織培養物又は任意の他の部分若しくは産物を含むが、これらに限定されず、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を含む植物部分。
12. 前記植物の子孫又は祖先は、前記子孫及び前記祖先がモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を産生することを可能にする非天然の酵素の供給源である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の植物。
13. ウリ科（Cucurbitaceae）／ウリ類である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の植物。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の植物から誘導されたモグロシド甘味料であって、前記植物又はその部分は、非天然のモグロール前駆体、モグロール、モグロシド及び／又はその代謝物若しくは誘導体を生合成的に産生し、及びそれらを含む、モグロシド甘味料。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の甘味料を含む食品、成分、香味料又は飲料。
16. 非天然のモグロール前駆体、モグロール又はモグロシドを産生する生合成方法であって、
    （ａ）植物をゲノム変換事象と組み合わせ、それにより植物を形成する工程であって、前記ゲノム変換事象は、モグロール又はモグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす、工程；
    （ｂ）（ａ）の前記植物の集団を栽培及び再生する工程；
    （ｃ）モグロール又はモグロシドを産生する前記遺伝子導入植物を選択する工程；及び
    （ｄ）モグロール又はモグロシドを収集する工程
    を含む生合成方法。
17. 非天然のモグロール又はモグロシド経路酵素を発現する発現カセットを含むプラスミドを調製／提供すること；
    宿主細胞を前記プラスミドで形質転換すること；及び
    前記植物を複数の前記形質転換された宿主細胞で形質移入すること
    をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 非天然のモグロール前駆体、モグロール又はモグロシドを産生する植物を製造する方法であって、植物をゲノム変換事象と組み合わせることを含み、前記ゲノム変換事象は、モグロール／モグロシド経路酵素の非天然の発現又は濃度をもたらす、方法。
19. 非天然のモグロール／モグロシド経路酵素を発現する発現カセットを含むプラスミドを調製／提供すること；
    宿主細胞を前記プラスミドで形質転換すること；及び
    前記植物を複数の前記形質転換された宿主細胞で形質移入すること
    をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記宿主細胞は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）である、請求項１９に記載の方法。
21. 遺伝子編集された植物であり、前記ゲノム変換事象は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）及びこれらの組合せを含む群から選択される方法によって前記植物に加えられる、請求項１に記載の植物。

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