JP2023523531A - 向上した線虫耐性を有する植物 - Google Patents

向上した線虫耐性を有する植物 Download PDF

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Abstract

本発明は、線虫に対して向上した耐性を示す新規植物に関する。本発明はまた、前記植物の種子及び一部に関する。本発明はさらに、このような種子及び植物の作成及び使用方法に関する。本発明はまた、線虫に対するこのような向上した耐性に関連する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらす新規ＳｍＤ１対立遺伝子に関する。

Description

本発明は、線虫に対して向上した耐性を示す新規植物に関する。本発明はまた、前記植物の種子及び一部に関する。本発明はさらに、このような種子及び植物の作成及び使用方法に関する。本発明はまた、線虫に対するこのような向上した耐性に関連する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらす新規ＳｍＤ１対立遺伝子に関する。
ネコブセンチュウ（ＲＫＮ；ネコブセンチュウの一種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．））及びシストセンチュウ（ＣＮ；シストセンチュウ属の種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）及びグロボデラ属の種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．））などの着性内部寄生性線虫は、多くの農業作物に対して多大な損害を引き起こす。線虫はライフサイクルのほとんどを植物の根の中で過ごし、それぞれ巨細胞及び合胞体と呼ばれる多核肥大フィーディング細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｅｄ ｆｅｅｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）の形成を誘起する。これらの巨細胞は小さな***細胞で囲まれていると共に、根瘤又は根こぶとして知られる新たな器官を根の中に形成し、これが、線虫がその生存期間にわたって栄養分を得る代謝シンクとして作用する。これにより、植物根系の機能に重大な異常が生じ、植物による養分の取り込み効率が大幅に低下し、最終的に、収量に影響が及ぶ（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｅｊｉａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
収量の損失を防ぐための線虫の防除は通常、作物の管理及び輪作、殺線虫剤の使用及び植物の遺伝的性質に依存する。しかしながら、多くの殺線虫剤溶液が市場から撤退している。さらに、これらの使用は、人間の健康、食品の安全性に対する懸念（例えば作物収穫物における残留に関し）、及び、環境的持続可能性（例えば土壌生物の保護）に対処するために、大幅に減少している。さらに、いく種かの線虫は、植物の遺伝的性質に基づくきわめて少数の既存の解決法を克服することが可能である。例えば、多くのメロイドギネ属の種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）（例えばＭ．エンテロロビイ（Ｍ．ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ）、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ）及びジャワネコブセンチュウ（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ））は、線虫の管理に広範に用いられているＭｉ－１．２及びＮ耐性遺伝子を有するトマト及びコショウ遺伝子型に係る耐性を克服可能である（Ｋｉｅｗｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
結果として、特にトマト植物といった植物における線虫防除をさらに向上する代替策が要求されている。
本発明は、線虫、特にメロイドギネ属の種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の線虫に対する高い耐性を示す新規植物を提供する要求を解決するものである。
第１の実施形態において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子を含む植物を提供するものであり、ここで、前記ＳｍＤ１タンパク質は、向上した線虫耐性を付与する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１～１０８のいずれか一つに対応する位置にミスセンス突然変異を含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にミスセンス突然変異を含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にスレオニン－イソロイシン置換を含む。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、トマト、タバコ、コショウ、カボチャ、スイカ、メロン、キュウリ及びダイズを含むリストから選択される。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、自殖、二ゲノム性半数体又はハイブリッド植物である。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は台木である。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、前記ＳｍＤ１対立遺伝子の２つのコピーを含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、メロイドギネ属の種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）、好ましくはサツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）、キタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）、メロイドギネエンテロロビイ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ）及びジャワネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）の線虫に対する向上した耐性を付与する。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、ソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態において、前記ＳｍＤ１対立遺伝子は、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２から入手可能である。
さらなる実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかに係る植物部位を提供するものであり、前記植物部位は前記ＳｍＤ１対立遺伝子を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかの植物又は植物部位を産する種子を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、
ａ）突然変異植物の個体群を得るステップ；
ｂ）そのアミノ酸配列中にミスセンス突然変異を有するＳｍＤ１タンパク質をコードする修飾ＳｍＤ１対立遺伝子を含む突然変異植物を選択するステップ
を含む、植物における線虫耐性を向上させる方法を提供する。
修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすＳｍＤ１対立遺伝子の使用によって、線虫に対するトレランスの増加がもたらされることが示されている。ミスセンス突然変異によって、線虫エフェクタによる前記ＳｍＤ１タンパク質の認識を防止しながら、植物内における修飾ＳｍＤ１タンパク質の必要な活性の維持が可能となり、これにより、有害生物に対する植物の対処能力が向上されることが実証された。本発明はしたがって、線虫有害生物に対する植物耐性を向上させるための将来における育種プログラムにおいて用いられる可能性がある。
図１：シロイヌナズナ（ＡＴ４Ｇ０２８４０．１（配列番号４）及びＡＴ３Ｇ０７５９０．１（配列番号５））、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（ＮｂＳ００００５３９０ｇ００１２．１（配列番号６）、ＮｂＳ００００６５６９ｇ０００６．１（配列番号７）及びＮｂＳ０００５４３０９ｇ０００７．１（配列番号８））及びソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０６４６６０．２．１（配列番号１）及びＳｏｌｙｃ０６ｇ０８４３１０．２．１（配列番号３））によりコードされる本発明のＳｍＤ１アミノ酸配列の配列アライメント及び同一性割合マトリックス、並びに、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｇｌｙｍａ．０２Ｇ０９６０００．１（配列番号９））、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）（ＣＡ０６ｇ２６８２０（配列番号１０）及びＣａｐａｎａ０６ｇ００００６８（配列番号１１））、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）（ＣｍｏＣｈ０２Ｇ０１８５２０．Ｔ １（配列番号１２））、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）（ＭＥＬＯ３Ｃ０１８２２０．２．１（配列番号１３））、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）（Ｃｓ．ｇｙｌ ４．３．１．０２２１８９．Ｔ１（配列番号１４））、スイカ（Ｃｉｔｒｉｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）（Ｃｌａ０２３４１５＿Ｔ（配列番号１５））、ソラヌムハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）（Ｓｈ．ＬＹＩ ０１．２．１．００３４２１ Ｊ１（配列番号１６））及びソラティウムペンネリイ（Ｓｏｌａｔｉｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）（Ｓｏｐｅｎ０９ｇ０２６３５０．１（配列番号１７））ＳｍＤ１対立遺伝子由来のオルソロガス配列。配列アライメント及び同一性割合マトリックスは、ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを用いて算出した（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。 図２：シロイヌナズナ（Ａ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（Ｂ）及びトマト（Ｃ）ＳｍＤ１遺伝子の発現障害を有する植物対それぞれの対照植物における線虫に対する感受性レベルのアセスメント。（Ｄ）ＳｍＤ１発現停止トマト植物における植物根系のアセスメント。（Ａ）４０株の植物を各遺伝子型について用い、結果の統計分析をスチューデントのｔ検定（Ｐ＜０．０５）で行った。（Ｂ）１２株の植物を各処理について用い、結果の統計分析をマンホイットニーテスト（ａ＝５％）で行った。（Ｃ）１８～２０株の植物を各遺伝子型のそれぞれに用い、結果の統計分析をマンホイットニーテスト（ａ＝５％）で行った。 図３：植物根系のアセスメント（Ａ）及びＳｍＤ１ｂ遺伝子にミスセンス突然変異を有するトマト植物に係る線虫に対する感受性レベルのアセスメント（Ｂ）。結果の統計分析は、マンホイットニーテスト（ａ＝１％）で行った。
配列の簡単な説明
配列番号１：ＳｍＤ１ｂ遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０６４６６０．２．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号２：配列番号１の位置１４にＴ１４Ｉミスセンス突然変異を含む修飾アミノ酸配列
配列番号３：ＳｍＤ１ａ遺伝子Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０８４３１０．２．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号４：ＳｍＤ１ｂ遺伝子ＡＴ４Ｇ０２８４０．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号５：ＳｍＤ１ａ遺伝子ＡＴ３Ｇ０７５９０．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号６：ＳｍＤ１遺伝子ＮｂＳ００００５３９０ｇ００１２．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号７：ＳｍＤ１遺伝子ＮｂＳ００００６５６９ｇ０００６．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号８：ＳｍＤ１遺伝子ＮｂＳ０００５４３０９ｇ０００７．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号９：ＳｍＤ１遺伝子Ｇｌｙｍａ．０２Ｇ０９６０００．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１０：ＳｍＤ１遺伝子ＣＡ０６ｇ２６８２０によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１１：ＳｍＤ１遺伝子Ｃａｐａｎａ０６ｇ００００６８によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１２：ＳｍＤ１遺伝子ＣｍｏＣｈ０２Ｇ０１８５２０．Ｔ１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１３：ＳｍＤ１遺伝子ＭＥＬＯ３Ｃ０１８２２０．２．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１４：ＳｍＤ１遺伝子Ｃｓ．ｇｙ１４．３．１．０２２１８９．Ｔ１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１５：ＳｍＤ１遺伝子Ｃｌａ０２３４１５＿Ｔによりコードされたアミノ酸配列
配列番号１６：ＳｍＤ１遺伝子Ｓｈ．ＬＹ１０１．２．１．００３４２１．Ｔ１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１７：ＳｍＤ１遺伝子Ｓｏｐｅｎ０９ｇ０２６３５０．１によりコードされたアミノ酸配列
配列番号１８：配列番号１をコードする核酸配列
配列番号１９：配列番号２をコードする核酸配列
配列番号２０：Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０６４６６０．２．１ ＳｍＤ１ｂ遺伝子のゲノム配列
配列番号２１：修飾Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０６４６６０．２．１ ＳｍＤ１ｂ遺伝子のゲノム配列
配列番号２２／２３：Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０６４６６０．２．１遺伝子領域を増幅するプライマー対
配列番号２４：配列番号３をコードするゲノム配列
配列番号２５：配列番号４をコードするゲノム配列
配列番号２６：配列番号５をコードするゲノム配列
配列番号２７：配列番号９をコードするゲノム配列
配列番号２８：配列番号１０をコードするゲノム配列
配列番号２９：配列番号１１をコードするゲノム配列
配列番号３０：配列番号１２をコードするゲノム配列
配列番号３１：配列番号１３をコードするゲノム配列
配列番号３２：配列番号１４をコードするゲノム配列
配列番号３３：配列番号１５をコードするゲノム配列
配列番号３４：配列番号１６をコードするゲノム配列
配列番号３５：配列番号１７をコードするゲノム配列
定義
本出願の範囲内で使用される技術用語及び表現は、一般に、本明細書において以下に特に示されない場合、植物の育種及び栽培の関連技術においてそれらに一般的に適用される意味を与えられるべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明記されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「植物」への言及は、１つ又は複数の植物を含み、「細胞」への言及は、細胞、組織などの混合物を含む。
本明細書において用いられるところ、「約」という用語は、値、又は、質量の量、重量、時間、体積、濃度若しくは割合に言及している場合、特定の量からの、いくつかの実施形態においては±２０％、いくつかの実施形態においては±１０％、いくつかの実施形態においては±５％、いくつかの実施形態においては±１％、いくつかの実施形態においては±０．５％、及び、いくつかの実施形態においては±０．１％の変動値を含むことを意味している（このような変動量は本開示の方法の実施に適切であるため）。
「栽培種」植物は、本発明の範囲内において、もはや自然の状態ではなく、農業用途及び／又は人間による消費のために、人間の手入れによって開発及び栽培植物化された植物を指すと理解され、野生系統は排除される。例として、実施形態において、「栽培種の植物」は、ハイブリッド植物である。或いは、又は、加えて、本発明に係る「栽培種のトマト」植物は、黄色、オレンジ色又は赤色の果実が成長可能である。或いは、又は、加えて、栽培種のトマト植物は、ソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物である。
「対立遺伝子」は、本発明の範囲内において、同一の又は異なる形態の遺伝子に関連する様々な遺伝単位の代替型又は異型を指すものと理解され、これらは、相同染色体における同じ遺伝子座に位置するため、遺伝的形質において代替的である。このような代替型又は異型は、一塩基多型、挿入、反転、転座若しくは欠失の結果であり得、又は例えば化学的若しくは構造的修飾、転写調節若しくは翻訳後修飾／調節によって引き起こされる遺伝子調節の結果であり得る。二倍体細胞又は生物において、所与の遺伝子又は遺伝要素の２つの対立遺伝子は、典型的に、相同染色体の対上の対応する遺伝子座を占有する。本発明の文脈において、ＳｍＤ１遺伝子の代替又は変異型対立遺伝子は、向上した線虫耐性表現型に関連するミスセンス突然変異を含む修飾ＳｍＤ１タンパク質をコードする。ＳｍＤ１遺伝子の代替又は変異型対立遺伝子は、野生型ＳｍＤ１遺伝子と相対的に定義される。例えば、野生型ＳｍＤ１ｂ遺伝子配列番号２０は、配列番号１の野生型ＳｍＤ１ｂタンパク質をコードする。対応して、配列番号２１の変異型ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子は、配列番号２の修飾ＳｍＤ１ｂタンパク質をコードする。
相対的には、「向上した線虫耐性」という用語は、本明細書において、例えば配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子を含み、前記ＳｍＤ１タンパク質がミスセンス突然変異を含む本発明に係る植物は、前記対立遺伝子を有さない植物と比した場合に、高い線虫耐性を示すことを意味すると理解される。「向上した線虫耐性」を有する植物は、本発明の範囲内において、マンホイットニーテスト（α＝１、２．５又は５％）又はスチューデントのテスト（Ｐ＜０．０５）を用いて、対照植物と比して統計的に顕著に高い線虫耐性を有する（例えば、実施例において記載されているとおり、卵塊の数の顕著な低減を示す）植物を意味すると理解される。
線虫耐性の文脈において、「中度の耐性」という用語は、本発明に係る対立遺伝子を含むと共に、野生型対応対立遺伝子を有する感染しやすい対照植物（Ｔｏｍａｔｏ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ－ＨＥＩＮＺ）と比較した際に、根瘤の数及び／又は卵塊の数において統計的に有意な差を示す植物を指す。
本発明の範囲内における「対照植物」は、本発明を含有する栽培種の植物と同一の遺伝的背景を有する植物であることが可能であり、ここで、対照植物は、向上した線虫耐性に関連する本発明に係る対立遺伝子を有さない。対照植物は、同一の植物品種に属すると共に、本発明に係る対立遺伝子を含まない植物であることが可能である。対照植物は、本発明に係る栽培種の植物と同一の期間、及び、同一の条件下栽培される。本明細書において、植物品種は、ＵＰＯＶの定義に準拠して理解される。それ故、対照植物は、近同質遺伝子系統、近交系又はハイブリッドであり得、ただし、これらは、本発明に係る植物と同一の遺伝的背景を有するが、対照植物は、向上した線虫耐性に関連する本発明に係る対立遺伝子のいずれも有していない。好ましい実施形態において、「対照植物」は「対照トマト植物」である。
「形質」という用語は、特性又は表現型を指す。本発明の文脈において、線虫耐性形質は、向上した線虫耐性形質である。形質は、顕性若しくは潜性形式又は部分顕性若しくは不完全顕性形式で遺伝され得る。形質は、単一遺伝子性若しくは多遺伝子性であり得、又は１つ又は複数の遺伝子と環境との相互作用から生じ得る。植物は、形質についてホモ接合性又はヘテロ接合性であり得る。
「雑種」、「雑種植物」及び「雑種子孫」という用語は、遺伝的に異なる親から生成された個体（例えば、遺伝的にヘテロ接合性又はほぼヘテロ接合性の個体）を指す。
「近交系」という用語は、遺伝的にホモ接合性又はほぼホモ接合性の集団を指す。近交系は、例えば、兄弟／姉妹育種若しくは自殖のいくつかの周期を通して又は二ゲノム性半数体生成において得られる。
「二ゲノム性半数体系統」という用語は、別の培養物に由来する安定した近交系を指す。特定の培地及び環境で栽培されたいくつかの花粉粒（半数体）は、ｎ個の染色体を含有する胚を発達させ得る。次に、これらの胚は、「倍化」され、２ｎ個の染色体を含有する。これらの胚の子孫は、「二ゲノム性半数体」と呼ばれ、本質的にもはや分離しない（安定している）。
「栽培品種」又は「品種」という用語は、天然の品種と区別される、園芸のための派生品種を指す。本発明のある実施形態において、栽培品種又は品種は、市販されている。
「台木」という用語は、挿木に対する受け部として用いられる植物を指す。典型的には、台木植物及び挿木は遺伝子型が異なるものである。実施形態において、本発明に係る植物は台木植物として用いられる。
「遺伝的に固定される」という用語は、遺伝要素を通常含有しない植物のゲノム中に安定的に組み込まれた遺伝要素を指す。遺伝的に固定される場合、遺伝要素は、有***配によって容易且つ予測可能な形式で他の植物に伝達され得る。
「植物」又は「植物部分」という用語は、以後、本発明に係る（例えばトマト）植物から得ることができる植物部分、器官又は組織であって、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、シュート、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、***組織部位、カルス組織、種子、挿木、細胞若しくは組織培養物、又は特に果実を産生する植物へと成長した場合、本発明に係る線虫耐性形質を依然として示す植物の任意の他の部分若しくは産物を含むが、これらに限定されない、植物部分、器官又は組織を指す。
「植物」は、任意の発達段階における任意の植物である。
「植物種子」は、実施形態にいずれかに記載の植物へと成長する種子である。
「植物細胞」は、プロトプラスト及び細胞壁を含む植物の構造的及び生理的単位である。植物細胞は、単離された単一の細胞若しくは培養された細胞の形態であり得、又は例えば植物組織、植物器官若しくは植物全体などの高度に組織化された単位の一部としてのものであり得る。
「植物細胞培養物」は、例えば、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚株、胚嚢、接合子及び様々な発達段階における胚などの植物単位の培養物を意味する。
「植物器官」は、根、茎、葉、花芽又は胚など、明確で視覚的に構造化された植物の分化した部分である。
本明細書において使用される際、「植物組織」は、構造的及び機能的単位へと組織化された植物細胞の群を意味する。植物中又は培養物中の任意の植物組織が含まれる。この用語は、限定はされないが、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物並びに構造的及び／又は機能的単位へと組織化された植物細胞の任意の群を含む。上に列挙されるか又はこの定義によって包含される任意の特定のタイプの植物組織と併せた又はそれを伴わないこの用語の使用は、任意の他のタイプの植物組織を除外することが意図されない。
本明細書において使用される際、「育種」という用語及びその文法的変化形は、子孫の個体を生成する任意のプロセスを指す。育種は、有性若しくは無性又はそれらの任意の組合せであり得る。例示的な非限定的な育種のタイプは、交配、自殖、倍加半数体の派生的生成及びそれらの組合せを含む。
本明細書において使用される際、「確立された育種集団」という語句は、育種計画、例えば商業的育種計画において親によって生成され、及び／又は親として使用される潜在的育種パートナーの集合を指す。確立された育種集団のメンバーは、典型的に、遺伝子的に及び／又は表現型的に十分に特性決定されている。例えば、対象とするいくつかの表現型形質は、例えば、異なる環境条件下、複数の場所及び／又は異なる時間で評価され得る。代わりに又は加えて、表現型形質の発現に関連する１つ又は複数の遺伝子座が同定され得、育種集団のメンバーの１つ又は複数は、１つ又は複数の遺伝子座に関して、及び１つ又は複数の遺伝子座に関連する１つ又は複数の遺伝子マーカーに関して遺伝子型を決定され得る。
本明細書において使用される際、「二倍体個体」という語句は、２組の染色体を有する個体を指し、典型的に、１つは、その２つの親のそれぞれからのものである。しかしながら、ある実施形態において、二倍体個体は、例えば、植物が自殖して植物の次の世代を生成する場合、同じ単一の生物からその「母親」及び「父親」の染色体の組を受け継ぎ得ることが理解される。
「ホモ接合」とは、本発明の範囲内において、相同染色体における１つ以上の対応する遺伝子座における同様の対立遺伝子を指すと理解される。本発明の文脈において、例えば配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子であって、前記ＳｍＤ１タンパク質が向上した線虫耐性を付与する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含むものである、特定の対立遺伝子の２つの同一のコピーを特定の遺伝子座で含む植物は、対応する遺伝子座でホモ接合である。
「ヘテロ接合」とは、本発明の範囲内において、相同染色体における１つ以上の対応する遺伝子座における異なる対立遺伝子を指すと理解される。本発明の文脈において、例えば配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子であって、前記ＳｍＤ１タンパク質が向上した線虫耐性を付与する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含むものである、特定の対立遺伝子の１つのコピーを特定の遺伝子座で含むトマト植物は、対応する遺伝子座でヘテロ接合である。
「優勢な」対立遺伝子は、本発明の範囲内において、ヘテロ接合又はホモ接合状態で存在する場合に表現型を決定する対立遺伝子を指すと理解される。
「劣勢」対立遺伝子は、ホモ接合状態で存在する場合のみに表現型を決定する対立遺伝子を指す。
「ミスセンス突然変異」は、単一のヌクレオチドの変更によって異なるアミノ酸をコードするコドンをもたらされる点突然変異を指すと理解される。
「戻し交配」は、本発明の範囲内において、雑種の子孫が元の親の一方と繰り返し交配されるプロセスを指すものと理解される。異なる反復親が後の戻し交配において使用され得る。
「遺伝子座」は、本発明の範囲内において、遺伝子又は形質に寄与する任意の他の遺伝要素若しくは因子を含む染色体上の領域を指すものと理解される。
本明細書において使用される際、「マーカー遺伝子座」は、個体のゲノムに存在し、対象とする１つ又は複数の遺伝子座に関連するヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列を含む染色体上の領域を指し、これは、遺伝子又は形質に寄与する任意の他の遺伝的決定因子若しくは因子を含み得る。「マーカー遺伝子座」は、プローブとして使用される核酸の配列などのゲノム配列と相補的なポリヌクレオチド配列を含む染色体上の領域も指す。
本明細書において使用される際、本開示の主題に関連する「有***配」及び「有性生殖」という語句は、配偶子の融合により（例えば、植物において受粉により種子を生成するなどの受精によって）子孫を生成することを指す。「有***配」又は「他家受精」は、ある実施形態において、一個体の、別の個体による受精（例えば、植物における他花受粉）である。「自殖」という用語は、ある実施形態において、自家受精又は自家受粉による種子の生成、すなわち花粉及び胚珠が同じ植物からのものであることを指す。
本明細書において使用される際、「遺伝子マーカー」という語句は、対象とする１つ又は複数の遺伝子座に関連する個体のゲノムの特徴（例えば、個体のゲノムに存在するヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列）を指す。ある実施形態において、遺伝子マーカーは、文脈に応じて、対象とする集団において多型であるか、又は多型によって占有される遺伝子座である。遺伝子マーカーとしては、多くの他の例の中でも、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）、インデル（すなわち挿入／欠失）、単純反復配列（ＳＳＲ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、多様性アレイ技術（ＤＡｒＴ）マーカー及び増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）が挙げられる。遺伝子マーカーは、例えば、表現型形質の変動性に寄与する染色体上の対立遺伝子を含有する遺伝子座の位置を特定するのに使用され得る。「遺伝子マーカー」という語句は、プローブとして使用される核酸の配列などのゲノム配列と相補的なポリヌクレオチド配列も指し得る。
「遺伝子マーカー」は、それが関連する遺伝子座内又は遺伝子座外にある（すなわちそれぞれ遺伝子内又は遺伝子外の）染色体上の位置に物理的に位置し得る。換言すれば、遺伝子マーカーは、典型的に、対象とする遺伝子座に対応する、遺伝子又は機能的変異の染色体上、例えば遺伝子の外部の制御要素内の位置が同定されておらず、遺伝子マーカーと、対象とする遺伝子座との間にゼロ以外の組み換え率がある場合に用いられるが、本開示の主題は、物理的に遺伝子座の境界内にある（例えば、限定はされないが、遺伝子のイントロン又はエクソン内の多型などの遺伝子に対応するゲノム配列内の）遺伝子マーカーを用いることもできる。本開示の主題のある実施形態において、１つ又は複数の遺伝子マーカーは、１～１０個のマーカーを含み、ある実施形態において、１つ又は複数の遺伝子マーカーは、１０個を超える遺伝子マーカーを含む。
本明細書において使用される際、「遺伝子型」という用語は、細胞又は生物の遺伝子構成を指す。個体の「一連の遺伝子マーカーに対する遺伝子型」は、個体のハプロタイプに存在する１つ又は複数の遺伝子マーカー遺伝子座に対する特定の対立遺伝子を含む。当該技術分野において公知であるように、遺伝子型は、遺伝子座が関連しているか若しくは関連していないか、及び／又は連鎖しているか若しくは連鎖していないかにかかわらず、単一の遺伝子座又は複数の遺伝子座に関連し得る。ある実施形態において、個体の遺伝子型は、遺伝子の１つ又は複数が、対象とする表現型（例えば、本明細書に定義される量的形質）の発現に関与するという点で関連する１つ又は複数の遺伝子に関連する。したがって、ある実施形態において、遺伝子型は、量的形質の１つ又は複数の遺伝子座における個体内に存在する１つ又は複数の対立遺伝子の概略を含む。ある実施形態において、遺伝子型は、ハプロタイプ（本明細書において以下に定義される）に関して発現される。
本明細書において使用される際、「遺伝資源」という用語は、集団又は他の個体群（例えば、種）の遺伝子型の全体を指す。「遺伝資源」という用語は、植物材料、例えば様々な対立遺伝子のレポジトリとして機能する植物の群も指し得る。「適合された遺伝資源」という語句は、例えば、所与の環境的又は地理的領域に対して遺伝子的優位性が証明された植物材料を指す一方、「非適合遺伝資源」、「原遺伝資源」及び「外来遺伝資源」という語句は、例えば、所与の環境的又は地理的領域に対して遺伝的価値が未知であるか又は証明されていない植物材料を指し、したがって、「非適合遺伝資源」という語句は、ある実施形態において、確立された育種集団の一部ではなく、確立された育種集団のメンバーに対する公知の関係を有さない植物材料を指す。
本明細書において使用される際、「核酸」という語句は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、典型的なＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡポリマー）、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル化オリゴヌクレオチドなど、生物学的ＲＮＡ又はＤＮＡに典型的ではない塩基を含むオリゴヌクレオチド）などを含む、ヌクレオチドの鎖に対応し得るモノマー単位の任意の物理的鎖を指す。ある実施形態において、核酸は、一本鎖、二本鎖、複数鎖又はそれらの組合せであり得る。特に示されない限り、本開示の主題の特定の核酸配列は、任意に、明示的に示される任意の配列に加えて相補的な配列を含むか又はそれをコードする。
本明細書において使用される際、「複数」という用語は、２つ以上を指す。したがって、「複数の個体」は、少なくとも２つの個体を指す。ある実施形態において、複数という用語は、全体の半分超を指す。例えば、ある実施形態において、「複数の集団」は、その集団のメンバーの半分超を指す。
本明細書において使用される際、「子孫」という用語は、特定の交配の子孫を指す。典型的に、子孫は、２つの個体の育種から生じるが、いくつかの種（特にいくつかの植物及び雌雄同体の動物）は、自殖し得る（すなわち同じ植物が雄性及び雌性配偶子の両方のドナーとしての役割を果たす）。子孫は、例えば、Ｆ1、Ｆ2又は任意の次世代のものであり得る。
「レシピエント植物」という用語は、本明細書において、向上した線虫耐性に係る突然変異対立遺伝子を含むドナー植物から得られるＤＮＡを受け取ることとなる植物を示すために用いられる。
「ドナー植物」は、本発明の範囲内において、向上した線虫耐性に関連する代替又は変異型対立遺伝子をもたらす植物を意味すると理解される。
本明細書において使用される際、「質的形質」という語句は、主要な表現型効果を示す１つ又はいくつかの遺伝子によって制御される表現型形質を指す。このため、質的形質は、典型的に単純に遺伝する。植物における例としては、限定はされないが、花の色及びいくつかの公知の病害抵抗性、例えば真菌の斑点病（Ｆｕｎｇｕｓ ｓｐｏｔ）抵抗性又はトマトモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）抵抗性などが挙げられる。
「マーカーによる選択」は、本発明の範囲内において、例えば植物由来の１つ又は複数の核酸を検出する遺伝子マーカーの使用を指すものと理解され、選択的育種計画においてそれらの植物が使用（又は回避）され得るように、核酸は、望ましい（又は望ましくない）形質に関する遺伝子を有する植物を同定するように所望の形質に関連している。
ＤＮＡ中の単一部位における変異である一塩基多型（ＳＮＰ）は、ゲノムの変異の最もよく見られるタイプである。一塩基多型（ＳＮＰ）は、ゲノム（又は他の共有配列）中の一塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）が生物学的種のメンバー間又は個体の対合染色体間で異なるときに起こるＤＮＡ配列の変異である。例えば、異なる個体由来の２つの配列決定されたＤＮＡ断片、ＡＡＧＣＣＴＡと、ＡＡＧＣＴＴＡとは、一塩基の相違を含む。この場合、２つの対立遺伝子：Ｃ及びＴがある。ＳＮＰアレイの基本原理は、ＤＮＡマイクロアレイと同じである。これらは、ＤＮＡハイブリダイゼーション、蛍光顕微鏡法及びＤＮＡ捕捉の集合である。ＳＮＰアレイの３つの構成要素は、核酸配列（すなわち増幅配列又は標的）を含むアレイ、１つ又は複数の標識された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイゼーションシグナルを記録し、それを解釈する検出システムである。
所望の対立遺伝子の有無は、二本鎖ＤＮＡ色素又は蛍光レポータープローブ法を用いたリアルタイムＰＣＲによって決定され得る。
「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」は、本発明の範囲内において、ゲノムのＤＮＡの特定の領域又はサブセットを比較的大量に生成し、それにより、それらの領域に基づく様々な分析を可能にする方法を指すものと理解される。
「ＰＣＲプライマー」は、本発明の範囲内において、ＤＮＡの特定領域のＰＣＲ増幅において使用される一本鎖ＤＮＡの比較的短い断片を指すものと理解される。
「表現型」は、本発明の範囲内において、遺伝的に制御される形質の区別できる特性を指すものと理解される。
本明細書において使用される際、「表現型形質」という語句は、そのゲノム、プロテオーム及び／又はメタボロームと環境との相互作用から生じる個体の外見又は他の検出可能な特性を指す。
「多型」は、本発明の範囲内において、２つ以上の異なる形態の遺伝子、遺伝子マーカー若しくは遺伝した形質又は例えば選択的スプライシング、ＤＮＡメチル化などによって得ることができる遺伝子産物の集団の存在を指すものと理解される。
「選択的育種」は、本発明の範囲内において、親として望ましい形質を有するか又はそれを示す植物を使用する育種の計画を指すものと理解される。
「試験用」植物は、本発明の範囲内において、試験される植物における形質を遺伝的に特性決定するのに使用される植物を指すものと理解される。典型的に、試験される植物は、「試験用」植物と交配され、交配の子孫における形質の分離比が採点される。
本明細書において使用される際、「プローブ」は、特定の標的分子又は細胞構造を認識しそれに結合することができ、したがって標的分子又は構造の検出を可能にする原子又は分子の群を指す。特に、「プローブ」は、分子ハイブリダイゼーションによって相補的な配列の存在を検出し、それを定量化するのに使用され得る標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。
本明細書において使用される際、「ハイブリダイズする」という用語は、従来のハイブリダイゼーション条件、好ましくは５×ＳＳＰＥ、１％のＳＤＳ、１×デンハート液が溶液として使用され、及び／又はハイブリダイゼーション温度が３５℃～７０℃、好ましくは６５℃であるハイブリダイゼーション条件を指す。ハイブリダイゼーション後、好ましくは、まず２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳを用いて、続いて０．２×ＳＳＣを用いて、３５℃～７５℃、特に４５℃～６５℃であるが、特に５９℃の温度で洗浄が行われる（ＳＳＰＥ、ＳＳＣ及びデンハート液の定義に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の引用箇所を参照されたい）。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（上記）に記載される高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が特に好ましい。特に好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄が上で示されるように６５℃で行われる場合に存在する。例えば、４５℃で行われるハイブリダイゼーション及び洗浄を用いた非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、より好ましくなく、３５℃ではさらにより好ましくない。
本発明によれば、「前記位置Ｘに対応する位置」という用語（Ｘは、本出願中のそれぞれの文脈において見出されるいずれかの数字である）は、後述される配列番号におけるそれぞれの位置を含むのみならず、ＳｍＤ１対立遺伝子に対応する、又は、ＳｍＤ１タンパク質をコードするいずれかの配列をも含み、ここで、基準配列番号とのアライメント後、それぞれの位置は、異なっているが、基準配列番号について示されたものに対応する数字を有していてもよい。ＳｍＤ１対立遺伝子又はＳｍＤ１タンパク質配列のアライメントは、実用的な様式で種々のアライメントツールを適用することにより、例えば、以下に記載のツールを適用することにより行うことが可能である。
「配列同一性」。２つ以上の核酸又はタンパク質配列に関する「同一の」又は「同一性」という用語は、同じであるか、又は以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して若しくは目視検査によって測定される際、最大の一致について比較及び整列したとき、同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。互いに比較される２つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一であるより短い配列のヌクレオチド残基のパーセンテージに関連する。本明細書において使用される際、２つの配列間のパーセント同一性／相同性は、２つの配列の最適アライメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列に共有される同一位置の数の関数である（すなわち％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、本明細書において後述されるように数学アルゴリズムを用いて行われ得る。例えば、配列同一性は、従来のように、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）などのコンピュータプログラムを用いて決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の最も高い配列同一性を有するセグメントを発見するために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２（１９８１），４８２－４８９の遺伝子座相同性アルゴリズムを利用する。特定の配列が例えば本発明の参照配列と９５％の同一性を有するかどうかを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔ又は別の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメータは、好ましくは、同一性のパーセンテージが参照配列の全長にわたって計算されるように、及び参照配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの相同性ギャップが許容されるように調整される。Ｂｅｓｔｆｉｔを使用する場合、いわゆる任意選択的パラメータは、好ましくは、それらの予め設定された（「初期」）値のままである。所与の配列と、本発明の上記の配列との間の比較において見られる逸脱は、例えば、付加、欠失、置換、挿入又は組み換えによって引き起こされ得る。このような配列比較は、好ましくは、プログラム「ｆａｓｔａ２０ｕ６６」（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａによるバージョン２．０ｕ６６、１９９８年９月；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３，６３－９８、添付の例及びｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／も参照されたい）を用いても行われ得る。この目的のために、「初期」パラメータ設定が使用され得る。
２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の示唆は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。「特異的にハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば、細胞全体の）ＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件下でその配列のみに分子が結合、二重鎖形成又はハイブリダイズすることを指す。「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するために、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させることによって適合され得る小さいミスマッチを包含する。
サザン及びノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲にわたる指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られる。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列について熱的融点より約５℃低くなるように選択される。典型的に、「ストリンジェントな条件」下において、プローブは、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にハイブリダイズしない。
「熱的融点」は、（規定のイオン強度及びｐＨで）標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブの溶融温度（Ｔm）に等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットにおいてフィルタ上に１００個を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で、１ｍｇのヘパリンを含む５０％のホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは、一晩行われる。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、約１５分間にわたって７２℃で０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、１５分間にわたって６５℃で０．２倍のＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（下記）を参照されたい）。多くの場合、高ストリンジェンシー洗浄前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖に対する中程度ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分間にわたって４５℃で１倍のＳＳＣである。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖に対する低ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分間にわたって４０℃で４～６倍のＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０～５０個のヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的に、ｐＨ７．０～８．３で約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的に約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）を含み、温度は、典型的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観察されるものの２倍（又はそれを超える）の信号対雑音比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードによって許容される最大のコドンの縮退を用いて形成される場合に生じる。
植物、種子、果実。
第１の実施形態において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９０％又は９１％、好ましくは９２％、９３％又は９４％、より好ましくは９５％、９６％又は９７％、さらにより好ましくは９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子を含む植物を提供するものであり、ここで、前記ＳｍＤ１タンパク質は、向上した線虫耐性を付与する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１～１０８のいずれか一つに対応する位置にミスセンス突然変異を含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にミスセンス突然変異を含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にスレオニン－イソロイシン置換を含む。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記ＳｍＤ１対立遺伝子はＳｍＤ１ｂ対立遺伝子である。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態に係る植物を提供するものであり、ここで、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質をコードする前記ＳｍＤ１対立遺伝子は、人工的に形成される。さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態に係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、基本的に生物学的プロセスによって排他的に得られるものではない。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記ＳｍＤ１対立遺伝子は、配列番号２０に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％核酸配列同一性を有する。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、トマト、タバコ、コショウ、カボチャ、スイカ、メロン、キュウリ及びダイズを含むリストから選択される。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、自殖、二ゲノム性半数体又はハイブリッド植物である。
他の実施形態において、本発明に係る植物は雄性不稔である。他の実施形態において、本発明に係る植物は、細胞質雄性不稔である。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は台木である。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、前記ＳｍＤ１対立遺伝子の２つのコピーを含む。
さらなる実施形態において、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、メロイドギネ属の種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）、シストセンチュウ属の種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）及びグロボデラ属の種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）、好ましくはメロイドギネ属の種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の線虫、より好ましくはサツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）、キタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）、メロイドギネエンテロロビイ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ）及びジャワネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）に対する中度の耐性を付与する。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、ソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子は、配列番号１９又は配列番号２１の核酸配列を含む。さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子は、配列番号１９又は配列番号２１の核酸配列からなる。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、前記ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子は、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２から入手可能である。
さらなる実施形態において、本発明は先行する実施形態のいずれかに係る植物を提供するものであり、ここで、線虫による外寄生の場合、前記ＳｍＤ１対立遺伝子を有さない同一の栽培種の植物と比して、卵塊を有するメスの数は２５％、好ましくは５０％少ない。
さらなる実施形態では、先行する実施形態のいずれかに係る栽培種の植物から、好ましくは栽培種のトマト植物から、より好ましくは、栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物から入手可能である植物部位、器官又は組織が提供され、これは、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、シュート、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、***組織部位、カルス組織、種子、挿木、細胞若しくは組織培養物、又は、特に果実を産する植物に成長した場合にも本発明に係る向上した線虫耐性形質を依然として示す植物のいずれかの他の部分若しくは産物を含むが、これらに限定はされない。
さらなる実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかに係る植物によりもたらされた果実を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかに係るトマト植物によりもたらされるトマト果実を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかの植物をもたらす種子を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかに係るトマト植物をもたらすトマト種子を提供する。
対立遺伝子、マーカー。
本発明はさらに、植物における線虫耐性形質に関連する、突然変異ＳｍＤ１対立遺伝子、好ましくは突然変異ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子に関する。さらなる実施形態において、本発明は突然変異ＳｍＤ１対立遺伝子であって、野生型のものは配列番号２０であり、配列番号１のＳｍＤ１タンパク質をコードし、又は、野生型ＳｍＤ１対立遺伝子が、配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするものに関し、ここで、前記突然変異ＳｍＤ１対立遺伝子は、向上した線虫耐性表現型をもたらすミスセンス突然変異を有する修飾ＳｍＤ１タンパク質をコードする。さらなる実施形態において、配列番号２１は、配列番号２の修飾ＳｍＤ１タンパク質をコードする突然変異ＳｍＤ１対立遺伝子である。さらなる実施形態において、本発明のトマトＳｍＤ１対立遺伝子は、染色体９に位置している。本発明のさらなる実施形態において、本発明に係る１つのトマトＳｍＤ１ｂ対立遺伝子は、本発明の前記１つのＳｍＤ１ｂ対立遺伝子を含む、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２又はその子孫若しくは祖先であるドナー植物から入手可能であり、入手され、又は、誘導される。
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１又は２をコードする単離された核酸配列に関する。さらなる実施形態において、前記単離された核酸配列は配列番号１８、１９、２０又は２１である。
本発明は、栽培種のトマト植物、特に栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物において線虫耐性形質対立遺伝子を検出するためのキットを開示するものであり、ここで、前記キットは、配列番号２２の順方向プライマー及び配列番号２３の逆方向プライマーによって表される１つのＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含む。このキットでは本発明のＳｍＤ１ｂ対立遺伝子の検出が可能であり、ここで、得られる単位複製配列は配列決定され、及び、本発明のＴ１４Ｉ（ＡＣＴ－－＞ＡＴＴコドン）突然変異が検出される。本文脈において、Ｔ１４Ｉ突然変異体は、ＳＮＰマーカーとして用いられることが可能である。
本発明はまた、栽培種の植物、特に栽培種のトマト植物、特に栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物における線虫耐性形質対立遺伝子の診断的選択及び／又は遺伝子型決定のための線虫耐性形質対立遺伝子の診断的選択及び／又は遺伝子型決定を開示するための本発明に係るＳＮＰマーカーの使用を開示する。
本発明はさらに、植物、特に栽培種のトマト植物、特に本発明に係るソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物における、線虫耐性形質対立遺伝子の存在を識別するため、及び／又は、栽培種の植物、特に栽培種のトマト植物、特に本発明に係るソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物における線虫耐性形質対立遺伝子の遺伝子移入を監視するための本発明に係るＳＮＰマーカーの使用を開示し、これは本明細書に記載のとおりである。
本発明はさらに、統計的に相関性があり、それ故、線虫耐性形質と、又は、開示のマーカーの一方と同時分離する、１つのオリゴヌクレオチドプライマー、又は、配列番号２２及び配列番号２３の一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを伴うＰＣＲ反応で入手可能であるポリヌクレオチド（増幅産物）を開示し、この増幅産物は、本発明のＳｍＤ１ｂ対立遺伝子を含む２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２又はその子孫若しくは祖先から、同等のプライマー又はプライマー対を伴うＰＣＲ反応で入手可能である増幅産物に対応するが、ただし、それぞれの対立遺伝子は、前記植物中に依然として存在しており、及び／又は、その対立遺伝子と見なされ得る。
上記のＰＣＲ反応において入手可能である前記増幅産物のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を示す前記増幅産物及び／又はポリヌクレオチドの配列に対して、少なくとも６０％、特に少なくとも６５％、特に少なくとも７０％、特に少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドもまた本明細書において予期されている。
本発明に係るものであって、上記において本明細書に記載の増幅産物は次いで、線虫耐性形質対立遺伝子の同定に使用可能である新規プライマー及び／又はプローブの生成又は開発に使用可能である。
本発明はしたがって、一実施形態において、本発明に係るものであって、上記において本明細書に記載の増幅産物から技術分野において公知である方法によって開発された派生マーカー、特に派生プライマー又はプローブにさらに関し、この派生マーカーは、向上した線虫耐性形質遺伝子座に遺伝的に関連付けられている。
本発明はまた、向上した線虫トレランスを示すと共に、配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子の少なくとも１つのコピーを有する栽培種のトマト植物、好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物を同定する方法に関し、ここで、前記ＳｍＤ１タンパク質は、修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含み、この方法は：
ａ）突然変異植物の個体群を得るステップ；
ｂ）前記個体群を前記ＳｍＤ１対立遺伝子の存在についてスクリーニングするステップ
を含む。
育種方法。
他の実施形態において、本発明は、栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種の植物ソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、植物部位又は種子を提供する方法に関し、ここで、前記方法は、以下の：
ａ）先行する実施形態のいずれかに係る第１の植物と、本発明のＳｍＤ１対立遺伝子を欠く第２の植物とを交配するステップ、
ｂ）子孫の植物を得るステップ、及び、
ｃ）任意に、前記子孫の植物であって、向上した線虫耐性を示すことを特徴とする前記植物を選択するステップ
を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、向上した線虫耐性を示す栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物を生産する方法であって、
ａ）本発明のＳｍＤ１対立遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む先行する実施形態のいずれかに係る第１の植物と、前記ＳｍＤ１対立遺伝子を欠く第２の栽培種の植物とを交配するステップ；
ｂ）向上した線虫耐性を示す子孫の植物を選択するステップ；
を含む方法を提供するものであり、ステップｂ）における選択は、配列番号２２及び２３のプライマー対を有する本発明のＳｍＤ１対立遺伝子の存在を検出し、続いて、得られる単位複製配列を配列決定することにより実施される。
さらなる実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかの方法に関し、ここで、ステップａ）における第１の植物は、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２である。
他の実施形態において、本発明は、向上した線虫耐性を示す栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物を提供する方法であって：
ａ）先行する実施形態のいずれかに係る第１の植物と、本発明のＳｍＤ１対立遺伝子を欠く第２の植物とを交配するステップ、
ｂ）子孫栽培種の植物を得るステップ、及び、
ｃ）任意に、前記子孫の植物であって、線虫の外寄生の場合に、卵塊を有するメスの数が、前記ＳｍＤ１対立遺伝子を欠く同一の栽培種の植物と比して２５％、好ましくは５０％少ないことを特徴とする前記植物を選択するステップ
を含む方法に関する。
さらなる実施形態においては、先行する実施形態のいずれかの方法であって、ステップａ）における第１のトマト植物が、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２又はその子孫若しくは祖先である方法が考慮される。
他の実施形態においては、向上した線虫耐性を示す栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物を生産する方法であって、以下の：
ａ）前述の実施形態のいずれかに係る植物の種子を提供するステップ、
ｂ）前記種子を出芽させ、そこから、成熟した繁殖力のある植物を育てるステップ、
ｃ）ａ）における前記植物の自家受粉を誘発し、果実を成長させ、及び、そこから、繁殖力のある種子を収穫するステップ、並びに
ｄ）ｃ）において収穫した種子から植物を育て、及び、向上した線虫耐性植物を選択するステップ
を含む方法が考慮される。
本発明のさらなる実施形態は、配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を植物に導入することにより向上した線虫耐性を示す植物を提供する方法であって、前記ＳｍＤ１タンパク質が、向上した線虫耐性を付与する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含む方法を提供することである。本発明のさらなる実施形態は、配列番号２のＳｍＤ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列をトマト植物に導入することにより向上した線虫耐性を示すトマト植物を提供する方法を提供する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号１９又は２１のヌクレオチド配列をトマト植物に導入することにより向上した線虫耐性を示すトマト植物を提供する方法を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、植物における線虫耐性を向上する方法であって、
ａ）突然変異植物の個体群を得るステップ；
ｂ）そのアミノ酸配列中にミスセンス突然変異を有するＳｍＤ１タンパク質をコードする修飾ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子を含む突然変異植物を選択するステップ
を含む方法を提供する。
修飾ＳｍＤ１対立遺伝子はまた、例えば化学的突然変異誘発（例えばＥＭＳ突然変異誘発）といった突然変異誘発によって導入可能である。或いは、又は、その後、修飾ＳｍＤ１対立遺伝子は、ｔｉｌｌｉｎｇ技術を用いて同定及び／又は導入可能である。
修飾ＳｍＤ１対立遺伝子はまた、標的化突然変異誘発、例えば相同的組み換え、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、オリゴヌクレオチド系突然変異誘発、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システム、又は、ゲノムを編集するためのいずれかの代替技術によって導入可能である。
或いは、修飾ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子はまた、ベクターに含まれ得るヌクレオチド構築物を介したトランスジェニック又はシスジェニック（ｃｉｓ－ｇｅｎｉｃ）な方法によって導入可能である。
使用
他の実施形態において、本発明は、植物を育てると共に、作物及び／又は果実を生産し及び収穫するための、先行する実施形態のいずれかに係る栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物、植物部位又は種子の使用に関する。
他の実施形態において、本発明は、生鮮市場又は食品加工のための果実を生産するための、先行する実施形態のいずれかに係る栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物の使用に関する。
他の実施形態において、本発明は、先行する実施形態のいずれかに係る栽培種のトマト植物、好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物、植物部位又は種子の使用に関し、ここで、栽培種のトマト植物、好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物、植物部位又は種子は、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２又はその子孫若しくは祖先である。
さらなる実施形態において、本発明は、圃場、温室又はビニールハウスにおいて播種するための、先行する実施形態のいずれかに係る栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物、植物部位又は種子の使用に関する。さらなる実施形態において、本発明は、台木植物としての、先行する実施形態のいずれかに係る栽培種の植物、好ましくは栽培種のトマト植物、より好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物、植物部位又は種子の使用に関する。
本発明はまた、植物を育てるための先行する実施形態のいずれかに係る植物から入手可能である線虫耐性繁殖材料の使用に関し、ここで、前記線虫耐性は、標準的なアッセイ、特に以下の実施例４に記載のアッセイで評価し得る。
さらなる実施形態において、本発明は、前記対立遺伝子を欠く植物に向上した線虫耐性形質を付与するための本発明のＳｍＤ１対立遺伝子の使用に関する。
本発明はさらに、前記形質を欠く植物に線虫耐性形質を遺伝子移入するための、先行する実施形態のいずれかに係る植物の使用に関する。
本発明における記載に基づいて、本明細書に記載されている、本発明に係るＳｍＤ１対立遺伝子の１つのコピーを含む、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２又はその子孫若しくは祖先を有する当業者にとって、技術分野において周知である育種技術を用いることにより、本発明の前記対立遺伝子を種々のタイプの他のトマト植物に導入することは容易である。或いは、当業者にとって、線虫トレランス表現型に関連する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を有するＳｍＤ１対立遺伝子の開示を含む本発明における記載に基づいて、技術分野において周知である技術を用いて本発明を再現することは容易である。
種子寄託の詳細
出願人は、ソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２の２５００個の種子を、２０１９年１１月２９日に、ＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託した。寄託した種子は、本発明のＳｍＤ１対立遺伝子について分離した個体群から入手した。したがって、寄託した種子の５０％は突然変異対立遺伝子にホモ接合であり、寄託した種子の２５％は突然変異対立遺伝子にヘテロ接合であり、及び、種子の２５％は野生型ＳｍＤ１対立遺伝子にホモ接合である。
出願人は、本特許の付与の告示が公告されるまで、又は、本出願が、拒絶され、取り下げられ、若しくは、みなし取り下げとされた場合には、出願日から２０年間は、ＥＰＣ規則３２（１）若しくは対応する他の国々の法規若しくは条約（専門家証人条項）にしたがって、寄託した材料は専門家のみに公開されることを要求する。
実施例１：線虫エフェクタの標的としての植物タンパク質ＳｍＤ１の同定
サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）エフェクタＭｉＥＦＦ１８（Ｍｉｎｃ１８６３６；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）をベイトとして用いる酵母ツーハイブリッド実験において、トマト植物タンパク質ＳｍＤ１が線虫エフェクタの洗剤的な標的であったことを観察した。先ず、この相互作用を、２つのトマトＳｍＤ１遺伝子Ｓｌ０６ｇ０８４３１０．２．１及びＳｌ０９ｇ０６４６６０．２．１についてＳｍＤ１タンパク質が１００％同一（配列番号１及び３）であるトマトにおいて実証した。次いで、相互作用を、シロイヌナズナ遺伝子ＡＴ４Ｇ０２８４０由来のＳｍＤ１ｂタンパク質（配列番号４）について、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）において検証した。補足したＳｍＤ１タンパク質、及び、その対応する遺伝子を表１に示す。
Figure 2023523531000001
酵母ツーハイブリッド実験において、線虫エフェクタと相互作用するＳｍＤ１タンパク質の一部は、最初の１０８アミノ酸であることが示された。図１は、植物種間における高度な保存を強調するＳｍＤ１アミノ酸配列のアライメントを開示する。
実施例２Ａ：線虫感受性に対するシロイヌナズナｓｍｄ１突然変異の効果
線虫に対する感受性におけるＳｍＤ１遺伝子の役割を検証するために、シロイヌナズナｓｍｄ１ａ（ＡＴ３Ｇ０７５９０）及びｓｍｄ１ｂ（ＡＴ４Ｇ０２８４０）突然変異植物（Ｃｏｌｕｍｂｉａバックグラウンド）を回収し（Ｅｌｖｉｒａ－Ｍａｔｅｌｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に供した際におけるその感受性レベルについて評価した。
シロイヌナズナｓｍｄ１ｂ突然変異体は、野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ植物又はｓｍｄ１ａ突然変異と比した場合に、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に著しく感染しにくいことが見出されたが（図２Ａ）、これは、ＡｔＳｍＤ１ｂが線虫感受性機構に主に関与していることを示唆している。
実施例２Ｂ：線虫感受性に対するベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）ＳｍＤ１発現停止の効果
線虫に対する感受性におけるＳｍＤ１遺伝子の重要な役割を確認するために、ＳｍＤ１遺伝子を発現停止したベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を作成し、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に供した場合における感受性レベルについて評価した。
ＳｍＤ１遺伝子が発現停止されたベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物は、対照タバコ植物と比した場合に、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に著しく感染しにくいことが再度見出されたが（図２Ｂ）、これは、ＮｂＳｍＤ１遺伝子が線虫感受性機構に同様に関与していることを示唆している。
実施例２Ｃ：線虫感受性に対するトマトＳｍＤ１発現停止の効果
最後に、線虫に対する感受性におけるＳｍＤ１遺伝子の重要な役割もまたトマトにおいて確認した。ＳｍＤ１遺伝子が発現停止されたトマト植物をＳａｉｎｔ－Ｐｉｅｒｒｅバックグラウンドにおいて作成し、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に供した場合における感受性レベルについて評価した。ＳｍＤ１遺伝子が発現停止されたトマト植物は、対照トマト植物と比した場合に、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に著しく感染しにくいことが再度見出されたが（図２Ｃ）、これは、ＳｌＳｍＤ１遺伝子が線虫感受性機構に同様に関与していることを示唆している。
しかしながら、ＳｌＳｍＤ１遺伝子が発現停止されたトマト植物はまた、根系が著しく減少し（図２Ｄ）、全体的に矮化し、最終的に果実収量が減少するという商業的に不都合な表現型をも示した。結果的に、ＳｍＤ１遺伝子においてナンセンス突然変異又はＫＯ－タイプ突然変異で変性された植物は、線虫に対してはより耐性であるにもかかわらず、植物内において機能性のＳｍＤ１タンパク質が欠けていることにより、望ましくない特性を示す可能性が高い。
実施例３：商業的に適切なトマトＳｍＤ１ｂ突然変異の同定
作物の経済的価値を保ちつつも線虫に対して高い耐性を示すトマト植物を得るために、Ｍ８２バックグラウンドにおいてＥＭＳを用いて突然変異体を作成し、ｔｉｌｌｉｎｇアプローチにおいてスクリーニングして、ＳｍＤ１タンパク質のミスセンス突然変異をもたらす修飾ＳｍＤ１遺伝子を有するトマト植物を同定した。そのＳｍＤ１ｂ遺伝子にミスセンス突然変異を有するｔｉｌｌｉｎｇトマト系統株（系統株＃１２３、１８ＴＥＰ２５０１２３、突然変異に対してホモ接合、寄託した系統株１９ＴＥＰ２５０１２２の祖先植物、配列番号１の位置１４にミスセンス突然変異を有する）をもたらすものに、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）及び卵塊を形成するメスを播種し、感染から６週間後に根の重量を測定し、対照Ｍ８２系統株＃１１７（１８ＴＥＰ２５０１１７、＋／＋、ＷＴ）と比較した。
根の形態及び重量の分析では、＃１２３突然変異系統株の根系の純増が見られた（図３（Ａ））。同時に、＃１２３突然変異系統株では、卵塊を形成するメスの数に５０％の有意な低減が見られた（マンホイットニーテスト、α＝２．５％）（図３（Ｂ））。
ＳｍＤ１ｂ（Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０６４６６０）における突然変異のホモ接合性を検証するために、各系統株の６株の植物の遺伝子型決定をプライマーＳｌＳｍＤ１ｂ－Ｍ８２－Ｆ（ＡＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＣＧ（配列番号２２））及びＳｌＳｍＤ１ｂ－Ｍ８２－Ｒ（ＡＣＴＣＴＡＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＣＴＴ（配列番号２３））を用いて行った。４２０ｂｐ単位複製配列の配列決定の結果では、すべての＃１１７植物が野生型ＳｍＤ１ｂ対立遺伝子を有し、その一方で、すべての＃１２３植物が、ミスセンス突然変異（Ｔ１４Ｉ）をもたらすホモ接合ＳｍＤ１ｂ突然変異対立遺伝子（ＡＣＴ－－＞ＡＴＴコドン）を有することが分かった。
Figure 2023523531000002
結論として、ＳｍＤ１ｂミスセンス突然変異（Ｔ１４Ｉ）がネコブセンチュウ（サツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ））に対する高い耐性をもたらし、その一方で、植物内におけるＳｍＤ１タンパク質の機能が保存されることが分かった。植物種においてＳｍＤ１タンパク質の構造がかなり保存されていることを考慮すると、オルソロガスＳｍＤ１ｂ遺伝子における同様のミスセンス突然変異により、＃１２３突然変異トマト系統株で観察されるものと同様の効果がもたらされることが想定される。
実施例４：トマト植物における線虫トレランスを評価するためのプロトコル
サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）（Ｃａｌｉｓｓａｎｅ系統株）を、温室中においてトマト植物（ソラヌムリコペルシカムｃｖサンピエール（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｃｖ Ｓｔ Ｐｉｅｒｒｅ）で増殖させる。新たに孵化した２齢幼虫（Ｊ２ｓ）を既に記載されているとおり集めた（Ｃａｉｌｌａｕｄ ａｎｄ Ｆａｖｅｒｙ，２０１６）。無菌トマト種子（ｃｖ Ｍ８２）を砂と混合した土壌（１：１）に播種し；４℃で４８時間後、サンプルを２４℃で１６時間の光周期のグロースチャンバに移した。７日齢の小植物を個々に、小型のポットの土壌／砂中に移した。一ヶ月経ったトマトの実生に、植物１株当り１５０匹のサツマイモネコブセンチュウ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）Ｊ２ｓを播種した。感染の６週間後に根を回収し、エオシン０．５％で染色した。卵塊を形成するメス及び根の重量を感染の６週間後に測定した。
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Claims (18)

  1. 配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子を含む植物であって、前記ＳｍＤ１タンパク質は、向上した線虫耐性を付与する修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含む、植物。
  2. 前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１～１０８のいずれか一つに対応する位置にミスセンス突然変異を含む、請求項１に記載の植物。
  3. 前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にミスセンス突然変異を含む、請求項１又は２に記載の植物。
  4. 前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にスレオニン－イソロイシン置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の植物。
  5. 前記ＳｍＤ１対立遺伝子は突然変異誘発により得られる、請求項１～４のいずれか一項に記載の植物。
  6. 前記植物は、トマト、タバコ、コショウ、カボチャ、スイカ、メロン、キュウリ及びダイズを含むリストから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の植物。
  7. 前記植物は自殖、二ゲノム性半数体又はハイブリッド植物である、請求項６に記載の植物。
  8. 前記植物は台木である、請求項６又は７に記載の植物。
  9. 前記植物は、前記ＳｍＤ１対立遺伝子の２つのコピーを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の植物。
  10. 前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は、メロイドギネ属の種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）、好ましくはサツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）、キタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）、メロイドギネエンテロロビイ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ）及びジャワネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）の線虫に対する向上した耐性を付与する、請求項１～９のいずれか一項に記載の植物。
  11. 前記植物は、ソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の植物。
  12. 前記修飾ＳｍＤ１タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の植物。
  13. 前記ＳｍＤ１対立遺伝子は、２０１９年１１月２９日にＮＣＩＭＢ系統番号４３５２９でＮＣＩＭＢに寄託されているソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）系統株１９ＴＥＰ２５０１２２から得られる、請求項１２に記載のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の植物の植物部位であって、前記ＳｍＤ１対立遺伝子を含む植物部位。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の植物を産する種子。
  16. 植物における線虫耐性を向上させる方法であって、
    ａ）突然変異植物の個体群を得るステップ；
    ｂ）そのアミノ酸配列中にミスセンス突然変異を有するＳｍＤ１タンパク質をコードする修飾ＳｍＤ１対立遺伝子を含む突然変異植物を選択するステップ
    を含む、方法。
  17. 向上した線虫トレランスを示すと共に配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＳｍＤ１タンパク質をコードするＳｍＤ１対立遺伝子の少なくとも１つのコピーを有する栽培種のトマト植物、好ましくは栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物を同定する方法であって、前記ＳｍＤ１タンパク質は修飾ＳｍＤ１タンパク質をもたらすミスセンス突然変異を含み：
    ａ）突然変異植物の個体群を得るステップ；
    ｂ）前記個体群を前記ＳｍＤ１対立遺伝子の存在についてスクリーニングするステップ
    を含む方法。
  18. 栽培種のトマト植物、特に栽培種のソラヌムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物において線虫耐性形質ＳｍＤ１対立遺伝子を検出するキットであって、配列番号２２の順方向プライマー及び配列番号２３の逆方向プライマーによって表される１つのＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含むキット。
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