JP2023519740A - 安定化型ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫学的有効量のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質などのウイルス融合タンパク質抗原と、安定化量の抗ウイルス性化合物とを含むワクチン組成物、及びかかるワクチン組成物の調製方法に関する。

Description

導入
本発明は、医薬分野に関する。本発明は、詳細には、安定化型ワクチン組成物、詳細には組換え融合前クラスＩ融合タンパク質を含む安定性ワクチン組成物、及びその使用に関する。

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）又はインフルエンザウイルスなどのエンベロープ型ウイルスは、その表面に発現する特殊な膜融合タンパク質によって触媒される過程であるウイルス膜と細胞膜との融合を誘導することによって細胞に侵入する。この融合糖タンパク質は、感染性ビリオンの表面に易変的な（準安定性の）形態で存在し、前記準安定性の融合前コンホメーションから安定性の融合後コンホメーションへの不可逆的タンパク質リフォールディングによって膜融合をドライブする動的な融合機械である。

エンベロープ型ウイルスの融合タンパク質は、ウイルスによる標的細胞との融合をドライブするためにそれが見せる全般的な不可逆的フォールディング機構に基づき異なる種類に分類することができる。パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の融合（Ｆ）タンパク質、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）エンベロープタンパク質、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）スパイクタンパク質及びオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄｅａｅ）ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質など、無関係なウイルスの融合タンパク質がクラスＩ融合タンパク質に分類されており、これらは類似した機構を通じて易変的な融合前状態から安定性の融合後状態へとリフォールディングするが、いかなる有意な配列相同性も示さない。種々のクラスＩ融合タンパク質について、融合前コンホメーション及び融合後コンホメーションの構造が決定されており、この複雑な融合機械の機構に関して洞察を与えている。

このような構造研究によれば、易変的な野生型タンパク質と同じ抗原部位を提示する安定性のクラスＩ融合タンパク質が、強力な中和抗体を効率的に引き出し、ひいてはワクチンの抗原としての使用に好適であることもまた示されている。ウイルス融合タンパク質がワクチンの免疫原として使用されるとき、その融合を起こす機能は重要でない。しかしながら、ウイルスに結合できる交差反応性抗体がワクチンによって誘導されることを確実にするために、免疫原が天然のウイルス表面タンパク質に擬態することが重要である。実際、タンパク質ワクチンの免疫原性は、特に立体エピトープ（天然のフォールディングによって一体となったポリペプチド鎖の異質な領域のところであって、抗体はそれに結合する必要がある）に関して、鍵となるタンパク質抗原の構造的完全性に（大きく）依存する。ひいては不可逆的なコンホメーション変化及び不可逆的な凝集は、ワクチンの有効性の低下につながり得る。従って、前記クラスＩ融合タンパク質をロバストで効果的なワクチン免疫原として開発するには、このような準安定性の融合タンパク質をその融合前コンホメーションに安定して維持することが望ましい。

しかしながら、多くのタンパク質ワクチンは、熱、若しくは４℃での（長期）貯蔵、又は凍結融解に不安定であり、ひいては貯蔵時にその効力が失われ得る。（熱）安定性の向上は、例えば辺地及び貧困地域で直面し得るコールドチェーンの問題を解決し、ワクチンの保管寿命を延ばし得る。ひいては、（熱）安定性が増加した及び／又は保管寿命が増加した安定ワクチン組成物を生み出すことが必要とされている。

本発明は、クラスＩ融合タンパク質などのウイルス融合タンパク質を抗原として含むワクチン組成物に関し、このワクチン組成物は、（熱）安定性の向上を呈する。本発明のワクチン組成物は、凍結又は冷蔵条件下で長期間貯蔵することができ、臨床及び商業生産での使用に好適である。本発明はまた、安定化型ワクチン組成物の調製方法にも関する。

第１の態様において、本発明は、免疫学的有効量のウイルス融合タンパク質抗原、詳細には融合前クラスＩ融合タンパク質と、安定化量の抗ウイルス性化合物とを含むワクチン組成物に関する。

本発明のワクチン組成物は、これまで開示された組成物と比較したとき、熱安定性の向上及び撹拌ストレス、熱ストレス（例えば凍結融解ストレス）、ｐＨ変動によるストレスに対する安定性の向上を呈し、その結果として長い保管寿命を呈する。

本発明によれば、意外にも、安定化量の抗ウイルス性化合物、例えば小分子融合阻害薬又はウイルス侵入阻害薬などを前記ワクチン組成物に添加することにより、凍結融解サイクルなど、ストレスのある条件下であっても、ウイルス融合タンパク質が融合前コンホメーションに安定したまま保たれることが示されている。

更なる態様において、本発明は、タンパク質抗原を含むワクチン組成物の調製方法に関し、前記方法は、免疫学的有効量の前記タンパク質抗原を安定化量の抗ウイルス性化合物と混合することを含む。

詳細な態様において、本発明は、ワクチン組成物中のウイルス融合タンパク質の凝集を低減する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、ワクチン組成物の凍結融解後における前記ワクチン組成物中のウイルス融合タンパク質の凝集を低減する方法を提供する。

更に別の態様において、本発明は、タンパク質抗原を含むワクチンの保存方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのワクチン組成物を調製することを含む。

本発明は更に、タンパク質抗原を含む液体ワクチン組成物を安定して維持する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのワクチン組成物を２～８℃の温度で少なくとも２０ヵ月間にわたって貯蔵することを含む。

前述の概要、並びに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、更に良く理解されるであろう。本発明が、図面に示される厳密な実施形態に限定されないことが理解されなければならない。

図１：Ａ．精製したｐｒｅＦのＳＥＣ分析。Ｂ．非還元（レーン２）及び還元（レーン３）条件下でのＲＳＶ融合前Ｆタンパク質（ｐｒｅＦ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。Ｃ．ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０６モノクローナル抗体によるＱ Ｏｃｔｅｔアッセイで、精製したｐｒｅＦを測定した。ＣＲ９５０１は部位Ｖに結合し、ＲＳＶ－Ｆの融合前コンホメーションに特異的である（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ ２０１９）。ＣＲ９５０６は部位ＩＩに結合し、ＲＳＶ Ｆの融合前コンホメーション及び融合後コンホメーションに特異的である。 （上記の通り。） （上記の通り。） 示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によるＰｒｅＦタンパク質の温度安定性分析。℃単位での抗ウイルス性化合物無しの融合前Ｆと有りの融合前Ｆとの融解温度の差（ΔＴｍ_５０）。使用した抗ウイルス性化合物は、ローマ数字Ｉ～ＶＸＩで示す（表１）。安定化化合物は、３つの三量体：化合物モル比：１：３、１：１０及び１：１００で添加する。安定化化合物は全て、ＤＭＳＯ中に溶解させた。対照試料として、１：３、１：１０及び１：１００組成物で使用したのと同じ量のＤＭＳＯをタンパク質に添加した。 図３：融合阻害薬（三量体：化合物モル比：１：３）無し（ｎ＝６）（Ａ）並びにＩＩ（Ｂ）及びＩＩＩ（Ｃ）有り（ｎ＝３）の緩慢凍結／融解処理後におけるリン酸緩衝液中のＰｒｅＦ三量体の分析的ＳＥＣ。６分より前にあるピークは凝集体であり、７分のピークは三量体ピークである。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図４：異なる製剤緩衝液中における緩慢凍結処理後の融合阻害薬（表１）有り及び無しでの分析的ＳＥＣによって測定された残留ＰｒｅＦ三量体。図４Ａでは、４つの異なる製剤緩衝液、即ち、ＡＰ１、ＦＢ１２並びに製剤１及び２を試験する。Ｂでは、比が異なる大規模な一組の化合物を製剤１中で試験する。Ｃでは、２つの異なるｐＨ値（ｐＨ７．０、製剤５ａ及びｐＨ８．３、製剤５ｂ）の追加的な緩衝液（製剤５）を試験する。Ｄは、製剤組成物１、２及びポリソルベート無しのＡＰ１（ＡＰ１－Ｐ）の結果を示す。ｙ軸上に４℃対照試料に対する相対的な三量体含有量を描く。データ平均値±ＳＤ。点線：１００％三量体、破線：９０％三量体。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図５：３７℃（Ａ）及び４０℃（Ｂ）で６週間貯蔵した後の安定化化合物ＩＩＩ（三量体：化合物モル比：１：３及び１：９）有り及び無しの異なる製剤緩衝液中におけるｐｒｅＦタンパク質のＳＥＣ分析。保持時間は凝集体が約３．１分及び三量体が約４．２分である。高温で６週間貯蔵した試料を破線として示し、黒色の線として示す４℃に置いておいた試料と比較する。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 安定化化合物を添加することがトランスフェクション後の粗上清中におけるＲＳＶ Ｆ発現に及ぼす影響。３つ全ての試料について、同じ容積の上清を注入した。融合前コンホメーションで安定化しているＲＳＶ Ｆ（ｐｒｅＦ；配列番号１）（黒色の実線）、不安定化型コンセンサスＲＳＶ Ａ Ｆ（黒色の破線；配列番号２）及び化合物ＩＩＩ（０．２８μＭの化合物濃度）の存在下で発現させた不安定化型コンセンサスＲＳＶ Ａ Ｆ（配列番号２）（灰色の線）について、上清中の三量体含有量をＳＥＣを用いて測定した。 図７：ＨＩＶ－１ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰを記載されるとおりに作製し、精製した（Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８）。Ａ．精製したＨＩＶ－１ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰのＳＥＣ分析。Ｂ．精製したＥｎｖ ＣｏｎＢ ＳＯＳＩＰに５０倍モル過剰で添加して４℃で１週間貯蔵した、侵入阻害薬ＸＶＩＩ（表２）の添加有り及び無しでの融解温度（Ｔｍ_５０）。Ｃ．ＡｌｐｈａＬＩＳＡで測定した広域中和抗体（ｂＮＡｂ）及び非広域中和抗体（非Ｎａｂ）の結合。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図８：（Ａ）５０倍過剰のインフルエンザＢ侵入阻害薬ＸＸＶＩＩ有り及び無しでのマサチューセッツ／２／１２（左側のパネル）及びコロラド／０６／２０１７（右側のパネル）に対応する精製した可溶性ＨＡタンパク質の融解温度（Ｔｍ_５０）（表３）。Ｔｍ_５０は、添加なし（黒色）、ＤＭＳＯのみ（灰色）及びＤＭＳＯ＋阻害薬（白色）のタンパク質について、ＤＳＦを用いてトリプリケートで測定した。（Ｂ）ＥｘｐｉＨＥＫ２９３Ｆ細胞（破線）についてＤＭＳＯの添加有り（点線）及びＤＭＳＯ＋３０倍過剰の侵入阻害薬の添加有り（黒色の線）でのトランスフェクション４日後の細胞培養上清中における可溶性Ｂ型インフルエンザＨＡエクトドメイン（ＵＦＶ １８０９３３）の分析的ＳＥＣ分析。４．０分に三量体ピーク及び４．３分に単量体ピーク。 （上記の通り。） 摂氏４０度で６週間後の可溶性Ａ型インフルエンザＨＡエクトドメイン（Ｈ１Ｎ１ Ａ／ブリスベン／５９／２００７）（灰色の破線）についてＤＭＳＯの添加有り（灰色の点線）及び化合物ＸＸＩＶの添加有り（黒色の実線）での分析的ＳＥＣ分析。保持時間は三量体が約４．１分及び単量体が約４．５分である。 液体安定性。異なる製剤緩衝液中に安定化化合物ＩＩＩ有り及び無しで３７℃で貯蔵した後の９、１６及び２６週間後のＳＥＣ分析に基づくＲＳＶ ｐｒｅＦタンパク質の三量体含有量。三量体：化合物モル比：１：３及び１：９。三量体含有量は、４℃対照に対する相対で示される。個々のレプリケート（ｎ＝２）、平均値及び標準偏差を指示するエラーバーが描かれる。 透析 過剰の安定化化合物ＩＩＩ。透析及び緩慢凍結後、作業台上で試料を解凍し、その（ａ）分析的ＳＥＣによる凝集体レベル及び（ｂ）ＤＳＦによる融解温度（０日目）について評価した。次に試料を４℃及で貯蔵し、２１日目及び８４日目に更なるＤＳＦ分析用のアリコートを取り分けた。個々のレプリケート（緩慢凍結についてｎ＝５；ＤＳＦについてｎ＝３）、平均値及び標準偏差を指示するエラーバーが描かれる。 ＵＦ／ＤＦ 過剰の安定化化合物ＩＩＩ。ＵＦ／ＤＦ及び緩慢凍結後、試料をその（ａ）分析的ＳＥＣによる凝集レベル及び（ｂ）ＤＳＦによる融解温度（０日目）について評価した。次に試料を４℃及で貯蔵し、２１日目及び８４日目に更なるＤＳＦ分析用のアリコートを取り分けた。個々のレプリケート（緩慢凍結についてｎ＝５；ＤＳＦについてｎ＝３）、平均値及び標準偏差を指示するエラーバーが描かれる。 図１３：異なる緩衝液及び過剰の安定化化合物ＩＩＩを用いた緩衝液交換。安定化化合物ＩＩＩを含有する試料を室温（ＲＴ）で２４時間プレインキュベートした。次に試料を透析するか（ＰＳ２０無しの製剤２及びＡＰ１緩衝液に対するｐｒｅＦ）、又はＵＦ／ＤＦし（ＰＳ２０無しの製剤１に対するｐｒｅＦ並びにＰＳ２０無しの製剤１及び２及びＡＰ１に対するｐｒｅＦ＋１：５０）、続いて、緩慢凍結した（２４時間で－７０℃に）。次に、（ａ）分析的ＳＥＣによる凝集レベル、（ｂ）ＤＳＦによる融解温度（０日目）について試料を評価した。個々のレプリケート（緩慢凍結についてｎ＝５；ＤＳＦについてｎ＝３）、平均値及び標準偏差を指示するエラーバーが描かれる。（ｃ）ＵＦ／ＤＦ後の安定化化合物ＩＩＩの定量化。予めＵＦ／ＤＦし、スナップ凍結した試料を使用して、緩衝液交換後のＦＩの量を定量化した。定量化はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて実施した。左のＹ軸に各試料からの濃度をプロットした。右のＹ軸は、三量体当たりの安定化化合物ＩＩＩ分子の当量に対応する。 （上記の通り。） ４２日目のＲＳＶ ＣＬ５７中和抗体力価。０及び２８日目にマウスを免疫し、４２日目に血清を採取した。ＲＳＶ ＣＬ５７株を使用したホタルルシフェラーゼアッセイによりＶＮＡ力価を測定した。ＩＣ９０力価のｌｏｇ２値として表す。黒色のバーは、各群内での応答平均値を特定し、点線は定量下限（ＬＬｏＱ）を表す。 ＲＳＶ ＣＬ５７中和抗体力価の統計的分析。４倍マージン（２ｌｏｇ２）での全用量間非劣性試験（多重比較のためのボンフェローニ補正を用いたＴｏｂｉｔモデル）により、ｐｒｅＦ＋安定化化合物ＩＩＩで免疫した群のＶＮＡ力価とｐｒｅＦタンパク質単独で免疫した群の力価との間の比較を行った。点が差の推定平均値を表し、水平の髭が信頼区間を表す。－２の点線は、予め設定した非劣性マージンを指し示している。０の点線は、ベンチマーク（融合阻害薬無しのｐｒｅＦ）の推定平均値を指し示している。 分化型ヒト気道細胞培養物（ｈＡＥＣ）における４２日目のＲＳＶ中和。０及び２８日目にマウスを免疫し、４２日目に血清を採取した。ＧＦＰレポーターをコードするＲＳＶ－Ａ２株を使用して、気液界面で分化させた初代ヒト気道細胞でＶＮＡ力価を測定した。感染後４日でＣｙｔａｔｉｏｎ １自動顕微鏡を使用してトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）インサート全体をイメージングした。感染細胞が灰色で描かれる。３回のバイオロジカルレプリケートの代表的なインサートを示す。

循環ヒト病原性ウイルスの多くは脂質二重層のエンベロープに包まれており、ウイルスエンベロープと標的細胞膜の融合を誘導することによってその標的細胞に感染する。ウイルス融合タンパク質は、膜融合反応を誘導してウイルスの侵入を可能にする鍵となる因子である。そのＲＮＡゲノムを宿主細胞に送達するため、こうしたエンベロープ型ウイルスでは、ウイルスによっては２つの表面糖タンパク質：受容体結合タンパク質（例えば、ＲＳＶ Ｇタンパク質）と融合タンパク質（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質）とを含む膜融合機構が進化している。しかしながら、エボラ及びＨＩＶなど、幾つかのエンベロープ型ウイルスは、粒子表面に単一のタンパク質を提示するのみであり、必然的にそれが細胞表面への付着の媒介並びに続く膜融合反応の誘導の両方を行う。

現在、特徴付けられている構造的に違いのある融合タンパク質には、インフルエンザＨＡが典型例であるクラスＩ；フラビウイルスエンベロープタンパク質Ｅによって例示されるクラスＩＩ；及びラブドウイルス糖タンパク質Ｇが典型例であるクラスＩＩＩと称される３つのクラスがある。

ウイルス膜と宿主細胞膜との融合は、クラスＩ融合タンパク質を用いるウイルスのライフサイクルにおいて決定的に重要である。クラスＩ融合タンパク質を担持するエンベロープ型ウイルスの群には、インフルエンザウイルス（オルトミクソウイルス科の４つの属：Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ型インフルエンザ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ、ニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ））並びにパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の関連する麻疹、ムンプス及びパラインフルエンザウイルスなどの呼吸器ウイルスが含まれ、これにはまた、最近出現した、ヒトに重篤な疾患を引き起こす人畜共通ヘンドラ及びニパ脳炎ウイルスも含まれる。クラスＩ群の他の呼吸器ウイルスメンバーには、コロナウイルス（ＣｏＶ）（コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ））であって、季節性呼吸器感染症の原因であるもの（例えば、ＮＬ７３ ＣｏＶ及びＨＫＵ１ ＣｏＶ）、並びに人畜共通重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ ＣｏＶ）及び中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ ＣｏＶ）が含まれる。ＨＩＶ及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）が例として挙げられるレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）は、別の重要な一部のクラスＩウイルスに相当する。最後に付け加えると、幾つかの重要な出血熱病原体がクラスＩ融合タンパク質を有し、最も注目すべきものは、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）の他のメンバーと共にラッサウイルス、並びにエボラウイルス及びフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）の近縁生物である。

これらのウイルスの一部に対しては効率的なワクチンが存在するものの、大多数は予防的又は治療的処置がない。公知のワクチンは、典型的には、細胞への病原体の侵入を遮断する抗体を引き出すことによって働き、エンベロープ型ウイルスの場合には、それには典型的には、ウイルスエンベロープ付着又は融合タンパク質への抗体結合が関わる。

上記に説明したとおり、融合タンパク質ベースのワクチンの免疫原活性は、特に立体エピトープ（天然のフォールディングによって一体となったポリペプチド鎖の異質な領域のところであって、抗体はそれに結合する必要がある）に関して、融合タンパク質抗原の構造的完全性に大きく依存する。ひいては不可逆的なコンホメーション変化及び凝集が、ワクチンの有効性の低下につながり得る。従って、ワクチン組成物の生産、輸送及び貯蔵時に融合タンパク質の構造特性、詳細にはワクチン中の融合タンパク質の二次、三次及び四次構造が保持されることが、極めて重要である。

概して、クラスＩ融合タンパク質は典型的には易変的な（準安定性の）タンパク質であることが公知である。例えば、ＲＳＶ Ｆは複数のコンホメーションをとり得る。ひいては、ウイルス表面上では、ＲＳＶ Ｆは準安定性の融合前コンホメーションで存在し、それが感染過程の中で再編成されて、より安定性の高い融合後形態となり、宿主細胞へのウイルス侵入が可能となる。ＲＳＶ自然感染によって誘導される中和抗体の大多数は、融合前コンホメーションに特異的なエピトープを指向することが示されている。従って、ＲＳＶ融合タンパク質をベースとする効果的なワクチンの開発に際しては、この準安定性の融合タンパク質を融合前コンホメーションに安定して維持することが望ましい。

例えば三量化ドメイン及び安定化アミノ酸置換によって融合前コンホメーションで安定化させた、且つ撹拌又は複数回の凍結／融解サイクルを受けても２～８度で長時間にわたって安定している準安定性のクラスＩ融合タンパク質は、それであってもなお、２４時間の超緩慢凍結処理のような更に苛酷な条件の後には凝集体を形成し得るか、又は熱、若しくは４℃での長期貯蔵に不安定であり、ひいては貯蔵時にその効力が失われ得る。かかるタンパク質の安定性の向上は、例えば辺地及び貧困地域で直面し得るコールドチェーンの問題を解決することができ、及びワクチンの保管寿命を延ばすことができる。

本発明は、免疫学的有効量のウイルス融合タンパク質抗原と安定化量の抗ウイルス性化合物とを含むワクチン組成物を提供し、この組成物は安定性の向上を呈する。特定の実施形態において、融合タンパク質は、準安定性の融合タンパク質である。準安定性の融合タンパク質は、融合前コンホメーションで安定しているが、その安定性は、融合前コンホメーションのままであり続けるには不十分である。特定のトリガー（受容体結合、ｐＨの降下、温度上昇）が、タンパク質を非融合前コンホメーションへと押し動かし得る。上記に説明したとおり、その機能のためには、融合タンパク質は不安定性又は準安定性である必要がある。しかしながら、ワクチン目的では、それを融合前コンホメーションで安定化させることが重要である。不安定性、まして準安定性がある場合には、融合前コンホメーションは製造及び貯蔵を「生き延びる」ことができず、ワクチンの使用にまでたどり着かない恐れがある。

好ましい実施形態において、融合タンパク質は、（準安定性の）三量体クラスＩ融合タンパク質である。

本明細書で使用されるとき、「免疫学的有効量」とは、それを必要としている対象において所望の免疫効果又は免疫応答を誘導するのに十分な抗原の量を意味する。特定の実施形態において、免疫学的有効量とは、それを必要としている対象において免疫を誘導する、例えば、ウイルス感染に対する防御効果を提供するのに十分な量を意味する。特定の実施形態において、免疫学的有効量とは、それを必要としている対象の免疫応答を亢進させるのに十分な量を意味する。例えば、プライム・ブーストレジメンにあるものなど、免疫応答を生じさせる能力を有する１つ以上の他の成分又は免疫原性組成物と組み合わせて使用されるとき、免疫学的有効量とは、その１つ以上の他の成分又は免疫原性組成物によって誘導される免疫応答を亢進させるのに十分な量であり得る。免疫学的有効量は、対象の身体条件、年齢、体重、健康、詳細な適用、例えば、免疫応答の誘導か、それとも防御免疫の付与か、及び免疫が所望されるウイルス感染症など、種々の要因に応じて異なり得る。有効量は、当業者が容易に決定することができる。

本明細書で使用されるとき、安定性の向上（又は増加）とは、前記融合タンパク質抗原の免疫学的有効量を含むが抗ウイルス性化合物の無い組成物と比較したときの安定性の向上（又は増加）を意味する。用語の向上と増加とは、この点で同義的に使用される。安定性の向上（又は増加）は、熱安定性の向上（又は増加）、撹拌ストレスに対する安定性の向上（又は増加）、熱ストレス（例えば凍結融解ストレス）に対する安定性の向上（又は増加）、及び／又はｐＨ変動によるストレスに対する安定性の向上（又は増加）を含み得る。本明細書で使用されるとき、熱安定性とは、タンパク質抗原が相対的に高い温度でその化学的又は物理的構造の不可逆的な変化に耐える性質を指す。

本発明によれば、ウイルス融合タンパク質抗原、詳細には（準安定性の）クラスＩ融合タンパク質は、前記ウイルスタンパク質に結合する及び／又はその機能を妨げることが公知の安定化量の抗ウイルス性化合物を添加することによって安定化させ得ることが示された。本発明の組成物は、安定性の増加を呈する。本発明は、タンパク質の構造特性、詳細には二次、三次及び四次構造の保持が重要性を持つワクチン組成物に特に適用可能である。本発明を適用することにより、タンパク質抗原の不可逆的なコンホメーション変化及び不可逆的な凝集並びに結果として生じる、天然のタンパク質に対する免疫応答の誘導能の喪失が起こる可能性が大幅に低下する。本発明は、限定はされないが、タンパク質抗原の単離又は発現、その精製、ワクチン製品の製造並びにその輸送及び貯蔵を含めた、その全製品寿命にわたるタンパク質抗原の安定化に適用可能である。

抗ウイルス性化合物は、宿主細胞内でのウイルス性病原体の発育を阻害することによってウイルス感染症の治療に特別に使用される抗微生物薬の部類である。本発明によれば、抗ウイルス性化合物は、ウイルスに結合し及び／又はそれが標的細胞に侵入するのを妨げることが公知の任意の抗ウイルス性化合物であってよい。本発明によれば、抗ウイルス性化合物は、典型的には、小分子化合物、即ち、低分子量（９００ダルトン未満）の有機化合物である。多くの公知の薬物が小分子である。特定の実施形態において、抗ウイルス性化合物は、融合阻害薬及び／又はウイルス侵入阻害薬である。小分子融合阻害薬及び／又はウイルス侵入阻害薬は公知であり、典型的には、ＲＳＶ、ＨＩＶ又はインフルエンザなどのウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の（実験的）治療において使用される。

本発明によれば、前記融合及び／又はウイルス侵入阻害薬の「安定化量」とは、典型的には、タンパク質抗原を安定化させるのに十分な、しかし前記化合物の治療有効量を下回る量である。

特定の好ましい実施形態において、抗ウイルス性化合物の安定化量は、前記抗ウイルス性化合物の治療有効量に満たない量である。ひいては、ワクチンとして投与されたとき、その抗ウイルス性化合物は何ら治療的な（抗ウイルス性の）効果を及ぼさないことになる。

特定の実施形態において、抗ウイルス性化合物の安定化量は、前記抗ウイルス性化合物の治療有効量の少なくとも１００分の１、好ましくは少なくとも１０００分の１、より好ましくは少なくとも１０，０００分の１又は少なくとも１００，０００分の１、例えば５００，０００分の１である。

特定の実施形態において、三量体融合タンパク質及び前記抗ウイルス性化合物は、限定はされないが、１：３、１：９、１：１０、１：２７、１：３０、１：５０、１：１５０、１：１００、又は１：３００の比など、１：１以上１：３００以下、好ましくは１：１以上３００，０００以下の範囲の三量体：化合物比で存在する。本発明によれば、例えば１：３の三量体：化合物比とは、１モル当量の融合タンパク質三量体、例えばＲＳＶ Ｆタンパク質三量体、及び３モル当量の阻害薬化合物を意味する。

特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質、好ましくは融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、即ち、例えば安定化突然変異及び／又は異種三量化ドメインの付加によって融合前コンホメーションで安定化しているＦタンパク質である。

ＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質は、典型的には、幾つかのＮ－結合型グリコシル化部位を含む５７４アミノ酸の単一の前駆体として発現する。この前駆体分子Ｆ０が小胞体内でオリゴマー化して、各単量体の２つの部位でタンパク質分解のプロセシングを受ける結果、２つのジスルフィドで連結された断片：Ｆ２（小さい方のＮ末端断片）及びＦ１の三量体となる。このタンパク質は、Ｆ１のＣ末端領域の疎水性ペプチドを介してビリオン膜にアンカリングされ、それが惹起されるまでは準安定性の融合前コンホメーションをとると考えられている。惹起は、標的膜及び／又は受容体への結合がなくても起こり得る。ＲＳＶ Ｆタンパク質は、２つの７アミノ酸リピートドメイン、ＨＲ１（別名ＨＲＡ）及びＨＲ２（別名ＨＲＢ）を含有する。融合時、融合タンパク質のフォールディング中間体が形成され、これは３つのＨＲ１ドメインのコイルドコイル構造を含有している。この三量体コイルドコイル構造が不可逆的にリフォールディングして、３つのＨＲ２ドメインとの「６ヘリックス束」（６ＨＢ）複合体となり、ウイルス膜と細胞膜とが隣り合って並ぶことになる。

融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質については、既に記載されている。本発明は、限定はされないが、国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレット、国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレット、国際公開第２０１７／００５８４４号パンフレット、国際公開第２０１７／１７４５６８号パンフレット及び国際公開第２０１７／２０７４８０号パンフレットに記載されるとおりの融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質を含め、幾つかの融合前Ｆタンパク質に適用可能である。好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質は、配列番号１の融合前Ｆタンパク質であり、これは２つのフューリン切断部位でプロセシングを受け、ｐ２７領域を切り出す結果、ジスルフィド架橋によって一体に保持されたＦ２及びＦ１で構成されるプロセシングされたＦタンパク質となり、配列番号１０のアミノ酸配列を有するプロセシングされたタンパク質を生じることになる。

本発明によれば、抗ウイルス性化合物は、ＲＳＶウイルスに結合し及び／又はそれが標的細胞に融合するのを妨げる任意の小分子化合物であってよい。当業者は、好適な融合又は侵入阻害薬を特定することが可能であろう。例えば、抗ウイルス性化合物は、国際公開第２００９／１０６５８０号パンフレットに記載されるとおり特定されるＲＳＶ侵入及び／又は融合阻害薬及びその類似体であってもよい。

特定の実施形態において、抗ウイルス性化合物は、表１の化合物Ｉ～ＸＶＩからなる群から選択されるＲＳＶ Ｆ侵入又は融合阻害薬及びその好適な類似体である。

好ましい実施形態において、抗ウイルス性化合物は、３－［［５－ブロモ－１－（３－メチルスルホニルプロピル）ベンズイミダゾール－２－イル］メチル］－１－シクロプロピル－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－オン（化合物ＩＩＩ）である。

他の実施形態において、クラスＩ融合タンパク質は、ＨＩＶエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質、好ましくは融合前ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質である。ＨＩＶのエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質は、ＨＩＶビリオンのエンベロープ上に発現し、ＨＩＶによるＨＩＶ標的細胞の標的化及びその細胞膜への付着並びにウイルス膜と標的細胞膜との融合を可能にする。

融合前ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質については、既に記載されている。本発明は、特定の融合前ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質に限定されない。好適なＨＩＶ ｅｎｖタンパク質は、例えば、Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２３：５８４－５９５（２０１８））によって記載されている。好ましいＨＩＶ ｅｎｖは、配列番号２の融合前ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質である。

上記に指摘したとおり、本発明によれば、抗ウイルス性化合物は、ＨＩＶウイルスに結合し及び／又は標的細胞においてそれが侵入するのを妨げる任意の小分子化合物であってよい。当業者は、好適な融合又は侵入阻害薬を特定することが可能であろう。特定の実施形態において、抗ウイルス性化合物は、限定はされないが、表２の化合物ＸＶＩＩ～ＸＸＩＩＩからなる群から選択されるＨＩＶ融合又は侵入阻害薬及びその好適な類似体など、ＨＩＶ融合及び／又は侵入阻害薬である。

更なる実施形態において、クラスＩ融合タンパク質は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、好ましくは融合前ＨＡタンパク質である。ヘマグルチニン（ＨＡ）は、インフルエンザウイルスの主要エンベロープ糖タンパク質である。ＨＡは、侵入過程の中で２つの主要な機能を有する。第一に、ヘマグルチニンは、シアル酸受容体との相互作用を通じて標的細胞の表面へのウイルスの付着を媒介する。第二に、ウイルスのエンドサイトーシス後、続いてＨＡはウイルス膜とエンドソーム膜との融合を惹起し、標的細胞の細胞質へとそのゲノムを放出する。ＨＡは、約５００アミノ酸の大型のエクトドメインを含み、これが宿主由来の酵素によって切断されると、ジスルフィド結合によって連結されたまま保たれる２つのポリペプチド（ＨＡ１及びＨＡ２）が生じる。Ｎ末端断片の大半（ＨＡ１ドメイン、３２０～３３０アミノ酸）が、受容体結合部位及びウイルス中和抗体によって認識されるほとんどの決定基を含有する膜遠位球状「頭部ドメイン」を形成する。小さい方のＣ末端部分（ＨＡ２ドメイン、約１８０アミノ酸）は、球状ドメインを細胞膜又はウイルス膜にアンカリングするステム様構造を形成する。

特定の実施形態において、クラスＩ融合タンパク質は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）Ａ又はＢタンパク質、好ましくは融合前ＨＡ Ａ又はＢタンパク質である。

本発明によれば、抗ウイルス性化合物は、インフルエンザウイルスに結合し及び／又は標的細胞においてそれが侵入するのを妨げる任意の小分子化合物であってよい。当業者は、好適な融合又は侵入阻害薬を特定することが可能であろう。特定の実施形態において、抗ウイルス性化合物は、インフルエンザ融合及び／又は侵入阻害薬である。特定の実施形態において、抗ウイルス性化合物は、Ａ型インフルエンザＨＡについては、表３の化合物ＸＸＩＶ～ＸＸＶＩ、及びその好適な類似体からなる群から選択され、又はＢ型インフルエンザＨＡについては、化合物ＸＶＩＩ、又はその好適な類似体である。

特定の実施形態において、ワクチン組成物は、液体組成物である。凍結条件下（－８０℃）で安定な液体組成物は、典型的には特別な発送及び高価な貯蔵施設を必要とするため、特に流通網の末端において、信頼できるコールドチェーンはほぼ不可能となる。従って、好ましいワクチン組成物は、２～８℃の温度範囲で、しかしまたそれより高い温度でも、例えば室温か又は更に高くても（例えば３７℃）熱安定性が増加しているなど、安定性が増加した液体組成物であって、また、２４時間の超緩慢凍結融解処理後であっても安定したまま保たれる液体組成物である。かかる組成物は、普通の冷蔵庫で貯蔵することができ、且つすぐに容易に投与することができる。加えて、冷蔵されているが凍結はされていない条件での貯蔵により、例えばリソースの限られた状況、例えば凍結機能が利用不可能な状況でのワクチン組成物の使用が確実に容易になる。その上、本発明の組成物が低温又は高温（例えば、２５℃、３７℃及び更には４７℃）で安定性を維持することが観察されるということは、不注意な温度逸脱、例えば意図しない凍結があったか、又は温暖な気候であっても、一時的に組成物が室温に曝露されたときに、それが本発明のワクチン組成物に直ちに有害とはならないはずであることを示している。

特定の実施形態において、本ワクチン組成物は、室温～４７℃の範囲の温度で少なくとも６週間にわたって貯蔵したときに安定性の向上を呈する。ひいては、本発明によれば、本ワクチン組成物は、例えば室温か又は更には４７℃に至るまでの高い温度など、上昇した温度で貯蔵したときに安定性の向上を呈する。

特定の実施形態において、本ワクチン組成物は、前記組成物を－２０～－８０℃の温度に緩慢凍結し、続いて解凍した後に安定性の向上を呈する。

特定の実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、限外ろ過／ダイアフィルトレーション時に安定性の向上を呈する。

本発明に係るワクチン組成物は、原薬又は薬物製品のいずれかを指す。薬物製品は、典型的には、完成した剤形、例えば、錠剤、カプセル、又は溶液（製剤）であり、これは、必ずとは限らないが、概して１つ以上の他の成分が付随する形で原薬を含有する。原薬は、疾患の診断、治癒、緩和、治療、若しくは予防において薬理活性若しくは他の直接的な効果を付与すること又は人体の構造若しくは任意の機能に影響を及ぼすことが意図される有効成分である。本明細書に記載されるとおりの本発明に係るワクチン組成物は、投与を容易にし、且つ有効性を向上させるため、限定はされないが、経口（経腸）投与及び非経口注射を含めた、ヒト対象への投与に好適な任意の物質（ｍａｔｔｅｒ）で製剤化されてもよい。例えば非経口注射には、皮下注射、筋肉内注射、又は皮内注射が含まれ得る。本発明の免疫原性組成物はまた、他の投与経路、例えば、経粘膜、直腸、舌下投与、経口、又は鼻腔内経路用に製剤化することもできる。好ましくは、免疫原性組成物は、筋肉内注射用に製剤化される。

上記に指摘したとおり、本発明のワクチン組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を更に含み得る。「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、心地良い又は便利な剤形を調製するために抗原などの活性分子と組み合わされる任意の不活性物質が意味される。「薬学的に許容可能な賦形剤」は、用いられる投薬量及び濃度で被投与者にとって非毒性の、且つ抗原を含む組成物の他の成分と適合性のある賦形剤である。賦形剤の例は、凍結保護物質、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、及び塩である。

ワクチン組成物は、アジュバントを更に含み得る。用語「アジュバント」は、免疫系の刺激を引き起こし又は免疫応答を亢進させる１つ以上の物質として定義される。

本発明は更に、タンパク質抗原を含むワクチン組成物の調製方法を提供し、前記方法は、免疫学的有効量の本明細書に記載されるとおりの前記融合タンパク質抗原を安定化量の本明細書に記載されるとおりの抗ウイルス性化合物と混合することを含む。

特定の実施形態において、本組成物は、例えば室温か又は更には４７℃に至るまでの高い温度など、上昇した温度で６週間にわたって貯蔵したとき安定している。本発明によれば、「安定している」とは、阻害薬化合物無しの同じ組成物と比較したときタンパク質の凝集が存在しないか、又は減少していることを意味する。

特定の実施形態において、ワクチン組成物は、前記組成物を－２０～－８０℃の温度に緩慢凍結し、続いて解凍した後に安定性の向上を呈する。

本発明は更に、ワクチン組成物中のウイルス融合タンパク質の凝集を低減する方法であって、免疫学的有効量の本明細書に記載されるとおりの融合タンパク質抗原を安定化量の本明細書に記載されるとおりの抗ウイルス性化合物と混合することを含む方法を提供する。

本発明は、詳細には、ワクチン組成物の凍結融解後における前記ワクチン組成物中のウイルス融合タンパク質の凝集を低減する方法であって、免疫学的有効量の本明細書に記載されるとおりの融合タンパク質抗原を安定化量の本明細書に記載されるとおりの抗ウイルス性化合物と混合することによってワクチン組成物を調製することを含む方法を提供する。

本発明はまた、融合タンパク質抗原を含むワクチンの保存方法であって、本明細書に記載されるとおりのワクチン組成物を調製することを含む方法も提供する。

特定の実施形態において、前記方法は、前記組成物を２～８℃の範囲の温度で少なくとも２４ヵ月間にわたって貯蔵することを更に含む。

更には、本発明は、タンパク質抗原を含む液体ワクチン組成物を安定して維持する方法であって、本明細書に記載されるとおりのワクチン組成物を２～８℃の温度で少なくとも２４ヵ月間にわたって貯蔵することを含む方法を提供する。

本発明はまた、融合タンパク質免疫原を作製する方法であって、安定化量の抗ウイルス性化合物の存在下で融合タンパク質免疫原を作製することを含む方法も提供する。本発明によれば、融合タンパク質を抗ウイルス性化合物の存在下で作製する（例えば発現させる）ことにより、発現レベル及び収率が増加することが示されている。

以下の詳細な例は、本発明の更なる理解に寄与することが意図される。しかしながら、本発明は、これらの例によって限定されない。本発明の他の実施形態は、当業者には、本明細書の考察及び本明細書に開示される本発明の実施から明らかであろう。

実施例１：ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質
融合前コンホメーションで安定化させた組換え可溶性ＲＳＶ Ｆ（配列番号１０）を精製し、分析的ＳＥＣ（図１Ａ）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１Ｂ）で分析した。クーマシーブリリアントブルーで染色すると、ゲル上にタンパク質が可視化された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの主バンドは、還元試料ではＲＳＶ Ｆタンパク質のＦ１及びＦ２ドメインに対応する；非還元試料では、主バンドは、ジスルフィド結合で一体に連結されたＦ１＋Ｆ２ドメインのサイズに対応する。融合前及び融合後結合抗体ＣＲ９５０６（それぞれ、配列番号８及び配列番号９の重鎖及び軽鎖可変領域を含む）を使用して、ＲＳＶ Ｆタンパク質を測定した（図１Ｃ）。ＣＲ９５０１（国際公開第２０１１／０２００７９号パンフレットに記載されるとおりの抗体５８Ｃ５の結合領域を含む）への結合により、精製したタンパク質の融合前コンホメーションが確認された（図１Ｃ）。

別の実験において、安定化型融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、２～８℃で２４ヵ月を超えて融合前コンホメーションに安定したまま保たれた（データは示さず）。

実施例２ 阻害薬有り及び無しのＲＳＶ融合前Ｆの熱安定性
配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の熱安定性を示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）により、９６ウェル光学ｑＰＣＲプレートにおいてＳｙｐｒｏオレンジ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の蛍光発光をモニタすることによって決定した。図２に示されるとおり阻害薬Ｉ～ＸＶＩ（表１）有り及び無しで、ウェル当たり１５μｌの６６．６７μｇ／ｍｌポリペプチド溶液を使用した。阻害薬は、実験前にＤＭＳＯで希釈した。同じ量のＤＭＳＯを阻害薬無しの融合前Ｆタンパク質に添加した。各ウェルに、５μｌの２０倍Ｓｙｐｒｏオレンジ溶液を添加した。温度を２５℃から９５℃に徐々に上昇させると（０．０１５℃／ｓ）、ポリペプチドがアンフォールディングし、露出した疎水性残基に蛍光色素が結合して、発光の特徴的な変化につながる。融解曲線は、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲ機（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。３つの個別の試料（テクニカルトリプリケート）の温度（℃）に対する蛍光シグナル（ａ．ｕ．）の一次導関数、並びに平均融解曲線をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｄａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）でプロットした。平均融解曲線から、Ｔｍ_５０を差し引いた（曲線の最下点）。Ｔｍ_５０値は、５０％のタンパク質がアンフォールディングする温度を表し、ひいてはポリペプチドの温度安定性の尺度である。Ｔｍ_５０の上昇は、安定化抗ウイルス性化合物有りの融合前Ｆタンパク質のＴｍ_５０を、ＤＭＳＯのみを添加した（即ち抗ウイルス性化合物無しの）融合前Ｆタンパク質のＴｍ_５０と比較した差として報告する。

図２に示されるとおり、１６種の異なる融合阻害薬を１：３、１：１０又は１：１００の三量体：阻害薬モル比で添加すると、Ｔｍ_５０値が増加したことから、タンパク質の熱安定性の増加が指摘される。

実施例３：阻害薬有りのＲＳＶ融合前Ｆの抗原性
安定化化合物の添加有り及び無しのポリペプチド（配列番号１０）に対する抗体の結合を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した（表４）。初めに、９６ウェルハーフエリアＨＢプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００２２９０）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５０μＬ／ウェル中の異なる抗体（１μｇ／ｍＬ）でコートし、プレートを４℃で一晩インキュベートした。使用した融合前特異抗体：ＣＲ９５０１、ＣＲ９５０２（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットに記載されるとおりの抗体３０Ｄ８の結合領域を含む）。使用した融合前及び融合後結合抗体：ＣＲ９５０６、ＣＲ９５０９（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットに記載されるとおりの、抗体１７Ｃ９の結合領域を含む）。一晩インキュベートした後、プレートを１００μＬ洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。各ウェルに１００μＬブロッキング緩衝液を添加し（２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、プレートを室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。次に、プレートを１００μＬ洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。試料調製のため、安定化化合物の添加有り及び無しのポリペプチド試料を初めにアッセイ緩衝液（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４μｇ／ｍＬに希釈した。安定化化合物有りの試料については、化合物は、７３．５ｎＭ、２４５ｎＭ及び１１２５ｎＭの最終濃度であった。７５０μＬアッセイ緩衝液に２５０μＬ希釈液を添加することにより、４μｇ／ｍＬ試料（化合物有り及び無し）を更に４倍希釈した。プレートを室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００μＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識を有する５０μＬの融合前及び融合後結合抗体ＣＲ９５０６を０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。プレートを室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００μＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、各ウェルに、２０μＬのＰＯＤ基質を添加した。基質の添加後５～１５分の間にプレートを測定した（ＥｎＳｉｇｈｔマルチモードプレートリーダー、ＨＨ３４００００００、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ読取り）。ＥＬＩＳＡ曲線（タンパク質希釈度対ＲＬＵ）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０値を計算した（表４）。ＲＳＶ融合前ＦのＩＣ_５０値は、化合物無しと有りとで極めて同等であり、融合阻害薬を添加しても実に融合前Ｆタンパク質の抗原性に何ら影響がないことを示している。

実施例４：小分子阻害薬がＲＳＶ融合前Ｆに及ぼす凍結保護効果
配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をリン酸緩衝液（製剤１）で０．３ｍｇ／ｍｌに希釈し、ゴム栓付きのガラス注射バイアルに０．７５ｍｌを充填し、アルミニウムキャップで密封した。加えて、タンパク質を阻害薬有りの製剤緩衝液中に１：３の三量体：化合物比で希釈した。１つの阻害薬が１つの三量体に結合し、そのため１：３比では阻害薬が過剰となる。この結果、阻害薬化合物の濃度は５．２×１０^－６Ｍになった。環境シミュレーションチャンバ（Ｂｉｎｄｅｒ、モデルＭＫＴ １１５）を使用してバイアルを緩慢凍結ストレスに供した。２４時間で試料をＲＴから－７０℃へと冷却した。試料をＲＴに解凍し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析することにより、ＲＳＶ Ｆ三量体の損失を測定した。

図３Ａは、安定化化合物無しのｐｒｅＦタンパク質が緩慢凍結／融解処理後に凝集する傾向を有し、三量体シグナルの２０±１７％が失われることを示している。しかしながら、組成物に化合物ＩＩ（図３Ｂ）又はＩＩＩ（図３Ｃ）を添加したとき、凝集は強力に減少し、それぞれ、僅か２．４±１．９％又は２．０±２．０％の三量体シグナルが失われたに過ぎなかったことから、両方の安定化化合物についての強力な凍結保護効果が指摘される。

実施例５．異なる製剤緩衝液中において小分子阻害薬がＲＳＶ融合前Ｆに及ぼす凍結保護効果
配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆ（ｐｒｅＦ）タンパク質を異なる製剤緩衝液（表５）で透析し、各製剤を０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。０．７５ｍｌの各製剤をゴム栓付きのガラス注射バイアルに充填し、アルミニウムキャップで密封した。加えて、タンパク質を製剤緩衝液で希釈し、１：１、１：３、１：９、１：２７及び１：５０の三量体：化合物比で阻害薬を添加した。最終的な化合物濃度は、それぞれ、１．７×１０^－６Ｍ、５．２×１０^－６Ｍ、１．６×１０^－５Ｍ、４．６×１０^－５Ｍ、及び８．６×１０^－５Ｍであった。バイアルを２４時間で－７０℃に緩慢凍結した。続いて試料をＲＴに解凍し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析することにより、４℃に置いておいた試料と比較したＲＳＶ Ｆ三量体の損失を測定した。

図４Ａが示すところによれば、安定化化合物無し又は化合物希釈剤（ＤＭＳＯ）の添加有りでは、試験した全ての製剤でｐｒｅＦタンパク質は凝集傾向を呈する。製剤に応じて、三量体損失は４３％（製剤２）から（製剤１、ＡＰ１及びＦＢ１２）について６０％を超えるまでの範囲にわたる。しかしながら、組成物に化合物Ｉ、ＩＩ又はＩＶを添加すると、全ての製剤緩衝液について三量体％が高くなることが観察され、３つ全ての化合物の強力な凍結保護効果が指摘される。

製剤１で更なる化合物を評価し（図４Ｂ）、化合物及び濃度に応じて緩慢凍結後の三量体の損失を防ぐことができた。

製剤５ｂ（ｐＨ８．３）及び５ａ（ｐＨ７．０）については、化合物Ｉ、ＩＩ又はＩＶ（表１）を添加したとき、凝集は観察されなかった（図４Ｃ）。

ポリソルベート２０の非存在下での異なる製剤の試験を図４Ｄにまとめる。この場合もまた、安定化化合物無しのｐｒｅＦタンパク質は凝集する傾向があった。ポリソルベート無しの製剤２に融合阻害薬を添加すると、９０％を超える高い三量体回収率が得られた。ポリソルベート無しの製剤１について、三量体割合の用量依存的向上が観察された。これらの結果は、ポリソルベート２０無しの製剤における化合物の強力な凍結保護効果を提示している。

試験したレプリケートの数：Ａ：ＰＳ４Ｐ ｐｒｅＦ ｎ＝２０；ＴＳ５Ｐ２ ｐｒｅＦ ｎ＝２０；ＡＰ１ ｐｒｅＦ ｎ＝１０；ＦＢ１２ ｐｒｅＦ ｎ＝５；ＰＳ４Ｐ／ＴＳ５Ｐ２ ｐｒｅＦ＋Ｉ １：３／１：９／１：５０ ｎ＝５；ＰＳ４Ｐ ｐｒｅＦ＋ＩＩ １：３ ｎ＝１５；ＴＳ５Ｐ２／ＡＰ１ ｐｒｅＦ＋ＩＩ １：３／１：５０ ｎ＝１０；ＦＢ１２ ｐｒｅＦ＋ＩＩ １：３ ｎ＝５；ＰＳ４Ｐ／ＡＰ１ ｐｒｅＦ＋ＩＶ １：３ ｎ＝１０；ＴＳ５Ｐ２／ＦＢ１２ ＋ｐｒｅＦ ＩＶ １：３ ｎ＝５；ＡＰ１＋ｐｒｅＦ ＩＶ １：５０ ｎ＝５；ＴＳ５Ｐ２／ＡＰ１ ｐｒｅＦ＋ＤＭＳＯ １：３ ｎ＝５；ＰＳ４Ｐ／ＴＳ５Ｐ２／ＡＰ１ ｐｒｅＦ＋ＤＭＳＯ １：５０ ｎ＝５．Ｂ：ＰＳ４Ｐ：ｐｒｅＦ ｎ＝１０；ｐｒｅＦ＋ＩＩＩ／Ｖ／ＶＩＩＩ／ＸＩＩ／ＸＩＩＩ １：３／１：９ ｎ＝１０；ｐｒｅＦ＋ＩＩＩ／Ｖ／ＶＩＩＩ／ＸＩＩ／ＸＩＩＩ １：２７ ｎ＝５；ｐｒｅＦ＋ＩＸ／Ｘ／ＸＩ／ＸＩＶ／ＸＶ／ＸＶＩ ｎ＝５．Ｃ：ｎ＝５．Ｄ：ＰＳ４ ｐｒｅＦ ｎ＝１５；ＴＳ５ ｐｒｅＦ ｎ＝１０；ＡＰ１－Ｐ ｐｒｅＦ ｎ＝５；ＰＳ４／ＴＳ５Ｐ ｐｒｅＦ＋ＩＩ １：１ ｎ＝５；ＰＳ４ ｐｒｅＦ＋ＩＩ １：３ ｎ＝１０；ＴＳ５Ｐ／ＡＰ１－１ ｐｒｅＦ＋ＩＩ １：３ ｎ＝５；ＰＳ４／ＴＳ５Ｐ ｐｒｅＦ＋ＩＩ １：９ ｎ＝５；ＰＳ４／ＴＳ５Ｐ ｐｒｅＦ＋ＩＶ １：１ ｎ＝５；ＰＳ４ ｐｒｅＦ＋ＩＶ １：３ ｎ＝１０；ＴＳ５Ｐ／ＡＰ１－１ ｐｒｅＦ＋ＩＶ １：３ ｎ＝５；ＰＳ４／ＴＳ５Ｐ ｐｒｅＦ＋Ｖ １：３ ｎ＝５；ＰＳ４／ＴＳ５Ｐ ｐｒｅＦ＋Ｉ １：３ ｎ＝５；ＰＳ４／ＴＳ５Ｐ／ＡＰ１－１ ｐｒｅＦ＋ＤＭＳＯ １：３ ｎ＝５）。

実施例６：異なる温度で異なる製剤緩衝液中において小分子阻害薬がＲＳＶ融合前Ｆに及ぼす安定化効果
配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆ（ｐｒｅＦ）タンパク質を異なる製剤緩衝液で透析し（ＡＰ１、製剤１、及び製剤５ａ（ｐＨ７．０）、各組成物を０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。試料を化合物ＩＩＩ有り及び無しで調製した（最終的な化合物濃度は５．２×１０^－６Ｍ（１：３の三量体：化合物比）、１．６×１０^－５（１：９の三量体：化合物比）。対照試料は４℃で貯蔵した。熱ストレスについては、試料を３７及び４７℃で６週間置いておいた。三量体含有量を分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。３７℃では、三量体含有量は対照と比較して変化しなかったが（図５Ａ）、４７℃では、凝集が観察された（図５Ｂ）。この凝集は、化合物有りの試料と比較して化合物の無しの試料について高かった。これは、異なる製剤緩衝液について化合物が融合前タンパク質に及ぼす保護効果を示している。

実施例７：限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）時に小分子阻害薬がＲＳＶ融合前Ｆに及ぼす安定化効果
ＵＦ／ＤＦは、サイズ排除に基づくロバストな分離処理であり、幅広い生物学的療法薬に適用が見出される。０．６ｍｇ／ｍｌの濃度の配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆ（ｐｒｅＦ）タンパク質（５０ｍｌ）をＰＳ２０無しの製剤２で限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）した。ＵＦ／ＤＦは、化合物有り及び無しで実施した。化合物ＩＶ（表１）は、ｐｒｅＦタンパク質試料及びＵＦ／ＤＦ緩衝液に１：３の三量体：化合物比で添加した。ＵＦ／ＤＦにおける３０ｋＤａフィルタ（Ｃｏｇｅｎｔ μｓｃａｌｅ ＴＦＦシステム（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））を使用し、３５０ｍｌのダイアボリュームのＵＦ／ＤＦ緩衝液を使用した。

ＵＦ／ＤＦ後、納入業者Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，米国）からの動的光散乱（ＤＬＳ）ＵＮｃｌｅによってＵＦ／ＤＦの２週間後に流体力学的径を測定した。ＵＦ／ＤＦ後、直径は、化合物無し及び有りの試料について、それぞれ２０９．７１ｎｍ及び８．６５ｎｍであった。直径を出発材料（１０．９３ｎｍの流体力学的径）と比較すると、化合物有りの試料の流体力学的径が出発材料と同等である一方、化合物無しの試料は直径の増加を示すことが示される。この直径の増加は、凝集し始めた結果である可能性が高い。

実施例８：ワクチン作製及び製造の向上
安定化化合物を添加すると、ＲＳＶ Ｆ三量体の発現及び収率もまた向上し得るかどうかを調べるため、可溶性コンセンサスＡ亜型ＲＳＶ Ｆタンパク質（安定化突然変異無し）をコードするプラスミドのトランスフェクションを抗ウイルス性化合物有り及び無しで実施した。トランスフェクション後の三量体総含有量をＳＥＣによって分析し、安定化型ｐｒｅＦをコードするプラスミドによるトランスフェクションと比較した。安定化型ｐｒｅＦ（配列番号１）及び不安定化型コンセンサスＲＳＶ Ａ（配列番号２）の一過性トランスフェクションは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して２０ｍＬスケールで実施した。トランスフェクションの６時間後、不安定化型コンセンサスＲＳＶ Ａコンストラクトに化合物ＩＩＩを１：３の（三量体：化合物）比（０．２８μＭの化合物濃度）で添加した。３日間のタンパク質作製後、細胞を回収し、分析的ＳＥＣで上清中のＲＳＶ Ｆの三量体含有量を評価した（図６）。不安定化型コンセンサスＲＳＶ ＡによるトランスフェクションについてはＲＳＶ Ｆタンパク質は検出されなかったが、しかしながら化合物ＩＩＩ有りの同じコンストラクトのトランスフェクションについては、三量体の発現を検出することができた。このことから、ＲＳＶ ｐｒｅＦの安定性及び収率を増加させるため、作製及び製造過程において化合物の添加を適用し得ることが指摘される。

実施例９：ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰタンパク質
ＨＩＶ－１ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ（配列番号３）は、クレードＢのＨＩＶ－１表面タンパク質ｇｐ１４０のエクトドメインに対応する。このタンパク質をＨＥＫ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションにより作製し、記載されるとおりレンチルレクチン及びＳＥＣによって精製した（Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８）。回収当日、分析的ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって示されるとおり、タンパク質は三量体であった（図７Ａ）。精製した融合前三量体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、更なる分析時まで－８０℃で貯蔵した。

実施例１０：阻害薬有り及び無しでのＨＩＶ－１ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖの熱安定性
納入業者Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ，米国）からのＵＮｃｌｅを使用したナノＤＳＦで熱安定性を測定した。トリス緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％スクロース、０．０３％Ｔｗｅｅｎ－８０ ｐＨ６．０）中０．８ｍｇ／ｍｌのＨＩＶ Ｅｎｖ三量体を５０倍モル過剰の侵入阻害薬化合物ＸＶＩＩ無し又は有りでインキュベートした。両方の溶液とも、同程度の量のＤＭＳＯを含有し、それは１．９５％ｖ／ｖであった）。阻害薬により、Ｅｎｖの融解温度は約５℃上昇した（図７Ｂ）。

実施例１１：阻害薬有り及び無しでのＨＩＶ－１ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ ｅｎｖの貯蔵安定性
ＨＩＶ ｅｎｖ三量体をクエン酸塩緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％スクロース、０．０３％Ｔｗｅｅｎ－８０ ｐＨ６．０）中０．８ｍｇ／ｍｌにて４℃で１週間、阻害薬有り又は無しとしてインキュベートした。侵入阻害薬ＸＶＩＩは、精製したＥｎｖ ＣｏｎＢ ＳＯＳＩＰに５０倍過剰で添加した。阻害薬をＤＭＳＯに溶解させたことに伴い、Ｅｎｖのみの対照試料は、阻害薬有りのＥｎｖと同じ濃度のＤＭＳＯ（１．９５％ｖ／ｖ）を含有した。ＨＩＶ Ｅｎｖの品質は、Ｅｎｖの閉じた天然の融合前コンホメーションに結合する広域中和抗体（ｂＮＡｂ）により、非天然のフォールディングのＥｎｖを認識する非広域中和抗体（非ｂＮＡｂ）と比べて評価することができる（Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １８）。ＨＩＶ Ｅｎｖの品質については、増幅発光近接ホモジニアスアッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）で測定した抗原性によって評価したとき、１週間貯蔵する間に組成物中に侵入阻害薬を含有したＥｎｖ試料が優れていた（図７Ｃ）。阻害薬を含有した組成物については、ｂＮＡｂへの優先的な結合がより多く、４４７－５２Ｄを除き、試験した５つ全ての非ｂＮＡｂへの結合が低下した。これは、阻害薬有りの試料がこれらの条件下で安定したまま保たれ、阻害薬無しのタンパク質が崩壊及び品質低下を示したことを示している。

実施例１２：Ｂ型インフルエンザＨＡタンパク質
哺乳類細胞におけるタンパク質発現
Ｂ型インフルエンザＨＡエクトドメインをコードするプラスミドでＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクションを実施した。ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐｃＤＮＡ２００４発現ベクター（転写促進型ＣＭＶプロモーターを有する改良されたｐｃＤＮＡ３プラスミド）にクローニングした。

ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地で培養したＥｘｐｉＣＨＯ浮遊細胞（３５０ｍＬスケール）において、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者のプロトコルに従い使用してそれぞれの産業グレードのＤＮＡを一過性にトランスフェクトすることにより、Ｃ末端フォルドン三量化ドメインに融合したインフルエンザＨＡエクトドメインを作製した。トランスフェクションの１日後に、製造者のプロトコルに従い細胞培養物にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯフィード（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクト細胞浮遊液を３２℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、７～１１日目に、分泌されたポリペプチドを含有する培養上清を回収した。培養上清を遠心によって清澄化し、続いて０．２μｍボトルトップフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でろ過した。

回収した培養上清から、ｈｉｓタグ付加ポリペプチド及びフォルドン三量化ドメインを含有するそれぞれの野生型株を、ＡＥＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して二段階プロトコルに従い精製した。第一に、プレパックｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓタグ精製カラム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを実施し、１ｍＭイミダゾールで洗浄し、３００ｍＭイミダゾールで溶出させた。第二に、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ２６／６００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。三量体ピーク画分をプールし、長期貯蔵のため－８０℃で凍結した。精製したＨＡ Ｂ三量体ＵＦＶ１７００９１（山形系統、Ｃ末端でフォルドンドメインに融合したＢ／マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ）／２／１２の野生型 ＨＡのエクトドメイン；配列番号４）及びＵＦＶ１８０３００（ビクトリア系統、Ｃ末端でフォルドン＿ＳｏｒｔＡ＿ｖ２（Ｈｉｓ）に融合したＢ／コロラド／０６／２０１７の野生型ＨＡのエクトドメイン、配列番号５）を更なる分析時まで－８０℃で貯蔵した。

阻害薬有り及び無し（１：６のＨＡ三量体：化合物比）での両方のタンパク質の融解温度（Ｔｍ５０）をＤＳＦを用いて測定した（図８Ａ）。阻害薬を添加した結果、ＵＦＶ１７００９１及びＵＦＶ１８０３００についてＴｍがそれぞれ０．５～１℃上昇したため、阻害薬は安定化効果を有した。

次に、インフルエンザＨＡエクトドメイン（Ｂ／ブリスベン／６０／０８のＨＡをベースとする、ＵＦＶ１８０９３３、配列番号６）を阻害薬有り又は無し（１：９０のＨＡ三量体：化合物比）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞において一過性に発現させた。トランスフェクションから４日後に上清を回収し、単量体及び三量体の量を分析的ＳＥＣ分析を用いて試験した（図７Ｂ）。阻害薬無し及び希釈剤ＤＭＳＯ有り又は無しの試料は、高い含有量の単量体を示した。融合阻害薬有りの試料は、単量体をほとんど示さず、ほぼ三量体であった。ＲＳＶ及びＨＩＶに関してと同様に、インフルエンザ融合阻害薬は、天然の融合前三量体に強力な安定化効果を及ぼした。従って、Ｂ型インフルエンザＨＡ天然三量体を含むワクチン組成物もまた、貯蔵時に非治療用量の融合阻害薬を添加することによって安定化させることができる。

実施例１３．Ａ型インフルエンザＨＡ
Ｈ１Ｎ１ Ａ／ブリスベン／５９／２００７のエクトドメイン（配列番号７）を含む精製したタンパク質に、化合物ＸＶ有り及び無しで、摂氏４０度にて６週間にわたり熱ストレスを与えた。分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、三量体及び単量体含有量を決定した（図８Ｂ）。化合物ＸＶは、１：６のＨＡ三量体：化合物比で使用した。化合物ＸＶを添加すると、三量体含有量が保たれたのに対し、化合物ＸＶ無し、タンパク質のみ及びタンパク質＋ＤＭＳＯの試料は、より多くの単量体を示し、三量体含有量が減少した。従って、Ａ型インフルエンザＨＡ天然三量体を含むワクチン組成物もまた、貯蔵時に非治療用量の融合阻害薬を添加することによって安定化させることができる。

実施例１４：異なる温度で異なる製剤緩衝液中において小分子阻害薬がＲＳＶ融合前Ｆに及ぼす安定化効果
配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆ（ｐｒｅＦ）タンパク質を異なる製剤緩衝液で透析し（ＡＰ１、製剤１、ＦＢ１２、及び製剤５ａ（ｐＨ７．０）、各組成物を０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。試料を安定化化合物ＩＩＩ有り及び無しで調製した（最終的な化合物濃度は５．２×１０^－６Ｍ（１：３の三量体：化合物比）又は１．６×１０^－５Ｍ（１：９の三量体：化合物比）。対照試料は４℃で貯蔵した。試料は３７℃で９又は１６又は２６週間にわたり置いておいた。三量体含有量を分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析し、４℃対照に対する相対で計算した。

結果及び結論
３７℃で最長２６週間の期間にわたってインキュベートする間、安定化化合物ＩＩＩを添加すると、異なる緩衝液における液相中でのタンパク質凝集体の形成が防止される（図１０）。比が高くなると（１：９）、時間の経過に伴う凝集の防止が最良となった。製剤５ａ及びＦＢ１２は、ＲＳＶ ｐｒｅＦタンパク質を３７℃で液相中に安定させておくのに最も良好な緩衝液であるように見えた。安定化化合物ＩＩＩを添加すると、これらの緩衝液中で三量体含有量が常に向上した。製剤１及びＡＰ１緩衝液は、時間が経つにつれ、最も低いタンパク質含有量を示した。安定化化合物ＩＩＩを添加すると、製剤１試料では三量体含有量が向上した。ＡＰ１試料では、安定化化合物ＩＩＩが存在しても、凝集の防止は示されなかった。

実施例１５：過剰の安定化化合物ＩＩＩを透析で取り除いた後の三量体安定性の向上
配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆ（ｐｒｅＦ）タンパク質を異なる製剤緩衝液で透析した（ＡＰ１、製剤１、ＦＢ１２、及び製剤５ａ（ｐＨ７．０）。透析は、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２透析カセット、２０Ｋ ＭＷＣＯ、７０ｍＬを使用して、暗所下４℃で実施した。５０ｍｌのタンパク質を１０Ｌの緩衝液で２４時間透析した。タンパク質を製剤緩衝液で０．３ｍｇ／ｍｌに希釈し、安定化化合物ＩＩＩを１：３及び１：３０の三量体：化合物比で添加し、４℃で２４時間プレインキュベートした。０．７５ｍｌの各製剤をゴム栓付きのガラス注射バイアルに充填し、アルミニウムキャップで密封した。バイアルを制御された条件下にて２４時間で－７０℃に凍結した。続いて試料をＲＴに解凍し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析することにより、４℃に置いておいた試料と比較したＲＳＶ Ｆ三量体の損失を測定した。加えて、安定化化合物ＩＩＩ有り及び無しの透析後の材料をＤＳＦで評価して、融解温度を測定した。実験の詳細については、実施例２を参照のこと。

結果及び結論
緩慢凍結後、ＲＳＶ ｐｒｅＦタンパク質は凝集する傾向がある。安定化化合物ＩＩＩを添加すると、透析前及び透析後試料において緩慢凍結後の凝集が防止された（図１１Ａ）。透析及び緩慢凍結後、安定化化合物ＩＩＩの存在により、タンパク質凝集が妨げられた（９０％を超える三量体（ｔｉｍｅｒ））。凝集の防止は、添加する安定化化合物ＩＩＩの比に依存せず、１：３比と１：３０比との間で三量体割合に有意差はなかった。安定化化合物ＩＩＩを添加した試料の全てにおいてＴｍ５０が高くなった（図１１Ｂ）。添加する安定化化合物ＩＩＩの比が高くなると（１：３０）、１：３比よりも高いＴｍ５０が生じた。安定化化合物ＩＩＩ有りの透析前試料は、時間とともにＴｍ５０の上昇傾向を示した。安定化化合物ＩＩＩ有りの試料では、透析後、Ｔｍ５０が長時間にわたって比較的一定のまま保たれた。

実施例１６：過剰（ａｃｃｅｓｓ）の安定化化合物ＩＩＩをＵＦ／ＤＦで取り除いた後の三量体安定性の向上
Ｃｏｇｅｎｔ μＳｃａｌｅ ＴＦＦシステム（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）により安定化化合物ＩＩＩ有り及び無しの試料の緩衝液交換を実施した。配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆ（ｐｒｅＦ）タンパク質を製剤緩衝液６でＵＦ／ＤＦした。安定化化合物ＩＩＩは、試料と共にプレインキュベートし、１つの例ではまた、ＵＦ／ＤＦに使用した緩衝液に添加した（図１２を参照のこと、１：３及び緩衝液中と表示される）。ＵＦ／ＤＦのセッティングを表４にまとめる。ランは、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ ５０ｃｍ２フィルタカセットを使用して実施した。ラン毎に、システムをミリＱ水によって３０～５０ｍＬ／分のクロスフローでフラッシュし、次にシステムをＮａＯＨ ０．１Ｍで（少なくとも５分間再循環させる）清浄化した。この後、システムを再びミリＱ水でｐＨ７に達するまでフラッシュし、その後、システムを所望の緩衝液で５分間フラッシュした。続いて、システムにタンパク質（５０ｍＬ）を添加し、７ダイアボリューム（３５０ｍＬ）の所望の緩衝液に対するダイアフィルトレーションにかけた。

各製剤（ＵＦ／ＤＦ前及びＵＦ／ＤＦ後試料）を０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。０．７５ｍｌの各製剤をゴム栓付きのガラス注射バイアルに充填し、アルミニウムキャップで密封した。バイアルを制御された条件下にて２４時間で－７０℃に凍結した。続いて試料をＲＴに解凍し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析することにより、４℃に置いておいた試料と比較したＲＳＶ Ｆ三量体の損失を測定した。加えて、安定化化合物ＩＩＩ有り及び無しの異なる製剤をＤＳＦで評価して、融解温度を測定した。実験の詳細については、実施例２を参照のこと。

結果及び結論
現在の条件下におけるＵＦ／ＤＦ手順の結果、凝集は生じなかった。ＵＦ／ＤＦ及び緩慢凍結後、安定化化合物ＩＩＩを含有する試料は全て、安定化化合物ＩＩＩの濃度にかかわらず、凝集が防止された（図１２Ａ）。ＵＦ／ＤＦ前緩衝液中での緩慢凍結では、製剤６緩衝液中での緩慢凍結よりも多くの凝集体が生じた。ＦＩを含有する試料（緩衝液交換無し又は交換緩衝液中でＦＩ有り）は、時間とともにＴｍ５０の上昇を生じる傾向を示した（図１２Ｂ）。タンパク質中及びダイアボリューム中に安定化化合物ＩＩＩを含んだ試料は、最も高いＴｍ５０を生じた。

実施例１７：高い比の安定化化合物ＩＩＩ及びｐｒｅＦに結合した全安定化化合物ＩＩＩの利点
配列番号１０のＲＳＶ融合前Ｆ（ｐｒｅＦ）タンパク質を異なる製剤緩衝液（ＰＳ２０無しの製剤１、ＰＳ２０無しの製剤２及びＡＰ１）で透析するか（方法の詳細については実施例１５を参照のこと）、又はＵＦ／ＤＦした（方法の詳細については実施例１６を参照のこと）。安定化化合物ＩＩＩを１：５０の三量体：化合物比で添加した後ＵＦ／ＤＦし、４℃で２４時間インキュベートした。ＵＦ／ＤＦ処理の間に、過剰な未結合の安定化化合物ＩＩＩは取り除かれる。

各製剤（透析前及び透析後試料）を０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。０．７５ｍｌの各製剤をゴム栓付きのガラス注射バイアルに充填し、アルミニウムキャップで密封した。バイアルを２４時間で－７０℃に緩慢に凍結した。続いて試料をＲＴに解凍し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析することにより、４℃に置いておいた試料と比較したＲＳＶ Ｆ三量体の損失を測定した。加えて、化合物ＩＩＩ有り及び無しの異なる製剤をＤＳＦで評価して、融解温度を測定した。実験の詳細については、実施例２を参照のこと。

加えて、ＵＦ／ＤＦ後に試料中に存在する安定化化合物ＩＩＩの濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより決定した。

結果及び結論
緩衝液にかかわらず、安定化化合物ＩＩＩを添加すると、緩衝液交換及び続く緩慢凍結後の凝集が防止された（図１３Ａ）。最適でないＰＳ２０無しの製剤１であっても、安定化化合物ＩＩＩによって凝集の防止がもたらされた。ＡＰ１緩衝液は最適でなく、安定化化合物ＩＩＩによってもたらされた凝集の防止は不十分であった。

安定化化合物ＩＩＩを添加すると、緩衝液にかかわらず、Ｔｍ５０が上昇した（図１３Ｂ）。ＵＦ／ＤＦ後も、安定化化合物ＩＩＩはタンパク質に結合したままであった。高過剰の安定化化合物ＩＩＩ（１：５０）を添加することにより、三量体当たり約２．６分子の安定化化合物ＩＩＩの結合（及び最も可能性が高いのは捕捉）が可能になった（図１３Ｃ）。データは、１：３を上回る比で添加したときにＴｍ５０が高くなる／向上することを描き出すＤＳＦ分析と相関している（図１１Ｂ及び図１２Ｂ）。

実施例１８：マウスにおける免疫原性
Ｂａｌｂ／ｃマウス（６～８週齢、雌）に対し、漸増用量のｐｒｅＦタンパク質（配列番号１０）（１．５、５又は１５μｇ）、又はｐｒｅＦ三量体をベースとする３倍、１０倍又は３０倍モル過剰の安定化化合物ＩＩＩと組み合わせたｐｒｅＦタンパク質（配列番号１０）（１．５、５又は１５μｇ）による２８日間隔の２回の筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫を与えた。初回投与から４２日後、血清試料を採取し、Ａ５４９細胞に対するＲＳＶ－ＣＬ５７株の感染の阻害を測定する自動ホタルルシフェラーゼアッセイ（ＦＦＬ－ＶＮＡ）を用いてウイルス中和力価について分析した。

融合阻害薬無しのｐｒｅＦをベンチマークとした４倍マージンでの非劣性試験（多重比較のためのボンフェローニ補正を用いたＴｏｂｉｔモデル）について、安定化化合物ＩＩＩ有りで製剤化したｐｒｅＦ群のＶＮＡ力価を全用量間で比較した。

結果及び結論
４２日目に測定したＦＦＬ－ＶＮＡ反応に基づけば、安定化化合物ＩＩＩと組み合わせたＰｒｅＦによって誘導されるＶＮＡ力価は、添加した安定化化合物ＩＩＩの量にかかわらず、安定化化合物ＩＩＩの添加無しのｐｒｅＦによって誘導される力価と比較して低くなかった（図１４）。４倍マージンでの非劣性分析に基づけば、試験した比での安定化化合物ＩＩＩの添加によってｐｒｅＦタンパク質ワクチン候補の免疫原性が負の影響を受けることはなかった（図１５）。

実施例１９：ヒト気道上皮細胞におけるＲＳＶ中和
気液界面で成長させた、ヒト上気道を模倣する分化型初代ヒト気道上皮細胞（ｈＡＥＣ）に対し、実施例１８からのプール血清を使用してＶＮＡを実施した。

Ｅｐｉｔｈｅｌｉｘ（スイス）にてｈＡＥＣトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）インサートが調製される。手短に言えば、１４例の健常ヒトドナーのプールからの初代ヒト細胞を気液界面で３週間超にわたって培養することにより、基底細胞、杯細胞及び線毛細胞からなる、粘液層に覆われた複合組織に分化させる。このｈＡＥＣインサートは、ＲＳＶの天然のインビボ標的である線毛細胞に特に富んでいる。中和アッセイは、ＲＳＶ－Ａ２レポーター（ＧＦＰ）ウイルスを使用して実施した。ウイルス感染レベルは、感染４日後にＣｙｔａｔｉｏｎ １自動顕微鏡（ＢｉｏＴｅｋ、米国）を使用してＧＦＰシグナルを可視化することにより決定した。感染は、グレースケールで描出する（即ち、感染細胞が薄い灰色）。

結果及び結論
安定化化合物ＩＩＩ有りのｐｒｅＦ（１：３０）の血清プールは、ｐｒｅＦ＋ＤＭＳＯと比較したとき、３つ全てのｐｒｅＦ投薬量で１／５０希釈の分化型ヒト気道上皮細胞（ｈＡＥＣ）において一層高い中和力価を示した（図１６）。

配列
配列番号１：フォルドンドメイン（下線）に融合した安定化型ＲＳＶ Ｆタンパク質（ＰｒｅＦ）（ｐ２７ペプチドは下線及び太字）

配列番号１０：フォルドンドメイン（下線）に融合した可溶性のプロセシングされた安定化型ＲＳＶ Ｆタンパク質（ＰｒｅＦ）

配列番号２：フォルドンドメイン（下線）に融合したコンセンサスＲＳＶ Ｆ Ａ

配列番号３ ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ

配列番号４：ＵＦＶ１７００９１、フォルドンドメイン（下線）に融合した、及びＨｉｓタグを有するＨＡエクトドメイン（Ｂ／マサチューセッツ／２／１２をベースとする）

配列番号５：ＵＦＶ１８０３００、フォルドンドメイン（下線）に融合した、Ｈｉｓタグを有するＨＡエクトドメイン（Ｂ／コロラド／０６／２０１７をベースとする）

配列番号６：ＵＦＶ１８０９３３、Ｃタグを有するＢ／ブリスベン／６０／０８のＨＡエクトドメイン

配列番号７：Ｈｉｓタグを有する、Ｈ１Ｎ１ Ａ／ブリスベン／５９／２００７のエクトドメイン

ＣＲ９５０６重鎖（配列番号８）

ＣＲ９５０６軽鎖（配列番号９）

Claims (32)

1. 免疫学的有効量のウイルス融合タンパク質抗原と安定化量の抗ウイルス性化合物とを含むワクチン組成物。
2. 前記ウイルス融合タンパク質がクラスＩ融合タンパク質である、請求項１に記載のワクチン組成物。
3. 前記ウイルス融合タンパク質抗原が準安定性クラスＩ融合タンパク質である、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
4. 前記ウイルス融合タンパク質が三量体クラスＩ融合タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
5. 前記抗ウイルス性化合物が融合阻害薬又はウイルス侵入阻害薬である、請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
6. 前記抗ウイルス性化合物の前記安定化量が前記抗ウイルス性化合物の治療有効量に満たない量である、請求項１～５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
7. 前記抗ウイルス性化合物の前記安定化量が前記抗ウイルス性化合物の前記治療有効量の少なくとも１００分の１である、請求項６に記載のワクチン組成物。
8. 前記ウイルス融合タンパク質及び前記抗ウイルス性化合物が、１：１以上１：３００以下、好ましくは１：１以上３００，０００以下の範囲の三量体：化合物比で存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
9. 前記ウイルス融合タンパク質がＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
10. 前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質である、請求項９に記載のワクチン組成物。
11. 前記抗ウイルス性化合物がＲＳＶ融合又は侵入阻害薬である、請求項８又は９に記載のワクチン組成物。
12. 前記ＲＳＶ融合又は侵入阻害薬が、表１の化合物Ｉ～ＸＶＩ及びその好適な類似体からなる群から選択される、請求項１１に記載のワクチン組成物。
13. 前記融合タンパク質がＨＩＶエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
14. 前記ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質が融合前ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質である、請求項１３に記載のワクチン組成物。
15. 抗ウイルス性化合物がＨＩＶ融合又は侵入阻害薬である、請求項１３又は１４に記載のワクチン組成物。
16. 前記ＨＩＶ融合又は侵入阻害薬が、表２の化合物ＸＶＩＩ～ＸＸＩＩＩ、及びその好適な類似体からなる群から選択される、請求項１５に記載のワクチン組成物。
17. 前記融合タンパク質がインフルエンザＡ型赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
18. 前記インフルエンザＨＡタンパク質がＢ型インフルエンザＨＡタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
19. 前記抗ウイルス性化合物がインフルエンザ融合又は侵入阻害薬である、請求項１７又は１８に記載のワクチン組成物。
20. 前記抗ウイルス性化合物が、表３の化合物ＸＸＩＶ～ＸＸＶＩ、及びその好適な類似体からなる群から選択される、請求項１７又は１９に記載のワクチン組成物。
21. 前記抗ウイルス性化合物が表３の化合物ＸＸＶＩＩ又はその好適な類似体である、請求項１８又は１９に記載のワクチン組成物。
22. 前記組成物が液体組成物である、請求項１～２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
23. 室温～４７℃の範囲の温度で少なくとも６週間にわたって貯蔵したときに安定性の向上を呈する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
24. 前記組成物を－８０℃まで凍結し、続いて解凍した後に安定性の向上を呈する、請求項１～２３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
25. 限外ろ過／ダイアフィルトレーション時に安定性の向上を呈する、請求項１～２４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
26. ウイルス融合タンパク質抗原を含むワクチン組成物の調製方法であって、免疫学的有効量の前記ウイルス融合タンパク質抗原を安定化量の抗ウイルス性化合物と混合することを含む方法。
27. ワクチン組成物中のウイルス融合タンパク質の凝集を低減する方法であって、免疫学的有効量の融合タンパク質抗原を安定化量の抗ウイルス性化合物と混合することを含む方法。
28. ワクチン組成物の凍結融解後における前記ワクチン組成物中のウイルス融合タンパク質の凝集を低減する方法であって、免疫学的有効量の融合タンパク質抗原を安定化量の抗ウイルス性化合物と混合することによって前記ワクチン組成物を調製することを含む方法。
29. ウイルス融合タンパク質抗原を含むワクチンの保存方法であって、請求項１～２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物を調製することを含む方法。
30. ウイルス融合タンパク質抗原を含むワクチンの保存方法であって、請求項１～２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物を調製すること、及び前記組成物を２～８℃の範囲の温度で少なくとも２４ヵ月間にわたって貯蔵することを含む方法。
31. ウイルス融合タンパク質抗原を含む液体ワクチン組成物を安定して維持する方法であって、請求項１～２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物を調製すること、及び前記組成物を２～８℃の範囲の温度で少なくとも２４ヵ月間にわたって貯蔵することを含む方法。
32. （熱）安定性ウイルス融合タンパク質免疫原を作製する方法であって、安定化量の抗ウイルス性化合物の存在下で前記ウイルス融合タンパク質免疫原を発現させることを含む方法。
    

Images