JP2023513512A - アデノウイルス ペントンベースの可変ドメイン由来の操作されたポリペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】アデノウイルスペントンベースタンパク質由来の操作されたポリペプチドに関し、ポリペプチドは、好ましくは標的物質への高親和性物質として、オリゴペプチド、ポリペプチド配列、タンパク質ドメイン、タンパク質および二つ、複数、多くのサブユニットからなるタンパク質複合体のようなペプチド性物質の最適化した提示のための新規スキャフォールドを提供する。【解決手段】ポリペプチドは、ペントンベース原子構造に示されるアデノウイルスペントンベースの「アッパー」αヘリックスドメインに基づき、ジェリーロールフォールド構造を示すβバレルシートドメインのいずれのアミノ酸も本質的に完全に欠く。ポリペプチドは、ＲＧＤループおよびＶＬＰループを含む、ペントンベースのαヘリックスドメインのラージフラグメントを少なくとも含み、アデノウイルスペントンベースのαヘリックスドメインの、第二、ショートフラグメントもまた含んでよい。【選択図】図４

Description

本発明は、アデノウイルス ペントンベース タンパク質に由来する、遺伝子工学的に操作されたポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、ペントンベース原子構造に見られるアデノウイルス ペントンベースの「アッパー」（上部）αヘリックスに基づくが、ジェリーロール構造（ジェリーロール フォールド ドメイン）を示すβバレルシートドメインのいずれのアミノ酸を本質的に完全に欠く。そのポリペプチドは、ＲＧＤループおよびＶＬＰループを含む、ペンタンベースの前記αヘリックス ドメインのラージフラグメント（以下「ビックフラグメント」とも称される）を少なくとも含有し、二つ目、アデノウイルス ペントンベースのαヘリックス ドメインのショートフラグメントもまた含んでよい。本発明のポリペプチドは、好ましくは標的分子への高親和性物質として、オリゴペプチド、ポリペプチド配列、タンパク質ドメイン、タンパク質、二つ、いくつか、または多くのサブユニットで作られるタンパク質複合体、のようなペプチド性物質を、最適に提示するための新規足場（スキャフォールド）を提供する。

オリゴペプチド、ポリペプチド配列、タンパク質ドメイン、タンパク質およびタンパク質複合体のようなペプチド性物質を提示するための、成功的なタンパク質足場設計の必要条件は、前記物質を乗せることができる柔軟で露出するループ構造を表すモダリティを有することができる、コンパクトで安定なタンパク質ドメインであることである。本発明の好ましい一つの態様において、これら提示される物質は、例えば、バインダー配列、および／または、パラトープ配列、および／または、配列、といった、ペプチド性構造のための結合パートナーによって認識されるいずれのペプチド性配列を表すことができる（図１）。ここで、前記配列は、例えば、前記バインダー配列（上記例示されたような）によって認識される化学的構造または生化学的構造のそれぞれ、例えば、抗原、および／または、毒素、および／または、毒液、および／または、化学物質、に存在するランダム化したライブラリーからの配列、である。加えて、本発明の遺伝子工学的に操作されたポリペプチドの一つ以上に挿入されてもよい外来配列は、例えば抗体である、特異的結合剤、の特定に用いられる抗原を表すことができる（図２）。

複数のアデノウイルス（Ａｄ）血清型からのペントンベース タンパク質（プロトマー）は、特許文献１（国際公開第２０１７／１６７９８８）に開示されたオリゴペプチド、ポリペプチド配列、タンパク質ドメイン、タンパク質およびタンパク質複合体をコードする外来配列を挿入するために機能することができる、非常に可変的なループ領域を含む。アデノウイルスは、ヒトにおいて最も汎用される遺伝子治療ベクターの一つである。アデノウイルスの殻は主に二つの区別できるタンパク質：ヘキソンタンパク質、と、ペントンベース タンパク質、によって主に構築され、ペントンベース タンパク質は、このウイルスを特色づけるファイバータンパク質が付く五量体集合を形成する。所定のアデノウイルス血清型のペントンベース タンパク質は、他のアデノウイルスの要素が存在しない状態で、組み換え的に発現したとき、多量体超構造に自発的に自己集合することが示された。この超構造は、１２同一コピーの五量体に配置された、合計６０のアデノウイルス ベース タンパク質によって形成される、十二面体を表す。

本発明の基をなす技術的問題は、標的分子のペプチド的結合パートナーを提示のためのタンパク質スキャフォールドの提供である。

上記の技術的問題の解決法は、特許請求の範囲、本明細書およびそれに伴う図面にて規定され、開示される、本発明の態様によって提供される。

ペントンベース タンパク質の高解像度構造（ＰＤＢ ＩＤ ６ＨＣＲ）の綿密な精査により、ペントンベース タンパク質それ自体が、区別される二つのドメイン構造を採用することが証明され、区別される二つのドメイン構造では、一つのドメインがβバレル ジェリーロール フォールドを表し、ジェリーロール フォールドは、本発明において「クラウン ドメイン」と称されるαヘリックスによって安定する第２ドメインに結合する（図３）。前者は、ミューテーション研究によって証明されたように、十二面体への多量体化を仲介し、一方後者は十二面体表面上に溶媒に延びたループを示す。これらのループは、異なるアデノウイルス血清型において、長さおよび配列要素において非常に可変であるが、一方、ベースタンパク質の残りはアデノウイルス血清型を通して高度に保存されている。アデノウイルス十二面体は、汎用性の高いディスプレイスキャフォールドを表し、例えば、アデノウイルス ペントンベースにおいて自然に生じる配列を置換するループに挿入されることができる免疫性ペプチド用である。したがって、すべての挿入部が埋められた場合、文字通り数百の異種ペプチドを一つの十二面体上に効率的に表示することができる（特許文献１）。十二面体は、組み換え的に非常に多量に生産されることができ、非常に安定であり、特に定められない期間、周囲の温度にて保管することができる（特許文献１）。これらの非常に有意義な特徴を利用することにより、それらの露出したループに免疫性ペプチドを表示する合成十二面体系粒子を、（がん）免疫学および新たに現れる感染症を含む幅広い用途における使用可能性のために操作できる。以前、ワクチン候補に関して、本願発明者は、特許文献１に開示のように、露出したループにエピトープを挿入することを容易にする合成ＢｉｏＢｒｉｃｋフォーマットにアデノウイルスドデカヘドロンを発展させ、ＭｕｌｔｉＢａｃpプラットフォームを基にした効率的なアデノウイルス ベース タンパク質製造プロトコールを確立した。より最近、アデノウイルス ベース タンパク質の構造を緻密に精査したところ、本願発明者は、その構造が、遺伝子融合によって進化の間に生じたであろう本物の二つのドメイン構造を表すことを認識した（図３）。その二つのドメインは、二つの明瞭に異なるコンパクトな物質、多量体化情報を含むβバレル ドメイン（ジェリーフォールド ドメイン）とクラウンに似ているαヘリックス ドメイン、に簡単に分割されることができるようだ。

国際公開第２０１７／１６７９８８ 国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０７０７２２ 国際公開第２０１０/１００２７８ 国際公開第２００５/０８５４５６

Ｓｃｈａｆｆｉｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）：Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ， Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ： Ｉｎｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ （Ｇｏｌｅｍｉｓ Ｅ．， ｅｄ．） ｐｐ５３５－５６７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｍｉｔｈ （１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８， １３１５－１３１７ Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔａｌ． （１９８４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２， ４３３－４５５ Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０， ２４５－２４６ Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ． Ａ． ８８， ９５７８－９５８２ Ｇｅｏｒｇｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１， ６－１０ Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５， ５５３－５５７ Ｓｔｏｄｄａｒｄ Ｂ．Ｌ．（２００５）Ｑ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３８， ４９－９５ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ , Ｍａｃｋ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｅｒｎ， ＰＡ， ＵＳＡ

同時係属中の特許文献２は、ペントンベース タンパク質のジェリーロール フォールド ドメインに由来する多量体化ポリペプチドを記載している。アデノウイルスのペントンベース タンパク質が二つのドメインに分割できることを発見する一方で、本発明者は、αヘリックス クラウン ドメイン自体が、特許文献１に開示されているように、さまざまな非アデノウイルス配列を採用するために非常に興味深いものであり、自分で生産できるであろうことを認識した。

本発明は、アデノウイルス ベース タンパク質ヘッドドメイン（すなわち、ペントンベース ドメインから多量体化ドメインを差し引いたもの）またはその特異的フラグメントからなる、または、アデノウイルス ベース タンパク質ヘッドドメインまたはその特異的フラグメントに由来する、操作されたポリペプチドを、独自、安定、汎用性の高いタンパク質物質を自分で形成するための自主的なスキャフォールドとして提供する。クラウン ドメインの高可変ループは抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を暗示するので、本発明によるクラウン ドメイン ポリペプチドは、以降「ＡＤＤｏｂｏｄｙ」とも呼ばれる。本発明のＡＤＤｏｂｏｄｙポリペプチドは、いずれのペプチド構造、特にペプチド、オリゴペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質またはタンパク質複合体の複数のコピーを提示することができる。ＡＤＤｏｂｏｄｙには、アデノウイルス ペントンベース αヘリックス ドメインの大小のフラグメントが含まれている。本発明はまた、αヘリックス ドメインのラージフラグメントのみを含む最小ＡＤＤｏｂｏｄｙ（またはミニＡＤＤｏｂｏｄｙ）に関する。

これらのオリゴペプチド、ポリペプチド配列、タンパク質ドメイン、およびタンパク質には次の（ｉ）から（ｉｉｉ）を含むことができる：（ｉ）自然に生じるバインダー配列またはパラトープ、（ｉｉ）ランダムライブラリーおよび選別進化（ファージ/リボソームディスプレイ）から得られたバインダー配列またはパラトープ、（ｉｉｉ）免疫系を刺激して免疫応答を誘発する抗原性物質、例えば、ワクチン接種目的、細胞培養中、または試験管中の in vitro での抗体または他のバインダー分子の調製用、の抗原性物質。理想的には、そのような物質を提示するそのようなタンパク質は、安全で、免疫原性がなく、効率的で、調整可能である。さらに、それらは工業規模で容易に生産されるであろう。特定の実施形態では、ポリペプチドは、特許文献１に開示されているように、ＶＬループ（Ｖループとも呼ばれる）および／またはＲＧＤループ内にある挿入サイトを含む。本発明によれば、既存のアデノウイルス ペントンベース タンパク質の天然配列のヘテロ改変のための柔軟性のさらに２つのサイトが開示され、例えば、多数の可能なヘテロペプチド構造を含むためのクラウン ドメインおよびアデノウイルス ペントンベースの柔軟な改変にさらに加える、２つのサイトが開示される。

加えて、本発明のポリペプチドを、多価ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として操作することができる。本開示は、操作されたポリペプチドの創生、設計および作成、ならびに標的結合パートナーへの提示のためのペプチド構造を提示するための新規タイプのタンパク質としてのその実施形態を記載する。

図１は、ランダム化したＡＤＤｏｂｏｄｙライブラリーから選別／進化によって、高親和単価および／または多価結合分子を産生するための、本発明（ＡＤＤｏｂｏｄｙ）のアデノウイルス ペントンベース タンパク質クラウン ドメインの使用を図示する模式図を示す。ＡＤＤｏｂｏｄｙライブラリーは、ループの選別したものまたはループの全てをランダム化することにより作成することができる。このＡＤＤｏｂｏｄｙライブラリーから、ファージディスプレイ法、ｍＲＮＡディスプレイ法、イーストディスプレイ法、バキュロウイルスカプシドディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、またはその他のような、選別／進化技術を適用することにより、いずれの抗原にも結合することができる特異的結合物質を見つけ出すことができる。 図２は、リバースワクチン法による多価ワクチンを産生するための、本発明のアデノウイルス ペントンベース タンパク質クラウン ドメインの使用を図示する模式図を示す。クラウンは最も左側に模式的に示される。クラウン ドメインは緑で色付けられる。ＡＤＤｏｂｏｄｙにおけるヘテロペプチドおよびポリペプチド配列の挿入のための４つの別個の部位（サイト）が見つけだされる（ここでは模式的に「ループ」と略して書く）。これらのループのランダム化は、感染した患者または免疫化した動物の血清のいたるところにある抗体によって特異的に結合するループ配列を見つけ出すために利用されるＡＤＤｏｂｏｄｙライブラリーをもたらす。このようなエピトープ配列を見つけ出すことを、治療目的のための単価ＡＤＤｏｍｅｒ超抗原または多価ＡＤＤｏｍｅｒ超抗原産生のために使用できる。 Ａは、所定のアデノウイルス血清型のベースタンパク質により形成された十面体が多方面スキャフォールド（足場）を表すことを示す。好感度ｃｒｙｏ－ＥＭ構造（６ＨＣＲ）を示す。中央のペントン軸を見下ろしている。各色は異なるペントンベース タンパク質を表す。Ｂは、６０コピーのアデノウイルス ペントンベース タンパク質を含むＡＤＤｏｍｅｒである。ペントンベース タンパク質は、クラウンドメイン（上）と多量体化ドメイン（下）の２ドメイン構造を有する。多量体化ドメインはジェリーロール フォールドを採用する。クラウン ドメインは露出した高可変ループを含む。その二つのドメインは、二つの独立なタンパク質物質に分離されることができる。クラウン ドメイン自体を多量に作成、精製することができる。加えて、クラウン ドメインを、ヘテロペプチド配列の提示を可能にするために（遺伝子的に）操作することができる（図１および図２参照）。Ｃは、図１および２での模式的図にクラウン ドメインを表したものである。多量体化ドメインの除去は、多量に作成し、精製、結晶化できる、本発明に係る自主的なタンパク質ドメイン（ＡＤＤｏｂｏｄｙ）をもたらす。 図４は、ヒトアデノウイルス血清型３（Ａｄｈ３）を基にした、本発明に係るＡＤＤｏｂｏｄｙの発現のためのコンストラクトｐＰＲＯＥＸ ＨＴｂ ＡＤＤｏｍｅｒ２＿Ｈｅａｄの模式的表示を示す。 図５は、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿ＨｅａｄコンストラクトのＡＤＤｏｂｏｄｙのＭｏｎｏＱ溶出プロファイルを示す。 図６は、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿ＨｅａｄコンストラクトのＭｏｎｏＱ溶出ＡＤＤｏｂｏｄｙのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。 図７は、図６によるサイズ排除クロマトグラフィーのピーク分画のＳＤＳポリアクリルアミドゲル解析を示す。 図８は、凍結前後の、図６によるサイズ排除クロマトグラフィーの集めたピーク分画のサンプルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル解析を示す。 図９は、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿ＨｅａｄコンストラクトのＡＤＤｏｂｏｄｙの結晶の一例を示す。 図１０は、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿ＨｅａｄコンストラクトのＡＤＤｏｂｏｄｙのＸ線溶液構造の上面図を示す。 図１１は、単位格子なしでの、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿ＨｅａｄコンストラクトのＡＤＤｏｂｏｄｙのＸ線溶液構造の上面図を示す。 図１２は、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿ＨｅａｄコンストラクトのＡＤＤｏｂｏｄｙのＸ線溶液構造の側面図を示す。 図１３は、単位格子なしでの、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿ＨｅａｄコンストラクトのＡＤＤｏｂｏｄｙのＸ線溶液構造の側面図を示す。

より具体的には、本発明は以下の実施形態を提供する。

本発明は、ペントンベースの第１および第２フラグメントに本質的に対応するアミノ酸ストレッチを含む、単離され操作されたポリペプチドを提供する。ここで、それぞれ、ポリペプチドの第1フラグメントは、全長ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２のアミノ酸ストレッチの間に存在し、ポリペプチドの第２のフラグメントは、全長ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第２および第３のフラグメントの間に存在する。また、ここで、単離され操作されたドメインは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成するアミノ酸ストレッチを欠き、ここで、ポリペプチドの第１および／または第２のフラグメントは、１つまたは複数のヘテロ改変を選択的にに含む。

好ましくは、以下の一般式（Ｉ）の構造を有するポリペプチドが提供される：
Ｎ－Ａ－Ｌ－Ｂ－Ｃ （Ｉ）
ここで
Ａは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２のアミノ酸ストレッチの間に存在する、アデノウイルス ペントンベースのＮ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
Ｂは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する２番目と３番目のアミノ酸ストレッチの間に挿入された、アデノウイルス ペントンベースのＣ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
Ｌは、アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチドからなる群から選択される化学基を表し、
Ｎは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドなどの化学基を表し、
Ｃは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドなどの化学基を表し、
ここで、選択的に、フラグメントＡおよび/またはＢは、1つ以上のヘテロ改変を含む。

好ましいフラグメントＮまたは基Ｎは、それぞれ、ポリペプチドの精製を容易にするアミノ酸配列、例えば、Ｈｉｓタグを含む。同じことが、それぞれフラグメントＣまたは基Ｃにも当てはまる。

より好ましくは、本明細書で規定されるポリペプチドのフラグメントＡは、以下の表１によるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。選択的に、フラグメントＡは、一つ以上のヘテロ改変を含む。

より好ましくは、本明細書で規定されるポリペプチドのフラグメントＢは、以下の表２によるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。選択的に、フラグメントＢは、一つ以上のヘテロ改変を含む。

本発明によるポリペプチドの好ましい態様では、フラグメントＡおよび／またはＢは、一つ以上のヘテロ改変を含み、ここで、前記一つ以上のヘテロ改変は、以下の位置に含まれる：
フラグメントＡのＲＧＤループ領域、および／または、
Ｖループ（フラグメントＡの‘可変ループ“とも称される）、および／または、
フラグメントＡの配列（Ｎ末端からＣ末端に）
Ｘ_１-Ｘ_２-Ｘ_３-Ｘ_４-Ｘ_５-Ｘ_６-Ｄ-Ｘ_７-Ｘ_８-Ｘ_９-Ｓ-Ｙ-Ｎ-Ｘ_１０-Ｘ_１１-Ｘ_１２-Ｘ_１３-Ｘ_１４-Ｘ_１５-Ｘ_１６ （配列番号２１）
（以降「フロアー領域」と称される）
ここで、
Ｘ_１はＩまたはＬ、好ましくはＩ
Ｘ_２はＫ、ＱおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＱ、
Ｘ_３はＰまたはＡ、好ましくはＰであり、
Ｘ_４はＬ、Ｖ、およびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＬであり、
Ｘ_５はＴ、Ｅ、Ａ、Ｋ、およびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_６はＥ、Ｋ、ＴおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_７はＳ、ＰおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_８はＫ、ＴおよびＳからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_９はＫ、Ｓ、Ｎ、ＧおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_１０はＬまたはＶ、好ましくはＶであり、
Ｘ_１１はＩまたはＬ、好ましくはＩであり、
Ｘ_１２はＳ、ＥおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_１３はアミノ酸なし（すなわち存在しない）またはＮであり、好ましくはアミノ酸なしであり、
Ｘ_１４はＤまたはＧ、好ましくはＤであり、
Ｘ_１５はＳ、Ｋ、ＱおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、および
Ｘ_１６はＴ、Ｎ、Ｉ、ＫおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、および／または、
フラグメントＢの配列（Ｎ末端からＣ末端に）Ｔ-Ｈ-Ｖ-Ｆ-Ｘ_１７-Ｒ-Ｆ-Ｐ （配列番号２２）（以降、Ｂループと称される）、ここでＸ_１７はＤまたはＮ、好ましくはＮである。

本発明によれば、驚くべきことに、フロアー領域（「フロアーサイト」とも呼ばれる）およびＢループは、本発明の例示的なＡＤＤｏｂｏｄｙのＸ線結晶解析によって証明されたように、柔軟なコンフォメーションを示すことが見出された。

フロアー領域（「フロアーサイト」とも呼ばれる）およびＢループに関して、これらは両方とも（より特にＢループ）、さまざまなアデノウイルス種のアデノウイルス ペントンベース配列の中でかなり保存された部位であり、一つ以上のヘテロ改変は、上記で概要した残基の任意の位置における任意の挿入、欠失、置換、それぞれを含み、挿入または置換は、フロアー領域およびＢループのそれぞれのアミノ酸の一つ以上またはすべてをそれぞれ含む、と解される。

Ｂループに関して、好ましいヘテロ改変は、上記で規定した配列番号２２のアミノ酸残基１から６の置換であり、好ましくはヘテロオリゴヌクレオチド、ヘテロポリペプチド、ヘテロタンパク質またはヘテロタンパク質複合体による置換である。

本発明の好ましい態様では、ポリペプチドは、少なくともＲＧＤループ（すなわち、上で規定したＲＧＤループ領域）、Ｖループ、およびフロアーサイトに一つ以上のヘテロ改変を含み、ここでこのタイプの所定の態様では、一つ以上のヘテロ改変は、前記ＲＧＤループ領域、前記Ｖループおよび前記フロアーサイトのみに位置する。他の態様では、本発明のポリペプチドは、少なくともＲＧＤループ領域およびＶループに一つ以上のヘテロ改変を含み、ここでこのタイプの所定の態様では、一つ以上のヘテロ改変は、前記ＲＧＤループ領域および前記Ｖループにのみ位置する。本発明の他の態様では、ポリペプチドは、少なくともフロアー領域およびＢループに一つ以上のヘテロ改変を含み、このタイプの所定の態様では、一つ以上のヘテロ改変は、フロアーサイトおよびＢループのみに位置する。一つ以上の改変は、上で規定されたフラグメントＡおよび／またはフラグメントＢのヘテロ改変のための位置のいずれの組み合わせにおいても存在して良く、上で規定されたすべての位置における一つ以上のヘテロ改変を含む、と解される。

より好ましくは、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）によって規定される。
Ｘ_１８-Ｘ_１９-Ｘ_２０-Ｘ_２１-Ｘ_２２-Ｘ_２３-Ｘ_２４-Ｘ_２５-Ｘ_２６ (配列番号２３)
ここで
Ｘ_１８はＤ、Ｅ、およびＮからなる群から選ばれ、好ましくはＤ、
Ｘ_１９はＶ、ＬおよびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_２０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＴであり、
Ｘ_２１はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＡであり、
Ｘ_２２はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
Ｘ_２３はＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＱであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_２４はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＥであり、
Ｘ_２５はＳまたはＴからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_２６はいずれかのアミノ酸であり、ＲＧＤループ領域のＮ末端アミノ酸を構成する。

より好ましくは、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＣ末端は以下の配列によって規定される（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｘ_２７-Ｘ_２８-Ｘ_２９-Ｘ_３０-Ｘ_３１-Ｘ_３２-Ｘ_３３-Ｘ_３４ (配列番号２４)
ここで
Ｘ_２７はいずれかのアミノ酸であり、第２ＲＧＤループ領域のＣ末端アミノ酸を構成し、
Ｘ_２８はＩ、ＬおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、
Ｘ_２９はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＱまたはＫであり、より好ましくはＱであり、
Ｘ_３０はＣ、ＧおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＰであり、
Ｘ_３１はＩ、Ｌ、およびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＬまたはＶであり、より好ましくはＬであり、
Ｘ_３２はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_３３はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＫであり、
Ｘ_３４はＤおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＤである。

特許文献１を参照すると、本発明に関する、本明細書に開示および規定されているＲＧＤループ領域は、第1および第２ＲＧＤループ、より具体的には特許文献１の３１から３３ページに規定されているように、細分できると解される。

好ましくは、フラグメントＡのＶループのＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）によって規定される。
Ｘ_３５-Ｘ_３６-Ｘ_３７-Ｘ_３８-Ｘ_３９-Ｘ_４０-Ｘ_４１-Ｘ_４２ (配列番号２５)
ここで
Ｘ_３５はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦであり、
Ｘ_３６はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_３７はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＡであり、
Ｘ_３８はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＲであり、
Ｘ_３９はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_４０はＡ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＭであり、
Ｘ_４１はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_４２はいずれかのアミノ酸であり、Ｖループ領域のＮ末端アミノ酸を構成する。

好ましくは、フラグメントＡのＶループのＣ末端は以下の配列によって規定される（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｘ_４３-Ｘ_４４-Ｘ_４５-Ｘ_４６-Ｘ_４７-Ｘ_４８-Ｘ_４９ (配列番号２６)
ここで
Ｘ_４３はいずれかのアミノ酸であり、Ｖループ領域のＣ末端アミノ酸を構成し、
Ｘ_４４はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
Ｘ_４５はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_４６はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＷであり、
Ｘ_４７はＡ、Ｆ、Ｖ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦまたはＶであり、より好ましくはＦであり、
Ｘ_４８はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＤまたはＥであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_４９はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦである。

別の態様によれば、本発明はまた、アデノウイルス ペントンベース タンパク質のαヘリックス ドメインのラージフラグメントを含む、単離された操作されたポリペプチドにさらに関し、ポリペプチドは、アデノウイルス ペントンベース タンパク質のαヘリックス ドメインのスモールフラグメントおよびジェリーロール フォールド ドメインを欠き、ここで、前記ラージフラグメントは、選択的に、一つ以上のヘテロ改変を含む。このさらに操作されたポリペプチドは、本明細書において「最小クラウン ドメイン」または「最小ＡＤＤｏｂｏｄｙ」または「ミニＡＤＤｏｂｏｄｙ」と呼ばれる。

本発明の最小クラウンドメイン（または最小ＡＤＤｏｂｏｄｙ）は、好ましくは、以下の式（ＩＩ）に従って定義される一般構造を有する。
Ｎ-Ａ-Ｃ (II)
ここで、Ｎ、ＡおよびＣは、上で規定した通りである（式（Ｉ））。

本発明は、本発明の最小ＡＤＤｏｂｏｄｙをコードする核酸にも関する。本発明はさらに、最小ＡＤＤｏｂｏｄｙをコードする前記核酸を含むベクターを提供し、好ましくは前記核酸は発現カセットに含まれる。前記最小ＡＤＤｏｂｏｄｙベクターを含む組換え宿主細胞をさらに提供する。本発明は、さらに、最小ＡＤＤｏｂｏｄｙベクターを含む組換え宿主細胞がさらに提供される。本発明はさらに、本発明の最小ＡＤＤｏｂｏｄｙを作成する方法を提供し、前記方法は、最小ＡＤＤｏｂｏｄｙの発現を可能にする条件下で、発現カセット内に最小ＡＤＤｏｂｏｄｙコード配列を含むベクターを培養するステップ、および選択的に、宿主細胞から最小ＡＤＤｏｂｏｄｙを精製するステップを含む。

本明細書で規定される「ヘテロ改変」は、好ましくは下記にてより詳細に記載されるアデノウイルスペントンベースタンパク質において見出されるような、それぞれの天然に存在する配列と比較した、それぞれのサイト（ＲＧＤループ領域、Ｖループ、フロアーサイト、Ｂループ）の任意の改変であってよい。好ましくは、ヘテロ改変は、フラグメントＡおよび／またはＢの野生型配列と比較しての一つ以上の単一アミノ酸突然変異、一つ以上のヘテロアミノ酸および／またはアミノ酸ストレッチによる野生型アミノ酸ストレッチの一つ以上の置換、一つ以上のヘテロアミノ酸ストレッチの挿入、一つ以上のアミノ酸の一つ以上の欠失、一つ以上のアミノ酸改変、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。本発明による一般に好ましい改変は、非アデノウイルスアミノ酸配列、好ましくは非アデノウイルスオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体による、本明細書で規定されたサイトの野生型アデノウイルス配列のアミノ酸残基への挿入および／または置換である。

点突然変異（好ましくは本明細書で定義されるフラグメントＡおよび／またはＢのそれぞれのサイトに、１つ以上存在し得る）は、例えば、カップリング残基によるアミノ酸の置換であってよい。カップリング残基は、すなわち、結合パートナーと共有結合を形成できる側鎖を有する天然または非天然のアミノ酸である。結合パートナーは、例えば、カップリング残基にカップリングされる別のポリペプチド上、または本発明のフラグメントＡおよび/またはＢ、および/または、リンカーＬ、および/または、フラグメントＮ、および/または、フラグメントＣのいずれかに存在する別のカップリング残基である。後者は、ＡＤＤｏｂｏｄｙまたは最小ＡＤＤｏｂｏｄｙそれぞれの構造を安定化するために働き、または本発明のポリペプチドの二量体、十量体、五量体および／または十二面体を安定化することによって（例えばヘッドトゥテールアレンジメント、ヘッドトゥヘッドアレンジメント、またはテイルトゥヘッドアレンジメント）働く。好ましいカップリング残基はアミノ酸Ｄ、Ｅ、ＫおよびＣであり、当技術分野で知られている適切なレドックス条件下で別のＣとジスルフィド結合を容易に形成できるので、Ｃが特に好ましい。

本発明の好ましい態様では、ヘテロ改変は、標的特異的結合物質を提供する。

本発明の好ましい態様では、標的特異的結合物質は、抗原、エピトープ、ＣＤＲ、抗体、抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、重鎖抗体、シングル ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、単鎖可変領域フラグメント(ｓｃＦＶ)、 可変領域フラグメント(Ｆｖ)、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、シングル ドメイン抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ (免疫グロブリン新規抗原受容体)、ｄｉ－ｓｃＦｖ、バイスペシフィックＴ細胞エンゲージャー(ＢＩＴＥ)、デュアル アフィニティ リターゲティング(ＤＡＲＴ)分子、トリプルボディ、ジアボディ、シングル チェーン ジアボディ、パラトープ、オルタナティブ スキャフォールド タンパク質、などの抗体フラグメント、およびその融合タンパク質、からなる群から選択される。

本発明によれば、抗体の抗原結合部位とも呼ばれるパラトープは、抗原、より具体的には抗原のエピトープ、を認識して結合する抗体の一部である。これは通常、短いアミノ酸ストレッチで、通常５～１０アミノ酸で、抗体のＦａｂ領域の一部である。

本発明の具体的なポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端からＣ末端に）。
［配１］

配列番号２７による本発明の上記ポリペプチドの変異体は、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端からＣ末端に）。
［配２］

本発明のさらに具体的なポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端からＣ末端に）。
［配３］

配列番号２８による本発明の上記ポリペプチドの変異体は、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端からＣ末端に）。
［配４］

本発明はさらに、本発明によるポリペプチドをコードする核酸に関する。

本発明の核酸（本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同義であることを意味する）を含むベクターも提供される。ベクターは、発現カセット内に核酸（またはヌクレオチド配列）を含んでよい。

本発明はまた、核酸またはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。

本発明はさらに、本発明によるポリペプチドの作成方法に関し、前記方法は、発現カセットとともに核酸を有するベクターを含む宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程を含む。作成方法は、培養宿主細胞からポリペプチドを精製する工程を含むことが好ましい。

本発明はまた、一つ以上のヘテロ改変を含む本発明のポリペプチド（すなわち、ＡＤＤｏｂｏｄｙまたは最小ＡＤＤｏｂｏｄｙ）を含む、操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質を提供する。好ましくは、一つ以上のヘテロ改変は、少なくともフロアー領域および／またはＢループにある（ＡＤＤｏｂｏｄｙを含む操作されたペントンベース タンパク質に関して）、または、一つ以上のヘテロ改変は、少なくともフロアー領域にあり（最小ＡＤＤｏｂｏｄｙを含む操作されたペントンベース タンパク質に関して）、アデノウイルス ペントンベース タンパク質の多量体化ドメイン（ジェリーロール フォールド ドメイン）に融合する。好ましくは、多量体化ドメインは、ヒトアデノウイルス血清型２（ｈＡｄ２）、ヒトアデノウイルス血清型３（ｈＡｄ３）、ヒトアデノウイルス血清型４（ｈＡｄ４）、ヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）、ヒトアデノウイルス血清型７（ｈＡｄ７）、ヒトアデノウイルス血清型１１（ｈＡｄ１１）、ヒトアデノウイルス血清型１２（ｈＡｄ１２）、ヒトアデノウイルス血清型１７（ｈＡｄ１７）、ヒトアデノウイルス血清型２５（ｈＡｄ２５）、ヒトアデノウイルス血清型３５（ｈＡｄ３５）、ヒトアデノウイルス血清型３７（ｈＡｄ３７）、ヒトアデノウイルス血清型４１（ｈＡｄ４１）、ゴリラアデノウイルス（ｇｏｒＡｄ）、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈｉｍｐＡｄ），サルアデノウイルス血清型１８（ｓＡｄ１８）、サルアデノウイルス血清型２０（ｓＡｄ２０）、サルアデノウイルス血清型４９（ｓＡｄ４９）、アカゲザルアデノウイルス血清型５１（ｒｈＡｄ５１）、アカゲザルアデノウイルス血清型５２（ｒｈＡｄ５２）およびアカゲザルアデノウイルス血清型５３（ｒｈＡｄ５３）を含むグループから選ばれる。

本発明のＡＤＤｏｂｏｄｙポリペプチドを含む本発明の操作されたペントンベース タンパク質は、概して、以下の式（ＩＩＩ）に係る構造を有する（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｄ-Ａ-Ｅ-Ｂ-Ｆ (ＩＩＩ)
ここでＡおよびＢは上記規定されたαヘリックス クラウン ドメインのフラグメントであり、Ｄ、ＥおよびＦは多量体化（ジェリーロール フォールド）ドメインを形成するアデノウイルス ペントンベースのアミノ酸配列であり、ここで一つ以上のヘテロ改変は、フラグメントＡのフロアー領域に存在する、および／またはフラグメントＢのＢループに存在する。

本発明の最小ＡＤＤｏｂｏｄｙポリペプチドを含む本発明の操作されたペントンベース タンパク質は、概して、以下の式（ＩＶ）に係る構造を有する（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｄ-Ａ-Ｅ-Ｌｉ-Ｆ (ＩＶ)
ここでＡは、上記規定されたαヘリックス クラウン ドメインのラージフラグメントであり、Ｄ、ＥおよびＦは多量体化（ジェリーロール フォールド）ドメインを形成するアデノウイルス ペントンベースのアミノ酸配列であり、ここで、選択的におよび好ましくは、一つ以上のヘテロ改変は、フラグメントＡのフロアー領域に存在し、ここでＬｉは、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体から選ばれるリンカーである。Ｌｉとして好ましいリンカーは、４から１０アミノ酸、すなわち４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸、を有するオリゴペプチドのようなオリゴペプチドリンカーから選ばれ、好ましくはアミノ酸ＧおよびＳを有する。好ましい例は、ＧＧＧＳ（配列番号３７）である。他の例としては、ＧおよびＳからなり、２、３、４、５またはそれ以上のＧＧＳリピートのような複数のＧＧＳリピートを有するリンカーである。このタイプの特に好ましいリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３８）である。

多量体化ドメインを形成する好ましいアミノ酸配列は、配列番号１から２０のアデノウイルス ペントンベース配列から得る。

フラグメントＤ、ＡおよびＦのためのより好ましいアミノ酸配列は、以下に特徴づけられる。

本発明の好ましい態様によると、一般式（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）のアミノ酸ストレッチＤは、以下のコンセンサス配列（配列番号３４）を有する。
［配５］

ここで、
アミノ酸ストレッチＤは、Ｃ末端上、Ｚ_１の前のＴ残基またはＺ_１からＺ_１５のアミノ酸で終わり、
Ｕ は、いずれのアミノ酸であるかアミノ酸なし、
Ｊ_１ は、ＥまたはＧ であり、
Ｊ_２ は、ＥまたはＳ であり、
Ｊ_３ は、ＬまたはＶ であり、
Ｊ_４ は、ＡまたはＳ であり、
Ｊ_５ は、ＬまたはＱ であり、
Ｊ_６ は、ＹまたはＥ であり、
Ｊ_７ は、ＲまたはＫ であり、
Ｊ_８ は、ＶまたはＬ であり、
Ｊ_９ は、ＶまたはＩ であり、
Ｊ_１０ は、ＦまたはＹ であり、
Ｊ_１１ は、ＴまたはＳ であり、
Ｊ_１２ は、ＡまたはＴまたはＩまたはＧ であり、
Ｊ_１３ は、ＳまたはＧ であり、
Ｊ_１４ は、ＦまたはＬ であり、
Ｊ_１５ は、ＥまたはＤ であり、
Ｊ_１６ は、ＡまたはＧ であり、
Ｊ_１７ は、ＤまたはＱ であり、
Ｊ_１８ は、ＬまたはＭ であり、
ｊ_１９ は、ＨまたはＲ であり、
Ｚ_１ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_２ は、もし存在するのであれば、Ｍ であり、
Ｚ_３ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
Ｚ_４ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_５ は、もし存在するのであれば、ＶまたはＩ であり、
Ｚ_６ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_７ は、もし存在するのであれば、ＥまたはＤ であり、
Ｚ_８ は、もし存在するのであれば、ＹまたはＦ であり、
Ｚ_９ は、もし存在するのであれば、Ｍ であり、
Ｚ_１０ は、もし存在するのであれば、ＦまたはＳまたはＹ であり、
Ｚ_１１ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＳ であり、
Ｚ_１２ は、もし存在するのであれば、ＳまたはＮ であり、
Ｚ_１３ は、もし存在するのであれば、Ｋ であり、
Ｚ_１４ は、もし存在するのであれば、Ｆ であり、
Ｚ_１５ は、もし存在するのであれば、Ｋ である。

フラグメントＤのより好ましいアミノ酸配列は、以下の表３に概要される。

本発明の好ましい態様によると、上記一般式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のアミノ酸ストレッチＥは以下の配列（配列番号３５）を有する。
［配６］

ここで、
アミノ酸ストレッチＥは、Ｎ末端上、Ｚ_１７からＺ_２７のアミノ酸またはＺ_２７の後のアミノ酸Ｑで始まり、
アミノ酸ストレッチＥは、Ｃ末端上、Ｚ_２８の前のアミノ酸ＬまたはＺ_２８からＺ_３０のアミノ酸で終わり、
Ｚ_１７ は、もし存在するのであれば、ＬまたはＳ であり
Ｚ_１８ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＰまたはＣ であり、
Ｚ_１９ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＰ であり、
Ｚ_２０ は、もし存在するのであれば、ＰまたはＳまたはＡまたはＲ であり、
Ｚ_２１ は、もし存在するのであれば、ＮまたはＤ であり、
Ｚ_２２ は、もし存在するのであれば、ＧまたはＶ であり、
Ｚ_２３ は、もし存在するのであれば、ＨまたはＴ であり、
Ｚ_２４ は、もし存在するのであれば、Ｃ であり、
Ｚ_２５ は、もし存在するのであれば、Ｇ であり、
Ｚ_２６ は、もし存在するのであれば、ＡまたはＶまたはＳ であり、
Ｚ_２７ は、もし存在するのであれば、ＥまたはＱ であり、
Ｊ_２０ は、ＬまたはＭ であり、
Ｊ_２１ は、ＱまたはＫ であり、
Ｊ_２２ は、ＱまたはＲまたはＳ であり、
Ｊ_２３ は、ＶまたはＩ であり、
Ｊ_２４ は、ＳまたはＮ であり、
Ｊ_２５ は、ＹまたはＦ であり、
Ｊ_２６ は、ＡまたはＶ であり、
Ｚ_２８ は、もし存在するのであれば、ＭまたはＬ であり、
Ｚ_２９ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
Ｚ_３０ は、もし存在するのであれば、ＶまたはＦ である。

フラグメントＥのより好ましいアミノ酸配列は、以下の表４に概要される。

本発明の好ましい態様によると、上記一般式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のアミノ酸ストレッチＦは以下の配列（配列番号３６）を有する。
［配７］

ここで、
アミノ酸ストレッチＦは、Ｎ末端上、Ｚ_３１からＺ_３３のアミノ酸またはＺ_３３の後のアミノ酸Ａで始まり、
Ｚ_３１ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_３２ は、もし存在するのであれば、Ｖ であり、
Ｚ_３３ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
Ｊ_２７ は、ＲまたはＳまたはＧ であり、
Ｊ_２８ は、ＶまたはＩ であり、
Ｊ_２９ は、ＹまたはＨ であり、
Ｊ_３０ は、ＡまたはＳ であり、
Ｊ_３１ は、ＲまたはＫ である。

フラグメントＦのより好ましいアミノ酸配列は、以下の表５に概要される。

一般式（ＩＩＩ）にかかる本発明の操作されたアデノウイルス ペントンベースのフラグメントＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦそれぞれの開始および終始アミノ酸は、配列番号１から２０に示される配列と比較したとき、好ましくは、一つのフラグメントから次のフラグメントへの移行を形成する残基の重複がないように、選択されることが好ましいと解される。

一般式（ＩＶ）にかかる本発明の操作されたアデノウイルス ペントンベースのフラグメントＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦそれぞれの開始および終始アミノ酸は、配列番号１から２０に示される配列と比較したとき、好ましくは、一つのフラグメントから次のフラグメントへの移行を形成する残基の重複がないように、選択されることが好ましいと理解される。

一般式（ＩＩＩ）にかかる本発明の操作されたアデノウイルス ペントンベースのフラグメントＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦは、好ましくは同一アデノウイルス血清型のアミノ酸配列からなるが、同様にキメラも考慮される。

一般式（ＩＶ）にかかる本発明の操作されたアデノウイルス ペントンベースのフラグメントＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦは、好ましくは同一アデノウイルス血清型のアミノ酸配列からなるが、同様にキメラも考慮される。

本発明は、本発明の操作されたペントンベース タンパク質、好ましくは式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のペントンベース タンパク質、最も好ましくは式（ＩＩＩ）のペントンベース タンパク質、の五量体複合体を提供する。

本発明は、本発明の操作されたペントンベース タンパク質の１２個の五量体複合体を含むウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＶＬＰ）にさらに関する。

本発明は、本明細書で概要したように一つ以上のヘテロ改変を有する、本明細書で規定したポリペプチド、および／または、本明細書で概要したように一つ以上のヘテロ改変を有する、本明細書で規定したそのようなポリペプチドポリペプチドを含むＶＬＰの、薬剤としての使用もまた提供する。

本発明は、本明細書で概要したように一つ以上のヘテロ改変を有する、本明細書で規定したポリペプチド、および／または、本明細書で概要したように一つ以上のヘテロ改変を有する、本明細書で規定したそのようなポリペプチドポリペプチドを含むＶＬＰを有する薬学的組成物もまた提供し、選択的に、薬学的組成物は少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および／または、希釈剤とともに提供される。

本発明は、本明細書で開示したようにＶＬＰを作成する方法をさらに提供し、好ましくは、ＶＬＰは本明細書で規定した一つ以上のヘテロ改変を含むポリペプチドからなり、本発明に係るポリペプチドの溶液をインキュベートする工程を含み、好ましくは、ＶＬＰ内にポリペプチドを集合させることができる条件下で、本明細書で規定した一つ以上のヘテロ改変を含むポリペプチドをインキュベートする工程を含む。

本発明は、本明細書で概要した一つ以上のヘテロ改変を有する本明細書で規定したポリペプチド、および／または、本明細書で規定した一つ以上のヘテロ改変を有するそのようなポリペプチドを含むＶＬＰの、感染症、免疫疾患、腫瘍、またはがんの、治療および／または予防における使用もまた提供する。

本発明は、以下の工程を含む、ターゲット分子の結合配列を特定する方法、にもまた関する。
（ｉ）ベクターそれぞれが、発現カセットに、候補結合配列を有する本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを調製する。前記ヌクレオチド配列によってコードされる各ポリペプチドは、本明細書で規定された、一つ以上のサイト（ＲＧＤループおよび／またはフロアー領域および／またはＢループ）にヘテロ改変を、候補結合配列として有し、ここで、各ベクターにおける、ヌクレオチド配列によってコードされる候補結合配列は異なる（すなわちベクターは、ランダム化された候補結合配列をコードする核酸配列のランダム化ライブラリーを好ましくは含む）。
（ｉｉ）宿主細胞または無細胞系において、核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現する。
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において発現したポリペプチドを、選択的に宿主細胞又は無細胞系から精製後、ターゲット分子に接触する。
および、
（ｉｖ）どのポリペプチドがターゲット分子と結合したか検出する。

より具体的には、上記工程（ｉ）は、以下の工程（ｉａ）および（ｉｂ）の一つであってもよい。
（ｉａ）ベクターそれぞれが、発現カセットに、候補結合配列を有する本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを調製する。前記ヌクレオチド配列によってコードされる各ポリペプチドは、本明細書で規定された、ＲＧＤループ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域および／またはＢループの一つ以上にヘテロ改変として、候補結合配列を有し、すなわち前記ライブラリーにおける核酸配列は、本明細書にて規定されたＡＤＤｏｂｏｄｙをコードし、ここで、ベクターがランダム化された候補結合配列をコードする核酸配列のランダム化されたライブラリーを含むように、各ベクター中の核酸配列によってコードされた候補結合配列は異なる。
または、
（ｉｂ）ベクターそれぞれが、発現カセットに、候補結合配列を有する本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを調製する。前記ヌクレオチド配列によってコードされる各ポリペプチドは、本明細書で規定された、ＲＧＤループ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域の一つ以上にヘテロ改変として、候補結合配列を有し、すなわち前記ライブラリーにおける核酸配列は、本明細書にて規定された最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙ（「ミニＡＤＤｏｂｏｄｙ」とも称される）をコードし、ここで、ベクターがランダム化された候補結合配列をコードする核酸配列のランダム化されたライブラリーを含むように、各ベクター中の核酸配列によってコードされた候補結合配列は異なる。

方法は、標的分子に結合するポリペプチドの解離定数（Ｋｄ）を決定する工程を、好ましくはさらに含む。

本発明の文脈において用いられる用語「特異的結合」は、エピトープのような、標的（ターゲット）に強力に結合する結合モイエティー（例えば抗体）を意味し、セカンドターゲットへの解離定数より低い解離定数を有するファーストターゲットに結合する場合、他のターゲットへの結合に比較して特異的であることを意味する。ターゲットは、それらのターゲットへの所定の親和性をともなって結合するそれらのリガンドによって認識させることができ、したがって、そのそれぞれのターゲットへのリガンド結合は生物学的効果となる。好ましくは、結合は両特異的であり、高親和性を伴って起こり、好ましくは１０^－７、１０^－８、１０^―９、１０^－１０Ｍまたはそれより低いＫｄを有する。そのような親和性を、好ましくは３７℃で測定する。適切なアッセイには、表面プラズモン共鳴測定（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標））、水晶振動子マイクロバランス測定（例えばＡｔｔａｎａ（登録商標））および競合アッセイが含まれる。

本明細書で使用されるように、用語「Ｋｄ」（通常は「ｍｏｌ／Ｌ」で測定され、「Ｍ」と省略されることもある）は、結合モイエティー（例えば、抗体またはそのフラグメント）と標的分子（例えば、抗原またはそのエピトープ）の間の特定の相互作用の解離平衡定数を指すことを意図している。Ｋｄを決定する方法には、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴アッセイが含まれるが、これらに限定されない。

上記の同定方法は、標的に結合する同定された配列が、ライブラリー調製（ここで、前の各ラウンドの候補配列は、標的分子への改善された結合を提供するように改変される）、発現、および標的への接触の続くラウンドにてさらに最適化される進化的プロセスとして提供されることもできる。選択的に、所定の最小解離定数、例えば好ましくは、候補配列の標的への特異的結合を示す解離定数、が達成されるまで、または前のラウンドと比較して、解離定数がさらに改善されない、さらに低下しなくなるまで、改善された結合候補が後続の各ラウンドで選択されるように、解離定数の決定が続く。

したがって、好ましくは最終的に最適化された結合配列を含む、選別されたＡＤＤｏｂｏｄｙおよび／または最適化されたＡＤＤｏｂｏｄｙ、それぞれをコードする核酸配列は、アデノウイルス ペントンベースと同一または異なる、好ましくは同一の、多量体化ドメインをコードする核酸配列に、例えば最適化されたＡＤＤｏｂｏｄｙまたは最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙそれぞれをコードするフラグメント、および、発現カセットに核酸配列を含むベクター、における適切な制限酵素サイトを用いることによって、その後遺伝子的に融合されることができる。そして、完全なＡＤＤｏｂｏｄｙ多量体化ドメイン（または最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙ多量体化ドメイン）コンストラクト（すなわち本発明による操作されたペントンベース タンパク質）が発現カセット内で産生されるように、好ましくは最適化された、ＡＤＤｏｂｏｄｙまたは最小ＡＤＤｏｂｏｄｙそれぞれをコードする核酸を、多量体化ドメインをコードする核酸配列をともなうラインに挿入する。そして、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、その、操作されたアデノウイルス ペントンベースと名付けられもした、コンストラクトを大量発現し精製することができる。そしてＶＬＰを、例えば、抗原（またはそのエピトープ）に関する結合配列に関して、ターゲット分子の改善された認識につながる選別された／最適化された結合配列の複数のコピー（６０コピーまで、結合配列がＶＬＰおいてペントンベースあたり一つのコピーとして存在する場合）を含む精製された操作されたアデノウイルス ペントンベースから調製することができる。このシステムは、もちろんいずれの結合パートナー、本明細書でさらに詳細されるような、例えば、抗原、抗体、そのような物質のフラグメント、に用いることができる。

本発明は、本発明のＡＤＤｏｂｏｄｙの五量体もまた提供する。本発明はさらに二つのＡＤＤｏｂｏｄｙ五量体からなる本発明のＡＤＤｏｂｏｄｙの十量体を提供する。

本明細書で開示されるすべての操作されたタンパク質およびポリペプチドは、当該分野で知られる無細胞発現システムにおいて対応する発現ベクターから発現できると理解される。

本発明の他の態様によると、操作されたペントンベース タンパク質が提供され、ここで、前記タンパク質は、以下の配列、
フラグメントＡの（Ｎ末端からＣ末端に）
Ｘ_１-Ｘ_２-Ｘ_３-Ｘ_４-Ｘ_５-Ｘ_６-Ｄ-Ｘ_７-Ｘ_８-Ｘ_９-Ｓ-Ｙ-Ｎ-Ｘ_１０-Ｘ_１１-Ｘ_１２-Ｘ_１３-Ｘ_１４-Ｘ_１５-Ｘ_１６ （配列番号２１）、
および／または、
フラグメントＢの（Ｎ末端からＣ末端に）Ｔ-Ｈ-Ｖ-Ｆ-Ｘ_１７-Ｒ-Ｆ-Ｐ （配列番号２２）
にヘテロ改変を有する。
ここで、フラグメントＡ（「フロアーサイト」または「フロアー領域」とも称される）の（Ｎ末端からＣ末端に） Ｘ_１-Ｘ_２-Ｘ_３-Ｘ_４-Ｘ_５-Ｘ_６-Ｄ-Ｘ_７-Ｘ_８-Ｘ_９-Ｓ-Ｙ-Ｎ-Ｘ_１０-Ｘ_１１-Ｘ_１２-Ｘ_１３-Ｘ_１４-Ｘ_１５-Ｘ_１６ （配列番号２１） について、
Ｘ_１はＩまたはＬ、好ましくはＩ
Ｘ_２はＫ、ＱおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＱ、
Ｘ_３はＰまたはＡ、好ましくはＰであり、
Ｘ_４はＬ、Ｖ、およびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＬであり、
Ｘ_５はＴ、Ｅ、Ａ、Ｋ、およびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_６はＥ、Ｋ、ＴおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_７はＳ、ＰおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_８はＫ、ＴおよびＳからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_９はＫ、Ｓ、Ｎ、ＧおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_１０はＬまたはＶ、好ましくはＶであり、
Ｘ_１１はＩまたはＬ、好ましくはＩであり、
Ｘ_１２はＳ、ＥおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_１３はアミノ酸なし（すなわち存在しない）またはＮであり、好ましくはアミノ酸なしであり、
Ｘ_１４はＤまたはＧ、好ましくはＤであり、
Ｘ_１５はＳ、Ｋ、ＱおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、および
Ｘ_１６はＴ、Ｎ、Ｉ、ＫおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＩである。
また、フラグメントＢの（Ｎ末端からＣ末端に） Ｔ-Ｈ-Ｖ-Ｆ-Ｘ_１７-Ｒ-Ｆ-Ｐ （配列番号２２）（「Ｂループ」とも称される） について、Ｘ_１７はＤまたはＮ、好ましくはＮである。

本発明にかかるリンカーＬ（式（Ｉ））は、４から１０アミノ酸、すなわち４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸、を有するオリゴペプチドのようなオリゴペプチドリンカーから選ばれてよい。１０アミノ酸以上、通常１１から５０アミノ酸、の大きなオリゴペプチドもまた考慮する。リンカーＬは、リンカーＬがＡＤＤｏｂｏｄｙの適切な折りたたみおよび安定性を邪魔しない限り、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体であってもよい。本明細書で規定されたフラグメントＮおよびCについても同じことが言える。本発明の好ましい態様によると、本明細書で規定されたリンカーＬは、アミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端に）ＧＡＭＧＳＧＩＱ（配列番号２９）およびＧＡＮＧＤＳＧＮ（配列番号２０）から選ばれてよい。

本発明の上記態様にてすでに概要したように（表１および２参照）、本発明の操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質同様に、フラグメントＡおよび／またはＢは、ヒトアデノウイルス血清型２（ｈＡｄ２）、ヒトアデノウイルス血清型３（ｈＡｄ３）、ヒトアデノウイルス血清型４（ｈＡｄ４）、ヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）、ヒトアデノウイルス血清型７（ｈＡｄ７）、ヒトアデノウイルス血清型１１（ｈＡｄ１１）、ヒトアデノウイルス血清型１２（ｈＡｄ１２）、ヒトアデノウイルス血清型１７（ｈＡｄ１７）、ヒトアデノウイルス血清型２５（ｈＡｄ２５）、ヒトアデノウイルス血清型３５（ｈＡｄ３５）、ヒトアデノウイルス血清型３７（ｈＡｄ３７）、ヒトアデノウイルス血清型４１（ｈＡｄ４１）、ゴリラアデノウイルス（ｇｏｒＡｄ）、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈｉｍｐＡｄ），サルアデノウイルス血清型１８（ｓＡｄ１８）、サルアデノウイルス血清型２０（ｓＡｄ２０）、サルアデノウイルス血清型４９（ｓＡｄ４９）、アカゲザルアデノウイルス血清型５１（ｒｈＡｄ５１）、アカゲザルアデノウイルス血清型５２（ｒｈＡｄ５２）およびアカゲザルアデノウイルス血清型５３（ｒｈＡｄ５３）を含むグループから選ばれるペントンベース配列にそれぞれ独立に由来するアミノ酸配列を好ましくは基にする。

上に示したアデノウイルス ペントンベースの好ましいアミノ酸配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔやＵｎｉＰｒｏｔＥのような一般的にアクセスできるデータベースに記載されており、上記したアデノウイルス サブタイプのために本明細書で参照される特に好ましい配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｑ２Ｙ０Ｈ９（ヒトアデノウイルス血清型３；配列番号１）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｐ０３２７６（ヒトアデノウイルス血清型２；配列番号２）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｑ２ＫＳＦ３（ヒトアデノウイルス血清型４；配列番号３）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｐ１２５３８（ヒトアデノウイルス血清型５；配列番号４）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｑ９ＪＦＴ６（ヒトアデノウイルス血清型７；配列番号５）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｄ２ＤＭ９３（ヒトアデノウイルス血清型１１；配列番号６）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｐ３６７１６（ヒトアデノウイルス血清型１２；配列番号７）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｆ１ＤＴ６５（ヒトアデノウイルス血清型１７；配列番号８）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｍ０ＱＵＫ０（ヒトアデノウイルス血清型２５；配列番号９）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｑ７Ｔ９４１（ヒトアデノウイルス血清型３５；配列番号１０）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｑ９１２Ｊ１（ヒトアデノウイルス血清型３７；配列番号１１）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｆ８ＷＱＮ４（ヒトアデノウイルス血清型４１；配列番号１２）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｅ５Ｌ３Ｑ９（ゴリラアデノウイルス；配列番号１３）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｇ９Ｇ８４９（チンパンジーアデノウイルス；配列番号１４）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｈ８ＰＦＺ９（サルアデノウイルス血清型１８；配列番号１５）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｆ６ＫＳＵ４（サルアデノウイルス血清型２０；配列番号１６）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｆ２ＷＴＫ５（サルアデノウイルス血清型４９；配列番号１７）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ａ０Ａ０Ａ１ＥＷＷ１（アカゲザルアデノウイルス血清型５１；配列番号１８）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ａ０Ａ０Ａ１ＥＷＸ７（アカゲザルアデノウイルス血清型５２；配列番号１９）およびＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ａ０Ａ０Ａ１ＥＷＺ７（アカゲザルアデノウイルス血清型５３；配列番号２０）に記載される。

上記ペントンベースのアミノ酸配列は以下のとおりである（それぞれのＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．をカッコ内で示す）。

ヒトアデノウイルス血清型３ ペントンベース ｈＡｄ３ （Ｑ２Ｙ０Ｈ９）：配列番号１
[配８]

ｈＡｄ２ （Ｐ０３２７６）：配列番号２
[配９]

ｈＡｄ４ （Ｑ２ＫＳＦ３）：配列番号３
[配１０]

ｈＡｄ５ （Ｐ１２５３８）：配列番号４
[配１１]

ｈＡｄ７ （Ｑ９ＪＦＴ６）：配列番号５
[配１２]

ｈＡｄ１１ （Ｄ２ＤＭ９３）：配列番号６
[配１３]

ｈＡｄ１２ （Ｐ３６７１６）：配列番号７
[配１４]

ｈＡｄ１７ （Ｆ１ＤＴ６５）：配列番号８
[配１５]

ｈＡｄ２５ （Ｍ０ＱＵＫ０）：配列番号９
[配１６]

ｈＡｄ３５ （Ｑ７Ｔ９４１）：配列番号１０
[配１７]

ｈＡｄ３７ （Ｑ９１２Ｊ１）：配列番号１１
[配１８]

ｈＡｄ４１ （Ｆ８ＷＱＮ４）：配列番号１２
[配１９]

ゴリラアデノウイルス ペントンベース ｇｏｒＡｄ （Ｅ５Ｌ３Ｑ９）：配列番号１３
[配２０]

チンパンジーアデノウイルス ペントンベース ｃｈｉｍｐＡｄ （Ｇ９Ｇ８４９）：配列番号１４
[配２１]

サルアデノウイルス ペントンベース ｓＡｄ１８ （Ｈ８ＰＦＺ９）：配列番号１５
[配２２]

ｓＡｄ２０ （Ｆ６ＫＳＵ４）：配列番号１６
[配２３]

ｓＡｄ４９ （Ｆ２ＷＴＫ５）：配列番号１７
[配２４]

アカゲザルアデノウイルス血清型５１ ペントンベース ｒｈＡｄ５１ （Ａ０Ａ０Ａ１ＥＷＷ１）：配列番号１８
[配２５]

ｒｈＡｄ５２ （Ａ０Ａ０Ａ１ＥＷＸ７）：配列番号１９
[配２６]

ｒｈＡｄ５３ （Ａ０Ａ０Ａ１ＥＷＺ７）：配列番号２０
[配２７]

本発明のポリペプチドは、上記参照のアデノウイルス サブタイプおよび血清タイプそれぞれのαヘリックス ドメインを形成する、アミノ酸ストレッチＡ（最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙ）またはＡおよびＢ（ＡＤＤｏｂｏｄｙ）それぞれの既知の特定の配列に限定されない。下記にさらに概要するように、結果として生じるポリペプチドが適切な条件下で立体構造的に安定なクラウン ドメインまたは最小化クラウン ドメインを採用するように配列ＡおよびＢがある限り、アミノ酸フラグメントＡおよびＢもまた、既知のアデノウイルス ペントンベース プロトマーの配列に類似したアミノ酸配列を有することができる。一つ以上のヘテロ改変がＲＧＤ領域、および／または、Ｖループ、および／または、フロアーセグメント、および／または、Ｂループに存在する本発明の態様において、という条件で、通常、フラグメントＡおよびＢのそのような類似配列は、既知のアデノウイルス ペントンベースのアミノ酸配列、好ましくは配列番号１から２０のアミノ酸配列、より好ましくは表１および表２に提供されたアミノ酸ストレッチＡおよびＢのそれぞれと、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、アミノ酸配列一致を共有する。上記概要した前記配列一致は、前記ＲＧＤループ領域、および／または、前記Ｖループ、および／または、前記フロアーセグメント、および／または、前記Ｂループを除き、アデノウイルス ペントンベース フラグメントＡおよびＢ、好ましくは上記概要した配列を参照とすると解される。フラグメントＤ、ＥおよびＦに関しても、これらのフラグメントは既知のアデノウイルス ペントンベース配列の関連部分に類似するアミノ酸配列をそれぞれ有することができると解され、上記フラグメントＡおよびＢのために与えられた好ましい配列一致値はフラグメントＤ、ＥおよびＦにも当てはまる。

本明細書では、他に特別に示さない限り、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端にＩＵＰＡＣの一文字表記を用いて記載される。

本発明の特に好ましいＡＤＤｏｂｏｄｙは、ヒトアデノウイルス血清型３（ｈＡｄ３）のペントンベース タンパク質を基にする。配列番号１のアミノ酸位置に関する好ましい配列について、表１（ラージフラグメントまたはフラグメントＡそれぞれ）および表２（スモールフラグメントまたはフラグメントＢそれぞれ）を参照する。ラージフラグメントまたはフラグメントＡそれぞれに関して、同じことが、最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙにも当てはまる。

本発明の特に好ましいＡＤＤｏｂｏｄｙは、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈｉｍｐＡｄ）のペントンベース タンパク質を基にする。配列番号１のアミノ酸位置に関する好ましい配列について、表１（ラージフラグメントまたはフラグメントＡそれぞれ）および表２（スモールフラグメントまたはフラグメントＢそれぞれ）を参照する。ラージフラグメントまたはフラグメントＡそれぞれに関して、同じことが、最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙにも当てはまる。

すでに上記概要したように、本発明の第一の態様は、一つ以上の抗原またはその一つ以上のエピトープ、より具体的にはウイルス、バクテリア、または他の感染源のような感染因子の一つ以上の抗原またはその一つ以上のエピトープ、腫瘍またはがん抗原またはその一つ以上のエピトープ、それぞれを、上記規定したように、本発明のＡＤＤｏｂｏｄｙまたは最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙの、フラグメントＡおよび／またはＢに好ましくは存在する、一つ以上のサイト内に含むことである。本明細書で用いたように、「抗原」または「抗原のエピトープ」という用語は、例えば抗体やＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＴＣＲ）など免疫反応分子によって認識される構造を指す。このような文脈で、特許文献１に開示された「抗原」および「エピトープ」の規定もまた明らかに参照する（抗原：１６ページ、エピトープ：１５および１６ページ）。ポリペプチドまたは操作されたアデノウイルス ベース プロトマーに存在するヘテロ改変は、対応する自然に生じるエピトープのミモトープであってもよい。

感染因子の抗原または抗原それぞれのエピトープには、これに限らないが、例えば、ＨＩＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ肝炎ウイルスのような肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、フラビウイルス（ジカウイルス）、インフルエンザウイルス、マールブルグ病ウイルス、エボラウイルスおよびチクングニアウイルスのようなアーボウイルス、のようなウイルス感染因子を含む。バクテリア感染因子の抗原には、これに限らないが、例えば、レジオネラ、ヘリコバクター、感染性大腸菌株、ブドウ球菌、サルモネラおよび連鎖球菌の抗原を含む。感染性原生動物病原体の抗原には、これに限らないが、プラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニア、トキソプラズマの抗原を含む。病原体因子の抗原のさらなる例には、クリプトコッカス ネオフォルマンス、ヒストプラスマ カプスラーツム、コクシジオイデス イチミス、ブラストマイセス デルマチチジス、カンジダ アルビカンスのような真菌病原体の抗原を含む。

本発明に係る使用できる腫瘍抗原または腫瘍抗原のエピトープの具体的例には、これに限らないが、７０７－ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、βカテニン/ｍ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７/ｍ、ＣＤＫ４/ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１－Ｒ１７０ｌ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ/ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１/Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン/ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、－２、－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｐ１９０マイナーｂｃｒ－ａｂｌ、Ｐｍｌ/ＲＡＲ．α．、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＴＥＬ/ＡＭＬ１、ＴＰｌ/ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２/ＩＮＴ２およびＷＴ１を含む。

本発明のポリペプチドのさらなる態様は、本明細書に規定されたヘテロ改変のためのフラグメントＡおよび／またはＢの少なくとも一つのサイトが抗体配列、または、抗体断片のような抗体の部分、を含むポリペプチドに関する。本発明の文脈において、用語「抗体」は抗原に特異的に結合する免疫グロブリンである。

用語「抗体断片」は、抗原へ特異的に結合する完全な抗体の能力を有する抗体の一部を意味する。抗体断片の例には、これに限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ´フラグメント、Ｆ（ａｂ´）_２フラグメント、重鎖抗体、シングル ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖフラグメント、可変フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅｓ、Ｆｖ），ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ナノボディ、ＩｇＮＡＲｓ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，新規抗原受容体）ｄｉ－ｓｃＦｖ、バイスペシフィックＴ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ、ＢｉＴＥｓ）、デュアル アフィニティ リターゲティング（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＤＡＲＴ）分子、トリプルボディ、ジアボディ、単鎖ジアボディのようなものを含む。

「ジアボディ」は融合タンパク質または異なる抗原に結合することができる二価の抗体である。ジアボディは、それぞれが抗体の可変フラグメントを含む二つの単一のタンパク質鎖（一般には二つのｓｃＦｖフラグメント）によって構成される。ジアボディはしたがって、二つの抗原結合部位を含み、同じ抗原を標的とする（単一特異性ジアボディ）または異なる抗原を標的とする（二重特異性ジアボディ）ことができる。

本発明の内容で用いられる用語「シングル ドメイン抗体」は、一つの抗体の単量体可変ドメインで構成される抗体断片を指す。簡単には、このような抗体断片は、ラクダ類または軟骨魚類によって作られる重鎖抗体の単量体重鎖可変領域のみを含む。抗体断片の起源の違いにより、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、可変新規抗原受容体）断片をさす。代替えとしては、シングル ドメイン抗体を、遺伝子工学の使用による従来のマウスまたはヒト抗体の可変領域の単量体化によって得ることができる。それらの分子量はおよそ１２ｋＤａから１５ｋＤａであり、したがって、抗原認識のできる最小の抗体断片である。さらなる例は、ナノボディやナノ抗体を含む。

本発明の内容で用いられる抗原結合物質は、ここでは、抗体のように抗原に特異的に結合する化合物を指す「抗体ミメティック」を含み、この化合物は構造的に抗体から離れないものである。一般に、抗体ミメティックは、モル質量がおよそ３から２０ｋＤａで、抗原に特異的に結合する一つ以上の露出ドメインを有する合成ペプチド又はタンパク質である。例には、特にＬＡＣＩ－Ｄ１（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、リポプロテイン関連凝固阻害剤）；ヒトγＢクリスタリンまたはヒトユビキチンなどのアフィリン；シスタチン；スルフォロブス アシドカルダリウスからのＳａｃ７Ｄ；リポカリンおよびリポカリン由来アンチカリン；ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎｓ）；ＦｙｎのＳＨ３ドメイン；プロテアーゼインヒビターのクニッツドメイン；フィブロネクチンの３型１０番目；アドネクチン；ノッチン（システイン ノット ミニプロテイン）；Ａｔｒｉｍｅｒ；ＣＴＬＡ４ベース結合剤などのＥｖｉｂｏｄｉｅｓ；黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＺドメインの３ヘリックスバンドルなどのアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）；ヒトトランスフェリンなどの細胞透過性抗体（Ｔｒａｎｓｂｏｄｙ）；単量体または三量体ヒトＣ型レクチンドメインなどテトラネクチン；トリプシンインヒビターIIなどのミクロボディ；アフィリン；アルマジロリピートタンパク質、が含まれる。抗体に対する共通の有利な点は、良好な溶解性、良好な組織貫通性、熱および酵素への安定性、および比較的低コストでの産生、である。

特に、抗体または抗体断片と同様に、抗原またはそのエピトープに関して、レセプター－リガンド結合のようないずれのタンパク質－タンパク質相互作用に関しても、ＡＤＤｏｂｏｄｙまたは最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙそれぞれのフラグメントＡおよび／またはフラグメントＢにおける異種修飾のための一つ以上のサイトに発明のポリペプチドを含め、レセプター－リガンド結合のようないずれのタンパク質－タンパク質相互作用に関しても、抗原またはそのエピトープへの改善した免疫反応を発揮するように、最適化した抗原またはそのエピトープのような標的結合最適化配列を提供するための選別および／または進化プロセスを含むことが可能であり（図２参照）、または、特に、抗原またはそのエピトープのための複数の結合サイトを有する分子を産生するために、抗原またはそのエピトープのための最適化した認識配列を提供するための選別および／または進化プロセスを含むことが可能である（図１）。

本発明に関する好ましい選別および/または進化プロセスは、非特許文献１に詳細が概要されているようなリボソームディスプレイである。リボソームディスプレイプロトコルには、選別プロセスの全ての工程をｉｎ ｖｉｔｒｏ（イン ビトロ）で完全に行うという利点がある。さらに可能性のある選別プロセスは、当該技術分野で知られているものであり、ファージディスプレイ（非特許文献２、非特許文献３）、イーストツーハイブリッド法（非特許文献４、非特許文献５）および細胞表面ディスプレイ法（非特許文献６、非特許文献７）、同様にｍＲＮＡディスプレイ法、イーストディスプレイ法、および／またはバキュロウイルスカプシドディスプレイ法を含む。

リボソームディスプレイプロセスは、本発明のポリペプチドの使用によって特定の分子を標的とすることに用いられる抗原または他のアミノ酸配列の最適化のために、基本的には二つの方法に用いられる。ターゲット分子に結合するための選別および/または進化プロセスのためのアミノ酸配列は、１０^１４個の個別の配列、より通常は１０^９から１０^１０配列程度の大きさ、のポリペプチド配列の最初のライブラリーから最初に選別されることができ、上記の非特許文献１に詳細が記載されている進化プロセスを選択的に用いる。標的分子に結合する最適化した抗原配列を選別した後、上記規定したような（ＲＧＤ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域および／またはＢループ）一つ以上のサイトに含まれる最適化したアミノ酸にポリペプチドが発現されるように、それ／それらをコードする核酸配列を本発明の適切なベクターにクローニングする。

本発明のこの見地の他の態様によると、各配列が上記規定したような（ＲＧＤ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域および／またはＢループ）一つ以上のサイトに含まれる候補結合配列を含むポリペプチドをコードするように、潜在的候補結合配列のライブラリーを直接本発明の核酸配列にクローニングする。候補結合配列の最初のライブラリーを含む本発明のポリペプチドは、その後通常ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現され、最適化された結合配列の選別が、上記非特許文献１に詳細が概要されているリボソームディスプレイ法、または、ファージディスプレイ法、ｍＲＮＡディスプレイ法、イーストディスプレイ法、および／またはバキュロウイルスカプシドディスプレイ法のような、当該分野で知られる標的分子に結合する候補アミノ酸配列のための他の適切な選別／進化方法の何れか、により行われる。

本来のペントンベース タンパク質がするように、本発明の操作されたアデノウイルスペントンベースタンパク質は五量体複合体に集合し、１２個のこれらが好ましくはｐＨ約５．０から８．０のバッファー溶液中で集合してウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）になる。好ましい例は、ＰＢＳ ｐＨ７．４またはＴＢＳまたはＴＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２から７．６のようなバッファー条件または生理的に近い条件である。このような条件下で、本発明のポリペプチドは約２０℃から４２℃の気温でＶＬＰを形成する。本発明はこのような五量体複合体とＶＬＰにも関する。

本発明のさらなる対象事項は、本明細書で規定されるＡＤＤｏｂｏｄｙ、最小化ＡＤＤｏｂｏｄｙまたは操作されたアデノウイルス タンパク質をコードする核酸である。

本発明によると、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は交換可能に用いられ、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは一以上のヌクレオチド類似体を含む種を指す。本発明の好ましい核酸またはポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、最も好ましくは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡである。本発明のヌクレオチド配列は、他に示さない限り、５’から３’に表され、ＩＵＰＡＣ塩基一文字コードが用いられる。

本発明の核酸およびベクターそれぞれの態様もまた、多方面ヘテロ改変（例えば、本明細書で規定されたオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質などとして）の挿入のために提供される。

本発明のこの態様の内容における挿入サイト（部位）は、好ましくは、制限酵素またはホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列である。
制限酵素サイト（部位）は、当業者に一般によく知られているものである。好ましい例は上に規定したようであるが、多種多様なものから選ぶことができ、米国、マサチューセッツ州、イプスウィッチにある、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．のような制限酵素を製造するさまざまな会社で手引きを見つけることができる。

このようなホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）サイトの例には、これに限らないが、ＰＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩおよびＩ－ＭｓｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、他のＬＡＧＬＩＤＡＧグループメンバーおよびそれらの変異、ＳｅｇＨ、Ｈｅｆ、又は他のＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ－ＡｐｅII、ＩａｎｉＩ、チトクロームｂ ｍＲＮＡマチュラーゼ ｂｌ３、ＰＩ－ＴｌｉＩおよびＰＩ－ＴｆｕII、ＰＩＴｈｙＩおよび他の認識部位を含む。非特許文献８を参照するとよい。対応する酵素は、米国、マサチューセッツ州、イプスウィッチにある、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．などで購入できる。

本発明の好ましい態様において、上で規定した核酸はさらに、ベクターまたは宿主細胞に核酸を挿入するための少なくとも一つのサイトを含む。その挿入サイトでは、一過性導入または遺伝子導入することができる。

ベクターへの挿入、特にプラスミド又はウイルス、に関しては、挿入サイトは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、自律性パルボウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レトロウイルス、ラディノウイルス、エプスタイン－バールウイルス、レンチウイルス、セミリキフォレストウイルス、またはバキュロウイルス、への核酸の挿入に好ましくは適合する。

本発明の核酸に導入できる具体的に好ましい挿入部位は、Ｔｎ７トランスポゾンエレメント、λ-インテグラーゼ特異的アタッチメントサイト、部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）、特にＬｏｘＰサイトやＦＬＰリコンビナーゼ特異的組み換え（ＦＲＴ）サイト、から選ぶことができる。本発明に係る核酸の導入のためのさらに好ましい機構は、ｌｅｆ２－６０３／Ｏｒｆ１６２９のような特異的相同組み換え配列である。

本発明のさらに好ましい態様では、本明細書で述べる核酸は、さらに、他の有毒物質に対して選別する一つ以上の耐性マーカーを含む。本発明の内容で用いられる耐性マーカーの好ましい例は、これに限らないが、アンピシリン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、スペクチノマイシンおよびカナマイシン耐性マーカーを含む。

本発明の核酸は、一つ以上のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含んでよい。

本発明のさらなる対象事項は、上に規定した核酸を含むベクターに関する。

本発明の好ましいベクターは、プラスミド、発現ベクター、トランスファーベクター、より好ましくは真核生物遺伝子トランスファーベクター、トランジエントまたはウイルス介在遺伝子トランスファーベクター、である。本発明に係る他のベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、自律性パルボウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ラディノウイルスベクター、エプスタイン－バールウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セミリキフォレストウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクターである。

本発明に係る核酸の挿入に適したバキュロウイルスベクター（例えば、トランスファーベクターのような適切なプラスミド上にある）もまた本発明の対象事項であり、好ましくは、Ｔｎ７アタッチメントサイト（挿入の有効性を判断する青白スクリーニングのためのｌａｃＺ遺伝子に埋め込まれてよい）および/またはＬｏｘＰサイトを含む。本発明に係るさらに好ましいバキュロウイルスは、（上記した挿入部位の代わり、または追加として）相同組み換えのための配列に隣接するホストに毒である薬剤を発現する遺伝子を含む。毒物を発現する遺伝子の例は、ジフテリアトキシンＡ遺伝子である。相同組み換えの配列の好ましい対は、例えば、ｌｅｆ２－６０３／Ｏｒｆ１６２９である。前記バキュロウイルスは上記したようにさらにマーカー遺伝子を有することもでき、ＧＦＰ、ＹＦＰなどのような蛍光マーカーもまた含む。バキュロウイルスに関する特別な例は、例えば、特許文献３に開示されているものである。

本発明で使用するためにさらに採用可能なベクターは、特許文献４に開示されている。

原核生物宿主細胞において使用できるベクターは、好ましくは、上記に例を挙げたマーカー遺伝子（それらの一つ以上）に加えて、複製起点（ｏｒｉ）を含む。例えば、ＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１およびＯｒｉＶやＲ６Ｋγのような条件複製起点であり、Ｒ６Ｋｙは、原核生物宿主細胞においてｐｉｒ遺伝子に依存する本願のベクターの増殖を行わせる好ましい条件複製起点である。ＯｒｉＶは、原核生物宿主細胞においてｔｒｆＡ遺伝子に依存する本願のベクターの増殖を行わせる。

さらに、本発明は、本発明の核酸及び/または本発明のベクターを含む（組み換え）宿主細胞に関する。

宿主細胞は原核生物または真核生物であってよい。真核生物宿主細胞は、例えば、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であってよい。ヒト宿主細胞の例には、これに限らないが、ＨｅＬａ、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＫＡＴＯ－III、ＩＭＲ３２、ＭＴ－２、膵β細胞、ケラチノサイト、骨髄線維芽細胞、ＣＨＰ２１２、初代神経系細胞、Ｗ１２、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ、Ｓａｏｓ－２、ＷＩ３８、初代肝細胞、ＦＬＣ４、１４３ＴＫ、ＤＬＤ－１、胚性肺線維芽細胞、初代***肺線維芽細胞、ＭＲＣ５およびＭＧ６３が含まれる。本発明のさらに好ましい宿主細胞は、ブタ細胞、好ましくはＣＰＫ、ＦＳ－１３、ＰＫ－１５細胞、ウシ細胞、好ましくはＭＤＢ、ＢＴ細胞、ウシ細胞、ＦＬＬ－ＹＦＴのようなヒツジ細胞、である。本発明の内容で用いられる真核生物の細胞はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞である。さらなる真核生物細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、 Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞を含む。さらに、本発明では宿主細胞として昆虫細胞を用いることができ、昆虫細胞は、より好ましくはＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｆ＋、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ Ｈ５細胞であるＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからの細胞および、特にＳ２ ＳｃｈｎｅｉｄｅｒであるＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒからの細胞を含む。さらに宿主細胞は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃのような寄生虫からの細胞を含む。

本発明に係る原核生物宿主は、バクテリア、特にＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＢＬ２１（ＤＥ３）などのような購入可能な大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉを含む。

当業者は、容易に、適切なベクター構築物（コンストラクト）/宿主細胞の対を適切な増殖、および/又は、本発明に係る核酸エレメントを適切な宿主にトランスファーするために選択することができる。適切なベクターエレメントとベクターを適切な宿主細胞に導入する特定の方法は、同様に当該分野で知られており、方法は非特許文献９の最新版で見つけることができる。

本発明の好ましい態様では、上に規定したベクターはさらに部位特異的（サイト スペシフィック）リコンビナーゼ（ＳＳＲ）のための部位を有し、好ましくはＣｒｅ－ｌｏｘ特異的組み換え用のＬｏｘＰサイトを一つ以上含む。さらに好ましい態様では、本発明のベクターはトランスポゾンエレメントを含み、好ましくはＴｎ７アタッチメントサイトを含む。

上に規定されたアタッチメントサイトはマーカー遺伝子内に位置することがさらに好ましい。このような配置によりトランスポジションによってアタッチメントサイトに挿入された配列を成功的に選別することが容易になる。好ましい態様によると、このようなマーカー遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ＧＡＬ、ＣＡＴ、好ましくはＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰである蛍光タンパク質をコードする遺伝子およびその変異物およびＬａｃＺα遺伝子から選ばれる。

本発明はまた、ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、そのようなベクターを含む宿主細胞と同様に、医薬品としての使用のための上に規定したＶＬＰ、特に感染症、免疫疾患、腫瘍またはがんの治療および/または予防に用いられる医薬品への使用を含む。

したがって、本願発明は、本明細書で規定したポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、そのようなベクターを含む宿主細胞または上述したＶＬＰを含む薬学的組成物に関し、選択的に少なくとも一つの薬学的に許容される担体、賦形剤および/または希釈剤をともに含む薬学的組成物に関する。

一般に、本発明の内容に関して、薬学的組成物の調製、それらの投与量、それらの投与方法は当業者に知られたものであり、非特許文献１０の最新版に手引きを見つけることができる。

本発明の薬学的組成物は、上に概要した有効成分の治療に有効な量を含む。治療に有効な量は有効成分に依存し、特に投与方法に依存する。本発明にかかる医薬組成物は、好ましくは非経口投与によって、特に静脈内、動脈内または骨内注入のような注入、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮膚内、皮下またはクモ膜下注射のような注射によって、投与される。抗腫瘍治療において、本発明にかかるＶＬＰを含む薬学的組成物のような薬学的組成物は、腫瘍内注射によって投与されることができる。

注射や注入のための発明の溶液は、通常は、水またはまたはバッファー溶液、好ましくは生理学的ｐＨの等張バッファー、に発明のＶＬＰを含む。本発明の液体薬学的組成物は、薬学的に許容可能な安定剤、懸濁材、乳化剤のような材料をさらに含んでよい。本発明の薬学的組成物のさらなる材料は、特にワクチン目的のための本発明の構築物（コンストラクト）の適用に関しては、アジュバントである。

本発明のさらなる対象事項は、本発明のポリペプチド、核酸、宿主細胞、ベクターおよび/またはＶＬＰの有益な特徴を利用する治療法である。好ましい態様では、本発明は、対象に、好ましくはヒトである対象に、上に規定したような薬学的組成物の治療に有効な量を投与する工程を含む感染症の予防予防法および/または治療法を提供することであり、ここで、薬学的組成物は感染症を引き起こす感染因子の抗原または抗原のエピトープを含む発明のＶＬＰを含む。別の態様は、腫瘍またはがんを予防するおよび/または治療する方法であり、好ましくはヒトである対象に上で規定した薬学的組成物の治療に有効な量を投与する工程を含み、薬学的組成物は、一つ以上の腫瘍抗原またはそのエピトープを含む。

好ましい態様によると、本発明は、対象に、好ましくはヒトである対象に、上に規定したような薬学的組成物の治療に有効な量の投与工程を含む、感染症の予防法および/または治療法を提供する。ここで、その薬学的組成物は、感染症を引き起こす感染因子の抗原、特にエピトープ、を認識する、一つ以上の抗体、または、抗体のパラトープのような抗体断片、を含む本発明のＶＬＰを含む。他の態様は、対象に、好ましくはヒトである対象に、上に規定したような薬学的組成物の治療に有効な量の投与工程を含む、腫瘍またはがんの予防法および/または治療法である。ここでその薬学的組成物は、腫瘍またはがんの抗原、特にそのエピトープ、を認識する、一つ以上の抗体、または、抗体のパラトープのような抗体断片、を含む本発明のＶＬＰを含む。

本発明はさらに、適切な培地において組み換え宿主細胞を培養する工程を含む、本明細書で述べたポリペプチドを作成する方法に関し、ここで宿主細胞は、前記ポリペプチドが発現できる環境下で、ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを有する。

好ましくは、本発明のポリペプチドの作成のための方法は、宿主細胞および/または培地から発現したポリペプチドを回収する工程をさらに含む。さらにより好ましくは、その方法は、遠心分離、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーのような当該分野で知られている精製手段によって、その回収したポリペプチドを精製する工程も含む。

本発明はまた、以前概要したように、ＶＬＰへのポリペプチドの集合を可能にする環境下でポリペプチドの溶液をインキュベートする工程を含む、本明細書で規定したＶＬＰを作成する方法を提供する。ＶＬＰの適切な形成はサンプル溶液を電子顕微鏡にて検査することにより試験することができる。

本発明を、以下の限定されない例によってさらに示す。

実施例１：
ヒトアデノウイルス血清型３（ｈＡｄ３）のアデノウイルスペントンベースクラウンドメインのクローニング、発現および精製

Ｈｉｓ－タグ配列を付加した、本発明のＡＤＤｏｂｏｄｙをコードする核酸配列（ＡＤＤｏｍｅｒ２＿Ｈｅａｄと命名する）
［配２８］

を図４に示したように制限部位（制限酵素サイト）を用いてｐＰｒｏＥＸ発現ベクターにクローニングした。
結果得られたベクターは次のような配列を有する（ＯＲＦ、開始および終始コドンを下線太字で示し、コード配列を小文字で示す）。
［配２９］

ポリペプチドを以下のように作成し、精製した。
＜バッファーおよびストック溶液＞
１０００×アンピシリンストック：１０ｍＬ ｄＨ_２Ｏに溶解した１ｇアンピシリン、０．２μｍフィルターに通す
１Ｍ ＩＰＴＧストック：１０ｍＬ ｄＨ_２Ｏに溶解した２．４ｇＩＰＴＧ、０．２μｍフィルターに通す
１０×ＰＢＳバッファーストック：８０ｇ ＮａＣｌ
２ｇ ＫＣｌ
７．６２ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４
０．７７ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４
を超純水に溶かし１Ｌにする。ｐＨ７．４に合わせる。
１０×ＰＢＳバッファーストックを１×ＰＢＳを得る前に１：１０で希釈する。
（以下、ＡＤ３Ｈｅａｄ発現をＡＤＤｏｂｏｄｙ用に用いる）
発現および精製プロトコールは１Ｌ培養で述べる。より多くの発現培養が必要であれば、量を増やしてよい。通常、１回の大きな調製に３～５Ｌの発現培養を作り、精製したタンパク質を凍結保存する。

＜１．ＢＬ２１（ＤＥ３）バクテリア トランスフォーメーション＞
ＡＤＤｏｍｅｒ ヘッド（頭）または「クラウン」ドメイン（ＡＤＤｏｂｏｄｙ）をコードするｐＰｒｏ＿ＥＸ＿ＨＴＢ＿ＡＤ３ＨｅａｄプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルにトランスフォームし、選択マーカーとしてアンピシリンを含むＬＢアガロースプレートに播く。
１．１．プレート調製
ＬＢアガロースを電子レンジにて温める。
ボトルを流水で冷やす。
１０００×アンピシリンストックを加える（１００ｍＬ ＬＢアガロースに対して１００μＬ）
１．２．トランスフォーメーション
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を氷上に置き、溶かす。
プラスミドＤＮＡ ５μＬ（～０．６７μｇ）を細胞に加え、氷上で１時間インキュベートする。
４２°Ｃ、４５秒のヒートショックを行い、チューブを氷上で１０分間冷やす。
滅菌ＬＢ５００μＬをチューブに加える。
細胞を３７°Ｃ、１時間、１８０ｒｐｍで回転するインキュベーターでインキュベートする。
細胞培養１００μＬをアンピシリン含有ＬＢアガロースプレートに播き、３７°Ｃでオーバーナイト、インキュベートする。
残りの４００μＬの細胞を３７°Ｃ、１８０ｒｐｍで回転するインキュベーターでオーバーナイト、インキュベートし、もう一度細胞を播く必要がある場合のためにバックアップとして保持する。

＜２．バクテリアの前培養＞
一つのコロニーを５０μＬアンピシリン含有５０ｍＬ ｄＹＴ培地を含む滅菌フラスコに播種する。
３７°Ｃ、１８０ｒｐｍ回転で、オーバーナイト、インキュベートする。

＜３．発現培養の誘導＞
ＯＤ３～４で、５０ｍＬ前培養を、あらかじめ温めておいた１ｍＬ アンピシリン含有１Ｌ ｄＹＴ培地に播種する。
培養を３７°Ｃ、１８０ｒｐｍ回転、でインキュベートする。
ＯＤが１になるまで、１時間ごとＯＤを測定する（約３時間かかる）。
誘導前のサンプルを各シェイカーフラスコから採取する（下記参照）。
そして、培養を１ｍＬ ＩＰＴＧストックで誘導し、３０°Ｃで３時間インキュベートする。
誘導後のサンプルを各シェイカーフラスコから採取する（下記ボックス参照）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１２％）を流す。

＜４．細胞の回収＞
１Ｌ培養を二つのプラスチック容器に分配し、遠心分離用に正確にバランスをとる。
３５００Ｇ、４°Ｃ、２０分間、遠心分離する。
上清を取り除き、ペレットを２０ｍＬの用いた培地で再懸濁し、そして５０ｍＬファルコンチューブに移す。
卓上遠心分離機で３５００Ｇ、１０分間遠心分離する。
培地を取り除き、残りの培地を取り除くため、ファルコンチューブを紙タオルに軽くたたく。
ペレットを液体窒素で瞬時に凍結し、精製まで－２０°Ｃで保存する。

＜５．ＴＡＬＯＮ（登録商標）レジンを用いたＩＭＡＣによるバッチ精製＞
バッファー
ＰＢＳ（１×）（上記参照）
高塩濃度洗浄バッファー：ｐＨ７．４（４°Ｃ、氷上に置く）
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（０．６２２ｇ トリズマ（登録商標）基）
１Ｍ ＫＣｌ （７．４５ｇ ＫＣｌ）
５ｍＭ イミダゾール（最終容量１００ｍＬ ｄＨ_２Ｏ中、０．０３４ｇイミダゾール）
溶出バッファー：ｐＨ７．４（４°Ｃ、氷上に置く）
２００ｍＭ イミダゾール（最終容量１００ｍＬ １×ＰＢＳ中、１．３６ｇイミダゾール）
回収したペレットの重量を測定し、ペレット１ｇあたり、１０ｍＬ １×ＰＢＳを加え、再懸濁する。
細胞を５分間、超音波処理する：パルス超音波、１０秒入、１５秒切
３０００Ｇ、１０分間遠心分離する。
上清を新しいファルコンチューブに移し、３０００Ｇ、１０分間もう一度遠心分離する。
きれいになった上清を、平衡化したＴＡＬＯＮ（登録商標）レジンにロードする。（下記参照）
５．２．レジンの平衡化（ＨｉｓＰｕｒ ＴＡＬＯＮ（登録商標）レジン）
１ｍＬ「スラリー」を１５ｍＬファルコンチューブに加え、５ｍＬ ｄＨ_２Ｏで洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り除く。
そのスラリーを５ｍＬ １×ＰＢＳで洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り除く。
５．３．結合および洗浄行程
きれいになった可溶化液を平衡化したレジンにロードし、低温室にて、一定に回転させながら４°Ｃ、オーバーナイト、インキュベートする。
次の日、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、フロースルー（ＦＴ）を集める。
高塩濃度洗浄バッファー（７ｍＬ）をレジンに加え、回転させながら、低温室にて、４°Ｃ、２０分間インキュベートする。
ファルコンチューブを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収する（ＨＳ）。
洗浄：１×ＰＢＳ ７ｍＬをレジンに加え、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収する（Ｗ１）。
１×ＰＢＳでの洗浄工程をもう２回繰り返し、上清を回収する（Ｗ２、Ｗ３）
１ｍＬ １×ＰＢＳにレジンを再度懸濁し、１．５ｍＬ エッペンドルフチューブに移す。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除く。
５．４．溶出
溶出バッファー ５ｍＬをレジンに加え、回転させながら、低温室にて、４°Ｃ、２０分間インキュベートする。
チューブを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、新しいチューブに上清を集める（Ｅ１）。
溶出バッファー ５ｍＬをレジンに加え、回転させながら、低温室にて、４°Ｃ、２０分間インキュベートする。
チューブを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、新しいチューブに上清を集める（Ｅ２）。
溶出バッファー ５ｍＬをレジンに加え、回転させながら、低温室にて、４°Ｃ、２０分間インキュベートする。
チューブを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、新しいチューブに上清を集める（Ｅ３）。
レジンを１ｍＬ 溶出バッファーに再懸濁する（「レジン」） １２μＬを採取する。
それぞれの工程からのサンプル（１２μＬ＋４μＬ ＰＧＬＢ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１２％）上に流す。

＜６．透析およびＴＥＶ切断＞
タンパク質濃度を、透析とＴＥＶ切断の前に、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ａ２８０）（商標）にて測定する（イミダゾール用補正のため溶出バッファーをブランクとして用いる）。
１２μＬを採取する（「透析前」サンプル）。
２０μＬ ＴＥＶプロテアーゼを加える。
低温室で、透析バッグにて、２ｍＭ ＭｅＳＨ（ＭｅＳＨはドラフト内で用いなくてはならない）含有１×ＰＢＳに対して透析する。
３０分後、新しいＭｅＳＨ含有１×ＰＢＳの入った新しいビーカーに変更する。
透析を４°Ｃでオーバーナイト続ける。
１２μＬを採取する（「透析後」サンプル）。
ＡＤＤｏｂｏｄｙを含むサンプルを回収し、タンパク質濃度を、透析バッファーをブランクとして用いて測定し、サンプルの量を決定し、表１に挿入した（添付参照）。

＜７．切断されていないタンパク質とＴＥＶの除去（逆相ＴＡＬＯＮ（登録商標））＞
透析されたサンプルを、１ｍＬの平衡化したＴＡＬＯＮ（登録商標）レジンにロードし（平衡化レジンは以前に述べた）、回転させながら、低温室にて、４°Ｃ、１時間インキュベートする。
濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（商標）にて測定する。サンプル１２μＬを採取する（「濃縮前」）
サンプルをＡｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）を用いて濃縮した。３０００Ｇ、４°Ｃで、５００μＬまで遠心分離する。
サンプル１２μＬを採取する（「濃縮後」）。
濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（商標）にて測定する。サンプルの量を決定し、表１に挿入する（添付参照）。
それぞれの工程からのサンプル（１２μＬ＋４μＬ ＰＧＬＢ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１２％）上に流す。

＜８．逆相イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）＞
イオン交換クロマトグラフィーを，ＭｏｎｏＱ（登録商標）５／５０カラムを用いて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（商標）システムで行う。
（注意：ＡＤＤｏｂｏｄｙはカラムから落ちてくるので（ＦＴ）、これは「逆相」ＩＥＸであり、対照的に、不純物は結合する）
バッファーＡ：１×ＰＢＳ（新しく作成し、フィルターを通す）
バッファーＢ：１Ｍ ＮａＣｌ含有１×ＰＢＳ
（１Ｌ バッファーＢについて、５８．４４ｇ（１モル）ＮａＣｌを量り、１Ｌ １×ＰＢＳに加え、攪拌して溶解する）。
デルタカラムプレッシャー： ４．００ＭＰａ
インジェクションの前に、カラムを１×ＰＢＳ（１５ｍＬ、すなわち１５カラムボリューム）で平衡化する。
流速 １ｍＬ／分
サンプルをフラクショネーターで回収する。フラクションの量は１ｍＬである。
カラムをバッファーＡで、流速 １ｍＬ／分で洗浄する。
５００μＬサンプルを、卓上遠心分離機にて１３，０００ｒｐｍで遠心分離する。
１２μＬプローブを採取する（ＩＥＸ ＩＮ）
サンプルをインジェクトとする。
直線グラジエントを採用する。：０－１００％Ｂ ２０分
１００％Ｂ ５分
０％Ｂ ５分
（５分間０％Ｂはカラムを再度平衡化するためである）
１ｍＬ フラクションに回収する。
ＡＤＤｏｂｏｄｙはＦＴ中に、１～１０ｍＬ溶出量で溶出する。（約２０ｍＬ溶出量でも小さなピークがある）
溶出プロファイルの例を図５に示す。
ＡＤＤｏｂｏｄｙを含むフラクションを組み合わせる。バッファーＡをブランクとして、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（商標）にて測定する。サンプルの量を決定し、表１に挿入する（添付参照）。

＜９．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）＞
バッファーＡ：１×ＰＢＳ（新しく作成し、フィルターを通す）
メインピークに対応するイオン交換クロマトグラフィーからのフラクションを集め、以前述べたように、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ タンパク質濃縮器（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）で濃縮した。
重要：タンパク質が沈殿するかもしれないので、過剰に濃縮しないように注意すること。３～５Ｌの発現培養の場合、二つの濃縮器が必要であろうが、工程において濃縮をモニターし、沈殿を見ることがないよう確認する。
サイズ排除クロマトグラフィーは、濃縮サンプルの５００μＬ 溶液について、ＨｉＬｏａｄ（登録商標） １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標） ２００ｐｇカラムを用いてＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（商標）システムで行う。
デルタカラムプレッシャー：０．３ＭＰａ
インジェクションの前に、カラムを全量５ｍＬ １×ＰＢＳで平衡化する。
流速 １ｍＬ／分
サンプルアプリケーション：ループは２ｍＬで空になる。
サンプルをフラクションで回収する。フラクションの量は１ｍＬである。
５００μＬサンプル溶液を、卓上遠心分離機にて１３，０００ｒｐｍで遠心分離する。
各インジェクションの１２μＬプローブを採取する（ＳＥＣ ＩＮ）
残り５００μＬをインジェクトとする。
溶出プロファイルの例を図６に示し、ピークフラクションのＳＤＳポリアクリルアミドゲル解析を図７に示す。

＜１０．凍結および保存＞
メジャーピークに対応するＳＥＣからのフラクションを集める。
バッファーＡをブランクとして、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（商標）にて測定する。サンプルの量を決定し、表１に挿入する（添付参照）。
１２μＬサンプルを採取する（「ＣｏｎｃＦｒｅｅｚｅ．ＩＮ」）
Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ タンパク質濃縮器（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）をもちいて、最終濃度５ｍｇ／ｍＬに濃縮する。
１２μＬサンプルを採取する（「ＣｏｎｃＦｒｅｅｚｅ．ＯＵＴ」）
１００μＬ溶液中のタンパク質を、タンパク質低吸着チューブにおいて瞬間凍結し、―２０°Ｃで保存する。
凍結前後の集めたフラクションのＳＤＳポリアクリルアミドゲル解析を図８に示す（凍結前：Ｃｏｎｃ．ｉｎ、凍結後：Ｃｏｎｃ．ｏｕｔ）。ＡＤＤｏｂｏｄｙコンストラクト、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿Ｈｅａｄが安定であることを示す。

実施例２：
ＡＤＤｏｂｏｄｙコンストラクト、ＡＤＤｏｍｅｒ２＿Ｈｅａｄの結晶化とＸ線構造決定

トランケートした（すなわち成熟した）ポリペプチドＡＤＤｏｍｅｒ２＿Ｈｅａｄ（Ｈｉｓタグ含有配列
［配３０］

を欠く、配列番号２７によるアミノ酸配列）
［配３１］

を結晶化し、Ｘ線回折に用いた。

結晶化条件：シッティングドロップ法、ＰＥＧ３３５０ ２０％（ｗ／ｖ）、０．１Ｍ クエン酸塩 ｐＨ５．５、タンパク質濃度：５ｍｇ／ｍＬ、ドロップサイズ：０．５μＬタンパク質および０．５μＬリザーバー

単一の結晶の例を図９に示す。最もよい結晶は約４．５Aに回折する。
Ｘ線回折は次の結果をもたらした。
空間群 Ｐ１
ａ＝１０２．１２４ ｂ＝１０３．８３７ ｃ＝９２．３０８ α＝９２．３０８ β＝９４．３１４ γ＝１１２．０４７

溶液構造を図１０から１３に示す。
単位格子は２つの十量体に存在する２０ＡＤＤｏｂｏｄｙを含む。

重要なことに、ＡＤＤｏｂｏｄｙのフラグメントＡのフロアー領域およびフラグメントＢのＢループが単離されたＡＤＤｏｂｏｄｙにおいて柔軟な構造を形成する。

実施例３：
チンパンジーアデノウイルスのアデノウイルス ペントンベース クラウン ドメインのクローニング、発現および精製

Ｈｉｓタグを付した本発明のさらなるＡＤＤｏｂｏｄｙ（ＣｈｉｍｐＣｒｏｗｎと名付ける）をコードする核酸配列
［配３２］

を、実施例１にて概要したように、ｐＰｒｏＥｘ発現ベクターにクローニングした。
発現および精製を、実施例１のプロトコールに従って実施した。

実施例４：
ヘテロ挿入を含有する、ヒトアデノウイルス血清型３のアデノウイルス ペントンベース クラウン ドメインのクローニング、発現および精製

チクングニアウイルスからの主な中和エピトープＳＴＫＤＮＦＮＶＹＫＡＴＲＰＹＬＡＨ (配列番号４０)をフラグメントＢのＢループに含有し、ｈＡｄ３ペントンベースの野生型フラグメントＢ（Ｈｉｓタグ配列が付加されている）においてＨＶＦＮＲＦ (配列番号４１)配列を置換する、本発明の改変したＡＤＤｏｂｏｄｙをコードする核酸配列
［配３３］

を、実施例１にて概要したように、ｐＰｒｏＥｘ発現ベクターにクローニングした。
発現および精製を、実施例１のプロトコールに従って実施した。

要約すると、本発明は特に次の事項に関する。

１．ペントンベースの第１および第２フラグメントに本質的に対応するアミノ酸ストレッチを含む、単離された遺伝子工学的に操作されたポリペプチドであって、それぞれ、ポリペプチドの第1フラグメントは、全長ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２アミノ酸ストレッチの間に存在し、ポリペプチドの第２フラグメントは、全長ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第２および第３フラグメントの間に存在し、単離された遺伝子工学的に操作されたドメインは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成するアミノ酸ストレッチを欠き、ここで、選択的に、ポリペプチドの第１および／または第２のフラグメントは、一つ以上のヘテロ改変を含む。

２．項目１のポリペプチドは、以下の一般式（Ｉ）の構造を有する。
Ｎ－Ａ－Ｌ－Ｂ－Ｃ （Ｉ）
ここで
Ａは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２のアミノ酸ストレッチの間に存在する、アデノウイルス ペントンベースのＮ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
Ｂは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する２番目と３番目のアミノ酸ストレッチの間に挿入された、アデノウイルス ペントンベースのＣ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
Ｌは、アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチドからなる群から選択される化学基を表し、
Ｎは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
Ｃは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
ここで、選択的に、フラグメントＡおよび/またはＢは、一つ以上のヘテロ改変を含む。

３．項目２の何れか一つに係るポリペプチドであって、フラグメントＡは以下の表に係るアミノ酸配列と、以下の表に示される各アミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含み、選択的に、フラグメントＡは、一つ以上のヘテロ修飾を含む。

４．項目２または３のポリペプチドであって、フラグメントＢは以下の表に係るアミノ酸配列と、以下の表に示される各アミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含み、選択的に、フラグメントＢは、一つ以上のヘテロ修飾を含む。

５．項目２から４の何れか一つのポリペプチドであって、
フラグメントＡおよび／またはＢは、一つ以上のヘテロ改変を含み、ここで、前記一つ以上のヘテロ改変は、以下のサイトに含まれることを特徴とする：
フラグメントＡのＲＧＤループ領域、および／または、
フラグメントＡのＶループ、および／または、
フラグメントＡの、配列（Ｎ末端からＣ末端に）
Ｘ_１-Ｘ_２-Ｘ_３-Ｘ_４-Ｘ_５-Ｘ_６-Ｄ-Ｘ_７-Ｘ_８-Ｘ_９-Ｓ-Ｙ-Ｎ-Ｘ_１０-Ｘ_１１-Ｘ_１２-Ｘ_１３-Ｘ_１４-Ｘ_１５-Ｘ_１６ （配列番号２１）
を有するフロアー領域、
ここで、
Ｘ_１はＩまたはＬ、好ましくはＩ
Ｘ_２はＫ、ＱおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＱ、
Ｘ_３はＰまたはＡ、好ましくはＰであり、
Ｘ_４はＬ、Ｖ、およびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＬであり、
Ｘ_５はＴ、Ｅ、Ａ、Ｋ、およびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_６はＥ、Ｋ、ＴおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_７はＳ、ＰおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_８はＫ、ＴおよびＳからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_９はＫ、Ｓ、Ｎ、ＧおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_１０はＬまたはＶ、好ましくはＶであり、
Ｘ_１１はＩまたはＬ、好ましくはＩであり、
Ｘ_１２はＳ、ＥおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_１３はアミノ酸なし（すなわち存在しない）またはＮであり、好ましくはアミノ酸なしであり、
Ｘ_１４はＤまたはＧ、好ましくはＤであり、
Ｘ_１５はＳ、Ｋ、ＱおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、および
Ｘ_１６はＴ、Ｎ、Ｉ、ＫおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、および／または、
フラグメントＢの配列（Ｎ末端からＣ末端に）Ｔ-Ｈ-Ｖ-Ｆ-Ｘ_１７-Ｒ-Ｆ-Ｐ （配列番号２２）、ここでＸ_１７はＤまたはＮ、好ましくはＮである。

６．項目５のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）によって規定される。
Ｘ_１８-Ｘ_１９-Ｘ_２０-Ｘ_２１-Ｘ_２２-Ｘ_２３-Ｘ_２４-Ｘ_２５-Ｘ_２６ (配列番号２３)
ここで
Ｘ_１８はＤ、Ｅ、およびＮからなる群から選ばれ、好ましくはＤ、
Ｘ_１９はＶ、ＬおよびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_２０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＴであり、
Ｘ_２１はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＡであり、
Ｘ_２２はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
Ｘ_２３はＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＱであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_２４はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＥであり、
Ｘ_２５はＳまたはＴからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_２６はいずれかのアミノ酸であり、ＲＧＤループ領域のＮ末端アミノ酸を構成する。

７．項目５または６のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＣ末端は以下の配列によって規定される（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｘ_２７-Ｘ_２８-Ｘ_２９-Ｘ_３０-Ｘ_３１-Ｘ_３２-Ｘ_３３-Ｘ_３４ (配列番号２４)
ここで
Ｘ_２７はいずれかのアミノ酸であり、第２ＲＧＤループのＣ末端アミノ酸を構成し、
Ｘ_２８はＩ、ＬおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、
Ｘ_２９はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＱまたはＫであり、より好ましくはＱであり、
Ｘ_３０はＣ、ＧおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＰであり、
Ｘ_３１はＩ、Ｌ、およびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＬまたはＶであり、より好ましくはＬであり、
Ｘ_３２はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_３３はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＫであり、
Ｘ_３４はＤおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＤである。

８．項目５から７の何れかのポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）によって規定される。
Ｘ_３５-Ｘ_３６-Ｘ_３７-Ｘ_３８-Ｘ_３９-Ｘ_４０-Ｘ_４１-Ｘ_４２ (配列番号２５)
ここで
Ｘ_３５はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦであり、
Ｘ_３６はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_３７はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＡであり、
Ｘ_３８はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＲであり、
Ｘ_３９はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_４０はＡ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＭであり、
Ｘ_４１はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_４２はいずれかのアミノ酸であり、ＶループのＮ末端アミノ酸を構成する。

９．項目５から８の何れかのポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＣ末端は以下の配列によって規定される（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｘ_４３-Ｘ_４４-Ｘ_４５-Ｘ_４６-Ｘ_４７-Ｘ_４８-Ｘ_４９ (配列番号２６)
ここで
Ｘ_４３はいずれかのアミノ酸であり、Ｖループ領域のＣ末端アミノ酸を構成し、
Ｘ_４４はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
Ｘ_４５はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_４６はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＷであり、
Ｘ_４７はＡ、Ｆ、Ｖ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦまたはＶであり、より好ましくはＦであり、
Ｘ_４８はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＤまたはＥであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_４９はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦである。

１０．項目２から９の何れかのポリペプチドであって、ヘテロ改変は、フラグメントＡおよび／またはＢの野生型配列と比較して一つ以上の単一アミノ酸突然変異、一つ以上のヘテロアミノ酸および／またはアミノ酸ストレッチによる野生型アミノ酸ストレッチの一つ以上の置換、一つ以上のヘテロアミノ酸ストレッチの挿入、一つ以上のアミノ酸の一つ以上の欠失、一つ以上のアミノ酸改変、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。

１１．項目２から１０の何れかのポリペプチドであって、ヘテロ改変は、標的特異的結合物質を提供する。

１２．項目１１のポリペプチドであって、標的特異的結合物質は、抗原、エピトープ、ＣＤＲ、抗体、抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、重鎖抗体、シングル ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、単鎖可変領域フラグメント(ｓｃＦＶ)、 可変領域フラグメント(Ｆｖ)、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、シングル ドメイン抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ (免疫グロブリン新規抗原受容体)、ｄｉ－ｓｃＦｖ、バイスペシフィックＴ細胞エンゲージャー(ＢＩＴＥ)、デュアル アフィニティ リターゲティング(ＤＡＲＴ)分子、トリプルボディ、ジアボディ、シングル チェーン ジアボディ、パラトープ、オルタナティブ スキャフォールド タンパク質、などの抗体フラグメント、およびその融合タンパク質、毒素および毒液からなる群から選択される。

１３．項目１から３の何れかのポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端からＣ末端に）。
［配３４］

１４．単離された遺伝子工学的に操作されたポリペプチドは、アデノウイルス ペントンベース タンパク質のαヘリックス ドメインのラージフラグメントを含み、アデノウイルス ペントンベース タンパク質のαヘリックス ドメインのスモールフラグメントおよびジェリーロール フォールド ドメインを欠き、ここで、前記ラージフラグメントは、選択的に、一つ以上のヘテロ改変を含む。

１５．項目１４のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式（ＩＩ）の一般構造を有する。
Ｎ-Ａ-Ｃ (ＩＩ)
ここで、
Ａは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２のアミノ酸ストレッチの間に存在する、アデノウイルス ペントンベースのＮ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
Ｎは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
Ｃは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
ここで、選択的に、フラグメントＡは、1つ以上のヘテロ改変を含む。

１６．項目１５のポリペプチドであって、フラグメントＡは、下記表によるアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列と、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

１７．項目１５または１６のポリペプチドであって、フラグメントＡは、一つ以上のヘテロ改変を含み、ここで、前記一つ以上のヘテロ改変は、以下のサイトに含まれる、ことを特徴とする：
フラグメントＡのＲＧＤループ領域、および／または、
Ｖループ（フラグメントＡの‘可変ループ“とも称される）、および／または、
フラグメントＡの、配列（Ｎ末端からＣ末端に）
Ｘ_１-Ｘ_２-Ｘ_３-Ｘ_４-Ｘ_５-Ｘ_６-Ｄ-Ｘ_７-Ｘ_８-Ｘ_９-Ｓ-Ｙ-Ｎ-Ｘ_１０-Ｘ_１１-Ｘ_１２-Ｘ_１３-Ｘ_１４-Ｘ_１５-Ｘ_１６ （配列番号２１）
を有するフロアー領域、
ここで、
Ｘ_１はＩまたはＬ、好ましくはＩ
Ｘ_２はＫ、ＱおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＱ、
Ｘ_３はＰまたはＡ、好ましくはＰであり、
Ｘ_４はＬ、Ｖ、およびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＬであり、
Ｘ_５はＴ、Ｅ、Ａ、Ｋ、およびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_６はＥ、Ｋ、ＴおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_７はＳ、ＰおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_８はＫ、ＴおよびＳからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_９はＫ、Ｓ、Ｎ、ＧおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_１０はＬまたはＶ、好ましくはＶであり、
Ｘ_１１はＩまたはＬ、好ましくはＩであり、
Ｘ_１２はＳ、ＥおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
Ｘ_１３はアミノ酸なし（すなわち存在しない）またはＮであり、好ましくはアミノ酸なしであり、
Ｘ_１４はＤまたはＧ、好ましくはＤであり、
Ｘ_１５はＳ、Ｋ、ＱおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、および
Ｘ_１６はＴ、Ｎ、Ｉ、ＫおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、および／または、
フラグメントＢの配列（Ｎ末端からＣ末端に）Ｔ-Ｈ-Ｖ-Ｆ-Ｘ_１７-Ｒ-Ｆ-Ｐ （配列番号２２）、ここでＸ_１７はＤまたはＮ、好ましくはＮである、
ことを特徴とする。

１８．項目１７のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）によって規定される。
Ｘ_１８-Ｘ_１９-Ｘ_２０-Ｘ_２１-Ｘ_２２-Ｘ_２３-Ｘ_２４-Ｘ_２５-Ｘ_２６ (配列番号２３)
ここで
Ｘ_１８はＤ、Ｅ、およびＮからなる群から選ばれ、好ましくはＤ、
Ｘ_１９はＶ、ＬおよびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_２０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＴであり、
Ｘ_２１はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＡであり、
Ｘ_２２はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
Ｘ_２３はＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＱであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_２４はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＥであり、
Ｘ_２５はＳまたはＴからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
Ｘ_２６はいずれかのアミノ酸であり、ＲＧＤループ領域のＮ末端アミノ酸を構成する。

１９．項目１７または１８のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＣ末端は以下の配列によって規定される（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｘ_２７-Ｘ_２８-Ｘ_２９-Ｘ_３０-Ｘ_３１-Ｘ_３２-Ｘ_３３-Ｘ_３４ (配列番号２４)
ここで
Ｘ_２７はいずれかのアミノ酸であり、第２ＲＧＤループのＣ末端アミノ酸を構成し、
Ｘ_２８はＩ、ＬおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、
Ｘ_２９はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＱまたはＫであり、より好ましくはＱであり、
Ｘ_３０はＣ、ＧおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＰであり、
Ｘ_３１はＩ、Ｌ、およびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＬまたはＶであり、より好ましくはＬであり、
Ｘ_３２はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_３３はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＫであり、
Ｘ_３４はＤおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＤである。

２０．項目１７から１９の何れか一つのポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）によって規定される。
Ｘ_３５-Ｘ_３６-Ｘ_３７-Ｘ_３８-Ｘ_３９-Ｘ_４０-Ｘ_４１-Ｘ_４２ (配列番号２５)
ここで
Ｘ_３５はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦであり、
Ｘ_３６はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
Ｘ_３７はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＡであり、
Ｘ_３８はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＲであり、
Ｘ_３９はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_４０はＡ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＭであり、
Ｘ_４１はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
Ｘ_４２はいずれかのアミノ酸であり、Ｖループ領域のＮ末端アミノ酸を構成する。

２１．項目１７から２０の何れか一つのポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＣ末端は以下の配列によって規定される（Ｎ末端からＣ末端に）。
Ｘ_４３-Ｘ_４４-Ｘ_４５-Ｘ_４６-Ｘ_４７-Ｘ_４８-Ｘ_４９ (配列番号２６)
ここで
Ｘ_４３はいずれかのアミノ酸であり、Ｖループ領域のＣ末端アミノ酸を構成し、
Ｘ_４４はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
Ｘ_４５はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_４６はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＷであり、
Ｘ_４７はＡ、Ｆ、Ｖ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦまたはＶであり、より好ましくはＦであり、
Ｘ_４８はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＤまたはＥであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ_４９はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦである。

２２．項目１５から２１の何れか一つのポリペプチドであって、ヘテロ改変は、フラグメントＡの野生型配列と比較して一つ以上の単一アミノ酸突然変異、一つ以上のヘテロアミノ酸および／またはアミノ酸ストレッチによる一つ以上野生型アミノ酸ストレッチの置換、一つ以上のヘテロアミノ酸ストレッチの挿入、一つ以上のアミノ酸の一つ以上の欠失、一つ以上のアミノ酸改変、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。

２３．項目１５から２２の何れか一つのポリペプチドであって、ヘテロ改変は、標的特異的結合物質を提供する。

２４．項目２３のポリペプチドであって、標的特異的結合物質は、抗原、エピトープ、ＣＤＲ、抗体、抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、重鎖抗体、シングル ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、単鎖可変領域フラグメント(ｓｃＦＶ)、 可変領域フラグメント(Ｆｖ)、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、シングル ドメイン抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ (免疫グロブリン新規抗原受容体)、ｄｉ－ｓｃＦｖ、バイスペシフィックＴ細胞エンゲージャー(ＢＩＴＥ)、デュアル アフィニティ リターゲティング(ＤＡＲＴ)分子、トリプルボディ、ジアボディ、シングル チェーン ジアボディ、パラトープ、オルタナティブ スキャフォールド タンパク質、などの抗体フラグメント、およびその融合タンパク質、毒素および毒液からなる群から選択される。

２５．項目１から２４の何れか一つのポリペプチドをコードする核酸。

２６．項目２５の核酸を含むベクター

２７．項目１５の核酸を発現カセットに含む、項目２６のベクター。

２８．項目２４の核酸、または項目２６または２７のベクター、を含む組み換え宿主細胞。

２９．項目１から２４の何れか一つのポリペプチドを生成する方法であって、前記ポリペプチドの発現か可能な条件下で、項目２８のベクターを含む項目２８の宿主細胞を培養する工程を含む。

３０．項目２９の方法であって、さらに培養した宿主細胞からポリペプチドを精製する工程を含む。

３１．アデノウイルス ペントンベース タンパク質の多量体化ドメインに（ジェリーロール フォールド ドメイン）に融合する項目５から１２の何れかのポリペプチドを含む、遺伝子工学的に操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質。

３２．項目３１のペントンベース タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、以下の一般式（ＩＩＩ）の構造を有する。
Ｄ-Ａ-Ｅ-Ｂ-Ｆ (III)
ここで、ＡおよびＢは、項目２から４の何れか一つに規定されたαヘリックス クラウン ドメインのフラグメントであり、Ｄ、ＥおよびＦは多量体化（ジェリーロール フォールド）ドメインを形成するアデノウイルス ペントンベースのアミノ酸配列であり、ここで一つ以上のヘテロ改変は、フラグメントＡのフロアー領域に存在する、および／またはフラグメントＢのＢループに存在する。

３３．アデノウイルス ペントンベース タンパク質の多量体化ドメインに（ジェリーロール フォールド ドメイン）に融合する項目１５から２４の何れかのポリペプチドを含む、操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質。

３４．項目３３のペントンベース タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、以下の一般式（ＩＶ）の構造を有する。
Ｄ-Ａ-Ｅ-Ｌｉ-Ｆ (ＩＶ)
ここでＡは、項目１５または１６の何れか一つに規定されたαヘリックス クラウン ドメインのラージフラグメントであり、Ｄ、ＥおよびＦは多量体化（ジェリーロール フォールド）ドメインを形成するアデノウイルス ペントンベースのアミノ酸配列であり、ここで、選択的におよび好ましくは、一つ以上のヘテロ改変は、フラグメントＡのフロアー領域に存在し、ここでＬｉは、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体から選ばれるリンカーである。

３５．項目３２または３４のペントンベースであって、一般式（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）のフラグメントＤは、以下のコンセンサス配列（配列番号３４）を有する。
［配３５］

ここで、
フラグメントＤは、Ｃ末端側、Ｚ_１の前のＴ残基またはＺ_１からＺ_１５のアミノ酸、で終わり、
Ｕ は、いずれのアミノ酸であるかアミノ酸なし、
Ｊ_１ は、ＥまたはＧ であり、
Ｊ_２ は、ＥまたはＳ であり、
Ｊ_３ は、ＬまたはＶ であり、
Ｊ_４ は、ＡまたはＳ であり、
Ｊ_５ は、ＬまたはＱ であり、
Ｊ_６ は、ＹまたはＥ であり、
Ｊ_７ は、ＲまたはＫ であり、
Ｊ_８ は、ＶまたはＬ であり、
Ｊ_９ は、ＶまたはＩ であり、
Ｊ_１０ は、ＦまたはＹ であり、
Ｊ_１１ は、ＴまたはＳ であり、
Ｊ_１２ は、ＡまたはＴまたはＩまたはＧ であり、
Ｊ_１３ は、ＳまたはＧ であり、
Ｊ_１４ は、ＦまたはＬ であり、
Ｊ_１５ は、ＥまたはＤ であり、
Ｊ_１６ は、ＡまたはＧ であり、
Ｊ_１７ は、ＤまたはＱ であり、
Ｊ_１８ は、ＬまたはＭ であり、
ｊ_１９ は、ＨまたはＲ であり、
Ｚ_１ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_２ は、もし存在するのであれば、Ｍ であり、
Ｚ_３ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
Ｚ_４ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_５ は、もし存在するのであれば、ＶまたはＩ であり、
Ｚ_６ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_７ は、もし存在するのであれば、ＥまたはＤ であり、
Ｚ_８ は、もし存在するのであれば、ＹまたはＦ であり、
Ｚ_９ は、もし存在するのであれば、Ｍ であり、
Ｚ_１０ は、もし存在するのであれば、ＦまたはＳまたはＹ であり、
Ｚ_１１ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＳ であり、
Ｚ_１２ は、もし存在するのであれば、ＳまたはＮ であり、
Ｚ_１３ は、もし存在するのであれば、Ｋ であり、
Ｚ_１４ は、もし存在するのであれば、Ｆ であり、
Ｚ_１５ は、もし存在するのであれば、Ｋ である。

３６．項目３５のペントンベースであって、フラグメントＤは、下記表のアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列と、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

３７．項目３２から３６の何れか一つのペントンベースであって、一般式(III)または(ＩＶ)のフラグメントＥは下記配列（配列番号３５）を有する。
［配３６］

フラグメントＥは、Ｎ末端側、Ｚ_１７からＺ_２７のアミノ酸またはＺ_２７の後のアミノ酸Ｑ、で始まり、
アミノ酸ストレッチＢは、Ｃ末端側、Ｚ_２８の前のアミノ酸ＬまたはＺ_２８からＺ_３０のアミノ酸、で終わり、
Ｚ_１７ は、もし存在するのであれば、ＬまたはＳ であり
Ｚ_１８ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＰまたはＣ であり、
Ｚ_１９ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＰ であり、
Ｚ_２０ は、もし存在するのであれば、ＰまたはＳまたはＡまたはＲ であり、
Ｚ_２１ は、もし存在するのであれば、ＮまたはＤ であり、
Ｚ_２２ は、もし存在するのであれば、ＧまたはＶ であり、
Ｚ_２３ は、もし存在するのであれば、ＨまたはＴ であり、
Ｚ_２４ は、もし存在するのであれば、Ｃ であり、
Ｚ_２５ は、もし存在するのであれば、Ｇ であり、
Ｚ_２６ は、もし存在するのであれば、ＡまたはＶまたはＳ であり、
Ｚ_２７ は、もし存在するのであれば、ＥまたはＱ であり、
Ｊ_２０ は、ＬまたはＭ であり、
Ｊ_２１ は、ＱまたはＫ であり、
Ｊ_２２ は、ＱまたはＲまたはＳ であり、
Ｊ_２３ は、ＶまたはＩ であり、
Ｊ_２４ は、ＳまたはＮ であり、
Ｊ_２５ は、ＹまたはＦ であり、
Ｊ_２６ は、ＡまたはＶ であり、
Ｚ_２８ は、もし存在するのであれば、ＭまたはＬ であり、
Ｚ_２９ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
Ｚ_３０ は、もし存在するのであれば、ＶまたはＦ である。

３８．項目３７のペントンベースであって、フラグメントＥは、下記表のアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列のそれぞれと、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

３９．項目３２から３８のいずれか一つのペントンベースであって、一般式(III)または(ＩＶ)のフラグメントＦは下記配列（配列番号３６）を有する。
［配３７］

ここで、
フラグメントＦは、Ｎ末端側、Ｚ_３１からＺ_３３のアミノ酸またはＺ_３３の後のアミノ酸Ａ、で始まり、
Ｚ_３１ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
Ｚ_３２ は、もし存在するのであれば、Ｖ であり、
Ｚ_３３ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
Ｊ_２７ は、ＲまたはＳまたはＧ であり、
Ｊ_２８ は、ＶまたはＩ であり、
Ｊ_２９ は、ＹまたはＨ であり、
Ｊ_３０ は、ＡまたはＳ であり、
Ｊ_３１ は、ＲまたはＫ である。

４０．項目３９のペントンベースであって、フラグメントＦは、下記表のアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列と、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

４１．項目３２から４０の何れかひとつの、遺伝子工学的に操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質の五量体複合体。

４２．項目４１の五量体複合体を１２個有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）。

４３．医薬品として使用するための項目１から２４の何れか一つのポリペプチド、または、項目４２のＶＬＰ。

４４．項目１から２４の何れか一つのポリペプチド、または、項目３２から４０の何れかの操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質、または、項目４２のＶＬＰ、を含む薬学的組成物であって、選択的に、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤の少なくとも一つを伴う薬学的組成物。

４５．項目４２のＶＬＰを作成する方法であって、ポリペプチドがＶＬＰに集合することができるような条件下で、項目３２から４０のいずれか一つのペントンベースの溶液をインキュベートする工程を含む。

４６．感染症、免疫疾患、腫瘍またはがんの治療および／または予防において使用するための、項目１から２４の何れか一つのポリペプチドまたは項目４２のＶＬＰ。

４７．標的分子への結合配列を同定する方法であって、以下の工程を含む。
（ｉａ）ベクターそれぞれが、発現カセットに、候補結合配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを調製する工程であって、前記ヌクレオチド配列によってコードされる各ポリペプチドは、項目５から９の何れかで規定された、ＲＧＤループ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域および／またはＢループの一つ以上にヘテロ改変として、候補結合配列を有し、ここで、ベクターがランダム化された候補結合配列をコードする核酸配列のランダム化されたライブラリーを含むように、各ベクター中の核酸配列によってコードされた候補結合配列は異なる、工程；
または、
（ｉｂ）ベクターそれぞれが、発現カセットに、候補結合配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを調製する工程であって、前記ヌクレオチド配列によってコードされる各ポリペプチドは、項目１７から２１で規定された、ＲＧＤループ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域の一つ以上にヘテロ改変として、候補結合配列を有し、ここで、ベクターがランダム化された候補結合配列をコードする核酸配列のランダム化されたライブラリーを含むように、各ベクター中の核酸配列によってコードされた候補結合配列は異なる、工程；
（ｉｉ）宿主細胞または無細胞系において、好ましくは無細胞系において、核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において発現したポリペプチドを、選択的に宿主細胞又は無細胞系、好ましくは無細胞系から精製後、ターゲット分子に接触する工程；
および、
（ｉｖ）どのポリペプチドがターゲット分子と結合したか検出する工程。

４８．項目４７の方法は、標的分子に結合したポリペプチドの解離定数（Ｋｄ）を決定する工程を、さらに含む。

Claims (48)

1. ペントンベースの第１および第２フラグメントに本質的に対応するアミノ酸ストレッチを含む、単離された、操作されたポリペプチドであって、
   それぞれ、ポリペプチドの第１フラグメントは、全長ペントンベースにおいてジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２アミノ酸ストレッチの間に存在し、ポリペプチドの第２のフラグメントは、全長ペントンベースにおいてジェリーロール フォールド ドメインを形成する第２および第３のフラグメントの間に存在し、
   単離された、操作されたドメインは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成するアミノ酸ストレッチを欠き、
   選択的に、ポリペプチドの第１および／または第２のフラグメントは、一つ以上のヘテロ改変を含む、
   ことを特徴とするポリペプチド。
2. 請求項１に記載のポリペプチドは、以下の一般式（Ｉ）の構造を有し、
   Ｎ－Ａ－Ｌ－Ｂ－Ｃ （Ｉ）
   ここで
   Ａは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２のアミノ酸ストレッチの間に存在する、アデノウイルス ペントンベースのＮ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
   Ｂは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第２と第３のアミノ酸ストレッチの間に挿入された、アデノウイルス ペントンベースのＣ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
   Ｌは、アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチドからなる群から選択される化学基を表し、
   Ｎは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
   Ｃは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
   ここで、選択的に、フラグメントＡおよび/またはＢは、一つ以上のヘテロ改変を含む、
   ことを特徴とするポリペプチド。
3. 請求項２の何れか一つに係るポリペプチドであって、フラグメントＡは以下の表に係るアミノ酸配列と、以下の表に示される各アミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含み、選択的に、フラグメントＡは、一つ以上のヘテロ修飾を含む、ことを特徴とするポリペプチド。
   

   
4. 請求項２または３に記載のポリペプチドであって、フラグメントＢは以下の表に係るアミノ酸配列と、以下の表に示される各アミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含み、選択的に、フラグメントＢは、一つ以上のヘテロ修飾を含む、ことを特徴とするポリペプチド。
   

   
5. 請求項２から４の何れか一つに記載のポリペプチドであって、
   フラグメントＡおよび／またはＢは、一つ以上のヘテロ改変を含み、ここで、前記一つ以上のヘテロ改変は、以下のサイト、
   フラグメントＡのＲＧＤループ領域、および／または、
   フラグメントＡのＶループ、および／または、
   フラグメントＡの、配列（Ｎ末端からＣ末端に）
   Ｘ_１-Ｘ_２-Ｘ_３-Ｘ_４-Ｘ_５-Ｘ_６-Ｄ-Ｘ_７-Ｘ_８-Ｘ_９-Ｓ-Ｙ-Ｎ-Ｘ_１０-Ｘ_１１-Ｘ_１２-Ｘ_１３-Ｘ_１４-Ｘ_１５-Ｘ_１６ （配列番号２１）
   を有するフロアー領域、
   ここで、
   Ｘ_１はＩまたはＬ、好ましくはＩ
   Ｘ_２はＫ、ＱおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＱ、
   Ｘ_３はＰまたはＡ、好ましくはＰであり、
   Ｘ_４はＬ、Ｖ、およびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＬであり、
   Ｘ_５はＴ、Ｅ、Ａ、Ｋ、およびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
   Ｘ_６はＥ、Ｋ、ＴおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
   Ｘ_７はＳ、ＰおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
   Ｘ_８はＫ、ＴおよびＳからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
   Ｘ_９はＫ、Ｓ、Ｎ、ＧおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
   Ｘ_１０はＬまたはＶ、好ましくはＶであり、
   Ｘ_１１はＩまたはＬ、好ましくはＩであり、
   Ｘ_１２はＳ、ＥおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
   Ｘ_１３はアミノ酸なし（すなわち存在しない）またはＮであり、好ましくはアミノ酸なしであり、
   Ｘ_１４はＤまたはＧ、好ましくはＤであり、
   Ｘ_１５はＳ、Ｋ、ＱおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、および
   Ｘ_１６はＴ、Ｎ、Ｉ、ＫおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、および／または、
   フラグメントＢの配列（Ｎ末端からＣ末端に）Ｔ-Ｈ-Ｖ-Ｆ-Ｘ_１７-Ｒ-Ｆ-Ｐ （配列番号２２）、ここでＸ_１７はＤまたはＮ、好ましくはＮである、
   に含まれる、ことを特徴とするポリペプチド。
6. 請求項５に記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）
   Ｘ_１８-Ｘ_１９-Ｘ_２０-Ｘ_２１-Ｘ_２２-Ｘ_２３-Ｘ_２４-Ｘ_２５-Ｘ_２６ (配列番号２３)
   によって規定され、
   ここで
   Ｘ_１８はＤ、Ｅ、およびＮからなる群から選ばれ、好ましくはＤ、
   Ｘ_１９はＶ、ＬおよびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
   Ｘ_２０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＴであり、
   Ｘ_２１はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＡであり、
   Ｘ_２２はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
   Ｘ_２３はＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＱであり、より好ましくはＥであり、
   Ｘ_２４はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＥであり、
   Ｘ_２５はＳまたはＴからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
   Ｘ_２６はいずれかのアミノ酸であり、ＲＧＤループ領域のＮ末端アミノ酸を構成する、
   ことを特徴とするポリペプチド。
7. 請求項５または６に記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＣ末端は以下の配列によって規定され（Ｎ末端からＣ末端に）、
   Ｘ_２７-Ｘ_２８-Ｘ_２９-Ｘ_３０-Ｘ_３１-Ｘ_３２-Ｘ_３３-Ｘ_３４ (配列番号２４)
   ここで
   Ｘ_２７はいずれかのアミノ酸であり、第２ＲＧＤループのＣ末端アミノ酸を構成し、
   Ｘ_２８はＩ、ＬおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、
   Ｘ_２９はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＱまたはＫであり、より好ましくはＱであり、
   Ｘ_３０はＣ、ＧおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＰであり、
   Ｘ_３１はＩ、Ｌ、およびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＬまたはＶであり、より好ましくはＬであり、
   Ｘ_３２はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
   Ｘ_３３はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＫであり、
   Ｘ_３４はＤおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＤである、
   ことを特徴とするポリペプチド。
8. 請求項５から７の何れかに記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）
   Ｘ_３５-Ｘ_３６-Ｘ_３７-Ｘ_３８-Ｘ_３９-Ｘ_４０-Ｘ_４１-Ｘ_４２ (配列番号２５)
   によって規定され、
   ここで
   Ｘ_３５はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦであり、
   Ｘ_３６はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
   Ｘ_３７はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＡであり、
   Ｘ_３８はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＲであり、
   Ｘ_３９はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
   Ｘ_４０はＡ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＭであり、
   Ｘ_４１はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
   Ｘ_４２はいずれかのアミノ酸であり、ＶループのＮ末端アミノ酸を構成する、
   ことを特徴とするポリペプチド。
9. 請求項５から８の何れかに記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＣ末端は以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）、
   Ｘ_４３-Ｘ_４４-Ｘ_４５-Ｘ_４６-Ｘ_４７-Ｘ_４８-Ｘ_４９ (配列番号２６)
   によって規定され、
   ここで
   Ｘ_４３はいずれかのアミノ酸であり、ＶループのＣ末端アミノ酸を構成し、
   Ｘ_４４はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
   Ｘ_４５はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
   Ｘ_４６はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＷであり、
   Ｘ_４７はＡ、Ｆ、Ｖ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦまたはＶであり、より好ましくはＦであり、
   Ｘ_４８はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＤまたはＥであり、より好ましくはＥであり、
   Ｘ_４９はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦである、
   ことを特徴とするポリペプチド。
10. 請求項２から９の何れかに記載のポリペプチドであって、前記ヘテロ改変は、フラグメントＡおよび／またはＢの野生型配列と比較して一つ以上の単一アミノ酸突然変異、一つ以上のヘテロアミノ酸および／またはアミノ酸ストレッチによる野生型アミノ酸ストレッチの一つ以上の置換、一つ以上のヘテロアミノ酸ストレッチの挿入、一つ以上のアミノ酸の一つ以上の欠失、一つ以上のアミノ酸改変、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選ばれる、ことを特徴とするポリペプチド。
11. 請求項２から１０の何れかに記載のポリペプチドであって、前記ヘテロ改変は、標的特異的結合物質を提供する、ことを特徴とするポリペプチド。
12. 請求項１１に記載のポリペプチドであって、前記標的特異的結合物質は、抗原、エピトープ、ＣＤＲ、抗体、抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、重鎖抗体、シングル ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、単鎖可変領域フラグメント(ｓｃＦＶ)、可変領域フラグメント(Ｆｖ)、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、シングル ドメイン抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ (免疫グロブリン新規抗原受容体)、ｄｉ－ｓｃＦｖ、バイスペシフィックＴ細胞エンゲージャー(ＢＩＴＥ)、デュアル アフィニティ リターゲティング(ＤＡＲＴ)分子、トリプルボディ、ジアボディ、シングル チェーン ジアボディ、パラトープ、オルタナティブ スキャフォールド タンパク質、などの抗体フラグメント、およびその融合タンパク質、毒素および毒液からなる群から選択される、ことを特徴とするポリペプチド。
    
13. 請求項１から３の何れかに記載のポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端からＣ末端に）、ことを特徴とするポリペプチド。
    ［配１］
    

    
14. 単離された、操作されたポリペプチドであって、アデノウイルス ペントンベース タンパク質のαヘリックス ドメインのラージフラグメントを含み、アデノウイルス ペントンベース タンパク質のαヘリックス ドメインのスモールフラグメントおよびジェリーロール フォールド ドメインを欠き、ここで、前記ラージフラグメントは、選択的に、一つ以上のヘテロ改変を含む、ことを特徴とするポリペプチド。
15. 請求項１４に記載のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式（ＩＩ）の一般構造を有し、
    Ｎ-Ａ-Ｃ (ＩＩ)
    ここで、
    Ａは、アデノウイルス ペントンベースのジェリーロール フォールド ドメインを形成する第１および第２アミノ酸ストレッチの間に存在する、アデノウイルス ペントンベースのＮ末端アミノ酸ストレッチに対応するアミノ酸ストレッチを表し、
    Ｎは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
    Ｃは存在してもしなくてもよく、存在する場合は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドからなる化学基を表し、
    ここで、随意、フラグメントＡは、一つ以上のヘテロ改変を含む、
    ことを特徴とするポリペプチド。
16. 請求項１５に記載のポリペプチドであって、フラグメントＡは、下記表によるアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列と、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とするポリペプチド。
    

    
17. 請求項１５または１６に記載のポリペプチドであって、フラグメントＡは、一つ以上のヘテロ改変を含み、ここで、前記一つ以上のヘテロ改変は、以下のサイト、
    フラグメントＡのＲＧＤループ領域、および／または、
    フラグメントＡのＶループ、および／または、
    フラグメントＡの、配列（Ｎ末端からＣ末端に）
    Ｘ_１-Ｘ_２-Ｘ_３-Ｘ_４-Ｘ_５-Ｘ_６-Ｄ-Ｘ_７-Ｘ_８-Ｘ_９-Ｓ-Ｙ-Ｎ-Ｘ_１０-Ｘ_１１-Ｘ_１２-Ｘ_１３-Ｘ_１４-Ｘ_１５-Ｘ_１６ （配列番号２１）
    を有するフロアー領域、
    ここで、
    Ｘ_１はＩまたはＬ、好ましくはＩ
    Ｘ_２はＫ、ＱおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＱ、
    Ｘ_３はＰまたはＡ、好ましくはＰであり、
    Ｘ_４はＬ、Ｖ、およびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＬであり、
    Ｘ_５はＴ、Ｅ、Ａ、Ｋ、およびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
    Ｘ_６はＥ、Ｋ、ＴおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
    Ｘ_７はＳ、ＰおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
    Ｘ_８はＫ、ＴおよびＳからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
    Ｘ_９はＫ、Ｓ、Ｎ、ＧおよびＤからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
    Ｘ_１０はＬまたはＶ、好ましくはＶであり、
    Ｘ_１１はＩまたはＬ、好ましくはＩであり、
    Ｘ_１２はＳ、ＥおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＥであり、
    Ｘ_１３はアミノ酸なし（すなわち存在しない）またはＮであり、好ましくはアミノ酸なしであり、
    Ｘ_１４はＤまたはＧ、好ましくはＤであり、
    Ｘ_１５はＳ、Ｋ、ＱおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、および
    Ｘ_１６はＴ、Ｎ、Ｉ、ＫおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、および／または、
    フラグメントＢの配列（Ｎ末端からＣ末端に）Ｔ-Ｈ-Ｖ-Ｆ-Ｘ_１７-Ｒ-Ｆ-Ｐ （配列番号２２）、ここでＸ_１７はＤまたはＮ、好ましくはＮである、
    に含まれる、ことを特徴とするポリペプチド。
18. 請求項１７に記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）
    Ｘ_１８-Ｘ_１９-Ｘ_２０-Ｘ_２１-Ｘ_２２-Ｘ_２３-Ｘ_２４-Ｘ_２５-Ｘ_２６ (配列番号２３)、
    によって規定され、
    ここで
    Ｘ_１８はＤ、Ｅ、およびＮからなる群から選ばれ、好ましくはＤ、
    Ｘ_１９はＶ、ＬおよびＩからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
    Ｘ_２０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＴであり、
    Ｘ_２１はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＡであり、
    Ｘ_２２はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
    Ｘ_２３はＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＱからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＱであり、より好ましくはＥであり、
    Ｘ_２４はいずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、ＮおよびＫからなる群から選ばれ、より好ましくはＥであり、
    Ｘ_２５はＳまたはＴからなる群から選ばれ、好ましくはＳであり、
    Ｘ_２６はいずれかのアミノ酸であり、ＲＧＤループ領域のＮ末端アミノ酸を構成する、
    ことを特徴とするポリペプチド。
19. 請求項１７または１８に記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＲＧＤループ領域のＣ末端は以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）
    Ｘ_２７-Ｘ_２８-Ｘ_２９-Ｘ_３０-Ｘ_３１-Ｘ_３２-Ｘ_３３-Ｘ_３４ (配列番号２４)
    によって規定され、
    ここで
    Ｘ_２７はいずれかのアミノ酸であり、第２ＲＧＤループのＣ末端アミノ酸を構成し、
    Ｘ_２８はＩ、ＬおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＩであり、
    Ｘ_２９はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＱまたはＫであり、より好ましくはＱであり、
    Ｘ_３０はＣ、ＧおよびＰからなる群から選ばれ、好ましくはＰであり、
    Ｘ_３１はＩ、Ｌ、およびＶからなる群から選ばれ、好ましくはＬまたはＶであり、より好ましくはＬであり、
    Ｘ_３２はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
    Ｘ_３３はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＫであり、
    Ｘ_３４はＤおよびＥからなる群から選ばれ、好ましくはＤである、
    ことを特徴とするポリペプチド。
20. 請求項１７から１９の何れか一つに記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＮ末端は、以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）
    Ｘ_３５-Ｘ_３６-Ｘ_３７-Ｘ_３８-Ｘ_３９-Ｘ_４０-Ｘ_４１-Ｘ_４２ (配列番号２５)
    によって規定され、
    ここで
    Ｘ_３５はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦであり、
    Ｘ_３６はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＫであり、
    Ｘ_３７はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＡであり、
    Ｘ_３８はＨ、ＫおよびＲからなる群から選ばれ、好ましくはＲであり、
    Ｘ_３９はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
    Ｘ_４０はＡ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭからなる群から選ばれ、好ましくはＭであり、
    Ｘ_４１はＡ、Ｖ、ＩおよびＬからなる群から選ばれ、好ましくはＶであり、
    Ｘ_４２はいずれかのアミノ酸であり、ＶループのＮ末端アミノ酸を構成する、
    ことを特徴とするポリペプチド。
21. 請求項１７から２０の何れか一つに記載のポリペプチドであって、フラグメントＡのＶループのＣ末端は以下の配列（Ｎ末端からＣ末端に）。
    Ｘ_４３-Ｘ_４４-Ｘ_４５-Ｘ_４６-Ｘ_４７-Ｘ_４８-Ｘ_４９ (配列番号２６)
    によって規定され、
    ここで
    Ｘ_４３はいずれかのアミノ酸であり、ＶループのＣ末端アミノ酸を構成し、
    Ｘ_４４はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＹであり、
    Ｘ_４５はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＥまたはＴであり、より好ましくはＥであり、
    Ｘ_４６はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＷであり、
    Ｘ_４７はＡ、Ｆ、Ｖ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦまたはＶであり、より好ましくはＦであり、
    Ｘ_４８はＤ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選ばれ、好ましくはＤまたはＥであり、より好ましくはＥであり、
    Ｘ_４９はＦ、ＹおよびＷからなる群から選ばれ、好ましくはＦである、
    ことを特徴とするポリペプチド。
22. 請求項１５から２１の何れか一つに記載のポリペプチドであって、前記ヘテロ改変は、フラグメントＡの野生型配列と比較して一つ以上の単一アミノ酸突然変異、一つ以上のヘテロアミノ酸および／またはアミノ酸ストレッチによる一つ以上の野生型アミノ酸ストレッチの置換、一つ以上のヘテロアミノ酸ストレッチの挿入、一つ以上のアミノ酸の一つ以上の欠失、一つ以上のアミノ酸改変、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選ばれる、ことを特徴とするポリペプチド。
23. 請求項１５から２２の何れか一つに記載のポリペプチドであって、前記ヘテロ改変が、標的特異的結合物質を提供する、ことを特徴とするポリペプチド。
24. 請求項２３のポリペプチドであって、前記標的特異的結合物質は、抗原、エピトープ、ＣＤＲ、抗体、抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、重鎖抗体、シングル ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、単鎖可変領域フラグメント(ｓｃＦＶ)、 可変領域フラグメント(Ｆｖ)、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、シングル ドメイン抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ (免疫グロブリン新規抗原受容体)、ｄｉ－ｓｃＦｖ、バイスペシフィックＴ細胞エンゲージャー(ＢＩＴＥ)、デュアル アフィニティ リターゲティング(ＤＡＲＴ)分子、トリプルボディ、ジアボディ、シングル チェーン ジアボディ、パラトープ、オルタナティブ スキャフォールド タンパク質、などの抗体フラグメント、およびその融合タンパク質、毒素および毒液からなる群から選択される、
    ことを特徴とするポリペプチド。
25. 請求項１から２４の何れか一つに記載のポリペプチドをコードする核酸。
26. 請求項２５に記載の核酸を含むベクター
27. 請求項１５に記載の核酸を発現カセットに含む、請求項２６に記載のベクター。
28. 請求項２４に記載の核酸、または請求項２６または２７に記載のベクター、を含む組み換え宿主細胞。
29. 請求項１から２４の何れか一つに記載のポリペプチドを生成する方法であって、前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で、請求項２８のベクターを含む請求項２８の宿主細胞を培養する工程を含む、ことを特徴とする方法。
30. 請求項２９に記載の方法であって、さらに、培養した宿主細胞からポリペプチドを精製する工程を含む、ことを特徴とする方法。
31. アデノウイルス ペントンベース タンパク質の多量体化ドメイン（ジェリーロール フォールド ドメイン）に融合する請求項５から１２の何れかに記載のポリペプチドを含む、操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質。
32. 請求項３１に記載のペントンベース タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、以下の一般式（ＩＩＩ）
    Ｄ-Ａ-Ｅ-Ｂ-Ｆ (ＩＩＩ)
    の構造を有し、
    ここで、ＡおよびＢは、請求項２から４の何れか一つにて規定されたαヘリックス クラウン ドメインのフラグメントであり、Ｄ、ＥおよびＦは多量体化（ジェリーロール フォールド）ドメインを形成するアデノウイルス ペントンベースのアミノ酸配列であり、ここで一つ以上のヘテロ改変は、フラグメントＡのフロアー領域に存在する、および／またはフラグメントＢのＢループに存在する、
    ことを特徴とするペントンベース タンパク質。
33. アデノウイルス ペントンベース タンパク質の多量体化ドメイン（ジェリーロール フォールド ドメイン）に融合する、請求項１５から２４の何れかに記載のポリペプチドを含む、操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質。
34. 請求項３３に記載のペントンベースであって、Ｎ末端からＣ末端に、以下の一般式（ＩＶ）
    Ｄ-Ａ-Ｅ-Ｌｉ-Ｆ (ＩＶ)
    の構造を有し、
    ここでＡは、請求項１５または１６の何れか一つにて規定されたαヘリックス クラウン ドメインのラージフラグメントであり、Ｄ、ＥおよびＦは多量体化（ジェリーロール フォールド）ドメインを形成するアデノウイルス ペントンベースのアミノ酸配列であり、ここで、選択的におよび好ましくは、一つ以上のヘテロ改変は、フラグメントＡのフロアー領域に存在し、ここでＬｉは、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびタンパク質複合体から選ばれるリンカーである、
    ことを特徴とするペントンベース。
35. 請求項３２または３４に記載のペントンベースであって、一般式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のフラグメントＤは、以下のコンセンサス配列（配列番号３４）
    ［配２］
    

    

    
    を有し、
    ここで、
    フラグメントＤは、Ｃ末端側、Ｚ_１の前のＴ残基またはＺ_１からＺ_１５のアミノ酸、で終わり、
    Ｕ は、いずれのアミノ酸であるかアミノ酸なし、
    Ｊ_１ は、ＥまたはＧ であり、
    Ｊ_２ は、ＥまたはＳ であり、
    Ｊ_３ は、ＬまたはＶ であり、
    Ｊ_４ は、ＡまたはＳ であり、
    Ｊ_５ は、ＬまたはＱ であり、
    Ｊ_６ は、ＹまたはＥ であり、
    Ｊ_７ は、ＲまたはＫ であり、
    Ｊ_８ は、ＶまたはＬ であり、
    Ｊ_９ は、ＶまたはＩ であり、
    Ｊ_１０ は、ＦまたはＹ であり、
    Ｊ_１１ は、ＴまたはＳ であり、
    Ｊ_１２ は、ＡまたはＴまたはＩまたはＧ であり、
    Ｊ_１３ は、ＳまたはＧ であり、
    Ｊ_１４ は、ＦまたはＬ であり、
    Ｊ_１５ は、ＥまたはＤ であり、
    Ｊ_１６ は、ＡまたはＧ であり、
    Ｊ_１７ は、ＤまたはＱ であり、
    Ｊ_１８ は、ＬまたはＭ であり、
    ｊ_１９ は、ＨまたはＲ であり、
    Ｚ_１ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
    Ｚ_２ は、もし存在するのであれば、Ｍ であり、
    Ｚ_３ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
    Ｚ_４ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
    Ｚ_５ は、もし存在するのであれば、ＶまたはＩ であり、
    Ｚ_６ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
    Ｚ_７ は、もし存在するのであれば、ＥまたはＤ であり、
    Ｚ_８ は、もし存在するのであれば、ＹまたはＦ であり、
    Ｚ_９ は、もし存在するのであれば、Ｍ であり、
    Ｚ_１０ は、もし存在するのであれば、ＦまたはＳまたはＹ であり、
    Ｚ_１１ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＳ であり、
    Ｚ_１２ は、もし存在するのであれば、ＳまたはＮ であり、
    Ｚ_１３ は、もし存在するのであれば、Ｋ であり、
    Ｚ_１４ は、もし存在するのであれば、Ｆ であり、
    Ｚ_１５ は、もし存在するのであれば、Ｋ である、
    ことを特徴とするペントンベース。
36. 請求項３５に記載のペントンベースであって、フラグメントＤは、下記表のアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列と、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とするペントンベース。
    

    
37. 請求項３２から３６の何れか一つに記載のペントンベースであって、一般式(III)または(ＩＶ)のフラグメントＥは下記配列（配列番号３５）
    ［配３］
    

    

    
    を有し、ここで、
    フラグメントＥは、Ｎ末端側、Ｚ_１７からＺ_２７のアミノ酸またはＺ_２７の後のアミノ酸Ｑ、で始まり、
    アミノ酸ストレッチＢは、Ｃ末端側、Ｚ_２８の前のアミノ酸ＬまたはＺ_２８からＺ_３０のアミノ酸、で終わり、
    Ｚ_１７ は、もし存在すのであれば、ＬまたはＳ であり
    Ｚ_１８ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＰまたはＣ であり、
    Ｚ_１９ は、もし存在するのであれば、ＴまたはＰ であり、
    Ｚ_２０ は、もし存在するのであれば、ＰまたはＳまたはＡまたはＲ であり、
    Ｚ_２１ は、もし存在するのであれば、ＮまたはＤ であり、
    Ｚ_２２ は、もし存在するのであれば、ＧまたはＶ であり、
    Ｚ_２３ は、もし存在するのであれば、ＨまたはＴ であり、
    Ｚ_２４ は、もし存在するのであれば、Ｃ であり、
    Ｚ_２５ は、もし存在するのであれば、Ｇ であり、
    Ｚ_２６ は、もし存在するのであれば、ＡまたはＶまたはＳ であり、
    Ｚ_２７ は、もし存在するのであれば、ＥまたはＱ であり、
    Ｊ_２０ は、ＬまたはＭ であり、
    Ｊ_２１ は、ＱまたはＫ であり、
    Ｊ_２２ は、ＱまたはＲまたはＳ であり、
    Ｊ_２３ は、ＶまたはＩ であり、
    Ｊ_２４ は、ＳまたはＮ であり、
    Ｊ_２５ は、ＹまたはＦ であり、
    Ｊ_２６ は、ＡまたはＶ であり、
    Ｚ_２８ は、もし存在するのであれば、ＭまたはＬ であり、
    Ｚ_２９ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
    Ｚ_３０ は、もし存在するのであれば、ＶまたはＦ である、
    ことを特徴とする、ペントンベース。
38. 請求項３７に記載のペントンベースであって、フラグメントＥは、下記表のアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とするペントンベース。
    

    
39. 請求項３２から３８のいずれか一つに記載のペントンベースであって、一般式(III)または(ＩＶ)のフラグメントＦは下記配列（配列番号３６）
    ［配４］
    

    

    
    を有し、ここで、
    フラグメントＦは、Ｎ末端側、Ｚ_３１からＺ_３３のアミノ酸またはＺ_３３の後のアミノ酸Ａ、で始まり、
    Ｚ_３１ は、もし存在するのであれば、Ｎ であり、
    Ｚ_３２ は、もし存在するのであれば、Ｖ であり、
    Ｚ_３３ は、もし存在するのであれば、Ｐ であり、
    Ｊ_２７ は、ＲまたはＳまたはＧ であり、
    Ｊ_２８ は、ＶまたはＩ であり、
    Ｊ_２９ は、ＹまたはＨ であり、
    Ｊ_３０ は、ＡまたはＳ であり、
    Ｊ_３１ は、ＲまたはＫ である、
    ことを特徴とするペントンベース。
40. 請求項３９に記載のペントンベースであって、フラグメントＦは、下記表のアミノ酸配列と、下記表に示された各アミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは９５％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とするペントンベース。
    

    
41. 請求項３２から４０の何れかひとつに記載の、操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質の五量体複合体。
42. 請求項４１に記載の五量体複合体を１２個有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
43. 医薬品として使用するための、請求項１から２４の何れか一つに記載のポリペプチド、または、請求項４２に記載のＶＬＰ。
44. 薬学的組成物であって、請求項１から２４の何れか一つに記載のポリペプチド、または、請求項３２から４０の何れか一つに記載の操作されたアデノウイルス ペントンベース タンパク質、または、請求項４２に記載のＶＬＰ、を含み、選択的に、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤の少なくとも一つを伴う、ことを特徴とする薬学的組成物。
45. 請求項４２に記載のＶＬＰを生成する方法であって、ポリペプチドがＶＬＰに集合することができるような条件下で、請求項３２から４０のいずれか一つに記載のペントンベースの溶液をインキュベートする工程を含む、ことを特徴とする方法。
46. 感染症、免疫疾患、腫瘍またはがんの治療および／または予防において使用するための、請求項１から２４の何れか一つに記載のポリペプチド、または請求項４２に記載のＶＬＰ。
47. 標的分子への結合配列を同定する方法であって、以下の工程、
    （ｉａ）ベクターそれぞれが、発現カセットに、候補結合配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを調製する工程であって、前記ヌクレオチド配列によってコードされる各ポリペプチドは、請求項５から９の何れかにて規定された、ＲＧＤループ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域および／またはＢループの一つ以上にヘテロ改変として、候補結合配列を有し、ここで、ベクターが、ランダム化された候補結合配列をコードする核酸配列のランダム化されたライブラリーを含むように、各ベクター中の核酸配列によってコードされる候補結合配列は異なる、工程；
    または、
    （ｉｂ）ベクターそれぞれが、発現カセットに、候補結合配列を有する本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを調製する工程であって、前記ヌクレオチド配列によってコードされる各ポリペプチドは、請求項１７から２１の何れかで規定された、ＲＧＤループ領域および／またはＶループおよび／またはフロアー領域の一つ以上にヘテロ改変として、候補結合配列を有し、ここで、ベクターが、ランダム化された候補結合配列をコードする核酸配列のランダム化されたライブラリーを含むように、各ベクター中の核酸配列によってコードされる候補結合配列は異なる、工程；
    （ｉｉ）宿主細胞または無細胞系において、好ましくは無細胞系において、工程（ｉａ）または（ｉｂ）のベクターのライブラリーからの核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現する工程；
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において発現したポリペプチドを、選択的に、宿主細胞又は無細胞系、好ましくは無細胞系、から精製後、ターゲット分子に接触する工程；
    および、
    （ｉｖ）どのポリペプチドがターゲット分子と結合したか検出する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
48. 請求項４７に記載の方法が、標的分子に結合したポリペプチドの解離定数（Ｋｄ）を決定する工程をさらに含む、ことを特徴とする方法。

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