JP2023512250A

JP2023512250A - ＩＬ１３Ｒα２陽性悪性腫瘍の治療のための標的キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞

Info

Publication number: JP2023512250A
Application number: JP2022546411A
Authority: JP
Inventors: ケイ．ガルシア，クリストファー; モラガゴンザレス，イグナシオ; ヤン，シン; イー．ブラウン，クリスティーン; シュテルン，ローレンス
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2023-03-24
Also published as: WO2021154543A2; EP4097127A2; WO2021154543A3; US20230372483A1; CN115551882A

Abstract

変異型ＩＬ－１３を含むキメラ抗原受容体分子に関する。変異型ＩＬ－１３はＩＬ１３Ｒα１への結合が弱いため、ＩＬ１３Ｒα１よりもＩＬ１３Ｒα２に対して選択的である。キメラ抗原受容体は、ＩＬ１３Ｒα２を発現するがんの治療に使用できる。

Description

優先権の主張
本出願は、２０２０年１月３１日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６２／９６８，９７５の利益を主張する。上記のすべての内容は、参照によりここに組み込まれる。

技術分野
本開示は、ＩＬ１３受容体に結合するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、当該ＣＡＲを発現するＴ細胞、当該ＣＡＲＴ細胞を製剤化する方法、及び抗がん剤としての使用方法に関する。

ＩＬＲα２（非特許文献１）は、正常組織での発現が稀であること（非特許文献２）、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）（非特許文献３）、膵管腺がん（非特許文献４）、黒色腫（非特許文献５）、卵巣がん（非特許文献６）、明細胞腎細胞がん（非特許文献７）、乳がん（非特許文献８）、肺がん（非特許文献９）等多くのヒトのがんで過剰発現することから、汎用性のある治療標的である。２番目のＩＬ１３受容体ファミリーメンバーであるＩＬ１３Ｒα１は、より低い親和性でＩＬ１３と相互作用し（非特許文献１）、健康な組織に普遍的に発現する（非特許文献２）。さらに、ＩＬ１３Ｒα１とＩＬ４Ｒαは、ＩＬ１３に高い親和性で結合し（非特許文献１）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ６経路を介したシグナル伝達を仲介する受容体ペアであり（非特許文献１０）、肺組織で共発現している（非特許文献１１）。ＩＬ１３結合パートナーが健常組織においてこのように広く発現しているにもかかわらず、ＩＬ１３－リガンド系ＣＡＲは、ＧＢＭ（非特許文献１２及び１３）での局所領域中枢神経系（ＣＮＳ）送達系を用いた臨床試験中にヒトでの安全性を示しており、オンターゲット／オフディジーズ結合による毒性がこの文脈で問題にならないことを示唆する。

Ｌｕｐａｒｄｕｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｍ．Ｅ．ＢｉｒｎｂａｕｍａｎｄＫ．Ｃ．Ｇａｒｃｉａ（２０１０）．‘ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｆｏｒＳｈａｒｅｄＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＲｅｖｅａｌｅｄｉｎｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｎＵｎｕｓｕａｌｌｙＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘｂｅｔｗｅｅｎＩＬ－１３ａｎｄＩＬ－１３Ｒα２’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１８（３）：３３２－３４２Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，Ｗ．ａｎｄＤ．Ｍ．Ｇｉｂｏ（２０００）．‘ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＲｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅＲｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１３，ａＢｒａｉｎＴｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＣａｎｃｅｒ／ＴｅｓｔｉｓＡｎｔｉｇｅｎ．‘ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ６（５）：４４０－４４９Ｔｈａｃｉ，Ｂ．，Ｃ．Ｅ．Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｂｉｎｅｌｌｏ，Ｋ．Ｗｅｒｂａｎｅｔｈ，Ｐ．ＳａｍｐａｔｈａｎｄＳ．Ｓｅｎｇｕｐｔａ（２０１４）．‘Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３ｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ２－ｔａｒｇｅｔｅｄｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｈｅｒａｐｙ’Ｎｅｕｒｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１６（１０）：１３０４－１３１２Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｔ．Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｓ．Ｒ．Ｈｕｓａｉｎ，Ｂ．ＪｏｓｈｉａｎｄＲ．Ｋ．Ｐｕｒｉ（２０１０）．‘Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１３ｍｅｄｉａｔｅｓｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１３ｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ２ｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｄｕｃｔａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｒｏｌｅｏｆＩＬ－１３Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅｘｏｔｏｘｉｎｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ’ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１６（２）：５７７－５８６Ｂｅａｒｄ，Ｒ．Ｅ．，Ｄ．Ａｂａｔｅ－Ｄａｇａ，Ｓ．Ｆ．Ｒｏｓａｔｉ，Ｚ．Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｓ．Ａ．ＲｏｓｅｎｂｅｒｇａｎｄＲ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ（２０１３）．‘ＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｕｓｉｎｇｎａｎｏｓｔｒｉｎｇｄｉｇｉｔａｌＲＮＡｃｏｕｎｔｉｎｇｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔａｎｔｉｇｅｎｓｆｏｒｍｅｌａｎｏｍａｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９（１８）：４９４１－４９５０Ｋｉｏｉ，Ｍ．，Ｍ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｔ．Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｓ．Ｒ．ＨｕｓａｉｎａｎｄＲ．Ｋ．Ｐｕｒｉ（２００６）．‘Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３ｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ２ｃｈａｉｎ：ａｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｉｏｍａｒｋｅｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｆｏｒｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．’Ｃａｎｃｅｒ１０７（６）：１４０７－１４１８Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｔ．Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｔ．Ｋａｎｎｏ，Ｒ．Ａｒａｋａｋｉ，Ｈ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｎ．Ｕｔｓｕｎｏｍｉｙａ，Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．Ｔｓｕｒｕｙａｍａ，Ｅ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｏ．ＯｇａｗａａｎｄＴ．Ｋａｍｂａ（２０１５）．‘ＲｏｌｅｏｆＩＬ１３ＲＡ２ｉｎＳｕｎｉｔｉｎｉｂＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＣｌｅａｒＣｅｌｌＲｅｎａｌＣｅｌｌＣａｒｃｉｎｏｍａ．’ＰＬｏＳＯｎｅ１０（６）：ｅ０１３０９８０Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｓ，Ｐ．，Ｓ．Ｏｚｔｕｒｋ，Ａ．Ｗ．Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃ．Ｍ．Ｎｅｏｐｈｙｔｏｕ，Ａ．Ｔｚａｔｓｏｓ，Ｃ．Ｋ．Ｗｏｎｇ，Ｓ．ＴｈｉａｇａｌｉｎｇａｍａｎｄＡ．Ｉ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ（２０１５）．‘ＴａｒｇｅｔｉｎｇＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２ａｃｔｉｖａｔｅｓＳＴＡＴ６－ＴＰ６３ｐａｔｈｗａｙｔｏｓｕｐｐｒｅｓｓｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｌｕｎｇｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．’ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ１７：９８．Ｘｉｅ，Ｍ．，Ｘ．Ｗｕ，Ｊ．ＺｈａｎｇａｎｄＣ．Ｈｅ（２０１５）．‘ＩＬ１３Ｒｅｃｅｐｔｏｒａ２ｉｓａｎｅｇａｔｉｖｅｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｉｎｈｕｍａｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｄｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｇｒｏｗｔｈｉｎｍｉｃｅ．’Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ６（３２）：３２９０２－３２９１３Ｍｕｒａｔａ，Ｔ．，Ｊ．ＴａｇｕｃｈｉａｎｄＲ．Ｋ．Ｐｕｒｉ（１９９８）．‘Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３ＲｅｃｅｐｔｏｒＡｌｐｈａ’ ｂｕｔＮｏｔＡｌｐｈａＣｈａｉｎ：ＡＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．’Ｂｌｏｏｄ９１：３８８４－３８９１Ｈｅｃｋｅｒ，Ｍ．，Ｚ．Ｚａｓｌｏｎａ，Ｇ．Ｋｗａｐｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｇ．Ｎｉｅｓｓ，Ａ．Ｚａｋｒｚｅｗｉｃｚ，Ｅ．Ｈｅｒｇｅｎｒｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｌ．Ｍ．Ｍａｒｓｈ，Ｄ．Ｓｅｄｄｉｎｇ，Ｗ．Ｋｌｅｐｅｔｋｏ，Ｊ．Ｌｏｈｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｄｉｍｍｅｌｅｒ，Ｗ．Ｓｅｅｇｅｒ，Ｎ．Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，Ｒ．Ｔ．Ｓｃｈｅｒｍｕｌｙ，Ｎ．Ｋｎｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｏ．ＥｉｃｋｅｌｂｅｒｇａｎｄＲ．Ｅ．Ｍｏｒｔｙ（２０１０）．‘ＤｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＩＬ１３Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｙｓｔｅｍ：ａｎｏｖｅｌｐａｔｈｏｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．’ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１８２（６）：８０５－８１８Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｂ．Ｂａｄｉｅ，Ｍ．Ｅ．Ｂａｒｉｓｈ，Ｌ．Ｗｅｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｏｓｔｂｅｒｇ，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｎａｒａｎｊｏ，Ｒ．Ｓｔａｒｒ，Ｊ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｙ．Ｚｈａｉ，Ｊ．Ｒ．Ｂａｄｉｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｒｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｐｏｒｔｎｏｗ，Ｍ．Ｄ’Ａｐｕｚｚｏ，Ｓ．Ｊ．ＦｏｒｍａｎａｎｄＭ．Ｃ．Ｊｅｎｓｅｎ（２０１５）．‘ＢｉｏａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙｏｆＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２－ＲｅｄｉｒｅｃｔｅｄＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒＣＤ８＋ＴＣｅｌｌｓｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＲｅｃｕｒｒｅｎｔＧｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．’ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２１（１８）：４０６２－４０７２Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｄ．Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ｒ．Ｓｔａｒｒ，Ｌ．Ｗｅｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．Ｎａｒａｎｊｏ，Ｊ．Ｒ．Ｏｓｔｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｋｕｒｉｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ｐｒｉｃｅｍａｎ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｌ．Ｈａｒｓｈｂａｒｇｅｒ，Ｍ．Ｄ’Ａｐｕｚｚｏ，Ｊ．Ａ．Ｒｅｓｓｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｅ．Ｂａｒｉｓｈ，Ｍ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｐｏｒｔｎｏｗ，Ｓ．Ｊ．ＦｏｒｍａｎａｎｄＢ．Ｂａｄｉｅ（２０１６）．‘ＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａａｆｔｅｒＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒＴ－ＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙ．’ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３７５（２６）：２５６１－２５６９．Ｋａｈｌｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｃ．Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｊ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ａ．Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ，Ｓ．Ｊ．ＦｏｒｍａｎａｎｄＭ．Ｃ．Ｊｅｎｓｅｎ（２００４）．‘Ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄｋｉｌｌｉｎｇｏｆｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅｂｙｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１３－ｚｅｔａｋｉｎｅｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄｃｙｔｏｌｙｔｉｃＴｃｅｌｌｓ．’ＣａｎｃｅｒＲｅｓ６４（２４）：９１６０－９１６６．Ｋｒｅｂｓ，Ｓ．，Ｋ．Ｋ．Ｃｈｏｗ，Ｚ．Ｙｉ，Ｔ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｃｒｕｚ，Ｍ．Ｈｅｇｄｅ，Ｃ．Ｇｅｒｋｅｎ，Ｎ．ＡｈｍｅｄａｎｄＳ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（２０１４）．‘Ｔｃｅｌｌｓｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄｔｏｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３Ｒａｌｐｈａ２ｗｉｔｈｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３ｍｕｔｅｉｎ－－ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｈａｖｅａｎｔｉ－ｇｌｉｏｍａａｃｔｉｖｉｔｙｂｕｔａｌｓｏｒｅｃｏｇｎｉｚｅｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３Ｒａｌｐｈａ１．’Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ１６（８）：１１２１－１１３１Ｋｏｎｇ，Ｓ．，Ｓ．Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｂ．Ｔｙｌｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｂａｉｓ，Ｑ．Ｍａ，Ｓ．Ｄｏｕｃｅｔｔｅ，Ｊ．Ｚｈｏｕ，Ａ．Ｓａｈｉｎ，Ｂ．Ｓ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｈ．Ｂｒｅｍ，Ｒ．Ｐ．ＪｕｎｇｈａｎｓａｎｄＰ．Ｓａｍｐａｔｈ（２０１２）．‘Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｇｌｉｏｍａｘｅｎｏｇｒａｆｔｓｗｉｔｈｓｅｃｏｎｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＩＬ１３Ｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄＴｃｅｌｌｓ．’ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１８（２１）：５９４９－５９６０

しかしながら、全身性疾患の治療では、病変組織外のＩＬ１３結合パートナーの広範な発現がＩＬ１３系治療のシンクとして機能する可能性があり、その結果、安全性が懸念され、疾患部位への輸送が阻害される可能性がある。この分野の以前の研究では、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαから離れて直接結合する変異を含むＩＬ１３変異体に由来するＣＡＲを生成することによって、この問題に対処しようとした。Ｅ１３の変異は、ＩＬ１３Ｒα１（非特許文献１４及び１５）よりもＩＬ１３Ｒα２に対する選択性を向上させたが、Ｅ１３Ｙ変異では、組換え抗原と抗原発現がん細胞の両方の状況において、ＩＬ１３Ｒα１の測定可能な認識が依然として可能である（非特許文献１５）。ＩＬ１３系ＣＡＲにＥ１３ＫとＲ１０９Ｋの両方の変異を加えると、ＩＬ１３Ｒα２を発現するがん細胞と比較して、ＩＬ１３Ｒα１を発現するがん細胞の認識が弱まることも示された（非特許文献１６）。これらの例は有望であるが、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＩＬ１３変異体を発生させるにはさらなる変異が必要であろう。このような分子を開発する上での課題は、ＣＡＲを含むＩＬ１３の機能に対するＩＬ１３変異の影響を予測できないことである。

本開示は、様々ながんを治療するための変異型ＩＬ１３（「変異型ＩＬ１３ＣＡＲ」）を含むＩＬ１３Ｒα２標的ＣＡＲである。

本開示の変異型ＩＬ１３ＣＡＲには、以下のアミノ酸配列：

（配列番号２６）を含むか又はからなる；又は、以下のアミノ酸配列：

（配列番号２７）を含むか又はからなる、変異型ＩＬ１３があげられる。

本開示は、配列番号２６又は２７で表されるアミノ酸配列、スペーサー（例えば、配列番号９、１０、１１又は１２を含む）、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号１４、１５又は２２を含む）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（構成配列番号４２）及びＣＤ３ゼータ細胞質ドメイン（配列番号２１）を含む変異型ＩＬ１３を含むＩＬ１３ＣＡＲである。

本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該キメラ抗原受容体は、配列番号２６又は配列番号２７を含む標的ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、核酸分子である。様々な実施形態では、膜貫通ドメインは、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ４膜貫通ドメイン又はその変異体、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ８膜貫通ドメイン又はその変異体、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ２８膜貫通ドメイン又はその変異体から選択され、ここで、ＩＬ１３受容体標的ドメインは配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列からなり；共刺激ドメインは、１～５個のアミノ酸が修飾された４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体から選択され、ここで、共刺激ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインであり；４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列又は１～５個のアミノ酸が修飾されたその変異体を含み；ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；３～１５個のアミノ酸のリンカーは、４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体の間に位置し；当該ＣＡＲは、配列番号２８～３９のアミノ酸配列、又は１～５個のアミノ酸が修飾されたその変異体を含み；当該ＣＡＲは、配列番号２８で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号２９で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３１で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３２で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３３で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３４で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３５で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３６で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３７で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３８で表されるアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み；当該ＣＡＲは、配列番号３９で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。本開示はまた、上記の核酸分子のいずれかを含む発現ベクターである。

本開示は、上記の核酸分子のいずれかを含むウイルスベクターである。

本開示はまた、上記の核酸分子のいずれかを含むヒトＴ細胞の集団である。本開示はまた、当該発現ベクター又はウイルスベクターのいずれかを含むヒトＴ細胞の集団である。様々な実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブメモリーＴ細胞、パンＴ細胞、又はＣＤ２５＋細胞及びＣＤ１４＋細胞に対して実質的に枯渇したＰＢＭＣを含む。

本開示はまた、膠芽腫、膵管腺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞がん、乳がん又は肺がんに罹患している患者を治療する方法であって、ここに記載されている核酸がある自己又は同種のヒトＴ細胞の集団を投与することを含む方法である。様々な実施形態では、キメラ抗原受容体は、局所的又は全身的に投与される；キメラ抗原受容体を単回又は反復投与する。様々な実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＩＬ１３Ｒα２を発現しないＩＬ１３Ｒα１を発現する細胞を実質的に回避する。

本開示はまた、自己又は同種ヒトＴ細胞の集団を提供し、請求項１の核酸分子を含むベクターによってＴ細胞を形質導入することを含むＣＡＲＴ細胞を調製する方法である。

本開示はまた、変異型ＩＬ１３ＣＡＲを発現するベクターを備えるＴ細胞である。様々な実施形態では、形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも２０％、３０％、又は４０％は、セントラルメモリーＴ細胞であり；形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも３０％は、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋である。様々な実施形態では、ヒトＴ細胞集団は、配列番号２７、２９、３０、及び３１から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクター、又は１～５個（例：１又は２）のアミノ酸が修飾された（例えば置換）その変異体を含む。

様々な実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、配列番号２７、２９、３０若しくは３１から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクター、又は１～５個のアミノ酸が修飾された（例えば、１若しくは２個）その変異体（例えば、置換）を含むベクターを含み；ヒトＴ細胞の集団はセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）を含むが例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％６０％、７０％、８０％の細胞がＴ_ＣＭ細胞である、又は、Ｔ細胞の集団がセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及び幹セントラルメモリー細胞_{（ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞）}の組み合わせで構成されている、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％の細胞がＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞である。

ある実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をともに含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０、又は９０％がＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかである；細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）。ある実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は患者に対して自己由来である。ある実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は患者と同種である。

ＩＬ１３Ｒα２標的ＣＡＲ
本開示の変異型ＩＬ１３ＣＡＲには、以下のアミノ酸配列：

有用なＩＬ１３変異体ＣＡＲは、配列番号２９、３２、３５又は３８（シグナル配列欠損成熟ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含むか又はからなることができ、ＩＬ１３変異体ＣＡＲは、配列番号３０、３３、３６又は３９（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列含有未成熟ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含むか又はからなることができる。したがって、ＣＡＲ及びシグナル配列は、例えばヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体αシグナル配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ；配列番号１）のようなシグナル配列を含む形で発現することができる。ＣＡＲは、発現をモニタリングするのに有用なさらなる配列、例えば、Ｔ２Ａスキップ配列及び切断型ＥＧＦＲｔで発現されることができる。ＣＡＲは、発現をモニタリングするのに有用なさらなる配列、例えば、Ｔ２Ａスキップ配列及び切断型ＣＤ１９ｔ、例えば、配列番号２８、３１、３４及び３７で発現されることができる。変異型ＩＬ１３ＣＡＲは、最大１、２、３、４又は５個のアミノ酸が変化（できれば保存的アミノ酸変化）した配列番号２８～２９のいずれかのアミノ酸配列含むか又はからなることができる。

ある実施形態では、アミノ酸配列番号２８及び２９をコードする核酸は、ヒト細胞における発現用に最適化されたコドンである。

スペーサー領域
本開示によるＣＡＲは、変異型ＩＬ１３ドメイン（すなわち、配列番号ｘＣ４又は配列番号ｘＤ７を含む変異型ＩＬ１３）と膜貫通ドメインの間に位置するスペーサーを含むことができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、若しくはＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて用いられることができる様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンのＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間にある配列、例えば、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全部又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むか又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに含む。当該免疫グロブリン由来の配列は、１個又はそれ以上のアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４又は５個の置換、例えば、オフターゲット結合を減少させる置換を含むことができる。

ヒンジ／リンカー領域はまた、配列がＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）であるＩｇＧ４ヒンジ領域を含むことができる。当該ヒンジ／リンカー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４ＣＨ３配列ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含むことができる。従って、当該リンカー／スペーサー領域全体は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）という配列を含むことができる。ある場合では、配列番号１０又は１１と比較して、スペーサーに１、２、３、４、又は５つの単一のアミノ酸が変化（例えば保存的変化）する。ある場合では、ＩｇＧ４のＦｃヒンジ／リンカー領域が２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）による結合が減少する（例えば、配列番号１０又は１１を含むか又はからなる）。

膜貫通ドメイン
様々な膜貫通ドメインを用いることができる。表２には、適当な膜貫通ドメインが例示されている。
スペーサー領域が存在する場合、膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、スペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。
表２：膜貫通ドメインの例

共刺激ドメイン
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインでありうる。ある場合、共シグナル伝達ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２４）と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はと同一である配列があげられる４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインである。ある場合、当該４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と比較して、１、２、３、４又は５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的）している。

共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と適当な共刺激ドメインを例示する。
表３：ＣＤ３ζドメインと共刺激ドメインの例

様々な実施形態では、共刺激ドメインは、表３に示される共刺激ドメイン又は１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されたＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾された４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体、及び１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されたＯＸ４０共刺激ドメイン又はその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体は、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されている。ある実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えば、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されているＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、及び１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されている４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体がある。様々な実施形態では、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸の修飾は置換である。共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ末端であり、２～１０個からなる短いリンカー、例えば、３つのアミノ酸（例えば、ＧＧＧ）が、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置してよい。

ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインであってよい。ある場合では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下の配列：ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一又は同一である配列を含む。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達は、配列番号２１と比較して、１、２、３、４又は５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的）している。

切断型ＥＧＦＲ及び切断型ＣＤ１９
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例：ＬＥＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号４０）及び、以下の

で表される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一又は同一である切断型ＥＧＦＲがあってよい。ある場合、切断型ＥＧＦＲは、配列番号４１と比較して、１，２，３，４若しくは５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的アミノ酸変化）する。

あるいはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例：ＬＥＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号４０）及び、以下の

で表される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一又は同一である切断型ＣＤ１９ＲＲがあってよい。

「アミノ酸修飾」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することをいう。当該置換は、非保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性があるアミノ酸群に属するアミノ酸から他の群に属するアミノ酸に変化させる）又は保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性があるアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸に変化させる）で、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させることができる。当該保存的変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより少なくなる。アミノ酸の分類の例として、１）非極性Ｒ基があるアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）極性Ｒ基が非電荷であるアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）極性Ｒ基があるアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）があげられる。他のグループとして、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンといったフェニル基があるアミノ酸があげられる。

ある場合、ＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列及び細胞質シグナル伝達尾部が欠失した切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）又は切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９Ｒｔ）が続くベクターを用いて作製することができる。

サイトカインストーム及び標的外毒性を回避するための増殖の効率的な制御は、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。この配置により、ＥＧＦＲｔ又はＣＤ１９Ｒｔの共発現は、遺伝子組換え細胞を正確に測定することができる、不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供することで、遺伝子組換え細胞を積極的に選択し、かつ養子移入後のインビボにおける治療用Ｔ細胞を効率的に追跡することができる。サイトカインストームとオフターゲット毒性を回避するために増殖を効率的に制御することは、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。レンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔ又はＣＤ１９Ｒｔは、治療関連の毒性がある場合、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を切除するための自殺遺伝子として作用することができる。

本開示のＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段により製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、簡便に調製し、完全なコード配列を構築することができる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球、最も好ましくは自己Ｔリンパ球の形質転換に用いられる。末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）からセントラルメモリーＴ細胞を単離するには、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択し、例えば免疫磁気学的に目的の受容体を発現する細胞を選択するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いることができる。セントラルメモリーＴ細胞が富化された細胞は、例えば、当該ＣＡＲの発現を指示するレンチウイルスベクター、ならびに生体内検出、アブレーション、及び潜在的な生体外（ｅｘｖｉｖｏ）選択用の非免疫原性表面マーカーで形質導入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化することができる。活性化／遺伝子組換えＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５で生体外増殖され、及び次いで凍結保存することができる。ＣＡＲＴ細胞を調製するさらなる方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３９２に記載されている。

特段の場合以外は、本明細書中で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同義である。本発明で用いる方法及び材料は本明細書に記載されるが、当該技術分野で公知の他の適当な方法及び材料も用いてよい。材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図しない。本明細書に記載されている全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース表示、及び他の参考文献は、全ての目的のため、その全体が参照され援用される。矛盾がある場合、定義がある場合は本明細書の記載が優先される。本発明の他の特徴及び利点は、以下の記載及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。

ＩＬ１３受容体に対するＩＬ１３Ｄ７とＩＬ１３Ｃ４の結合プロファイルを示す図である。（Ａ）はＩＬ１３／ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３／ＩＬ１３Ｒα２複合体の構造的な重ね合わせを示す。ＩＬ１３とＩＬ１３Ｒα１のドッキングモードは、ＩＬ１３Ｒα２とのドッキングモードと本質的に同じである。右側のはめ込みボックスは、ＩＬ１３上のアミノ酸がＩＬ１３Ｒα１－ＩＬ１３Ｒα２－部位ＩＩ及び部位ＩＩＩ結合インターフェース（黄色：ＩＬ１３結合ＩＬ１３Ｒα１；緑：ＩＬ１３結合ＩＬ１３Ｒα２）を形成していることを示す。ＩＬ１３は同じアミノ酸を用いてＩＬ１３Ｒα１－とＩＬ１３Ｒα２－の部位ＩＩと部位ＩＩＩの結合インターフェースを形成する。（Ｂ）は、ＩＬ１３野生型がＩＬ１３Ｒα１とＩＬ１３Ｒα２を高効率で結合することを示す図である。ＩＬ１３Ｃ４とＤ７はＩＬ１３Ｒα２に特異的に結合する。（Ｃ）は、表面プラズモン共鳴によって測定されたＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２に対するＩＬ１３変異体結合パラメータを示す。ＩＬ－１３変異体のＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２結合親和性を示すグラフである。ＩＬ１３Ｒα１に対するＩＬ－１３、ＩＬ－１３Ｄ７及びＩＬ－１３Ｃ４の表面プラズモン共鳴測定である。チップの表面にＩＬ１３Ｒα１を固定し、ＩＬ－１３又は２つのＩＬ－１３変異体の指示用量を流した。ＩＬ１３Ｒα２に対するＩＬ－１３、ＩＬ－１３Ｄ７及びＩＬ－１３Ｃ４の表面プラズモン共鳴測定である。チップの表面にＩＬ１３Ｒα２を固定し、ＩＬ－１３又は２つのＩＬ－１３変異体の指示用量を流した。ＩＬ１３Ｄ７及びＩＬ１３Ｃ４変異体が示すシグナル活性化及び活性化能を示すグラフである。（Ａ）は、指示された用量で１５分間刺激したＡ５４９細胞において、ＩＬ１３又は二つのＩＬ１３変異体によって誘導された、フローサイトメトリーによって測定されたｐＳＴＡＴ６のレベルである。データは２つの複製の平均±範囲として示される。（Ｂ）は、ヒト線維芽細胞ＫＡ２３においてＩＬ１３と２つの変異体によって誘導されるＣＣＬ２６遺伝子誘導のレベルをｑＰＣＲで測定した。データは２つの複製の平均±範囲として示される。（Ｃ）は、指示された用量で９６時間刺激した後、ＩＬ１３及び二つのＩＬ１３変異体によって示されるＴＦ－１細胞増殖のレベルである。データは２つのレプリカの平均±範囲として示される。ＩＬ１３変異体のＣＡＲを示す図等である。（Ａ）は、野生型（ＷＴ）、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４又はＤ７結合ドメインを含むＩＬ１３－ＣＡＲ構築物の概略図である。ＣＡＲには、ＩｇＧ４（ＥＱ）－Ｆｃリンカー、ＣＤ２８膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζも含まれる。構築物はまた、リボソームＴ２Ａスキップ配列によってＣＡＲから分離された切断型ＣＤ１９Ｒ（ＣＤ１９Ｒｔ）を含む。（Ｂ）は、フローサイトメトリーによる細胞形質導入のための抗ＣＤ１９を示すヒストグラム（左パネル）と、形質導入されていない（モック）、ＩＬ１３ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４、Ｄ７ＣＡＲのＣＡＲ発現のための抗Ｆｃ染色（右パネル）である。陽性細胞の比率（及びＭＦＩ）は各ヒストグラムで示される。代表的な実験を一つ示す。（Ｃ）ヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ（左）又はＩＬ１３Ｒα１－Ｆｃ（右）に対するＩＬ１３ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４及びＤ７ＣＡＲＴ細胞の用量反応結合親和性曲線である。データは３つの独立した試験の平均±標準偏差として示される。がん細胞株におけるＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ１３Ｒα１、ＩＬ－４Ｒの検出を示す写真やグラフである。（Ａ）は、（１）ＰＢＴ０３０－２、（２）Ｕ２５１Ｔ、（３）Ａ５４９、（４）ＨＴ１０８０Ｐ、（５）ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα１、（６）ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒ、（７）ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα２のいずれかの付着ヒトがん細胞株におけるＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ１３Ｒα１又はＩＬ－４Ｒの発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラムである。がん細胞株を酵素的に単一細胞に解離させ、直ちに抗原マーカー（ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ１３Ｒα１、ＩＬ４Ｒ）で暗所４°で３０分間染色した。その後、細胞をフローによって評価し、生腫瘍の抗原発現をヒストグラムとして表示した。各ヒストグラム内に位置する値は、括弧内に平均蛍光強度（ＭＦＩ）がある％発現を表す。（Ｂ）は、βアクチンを負荷コントロールとし、ＩＬ１３Ｒα２とＩＬ１３Ｒα１のタンパク質発現を示すウェスタンブロット法である。（Ｃ）は、ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ１３Ｒα１、ＩＬ４Ｒ及びコドン最適化ＩＬ１３Ｒα２のｍＲＮＡ発現を示すｑＰＣＲ解析である。ウェスタンブロット法とｑＰＣＲ法の両方で、当該がん細胞株から各々タンパク質又はｍＲＮＡ溶解物が単離された。表示されているデータはすべてｍｅａｎｓ＋／－ｓｅｍである。ＩＬ１３ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４、Ｄ７ＣＡＲは、ＩＬ１３Ｒα２依存性インビトロエフェクター機能を同等に仲介することを示すグラフである。ＩＬ１３ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４、Ｄ７ＣＡＲ及び非形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞に対するＩＬ１３Ｒα２依存性脱顆粒（Ａ）及びＩＦＮ－γ産生（Ｂ）である。Ｔ細胞株をＩＬ１３Ｒα２＋グリア芽細胞腫株Ｕ２５１Ｔ及びＰＢＴ０３０－２又はＩＬ１３Ｒα２（ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα２）を発現するように操作されたＨＴ１０８０とエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で共培養した。５時間後、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａと細胞内ＩＦＮ－γをフローサイトメトリーで測定し、陽性細胞の割合をグラフ化した（平均±ＳＤ；ｎ＝３ウェル）。（Ｃ）は、固定化組換えヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ（平均±ＳＤ；ｎ＝３ウェル）の濃度上昇に応答した、適応Ｔ細胞株による分泌型ＩＦＮ－γ産生。ｐ＜すべてのＣＡＲＴ細胞ＩＬ１３－変異体及びモックＴ細胞で０．０００１である。（Ｄ）は、ＩＬ１３－ＣＡＲ及びＥ：Ｔ比１：１０で２日間培養した模擬Ｔ細胞株による腫瘍死滅である。フローサイトメトリーを用いて残存する生存可能な腫瘍数を決定し、腫瘍死滅率を模擬して正規化した％（平均±ＳＤ；ｎ＝３ウェル）として決定した。（Ｅ）は、ＰＢＴ０３０－２、Ｕ２５１Ｔ、ＨＴ１０８０ＩＬ１３Ｒα２に対する１：５０（Ｅ：Ｔ）での４つの別々のドナーを用いた実験でのＣＡＲＴ細胞の殺傷は、ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４、Ｄ７に対して同程度の腫瘍殺傷レベルを示した。プロットは７日目の残存腫瘍細胞を表す（点線はシードされた腫瘍細胞を表す）。（Ｆ）（Ｅ）で示した７日間の共培養後に示した実験におけるＣＡＲＴ細胞。Ｔｕｍｏｒのみ及びモックＣＡＲＴ細胞実験では、生ＣＡＲＴ細胞は観察されなかった；ＣＡＲＴ細胞の持続性のレベルは以下のとおりであった：ＷＴ＞Ｄ７＞Ｅ１２Ｙ＞Ｃ４（点線はシードされたＣＡＲＴ細胞を表す）。Ａ－Ｆのパネルは少なくとも３つの独立した実験の代表である。Ａ－Ｆから表示されるデータはすべてｍｅａｎｓ＋／－ｓｅｍである。（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊ｐ＜０．００５，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。ＩＬ１３－Ｅ１２Ｙ、－Ｃ４及び－Ｄ７ムテインＣＡＲは、ヒトグリオーマ異種移植片に対してインビボで同様のレベルの治療効果を示す写真やグラフである。インビボでの有効性は、ヒトグリオーマ異種移植片に対するＷＴＣＡＲとムテインＣＡＲで同様である。（Ａ）は、ＮＳＧマウスに０．１×１０^５のＥＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０－２腫瘍球を定位的に右前脳に移植した。８日目のマウスには、処理を行わず、モックＴｎ／ｍｅｍ（ＣＡＲなし）Ｔ細胞を０．３×１０^６注射するか、ＣＡＲ陽性のＴｎ／ｍｅｍ細胞であるＩＬ１３ＷＴ、ＩＬ１３ζ２８（Ｅ１２Ｙ）、ＩＬ１３ζ２８（Ｃ４）、ＩＬ１３ζ２８（Ｄ７）を０．３×１０^６注射した。（ｎ＝６－８）［Ｄ７群のマウスのうち２匹は治療中に早期に死亡した。］代表的なフラックス画像を生着後１５０日目に示す。（Ｂ）カプランマイヤ―生存曲線（３つの実験の要約データ）は、ＩＬ１３－ＣＡＲ変異体を投与したマウスの１５０日目の生存率（点線は９日目＋／－１日目を表す）は同程度であることを示し、ＩＬ１３－ＷＴ、－Ｅ１３Ｙ、－Ｃ４及び－Ｄ７ＣＡＲＴ細胞はすべて、モックＴ細胞と比較して生存率が改善された（ｐ≦０．０００１マントルコックスｌｏｇ順位検定（ｎ＝１４－１８））。（Ｃ）腫瘍移植後１５０日目にＩＬ１３－ＷＴ、－Ｅ１３Ｙ、－Ｃ４及び－Ｄ７ＣＡＲＴ細胞を用いてＩＬ１３－ＣＡＲ変異体を投与されたマウス、及び腫瘍のないマウス、腫瘍再発マウス及び安楽死させた未治療マウスの数を示す３つの別々の実験から得られたデータを要約した棒グラフである。ＩＬ１３－Ｅ１２Ｙ、－Ｃ４及び－Ｄ７ムテインＣＡＲは、ヒトグリオーマモデルに対してインビボで同様のレベルの治療効果を示すグラフである。（Ａ－Ｃ）は、ｆｆＬｕｃ＋ｆｌｕｘの定量（光子／秒はＣ４及びＤ７ＩＬ－１３ムテインＣＡＲＴ細胞がＷＴ及びＥ１２Ｙ単一変異ＩＬ－１３－ＣＡＲに匹敵する効力を持つことを示す。点線は個々のマウスの流束値を表し、色付きの実線はその治療コホートの平均流束を表す。データは３つの独立した実験（ｎ＝６－８）を表している。（Ｄ－Ｆ）は、カプランマイヤ―生存曲線は、ＩＬ１３－ＣＡＲ変異体を投与したマウスの生存率と腫瘍再発率が同程度であることを示し、ＩＬ１３－ＷＴ、－Ｅ１３Ｙ、－Ｃ４及び－Ｄ７ＣＡＲＴ細胞を投与したマウスでは、モックＴ細胞を投与したマウス及び未治療マウスと比較して生存率が改善された（ｐ≦０．０００１マントルコックスｌｏｇ順位検定（ｎ＝６～８））。ＩＬ１３Ｃ４及びＤ７ムテインＣＡＲＴ細胞はＩＬ１３Ｒα１の認識低下を示すグラフである。ＩＬ１３Ｒα１＋Ａ５４９と共培養したＩＬ１３ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４及びＤ７ＣＡＲＴ細胞、ＨＴ１０８０親細胞、及びいずれかを発現するように操作されたＨＴ１０８０に対するＩＬ１３Ｒα１依存性脱顆粒（Ａ）及びＩＦＮ－γ産生（Ｂ）ＩＬ１３Ｒα１又は図７に記載されているＩＬ１３Ｒα１とＩＬ４Ｒである。（Ｃ）は、固定された組換えヒトＩＬ１３Ｒα１－Ｆｃ（平均±ＳＤ；ｎ＝３ウェル）の濃度上昇に応答して、適応Ｔ細胞株が分泌するＩＦＮ－γ産生である。（Ｄ）では、１：１０Ｅ：Ｔ比で２日間、ＩＬ１３Ｒα１依存的に、適応ＣＡＲ及び標的株を細胞死させた。（Ａ）～（Ｄ）は、少なくとも３つの独立した実験の代表である。（Ｅ）は、ＣＡＲ及び模擬Ｔ細胞株（Ｅ：Ｔ比１０：１；２時間のプレインキュベーションと０日目の生着；ｎ＝４の場合）との共培養後のＡ５４９（０．１×１０^６）腫瘍生着を評価するＷｉｎｎ試験である。（Ｆ）ＮＳＧマウスに、０．５×１０^６ＨＴ１０８０ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒを培地とマトリゲルの１：１の比率で異種移植した後、４日目にＴ細胞を投与しないか、５×１０^６模擬Ｔ細胞又は様々なムテインＣＡＲＴ細胞を投与した。Ａ－Ｆに表示されるデータはすべてｍｅａｎｓ＋／－ｓｅｍである。（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊ｐ＜０．００５，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。Ｃ４ムテイン標的ドメインがあるＣＡＲの配列を示す図である。シグナル配列及びＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカー（配列番号２８）を含む、（Ａ）ＩＬ１３（Ｃ４）－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔのアミノ酸配列；（Ｂ）シグナル配列とＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカーのない同じＣＡＲ（配列番号２９）である。どちらの場合も、様々なドメインが示される。ＣＡＲ配列は太字で、マーカー配列は太字ではない。配列番号３０にはシグナル配列は含まれるが、Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカーは含まれない。Ｃ４ムテイン標的ドメインを持つＣＡＲの配列を示す図である。シグナル配列及びＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔ（ＢｓｐＥＩ）マーカーを含む、（Ａ）ＩＬ１３（Ｃ４）－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ４ｔｍ－４－１ＢＢ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔ（ＢｓｐＥＩ）のアミノ酸配列（配列番号３１）；（Ｂ）シグナル配列とＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔ（ＢｓｐＥＩ）マーカーなしの同じＣＡＲ（配列番号３２）である。どちらの場合も、様々なドメインが示される。ＣＡＲ配列は太字で、マーカー配列は太字ではない。配列番号３３にはシグナル配列は含まれるが、Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカーは含まれない。Ｄ７ムテイン標的ドメインがあるＡＲの配列を示す図である。シグナル配列及びＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカー（配列番号３４）を含む、（Ａ）ＩＬ１３（Ｄ７）－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔのアミノ酸配列；（Ｂ）シグナル配列とＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカーのない同じＣＡＲ（配列番号３５）である。どちらの場合も、様々なドメインが示される。ＣＡＲ配列は太字で、マーカー配列は太字ではない。配列番号３６にはシグナル配列は含まれるが、Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカーは含まれない。Ｄ７ムテイン標的ドメインを持つＣＡＲの配列を示す図である。シグナル配列及びＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔ（ＢｓｐＥＩ）マーカーを含む、（Ａ）ＩＬ１３（Ｄ７）－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ４ｔｍ－４－１ＢＢ－ゼータ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔ（ＢｓｐＥＩ）のアミノ酸配列（配列番号３７）；（Ｂ）シグナル配列とＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔ（ＢｓｐＥＩ）マーカーなしの同じＣＡＲ（配列番号３８）である。どちらの場合も、様々なドメインが示される。ＣＡＲ配列は太字で、マーカー配列は太字ではない。配列番号３９にはシグナル配列は含まれるが、Ｔ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔマーカーは含まれない。Ｄ７及びＣ４のムテインＣＡＲの肺からの転移を示すグラフである。マウスにＣＡＲを投与し、投与８日目に発光により肺における存在を評価した。

本開示では、ＩＬ１３Ｒα２を標的とする変異ＩＬ１３ドメインがあるＣＡＲの生成と抗腫瘍効果が記載される。ＣＡＲＴ細胞はＬ１３Ｒα２発現ヒトがん株に対して強力な抗原依存性細胞毒性を示した。マウス腫瘍モデルにおけるＣＡＲＴ細胞のインビボ送達により、抗原陽性疾患が除去され、かつ、全生存期間が延長された。

ＩＬ１３Ｒα２標的ＣＡＲ
本開示のＣＡＲには、以下のアミノ酸配列：

ある実施形態では、アミノ酸配列配列番号２８及び２９をコードする核酸は、ヒト細胞における発現用に最適化されたコドンである。

スペーサー領域
本開示によるＣＡＲは、変異型ＩＬ１３ドメイン（すなわち、配列番号ｘＣ４又は配列番号ｘＤ７を含む変異型ＩＬ１３）と膜貫通ドメインの間に位置するスペーサーを含むことができる。様々な異なるスペーサーを用いることができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、若しくはＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて用いられることができる様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンのＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間にある配列、例えば、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全部又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ＣＨ３又はΔＣＨ２という）を含むか又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに含む。当該免疫グロブリン由来の配列は、１個又はそれ以上のアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４又は５個の置換、例えば、オフターゲット結合を減少させる置換を含むことができる。

ヒンジ／リンカー領域はまた、配列がＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）であるＩｇＧ４ヒンジ領域を含むことができる。当該ヒンジ／リンガー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４ＣＨ３配列ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含むことができる。従って、当該リンカー／スペーサー領域全体は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）という配列を含むことができる。ある場合では、当該スペーサーには、配列番号１１と比較して、１、２、３、４又は５個の単一のアミノ酸が変化（例えば、保存的変化）している。ある場合では、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合が低下するように、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異する。

本開示のＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段により製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、簡便に調製し、完全なコード配列を構築することができる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球、最も好ましくは自己Ｔリンパ球の形質転換に用いられる。

患者から分離された様々なＴ細胞サブセットをＣＡＲ発現用ベクターで形質導入することができる。セントラルメモリーＴ細胞は有用なＴ細胞サブセットの一つである。末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）からセントラルメモリーＴ細胞を単離するには、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択し、例えば免疫磁気学的に目的の受容体を発現する細胞を選択するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いることができる。セントラルメモリーＴ細胞が富化された細胞は、例えば、当該ＣＡＲの発現を指示するレンチウイルスベクター、ならびに生体内検出、アブレーション、及び潜在的な生体外（ｅｘｖｉｖｏ）選択用の非免疫原性表面マーカーで形質導入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化することができる。活性化／遺伝子組換えＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５で生体外増殖され、及び次いで凍結保存することができる。ＣＡＲＴ細胞を調製するさらなる方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３９２に記載されている。

本発明は、特許請求の範囲に記載されている発明の範囲を限定しない以下の例にさらに記載されている。

ＩＬ１３変異体はＩＬ１３Ｒα２に選択的に結合する
ＩＬ１３Ｃ４及びＩＬ１３Ｄ７は、野生型ＩＬ１３（ＷＴ）（Ｍｏｒａｇａ，Ｒｉｃｈｔｅｒｅｔａｌ．２０１５）と比較してＩＬ１３Ｒα１に対する親和性が低下した変異体である。ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２はＩＬ１３（図１Ａ）上で極めて類似した結合インターフェースを共有するため、ＩＬ１３Ｃ４及びＩＬ１３Ｄ７はＩＬ１３Ｒα２に対して同様の親和性低下を示す可能性がある。受容体結合を評価するため、ＷＴ、Ｃ４、Ｄ７を各々酵母の表面に表示した。酵母を組換えＩＬ１３Ｒα１又はＩＬ１３Ｒα２とインキュベートし、フローサイトメトリー（図１Ｂ）によって結合を分析した。予想通り、ＷＴはＩＬ１３Ｒα１とＩＬ１３Ｒα２にともに強く結合した。Ｃ４とＤ７はいずれもＷＴと同等のＩＬ１３Ｒα２結合を示したが、試験した濃度ではＩＬ１３Ｒα１との結合は検出できなかった。表面プラズモン共鳴の研究は、これらの観察をさらに確認した（図１Ｃ及び図２Ａ－Ｆ）。ＷＴ、Ｃ４、Ｄ７はいずれもＩＬ１３Ｒα２（各々０．００１ｎＭ、０．３９３ｎＭ、０．００３ｎＭ）に対してナノモル以下の親和性を示す。しかし、３つの変異体はＩＬ１３Ｒα１への結合親和性が大きく異なり、以前の報告（Ｍｏｒａｇａ，Ｒｉｃｈｔｅｒｅｔａｌ．２０１５）を裏付けている。これらの違いにより、ＩＬ１３Ｒα１と比較してＩＬ１３Ｒα２の選択性は数ｌｏｇの範囲となり、ＷＴ、Ｃ４、Ｄ７はＩＬ１３Ｒα１と比較してＩＬ１３Ｒα２に対して４４０倍、９２，０００倍、１４０万倍強い親和性を示すことが明らかである。

この選択性をさらに確認するために、ＩＬ１３ＷＴ、ＩＬ１３Ｃ４、及びＩＬ１３Ｄ７を、ＩＬ１３Ｒα１を介した活性化が機能的出力をもたらす様々な生物学的アッセイでテストした。まず、可溶性ＩＬ１３変異体をＩＬ１３応答性Ａ５４９細胞に対して１５分間滴定し、ＳＴＡＴ６のリン酸化をフローサイトメトリー（図３Ａ）によって評価した。ＷＴと比較して、Ｄ７とＣ４はどちらもＳＴＡＴ６リン酸化の減衰を示し、後者はより顕著であった。次に、ヒト線維芽細胞をＩＬ１３変異体で８時間刺激し、ＣＣＬ２６遺伝子のアップレギュレーションをｑＰＣＲ（図３Ｂ）で評価した。いずれの濃度でも、ＷＴはＣＣＬ２６の強いアップレギュレーションを誘導した。Ｄ７は減弱反応を示し、高濃度の１μｇ／ｍＬではアップレギュレーションのみを誘導した。Ｃ４は試験した両濃度で基本的に反応を示さなかった。最後に、ＩＬ１３変異体をＴＦ－１に対して９６時間滴定し、細胞増殖を（図３Ｃ）追跡した。ＷＴと比較して、Ｄ７とＣ４による治療では増殖が弱まり、後者の方がより顕著であった。

変異体ＩＬ１３ＣＡＲ
Ｃ４ＩＬ１３、Ｄ７ＩＬ１３、Ｅ１２ＹＩＬ１３又はＷＴＩＬ１３を含むＣＡＲを作製した。４つのＣＡＲはそれ以外は同一であり、ＣＤ２８共刺激性があった。ＣＡＲには、Ｆｃ受容体結合を軽減させるためにＣＨ２領域内の２つの部位（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異させたＩｇＧ４－Ｆｃリンカー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζ（図４Ａ）と直列のＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれた。発明者らのグループや他の研究者らは、ＣＤ２８系共刺激を伴うＩＬ１３系ＣＡＲ（Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ，Ｎｏｎｏｅｔａｌ．２０１７）がＩＬ１３Ｒα１発現をより高感度に認識することを見出した。そこで、ＩＬ１３Ｒα２特異性をよりよく識別するために、ＣＡＲバックボーンの一部としてＣＤ２８共刺激を用いた。さらに、ＣＡＲカセットには、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列に続いて、レンチウイルストランスダクション効率、細胞追跡、及びエンリッチメントのマーカーとして用いられる切断型ＣＤ１９がある。細胞形質導入用のＣＤ１９ＲｔとＣＡＲ検出用のＩｇＧ４－Ｆｃのフローサイトメトリー分析により、４つのＩＬ１３－ＣＡＲ変異体（図４Ｂ）について同等の発現が確認された。すべてのインビトロ及びインビボ研究において、ＩＬ１３－ＣＡＲはナイーブ／メモリーＴ細胞（Ｔｎ／ｍｅｍ）で操作された。Ｔｎ／ｍｅｍは、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）とともに、セントラルメモリー（Ｔｃｍ）と幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）の集団をともに含む、濃縮されたＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ及びメモリーＴ細胞である。

ＩＬ１３－ＣＡＲＴ細胞の標的特異性を評価するため、組換えヒトＩＬ１３Ｒα２及びＩＬ１３Ｒα１に対する結合親和性を用量反応曲線（図４Ｃ）で評価した。示されたＩＬ１３系構築物を安定的に発現するＴ細胞をビオチニル化したＩＬ１３Ｒα１又はＩＬ１３Ｒα２で４°Ｃで１時間滴定し、ＩＬ１３に結合する受容体のレベルを、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７に結合させたストレプトアビジンとインキュベートすることによって測定した。Ｅ１２Ｙ及びＤ７ＣＡＲＴ細胞はＷＴと同様の親和性でＩＬ１３Ｒα２に結合するが、すなわち、各々１．８ｎＭ（９５％信頼区間：１．０－３．７ｎＭ）、４．２ｎＭ（９５％信頼区間：２．８－６．３ｎＭ）及び１．７ｎＭ（９５％信頼区間：１．２－２．４ｎＭ）であり、Ｃ４はより弱い親和性である２９ｎＭ（９５％信頼区間：２３－３６）を示した（図４Ｃ右パネル）。特に、ＩＬ１３由来ＣＡＲのＩＬ１３Ｒα２に対する親和性は、遊離タンパク質よりも２～３桁弱い。対照的に、Ｄ７及びＣ４ＣＡＲＴ細胞は、分析された濃度範囲でＩＬ１３Ｒα１に最小の結合を示したが、ＷＴとＥ１２Ｙはほぼ同じ親和性（３４ｎＭ；９５％ＣＩ：両変異株とも２１－５４ｎＭ）を示した（図４Ｃ左パネル）。

ＩＬ１３Ｒα２標的化におけるＣ４及びＤ７ＩＬ１３変異体ＣＡＲＴ細胞の機能的特性化
ＩＬ１３野生型及び変異型ＣＡＲＴ細胞のＩＬ１３Ｒα２標的化能を抗原特異的Ｔ細胞活性化の検討により評価した。これらの機能研究のために、３つのＩＬ１３Ｒα２発現ヒトがん細胞株を用いた。患者由来の原発性神経膠芽腫腫瘍系統ＰＢＴ０３０－２及びヒト神経膠腫系統Ｕ２５１Ｔは、内因的にＩＬ１３Ｒα２を高レベルで発現しており、病理学的状態での過剰発現と一致している（図５Ａ－５Ｃ）。ＩＬ１３受容体ファミリー陰性ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０は、ＩＬ１３Ｒα２（ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα２）を過剰発現するように操作された。細胞株におけるＩＬ１３Ｒα２の発現は、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット及びｑＰＣＲ（図５Ａ－５Ｃ）によって確認された。ＣＤ１０７ａを脱顆粒のマーカーとして用い、３つのＩＬ１３Ｒα２発現細胞株とエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で５時間共培養した後、ＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能を評価した。ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｄ７、及びＣ４ＣＡＲＴ細胞は、陽性細胞の割合として測定されたＩＬ１３Ｒα２を発現するすべての細胞株に対して同等のＣＤ１０７ａ発現を示し、模擬（非形質導入）Ｔ細胞（図６Ａ）ではごくわずかなＣＤ１０７ａ発現が見られた。Ｔ細胞活性の別の尺度として、フローサイトメトリーによる細胞内ＩＦＮ－γ産生（図６Ｂ）と、固定化組換えヒトＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃ（図６Ｃ）の濃度上昇に応答して分泌されるＩＦＮ－γの両方のサイトカイン産生を評価した。ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞株とＥ：Ｔ１：１で５時間培養した後の細胞内ＩＦＮ－γ陽性細胞の割合は、ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｄ７、及びＣ４ＣＡＲＴ細胞全体で同程度であり、模擬Ｔ細胞ではＩＦＮ－γの産生はごくわずかであった。ＩＬ１３Ｒα２濃度の関数として分泌されるＩＦＮ－γのレベルはＣＡＲＴ細胞の種類によって異なり、ＷＴ及びＥ１２ＹＣＡＲＴ細胞が最も高いＩＦＮ－γ濃度を分泌し、次いでＤ７、Ｃ４ＣＡＲＴ細胞の順であった。

ＩＬ１３野生型と変異型ＣＡＲＴ細胞の機能的差異をさらに調べるために、インビトロでの腫瘍殺傷試験を行った。ＣＡＲＴ細胞を腫瘍標的ＰＢＴ０３０－２、Ｕ２５１Ｔ、ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα２とＥ：Ｔ１：１０で２日間共培養し、生残腫瘍細胞をフローサイトメトリーで計数し、結果は模擬Ｔ細胞と培養後の腫瘍細胞数に正規化した比率で表された。ＣＡＲＴ細胞（ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｄ７、及びＣ４）の全ては、同様の効率で腫瘍細胞を殺した（図６Ｄ）。ＣＡＲＴ細胞の機能的特徴は、各実験内の４つの異なる健康なドナーで一貫していた。長期殺菌試験では、ＰＢＴ０３０－２とＥ：Ｔ１：５０で共培養したＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ１３変異体に関係なく、４つのドナー（図６Ｅ）にわたって同様の細胞溶解活性を示した。重要なことに、ＩＬ－１３ムテインＣＡＲを用いて観察された細胞毒性は、模擬Ｔ細胞及び非Ｔ細胞対照よりも有意に高かった（全例でｐ＜０．００５）。同じ実験から、７日間の共培養後の生きたＣＡＲＴ細胞の分析は、生きたＴ細胞が観察されなかった（図６Ｆ）非Ｔ細胞及び模擬対照と比較して、野生型及び変異型ＣＡＲＴ細胞における持続性／増殖を示した。注目すべきことに、Ｃ４は他のＩＬ１３ＣＡＲと比較してＣＡＲＴ細胞の持続／拡大のレベルが低く、抗原依存性増殖の可能性が低いことが示唆された。

例５：患者由来ＩＬ１３Ｒα２＋異種移植マウスモデルはＩＬ１３変異ＣＡＲＴ細胞による治療後の生存率の改善を示す
ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）レポーター遺伝子（Ｂｒｏｗｎ，Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．２０１２）を発現するように改変したＩＬ１３Ｒα２ＰＢＴ０３０－２細胞を用いて、以前に確立した異種移植脳腫瘍モデルにおいて、ＣＡＲＴ細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。３つの独立した実験では、腫瘍を持つＮＳＧマウス（頭蓋内に注入された１×１０^６個の腫瘍細胞；９±１日生着）に腫瘍内（ｉ．ｔ．）を０．３×１０^６の模擬Ｔ細胞（非形質導入）に注入すると、非処理対照と同様に腫瘍増殖と生存が認められたが、ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４、及びＤ７ＣＡＲＴ細胞による処理は、腫瘍量を効率的に減少させた（図７Ａ）。カプランマイヤ―生存分析は、ＩＬ１３野生型及び変異型ＣＡＲＴ細胞で処理したマウスの生存率の改善を示しており（図７Ｂと図８）、１５０日目までにＩＬ１３野生型及び変異型ＣＡＲＴ細胞で処理したマウスでは、腫瘍のないマウスと腫瘍が再発したマウスの数は同程度であった（図７Ｃ）。総合すると、これらの結果は、Ｃ４及びＤ７ＣＡＲＴ細胞が、ＷＴ及びＥ１２ＹＣＡＲＴ細胞処理と比較して、ＩＬ１３Ｒα２発現腫瘍に対して同様のインビボ抗腫瘍活性を示すことを示している。

例６：ＩＬ１３変異ＣＡＲＴ細胞はＩＬ１３Ｒα１発現腫瘍に対するエフェクター活性の低下を示す
ＩＬ１３Ｒα１の発現が異なるあるヒトがん細胞株を用いて、ＩＬ１３野生型及び変異型ＣＡＲＴ細胞の相対的エフェクター活性を評価した。ヒト肺腺がん細胞株Ａ５４９は内因的に中程度のＩＬ１３Ｒα１を発現するが、ＩＬ１３Ｒα２やＩＬ４Ｒαは検出されない。ＩＬ１３Ｒα１、ＩＬ１３Ｒα２、又はＩＬ４Ｒαを発現しないヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０は、ＩＬ１３Ｒα１（ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα１と表記）又はＩＬ１３Ｒα１とＩＬ４Ｒα（ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα１－ＩＬ４Ｒαと表記）をともに、のいずれかを過剰発現するように操作された（図５Ａ－５Ｃ）。ＣＡＲＴ細胞とＩＬ１３Ｒα１発現腫瘍細胞（Ａ５４９とＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα１）を１：１Ｅ：Ｔで５時間共培養すると、ＷＴとＥ１２ＹはＣ４とＤ７よりもＣＤ１０７ａ（図９Ａ）の表面発現とＩＦＮ－γ（図９Ｂ）の細胞内発現を有意に多く誘導した（全ての比較でｐ＜０．０５）。対照的に、ＣＡＲＴ細胞をＨＴ１０８０－ＩＬＲα１－ＩＬ４Ｒαと共培養した場合、Ｅ１２ＹとＤ７は表面ＣＤ１０７ａと細胞内ＩＦＮ－γの類似した発現を示したが、Ｃ４はどちらのアッセイにおいてもＥ１２Ｙと比較して減弱応答を示した（いずれもｐ＜０．０５）。特に、ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα１－ＩＬ４Ｒα細胞に対して、すべてのムテインＣＡＲＴ細胞（Ｅ１２Ｙ、Ｃ４、及びＤ７）は、ＷＴＣＡＲＴ細胞と比較して、ＩＦＮ－γ産生細胞の頻度が有意に低かった。プレート結合ＩＬ１３Ｒα１による培養後に分泌されたＩＦＮ－γを評価したところ、ＣＡＲ変異体の間でＴ細胞活性に明確な違いがあることが明らかになった。ＷＴとＥ１２ＹはいずれもＣ４及びＤ７と比較して有意に高いＩＦＮ－γレベルを分泌し、Ｃ４及びＤ７はほとんど検出できなかった（図９Ｃ）。ＩＬ１３Ｒα１を発現するがん細胞株に対する長期殺処分試験の結果は、脱顆粒及びサイトカイン産生試験の結果を反映しており、Ｃ４及びＤ７ＣＡＲＴ細胞は、ＷＴ及びＥ１２Ｙと比較して殺処分の減少を示した（図９Ｄ）。ＨＴ１０８０－ＩＬＲα１－ＩＬ４Ｒαに対して、Ｄ７はＥ１２Ｙ及びＷＴと同程度に殺腫瘍性を示したが、Ｃ４は有意に殺腫瘍性が低かった（全ての比較でｐ＜０．０５）。

Ｃ４及びＤ７ムテインＣＡＲＴ細胞の選択性をインビボで調べるために、ＩＬ１３Ｒα１発現腫瘍細胞を用いた異種移植モデルにおいてＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性を調べた。ＣＡＲＴ細胞活性の小さな違いをより高い感度で検出するために、注射前に腫瘍とＴ細胞を２時間一緒にインキュベートすることによってエフェクター活性を直接評価するＷｉｎｎ分析を使用した（１９６０勝１９６１勝）。１×１０^６ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４及びＤ７ＣＡＲＴ細胞を０．１×１０^６Ａ５４９細胞と２時間共培養し、その後、共培養細胞をＮＳＧマウスに生着させた（図９Ｅ）。６０日間にわたる腫瘍増殖動態に続いて、ＷＴＣＡＲＴ細胞はＩＬ１３Ｒα１発現腫瘍の生着を除去した。すべてのＣＡＲＴ細胞変異体は、ＰＢＳ及び模擬Ｔ細胞処理腫瘍と比較して、生着にある程度の遅延を示した。その後の時点で、Ｃ４ＣＡＲＴ細胞はＷＴ及びＥ５８Ｙよりも有意に低い増殖阻害を示した（５４日目と日目のすべての比較でｐ＜０．０５）。
高親和性対ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαを発現する腫瘍に対するＣＡＲＴ細胞変異体を評価するために、ＮＳＧマウスに０．５×１０^６ＨＴ１０８０－ＩＬ１３Ｒα１－ＩＬ４Ｒαを皮下に異種移植し、４日後に生着させた。マウスは、（図９Ｆ）腫瘍内注射によって、モック、ＷＴ、Ｅ１２Ｙ、Ｃ４、及びＤ７ＣＡＲＴ細胞、又はＰＢＳで処理された。ここでも、Ｃ４ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性は最も低く、腫瘍増殖はＰＢＳ処理マウスや模擬Ｔ細胞処理マウスに匹敵した（図９Ｆ）。インビトロ殺傷アッセイと同様に、Ｄ７及びＥ１２ＹＣＡＲＴ細胞処理は、ＷＴＣＡＲＴ細胞と比較して同等の抗腫瘍活性の低下を示した（１６日目以降のすべての比較でｐ＜０．０５）。

実施例で用いられる方法
腫瘍株
ＰＢＴ０３０－２は、ＮＯＤ／ＳｃｉｄＩＬ２ＲγＣｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（Ｂｒｏｗｎ，Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．２０１２）で２回異所性継代された患者由来の原発性膠芽腫腫瘍球系統である。Ｂｒｏｗｎ，Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．２０１２）。確立されたヒト腫瘍株Ａ５４９（肺がん）及びＨＴ１０８０（線維肉腫）は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ－グルタミン、及び２５ｍＭＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ（ギブコ、ニューヨーク州グランドアイランド）で維持された。ＨＴ－１０８０は、ＩＬ１３Ｒα１、ＩＬ１３Ｒα１とＩＬ４Ｒαの両方、又はＩＬ１３Ｒα２を発現するようにレンチウイルス修飾された。Ｕ２５１Ｔグリオーマ系統はＤｒ．ＷａｌｄｅｍａｒＤｅｂｉｎｓｋｉからの贈与であり、上記のように増殖させた（Ｂｒｏｗｎ，Ｗａｒｄｅｎｅｔａｌ．２０１３）。細胞株ＴＦ－１（赤白血病）を１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、２ｍＭＬ－グルタミン、ＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩで増殖させ、増殖と生存を促進した。すべての細胞株は５％のＣＯ_２で３７°Ｃに維持された。

フローサイトメトリー
細胞内ホスホ‐ＳＴＡＴ６染色は氷冷メタノール（１００％ｖ／ｖ）透過後にｐＳＴＡＴ６‐Ａｌｅｘａ４８８（ＢＤバイオサイエンス１：５０）で行った。ＳＴＡＴ６リン酸化の誘導は、刺激された試料の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を刺激されていない試料の平均蛍光強度から差し引くことによって計算された。正規化した値をサイトカイン濃度に対してプロットして用量反応曲線を作成し、そこからＥＣ５０値をＳ字曲線にフィットする非線形最小二乗回帰に基づいて計算した。

ＣＡＲの発現は、ビオチニル化抗Ｆｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｏｖｅ，ＰＡ１：１００）抗体に続いてストレプトアビジン－ＰＥ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ，１：２０）を用いて、ＣＤ１９－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃｌ，ＳＪ２５Ｃ１，１：１００）で切断型ＣＤ１９細胞外配列を染色することによって評価した。ＩＬ１３Ｒα２－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃｌ．ＳＨＭ３８，１：１００）、ＩＬ１３Ｒα１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃｌ．ＳＳ１２Ｂ，１：１００）、ＩＬ－４Ｒα－ＰＥ（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ｃｌ．ｈＩＬ４Ｒ－Ｍ５７，１：２０）で標的株を染色した。他のアッセイでは、ＣＤ１０７ａ－ＦＩＴＣ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌ．Ｈ４Ａ３，１：９）、ＣＤ４５ＰｅｒＣＰ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌ．２Ｄ１，１：２０）、ＣＤ３－ＶｉｏＢｌｕｅ（ＭｉｌｅｎｔｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ，１：２０）、ＣＤ８ＡＰＣ－Ｃ７（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌ．ＳＫ１，１：５０）、及びＩＦＮγ－ＡＰＣ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌ．Ｂ２７，１：１００）というさらなる抗体を指定通りに用いた。細胞を染色するために、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＳｔａｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、２０％ｖ／ｖＦＢＳ、０．１％ｗ／ｖＮａＮ_３）に再懸濁し、抗体と４°Ｃで３０分間インキュベートし、必要に応じて二次染色を行った後、洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で実行し、ＦｌｏｗデータをＦＢＳＥｘｐｒｅｓｓ４（ＤｅＮｏｖｏＳｏｆｔｗａｒｅ，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）で分析した。

タンパク質の発現と精製
ヒトＩＬ－１３とＩＬ－１３変異体は、（ＬａＰｏｒｔｅ，Ｊｕｏｅｔａｌ．２００８）に記載されているように、Ｎ末端ｇｐ６７シグナル配列とＣ末端ヘキサヒスチジンタグを持つフレームでｐＡｃＧＰ６７－Ａベクター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローン化され、バキュロウイルス発現システムを使用して生産された。バキュロウイルス株はＳＦ９００ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞でのトランスフェクションと増幅によって調製し、タンパク質発現はＩｎｓｅｃｔＸｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ）で増殖させたＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）懸濁細胞で行った。発現後、ニッケル－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティークロマトグラフィーによって４８時間後にＨｉｇｈＦｉｖｅ上清からタンパク質質を捕捉し、濃縮した後、１５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。組換えサイトカインは９８％以上の均一性に精製された。ビオチニル化受容体発現のために、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ１３Ｒα２エクトドメインをＣ末端ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）－ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＷとそれに続くヘキサヒスチジンタグでｐＡｃＧＰ６７－Ａベクターにクローン化した。過剰なビオチン（１０μＭ）の存在下で受容体をＢｉｒＡリガーゼと共発現させた。タンパク質質濃度はナノドロップ２０００分光計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２８０ｎｍのＵＶ分光法で定量した。

ＩＬ－１３の酵母ディスプレイ
一般的な酵母ディスプレイ方法論は、以前に記載されたプロトコル（ＢｏｄｅｒａｎｄＷｉｔｔｒｕｐ１９９７）から変更した。ヒトＩＬ－１３ｃＤＮＡを酵母ディスプレイベクターｐＣＴ３０２にクローニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥＢＹ１００株をｐＣＴ３０２＿ＩＬ－４ベクターで形質転換し、ＳＤＣＡＡプレート上で３０°Ｃで二日間培養した。ＩＬ－１３表示酵母の個々のコロニーをＳＤＣＡＡ液体培地（ｐＨ４．５）で３０°Ｃで一晩培養した後、ＳＧＣＡＡ培地（ｐＨ４．５）で２０°Ｃで２日間誘導し、酵母をビオチニル化ＩＬ１３Ｒα１又はＩＬ１３Ｒα２で染色した後、ストレプトアビジン対を用いてＡｌｅｘａ－６４７色素とインキュベートした。蛍光はＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメーターで分析した。

表面プラズモン共鳴
ＳＰＲ実験は、ＢｉａｃｏｒｅＳＡセンサーチップ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器で行った。ビオチニル化されたＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ１３Ｒα２を低密度（５０－１００応答ユニット（ＲＵ））で捕捉し、３０μＬ／分で動態測定を行った。非血縁ビオチニル化タンパク質質をＳＡセンサーチップの基準表面として固定化し、ＲＵを実験表面に一致させた。すべての測定は、ＩＬ－１３作動薬をランニングバッファー（１ｘＨＢＳ－Ｐ、０．１％ＢＳＡ）で３倍に連続希釈して行った。チップ表面に結合したＩＬ‐１３Ｒα１／ＩＬ‐１３Ｒα２を７ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）と２５０ｍＭＮａＣｌで再生した。ＩＬ－１３アゴニスト会合時間１２０秒から１９０秒、解離時間２０秒から１２００秒を用いて、速度パラメータを決定した。すべてのデータフィッティングは、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを備えるＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアバージョン２．０を用いて行った。

ＴＦ－１細胞増殖試験
２０００個／ウェルのＴＦ－１細胞を９６ウェルプレートに播種し、指示された用量のＩＬ－１３ｗｔと選択されるＩＬ－１３アゴニストで刺激した。９６時間の刺激後、細胞を採取し、ＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメーターによるフローサイトメトリーに基づく計数法を用いて細胞数を決定した。各アゴニストで得られた細胞数をサイトカイン濃度に対してプロットしてＳ字状の用量／反応曲線を得、そこからＴＦ－１増殖ＥＣ５０値を算出した。

ＣＡＲの構成要素
コドン最適化ＩＬ－１３（Ｅ１３Ｙ）変異体ＣＡＲ配列は以前に記述されていた（非特許文献１２）。リーダーペプチドから得られた切断されたＣＤ１９Ｒｔ配列へのＰＣＲスプライス重複拡張により、リボソームスキップＴ２Ａ配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｌｕｋｅｅｔａｌ．２００１）をＣＤ１９含有プラスミドの膜貫通構成要素（すなわち、塩基対１－９７２）に融合させた。ＩＬ１３－ｖａｒｉａｎｔとＴ２Ａ－ＣＤ１９Ｒｔ断片を前に記載したｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクター（Ｗａｎｇ，Ｎａｒａｎｊｏｅｔａｌ．２０１２）に連結した。次に、ＣＤ２８共刺激配列をスプライス重複拡張ＰＣＲによって挿入し、その後、その構築物は、ＣＡＲ変異体を生成するためにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩＸＬキット（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）を用いて順次部位特異的変異誘発を受けた。

濃縮Ｔｎ／ｍｅｍ細胞の単離
血液製剤は、ＣｉｔｙｏｆＨｏｐｅ（ＣＯＨ）ＩｎｔｅｒｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄによって承認されたプロトコルに基づいて、健康なドナーから採取された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）上で密度勾配遠心法により分離した。ＰＢＭＣを臨床グレードの抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ１４マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＧＥヘルスケア）を含むＸＶｉｖｏ１５培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。その後、ＣＤ２５＋及びＣＤ１４＋細胞は、メーカーの指示（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に従って、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ枯渇モードを用いてすぐに枯渇させた。遠心分離後、細胞の非標識陰性分画を０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ＣＳＬＢｅｈｒｉｎｇ，ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を含むＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に再懸濁し、次に臨床グレードのビオチニル化ＤＲＥＧ５６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＣｉｔｙｏｆＨｏｐｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて０．１μｇ／１０^６細胞で、ＲＴで３０分間標識した。その後、細胞を洗浄し、０．５％のＨＳＡを含む１００ｍＬの最終容量のＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁した。１．２５ｍＬのアンチビオチンマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）と３０分間インキュベートした後、ＣＤ６２Ｌ＋画分（Ｔｎ／ｍｅｍ）をメーカーの指示に従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ上で、ポジティブセレクションで精製し、１０％ＦＢＳを含むＸ－Ｖｉｖｏ１５培地に再懸濁した。

ＣＡＲＴ細胞の活性化、レンチウイルストランスダクション、ｅｘｖｉｖｏでの増殖
Ｔｎ／ｍｅｍ細胞を、細胞対ビーズ比１：３のＤｙｎａｂｅａｄｓＨｕｍａｎＴｅｘｐａｎｄｅｒＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で刺激し、１０％ＦＢＳ（ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）と１００μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＡＰＰＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）、５０Ｕ／ｍＬの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－２、及び０．５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１５を含むＸ－Ｖｉｖｏ１５において、１．５－３の感染多重度で、レンチウイルスで形質導入した。その後、細胞密度を６×１０^５細胞／ｍＬ前後に維持するために必要に応じてＸ－Ｖｉｖｏ１５培地（１０％ＦＢＳ）を添加し、週３回サイトカインを補充しながら、培養を３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で維持した。培養７日目に、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを、ＤｙｎａＭａｇ５磁石（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養物から除去した。Ｔ細胞株を１４日目頃にＥａｓｙＳｅｐＴＭＣＤ１９選択キットＩＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で濃縮し、凍結保存の前に１９日から２４日の間増殖させた。

サイトカイン産生アッセイ
脱顆粒と細胞内ＩＦＮ－γ評価のために、サイトカインを含まないＸ－Ｖｉｖｏ１５培地でＣＡＲＴ細胞と腫瘍をエフェクター対標的比１：１で共培養した。３７°Ｃで５時間培養する前に、ＣＤ１０７ａとゴルジストップ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１：１５００ｖ／ｖ）を共培養に加え、その後、無傷の細胞をヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＩＬ１３Ｒα２抗体で染色した。その後、細胞を固定し、製造業者の指示に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて透過させ、ＩＦＮ－γについて染色して分析した。

ＥＬＩＳＡでは、５００，２５０，１２５、６２．５又は３１．２５ｎｇ／ｗｅｌｌのｒｈＩＬ１３Ｒα１－Ｆｃキメラ又はＩＬ１３Ｒα２－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でコーティングした平底９６ウェルプレート上で、Ｔ細胞を５ｘ１０^３エフェクター／ウェルで一晩培養した。その後、製造業者の指示に従ってＬｅｇｅｎｄＭａｘＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、上清のＩＦＮ－γレベルを評価した。

細胞毒性試験
Ｔ細胞と腫瘍を９６ウェルプレートで２日間、サイトカインを添加せずにＸ－Ｖｉｖｏ１５培地で、エフェクター対標的比１：１０で共培養した。長時間殺菌分析では、エフェクターと標的をサイトカインの非存在下で７日間１：５０の比率で共培養し、３－４日ごとに新鮮な培地を補充した。分析の最後に、付着腫瘍をトリプシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を用いて酵素的に採取した。次に、細胞をヒトＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＩＬ１３Ｒα２で染色し、流れによって評価した。ＣＡＲＴ細胞による腫瘍死滅は、モック（非形質導入）Ｔ細胞で観察されたものと比較して、生存可能なＣＤ４５陰性細胞数を比較することによって計算した。

異種移植モデル
すべてのマウス実験は、ＣＯＨＩｎｓｔｉｔｕｔｅＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。同位体モデルでは、ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０－２細胞（１×１０^５）を、０日目にＮＳＧマウスの右前脳に定位移植した。次に、各実験で示されたように、マウスに０．２－２．０×１０^６のＣＡＲＴ細胞を腫瘍内に投与した。その後、マウスのグループを、上記のようなゼノゲン非侵襲的光学画像法（非特許文献１４）による腫瘍生着、又は米国獣医師会ガイドラインに従って安楽死を適用した生存について監視した。皮下モデルは、ＨＴ１０８０腫瘍（５×１０^５、５０μｌ）を５０％ｖ／ｖのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でＮＳＧマウスの脇腹に注射することによって確立された。腫瘍生着の４日後、ＣＡＲＴ細胞（５×１０^６）を腫瘍内に注入し、腫瘍の大きさをキャリパーでモニターした。Ｗｉｎｎ分析を行うために、Ａ５４９腫瘍（１×１０^５）とＣＡＲＴ細胞（１×１０^６）を３７°Ｃで２時間、培地中で共培養した。次に、細胞混合物を５０％ｖ／ｖのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と混合し、ＮＳＧマウスの脇腹に注入した。

統計解析
統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）におけるスチューデントｔ検定（２群）、一方向分散分析（＞３群、ボンフェローニ調整）又はログランク（カプランマイヤ―生存曲線、マントルコックス補正）によって決定された。有意水準は＊で表され、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１であった；＊＊＊、Ｐ＜０．００１であった；ｎｓは有意でないことを示す。

その他の実施形態
発明は、その詳細な説明と併せて説明されているが、上記の説明は、添付された特許請求の範囲によって定義される発明の範囲を説明することを意図しており、制限するものではないことを理解すべきである。その他の側面、利点、及び変更は、次のクレームの範囲内にある。すべての参考文献は、あらゆる目的のためにその全体がここに援用される。

Claims

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２９～３７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はからなる、核酸分子。
キメラ抗原受容体は、配列番号２９～３７から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はからなる、請求項１に記載の核酸分子。
キメラ抗原受容体は、配列番号２９、３２、３５及び３８から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はからなる、請求項１に記載の核酸分子。
配列番号２９～３７から選択されるアミノ酸配列と９５％以上同一であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はからなる、キメラ抗原受容体。
配列番号２９～３７から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はからなる、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
配列番号配列番号２９、３２、３５及び３８から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はからなる、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
請求項１に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。
請求項１に記載の核酸分子を含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団。
セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブメモリーＴ細胞、パンＴ細胞、又はＣＤ２５＋細胞及びＣＤ１４＋細胞に対して実質的に枯渇したＰＢＭＣを含む、請求項９に記載のヒトＴ細胞集団。
膠芽腫、膵管腺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞がん、乳がん又は肺がんに罹患している患者を治療する方法であって、請求項１に記載の核酸分子を含むベクターによって形質導入された自己又は同種のヒトＴ細胞の集団を投与することを含む方法。
細胞を局所的又は全身的に投与する、請求項１１に記載の方法。
細胞を単回又は反復投与する、請求項１２に記載の方法。
自己又は同種のヒトＴ細胞の集団を提供し、請求項１に記載の核酸分子を含むベクターによってＴ細胞を形質導入することを含む、ＣＡＲＴ細胞を調製する方法。