JP2023510770A - 抗生剤と組み合わせた、サルモネラベースのｄｎａワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、抗生剤を用いた治療後のヒト対象におけるがんの治療における使用のための、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含み、経口投与され、場合によりチェックポイント阻害剤と組み合わされるチフス菌Ty21a株に関する。

Description

本発明は、抗生剤を用いた治療後のヒト対象におけるがんの治療における使用のための、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含み、経口投与され、場合によりチェックポイント阻害剤と組み合わされるチフス菌Ty21a株に関する。

腫瘍により免疫を生じさせうるという知見により、正常な組織には危害を加えずに悪性細胞を選択的に排除するのに免疫系を利用する設計の多数のがん免疫療法が開発されている。しかし腫瘍抗原単独ではワクチン接種による生存の有益性は依然として高くない。抗がんワクチンは多くの課題に直面しており、その課題には、微小環境が免疫抑制性であることと、自己免疫反応を誘起することなく宿主のタンパク質に最適な免疫刺激を与えることが含まれる。異常な腫瘍血管系は低酸素の微小環境を作り出し、それが炎症細胞を免疫抑制に向かわせる。さらに、腫瘍は、増殖因子とサイトカインの分泌を通じ、全身で免疫細胞の増殖、分化、および機能を変化させる。

がんに対する免疫化の方法がいくつかあるが、1つの非常に有望な方法は、サルモネラなどの細菌を腫瘍抗原またはストローマ抗原に対するDNAワクチンのための担体として用いることである。例えばWO 2014/005683には、がん免疫療法で使用することを目的として、特に膵臓がんの治療で使用することを目的として、VEGF受容体タンパク質をコードする組み換えDNA分子を含むサルモネラの弱毒化株が開示されている。ヒトVEGFR-2を発現するこのワクチンはVXM01とも称される。

さらに、WO 2014/173542、WO 2015/090584、WO 2016/2020458、およびWO 2018/167290には、ウィルムス腫瘍タンパク質、メソテリン、CMVpp65、またはPD-L1をそれぞれコードする組み換えDNA分子を含むサルモネラの弱毒化株が、がん免疫療法で使用するために開示されている。

WO 2013/09189には、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠いていてある組み換えDNA分子を有する弱毒化変異チフス菌株を増殖させる方法が開示されており、WO 2018/011289には、サルモネラの弱毒化株を含む個別化されたがんワクチンを製造するための迅速かつ有効な方法が開示されている。

膠芽腫は脳の中で始まる最も侵襲性の強いがんであり、WHOのグレードIVが神経膠腫の最も侵襲性の強い形態である。最初に診断された後の患者の生存期間中央値は複数の研究コホートでまだ15ヶ月未満であり、ほぼすべての患者が腫瘍再発に苦しみ、わずか25％の人が1年を超えて生存する。2005年以後、外科手術の後に放射線療法をテモゾロミドと組み合わせることが膠芽腫における標準的な一次治療となっている。最初の治療が失敗した後のさらなる治療の選択肢は限られている。再発膠芽腫に関する標準治療は存在しない。新しくてより有効な免疫療法のアプローチが、患者の生存期間を長くするため大いに必要とされている。VXM01はVEGFR-2をコードするDNAワクチンであり、サルモネラTy21a担体を経口投与のために使用している。膠芽腫腫瘍組織と腫瘍血管系の表面でのVEGFR-2の高発現が、VEGFR-2によるプライミングを受けたT細胞の1つの有望な標的として機能する。膠芽腫の第I/II相VXM01研究において、14人の再発腫瘍患者へのVXM01の投与から、許容可能な安全性プロファイルが示された。2人の患者での客観的臨床応答（CRとPR）と延長された全生存期間をVEGFR-2-特異的免疫応答と関連づけることができよう、J Clin Oncol 36, 2018 (suppl; abstr. 2017)。

再発膠芽腫における治療の選択肢は特に限られており、この特別な固形腫瘍を有する患者の予後は悪いため、改善されたがん療法のアプローチが、特に腫瘍に対する治療用ワクチン接種のさらなる改善において、組み合わせ療法を含めて一般に必要とされている。チェックポイント阻害剤が、サルモネラベースのDNAワクチンを用いたワクチン接種を改善するため以前にWO 2016/202459とWO 2018/083209などの中に記載されている。

宿主の微生物叢、すなわち常在微生物が最近興味を引いている。特に腸マイクロバイオームは、重要で有益な機能（栄養素の代謝、腸ホメオスタシスの維持、および腸粘膜免疫の調節が含まれる）を実行する豊富で非常に多様な微生物を含む。マイクロバイオームが免疫系に影響を与える可能性のある手段のリストは増えているため、マイクロバイオームがワクチン応答にも影響を与えていることが否定されたのは驚きであろうが、その証拠は今のところ比較的限られている（Lynn and Pulendran, J. Leukoc. Biol., 2018; 103(2): 225-231）。微生物叢はワクチンアジュバントとして作用し、抗体応答にとって重要であると推測されるが、その相互作用と効果は理解から程遠い。それ以上にT細胞応答についてはわかっておらず、固形腫瘍に対する治療用ワクチンにとっては致命的である。また、ヒトの免疫応答におけるマイクロバイオームの役割についてはほんのわずかしかわかっていない。

1つの研究において、生弱毒化チフス菌Ty21aを含むワクチンに対するB細胞応答に抗生剤が及ぼすプラスの効果がマウスで報告された（Woo et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 1999; 6(6): 832-837）。この研究では、チフス菌Ty21aがpBR322で形質転換されてアンピシリン耐性とドキシサイクリン耐性にされるとともにクラリスロマイシンに対して一過性に耐性にされて、アンピシリン、ドキシサイクリン、またはクラリスロマイシンとともにマウスに腹腔内投与された。T細胞応答に対する効果は報告されていない。

発明者らは、驚くべきことに、抗生剤を用いた前治療により、ヒトのがんに対してサルモネラベースの経口DNAワクチンの治療効果が増強されることを見いだした。

本発明は、抗生剤を用いた治療後のヒト対象におけるがんの治療における使用のための、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含み、経口投与されるチフス菌Ty21a株に関する。

一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）、ヒトメソテリン（MSLN）、ヒトCEA、CMV pp65、ヒトPD-L1、ヒトVEGFR-2、およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）からなるグループから選択される少なくとも1つの抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。別の一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのネオ抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセット（好ましくは、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセット）を含むDNA分子を含む。

場合により、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と組み合わせ、好ましくは前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と同時に、または前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤の前に投与することができる。一実施形態では、チフス菌Ty21a株は少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与され、その少なくとも1つのチェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、GITR、OX40、TIM-3、LAG-3、KIR、CSF1R、およびCD137に対する抗体からなるグループから選択される免疫調節抗体であることが好ましい。

ある実施形態では、チフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いた治療が完了してから少なくとも3日間経過した後に投与される。ある実施形態では、チフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いた治療が完了してから1ヶ月以内に投与され、好ましくはチフス菌Ty21a株の初回用量は、ほぼ少なくとも3日～1ヶ月の間に投与される。抗生剤は、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株が耐性でない抗生剤であることが好ましい。

投与する抗生剤として、組み合わせ調製物が可能である。ある実施形態では、抗生剤の選択は、ペニシリン系（例えばアモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、またはフルクロキサシリン）、セファロスポリン系、ポリミキシン系（例えばコリスチン）、リファマイシン系（例えばリファキシミン）、リピアルマイシン系、キノロン系（例えばシプロフロキサシン）、スルホンアミド系（例えばスルファメトキサゾール）、マクロライド系（エリスロマイシン）、リノコサミド系、テトラサイクリン系（例えばテトラサイクリン）、アミノグリコシド系（例えばパロモマイシン）、環状リポペプチド系（例えばダプトマイシン）、グリシルサイクリン系（例えばチゲサイクリン）、オキソゾリジノン系（例えばリネゾリド）、ニトロジマゾール系（例えばメトロニダゾール）、リピアルマイシン系（例えばフィダキソマイシン）、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えばジアミノピリミジン系（トリメトプリムまたはテトロキソプリムなど））からなるグループからなされる。一実施形態では、抗生剤は、スルファメトキサゾールまたはトリメトプリム、またはこれらの組み合わせである。別の一実施形態では、抗生剤はコトリモキサゾールである。

本発明に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株には化学療法または放射線療法を付随させてもよい。

好ましい実施形態では、治療するがんは固形腫瘍であり、その例は、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、中皮腫、膠芽腫、胃がん、肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、子宮頚がん、乳がん、および黒色腫である。一実施形態では、固形腫瘍は膠芽腫（好ましくは再発膠芽腫）である。

本発明に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株は、約10⁶～約10⁹、より厳密には約10⁶～約10⁸、最も厳密には約10⁶～約10⁷コロニー形成単位（CFU）を含む単一用量のチフス菌Ty21a株として投与することができる；および／またはチフス菌Ty21a株は、最初の週に2～4回投与された後、2～4週間ごとに単一用量のブースト投与がなされる。チフス菌Ty21a株は医薬組成物の形態にすることができ、医薬として許容可能な少なくとも1つの賦形剤をさらに含む。

図1は、代表的な抗原VEGFR-2として発現するpVAX10.VR2-1のプラスミドマップを示す。

図2Aは、VXM01と抗PD-L1チェックポイント阻害剤アベルマブを用いて治療した再発膠芽腫を有する患者における第I/II相組み合わせ臨床試験の模式的全体図を示しており、その中にはこの臨床試験の時系列と、参加している患者の個別の応答（部分奏功（PR）、安定な疾患（SD）、および進行疾患（PD）など）が含まれる。

図2Bは、VXM01と抗PD-L1チェックポイント阻害剤アベルマブを抗生剤と同時に用いて治療した再発膠芽腫を有する患者における第I/II相組み合わせ臨床試験の模式的全体図を示しており、その中にはこの臨床試験の時系列と、参加している患者の個別の応答（部分奏功（PR）、安定な疾患（SD）、および進行疾患（PD）など）が含まれる。これら4人の患者をCotrim forte（登録商標）で治療した期間が黒色の棒で示されている。

図3は、図2に示されているVXM01と抗PD-L1チェックポイント阻害剤アベルマブを用いて治療した9人の患者の腫瘍応答を示す。個々の患者の番号がx軸に示され、ベースライン（d0）での腫瘍の直径に対する割合としての腫瘍の直径が、示されている月についてy軸に与えられている。

図4は、Cotrim forte（登録商標）を用いて前治療した患者番号0104におけるVXM01とアベルマブを用いた治療のVEGFR-2特異的T細胞応答と腫瘍応答を示す。A）臨床試験の0日目と臨床試験の約3、6、および9ヶ月後の患者番号0104の血液サンプルでのEnzyme Linked Immuno Spot Assay（ELISpot）の結果（プール-陰性対照）が、末梢血単核細胞（PBMC）4×10⁵個当たりのVEGFR-2プール特異的スポットのカウント数として示されている。B）患者番号0104で臨床試験の約3、6、および9ヶ月後にベースラインと比べた腫瘍体積の変化が示されている。

図5は、ベースラインで患者番号0104から得られた腫瘍サンプルの免疫組織化学切片における腫瘍内免疫バイオマーカーのレベルを示す。A）CD8+ T細胞、FoxP3+ T細胞、およびCD68+ T細胞の1 mm²当たりのレベルが示されている。B）PD-1染色とPD-L1染色がヒスト・スコアとして示されている。

図6は、Cotrim forte（登録商標）を研究の3日目から7日目まで（すなわち2回目から4回目の初期研究薬投与の時点をカバーする）用いて前治療した患者番号0109におけるベースラインでの腫瘍内免疫バイオマーカーのレベルと、VXM01とアベルマブを用いた治療の後の腫瘍応答を示す。A）ベースラインにおけるCD8+ T細胞、FoxP3+ T細胞、およびCD68+ T細胞の1 mm²当たりのレベルが示されている。B）PD-1染色とPD-L1染色がヒスト・スコアとして示されている。

図7は、以前の臨床試験でVXM01と抗PD-1チェックポイント阻害剤ニボルマブを用いて治療した3人の評価可能な患者の腫瘍応答を示す。腫瘍のサイズは患者番号2611と2603で縮小し、VXM01とニボルマブを用いた治療の30ヶ月後にPR、6ヶ月後にCRをそれぞれ示した。患者2603では、部分奏功（腫瘍のサイズがベースラインでの15×11 mmから3ヶ月の時点の2×2 mmまで縮小）が、VXM01単剤療法を用いた3ヶ月目にすでに観察された。

1つの側面では、本発明は、抗生剤を用いた治療後のヒト対象におけるがんの治療に用いるため、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含んでいて経口投与されるチフス菌Ty21a株に関する。

別の1つの側面では、本発明は、ヒト対象におけるがんを治療する方法に関するものであり、抗生剤を前記ヒト対象に投与した後、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を経口投与することを含む。

さらに別の1つの側面では、本発明は、少なくとも1つの抗生剤を用いて治療したことがあるか、治療中のヒト対象におけるがんの治療に用いるため、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含んでいて経口投与されるチフス菌Ty21a株に関する。

腫瘍抗原として、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原が可能である。腫瘍特異的抗原にはネオ抗原が包含される。したがってある実施形態では、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのネオ抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。あるいはチフス菌Ty21a株は、本出願全体を通じ、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むと明示することができる。一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのネオ抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセット（好ましくは5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセット）を含むDNA分子を含む。

生弱毒化サルモネラ株、より具体的には本発明のチフス菌Ty21a株は、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含む組み換えDNA分子を安定に担持する。「チフス菌Ty21a株」という用語は、本明細書では、サルモネラの弱毒化株、より具体的にはチフス菌の弱毒化株を意味し、その弱毒化株はTy21aであり、本明細書では「弱毒化株チフス菌Ty21a」の同義語として用いられる。

本発明によれば、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子の細菌担体として機能し、前記DNA分子を標的細胞に送達する。したがってそのDNA分子は組み換えDNA分子である。そのDNA分子は、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むプラスミドであることが好ましい。少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むこのような細菌担体または送達ベクターはDNAワクチンと呼ぶこともできる。したがって本発明はさらに、抗生剤を用いた治療後のヒト対象におけるがんの治療に用いるため、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含んでいて経口投与されるDNAワクチンに関する。

遺伝子免疫化は従来のワクチン接種よりも有利である可能性がある。標的DNAはかなりの期間にわたって検出できるため、抗原のためのデポとして作用する。いくつかのプラスミドの中の配列モチーフ（CpG島など）は免疫刺激性であり、LPSとそれ以外の細菌成分に起因する免疫刺激によって促進されるアジュバントとして機能することができる。

本発明の文脈では、「ワクチン」という用語は、投与されたとき対象で免疫応答を誘導することのできる薬剤を意味する。ワクチンは、疾患を予防、改善、または治療できることが好ましい。本発明の文脈では、ワクチンは経口ワクチンである。少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む本発明のチフス菌Ty21a株は、「少なくとも1つの抗原をコードするチフス菌Ty21a株」または「がんワクチン」と略することができる。好ましい一実施形態では、少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株は、少なくとも1つの腫瘍抗原および／またはストローマ抗原、より好ましくは腫瘍抗原またはストローマ抗原をコードしている。

生弱毒化サルモネラベクターは自らの免疫調節因子（リポ多糖（LPS）など）をその場で産生するため、そのことが他の形態の投与（マイクロカプセル化など）を上回る利点を構成する可能性がある。さらに、本発明の粘膜ワクチンはリンパ内作用モードを有し、それが有益であることが証明された。本発明の弱毒化ワクチンの接種後、改変された細菌が、腸のパイエル板にあるマクロファージとそれ以外の細胞に侵入する。その細菌はこれら食細胞に取り込まれる。チフス菌Ty21株の細菌は、弱毒化変異が原因でこれら食細胞の中で存続することができず死滅する。組み換えDNA分子は、放出された後、特定の輸送系を通じて、またはエンドソーム漏出によって食免疫細胞のサイトゾルの中へと移される。最後に、組み換えDNA分子は核に入り、そこで転写され、前記少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原が食細胞のサイトゾルの中で大量発現するに至る。前記少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をロードされた感染細胞はアポトーシスを起こし、腸の免疫系に取り込まれて処理される。細菌感染の危険シグナルがこのプロセスにおける強力なアジュバントとして機能し、全身組織と粘膜組織の両方のレベルで強い標的抗原特異的CD8+T細胞・抗体応答に至る。この免疫応答はワクチン接種の約10日後にピークに達する。抗担体応答がないため、同じワクチンを何回か用いたブーストが可能になる。

本発明の文脈では、「弱毒化された」という表現は、弱毒化変異が原因で、弱毒化変異を有さない親細菌株と比べて病原性が低下した細菌株を意味する。弱毒化した細菌株は、その病原性を喪失しているが保護免疫を誘導する能力は保持していることが好ましい。弱毒化は、さまざまな遺伝子（病原性、調節、および代謝の遺伝子が含まれる）の欠失によって実現することができる。弱毒化した細菌は自然界に見いだすこと、または例えば新たな培地または細胞培養条件に適合させることによって実験室の中で人工的に作製すること、または組み換えDNA技術によって作製することができる。本発明によるサルモネラの弱毒化株を約10¹¹ CFU投与することによって対象のサルモネラ症の発症が好ましくは5％未満になり、より好ましくは1％未満になり、最も好ましくは1‰未満になる。本発明の株Ty21aは、チフス菌の弱毒化株である。

「含む」または「含んでいる」という用語は、「非限定的な例として含む」を意味する。この用語は制約がないことが想定されており、記載されている任意の特徴、要素、整数、工程、または構成要素が存在することを規定するが、1つ以上の他の特徴、要素、整数、工程、構成要素、またはこれらのグループの存在または追加を排除しない。したがって「含んでいる」という用語には、より限定的な表現である「からなる」と「実質的にからなる」が含まれる。一実施形態では、「含んでいる」という用語は、「からなる」という表現で個別に置き換えることができる。「1つの」という表現は、本明細書では複数を含んでいてもよいため、「1つ」を含むがそれに限定されない。

「抗原」という用語は、本明細書では、免疫応答の誘導に適した任意のタンパク質またはペプチドを意味する。しかし本発明のチフス菌Ty21a株の文脈では、「抗原」という用語は、腫瘍抗原、腫瘍ストローマ抗原、またはチェックポイント阻害剤抗原に関係し、その腫瘍抗原として、腫瘍特異的抗原（ネオ抗原を含む）または腫瘍関連抗原が可能である。「腫瘍抗原」という用語は、本明細書では、腫瘍（好ましくは固形腫瘍）の中でだけ発現または過剰発現している抗原を意味する。したがってある実施形態では、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのネオ抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。好ましい一実施形態では、少なくとも1つのネオ抗原は、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドとして発現する。

一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）、ヒトメソテリン（MSLN）、ヒトCEA、CMV pp65、ヒトPD-L1、ヒトVEGFR-2、およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）からなるグループから選択される少なくとも1つの抗原（好ましくはヒトVEGFR-2）をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。本発明のチフス菌Ty21a株は、腫瘍抗原、ストローマ抗原、およびチェックポイント阻害剤抗原からなるグループから選択される1、2、3、4、5個、またはそれよりも多数の抗原（好ましくはヒトVEGFR-2）を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子も含むことができる。

別の一実施形態では、または追加して、チフス菌Ty21a株は、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。ある実施形態では、前記5つ以上のネオ抗原は、前記対象の固形腫瘍において同定された腫瘍特異的抗原である。

腫瘍抗原、特にヒト腫瘍抗原の非限定的な例は、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）、ヒトメソテリン（MSLN）、ヒト癌胎児性抗原（CEA）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）、上皮成長因子受容体（EGFR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ヒトプログラムされた死-リガンド1（PD-L1）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、黒色腫抗原A1（MAGE-A1）、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、ムチン-1（MUC1）、グリピカン-3（GPC3）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、B細胞成熟抗原（BCMA）、およびチロシン-プロテインキナーゼ膜貫通受容体（ROR1）、および抗サイトメガロウイルスpp65（CMV pp65）であり、表1に列挙されているようにこれらの腫瘍抗原を例えば固形腫瘍が発現する可能性がある：

特別な一例では、本発明のチフス菌Ty21a株は、WT1、MSLN、CEA、CMVpp65、PD-L1、VEGFR-2、およびFAPからなるグループから選択される少なくとも1つの抗原をコードする少なくとも1つ真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。さらなる一例では、本発明のチフス菌Ty21a株は、1、2、3、4、5個、またはそれよりも多数の抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つ真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むことができる。特別な一例では、チフス菌Ty21a株は、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つ真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。

特別な実施形態では、ヒトVEGFR-2は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％の配列が一致するアミノ酸配列を含む。特別な実施形態では、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）は、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80％の配列が一致するアミノ酸配列を含む。特別な実施形態では、ヒトメソテリン（MSLN）は、配列番号4のアミノ酸配列、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80％の配列が一致するアミノ酸配列を含む。特別な実施形態では、ヒトCEAは、配列番号5のアミノ酸配列、または配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80％の配列が一致するアミノ酸配列を含む。特別な実施形態では、CMV pp65は、配列番号6、7、または8のアミノ酸配列、または配列番号6、7、または8のアミノ酸配列と少なくとも80％の配列が一致するアミノ酸配列を含む。特別な実施形態では、ヒト PD-L1は、配列番号9または10のアミノ酸配列、または配列番号9、10、または11のアミノ酸配列と少なくとも80％の配列が一致するアミノ酸配列を含む。

VEGFR-2は配列番号1のアミノ酸配列を有すること、WT1は配列番号3のアミノ酸配列を有すること、MSLNは配列番号4のアミノ酸配列を有すること、CEAは配列番号5のアミノ酸配列を有すること、CMV pp65は配列番号6、7、または8のアミノ酸配列を有すること、および／またはPD-L1は配列番号9、10、または11のアミノ酸配列を有することが好ましい。

VEGFR-2は、キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（KDR）としても知られており、VEGFに対する既知のほぼすべての細胞応答を媒介するように見える。例えば血管新生におけるVEGFの役割は、このタンパク質とVEGFR-2の相互作用を通じて媒介されるように見える。VEGFR-2は、VEGFのほかVEGF-CとVEGF-Dのための高親和性受容体であり、長さが1356個のアミノ酸で200～230 kDaの分子量を有する。VEGFR-2はチロシンキナーゼ受容体のための内皮cDNAのスクリーニングを通じてヒトで同定され、以前に発見されたマウス胎仔肝臓キナーゼ1（Flk-1）と85％配列が一致している。VEGFR-2は、通常は、内皮前駆体と造血前駆体のほか、内皮細胞、新生造血幹細胞、および臍帯ストローマで発現する。しかし休止成人血管系ではVEGFR-2 mRNAは下方調節されているように見える。

VEGFR-2の細胞外ドメインは18箇所の潜在的なN結合型グリコシル化部位を含有する。VEGFR-2は最初に150 kDaのタンパク質として合成され、急速にグリコシル化されて200 kDaの中間形態になった後、より遅い速度でさらにグリコシル化されて成熟した230 kDaのタンパク質になり、細胞表面に発現する。一実施形態では、少なくとも1つの腫瘍抗原、腫瘍ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原は、VEGFR-2の細胞外ドメインを含むか、VEGFR-2の細胞外ドメインである。VEGFR-2をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株はVXM01とも称される。より具体的には、VXM01は図1に示されているプラスミドを含む。

VEGF受容体は、悪性腫瘍の血管系、すなわち腫瘍ストローマに限定されていると長い間考えられてきた。しかし最近の発現分析から、腫瘍細胞そのものの表面に血管内皮増殖因子受容体、特にVEGFR-2が発現していることが明らかになった。腫瘍特異的VEGF受容体の発現がさまざまな起源のがん細胞の表面で観察された。これは、VEGFが腫瘍形成に対して血管新生の促進以外に追加の効果を有する可能性があることを示す。VEGFR-2を発現しているがん細胞を特徴とするがんの非限定的な例に含まれるのは、膠芽腫、カルチノイドがん、腎臓がん（特に腎臓細胞癌）、甲状腺がん、肺がん（特に非小細胞肺がん（NSCLC））、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、消化器がん（特に結腸直腸がん、より厳密には大腸がん）、および皮膚がん（特に黒色腫）である。

VEGFR-2を標的とする免疫療法にとって1つの特に有望な対象は膠芽腫である。膠芽腫は極めて多い腫瘍血管新生を示す。さらに、腫瘍血管系と腫瘍細胞の両方の表面でVEGFR-2を標的にできる可能性がある。膠芽腫患者の約20％～50％が腫瘍特異的なVEGFR-2の発現を示し、それは特に侵入前線で観察される。さらに、VEGFR-2の発現は神経膠腫様幹細胞で観察された。これまで、膠芽腫に関する治療の選択肢は不十分である状態が続いている。例えばVEGFだけを標的とするモノクローナル抗体アバスチンは無増悪生存期間に関して利点を示したが、全生存期間に関してはそうでなかった。

したがって本発明には、ヒト対象がVEGFR-2を発現しているがん細胞を特徴とするがんを有するか、少なくとも1つのVEGFR-2を発現しているがん細胞を有すると判断されたことも包含される。第1段階として、対象の腫瘍特異的VEGFR-2発現（例えばVEGFR-2の腫瘍特異的発現）をmRNAまたはタンパク質のレベルで好ましくはインビトロにて評価することができる。その目的で、腫瘍組織サンプル（例えば生検）に対して例えば免疫組織化学染色による染色、またはインサイチュハイブリダイゼーションを実施することができる。腫瘍特異的抗原発現を評価する方法は本分野で周知である。同じことが、ヒト対象が腫瘍抗原を発現しているがん細胞（特にヒトWT1、ヒトMSLN、ヒトCEA、CMV pp65、ヒトPD-L1、およびヒトFAPを発現しているがん細胞）を特徴とするがんを有するかどうか、またはヒト対象が少なくとも1つの腫瘍抗原を発現しているがん細胞（特にヒトWT1、ヒトMSLN、ヒトCEA、CMV pp65、ヒトPD-L1、およびヒトFAPを発現しているがん細胞）を有するかどうかの判断に当てはまる。当業者であれば、ヒトWT1、ヒトMSLN、ヒトCEA、CMV pp65、ヒトPD-L1および／またはFAPをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を使用して、WT1、MSLN、CEA、CMV pp65、PD-L1、および／またはFAPをそれぞれ発現しているがん細胞を特徴とするがんを有するか、少なくとも1つのWT1、MSLN、CEA、CMV pp65、PD-L1、および／またはFAPを発現しているがん細胞を有すると判断されたヒト対象のがんを治療できる可能性があることをただちに理解するであろう。

メソテリンは、正常な中皮細胞の表面に存在する40-kDaの細胞表面糖タンパク質であり、いくつかのヒト腫瘍（中皮腫、および卵巣と膵臓の腺癌が含まれる）で過剰発現している。メソテリン遺伝子は71-kDaの前駆体タンパク質をコードしており、それが処理されて、巨核球増強因子（MPF）という名称の31-kDaの分断タンパク質と40-kDaの細胞結合断片メソテリンを生じさせる。メソテリンはインターロイキン-3の存在下で巨核球コロニー形成活性を示すことが示された。メソテリンは、限られた一連の正常な成体組織（中皮など）の表面に低レベルで存在するが、多彩なヒト腫瘍（中皮腫、卵巣がん、および膵臓がん、子宮頚、頭頸部、陰門、肺、および食道の扁平上皮癌、肺腺癌、子宮内膜癌腫、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、および胃腺癌が含まれる）の中で異常に過剰発現している腫瘍分化抗原である。メソテリンの通常の生物学的機能は未知である。メソテリンノックアウトマウスにおける研究から、検出可能な表現型はなく、雄と雌のマウスの両方が健康な子孫を産むことが明らかにされた。膵臓がんの研究は、メソテリンが細胞の増殖、移動、およびS期細胞集団を増やすことによって腫瘍形成においてある役割を果たしていることを示唆する。さらに、メソテリンは免疫原性タンパク質であるという証拠が存在する。腫瘍抗原メソテリンは、その発現プロファイル、その発癌機能、およびその免疫原性が理由で、がんワクチン開発のための1つの有望な候補である。

ウィルムス腫瘍遺伝子1（WT1）は、細胞の増殖と分化に関与するジンクフィンガー転写因子をコードしている。WT1タンパク質はC末端に4つのジンクフィンガーモチーフを、N末端にプロリン／グルタミンが豊富なDNA結合ドメインを含有する。2つのコーディングエキソンの位置での選択的スプライシングから生じる多数の転写産物バリアントがよく特徴づけられている。WT1は泌尿生殖系の発生において極めて重要な役割を果たすとともに、細胞の増殖と分化に関与する。WT1遺伝子は小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の責任遺伝子として単離された。それは多彩な悪性腫瘍（いくつかのタイプの血液悪性腫瘍とさまざまな固形腫瘍が含まれる）の中で高発現している。それとは対照的に、成人におけるWT1の正常な組織発現は、生殖腺、子宮、腎臓、中皮、およびさまざまなタイプの組織の中の前駆細胞に限定される。WT-1は分化に負の影響を及ぼし、前駆細胞の増殖を促進する。さらに、過剰発現したWT1は免疫原性であり；WT1特異的T細胞のほかIgG抗WT1抗体ががん患者で観察されている。腫瘍抗原WT1は、その発現プロファイル、その発癌機能、およびその免疫原性能が理由で、がんワクチンを開発するための1つの有望な候補である。特別な実施形態では、WT1は短縮されている。特別な実施形態では、WT1のジンクフィンガードメインが欠失している。特別な実施形態では、短縮WT1は配列番号3のアミノ酸配列を有する。

WT1のC末端にあるジンクフィンガードメインは4つのジンクフィンガーモチーフを含む。配列番号3のアミノ酸配列を有する短縮WT1はUniProt ref P19544-7のアミノ酸1～371を表す。ジンクフィンガードメインの欠失は、他のジンクフィンガー含有転写因子との免疫学的交差反応性のリスクを最少にする。さらに、ジンクフィンガードメインを欠く短縮 WT1は、完全長WT1よりも大きな免疫原性能を有する。それに加え、DNAの結合に不可欠なジンクフィンガーモチーフの欠失によりWT1の発癌能が失われ、したがって発癌のリスクが最少になる。

テグメントタンパク質CMV pp65は、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）の主要な免疫優勢タンパク質である。CMV pp65の生物学的機能は明確でないが、細胞周期の調節に関与していると考えられている。CMV pp65はタンパク質キナーゼ活性を示す向核性タンパク質であり、ポロ様キナーゼ（PLK-1）に結合することができる。ヒトCMV pp65は膠芽腫試料の90％超で発現しているが、周囲の正常な脳では発現していない。したがってこのウイルスタンパク質は、新たながん免疫療法を開発するための腫瘍特異的標的として1つの有望な候補である。

CMV pp65タンパク質は、カルボキシ末端近傍のアミノ酸415～438とアミノ酸537～561の位置にある2つの双節型核局在化シグナル（NLS）と、リシン-436の位置にあってキナーゼ活性に関係するリン酸結合部位を含有する。436位のリシンからアスパラギンへの変異と、アミノ酸537～561の欠失がある結果としてキナーゼ活性のないタンパク質になり、核局在化が顕著に減少する。この変異タンパク質は変化していない免疫原性を示す。

特別な実施形態では、CMV pp65は配列番号6のアミノ酸配列を有する。野生型ヒトCMV pp65のアミノ酸配列を表している配列番号6。特別な別の実施形態では、CMV pp65は配列番号7のアミノ酸配列を有する。配列番号7はヒトCMV pp65のアミノ酸配列を表しており、配列番号6のアミノ酸配列を有する野生型ヒトCMV pp65と比べて変異K436Nを有する。特別な別の実施形態では、CMV pp65は配列番号8のアミノ酸配列を有する。配列番号8は、配列番号7のアミノ酸配列を有するCMV pp65の短縮バージョンのアミノ酸配列を表しており、第2のよりC末端のNLS（核局在化配列）（すなわち配列番号7のCMV pp65のアミノ酸537～561）を欠いている。

癌胎児性抗原（CEA）（CEACAM5およびCD66eとしても知られる）は、細胞接着に関与する互いに密接に関連したグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）細胞表面係留糖タンパク質のファミリーの一員である。CEAは通常は胚発生の間に消化器組織で産生され；タンパク質の発現は誕生前に終了する。したがってCEAは通常は健康な成人の血液中に非常に低レベルでしか存在しない。しかし血清レベルはいくつかのタイプのがん（特に結腸直腸癌）で上昇しているため、腫瘍マーカーとして機能する。CEAのレベルは、胃癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、および髄様甲状腺癌のほか、いくつかの非腫瘍性状態（潰瘍性大腸炎、膵炎、肝硬変、COPD、クローン病、および甲状腺機能低下症など）でも上昇している可能性がある。

プログラムされた細胞死1（PD-1）はT細胞の表面に発現し、コグネイト抗原に対するT細胞の機能停止を維持する阻害シグナルを伝達する。そのリガンドであるPD-L1は通常は炎症性微小環境において抗原提示細胞、胎盤細胞、および非造血細胞の表面に発現する。PD-L1は免疫抑制性骨髄由来サプレッサ細胞（MDSC）の表面に発現することが報告されている。それに加え、PD-L1はさまざまなタイプのがん細胞の表面に広く発現しており、がん細胞はPD-1／PD-L1シグナル伝達軸を利用して宿主の免疫系を逃れる。がん細胞によるPD-L1の発現は、疾患のステージおよび患者の悪い予後と相関することが示された。

特別な実施形態では、PD-L1は、完全長PD-L1と、PD-L1の細胞外ドメインを含む短縮 PD-L1からなるグループから選択される。短縮PD-L1は、配列番号11のアミノ酸19～238のアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸配列、配列番号10のアミノ酸配列を含むこと、または配列番号11のアミノ酸19～238、配列番号11、または配列番号10と少なくとも80％配列が一致するアミノ酸配列を含むことができる。特別な実施形態では、PD-L1は、配列番号9のアミノ酸配列を有するPD-L1と、それと少なくとも80％配列が一致するタンパク質からなるグループから選択される。特別な別の実施形態では、PD-L1は、配列番号10のアミノ酸配列を有するPD-L1と、それと少なくとも80％配列が一致するタンパク質からなるグループから選択される。特別な別の実施形態では、PD-L1は、配列番号11のアミノ酸配列を有するPD-L1と、それと少なくとも80％配列が一致するタンパク質からなるグループから選択される。特別な別の実施形態では、PD-L1は、配列番号11のアミノ酸19～238のアミノ酸配列を有するPD-L1と、それと少なくとも80％配列が一致するタンパク質からなるグループから選択される。特にPD-L1は、配列番号9、配列番号10、または配列番号11のアミノ酸配列を有する。PD-L1は配列番号11のアミノ酸19～238のアミノ酸配列を含むことが好ましい。一実施形態では、PD-L1は少なくとも、そのシグナル伝達ペプチドあり、またはなしの細胞外ドメインを含む。

本明細書では、「約」または「大まかに」という用語は、所与の値または範囲の80％～120％以内、あるいは90％～110％以内を意味し、その中には95％～105％以内が含まれる。

本発明の文脈では、「配列番号Xのアミノ酸配列と少なくとも80％配列が一致するタンパク質」という表現は、提供されるアミノ酸配列とアラインメントさせたときに80％超のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。タンパク質として、天然起源のもの（例えば野生型タンパク質の変異体バージョン、例えば野生型VEGFR-2タンパク質の変異体バージョン）、または異なる種のホモログ、または操作されたタンパク質（例えば操作されたVEGFR-2タンパク質）が可能である。所与のタンパク質の誘導体を設計して構成する方法は当業者に周知である。

所与のアミノ酸配列と少なくとも80％の配列が一致するタンパク質は、参照アミノ酸配列と比べて1個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む1つ以上の変異を含有する可能性がある。本発明の教示によれば、前記の欠失、付加、および／または置換があるアミノ酸は、連続したアミノ酸であること、または所与の参照タンパク質と少なくとも80％配列が一致するタンパク質のアミノ酸配列の長さ全体に点在していることが可能である。本発明の教示によれば、アミノ酸配列が参照アミノ酸配列と少なくとも80％一致し、変異したタンパク質が免疫原性である限り、任意の数のアミノ酸が付加、欠失、および／または置換されていてもよい。参照アミノ酸配列と少なくとも80％配列が一致するタンパク質の免疫原性は、ELISAによって測定したときに参照アミノ酸配列と比べて50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満に低下していることが好ましい。タンパク質ホモログを設計して構成する方法と、そのようなホモログの免疫原性能を調べる方法は当業者に周知である。特別な実施形態では、参照アミノ酸との配列の一致は少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、そして最も特別な場合には少なくとも99％である。配列の一致を判断するための方法とアルゴリズム（親タンパク質と、その誘導体で親配列と比べて欠失、付加、および／または置換を有するものとの比較が含まれる）は当業者に周知である。DNAレベルでは、参照アミノ酸配列と少なくとも80％配列が一致するタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝暗号の縮重が原因でより大きく異なっている可能性がある。

腫瘍抗原は、腫瘍、好ましくは固形腫瘍の中でだけ発現または過剰発現している抗原である。したがって腫瘍抗原として、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原が可能である。腫瘍特異的抗原にはネオ抗原が包含される。したがってある実施形態では、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのネオ抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む。好ましい一実施形態では、少なくとも1つのネオ抗原は、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドとして発現する。その5つ以上のネオ抗原は、前記対象の固形腫瘍の中で同定された腫瘍特異的抗原であることが好ましい。

「ネオ抗原」という用語は、本明細書では、がん細胞の中でだけ発現するが同じ患者の正常な組織の中では発現しない体細胞変異した遺伝子から生成するペプチドに関係する。遺伝子と染色体は体細胞組織または生殖細胞系列組織の中で変異する可能性がある。生殖細胞系列の変異とは異なり、体細胞変異は子孫に伝達されない。したがって遺伝子内の体細胞変異はがん細胞の中でがんが発達している間に獲得されたものである。典型的には、変異は腫瘍特異的点変異であり、ネオエピトープ（変異エピトープまたは点変異ペプチドとも称される）を生成させる。変異は正常な組織には存在しないため免疫原性が大きく、したがって中枢性胸腺寛容を回避する。ネオ抗原は、MHC IまたはMHC IIによってペプチドとして提示されるネオエピトープを含む、好ましくはそのようなネオエピトープからなる。変異としてフレームシフト変異も可能であり、その結果としてフレームシフトペプチド（FSP）抗原になる。FSPネオ抗原は単一のヌクレオチドの挿入または欠失によって生じるが、長い抗原性アミノ酸列を包含しており、そのアミノ酸列は免疫学的に重要な多数のネオエピトープを含有することができる。特別な実施形態では、「ネオ抗原」という用語に、ペプチドプロセシングに関連するT細胞エピトープ（TEIPP）がさらに含まれる。TEIPPは、健康な細胞内のMHC Iにはロードされない偏在的に発現している非変異「自己」タンパク質に由来する。免疫を逃れるがんでは、抗原プロセシング成分（抗原プロセシングに関連する輸送体（TAP）など）が下方調節されていることがしばしばある。したがって変異またはエピジェネティックなサイレンシングが原因でTAPが不在であるなど抗原プロセシング機構に欠陥がある細胞の中でだけ、TEIPPはがん細胞の表面に提示される可能性がある（Marjit et al., Journal of Experimental Medicine, 2018, 215(9): 2325）。

がんの進行中にがんのゲノムに蓄積する変異がタンパク質をコードする遺伝子に影響を及ぼし、その結果として変化したタンパク質配列になる可能性がある。変異したタンパク質はタンパク質分解によって切断されて短いペプチドになり、MHC（ヒトではヒト白血球抗原（HLA））によって腫瘍細胞の表面に提示される。これらの体細胞変異した遺伝子、すなわちネオ抗原は悪性T細胞では提示されるが正常な細胞では提示されず、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）によって外来性であると認識される可能性がある。したがってネオ抗原という用語は、MHC IまたはIIによって提示される体細胞変異を含有するペプチドを含むペプチド、好ましくはそのようなペプチドからなるペプチドを意味する。MHC Iによって提示されるネオ抗原はCD8 T細胞抗原と呼ぶこともできる。MHC IIによって提示されるネオ抗原はCD4 T細胞抗原（またはTヘルパー抗原）と呼ぶこともできる。ネオ抗原はTILによって外来性であると認識される可能性があるため、強力な腫瘍特異的免疫応答を誘導することができる。腫瘍細胞の死後に放出されるネオ抗原が多数のプロセスを開始させ、別々のT細胞受容体（TCR）と特異的ネオ抗原-MHC複合体の相互作用を通じて最終的にT細胞ががん細胞を認識するに至る。

「5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチド」という表現は、本明細書では、5つ以上のネオ抗原をまとめて含む1つのポリペプチドまたは2つ以上のポリペプチドを意味する。5つ以上のネオ抗原が同じポリペプチドの一部であるか異なるポリペプチドの一部であるかは重要でない。したがってその5つ以上のネオ抗原は、1つのポリペプチドとして、または2つ以上のポリペプチドとして発現することができる。少なくとも1つ以上のポリペプチドの中に含まれるネオ抗原は、10以上、20以上、30以上、50以上、または50超のネオ抗原であることが好ましい。本明細書で用いられるチフス菌Ty21a株の文脈では、少なくとも1つのポリペプチドをコードするインサートは、300までのネオ抗原、好ましくは200までのネオ抗原を含むことができる。（ヒトHLAの中の）MHCクラスIまたはIIの表面にペプチドとして提示される抗原は、典型的には、MHC IIについては長さが11～30個のアミノ酸（CD4抗原）、MHC Iについては長さが8～10個のアミノ酸（CD8抗原）である。したがって5つ以上のネオ抗原は、CD8 T細胞抗原、またはCD8 T細胞抗原とCD4 T細胞抗原を含有できることが好ましい。さらに、少なくとも1つのポリペプチドの中に含まれるネオ抗原の好ましい範囲は、5～300、10～300、20～300、30～300、50～300、または50～300超のネオ抗原が可能である。少なくとも1つのポリペプチドの中に含まれるネオ抗原のより好ましい範囲は、5～200、10～200、20～200、30～200、50～200、または50～200超のネオ抗原が可能である。融合ネオ抗原を含むそれぞれのポリペプチドは抗原提示細胞の中でタンパク質分解によって切断されてネオ抗原になり、HLAを通じて提示され、T細胞応答を誘導する。

本発明によれば、前記5つ以上のネオ抗原はCD8 T細胞抗原および／またはCD4 T細胞抗原を含むことができる。前記5つ以上のネオ抗原はCD8 T細胞抗原とCD4 T細胞抗原を含むことが好ましい。

ネオ抗原を用いたワクチン接種は、あらかじめ存在しているネオ抗原特異的T細胞集団の増殖と、新たなT細胞特異性のより広いレパートリーの誘導の両方をがん患者で可能にするという仮説が立てられる。

ネオ抗原は、典型的には、8～30個のアミノ酸、好ましくは8～20個、より好ましくは8～12個のアミノ酸を有するペプチドである。

ネオ抗原がんワクチンにとって、このワクチンが多数のネオ抗原を標的とし、したがってネオ抗原のサブセットの発現の喪失に起因する免疫逃避のリスクを低下させることができれば有益である。本発明には、5つ以上のネオ抗原（腫瘍が進行している間に選択されて標的に向かう新たなネオ抗原またはネオ抗原の新たなサブセットを含む）を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む別のチフス菌Ty21a株を順次用いてヒト対象を治療することも包含される。

5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドの担体としてのチフス菌Ty21aの弱毒化株（「チフス菌Ty21a」とも呼ぶ）の利点は、a）品質管理アッセイが確立されていること、b）1つ以上のネオ抗原をコードするインサートの中でだけプラスミドが個々に異なること、c）増殖の必要がないこと、およびd）経口投与に起因する無菌検査の必要性がないことである。さらに、形質転換に適した発現プラスミドと、担体としてのチフス菌Ty21a株により、多数（300個まで）のエピトープ（ネオ抗原）が可能になる。ネオ抗原は、プラスミドの中に、場合によりリンカーによって分離された（1つ以上のポリペプチドとして発現する）ビーズの紐として挿入することができる。リンカーの非限定的な例として、GSリンカー、2A切断部位、またはIRES配列が可能である。生成が迅速で品質管理の必要性は限定されているため、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を生成させるための時間は短く、ネオ抗原を同定してから例えば15日以内、好ましくは14日以内またはより短期間が可能である。一晩の発酵で十分であり、細菌は高収率であるためスケールアップは必要なく、1 Lの培養物の中に正味の収量が10¹¹コロニー形成単位（CFU）ほどになる。そのため短い製造時間と低い製造コストが可能になる。さらに、各バッチは何年もの治療に十分であり、薬製品は少なくとも3年間は安定であることが示された。したがってバッチの変動が起こることはない。なぜなら1つのバッチが固形腫瘍を有するヒト対象の全治療期間を通じて続くからである。

固形腫瘍を有する個々の対象のために5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を生成させるための方法は、（a）前記対象から腫瘍細胞サンプルと対照サンプルを用意し；（b）腫瘍細胞サンプルの中に存在していて対照サンプルの中には存在しない5つ以上のネオ抗原を同定し；（c）5つ以上のネオ抗原を選択し；（d）5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードするcDNAを合成し；（e）そのcDNAを少なくとも1つの真核生物発現カセットの中にクローニングし；（f）5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子でチフス菌Ty21aレシピエント株を形質転換し；（g）工程（f）で得られた株を発酵させ、CFUに基づいて標的濃度まで希釈し；（h）前記形質転換されたチフス菌Ty21a株を分析すること（5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードするcDNAのシークエンシングが含まれる）を含む。対照サンプルとして、治療する対象からの正常な組織または血液の任意のサンプルが可能である。「正常な組織」という用語は、同じ組織、すなわち同じ起源であることが好ましい非がん組織を意味する。対照サンプルは血液サンプルであることが好ましい。血液サンプルはさらに、患者のHLAの型を判定するのに使用できる。腫瘍細胞サンプルとして腫瘍生検が可能である。

腫瘍内の（あらゆる）コーディング変異を検出し、自家ヒト白血球抗原（HLA）分子が大きな親和性で結合する変異したペプチドを信頼性よく予測または判定する方法は本分野で知られている。例えば個々の患者からのマッチした腫瘍と正常な細胞のDNAの全エキソームシークエンシング（WES）を実施することができる。その後、同定された体細胞変異は抗体を使用せずに検証され、腫瘍のRNAシークエンシングによって変異したアレルの発現が評価される。その後、患者の自家HLA-AまたはHLA-Bタンパク質に結合する可能性が大きいと予測されるペプチドが選択される。それは、例えば生体外インターフェロンγ Enzyme Linked Immuno Spot（ELISpot）によって確認することができる。あるいはHLA-ペプチドリガンドは細胞培地から単離することができ、同定はLC-MS/MS分析によって実施することができる。

ポリペプチドは、互いに融合したいくつかのネオ抗原、好ましくは5以上、10以上、20以上、30以上、または50以上のネオ抗原を含むことができる。チフス菌Ty21a株をトランスフェクトするのに用いる典型的なプラスミド（pVAX1（商標）発現プラスミド（Invitrogen、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）またはそれに由来するpVAX10など）では、約300までのネオ抗原を発現させることができる。したがってこのポリペプチドは、約5～300、10～300、20～300、30～300、または50～300のネオ抗原、好ましくは10～200、20～200、30～300、または50～200のネオ抗原を含むことができる。ポリペプチドは細胞内で切断されてペプチドになり、ネオ抗原のタイプに応じてMHC I分子またはMHC II分子の表面に提示される。個々のネオ抗原はリンカー（GSリンカー、特別に設計されたリンカー、または2A切断部位など）によって分離することができる。ネオ抗原をコードするDNA分子をIRES配列によって分離することもでき、その結果として別々のポリペプチドが生じる。

5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株は、少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原および／または腫瘍ストローマ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子をさらに含むことができ、前記少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原は治療する患者の固形腫瘍の中で発現する。「少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原および／または腫瘍ストローマ抗原」という表現は、本明細書では、少なくとも1つの腫瘍抗原および／またはストローマ抗原（ただし腫瘍抗原はネオ抗原ではない）を意味する。少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原および／または腫瘍ストローマ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドは、（a）5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含む同じDNA分子によって、またはさらに別のDNA分子によってコードすること、（b）5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットによって、またはさらに別の発現カセットによってコードすること；または（c）5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチド、またはさらに別のポリペプチドであることが可能である。したがってチフス菌Ty21a株は、2個のDNA分子（第1は5つ以上のネオ抗原をコードし、第2は少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原および／または腫瘍ストローマ抗原をコードしている）を用いて形質転換することができる。あるいはチフス菌Ty21a株は、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットと、少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原および／または腫瘍ストローマ抗原をコードする少なくとも1つのさらなる真核生物発現カセットを含む1個のDNA分子を用いて形質転換することができる。あるいはチフス菌Ty21a株は、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含み、少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原および／または腫瘍ストローマ抗原をさらに含む1個のDNA分子を用いて形質転換することもできる。この文脈における非ネオ抗原腫瘍抗原の非限定的な例は、WT1、MSLN、CEA、HER2、EGFR、FBP、GD2、GD3、MAGE-A1、PSCA、PSMA、PD-L1、MUC1、GPC3、およびCMV pp65である。腫瘍抗原として、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原が可能である。「腫瘍特異的抗原」という用語は、本明細書では、腫瘍の中で発現するが正常な組織の中では発現しない抗原を意味する。「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書では、正常な組織と比べて腫瘍の中で過剰発現している抗原に関係する。「腫瘍ストローマ抗原」という用語は、本明細書では、腫瘍ストローマ（その非限定的な例に含まれるのはVEGFR-2とFAPである）の中で発現する抗原を意味する。5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株は、チェックポイント阻害剤抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子も含むことができ、前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤抗原またはそのリガンドが、治療する患者の固形腫瘍の中で過剰発現する。したがってチェックポイント阻害剤抗原として腫瘍抗原（PD-L1など）も可能であり、それは腫瘍細胞の表面で上方調節されていることがしばしばある。5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株の中でのチェックポイント阻害剤抗原の発現について、少なくとも1つの非ネオ抗原腫瘍抗原および／または腫瘍ストローマ抗原と同じことが当てはまる。チェックポイント阻害剤抗原の一例はPD-1またはPD-L1であり、別の例は、CTLA-4、IDO、GITR、OX40、TIM-3、LAG-3、KIR、CSF1R、およびCD137である。この文脈で用いられるDNA分子は発現プラスミドであることが好ましい。PD-L1は腫瘍抗原または腫瘍関連抗原と見なすこともできる。

少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子は、組み換えDNA分子、すなわち操作されたDNAコンストラクトと呼ぶこともでき、起源の異なるDNA断片で構成されていることが好ましい。DNA分子として、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードするオープンリーディングフレームをプラスミドの真核生物発現カセットに導入することによって作製される直線状の核酸または環状DNAプラスミドが可能である（後者が好ましい）。真核生物発現カセットを含むプラスミドは真核生物発現プラスミドと呼ぶこともできる。

本発明の文脈では、「発現カセット」という用語は、その発現を制御する調節配列の制御下にある少なくとも1つのオープンリーディングフレーム（ORF）を含む核酸ユニットを意味する。発現カセットは転写終止シグナルも含むことが好ましい。発現カセットは、標的細胞の中で、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする含まれているオープンリーディングフレームの転写を媒介できることが好ましい。真核生物発現カセットは、典型的には、プロモータ、少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、および転写終止シグナルを含み、これらが真核生物標的細胞の中での発現を可能にする。

特別な実施形態では、単回用量のチフス菌Ty21a株は、約10⁶～約10⁹、より厳密には約10⁶～約10⁸、最も厳密には約10⁶～約10⁷コロニー形成単位（CFU）を含む。

より具体的には、単回用量のチフス菌Ty21a株は、約1×10⁶～約1×10⁹、より厳密には約1×10⁶～約1×10⁸、最も厳密には約1×10⁶～約1×10⁷コロニー形成単位（CFU）を含む。

この文脈では、「約」または「大まかに」という用語は、所与の値または範囲の3倍以内、あるいは2倍以内を意味し、そこには1.5以内が含まれる。

さらに、本発明のチフス菌Ty21a株は、最初の週に2～4回（好ましくは最初の週に4回）投与された後、2～4週間ごとに単回用量のブースト投与がなされることが好ましい。本発明のチフス菌Ty21a株は、1日目と7日目（好ましくは1日目、3日目、5日目、および7日目）に投与された後、2～4週間ごとに単回用量のブースト投与がなされることが好ましい。

特別な実施形態では、治療は、本発明のチフス菌Ty21a株、または本発明のチフス菌Ty21a株を含む医薬組成物またはDNAワクチンの単回または複数回の投与を含む。複数投与の単回用量は同じでも異なっていてもよいが、同じであることが好ましく、本明細書に開示されている範囲内であることが好ましい。一実施形態では、治療は、プライムワクチン接種とブーストワクチン接種を含む。「プライムワクチン接種」という用語は、免疫系に初回刺激を与えるための最初のワクチン接種を意味し、典型的には最初の週のうちに2～4回の単回用量のワクチン接種を含む。「ブーストワクチン接種」という用語は、その後の定期的に反復される単回用量の投与により、初回刺激を与えられた免疫系を追加して刺激することを意味し、典型的には2～4週間ごとの単回用量のブースト投与を含む。特に、治療は、（5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドを含む）少なくとも1つの腫瘍抗原、腫瘍ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードするチフス菌Ty21a株、または本発明のチフス菌Ty21a株を含む医薬組成物を最初の週の治療で2～4回プライムワクチン接種した後、2～4週間ごとに単回用量をブースト投与することを含むことができる。

少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードするチフス菌Ty21a株は、ヒト対象のがんの治療、好ましくはヒト対象の固形腫瘍の治療に使用するためのものであり、その対象は、少なくとも1つの抗生剤を用いた治療を受けたことがあるか、受けている。好ましい一実施形態では、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原は、抗生剤を用いた治療の後のヒト対象（すなわち対象は少なくとも1つの抗生剤を用いて治療されたことがあるのがんの治療、好ましくはヒト対象の固形腫瘍の治療に用いられる。

チフス菌Ty21a株は、抗生剤治療が完了してから適切な期間の後に投与することができる。例えばチフス菌Ty21a株の初回用量は、抗生剤を用いた治療が完了してから約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約1週間、約2週間、約3週間、約1ヶ月、または約2ヶ月、好ましくは約3日、4日、約5日、約6日、約1週間、約2週間、約3週間、または約1ヶ月が経過した後に投与することができる。ある実施形態では、チフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いた治療が完了してから少なくとも3日間経過した後に、すなわち抗生剤を用いた治療が完了してから3日間または3日間超が経過した後に投与される。一実施形態では、（初回用量の）チフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いた治療が完了してから約3日間経過した後に投与される。別の一実施形態では、（初回用量の）チフス菌Ty21a株は抗生剤を用いた治療が完了してから1ヶ月以内に投与される。さらに別の実施形態では、（初回用量の）チフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いた治療が完了してから約1日～1ヶ月後、好ましくは3日～1ヶ月後、より好ましくは3日～2週間後に投与される。抗生剤を用いた治療の後」という表現は、本明細書では、抗生剤治療の完了後、すなわち最終用量の抗生剤の後を意味する。示されている時間または期間または範囲は、投与する初回用量のチフス菌Ty21aに関係するが、治療または投与は必要な限り続けることができる。

理論に囚われなければ、抗生剤は腸マイクロバイオームに影響を与える可能性があり、そのことによって経口投与された本発明のチフス菌Ty21aの取り込みが容易になる可能性がある。チフス菌Ty21aの取り込みが増えると宿主細胞の中での少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原の発現が増加し、したがって免疫系への少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原の提示が増加し、免疫応答、特にがんの治療において特に重要なT細胞を媒介とした免疫応答が増加する可能性が大きい。したがって腸マイクロバイオームを減らす、または腸マイクロバイオームに影響を与えるのに適した任意の抗生剤が、本発明の文脈では適している。抗生剤として、単一の化合物または組み合わせ（スルホンアミドまたはβ-ラクタマーゼ阻害剤を含む組み合わせ調製物など）が可能である。このようなβ-ラクタマーゼ阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、スルバクタムまたはタゾバクタムである。

あるいはチフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いて治療中であるか治療されたことがあるヒト対象に投与することができる。一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いた治療に続けて、または抗生剤治療の完了後に投与される。別の一実施形態では、少なくとも初回用量のチフス菌Ty21a株は抗生剤を用いた治療中に投与することができ、好ましくは最初の週の2～4回の投与（プライムワクチン接種）は抗生剤を用いた治療中に投与することができ、2～4週間ごとが好ましい反復される単回用量ブースト投与は、抗生剤を用いた治療の完了後に投与される。

理論に囚われなければ、患者番号0104にチフス菌Ty21a株と抗生剤を同時に投与すると、腸マイクロバイオームに影響が及ぶことに加え、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株の殺傷または不活性化が起こり、免疫系が刺激され、および／または少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子が食作用を通じて宿主細胞によって取り込まれ、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットがさらに発現して有効な初回刺激が得られた可能性がある。しかし（5ヶ月にわたるワクチンと抗生剤の併用治療の後の）6ヶ月目に患者番号0104で観察された抗原特異的免疫応答の進行に伴って腫瘍体積が3ヶ月目と比べて減少し、9ヶ月後にはベースラインと比べて腫瘍体積がさらに減少したことは、ワクチンが最初の5ヶ月（すなわち抗生剤とともに投与している間）は有効でなく、抗生剤を用いた治療に続く4週間ごとのブーストが抗原特異的免疫応答を誘導するのに十分であったことを示唆する。免疫応答は、チフス菌Ty21a株をプライムワクチン接種として1週間に2～4回投与した後、2～4週間ごとに単回用量のブースト投与を実施するとき、すなわち抗生剤を用いた治療が完了した後にプライムとブーストを投与するとき（抗生剤を用いた治療が完了してから約3日～約1ヶ月後にプライムワクチン接種の初回用量を投与し、それに続けてブーストワクチン接種するときなど）、一層増強される可能性がある。

抗生剤として、広域抗生剤（広域ペニシリン系抗生剤であるアモキシシリン、アンピシリン、またはピペラシリンなど）、または狭域抗生剤（マクロライド系抗生剤（アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、フィダキソマイシン、またはロキシスロマイシンなど）またはバンコマイシン）が可能である。抗生剤として静菌抗生剤も可能であり、その非限定的な例に含まれるのは、テトラサイクリン系とスルホンアミド系、または殺菌抗生剤（ベータ-ラクタム系抗生剤（ペニシリン系抗生剤が含まれる）など）である。

ある実施形態では、抗生剤の選択は、ペニシリン系（例えばアモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、およびフルクロキサシリン）、セファロスポリン系、ポリミキシン系（例えばコリスチン）、リファマイシン系（例えばリファキシミン）、リピアルマイシン系、キノロン系（例えばシプロフロキサシン）、スルホンアミド系、マクロライド系（例えばエリスロマイシン）、リノコサミド系、テトラサイクリン系（例えばテトラサイクリン）、アミノグリコシド系（例えばパロモマイシンとネオマイシン）、環状リポペプチド系（例えばダプトマイシン）、グリシルサイクリン系（例えばチゲサイクリン）、オキソゾリジノン系（例えばリネゾリド）、ニトロジマゾール系（例えばメトロニダゾール）、リピアルマイシン系（例えばフィダキソマイシン）、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えばジアミノピリミジン系（トリメトプリムまたはテトロキソプリムなど））からなるグループから選択される。抗生剤の選択は、ペニシリン系（アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、およびフルクロキサシリンなど）、ポリミキシン系（コリスチンなど）、リファマイシン系（リファキシミンなど）、キノロン系（シプロフロキサシンなど）、スルホンアミド系（スルホメタキソゾールなど）、マクロライド系（エリスロマイシンなど）、テトラサイクリン系（テトラサイクリンなど）、アミノグリコシド系（パロモマイシンなど）、環状リポペプチド系（ダプトマイシンなど）、ニトロジマゾール系（メトロニダゾールなど）、ジアミノピリミジン系（トリメトプリムなど）からなされることが好ましい。特別な一実施形態では、抗生剤の選択は、アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、フルクロキサシリン、コリスチン、リファキシミン、シプロフロキサシン、スルホメタキソゾール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、パロモマイシン、ダプトマイシン、メトロニダゾール、およびトリメトプリムからなされる。当業者は、抗生剤が腸の中で活性であることを理解するであろう。抗生剤が腸の中で優先的に活性である1つの理由は、腸からの吸収の乏しさである可能性があるが、理由はそれに限定されない。したがって抗生剤の好ましい1つの投与経路は経口投与である。

ある実施形態では、抗生剤は、例えば別の抗生剤または別の（増強）薬と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、抗生剤はスルファメトキサゾールまたはトリメトプリムであるか、これらの組み合わせであり、スルファメトキサゾールとトリメトプリムが好ましい。好ましい一実施形態では、抗生剤はコトリモキサゾールである。さらに別の一実施形態では、抗生剤はペニシリン系抗生剤（アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、またはフルクロキサシリンなど）とβ-ラクタマーゼ阻害剤（スルバクタムまたはタゾバクタムなど）の組み合わせである。抗生剤はβ-ラクタマーゼ阻害剤と組み合わされたアンピシリンとピペラシリンであることが好ましい。好ましい一実施形態では、抗生剤はアンピシリンとスルバクタムの組み合わせ、またはピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせである。チフス菌Ty21a株が固有の抗生剤耐性を含む場合、または少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子が抗生剤耐性遺伝子を含む場合には、抗生剤として、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株が耐性である1つ以上の抗生剤を除く任意の抗生剤が可能である。言い換えると、抗生剤は、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株が耐性ではない抗生剤が好ましい。

抗生剤は、好ましくは少なくとも3日間、好ましくは少なくとも1週間、より好ましくは少なくとも2週間にわたって投与される。

本発明に従って治療するがんは固形腫瘍であることが好ましく、その固形腫瘍の選択は、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、中皮腫、膠芽腫、胃がん、肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、子宮頚がん、乳がん、および黒色腫からなされることが好ましい。好ましい一実施形態では、固形腫瘍は、膵臓がんと膠芽腫、より好ましくは膠芽腫である。一実施形態では、がんは再発膠芽腫である。

チフス菌Ty21a株を含む組み合わせ

本発明に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株は1つ以上の他の化合物または治療と組み合わせて投与することもできる。

ある実施形態では、使用するチフス菌Ty21a株に化学療法または放射線療法が付随する。チフス菌Ty21a株は、化学療法または放射線療法による治療前、治療中、または治療後に、または化学療法または放射線療法による治療前と治療中に投与することができる。がんを治療するには、がん幹細胞の完全な消滅が重要である可能性がある。したがって効果を最大にするため、異なる療法アプローチの組み合わせが有効である可能性がある。

本発明のチフス菌Ty21a株と組み合わせて使用できる化学療法剤として、例えばゲムシタビン、アミフォスチン（エチオール）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルヌスチン（BCNU）、ロムスチン（CCNU）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、フォリン酸、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT-11、10-ヒドロキシ-7-エチル-カンプトテシン（SN38）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペンとスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルと、これらの組み合わせが可能である。

本発明で最も好ましい化学療法剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ゲムシタビン、キソルビシン、パクリタキセル（タキソール）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、5-フルオロウラシル、およびブレオマイシン、特にゲムシタビンである。

ある実施形態では、使用するチフス菌Ty21a株に生物学的がん療法が付随する。本発明の文脈では、「生物学的がん療法」という用語は、バイオ医薬品、すなわちタンパク質ベースの薬（抗体を含む）またはワクチンの使用、または細胞（CAR-T細胞、CAR-NK細胞、またはCAR-NKT細胞、または生体外で初回刺激を与えられた抗原提示細胞（APC）など）ベースの治療の利用を伴うがん療法を意味する。

好ましい一実施形態では、VEGFR-2をコードするチフス菌Ty21a株の投与は、WT1、MSLN、CEA、CMV pp65、PD-L1、およびFAPからなるグループから選択される少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードするチフス菌Ty21a株の投与と組み合わされ、場合によりさらに、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と組み合わされる。VEGFR-2をコードするチフス菌Ty21a株と、WT1、MSLN、CEA、CMV pp65、PD-L1、およびFAPからなるグループから選択される少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードするチフス菌Ty21a株は、同時に、または別々に投与することができる。

本発明の文脈では、「同時に」という用語は、チフス菌Ty21aの異なる弱毒化株を同日に、より厳密には12時間以内に、より厳密には2時間以内に投与することを意味する。チフス菌Ty21aの異なる弱毒化株は同じ剤形にしてもよいが、その必要はない。この文脈で用いられる「別々に」という用語は、異なる日に、より厳密には異なる投与計画で、異なる剤形にして投与することを意味する。

特に好ましい一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と組み合わせ、好ましくは前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と同時に、または前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤の前に投与される。少なくとも1つのチェックポイント阻害剤として免疫調節抗体が可能であり、それは、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、GITR、OX40、TIM-3、LAG-3、KIR、CSF1R、およびCD137に対する抗体からなるグループから選択されることが好ましい。

本発明によれば、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする（好ましくは少なくとも1つの腫瘍抗原および／またはストローマ抗原をコードする）少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株はさらに、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤とともに投与することができる。「チェックポイント阻害剤」という用語は、本明細書では「免疫チェックポイント阻害剤」の同義語として用いられる。典型的には、チェックポイント療法は阻害性チェックポイントを阻止して免疫系の機能を回復させる。具体的には、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤として、プログラムされた細胞死タンパク質1（PD-1）、プログラムされた細胞死1リガンド1（PD-L1）、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質（GITR）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー4（OX40）、T細胞免疫グロブリンとムチンドメイン含有-3（TIM-3）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、コロニー刺激因子1受容体（CSF1R）、およびCD137に対する抗体からなるグループから特に選択される抗体が可能である。したがって特に好ましい一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与され、その少なくとも1つのチェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、GITR、OX40、TIM-3、LAG-3、KIR、CSF1R、およびCD137に対する抗体、好ましくはPD-1、PD-L1、および／またはCTLA-4に対する抗体、より好ましくはPD-1またはPD-L1に対する抗体からなるグループから選択される免疫調節抗体であることが好ましい。チェックポイント阻害剤は、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む少なくとも1つのチフス菌Ty21a株と同時に投与すること、または別々に投与することができる。

一実施形態では、チフス菌Ty21a株は、抗生剤を用いた治療後のヒト対象におけるがんの治療に用いるため、少なくともVEGFR-2をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含み、そのチフス菌Ty21a株は経口投与され、そのチフス菌Ty21a株は、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与され、好ましくはその少なくとも1つのチェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、GITR、OX40、TIM-3、LAG-3、KIR、CSF1R、およびCD137に対する抗体、より好ましくはPD-1、PD-L1、および／またはCTLA-4に対する抗体、より一層好ましくはPD-1またはPD-L1に対する抗体からなるグループから選択される。チェックポイント阻害剤は、 VEGFR-2をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む少なくとも1つのチフス菌Ty21a株と同時に、または別々に投与することができる。

少なくとも1つのチェックポイント阻害剤は、市販品の承認されたガレヌス製剤の中に入れて投与することが好ましい。

本発明の文脈では、「同時に」という用語は、1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むチフス菌Ty21aの弱毒化株とチェックポイント阻害剤を同日に、より厳密には12時間以内に、より厳密には2時間以内に投与することを意味する。「別々に」という用語は、この文脈で用いられるときには、異なる日の投与、より厳密には異なる投与計画での異なる剤形での投与を意味する。

チフス菌Ty21a

サルモネラ、特に種サルモネラ・エンテリカの弱毒化株は、哺乳類免疫系に異種抗原を送達するための魅力的な担体である。というのもS. エンテリカ株は、免疫の粘膜経路、すなわち口または鼻を通じて送達できる可能性があるからである。これは、非経口投与と比べて簡単で安全であるという利点を提供する。さらに、サルモネラ株は全身組織と粘膜組織の両方のレベルで強い液性免疫応答と細胞免疫応答を誘導する。バッチ調製のコストは低く、生細菌ワクチンの製剤は非常に安定である。弱毒化は、さまざまな遺伝子（病原性、調節、および代謝の遺伝子が含まれる）の欠失によって実現することができる。

アロ変異によって弱毒化したいくつかのネズミチフス菌株は、動物モデルにおいて、異種抗原のための安全かつ有効な送達用担体であることが示されている。

本発明によれば、サルモネラの弱毒化株は腸チフス株Ty21aであり、チフス菌Ty21aとも称される。生弱毒化チフス菌Ty21a株はTyphoral L（登録商標）（Vivotif（登録商標）としても知られる）（製造者はBerna Biotech Ltd., a Crucell Company、スイス国）の活性成分である。これは、現時点で、腸チフスに対して認可された唯一の生経口ワクチンである。このワクチンが精力的に試験され、患者に対する毒性と第三者への伝染に関して安全であることが証明された（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295）。ワクチンは40を超える国で認可され、腸チフスに対する予防ワクチン接種のため、何千人もの子供を含む数百万の個人で使用されてきた。これは比類ない安全性追跡記録を有する。チフス菌Ty21aが全身の血流に入りうることを示す入手可能なデータは存在しない。したがって生弱毒化チフス菌Ty21aワクチン株は、腸内の免疫系を特異的に標的とすることを可能にする一方で、安全かつよく忍容される。Typhoral L（登録商標）の販売承認番号は1996年12月16日付けのPL 15747/0001である。ワクチンの1用量は、少なくとも2×10⁹個の生きたチフス菌Ty21aコロニー形成単位と、少なくとも5×10⁹個の生きていないチフス菌Ty21a細胞を含有する。

腸チフスに対するこのよく忍容される生経口ワクチンは野生型病原性細菌単離体チフス菌Ty2 の化学的突然変異誘発に由来しており、galE遺伝子の中に機能喪失変異を有する結果としてガラクトースを代謝することができない。この弱毒化細菌株は硫酸塩を還元して硫化物にすることもできない（この硫化物によって弱毒化細菌株が野生型チフス菌Ty2株から識別される）。チフス菌Ty21a株は、その血清学的特徴に関し、この細菌の外膜の多糖であるO9-抗原を含有するが、その代わりにネズミチフス菌の特徴的な構成成分であるO5-抗原を欠いている。この血清学的特徴は、それぞれの試験をバッチリリースのための一群の同定試験に含めるための根拠を支持する。

本発明のチフス菌Ty21a株で用いられる発現カセットは真核生物発現カセットであり、特にCMVプロモータを含む。本発明の文脈では、「真核生物発現カセット」という用語は、真核生物細胞の中でオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを意味する。十分な免疫応答の誘導に必要な量の異種抗原は細菌にとって有害である可能性があり、その結果として細胞死、異種抗原の発現の過剰減弱または喪失に至る可能性があることが示された。細菌ベクターの中で発現せず、標的細胞の中でだけ発現する真核生物発現カセットを用いるとこの毒性問題を克服できる可能性があり、発現するタンパク質は典型的には真核生物グリコシル化パターンを示す。

真核生物発現カセットは、真核生物細胞の中にオープンリーディングフレーム、好ましくはプロモータとポリアデニル化シグナルの発現を制御することのできる調節配列を含む。本発明のチフス菌Ty21a株に含まれる真核生物発現カセットに含まれるプロモータとポリアデニル化シグナルは、免疫化する対象の細胞の中で機能するように選択されることが好ましい。特にヒト用DNAワクチンの製造に適したプロモータの非限定的な例に含まれるのは、サイトメガロウイルス（CMV）（強力なCMV前初期プロモータなど）、シミアンウイルス40（SV40）、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）（HIV長い末端反復（LTR）プロモータなど）、モロニーウイルス、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）からのプロモータ、CMV初期エンハンサエレメントからなる合成CAGプロモータ、ニワトリベータ-アクチン遺伝子のプロモータ、第1エキソン、および第1イントロン、およびウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプタのほか、ヒト遺伝子（ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインなど）からのプロモータである。特別な一実施形態では、真核生物発現カセットはCMVプロモータを含有する。本発明の文脈では、「CMVプロモータ」という用語は、強力な前初期サイトメガロウイルスプロモータを意味する。

特にヒト用DNAワクチンの製造に適したポリアデニル化シグナルの非限定的な例に含まれるのは、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化部位、SV40ポリアデニル化シグナル、およびLTRポリアデニル化シグナルである。特別な一実施形態では、本発明のチフス菌Ty21a株に含まれる真核生物発現カセットは、BGHポリアデニル化部位を含む。

異種ポリペプチドの発現に必要なプロモータやポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントに加え、他のエレメントも真核生物発現カセットに含めることができる。このような追加エレメントにエンハンサが含まれる。エンハンサとして、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサと、ウイルスエンハンサ（CMV、RSV、およびEBVからのエンハンサなど）が可能である。

調節配列とコドンは一般に種に依存するため、タンパク質の産生を最大にすることを目的として、調節配列とコドンは、免疫化する種の中で有効であるように選択することが好ましい。当業者は、所与の対象種（例えばヒト対象など）の中で機能する組み換えDNA分子を作製することができる。

特別な実施形態では、DNA分子、または少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子は、抗生剤耐性遺伝子（カナマイシン抗生剤耐性遺伝子など）、ori（pMB1 oriまたはpUCなど）、および強力なプロモータ（CMVプロモータなど）を含む。特別な実施形態では、組み換えDNA分子、または少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子は、プラスミド（市販のpVAX1（商標）発現プラスミド（Invitrogen、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）に基づくか、それに由来するプラスミドなど）である。

この発現ベクターはpBR322の高コピーpUC複製起点を低コピーpMB1複製起点で置き換えることによって改変することができる。低コピー改変は、代謝負荷を減らし、コンストラクトをより安定にするためになされた。作製された発現ベクターの骨格をpVAX10と名づけた。

特別な実施形態では、発現プラスミドは、制限部位NheIとXhoIの間に位置する多重クローニング部位の部分がない発現ベクターpVAX10の配列と相関している配列番号2のDNA分子を含む（ベクター骨格pVAX10）。

チフス菌Ty21a株は経口投与される。経口投与は非経口投与よりも簡単で、安全で、快適である。しかし本発明のチフス菌Ty21株は他の適切な任意の経路によって投与することもできることに注意されたい。治療に有効な用量が対象に投与されることが好ましく、この用量は、具体的な用途、悪性腫瘍のタイプ、対象の体重、年齢、性別、および健康状態、投与法、および製剤などに依存する。投与は、必要に応じて1回または多数回にすることができる。

5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードするチフス菌Ty21a株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、腸溶カプセルの形態、または適切な他の任意の形態で提供することができる。典型的には、チフス菌Ty21a株は飲料溶液として製剤化される。この実施形態は、改善された患者のコンプライアンスという利点を提供する。飲料溶液は、胃酸を少なくともある程度中和する手段、すなわち胃酸のpHをpH 7に近づける手段を含むことが好ましい。飲料溶液は、本発明のチフス菌Ty21a株を含む緩衝化懸濁液であることが好ましい。特別な一実施形態では、緩衝化懸濁液は、2.6 gの炭酸水素ナトリウム、1.7 gのL-アスコルビン酸、0.2 gのラクトース一水和物、および100 mlの飲料水を含有することが好ましい適切なバッファの中にチフス菌Ty21a株を懸濁させることによって得られる。

特別な実施形態では、チフス菌Ty21a株の単回用量は、約10⁶～約10⁹、好ましくは約10⁶～約10⁸、より好ましくは約10⁶～約10⁷コロニー形成単位（CFU）を含む。

より厳密には、チフス菌Ty21a株の単回用量は、約1×10⁶～約1×10⁹、好ましくは約1×10⁶～約1×10⁸、より好ましくは約1×10⁶～約1×10⁷コロニー形成単位（CFU）を含む。

さらに、本発明のチフス菌Ty21a株は、最初の週に2～4回、好ましくは最初の週に4回投与した後、2～4週間ごとに単回用量のブースト投与をすること、特に1日目と7日目、好ましくは1日目、3日目、5日目、および7日目に投与した後、2～4週間ごとに単回用量のブースト投与をすることが好ましい。

この文脈では、「約」または「大まかに」という用語は、所与の値または範囲の3倍以内、あるいは2倍以内を意味し、そこには1.5以内が含まれる。

可能な副作用の発生に応じ、抗生剤または抗炎症剤を用いた治療を含めることが好ましかろう。

ヒスタミン、ロイコトリエン、またはサイトカインによって媒介される過敏反応に似た有害事象が発生した場合には、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定性、気管支痙攣、および呼吸困難に関する治療の選択肢を利用できる。望ましくないT細胞由来の自己攻撃の場合の治療の選択肢は、幹細胞移植の後の急性と慢性の移植片対宿主病において適用される標準治療スキームに由来する。シクロスポリンとグルココルチコイドが治療の選択肢として提案される。

全身性チフス菌Ty21aタイプの感染症というありそうもない場合には、例えばフルオロキノロン系（シプロフロキサシンまたはオフロキサシンが含まれる）を用いた適切な抗生剤療法が推奨される。胃腸管の細菌感染はそれぞれの薬剤（リファキシミンなど）で治療すべきである。

医薬組成物

さらなる1つの側面では、本発明は、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含む医薬組成物に関する。

本発明の医薬組成物は、溶液、懸濁液、腸溶カプセル、凍結乾燥粉末の形態にすること、または想定される経口での使用に適した他の任意の形態にすることができる。本発明の医薬組成物は、医薬として許容可能な1つ以上の賦形剤をさらに含むことができる。

本発明の文脈では、「賦形剤」という用語は、医薬の活性成分とともに製剤化される天然または合成の物質を意味する。適切な賦形剤に含まれるのは、付着防止剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、香料、着色剤、潤滑剤、流動促進剤、吸着剤、保存剤、溶媒、および甘味剤である。

本発明の文脈では、「医薬として許容可能な」という表現は、生理学的に忍容可能で典型的には哺乳類（例えばヒト）に投与されたときに望ましくない反応を生じさせない分子化合物と医薬組成物の他の成分を意味する。「医薬として許容可能な」という表現は、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、またはアメリカ薬局方か、哺乳類、より厳密にはヒトで使用するための他の一般に認められている薬局方に掲載されていることも意味することができる。

特に、適切な飲料溶液は、典型的には、胃酸を少なくともある程度中和する手段、すなわち胃酸のpHをpH 7に近づける手段を含む。特別な一実施形態では、飲料溶液は、適切なバッファ、好ましくは胃酸を少なくともある程度まで中和するバッファ、好ましくは2.6 gの炭酸水素ナトリウム、1.7 gのL-アスコルビン酸、0.2 gのラクトース一水和物、および100 mlの飲料水を含有するバッファの中に本発明のチフス菌Ty21a株を懸濁させることによって得られる緩衝化懸濁液である。

特別な実施形態では、医薬組成物は、本発明に従って薬として使用され、特にヒト対象におけるがん（好ましくは固形腫瘍）の治療に使用される。特別な実施形態では、医薬組成物は、好ましくは抗生剤を用いた治療の後に薬として使用され、特に、少なくとも1つの抗生剤で治療されたことがあるか治療中であるヒト対象におけるがん（好ましくは固形腫瘍）の治療で使用される。

実施例1：場合により抗生剤Cotrim forte（登録商標）が投与される、VXM01とアベルマブの第I/II相組み合わせ臨床試験

この試験は多施設非盲検第I/II相試験（EudraCT.gov no. 2017-003076-31、NCT03750071）として実施され、腫瘍を切除しテモゾロミドを含む放射線化学療法を実施した後に切除不能な進行性膠芽腫を有する患者（n＝24）と切除可能な進行性膠芽腫を有する患者（n＝6）において有効性と安全性のほか、チェックポイント阻害抗体アベルマブ（抗PD-L1）と組み合わせたVXM01の臨床応答と免疫原性応答が評価される。30人の患者が、ドイツ、オランダ、およびフランスにある8箇所の研究センターに登録される。これまでに9人の切除不能な患者が登録されて分析された。すべての患者で原発腫瘍が外科手術で除去され、これらの患者は、標準療法、すなわち放射線療法とテモゾロミドの組み合わせのもとで再発した。

患者を10⁶または10⁷ CFUのVXM01とアベルマブで治療した。患者にVXM01のワクチンを1、3、5、および7日目に経口投与した後、増悪するまで4週間ごとのブーストを続けた。アベルマブは、進行するまで800 mgの固定用量で2週間ごとに静脈内投与した。研究の終了は60週であった。研究終了後の追跡来院は、1、3、6、12、および24ヶ月などの時点であった。バイオマーカーと免疫原性を調べるためのサンプルを、治療前、治療中、および治療後のいくつかの時点で回収した。

図2Aと3に示されているように、分析した9人の患者のうち6人が疾患の進行を示し、3人が部分奏功（PR）（患者番号0104、0109、および2210）を示し、腫瘍の縮小は50％超であった（図3）。部分奏功であった患者の1人は9ヶ月超の無増悪生存期間（PFS）を示しさえした（患者番号0104）。腫瘍のサイズは、Response Assessment in Neuro-Oncology（RANO）基準に従ってMRIを利用して求めた。部分奏功であったこれら患者のうちの2人（9ヶ月超の無増悪生存期間を示した患者を含む）は、リンパ球のカウント数が少なくて肺炎に関連するリスクがあるという理由で、研究初期のワクチンの接種前と接種時に抗生剤Cotrim forte（登録商標）（スルファメトキサゾールを800 mgとトリメトプリムを160 mg）を受けた（図2B）。VXM01と相互作用する可能性があるという理由でこの抗生剤療法を停止した。特に、患者番号0104はCotrim forte（登録商標）をこの試験の0日目から約20週間受け、患者番号0109はCotrim forte（登録商標）を約4日間受けた。

さらに、VEGFR-2特異的T細胞応答が、患者番号0104からの血液サンプルにおいて、低温保存した末梢血単核細胞を用いたEnzyme Linked Immuno Spot（ELISpot）アッセイを利用し、ベースラインの時点と、3、6、および9ヶ月の治療後に分析された。この患者におけるVEGFR-2特異的免疫応答（図4A）と腫瘍応答（図4B）の経時変化は、VXM01がこの治療の治療効果に主に寄与していることを示している。データは、抗生剤治療の終了後にVEGFR-2特異的免疫応答が明確に増加していることを実証している。さらに、腫瘍のサイズはVEGFR-2特異的免疫応答の増加後に減少した。治療前に取得したサンプルで腫瘍組織免疫組織化学を利用した腫瘍内免疫バイオマーカー分析は、高レベルの腫瘍浸潤CD8陽性T細胞と、低レベルのTreg細胞（FoxP3+細胞）および骨髄由来サプレッサ細胞（CD68+細胞）を示した（図5A）。さらに、PD1またはPD-L1の発現が治療前の患者番号0104の腫瘍サンプルの組織学的切片で検出されることはなかった（図5B）。全体として、データは、VXM01を単独で、またはチェックポイント阻害剤（アベルマブなど）との組み合わせで接種する前の抗生剤による前治療の有益な効果を示唆している。

3ヶ月の時点で部分奏功を示した患者番号0109（図2、3と表2）では、ベースラインにおける腫瘍内免疫バイオマーカー分析は、高レベルの腫瘍浸潤CD8陽性T細胞とMDCSを示したが、Treg細胞（FoxP3+細胞）は見られなかった（図6A）。患者番号0109は抗生剤で数日間治療しただけだが、それがこの患者における良好な転帰に寄与した可能性がある。

実施例2：VXM01とニボルマブの第I相組み合わせ臨床試験

VXM01をニボルマブ（抗PD-1）と組み合わせて使用することの有益な効果は、難治性膠芽腫を有する患者における第I相臨床試験でも観察された（図9）。さらに、VXM01と抗CTLA-4抗体の相乗効果はすでにWO 2016/202459の中でマウスにおいて報告されている。したがって、VXM01を接種する前の抗生剤による前治療の有益な効果は、他のチェックポイント阻害剤（抗PD-1や抗CTLA-4抗体、またはそれ以外のものなど）と組み合わせて用いるときにも予想される。

Claims (19)

1. 抗生剤を用いた治療後のヒト対象におけるがんの治療における使用のための、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含み、経口投与されるチフス菌Ty21a株。
2. ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）、ヒトメソテリン（MSLN）、ヒトCEA、CMV pp65、ヒトPD-L1、ヒトVEGFR-2、およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）からなるグループから選択される少なくとも1つの抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む、請求項1に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
3. 少なくとも1つのネオ抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセット、好ましくは、5つ以上のネオ抗原を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む、請求項1に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
4. 前記5つ以上のネオ抗原が、前記対象の固形腫瘍の中で同定された腫瘍特異的抗原である、請求項3に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
5. 少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と組み合わせ、好ましくは前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤と同時に、または前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤よりも前に投与される、請求項1～4のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
6. 前記少なくとも1つのチェックポイント阻害剤が、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、GITR、OX40、TIM-3、LAG-3、KIR、CSF1R、およびCD137に対する抗体からなるグループから選択される免疫調節抗体である、請求項5に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
7. （a）抗生剤を用いた治療が完了してから少なくとも3日間経過した後に投与される、および／または（b）抗生剤を用いた治療が完了してから1ヶ月以内に投与される、請求項1～6のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
8. 前記抗生剤が、少なくとも1つの腫瘍抗原、ストローマ抗原、および／またはチェックポイント阻害剤抗原をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含む前記チフス菌Ty21a株が耐性でない抗生剤である、請求項1～7のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
9. 前記抗生剤が組み合わせ調製物である、請求項1～8のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
10. 前記抗生剤が、ペニシリン系、セファロスポリン系、ポリミキシン系、リファマイシン系、リピアルマイシン系、キノロン系、スルホンアミド系、マクロライド系、リノコサミド系、テトラサイクリン系、アミノグリコシド系、環状リポペプチド系、グリシルサイクリン系、オキソゾリジノン系、ニトロジマゾール系、リピアルマイシン系、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤からなるグループから選択される、請求項1～9のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
11. 前記抗生剤が、スルファメトキサゾールまたはトリメトプリム、またはこれらの組み合わせである、請求項10に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
12. 前記抗生剤がコトリモキサゾールである、請求項11に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
13. 前記治療に化学療法または放射線療法が付随する、請求項1～12のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
14. 前記がんが固形腫瘍である、請求項1～13のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
15. 前記固形腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、中皮腫、膠芽腫、胃がん、肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、子宮頚がん、乳がん、および黒色腫から選択される、請求項14に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
16. 前記固形腫瘍が膠芽腫である、請求項15に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
17. 前記固形腫瘍が再発膠芽腫である、請求項16に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
18. （a）単回用量が、約10⁶～約10⁹、より厳密には約10⁶～約10⁸、最も厳密には約10⁶～約10⁷コロニー形成単位（CFU）を含む；および／または
    （b）最初の週に2～4回投与された後、単回用量のブーストが2～4週間ごとに投与される、請求項1～17のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。
19. 医薬組成物の形態であり、医薬として許容可能な少なくとも1つの賦形剤をさらに含む、請求項1～18のいずれか1項に記載の使用のためのチフス菌Ty21a株。

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