JP2023510113A - 神経膠芽腫を処置するための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、免疫療法によって効果的に処置され得る神経膠芽腫患者集団を同定することによる、新規な治療方法を提供する。また、治療の有効性を高めるために、免疫チェックポイント療法（ICB）と併用され得る治療法が提供される。本開示の局面は、対象が対象由来の生物学的サンプル中で低いCD73発現を有すると決定された後、免疫チェックポイント遮断（ICB）療法を対象に投与する段階を含む、対象における神経膠芽腫を処置する方法に関する。

Description

本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2019年12月19日に出願された米国特許仮出願第62/950,509号への優先権を主張する。

II. 発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーおよび治療的処置法の分野に関する。

III. 背景
過去10年間、標的指向型療法および免疫療法の使用を通して、がん治療において大幅な進歩が達成された。チェックポイント遮断免疫療法は、CTLA-4およびPD-1を伴う免疫抑制リガンド－受容体相互作用を遮断することにより、主要な抑制シグナルのTリンパ球を救援し、ひいては、基礎にあるT細胞媒介抗腫瘍免疫活性を増強する。しかし、抑制シグナルの遍在的な救援はまた、自己抗原に対して反応するTリンパ球をも活性化して、自己耐性の喪失および免疫関連の有害事象を招くことがある。高度な毒性を発現する患者は一般的に、一時的または永久的な治療の中断を必要とし、毒性を管理するために長期間の重い免疫抑制を必要とする場合がある。抗CTLA-4および／または抗PD-1治療に対して重度ないし生命を脅かす程度の毒性を発現する高い頻度ならびに患者が応答するかどうかに関する予測不能性は、臨床医がこの治療形態を処方する際の制限要因となっている。

免疫チェックポイント阻害療法に対する患者応答に関連するいくつかの要因が発見されているが、免疫チェックポイント遮断療法による毒性の予測因子および免疫チェックポイント遮断療法に対する応答者の予測因子が当技術分野において必要とされている。1つまたは複数のバイオマーカーに基づいて、患者を、チェックポイント遮断療法に応答する可能性が高い患者とその可能性が低い患者とに層別化することは、疾患のさらなる拡がりの前に最も効果的な治療を患者に提供することができるため、患者にとってより効果的かつ治療的な処置法を提供するであろう。

本開示は、免疫療法によって効果的に治療され得る神経膠芽腫患者集団を同定することによる、新規な治療方法を提供する。また、治療の有効性を高めるために、免疫チェックポイント療法（ICB）と併用され得る治療が提供される。したがって、本開示の局面は、対象が対象由来の生物学的サンプル中で低いCD73発現を有すると決定された後、免疫チェックポイント遮断（ICB）療法を対象に投与する段階を含む、対象における神経膠芽腫を処置する方法に関する。さらなる局面は、対象が対象由来の生物学的サンプル中で高いCD73発現を有すると決定された後、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストから選択される作用物質を対象に投与する段階を含む、対象における神経膠芽腫を処置する方法に関する。

さらなる局面は、神経膠芽腫を有する対象におけるICB療法に対する応答を予測する方法であって、（a）対象由来のサンプル中のCD73の発現レベルを決定する段階；（b）対象由来のサンプル中のCD73の発現レベルを対照と比較する段階；および（c）（i）ICB療法に応答しないと決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて低下したCD73の発現レベルが対象由来の生物学的サンプル中で検出された後；または（ii）ICB療法に応答すると決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて低下したもしくは有意に異ならないCD73の発現レベルが対象由来の生物学的サンプル中で検出された後、対象がICB療法に応答すると予測する段階；あるいは（d）（i）ICB療法に応答すると決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて増大したCD73の発現レベルが対象由来のサンプル中で検出された後；または（ii）ICB療法に応答しないと決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて増大したもしくは有意に異ならないCD73の発現レベルが対象由来の生物学的サンプル中で検出された後、対象がICB療法に応答しないと予測する段階を含む方法に関する。

なおさらなる局面は、神経膠芽腫を有する対象に由来する生物学的サンプル中のCD73を検出する段階を含む方法に関する。いくつかの態様では、低レベルのCD73発現が検出される。いくつかの態様では、高レベルのCD73発現が検出される。

いくつかの態様では、生物学的サンプルは、単離された免疫細胞を含む。いくつかの態様では、生物学的サンプルは、単離されたマクロファージを含む。いくつかの態様では、生物学的サンプルは血清サンプルを含む。いくつかの態様では、生物学的サンプルは、免疫細胞の単離された画分を含む。いくつかの態様では、生物学的サンプルは生検材料を含む。いくつかの態様では、生物学的サンプルは、組織細胞および免疫細胞を含むサンプルを含む。いくつかの態様では、組織は神経膠芽腫腫瘍からの細胞を含む。いくつかの態様では、CD73の発現は、対照に比べ、免疫細胞中で低いと決定される。いくつかの態様では、CD73の発現は、対照に比べ、免疫細胞中で高いと決定される。いくつかの態様では、高いCD73発現レベルまたは低いCD73発現レベルは、対象由来の生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを対照と比較することにより、対象由来の生物学的サンプル中で決定されたものである。いくつかの態様では、低い発現レベルとは、対照に比べ、対象由来の生物学的サンプル中で検出されたCD73+免疫細胞の低い数を指す。いくつかの態様では、高い発現レベルとは、対照に比べ、対象由来の生物学的サンプル中で検出されたCD73+免疫細胞の高い数を指す。例えば、低い発現とは、基準、ベースラインまたは対照に比べ、生検材料などの生物学的サンプル中で検出されたCD73+免疫細胞の低い数を指し得る（該基準、ベースラインまたは対照は、免疫療法に応答すると決定されている対象に由来する生物学的サンプル中で検出されたCD73+免疫細胞の数を表す）、または、対照の0.5、1、2もしくは3標準偏差以内である、または対照と有意に異ならない。同様に、高い発現とは、基準、ベースラインまたは対照に比べ、生検材料などの生物学的サンプル中に検出されたCD73+免疫細胞の高い数を指し得る（該基準、ベースラインまたは対照は、免疫療法に応答すると決定されている対象に由来する生物学的サンプル中で検出されたCD73+免疫細胞の数を表す）、または、対照の少なくとも1.5、2、3、4、5、6、10、20、100、500または1000倍である。いくつかの態様では、対象由来の生物学的サンプルは、免疫細胞を他の細胞から単離するために分画されてもよい。いくつかの態様では、生物学的サンプルは、免疫細胞を腫瘍細胞から単離するために分画され、CD73の発現レベルまたはCD73+細胞の量は、単離された画分中で決定される。いくつかの態様では、生物学的サンプルは、腫瘍細胞を含まない、腫瘍細胞を本質的に含まない、または免疫細胞が濃縮され、かつ腫瘍細胞が枯渇されている画分である。

いくつかの態様では、ICB療法は単独療法または併用ICB療法を含む。いくつかの態様では、対象は、ICB療法の候補であると決定されている。いくつかの態様では、対象は、現在ICB療法で処置されているか、少なくとも一度はICB療法を受けたことがある。いくつかの態様では、対象は、ICB療法で処置されたことがない。いくつかの態様では、対象は、以前の処置に対して非応答性であると決定されている。

本開示のいくつかの態様では、方法は、対象をICB療法で処置する段階を含む、またはさらに含む。いくつかの態様では、対象は、対象由来の生物学的サンプル中のCD73の検出レベルに基づいてICB療法に対して応答すると予測されている対象である。いくつかの態様では、ICB療法は、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、B7-1および／またはB7-2の阻害物質を含む。いくつかの態様では、ICB療法は抗PD-1モノクローナル抗体および／または抗CTLA-4モノクローナル抗体を含む。いくつかの態様では、ICB療法は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、イピリムマブまたはトレメリムマブのうちの1つまたは複数を含む。

いくつかの態様では、方法はさらに、少なくとも1つの追加的抗がん処置を投与する段階を含む。いくつかの態様では、少なくとも1つの追加的抗がん処置は、外科療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、小分子療法、受容体キナーゼ阻害物質療法、抗血管新生療法、サイトカイン療法、凍結療法または生物学的療法である。いくつかの態様では、方法はさらに、対象へのICB療法の投与を含む。

いくつかの態様では、対照はカットオフ値または正規化された値を含む。いくつかの態様では、発現レベルは、正規化された発現レベルを含む。いくつかの態様では、CD73発現は、イムノアッセイによって検出されたものである。いくつかの態様では、低い発現レベルは、対照に比べて低下していると決定される正規化された発現レベルを含む。いくつかの態様では、低い発現レベルは、対照に比べて増大していると決定される正規化された発現レベルを含む。

いくつかの態様では、ICB療法の前に、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストが投与される。いくつかの態様では、ICB療法と、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストとが同時に投与される。いくつかの態様では、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストは、ICB療法の前に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23もしくは24時間、日間または週間（またはこの中の任意の導出可能な範囲）投与される。いくつかの態様では、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストは、ICB療法の投与から少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23もしくは24時間、日間または週間（またはこの中の任意の導出可能な範囲）以内に投与される。

いくつかの態様では、CD73阻害物質またはCD39阻害物質は抗CD73抗体または抗CD39抗体をそれぞれ含む。いくつかの態様では、抗体は、遮断抗体を含む、および／または抗体依存性細胞傷害性を誘導する。いくつかの態様では、A2ARアンタゴニストは、ATL-444、イストラデフィリン（KW-6002）、MSX-3、プレラデナント（SCH-420,814）、SCH-58261、SCH-412,348、SCH-442,416、ST-1535、カフェイン、VER-6623、VER-6947、VER-7835、ビパデナント（BIIB-014）、ZM-241,385またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの態様では、方法はさらに、検出されたCD73の発現レベルを対照と比較する段階を含む。いくつかの態様では、対照は、ICB療法に応答しない対象に由来する生物学的サンプルを含む。いくつかの態様では、対照は、ICB療法に応答する対象に由来する生物学的サンプルを含む。いくつかの態様では、対象は、対照よりも高い発現レベルを有すると決定される。いくつかの態様では、対象は、対照よりも低い発現レベルを有すると決定される。いくつかの態様では、対象は、対照と有意に異ならない発現レベルを有すると決定される。

本願全体を通して、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられる装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために、細胞および分子生物学の分野におけるその明白かつ通常の意味にしたがって用いられる。

用語「含む」とともに使用される単数形不定冠詞（「a」および「an」）の使用は「1つの」を意味し得るが、それはまた、「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」および「1つまたは1よりも多い」の意味とも矛盾しない。

本明細書において使用するとき、用語「または」および「および／または」は、互いに組み合わせたまたは互いを除いた複数の成分を記載するために使用される。例えば、「x、y、および／またはz」は、「x」のみ、「y」のみ、「z」のみ、「x、y、およびz」、「（xおよびy）またはz」、「xまたは（yおよびz）」、または「xまたはyまたはz」を指し得る。具体的には、x、y、またはzが態様から具体的に除外されてもよいと考慮される。

用語「含む」（および含むの任意の形、例えば「含み」）、「有する」（および有するの任意の形、例えば「有し」）、「包含する」（および包含するの任意の形、例えば「包含し」）、「特徴とする」（および特徴とするの任意の形、例えば「特徴とし」）または「含有する」（および含有するの任意の形、例えば「含有し」）は包括的または非限定的であり、挙げられていない追加的要素または方法段階を除外しない。

組成物およびその使用のための方法は、本願全体を通して開示される成分または段階のいずれか「を含む」、「から本質的になる」または「からなる」ことができる。語句「からなる」は、特定されていない任意の要素、段階または成分を除外する。語句「から本質的になる」は、記載される主題の範囲を、特定された材料または段階およびその基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しない材料または段階に限定する。用語「含む」に関連して記載された態様が、用語「からなる」または「から本質的になる」の文脈において実現されてもよいと考慮される。

具体的に、本発明の1つの態様に関して記載された任意の限定が本発明の他の任意の態様に適用されてもよいことが考慮される。さらに、本発明の任意の組成物を本発明の任意の方法に使用してもよく、本発明の任意の方法を使用して、本発明の任意の組成物を製造または利用してもよい。実施例に記される態様の局面はまた、異なる実施例の他の箇所または本願の他の箇所、例えば、発明の概要、態様の詳細な説明、特許請求の範囲、および図面凡例の説明に記載される態様に関して実現されてもよい。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、発明の特定の態様を示すものの、例示のためだけに与えられることを理解すべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を構成し、そして、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。これら図面のうちの1つまたは複数を、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、本発明をより深く理解することができる。

図1A～F. 腫瘍浸潤白血球表現型の同定。TILをCyTOFによって分析し、生存CD45+細胞に対してPhenoGraphアルゴリズムを使用して同定した。A：マスサイトメトリーデータの手動ゲーティングによって得られた生きたシングレットからのCD3、CD4、CD8またはCD68陽性細胞およびCD4⁺FoxP3⁺細胞の頻度を示す箱ひげ図（n＝66）。図示するすべての箱ひげ図において、箱は四分位範囲を示し、中央のバーは中央値を示し、ひげは範囲を示す。個々の患者がドットで表されている。マン・ホイットニー検定（両側）によってp値を計算した。p.adjust関数を使用してq値を計算した。q＜0.05を統計的に有意とみなした。B：NSCLC（n＝11）、RCC（n＝11）、CRC（n＝11）、PCa（n＝5）およびGBM（n＝7）患者から得られたCD45⁺細胞に対する本発明者らのPhenoGraphベースのクラスタリング手法による、様々な免疫マーカーの正規化された発現を示すヒートマップ。右のカラーバーはそれぞれのメタクラスターの白血球系統を示す（骨髄：CD3^-CD68⁺；T細胞：CD3⁺；NK細胞：CD3^-CD56⁺）。右の棒グラフはそれぞれのメタクラスターの相対頻度を示す。C：免疫メタクラスター中の腫瘍タイプの分布のシャノンエントロピーを示す箱ひげ図。1000個の細胞の間での腫瘍の経験的分布に関してシャノンエントロピーを計算した。この手順をクラスターごとに1000回繰り返して、エントロピーのクラスターサイズ補正された標準誤差をブートストラップした（n＝1000）。平均エントロピー順に並べた、各クラスター中のエントロピー値の箱ひげ図。破線は、クラスター内の腫瘍タイプ分布がデータセット中の全細胞の腫瘍タイプの分布と一致する場合の、予想されるエントロピー値を示す。D：腫瘍タイプ間でのそれぞれのCD4およびCD8T細胞メタクラスターの頻度を示す箱ひげ図（患者数：GBM＝7、NSCLC＝11、RCC＝11、CRC＝11、PCa＝5）。14のメタクラスターに関してクラスカル・ウォリス検定を実施し、ベンジャミニ・ホッホベルク（BH）法を使用して多重比較のために補正した。E：右に示すカラーコードを使用する、個々の患者におけるメタクラスター頻度を可視化する積み上げ棒グラフ。左の樹状図は、患者メタクラスター頻度の階層的クラスタリングを示す。黒いフレームは、このクラスタリング手法によって同定された患者サブグループを強調する。左のカラーバーは、以下に示すカラーコードを使用して個々の患者の腫瘍タイプを示す。F：Eで同定された患者サブグループの間でのT細胞メタクラスター頻度を示す箱ひげ図。グループI＝11、グループII＝8、グループIII＝9。図示されたすべての箱ひげ図において、箱は四分位範囲を示し、中央のバーは中央値を示し、ひげは範囲を示す。個々の患者がドットで表されている。クラスカル・ウォリス検定を使用して、サブグループ間で比較を実施した。マン・ホイットニー検定をペアワイズ比較に使用した。有意なペアワイズ比較が示されている（FDR＝5％）。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図2A～E. 図2：CD73^hiマクロファージがGBM中に特異的に存在する。複数の腫瘍タイプの患者において骨髄系細胞（CD3^-CD68⁺）をCyTOFによって分析し、さらに、GBM中のsc-RNAseqによって特性評価した。A：腫瘍タイプ間でのL1、L5、L8およびL17メタクラスターの頻度を示す箱ひげ図（患者数：NSCLC＝11、RCC＝11、CRC＝11、PCa＝5、GBM＝7）。クラスカル・ウォリス検定（異なる腫瘍タイプ間）およびベンジャミニ・ホッホベルク法を使用してq値を計算した。マン・ホイットニーU検定を使用してペアワイズ比較を実施し、ベンジャミニ・ホッホベルクを使用して多重比較のために補正した。有意なペアワイズ比較が示されている（FDR＝5％）。B：未処置のGBM腫瘍（n＝4）からのTILをsc-RNA seqによって分析し、MAGICアルゴリズムを使用して同定した。MAGICによって同定された白血球クラスター中の選択されたマーカーの正規化された発現を示すヒートマップ。黒の矢印はCD73^hi骨髄系細胞クラスターを示す。C：上トップパネル：クラスター表現型およびCD73の相対的発現レベルをシングルセルレベルで示す、右に色凡例があるt-SNEマップ。楕円形の区域がCD73^hiマクロファージクラスター（R3、R7、R14、R17）を強調している。下ボトムパネル：血液由来のマクロファージ遺伝子シグネチャーおよびミクログリア遺伝子シグネチャーの相対的な発現レベルをシングルセルレベルで示す、右に色凡例があるt-SNEマップ（n＝4）。D：MAGICによって同定されたCD73^hiマクロファージクラスター上のケモカイン受容体の正規化された発現を示すヒートマップ。黒の矢印はCD73^hi骨髄系細胞クラスターを示す。E：上パネル：免疫抑制および免疫刺激遺伝子シグネチャーの相対的な発現レベルをシングルセルレベルで示すt-SNEマップ。下ボトムパネル：低酸素誘導遺伝子シグネチャーの相対的な発現レベルを示すt-SNEマップ（n＝4）。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図3A～G. 図3：CD73^hi骨髄系細胞は抗PD-1治療後も持続し、TCGA-GBMコホートにおける全生存期間の短縮と相関する。差次的に発現した遺伝子（z＞3.0、45の遺伝子）のCD73^hiマクロファージ遺伝子シグネチャー（補足表3）。MAGICによって同定されたCD73^hiマクロファージ中で上位の差次的に発現した遺伝子の正規化された発現（zスコア＞2.0）を示すヒートマップ。B：Aにおいて導出された45個の遺伝子シグネチャーの発現中央値よりも上（青＝高発現、患者数n＝263）または下（赤＝低発現、患者数n＝262）の、TCGAデータベースからのGBM患者の全生存期間を示すカプラン・マイヤープロット。ログランクp値（両側）およびハザード比（HR）が表示されている。免疫チェックポイント療法未経験患者（未処置）およびペムブロリズマブ処置患者（ペムブロ）からの腫瘍のシングルセル懸濁液中の白血球表現型をマスサイトメトリーによって分析し、生存CD45⁺細胞に対してPhenoGraphアルゴリズムを使用して同定した。C：ペムブロリズマブ処置患者（n＝5）または未処置の患者（n＝7）におけるGBM浸潤白血球の表現型類似度をシングルセルレベルで示すt-SNEマップ。D：ペムブロリズマブによる治療後（n＝5）またはICT未経験GBM患者（n＝7）のGBM腫瘍からのTILをマスサイトメトリーによって分析し、生存CD45⁺細胞に対してPhenoGraphアルゴリズムを使用して同定した。PhenoGraphによって同定されたCD45⁺メタクラスター上の選択されたマーカーの正規化された発現を示すヒートマップ。E～F：ペムブロリズマブ処置および未処置GBM患者におけるCD73^hi骨髄メタクラスターおよびT細胞クラスターの頻度を示す積み上げ棒グラフ。G：カスタマイズされた739遺伝子Nanostringパネルを使用した、未処置の患者（n＝6）および抗PD-1処置患者（n＝4）由来の腫瘍標本のGSEAを使用したトランスクリプトームプロファイリングの代表的なヒートマップ。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図4A～D. CD73の非存在がGBMのマウスモデルにおいてICTの効力を高める。A：ICT処置ありの場合およびICT処置なしの場合で、GL-261腫瘍株をCD73^-/-および野生型マウスに同所的に接種してから14日目の代表的なMRI画像。図は3つの独立した実験を表す。B：GL-261神経膠腫を同所的に注射された、抗PD-1のみ、抗PD-1と抗CTLA-4とで処置された野生型およびCD73^-/-（n～10マウス）または未処置マウスの全生存期間を示すカプラン・マイヤープロット。ログランク検定（両側）を使用してp値を計算した。詳細に関しては補足表2を参照されたい。C：GBM腫瘍を有するWTマウスとCD73^-/-マウスの両方においてFlowSOMによって決定された腫瘍内CD45⁺免疫集団を示すヒートマップ。右上のカラーコードは、zスコア化された発現値を示す。右下の凡例は、色付けされた各クラスターの細胞タイプを示す。D：白血球サブセットの存在比を示す箱ひげ図（1グループ5匹）。データは2つの独立した実験を表す。箱ひげ図のデータは平均±SEMである。ペアワイズ比較のために、マン・ホイットニーU検定（両側）を使用してp値を計算した。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 手動ゲーティングによる免疫細胞サブセットの同定のためのゲーティング戦略。等高線プロットが、図1aにおける手動でゲーティングされたCD3、CD4、CD8およびFoxP3陽性集団を画定するために使用されたゲーティング戦略を示す。 図6A～D. 腫瘍浸潤白血球の不均一性。A：多腫瘍比較に使用されたマスサイトメトリーサンプルの生きたCD45+シングレットの絶対数を示す散布図。破線はサンプル包含のための600細胞しきい値を示す。B：様々な腫瘍タイプ内の同定されたメタクラスター頻度の分布を以下に示すカラーコードで示す積み上げ棒グラフ（左）。腫瘍タイプごとに（右上パネル）（色凡例は右に示す）またはメタクラスターごとに（右下パネル）（色凡例は左パネルに示す）色分けされた腫瘍タイプあたりランダムに選択された10,000個の細胞のt-SNEマップ。C：図1におけるPhenoGraphベースのクラスタリング手法からの腫瘍タイプの間でのCD45+免疫メタクラスター頻度を示す箱ひげ図（患者数、GBM＝7、NSCLC＝11、RCC＝11、CRC＝11およびPCa＝5）。図示されたすべての箱ひげ図において、箱は四分位範囲を示し、中央のバーは中央値を示し、ひげは範囲を示す。個々の患者がドットで表されている。D：図1dに関連して左に示すそれぞれのメタクラスター上の免疫マーカーの発現を示すヒストグラム。 図7A～C. PD-1^hi T細胞は、臨床応答者において免疫チェックポイント療法中に増殖する。イピリムマブとニボルマブとの併用ICTを受けている腎細胞がん（RCC）患者由来のPBMC懸濁液中のT細胞表現型をマスサイトメトリーによって分析し、生存CD45+細胞に対してPhenoGraphアルゴリズムを使用して同定した（n＝14）。A：PhenoGraphによって同定されたCD45+メタクラスター上の選択されたマーカーの正規化された発現を示すヒートマップ。B：応答者（n＝7）および非応答者（n＝7）における、併用ICTによる処置の前（T0）および2サイクル後（T2）または4サイクル後（T4）の、CD4+T細胞クラスターP33およびCD8+T細胞クラスターP24の頻度。マン・ホイットニーU検定（両側）を使用してp値を計算した。出力されたp値を用いてq値を計算した。C：PBMCサンプルおよびTILからのクラスターの相関行列を表示するヒートマップ。各実験間で共有された全29のチャネルにわたってzスコア化値を使用して、各RCC PBMCクラスター（「方法」に記載されるしきい値を超える）と各TILクラスターとの間のピアソン相関係数を計算した（別々の正規化を考慮するために、RCC PBMCおよびTILクラスターそれぞれに関して）。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図8A～C. 腫瘍タイプ間でのT細胞表現型の分布。免疫チェックポイント療法未経験患者由来の腫瘍のシングルセル懸濁液中のT細胞表現型をマスサイトメトリーによって分析し、生存CD45+CD3+細胞に対してPhenoGraphアルゴリズムを使用して同定した。A：免疫チェックポイント療法未経験患者（n＝37）由来の腫瘍シングルセル懸濁液中の生きたCD45+CD3+シングレットの絶対数を示す散布図。破線は、サンプル包含のための600細胞しきい値を示す（「方法」を参照）。B：腫瘍タイプの間での選択されたT細胞メタクラスターの頻度を示す箱ひげ図（患者数：NSCLC n＝10、RCC n＝11、CRC n＝9）。サンプルは、図2、3、5で使用されたサンプルと同一である。C：左に示すそれぞれのCD4およびCD8T細胞メタクラスター上の免疫マーカーの発現を示すヒストグラム。図1Fに関連。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9A～H. 骨髄メタクラスターの特性評価。A：左および図2Aに示すそれぞれのメタクラスター上の免疫マーカーの発現を示すヒストグラム。B：PhenoGraphによって同定されたL8メタクラスターに表現型的に類似する骨髄系細胞を手動で画定するために使用されたゲーティング戦略を示す等高線プロット。図5に概説されたゲーティング戦略にしたがって、すべての細胞をCD45+生細胞上でゲーティングした。C：手動でゲーティングされたL8サブセット頻度をCD45+生細胞の割合として示す箱ひげ図（患者数、GBM＝7、NSCLC＝11、RCC＝11、pCRC＝7、mCRC＝4、PCa＝5）。ペアワイズ比較のために、マン・ホイットニー検定によってp値を計算した。ベンジャミニ・ホッホベルク法を使用して、出力されたp値とでq値を計算した。D：CyTOFによる、正常なドナーPBMC（青）およびGBM-TIL（赤）におけるCD68+細胞のCD73発現のヒストグラムオーバーレイ。E：GBM患者サンプルの代表的なIHC画像。F：GBM患者サンプル（n＝7）のIHC切片中のCD3+、CD8+およびCD68+細胞の密度（個／mm²）を示す箱ひげ図。G：GBM腫瘍サンプル（n＝6）における多色IFの代表的な画像。H：全有核細胞（n＝6）中のCD68+細胞およびCD68+CD73+細胞の割合を示す箱ひげ図。 図9-1の説明を参照のこと。 図10A～B. 未処置のGBM患者の第一のコホートと第二のコホートとの間の腫瘍浸潤白血球表現型の類似性。免疫チェックポイント療法未経験患者由来の腫瘍のシングルセル懸濁液中の白血球表現型をマスサイトメトリーによって分析し、生存CD45+細胞に対してPhenoGraphアルゴリズムを使用して同定した。A：未処置のコホート1患者（n＝7）および未処置のコホート2患者（n＝9）由来の腫瘍のシングルセル懸濁液中で示されたCD45+細胞の頻度を示すグループ化された箱ひげ図。箱は四分位範囲を示し、中央のバーは中央値を示し、ひげは範囲を示す。個々の患者がドットで表されている。B：コホート2患者からPhenoGraphによって同定されたCD45+メタクラスター上の選択されたマーカーの正規化された発現を示すヒートマップ。 図11A～B. ペムブロリズマブ処置および未処置のGBM患者における腫瘍浸潤白血球表現型の分布。免疫チェックポイント療法未経験患者（未処置）およびペムブロリズマブ治療患者（ペムブロ）由来の腫瘍のシングルセル懸濁液中の白血球表現型をマスサイトメトリーによって分析し、生存CD45+細胞に対してPhenoGraphアルゴリズムを使用して同定した。A：未処置の患者（n＝8）およびペムブロ処置患者（n＝5）由来の腫瘍のシングルセル懸濁液中の生きたCD45+シングレットの絶対数を示す散布図。B：未処置の腫瘍（n＝7）およびペムブロリズマブ処置腫瘍（n＝5）においてPhenoGraphによって同定されたCD45+免疫メタクラスター頻度を示すグループ化された箱ひげ図。 図12A～E. 未処置の野生型およびCD73^-/-マウスに同所的に注射されたGL-261神経膠腫からの腫瘍浸潤白血球表現型の分布。CD73^-/-およびWTマウスにGL-261神経膠腫を頭蓋内接種した。A：左：WTマウス（青）およびCD73^-/-マウス（赤）においてMRIによって決定された腫瘍サイズを示す箱ひげ図。データは2つの独立した実験を表す（1グループ5匹）。マン・ホイットニーU検定を使用してp値を計算した。箱は四分位範囲を示し、中央のバーは中央値を示し、ひげは範囲を示す。右：腫瘍細胞接種から14日目の代表的なMRI画像が示されている。矢印は腫瘍の大きさを示す。B：GL-261神経膠腫を同所的に注射された未処置の野生型またはCD73^-/-（n＝10）の全生存期間を示すカプラン・マイヤープロット。ログランク検定（両側）を使用してp値を計算した。示されるデータは2つの実験を表す。C：FlowSOM分析による、GBM腫瘍を有するWTマウスとCD73^-/-マウスの両方における腫瘍内CD11b+免疫集団を示す代表的なヒートマップ。D：右のクラスターは、有意な変化を示すクラスターを示す。マン・ホイットニーU検定（両側）を使用してp値を計算し、ベンジャミニ・ホッホベルク法を使用して多重比較のために補正した。データは2つの独立した実験を表す（1グループ5匹）。E：ヒートマップによって同定されたCD45+免疫クラスター頻度を示す棒グラフ（1グループ5匹）。箱は四分位範囲を示し、中央のバーは中央値を示し、ひげは範囲を示す。個々のマウスがドットで表されている。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。

発明の詳細な説明
抗CTLA-4および抗PD-1/PD-L1による免疫チェックポイント療法（ICT）は、多くの固形腫瘍の処置に革命をもたらした。しかし、ICTの臨床効力は、特定の腫瘍タイプのある患者のサブセットに限られる（1,2）。コンビナトリアル免疫チェックポイント戦略を用いた複数の臨床試験が進行中であるが、免疫チェックポイントの腫瘍特異的ターゲティングのための機序原理は依然としてわかりにくい。腫瘍特異的免疫調節標的への洞察を得るために、本発明者らは、ICTに比較的よく応答するものおよびそうでないもの、例えば神経膠芽腫（GBM）、前立腺がん（PCa）および結腸直腸がん（CRC）を含む5つの異なるがんタイプを代表する腫瘍（N＝94）を分析した。マスサイトメトリーおよびシングルセルRNAシーケンシングを通して、本発明者らは、抗PD-1処置後も持続するGBM中のCD73hiマクロファージのユニークな集団を同定した。CD73のターゲティングがGBMにおける併用戦略の成功に重要であるかどうかを試験するために、発明者らは、CD73-/-マウスを使用して逆翻訳研究を実施した。本発明者らは、CD73の非存在が、抗CTLA-4および抗PD-1で処置されたGBMのマウスモデルにおいて生存を改善することを見いだした。データは、CD73を、GBMにおけるICTに対する抗腫瘍免疫応答を改善するための特異的な免疫治療標的として同定し、包括的なヒトおよび逆翻訳研究をコンビナトリアル免疫チェックポイント戦略の合理的な設計に使用することができることを実証する。

IV. 免疫療法
いくつかの態様では、方法は、がん免疫療法の投与を含む。がん免疫療法（イムノオンコロジーと呼ばれることもあり、IOと略される）は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は、能動、受動またはハイブリッド（能動および受動）として分類することができる。これらの手法は、がん細胞が、多くの場合、その表面に、腫瘍関連抗原（TAA）として知られる、免疫系によって検出されることができる分子を有するという事実を利用する。そのような分子は、多くの場合、タンパク質または他の高分子（例えば炭水化物）である。能動免疫療法は、TAAをターゲティングすることによって腫瘍細胞を攻撃するよう、免疫系に指示する。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球およびサイトカインの使用を含む。免疫療法は当技術分野において公知であり、以下、いくつかを説明する。

免疫チェックポイント遮断療法
本開示の態様は、免疫チェックポイント遮断療法の投与を含み得、これを以下さらに説明する。

PD-1、PDL1およびPDL2阻害物質
PD-1は、T細胞が感染または腫瘍に遭遇する腫瘍微小環境内で作用することができる。活性化されたT細胞はPD-1をアップレギュレートし、それを末梢組織で発現し続ける。IFN-ガンマなどのサイトカインが上皮細胞および腫瘍細胞上でPDL1の発現を誘導する。PDL2はマクロファージおよび樹状細胞上に発現する。PD-1の主な役割は、末梢におけるエフェクターT細胞の活性を制限し、免疫応答中に組織に対する過度な損傷を防ぐことである。本開示の阻害物質は、PD-1および／またはPDL1活性の1つまたは複数の機能を遮断し得る。

「PD-1」の別名はCD279およびSLEB2を含む。「PDL1」の別名はB7-H1、B7-4、CD274およびB7-Hを含む。「PDL2」の別名はB7-DC、BtdcおよびCD273を含む。いくつかの態様では、PD-1、PDL1およびPDL2はヒトPD-1、PDL1およびPDL2である。

いくつかの態様では、PD-1阻害物質は、PD-1の、そのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PD-1リガンド結合パートナーはPDL1および／またはPDL2である。別の態様では、PDL1阻害物質は、PDL1の、そのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PDL1結合パートナーはPD-1および／またはB7-1である。別の態様では、PDL2阻害物質は、PDL2の、そのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PDL2結合パートナーはPD-1である。阻害物質は、抗体、その抗原結合フラグメント、免疫アドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体が、すべて参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,735,553号、第8,354,509号および第8,008,449号に記載されている。本明細書に提供される方法および組成物において使用するための他のPD-1阻害物質が、すべて参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第2014/0294898号、第2014/022021号および第2011/0008369号に記載されているように、当技術分野において公知である。

いくつかの態様では、PD-1阻害物質は抗PD-1抗体（例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの態様では、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびピジリズマブからなる群より選択される。いくつかの態様では、PD-1阻害物質は免疫アドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のFc領域）に融合したPDL1またはPDL2の細胞外またはPD-1結合部分を含む免疫アドヘシン）である。いくつかの態様では、PDL1阻害物質はAMP-224を含む。MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558およびOPDIVO（登録商標）とも知られるニボルマブは、W02006/121168に記載されている抗PD-1抗体である。MK-3475、Merck 3475、ラムブロリズマブ、KEYTRUDA（登録商標）およびSCH-900475とも知られるペムブロリズマブは、W02009/114335に記載されている抗PD-1抗体である。CT-011、hBATまたはhBAT-1とも知られるピジリズマブは、W02009/101611に記載されている抗PD-1抗体である。B7-DCIgとも知られるAMP-224は、W02010/027827およびWO2011/066342に記載されているPDL2-Fc融合可溶性受容体である。追加的なPD-1阻害物質としては、AMP-514とも知られるMEDI0680およびREGN2810がある。

いくつかの態様では、ICB療法は、PDL1阻害物質、例えば、MEDI4736とも知られるデュルバルマブ、MPDL3280Aとも知られるアテゾリズマブ、MSB00010118Cとも知られるアベルマブ、MDX-1105、BMS-936559またはそれらの組み合わせを含む。特定の局面では、ICB療法は、rHIgM12B7などのPDL2阻害物質を含む。

いくつかの態様では、阻害物質は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピジリズマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。したがって、一態様では、阻害物質は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピジリズマブのVH領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインならびにニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピジリズマブのVL領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。別の態様では、抗体は、PD-1、PDL1またはPDL2上の、上述の抗体と同じエピトープとの結合を求めて競合する、および／またはそれと結合する。別の態様では、抗体は、上述の抗体とで少なくとも約70、75、80、85、90、95、97または99％（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。

2. CTLA-4、B7-1およびB7-2
本明細書に提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、CD152とも知られる細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列はGenbankアクセッション番号L15006を有している。CTLA-4は、T細胞の表面に見られ、抗原提示細胞の表面のB7-1（CD80）またはB7-2（CD86）に結合すると、「オフ」スイッチとして作用する。CTLA4は、ヘルパーT細胞の表面に発現し、抑制シグナルをT細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4はT細胞共刺激タンパク質CD28に類似し、両分子とも、抗原提示細胞上のB7-1およびB7-2に結合する。CTLA-4は抑制シグナルをT細胞に伝達するが、CD28は刺激シグナルを伝達する。細胞内CTLA-4はまた、制御性T細胞中にも見られ、それらの機能にとって重要であり得る。T細胞受容体およびCD28を介するT細胞活性化が、B7分子の抑制受容体であるCTLA-4の発現増大を招く。本開示の阻害物質は、CTLA-4、B7-1および／またはB7-2活性の1つまたは複数の機能を遮断し得る。いくつかの態様では、阻害物質はCTLA-4とB7-1の相互作用を遮断する。いくつかの態様では、阻害物質はCTLA-4とB7-2の相互作用を遮断する。

いくつかの態様では、ICB療法は、抗CTLA-4抗体（例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合フラグメント、免疫アドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドを含む。

本方法における使用に適した抗ヒトCTLA-4抗体（または、それに由来するVHおよび／またはVLドメイン）は、当技術分野において周知の方法を使用して作製することができる。あるいはまた、当技術分野において認められている抗CTLA-4抗体を使用することもできる。例えば、米国特許第8,119,129号、WO01/14424、WO98/42752；WO00/37504（CP675,206、トレメリムマブとも知られる；以前のチシリムマブ）、米国特許第6,207,156号；Hurwitz et al., 1998に開示されている抗CTLA-4抗体を、本明細書に開示される方法に使用することができる。前述の刊行物それぞれの教示が参照により本明細書に組み込まれる。また、CTLA-4への結合を求めてこれらの当技術分野において認められている抗体のいずれかと競合する抗体を使用することもできる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体が、すべて参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報WO2001/014424、WO2000/037504および米国特許第8,017,144号に記載されている。

本開示の方法および組成物においてICB療法として有用なさらなる抗CTLA-4抗体が、イピリムマブ（10D1、MDX-010、MDX-101およびYervoy（登録商標）とも知られる）またはその抗原結合フラグメントおよびその変異体である（例えばWO01/14424を参照）。

いくつかの態様では、阻害物質は、トレメリムマブまたはイピリムマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。したがって、一態様では、阻害物質は、トレメリムマブまたはイピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインならびにトレメリムマブまたはイピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。別の態様では、抗体は、PD-1、B7-1またはB7-2上の、上述の抗体と同じエピトープとの結合を求めて競合する、および／またはそれに結合する。別の態様では、抗体は、上述の抗体とで少なくとも約70、75、80、85、90、95、97または99％（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。

B. 共刺激分子の阻害
いくつかの態様では、免疫療法は共刺激分子の阻害物質を含む。いくつかの態様では、阻害物質は、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD28、ICOS、0X40（TNFRSF4）、4-1BB（CD137；TNFRSF9）、CD40L（CD40LG）、GITR（TNFRSF18）およびそれらの組み合わせの阻害物質を含む。阻害物質としては阻害抗体、ポリペプチド、化合物および核酸がある。

C. 樹状細胞療法
樹状細胞療法は、樹状細胞をして腫瘍抗原をリンパ球に提示させ、それがリンパ球を活性化し、プライミングすることによって抗腫瘍応答を誘発して、抗原を提示する他の細胞を死滅させる。樹状細胞は、哺乳動物免疫系における抗原提示細胞（APC）である。がん処置においては、がん抗原ターゲティングを支援する。樹状細胞に基づく細胞がん療法の一例がSipuleucel-Tである。

樹状細胞を誘導して腫瘍抗原を提示させる1つの方法が、自己腫瘍溶解物または短いペプチド（がん細胞上のタンパク質抗原に対応するタンパク質の小さな部分）の接種による方法である。これらのペプチドは、多くの場合、免疫および抗腫瘍応答を高めるために、アジュバント（高免疫原性物質）と組み合わせて投与される。他のアジュバントとしては、樹状細胞を誘引および／または活性化するタンパク質または他の化学物質、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）がある。

樹状細胞はまた、腫瘍細胞をしてGM-CSFを発現させることによってインビボで活性化させることもできる。これは、腫瘍細胞を遺伝子操作してGM-CSFを産生させることにより、またはGM-CSFを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞に感染させることにより、達成することができる。

別の戦略が、患者の血液から樹状細胞を取り出し、それを体外で活性化する戦略である。樹状細胞は、単一の腫瘍特異的ペプチド／タンパク質または腫瘍細胞溶解物（分解された腫瘍細胞の溶液）であり得る腫瘍抗原の存在下で活性化される。これらの細胞が（任意選択のアジュバントとともに）注入され、免疫応答を誘発する。

樹状細胞療法は、樹状細胞の表面上の受容体に結合する抗体の使用を含む。抗原が抗体に加えられ、樹状細胞を誘導して成熟させ、腫瘍に対する免疫を提供させることができる。TLR3、TLR7、TLR8またはCD40などの樹状細胞受容体が抗体標的として使用されてきた。

D. CAR-T細胞療法
キメラ抗原受容体（CAR、キメラ免疫受容体、キメラT細胞受容体または人工T細胞受容体とも知られる）は、新たな特異性を免疫細胞と組み合わせてがん細胞をターゲティングする、操作された受容体である。通常、これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をT細胞に移植する。受容体は、異なる供給源からの部分が融合しているため、キメラと呼ばれる。CAR-T細胞療法とは、そのような形質転換細胞をがん治療のために使用する処置を指す。

CAR-T細胞設計の基本原理は、抗原結合機能とT細胞活性化機能とを組み合わせる組換え受容体を含む。CAR-T細胞の一般的前提は、がん細胞上に見られるマーカーに標的を合わせたT細胞を人工的に作製することである。科学者は、ヒトからT細胞を取り出し、それを遺伝子改変し、それを、がん細胞を攻撃させるために、患者に戻すことができる。T細胞は、操作されてCAR-T細胞になったならば、「生きた薬」として作用する。CAR-T細胞は、細胞外リガンド認識ドメインと細胞内シグナル伝達分子との間にリンクを創製し、それが次いでT細胞を活性化する。細胞外リガンド認識ドメインは通常、単鎖可変フラグメント（scFv）である。CAR-T細胞療法の安全性の重要な局面が、がん性腫瘍細胞のみが標的とされ、正常な細胞が標的とされないことをいかにして保証するかである。CAR-T細胞の特異性は、標的とされる分子の選択によって決まる。

例示的なCAR-T療法としては、Tisagenlecleucel（Kymriah）およびAxicabtagene ciloleucel（Yescarta）がある。いくつかの態様では、CAR-T療法はCD19をターゲティングする。

E. サイトカイン療法
サイトカインとは、腫瘍内に存在する多くのタイプの細胞によって産生されるタンパク質である。サイトカインは免疫応答を調節することができる。腫瘍は、多くの場合、サイトカインを用いて自らを成長させ、免疫応答を低下させる。この免疫調節効果が、サイトカインが免疫応答を誘発するための薬として使用されることを可能にする。一般的に使用される2つのサイトカインがインターフェロンおよびインターロイキンである。

インターフェロンは免疫系によって産生される。インターフェロンは通常、抗ウイルス応答に関与するが、がんにも使用される。インターフェロンは3つのグループ：タイプI（IFNαおよびIFNβ）、タイプII（IFNγ）およびタイプIII（IFNλ）に分類される。

インターロイキンは数々の免疫系効果を有する。IL-2が例示的なインターロイキンサイトカイン療法である。

F. 養子T細胞療法
養子T細胞療法は、T細胞の輸注（養子細胞移入）による受動免疫の一形態である。T細胞は、血液および組織中に見られ、通常、外来性病原体を見つけたとき活性化する。具体的には、T細胞は、T細胞の表面受容体が、外来性タンパク質の一部をその表面抗原上に表示する細胞に遭遇したとき、活性化する。そのような細胞は、感染細胞または抗原提示細胞（APC）のいずれかであることができる。T細胞は、正常組織および腫瘍組織中に見られ、そこでは腫瘍浸潤リンパ球（TIL）として知られている。T細胞は、腫瘍抗原を提示する樹状細胞などのAPCの存在によって活性化される。これらの細胞は腫瘍を攻撃することができるが、腫瘍内の環境は免疫抑制性が高く、免疫媒介腫瘍死を妨げる。

腫瘍標的指向型T細胞を産生し、取得する複数の方法が開発されている。腫瘍抗原に特異的なT細胞を腫瘍サンプルから取り出す（TIL）、または血液からろ過することができる。その後の活性化および培養をエクスビボで実施し、成果物を再注入する。活性化は、遺伝子療法を通して実施することもできるし、T細胞を腫瘍抗原に曝露することによって実施することもできる。

がん処置は、本明細書に記載されるがん処置のいずれかを除外し得ることが考慮される。さらに、本開示の態様は、本明細書に記載される治療法のために以前に処置されたことがある患者、本明細書に記載される治療法のために現在処置されている患者または本明細書に記載される治療法のために処置されたことがない患者を含む。いくつかの態様では、患者は、本明細書に記載される治療法に耐性であると決定されている患者である。いくつかの態様では、患者は、本明細書に記載される治療法に感受性であると決定されている患者である。

V. 追加的治療法
本開示の現行の方法および組成物は、当技術分野において公知である、および／または本明細書に記載される1つまたは複数の追加的治療法を含み得る。いくつかの態様では、追加的治療法は追加的がん処置を含む。そのような処置の例は、本明細書に記載される免疫療法または以下に記載される追加的治療法タイプなど、本明細書に記載されている。

腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの態様では、追加的治療法は腫瘍溶解性ウイルスを含む。腫瘍溶解性ウイルスとは、がん細胞に優先的に感染し、それを死滅させるウイルスである。感染したがん細胞は、腫瘍溶解によって破壊されるとき、新たな感染性ウイルス粒子またはビリオンを放出して、残る腫瘍の破壊を支援する。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接的破壊を生じさせるだけでなく、長期的免疫療法のために宿主抗腫瘍免疫応答を刺激すると考えられる。

B. 多糖類
いくつかの態様では、追加的治療法は多糖類を含む。キノコに見いだされる特定の化合物、主に多糖類は、免疫系をアップレギュレートすることができ、抗がん性を有する場合がある。例えば、レンチナンなどのベータグルカンは、マクロファージ、NK細胞、T細胞および免疫系サイトカインを刺激することが実験室での研究で示されており、免疫アジュバントとして臨床試験で調査されている。

C. ネオアンチゲン
いくつかの態様では、追加的治療法はネオアンチゲン投与を含む。多くの腫瘍は変異を発現する。これらの変異は、T細胞免疫療法に使用するための新たなターゲティング可能な抗原（ネオアンチゲン）を潜在的に創製する。RNAシーケンシングデータを使用して同定される、がん病巣中のCD8+T細胞の存在は、高い遺伝子変異量を有する腫瘍においてより高い。ナチュラルキラー細胞およびT細胞の細胞溶解活性と関連する転写産物のレベルは、多くのヒト腫瘍における遺伝子変異荷重と正に相関する。

D. 化学療法
いくつかの態様では、追加的治療法は化学療法を含む。化学療法剤の適当なクラスは、（a）アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えばヘキサメチルメラミン、チオテパ）、アルキルスルホネート（例えばブスルファン）、ニトロソウレア（例えばカルムスチン、ロムスチン、クロロゾチシン、ストレプトゾシン）およびトリアジン（例えばダカルバジン）、（b）代謝拮抗剤、例えば葉酸類似体（例えばメトトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、アザウリジン）およびプリン類似体ならびに関連物質（例えば6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン）、（c）天然産物、例えばビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン）、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えばダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびミトキサントロン）、酵素（例えばL-アスパラギナーゼ）および生体応答修飾物質（例えばインターフェロン-α）、ならびに（d）その他各種作用物質、例えば白金配位錯体（例えばシスプラチン、カルボプラチン）、置換尿素（例えばヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えばプロカルバジン）および副腎皮質ホルモン合成阻害剤（例えばタキソールおよびミトタン）を含む。いくつかの態様では、シスプラチンが特に適当な化学療法剤である。

シスプラチンは、がん、例えば転移性精巣がんまたは卵巣がん、進行性膀胱がん、頭頸部がん、子宮頸がん、肺がんまたは他の腫瘍を処置するために広く使用されてきた。シスプラチンは経口的には吸収されず、したがって、他の経路、例えば静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内注射を介して送達されなければならない。シスプラチンは、単独で使用することもできるし、他の作用物質とで併用することもでき、特定の態様では、約15mg/m2～約20mg/m2を3週ごとに5日間の合計3クールを含む臨床用途で使用される有効量が考慮される。いくつかの態様では、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたEgr-1プロモーターを含む構築物とともに細胞および／または対象に送達されるシスプラチンの量は、シスプラチンを単独で使用する場合に送達される量よりも少ない。

他の適当な化学療法剤としては、微小管阻害薬、例えばパクリタキセル（「タキソール」）および塩酸ドキソルビシン（「ドキソルビシン」）がある。アデノウイルスベクターを介して送達されるEgr-1プロモーター／TNFα構築物とドキソルビシンの組み合わせが、化学療法および／またはTNF-αに対する耐性を克服するのに有効であると決定され、これは、構築物とドキソルビシンとの併用処置がドキソルビシンとTNF-αの両方に対する耐性を克服することを示唆する。

ドキソルビシンは吸収が不十分であり、好ましくは静脈内投与される。特定の態様では、成人に対する適切な静脈内投与量は、約21日間隔で約60mg/m2～約75mg/m2または連続する2もしくは3日のそれぞれで約25mg/m2～約30mg/m2（約3週～約4週の間隔で繰り返す）または週1回約20mg/m2を含む。高齢患者においては、以前の化学療法または新生物骨髄浸潤によって引き起こされた以前の骨髄抑制がある場合または薬が他の骨髄造血抑制薬と併用される場合、最低用量を使用すべきである。

ナイトロジェンマスタードが、本開示の方法において有用な別の適当な化学療法剤である。ナイトロジェンマスタードとしては、メクロレタミン（HN2）、シクロホスファミドおよび／またはイホスファミド、メルファラン（L-サルコリシン）およびクロラムブシルがあるが、これらに限定されない。シクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））はMead Johnsonから市販されており、NEOSTAR（登録商標）（Adriaから市販）が別の適当な化学療法剤である。成人に適した経口投与量は、例えば、約1mg/kg/日～約5mg/kg/日を含み、静脈内投与量は、例えば、はじめに約40mg/kg～約50mg/kgを約2日～約5日の期間で分割する投与量または約7日～約10日ごとに約10mg/kg～約15mg/kgまたは週2回約3mg/kg～約5mg/kgまたは約1.5mg/kg/日～約3mg/kg/日を含む。胃腸への悪影響のため、静脈内経路が好ましい。薬はまた、筋内的に、浸潤によってまたは体腔中に投与されることもある。

適当な追加的化学療法剤としては、ピリミジン類似体、例えばシタラビン（シトシンアラビノシド）、5-フルオロウラシル（フルオロウラシル；5-FU）およびフロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；FudR）がある。5-FUは、約7.5～約1000mg/m2のどこかの投与量で対象に投与され得る。さらに、5-FU投与スケジュールは、様々な期間、例えば最大6週間または本開示が関連する技術分野の当業者によって決定される期間であり得る。

別の適当な化学療法剤であるゲムシタビン二リン酸（GEMZAR（登録商標）、Eli Lilly & Co.、「ゲムシタビン」）が、進行性および転移性膵臓がんの処置に推奨され、したがって、本開示において、これらのがんの場合に有用である。

患者に送達される化学療法剤の量は可変的であり得る。適当な一態様では、化学療法剤は、化学療法が構築物とともに投与される場合、宿主においてがんの停止または退行を生じさせるのに有効な量で投与され得る。他の態様では、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法的有効量の2分の1～10,000分の1のどこかである量で投与され得る。例えば、化学療法剤は、化学療法剤の有効量の約20分の1、約500分の1またはさらには約5000分の1である量で投与され得る。本開示の化学療法剤は、構築物と併用される場合の所望の治療活性に関して、また、有効投与量の決定のために、インビボで試験することができる。例えば、そのような化合物は、ヒトにおいて試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ適当な動物モデル系において試験することができる。また、実施例に記載されるように、インビトロ試験を使用して適当な組み合わせおよび投与量を決定してもよい。

E. 放射線療法
いくつかの態様では、追加的治療法または以前の治療法は、電離放射線などの放射線を含む。本明細書中で使用される「電離放射線」とは、電離（電子の獲得または喪失）を生じさせるのに十分なエネルギーを有する、または電離（電子の獲得または喪失）を生じさせるのに十分なエネルギーを核相互作用を介して生み出すことがきる粒子または光子を含む放射線を指す。例示的かつ好ましい電離放射線はX線である。X線を標的組織または細胞に送達するための手段は当技術分野において周知である。

いくつかの態様では、電離放射線の量は20グレイ（Gy）よりも多く、1回の線量で投与される。いくつかの態様では、電離放射線の量は18Gyであり、3回の線量で投与される。いくつかの態様では、電離放射線の量は、少なくとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは40Gy（またはこの中の任意の導出可能な範囲）、多くとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは40Gy（またはこの中の任意の導出可能な範囲）または厳密に2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは40Gy（またはこの中の任意の導出可能な範囲）である。いくつかの態様では、電離放射線は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10回の線量（またはこの中の任意の導出可能な範囲）、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10回の線量（またはこの中の任意の導出可能な範囲）または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10回の線量（またはこの中の任意の導出可能な範囲）で投与される。1回よりも多い線量が投与される場合、線量は、約1、4、8、12もしくは24時間または1、2、3、4、5、6、7もしくは8日または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14もしくは16週（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の時間を隔てられ得る。

いくつかの態様では、IRの量は、IRの全線量として提示され得、その後それが分割線量で投与される。例えば、いくつかの態様では、全線量は50Gyであり、それが各5Gyの10回の分割線量で投与される。いくつかの態様では、全線量は50～90Gyであり、それが各2～3Gyの20～60回の分割線量で投与される。いくつかの態様では、IRの全線量は、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140もしくは150（またはこの中の任意の導出可能な範囲）、多くとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140もしくは150（またはこの中の任意の導出可能な範囲）または約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140もしくは150（またはこの中の任意の導出可能な範囲）である。いくつかの態様では、全線量は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45もしくは50Gy（またはこの中の任意の導出可能な範囲）、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45もしくは50Gy（またはこの中の任意の導出可能な範囲）または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45もしくは50Gy（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の分割線量で投与される。いくつかの態様では、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100（またはこの中の任意の導出可能な範囲）、多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100（またはこの中の任意の導出可能な範囲）または厳密に2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の分割線量が投与される。いくつかの態様では、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の分割線量、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の分割線量または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の分割線量が1日あたり投与される。いくつかの態様では、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30（またはこの中の任意の導出可能な範囲）、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30（またはこの中の任意の導出可能な範囲）または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の分割線量が1週あたり投与される。

F. 外科手術
がん患者の約60％は、予防的、診断的または病期分類的、治癒的および緩和的な手術を含む、何らかのタイプの外科手術を受ける。治癒的手術は、がん性組織の全部または一部を物理的に除去、摘出および／または破壊する切除を含み、他の治療法、例えば、本態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法と併用され得る。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気外科手術および顕微鏡制御手術（モース手術）を含む。

がん性細胞、組織または腫瘍の一部または全部を摘出すると、体内に空洞が形成される場合がある。その区域への追加的抗がん治療の灌流、直接注射または局所適用によって処置を達成し得る。このような処置が、例えば、1、2、3、4、5、6もしくは7日ごと、または1、2、3、4および5週間ごと、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしく12か月ごとに繰り返されてもよい。これらの処置はまた、様々な投与量の処置であってもよい。

G. 他の作用物質
処置の治療効力を改善するために、他の作用物質を本態様の特定の局面と併用し得ることが考えられる。これらの追加的作用物質としては、細胞表面受容体およびギャップ結合のアップレギュレーションに影響する作用物質、細胞増殖抑制および分化作用物質、細胞接着の阻害物質、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を高める作用物質または他の生物学的作用物質がある。ギャップ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加が、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を高めるであろう。他の態様では、細胞増殖抑制または分化作用物質を本態様の特定の局面と併用して、処置の抗過剰増殖効力を改善することができる。細胞接着の阻害物質が本態様の効力を改善すると考えられる。細胞接着阻害物質の例は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（FAK）阻害物質およびロバスタチンである。さらに、抗体c225などの、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を高める他の作用物質を本態様の特定の局面と併用して処置効力を改善することもできると考えられる。

VI. サンプル調製
特定の局面では、方法は、対象からサンプルを採取する段階を含む。本明細書に提供される採取方法は、生検の方法、例えば細針吸引、コア針生検、真空補助下生検、切開生検、切除生検、パンチ生検、薄片生検または皮膚生検を含み得る。特定の態様では、サンプルは、前述の生検方法のいずれかにより、食道組織からの生検材料から採取される。他の態様では、サンプルは、非がん性またはがん性組織および血清、胆嚢、粘膜、皮膚、心臓、肺、***、膵臓、血液、肝臓、筋肉、腎臓、平滑筋、膀胱、結腸、腸、脳、前立腺、食道または甲状腺組織からの非がん性またはがん性組織をはじめとする、本明細書に提供される組織のいずれかから採取され得る。あるいはまた、サンプルは、血液、汗、毛包、口腔内組織、涙、月経分泌物、糞便または唾液をはじめとする他の任意の供給源から採取されてもよい。現行の方法の特定の局面では、医師、看護師または医療技術者などの任意の医療専門家が検査のための生物学的サンプルを採取し得る。さらに、生物学的サンプルは、医療専門家の支援なしに採取することもできる。

サンプルとしては、対象の組織、細胞または細胞に由来する生物学的材料があるが、これらに限定されない。生物学的サンプルは、細胞または組織の不均一または均一な集団であり得る。生物学的サンプルは、本明細書に記載される分析方法に適したサンプルを提供することができる、当技術分野において公知の任意の方法を使用して採取され得る。サンプルは、皮膚または子宮頸部の掻き取り、口腔粘膜の拭き取り、唾液捕集、尿捕集、糞便捕集、月経分泌物、涙または***の捕集をはじめとする非侵襲的方法によって採取され得る。

サンプルは、当技術分野において公知の方法によって採取され得る。特定の態様では、サンプルは生検によって採取される。他の態様では、サンプルは、拭き取り、内視鏡検査、掻き取り、静脈切開術または当技術分野において公知の他の任意の方法によって採取される。場合によっては、サンプルは、本方法のキットのコンポーネントを使用して採取、保存または輸送されてもよい。場合によっては、複数の食道サンプルなどの複数のサンプルが、本明細書に記載される方法により、診断のために採取されてもよい。他の場合には、複数のサンプル、例えば、ある組織タイプ（例えば食道）からの1つまたは複数のサンプルおよび別の標本（例えば血清）からの1つまたは複数のサンプルが、本方法により、診断のために採取されてもよい。場合によっては、複数のサンプル、例えば、ある組織タイプ（例えば食道）からの1つまたは複数のサンプルおよび別の標本（例えば血清）からの1つまたは複数のサンプルが、同じ時間または異なる時間に採取されてもよい。サンプルは、異なる時間に採取され得、異なる方法によって保存および／または分析される。例えば、サンプルは、慣例的な染色法または任意の他の細胞学的分析法によって採取され、分析されてもよい。

いくつかの態様では、サンプルは、遠心分離または他の分画技術によって分画された血液サンプルなどの分画されたサンプルを含む。サンプルは、白血球または赤血球を濃縮されたものであってもよい。いくつかの態様では、サンプルは、白血球またはリンパ球のために分画または濃縮されたものであってもよい。いくつかの態様では、サンプルは全血サンプルを含む。

いくつかの態様では、生物学的サンプルは、医師、看護師または他の医療専門家、例えば医療技術者、内分泌科医、細胞学者、フレボトミスト、放射線科医または呼吸器科医によって採取され得る。医療専門家が、サンプルに対して実施すべき適切な検査またはアッセイを指示し得る。特定の局面では、分子プロファイリング業者が、どのアッセイまたは検査が最も適切に指示されるかに関して意見を述べてもよい。本方法のさらなる局面では、患者または対象は、医療専門家の支援なしに、全血サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、口腔内サンプルまたは唾液サンプルを採取するなど、検査用の生物学的サンプルを採取し得る。

他の場合、サンプルは、生検、針吸引、内視鏡検査または静脈切開術をはじめとする侵襲的処置によって採取される。針吸引の方法はさらに、細針吸引、コア針生検、真空補助下生検またはラージコア生検を含み得る。いくつかの態様では、十分な量の生物学的材料を確保するために、本明細書における方法によって複数のサンプルが採取されてもよい。

また、生物学的サンプルを採取するための一般的な方法が当技術分野において公知である。全体として参照により本明細書に組み入れられるRamzy, Ibrahim Clinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001などの刊行物が、生検および細胞学的方法の一般的な方法を記載している。一態様では、サンプルは、食道または疑われる食道腫瘍もしくは新生物の細針吸引物である。場合によっては、細針吸引サンプリング手順は、超音波、X線または他のイメージングデバイスの使用によって誘導されてもよい。

本方法のいくつかの態様では、分子プロファイリング業者は、対象から直接、医療専門家から、第三者から、または分子プロファイリング業者もしくは第三者によって提供されたキットから、生物学的サンプルを採取し得る。場合によっては、対象、医療専門家または第三者が生物学的サンプルを取得し、分子プロファイリング業者に送付した後、分子プロファイリング業者によって生物学的サンプルが採取されてもよい。場合によっては、分子プロファイリング業者が、生物学的サンプルを保存し、分子プロファイリング業者に輸送するための適当な容器および賦形剤を提供してもよい。

本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、医療専門家が初期診断またはサンプル取得に関与する必要はない。あるいはまた、個人が、店頭販売（OTC）キットを使用してサンプルを採取してもよい。OTCキットは、本明細書に記載されるように前記サンプルを採取するための手段と、検査に備えて前記サンプルを保存するための手段と、キットの正しい使用のための使用説明書とを含み得る。場合によっては、分子プロファイリングサービスがキットの購入価格に含まれる。他の場合、分子プロファイリングサービスは別途に請求される。分子プロファイリング業者による使用に適したサンプルは、検査される個人の組織、細胞、核酸、遺伝子、遺伝子フラグメント、発現産物、遺伝子発現産物または遺伝子発現産物フラグメントを含む任意の材料であり得る。サンプルの適性および／または妥当性を決定する方法が提供される。

いくつかの態様では、対象は、腫瘍内科医、外科医または内分泌科医などの専門医に紹介される場合がある。専門医は同様に、検査のために生物学的サンプルを採取してもよいし、生物学的サンプルの提出のためにその個人を検査センターまたは研究施設に紹介してもよい。場合によっては、医療専門家は、生物学的サンプルの提出のために対象を検査センターまたは研究施設に紹介してもよい。他の場合、対象がサンプルを提供してもよい。場合によっては、分子プロファイリング業者がサンプルを採取してもよい。

VII. がんモニタリング
特定の局面では、患者が、対象由来の生物学的サンプル中の発現レベルおよび／またはCD73陽性マクロファージの存在など、上記のバイオマーカー発現に基づいて、再発のリスクが高いまたは予後不良であると決定されるならば、本開示の方法は、より頻繁に、1つまたは複数の他のがん診断またはスクリーニング検査と組み合わされてもよい。

いくつかの態様では、本開示の方法はさらに、1つまたは複数のモニタリング検査を含む。モニタリングプロトコルは、当技術分野において公知の任意の方法を含み得る。特に、モニタリングは、サンプルを採取すること、および診断のためのサンプルを検査することを含む。例えば、モニタリングは、内視鏡検査、生検、超音波内視鏡検査、X線、バリウム嚥下、CTスキャン、MRI、PETスキャン、腹腔鏡検査またはHER2検査を含み得る。いくつかの態様では、モニタリング検査は放射線画像診断を含む。本開示の方法において有用である放射線画像診断の例は、肝臓超音波診断、コンピュータ断層撮影（CT）腹部スキャン、肝臓磁気共鳴画像診断（MRI）、全身CTスキャンおよび全身MRIを含む。

VIII. ROC分析
統計学では、受信者動作特性（ROC）またはROC曲線は、識別閾値が変化するときの二項分類システムの性能を示すグラフィカルプロットである。曲線は、様々な閾値設定において偽陽性率に対して真陽性率をプロットすることによって作成される（真陽性率は、バイオメディカルインフォマティクスにおいては感度または機械学習においては再現率とも知られる。偽陽性率はフォールアウトとも知られ、1－特異度として計算することができる）。したがって、ROC曲線は、フォールアウトの関数としての感度である。一般に、検出と誤警報の両方の確率分布が既知であるならば、ROC曲線は、y軸の検出確率の累積分布関数（－無限大から＋無限大までの確率分布下の区域）をx軸の誤警報確率の累積分布関数に対してプロットすることによって作成することができる。

ROC分析は、コストコンテキストまたはクラス分布とは独立して（かつ、それらを指定する前に）、おそらくは最適なモデルを選択し、最適以下のモデルを破棄するためのツールを提供する。ROC分析は、診断意思決定の費用便益分析に直接的かつ自然な方法で関連する。

ROC曲線は、当初、第二次世界大戦中、戦場で敵対象物を検出するために電気技師およびレーダー技師によって開発され、ほどなく、刺激の知覚的検出を説明するために心理学に導入された。それ以来、ROC分析は、医学、放射線学、生体認証および他の分野において何十年にもわたり使用されており、機械学習およびデータマイニングリサーチにおいてますます使用されている。

ROCは、基準が変化するときの2つの動作特性（TPRおよびFPR）の比較であるため、相対動作特性曲線とも知られている。ROC分析曲線は、当技術分野において公知であり、全体として本明細書に組み入れられるMetz CE (1978) Basic principles of ROC analysis. Seminars in Nuclear Medicine 8:283-298；Youden WJ (1950) An index for rating diagnostic tests. Cancer 3:32-35；Zweig MH, Campbell G (1993) Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clinical Chemistry 39:561-577；およびGreiner M, Pfeiffer D, Smith RD (2000) Principles and practical application of the receiver-operating characteristic analysis for diagnostic tests. Preventive Veterinary Medicine 45:23-41に記載されている。ROC分析は、予後および／または診断目的でカットオフ値を作成するために使用されてもよい。

IX. 核酸アッセイ
方法の局面は、生物学的サンプル中のCD73発現細胞の発現もしくは活性レベルおよび／または存在を決定するために核酸をアッセイすることを含む。アレイを使用して、2つのサンプル間の差を検出することができる。具体的に考慮される用途は、正常であるサンプルからのRNAと正常でないサンプルからのRNAとの間、がん性状態と非がん性状態との間、速い倍加時間の細胞などの1つのがん性状態と、遅い倍加時間の細胞などの別のがん性状態との間または2つの異なる処置を受けたサンプルの間で差を識別および／または定量化する用途を含む。また、RNAは、特定の疾患または状態に感受性であると考えられるサンプルと、その疾患または状態に感受性または耐性ではないと考えられるサンプルとの間で比較されてもよい。正常ではないサンプルとは、疾患もしくは状態の表現型形質を示すサンプルまたはその疾患もしくは状態に関して正常ではないと考えられるサンプルである。それは、その疾患または状態に関して正常である細胞に比較されてもよい。表現型形質は、成分が遺伝的である、または遺伝的であり得る、もしくはあり得ない、または過剰増殖性もしくは新生細胞によって引き起こされる、または引き起こされ得る、もしくは引き起こされ得ない疾患もしくは状態の症状または疾患もしくは状態に対する感受性を含む。

バイオマーカーの発現レベルを決定するために、アレイが使用されてもよい。アレイは、核酸プローブが取り付けられた固体支持体を含む。アレイは通常、異なる既知の位置で基板の表面に結合されている複数の異なる核酸プローブを含む。「マイクロアレイ」または口語的には「チップ」とも記されるこれらのアレイは、当技術分野、例えば、それぞれが全体としてあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,143,854号、第5,445,934号、第5,744,305号、第5,677,195号、第6,040,193号、第5,424,186号およびFodor et al., 1991において一般に説明されている。機械的合成法を使用してこれらのアレイを合成するための技術が、例えば、全体としてあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,384,261号に記載されている。特定の局面では平面的なアレイ面が使用されるが、アレイは、事実上いかなる形状の表面に作製されてもよいし、複数の表面に作製されてもよい。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどのファイバー、ガラスまたは任意の他の適切な基板上の核酸であり得る。全体としてあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,770,358号、第5,789,162号、第5,708,153号、第6,040,193号および第5,800,992号を参照すること。

バイオマーカー発現を決定するために有用なさらなるアッセイとしては、核増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的PCR、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）（GenProbe）、分岐DNA（bDNA）アッセイ（Chiron）、ローリングサークル増幅（RCA）、単一分子ハイブリダイゼーション検出（US Genomics）、Invaderアッセイ（ThirdWave Technologies）および／またはBridge Litigation Assay（Genaco）があるが、これらに限定されない。

バイオマーカー遺伝子を含む核酸などの核酸を定量化および／または同定するのに有用なさらなるアッセイがRNAseqである。全トランスクリプトームショットガンシーケンシングとも呼ばれるRNA-seq（RNAシーケンシング）は、次世代シーケンシング（NGS）を使用して、所与の瞬間における生物学的サンプル中のRNAの存在および量を明らかにする。RNA-Seqは、絶えず変化する細胞トランスクリプトームを分析するために使用される。具体的には、RNA-Seqは、選択的遺伝子スプライシングされた転写産物、転写後修飾、遺伝子融合、変異／SNPおよび遺伝子発現の変化を見る能力を促進する。RNA-Seqは、mRNA転写産物に加え、RNAの様々な集団を見て、全RNA、スモールRNA、例えばmiRNA、tRNAおよびリボソームプロファイリングを含めることができる。RNA-Seqはまた、エキソン／イントロン境界を決定し、事前にアノテーションされた5'および3'遺伝子境界を検証または修正するために使用されることもできる。

X. タンパク質アッセイ
バイオマーカー発現レベルを決定するために、生物学的サンプル中のポリペプチドおよびタンパク質の発現レベルを測定するための様々な技術を用いることができる。そのようなフォーマットの例は、酵素イムノアッセイ（EIA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ウエスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を含むが、これらに限定されない。当業者は、既知のタンパク質／抗体検出方法を、バイオマーカーのタンパク質発現レベルを決定する際の使用に容易に適合することができる。

一態様では、抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体を、ウエスタンブロット、ELISA、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光技術などの方法に使用して、バイオマーカー発現および／またはCD73などの細胞表面マーカーの存在を検出することができる。いくつかの態様では、抗体またはタンパク質のいずれかが固体支持体に固定化される。適当な固相支持体または担体としては、抗原または抗体に結合することができる任意の支持体がある。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩およびマグネタイトがある。

当業者は、抗体または抗原に結合するのに適した他の多くの担体を知っており、本開示との使用のためにそのような支持体を適合させることができるであろう。次いで、支持体を適当な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識された抗体で処置を行う。次いで、固相支持体を再び緩衝液で洗浄して、結合しない抗体を除去することができる。次いで、固体支持体に結合した標識の量を従来手段によって検出することができる。

免疫組織化学法もまた、バイオマーカーの発現レベルを検出するのに適している。いくつかの態様では、抗体または抗血清、例えばポリクローナル抗血清と、各マーカーに特異的なモノクローナル抗体とを使用して発現を検出し得る。抗体は、抗体そのものを、例えば放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素で直接標識することによって検出することができる。あるいはまた、非標識の一次抗体が、抗血清、ポリクローナル抗血清または一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体とともに使用される。免疫組織化学プロトコルおよびキットは当技術分野において周知であり、市販されている。

特定のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用してタンパク質発現の尺度として複合体形成を検出し、測定する免疫学的方法が当技術分野において公知である。そのような技術の例は、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化セルソーティング（FACS）および抗体アレイを含む。そのようなイムノアッセイは通常、タンパク質とその特異的抗体との間の複合体形成の測定を含む。これらのアッセイおよび精製され、標識された標準に対するそれらの定量化は当技術分野において周知である。2つの非干渉性エピトープに反応する抗体を利用する2部位のモノクローナルベースのイムノアッセイまたは競合的結合アッセイが用いられてもよい。

数多くの標識が当技術分野において利用可能であり、一般的に公知である。放射性同位元素標識としては、例えば、36S、14C、1251、3Hおよび131Iがある。抗体は、当技術分野において公知の技術を使用して、放射性同位元素で標識することができる。蛍光標識としては、例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドなどの標識が利用可能である。当技術分野において公知の技術を使用して、蛍光標識を抗体変異体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光光度計を使用して定量化することができる。様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第4,275,149号、第4,318,980号がこれらのいくつかのレビューを提供している。酵素は一般に、発色基質の化学的変質を触媒し、それを、様々な技術を使用して測定することができる。例えば、酵素は基質における色の変化を触媒し得、それを分光光度的に測定することができる。あるいはまた、酵素は基質の蛍光または化学発光を変化させる場合がある。蛍光の変化を定量化するための技術は先に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、すると、測定することができる（例えば、ケミルミノメーターを使用して）光を放出し得る、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素を抗体にコンジュゲートするための技術は、O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzymology (Ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。

XI. 治療組成物の投与
本明細書に提供される療法は、第1のがん療法および第2のがん療法などの治療物質の組み合わせの投与を含み得る。療法は、当技術分野において公知の任意の適当なやり方で投与され得る。例えば、第1および第2のがん処置は、順次に（異なる時間に）または並行的に（同時に）投与され得る。いくつかの態様では、第1および第2のがん処置は別々の組成物として投与される。いくつかの態様では、第1および第2のがん処置は同じ組成物中にある。

本開示の態様は、治療組成物を含む組成物および方法に関する。異なる治療が1つの組成物または1つよりも多い組成物、例えば2つの組成物、3つの組成物または4つの組成物として投与され得る。作用物質の様々な組み合わせが用いられてもよい。

本開示の治療物質は、同じ投与経路または異なる投与経路によって投与され得る。いくつかの態様では、がん治療は、静脈内的、筋内的、皮下的、局所的、経口的、経皮的、腹腔内的、眼窩内的、移植により、吸入により、髄腔内的、脳室内的または鼻腔内的に投与される。いくつかの態様では、抗生物質は、静脈内的、筋内的、皮下的、局所的、経口的、経皮的、腹腔内的、眼窩内的、移植により、吸入により、髄腔内的、脳室内的または鼻腔内的に投与される。適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、個人の臨床状態、個人の病歴および処置に対する応答ならびに主治医の裁量に基づいて決定され得る。

処置は様々な「単位用量」を含み得る。単位用量は、所定量の治療組成物を含むものとして定義される。投与される量ならびに具体的な経路および製剤化は臨床分野の当業者の決定能力の範囲内である。単位用量は、単回注射として投与される必要はなく、一定期間にわたる持続的注入を含み得る。いくつかの態様では、単位用量は単一の投与可能な用量を含む。

処置の回数と単位用量の両方にしたがって投与される量は、所望の処置効果に依存する。有効用量は、特定の効果を達成するために必要な量を指すものと理解される。特定の態様における実施では、10mg/kg～200mg/kgの範囲の用量がこれらの作用物質の保護能力に影響することができると考えられる。したがって、用量は、約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195および200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/日、mg/日またはその中で導出可能な任意の範囲を含むと考えられる。さらに、そのような用量は、1日に複数回投与されることもでき、かつ／または複数の日、週もしくは月にわたって投与されることもできる。

特定の態様では、薬学的組成物の有効用量は、約1μM～150μMの血中レベルを提供することができる用量である。別の態様では、有効用量は、約4μM～100μM；または約1μM～100μM；または約1μM～50μM；または約1μM～40μM；または約1μM～30μM；または約1μM～20μM；または約1μM～10μM；または約10μM～150μM；または約10μM～100μM；または約10μM～50μM；または約25μM～150μM；または約25μM～100μM；または約25μM～50μM；または約50μM～150μM；または約50μM～100μM（またはこの中の任意の導出可能な範囲）の血中レベルを提供する。他の態様では、用量は、治療物質が対象に投与される結果として生じる、作用物質の以下の血中レベルを提供することができる：約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100μM、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100μMまたは多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100μMまたはこの中の任意の導出可能な範囲。特定の態様では、対象に投与される治療物質は、体内で代謝された治療物質へと代謝され、その場合、血中レベルは、その治療物質の量を指し得る。あるいはまた、治療物質が対象によって代謝されない限りでは、本明細書中に記載される血中レベルは、未代謝の治療物質を指す場合もある。

治療組成物の正確な量もまた、施術者の判断に依存し、各個人に特有である。用量に影響する要因としては、患者の身体的および臨床的状態、投与経路、処置の意図される目標（治癒に対して症状の緩和）および対象が受けている場合がある特定の治療物質または他の治療の作用強度、安定性および毒性がある。

当業者には、μg/kg体重またはmg/kg体重の投与量単位が、4μM～100μMなど、同等のμg/mlまたはmM（血中レベル）の濃度単位に変換され、その単位で表されることもできることが理解され、認識されるであろう。また、取り込みが種および器官／組織依存性であることが理解されよう。適用可能な変換係数ならびに取り込みおよび濃度測定に関して実施される生理学的推測は周知であり、当業者が、ある濃度測定値を別の濃度測定値に変換し、本明細書に記載される用量、効力および結果に関して合理的な比較および結論を下すことを可能にするであろう。

XII. 処置の方法
本明細書には、治療組成物の投与を通して対象におけるがんを処置する、またはその進行を遅らせる方法が提供される。

いくつかの態様では、治療は、治療の中止後、個人において持続的な応答を生じさせる。本明細書に記載される方法は、がんの処置の場合に腫瘍免疫原性を増大させるなど、免疫原性の増強が望まれる状態を処置する際に用途を見いだし得る。

いくつかの態様では、個人は、1つまたは複数の抗がん治療に対して耐性である（耐性であることが実証されている）がんを有する。いくつかの態様では、抗がん治療に対する耐性は、がんまたは難治性がんの再発を含む。再発とは、処置後、元の部位または新たな部位におけるがんの再出現を指し得る。いくつかの態様では、抗がん治療に対する耐性は、抗がん治療による処置中のがんの進行を含む。いくつかの態様では、がんは早期がんまたは末期がんである。

本開示の方法のいくつかの態様では、がんは、低レベルのT細胞浸潤を有する。いくつかの態様では、がんは、検出可能なT細胞浸潤を有しない。いくつかの態様では、がんは非免疫原性がん（例えば非免疫原性結腸直腸がんおよび／または卵巣がん）である。理論によって拘束されることなく、併用処置が、併用の投与前に比べ、T細胞（例えばCD4+T細胞、CD8+T細胞、メモリーT細胞）プライミング、活性化、増殖および／または浸潤を増大させ得る。

がんは、固形腫瘍、転移性がんまたは非転移性がんであり得る。特定の態様では、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、***、泌尿器、子宮頸部、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮に起源を有し得る。

がんは、具体的には、以下の組織タイプであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；未分化、膀胱、血液、骨、脳、***、泌尿器、食道、胸腺腫、十二指腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、軟部組織、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、子宮、胸腺、皮膚扁平上皮細胞、非結腸直腸消化器、結腸直腸、黒色腫、メルケル細胞、腎細胞、子宮頸、肝細胞、尿路上皮、非小細胞肺、頭頸部、子宮内膜、食道胃接合部、小細胞肺中皮腫、卵巣、食道胃接合部、神経膠芽腫、副腎皮質、ブドウ膜、膵臓、生殖細胞、巨細胞および紡錘体細胞癌腫；小細胞がん；乳頭状がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；石灰化上皮腫；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管がん；肝細胞がん；混合型肝細胞がんおよび胆管がん；索状腫瘍；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープ内腺がん；腺がん、家族性大腸ポリポーシス；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺がん；乳頭状腺がん；色素嫌性がん；好酸性がん；酸親和性腺がん；好塩基球癌腫；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭状腺がんおよび濾胞腺がん；非被包性硬化がん；副腎皮質がん；類内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性導管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、***；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；***外傍神経節腫、悪性；クロム親和性細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；皮膚黒色腫、青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣型横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミューラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；指定された他の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；および有毛細胞白血病。

いくつかの態様では、がんは、皮膚扁平上皮がん、非結腸直腸および結腸直腸消化器がん、メルケル細胞がん、肛門がん、子宮頸がん、肝細胞がん、尿路上皮がん、黒色腫、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、頭頸部がん、腎臓がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫、膵臓がんまたは皮膚がんを含む。

いくつかの態様では、がんは、肺がん、膵臓がん、転移性黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がんまたはホジキンリンパ腫を含む。

方法は、適切ながん「管理レジメン」の決定、投与または選択と、その結果の予測とを含み得る。本明細書中で使用される語句「管理レジメン」とは、それを必要とする対象（例えば、がんと診断された対象）に提供される検査、スクリーニング、診断、監視、ケアおよび処置のタイプ（例えば投与量、スケジュールおよび／または処置の期間）を規定する管理計画を指す。

用語「処置」または「処置する」は、（i）疾患を予防すること、すなわち、疾患の誘導の前に保護的組成物の投与によって疾患の臨床症状を発現させないこと；（ii）疾患を抑制すること、すなわち、誘導事象の後であるが疾患の臨床的出現または再出現の前に保護的組成物の投与によって疾患の臨床症状を発現させないこと；（iii）疾患を阻害すること、すなわち、最初の出現後に保護的組成物の投与によって臨床症状の発現を阻止すること、および／または（iv）疾患を緩和すること、すなわち、最初の出現後に保護的組成物の投与によって臨床症状の退行を生じさせることを含む、哺乳動物における疾患に対する任意の処置を意味する。いくつかの態様では、処置は、疾患の予防を除外する場合もある。

特定の局面では、特定の腸内細菌叢構成を有すると決定された患者におけるがんまたはがん転移の検出のために、さらなるがんもしくは転移検査もしくはスクリーニングまたはさらなる診断、例えばコントラスト増強コンピュータ断層撮影（CT）、陽電子放出断層撮影－CT（PET-CT）および磁気共鳴画像診断（MRI）が実施されてもよい。

XIII. キット
本発明の特定の局面はまた、本発明の組成物または本発明の方法を実施するための組成物を含むキットに関する。いくつかの態様では、キットは、細胞表面マーカーの発現レベルおよび／または有無を評価するために使用することができる。特定の態様では、キットは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1,000もしくはより多くの、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1,000もしくはより多くの、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1,000もしくはより多くの、またはその中で導出可能な任意の値または範囲および組み合わせのプローブ、プライマーもしくはプライマーセット、合成分子、検出物質、抗体または阻害物質を含む。いくつかの態様では、細胞中のバイオマーカーの発現レベルおよび／または細胞表面発現を評価するためのキットがある。

キットは、チューブ、ボトル、バイアル、注射器または他の適当な容器手段などの容器に個別に包装または配置され得る成分を含み得る。

個々の成分はまた、キット中に濃縮された量で提供されてもよい。いくつかの態様では、成分は、他の成分とともに溶液に含まれるときと同じ濃度で個別に提供される。成分の濃度は、1倍、2倍、5倍、10倍または20倍またはより高い倍率として提供され得る。

本開示のプローブ、合成核酸、非合成核酸および／または阻害物質を予後または診断用途のために使用するためのキットが本開示の一部として含まれる。具体的には、バイオマーカーの非コード配列およびバイオマーカーのコード配列を含み得る、バイオマーカーの全部または一部と同一である、またはそれに対して相補的である核酸プライマー／プライマーセットおよびプローブを含む、本明細書中で同定される任意のバイオマーカーに対応する任意のそのような分子が考えられる。

特定の局面では、陰性および／または陽性対照核酸、プローブおよび阻害物質がいくつかのキットの態様に含まれる。加えて、キットは、バイオマーカー発現レベルのための陰性または陽性対照であるサンプルを含み得る。

本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実現されることもでき、様々な態様を組み合わせてもよいことが考慮される。当初に提出された請求項は、任意の提出された請求項または提出された請求項の組み合わせに多重に従属する請求項を包含するものと考えられる。

本開示の態様は、サンプルのバイオマーカー発現プロファイルを評価することによって病理学的サンプルを分析するためのキットであって、2つ以上のプローブまたは検出物質を適当な容器手段中に含み、プローブまたは検出物質が、本明細書中で同定された1つまたは複数のマーカーを検出する、キットを含む。

XIV. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって見いだされた技術を表し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成するものとみなすことができることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を鑑みて、発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示される具体的な態様に数多くの変更を加えることができ、それでもなお、同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。

実施例1：ヒト腫瘍の免疫プロファイリングがCD73を神経膠芽腫におけるコンビナトリアル標的として同定する
A. 結果
ICTは、特定の腫瘍タイプの患者のサブセットに抗腫瘍応答を提供する（3～9）。最近、独立した研究が、個々の腫瘍、すなわち、腎細胞がん（RCC）、肝細胞がん（HCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）および黒色腫からの腫瘍浸潤白血球（TIL）の詳細なシングルセル分析を提供した（10～13）。これらの研究は、新たな洞察をもたらし、様々ながんの免疫浸潤物に関する以前の所見を検証するが、がんタイプ間の応答の不均一性は、腫瘍タイプ特異的な免疫チェックポイント発現パターンの結果であり得、複数の腫瘍の間でのTIL表現型の包括的な比較を必要とする。この必要性に対処するために、本発明者らは、マスサイトメトリー（CyTOF）を適用して、5つの異なる腫瘍タイプ：NSCLC（n＝15）、RCC（n＝25）、MSI安定結腸直腸がん（CRC）（n＝11）、前立腺がん（PCa）（n＝21）および多形性神経膠芽腫（GBM）（n＝13）を有する患者85名における免疫細胞サブセットをプロファイリングした（補足表1）。これは、様々なヒト腫瘍タイプにわたって免疫細胞サブセットを評価する最初のCyTOFデータセットである。

本発明者らは、まず、各腫瘍タイプ中に存在する主要な免疫浸潤物を比較した（図5）。本発明者らは、NSCLC、RCCおよびCRC腫瘍がCD3⁺T細胞に富み、CD4⁺FoxP3⁺細胞がCRC中で最も頻繁に見られることを認めた（図1A）。PCaおよびGBMはいずれもCD3⁺T細胞による浸潤が不十分であったが、GBMが、より高いCD68⁺骨髄系細胞の存在量を有していた（図1A）。様々な腫瘍タイプの間で共有される表現型を同定するために、本発明者らは、CD45+細胞のPhenoGraphクラスタリングを実施し、6つのCD68⁺骨髄系クラスターおよび1つのNK細胞メタクラスターを含む、8つがCD3⁺T細胞メタクラスターであり、10がCD3^-メタクラスターである、18のメタクラスター（L1～18）を同定した（図1Bおよび図6A～B）。本発明者らは、5つすべての腫瘍タイプ中に存在する6つの免疫メタクラスターのグループを同定した。これらのクラスターは、腫瘍タイプ間でのそれらの分布におけるより高い均一性の尺度である高いシャノンエントロピーを示した。本発明者らはまた、腫瘍特異的分布を示す低いシャノンエントロピー値を示す8つの免疫メタクラスターを同定した（図1C）。

様々なT細胞クラスターの頻度の分析が、NSCLC、RCCおよびCRC中のCD3⁺CD4⁺PD-1^hiおよびCD3⁺CD8⁺PD-1^hiメタクラスター（それぞれL3およびL6）を同定した（図1Dおよび図6C～D）。RCCコホートからのPBMCサンプルを分析すると、本発明者らは、それぞれL3およびL6クラスターと相関するT細胞サブセット（P33およびP24）を同定した。興味深いことに、P33およびP24クラスターは、ICTへの非応答者に比較して応答者において拡大することがわかった（図7A～C）。本発明者らはまた、ICTに対する応答の欠如に寄与しているおそれがある（14、15）、CRCおよびPCa中のそれぞれCD4⁺FoxP3^hi制御性T細胞（L12）およびCD8⁺VISTA⁺（L14）細胞のより高い存在量に注目した（図1D、図6D）。3つのT細胞浸潤腫瘍タイプ（NSCLC、RCCおよびCRC）にわたる30のサンプルからのすべてのCD3ゲート細胞のPhenoGraphクラスタリングが17のメタクラスターを明らかにした（図8A～B）。本発明者らは、T細胞メタクラスター頻度に基づいてこれら30の患者サンプルすべての階層的クラスタリングを実施し、3つの主要なサブグループ（I、IIおよびIII）を同定した（図IE）。T細胞メタクラスターT1（PD-1^hiICOS⁺CD4⁺T細胞様L3）およびT4（PD-1^hiCD8⁺T細胞様L6）がより高い頻度でサブグループII中に認められ、これは主に、ICTに良好に応答する2つの腫瘍タイプNSCLCおよびRCCを含むものであった（図1F）。サブグループIIIは、チェックポイント受容体発現が低いメタクラスターT2（CD4⁺T細胞）およびT3（CD8⁺T細胞）をより高い頻度で含み、サブグループIは、免疫チェックポイントの高い発現と低い発現の両方が見られる、様々なT細胞サブセットを中間の頻度で示した（図8C）。

次に、本発明者らは、異なる腫瘍タイプにわたるCD45⁺細胞のPhenoGraphクラスタリングから同定されたCD3^-CD68⁺骨髄系クラスターの詳細な分析を実施した。本発明者らは、腫瘍タイプにわたって2つのPD－L1^-サブセット（L5およびL17）および2つのPD－L1⁺サブセット（L1およびL8）を認めた（図2Aおよび図9A）。L5はVISTA⁺サブセットとして同定され、NSCLCおよびPCaに比べ、より高い頻度でCRC中に存在していた。L17もまた、VISTA⁺サブセットとして同定されたが、CRC中でのみ見いだされた。L1は、すべての腫瘍タイプによって共有される骨髄系サブセットとして同定された。

メタクラスターL8は、GBM中にのみ見られるユニークなサブセットであった（これは、手動ゲーティングによってさらに検証された）（図2Aおよび図9A～C）。L8は、VISTAおよびPD-1などの他の共阻害分子に加えて、高レベルのCD73を発現した（図9D）。さらに、IHCおよびIF研究は、ヒトGBM腫瘍が、CD73を共発現するCD68⁺マクロファージを高密度で有することを明らかにした（図9E～H）。GBM中の白血球浸潤に関するこれらの所見の妥当性を実証するために、本発明者らは、GBM患者9名の独立したコホートにおけるCyTOFにより、マクロファージおよびT細胞浸潤を分析した（図10）。最初のGBMコホートに比べ、本発明者らは、同様に高頻度のCD73^hiマクロファージおよび低いT細胞数を見いだした。

CD73は、細胞外ATPをアデノシンに変換するためにその上流のシグナル伝達分子CD39と協働するエクトヌクレオチダーゼである（16）。CD73は、GBM中で腫瘍進行を促進し、免疫抑制を誘導することが示されている（16～20）。さらに、最近、マウスGBM細胞によって産生されるキヌレニンがマクロファージ中でCD39をアップレギュレートすることができることが示された（19）。CD73^hi骨髄系細胞を画定し得る遺伝子をより深く理解するために、本発明者らは、4つの追加的なGBM腫瘍に対してシングルセルRNAシーケンシング（sc-RNA seq）を実施した（補足表1）。この分析が17のクラスターを明らかにし、そのうち4つがCD3⁺T細胞クラスターであり、10がCD3^-CD68⁺骨髄系細胞クラスターであった。10の骨髄系クラスターのうち、4つ（R7、R14、R3およびR17）がCD73^hiであった（図2B、矢印によって示す）。本発明者らは、CD73^hi骨髄系クラスターが、ミクログリアシグネチャーとは対照的に、血液由来のマクロファージシグネチャーを示唆する遺伝子の高い発現を有することを見いだした（21）（図2C）。また、CD73^hiマクロファージが、CCR5、CCR2、ITGAV/ITGB5およびCSF1Rを発現することが見いだされ、CD73^hiマクロファージがおそらくはこれらの因子によってGBM腫瘍微小環境に動員されることを示唆した（22～26）（図2D）。本発明者らはまた、免疫刺激遺伝子または免疫抑制遺伝子の発現に関してCD73^hi骨髄系細胞を評価し、CD73^hi骨髄系細胞が免疫抑制および低酸素関連遺伝子の高い発現を有することを見いだした（図2E）。

次に、本発明者らは、4つのCD73^hiクラスター（R7、R14、R3およびR17）を使用して、CD73^hiマクロファージに特異的な遺伝子シグネチャーを導出した（図3；「方法」を参照）。MARCO、TGFBおよびいくつかのSIGLECがCD73^hi細胞中で発現することがわかった（図3A）。遺伝子シグネチャーの有意性を理解するために、本発明者らは、生存率との潜在的な相関に関してCD73^hi遺伝子シグネチャーを評価した。この分析を実施するために、本発明者らはTCGA-GBMコホート（N＝525）を使用した。本発明者らは、TCGA-GBMコホートにおける全生存率（OS）とCD73^hi遺伝子シグネチャーの高い発現との間に有意な負の相関（図3B、p＝0.013、HR＝1.268）を見いだした。CD73^hi骨髄系細胞の潜在的な免疫抑制機能に基づいて、本発明者らは、抗PD-1で処置された患者に由来するGBMサンプルを評価して、これらの細胞の優勢が治療に対する応答の欠如と相関し得るかどうかを決定した。本発明者らは、再発性GBM患者におけるペムブロリズマブの効果を評価する第II相試験に登録されたGBM患者5名のコホートを使用した（NCT02337686、「方法」）。7つの未処置腫瘍およびペムブロリズマブで処置されたGBM患者5名のコホートのPhenoGraphクラスタリングが、CD3^-CD68⁺骨髄系サブセットとして特性評価された12のサブセット、2つのCD3⁺T細胞サブセットおよび1つのNK細胞CD3^-CD56⁺サブセットからなる17のクラスターを明らかにした（図3C～D；図11）。12のCD68⁺骨髄系サブセットのうち、3つのCD73^hi骨髄系クラスターが見られた（図3D；赤い矢印によって示すG2、G8、G11）。未処置GBMサンプルを抗PD-1処置GBMサンプルと比べると、本発明者らは、ICTによる処置にもかかわらず、これら3つのCD73^hi骨髄系クラスターが持続することを見いだした（図3E）。CD73低またはCD73陰性であった残りの骨髄様クラスターの評価もまた、ICTによる処置にもかかわらず持続し、これは、抗PD-1処置後に骨髄系マーカーに変化が見られなかった以前の研究（27）の結果と一致している。注目すべきことに、それぞれCD4およびCD8を表す2つのT細胞クラスターが同定され（図3D；青い矢印によって示すG3、G6）、それらは、未処置GBM腫瘍と抗PD-1処置GBM腫瘍との間で有意差を示さなかった（図3F）。未処置および抗PD-1処置腫瘍のGSEA分析が、ネオアジュバント設定における抗PD-1処置の適度な臨床ベネフィットを示唆した最近の研究（28）と一致して、抗PD-1処置患者におけるIFN-γ応答性遺伝子のより高い発現を明らかにした（図3G）。これらの所見は、抗PD-1が、おそらくはTILにおいて中等度の免疫応答を誘導するにもかかわらず、CD73^hi骨髄系細胞のその高い含有を特徴とするGBM TMEを大きくは変化させないことを示唆する。CD73^hi骨髄系細胞の優勢がT細胞浸潤の欠如に寄与し、それによって不十分な臨床転帰を招くということが考えられる。

CD73のターゲティングがGBMにおける併用戦略の成功に重要であるという仮説を試験するために、本発明者らは、GL-261 GBM腫瘍細胞を同所的に接種された野生型（WT）およびCD73^-/-マウスを使用して逆翻訳研究を実施した。CD73の非存在下では、頭蓋内腫瘍の成長が妨げられ（図12A）、マウスは生存率の改善を示して、GBMにおけるCD73の免疫抑制的役割が確認された（p＝0.01）（図12B）。腫瘍微小環境内のCD73の効果を理解するために、本発明者らは、腫瘍微小環境の比較免疫プロファイリングを実施し、CyTOFを使用してWTマウスとCD73^-/-マウスとの間の免疫浸潤物の差を評価した（図12C）。CD73の非存在は、B16-F10黒色腫およびMC-38結腸がんなどのマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍内T細胞存在量を増すことが示されたが（29）、CD45⁺ゲート細胞のクラスタリングは、WTマウスとCD73^-/-GBM腫瘍担持マウスとの間でT細胞サブセットの有意な変化を明らかにしなかった。GBMモデルにおいて、発明者らは、WTマウスに比べたときのCD73^-/-マウスにおける免疫抑制CD206⁺Arg1⁺VISTA⁺PD-1⁺CD115⁺骨髄系クラスターの減少（Gmm20、p＝0.0079）を含む、骨髄系（CD11b⁺F4/80⁺）サブセットにおける差に注目した（図12D）。興味深いことに、本発明者らはまた、WTマウスに比べたときのCD73^-/-マウスにおけるiNOS⁺骨髄系クラスターの付随的増加（Gmm13、p＝0.0159）を認めた（図12D～E）。このデータは、マクロファージ極性化におけるCD73の役割を裏付ける。全体として、データは、マウスGBM腫瘍モデルにおけるCD73の非存在が、腫瘍内骨髄系サブセットを調節することによって生存率を改善することを示す。

次に、本発明者らは、マクロファージ表現型におけるCD73媒介変化がICTの効力に影響することができるかどうかを評価した。本発明者らは、GBM腫瘍担持マウスを抗PD-1抗体または抗PD-1抗体と抗CTLA-4抗体との併用で処置した。図4Aは、未処置およびICT処置マウスからのGBM腫瘍の代表的なMRI画像を示す。未処置の対照に比べ、抗PD-1と抗CTLA-4との併用で処置されたWTおよびCD73^-/-マウスにおいて、生存率の有意な改善が認められた（p＜0.0001）（図4B）。重要なことに、抗PD-1と抗CTLA-4との併用による処置の後、CD73^-/-マウスは、WT GBM腫瘍担持マウスに比べ、改善された生存率を示した（p＝0.03、図4B）。本発明者らは、WTおよびCD73^-/-マウスにおける抗PD-1処置からは有意な延命効果を見いださなかった（図4B）。本発明者らは、CD206⁺免疫抑制マクロファージに対するiNOS⁺免疫刺激マクロファージの比が、WTマウスに比べてCD73^-/-マウスにおいて有意に高いことに注目した。これは、併用療法で処置された腫瘍担持マウスにおいてより明らかであった。同様に、CD206⁺免疫抑制マクロファージに対するグランザイムB⁺ CD8 T細胞の比が、WTに比べてCD73^-/-マウスにおいて有意に高く、併用療法後、さらに顕著になる（図4C～D）。したがって、これらのデータは、併用ICTを使用するT細胞浸潤の増大が、CD73^-/-マウスにおける免疫刺激表現型へのマクロファージの極性化と相まって、ICTに対する応答を決定する上で重要な役割を果たすことを示唆する。

複数の免疫チェックポイントが存在するが（30～32）、データは、腫瘍微小環境における免疫チェックポイントの動的な相互作用が腫瘍タイプごとに特異的であることを示唆する。併用免疫療法による臨床試験が前例のない速度で進行中である。しかし、腫瘍－免疫相互作用の包括的な理解はまだ限られており、腫瘍特異的なやり方で合理的な併用療法を設計することはできない。この研究は、詳細なヒト腫瘍分析をマウス逆翻訳研究と結合して、GBMにおける将来の臨床試験のための併用戦略を生み出した。全体として、この研究は、プレシジョン免疫療法のためにヒトデータセットから生成された関連する仮説を試験するためには逆翻訳研究がきわめて重要であることを強調する。

この研究において、本発明者らは、1）複数の異なるヒト腫瘍、および2）GBM患者における抗PD-1臨床試験からの免疫プロファイリングデータを提供した。本発明者らは、抗PD-1療法による処置後でも持続する、GBM中に特異的に存在するCD73^hi骨髄系集団を同定した。さらに、本発明者らは、TCGA-GBMコホートにおいてOSと負に相関するCD73^hi骨髄系細胞クラスターから遺伝子シグネチャーを導出した。scRNAシーケンシングは、CD73^hi骨髄系細胞が免疫抑制遺伝子に富み、内在するミクログリアシグネチャーとは異なるシグネチャーを有することを示した。CD73^hi骨髄系細胞はさらに、CCR5、CCR2、ITGAV/ITGB5およびCSF1Rなどのケモカイン／ケモカイン受容体のより高い発現を特徴とする。いくつかの臨床試験が、GBMをはじめとする進行性固形腫瘍のある患者においてこれら個々のケモカイン受容体をターゲティングする有用性を試験しているが、CD73^hi骨髄系細胞におけるこれらの受容体の累積的な発現は、CD73そのものが、これらの受容体すべてを発現する細胞の大部分で高度に発現するため、より適切な標的であることを示唆する。例えば、CSF1Rをターゲティングする臨床試験が、他の免疫抑制マーカーを発現する骨髄系集団の継続的な存在に起因し得る、限られた臨床効力を実証している（33、34）。

このデータは、抗PD-1療法を受けたGBM患者における免疫抑制CD73^hi骨髄系サブセットの持続性と、CD73欠損マウスモデルにおける免疫チェックポイント阻害物質の治療ベネフィットとを示す。このデータおよび以前の研究に基づいて、本発明者らは、CD73をターゲティングし、かつPD-1およびCTLA-4を二重遮断する併用療法戦略を提案する。抗CD73抗体は、前臨床および初期臨床研究において有望な結果を出し（35、36）、したがって、これらのデータは、現在利用可能な抗CD73抗体によるGBMの併用療法の迅速な変換による臨床用途を有する。

B. 方法
1. 患者および外科的サンプル
再発した多形性神経膠芽腫のある患者を、MDACC臨床プロトコル2014-0820（NCT02337686）において3週ごとにペムブロリズマブで処置し、PA13-0291への同意を得た。個々の患者の臨床的特性が補足表1に示されている。

2. 細胞株および腫瘍モデル
マウス神経膠芽腫がん細胞株（GL-261）は、アメリカ国立がん研究所（Rockville, MD, USA）から入手したものであった。細胞を対数期に捕集し、PBSで2回洗浄した直後、腫瘍を注射した。以前に記載されているようにして、細胞50,000個をマウス（1グループあたり5または10匹）に脳内注射した（37）。抗CTLA-4（クローン9H10）および抗PD-1（RMP1-14）抗体は、BioXcell（West Lebanon, NH）から購入したものであった。腫瘍接種後7日目（200μg/マウス）、10日目（100μg/マウス）および13日目（100μg/マウス）に、抗PD-1および抗PD-1と抗CTLA-4との組み合わせをマウスに腹腔内注射した。

3. マスサイトメトリー（CyTOF）
患者PBMCを密度勾配遠心分離によって血液から分離し、90％ AB血清および10％ DMSO中に再懸濁させ、分析まで液体窒素中に保存した。新鮮な腫瘍組織を、GentleMACSシステム（Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach, Germany）により、製造元の使用説明書にしたがって分離させ、96ウェルプレート中、10％ヒトAB血清、10mM Hepes、50μM β-ME、ペニシリン／ストレプトマイシン／l-glumacrophagesineを添加されたRPMI1640培地とともに一晩培養した。マウス実験のために、新たに捕集した腫瘍をリベラーゼ／DNAse溶液で分離させ、37℃で30分間インキュベートした後、シングルセルを作製した。細胞を最大36の抗体で染色した。抗体は、Fluidigmから事前にコンジュゲートされた状態で購入されたもの、または、購入された後、MaxPar X8ポリマーキット（Fluidigm）を使用して製造元の使用説明書にしたがって社内で精製し、コンジュゲートさせたものであった（補足表4を参照）。簡潔にいうと、サンプルを、5％ヤギ血清および30％ BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中、4℃で30分間、細胞表面抗体で染色した。ヒトPBMCの連続希釈染色によって最適な抗体濃度を決定した。30％ BSAを含むPBS中、5μMシスプラチン（Fluidigm）による生死判別染色の後、サンプルを、30％BSAを含むPBS中で洗浄し、FoxP3染色バッファーセット（eBioscience）を使用して、製造元の使用説明書にしたがって固定し、透過処理し、その後、透過処理バッファー中、4℃で30分間、細胞内抗体とともにインキュベートした。サンプルを洗浄し、Irインターカレーター（Fluidigm）中でインキュベートし、一般には12時間以内の取得まで4℃で保存した。取得の直前にサンプルを洗浄し、EQ 4エレメントビーズ（Fluidigm）を含む水中に再懸濁させた。サンプルをHeliosマスサイトメーター（Fluidigm）上に取得した。

4. マスサイトメトリー分析
CyTOFを使用して、ヒト患者サンプルの4つの別々のコホートを分析した（以下、異なるデータセットに関して個別に説明するように、分析には細胞が少なすぎるサンプルを除いた後）：1）5つの異なる腫瘍タイプから抽出されたTILからの66のサンプル；2）ペムブロリズマブによる処置後に患者から切除された腫瘍から抽出された5つの追加的GBM TILサンプル；3）9つの追加的免疫チェックポイント療法未経験のGBM TILサンプルの検証コホート；および4）14名の別々のRCC患者由来の、2および／または4サイクルのイピリムマブおよびニボルマブの併用処置の前と後の両方からの14のマッチしたPBMCサンプル。多腫瘍およびGBMコホートに使用されたパネルは同一であったが（以下に説明する、いくつかのサンプルにおいてどのチャネルをHLA-DRに使用したかに関する1つの違いを除き）、RCC PBMCコホートには別個のパネルを使用し、それを完全に別個に分析した（補足表1）。大部分、これらの異なるコホートを使用した様々な分析は、同一ではないとしても類似したやり方で進めた。異なった点は以下で明示的に言及する。

まず、ファイル（fcs）をCytobankにアップロードし、マスサイトメトリーデータ用のビーズベースの正規化ソフトウェア（R package premessa, Parker Institute for Cancer Immunotherapy）（Amir el, A.D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature biotechnology 31, 545-552 (2013)）を使用して正規化した。RCC PBMCサンプル（上記コホート3）は、所与の患者由来の各サンプルのためのマスタグ細胞バーコーディングを使用して標識されたものであったため、患者間でのビーズベースの正規化の前に、Zunder et al., 2015（Levine, J.H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell 162, 184-197 (2015)）に概説された戦略を使用してさらに逆多重化した。初期TIL（コホート1）および追加的な処置後GBM（コホート2）サンプルの場合、異なるサンプルのために174Ybまたは209BiのいずれかにコンジュゲートされたHLA-DRに対する抗体を使用したため、発明者らは、174Ybおよび209Bi同位体のためのシグナルをHLA-DRのための単一チャネルへとマージした。

次いで、FlowJoで、サンプルを、イベント長ごと、生死識別ごと、かつ関心対象の集団に関し、別々の分析のための系統マーカー（CD45およびCD3）を使用して手動でゲーティングした。次いで、ダウンストリーム分析のために、データをfcsファイルとしてMatlabまたはRにエクスポートし、5の係数を使用してarcsinh変換した（x_transformed＝arsinh（x/5））。最終ゲートにおけるイベントが600未満のサンプル（例えばCD45⁺細胞またはCD3⁺細胞）は、クラスタリング、次元削減および他の分析に細胞が不十分であるため、除外した。GBM特異的TIL分析の場合、ファイル1814が1170の細胞を含み、それがサブサンプリングされておらず、全1170の細胞が分析に含まれたため、11のサンプルそれぞれから4300の細胞（1つを除くすべてのサンプルからのゲーティング後の生存細胞の最小数であったため、選択された）をランダムに選択した。

高次元データを二次元で可視化するために、t分布型確率的近傍埋め込み法（t-SNE）次元削減アルゴリズム（Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A 87, 636-645 (2015)）を多腫瘍TILサンプルの分析に適用し、かつ、別個に、合計12のGBMサンプル（5つの処置後サンプルを7つの初期サンプルとともに含む）の分析にも適用した。多腫瘍サンプルの場合、CD326（EPCAM）以外のすべてのマーカーと、関心対象の集団（例えばCD45およびCD3）を手動でゲーティングするために使用されるマーカーとを使用して、各腫瘍タイプから10,000の細胞をランダムに選択した。GBM TIL分析の場合、上記に説明したようにサブサンプリングを実施した。RパッケージRtsne中のアルゴリズムのBarnes-Hut実装を使用してすべてのt-SNEマップを作成し、ggplot2 Rパッケージ()を使用してデータを表示した。個々のマーカーの発現がオーバーレイされたt-SNEプロットの場合、すべての値のarcsinh変換されたシグナル強度をそのチャネルの強度の99パーセンタイル値で割って、チャネルごとに0～1の範囲のシグナル強度を導出した。

マウスCyTOFサンプルの場合、前処理と正規化の両方を同一に実施した（ただし、完全に別々のマウスパネルを使用）。クラスタリングおよび他のダウンストリーム分析は、以下で説明するように、異なるやり方で実施した。

5. マスサイトメトリークラスタリング
PhenoGraphクラスタリングアルゴリズムのMATLAB実装を使用してクラスタリング分析を実施した（Azizi, E., et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell 174, 1293-1308 el236 (2018)）。多腫瘍サンプル（コホート1）のクラスタリング分析の場合、バッチからのノイズおよび他の効果を減らし、マーカー冗長性を圧縮するために、CD326（EPCAM）以外のすべてのマーカーと、関心対象の集団（それぞれCD45およびCD3ならびにネガティブゲートとして使用されたときの別個のT細胞分析のためのCD68）を手動でゲーティングするために使用されるマーカーとを使用して、個々の患者からのデータを、クラスタリング前に観測された分散の90％を占める主成分上に投影した。この手法は、生理学的に無関係な集団の捕捉を回避し、ビーズ正規化によって考慮されない残留ノイズを減らすために用いられたものである。これらの主成分によって形成される空間中、PhenoGraphをサンプルごとに使用してクラスターを同定した。その際、最近傍の数のためのパラメーターkは、式k＝最小数（0.002＊細胞数、10）を使用して、サンプルごとにユニークに選択した。個々のサンプルごとに、汎陽性（高レベルの全マーカーを発現する、すなわち、おそらくはダブレット）および汎陰性（マーカーを発現しない）クラスターは、アーチファクトである可能性が高いため、ダウンストリームのメタクラスタリングおよび頻度分析から除外した。それらは各親集団の0.4％未満を占めた。

マウスCyTOFデータの場合、Cytobankを介するFlowSOMクラスタリング法（van Dijk, D., et al. Recovering Gene Interactions from Single-Cell Data Using Data Diffusion. Cell 174, 716-729 e727 (2018)）を使用して正規化データをクラスタリングした。

バッチ効果を考慮しながらサンプル間で表現型を比較するために、各サンプルからのクラスターを、すべての非放棄チャネルにわたるそれらの重心によって表現し、CD45⁺TIL分析の場合には794クラスター（45のサンプルにわたる）×34マーカーおよびCD3⁺TIL分析の場合には486クラスター（30のサンプルにわたる）×32マーカーのサイズの単一の行列へとマージした。これらの行列の両方に対して個別にパラメーターk＝10でPhenoGraphを実施して、CD45⁺分析では18のメタクラスターを得、CD3⁺分析では17のメタクラスターを得た。

腫瘍タイプ間で腫瘍タイプ非依存的な免疫ランドスケープを見いだすために、多腫瘍TIL分析中のサンプルおよび腫瘍タイプごとに、各メタクラスターに属する細胞の頻度を計算した。サンプルを、ウォード法による階層的クラスタリングを使用してそれらのメタクラスター頻度ごとに階層的にクラスタリングし、樹状図で可視化した。

RCC PBMC分析の場合（図7）、バーコーディングが、最初のサンプル特異的なクラスタリングステップおよびそれに続くメタクラスタリングの必要性を減らした。その結果、すべての処置前および処置後サンプルからの全細胞（サブサンプリングなしでは100万超の全細胞が得られる）が一斉にクラスタリングされた。また、12の処置前または処置後GBMサンプルのクラスタリング分析の場合（図3A）、この小さめのセット中の個々の患者それぞれから得られたクラスターの数（全部で約200）は安定かつロバストなダウンストリームメタクラスタリングを可能にしなかったため、すべてのサンプルから細胞（上記tSNEセクションと同一にサブサンプリングされたもの。各サンプルからの4300の細胞の他、サンプル1814からの1170の細胞）に対して一斉にクラスタリングを実施した。これは、この特定の分析において軽度に高められたバッチ効果を生じさせるおそれがあり、したがって、それが解釈において考慮に入れられるべきである。また、この分析においては、147の細胞の1つの小さな汎陽性クラスター（合計の0.3％）がダウンストリーム分析から除外された。また、GBM検証コホート（コホート3）中の9つのサンプルすべてが一斉にクラスタリングされた。これらの分析すべてにおいて、PCA前処理は上記のように実施した。

分析に依存してクラスターまたはメタクラスターのいずれかによるマーカー発現のヒートマップ表示のために、発現を、各パラメーターの最大平均クラスター値で割ることによって正規化し、ggplot2パッケージ中のgeom_tile関数を使用するカスタムメイドスクリプトでRに表示した。すべての箱ひげ図中、描かれた箱は四分位範囲を示し、中央のバーは中央値を示し、ひげは範囲を示す。

6. 統計的分析
メタクラスターおよびサブセット頻度を二段階手法で比較した。第一に、多腫瘍CyTOF分析からの14のメタクラスターに関してクラスカル・ウォリス検定を実施し、ベンジャミニ・ホッホベルク法を使用して多重比較のために補正した。L2、L4、L15およびL18ならびにT12、T13は、分析されたデータセット中で発現しなかった、1名の患者によってしか発現されなかった、または不明確な系統であり、ひいては比較に適さなかったため、多重比較補正から除外した。p.adjust()関数（R studio Version 1.0.153）を使用してq値を計算し、q＜0.05を統計的に有意とみなした。第二に、腫瘍タイプ間で統計的に有意な変動があるメタクラスター／サブセットに対してのみ、マン・ホイットニー検定を使用してペアワイズ比較を実施し、ベンジャミニ・ホッホベルク法を使用して、統計的に有意とみなされるq＜0.05でそれぞれのクラスター内の多重比較を補正した。

マウス実験における細胞クラスター頻度の比を計算するために（図4D）、グランザイムBを発現する3つのCD8 T細胞クラスターを同定し（クラスター19、26および27）、それらの細胞頻度を加算した。同様に、骨髄系クラスターを発現する4つのiNOS（クラスター1、2、6および7）を同定し、細胞頻度を加算した。骨髄系クラスターを発現するCD206は1つしか認められなかったため（クラスター5）、それを個別に採取した。グランザイムB⁺CD8 T細胞クラスターの累積頻度およびiNOS⁺骨髄系クラスターの累積頻度をそれぞれCD206⁺骨髄系クラスターの頻度で割り、その比をGraphPad Prism 7中でプロットして統計値を得た。これらの分析に使用された統計的方法の概要が補足表2に含まれている。

7. クラスター混合
ブートストラップ技術を使用して、6つの腫瘍タイプ（mCRCを含む）の間で18のCD45⁺免疫メタクラスターの混合を推定して、1,800余りの細胞から180,000余りの細胞まで及ぶ様々なクラスターサイズを補正した。置き換えによって各クラスターから均一にサンプリングされた1000の細胞にわたる腫瘍タイプの経験分布に関してシャノンエントロピーを計算した。このサンプリング手法をクラスターごとに1000回繰り返して、エントロピーのクラスターサイズ補正された標準誤差をブートストラップした。図2Cは、平均エントロピー順に並べた、各クラスター中のエントロピー値の箱ひげ図を示す。

8. 免疫組織化学
IHC分析のために、GBM腫瘍組織を10％ホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋し、横方向に切断した。4μmの切片をヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色した。パラフィン包埋組織切片に対してIHC分析を実施した。一次抗体を使用して、CD3（Dako, Cat# A0452）、CD8（Thermo Scientific, Cat# MS-457-S）、CD68（Dako, Cat# M0876）を検出した。抗体を二次抗体で検出したのち、ペルオキシダーゼ結合アビジン／ビオチンおよび3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）基質（Leica Microsystem）で検出した。Scanscope XT（Aperio/Leica Technologies）からのスキャンスコープシステムを使用してすべてのIHCスライドをスキャンし、デジタル化した。提供された画像分析ソフトウェア（ImageScope-Aperio/Leica）を使用してIHC染色の定量分析を実施した。陽性細胞の密度（陽性細胞数/mm2）の分析のために、特異的マーカーごとにカスタマイズされたアルゴリズムを使用して、5つのランダムな区域（それぞれ少なくとも1mm2）を選択した。

9. 多重免疫蛍光アッセイおよびマルチスペクトル分析
多重染色のために、本発明者らは、以下のマーカーに関してOpalプロトコル染色法（Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A 83, 483-494 (2013)）を踏襲した：CD73（1：200、Abcam、ab91086）と、それに続く、フルオレセインCy3（1：50）を使用した可視化；CD163（1：25、Leica Biosystems、NCL-L-CD163）と、Cy5（1：50）を使用して達成した可視化；およびCD68（1：100、Dako、M0876）と、Cy5.5（1：50）を使用した可視化。その後、DAPI（1：2000）で核を可視化した。Vectashield H-1400封入剤を使用してすべての切片をカバースリップした。マルチスペクトル分析のために、以前に記載されている詳細な方法論（Stack et al., 2014）を踏襲した。個別に染色された切片それぞれを利用して、マルチスペクトル分析に必要なフルオロフォアのスペクトルライブラリーを確立した。スライドを、蛍光条件下、Vectraスライドスキャナー（PerkinElmer）を使用してスキャンした。次いで、マーカーごとに、症例あたりの平均蛍光強度を、陽性細胞を樹立することができる基点として決定した。最後に、共局在化アルゴリズムを使用して、CD68、CD163およびCD73染色の割合を決定した。

10. シングルセルRNAシーケンシング
10×ゲノミクスクロムシングルセルコントローラーを使用してシングルセルRNAシーケンス（sc-RNA seq）を実施した。簡潔にいうと、腫瘍細胞シングルセル懸濁液を上記のように調製した。細胞を、90％ AB血清および10％DMSOを含む凍結培地中に再懸濁させ、分析まで液体窒素中に保存した。sc-RNA seq分析のために、細胞を解凍し、洗浄し、BD FACSAriaを使用して生存CD45⁺細胞をソートした。次に、Chromium（商標）Single Cell 3'v2 Reagent Kitを10×ゲノミクスマイクロ流体システムとともに使用して細胞を液滴分離して、個々の細胞のための個々のバーコードを有するcDNAライブラリーを創製した。GBM患者からのバーコーディングされたcDNA転写物をプールし、Ilumina HiSeq 4000 Sequencing Systemを使用してシーケンシングした。

11. シングルセルRNAシーケンシングクラスタリングおよび統計的分析
4つのGBM sc-RNAseqサンプルそれぞれに関し、Illumina fastqファイルを前処理し、Sequence Quality Control（SEQC）パッケージを使用してカウント行列へと変換した。簡潔にいうと、SEQCは、Iluminaバーコードおよびゲノムシーケンスのfastqまたはbclファイルを入力として受け取り；それらを、アラインメント可能なシーケンスおよびメタデータを含む単一のfastqファイルへとマージし；バーコード置換エラーおよび低複雑度エラーを含む一般的なエラーのためのリードをフィルタリングし；STARを使用してリードをアラインメントし；複数のアラインメントリードを解決し；エラー削減され、フィルタリングされたリードを細胞、分子および遺伝子アノテーションごとにカウント行列へとグループ化する。また、ライブラリーの品質を評価するための一連のQCメトリックを出力する。パイプラインは、Azizi, et al. 2018で詳細に記載されている。

次いで、これらの4つの別々のカウント行列を、13,263細胞（患者1名あたり2,763～3666個の範囲）×19,187遺伝子のサイズの1つの大きなカウント行列へとマージした。まず、データを3つの連続的な方法で前処理した。まず、sc-RNA seqデータのための標準的な実施と同様に、細胞ごとに中央値ライブラリーサイズにしたがって正規化し；次に、対数変換し；最後に、主成分分析を適用して、遺伝子発現に固有の冗長性（いわゆる「内在次元」）を利用しながら、ノイズをさらに減らし、シグナルロバスト性を最大化して、主成分が、保持された分散の90％を占めるようにした。

次に、1細胞あたりのユニークな分子（UMI）の中央値は4つのサンプルの間で低く（それぞれ1170、1210、1468および1592）、sc-RNAseqデータに一般的であるように、疎データ行列を生じさせた。したがって、本発明者らは、代入アルゴリズムMarkov affinity-based graph imputation of cells（MAGIC）を使用して、カウント行列のノイズを除去し、データ希薄性および遺伝子ドロップアウトを補正した。MAGICは、データ拡散を介して、類似した（「隣接する」）細胞間で共有される情報を利用して、カウント行列のノイズを除去し、かつ重要なことに、おそらくは存在するがサンプリングエラーのせいで失われた欠落した転写物（「ドロップアウト」または偽陰性）を埋める。これは、重要な細胞集団中の共発現パターンの場合など、遺伝子－遺伝子の関係を調べる場合に特に重要である。小さな留意点として、MAGICはまた、前処理ステップとしてPCAを実行するが、完全な（非次元削減）代入カウント行列を返す。ダウンストリーム分析（クラスタリングなど）のために、上記のPCA前処理をこの代入カウント行列に適用した。MAGICの直感的、生物学的および数学的理論ならびにアルゴリズム手順の完全な詳細な説明がvan Djik et al., 2018に提供されている。この分析の場合、以下のパラメーター設定：全遺伝子；10のk（最近傍の数）；15のアルファ；および拡散データのプロクラステスディスパリティにしたがってtが選択されるように拡散演算子が累乗されるべき指数の自動（「t＝auto」）値（このやり方で選択されたtの値は8であった）で、MAGICのR実装を使用した。

sc-RNA seqデータのt-SNE可視化を、再度、4名すべての患者に由来する全細胞に適用された縮小PCAスペースを使用して、アルゴリズムのBarnes-Hut実装と、個々のマーカーまたは多遺伝子シグネチャーの平均発現のいずれかの最大帰属発現に対するシグナル強度とを使用して実施した。

全細胞における縮小PCAスペース中でPhenoGraphを使用して、kを再び0.002＊数（細胞）＝38に設定した状態で、sc-RNA seqデータのクラスタリングを実施した。かなりの頻度で任意の標準的な免疫タイピングマーカー（CD45、CD3、CD8、CD4、CD14、CD68など）を発現しない、合計でも全体の1パーセントの半分に満たない細胞の1つのクラスターを同定した。しかし、それは、ニューロンと関連するいくつかのマーカーを高レベルで発現した。したがって、本発明者らは、それが、おそらくは、CD45ベースのソートプロセスによって誤って見落とされ、すべての分析から除外された希な汚染物質であり、この研究における調査対象である免疫集団の範囲外であったと結論づける。

低酸素症、抗炎症（「免疫抑制」）および炎症促進（「免疫刺激」）遺伝子シグネチャーはAzizi, et al. 2018から引用されたものであり、ミクログリア対骨髄由来シグネチャーはMuller et al., 2017から引用されたものである。すべての場合において、問題のシグネチャーの発現の強度は、シグネチャーに含まれる遺伝子の平均発現として計算した。

この研究において特に関心対象であるCD73⁺マクロファージ集団を表す遺伝子シグネチャーを画定するために、高レベルのCD73および様々な組み合わせの他の免疫抑制因子（R3、R7、R14およびR17）を発現する4つのsc-RNA seq PhenoGraphクラスターを1つにグループ化し（4つのクラスターからの全細胞をマージした）、それらの差次的発現を、それら4つのクラスターのいずれの中にもない（すなわち、T細胞、骨髄系およびNK細胞集団を含む、13の他のクラスターのいずれかに属する）全細胞に比較した。合わさると、これらの3つのクラスターの1つの中に3453の細胞があった。差次的発現のための従来のバルクRNA-seq法は、サンプル／細胞集団間の平均発現および倍数変化に依存するが、シングルセルデータの決定的な局面は、細胞集団中の細胞の完全な分布（すなわち、点表現とは対照的に、分布）（多次元遺伝子発現に関する）を利用する能力である。これらの完全な分布を最大限に活用し、最近の研究でますます使用されている集団間の差次的発現を評価する方法がEMD（Earth Mover's Distance）である。物理的にいうと、EMDは、移動させる物質の量に移動距離を掛けたものとして定義される、何らかの物質（たとえば土）の1つのパイルを別の物質のパイルに変換する最小「コスト」を定量化する。したがって、確率論においては、2つの分布の間の距離（ここでもまた、単に例えばそれらの平均の間の距離とは対照的に）を測定する。一次元分布の場合（細胞のグループ中の単一遺伝子の発現の分布の場合）、それは、2つの分布の累積密度関数のL1ノルムとして簡便かつ効率的に計算することができる。したがって、本発明者らは、関心対象の2つの分布（4つのCD73⁺クラスターに属する細胞および他のすべてのクラスターに属する細胞）の間で、遺伝子ごとにこの方法を使用してEMDを計算し、それらのEMDによって19,000超の遺伝子すべてをランク付けした（上位の遺伝子はCD73⁺クラスター中で差次的に高く発現し、下位の遺伝子はその逆）。全遺伝子にわたるEMD値および対応するzスコアが補足表3中で全遺伝子に関して提供されている。zスコアが2.0を超える全遺伝子が図3Aに示されている。

12. ナノストリング遺伝子発現分析
脱パラフィン溶液（Qiagen, Valencia, CA）を使用する脱蝋により、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）腫瘍切片からRNAを単離し、RecoverALL（商標）Total Nucleic Acid Isolationキット（Ambion, Austin, TX）を製造元の使用説明書にしたがって使用して、全RNAを抽出した。ND-Nanodrop 1000分光計（Thermo Scientific, Wilmington, MA, USA）でRNA純度を評価した。NanoStringプラットフォームの場合、RNA 100ngを使用して、nCounter PanCancer Immune ProfilingパネルをカスタムCodeSetとともに使用して免疫遺伝子発現を検出した。レポータープローブのカウントをnCounter Digital Analyzerによってサンプルごとに表にまとめ、生データ出力をnSolver（ワールドワイドウェブ上、nanostring.com/products/nSolverで入手可能）中にインポートした。nSolverデータ分析パッケージを正規化に使用し、Qlucore Omics Explorerバージョン3.5ソフトウェア（Qlucore, NY, USA）で階層的クラスタリングヒートマップ分析を実施した。

13. MRI画像定量化
ImageJソフトウェアバージョン1.52aを使用してMRI画像を定量化した。まず、画像をインポートし、明るさ／コントラストを調節した。次いで、画像スライスをスキャンして腫瘍セクションを特定した。各セクション中の腫瘍の周囲にゲートを引き、面積を測定した。画像寸法形状が、スライス厚さが0.75mmであり、2つのセクション間の距離が1mmであることを示した。各セクション中の腫瘍面積に0.75を掛け、2つのセクション中の腫瘍面積の平均をとり、（1－0.75）0.25を掛けた（これが深さの値を出した）。腫瘍含有セクションからの腫瘍面積と深さとを掛けることによって各腫瘍の体積を出した。すべての値を加算して、腫瘍の体積を立方mm単位で決定した。

14. 生存率分析
この方法を使用する遺伝子発現シグネチャーは、zスコアが3.0を超える上位44の遺伝子をとることによって画定した。マイクロアレイパネルに基づく遺伝子発現データをcBioportal（2018年11月7日時点、ワールドワイドウェブ上、cbioportal.org/datasets, Glioblastoma Multiforme (TCGA, Provisional)から入手可能）からダウンロードした。分析において、本発明者らは、臨床データが利用可能である原発腫瘍を有する患者525名を使用した。暫定データセットにおいて、本発明者らは、Nature 2008で公開された患者201名からのデータを利用し、本発明者らは、Cell 2013で公開された患者151名からのデータを利用し；U133マイクロアレイデータ中に9つの遺伝子が見いだされないため、44のシグネチャー遺伝子のうち35を使用した。患者を、シグネチャー遺伝子の平均zスコア値によってソートしたのち、高発現のグループ（n＝263）と低発現のグループ（n＝262）とに分けた。ログランク検定が、生存率とシグネチャー遺伝子の発現レベルとの有意な負の関連を示した（p＝0.013）（図3B）。

15. マウス実験の統計分析：
すべてのデータは、各インビボ実験において5～10匹のマウスを使用した少なくとも2～3回の独立した実験を表す。データは、平均±平均の標準誤差（SEM）として表され、Prism 7.0統計分析ソフトウェア（GraphPad Software, La Jolla, CA）を使用して分析した。スチューデントt検定（両側）、ANOVAおよびボンフェローニ多重比較検定を使用して、処置グループ間の有意差（p＜0.05）を特定した。ログランク検定を使用して生存実験からのデータを分析した。

C. 表
（補足表１）相関アッセイを実施した患者特性
ICT：免疫チェックポイント療法、CT：化学療法、RT：放射線療法、TT：標的療法、HT：ホルモン療法

（補足表２）統計的検定を要約する表
BH：ベンジャミニ・ホッホベルク、CRC：結腸直腸がん、GBM：多形性神経膠芽腫、KO：CD73ノックアウト、KW：クラスカル・ウォリス検定、MW：マン・ホイットニー検定、WSR：ウィルコクソンの符号順位検定、n/a：該当なし；NSCLC：非小細胞肺がん、PCa：前立腺がん、RCC：腎細胞がん、wt：CD73野生型

（補足表３）遺伝子のEMD値および対応するzスコア

（補足表４）主要リソース表

本明細書に開示および特許請求されるすべての方法は、過度の実験なしに、本開示に照らして作製し、実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明されてきたが、当業者には、発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載された方法および本明細書に記載された方法のステップまたはステップの順序に変更を加え得ることが明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載される作用物質の代わりに化学的および生理学的に関連する特定の作用物質を使用しても、同じまたは類似の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および変更はすべて、添付の特許請求の範囲によって画定される発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。

参考文献
以下の参考文献および本明細書全体を通して参照される刊行物が、本明細書に記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims (77)

1. 対象が該対象由来の生物学的サンプル中で低いCD73発現を有すると決定された後、免疫チェックポイント遮断（ICB）療法を該対象に投与する段階を含む、該対象における神経膠芽腫を処置する方法。
2. 前記発現が対照に比べて低い、請求項1記載の方法。
3. 生物学的サンプルが、単離された免疫細胞を含む、請求項1または2記載の方法。
4. 生物学的サンプルが、単離されたマクロファージを含む、請求項3記載の方法。
5. 生物学的サンプルが、血清サンプル、生検サンプルまたは免疫細胞の単離された画分を含む、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
6. CD73の発現が、免疫細胞中で低いと決定される、請求項3～5のいずれか一項記載の方法。
7. ICB療法が単独療法または併用ICB療法を含む、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
8. ICB療法が、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、B7-1および／またはB7-2の阻害物質を含む、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
9. ICB療法が抗PD-1モノクローナル抗体および／または抗CTLA-4モノクローナル抗体を含む、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
10. ICB療法が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、イピリムマブまたはトレメリムマブのうちの1つまたは複数を含む、請求項9記載の方法。
11. 少なくとも1つの追加的抗がん処置を投与する段階をさらに含む、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
12. 少なくとも1つの追加的抗がん処置が、外科療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、小分子療法、受容体キナーゼ阻害物質療法、抗血管新生療法、サイトカイン療法、凍結療法または生物学的療法である、請求項11記載の方法。
13. 対照がカットオフ値または正規化された値を含む、請求項2～12のいずれか一項記載の方法。
14. 低い発現レベルが、対照に比べて低下していると決定される正規化された発現レベルを含む、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
15. CD73発現が、イムノアッセイによって検出された、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
16. 対象が該対象由来の生物学的サンプル中で高いCD73発現を有すると決定された後、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストから選択される作用物質を該対象に投与する段階を含む、該対象における神経膠芽腫を処置する方法。
17. 前記発現が、対照に比べて高いと決定される、請求項16記載の方法。
18. 対象へのICB療法の投与をさらに含む、請求項16または17記載の方法。
19. ICB療法の前にCD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストが投与される、請求項18記載の方法。
20. ICB療法と、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストとが同時に投与される、請求項18記載の方法。
21. CD73阻害物質またはCD39阻害物質が抗CD73抗体または抗CD39抗体をそれぞれ含む、請求項16～20のいずれか一項記載の方法。
22. 抗体が、遮断抗体を含む、および／または抗体依存性細胞傷害性を誘導する、請求項21記載の方法。
23. A2ARアンタゴニストが、ATL-444、イストラデフィリン（KW-6002）、MSX-3、プレラデナント（SCH-420,814）、SCH-58261、SCH-412,348、SCH-442,416、ST-1535、カフェイン、VER-6623、VER-6947、VER-7835、ビパデナント（BIIB-014）、ZM-241,385またはそれらの組み合わせを含む、請求項16～22のいずれか一項記載の方法。
24. 生物学的サンプルが、単離された免疫細胞を含む、請求項16～23のいずれか一項記載の方法。
25. 生物学的サンプルが、単離されたマクロファージを含む、請求項24記載の方法。
26. 生物学的サンプルが、血清サンプル、生検サンプルまたは免疫細胞の単離された画分を含む、請求項16～25のいずれか一項記載の方法。
27. CD73の発現が、免疫細胞中で高いと決定される、請求項16～26のいずれか一項記載の方法。
28. ICB療法が単独療法または併用ICB療法を含む、請求項24～27のいずれか一項記載の方法。
29. ICB療法が、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、B7-1および／またはB7-2の阻害物質を含む、請求項18～28のいずれか一項記載の方法。
30. ICB療法が抗PD-1モノクローナル抗体および／または抗CTLA-4モノクローナル抗体を含む、請求項18～29のいずれか一項記載の方法。
31. ICB療法が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、イピリムマブまたはトレメリムマブのうちの1つまたは複数を含む、請求項30記載の方法。
32. 少なくとも1つの追加的抗がん処置を投与する段階をさらに含む、請求項16～29のいずれか一項記載の方法。
33. 少なくとも1つの追加的抗がん処置が、外科療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、小分子療法、受容体キナーゼ阻害物質療法、抗血管新生療法、サイトカイン療法、凍結療法または生物学的療法である、請求項32記載の方法。
34. 対照がカットオフ値または正規化された値を含む、請求項17～33のいずれか一項記載の方法。
35. 高い発現レベルが、対照に比べて高いと決定される正規化された発現レベルを含む、請求項16～34のいずれか一項記載の方法。
36. CD73発現が、イムノアッセイによって検出された、請求項16～35のいずれか一項記載の方法。
37. 以下の段階を含む、神経膠芽腫を有する対象におけるICB療法に対する応答を予測するための方法：
    （a）該対象由来のサンプル中のCD73の発現レベルを決定する段階；
    （b）該対象由来のサンプル中のCD73の発現レベルを対照と比較する段階；および
    （c）（i）ICB療法に応答しないと決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて低下したCD73の発現レベルが該対象由来の生物学的サンプル中で検出された後；または
    （ii）ICB療法に応答すると決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて低下したもしくは有意に異ならないCD73の発現レベルが該対象由来の生物学的サンプル中で検出された後、
    該対象がICB療法に応答すると予測する段階；あるいは
    （d）（i）ICB療法に応答すると決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて増大したCD73の発現レベルが該対象由来の生物学的サンプル中で検出された後；または
    （ii）ICB療法に応答しないと決定されている対象に由来する生物学的サンプル中のCD73の発現レベルを表す対照に比べて増大したもしくは有意に異ならないCD73の発現レベルが該対象由来の生物学的サンプル中で検出された後、
    該対象がICB療法に応答しないと予測する段階。
38. ICB療法に応答すると予測された対象をICB療法で処置する段階をさらに含む、請求項37記載の方法。
39. 生物学的サンプルが、単離された免疫細胞を含む、請求項37または38記載の方法。
40. 生物学的サンプルが、単離されたマクロファージを含む、請求項39記載の方法。
41. 生物学的サンプルが、血清サンプル、生検サンプルまたは免疫細胞の単離された画分を含む、請求項37～40のいずれか一項記載の方法。
42. ICB療法が単独療法または併用ICB療法を含む、請求項37～41のいずれか一項記載の方法。
43. ICB療法が、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、B7-1および／またはB7-2の阻害物質を含む、請求項37～42のいずれか一項記載の方法。
44. ICB療法が抗PD-1モノクローナル抗体および／または抗CTLA-4モノクローナル抗体を含む、請求項37～43のいずれか一項記載の方法。
45. ICB療法が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、イピリムマブまたはトレメリムマブのうちの1つまたは複数を含む、請求項44記載の方法。
46. ICB療法に応答すると予測された対象にICB療法を投与する段階をさらに含む、請求項37～45のいずれか一項記載の方法。
47. ICB療法に応答しないと予測された対象にCD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストを投与する段階をさらに含む、請求項37～45のいずれか一項記載の方法。
48. 対象へのICB療法の投与をさらに含む、請求項47記載の方法。
49. ICB療法の前にCD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストが投与される、請求項48記載の方法。
50. ICB療法と、CD73阻害物質、CD39阻害物質またはA2ARアンタゴニストとが同時に投与される、請求項48記載の方法。
51. CD73阻害物質またはCD39阻害物質が抗CD73抗体または抗CD39抗体をそれぞれ含む、請求項47～50のいずれか一項記載の方法。
52. 抗体が、遮断抗体を含む、および／または抗体依存性細胞傷害性を誘導する、請求項51記載の方法。
53. A2ARアンタゴニストが、ATL-444、イストラデフィリン（KW-6002）、MSX-3、プレラデナント（SCH-420,814）、SCH-58261、SCH-412,348、SCH-442,416、ST-1535、カフェイン、VER-6623、VER-6947、VER-7835、ビパデナント（BIIB-014）、ZM-241,385またはそれらの組み合わせを含む、請求項47～52のいずれか一項記載の方法。
54. 少なくとも1つの追加的抗がん処置を投与する段階をさらに含む、請求項37～53のいずれか一項記載の方法。
55. 少なくとも1つの追加的抗がん処置が、外科療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、小分子療法、受容体キナーゼ阻害物質療法、抗血管新生療法、サイトカイン療法、凍結療法または生物学的療法である、請求項54記載の方法。
56. 対照がカットオフ値または正規化された値を含む、請求項37～55のいずれか一項記載の方法。
57. 発現レベルが、正規化された発現レベルを含む、請求項37～56のいずれか一項記載の方法。
58. CD73発現が、イムノアッセイによって検出された、請求項37～57のいずれか一項記載の方法。
59. 神経膠芽腫を有する対象に由来する生物学的サンプル中のCD73を検出する段階を含む、方法。
60. 生物学的サンプルが、単離された免疫細胞を含む、請求項59記載の方法。
61. 生物学的サンプルが、単離されたマクロファージを含む、請求項60記載の方法。
62. 生物学的サンプルが、血清サンプル、生検サンプルまたは免疫細胞の単離された画分を含む、請求項59～61のいずれか一項記載の方法。
63. 対照がカットオフ値または正規化された値を含む、請求項59～62のいずれか一項記載の方法。
64. 発現レベルが、正規化された発現レベルを含む、請求項59～63のいずれか一項記載の方法。
65. CD73発現が、イムノアッセイによって検出された、請求項59～64のいずれか一項記載の方法。
66. 対象が、ICB療法の候補であると決定されている、請求項59～65のいずれか一項記載の方法。
67. 対象が、現在ICB療法で処置されている、少なくとも一度はICB療法を受けたことがある、またはICB療法で処置されたことがない、請求項59～66のいずれか一項記載の方法。
68. 検出されたCD73の発現レベルを対照と比較する段階をさらに含む、請求項59～67のいずれか一項記載の方法。
69. 対照が、ICB療法に応答しない対象に由来する生物学的サンプルを含む、請求項68記載の方法。
70. 対照が、ICB療法に応答する対象に由来する生物学的サンプルを含む、請求項68記載の方法。
71. 対象が、対照よりも高い発現レベルを有すると決定される、請求項69または70記載の方法。
72. 対象が、対照よりも低い発現レベルを有すると決定される、請求項69または70記載の方法。
73. 対象が、対照と有意に異ならない発現レベルを有すると決定される、請求項69または70記載の方法。
74. ICB療法が単独療法または併用ICB療法を含む、請求項66～73のいずれか一項記載の方法。
75. ICB療法が、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、B7-1および／またはB7-2の阻害物質を含む、請求項66～74のいずれか一項記載の方法。
76. ICB療法が抗PD-1モノクローナル抗体および／または抗CTLA-4モノクローナル抗体を含む、請求項66～75のいずれか一項記載の方法。
77. ICB療法が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、イピリムマブまたはトレメリムマブのうちの1つまたは複数を含む、請求項76記載の方法。

Images