JP2023506593A - 抗ｇｉｔｒ抗体およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本明細書において、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、該抗体またはその抗原結合断片を含む組成物、ならびにこれらを使用する方法、例えば、これらを使用する治療方法が提供される。本開示は、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。本明細書に提供される抗体は、特に、ＧＩＴＲを発現する免疫細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、制御性Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を標的化するのに有用である。本抗体は、抗体のインビボでの切断が最小化されるという点で特に有用である。

Description

本開示は、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびにその使用方法に関する。
配列表
配列表の公的な写しは、ＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出され、当該写しのファイル名は「１０６７１ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」であり、２０２１年３月５日が作成日であり、サイズはおよそ６０キロバイトである。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである。ＧＩＴＲ発現は、制御性Ｔ細胞では構成的に高く、ナイーブＴ細胞、ＮＫ細胞、および顆粒球では低／中程度であり、活性化により誘導される。ＧＩＴＲは、主に抗原提示細胞で発現するそのリガンドＧＩＴＲＬと相互作用する。ＧＩＴＲ受容体の活性化は、エフェクターＴ細胞の増殖および機能の増強、ならびに制御性Ｔ細胞によって誘導される抑制の減弱の両方を行うことができる。結果として、ＧＩＴＲ活性の調節は、癌免疫療法および免疫障害の基礎としての役目を果たすことができる。したがって、ＧＩＴＲの活性を調節する薬剤、例えば、抗体に対するニーズがある。
本開示は、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。本明細書に提供される抗体は、特に、ＧＩＴＲを発現する免疫細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、制御性Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を標的化するのに有用である。本抗体は、抗体のインビボでの切断が最小化されるという点で特に有用である。
本明細書で提供する抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体）であってもよいか、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはｓｃＦｖ断片）のみを含んでいてもよく、かつ、例えば、残存するエフェクター機能を排除するように機能性に影響するように修飾されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。
本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体の例示を、本明細書の表７、８、および９に列挙する。表７は、例示的な抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子が記載されている。表８には、例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子が記載されている。表９は、例示的な抗ＧＩＴＲ抗体の全長重鎖および軽鎖配列の配列識別子を提供する。
本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２、２８、３４、および４０からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に、三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号１０の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に、三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む。
本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２、２８、３４、および４０からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体が、配列番号２６、３２、３８、および４４からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列を含み、配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列を含む。
本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片が、Ｎ１０１Ｄ、Ｎ１０１Ｅ、Ｎ１０１Ｓ、またはＮ１０１Ｔ変異で修飾された配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列内に三つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に三つの軽鎖ＣＤＲを含む。
本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、Ｎ１０１Ａ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｉ、Ｎ１０１Ｋ、Ｎ１０１Ｌ、Ｎ１０１Ｍ、Ｎ１０１Ｐ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０１Ｒ、Ｎ１０１Ｖ、Ｎ１０１ＷまたはＮ１０１Ｙ変異で修飾された、配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列内に三つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に、三つの軽鎖ＣＤＲを含む。
本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、Ｓ１０３Ａ、Ｓ１０３Ｄ、Ｓ１０３Ｅ、Ｓ１０３Ｆ、Ｓ１０３Ｇ、Ｓ１０３Ｈ、Ｓ１０３Ｉ、Ｓ１０３Ｋ、Ｓ１０３Ｌ、Ｓ１０３Ｍ、Ｓ１０３Ｎ、Ｓ１０３Ｐ、Ｓ１０３Ｑ、Ｓ１０３Ｒ、Ｓ１０３Ｔ、Ｓ１０３Ｖ、Ｓ１０３Ｗ、またはＳ１０３Ｙ変異で修飾された、配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列内に三つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に三つの軽鎖ＣＤＲを含む。
本明細書の表１に提供され、かつ米国特許出願公開第２０１７／０３５５７７４Ａ１号に開示されている抗体は、明示的に除外され、抗体は、ＨＣＶＲにおいてＮ１０１またはＳ１０３の修飾または変異を欠く。
本開示は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲは、表７に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ＨＣＶＲは、表７に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似した配列をさらに含むことができる。ＬＣＶＲは、表７に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似した配列を含むことができる。
本開示はまた、表７に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列と対になった、表７に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本開示は、表７に列挙される例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２２／１０、２８／１０、３４／１０、および４０／１０からなる群から選択される。
本開示はまた、表７に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本開示はまた、表７に提供されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列と対になった、表７に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある実施形態によれば、本開示は、表７に列挙される例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号２４／１６、３０／１６、３６／１６、および４２／１６からなる群から選択される。
本開示はまた、表７に列挙される例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの中に含有される六個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４－６－２４－１２－１４－１６、４－６－３０－１２－１４－１６、４－６－３６－１２－１４－１６、および４－６－４２－１２－１４－１６からなる群から選択される。
関連の実施形態では、本開示は、表７に列挙される例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかにより定義される、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有される六個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本開示は、配列番号２４／１６、３０／１６、３６／１６、および４２／１６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
本開示はまた、抗ＧＩＴＲ抗体またはその一部分をコードする核酸分子も提供する。例えば、本開示は、表７に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表８に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
本開示はまた、表７に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表８に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
本開示はまた、表７に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表８に列挙されるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
本開示はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ＨＣＶＲは、三つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のセットは、表７に列挙される例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかによって定義されるとおりである。
本開示はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子も提供し、ＨＣＶＲは、表７に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、表７に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表８に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列と、表８に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列とを含む。本明細書に提供されるこの態様によるある特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは両方とも、表７に列挙される同じ抗ＧＩＴＲ抗体から誘導される。
本開示はまた、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖または軽鎖の可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターも提供する。例えば、本開示は、上述の核酸分子、すなわち、表７に記載されるようなＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む、組換え発現ベクターを含む。また、本開示の範囲内には、そのようなベクターが導入された宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞などの真核宿主細胞が含まれる。例示的な真核宿主細胞としては、酵母細胞および哺乳類細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒト細胞株などの脊椎動物細胞、例えば、ＨＫＢ１１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞が挙げられる。抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することにより抗体またはその部分を産生する方法、およびそのように産生された抗体および抗体断片を回収する方法も、本明細書に提供される。
本開示は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。いくつかの実施形態では、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾、または抗体がオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損していることが有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の応用において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
別の態様では、本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。関連の態様では、本開示は、抗ＧＩＴＲ抗体および第二の治療剤の組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第二の治療剤は、抗ＧＩＴＲ抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。本開示はまた、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた抗ＧＩＴＲ抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も提供する。本開示の抗ＧＩＴＲ抗体が関与する例示的な併用療法、共製剤、およびＡＤＣは、本明細書の他の場所で開示されている。
さらに別の態様では、本開示は、腫瘍細胞を死滅させる、または腫瘍細胞の増殖を阻害もしくは減弱させる、または癌に罹患している患者を治療するための医薬品の製造で使用するために、ＧＩＴＲに特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、医薬組成物は、第二の治療剤と治療的に組み合わされる。いくつかの態様では、第二の治療剤はＰＤ－１阻害剤である。いくつかの態様では、ＰＤ－１阻害剤は、セミプリマブである。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体または抗体の抗原結合部分を使用して、腫瘍細胞を死滅させる、または腫瘍細胞の増殖を阻害もしくは減弱させる、または癌に罹患した患者を治療するための治療方法を提供する。本明細書に提供されるこの態様による治療方法は、本明細書に提供の抗体または抗体の抗原結合断片を含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。治療される障害は、ＧＩＴＲを標的化すること、および／またはＴ細胞の増殖もしくは機能を増加させること、および／または制御性Ｔ細胞によって誘導される抑制活性を阻害することによって、改善、回復、抑制、または予防される任意の疾患または状態である。いくつかの態様では、本方法は、第二の治療剤を、患者、またはそれを必要とする対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、第二の治療剤はＰＤ－１阻害剤である。いくつかの態様では、ＰＤ－１阻害剤は、セミプリマブである。
さらに別の態様では、本開示は、腫瘍細胞を死滅させる、または腫瘍細胞の増殖を阻害もしくは減弱させる、または癌に罹患している患者を治療するための医薬品の製造で使用するために、ＧＩＴＲに特異的に結合する組換えヒト抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物の使用を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＧＩＴＲ抗体の抗原結合部分と抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ１抗体の抗原結合部分との組み合わせを使用して、腫瘍細胞を死滅させる、または腫瘍細胞の増殖を阻害もしくは減弱させる、または癌に罹患した患者を治療するための治療方法を提供する。いくつかの態様では、抗ＰＤ１抗体は、セミプリマブである。本明細書に提供されるこの態様による治療方法は、抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ１抗体または抗原結合断片組成物の組み合わせを含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。治療される障害は、ＧＩＴＲおよびＰＤ１の両方を標的にすることによって、改善、回復、抑制、または予防される任意の疾患または状態である。
さらに別の態様では、本開示は癌を治療する方法を提供し、それを必要とする対象に、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、および（ｉｉ）セミプリマブを投与することを含む。いくつかの態様では、癌は、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される。
さらに別の態様では、本開示は、それを必要とする対象における癌を治療する方法に使用するための医薬品の製造において、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の使用方法を提供する。本方法は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片およびセミプリマブを対象に投与することを含む。いくつかの態様では、癌は、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される。
さらに別の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における癌を治療する方法に使用するための抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を提供し、本方法は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、および（ｉｉ）セミプリマブを対象に投与することを含む。いくつかの態様では、癌は、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される。
他の実施形態は、後に続く発明を実施するための形態の検討から明らかになるであろう。
図１は、サル血清またはＰＢＳ中でインキュベートした場合、ＣｏｍｐＡｂ１で観察された切断の増加を示す。サル血清中の推定切断率は、約１．５％／日であり、ＰＢＳ中では、約０．５％／日であった。
図２は、マウスに１０ｍｇ／ｋｇを投与したときに、ＣｏｍｐＡｂ１で観察された切断の増加を示す。ＣｏｍｐＡｂ１を、０日目の対照として、プルダウン（親和性精製）の前に、マウス血清およびＰＢＳにスパイクした。
図３は、ＩｇＧ枯渇ヒト血清でインキュベーションした後、ＣｏｍｐＡｂ１抗体では観察され、バリアントｍＡｂ１またはｍＡｂ２では観察されなかった切断の増加を示す。ＣｏｍｐＡｂ１抗体は、Ｃ末端で１．９％／日、Ｎ末端で０．７％／日の切断率を示した。
図４は、マウス血清でインビトロでインキュベーションした後、ＣｏｍｐＡｂ１（ＣｏｍｐＡｂ１とも呼ばれる）抗体では観察され、バリアントｍＡｂ１またはｍＡｂ２では観察されなかった切断の増加を示す。マウス血清では、ＣｏｍｐＡｂ１抗体の推定切断率は、少なくとも１．７％／日であった。
図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０（図５Ａ）、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ（図５Ｂ）、およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（図５Ｃ）細胞上の濃度の範囲（１８ｐＭ～３００ｎＭ）におけるｍＡｂ１およびＩｇＧ１アイソタイプ対照の細胞表面結合を示す。フローサイトメトリーによりＡｌｅｘａ６４７標識抗ヒトＩｇＧを使用して結合を検出した。蛍光強度を、幾何学的ＭＦＩとしてプロットした。ｈ、ヒト、Ｍｆ、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）。
図６は、活性化（ＣＤ２５＋）ヒト初代Ｔ細胞への抗体結合を示す。４つの別個のドナーからの初代ヒトＴ細胞を抗ＣＤ２／抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズでｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。ＣＤ２５＋およびＣＤ２５－ヒト初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の、ある濃度範囲（８ｐＭ～２００ｎＭ）でのＡＦ６４７抱合ｍＡｂ１およびＡＦ６４７抱合ＩｇＧ１アイソタイプ対照の細胞表面結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。蛍光強度を幾何学的ＭＦＩとしてプロットした。Ｈｕ、ヒト
図７は、ＣＤ６９＋カニクイザル初代Ｔ細胞に結合する抗体を示す。４つの別個のドナーからの初代カニクイザルＴ細胞を抗ＣＤ２／抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズでｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。ＣＤ６９＋およびＣＤ６９－カニクイザル初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の、ある濃度範囲（８ｐＭ～２００ｎＭ）でのＡＦ６４７抱合ｍＡｂ１およびＡＦ６４７抱合ＩｇＧ１アイソタイプ対照の細胞表面結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。蛍光強度を幾何学的ＭＦＩとしてプロットした。Ｍｆ、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）
図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄは、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａおよびＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａエフェクター細胞におけるＦｃ介在性ＮＦＡＴ活性を示す。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａおよびＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａを、無抗体対照を含む、９１６ｆＭ～６０ｎＭのｍＡｂ１もしくはＩｇＧ１アイソタイプ対照、または４５．８ｆＭ～３ｎＭの抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１、およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０（図８Ａ、図８Ｃ）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ（図８Ｂ）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（図８Ｄ）細胞（エフェクター細胞と標的細胞の比は１：２）と共にインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａ細胞およびＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａ細胞におけるシグナル伝達は、ルシフェラーゼ活性として検出され、発光シグナルの定量化によって測定され、相対光単位（ＲＬＵ）として報告された。データは二重ウェルで実施したアッセイからのものであり、平均±ＳＤとしてプロットされる。
図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅ、および図９Ｆは、ヒトまたはカニクイザルのＧＩＴＲを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＡＤＣＣの抗体媒介を示す。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０（図９Ａ、図９Ｄ）、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ（図９Ｂ、図９Ｅ）、またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（図９Ｃ、図９Ｆ）標的細胞を、ヒトＮＫ細胞（エフェクター細胞と標的細胞の比は５：１）およびｍＡｂ１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、および抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１と共に、９．５ｆＭ～１０ｎＭの範囲の濃度で、３．５時間インキュベートした。細胞傷害性を、発光読み出しを使用した、細胞集団内の死滅細胞の相対数を測定する、発光細胞傷害性アッセイである、市販のＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏアッセイを使用して決定した。各グラフの点線は、抗体の非存在下でのＮＫ細胞を添加した際に観察された非特異的細胞傷害性のレベルを示す。三重ウェルで実施したアッセイからのデータを、平均±ＳＤとしてプロットする。
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、および図１０Ｄは、ヒト初代Ｔ細胞に対するＡＤＣＣの抗体媒介を示す。ヒト初代Ｔｒｅｇ（図１０Ａ、図１０Ｃ）およびＣＤ８＋ Ｔ細胞（図１０Ｂ、図１０Ｄ）（標的細胞）を、ＰＢＭＣ（３ドナー）から単離し、培養で刺激し、増殖させ、全血（２ドナー）から単離されたヒト初代ＮＫ細胞（エフェクター細胞）（エフェクター細胞と標的細胞の比は５：１）と共にインキュベートした。ｍＡｂ１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、または抗ＣＤ３ ＩｇＧ１を、１６９ｆＭ～１０ｎＭの濃度範囲で、エフェクター細胞および標的細胞と共に３．５時間インキュベートした。細胞傷害性を、細胞集団内の死滅細胞の相対数を測定する、発光細胞傷害性アッセイである、市販のＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏアッセイを使用して決定した。各グラフの点線は、抗体の非存在下でのＮＫ細胞を添加した際に観察された非特異的細胞傷害性のレベルを示す。三重ウェルで実施したアッセイからのデータを、平均±ＳＤとしてプロットする。 同上。
図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、ヒトまたはカニクイザルのＧＩＴＲを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＡＤＣＰの抗体媒介を示す。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ染料で標識されたＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０（図１１Ａ）、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ（図１１Ｂ）、またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（図１１Ｃ）標的細胞を、無抗体対照を含む、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ 遠赤色染料およびｍＡｂ１で標識されたヒト初代単球由来食細胞、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、または抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１と共に、３８１ｆＭ～１００ｎＭの濃度範囲で、１時間～２時間インキュベートした。食作用を、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｏｅｎｉｘハイコンテントスクリーニングシステムの蛍光イメージングにより分析し、遠赤色で標識された細胞集団（遠赤色染料で標識された食細胞、６４７ｎｍの発光チャネルで検出）内の緑色蛍光強度（ＣＦＳＥで標識された標的細胞、４８８ｎｍの発光チャネルで検出）として測定し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で報告した。二重ウェルで実施したアッセイからのデータは、平均±ＳＤとしてプロットされる。
図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、および図１２Ｆは、抗ＣＤ３を介した初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を示す。濃縮されたヒト初代Ｔ細胞（６ドナー）を、一定濃度（２ｎＭ）の刺激性抗ＣＤ３およびＨＥＫ２９３／ＦｃγＲ２ｂ補助細胞の存在下で、無抗体対照を含む、ある濃度範囲（３２ｆＭ～１３３ｎＭ）のｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の連続希釈物と共にインキュベートした。データは、三重ウェルで実施したアッセイからのものであり、平均±ＳＤとしてプロットされる。Ｔ細胞の増殖は、（***細胞に組み込まれたトリチウム化チミジンからの）トリチウム崩壊の検出によって測定され、ＣＰＭとして報告された。各グラフの点線は、滴定抗体の非存在下で、刺激性抗ＣＤ３を添加した際に観察された増殖のレベルを示す。
図１３は、ヒトＧＩＴＲ－ＬへのヒトＧＩＴＲ結合に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を示す。固定化ヒトＧＩＴＲ－Ｌへの、ある濃度範囲（３．４ｐＭ～２００ｎＭ）でのヒトＧＩＴＲタンパク質ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨの結合を、ＥＬＩＳＡにより評価し、結合のＥＣ５０値を決定した。ｈＧＩＴＲ－Ｌへの結合について計算されたＥＣ５０値に基づいて、一定濃度の組換えｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ（１．５ｎＭ）を、ｍＡｂ１、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照と共に、ある濃度範囲（５１ｐＭ～３μＭ）でプレインキュベートし、固定化ヒトＧＩＴＲ－Ｌを含有するウェルに添加して、抗体の固定化ヒトＧＩＴＲ－ＬへのｈＧＩＴＲ．ｍｍＨの結合を遮断する能力を決定した。ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨの結合は、ＴＭＢ基質を使用してＨＲＰ抱合ｃＭｙｃ抗体で検出され、ＯＤ４５０は分光光度法により測定された。
図１４は、ＡＤＣに対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を示す。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ、またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ標的細胞を、１１９ｆＭでの無抗体対照セットを含む、５％のＮＨＳおよびｍＡｂ１と共に、またはなしで、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、および抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１と共に４７７ｆＭ～５００ｎＭの濃度範囲で、３．５時間インキュベートした。細胞傷害性を、細胞集団内の死滅細胞の相対数を測定する、発光細胞傷害性アッセイである、市販のＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏアッセイを使用して決定した。各グラフの点線は、抗体の非存在下で５％のＮＨＳを添加した際に観察された非特異的細胞傷害性のレベルを示す。三重ウェルで実施したアッセイからのデータを、平均±ＳＤとしてプロットする。
図１５Ａおよび図１５Ｂは、抗ＧＩＴＲ抗体が、可溶性ＧＩＴＲとインキュベートした時に、Ｃ１ｑに結合できる免疫複合体を形成しないことを示す。３０ｎＭでのＧＩＴＲ ｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照を、組換えヒトＧＩＴＲ細胞外ドメインタンパク質単量体、ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ（図１５Ａ）、または二量体、ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ（図１５Ｂ）と共に、１：１のモル比でインキュベートした。抗体、ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ、またはｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ単独を含有する対照ウェルも評価した。すべての試料を、分析前にキットアッセイ溶液中に５０倍希釈した。高（３８μｇ Ｅｑ／ｍＬ）および低（１５μｇ Ｅｑ／ｍＬ）ＨＡＧＧ陽性対照を並列で分析し、各対照試料のＣ１ｑ結合を、それぞれ１１～２６μｇ Ｅｑ／ｍＬ、および４μｇ Ｅｑ／ｍＬ未満の予想範囲内で観察した。点線は、４μｇ Ｅｑ／ｍＬを示す。三回試験した試料からのデータを、平均±ＳＤとしてプロットする。
図１６Ａおよび図１６Ｂは、ヒトＰＤ－Ｌ１の存在下でセミプリマブで処理された、ドナー５５５１０５（図１６Ａ）およびドナー５５５１３０（図１６Ｂ）からの、抗ＣＤ３刺激初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞からの増強されたＩＬ－２放出を示す。濃縮されたヒト初代Ｔ細胞を、固定濃度（２０ｎＭ）のセミプリマブまたはある濃度範囲（７６ｆＭ～２００ｎＭ）のＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照の存在下で、抗原提示細胞とＴ細胞の比が１：２のＲＢＬ－２Ｈ３／αＣＤ３またはＲＢＬ－２Ｈ３／αＣＤ３／ｈＰＤ－Ｌ１の存在下で、ｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の連続希釈物と共にインキュベートした。データは、三重ウェルで実施したアッセイからのものであり、平均±ＳＤとしてプロットされる。ＩＬ－２放出を、製造業者のプロトコルに従ってＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからのヒトＩＬ－２キットを使用して測定した。
図１７は、ＭＣ３８マウス結腸腫瘍細胞で皮下チャレンジされたＧＩＴＲ／ＧＩＴＲ－Ｌヒト化マウスにおける、抗ＧＩＴＲ抗体による腫瘍内Ｔ制御性細胞の枯渇、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞／Ｔ制御性細胞比の増加を示す。
図１８は、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１と組み合わせた１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブが、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲ－Ｌ－ＰＤ－１ヒト化マウスにおいて、セミプリマブ単独と比較して、ＭＣ３８腫瘍増殖のより大きな減少をもたらすことを示す。
図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｄ、および図１９Ｅは、１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブを、０．１ｍｇ／ｋｇ（図１９Ｅ）、１．０ｍｇ／ｋｇ（図１９Ｄ）、および１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１（図１９Ｃ）と組み合わせて処置したマウスにおいて、セミプリマブ単独（図１９Ｂ）と比較して、ＭＣ３８腫瘍クリアランスの頻度がより高いことを示す。アイソタイプ対照を用いた処置を図１９Ａに示す。
図２０は、１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブを、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１と組み合わせて処置したＭＣ３８腫瘍担持マウスにおける生存率が、セミプリマブ単独と比較して、より高いことを示す。
腫瘍内免疫細胞を標的化することによる腫瘍微小環境の調節は、癌治療のための治療的アプローチである。具体的には、腫瘍内Ｔ細胞の細胞表面上に発現する共刺激性および共阻害性免疫チェックポイント受容体を標的化することで、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を強化し、局所免疫抑制を下方制御することによって、内因性抗腫瘍応答を高めることができる。
グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）としても知られる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）は、従来のＴ細胞、ならびに免疫系の他の細胞と呼ばれる制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および非Ｔｒｅｇで発現される共刺激受容体である。ＧＩＴＲは、休止Ｔ細胞上では低レベルで発現し、Ｔ細胞活性化後に上方制御され、活性化された従来のＴ細胞よりも活性化Ｔｒｅｇでより高い発現を示す（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２３（２）：１３５－１４２，２００２）（Ｋｒａｕｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ，７：５３３－６６，２００７）（Ｋｎｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，６７：１－１０，２０１６）。活性化ＴｒｅｇでのＧＩＴＲの異なる発現プロファイルは、抗腫瘍免疫を促進するために、活性化された腫瘍内Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させるための魅力的な標的となる。
ｍＡｂ１およびｍＡｂ２は、活性化Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させるヒトＩｇＧ１ ＧＩＴＲアゴニスト抗体である。ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、ＦｃγＲ依存的に腫瘍内Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させることによって、抗腫瘍免疫を誘導することができ（例えば、抗体依存性細胞傷害性／食作用［ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ］）、これはＧＩＴＲ細胞表面発現と相関する。これらのＧＩＴＲ抗体は、プログラムされた細胞死－１（ＰＤ－１）チェックポイント遮断と相乗効果を示し、前臨床モデルにおいて長期抗腫瘍応答をもたらすことができる。いくつかの態様では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＰＤ－１阻害剤、例えば、セミプリマブと組み合わされる。理論に拘束されることを意図するものではないが、ＰＤ－１阻害剤は、抗ＣＤ３刺激Ｔ細胞活性化を強化する抗ＧＩＴＲ抗体の能力を回復させる可能性がある。いくつかの態様では、本明細書に開示される抗ＧＩＴＲ抗体をＰＤ－１阻害剤と治療的に組み合わせることは、ＰＤ－１阻害剤単独と比較して、腫瘍増殖のより大きな減少をもたらす。いくつかの態様では、本明細書に開示される抗ＧＩＴＲ抗体をＰＤ－１阻害剤と治療的に組み合わせることは、ＰＤ－１阻害剤単独と比較して、より高い頻度の腫瘍クリアランスをもたらす。いくつかの態様では、本明細書に開示される抗ＧＩＴＲ抗体をＰＤ－１阻害剤と治療的に組み合わせることは、ＰＤ－１阻害剤単独と比較して、腫瘍を有する対象において、より高い生存率をもたらす。
本開示を説明する前に、本開示が記載される特定の方法および実験条件に限定されず、したがって方法および条件が変化し得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書にて使用される場合、「約」という用語は、特定の言及される数値に関して使用される場合、値が言及された値から１％以下まで変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９および１０１、ならびに間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験で使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから記載する。本明細書で言及されるすべての特許、特許出願、および非特許出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体
本明細書で使用される場合、発現グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体である「ＧＩＴＲ」などは、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含む、ヒトグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体を指す（ＮＣＢＩアクセッション＃ＮＰ＿００４１８６．１）。「ＧＩＴＲ」という表現は、単量体および多量体ＧＩＴＲ分子の両方を含む。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトＧＩＴＲ」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有も、有してもいなく、かつ、別のＧＩＴＲ分子への直接的な物理的接続なしに、単一のＧＩＴＲ分子として、通常の条件下に存在する、ＧＩＴＲタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＧＩＴＲ分子は、本明細書において、配列番号４５のアミノ酸配列を含む「ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例３を参照）。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトＧＩＴＲ」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のＧＩＴＲ分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＧＩＴＲ分子としては、それぞれ配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を含む、本明細書において「ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ」および「ｈＧＩＴＲ．ｈＦｃ」と称される分子が挙げられる。
本明細書における、タンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片への全ての参照は、非ヒト種からと明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図されている。したがって、「ＧＩＴＲ」という表現は、例えば、「マウスＧＩＴＲ」、「サルＧＩＴＲ」など、非ヒト種からであると特定されていない限り、ヒトＧＩＴＲを意味する。
本明細書において使用される場合、「細胞表面発現ＧＩＴＲ」という表現は、ＧＩＴＲタンパク質の少なくとも一部が、細胞膜の細胞外側に曝露され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボによって細胞の表面上に発現される、一つまたは複数のＧＩＴＲタンパク質、またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＧＩＴＲ」は、通常ＧＩＴＲタンパク質を発現する細胞の表面上で発現されるＧＩＴＲタンパク質を含むか、またはそれからなり得る。あるいは、「細胞表面発現ＧＩＴＲ」は、通常はその表面上にヒトＧＩＴＲを発現せず、その表面上にＧＩＴＲを発現するように人為的に操作されている、細胞の表面上で発現されるＧＩＴＲタンパク質を含むか、またはそれからなり得る。
抗体および抗体の抗原結合断片
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗原（例えば、ＧＩＴＲ）に特異的に結合する、またはそれと相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あらゆる抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語には、四つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続した二つの重（Ｈ）鎖および二つの軽（Ｌ）鎖、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む、免疫グロブリン分子が包含される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本明細書に提供される異なる実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体のＦＲ（またはその抗原結合部分）は、ヒトの生殖系列配列と同一であってもよく、または自然にもしくは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
本明細書に提供される特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本明細書に提供されるヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的な変異誘発により、またはインビボでの体細胞変異により変異が導入される）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されていない。「ヒト抗体」という用語は、天然に存在し、改変されていない生物において、改変またはヒトの介入／操作なしに通常存在する天然に存在する分子を含まない。
本明細書で使用される場合、「抗ＧＩＴＲ抗体」という表現は、単一の特異性を有する一価抗体および単一特異性二価抗体の両方、ならびにＧＩＴＲに結合する第一のアームおよび第二（標的）抗原に結合する第二のアームを含む二重特異性抗体の両方を含み、抗ＧＩＴＲアームは、本明細書の表７に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列またはＣＤＲ配列のいずれかを含む。「抗ＧＩＴＲ抗体」という表現はまた、薬剤または毒素（すなわち、細胞傷害性薬剤）にコンジュゲートされた抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む。「抗ＧＩＴＲ抗体」という表現はまた、放射性核種にコンジュゲートされた抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体－放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）を含む。
本明細書に提供される抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であってもよい。「遺伝子組み換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子組み換え手段によって、調製される、発現する、作成される、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞（以下で詳述する）中に形質導入された組み換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組み換え体から単離され抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（以下で詳述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、または抗体ヒト免疫グロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へスプライスすることを含むあらゆるその他の手段によって調製される、発現する、作成される、もしくは単離される抗体などを含むように意図される。その様な遺伝子組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。特定の実施形態において、しかしながら、その様な遺伝子組換えヒト抗体はインビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞の突然変異誘発）に供されるため、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、関連する配列である一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中には自然に存在し得ない。
「～を特異的に結合する」という用語もしくは「～へ特異的に結合する」などの用語は、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定である抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１ｘ１０－８Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とすることができる（例えば、より小さなＫＤはより緊密な結合を示す）。二つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書に記載されるように、抗体は、ＧＩＴＲに特異的に結合する、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサーでのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイで同定されている。さらに、ＧＩＴＲの一つのドメインおよび一つまたは複数の追加の抗原に結合する多重特異性抗体、またはＧＩＴＲの二つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず、本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」抗体とみなされる。
「高親和性」抗体という用語は、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイ、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサー、または表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、または溶液－親和性ＥＬＩＳＡによって測定される、少なくとも１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、または少なくとも約１０－１１ＭのＫＤとして表される、ｈＧＩＴＲに対する結合親和性を有するそれらのモノクローナル抗体を指す。
「スローオフレート」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイ、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサー、または表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定される場合、１ｘ１０－３ｓ－１以下、または１ｘ１０－４ｓ－１以下の速度定数で、ＧＩＴＲから解離する抗体を意味する。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すよう意図される。
本明細書に提供される抗体は、単離抗体であってもよい。本明細書において使用される場合、「単離抗体」とは、その天然環境の少なくとも一つの構成要素から特定され、および分離され、および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも一つの構成要素から、または当該抗体が自然に存在するか、もしくは自然に産生される組織もしくは細胞から分離された、または取り出された抗体は、本開示の目的で「単離抗体」である。単離抗体はまた、組み換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離抗体は、少なくとも一つの精製工程または単離工程を受けた抗体である。ある特定の実施形態によると、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などという用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」という用語は、に結合する能力を保持する抗体の一つまたは複数の断片を指す。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、完全抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などという用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変領域および任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う、タンパク質消化または組み換え遺伝子工学技術などの、あらゆる好適な標準的方法を使用する、完全抗体分子に由来してもよい。そのようなＤＮＡは公知であり、かつ／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成され得る。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子生物学技法を使用することによって操作して、例えば、一つまたは複数の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な構成に配置するか、またはコドンを導入する、システイン残基を作成する、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させるなどが可能である。
抗原結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインはあらゆる大きさであってもよいか、またはアミノ酸組成であってもよく、一般的に一つまたは複数のフレームワーク配列に隣接するか、またはフレーム内にある少なくとも一つのＣＤＲを含み得る。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であってもよく、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有してもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含有してもよい。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合された少なくとも一つの可変ドメインを含有してもよい。本開示の抗体の抗原結合断片内で見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な構成には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上で列挙された例示的な構成のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインのいずれの構成において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接結合されてもよいか、または完全もしくは部分ヒンジまたはリンカー領域により結合されてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子における隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可動性または半可動性連鎖をもたらす、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなってもよい。さらに、本開示の抗体の抗原結合断片は、互いとの、および／または一つまたは複数の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）非共有会合で、上に列挙される可変ドメイン構成および定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的に、少なくとも二つの異なる可変ドメインを含み、各々の可変ドメインは、別個の抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な常套的な技術を使用して、本開示の抗体の抗原結合断片に関連した使用のために適合され得る。
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する二つの形態で存在し得る。一形態では、免疫グロブリン分子は、およそ１５０～１６０ｋＤａの安定した四つの鎖構築物を含み、二量体は、鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持される。第二の形態では、二量体は、鎖間ジスルフィド結合を介して結合されず、約７５～８０ｋＤａの分子は、共有結合した軽鎖および重鎖（半抗体）から構成される。これらの形態は、親和性精製後であっても、分離が非常に困難であった。
様々なインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第二の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的差異によるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第二の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで著しく低減し得る（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域において一つまたは複数の変異を有する抗体を包含し、それら変異は、例えば、産生において、所望の抗体型の収率を改善するために望ましいものであり得る。
抗体およびその抗原結合断片に対する改変
本明細書に開示される抗ＧＩＴＲ抗体は、本明細書に提供される抗体の配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に一つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含んでもよく、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。ある特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のフレームワーク領域は、ヒト生殖系列配列と同一、例えば、本明細書に提供される抗体の配列と同一であってもよいか、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。所与のフレームワーク領域（または一つまたは複数のフレームワーク領域）内の一つまたは複数のアミノ酸は置換され得、置換は、保存的または非保存的であってもよい。一つまたは複数のＣＤＲ残基の置換または一つまたは複数のＣＤＲの省略も可能である。抗体は、一つまたは二つのＣＤＲが結合のために省かれることができると科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９）は、公開されている結晶構造に基づいて、抗体とこれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約１／５～１／３のみが実際に抗原と接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎは、一つまたは二つのＣＤＲが抗原と接触しているアミノ酸を有しない多くの抗体も発見した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照されたい）。したがって、本明細書で提供される抗体は、改変抗体が一つまたは複数の望ましい特徴、例えば、抗体またはその抗原結合断片が、約１０－９Ｍ未満のＥＣ５０でｈＧＩＴＲに結合する、および／またはＮ１０１またはＳ１０３改変を欠く抗体と比較して切断率の減少を示す、を維持する限り、ＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域において効果的に改変され得る。
所与のＣＤＲに対する改変は、本明細書に提供される抗体からのＣＤＲ配列に対して行われてもよく、改変は、保存的または非保存的置換を含むことができる。望ましい置換は、分子モデリングによって、および／または経験的に決定され得る。例えば、一つまたは複数のＣＤＲ残基は、別のヒト抗体配列またはそのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占有するアミノ酸と置換され得る。
さらに、その抗原結合断片は、本明細書に開示される抗体であってもよいが、改変抗体（別名、抗原結合断片）がｈＧＩＴＲへの結合を維持する限り、一つまたは複数のＣＤＲおよび／または一つまたは複数のフレームワーク領域を省略するように改変される。
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、先行研究に基づいて、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングによって、かつ／または経験的に同定することができる（例えば、ＨＣＤＲ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５はしばしば必要ではない）。本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片は、所与のＣＤＲ、特に抗原と接触しないＣＤＲを除去または置換するように改変され得る。軽鎖ＣＤＲは、例えば、ユニバーサル軽鎖ＣＤＲと置換され得る。
本明細書に提供される完全ヒト抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、または本明細書に提供される配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に一つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。そのような改変または変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、またはアミノ酸配列を、本明細書に提供される抗体、例えば、表７に提供される抗体配列のうちのいずれか一つと比較することによって、容易に確認され得る。
本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体、およびその抗原結合断片を含み、一つまたは複数のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ内の一つまたは複数のアミノ酸は、改変抗体が一つまたは複数の望ましい特徴、例えば、抗体またはその抗原結合断片が、約１０－９Ｍ未満のＥＣ５０でｈＧＩＴＲに結合する、および／またはインビボまたはインビトロでの切断率に減少を示す、を維持する限り、改変されている。いったん得られれば、フレームワーク領域および／またはＣＤＲ内の一つまたは複数の改変を含有する抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または亢進（場合により得る）、免疫原性の低下などの一つまたは複数の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られた抗体および抗原結合断片は、本開示に包含される。
本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体、およびこれらの抗原結合断片を含み、一つまたは複数のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の一つまたは複数のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異する（そのような配列変化は、本明細書において集合的に「生殖細胞系変異」と称される）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から開始して、一つまたは複数の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多くの抗体および抗原結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖系列配列に見られる残基に再び変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみが、元の生殖系列配列に再び変異する。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの一つまたは複数は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異する。さらに、本開示の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に二つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異する一方で、元の生殖系列配列とは異なる、ある特定の他の残基が維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異する。いったん得られれば、一つまたは複数の生殖細胞系列変異を含有する抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または強化（場合により得る）、免疫原性の低減などの一つまたは複数の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られた抗体および抗原結合断片は、本開示に包含される。
本発明は、一つまたは複数の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＧＩＴＲ抗体も含む。例えば、本開示は、本明細書の表７に記載されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下で説明するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定したときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。
ポリペプチドに適用されるように、「実質的な類似性」または「実質的に類似した」という用語は、二つのペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列化されたとき、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性特性を実質的に変化させない。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の百分率または相同性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖はシステインおよびメチオニンである、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示される、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負以外の値を有する何らかの変化である。
ポリペプチドについての配列同一性および／または類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の改変へ割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を判定するための既定パラメータとともに使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複の領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。配列はまた、ギャップオープンペナルティが１２、およびギャップエクステンションペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２のアフィンギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して比較することができる。本明細書に提供される配列を、異なる生物体からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴであり、特にデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる。
Ｎ１０１またはＳ１０３改変を含む抗ＧＩＴＲ抗体
本開示の特定の実施形態によれば、ＨＣＶＲ中にＮ１０１またはＳ１０３改変を有する、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片が提供される。かかる改変は、インビトロおよびインビボでの安定性において望ましい特徴を有する開示された抗体を提供する。
明示的に除外されるのは、本明細書の表１に提供され、かつ米国特許出願公開第２０１７／０３５５７７４号に開示されている抗体であり、ＨＣＶＲにおけるＮ１０１またはＳ１０３の改変または変異を欠いている。
いくつかの態様では、ＨＣＶＲ中にＮ１０１またはＳ１０３の改変を有する単離された抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。そのような改変を有する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）ヒト、サル、またはマウスの血清中の切断率が１日あたり０．５％未満である；および
（ｂ）約０％のマウスにおけるインビボ切断率を有する、からなる群から選択される一つまたは複数の特性をさらに示すことができる。
切断率は、例えば、実施例２、５、および６に記載されるアッセイによって決定することができる。
いくつかの態様では、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２、２８、３４、および４０からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に、三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を含むことができ、かつ配列番号１０の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に、三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含むことができる。
いくつかの態様では、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２、２８、３４、および４０からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列を含むことができ、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの態様では、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２６、３２、３８、および４４からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列を含むことができ、かつ配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの態様では、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、Ｎ１０１Ａ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｉ、Ｎ１０１Ｋ、Ｎ１０１Ｌ、Ｎ１０１Ｍ、Ｎ１０１Ｐ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０１Ｒ、Ｎ１０１Ｖ、Ｎ１０１ＷまたはＮ１０１Ｙ変異で修飾された、配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列内に三つの重鎖ＣＤＲを含むことができ、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に、三つの軽鎖ＣＤＲを含むことができる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、Ｎ１０１Ｄ、Ｎ１０１Ｅ、Ｎ１０１Ｓ、またはＮ１０１Ｔ変異で修飾された配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列内に三つの重鎖ＣＤＲを含むことができ、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に三つの軽鎖ＣＤＲを含むことができる。
いくつかの態様では、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、Ｓ１０３Ａ、Ｓ１０３Ｄ、Ｓ１０３Ｅ、Ｓ１０３Ｆ、Ｓ１０３Ｇ、Ｓ１０３Ｈ、Ｓ１０３Ｉ、Ｓ１０３Ｋ、Ｓ１０３Ｌ、Ｓ１０３Ｍ、Ｓ１０３Ｎ、Ｓ１０３Ｐ、Ｓ１０３Ｑ、Ｓ１０３Ｒ、Ｓ１０３Ｔ、Ｓ１０３Ｖ、Ｓ１０３Ｗ、またはＳ１０３Ｙ変異で修飾された、配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列内に三つの重鎖ＣＤＲを含むことができ、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に三つの軽鎖ＣＤＲを含む。
本明細書の表１に提供され、米国特許出願公開第２０１７／０３５５７７４号に開示されている抗体は、明示的に除外される。この抗体は、ＨＣＶＲにおけるＮ１０１またはＳ１０３の改変または変異を欠く。
Ｆｃバリアントを含む抗ＧＩＴＲ抗体
本開示の特定の実施形態によると、例えば中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化する、または減少させる一つまたは複数の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。例えば、本開示は、ＦｃドメインのＣＨ２領域またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＧＩＴＲ抗体が含まれ、この場合において当該変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与されたときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）における修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦもしくはＹ）における修飾、または２５０位および／もしくは４２８位における修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における修飾が含まれる。一つの実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。
例えば、本開示は、以下からなる群から選択される変異の一つまたは複数の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＧＩＴＲ抗体を含む：２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本開示の範囲内であることが企図される。
抗ＧＩＴＲ抗体の生物学的特徴
本開示は、高い親和性で単量体型ヒトＧＩＴＲに結合する抗体およびその抗原結合断片を含む。例えば、本開示は、例えば、精製抗体を用いた本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを用いて、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約１２．０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ）に結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定されたときに、約１２ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約２．０ｎＭ未満のＫＤで、２５℃で単量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。本開示はまた、本明細書の実施例３に提供されるアッセイフォーマットを用いて、２５℃の表面プラズモン共鳴によって測定されたときに、約１１０ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１５ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含み、抗体は条件培養で分泌される。
本開示はさらに、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、２５℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約２分を超える解離半減期（ｔ１／２）で単量体型ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ）に結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。特定の実施形態によると、例えば、本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約２分を超える、約４分を超える、約６分を超える、約７分を超える、またはそれ以上のｔ１／２で、２５℃で単量体型ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
本開示はさらに、二量体型ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ）に高い親和性で結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。例えば、本開示は、例えば、精製抗体を用いた本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを用いて、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約１ｎＭ未満のＫＤで、二量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。特定の実施形態によると、例えば、本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満のＫＤで、２５℃で二量体型ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。本開示はまた、本明細書の実施例３に提供されるアッセイフォーマットを用いて、２５℃の表面プラズモン共鳴によって測定されたときに、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約３００ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満のＫＤで、二量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含み、抗体は条件培養で分泌される。
本開示はさらに、例えば、本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、２５℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約４分を超える解離半減期（ｔ１／２）で二量体型ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ）に結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。特定の実施形態によると、例えば、本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約４分を超える、約９分を超える、約１０分を超える、約３５分を超える、もしくは約７０分を超える、またはそれ以上のｔ１／２で、２５℃で二量体型ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
本開示はまた、ヒトまたはサルＧＩＴＲを発現するＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０標的細胞に結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。例えば、高い親和性を有するＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞を発現するヒトＧＩＴＲまたはサルＧＩＴＲに結合する抗体が本明細書に提供される。例えば、本開示は、例えば、本明細書の実施例７に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される約４ｎＭ未満のＥＣ５０で、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０標的細胞を発現するヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。特定の実施形態では、例えば、本明細書の実施例７に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用して、ＭＦＩによって測定されたときに、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満のＥＣ５０で、ヒトまたはサルＧＩＴＲを発現するＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０標的細胞に結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
本開示はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞に結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。ＣＤ２５およびＣＤ６９はそれぞれ、ヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞活性化のための代理マーカーである。例えば、本明細書の実施例８に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用して、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞に高い親和性で結合する抗体が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、セミプリマブなどのＰＤ－１阻害剤と組み合わせることができる。理論に拘束されることを意図するものではないが、阻害性ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１シグナル伝達の存在下で、セミプリマブは、抗ＣＤ３刺激Ｔ細胞活性化を強化する抗ＧＩＴＲ抗体の能力を回復させる可能性がある。
本開示はまた、ヒトまたはカニクイザルＦｃγＲ３ａ（ＡＤＣＣを媒介し、ＮＫ細胞上で主に発現するＦｃ受容体）を介してＮＦＡＴ活性化を媒介する抗体およびその抗原結合断片も含む。例えば、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイで評価したヒトまたはカニクイザルのＦｃγＲ３ａを介してＮＦＡＴ活性化を媒介する抗体が本明細書に提供される。例えば、本開示は、例えば、本明細書の実施例９に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、発光によって測定される約３２ｐＭ未満のＥＣ５０で、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいて、ヒトまたはカニクイザルのＦｃγＲ３ａを介してＮＦＡＴ活性化を媒介する、抗ＧＩＴＲ抗体を含む。特定の実施形態では、例えば、本明細書の実施例９に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、発光によって測定される約３２ｐＭ未満または約１６ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒトまたはカニクイザルＦｃγＲ３ａを介してＮＦＡＴ活性化を媒介する、抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
本開示の抗体は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞傷害性」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本明細書で提供される抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、当該技術分野で公知かつ利用可能であるアッセイを使用して測定され得る。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６を参照されたい）。抗体の定常領域は、抗体が補体を固定し、細胞依存性細胞傷害性を媒介する能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択され得る。
本開示はまた、ＡＤＣＣを媒介する抗体およびその抗原結合断片を含む。例えば、ヒト初代ＮＫ細胞（エフェクター細胞）の存在下でＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲおよびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（標的細胞）に対してＡＤＣＣを媒介する抗体が本明細書に提供される。例えば、本開示は、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、発光によって測定される約１４ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒト初代ＮＫ細胞の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲおよびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲに対してＡＤＣＣを媒介する、抗ＧＩＴＲ抗体を含む。特定の実施形態では、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、発光によって測定される約１４ｐＭ未満、または約１３ｐＭ未満、または約１２ｐＭ未満、または約１１ｐＭ未満、または約１０ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒト初代ＮＫ細胞の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲおよびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲに対してＡＤＣＣを媒介する。
さらなる例では、ヒト初代ＮＫ細胞（エフェクター細胞）の存在下でヒト初代Ｔ細胞（標的細胞）に対してＡＤＣＣを媒介する抗体が本明細書に提供される。例えば、本開示は、例えば、本明細書の実施例１１に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、発光によって測定されるｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒト初代ＮＫ細胞の存在下で、ヒト初代Ｔ細胞に対してＡＤＣＣを媒介する、抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
本開示はまた、ＡＤＣＰを媒介する抗体およびその抗原結合断片も含む。例えば、ヒト初代単球由来食細胞（エフェクター細胞）の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲおよびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（標的細胞）の濃度依存性ＡＤＣＰを媒介する抗体が本明細書に提供される。例えば、本開示は、例えば、本明細書の実施例１２に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、緑色蛍光強度によって測定されるｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒト初代単球由来食細胞の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲおよびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲの濃度依存性ＡＤＣＰを媒介する、抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
本開示はまた、抗ＣＤ３を介したＴ細胞増殖を強化する抗体およびその抗原結合断片も含む。例えば、ＨＥＫ２９３／ＦｃγＲ２ｂ補助細胞の存在下で、刺激ＣＤ３抗体によって媒介される初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を強化する抗体が本明細書に提供される。例えば、本開示は、例えば、本明細書の実施例１３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、ｎＭ以下のＥＣ５０値で、かつバックグラウンドより最大Ｔ細胞増殖（トリチウム崩壊からＣＰＭとして測定）が２．３倍から３．１倍まで増加したＨＥＫ２９３／ＦｃγＲ２ｂ補助細胞の存在下で、刺激ＣＤ３抗体によって媒介される初代ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
いくつかの態様では、ＨＣＶＲアミノ酸配列中にＮ１０１またはＳ１０３の改変を有する単離された抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。そのような改変を有する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）単量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される約１２ｎＭ未満のＫＤで結合する、
（ｂ）単量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で約２分超のｔ１／２で結合する、
（ｃ）二量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される約１ｎＭ未満のＫＤで結合する、
（ｄ）二量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で約５分超のｔ１／２で結合する、からなる群から選択される一つまたは複数の特性をさらに示すことができる。
いくつかの態様では、ＨＣＶＲアミノ酸配列中にＮ１０１またはＳ１０３の改変を有する単離された抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。そのような改変を有する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）細胞表面ヒトおよびカニクイザルのＧＩＴＲを、約４ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する、
（ｂ）Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａおよび／またはＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａエフェクター細胞におけるＦｃを介したＮＦＡＴ活性を、約４０ｐＭ未満のＥＣ５０で強化する、
（ｃ）ヒト初代ＮＫ細胞の存在下で、ヒト初代Ｔ細胞に対して、約２０ｐＭ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣを媒介する、
（ｄ）ヒトまたはカニクイザルのＧＩＴＲを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞において、非ＧＩＴＲ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５倍のＡＤＣＰを媒介する、
（ｅ）抗ＣＤ３を介した初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を強化する、
（ｆ）ＦｃγＲ依存的に、腫瘍内Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させることによって抗腫瘍免疫を誘導する、
（ｇ）約７ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＧＩＴＲリガンドへのヒト単量体ＧＩＴＲ結合を遮断する、からなる群から選択される一つまたは複数の特性をさらに示すことができる。
本開示の抗体は、前述の生物学的特徴、またはそれらの任意の組み合わせのうちの一つまたは複数を保有し得る。本明細書に提供される抗体の生物学的特徴の前述のリストは、包括的であることは意図されない。本開示の抗体のその他の生物学的特徴は、本明細書の作業実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかであろう。
ＧＩＴＲリガンドへのＧＩＴＲ結合を阻害する抗体
本開示は、例えば、本明細書の実施例１４に記載されるアッセイフォーマットで決定される、ヒトＧＩＴＲへのヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）結合を遮断する抗体を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）を遮断する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、実施例１４または実質的に類似のアッセイフォーマットに記載されるように、約７．０ｎＭ未満のＩＣ５０で、約９０％を超える遮断率で、ヒトＧＩＴＲリガンドを遮断する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、実施例１４または実質的に類似のアッセイフォーマットに記載されるように、約１０ｎＭ未満、約７．０ｎＭ未満、約５．０ｎＭ未満、または約３．０ｎＭ未満のＩＣ５０で、約９０％を超える、約９５％を超える、または約９８％を超える遮断率で、ヒトＧＩＴＲリガンドを遮断する。
エピトープマッピングおよび関連技術
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、二つより多くのエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。エピトープは、立体構造的または直線状のいずれであってもよい。立体構造的エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。ある特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
本開示の抗体が結合するエピトープは、ＧＩＴＲタンパク質の３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のアミノ酸の単一連続配列からなる場合もある。あるいは、エピトープは、ＧＩＴＲの複数の非連続的アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなる場合もある。いくつかの実施形態では、エピトープは、ＧＩＴＲのＧＩＴＲ結合ドメイン上に位置し、またはその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＧＩＴＲのＧＩＴＲ結合ドメインの外側に位置し、例えば、抗体が当該エピトープに結合したときに、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲ結合に干渉しないＧＩＴＲ表面上の位置にある。
当業者にとって公知の様々な技法を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内の「一つまたは複数のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．、ＮＹ）に記載されているような常套的な交差遮断アッセイ、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、およびペプチド切断解析などが挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７～４９６）。抗体と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸の特定に使用され得るもう一つの方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換法である。総称的な用語として、水素／重水素交換法は、対象タンパク質を重水素標識すること、次いで抗体を当該重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移され、抗体によって保護された残基（重水素標識のまま残る）を除く全ての残基で、水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質はプロテアーゼ切断および質量分析解析を受け、それと抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａを参照されたい。
本開示は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表７に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）と同じエピトープに結合する抗ＧＩＴＲ抗体をさらに含む。同様に、本開示はまた、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表７に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＧＩＴＲへの結合に関して競合する抗ＧＩＴＲ抗体も含む。
当分野に公知であり、本明細書において例証される日常的な方法を使用することにより、抗体が、参照抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープに結合するか、または参照抗ＧＩＴＲ抗体と結合に関して競合するかを容易に決定することができる。例えば被験抗体が、本発明に提供される参照抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体を、ＧＩＴＲタンパク質に結合させる。次に、ＧＩＴＲ分子に結合する被験抗体の能力が評価される。参照抗ＧＩＴＲ抗体との飽和結合後に被験抗体がＧＩＴＲに結合することができた場合、当該被験抗体は参照抗ＧＩＴＲ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、参照抗ＧＩＴＲ抗体との飽和結合後に被験抗体がＧＩＴＲ分子に結合できない場合、当該被験抗体は、本明細書に提供される参照抗ＧＩＴＲ抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。追加の日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施して、観察された試験抗体の結合の欠落が実際に、参照抗体と同じエピトープに結合することが原因であるのか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠落の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本開示の特定の実施形態によると、競合結合アッセイにおいて測定したとき、ある抗体の、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍の余剰量が、他の抗体の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、またはさらには９９％まで阻害する場合、二つの抗体は同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照のこと）。別の方法として、一個の抗体の結合を減少または除去する抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を減少または除去する場合、二個の抗体は同一エピトープに結合するとみなされる。一個の抗体の結合を減少または除去するアミノ酸突然変異のサブセットのみが、他方の抗体の結合を減少または除去する場合、二個の抗体は「重複エピトープ」を有すると見なされる。
抗体が、参照抗ＧＩＴＲ抗体と結合に関して競合する（または結合に関して交差競合する）かどうかを決定するために、以下の二つの方向性で上述の結合技法が実施される：第一の方向性では、参照抗体は、飽和条件下でＧＩＴＲタンパク質に結合され、その後、ＧＩＴＲ分子への被験抗体の結合が評価される。第二の方向性では、被験抗体が、飽和条件下でＧＩＴＲ分子に結合され、その後、ＧＩＴＲ分子への参照抗体の結合が評価される。両方の方向性で、第一の（飽和）抗体のみがＧＩＴＲ分子に結合することができた場合、被験抗体と参照抗体は、ＧＩＴＲへの結合に関して競合すると結論付けられる。当分野の当業者によって理解されるように、参照抗体への結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてよく、重複したエピトープまたは隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断する場合もある。
ヒト抗体の調製
本開示の抗ＧＩＴＲ抗体は、完全ヒト抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の作製方法は、当分野に公知である。ヒトＧＩＴＲに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の状況下で任意のそうした公知の方法が使用され得る。
例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）法、または任意の他の類似の公知の方法を使用して完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する、ＧＩＴＲに対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。以下の実験セクションと同様に、抗体を、親和性、リガンド遮断活性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付け、選択する。必要であれば、マウス定常領域と、所望のヒト定常領域、例えば野生型もしくは改変型のＩｇＧ１またはＩｇＧ４を置換して、完全ヒト抗ＧＩＴＲ抗体が作製される。選択された定常領域は、特定の用途に応じ変動し得る一方、高親和性の抗原結合および標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。ある例において、完全ヒト抗ＧＩＴＲ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離される。
生物学的等価物
本開示の抗ＧＩＴＲ抗体および抗体断片は、説明された抗体のアミノ酸配列とは異なるがヒトＧＩＴＲに結合する能力を保有するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の一つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。同様に、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較して一つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片と本質的に生物学的に均等である抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。そうしたバリアントなアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の例は、上記に検討される。
二つの抗原結合性タンパク質または抗体が、薬学的等価物または薬学的代替物であり、類似した実験条件下で、単回投与または複数回投与のいずれかで同モル投与量で投与されたときに、その吸収の速度および範囲が有意な差を示さない場合、それら二つの抗原結合性タンパク質または抗体は生物学的に等価であるとみなされる。いくつかの抗体で、吸収の範囲は同等であるが、吸収の速度は同等ではなく、しかし吸収速度における当該差異が意図的であり、ラベリングに反映されており、例えば、慢性的使用での有効身体薬物濃度の獲得に必須ではなく、試験された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないとみなされるために、それら抗体が生物学的に等価であるとみなされ得る場合、それら抗体は等価物、または薬学的代替物とみなされる。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度および有効性において臨床的に意義のある差異が無ければ、生物学的に均等である。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、参照製品と生物学的製品の間での一回以上の切り替えを行わない持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害作用のリスクの予想される上昇または有効性の減退が生じずに、患者がそのような切り替えを行うことができる場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、一つまたは複数の使用条件について、一つまたは複数の共通の作用機序によって、このような機序が公知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性の測定方法としては、例えば、（ａ）時間の関数として血液、血漿、血清または他の生物学的液体中で抗体またはその代謝物の濃度が測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、（ｂ）ヒトのインビボ生体利用効率データと相関し、このデータを合理的に予測するインビトロ検査、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的作用が時間関数として計測される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、および（ｄ）抗体の安全性、有効性または生体利用効率もしくは生物学的等価性を立証する、適切に管理された臨床試験が挙げられる。
本発明に提供される抗ＧＩＴＲ抗体の生物学的に均等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基または配列を欠失させることによって構築されてもよい。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要な、または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために欠失されてもよく、または他のアミノ酸で置換されてもよい。他の状況では、生物学的に均等の抗体には、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消滅または除去する変異を含む、抗ＧＩＴＲ抗体バリアントを含んでもよい。
種選択性および種交差反応
特定の実施形態によると、本開示は、ヒトＧＩＴＲに結合するが、他種由来のＧＩＴＲには結合しない抗ＧＩＴＲ抗体を提供する。本開示はさらに、ヒトＧＩＴＲと、一つまたは複数の非ヒト種に由来するＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体も提供する。例えば、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲに結合してもよく、そして場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＧＩＴＲのうちの一つまたは複数にも結合してもよく、または結合しなくてもよい。本開示の特定の例示的実施形態によると、ヒトＧＩＴＲとカニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＧＩＴＲに特異的に結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。本明細書に提供される他の抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲには結合するが、カニクイザルＧＩＴＲには結合しないか、または弱くしか結合しない。
多特異性抗体
本開示の抗体は、一特異性または多特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。多重特異性抗体は、一つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよく、または複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本開示の抗ＧＩＴＲ抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質と連結されることができ、または共発現されることができる。例えば、抗体またはその断片は、例えば別の抗体または抗体断片などの、一つまたは複数の他の分子実体に、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有会合、またはその逆により）機能的に連結して、第二の結合特異性を有する二重特異性、または多特異性の抗体を産生することができる。
本開示は、免疫グロブリンの一つのアームはヒトＧＩＴＲに結合し、免疫グロブリンの他方のアームが第二の抗原に特異的である、二重特異性抗体を含む。ＧＩＴＲ結合アームは、本明細書の表７に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかを含んでもよい。特定の実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ヒトＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬ結合を遮断する。他の実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ヒトＧＩＴＲに結合するが、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬ結合は遮断しない。いくつかの実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ヒトＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲシグナル伝達を活性化する。他の実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ＧＩＴＲＬを介した受容体刺激を遮断する。本開示は、抗体の一方のアームがヒトＧＩＴＲの第一のエピトープに結合し、該抗体の他方のアームがヒトＧＩＴＲの第二の別個のエピトープに結合する二重特異性抗体も含む。
本開示の状況下で使用され得る例示的な二重特異性抗体のフォーマットは、第一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインと第二のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、この場合において当該第一および第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸によって互いに異なり、そしてこの場合において、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較して、二重特異性抗体のプロテインＡへの結合を低下させる。一実施形態では、第一のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、例えばＨ９５Ｒ（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）改変などのプロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含有する。第二のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＹ４３６Ｆ）を含んでもよい。第二のＣＨ３に見られ得るさらなる改変としては、以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合には、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ （ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合には、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ （ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合には、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ （ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。上述の二重特異性抗体のフォーマットの変形も、本開示の範囲内に予期される。
本開示の状況下で使用され得る他の例示的な二重特異性のフォーマットとしては限定されないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディの二重特異性フォーマット（ｄｉａｂｏｄｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｍａｔ）、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマット（前述のフォーマットのレビューに関しては、例えばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１～１１、および当該文献内に引用される参考文献を参照のこと）が挙げられる。二重特異性抗体はさらに、ペプチド／核酸結合を使用して構築されてもよい。例えば、直交的な化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド結合体を作製し、次いでこれを規定の組成、結合価および構造を有する多量体性複合体へと自己アセンブリさせる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
治療用製剤および投与
本開示は、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。本明細書に提供される医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の薬剤と共に製剤化される。数多くの適切な製剤が、すべての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出され得る。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水乳剤、乳剤カルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
患者に投与される抗体の投与量は、患者の年齢および大きさ、標的の疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従い計算される。成人患者では、本開示の抗体を、約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、または約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重で、通常に単回投与で静脈内投与することが有益であり得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整できる。抗ＧＩＴＲ抗体を投与するための効果的な用量およびスケジュールは経験的に決定されうるが、例えば、患者の進行は定期的な評価によってモニタリングすることができ、それに応じて投与量が調整される。さらに投与量の種間スケーリングは、当分野に公知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
様々な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞内へのカプセル化、受容体媒介性エンドサイトーシスが既知であり、本明細書に提供する薬学的組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。導入方法としては限定されないが、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が挙げられる。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所性であってもよい。
本開示の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジで皮下または静脈内に送達され得る。さらに皮下送達に関しては、ペン型送達デバイスが、本開示の医薬組成物の送達に容易に応用される。そのようなペン型送達デバイスは、再利用可能であるか、または使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、概して、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内部の医薬組成物のすべてが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄することができ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換され得る。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、医薬組成物がデバイス内部のリザーバ内に保持された事前に充填された状態で販売される。いったんリザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
多数の再利用可能なペン型および自動注入装置送達デバイスは、本開示の医薬組成物の皮下送達において用途を見出す。例としては限定されないが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、英国、ウッドストック）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン （Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、スイス、バーグドーフ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、インディアナ州インディアナポリス）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社、デンマーク、コペンハーゲン）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社、デンマーク、コペンハーゲン）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ニュージャージー州フランクリンレイク）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ社、ドイツ、フランクフルト）が挙げられる。本開示の医薬組成物の皮下送達における用途を有するディスポーザブルペン送達デバイスの例としては限定されないが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ社）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ社、カリフォルニア州サウザンドオークス）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ社、ドイツ、シュトゥットガルド）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ社、イリノイ州アボットパーク）が挙げられる。
ある特定の状況では、医薬組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（上記のＬａｎｇｅｒ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、多量体性材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的の近傍に配置することができる。したがって全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３によるレビューにおいて検討されている。
注入可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内注射、点滴などのための剤形を含み得る。これらの注射可能な調製物は、公知の方法によって調製されてもよい。例えば、注入可能な調製物は、例えば、注入に従来使用される無菌水性媒体または油性媒体に、上述される抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等張液、および他の助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と併用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが採用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と併用され得る。このようにして調製した注射液は、好ましくは、適切なアンプル中に充填される。
有利に、上述の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量で剤形に調製される。単位用量におけるこのような剤形には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。含有される前述の抗体の量は、一般的に単位用量で剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、上記の抗体は約５～約１００ｍｇに含有されることが好ましく、およびその他の剤形に対しては約１０～約２５０ｍｇに含有されることが好ましい。
抗体の治療用途
本開示は、その必要のある対象に、抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、本明細書の表７に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列またはＣＤＲ配列のいずれかを含む抗ＧＩＴＲ抗体）を含む治療用組成物を投与することを含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗ＧＩＴＲ抗体、その抗原結合断片、またはＡＤＣのいずれかと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。
本明細書に提供される抗体は、特に、ＧＩＴＲの発現もしくは活性に関連するか、またはそれによって媒介される、あるいはＧＩＴＲとＧＩＴＲＬとの間の相互作用を遮断すること、および／またはＧＩＴＲ活性および／もしくはシグナル伝達を刺激することによって治療可能な、任意の疾患もしくは障害の治療、予防、および／または改善に有用である。例えば、本開示の抗体および抗原結合断片は、例えば、ＧＩＴＲ活性化ではあるが、免疫反応、すなわち抗腫瘍応答を調節することによって、免疫および増殖性疾患または障害、例えば、癌を治療するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、例えば、ＡＤＣＣを介して、リガンド遮断能力とは無関係に高レベルのＧＩＴＲを発現する細胞を枯渇させる。本開示の抗体および抗原結合断片は、免疫応答を強化することによって疾患または障害を治療するために使用することができる。本開示は、対象において抗腫瘍免疫応答を調節する方法を含み、当該方法は、本明細書に記載される抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合断片を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、治療的利益を助長する腫瘍内Ｔエフェクター／Ｔ制御性細胞比を強化する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、治療的利益を助長する腫瘍内Ｔ制御性細胞の枯渇を強化する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、治療的利益を助長するＣＤ８＋ Ｔ細胞／Ｔ制御性細胞比を増加させる。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、Ｔ細胞生存を促進する。
抗体および抗原結合断片によって治療され得る例示的な疾患または障害としては、免疫および増殖性疾患または障害、例えば、癌が挙げられる。本開示の抗体および抗原結合断片は、脳および髄膜、中咽頭、肺および気管支樹、消化管、男性および女性生殖器、筋肉、骨、皮膚および付属器官、結合組織、脾臓、免疫系、血液形成細胞および骨髄、肝臓および尿路、ならびに眼などの特殊感覚器官において生じる原発性および／または転移性の腫瘍を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、固形腫瘍または血液由来腫瘍を治療するために使用される。特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、または肝癌のうちの一つまたは複数を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、ＩＣＢ経験癌を治療するために使用される。
いくつかの態様では、本開示の抗体は、結腸直腸癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣまたはＳＣＣＨＮ）を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、胃癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、子宮頸癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、食道癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、黒色腫を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、トリプルネガティブ乳癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、腎細胞癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、乳癌を治療するために使用される。
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性筋疾患、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性じんましん、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない自己免疫疾患の治療に有用である。
本明細書に記載される治療方法の背景において、抗ＧＩＴＲ抗体は、単剤療法として（すなわち唯一の治療剤として）投与されてもよく、または一つもしくは複数の追加の治療剤（その実施例は本明細書において別に記載される）と併用されて投与されてもよい。
併用療法および製剤
本開示の抗ＧＩＴＲ抗体、および本開示の抗体またはその抗原結合断片と有利に組み合わせられ得る任意の追加の治療剤を利用する併用療法も、本明細書に提供される。
本開示は、本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかと、一つまたは複数の追加の治療活性成分との組み合わせを含む組成物および治療用製剤、ならびにそのような組み合わせを、その必要のある対象に投与することを含む治療方法を含む。
本開示の抗体は、例えば、以下を含む癌を治療するために使用される一つまたは複数の抗癌剤または治療と相乗的に組み合わされてもよい。特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、または肝癌のうちの一つまたは複数を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、ＩＣＢ経験癌を治療するために使用される。
いくつかの態様では、本開示の抗体は、結腸直腸癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣまたはＳＣＣＨＮ）を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、胃癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、子宮頸癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、食道癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、黒色腫を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、トリプルネガティブ乳癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、腎細胞癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示の抗体は、乳癌を治療するために使用される。
本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体を、免疫賦活療法および／または免疫抑制療法と組み合わせて使用して、腫瘍増殖を阻害し、および／または癌患者の生存を高めることが本明細書で企図されている。免疫賦活療法は、抑制された免疫細胞の「ブレーキを解除する」、または免疫反応を活性化する「アクセルを踏む」のいずれかによって、免疫細胞活性を強化する直接的な免疫賦活療法を含む。例としては、他のチェックポイント受容体、ワクチン接種、およびアジュバントの標的化が挙げられる。免疫抑制手段は、免疫原性細胞死、炎症を促進することによって腫瘍の抗原性を高めるか、または抗腫瘍免疫応答を促進する他の間接的な効果を有する場合がある。例としては、放射線療照射、化学療法、抗血管新生薬、および手術が挙げられる。
本開示は、抗ＧＩＴＲ抗体を、腫瘍破壊を促進するためのＴ細胞刺激を強化する、活性化受容体に対する一つまたは複数のアゴニスト抗体、および阻害性受容体に対する一つまたは複数の遮断抗体と組み合わせて対象に投与することを含む、対象において抗腫瘍免疫応答を調節する方法を含む。
本開示は、対象において抗腫瘍免疫応答を調節する方法を含み、当該方法は、本明細書に記載される抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合断片を、第二のＴ細胞活性化受容体（すなわち、ＧＩＴＲ以外）に結合する一つまたは複数の単離された抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、第二のＴ細胞活性化受容体は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、またはＶＥＭである。本開示はまた、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片と、該第二のＴ細胞活性化受容体に結合する抗体または抗原結合断片とを含む製剤を含む。
様々な実施形態では、本開示の一つまたは複数の抗体を、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＰＤ－１に対する抗体（例えば、ニボルマブ、セミプリマブ）、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、イピリムマブ）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、別のＴ細胞共阻害剤またはリガンドのアンタゴニスト（例えば、ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０またはＶＩＳＴＡに対する抗体）、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、米国特許出願公開第７，０８７，４１１号に記載されるアフリベルセプトまたは他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質などの「ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ」、または抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合断片（例えば、ベバシズマブ、またはラニビズマブ）またはＶＥＧＦ受容体の低分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ）］、Ａｎｇ２阻害剤（例えば、ネスバクマブ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、エルロチニブ、セツキシマブ）、共刺激受容体に対するアゴニスト（例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質）、腫瘍特異的抗原に対する抗体（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍－Ｍ２－ＰＫ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ムチン－１、ＭＡＲＴ－１、およびＣＡ１９－９）、ワクチン（例えば、無菌化ウシ型結核菌、癌ワクチン）、抗原提示を増加させるアジュバント（例えば、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子）、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体、ＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体）、細胞毒素、化学療法剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、セタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、およびビンクリスチン）、シクロホスファミド、放射線療法、ＩＬ－６Ｒ阻害剤（例えば、サリルマブ）、ＩＬ－４Ｒ阻害剤（例えば、デュピルマブ）、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１５などのサイトカイン、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（例えば、抗ＣＤ１９－ＤＭ４ ＡＤＣ、および抗ＤＳ６－ＤＭ４ ＡＤＣ）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬）、抗酸化剤などの栄養補助食品、または癌を治療するための任意の緩和ケアと組み合わせて使用することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体は、抗腫瘍応答を増強するために、樹状細胞ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍細胞ワクチンなどを含む癌ワクチンと組み合わせて使用されてもよい。本開示の抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用できる癌ワクチンの例には、黒色腫および膀胱癌用のＭＡＧＥ３ワクチン、乳癌用ＭＵＣ１ワクチン、脳癌（多形性膠芽腫を含む）用のＥＧＦＲｖ３（例えば、リンドペピムト）、またはＡＬＶＡＣ－ＣＥＡ（ＣＥＡ＋癌のための）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される一つまたは複数の抗ＧＩＴＲ抗体は、以下に限定されないが、米国特許公開第２０１５／０２０３５７９号および米国特許第９，９８７，５００号に記載されるものを含む、一つまたは複数の抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与され、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、本明細書に記載されるように改変された、米国特許第２０１７／０３５５７７４Ａ１号からの抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、またはニボルマブである。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、長期持続性抗腫瘍応答を生じさせる、および／または癌を有する患者の生存を高めるための方法において、放射線療法と組み合わせて投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、癌患者への放射線療法の前、併用、または後に投与されてもよい。例えば、放射線療法は、腫瘍病変に対して一回または複数回の線量で投与され、その後に本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体の一回または複数回の用量の投与が行われてもよい。いくつかの実施形態では、放射線療法を腫瘍性病変に局所投与して、患者の腫瘍の局所免疫原性を増させ（アジュバント作用性放射線照射（ａｄｊｕｖｉｎａｔｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ））、および／または腫瘍細胞を死滅させ（切除性放射線照射（ａｂｌａｔｉｖｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ））、その後、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体を全身投与することができる。例えば、頭蓋内放射線照射を、脳癌（例えば、多形性膠芽腫）を有する患者に、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体の全身投与と組み合わせて投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、放射線療法および化学療法剤と（例えば、テモゾロミド）またはＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト）と組み合わせて投与されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、ＬＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶによって引き起こされる慢性ウイルス感染を治療するために、一つまたは複数の抗ウイルス薬と組み合わせて投与されてもよい。抗ウイルス薬の例には、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリン、およびコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、慢性ウイルス感染を治療するために、ＬＡＧ３阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、または別のＴ細胞共阻害剤の任意のアンタゴニストと組み合わせて投与されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、自己免疫性疾患の治療のために、免疫細胞上のＦｃ受容体に対する抗体と組み合わせてもよい。一実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその断片は、自己免疫組織に特異的な抗原を標的とした抗体または抗原結合タンパク質と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片は、限定されないが、Ｆｃα（例えば、ＣＤ８９）、Ｆｃガンマ（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ１６ｂ）、ＣＤ１９などを含む、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体を標的とする抗体または抗原結合タンパク質との組み合わせで投与される。本明細書に提供されるその断片の抗体は、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性筋疾患、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性じんましん、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない自己免疫疾患または障害を治療するために、当技術分野で公知の任意の薬物または療法（例えば、コルチコステロイドおよび他の免疫抑制剤）と組み合わせて使用されてもよい。
本開示はまた、対象において抗腫瘍免疫応答を調節する方法を含み、当該方法は、本明細書に記載される抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合断片を、Ｔ細胞阻害性受容体に結合する一つまたは複数の単離された抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞阻害性受容体は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、またはＬＡＧ－３である。本開示はまた、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片と、該Ｔ細胞阻害性受容体に結合する抗体または抗原結合断片とを含む製剤を含む。いくつかの態様では、例えば、ＰＤ１シグナル伝達の存在下で、セミプリマブは、抗ＣＤ３－刺激Ｔ細胞活性化を強化する抗ＧＩＴＲ抗体の能力を回復した。
本開示はまた、放射線または化学療法と併せて、抗体またはその抗原結合断片、または本明細書に記載される製剤を対象に投与することによって、癌を治療する方法を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体は、以下からなる群から選択される一つまたは複数の追加の治療活性成分と共製剤化され、および／または組み合わせて投与される：ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ］、またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２［例えば、トラスツズマブまたはＴ－ＤＭ１｛ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）｝］、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ－ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０）、ＰＤＧＦＲ－α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－α抗体）、ＰＤＧＦＲ－β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－β抗体または小分子キナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブメシル酸塩またはスニチニブリンゴ酸塩）、ＰＤＧＦリガンド阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、または－Ｄ抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡなど）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号を参照（本明細書では、「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも呼称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１などの米国特許第２００９／０１４２３５４号に開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐなどの米国特許第２０１１／００２７２８６号に開示されている抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン［例えば、抗ＵＰＫ３Ａ］抗体）、ＭＵＣ１６アンタゴニスト（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）、Ｔｎ抗原アンタゴニスト（例えば、抗Ｔｎ抗体）、ＣＬＥＣ１２Ａアンタゴニスト（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体）、ＴＮＦＲＳＦ１７アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ１７抗体）、ＬＧＲ５アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブなどの一価抗ＣＤ２０抗体）。本明細書に提供される抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の剤としては例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤およびサイトカイン阻害剤が挙げられ、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、またはそれらの各受容体に結合する低分子サイトカイン阻害剤および抗体が挙げられる。
本開示は、本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかと、一つまたは複数の化学療法剤との組合せを含む、組成物および治療用製剤を含む。化学療法剤の例示としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補液（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ社、フランス、アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモンの作用を制御する、または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）をはじめとする抗エストロゲン；例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体はさらに、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、心臓保護剤、金属キレート剤、ＩＦＮ－ガンマ、および／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与されてもよく、および／または一緒に製剤化されてもよい。
追加の治療活性成分、例えば、上記に列記される剤またはその誘導体のいずれかは、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体の投与の直前に、同時に、または直後に投与されてもよい（本開示の目的に対し、そうした投与レジメンは、追加の治療活性成分と「併用された」抗ＧＩＴＲ抗体の投与とみなされる）。本開示は、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体が、本明細書の別の箇所に記載される追加の治療活性成分のうちの一つまたは複数と共製剤化される医薬組成物を含む。
追加の治療活性成分は、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体の投与前に対象に投与されてもよい。例えば、第一の成分が、第二の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、または１分未満前に投与される場合に、第一の成分は、第二の成分の「前に」投与されるとみなされ得る。他の実施形態では、追加の治療活性成分は、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体の投与の後に対象に投与されてもよい。例えば、第一の成分が、第二の成分の投与の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合に、第一の成分は、第二の成分の「後に」投与されるとみなされ得る。さらに他の実施形態では、追加の治療活性成分は、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体の投与と同時に対象に投与され得る。本開示の目的に対し、「同時」投与とは、例えば、抗ＧＩＴＲ抗体と追加の治療活性成分を、単一剤形（例えば、共製剤化）で、または互いに約３０分以内に対象に投与される個別の剤形で対象に投与することを含む。個別の剤形で投与する場合、各剤形は同じ経路を介して投与することができ（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体と追加の治療活性成分の両方を静脈内、皮下に投与することができるなど）、別の方法として、各剤形は異なる経路を介して投与することができる（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は静脈内に投与されてもよく、追加の治療活性成分は皮下投与されてもよい）。いずれの場合でも、成分を、単一の剤形で、個別の剤形を同じ経路で、または個別の剤形を異なる経路で投与することはすべて、本開示の目的のための「同時投与」とみなされる。本開示の目的に関し、追加の治療活性成分の投与の「前に」、「同時に」または「後に」（これらの用語は本明細書において上記に定義されるとおり）抗ＧＩＴＲ抗体を投与することは、抗ＧＩＴＲ抗体を追加の治療活性成分「と組み合わせて」投与することとみなされる。
本開示は、本開示の抗ＧＩＴＲ抗体が、様々な用量の組み合わせを使用して、本明細書の別の箇所に記載される追加の治療活性成分のうちの一つまたは複数と共製剤化される医薬組成物を含む。
本明細書において提供される抗ＧＩＴＲ抗体が、抗ＧＩＴＲ抗体およびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤の投与を含む、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦトラップ）との組み合わせで投与される例示的な実施形態では、個々の成分は、対象に投与されてもよく、および／または様々な用量の組み合わせを使用して共製剤化されてもよい。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、６．０ｍｇ、７．０ｍｇ、８．０ｍｇ、９．０ｍｇ、および１０．０ｍｇからなる群から選択される量で対象に投与されてもよく、および／または共製剤中に含有されてもよい。ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦトラップ）は、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．１ｍｇ、１．２ｍｇ、１．３ｍｇ、１．４ｍｇ、１．５ｍｇ、１．６ｍｇ、１．７ｍｇ、１．８ｍｇ、１．９ｍｇ、２．０ｍｇ、２．１ｍｇ、２．２ｍｇ、２．３ｍｇ、２．４ｍｇ、２．５ｍｇ、２．６ｍｇ、２．７ｍｇ、２．８ｍｇ、２．９ｍｇおよび３．０ｍｇからなる群から選択される量で対象に投与されてもよく、および／または共製剤中に含有されてもよい。組み合わせ／共製剤は、例えば、週に二回、週に一回、２週間に一回、３週間に一回、月に一回、２か月に一回、３か月に一回、４か月に一回、５か月に一回、６か月に一回など、本明細書の他の場所に開示される投与レジメンのいずれかに従って、対象に投与されてもよい。
投与レジメン
本開示の特定の実施形態によると、抗ＧＩＴＲ抗体（または抗ＧＩＴＲ抗体と、本明細書に言及される追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物）の複数回投与量を、規定の時間経過にわたり対象に投与してもよい。本明細書に提供される本態様による方法は、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体の複数回投与量を対象に逐次的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与すること」とは、抗ＧＩＴＲ抗体の各投与量が、例えば所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）をあけた異なる日など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本開示は、抗ＧＩＴＲ抗体の一つの初回投与量、次いで抗ＧＩＴＲ抗体の一つまたは複数の第二の投与量、および任意で次いで抗ＧＩＴＲ抗体の一つまたは複数の第三の投与量を逐次的に患者に投与することを含む方法を含む。
「初回投与量」、「第二の投与量」、および「第三の投与量」という用語は、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体の投与の時間的な順序を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量である（また「ベースライン用量」とも呼称される）、「二次用量」は初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は二次用量の後に投与される用量である。初回投与量、第二の投与量、および第三の投与量はすべて、同じ量の抗ＧＩＴＲ抗体を含有し得るが、概して投与頻度に関しては概して互いに異なり得る。しかしながら特定の実施形態では、初回投与量、第二の投与量、および／または第三の投与量に含有される抗ＧＩＴＲ抗体の量は、治療経過の間に（例えば、適宜調整されて加減され）、互いに異なっている。特定の実施形態では、二つ以上（例えば、２、３、４、または５）の用量が、治療レジメンの開始時に負荷用量」として投与され、その後に続く用量は、より少ない頻度ベースで投与される（例えば、「維持用量」）。
本開示の特定の例示的な実施形態では、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１～２６週間後（例えば、１週間後、１週間半後、２週間後、２週間半後、３週間後、３週間半後、４週間後、４週間半後、５週間後、５週間半後、６週間後、６週間半後、７週間後、７週間半後、８週間後、８週間半後、９週間後、９週間半後、１０週間後、１０週間半後、１１週間後、１１週間半後、１２週間後、１２週間半後、１３週間後、１３週間半後、１４週間後、１４週間半後、１５週間後、１５週間半後、１６週間後、１６週間半後、１７週間後、１７週間半後、１８週間後、１８週間半後、１９週間後、１９週間半後、２０週間後、２０週間半後、２１週間後、２１週間半後、２２週間後、２２週間半後、２３週間後、２３週間半後、２４週間後、２４週間半後、２５週間後、２５週間半後、２６週間後、２６週間半後、またはそれ以上）に投与される。「直前の投与量」という文言は、本明細書において使用される場合、複数回の投与の順序を意味し、当該順序のまさに次の投与量の投与が、その間の投与を伴わずに患者に投与される抗ＧＩＴＲ抗体の投与を意味する。
本明細書に提供される本態様による方法は、抗ＧＩＴＲ抗体の二次用量および／または三次用量の任意の数を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、患者に単一の二次用量のみが投与される。他の実施形態では、二つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の二次用量を患者に投与する。同様に、ある特定の実施形態では、患者に単一の三次用量のみが投与される。他の実施形態では、二つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上）の第三の投与量が患者に投与される。投与レジメンは、特定の対象の生涯にわたって、またはそのような治療がもはや治療上必要とされなくなるか、または有益でなくなるまで、無期限に行われてもよい。
複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～２週間後または１～２か月後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～１２週間後に患者に投与されてもよい。本明細書に提供される特定の実施形態では、第二および／または第三の投与量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過中に変化し得る。投与の頻度は、臨床検査後の個々の患者のニーズに応じて、医師による治療過程の間に、調節され得る。
本開示は、２～６回の負荷用量が、第一の頻度で患者に投与され（例えば、週に一回、二週間に一回、三週間に一回、一か月に一回、二か月に一回など）、その後、より少ない頻度で患者に二回以上の維持用量が投与される投与レジメンを含む。例えば、本明細書に提供されるこの態様によれば、負荷用量が月に一回の頻度で投与される場合、維持用量は、六週間に一回、二か月に一回、三か月に一回など、患者に投与され得る。
抗体の診断上の使用
本開示の抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、診断目的のために、試料中のＧＩＴＲまたはＧＩＴＲ発現細胞を検出および／または測定するためにも使用され得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体またはその断片を使用して、ＧＩＴＲの異常発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現の欠如など）を特徴とする状態または疾患を診断してもよい。ＧＩＴＲに対する例示的な診断アッセイは、例えば、患者から取得された試料を、本明細書に提供される抗ＧＩＴＲ抗体と接触させることなどを含み、当該抗ＧＩＴＲ抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識される。あるいは標識されていない抗ＧＩＴＲ抗体が、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わされて、診断応用に使用され得る。検出可能な標識またはレポーター分子は、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＧＩＴＲを検出または測定するために使用され得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、およびイムノ－ＰＥＴ（例えば、８９Ｚｒ、６４Ｃｕなど）、および蛍光活性化細胞ソーティング法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本開示によるＧＩＴＲ診断アッセイで使用できる試料としては、正常な状態または病理学的状態下で、検出可能な量のＧＩＴＲタンパク質またはその断片を含有する、患者から取得可能な任意の組織または液体試料が挙げられる。概して、健常な患者（例えば、ＧＩＴＲのレベルまたは活性の異常と関連した疾患または状態に罹患していない患者）から取得された特定の試料中のＧＩＴＲレベルが、基準または標準的なＧＩＴＲレベルを最初に確立するために測定される。次に、ＧＩＴＲの基準レベルを、ＧＩＴＲ関連の疾患または状態を有すると疑われる個体から得られた試料において測定されたＧＩＴＲレベルと比較してもよい。
以下の実施例は、当業者に、本明細書に提供される方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示と説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明であるとみなす範囲を限定することは意図されていない。使用した数字（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保するために努力がなされているが、一部の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は大気圧でまたは大気圧付近での℃（摂氏）である。
実施例１．抗ＧＩＴＲ抗体の生成
抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲの可溶性二量体エクトドメインを含む免疫原を用いて、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを含む操作マウス）を免疫化することにより取得された。抗体の免疫応答を、ＧＩＴＲ特異的免疫測定法によってモニタリングした。米国特許第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載されるように、いくつかの完全ヒト抗ＧＩＴＲ抗体を、骨髄腫細胞との融合をおこなわずに直接、抗原陽性Ｂ細胞から単離した。
表１は、米国特許第２０１７／０３５５７７４Ａ１号に以前に開示されたように、選択された抗ＧＩＴＲ抗体である、ＣｏｍｐＡｂ１抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列識別子を、表２に記載する。表３は、ＣｏｍｐＡｂ１抗体の全長重鎖配列および全長軽鎖配列を提供する。
表１：アミノ酸配列識別子
Figure 2023506593000001
表２：核酸配列識別子
Figure 2023506593000002
表３：全長重鎖配列および全長軽鎖配列
Figure 2023506593000003
実施例２．抗ＧＩＴＲ抗体であるＣｏｍｐＡｂ１における切断の評価および定量化
ＣｏｍｐＡｂ１抗体の特徴解析により、タンパク質発現中に一部が切断されることが観察された。以下の分析を実施して、切断が発生している点を特定し、切断される抗体の量を決定した。
ＣｏｍｐＡｂ１抗体の試料を、ＵＶ検出器および質量分析計のインラインＷａｔｅｒｓ Ｖｉｏｎ ＩＭＳ ＱＴｏｆ質量分析計を備えた逆相液体クロマトグラフィーを使用したインタクト質量分析によって分析し、抗体およびそのバリアントの分子量を決定した。各抗体試料を、試料注入前に、移動相Ａの９９％（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中０．１％のギ酸）および移動相Ｂの１％（アセトニトリル中０．１％のギ酸）で平衡化したＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）上に注入した。カラム温度を８０℃に維持した。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを使用して、０．２５ｍＬ／分の流速でタンパク質を溶出した。試料注入時に、全体的な移動相勾配を、最初の３分間は１％の移動相Ｂで保持し、その後、２分間にわたって１％～２０％の移動相Ｂに直線的増加、１５分間にわたって２０％～３５％の移動相Ｂに第二の直線的増加、その後、５分間にわたって３５％～７０％の移動相Ｂに第三の直線的増加、その後、次の２分間にわたって９０％の移動相Ｂに最終的増加をさせた。溶出されたタンパク質の溶出プロファイルを、フォトダイオードアレイ検出器を使用して２１５ｎｍでモニタリングし、溶出されたタンパク質の質量を、Ｗａｔｅｒｓ Ｖｉｏｎ ＩＭＳ ＱＴｏｆ質量分析計を使用して測定した。
このプロセスを使用して、全長ＧＩＴＲ抗体ＣｏｍｐＡｂ１の短縮型バリアントが特定された。ＵＶクロマトグラムでは、全長抗体よりも切断型抗体の方が早く溶出した。切断型の質量は、ＣｏｍｐＡｂ１重鎖のＣＤＲ３領域中の残基Ｎ１０１とＰ１０２との間の切断に対応していた。切断型の存在量は、ＣｏｍｐＡｂ１の複数のロットからのＵＶクロマトグラムピーク面積に基づいて、全抗体の約５％と推定された。これらの切断の位置は、ＣｏｍｐＡｂ１をトリプシンを使用してリジンまたはアルギニンで終わるペプチドに消化し、逆相ＬＣ分離と、それに続くＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計での質量分析によって分析した、還元ペプチドマッピング分析によって検証された。全長抗体に対応するトリプシンペプチド、ならびにＣＤＲ３中の切断部位に対応するＮ１０１およびＰ１０２で終わる短いペプチドを、それらの正確な質量および断片化スペクトルに基づいて特定した。
ＣｏｍｐＡｂ１の切断レベルは、インビトロおよびインビボの血清中で経時的に増加する：
ＣｏｍｐＡｂ１を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とサル血清中で、３７℃で、最大２８日間インキュベートし、インビトロの生理学的条件下でのＣｏｍｐＡｂ１の安定性を試験した。さらに、マウスに１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１を投与し、１および８日目に血清を採取して、インビボでＣｏｍｐＡｂ１の安定性を試験した。
ＣｏｍｐＡｂ１は、抗ヒトＦｃ抗体で被覆された磁気ビーズを使用して血清試料から精製された。精製されたＣｏｍｐＡｂ１は、酸性条件下でビーズから溶出され、次いで酵素Ｌｙｓ－Ｃを使用して消化され、全長抗体がリジンで終わるペプチドに切断された。逆相ＬＣ勾配を使用して試料を分離し、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計によって分析した。全長抗体およびＮ１０１／Ｐ１０２で切断された抗体に対応するＬｙｓ－Ｃ生成ペプチドを、正確な質量および断片化スペクトルに基づいてすべての試料で特定した。インタクト抗体および切断抗体の質量に対応する抽出されたイオンクロマトグラムのピーク面積を使用して、各試料における切断率を計算した。
結果は、ＰＢＳでのインキュベーションにより、２８日間でＣｏｍｐＡｂ１切断が１０．３％から２４．５％に増加し、サル血清でのインキュベーションにより、２８日間で同じＣｏｍｐＡｂ１切断が７．４％から４８．７％に増加したことを示した（図１）。投与マウスの血清中のＣｏｍｐＡｂ１の切断レベルは、８日後、開始レベル７．７％から５４％に増加した（図２）。
実施例３．ＧＩＴＲへの結合を保持する抗ＧＩＴＲ抗体ＣｏｍｐＡｂ１の重鎖バリアントの生成
抗ＧＩＴＲ機能を保持しながらＣＤＲ３中のアミノ酸１０１ＮＰ１０２または１０２ＰＳ１０３での切断を防止するＣｏｍｐＡｂ１重鎖（ＨＣ）のバリアントを特定するためにスクリーニングを実施した。ＣｏｍｐＡｂ１重鎖（ＨＣ）可変ドメインのバリアントを表す二本鎖ＤＮＡ断片は、ＩＤＴ（ｇＢｌｏｃｋ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）によって発注および合成され、その後、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングされた。ＣｏｍｐＡｂ１ ＨＣのＮ１０１またはＳ１０３をシステインを除くすべてのアミノ酸で置換することによって、合計３６個のバリアントが作製された。表４を参照のこと。
抗体は、ＣＨＯ細胞における各ＨＣバリアントおよびＣｏｍｐＡｂ１軽鎖（１～３９の生殖細胞ユニバーサル軽鎖）の一過性発現後に産生された。
表４：ＣｏｍｐＡｂ１重鎖バリアント
Figure 2023506593000004
Figure 2023506593000005
抗体含有上清を収集し、Ｂｉａｃｏｒｅによるスクリーニングのために送付し、ＧＩＴＲ結合を測定した。
ヒト抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性および速度定数が表面プラズモン共鳴によって決定された。
ならし培養培地に分泌された抗体のＢｉａｃｏｒｅ実験を以下のように行った。Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器を２５℃で使用して、ＣＭ５抗ヒトＦｃ結合表面上で８ｕＬ／分の流速で８０秒間抗体を捕捉した。各抗体のおよそ１０００～２０００ＲＵを捕捉した。１００ｎＭ ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ（可溶性単量体ｈＧＩＴＲ、配列番号４５）または５０ｎＭ ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ（二量体カニクイザルＧＩＴＲ、配列番号４６）を、この表面上に５０ｕＬ／分の流速で２分間注入した。解離を２分間測定した。ＫＤおよびｔ１／２は、二重参照センサーグラムを１：１結合モデルに適合させることによって計算した。
表５：Ｂｉａｃｏｒｅ結合親和性：ＣＨＯｔ上清
Figure 2023506593000006
Figure 2023506593000007
 ＮＢ＝使用した条件下では結合は検出されなかった
ＩＣ：不確定データ
ＣＨＯｔ上清のＢｉａｃｏｒｅ結果は、少なくとも四つのＨＣバリアント（Ｎ１０１Ｄ、Ｎ１０１Ｅ、Ｎ１０１Ｓ、およびＮ１０１Ｔ）が、ＣｏｍｐＡｂ１と比較して単量体（ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ）および二量体（ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ）ＧＩＴＲとの類似の結合を維持したことを示唆した。表５を参照のこと。
特に、多くのバリアントは、親抗体によるＧＩＴＲ結合と比較してＧＩＴＲ結合を失った。ＣｏｍｐＡｂ１と比較してＧＩＴＲとの類似の結合を維持したＮ１０１バリアント候補のうち、四つをさらなる特徴解析のために選択した。これらのバリアントは、ＣＨＯ安定（ＣＨＯ）細胞株で生産され、その後精製された。
精製された抗体については、Ｂｉａｃｏｒｅ実験を以下のように行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００機器を使用して、抗体をＣＭ５抗ヒトＦｃ結合表面上で８ｕＬ／分の流速で３０秒間捕捉した。各抗体のおよそ１２０ＲＵを捕捉した。１０ｎＭ ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ（可溶性単量体ｈＧＩＴＲ、配列番号４５）または５ｎＭ ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ（二量体カニクイザルＧＩＴＲ、配列番号４６）を、この表面上に５０ｕＬ／分の流速で５分間注入した。解離を１０分間測定した。ＫＤおよびｔ１／２は、二重参照センサーグラムを１：１結合モデルに適合させることによって計算した。
ＣｏｍｐＡｂ１と比較した、単量体（ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ）および二量体（ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ）ＧＩＴＲに対する四つの精製されたＮ１０１バリアントのＫＤおよびｔ１／２を表６に示す。
表６：ＣＨＯ細胞によって産生されるバリアントのＢｉａｃｏｒｅ結合親和性
Figure 2023506593000008
実施例４．重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
表７は、ＣｏｍｐＡｂ１抗体の抗ＧＩＴＲ抗体バリアントの重鎖および軽鎖の可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を、表８に記載する。

表7: アミノ酸配列識別子
Figure 2023506593000009
表８：核酸配列識別子
Figure 2023506593000010
当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる。しかしいずれの場合でも、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）－これは、表７および８に示される数値識別子によって示されている－は変わらず同じであり、結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず同一または実質的に類似していると予想される。
表９は、選択された抗ＧＩＴＲ抗体に対する、全長重鎖（ＨＣ）および全長軽鎖（ＬＣ）の核酸およびアミノ酸配列識別子の例を提供する。
表９：例示的な抗ＧＩＴＲ抗体に対する全長重鎖配列および全長軽鎖配列の配列識別子
Figure 2023506593000011
Figure 2023506593000012
実施例５．抗ＧＩＴＲ抗体ＣｏｍｐＡｂ１のバリアントにおける切断の評価および定量化
上述のように、全長抗ＧＩＴＲ抗体ＣｏｍｐＡｂ１の短縮型バリアントが特定された。切断型の質量は、ＣｏｍｐＡｂ１重鎖のＣＤＲ３領域中の残基Ｎ１０１とＰ１０２との間の切断に対応していた。続いて、ＣｏｍｐＡｂ１のＮ１０１／Ｐ１０２切断部位のＮ１０１位置で単一アミノ酸置換を有する新しい抗体バリアントが作製された。これらの新しい抗体バリアントを解析して、それらの同一性を確認し、新しいバリアントが切断を示したかどうかを判定した。
変性ＳＥＣ（低温および軽度ｐＨで実行される）を使用して、バリアント切断を解析した。ＣｏｍｐＡｂ１およびｍＡｂ１を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、５μｇの各試料をＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（１．７μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍ）に注入した。試料注入前に、１００％の移動相Ａ（３０％アセトニトリル、０．１％ギ酸、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の０．１％トリフルオロ酢酸）で、カラムを平衡化した。カラム温度はオフであった。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを使用して、１００％の移動相Ａで、０．１０ｍＬ／分の流速で５分間、タンパク質を均一濃度で溶出した。
カラム加熱なしの変性ＳＥＣ－ＭＳによるインタクト抗体の分析では、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２において切断を示さなかった（表１０）。これらの結果は、バリアントが還元ペプチドマッピングおよびＬＣ－ＭＳによって分析されたときに確認された（データは示さず）。
表１０：ＣｏｍｐＡｂ１およびＮ１０１バリアントで測定された切断率。
Figure 2023506593000013
 ＮＡ：分析なし
実施例６：血清安定性解析においてＣｏｍｐＡｂ１のＮ１０１ＤおよびＮ１０１Ｅバリアントに切断は観察されなかった
ＣｏｍｐＡｂ１と、Ｂｉａｃｏｒｅを介したヒトＧＩＴＲタンパク質と結合する点でオリジナル候補と最も類似したバリアント候補、ｍＡｂ１（Ｎ１０１Ｄ）およびｍＡｂ２（Ｎ１０１Ｅ）（前の例を参照）を、ＩｇＧ欠乏ヒト血清およびマウス血清とＨＥＰＥＳ緩衝液中で、３７℃でインキュベートし、生理学的条件下での安定性を試験した。さらに、ＣｏｍｐＡｂ１、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２をマウス（１０ｍｇ／ｋｇ）に投与し、４時間後、１、２、４、および８日後に血清を採取した。抗体を、抗Ｆｃプルダウンにより親和性精製し、Ｌｙｓ－Ｃを使用して消化した。Ｌｙｓ－Ｃ消化およびＬＣ－ＭＳ法は、抗体変性のために低温のみを、Ｎ１０１Ｄバリアントの人工的な切断を防止するために低いカラム温度のみを使用した。血清インキュベーション後にＣｏｍｐＡｂ１分子において切断のレベルは増加したが、全時間経過にわたってｍＡｂ１またはｍＡｂ２では切断は検出されなかった（図３および図４）。同様に、切断は、マウスに投与されたＣｏｍｐＡｂ１において可変レベルで検出されたが、バリアントｍＡｂ１またはｍＡｂ２では検出されなかった。表１１を参照のこと。
表１１：ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のインビトロおよびインビボ安定性
Figure 2023506593000014
実施例７．細胞表面ＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体
フローサイトメトリーを使用して、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ細胞およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ細胞に結合するｍＡｂ１を評価した。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞を、ＧＩＴＲ結合のための陰性対照細胞株として使用した。細胞を９６ウェルＶ底プレート（２×１０５～４×１０５細胞／ウェル）に添加し、Ｆｃブロック溶液中でインキュベートし、続いて、最終濃度が１８ｐＭ～３００ｎＭの範囲の一次抗体（ｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照）および５μｇ／ｍＬの二次抗体（ＡＦ６４７抱合抗ヒトＩｇＧ）と共に氷上で連続インキュベーションした。次いで、製造業者の指示に従って、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＦｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎで染色した。細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘで固定し、ＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅを通して濾過した後、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳフローサイトメーターで取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてデータを分析した。ＥＣ５０（５０％活性での効果濃度）の決定については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて９点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式を使用して、測定された幾何学的ＭＦＩ値を分析した。結合倍率は、二次抗体のみを含有するウェルのＭＦＩに対する曲線上の最も高いＭＦＩの比率を取ることによって決定された。
ｍＡｂ１は、ｈＧＩＴＲ細胞またはＭｆＧＩＴＲ細胞のいずれかを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞に対して、ナノモル範囲のＥＣ５０値で濃度依存的に結合し、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞への結合は検出されなかった（図５）。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、試験した３つの細胞株のいずれにも結合を示さなかった。ｍＡｂ１およびＩｇＧ１アイソタイプ対照について、ＥＣ５０値（該当する場合）、最大ＭＦＩ（試験用量範囲内の最高平均ＭＦＩ）、およびバックグラウンド（二次抗体単独）を超える最大ＭＦＩとして計算された結合倍率が報告された。結果を表１２にまとめる。
表１２：ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への抗体結合
Figure 2023506593000015
 a 最大MFIは、試験された濃度範囲内の最も高い平均MFI値(18pM～300nM)であった。
b 結合倍率は、バックグラウンド（二次抗体単独）を超える最大MFIとして計算された。
h、ヒト、Mf、Macaca fascicularis（カニクイザル）、ND、濃度依存性の結合が観察されなかったため判定せず
要約すると、ｍＡｂ１は、ヒトまたはサルＧＩＴＲを発現するＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０標的細胞に対して、類似の効力（ＥＣ５０）と最大結合倍率で濃度依存性の結合を示した。
実施例８：活性化したヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞に結合する抗ＧＩＴＲ抗体
この実験では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞へのｍＡｂ１の結合を評価した。ＣＤ２５およびＣＤ６９を、それぞれヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞活性化の代替マーカーとして使用した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＳｅｐＭａｔｅ管（ヒトＰＢＭＣ用）または５０ｍＬの円錐管（カニクイザルＰＢＭＣ用）中のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳによる密度遠心分離を使用して、ヒトまたはカニクイザルの全血（４ドナーずつ）から単離し、赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液中でインキュベーションするために新しい円錐管に移した。次いで、ＰＢＭＣを洗浄し、ヒトまたは非ヒト霊長類用のＴ細胞活性化／増殖キットを使用して、Ｔ細胞の活性化および増殖のためにＴ７５培養フラスコに移した。４日後、ＭＡＣＳｉＭＡＧ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを使用して培養物から活性化ビーズを除去し、細胞を回収し、計数した。
フローサイトメトリーを使用して、活性化ＰＢＭＣ中のヒトまたはカニクイザルＴ細胞へのｍＡｂ１結合を評価した。細胞を９６ウェルＶ底プレート（３×１０５細胞／ウェル）に添加し、Ｆｃブロック／単球ブロック溶液中でインキュベートした後、フルオロフォア抱合抗体（抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、および抗ＣＤ２５［ヒトＴ細胞に対する活性化マーカー］または抗ＣＤ６９［カニクイザルＴ細胞に対する活性化マーカー］）、ＡＦ６４７抱合ｍＡｂ１またはＡＦ６４７抱合ＩｇＧ１アイソタイプ対照（８ｐＭ～２００ｎＭの範囲の最終濃度）、および（製造業者の指示に従って）ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＦｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ ＳｔａｉｎのＴ細胞表現型カクテルと氷上でインキュベートした。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０フローサイトメーターで取得する前に、細胞をＢＤ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅで固定し、ＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅを通して濾過した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてデータを分析した。ＥＣ５０判定については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた１２点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式を使用して、測定された幾何学的ＭＦＩ値を分析した。
ｍＡｂ１は、活性化したヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞に対する濃度依存性の結合を示した。ｍＡｂ１は、活性化していないヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞に対して、ＩｇＧ１アイソタイプ対照に匹敵する最小限の結合を示した（図６および図７）。ｍＡｂ１およびＩｇＧ１アイソタイプ対照結合の最大ＭＦＩ値（試験した最高濃度の２００ｎＭで検出）を表１３および表１４にまとめる。
表１３：活性化（ＣＤ２５＋）および非活性化（ＣＤ２５－）ヒト初代Ｔ細胞への抗ＧＩＴＲ抗体結合
Figure 2023506593000016
 a 最大MFIを、200nMの非飽和濃度（試験した最大濃度）で決定した。

表１４：活性化（ＣＤ６９＋）および非活性化（ＣＤ６９－）カニクイザル初代Ｔ細胞への結合
Figure 2023506593000017
Figure 2023506593000018
 a 最大MFIを、200nMの非飽和濃度（試験した最大濃度）で決定した。
実施例９．操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＦｃγＲ３ａを介したＮＦＡＴ活性化
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，４（３）：３１０－３１８，２０１２）は、ヒトまたはカニクイザルのＦｃγＲ３ａ（ＡＤＣＣを媒介し、主にＮＫ細胞上で発現されるＦｃ受容体）を介して活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化を媒介するｍＡｂ１の能力を評価するために開発された。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａまたはＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａエフェクター細胞、およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲまたはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ標的細胞が、これらのアッセイに使用された。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞を対照標的細胞として評価した。
ｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照（９１６ｆＭ～６０ｎＭの範囲の最終濃度）または抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１（４５．８ｆＭ～３ｎＭの範囲の最終濃度）を、Ｊｕｒｋａｔ完全培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２９２μｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミンで補充されたＲＰＭＩ）中で、標的細胞（５×１０４細胞／ウェル）の存在下で、エフェクター細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）と二重にインキュベートした。抗体を含有しないウェルを、バックグラウンドシグナル伝達の対照として含めた。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で５時間インキュベートした。次いで、プレートを室温に１０分間平衡化し、続いてＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質をウェルに３分間添加した。ルシフェラーゼ活性は、発光信号として捕捉され、ＥＮＶＩＳＩＯＮプレートリーダーを使用して相対光単位（ＲＬＵ）として表された。ＥＣ５０判定については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた９点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式を使用してＲＬＵ値を分析した。活性の変化倍率は、抗体を含有しないウェルのＲＬＵに対する曲線上の最も高いＲＬＵの比率を取ることによって決定された。
結果を表１５に要約する。ｍＡｂ１は、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲまたはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲの存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａおよびＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａにおいて、ＮＦＡＴシグナル伝達の濃度依存的増加を、それぞれｎＭ以下のＥＣ５０値で媒介した（図８）。陽性アッセイ対照である抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１は、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０、およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲまたはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲのいずれかの存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａおよびＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａにおいて、ＮＦＡＴシグナル伝達の濃度依存的増加を、それぞれｎＭ以下のＥＣ５０値で媒介した。ベースラインＮＦＡＴ活性化の増加は、標的細胞の非存在下（すなわち、エフェクター細胞に加えて細胞のない培地）でのｍＡｂ１または抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１のいずれでも、または試験された任意の条件におけるＩｇＧ１アイソタイプ対照でも観察されなかった。

表１５：Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａおよびＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａエフェクター細胞におけるｍＡｂ１を介したＮＦＡＴ活性化の概要
Figure 2023506593000019
 a 最大RLUを、試験された濃度範囲内の最高平均RLU値として決定した(mAb1およびIgG1アイソタイプ対照については916fM～60nM、抗CD20 IgG1については45.8fM～3nM)。
b活性の変化倍率は、バックグラウンド（抗体なし）を超える最大RLUとして計算された。
h、ヒト;Mf、Macaca fascicularis（カニクイザル);ND、濃度依存性ルシフェラーゼ活性が観察されなかったため、判定せず
実施例１０：ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＡＤＣＣの抗ＧＩＴＲ抗体媒介性
ＡＤＣＣアッセイを実施して、ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲを発現するＴ細胞に対するＡＤＣＣを誘導するｍＡｂ１の能力を評価した。第一の実験では、標的細胞にはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ細胞が含まれ、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞は対照標的細胞株として含まれた。第二の実験では、標的細胞には、刺激／増殖Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）およびヒトＰＢＭＣ（同じ３人のドナー）からのＣＤ８＋ Ｔ細胞が含まれた。白血球濃縮全血から単離されたヒトＮＫ細胞（操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いたアッセイについては２人のドナーから、初代Ｔ細胞を用いたアッセイについては２人のドナーから）を、ＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＩｇＧ１アイソタイプ対照をｍＡｂ１と並列に評価した。抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１または抗ＣＤ３ ＩｇＧ１を、ＮＫ細胞の存在下で、操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびヒト初代Ｔ細胞それぞれに対してＡＤＣＣを誘導するための陽性対照として使用した。
ｍＡｂ１は、ヒト初代ＮＫ細胞（エフェクター細胞）の存在下、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲおよびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（標的細胞）に対して濃度依存性ＡＤＣＣを媒介した。細胞傷害性のＥＣ５０値は、ｎＭ以下の範囲であった。対照的に、ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、９．５ｆＭ～１０ｎＭの範囲の濃度で、任意の標的細胞株に対してＡＤＣＣを媒介しなかった。抗体処理を行わずにＮＫ細胞を添加すると、標的細胞株に対する非特異的な細胞傷害性の割合が低くなった。
陽性対照抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１を使用して、同じ標的細胞株に対してＡＤＣＣを誘導する能力についてＮＫ細胞を評価した。抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１は、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ、およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ標的細胞に対して、ｎＭ以下の細胞傷害性のＥＣ５０値で濃度依存的にＡＤＣＣを媒介した。２人のヒトＮＫドナーの代表的なデータを図９に示し、表１６に要約する。
表１６：操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対する抗体媒介性ＡＤＣＣ
Figure 2023506593000020
 a最大細胞傷害性%を、試験した濃度範囲内(9.5fM～10nM)の最高平均細胞傷害性の割合値として決定した。h、ヒト; Mf、Macaca fascicularis（カニクイザル); ND、濃度依存性の細胞傷害性は観察されなかったため、判定せず
実施例１１：ヒト初代Ｔ細胞に対する抗ＧＩＴＲ抗体のＡＤＣＣへの媒介
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ密度勾配媒体およびＳｅｐＭａｔｅ管を使用した密度遠心分離を介して、ヒト全血（３ドナー）から、製造業者の推奨プロトコルに従って単離した。その後、赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液を単離ＰＢＭＣに添加し、望ましくないＲＢＣを除去した。次いで、ＰＢＭＣを洗浄し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、製造業者の指示に従ってＣＤ８マイクロビーズを使用して単離した。残りのＣＤ８陰性細胞をペレット化し、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って単離した。
ＣＤ８＋およびＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の単離（すなわち、Ｔｒｅｇ）を、フローサイトメトリーを使用して確認した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して、増殖用にＩＬ－２で補充された培地含む、Ｔ７５フラスコに播種した（１ビーズ：１細胞）。Ｔｒｅｇを、製造業者の指示に従って、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を使用して、増殖用にＩＬ－２およびラパマイシンで補充された培地を含む、Ｔ７５フラスコに播種した（４ビーズ：１細胞）。ビーズは、５日間の培養後、除去され、細胞を、ＩＬ－２またはラパマイシンを有さない培地中で２４時間休ませて、ＡＤＣＣアッセイで使用した。
細胞傷害性アッセイの前に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＴｒｅｇを実施例８に記載されるように染色し、飽和条件下で細胞表面に結合した抗体分子の数として定義される抗体結合能（ＡＢＣ）を、フローサイトメトリーによって評価した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のＧＩＴＲ抗体のＡＢＣを、製造業者の指示に従って、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＦ６４７ ＭＥＳＦ（可溶性蛍光色素の分子）ビーズキットを使用して決定した。
標的細胞（５×１０３細胞／ウェル）を、不透明な白色９６ウェル平底プレートに三回に分けて加え、続いてｍＡｂ１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、または抗ＣＤ２０（操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞用）もしくは抗ＣＤ３（ヒト初代Ｔ細胞用）ＩｇＧ１（操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の最終濃度は９．５ｆＭ～１０ｎＭ、ヒト初代Ｔ細胞の最終濃度は１６９ｆＭ～１０ｎＭ）を添加し、次いでヒトＮＫ細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）をアッセイ培地（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２９２μｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ）に添加した。抗体を除くすべての成分を含有する対照試料を各実験に組み込み、アッセイのバックグラウンドシグナルを決定した（すなわち、ＮＫ細胞の存在下での標的細胞の非特異的溶解）。自然溶解を評価するために、未処理の標的細胞のみ（標的細胞）およびエフェクター細胞のみ（エフェクター細胞）を別個のウェル中でインキュベートした。
プレートを３７℃、５％のＣＯ２で３．５時間インキュベートした。次いで、プレートを１０分間室温に平衡化し、その後、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ試薬を振盪しながら１５分間ウェルに加えた。発光シグナルを、ＥＮＶＩＳＩＯＮプレートリーダーを使用して細胞傷害性の読み出しとして測定した。
ｍＡｂ１は、ヒト初代ＮＫ細胞（エフェクター細胞）の存在下で、試験した３人中３人のドナーのヒト初代Ｔ細胞（標的細胞）に対して、ｎＭ以下の範囲の細胞傷害性のＥＣ５０値で濃度依存的にＡＤＣＣを媒介した。６つの試験条件（エフェクター細胞ドナー２人×標的細胞ドナー３人）のうち４つの条件において、ｍＡｂ１を介した細胞傷害性は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇに対して有意に大きかった。図１０および 表１７を参照のこと。
対照的に、ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、初代Ｔ細胞ドナーのいずれに対してもＡＤＣＣを媒介しなかった。抗体処理を行わずにＮＫ細胞を添加すると、初代Ｔ細胞に対する非特異的な細胞傷害性の割合が低くなった。
ＮＫ細胞はまた、陽性対照抗ＣＤ３ ＩｇＧ１と共に同じＮＫおよびＴ細胞ドナーを使用するアッセイにおいて、ＡＤＣＣを誘導する能力についても評価された。抗ＣＤ３ ＩｇＧ１は、初代Ｔ細胞に対して、ｎＭ以下の細胞傷害性のＥＣ５０値で濃度依存的にＡＤＣＣを媒介した。３人のヒト初代Ｔ細胞ドナーと共に試験された２人のヒト初代ＮＫドナーの代表的なデータを図１０に示し、表１７に要約する。
表１７：ヒト初代Ｔ細胞に対する抗体媒介性ＡＤＣＣ
Figure 2023506593000021
 a 最大細胞傷害性%を、試験した濃度範囲内(169fM～10nM)の最高平均細胞傷害性の割合値として決定した。
b mAb1は、ドナー0400NからのCD8＋T細胞と比較してTregに対して有意に大きなADCCを媒介し(p<0.0001)、ドナー0200RからのTregと比較してCD8＋T細胞に対して有意に大きなADCCを媒介した(p<0.0001)。
c 抗CD3 IgG1は、ドナー5100XからのTregと比較して、CD8＋ T細胞に対して有意に大きなADCCを媒介した(p<0.0001)。
d mAb1は、3人ドナーのすべてからのCD8＋ T細胞と比較して、Tregに対して有意に大きなADCCを媒介した(p<0.0001)。
各NK細胞ドナーに対するすべての試験条件にわたるADCCの統計的有意性は、テューキーの多重比較事後検定を用いた二元配置ANOVAによって決定された(α=0.05)。
ABC、抗体結合能（フローサイトメトリーにより測定された蛍光強度に基づいて計算された、細胞当たりの結合抗体);ND、濃度依存性細胞傷害性が観察されなかったため判定せず
実施例１２：ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＡＤＣＰの抗ＧＩＴＲ抗体媒介性
ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲを発現するＴ細胞のＡＤＣＰを誘導するｍＡｂ１の能力を評価するために、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞食作用）アッセイを実施した。標的細胞は、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ細胞を含み、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞は、対照標的細胞株として含まれた。顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の存在下でＣＤ１４＋単球から分化した食細胞が、ＡＤＣＰアッセイにおいてエフェクター細胞として使用された。ＩｇＧ１アイソタイプ対照をｍＡｂ１と並列に評価した。抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１を、操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＡＤＣＰを誘導するための陽性対照として使用した。
Ｌｏｎｚａから入手した凍結ＣＤ１４＋細胞を解凍し、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを補充した、細胞培養培地（１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２９２μｇ／ｍＬのＬ－グルタミンで補充されたＲＰＭＩ、１％ヒトＡＢ血清、ＮａＰｙｒ（ピルビン酸ナトリウム）、ＨＥＰＥＳ、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、および０．０１ｍＭのベータ－メルカプトエタノール）に再懸濁し、５×１０４細胞／ウェルで透明底のコラーゲンコート９６ウェルプレート黒に播種し、１３日間にわたって食細胞への分化を行い、６日目および１２日目に新鮮なＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。
標的細胞および単球由来食細胞をそれぞれ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）染料またはＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤色染料のいずれかと共に、３７℃、５％ ＣＯ２で１５分間インキュベートし、ＡＤＣＰアッセイ前の標識を行った。
標的細胞（５×１０５細胞／ウェル）を、９６ウェルのＵ底プレートに二重に添加し、続いて氷上で少なくとも１５分間、アッセイ培地（１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２９２μｇ／ｍＬのＬ－グルタミンで補充されたＲＰＭＩ）中のｍＡｂ１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、または抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１（３８１ｆＭ～１００ｎＭの範囲の最終濃度）を添加した。抗体を有しない標的細胞を、バックグラウンド食作用の対照として含めた。次いで、滴定した抗体を含む、または含まない標的細胞の混合物を、付着した遠赤色標識の食細胞を含有するプレートに移し、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で１～２時間インキュベートした。
インキュベーション後、付着していない細胞を含有する培地をウェルから除去し、ウェルをＰＢＳですすいだ。ＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドの溶液をウェルに加え、細胞を２０分間固定した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、プレートを分析まで４℃で保存した。
食作用は、４８８ｎｍ（ＣＦＳＥ標識標的細胞）および６４７ｎｍ（遠赤色標識食細胞）発光チャネルの両方で画像を取得するために、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアを使用して、Ｏｐｅｒａ ＰｈｏｅｎｉｘＨｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでの蛍光イメージングによって分析された。画像解析をＣｏｌｕｍｂｕｓソフトウェアで行い、６４７ｎｍの発光チャネルで画像分割を実施して、食細胞集団を選択し、各細胞内の４８８ｎｍの蛍光強度（ＣＦＳＥ標識された標的細胞からの）を相対蛍光単位（ＲＦＵ）として計算することによって、食作用を定量化した。ＥＣ５０測定では、操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはヒト初代Ｔ細胞を用いたアッセイ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、それぞれ１０点または９点の応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式を使用してＲＦＵ値を分析した。活性における変化倍率は、抗体を含有しないウェルのＲＦＵに対する曲線上の最も高いＲＦＵの比率を取ることによって決定された。
ｍＡｂ１は、ヒト初代単球由来食細胞（エフェクター細胞）の存在下でのＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲおよびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ（標的細胞）の濃度依存性ＡＤＣＰを媒介した。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲの食作用のＥＣ５０値は、４パラメータロジスティック回帰が単一の値に収束しなかったため、計算できなかった。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲの食作用に対するＥＣ５０値は、ｎＭ以下の範囲であった。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ細胞およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ細胞のｍＡｂ１を介した食作用の最大レベルは同等であり、バックグラウンド（抗体なし）よりも、それぞれ５．９２倍および６．９８倍の活性の変化があった。対照的に、ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、いずれの標的細胞株のＡＤＣＰも媒介しなかった。１人のヒト初代単球由来食細胞ドナーのデータを図１１に示し、表１８に要約する。
陽性対照抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１を使用して、同じ標的細胞株のＡＤＣＰを誘導する能力についてヒト初代単球由来食細胞を評価した。抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１は、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ、およびＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ標的細胞のＡＤＣＰを、ｎＭ以下の食作用のＥＣ５０値で濃度依存的に媒介した。
表１８：操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の抗体媒介性ＡＤＣＰ
Figure 2023506593000022
 a 最大RFUを、試験した濃度範囲内(381fM～100nM)の最高平均RFU値として決定した。
b活性の変化倍率は、バックグラウンド（抗体なし）を超える最大RFUとして計算された。
h:ヒト、Mf:Macaca fascicularis（カニクイザル）、NC:データセットに対して固有の適合が見つからなかったため計算せず、ND:濃度依存性の食作用が観察されなかったため判定せず
実施例１３：抗ＣＤ３を介した初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果
刺激ＣＤ３抗体によって媒介される初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖に対するｍＡｂ１の効果を、ＨＥＫ２９３／ＦｃγＲ２ｂ補助細胞の存在下で評価した。６人のドナーからのヒト初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞を評価した。
ＨＥＫ２９３／ＦｃγＲ２ｂ細胞を、５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ中で、３７℃、５％ ＣＯ２で３０分間インキュベートし、９６ウェルの平底組織培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで３７℃、５％ ＣＯ２で一晩播種した。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ勾配を使用した密度勾配遠心分離を使用して、６人のドナーからのＰＢＭＣから単離され、続いて、製造業者のプロトコルに従ってヒトＣＤ４５ＲＯマイクロビーズを使用してメモリーＴ細胞を枯渇させた。ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を、アッセイ培地（５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２９２μｇ／ｍＬのＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ）中に再懸濁させた。
アッセイの日、播種したＨＥＫ２９３／ＦｃγＲ２ｂ細胞を、１．２μｇ／ｍＬのＯＫＴ３で、室温で２０分間プレインキュベートし、続いて、５ｘ１０５ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞／ウェル、およびｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照のいずれかを、３２ｆＭ～１３３ｎＭの範囲の最終濃度で添加した。
プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２で４日間インキュベートし、０．５ｕＣｉトリチウム化チミジンを細胞に添加し、プレートをさらに１６時間インキュベートした。チミジン、およびそれゆえトリチウムは、より高い量で***細胞に組み込まれる。
インキュベーション後、細胞を９６ウェルのＵｎｉＦｉｌｔｅｒプレートに採取し、３５μＬのシンチレーション流体を各ウェルに添加した。トリチウム取り込みを、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ＆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ装置を使用して、一分当たりのカウント数（ＣＰＭ）として測定した。すべての段階希釈物を、二通りで試験した。
抗体のＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、１２点用量応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式から決定した。最大増殖は、試験された濃度範囲内で検出された平均最大ＣＰＭとして決定された。活性における変化倍率は、抗体を含有しないウェルのＣＰＭに対する曲線上の最も高いＣＰＭの比率を取ることによって決定された。
ｍＡｂ１は、濃度依存的に抗ＣＤ３を介したＴ細胞増殖を、ｎＭ以下のＥＣ５０値で増強し（図１２）、最大Ｔ細胞増殖（トリチウム崩壊からのＣＰＭとして測定）のバックグラウンドを超える２．３～３．１倍の増加と関連していた。対照的に、ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、Ｔ細胞増殖の濃度依存的な増強を促進しなかった。結果を表１９にまとめる。
表１９：抗ＣＤ３を介した初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖に対する抗ＧＩＴＲ抗体効果
Figure 2023506593000023
 a 最大CPMを、試験した濃度範囲内(32fM～133nM)の最高平均CPM値として決定した。
b活性の変化倍率は、バックグラウンド（抗体なし）を超える最大CPMとして計算された。
NC、4パラメータロジスティック回帰が単一の値に収束しなかったため計算せず、ND、濃度依存的な増殖が観察されなかったため判定せず
実施例１４：ブロッキングＥＬＩＳＡにおけるＧＩＴＲ－ＬへのＧＩＴＲ結合に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ベースの結合アッセイを使用して、そのリガンド、ｈＧＩＴＲ－Ｌへの組換えｈＧＩＴＲの結合を決定した。ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬの濃度の組換えｈＧＩＴＲ－Ｌを、マイクロタイタープレートに受動的に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。次いで、ある範囲の濃度（３．４ｐＭ～２００ｎＭ）の単量体組換えヒトＧＩＴＲ細胞外ドメインタンパク質、ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨを、プレートに二重添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで４回洗浄した。プレートに結合したｈＧＩＴＲ．ｍｍＨを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ヤギ抗ｃＭｙｃ抗体で０．３３μｇ／ｍｌで検出し、製造業者の推奨手順に従って、比色ＨＲＰ基質３－３’，５－５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して可視化した。４５０ｎｍでの吸光度データ（ＯＤ４５０）を、組換えｈＧＩＴＲ．ｍｍＨの濃度の関数としてプロットした。バックグラウンドシグナルを決定するために緩衝液のみの試料が含まれていたが、そのＯＤ ４５０は応答曲線にプロットされなかった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、１１点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式を使用して、結合データを解析し、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値は、最大結合の５０％が観察されたｈＧＩＴＲ．ｍｍＨの濃度として定義される。ＥＣ５０値に近い濃度（線形範囲内）を、ブロッキングアッセイの固定ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ濃度として選択した。
ｍＡｂ１が組換えヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ）のｈＧＩＴＲ－Ｌへの結合を遮断する能力を決定するために、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイが開発された。固定濃度の組換えｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ（１．５ｎＭ）を、ｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照、（５１ｐＭ～３μｍ）で１時間、プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、上述のようにＧＩＴＲ－Ｌで予めコーティングしたマイクロタイタープレートの複製ウェルに移した。プレートを室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで４回洗浄し、プレート結合ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨを上述のように検出した。ＯＤ４５０での吸光度データを、抗体濃度の関数としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、１１点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式を使用して、結合データを解析し、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値は、プレートコーティングされたｈＧＩＴＲ－ＬへのｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ結合の５０％を遮断するために必要な抗体の濃度として定義される。
固定化ヒトＧＩＴＲ－Ｌ（６Ｈｉｓ．ＧＣＮ４．Ｇ４Ｓｘ３．ｈＧＩＴＲ－Ｌ）への単量体組換えヒトＧＩＴＲ細胞外ドメインタンパク質（ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ）結合に対する、ｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の効果を、図１３に示す。抗体のＩＣ５０値および最大阻害率を表２０に要約する。
表２０：固定化ヒトＧＩＴＲ－ＬへのｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ結合の遮断
Figure 2023506593000024
 最大遮断%=抗体の最大濃度での遮断率
ND、濃度依存的な結合の阻害が観察されなかったため、判定せず
組換えｈＧＩＴＲ．ｍｍＨは、固定化ヒトＧＩＴＲ－Ｌに、２．０５ｎＭのＥＣ５０値で濃度依存的に結合した。ＥＣ５０値に近い（直線範囲内）１．５ｎＭの濃度を、ブロッキングアッセイの固定組換えｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ濃度として選択した。
ｍＡｂ１は、ｈＧＩＴＲ－Ｌに結合するｈＧＩＴＲ．ｍｍＨを濃度依存的に遮断し、最大阻害は９８％、ＩＣ５０値は６．６６ｎＭであった。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、試験した濃度のいずれにおいても、ヒトＧＩＴＲ－ＬへのｈＧＩＴＲ．ｍｍＨの結合を阻害しなかった。
実施例１５：ＣＤＣに対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果
血清補体の存在下で、ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲを発現する操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＣＤＣを媒介するｍＡｂ１の能力を、細胞傷害性アッセイで評価した。最大細胞傷害性の割合およびＥＣ５０値が報告された。
ＣＤＣアッセイを実施して、ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲを発現するＴ細胞に対するＣＤＣを誘導するｍＡｂ１の能力を評価した。標的細胞は、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ細胞を含み、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０細胞は、対照標的細胞株として含まれた。ＩｇＧ１アイソタイプ対照をｍＡｂ１と並列に評価した。抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１を、血清補体因子の存在下で操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対してＣＤＣを誘導するための陽性対照として使用した。
標的細胞（５×１０３細胞／ウェル）を、不透明な白色９６ウェル平底プレートに三回に分けて添加し、続いてｍＡｂ１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、または抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１（４７７ｆＭ～５００ｎＭの範囲の最終濃度）を添加し、次いで、血清（５％の最終容量）をアッセイ培地（１％ＢＳＡ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを、２９２μｇ／ｍＬのＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ）に添加し、アッセイ培地のみを並行して添加し、補体因子の非存在下での溶解を評価した。抗体を除くすべての成分を含有する緩衝液対照試料を各実験に組み込み、アッセイのバックグラウンドシグナルを決定した（すなわち、標的細胞の非特異的溶解）。
プレートを３７℃、５％のＣＯ２で３．５時間インキュベートした。次いで、プレートを３０分間室温に平衡化し、その後、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ試薬を振盪しながら１５分間ウェルに加えた。発光シグナルを、ＥＮＶＩＳＩＯＮプレートリーダーを使用して細胞傷害性の読み出しとして測定した。
細胞傷害性応答を以下のように計算した：
Figure 2023506593000025
 ａＳＢＳ、自然バックグラウンドシグナル
ＥＣ５０判定については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて１２点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式を使用して、細胞傷害性の割合を分析した。
ｍＡｂ１は、５％のＮＨＳの存在下で、４７７ｆＭ～５００ｎＭの範囲の濃度で、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ｈＧＩＴＲ、またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＤ２０／ＭｆＧＩＴＲ標的細胞に対してＣＤＣを媒介しなかった。同様に、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートされた標的細胞については、ＣＤＣは観察されなかった（図１４）。
アッセイで使用されるＮＨＳは、陽性対照である抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１を使用して、ＣＤＣを誘導する能力について、同じ標的細胞株で評価された。ＮＨＳの存在下で、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１は、３つの標的細胞株すべてに対して、濃度依存的にＣＤＣを媒介した。ＮＨＳの非存在下で、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１は、試験された標的細胞株のいずれに対しても溶解を媒介しなかった。
実施例１６：Ｃ１ｑに結合することができる免疫複合体を形成する抗ＧＩＴＲ抗体の能力
Ｃ１ｑに結合できる免疫複合体を形成するｍＡｂ１の能力は、単量体（ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ）または二量体（ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ）形態の組換え可溶性ＧＩＴＲ細胞外ドメインタンパク質およびＭｉｃｒｏＶｕｅ ＣＩＣ－Ｃ１ｑ ＥＩＡキットを使用して評価された。陽性対照として、熱凝集ガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）のＣ１ｑへの結合も評価した。
３０ｎＭでのｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照を、１：１モル比でｈＧＩＴＲ．ｍｍＨまたはｈＧＩＴＲ．ｍＦｃのいずれかでインキュベートした。３０ｎＭ ｍＡｂ１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ、またはｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ単独を含有する対照も評価した。試料を、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で、３７℃で３０分間インキュベートした。各試料を三回に分けて評価した。
複合体のＣ１ｑへの結合を調べるために、Ｃ１ｑタンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで、試料をキットアッセイ緩衝液に５０倍に希釈し、室温で６０分間インキュベートした。ウェルを洗浄して非結合タンパク質を除去し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＭｉｃｒｏＶｕｅ ＣＩＣ－Ｃ１ｑ ＥＩＡキット）を各ウェルに加え、Ｃ１ｑ結合免疫複合体を検出した。非結合ＨＲＰコンジュゲートを洗浄した後、酵素基質を添加することによって結合複合体を検出した。吸光度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶＩＣＴＯＲ Ｘ５ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して４０５ｎｍで読み取った。
ＣＩＣ－Ｃ１ｑアッセイ標準であるＨＡＧＧを使用して、１ｍＬ当たり０、１５、および３８ ＨＡＧＧμｇ相当の吸光度値に基づいて線形参照曲線を作成した（μｇ Ｅｑ／ｍＬ）。各試験試料のμｇ Ｅｑ／ｍＬ 濃度は、この標準曲線を参照することによって決定された。高および低ＨＡＧＧ陽性対照も実施した。高ＨＡＧＧ対照は、アッセイにおいて１１～２６μｇのＥｑ／ｍＬの範囲をもたらすと予想され、低ＨＡＧＧ対照は、４μｇのＥｑ／ｍＬ未満であると予想される。キットの製造業者は、４μｇ Ｅｑ／ｍＬ未満の値を、Ｃ１ｑ結合ＣＩＣの有意なレベルを示す陰性と定義している。
ｍＡｂ１、およびｈＧＩＴＲ．ｍｍＨまたはｈＧＩＴＲ．ｍＦｃのいずれかを含有する試料では、Ｃ１ｑ結合は観察されなかった（図１５）。同様に、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、およびｈＧＩＴＲ．ｍｍＨまたはｈＧＩＴＲ．ｍＦｃのいずれかを含有する試料では、Ｃ１ｑ結合は観察されなかった。ｍＡｂ１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、ｈＧＩＴＲ．ｍｍＨ、またはｈＧＩＴＲ．ｍＦｃを単独で含有する試料では、Ｃ１ｑ結合は観察されなかった。高および低ＨＡＧＧ陽性対照を並列で分析し、各試料のＣ１ｑ結合を、予想されるそれぞれの範囲内で観察した。
実施例１７：操作されたＲＢＬ－２Ｈ３細胞で刺激されたヒト初代Ｔ細胞からのＩＬ－２放出に対する、セミプリマブと組み合わせた抗ＧＩＴＲ抗体の効果
この例では、２人のドナーからのヒト初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞からの抗ＣＤ３刺激によるＩＬ－２放出に対するｍＡｂ１のアゴニスト効果を調べた。ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、２人のドナーからのＰＢＭＣから単離した。一人のドナーについては、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ勾配を用いた密度勾配遠心分離を使用して、末梢血からＰＢＭＣを単離した。もう一人のドナーについては、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＥａｓｙＳｅｐ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコルに従って、健康なドナーの末梢血からＰＢＭＣを単離した。両方のドナーから単離されたＰＢＭＣを、１０％のＤＭＳＯを含有するＦＢＳ中で別々に凍結した。
ＣＤ３＋ Ｔ細胞を単離にするために、ＰＢＭＣの凍結バイアルを３７℃の水浴中で解凍し、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼを含有する刺激培地（１０％のＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、および０．０１ｍＭのＢＭＥで補充されたＸ－ＶＩＶＯ １５細胞培養培地）で希釈した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＥａｓｙＳｅｐ緩衝液中に再懸濁し、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥａｓｙＳｅｐ Ｔ細胞単離キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って単離した。
ＣＤ３＋ Ｔ細胞を刺激培地に再懸濁し、１×１０５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルの丸底プレートに播種した。ＲＢＬ－２Ｈ３／αＣＤ３またはＲＢＬ－２Ｈ３／αＣＤ３／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、１０×１０６細胞／ｍＬの濃度で一次刺激培地中の１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで処理した。３７℃、５％ ＣＯ２で１時間インキュベーションした後、マイトマイシンＣ処理細胞を、２％のＦＢＳを含有するＤ‐ＰＢＳで３回洗浄し、Ｔ細胞を含有するウェルに最終濃度５×１０４細胞／ウェルで添加した。その後、３ｐＭ～２００ｎＭの範囲の最終濃度でのｍＡｂ１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照、および２０ｎＭの固定濃度でのセミプリマブまたはＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照の抗体組み合わせをウェルに加えた。１０点希釈の最終点は、滴定された抗体を含まなかった。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で３日間インキュベートした後、遠心分離して細胞をペレット化した。ＩＬ－２放出については、製造業者のプロトコルに従って、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからのヒトＩＬ－２キットを使用して、５μＬの上清を試験した。ＩＬ－２測定値を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのマルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ上で取得した。すべての段階希釈物を、三通りで試験した。
抗体のＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、１０点用量応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式から決定した。最大ＩＬ－２放出は、試験された濃度範囲内で検出された平均最大応答として決定された。
ＲＢＬ－２Ｈ３／ａＣＤ３標的細胞上にＰＤ－Ｌ１が存在しない場合、ｍＡｂ１は、セミプリマブの固定濃度とは関係なく、用量依存的にＩＬ－２放出を増加させた。両方のＴ細胞ドナーは、セミプリマブとは関係なく、類似したＥＣ５０および最大ＩＬ－２値を示した（図１６）。
ＲＢＬ－２Ｈ３／αＣＤ３細胞上にＰＤ－Ｌ１が存在する場合、両方のＴ細胞ドナーについて、ＰＤ－Ｌ１を欠く標的細胞と比較して、ベースラインのＩＬ－２レベルが低下した。しかし、固定濃度のセミプリマブの添加は、ベースラインのＩＬ－２値を増加させた。ｍＡｂ１は、セミプリマブとは無関係に、ＩＬ－２の用量依存的な増加をもたらし、セミプリマブの添加は、両方のＴ細胞ドナーについて、最大ＩＬ－２レベルをさらに高めた（図１６）。
結果を表２１にまとめる。
表２１：抗ＣＤ３刺激初代Ｔ細胞からのＩＬ－２放出に対する、セミプリマブと組み合わせたｍＡｂ１の効果の概要
Figure 2023506593000026
Figure 2023506593000027
 a 最大IL-2濃度は、試験された抗体濃度範囲(76fM～200nM)内で記録された最高平均IL-2濃度値である。
b セミプリマブまたはIgG4Pアイソタイプ対照を、20nMの固定濃度で試験した。
NC、4パラメータロジスティック回帰が単一の値に収束しなかったため計算せず、ND、濃度依存的なIL-2放出が観察されなかったため判定せず
概要
上記の実施例は、ｍＡｂ１が、Ｔ細胞の細胞表面上に発現するヒトおよびカニクイザルのＧＩＴＲに結合し、代理ＡＤＣＣレポーターアッセイにおいてＦｃγ受容体を介したＮＦＡＴ活性化を増強できることを実証した。したがって、ｍＡｂ１は、操作されたＴ細胞のＡＤＣＰを誘導し、Ｔｒｅｇ対ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して優先的なＡＤＣＣを媒介した。一方で、ｍＡｂ１は、操作されたＧＩＴＲ発現Ｔ細胞のＣＤＣを媒介することも、Ｃ１ｑに結合できる免疫複合体を形成することもできなかった。ｍＡｂ１はまた、ヒトＧＩＴＲのヒトＧＩＴＲ－Ｌへの結合を遮断した。ｍＡｂ１は、セミプリマブとは関係なく、ＩＬ－２の用量依存的な増加をもたらし、セミプリマブの添加は最大ＩＬ－２レベルをさらに増加させた。
実施例１８：抗ＧＩＴＲ抗体は腫瘍内Ｔ制御性細胞を枯渇させ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞／Ｔ制御性細胞比を増加させる
この実験では、親抗ＧＩＴＲ抗体であるＣｏｍｐＡｂ１、および関連するバリアントであるｍＡｂ１およびｍＡｂ２の、腫瘍内Ｔ制御性細胞を枯渇させる能力を評価した。１２週齢のメスＧＩＴＲ／ＧＩＴＲ－Ｌヒト化マウスに、ＭＣ３８マウス結腸腫瘍細胞（３．０×１０５細胞／マウス）を皮下チャレンジした。ＣｏｍｐＡｂ１、ｍＡｂ１、またはｍＡｂ２を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を介して６日目に投与した。１１日目にマウスを安楽死させ、ＦＡＣＳ分析のために腫瘍組織を採取した。ＦＡＣＳ試料は、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０によって取得され、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
データを図１７に示す。全体として、抗ＧＩＴＲ抗体による単回投与抗体治療は、腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞の有意な枯渇を媒介し、ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔ－ｒｅｇ比を増加させた。ＣｏｍｐＡｂ１およびＮ１０１ＤバリアントであるｍＡｂ１は、Ｎ１０１ＥバリアントであるｍＡｂ２と比較して、より一貫してＴ－ｒｅｇを枯渇させ、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を増加させた。
実施例１９：マウス大腸癌腫瘍を有するＧＩＴＲ／ＧＩＴＲ－Ｌ－ヒト化マウスにおけるｍＡｂ１単独の抗腫瘍効果、およびＧＩＴＲ／ＧＩＴＲ－Ｌ／ＰＤ－１－ヒト化マウスにおけるセミプリマブと組み合わせたｍＡｂ１の抗腫瘍効果
９～１４週齢のメスＧＩＴＲ／ＧＩＴＲ－Ｌ／ＰＤ－１－ヒト化マウスの右脇腹に、ＭＣ３８結腸直腸癌細胞（１００μＬ ＰＢＳ中３×１０５細胞）を、０日目に皮下移植した。移植の６日後（６日目）、腫瘍が平均４３ｍｍ３になった時、マウスを５つの群に無作為に分け、１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１アイソタイプ対照＋１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照（ｎ＝７）、１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１アイソタイプ対照＋１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブ（ｎ＝７）、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１＋１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブ（ｎ＝７）、１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１＋１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブ（ｎ＝６）、または０．１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１＋１ｍｇ／ｋｇのセミリプリマブ（ｎ＝７）の初回用量を投与した。すべてのマウスは、１３日目に追加投与を受け、合計で２回投与を受けた。マウスを、７、１２、１４、および２０日目に採血し、血清中の抗体濃度を監視した。腫瘍増殖は、５、１０、１３、１７、２０、２６、２８、３１、３４、３８、４１、４５、４８、５２、６０、６８、および７５日目の腫瘍体積のキャリパー測定によって監視された。腫瘍量により早期に安楽死させない限り、すべてのマウスを７５日目まで監視した。
アイソタイプ対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１アイソタイプ対照と組み合わせた１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照と）を投与されたマウスと比較して、０．１、１、または１０ｍｇ／ｋｇのいずれかのｍＡｂ１と組み合わせて１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブを投与されたマウスは、腫瘍増殖の統計的に有意な減少が観察された（図１８）。１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブを１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１（０．１または１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１ではない）と組み合わせて投与したマウスでは、セミプリマブ単独（１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１アイソタイプ対照と組み合わせた１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブ）を投与したマウスと比較して、腫瘍増殖の数字的に大きな減少が観察されたが、この差は統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．０５２５に調整）。
１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブ単独の用量は、マウス７匹中２匹で腫瘍クリアランスをもたらした（図１９Ｂ）。セミプリマブにｍＡｂ１を添加した用量は、試験した最高用量の１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１（マウス７匹中５匹、図１９Ｃ）で腫瘍クリアランスの頻度を増加させたが、より低い用量の１および０．１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１（それぞれ、マウス６匹中２匹および７匹中２匹、図１９ＤおよびＥ）では増加しなかった。腫瘍クリアランスを有するマウスはすべて、試験終了まで腫瘍のない状態のままであった（７５日目、最終投与の約９週間後）。予想通り、アイソタイプ対照抗体を投与されたマウスでは腫瘍クリアランスは観察されなかった（図１９Ａ）。
群間の生存率における統計的に有意な差は、オムニバスＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定（ｐ＝０．０１０５）を使用して検出され、追加のＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定が、群間比較のために実施された。アイソタイプ対照抗体を投与されたマウス（生存なし）と比較して、１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブを１または１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１と組み合わせて投与されたマウス（それぞれ３３％および７１％の生存率）では、生存率の有意な増加が観察された（図２０）。さらに、セミプリマブ単独を投与されたマウス（２９％の生存率）と比較して、１ｍｇ／ｋｇのセミプリマブを１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１と組み合わせて投与したマウス（０．１または１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１ではない）では、生存率の有意な増加が観察された。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本明細書に提供される様々な改変が、本明細書に記載されるものに加えて、上記の記述および付随する図面から、当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims (50)

  1. グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、
    （ａ）前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２、２８、３４、および４０からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に、三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号１０の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に、三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含み、
    （ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２、２８、３４、および４０からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列を含み、
    （ｃ）前記抗体が、配列番号２６、３２、３８、および４４からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列を含み、かつ配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列を含み、
    （ｄ）前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｎ１０１Ｄ、Ｎ１０１Ｅ、Ｎ１０１Ｓ、またはＮ１０１Ｔ変異で修飾された配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列内に三つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に三つの軽鎖ＣＤＲを含む、からなる群から選択される一つまたは複数の特性を示す、単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗体またはその抗原結合断片が、
    （ａ）単量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される約１２ｎＭ未満のＫＤで結合する、
    （ｂ）単量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で約２分超のｔ１／２で結合する、
    （ｃ）二量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される約１ｎＭ未満のＫＤで結合する、
    （ｄ）二量体ヒトＧＩＴＲを、２５℃で約５分超のｔ１／２で結合する、からなる群から選択される一つまたは複数の特性を示す、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗体またはその抗原結合断片が、
    （ａ）ヒトまたはマウスの血清における一日当たり０．５％未満の切断率を有する、および
    （ｂ）約０％のマウスにおけるインビボ切断率を有する、からなる群から選択される一つまたは複数の特性を示す、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記抗体またはその抗原結合断片が、
    （ａ）細胞表面ヒトおよびカニクイザルのＧＩＴＲを、約４ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する、
    （ｂ）Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＦｃγＲ３ａおよび／またはＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＦｃγＲ３ａエフェクター細胞におけるＦｃを介したＮＦＡＴ活性を、約４０ｐＭ未満のＥＣ５０で強化する、
    （ｃ）ヒト初代ＮＫ細胞の存在下で、ヒト初代Ｔ細胞に対して、約２０ｐＭ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣを媒介する、
    （ｄ）ヒトまたはカニクイザルのＧＩＴＲを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞において、非ＧＩＴＲ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５倍のＡＤＣＰを媒介する、
    （ｅ）抗ＣＤ３を介した初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を強化する、
    （ｆ）ＦｃγＲ依存的に、腫瘍内Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させることによって抗腫瘍免疫を誘導する、
    （ｇ）約７ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＧＩＴＲリガンドへのヒト単量体ＧＩＴＲ結合を遮断する、からなる群から選択される一つまたは複数の特性を示す、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  5. 配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  6. 配列番号２８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  7. 配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  8. 配列番号４０のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  9. 配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  10. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  11. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  12. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  13. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  14. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  15. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  16. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  17. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  18. 重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  19. 重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  20. 重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  21. 重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  22. 重鎖および軽鎖を含み、前記軽鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  24. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  25. 請求項２３または２４に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
  26. 請求項２５に記載のベクターを発現する単離された宿主細胞。
  27. 請求項１～２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
  28. 対象における癌を治療するための方法において使用するための請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 対象における抗腫瘍免疫応答を調節する方法において使用するための、請求項１～２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  30. 前記方法が、第二のＴ細胞活性化受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することをさらに含み、前記Ｔ細胞活性化受容体は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、またはＨＶＥＭである、請求項２９に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
  31. 前記方法が、Ｔ細胞阻害性受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することをさらに含み、前記Ｔ細胞阻害性受容体は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、またはＬＡＧ－３である、請求項２９に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
  32. 前記Ｔ細胞阻害性受容体がＰＤ１であり、Ｔ細胞受容体に結合する前記抗体がセミプリマブである、請求項３１に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
  33. 前記方法が、前記対象に放射線療法を施すことをさらに含む、請求項２９に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
  34. 前記方法が、一つまたは複数の化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項２９に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
  35. 前記癌が、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される、請求項２９に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
  36. 癌を治療する方法であって、請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  37. 抗腫瘍免疫応答を調節する方法であって、請求項１～２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  38. 第二のＴ細胞活性化受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することをさらに含み、前記Ｔ細胞活性化受容体が、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、またはＨＶＥＭである、請求項３７に記載の方法。
  39. Ｔ細胞阻害性受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することをさらに含み、前記Ｔ細胞阻害性受容体が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、またはＬＡＧ－３である、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記Ｔ細胞阻害性受容体がＰＤ１であり、Ｔ細胞受容体に結合する前記抗体が、セミプリマブである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記対象に、放射線療法を施すことをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  42. 一つまたは複数の化学療法剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  43. 前記癌が、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  44. 配列番号２のＨＣＶＲおよび配列番号１０のＬＣＶＲを含む抗体を除く、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  45. 癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、
    （ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、および
    （ｉｉ）セミプリマブを、投与することを含む、方法。
  46. 前記癌が、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記方法が、前記抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片およびセミプリマブを対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象における癌を治療する方法に使用するための医薬品の製造において、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の使用。
  48. 前記癌が、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される、請求項４７に記載の使用。
  49. それを必要とする対象において癌を治療する方法において使用するための抗体またはその抗原結合断片であって、前記方法が、前記対象に
    （ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、および
    （ｉｉ）セミプリマブを、投与することを含む、抗体またはその抗原結合断片。
  50. 前記癌が、扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、骨髄腫、肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌（子宮頸部ＳＣＣ）、乳癌、および腎細胞癌（ＲＣＣ）、腺癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵癌、頭頸部癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、精巣癌、食道癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）ナイーブ癌、およびＩＣＢ経験癌からなる群から選択される、請求項４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
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