JP2023150352A - Virus concentrator material - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、検査対象液中のウイルスを濃縮することが可能なウイルス濃縮材、その製造方法、それを用いたウイルス濃縮キット、ウイルス検査キット、ウイルス濃縮方法及びウイルス検査方法に関する。 The present invention relates to a virus concentration material capable of concentrating viruses in a liquid to be tested, a method for manufacturing the same, a virus concentration kit using the same, a virus test kit, a virus concentration method, and a virus test method.
ウイルスによる感染症の診断及び治療を行うために、患者から検体を採取してウイルス検査が行われる。さらに、空気中、水中、土壌中などの自然環境や建築物屋内の空気中や硬質表面などの人工的環境に存在しているウイルスの検出もまた、ウイルスによる感染症の感染源の特定やウイルスによる感染症のリスクを予測する上で重要であり、この場合、各々の環境から採取したサンプルを用いたウイルス検査が行われる。感染の有無及びウイルスの存在の有無を判断可能なウイルス検査としては、検体からウイルスの遺伝子（核酸）を検出する遺伝子検査、検体からウイルスに特異的な抗体を用いてウイルスに特異的な蛋白質を検出する抗原検査等が挙げられる。 In order to diagnose and treat infectious diseases caused by viruses, samples are collected from patients and tested for viruses. Furthermore, the detection of viruses that exist in natural environments such as in the air, water, and soil, as well as in artificial environments such as indoor air and hard surfaces of buildings, is also useful for identifying the source of infection by viral infections and Virus testing is important in predicting the risk of infectious diseases caused by viruses, and in this case, virus testing is performed using samples collected from each environment. Viral tests that can determine the presence or absence of infection and the presence of viruses include genetic tests that detect virus genes (nucleic acids) from specimens, and virus-specific proteins that are detected from specimens using virus-specific antibodies. Examples include antigen tests for detection.
一方で、各検査方法は検出限界を有しており、当該検出限界以下の少量のウイルスは検出が困難となる。ウイルス検査の検出感度を高める方法として、検体中のウイルスを濃縮する試みがなされている。例えば、特許文献１には、表面にアミン化合物を固定化したウイルス濃縮材料が記載されている。
On the other hand, each testing method has a detection limit, and it becomes difficult to detect a small amount of virus below the detection limit. As a way to increase the detection sensitivity of virus tests, attempts have been made to concentrate viruses in specimens. For example,
近年、ＣＯＶＩＤ－１９等のウイルスによる感染症の拡大の防止が急務となっている。これに伴い、感染初期や無症状の患者の検体を含む多くの検体から、高い感度でウイルスを検出したいという要請が高まっている。このため、特許文献１に記載のウイルス濃縮材料よりも高い濃縮率で、簡便かつ迅速にウイルスを濃縮し、ウイルスの検出感度を高めるための技術が望まれている。
In recent years, there has been an urgent need to prevent the spread of infectious diseases caused by viruses such as COVID-19. Along with this, there is a growing demand for highly sensitive virus detection from a large number of samples, including samples from early stages of infection and asymptomatic patients. For this reason, there is a need for a technology that can easily and quickly concentrate viruses at a higher concentration rate than the virus concentration material described in
本発明は、ウイルスを簡便に濃縮し、検出感度を高めることが可能なウイルス濃縮材、その製造方法、それを用いたウイルス濃縮キット、ウイルス検査キット、ウイルス濃縮方法、及びウイルス検査方法の提供に関する。 The present invention relates to a virus concentration material that can easily concentrate viruses and increase detection sensitivity, a method for producing the same, a virus concentration kit, a virus test kit, a virus concentration method, and a virus test method using the same. .
本発明の一形態に係るウイルス濃縮材は、
繊維を含み、α－セルロースを主成分とする柔軟なセルロース膜と、
前記繊維を被覆し、カチオン基を有するポリマーから選ばれる１種以上のポリマーと、
を備える。
本発明の他の特徴は、特許請求の範囲及び以下の説明から明らかになるであろう。
The virus concentration material according to one embodiment of the present invention is
A flexible cellulose membrane containing fibers and mainly composed of α-cellulose,
One or more polymers selected from polymers having cationic groups and covering the fibers;
Equipped with
Other features of the invention will be apparent from the claims and the following description.
本発明のウイルス濃縮材等によれば、ウイルスを簡便に濃縮し、検出感度を高めることが可能である。 According to the virus concentration material of the present invention, it is possible to easily concentrate viruses and increase detection sensitivity.
本明細書において、数値の限界値や範囲が記載されている場合には、その端点を含む。また、数値的な限界又は範囲に含まれる全ての値及びサブレンジは、明示的に書き出す場合と同様に、具体的に記載しているものとする。
本明細書において、単数で記載されている名詞は、「１つ以上」の意味を包含するものとする。
本発明の多数の修正及び変形は、明らかに、以下の教示に照らして可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施され得ることが理解される。
本明細書に記載の全ての特許文献及び参考文献は、長々と記載されている場合と同様に、この参照により本明細書に完全に組み込まれる。
In this specification, when numerical limits or ranges are described, the endpoints thereof are included. In addition, all values and subranges within a numerical limit or range shall be specifically stated, as if written out explicitly.
In this specification, nouns written in the singular shall include the meaning of "one or more."
Obviously, many modifications and variations of the present invention are possible in light of the following teachings. It is therefore understood that within the scope of the appended claims, the invention may be practiced otherwise than as specifically described herein.
All patent documents and references mentioned herein are fully incorporated by reference into this specification, as if set forth at length.
［ウイルス濃縮材］
本発明のウイルス濃縮材は、ウイルス検査のための検査対象液中の標的ウイルスを簡便に濃縮し、かつ、検出感度を高めることが可能な材料である。
本発明のウイルス検査は、抗原検査及び遺伝子検査を含む。抗原検査は、ウイルスの有するタンパク質あるいはタンパク質の断片を検出する検査である。遺伝子検査は、ウイルスの遺伝子（核酸）を検出する検査である。
なお、本明細書において、「ウイルス検査」を単に「検査」とも称する。
本発明の「検査対象液」とは、ウイルス検査の対象となる液であり、検査対象から採取された液状の検体又は検体を含む液を意味する。「検査対象」は、ヒト（被験者）及び家畜等の生体の一部、並びに非生体であってもよい。非生体の検査対象は、ウイルスに汚染された可能性のあるものを広く含み、例えば、ドアノブ、机、便器、装置の操作盤、コンピュータに接続された入力装置、スイッチ、床、壁等の固体の人工物、下水、河川等の水、土壌、屋内又は屋外の空気等を含む。
本発明において「濃縮」とは、検査対象液からウイルス濃度のより高いウイルス含有液を生成するための操作であり、具体的には、本発明のウイルス濃縮材に検査対象液中のウイルスを集合及び吸着させる操作を含む。
本発明において、ウイルスの「吸着」とは、ウイルス及び／又はその断片を選択的に結合することを意味する。ウイルスの断片は、例えば、ウイルスのタンパク質を含む。
[Virus concentrate material]
The virus concentration material of the present invention is a material that can easily concentrate a target virus in a liquid to be tested for virus testing and can increase detection sensitivity.
The virus test of the present invention includes an antigen test and a genetic test. Antigen tests are tests that detect proteins or protein fragments possessed by viruses. Genetic testing is a test that detects viral genes (nucleic acids).
In addition, in this specification, a "virus test" is also simply called a "test."
The "liquid to be tested" in the present invention is a liquid to be tested for viruses, and refers to a liquid sample collected from a test subject or a liquid containing a sample. The "inspection object" may be a part of a living body such as a human (subject) or a domestic animal, or a non-living body. Non-living objects to be tested include a wide range of objects that may be contaminated with viruses, such as doorknobs, desks, toilets, equipment operation panels, input devices connected to computers, switches, solid objects such as floors, walls, etc. This includes artificial objects, sewage, river water, soil, indoor or outdoor air, etc.
In the present invention, "concentration" refers to an operation for producing a virus-containing liquid with a higher virus concentration from a liquid to be tested. Specifically, it is an operation to collect viruses in the liquid to be tested into the virus concentration material of the present invention. and adsorption operations.
In the present invention, "adsorption" of a virus means selectively binding the virus and/or its fragments. Viral fragments include, for example, viral proteins.
本発明のウイルス濃縮材は、例えば、ウイルス検査のための検査対象液と接触させてウイルスを吸着させることができる。ウイルス濃縮材と検査対象液との接触方法は、特に限定されない。例えば、ウイルス濃縮材は、検査対象液に浸漬されてもよく、浸漬された状態で振とうされてもよい。あるいは、ウイルス濃縮材は、検査対象液をフィルトレーションするためのフィルタとして用いられてもよい。また、検査対象液が付着した検出対象をウイルス濃縮材で拭うことで、検査対象液中の標的ウイルスを濃縮してもよい。本発明に係る具体的な濃縮方法については、後述する。
ウイルス濃縮材を検査対象液と接触させた後、ウイルス濃縮材が回収される。回収されたウイルス濃縮材には、後述する構成により、多くのウイルスが吸着され得る。このウイルス濃縮材からウイルスを回収することで、濃度の高いウイルス含有液を得ることができ、ウイルス検査における検出感度を高めることができる。
For example, the virus concentration material of the present invention can be brought into contact with a liquid to be tested for virus testing to adsorb viruses. The method of contact between the virus concentration material and the liquid to be tested is not particularly limited. For example, the virus concentration material may be immersed in the liquid to be tested, or may be shaken while being immersed. Alternatively, the virus concentration material may be used as a filter for filtering the liquid to be tested. Alternatively, the target virus in the test liquid may be concentrated by wiping the detection target to which the test liquid has adhered with a virus concentrating material. A specific concentration method according to the present invention will be described later.
After contacting the virus concentration material with the liquid to be tested, the virus concentration material is collected. Many viruses can be adsorbed to the collected virus concentration material by the configuration described below. By collecting viruses from this virus concentration material, a highly concentrated virus-containing liquid can be obtained, and detection sensitivity in virus testing can be increased.
本発明の一実施形態において、ウイルス濃縮材１は、繊維Ｆを含むセルロース膜２と、繊維Ｆを被覆するポリマー３と、を備える。この例は図１及び図２に模式的に示される。
なお、図１の拡大断面図及び図２において、ハッチングは各部の断面形状を模式的に示すものであり、繊維の配向性又は分子構造等を示すものではない。
In one embodiment of the present invention, the
Note that in the enlarged cross-sectional view of FIG. 1 and FIG. 2, hatching schematically shows the cross-sectional shape of each part, and does not indicate the orientation of the fibers or the molecular structure.
（セルロース膜）
セルロース膜２は、ウイルス濃縮材１の基材である。セルロース膜２は、α－セルロースを主成分とする。
「セルロース膜２がα－セルロースを主成分とする」とは、セルロース膜２全体の質量を１００質量％とした際に、セルロース膜２が５０質量％以上のα－セルロースを含んでいることをいう。セルロース膜２のα－セルロースの含有量は、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上である。
セルロース膜２のα－セルロースの含有量を高めることにより、α－セルロースの化学的修飾等の工程を省略でき、製造効率を高めることができる。さらに、セルロース膜２の組成をシンプルにすることで、セルロース膜２の製造コストを削減することができる。また、後述する実施例で示すように、このようなα－セルロースの含有量が高いセルロース膜２は、ポリマー３を安定して固定することができ、高い濃縮率を得ることができる。
(cellulose membrane)
The
"The
By increasing the content of α-cellulose in the
図１に例示するように、セルロース膜２は、繊維Ｆを含んでいる。さらに、セルロース膜２は、繊維Ｆの集合体であって、膜状に成形されたものであることが好ましい。
繊維Ｆは、α－セルロースを主成分とする繊維であることが好ましい。α－セルロースを主成分とする繊維とは、繊維Ｆ全体の質量を１００質量％とした際に、５０質量％以上のα－セルロースを含んでいる繊維をいう。繊維Ｆのα－セルロースの含有量は、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上である。
As illustrated in FIG. 1, the
The fibers F are preferably fibers containing α-cellulose as a main component. Fibers containing α-cellulose as a main component refer to fibers containing 50% by mass or more of α-cellulose when the mass of the entire fiber F is 100% by mass. The content of α-cellulose in fiber F is preferably 80% by mass or more, more preferably 90% by mass or more.
濃縮率を高める観点から、セルロース膜２の繊維Ｆのメジアン繊維径は、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは５０μｍ以下である。これにより、セルロース膜２の比表面積が高められ、ポリマー３の被覆面積を増加させることができる。したがって、ウイルス濃縮材１の濃縮性能を高めることができる。
また、セルロース膜２の強度を高め、セルロース膜２の構造を維持する観点から、セルロース膜２の繊維Ｆのメジアン繊維径は、好ましくは１０μｍ以上、好ましくは２０μｍ以上である。
本発明の「繊維径」とは、円相当直径を意味する。繊維の繊維径は、例えば走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の観察による二次元画像から繊維の塊、繊維の交差部分といった欠陥を除いた繊維を任意に５００本選び出し、繊維の長手方向に直交する線を引いたときの長さを繊維径として直接読み取ることで測定することができる。測定した５００本の繊維径の分布からメジアン繊維径を求めることができる。
From the viewpoint of increasing the concentration rate, the median fiber diameter of the fibers F of the
Moreover, from the viewpoint of increasing the strength of the
The "fiber diameter" in the present invention means a circular equivalent diameter. The fiber diameter of the fibers can be determined by arbitrarily selecting 500 fibers from a two-dimensional image obtained by scanning electron microscopy (SEM), excluding defects such as fiber clumps and fiber intersections, and measuring the fiber diameter by a line perpendicular to the longitudinal direction of the fibers. It can be measured by directly reading the length when the fiber diameter is pulled. The median fiber diameter can be determined from the distribution of the 500 measured fiber diameters.
濃縮率を高める観点から、セルロース膜２は、ポリマー３によってウイルスを吸着可能に構成された吸着面２ｓを有する。つまり、セルロース膜２では、厚み方向に略垂直な２つの面のうち、少なくとも一方の面がポリマー３によって被覆された吸着面２ｓとなることが好ましく、さらに、両面ともが吸着面２ｓとなることがより好ましい。これにより、ウイルスの吸着量を高めることができる。
なお、ポリマー３は、吸着面２ｓを構成する繊維Ｆに加えて、又は吸着面２ｓを構成する繊維Ｆに替えて、セルロース膜２の内部の繊維Ｆを被覆していることが好ましい。
また、ウイルス濃縮材１の基材を膜状に構成することで、１つのウイルス濃縮材１における吸着面２ｓを広く確保することができる。これにより、ウイルス濃縮材１の１枚あたりのウイルス吸着量を増加させることができ、１検体に対する濃縮処理を、１枚又は数枚のウイルス濃縮材１によって行うことができる。したがって、ウイルス濃縮時におけるウイルス濃縮材１の準備、及び濃縮後のウイルス濃縮材１の回収を、簡便に行うことができる。
セルロース膜２は、単層でも積層体でもよい。図２に示す例では、セルロース膜２が単層である例を示している。
From the viewpoint of increasing the concentration rate, the
In addition, it is preferable that the
Further, by configuring the base material of the
The
一対の吸着面２ｓは、典型的には、同一の平面形状を有する。吸着面２ｓの平面形状は、円形、楕円形若しくはこれらに類する形状、多角形状若しくはこれに類する形状、又はその他の形状から選択される任意の平面形状を有する。セルロース膜２は、広げた状態で用いられてもよく、あるいは、折り曲げ等によって変形された状態で用いられてもよい。
濃縮を簡便に行う観点から、吸着面２ｓの平面形状は、円形であることが好ましい。これにより、平面視において、セルロース膜２の重心から周縁部までの寸法がほぼ一定となる。したがって、振とうやフィルタリングといった検査対象液からの圧力が加わるような場合でも、周縁部の意図しない形状変化を抑制することができる。さらに、吸着面２ｓの平面形状を円形とすることで、円筒状や円錐状の検査器具に適した形状となり、濃縮処理を効率よく行うことができる。
The pair of
From the viewpoint of convenient concentration, the planar shape of the
一対の吸着面２ｓ各々の面積は、検査対象液の量や用いる器具の大きさに応じて適宜設定できる。０．５～２ｍＬ程度の少量の検査対象液に対して効率よく濃縮を行う観点から、当該面積は、好ましくは７ｍｍ２以上、より好ましくは１９ｍｍ２以上、さらに好ましくは７８．５ｍｍ２以上であり、好ましくは８０００ｍｍ２以下、より好ましくは２０００ｍｍ２以下、さらに好ましくは８００ｍｍ２以下、さらに好ましくは３００ｍｍ２以下である。上記範囲に設定することで、一対の吸着面２ｓの面積を十分に確保でき、十分な濃縮率を得ることができる。
また、一対の吸着面２ｓの平面形状が円形である場合における、これらの面の直径は、同様の観点から、好ましくは３ｍｍ以上、より好ましくは５ｍｍ以上であり、好ましくは１００ｍｍ以下、より好ましくは５０ｍｍ以下である。
The area of each of the pair of
Further, when the planar shape of the pair of
セルロース膜２は、柔軟性を有する。ここでいう「柔軟なセルロース膜」とは、人の手で容易に折り曲げることが可能な軟質なセルロース膜を言う。具体的に、「柔軟なセルロース膜」は、板紙と同等又はそれよりも剛度の低い膜であり、例えば、取り扱い性を高める観点から、テーバー剛度（ＪＩＳ Ｐ８１２５：２０００）が３０ｍＮ・ｍ以下であることが好ましい。柔軟なセルロース膜の例としては、紙状のセルロース膜が挙げられ、より具体的には、後述するペーパーフィルタが挙げられる。
これにより、ピンセット等の器具でセルロース膜２の周縁を掴みやすくなり、複数のウイルス濃縮材１を含む包装体からの取り出しや、検査対象液からのウイルス濃縮材１の回収が容易になる。また、柔軟性を有する程度にセルロース膜２を薄く構成することで、体積に対して吸着面を広く確保することができ、濃縮率を高めることができる。また、セルロース膜２を薄く構成することで、検査対象液の全体に浸漬しやすくなり、十分な濃縮率を得ることができる。さらに、セルロース膜２を薄く構成することで、ウイルス濃縮材１の体積を低減することができ、保管に必要なスペースを削減することができる。
This makes it easier to grasp the periphery of the
一方で、セルロース膜２は、濃縮中の意図しない形状変化や破れを抑制するため、ある程度の強度を有していることが好ましい。薄さと強度のバランスの良いセルロース膜２を得る観点から、セルロース膜２の坪量は、好ましくは７０ｇ／ｍ２以上、より好ましくは８０ｇ／ｍ２以上であり、好ましくは２００ｇ／ｍ２以下、より好ましくは１５０ｇ／ｍ２以下である。
なお、セルロース膜２の坪量は、以下のように測定する。
測定対象であるセルロース膜２を所定の大きさに切断し、測定用の小片を得る。それらの小片の重量を測定し、求めた重量を各小片の面積で除して小片の坪量を算出する。小片５個の坪量の平均値を、セルロース膜２の坪量とする。
On the other hand, it is preferable that the
Note that the basis weight of the
The
坪量と同様の観点から、セルロース膜２の厚みは、好ましくは０．１５ｍｍ以上、より好ましくは０．１６ｍｍ以上であり、好ましくは０．４ｍｍ以下、より好ましくは０．３ｍｍ以下である。
なお、セルロース膜２の厚みは、以下のように測定する。
３枚のセルロース膜２を、測定用サンプルとして準備する。レーザー変位計（オムロン株式会社製ＺＳＬＤ８０）を使用し、サンプル中の任意の３箇所の厚みを測定する。測定した全ての厚みの平均値をセルロース膜２の厚みとする。
From the same viewpoint as the basis weight, the thickness of the
Note that the thickness of the
Three
薄さと強度のバランスが良く、上記厚み及び坪量の範囲を満たし得る構成の例として、セルロース膜２は、紙状に構成されることが好ましい。紙状のセルロース膜２は、繊維Ｆを膠着させて製造されたものである。なお、検査対象液と接触させた際の破れや溶解を抑制する観点から、本明細書における「紙」は、トイレットペーパーのような水解紙を含まないものとする。
これにより、セルロース膜２に適度な柔軟性及び強度を付与できる。また、綿状などの構成と比較して薄いセルロース膜２を得ることができるため、保管のためのスペースを削減することができる。さらに、セルロース膜２が１枚ずつ取り出しやすくなり、使用の際の利便性を高めることができる。
As an example of a structure that has a good balance between thinness and strength and can satisfy the above thickness and basis weight ranges, the
Thereby, appropriate flexibility and strength can be imparted to the
濃縮率を高める観点から、セルロース膜２は、フィルタ状に構成されることが好ましい。
例えば、図１の拡大図に示すように、繊維Ｆ間に複数の孔Ｐが形成されることにより、セルロース膜２がフィルタ状に形成される。
これにより、セルロース膜２の孔Ｐに検査対象液が流入し、検査対象液の流れが生じることで、検査対象液中のウイルスとポリマー３に被覆された繊維Ｆとの接触機会を高めることができる。したがって、セルロース膜２へのウイルスの吸着量を増加させ、濃縮率を高めることができる。
さらに、孔Ｐに接する繊維Ｆをポリマー３が被覆することで、検査対象液が孔Ｐに流入した際に、ウイルスが繊維Ｆに吸着されやすくなる。このような作用によってもセルロース膜２へのウイルスの吸着量を増加させることができる。
From the viewpoint of increasing the concentration rate, the
For example, as shown in the enlarged view of FIG. 1, by forming a plurality of holes P between fibers F, the
As a result, the liquid to be tested flows into the pores P of the
Furthermore, by coating the fibers F in contact with the holes P with the
より具体的に、セルロース膜２は、例えばペーパーフィルタ（濾紙）として構成されることがより好ましい。これにより、フィルタ状でありつつも、上述の紙としての利点を活かすことができ、検査対象液との接触時に十分な強度を有するセルロース膜２を得ることができる。
さらに、セルロース膜２は、定性分析用の濾紙（定性濾紙）であることがより好ましい。これにより、後述する実施例で説明するように、ポリマー３を安定して固定することができ、高い濃縮率を得やすくなる。また、セルロース膜２を安価にかつ容易に作製することができ、製造コストを低減することができる。
More specifically, it is more preferable that the
Furthermore, it is more preferable that the
セルロース膜２がフィルタ状に構成される場合、セルロース膜２と検査対象液中のウイルスとの接触機会を増やす観点からは、孔径をある程度の大きさに設定することが好ましい。その一方で、繊維Ｆを密に配置することで、ポリマー３を固定するための繊維Ｆの表面積を増加させることができる。
このように、セルロース膜２の孔径と繊維Ｆの密度のバランスの良いセルロース膜２を得る観点から、セルロース膜２の保留粒子径（粒子保持能）は、好ましくは１μｍ以上、より好ましくは１．５μｍ以上、さらに好ましくは２μｍ以上であり、好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以下、さらに好ましくは３０μｍ以下である。
保留粒子径は、ＪＩＳ Ｐ ３８０１に規定された硫酸バリウム等の懸濁液を自然濾過したときの漏洩粒子径により求めた値であり、具体的には、保持効率が９８％となる粒子径である。つまり、保留粒子径は、セルロース膜２の平均孔径を反映した値となる。後述する実施例で示すように、保留粒子径がウイルスの大きさと比較して非常に大きい場合でも、本発明では、ポリマー３によって十分な濃縮作用を得ることができる。
When the
As described above, from the viewpoint of obtaining a
The retention particle size is a value determined from the leakage particle size when a suspension of barium sulfate, etc. is naturally filtered as specified in JIS P 3801, and specifically, it is the particle size at which the retention efficiency is 98%. be. In other words, the retained particle diameter is a value that reflects the average pore diameter of the
保留粒子径と同様の観点から、セルロース膜２の濾水時間は、好ましくは２０秒以上、より好ましくは３０秒以上であり、好ましくは２０００秒以下、より好ましくは１５００秒以下である。
濾水時間は、ＪＩＳ Ｐ ３８０１に記載の方法で測定される。具体的に、濾水時間は、ヘルツベルグ濾過速度試験器を使用し、１０ｃｍ２のフィルタ面（例えばセルロース膜２では吸着面２ｓ）において、２０℃、１００ｍｌの蒸留水を０．９８ｋＰａの圧力により濾過する時間である。つまり、濾水時間が長いと、水がセルロース膜２を透過しにくくなる。
濾水時間の下限値を上記のように設定することで、検査対象液がセルロース膜２を通過する時間が長くなり、検査対象液とセルロース膜２との接触機会を高めることができる。また、繊維Ｆを密に配置することができ、セルロース膜２上に十分な量のポリマー３を固定することができる。濾水時間の上限値を上記のように設定することで、検査対象液がセルロース膜２を通過しやすくなる。
From the same viewpoint as the retained particle size, the drainage time of the
Drainage time is measured by the method described in JIS P 3801. Specifically, the filtration time is determined by using a Herzberg filtration rate tester to filter 100 ml of distilled water at 20°C and a pressure of 0.98 kPa on a 10 cm 2 filter surface (for example, 2 s of adsorption surface for cellulose membrane 2). It's time to do it. In other words, if the drainage time is long, it becomes difficult for water to permeate through the
By setting the lower limit of the drainage time as described above, the time for the test liquid to pass through the
（ポリマー）
本発明のポリマー３は、上述のように、繊維Ｆを被覆している。この例は、図１の拡大図に示されている。この拡大図は、繊維Ｆの延在方向に沿って切断した断面を示す縦断面図であり、繊維Ｆの表面をポリマー３が覆っている態様を示している。
本明細書において、「ポリマー３が繊維Ｆを被覆する」とは、ポリマー３が繊維Ｆの表面の少なくとも一部を被覆していることを意味し、ポリマー３が繊維Ｆの表面全体を被覆していなくてもよい。また、「ポリマー３が繊維Ｆを被覆する」という表現は、ポリマー３が繊維Ｆの表面に直接接している態様のみならず、繊維Ｆの表面に、他の材料を介して間接的に固定されている態様も含む。
(polymer)
The
In this specification, "the
本発明において、ポリマー３は、カチオン性基を有するポリマーから選ばれた１種以上のポリマーである。カチオン性基とは、カチオン性基、又は、イオン化されてカチオン性基になり得る基をいい、アニオン性基とは、アニオン性基、又は、イオン化されてアニオン性基になり得る基をいう。
つまり、ポリマー３は、カチオン性基に由来して、全体的又は局所的に正に帯電し得る。
本明細書のカチオン性基を有するポリマーとは、常にカチオン性を帯びたポリマーのみならず、ｐＨの変化によりカチオン性を帯びることがあるポリマーも含む。
このようなポリマー３により、繊維Ｆの表面が正に帯電することになり、負に帯電しやすいウイルスを静電相互作用によって吸着させることが可能となる。また、繊維Ｆの表面が親水性の高い状態に改質されることから、繊維Ｆの検査対象液に対する濡れ性を高めることができる。これにより、検査対象液が繊維Ｆと広い範囲で接触しやすくなり、ウイルスの吸着性がより高まるものと考えられる。
In the present invention, the
That is,
The term "polymer having a cationic group" as used herein includes not only a polymer that is always cationic, but also a polymer that may become cationic due to a change in pH.
Such a
本明細書のカチオン性基を有するポリマーは、例えば、カチオン性モノマーの１種以上に由来する構成単位を有していてもよい。本明細書にいうカチオン性モノマーとは、常にカチオン性を帯びたモノマーのみならず、ｐＨの変化によりカチオン性を帯びることがあるモノマーも含む。
当該カチオン性モノマーは、不飽和モノマーが好ましく、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、リジン、アリルアミン、ジアリルアミン及びトリアリルアミンや、これらの塩類及び四級アンモニウム塩が好ましい。これらの塩類として塩酸、硫酸、酢酸、燐酸等の無機酸及び有機酸の塩類が挙げられる。これらの四級アンモニウム塩として、メチルハライド（クロライド、ブロマイド等）、エチルハライド（クロライド、ブロマイド等）、ベンジルハライド（クロライド、ブロマイド等）、ジアルキル（メチル、エチル等）硫酸、ジアルキル（メチル、エチル等）炭酸、エピクロロヒドリン等の四級化剤との反応により得られる四級アンモニウム塩が挙げられる。
なお、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、アリルアミン、ジアリルアミン、トリアリルアミンは、共重合した後、塩酸、硫酸、酢酸、燐酸等の無機酸、有機酸等の塩類で処理したものも用いることができる。
The polymer having a cationic group in this specification may have a structural unit derived from one or more cationic monomers, for example. The cationic monomer as used herein includes not only monomers that are always cationic, but also monomers that may become cationic due to a change in pH.
The cationic monomer is preferably an unsaturated monomer, such as dimethylaminoethyl (meth)acrylate, diethylaminoethyl (meth)acrylate, dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, diethylaminopropyl (meth)acrylamide, lysine, allylamine, diallylamine, and triallylamine. and their salts and quaternary ammonium salts are preferred. These salts include salts of inorganic and organic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, and phosphoric acid. These quaternary ammonium salts include methyl halide (chloride, bromide, etc.), ethyl halide (chloride, bromide, etc.), benzyl halide (chloride, bromide, etc.), dialkyl (methyl, ethyl, etc.) sulfuric acid, dialkyl (methyl, ethyl, etc.) ) Quaternary ammonium salts obtained by reaction with quaternizing agents such as carbonic acid and epichlorohydrin.
In addition, dimethylaminoethyl (meth)acrylate, diethylaminoethyl (meth)acrylate, dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, diethylaminopropyl (meth)acrylamide, allylamine, diallylamine, and triallylamine are used after copolymerization with hydrochloric acid, sulfuric acid, and acetic acid. , those treated with salts such as inorganic acids such as phosphoric acid, and organic acids can also be used.
上記ポリマーの重合には、上記カチオン性モノマーと共に、その他のモノマーを用いることができる。その他のモノマーの割合は、全モノマーに対して０～８０モル％が好ましく、０～５０モル％がより好ましく、０～２０モル％が特に好ましい。また、必要に応じて架橋性モノマーを用いることができる。架橋性モノマーは、前記のカチオン性モノマーに属するものであってもよく、属さない他のモノマーであってもよい。 In addition to the cationic monomer, other monomers can be used in the polymerization of the polymer. The proportion of other monomers is preferably 0 to 80 mol%, more preferably 0 to 50 mol%, particularly preferably 0 to 20 mol%, based on the total monomers. Further, a crosslinkable monomer can be used as necessary. The crosslinking monomer may belong to the above-mentioned cationic monomers or may be another monomer that does not belong to the above-mentioned cationic monomers.
より具体的に、本明細書のカチオン性基を有するポリマーは、塩化ジメチルジアリルアンモニウムに由来する構成単位を有するポリマー、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートに由来する構成単位を有するポリマー、ジアリルアミン系のコポリマー、及びポリリジン（ε－ポリ－Ｌ－リジン）から選択された１種又は２種以上を含むことが好ましく、さらに、塩化ジメチルジアリルアンモニウムのホモポリマー、ラウリルメタクリレートとジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートを構成単位として有するコポリマー、及びポリリジン（ε－ポリ－Ｌ－リジン）から選択された１種又は２種以上を含むことがより好ましい。これにより、後述する実施例で示すように、ウイルスを吸着する効果を安定して得ることができる。 More specifically, the polymer having a cationic group in the present specification includes a polymer having a constituent unit derived from dimethyldiallylammonium chloride, a polymer having a constituent unit originating from dialkylaminoalkyl (meth)acrylate, and a diallylamine copolymer. , and polylysine (ε-poly-L-lysine), and further comprises a homopolymer of dimethyldiallylammonium chloride, lauryl methacrylate and dimethylaminoethyl (meth)acrylate. It is more preferable to include one or more selected from a copolymer having as a unit and polylysine (ε-poly-L-lysine). This makes it possible to stably obtain the effect of adsorbing viruses, as shown in the examples described later.
上記ポリマーの重量平均分子量は、１０００～１００万が好ましく、３０００～５０万がより好ましく、１万～３０万が特に好ましく、１万～２０万がさらに好ましい。
上記ポリマーの重量平均分子量は、下記の条件でゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）にて測定したものである。換算分子量には、ポリエチレングリコール（ＧＰＣ用の標準試料）を用いることができる。
＜測定条件＞
カラム：α－Ｍ×２（東ソー）
溶離液：５０ｍＭ ＬｉＢｒ、１％酢酸／エタノール＝７０／３０（体積比）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ
試料濃度：４ｍｇ／ｍＬ
注入量：１００μＬ
The weight average molecular weight of the above polymer is preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 3,000 to 500,000, particularly preferably 10,000 to 300,000, and even more preferably 10,000 to 200,000.
The weight average molecular weight of the above polymer was measured by gel permeation chromatography (GPC) under the following conditions. Polyethylene glycol (standard sample for GPC) can be used for the equivalent molecular weight.
<Measurement conditions>
Column: α-M x 2 (Tosoh)
Eluent: 50mM LiBr, 1% acetic acid/ethanol = 70/30 (volume ratio)
Flow rate: 1mL/min
Column temperature: 40℃
Detector: RI
Sample concentration: 4mg/mL
Injection volume: 100μL
［標的ウイルス］
本発明のウイルス濃縮材は、主に静電相互作用によって標的ウイルスを吸着することができる。
ウイルスは遺伝情報を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を中心とし，その周囲をタンパク質の殻（カプシド）で包んだ構造からできている。また、一部のウイルスにはさらに外側に脂質二重膜や糖タンパク質からなる被膜（エンベロープ）を有するものがあり、この構造的特徴を有するウイルスはエンベロープウイルスと呼ばれる。
本発明のウイルス濃縮材は、静電相互作用によって効率よくウイルスを吸着する観点から、負に帯電しやすいウイルスであるエンベロープウイルスを標的とすることが好ましい。エンベロープウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、レトロウイルスなどが挙げられる。
[Target virus]
The virus concentration material of the present invention can adsorb target viruses mainly through electrostatic interaction.
Viruses are made up of a structure in which a nucleic acid (DNA or RNA) containing genetic information is surrounded by a protein shell (capsid). Furthermore, some viruses have an outer membrane (envelope) consisting of a lipid bilayer membrane or glycoprotein, and viruses having this structural feature are called enveloped viruses.
From the viewpoint of efficiently adsorbing viruses through electrostatic interaction, the virus concentration material of the present invention preferably targets enveloped viruses, which are viruses that tend to be negatively charged. Examples of enveloped viruses include influenza viruses, herpes viruses, coronaviruses, and retroviruses.
特に、本発明の標的となるエンベロープウイルスは、コロナウイルスに属するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むことがより好ましい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるウイルスである。本発明によって検査対象液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を簡便かつ高い濃縮率で濃縮することで、ウイルス検査におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出感度が向上する。これにより、感染初期の患者や無症状の患者に対してもＣＯＶＩＤ－１９が診断される可能性が高まる。さらに、後述するように、本発明では非常に迅速かつ簡便に標的ウイルスの濃縮が可能となり、検査効率が高められる。したがって、本発明により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染防止策が適切に講じられ、ＣＯＶＩＤ－１９の拡大防止に貢献できる。 In particular, the enveloped virus targeted by the present invention more preferably includes SARS-CoV-2, which belongs to the coronavirus. SARS-CoV-2 is the virus that causes acute respiratory disease (COVID-19). By concentrating SARS-CoV-2 in a liquid to be tested easily and at a high concentration rate according to the present invention, the detection sensitivity of SARS-CoV-2 in virus testing is improved. This increases the possibility that COVID-19 will be diagnosed even in patients in the early stages of infection or in asymptomatic patients. Furthermore, as will be described later, the present invention makes it possible to concentrate the target virus very quickly and easily, thereby increasing testing efficiency. Therefore, according to the present invention, measures to prevent the infection of SARS-CoV-2 can be appropriately taken and can contribute to preventing the spread of COVID-19.
（ウイルス濃縮材を用いた濃縮原理及び作用効果）
図３を用いて、以上の構成を有するウイルス濃縮材１の、ウイルス検査における濃縮原理及び典型的な作用効果について説明する。
図３（Ａ）は、検査対象液Ｌ中にウイルスＶが分散している状態を示す。検査対象液Ｌは、容器等に採取された状態でもよいし、検査対象の表面に付着した状態でもよい。
図３（Ｂ）では、セルロース膜２を検査対象液Ｌと接触させる。セルロース膜２の繊維Ｆは、ポリマー３で被覆されているため（図１の拡大図参照）、ポリマー３を介して検査対象液Ｌ中のウイルスＶがセルロース膜２の吸着面２ｓに選択的に吸着する。これにより、検査対象液Ｌ中のウイルスＶがセルロース膜２上に集合した状態となる。つまり、検査対象液Ｌ中のウイルスＶがセルロース膜２によって濃縮される。
そして、図３（Ｃ）に示すように、セルロース膜２を検査対象液Ｌから分離し、回収する。これにより、濃縮されたウイルスＶが検査対象液Ｌから分離され、濃縮処理が完了する。
(Concentration principle and effects using virus concentration material)
With reference to FIG. 3, the concentration principle and typical effects of the
FIG. 3(A) shows a state in which the virus V is dispersed in the liquid L to be tested. The test target liquid L may be collected in a container or the like, or may be attached to the surface of the test target.
In FIG. 3(B), the
Then, as shown in FIG. 3(C), the
セルロース膜２に吸着したウイルスＶは、例えば、ウイルス抽出液等によってセルロース膜２から分離され、ウイルス検査の試料として利用される。
セルロース膜２がウイルスＶを選択的に吸着して濃縮することで、ウイルス抽出液等の濃縮後のウイルス含有液におけるウイルスＶの濃度が高められる。
The virus V adsorbed on the
As the
ウイルスＶの濃縮率を高める観点から、本発明のウイルス濃縮材１では、カチオン性基を有するポリマーから選ばれる１種以上のポリマー３が、セルロース膜２の繊維Ｆを被覆している（図１参照）。これにより、繊維Ｆの表面が正に帯電し、静電相互作用によってウイルスＶを吸着可能となる。繊維Ｆの表面にウイルスが吸着されることにより、セルロース膜２におけるウイルスＶを吸着可能な面積が増大し、セルロース膜２の単位質量あたりに吸着するウイルスＶの量が高められる。
このことから、以下の具体例に示すように、ウイルスＶの濃縮率を高めることができる。
例えば、質量（サイズ）が一定であっても、単位質量あたりに吸着可能なウイルスＶの量がより高いセルロース膜２を形成することができる。この結果、検査対象液Ｌからより多くのウイルスＶを当該ウイルス抽出液に移動させることができ、当該ウイルス抽出液におけるウイルスＶの濃度が高められる。これにより、ウイルスＶの高濃度化が実現する。
さらに、例えば、セルロース膜２に吸着可能なウイルスＶの量を維持しつつ、質量（サイズ）の小さいセルロース膜２を形成することもできる。これにより、セルロース膜２が浸漬可能なウイルス抽出液の容積を低減させることができる。仮に、同一量のウイルスＶを抽出するためのウイルス抽出液の容積が１／１０であれば、濃縮率は１０倍となる。したがって、このような観点からも、ウイルスＶの高濃度化が可能となる。
From the viewpoint of increasing the concentration rate of the virus V, in the
From this, as shown in the following specific example, the concentration rate of virus V can be increased.
For example, even if the mass (size) is constant, a
Furthermore, for example, it is also possible to form a
ウイルスＶの濃度を高めることで、ウイルス検査の検出感度が高められ、ウイルス検査の信頼性が高められる。さらに、ウイルスの保持量の少ない、感染初期の患者や無症状の患者の検体からもウイルスを検出できる可能性がある。これにより、検査結果に基づいて、感染防止策がより適切に講じられ、ウイルス感染症の拡大が防止される。 By increasing the concentration of virus V, the detection sensitivity of the virus test is increased and the reliability of the virus test is increased. Furthermore, it may be possible to detect the virus in specimens from patients in the early stages of infection or asymptomatic patients, who carry only a small amount of virus. As a result, infection prevention measures can be taken more appropriately based on the test results, and the spread of viral infections can be prevented.
本発明のウイルス濃縮材１を用いることで、セルロース膜２を検査対象液Ｌに接触させることを主体とする簡単なステップでウイルスＶの濃縮ができる。例えば、遠心分離機等の装置を必要とせずに、ウイルスＶの濃縮ができる。例えば、ウイルス濃縮材１はセルロース膜２を基材とするため、１枚ずつ取り出して使用しやすくなり、使用の際の計量等のステップを省略しやすくなる。加えて、セルロース膜２は、磁性体等の特殊な材料と比較して比較的容易に管理することができる。
このように、本発明のウイルス濃縮材１によれば、ウイルスＶの濃縮のための技術や特殊な装置が不要となり、多様な場所において、かつ多様な作業者（ユーザ）によって、ウイルスＶの濃縮処理が可能となる。さらに、ウイルスＶの濃縮が短時間で完了する。したがって、本発明のウイルス濃縮材１によれば、迅速かつ大量に、適切なウイルス検査の結果が得られ、ウイルス検査の効率化に大きく寄与できる。この結果、感染防止策がより適切に講じられ、ウイルス感染症の拡大が防止される。
By using the
As described above, according to the
［ウイルス濃縮材の製造方法］
本発明のウイルス濃縮材は、一実施形態において、以下のように製造される。
本発明のウイルス濃縮材の製造方法は、
セルロース膜を準備する工程（Ｓ１１）と、
セルロース膜の繊維の表面を、カチオン性基を有するポリマーから選ばれる１種以上のポリマーで被覆する工程（Ｓ１２）と、
を含む。この製造方法の例は、図４に示されている。
[Method for manufacturing virus concentrate material]
In one embodiment, the virus concentrate material of the present invention is manufactured as follows.
The method for producing the virus concentrate material of the present invention includes:
a step of preparing a cellulose membrane (S11);
Coating the surface of the fibers of the cellulose membrane with one or more polymers selected from polymers having cationic groups (S12);
including. An example of this manufacturing method is shown in FIG.
（セルロース膜の準備（Ｓ１１））
まず、セルロース膜２を準備する。セルロース膜２の材料は、市販のペーパーフィルタ、不溶性の紙、その他の市販のセルロース製シート材でもよいし、公知の方法によって作製されたセルロース製シート材でもよい。
(Preparation of cellulose membrane (S11))
First, a
ペーパーフィルタ状のセルロース膜２の作製方法の一例について説明する。
セルロース膜２の原料として、精製されたα－セルロース、及び／又は天然由来のセルロース原料を準備する。天然由来のセルロース原料は、綿糸、麻、ヤシ、パルプ、その他の植物原料から選択された１種又は２種以上であり得る。
これらのセルロース原料を水と混合し、セルロース原料を膨潤させる。膨潤させたセルロース原料を、叩解機等を用いて叩きほぐす。その後、必要に応じて貯蔵・除塵する。続いて、抄紙機を用いて、膨潤したセルロース原料を網上に薄く延ばし、このセルロース原料から水を除き、乾燥させる。乾燥したシートをロール等によって巻取り、必要に応じて仕上げ加工する。そして、このシートを所定の形状に切断することで、セルロース膜２が作製される。
An example of a method for producing a paper filter-
As a raw material for the
These cellulose raw materials are mixed with water to swell the cellulose raw materials. The swollen cellulose raw material is beaten using a beating machine or the like. After that, store and remove dust as necessary. Subsequently, using a paper machine, the swollen cellulose raw material is spread thinly on a mesh, water is removed from the cellulose raw material, and the cellulose raw material is dried. The dried sheet is wound up using a roll or the like, and finishing processing is performed as necessary. Then, the
セルロース膜２に用いることができる市販のシート材としては、例えば、ペーパーフィルタ（濾紙）が好ましく、定性濾紙がより好ましい。定性濾紙は、比較的安価に入手できることに加えて、薄さと強度のバランスが良く、セルロース膜２の材料として適している。
また、セルロース膜２に適した市販のシート材を選択する際には、上述の範囲の厚み、坪量、保留粒子径、及び／又は濾水時間を有するものを選択することが好ましい。
市販のシート材を所定の形状に切断することで、セルロース膜２が作製される。
As a commercially available sheet material that can be used for the
Furthermore, when selecting a commercially available sheet material suitable for the
（ポリマーによる被覆処理（Ｓ１２））
続いて、セルロース膜２の繊維Ｆの表面を、カチオン性基を有するポリマーから選ばれる１種以上のポリマーで被覆する。これにより、繊維の表面の親水性を高め、かつ、正に帯電させることができ、ウイルス吸着性を高めることができる。
(Polymer coating treatment (S12))
Subsequently, the surface of the fibers F of the
本工程では、例えば、形成されたセルロース膜２を上記ポリマーの溶液に接触させる。接触方法としては、セルロース膜２をポリマー溶液に浸漬させることが好ましく、あるいは、セルロース膜２にポリマー溶液を噴霧等してもよい。
In this step, for example, the formed
ポリマー溶液は、水、又は水溶性の液状の媒体にポリマーを溶解させた液であり、例えば脱イオン水等の精製水又は緩衝液にポリマーを溶解させた液とすることができる。
ポリマー溶液におけるポリマーの濃度は、繊維Ｆ上に十分な量のポリマーを付与する観点から、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．３質量％以上である。
また、コストを抑える観点から、当該濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。
The polymer solution is a solution in which a polymer is dissolved in water or a water-soluble liquid medium, and can be, for example, a solution in which a polymer is dissolved in purified water such as deionized water or a buffer solution.
The concentration of the polymer in the polymer solution is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.3% by mass or more from the viewpoint of providing a sufficient amount of polymer on the fibers F.
Further, from the viewpoint of reducing costs, the concentration is preferably 10% by mass or less, more preferably 5% by mass or less.
ポリマー溶液にセルロース膜２を浸漬させる場合の浸漬時間は、繊維Ｆ上に十分な量のポリマーを付与する観点から、好ましくは１分間以上、より好ましくは３分間以上である。
また、生産性を高める観点から、当該浸漬時間は、好ましくは１０時間以下、より好ましく３時間以下である。
本工程におけるポリマー溶液の温度は、繊維Ｆに対してポリマーを効率よく付与するとともに、繊維Ｆの変性を防止する観点から、好ましくは４℃以上６０℃以下である。
The immersion time when the
Moreover, from the viewpoint of increasing productivity, the immersion time is preferably 10 hours or less, more preferably 3 hours or less.
The temperature of the polymer solution in this step is preferably 4° C. or more and 60° C. or less from the viewpoint of efficiently applying the polymer to the fibers F and preventing modification of the fibers F.
なお、２種以上のポリマーを用いる場合には、各ポリマーの処理後にセルロース膜２を脱イオン水等で洗浄することが好ましい。また、工程Ｓ２の後に、必要に応じて、セルロース膜２を乾燥してもよい。乾燥方法としては、例えば、風乾、加熱による乾燥、自然乾燥等から選ばれる１又は２以上の公知の乾燥方法を用いることができる。このうち、セルロース膜２の変性を防止しつつ、生産性を高める観点から、風乾が好ましく用いられる。乾燥温度は、セルロース膜２の変性を防止する観点から、好ましくは４℃以上６０℃以下である。
Note that when two or more types of polymers are used, it is preferable to wash the
［ウイルス濃縮方法］
本発明のウイルス濃縮方法は、本発明のウイルス濃縮材１を準備する工程（Ｓ２０）と、セルロース膜２を検査対象液と接触させることで、検査対象液中の標的ウイルスを濃縮する工程（Ｓ２１）と、を含む。この例は、図５（Ａ）に示されている。
本発明のウイルス濃縮方法において、検査対象液は、生体由来の採取物を検体として含んでいてもよく、あるいは非生体由来の検体を含んでいてもよい。非生体由来の検体の例については、後述する。
上記生体由来の採取物としては、例えば、気管スワブ、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等が挙げられる。
採取物が固形物を含む場合は、検査対象液は、当該固形物を適当な検体処理液によって懸濁させた液体であってもよい。
検査対象液は、気管スワブ、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿等から選ばれる１又は２以上の生体の体液を含んでいるのが好ましく、詳細を後述するように、唾液を含んでいるのがより好ましい。なお、この場合、検査対象液中のウイルスの濃度をより高める観点から、検査対象液が唾液そのものであることがより一層好ましい。
[Virus concentration method]
The virus concentration method of the present invention includes the step of preparing the
In the virus concentration method of the present invention, the test liquid may contain a specimen derived from a living body or a specimen derived from a non-living body. Examples of specimens derived from non-living organisms will be described later.
Examples of the above-mentioned biological samples include tracheal swabs, nasal swabs, throat swabs, nasal washings, nasal aspirates, nasal discharge, saliva, sputum, blood, serum, urine, feces, tissues, cells, Examples include crushed tissue or cells.
When the sample contains solid matter, the liquid to be tested may be a liquid in which the solid matter is suspended in an appropriate specimen processing liquid.
The liquid to be tested is one or more biological body fluids selected from tracheal swabs, nasal swabs, throat swabs, nasal washings, nasal aspirates, nasal discharge, nose blows, saliva, sputum, blood, serum, urine, etc. Preferably, it contains saliva, and more preferably, it contains saliva, as will be described in detail later. In this case, from the viewpoint of further increasing the concentration of the virus in the liquid to be tested, it is even more preferable that the liquid to be tested is saliva itself.
本発明のウイルス濃縮方法は、好ましくは、
（１）容器に採取された検査対象液中にウイルス濃縮材１を浸漬させて濃縮する方法、
（２）容器に採取された検査対象液をウイルス濃縮材１によってフィルトレーションして濃縮する方法、
（３）検査対象をセルロース膜２により拭い、検査対象液中のウイルスを濃縮する方法、
の少なくとも一つを含む。
以下、（１）を実施形態１、（２）を実施形態２、（３）を実施形態３として、それぞれ説明する。
The virus concentration method of the present invention preferably includes:
(1) A method of concentrating the
(2) A method of filtering and concentrating the test liquid collected in a container using the
(3) A method of wiping the test target with a
Contains at least one of the following.
Hereinafter, (1) will be described as
（１）実施形態１
本実施形態のウイルス濃縮方法は、例えば、本発明のウイルス濃縮材１を準備する工程（Ｓ２０）と、容器に検査対象液を採取する工程（Ｓ２２）と、濃縮工程（Ｓ２１）と、を含む。この例は、図５（Ｂ）に示されている。
(1)
The virus concentration method of the present embodiment includes, for example, a step of preparing the
（検体採取工程（Ｓ２２））
本工程では、公知の方法により容器に検査対象液を採取する。
容器は、十分な量の検査対象液を収容可能であり、かつ、セルロース膜の挿入及び取り出しが可能なサイズを有する。容器の容量は、好ましくは１ｍＬ以上、より好ましくは５ｍＬ以上であり、好ましくは５０ｍＬ以下、より好ましくは１５ｍＬ以下である。容器は、具体的には、遠沈管、コップ等で構成される。容器としては、好ましくは、本発明のウイルス濃縮キットに含まれる容器を用いることができる。
検査対象液の採取方法は、検体の種類により適切な方法を選択することができる。
例えば、検査対象液が唾液、痰等の体液を含む場合は、容器に直接体液を採取してもよい。
あるいは、綿棒、スワブ又はシリンジ等の検体採取具を用いて採取した採取物を容器に入れてもよい。この場合、採取物が液体の場合は、当該採取物を検査対象液として用いてもよいし、当該採取物に適当な処理液を加えて検査対象液を調製してもよい。
(Sample collection step (S22))
In this step, a liquid to be tested is collected into a container using a known method.
The container has a size that is capable of containing a sufficient amount of the liquid to be tested and that allows insertion and removal of the cellulose membrane. The capacity of the container is preferably 1 mL or more, more preferably 5 mL or more, and preferably 50 mL or less, more preferably 15 mL or less. Specifically, the container is composed of a centrifuge tube, a cup, and the like. As the container, preferably, a container included in the virus concentration kit of the present invention can be used.
An appropriate method for collecting the liquid to be tested can be selected depending on the type of specimen.
For example, if the liquid to be tested includes body fluids such as saliva and sputum, the body fluids may be collected directly into a container.
Alternatively, a sample collected using a specimen collection device such as a cotton swab, swab, or syringe may be placed in a container. In this case, if the collected material is a liquid, the collected material may be used as the liquid to be tested, or a suitable processing liquid may be added to the collected material to prepare the liquid to be tested.
本実施形態において、検査対象液は、生体の体液として唾液を含むことがより好ましい。これにより、検査対象が苦痛を伴うことなく検体を採取することができる。また、検査対象である被験者自身で検体を採取することが可能となり、検体採取時における医療従事者への感染が抑制される。さらに、検体の採取時に飛沫が飛ぶ可能性が低減され、これによっても周囲への感染が抑制される。
本実施形態では、検査対象液が唾液を含む場合であっても、後述する濃縮工程によって十分にウイルスが濃縮されるため、検出感度の良好なウイルス検査を行うことができる。
In this embodiment, it is more preferable that the liquid to be tested includes saliva as a biological fluid. This allows the specimen to be collected without causing any pain to the test subject. In addition, it becomes possible for the subject to be tested to collect the specimen himself, thereby suppressing infection of medical workers during specimen collection. Furthermore, the possibility of droplets flying during sample collection is reduced, which also reduces infection to the surrounding area.
In the present embodiment, even if the liquid to be tested contains saliva, the virus is sufficiently concentrated in the concentration step described below, so that a virus test with good detection sensitivity can be performed.
セルロース膜と検査対象液とを十分に接触させる観点から、検査対象液の量は、好ましくは０．１ｍＬ以上、より好ましくは０．５ｍＬ以上であり、好ましくは１０ｍＬ以下、より好ましくは５ｍＬ以下である。 From the viewpoint of sufficient contact between the cellulose membrane and the liquid to be tested, the amount of the liquid to be tested is preferably 0.1 mL or more, more preferably 0.5 mL or more, and preferably 10 mL or less, more preferably 5 mL or less. be.
さらに、検査対象液が唾液等の生体の体液を含んでいる場合、濃縮工程（Ｓ２１）前に、検査対象液にキレート剤を添加することが好ましい。これにより、濃縮工程における濃縮率を安定的に高めることができる。キレート剤としては特に限定されず、例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、ＤＨＥＧ、クエン酸、ＭＧＤＡ、ＧＬＤＡ等から選択される１種又は２種以上を用いることができる。例えば、キレート剤は、アミノカルボン酸系のキレート剤が好ましく、ＥＤＴＡがより好ましい。
検査対象液に対するキレート剤の濃度は、上記作用効果を十分に得る観点から、好ましくは０．０００５ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．００５ｍｏｌ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上である。また、当該濃度の上限値については特に限定されないが、好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以下である。
Furthermore, when the test target liquid contains biological body fluids such as saliva, it is preferable to add a chelating agent to the test target liquid before the concentration step (S21). Thereby, the concentration rate in the concentration step can be stably increased. The chelating agent is not particularly limited, and for example, one or more selected from EDTA, NTA, DTPA, HEDTA, GEDTA, TTHA, HIDA, DHEG, citric acid, MGDA, GLDA, etc. can be used. For example, the chelating agent is preferably an aminocarboxylic acid-based chelating agent, and more preferably EDTA.
The concentration of the chelating agent in the test liquid is preferably 0.0005 mol/L or more, more preferably 0.005 mol/L or more, and even more preferably 0.05 mol/L or more, from the viewpoint of sufficiently obtaining the above effects. It is. Further, the upper limit of the concentration is not particularly limited, but is preferably 1 mol/L or less, more preferably 0.5 mol/L or less.
（濃縮工程（Ｓ２１））
本実施形態の濃縮工程では、容器に採取された検査対象液にセルロース膜２を浸すことで、検査対象液中の標的ウイルスを濃縮する。
本工程では、例えば、ウイルス濃縮材１のユーザが、セルロース膜２をピンセット等で把持して、検査対象液にセルロース膜２を浸してもよい。
検査対象液にセルロース膜２を浸すことで、図３を用いて説明したように、セルロース膜２に固定されたポリマー３に、検査対象液中のウイルスが結合する。これにより、検査対象液中のウイルスがセルロース膜２上に集められ、当該ウイルスが濃縮される。
濃縮率を高める観点から、セルロース膜２は、検査対象液中で攪拌又は振とうされてもよい。これにより、検査対象液中におけるウイルスとセルロース膜２との接触機会が高められ、セルロース膜２上により多くのウイルスが吸着され得る。
浸漬時間は、セルロース膜２と検査対象液中のウイルスとを十分に接触させるとともに、濃縮工程を効率よく行う観点から、好ましくは６０秒以上、より好ましくは３００秒以上であり、好ましくは９００秒以下、より好ましくは６００秒以下である。
セルロース膜２の浸漬後、セルロース膜２を検査対象液から分離する。これにより、セルロース膜２上に集められたウイルスも検査対象液から分離され、ウイルスの濃縮が可能となる。
(Concentration step (S21))
In the concentration step of this embodiment, the target virus in the test liquid is concentrated by immersing the
In this step, for example, the user of the
By immersing the
From the viewpoint of increasing the concentration rate, the
The immersion time is preferably 60 seconds or more, more preferably 300 seconds or more, and preferably 900 seconds, from the viewpoint of sufficiently contacting the
After the
上記実施形態のウイルス濃縮方法では、本発明のウイルス濃縮材１を用いることで、セルロース膜２の単位質量あたりに吸着するウイルス量が多くなり、ウイルスの濃縮率が向上する。したがって、上記濃縮工程によって濃縮されたウイルスをウイルス検査に用いることで、検査試料におけるウイルス濃度が向上し、ウイルス検査の検出感度が向上する。
また、上記ウイルス濃縮方法では、セルロース膜２を検査対象液に浸すといった非常に簡便な操作でウイルスの濃縮が行われる。これにより、迅速かつ大量に、適切なウイルス検査の結果が得られ、ウイルス検査の効率化に大きく寄与できる。この結果、感染防止策がより適切に講じられ、ウイルス感染症の拡大が防止される。
In the virus concentration method of the above embodiment, by using the
Moreover, in the above virus concentration method, the virus is concentrated by a very simple operation such as immersing the
（２）実施形態２
本実施形態の濃縮工程（Ｓ２１）では、検査対象液をウイルス濃縮材１によってフィルトレーションすることで、検査対象液中の標的ウイルスを濃縮する。
「フィルトレーション」とは、検査対象液を、フィルタ状に構成されたウイルス濃縮材１に通液させる処理を意味する。フィルトレーションの一例が、図６に示される。
図６に示す例では、まず、フィルタユニット１０のハウジング１１にウイルス濃縮材１を装着する。ハウジング１１は、第１端部１１ａ及び第２端部１１ｂを含み、第１端部１１ａ及び第２端部１１ｂ間に流路が形成される。ウイルス濃縮材１は、例えば、一対の吸着面２ｓが液体の流れ方向（図６の白抜き矢印の方向）に対してほぼ垂直となるように、ハウジング１１の内部に配置される。
そして、検査対象液Ｌを含むシリンジ１２を、ハウジング１１の第１端部１１ａに装着する。
続いて、シリンジ１２のプランジャ１２ａを押圧する。これにより、検査対象液Ｌが加圧され、ウイルス濃縮材１を通過する。この際、検査対象液Ｌ中のウイルスＶがウイルス濃縮材１に接触して吸着される。
通液後、ウイルス濃縮材１をフィルタユニット１０から回収する。セルロース膜２には検査対象液中のウイルスＶが吸着されるため、ウイルスＶの濃縮が可能となる。
(2)
In the concentration step (S21) of this embodiment, the target virus in the test liquid is concentrated by filtering the test liquid using the
"Filtration" refers to a process in which a liquid to be tested is passed through a
In the example shown in FIG. 6, first, the
Then, the
Subsequently, the
After passing through the liquid, the
（３）実施形態３
本実施形態の濃縮工程では、検査対象液が付着した検査対象をセルロース膜２で拭うことで、検査対象液中の標的ウイルスを濃縮する（Ｓ２１）。この例は、図５（Ａ）及び（Ｃ）に示されている。
「検査対象」とは、検査の対象となる検体の採取元を意味し、ヒト（被験者）及び家畜等の生体の一部、並びに非生体を含む。
本工程では、例えば、ウイルス濃縮材１のユーザが、セルロース膜２をピンセット等で把持して、検査対象をセルロース膜２で拭ってもよい。
検査対象が生体の場合には、例えば、検査対象液である体液が付着した検査対象を上記セルロース膜２で拭う。当該体液が付着した検査対象としては、鼻腔、咽頭等が挙げられる。これにより、体液中のウイルスがセルロース膜２に吸着し、ウイルスが濃縮される。
(3)
In the concentration step of this embodiment, the target virus in the test liquid is concentrated by wiping the test object to which the test liquid has adhered with the cellulose membrane 2 (S21). An example of this is shown in FIGS. 5A and 5C.
"Test subject" means a source from which a specimen to be tested is collected, and includes parts of living bodies such as humans (subjects) and domestic animals, as well as non-living bodies.
In this step, for example, the user of the
When the test object is a living body, for example, the
一方、本実施形態では、検査対象が非生体の固体であってもよい。非生体の固体としては、例えば、ドアノブ、机、便器、キーボード等の操作盤、マウス等の入力装置、スイッチ、床、壁、下水、河川等の水、土壌、屋内又は屋外の空気等が挙げられる。
この場合は、濃縮工程の前に、セルロース膜２又は固体の表面を、検査対象液の媒体で濡らす工程（Ｓ２３）をさらに含み、濃縮工程では、当該固体の表面をセルロース膜２で拭ってもよい。この例は、図５（Ｃ）に示されている。
検査対象液の媒体は、検査対象液に含まれる液体であって、検査対象上のウイルスとセルロース膜２に固定されたポリマー３との結合を可能とする液体である。当該媒体は、例えば、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）等の緩衝液やＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等の界面活性剤、あるいはエタノール等の有機溶媒から選ばれる１種又は２種以上の成分を含む。
セルロース膜２を媒体で濡らす方法としては、例えば、上記媒体にセルロース膜２を浸漬させる方法、上記媒体をセルロース膜２に噴霧する方法等が挙げられる。
上記固体の表面を媒体で濡らす方法としては、例えば、上記媒体を上記固体の表面に噴霧する方法、上記媒体を上記固体の表面に注ぐ方法等が挙げられる。
セルロース膜２又は固体の表面を上記媒体で濡らした後に、固体の表面をセルロース膜２で拭うことで、媒体で濡れた状態のセルロース膜２にウイルスが吸着し得る。このセルロース膜２に付着したウイルス及び媒体を含む液体が、検査対象液として扱われる。
On the other hand, in this embodiment, the object to be inspected may be a non-living solid. Examples of non-living solids include doorknobs, desks, toilets, operation panels such as keyboards, input devices such as mice, switches, floors, walls, sewage, water from rivers, soil, indoor or outdoor air, etc. It will be done.
In this case, before the concentration step, it further includes a step (S23) of wetting the
The medium of the liquid to be tested is a liquid contained in the liquid to be tested, and is a liquid that allows the virus on the test object to bind to the
Examples of the method of wetting the
Examples of the method of wetting the surface of the solid with the medium include a method of spraying the medium onto the surface of the solid, a method of pouring the medium onto the surface of the solid, and the like.
By wetting the
本実施形態のウイルス濃縮方法では、本発明のウイルス濃縮材１のセルロース膜２によって検査対象を拭うことで、従来用いられていた検体採取方法と比較して、より多くのウイルスを採取することができる。これにより、ウイルスが効率よく濃縮され、ウイルス検査の検出感度が高められる。
さらに、多くの人が接触する可能性のあるドアノブ、机、操作盤等の非生体の固体に対しても、容易に、かつ高い感度でウイルス検査を行うことができる。したがって、本発明は感染源の特定等の疫学的調査にも有用であり、感染拡大の防止に大きく貢献できる。
In the virus concentration method of this embodiment, by wiping the test object with the
Furthermore, non-living solid objects such as doorknobs, desks, and operation panels that many people may come into contact with can be tested for viruses easily and with high sensitivity. Therefore, the present invention is also useful for epidemiological investigations such as identifying the source of infection, and can greatly contribute to preventing the spread of infection.
［ウイルス検査方法］
本発明は、さらに、ウイルス検査方法を提供する。
本発明のウイルス検査方法は、本発明のウイルス濃縮材１を準備する工程（Ｓ２０）と、セルロース膜２を検査対象液と接触させることで、検査対象液中の標的ウイルスを濃縮する工程（Ｓ２１）と、濃縮された標的ウイルスを検出する工程（Ｓ３１）と、を含む。この例は、図７（Ａ）に示されている。
さらに、本発明のウイルス検査方法は、上記検出工程の前に、検査対象液と接触させたセルロース膜２から標的ウイルスを抽出する工程（Ｓ３２）を含んでもよい。この例は、図７（Ｂ）に示されている。
上記ウイルスの濃縮工程は、上述の「ウイルス濃縮方法」の項において説明した濃縮工程と同様であるため、説明を省略する。
[Virus testing method]
The present invention further provides a virus testing method.
The virus testing method of the present invention includes the step of preparing the
Furthermore, the virus testing method of the present invention may include, before the detection step, a step (S32) of extracting the target virus from the
The virus concentration step described above is the same as the concentration step explained in the section of the above-mentioned "Virus concentration method," so the explanation will be omitted.
（抽出工程（Ｓ３２））
本工程では、濃縮工程後のセルロース膜２から、公知のウイルス抽出方法を用いてウイルスを抽出することができる。
例えば、濃縮工程後のセルロース膜２を、公知のウイルス抽出液に浸すことで、ウイルスがセルロース膜２から分離され、抽出される。当該ウイルス抽出液は、例えば、界面活性剤、緩衝液等を含む。本工程では、必要に応じて、ウイルス抽出液中におけるセルロース膜２の攪拌、ウイルス抽出液の加熱等が行われてもよい。
抽出工程後のウイルス抽出液は、そのままウイルスの検出工程に用いられてもよいし、さらに希釈液等によって調製されてもよい。
本発明のウイルス検査方法が上記抽出工程を含むことで、濃縮後のウイルスがセルロース膜２から分離され、検出工程において取り扱いやすくなる。
(Extraction step (S32))
In this step, viruses can be extracted from the
For example, the virus is separated from the
The virus extract after the extraction step may be used as it is in the virus detection step, or may be further prepared with a diluted solution or the like.
By including the above extraction step in the virus testing method of the present invention, the concentrated virus is separated from the
（検出工程（Ｓ３１））
本工程では、濃縮工程後のセルロース膜２から、公知のウイルス検出方法を用いてウイルスを検出することができる。
本工程におけるウイルス検出方法は、抗原検査によるウイルスタンパク質の検出方法、又は遺伝子検査による核酸の検出方法を含む。
抗原検査は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法等の抗原抗体反応を利用した方法が挙げられる。
遺伝子検査としては、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。
抗原検査によってウイルスタンパク質を検出する場合には、例えば、濃縮後のウイルス抽出液に対して、当該ウイルスのタンパク質に結合可能な抗体を反応させ、ウイルスを検出することができる。
遺伝子検査によってウイルスを検出する場合には、例えば、濃縮後のウイルス抽出液又はウイルスが吸着されたセルロース膜に対して核酸抽出処理を行い、当該抽出された核酸を用いて核酸増幅処理を行い、当該ウイルスの核酸を検出することができる。
(Detection step (S31))
In this step, viruses can be detected from the
The virus detection method in this step includes a virus protein detection method using an antigen test or a nucleic acid detection method using a genetic test.
Antigen tests include methods that utilize antigen-antibody reactions, such as ELISA and immunochromatography.
Examples of genetic testing include PCR method, real-time PCR method, and LAMP method.
When detecting a viral protein by an antigen test, for example, the virus can be detected by reacting a concentrated virus extract with an antibody capable of binding to the protein of the virus.
When detecting a virus by genetic testing, for example, a nucleic acid extraction process is performed on the concentrated virus extract or a cellulose membrane to which the virus has been adsorbed, and the extracted nucleic acid is used to perform a nucleic acid amplification process. The nucleic acid of the virus can be detected.
本発明のウイルス検査方法では、本発明のウイルス濃縮材１を用いることで、上述のようにウイルスの濃縮率が向上し、ウイルス検査の感度が高められる。さらに、簡便な操作で迅速にウイルスが濃縮されることで、大量の検体のウイルス検査が可能となり、感染防止策がより適切に講じられる。したがって、本発明は、感染防止の拡大に大きく貢献できる。
In the virus testing method of the present invention, by using the
［ウイルス濃縮キット］
本発明のウイルス濃縮材は、ウイルス検査において検査対象液中のウイルスを濃縮するためのウイルス濃縮キットに用いられてもよい。
一実施形態において、本発明のウイルス濃縮キット４は、ウイルス濃縮材１と、容器５と、を備えることが好ましい。
ウイルス濃縮材１は、上述の「ウイルス濃縮材」の項において説明した構成を有し、具体的には、繊維Ｆを含みα－セルロースを主成分とする柔軟なセルロース膜２と、繊維Ｆを被覆しカチオン基を有するポリマーから選ばれる１種以上のポリマー３と、を有する。この例は、この例は、図８及び図９に示されている。
なお、図８では、図示の都合上、容器５に対するウイルス濃縮材１の大きさが実際よりも大きくなるように記載している。
[Virus concentration kit]
The virus concentration material of the present invention may be used in a virus concentration kit for concentrating viruses in a liquid to be tested in a virus test.
In one embodiment, the
The
In addition, in FIG. 8, for convenience of illustration, the size of the
容器５は、ウイルス濃縮材１と、標的ウイルスの検査のための検査対象液と、を内部に保持することが可能な器物である。
本発明において、「容器」は、検査対象液を貯留できる構成に限定されず、図６で説明したハウジング１１のように、流路として検査対象液を一時的に保持できる構成も含むものとする。また、「検査対象液が容器５の内部に保持される」とは、一検体の検査対象液の全てが一度に容器５の内部に収容される態様に限られず、検査対象液が少量ずつ容器５の内部に流入するような態様を含む。
また、「ウイルス濃縮材１が容器５の内部に保持される」とは、ウイルス濃縮材１が容器５の内部に配置されればよく、ウイルス濃縮材１が容器５に対して固定されることを要しない。
容器５は、滅菌されていることが好ましく、例えば滅菌可能なプラスチック、ガラス等で構成される。
The
In the present invention, the "container" is not limited to a structure capable of storing a liquid to be tested, but also includes a structure capable of temporarily holding a liquid to be tested as a flow path, like the
Furthermore, "the
The
容器５は、例えば、唾液等の検査対象液を採取するための検体採取容器、又は検体採取具によって採取された検体が処理された検体処理液を収容可能な容器であることが好ましく、検体採取容器であることがより好ましい。この例は、図８に示されている。
図８に示す例において、容器５は、セルロース膜２の挿入及び取り出しが可能なサイズで構成され、その容量は、好ましくは１ｍＬ以上、より好ましくは５ｍＬ以上であり、現実的には５０ｍＬ以下、又は１５ｍＬ以下である。容器５は、具体的には、遠沈管、コップ等で構成される。容器５において、「セルロース膜２の挿入及び取り出しが可能である」とは、セルロース膜２が、ウイルスに対する濃縮能を損なうことなく、容器５の内部まで挿入可能であり、かつ、容器５の内部から取り出されることを意味する。
The
In the example shown in FIG. 8, the
あるいは、容器５は、図６を用いて説明した、ウイルス濃縮材１を用いたフィルトレーションを行う際のフィルタユニット１０のハウジング１１として構成されてもよい。つまり、容器５内にウイルス濃縮材１をセットすることで、フィルタユニット１０として構成されてもよい。この例は、図９に示されている。
容器５（ハウジング１１）は、第１端部１１ａ及び第２端部１１ｂを含む。第１端部１１ａは、検査対象液を含むシリンジ等を取り付けることが可能に構成される。第２端部１１ｂは、フィルトレーションされたフロースルーが流出する。
この例において、ウイルス濃縮材１は、図９に示すように容器５（ハウジング１１）の内部にセットされた状態であってもよい。あるいは、ウイルス濃縮材１は、容器５（ハウジング１１）とは別体で流通され、ユーザにより容器５内にセットされてもよい。
また、容器５は、ウイルス濃縮材１が配置可能な断面形状を有していればよい。容器５の断面形状は、セルロース膜２の平面形状に応じた断面形状であることが好ましく、例えば円形状であることが好ましい。容器５の断面形状が円形状である場合の内径は、例えば５ｍｍ以上１００ｍｍ以下とすることができる。
なお、この例では、ウイルス濃縮キット４は、フィルタユニットのハウジングとしての容器５の他に、図８で示した検査対象液を採取及び／又は収容するための容器をさらに有していてもよい。また、ウイルス濃縮キット４は、図６で示すシリンジをさらに有していてもよい。
このようなウイルス濃縮キット４によっても、フィルトレーションによってウイルスの濃縮が可能となる。
Alternatively, the
The container 5 (housing 11) includes a
In this example, the
Further, the
In addition, in this example, the
Such a
上記構成のウイルス濃縮キット４によれば、ウイルス濃縮材１と容器５とが提供される。これにより、ウイルスの濃縮処理がより簡便に行われるとともに、当該濃縮処理におけるウイルスの濃縮率が高められる。
According to the
［ウイルス検査キット］
本発明のウイルス濃縮材は、ウイルス検査のためのウイルス検査キットに用いられてもよい。
本発明のウイルス検査キット６は、ウイルス濃縮材１と、容器５と、検査試薬７と、を備えることが好ましい。この例は、図８及び図９に示されている。
ウイルス濃縮材１及び容器５は、「ウイルス濃縮材」及び「ウイルス濃縮キット」の項で説明した構成を有するため、説明を省略する。
[Virus test kit]
The virus concentration material of the present invention may be used in a virus test kit for virus testing.
The
The
本発明のウイルス検査キット６は、ウイルスを検出可能なウイルス検査を行うためのキットである。本発明のウイルス検査キット６の対象となるウイルス検査としては、抗原検査及び遺伝子検査が挙げられる。
抗原検査は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法等の抗原抗体反応を利用した方法が挙げられる。
遺伝子検査としては、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。
The
Antigen tests include methods that utilize antigen-antibody reactions, such as ELISA and immunochromatography.
Examples of genetic testing include PCR method, real-time PCR method, and LAMP method.
検査試薬７は、セルロース膜２に付着した検査対象液を用いて標的ウイルスを検出するための検査試薬である。図８及び図９には、ウイルス検査キット６が１つの検査試薬７を含む例を示しているが、ウイルス検査キット６が複数の検査試薬を含んでいてもよい。
検査試薬７は、例えば、セルロース膜２に吸着されたウイルスをセルロース膜２から分離するためのウイルス抽出液を含んでいてもよい。ウイルス抽出液は、例えば、界面活性剤、緩衝液等を含む。ウイルス抽出液によってセルロース膜２からウイルスが分離されることで、濃縮されたウイルスを用いてウイルス検査の試料を容易に調製することができる。
例えば、ＥＬＩＳＡ法を対象とする検査試薬７は、上記ウイルス抽出液、酵素標識抗体含有液、基質液、洗浄液、希釈液等から選択された１又は２以上の試薬を含んでいてもよい。
例えば、イムノクロマト法を対象とする検査試薬７は、上記ウイルス抽出液を含んでいてもよい。
遺伝子検査を対象とする検査試薬７は、例えば、上記ウイルス抽出液、ウイルスから核酸を抽出する核酸抽出液、核酸増幅用試薬等から選択された１又は２以上の試薬を含んでいてもよい。
The
The
For example, the
For example, the
The
さらに、本発明のウイルス検査キット６は、必要に応じて、ウイルス検査に用いられる検査器具を含んでいてもよい。当該検査器具としては、イムノクロマト法に用いられる抗体等を含むニトロセルロース膜、検査試料滴下用のチップ、検査用プレート等が挙げられる。
Furthermore, the
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上述の実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
例えば、セルロース膜２の形状は、図１に示すものに限定されず、種々の形状を採り得る。例えば、セルロース膜２は、矩形状であってもよいし、他の形状であってもよい。
また、ウイルス濃縮材１は、セルロース膜及びポリマーの他、例えば、セルロース膜を保持する棒状の保持部材を備えていてもよい。これにより、ユーザが保持部材を把持してウイルスの濃縮処理を行うことが可能となり、利便性が高められる。
また、ウイルス濃縮キット４及びウイルス検査キット６は、図８及び図９に示した例に限定されず、本発明に包含される種々の形態を採り得る。
Although the embodiments of the present invention have been described above, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and it goes without saying that various changes can be made without departing from the gist of the present invention.
For example, the shape of the
In addition to the cellulose membrane and the polymer, the
Further, the
＜試験例１：検査対象液への浸漬によるウイルス濃縮材の濃縮能の検討＞
試験例１として、ポリマーによって被覆されたセルロース膜を作製し、検査対象液への浸漬によって当該ウイルスの濃縮が可能か否か、検討した。
<Test Example 1: Examination of concentration ability of virus concentration material by immersion in test target liquid>
As Test Example 1, a cellulose membrane coated with a polymer was prepared, and it was examined whether it was possible to concentrate the virus by immersing it in a liquid to be tested.
［ウイルス濃縮材の作製］
（セルロース膜の準備）
セルロース膜として、セルロースメンブレン１～３を準備した。セルロースメンブレン１～３は、いずれも、α－セルロースを９０質量％以上含む定性濾紙とした。セルロースメンブレン１～３は、人の手で容易に折り曲げることが可能であった。
セルロースメンブレン１として、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標） 定性濾紙 グレード１を準備した。セルロースメンブレン１の各パラメータは、以下の通りであった。厚さは１８０μｍ、坪量は８７ｇ／ｍ２であった。保留粒子径は１１μｍ、濾水時間は１５０秒であった。
セルロースメンブレン２として、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標） 定性濾紙 グレード４を準備した。セルロースメンブレン２の各パラメータは、以下の通りであった。厚さは２１０μｍ、坪量は９２ｇ／ｍ２であった。保留粒子径は２０－２５μｍ、濾水時間は３７秒であった。
セルロースメンブレン３として、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標） 定性濾紙 グレード５を準備した。セルロースメンブレン３の各パラメータは、以下の通りであった。厚さは２００μｍ、坪量は１００ｇ／ｍ２であった。保留粒子径は２．５μｍ、濾水時間は１４２０秒であった。
これらのセルロースメンブレン１～３を直径１０ｍｍの円形に切り出し、セルロース膜とした。
[Preparation of virus concentration material]
(Preparation of cellulose membrane)
As
As
As
These
（ポリマーの準備）
表１に示すポリマーサンプル１～６を準備した。
ポリマーサンプル１として、カチオン性基を有するポリマーである、ジアリルアミン塩酸塩ポリマーを含む、「ＰＡＳ－２１ＣＬ」（ニットーボーメディカル株式会社製）を準備した。
ポリマーサンプル２として、カチオン性基とアニオン性基を有するポリマーである、マレイン酸・ジアリルジメチルアンモニウムクロリド・二酸化硫黄コポリマーを含む、「ＰＡＳ－８４」（ニットーボーメディカル株式会社製）を準備した。
ポリマーサンプル３として、カチオン性基とアニオン性基を有するポリマーである、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドマレイン酸コポリマーを含む、「ＰＡＳ－２３５１」（ニットーボーメディカル株式会社製）を準備した。
ポリマーサンプル４として、アニオン性基を有するポリマーである、スチレン－マレイン酸コポリマーを含む、「アラスター７０３Ｓ」（荒川化学工業株式会社製）を準備した。
ポリマーサンプル５として、カチオン性基を有するポリマーである、塩化ジメチルジアリルアンモニウムのポリマーを含む、「Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標） １００ Ｐｏｌｙｍｅｒ」（ルブリゾール社製）を準備した。
(Preparation of polymer)
As
As
As
As
As
また、ポリマーサンプル６については、以下のように作製した。
カチオン性基を有するポリマーとして、９０ｍｏｌ％のジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート（ＤＭＥＭＡ）と、１０ｍｏｌ％のラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）とを構成単位とする、コポリマーの塩酸塩を合成した。当該コポリマーの塩酸塩を、ポリマーサンプル６とした。
上記コポリマーの合成方法は、次の方法に準じて行った。
温度計、撹拌機、滴下ロート、窒素導入管、及び還流冷却器を備えたガラス製反応容器に、溶媒として７１８質量部のジエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＤＧ）を仕込み、反応容器内を窒素置換した。その後窒素雰囲気下で反応容器内を７５℃まで昇温した。第１滴下ロートに、２１１９質量部のＤＭＥＭＡと３８１質量部のＬＭＡを混合し仕込んだ。第２滴下ロートに２，２'－Ａｚｏｂｉｓ（２，４－ｄｉｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）（Ｖ－６５）を４８８質量部のＭＤＧで溶解し仕込んだ。第１滴下ロート及び第２滴下ロートを６時間かけて反応容器に滴下し、７５℃にて滴下重合を行った。滴下終了後に７８℃に昇温し６時間熟成反応を行った。その後７８７質量部のＭＤＧを添加し、室温まで冷却した。１０２４質量部の０．１Ｍ塩酸を添加し混合後、コポリマー有効分３６．５％のポリマーサンプル６を得た。
なお、原料の使用量から算出されたモノマー単位のモル比（ＤＭＥＭＡ／ＬＭＡ）は９０／１０である。
ポリマーサンプル６の分子量は約１５０００であった。
Moreover,
As a polymer having a cationic group, a copolymer hydrochloride having constitutional units of 90 mol% dimethylaminoethyl (meth)acrylate (DMEMA) and 10 mol% lauryl methacrylate (LMA) was synthesized. The hydrochloride salt of the copolymer was designated as
The above copolymer was synthesized according to the following method.
A glass reaction vessel equipped with a thermometer, a stirrer, a dropping funnel, a nitrogen introduction tube, and a reflux condenser was charged with 718 parts by mass of diethylene glycol monomethyl ether (MDG) as a solvent, and the inside of the reaction vessel was purged with nitrogen. Thereafter, the temperature inside the reaction vessel was raised to 75° C. under a nitrogen atmosphere. A mixture of 2119 parts by mass of DMEMA and 381 parts by mass of LMA was charged into the first dropping funnel. 2,2'-Azobis (2,4-dimethylvaleronitrile) (V-65) was dissolved in 488 parts by mass of MDG and charged into the second dropping funnel. The mixture was dropped into the reaction vessel through the first dropping funnel and the second dropping funnel over a period of 6 hours, and dropwise polymerization was carried out at 75°C. After the dropwise addition was completed, the temperature was raised to 78°C, and an aging reaction was carried out for 6 hours. Thereafter, 787 parts by mass of MDG was added, and the mixture was cooled to room temperature. After adding and mixing 1024 parts by mass of 0.1M hydrochloric acid, a
Note that the molar ratio of monomer units (DMEMA/LMA) calculated from the amount of raw materials used is 90/10.
The molecular weight of
（実施例１）
セルロースメンブレン１に対し、ポリマーサンプル１を用いて表面処理を行い、表１に示す実施例１のサンプルを作製した。
まず、セルロースメンブレン１を１％ポリマー水溶液に浸漬し、室温で６０分間撹拌した。１％ポリマー水溶液は、緩衝液（ＰＢ：４７．３５ｍＭリン酸水素二ナトリウム＋２．６５ｍＭリン酸水素二ナトリウム）によってｐＨ８に調製されたものとした。処理後のセルロースメンブレンを脱イオン水で洗浄後、キムタオルで脱水し、風乾させた。
これにより、実施例１のサンプルを得た。
(Example 1)
First,
As a result, a sample of Example 1 was obtained.
（実施例２）
ポリマーサンプル２を用いて表面処理を行った以外は、実施例１と同様に、表１に示す実施例２のサンプルを作製した。
(Example 2)
Samples of Example 2 shown in Table 1 were prepared in the same manner as Example 1 except that
（実施例３）
ポリマーサンプル３を用いて表面処理を行った以外は、実施例１と同様に、表１に示す実施例３のサンプルを作製した。
(Example 3)
Samples of Example 3 shown in Table 1 were prepared in the same manner as Example 1 except that
（比較例１）
ポリマーサンプル４を用いて表面処理を行った以外は、実施例１と同様に、表１に示す比較例１のサンプルを作製した。
(Comparative example 1)
A sample of Comparative Example 1 shown in Table 1 was prepared in the same manner as in Example 1 except that
（実施例４）
ポリマーサンプル５を用いて表面処理を行った以外は、実施例１と同様に、表１に示す実施例４のサンプルを作製した。
(Example 4)
Samples of Example 4 shown in Table 1 were prepared in the same manner as Example 1 except that
（実施例５）
ポリマーサンプル６を用いて表面処理を行った以外は、実施例１と同様に、表１に示す実施例５のサンプルを作製した。
(Example 5)
A sample of Example 5 shown in Table 1 was prepared in the same manner as Example 1 except that
（実施例６）
セルロースメンブレン２を用いた以外は、実施例４と同様に、表１に示す実施例６のサンプルを作製した。
(Example 6)
A sample of Example 6 shown in Table 1 was prepared in the same manner as Example 4 except that
（実施例７）
セルロースメンブレン２を用いた以外は、実施例５と同様に、表１に示す実施例７のサンプルを作製した。
(Example 7)
A sample of Example 7 shown in Table 1 was prepared in the same manner as Example 5 except that
（実施例８）
セルロースメンブレン３を用いた以外は、実施例４と同様に、表１に示す実施例８のサンプルを作製した。
(Example 8)
A sample of Example 8 shown in Table 1 was prepared in the same manner as Example 4 except that
（実施例９）
セルロースメンブレン３を用いた以外は、実施例５と同様に、表１に示す実施例９のサンプルを作製した。
(Example 9)
A sample of Example 9 shown in Table 1 was prepared in the same manner as Example 5 except that
（比較例２）
ポリマーによる表面処理を行っていないセルロースメンブレン１を、比較例２のサンプルとした。
(Comparative example 2)
［濃縮能の評価］
（シュードウイルス溶液への浸漬及び振とう）
実施例１～３、比較例１～２のサンプルを、以下の手順でシュードウイルス溶液と接触させた。
サンプルを１枚ずつ、５ｍＬチューブ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄ ｔｕｂｅ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れた。ＰＢＳで１０００倍に希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿Ｓ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ、７．９７×１０＾８ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）溶液を２ｍＬ加え、インテリミキサー（株式会社トーホー）を用いて室温で転倒混和（振とう）した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス溶液を加えてから１分後，５分後，１０分後，及び３０分後の溶液の上清をそれぞれ回収した。
実施例４～９のサンプルについても、上述のようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス溶液に加えて転倒混和した。但し、これらのサンプルについては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス溶液を加えてから１０分後，３０分後，１時間後、及び２時間後の溶液の上清をそれぞれ回収した。
[Evaluation of concentration ability]
(Immersion in pseudovirus solution and shaking)
The samples of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2 were brought into contact with the pseudovirus solution according to the following procedure.
Each sample was placed in a 5 mL tube (Protein LoBind tube, Eppendorf). Add 2 mL of SARS-CoV-2_S pseudotyped lentivirus (Luciferase), Vector Builder, 7.97 x 10^8 copies/mL solution diluted 1000 times with PBS, and add Intellimixer ( Toho Co., Ltd. ) was used to mix (shake) by inversion at room temperature. The supernatant of the solution was collected 1 minute, 5 minutes, 10 minutes, and 30 minutes after adding the SARS-CoV-2 pseudovirus solution.
The samples of Examples 4 to 9 were also added to the SARS-CoV-2 pseudovirus solution and mixed by inversion as described above. However, for these samples, the supernatant of the solution was collected 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, and 2 hours after adding the SARS-CoV-2 pseudovirus solution.
（上清中のシュードウイルス量の測定）
回収した上清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス量を定量した。各上清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス量を測定するため、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス内の遺伝子コピー数の定量を行った。ｄｄＰＣＲにはＱＸ２００ ＡｕｔｏＤＧ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた。まず、ドロップレットを作成した。１サンプルあたり１１μＬのｄｄＰＣＲ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｘ２）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、０．３μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０．３μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、９．３μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、１．１μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス溶液を混合し、ドロップレット反応液を調製した。プライマーはＬｕｃｉ１Ｆ（５'－ＣＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＴＧＧＧＣＴＣＡＣ－３'：配列番号１）とＬｕｃｉ１Ｒ（５'－ＴＴＣＧＣＣＴＣＴＣＴＧＡＴＴＡＡＣＧＣ－３'：配列番号２）を用いた。反応液を２２μＬずつ９６ｗｅｌｌプレートに添加後、ＰＸ１ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１８０℃、５秒間の設定でホイルヒートシールによりシーリングし、ＡｕｔｏＤＧ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてドロップレットを作製した。全ドロップレットの作製が完了後、３０分以内にドロップレットプレートにホイルヒートシールでシーリングした。次のＰＣＲサイクリングは、シーリング後３０分以内に実施した。ＰＣＲは、ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒間と５８℃で１分間を４０サイクル、その後４℃で５分間、９０℃で５分間、４℃でインキュベートの条件で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは２℃／秒に設定した。ＰＣＲ後、ドロップレットプレートをプレートホルダーにセットし、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて陽性及び陰性ドロップレットをカウントした。データ解析にはＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた。Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄは５，０００に設定した。
(Measurement of pseudovirus amount in supernatant)
The amount of SARS-CoV-2 pseudovirus in the collected supernatant was quantified. In order to measure the amount of SARS-CoV-2 pseudovirus in each supernatant, the number of gene copies within the SARS-CoV-2 pseudovirus was quantified using Droplet Digital PCR (ddPCR). QX200 AutoDG Droplet Digital PCR system (Bio-Rad) was used for ddPCR. First, we created a droplet. 11 μL ddPCR EvaGreen Supermix (x2) (Bio-Rad) per sample, 0.3
図１０に実施例１～３、比較例１～２のサンプルの結果を示す。カチオン性基を有するポリマーでセルロースメンブレン１を被覆した実施例１～３のサンプルでは、振とうによってシュードウイルス濃度（ＰＴＶ濃度）が大きく低下した。特に、ポリマーサンプル１，２を用いた実施例１，２のサンプルでは、振とう開始から１分後以降の上清において、ほとんどウイルスが検出されなかった。この結果から、実施例１～３のサンプル、特に実施例１，２のサンプルは、ウイルスの吸着性が高く、ウイルスを濃縮できることが示された。
FIG. 10 shows the results of samples of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2. In the samples of Examples 1 to 3 in which the
図１１に実施例４～９のサンプルの結果を示す。カチオン性基を有するポリマーでセルロースメンブレン１～３を被覆した実施例４～９のサンプルにおいても、振とうによってシュードウイルス濃度（ＰＴＶ濃度）が大きく低下した。特に、ポリマーサンプル５を用いた実施例４，６，８のサンプルでは、振とう開始から１分後の上清において、ほとんどウイルスが検出されなかった。この結果から、実施例４～９のサンプル、特に実施例４，６，８のサンプルは、ウイルスの吸着性が高く、ウイルスを濃縮できることが示された。
また、実施例４～９では、保留粒子径等のパラメータの異なる３種類のセルロースメンブレンを用いたが、いずれにおいてもウイルスが吸着可能であることがわかった。
FIG. 11 shows the results of the samples of Examples 4 to 9. In the samples of Examples 4 to 9 in which
Furthermore, in Examples 4 to 9, three types of cellulose membranes with different parameters such as retention particle size were used, and it was found that viruses could be adsorbed in any of them.
＜試験例２：検査対象液のフィルトレーションによるウイルス濃縮材の濃縮能の検討＞
試験例２として、試験例１と同様の実施例４，５及び比較例１のサンプルと、新たに追加した実施例１０のサンプルとを、検査対象液のフィルトレーションに用いることで、ウイルスの濃縮が可能か否か検討した。
実施例１０のサンプルは、ポリマーサンプルとして、カチオン性基を有する「ε－ポリ－Ｌ－リジン」（ペプチド研究所）を用いて表面処理を行った以外は、実施例１と同様に作製された。つまり、実施例１０のサンプルは、セルロースメンブレン１にε－ポリ－Ｌ－リジンを表面処理したものとした。
<Test Example 2: Examination of concentration ability of virus concentration material by filtration of test liquid>
As Test Example 2, the samples of Examples 4 and 5 and Comparative Example 1, which are similar to Test Example 1, and the newly added sample of Example 10 were used for filtration of the test liquid, and the virus was detected. We investigated whether it is possible to concentrate it.
The sample of Example 10 was prepared in the same manner as Example 1, except that the surface treatment was performed using "ε-poly-L-lysine" (Peptide Institute) having a cationic group as a polymer sample. . That is, in the sample of Example 10,
［フィルトレーション］
複数の同一のフィルタユニット（ＷＩＮＮＥＸフィルターホルダー、３５ｍｍ、メルク株式会社製）を準備した（図６参照）。各フィルタユニットのハウジング内に、実施例４，５、１０及び比較例１のサンプルを１枚ずつ取り付けた。各サンプルは、フィルタ面（吸着面）が、液体の流れ方向と垂直になるように取り付けた。
５ｍＬシリンジに、試験例１で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス溶液を１ｍＬずつ吸引した。各シリンジの端部を、フィルタユニットの一端部に取り付けた。プランジャを押して５０μL／ｍｉｎの速さで送液した。フィルタユニットの他端部からフロースルーを回収した。
このフロースルーを、試験例１と同様にｄｄＰＣＲに供し、陽性及び陰性ドロップレットをカウントした。吸着率（％）は「（サンプルとの接触前のウイルス含有溶液中のコピー数－サンプルとの接触後の上清中のコピー数）／サンプルとの接触前のウイルス含有溶液中のコピー数×１００」により算出した。この結果を、図１２に示す。なお、図１２の各サンプルに対する２本のバーは、同様の手順の試験を２回行った際の結果をそれぞれ示す。
[Filtration]
A plurality of identical filter units (WINNEX filter holder, 35 mm, manufactured by Merck & Co., Ltd.) were prepared (see FIG. 6). One sample of Examples 4, 5, 10, and Comparative Example 1 was attached to the housing of each filter unit. Each sample was attached so that the filter surface (adsorption surface) was perpendicular to the flow direction of the liquid.
1 mL of the SARS-CoV-2 pseudovirus solution prepared in Test Example 1 was aspirated into a 5 mL syringe. The end of each syringe was attached to one end of the filter unit. The plunger was pressed to feed the liquid at a rate of 50 μL/min. Flow-through was collected from the other end of the filter unit.
This flow-through was subjected to ddPCR in the same manner as Test Example 1, and positive and negative droplets were counted. The adsorption rate (%) is "(number of copies in the virus-containing solution before contact with the sample - number of copies in the supernatant after contact with the sample) / number of copies in the virus-containing solution before contact with the sample x 100". The results are shown in FIG. 12. Note that the two bars for each sample in FIG. 12 each indicate the results of conducting a test using the same procedure twice.
［結果］
図１２に示すように、塩化ジメチルジアリルアンモニウムのホモポリマーを含む実施例４、及びε－ポリ－Ｌ－リジンを含む実施例１０のサンプルを用いた場合は、シュードウイルスの吸着率が１００％であった。また、ＤＭＥＭＡ／ＬＭＡのコポリマーを含む実施例５を用いた場合も、当該吸着率が６０～８０％と高かった。これらの結果より、実施例４，５，１０のサンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を吸着する能力が高く、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮できることが示された。
[result]
As shown in Figure 12, when the samples of Example 4 containing the homopolymer of dimethyldiallylammonium chloride and Example 10 containing ε-poly-L-lysine were used, the pseudovirus adsorption rate was 100%. there were. Furthermore, when Example 5 containing a DMEMA/LMA copolymer was used, the adsorption rate was as high as 60 to 80%. These results showed that the samples of Examples 4, 5, and 10 had a high ability to adsorb SARS-CoV-2 and were able to concentrate SARS-CoV-2.
１ ウイルス濃縮材
２ セルロース膜
２ｓ 吸着面
３ ポリマー
４ ウイルス濃縮キット
５ 容器
６ ウイルス検査キット
７ 検査試薬
1
Claims (15)
前記繊維を被覆し、カチオン基を有するポリマーから選ばれる１種以上のポリマーと、
を備えるウイルス濃縮材。 A flexible cellulose membrane containing fibers and mainly composed of α-cellulose,
One or more polymers selected from polymers having cationic groups and covering the fibers;
A virus concentration material comprising:
請求項１に記載のウイルス濃縮材。 The virus concentration material according to claim 1, wherein the cellulose membrane is configured in a filter shape.
請求項２に記載のウイルス濃縮材。 The virus concentration material according to claim 2, wherein the cellulose membrane has a retained particle diameter of 2.5 μm or more and 25 μm or less.
請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス濃縮材。 The virus concentration material according to any one of claims 1 to 3, wherein the cellulose membrane contains 90% by mass or more of α-cellulose.
請求項１から４のいずれか一項に記載のウイルス濃縮材。 The virus concentration material according to any one of claims 1 to 4, wherein the cellulose membrane has a basis weight of 80 g/m 2 or more and 200 g/m 2 or less.
請求項１から５のいずれか一項に記載のウイルス濃縮材。 The virus concentration material according to any one of claims 1 to 5, wherein the cellulose membrane contains 90% by mass or more of α-cellulose.
請求項１から６のいずれか一項に記載のウイルス濃縮材。 The polymers having a cationic group include polymers having constitutional units derived from dimethyldiallylammonium chloride, polymers having constitutional units derived from dialkylaminoalkyl (meth)acrylate, diallylamine copolymers, and polylysine (ε-poly-L The virus concentrate material according to any one of claims 1 to 6, comprising one or more selected from the group consisting of:
請求項１から７のいずれか一項に記載のウイルス濃縮材。 The virus concentrate material according to any one of claims 1 to 7, which targets enveloped viruses.
請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス濃縮材。 The virus concentrate material according to any one of claims 1 to 8, which targets SARS-CoV-2.
前記ウイルス濃縮材と、ウイルス検査のための検査対象液と、を内部に保持することが可能な容器と、
を備えるウイルス濃縮キット。 A virus concentrating material comprising a flexible cellulose membrane containing fibers and mainly composed of α-cellulose, and one or more polymers selected from polymers having cationic groups and covering the fibers;
a container capable of holding therein the virus concentration material and a test liquid for virus testing;
Virus concentration kit with.
前記ウイルス濃縮材と、ウイルス検査のための検査対象液と、を内部に保持することが可能な容器と、
前記セルロース膜に付着した前記検査対象液を用いて前記ウイルスを検出するための検査試薬と、
を備えるウイルス検査キット。 A virus concentrating material comprising a flexible cellulose membrane containing fibers and mainly composed of α-cellulose, and one or more polymers selected from polymers having cationic groups and covering the fibers;
a container capable of holding therein the virus concentration material and a test liquid for virus testing;
a test reagent for detecting the virus using the test target liquid attached to the cellulose membrane;
Virus test kit with.
前記セルロース膜を、ウイルス検査のための検査対象液と接触させることで、前記検査対象液中の前記ウイルスを濃縮する
ウイルス濃縮方法。 Prepare a virus concentration material having a flexible cellulose membrane containing fibers and mainly composed of α-cellulose, and one or more polymers selected from polymers having cationic groups and covering the fibers,
A method for concentrating viruses, comprising: bringing the cellulose membrane into contact with a liquid to be tested for virus testing to concentrate the virus in the liquid to be tested.
請求項１２に記載のウイルス濃縮方法。 The virus concentration method according to claim 12, wherein the test target liquid includes saliva.
前記セルロース膜を、ウイルス検査のための検査対象液と接触させることで、前記検査対象液中の前記ウイルスを濃縮し、
濃縮された前記ウイルスを検出する
ウイルス検査方法。 Prepare a virus concentration material having a flexible cellulose membrane containing fibers and mainly composed of α-cellulose, and one or more polymers selected from polymers having cationic groups and covering the fibers,
By bringing the cellulose membrane into contact with a liquid to be tested for virus testing, the virus in the liquid to be tested is concentrated;
A virus testing method for detecting the concentrated virus.
前記セルロース膜の繊維の表面を、カチオン性基を有するポリマーから選ばれる１種以上のポリマーで被覆する
ウイルス濃縮材の製造方法。 Prepare a flexible cellulose membrane containing fibers and mainly composed of α-cellulose,
A method for producing a virus concentration material, comprising coating the surface of the fibers of the cellulose membrane with one or more polymers selected from polymers having cationic groups.
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