JP2023135741A - Method for producing amino acid - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、アミノ酸の製造方法に関する。より詳しくは、ニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合物からグリシンなどのアミノ酸を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing amino acids. More specifically, the present invention relates to a method for producing amino acids such as glycine from nitrile compounds using nitrile hydratase.
グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、青酸、及びアンモニアからシュトレッカー法にて一旦アミノアセトニトリルを合成し、これを水酸化ナトリウム等のアルカリで加水分解しグリシンソーダとアンモニアに変換した後、硫酸等の酸で中和して製造されている。従来法は、アルカリや酸を多量に用いることに加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため廃棄物が多く、環境負荷が大きいという問題があった。 Glycine has traditionally been produced by first synthesizing aminoacetonitrile from formaldehyde, hydrocyanic acid, and ammonia using the Strecker method, then hydrolyzing this with an alkali such as sodium hydroxide to convert it into glycine soda and ammonia, and then using an acid such as sulfuric acid to convert it into glycine soda and ammonia. Manufactured by neutralization. In the conventional method, in addition to using large amounts of alkali and acid, a large amount of salts are produced as by-products in the neutralization process, resulting in a large amount of waste and a large environmental burden.
一方、アミノアセトニトリル(グリシノニトリル)を酵素的に加水分解してグリシンを得る方法も知られている。例えば、シュードモナス属sp.88-SB-CN5株をpH調整せずに反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法(特許文献1)、及び、アルカリゲネス属・フェカリスATCC8750株を同じくpH調整せずに反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法(特許文献2)が開示されている。 On the other hand, a method of enzymatically hydrolyzing aminoacetonitrile (glycinonitrile) to obtain glycine is also known. For example, there is a method in which Pseudomonas sp.88-SB-CN5 strain is suspended in a reaction solution without pH adjustment and used for hydrolysis reaction (Patent Document 1), and Alcaligenes faecalis ATCC8750 strain is suspended in a reaction solution without pH adjustment. A method (Patent Document 2) has been disclosed in which the suspension is suspended in a reaction solution and used for a hydrolysis reaction.
コリネバクテリウムN-774株をリン酸緩衝液でpH7.7に調整した反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法(特許文献3)、及び、ブレビバクテリウムR312株を苛性カリ等でpH8に調整した反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法(特許文献4)が開示されている。 A method in which Corynebacterium N-774 strain is suspended in a reaction solution adjusted to pH 7.7 with a phosphate buffer and used for a hydrolysis reaction (Patent Document 3), and Brevibacterium R312 strain is adjusted to pH 8 with caustic potash etc. A method is disclosed in which the suspension is suspended in a reaction solution and used for a hydrolysis reaction (Patent Document 4).
シュトレッカー法によってアミノアセトニトリルを合成する際には、グリコロニトリルを過剰量のアンモニアでアミノ化する方が効率的であるため、生成したアミノアセトニトリル水溶液中には未反応のアンモニアが残存し、pH10.5以上のアミノアセトニトリル水溶液になっていることが多い。しかし、従来の方法では、pH10.5以上の条件下で酵素的にグリシンを製造することはできなかった。 When synthesizing aminoacetonitrile by the Strecker method, it is more efficient to aminate glycolonitrile with an excess amount of ammonia, so unreacted ammonia remains in the aminoacetonitrile aqueous solution produced, and the pH It is often an aqueous aminoacetonitrile solution with a molecular weight of .5 or higher. However, with conventional methods, it has not been possible to enzymatically produce glycine under conditions of pH 10.5 or higher.
アルカリ耐性があるニトリラーゼとして、Pseudomonas sp. 13由来のニトリラーゼが、pH10.5まで安定性を有することが報告されている(非特許文献1)。しかし、その安定性には還元剤(メルカプトエタノール)の存在が必須であり、メルカプトエタノールの非存在下では完全に失活することが記載されている。 As a nitrilase with alkaline resistance, it has been reported that nitrilase derived from Pseudomonas sp. 13 has stability up to pH 10.5 (Non-Patent Document 1). However, the presence of a reducing agent (mercaptoethanol) is essential for its stability, and it has been described that it is completely inactivated in the absence of mercaptoethanol.
ジニトリル化合物に対する加水分解活性が高いニトリラーゼとして、Acidovorax facilis 72W由来のニトリラーゼが報告されている(非特許文献2及び特許文献5)。しかし、グリシンなどのアミノ酸の製造に使用することは記載されておらず、また、4-シアノペンタンニトリルを基質とした場合の至適pHは8-9であり、pH9以上では急激に活性が低下する旨が記載されている。 A nitrilase derived from Acidovorax facilis 72W has been reported as a nitrilase with high hydrolysis activity for dinitrile compounds (Non-Patent Document 2 and Patent Document 5). However, there is no mention of its use in the production of amino acids such as glycine, and the optimum pH when using 4-cyanopentanenitrile as a substrate is 8-9, and the activity decreases rapidly at pH 9 or higher. It is stated that.
上述のとおり、アミノアセトニトリルからグリシンを酵素的に生産する従来の方法では、ニトリラーゼのアルカリ耐性は低いと認識されており、pHが10.5未満の水溶液で反応させる必要があった。そのため、アミノアセトニトリル水溶液に含まれているアンモニアを除去してから反応させる必要があった。 As mentioned above, in the conventional method of enzymatically producing glycine from aminoacetonitrile, it is recognized that nitrilase has low alkaline resistance, and it is necessary to carry out the reaction in an aqueous solution with a pH of less than 10.5. Therefore, it was necessary to remove ammonia contained in the aminoacetonitrile aqueous solution before the reaction.
本発明は、ニトリル化合物から微生物(酵素)を用いてグリシンなどのアミノ酸を効率的に製造するための新規な方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel method for efficiently producing amino acids such as glycine from nitrile compounds using microorganisms (enzymes).
発明者らは、アミノアセトニトリル水溶液に直接添加することが可能な、高アルカリ耐性を有するニトリラーゼの探索を行い、pHが10.5以上の反応条件下でグリシン生成活性を示すニトリラーゼを見出だすことに成功した。 The inventors searched for a nitrilase with high alkaline resistance that can be added directly to an aqueous aminoacetonitrile solution, and found a nitrilase that exhibits glycine production activity under reaction conditions where the pH is 10.5 or higher. succeeded in.
本発明は上記の知見に基づくものであり、以下の[1]~[7]に関する。
[1] pH10.5以上、好ましくはpH10.8以上、より好ましくはpH11.0以上のアルカリ条件下で、ニトリル化合物を含む水溶液にニトリラーゼを作用させる工程を含む、アミノ酸の製造方法。
[2] 前記ニトリラーゼが、以下の(1)又は(2)のアミノ酸配列を有する、[1]に記載の方法。
(1)配列番号2、4、6、8、10、12、14、及び16のいずれかに示されるアミノ酸配列
(2)配列番号2、4、6、8、10、12、14、及び16のいずれかに示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列
[3] 前記ニトリラーゼが、アシドボラックス(Acidovorax)属細菌、アクロモバクター(Achromobacter)属細菌、ノビバチルス(Novibacillus)属細菌、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属酵母、ロドトルラ(Rhodotorula)属酵母、及びロドコッカス(Rhodococcus)属細菌から選ばれるいずれかの微生物由来である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] ニトリル化合物を含む水溶液中のアンモニア濃度が3.3%以上である、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 前記ニトリル化合物が、アンモニアの存在下にシアン化合物とアルデヒド化合物とを反応させて得られたものである、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 前記アミノ酸がグリシンである、[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7] ニトリル化合物がアミノアセトニトリルである、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
The present invention is based on the above findings and relates to the following [1] to [7].
[1] A method for producing an amino acid, comprising a step of allowing nitrilase to act on an aqueous solution containing a nitrile compound under alkaline conditions at pH 10.5 or higher, preferably pH 10.8 or higher, more preferably pH 11.0 or higher.
[2] The method according to [1], wherein the nitrilase has the following amino acid sequence (1) or (2).
(1) Amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16 (2) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16 [3] An amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more identity with the amino acid sequence shown in any of the following, and encoding a protein having nitrilase activity [3] selected from bacteria of the genus Acidovorax, bacteria of the genus Achromobacter, bacteria of the genus Novibacillus, yeast of the genus Rhodosporidium, yeast of the genus Rhodotorula, and bacteria of the genus Rhodococcus The method according to [1] or [2], which is derived from any microorganism.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the ammonia concentration in the aqueous solution containing the nitrile compound is 3.3% or more.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the nitrile compound is obtained by reacting a cyanide compound and an aldehyde compound in the presence of ammonia.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the amino acid is glycine.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the nitrile compound is aminoacetonitrile.
本発明によれば、pH10.5以上の条件下でもアミノアセトニトリルにニトリラーゼを作用することが可能になる。これにより、グリコロニトリルのアミノ化工程で得られるアミノアセトニトリル水溶液中のアンモニアを除去したり、特別な還元剤等を使用することなく効率的にグリシンを製造することが可能となる。 According to the present invention, it becomes possible to act nitrilase on aminoacetonitrile even under conditions of pH 10.5 or higher. This makes it possible to efficiently produce glycine without removing ammonia from the aminoacetonitrile aqueous solution obtained in the glycolonitrile amination step or without using a special reducing agent.
1.ニトリラーゼ
ニトリラーゼ(EC番号3.5.5.1)は、ニトリルを対応するカルボン酸とアンモニアに加水分解する酵素であり、温和な条件下でニトリルの加水分解を触媒することから、工業用生体触媒としての利用が広く検討されている。
1. Nitrilase Nitrilase (EC number 3.5.5.1) is an enzyme that hydrolyzes nitriles into the corresponding carboxylic acids and ammonia, and because it catalyzes the hydrolysis of nitriles under mild conditions, it is useful as an industrial biocatalyst. It is being widely considered.
本発明に使用できるニトリラーゼとしては、pH10.5以上でニトリラーゼ活性を有するものであれば特段限定されない。前記ニトリラーゼの代表例として、下表に示されるニトリラーゼを挙げることができる。 The nitrilase that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it has nitrilase activity at pH 10.5 or higher. Representative examples of the nitrilase include the nitrilase shown in the table below.
本発明で使用されるニトリラーゼは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号2、4、6、8、10、12、14、及び16のいずれかに記載のアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、特に好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質も包含する。 The nitrilase used in the present invention is not limited to those having the above sequence, but has the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16, and approximately Homology or identity of 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, even more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 98% or more Also included are proteins that contain the amino acid sequence and have nitrilase activity.
また、本発明で使用されるニトリラーゼには、上記配列のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1個又は数個、具体的には、1~20個、好ましくは1~10個、より好ましくは1~5個、1~4個、1~3個、さらに好ましくは1又は2個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。 Furthermore, the nitrilase used in the present invention includes one or several amino acids, specifically 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 10, in the amino acid sequence described in any of the above sequences. Also included are proteins that contain an amino acid sequence in which 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, and more preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted, or added, and that have nitrilase activity.
好ましくは、本発明で使用されるニトリラーゼは、アシドボラックス(Acidovorax)属細菌、アクロモバクター(Achromobacter)属細菌、ノビバチルス(Novibacillus)属細菌、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属酵母、ロドトルラ(Rhodotorula)属酵母、又はロドコッカス(Rhodococcus)属細菌由来である。アシドボラックス属細菌としては、例えば、Acidovorax facilisが、アクロモバクター属細菌としては、例えば、Achromobacter denitrificansが、ノビバチルス属細菌としては、例えば、Novibacillus thermophilusが、ロドスポリジウム属酵母としては、例えば、Rhodosporidium toruloidesが、ロドトルラ属酵母としては、例えば、Rhodotorula gracilisが、Rhodococcus属細菌としては、例えば、Rhodococcus sp. NS1がそれぞれ挙げられる。 Preferably, the nitrilase used in the present invention is a bacterium of the genus Acidovorax, a bacterium of the genus Achromobacter, a bacterium of the genus Novibacillus, a yeast of the genus Rhodosporidium, a yeast of the genus Rhodotorula. It is derived from yeast of the genus Rhodococcus or bacteria of the genus Rhodococcus. Examples of Acidovorax bacteria include Acidovorax facilis; examples of Achromobacter bacteria include Achromobacter denitrificans; examples of Novibacillus bacteria include Novibacillus thermophilus; examples of Rhodosporidium yeast include: Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula yeast include, for example, Rhodotorula gracilis, and Rhodococcus bacteria include, for example, Rhodococcus sp. NS1.
本発明で使用されるニトリラーゼの遺伝子は、下記アミノ酸配列をコードする。
a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、及び16のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は
b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、及び16のいずれかで示されるアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、特に好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつ、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。
The nitrilase gene used in the present invention encodes the following amino acid sequence.
a) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16, or b) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16 About 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, even more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 98 Amino acid sequence of a protein that has a sequence identity of % or more and has nitrilase activity.
本発明で使用されるニトリラーゼの遺伝子は、例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、及び15のいずれかで示される塩基配列を有する。また、配列番号1、3、5、7、9、11、13、及び15のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子も本発明のリン酸化酵素の遺伝子に含まれる。好ましくは、上記遺伝子は、アシドボラックス属細菌、アクロモバクター属細菌、ノビバチルス属細菌、ロドスポリジウム属酵母、ロドトルラ属酵母、又はロドコッカス属細菌由来である。 The nitrilase gene used in the present invention has a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15, for example. Further, a base that hybridizes under stringent conditions with the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15 and encodes a protein having nitrilase activity. A gene containing the sequence is also included in the gene for the kinase of the present invention. Preferably, the gene is derived from a bacterium of the genus Acidovorax, a bacterium of the genus Achromobacter, a bacterium of the genus Novibacillus, a yeast of the genus Rhodosporidium, a yeast of the genus Rhodotorula, or a bacterium of the genus Rhodococcus.
ストリンジェントな条件としては、例えば、DNAを固定したナイロン膜を、6×SSC(1×SSCは塩化ナトリウム8.76g、クエン酸ナトリウム4.41gを1リットルの水に溶かしたもの)、1%SDS、100μg/mlサケ***DNA、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコールを含む溶液中で65℃にて20時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「2×SSC、0.1%SDS、42℃」、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「1×SSC、0.1%SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1%SDS、50℃」等の条件を挙げることができる。 Stringent conditions include, for example, a nylon membrane with immobilized DNA, 6x SSC (1x SSC is 8.76 g of sodium chloride and 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water), 1% SDS, One example of the conditions for hybridization is to incubate the probe at 65°C for 20 hours in a solution containing 100 μg/ml salmon sperm DNA, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, and 0.1% Ficoll. It is not limited to. Those skilled in the art will be able to set hybridization conditions by taking into consideration other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc., in addition to conditions such as buffer salt concentration and temperature. I can do it. Post-hybridization washing conditions include, for example, "2x SSC, 0.1% SDS, 42°C," "1x SSC, 0.1% SDS, 37°C," and more stringent conditions include, for example, "1x SSC, 0.1% SDS, 42°C." , 0.1% SDS, 65°C" and "0.5×SSC, 0.1% SDS, 50°C".
精製の簡略化や可溶性発現の促進、抗体による検出等を目的として、酵素には種々のタグ(タンパク質又はペプチド)が付加されていてもよい。タグの種類としては、Hisタグ(ヒスチジンタグ)、Strep(II)-tag、GSTタグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ)、MBPタグ(マルトース結合タンパク質タグ)、GFPタグ(緑色蛍光タンパク質タグ)、SUMOタグ(Small Ubiquitin-related(like) Modifierタグ)FLAGタグ、HAタグ、mycタグ等が挙げられる。上記タグに限定されず、アルカリ条件下でニトリラーゼ活性を有する限り、他のタンパク質との融合タンパク質でもよい。 Various tags (proteins or peptides) may be added to the enzyme for the purpose of simplifying purification, promoting soluble expression, detection with antibodies, etc. Types of tags include His tag (histidine tag), Strep(II)-tag, GST tag (glutathione-S-transferase tag), MBP tag (maltose-binding protein tag), GFP tag (green fluorescent protein tag), SUMO Tags (Small Ubiquitin-related (like) Modifier tags) include FLAG tags, HA tags, myc tags, etc. The tags are not limited to the above tags, and may be fusion proteins with other proteins as long as they have nitrilase activity under alkaline conditions.
本発明で使用されるニトリラーゼは、アルカリ条件下でその活性が保持されうる限りはどのような形態・純度でもよい。すなわち、純粋なニトリラーゼ(精製酵素)のみならず、当該ニトリラーゼがその生体内に発現されている細胞や微生物菌体(以下、菌体等と呼ぶ)、当該菌体等から調製した休止菌体等、当該菌体等から調製した膜透過性向上菌体等、当該菌体等から調製した不活化菌体等、当該菌体等を破砕して得られる破砕菌体等が挙げられる。また、当該破砕菌体等から調製した無細胞抽出物(粗酵素)も、本発明におけるニトリラーゼの態様に含まれる。さらには、いわゆる無細胞タンパク質合成反応を用いて合成されたニトリラーゼ粗酵素及び精製酵素も、本発明におけるニトリラーゼの態様に含まれる。加えて、上記菌体等、休止菌体等、不活化菌体等、破砕菌体等、粗酵素及び精製酵素に対して何らかの安定化処理を行ったものも、本発明におけるニトリラーゼの態様に含まれる。 The nitrilase used in the present invention may be in any form and purity as long as its activity can be maintained under alkaline conditions. That is, not only pure nitrilase (purified enzyme), but also cells and microbial cells in which the nitrilase is expressed in the body (hereinafter referred to as cells, etc.), resting cells prepared from the cells, etc. , membrane permeability-improved bacterial cells prepared from the bacterial cells, etc., inactivated bacterial cells prepared from the bacterial cells, etc., crushed bacterial cells obtained by crushing the bacterial cells, etc., and the like. Furthermore, a cell-free extract (crude enzyme) prepared from the disrupted bacterial cells and the like is also included in the embodiment of nitrilase in the present invention. Furthermore, crude nitrilase enzymes and purified enzymes synthesized using so-called cell-free protein synthesis reactions are also included in the embodiment of nitrilase in the present invention. In addition, the above-mentioned bacterial cells, dormant bacterial cells, inactivated bacterial cells, crushed bacterial cells, etc., crude enzymes, and purified enzymes subjected to some kind of stabilization treatment are also included in the embodiment of the nitrilase in the present invention. It will be done.
休止菌体とは、その増殖が実質的に停止した状態に置かれた菌体を意味する。具体的には、培養により増殖させた形質転換体を培地から回収した後、形質転換体が容易に利用可能な炭素源等を含まない緩衝液等に懸濁したり、回収した形質転換体を凍結させたり、乾燥させて粉末化したりすることにより調製することができる。形質転換体を培地から回収する方法は如何なる方法でもよく、例えば、遠心分離を用いた方法、膜ろ過を用いた方法等が挙げられる。遠心分離は、形質転換体を沈降させる遠心力が供給できるものであれば特に限定されることはなく、円筒型や分離板型などを利用することができる。遠心力としては、例えば、500G~20,000G程度で行うことができる。膜ろ過は、形質転換体を培地から回収することができれば、精密ろ過(MF)膜、限外ろ過(UF)膜いずれを用いて行ってもよい。形質転換体を懸濁する緩衝液としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、ニトリラーゼの活性が保たれるものであれば如何なるものでもよく、例えば、リン酸緩衝液、アクリル酸緩衝液、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)‐塩酸緩衝液、HEPES(2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid)やその他グッドの緩衝液(Good's buffers)等を用いることができる。形質転換体を凍結する場合は、上記の遠心分離等の操作により大半の水分を除去した状態、又は適当な緩衝液に懸濁された状態で凍結すればよい。凍結する温度は、形質転換体を懸濁する緩衝液の成分によっても異なるが、実質的に形質転換体が凍結する温度であれば如何なる温度でもよく、例えば、-210℃~0℃等の範囲で行えばよい。また、形質転換体を乾燥する場合、その乾燥方法としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、ニトリラーゼの活性が保たれる方法であれば如何なる方法でもよく、凍結乾燥法や噴霧乾燥法等が挙げられる。 A dormant bacterial cell means a bacterial cell whose growth has substantially stopped. Specifically, after the transformants grown by culture are collected from the medium, the transformants are suspended in a buffer solution that does not contain an easily available carbon source, or the collected transformants are frozen. It can be prepared by drying, drying and powdering. Any method may be used to recover the transformant from the culture medium, such as a method using centrifugation, a method using membrane filtration, and the like. Centrifugation is not particularly limited as long as it can supply centrifugal force to sediment the transformant, and a cylindrical type, separation plate type, etc. can be used. The centrifugal force can be, for example, about 500G to 20,000G. Membrane filtration may be performed using either a microfiltration (MF) membrane or an ultrafiltration (UF) membrane, as long as the transformant can be recovered from the culture medium. The buffer for suspending the transformant may be any buffer as long as it substantially stops the growth of the transformant and maintains the activity of nitrilase, such as phosphate buffer, acrylic, etc. Acid buffers, Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane)-hydrochloric acid buffers, HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid) and other Good's buffers, etc. can be used. When freezing the transformant, it may be frozen after most of the water has been removed by the above-mentioned operation such as centrifugation, or after being suspended in an appropriate buffer. The freezing temperature varies depending on the components of the buffer in which the transformant is suspended, but it may be any temperature that substantially freezes the transformant, for example, in the range of -210°C to 0°C. You can do it with In addition, when drying the transformant, any drying method may be used as long as the growth of the transformant is substantially stopped and the nitrilase activity is maintained, such as freeze-drying or Examples include spray drying method.
膜透過性向上菌体の調製は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、有機溶媒や界面活性剤で形質転換体を処理することにより、基質や生成物が、形質転換体の細胞膜や細胞壁を通過しやすくなる。使用する有機溶媒や界面活性剤の種類としては、膜透過性が向上し、かつ、ニトリラーゼの活性が保たれるものであれば特段限定されることはなく、有機溶媒であればトルエンやメタノール等、界面活性剤であればTriton-X100や塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。 The membrane permeability-improved bacterial cells can be prepared using known methods. For example, by treating a transformant with an organic solvent or a surfactant, substrates and products can easily pass through the cell membrane and cell wall of the transformant. The type of organic solvent or surfactant to be used is not particularly limited as long as it improves membrane permeability and maintains nitrilase activity, and organic solvents such as toluene and methanol can be used. Examples of surfactants include Triton-X100 and benzethonium chloride.
不活化菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば薬剤処理や加熱処理により行うことができる。薬剤による処理は、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤、塩酸アルキルジアミノエチルグリシンなどの両性イオン系界面活性剤などを用いることができる。また、エタノール等のアルコール類、2-メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン、シトルリン等のアミノ酸類なども挙げられる。加熱による処理は、ニトリラーゼが失活しない温度と時間で熱処理を行えばよい。 Inactivated bacterial cells can be prepared using known techniques. For example, this can be done by chemical treatment or heat treatment. For treatment with chemicals, for example, cationic surfactants such as benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride, methylstearoyl chloride, and cetyltrimethylammonium bromide, and amphoteric surfactants such as alkyldiaminoethylglycine hydrochloride can be used. can. Also included are alcohols such as ethanol, thiols such as 2-mercaptoethanol, amines such as ethylenediamine, and amino acids such as cysteine, ornithine, and citrulline. The heat treatment may be performed at a temperature and for a time that does not deactivate the nitrilase.
破砕菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ビーズミルによる磨砕処理、衝撃破砕装置による衝突処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等が挙げられ、いずれかの方法を単独又は必要に応じ組み合わせて利用することができる。工業的規模で細胞の破砕を行う場合は、操作性、回収率、コスト等を勘案し、例えば、高圧処理や磨砕処理、衝突処理あるいはこれら処理に酵素処理等を組み合わせた処理を行うことが好ましい。ビーズミルによる磨砕処理を行う場合、用いられるビーズは、例えば、密度2.5~6.0g/cm3、サイズ0.1~1.0mmのものを通常80~85%程度充填することにより破砕を行うことができ、運転方式としては回分式、連続式いずれをも採用することができる。高圧処理を行う場合、処理圧力は、細胞からのニトリラーゼタンパク質回収率が十分高いものであれば特段限定されないが、例えば、40~200MPa程度、好ましくは60~150MPa程度、より好ましくは80~120MPa程度の圧力で破砕を行うことができる。必要に応じて、装置を直列に配置したり、複数ステージ構造の装置を用いたりすることにより、多段階処理を行い、破砕及び操作効率を向上させることも可能である。通常、処理圧力10MPaあたり2~3℃の温度上昇が生じることから、必要に応じて冷却処理を行うことが好ましい。衝突処理の場合、例えば、細胞スラリーを予め噴霧急速凍結処理(凍結速度:例えば1分間当たり数千℃)等によって凍結微細粒子(例えば50μm以下)にしておき、これを高速(例えば約300m/s)の搬送ガスによって衝突板に衝突させることで効率的に菌体等を破砕することができる。 Preparation of crushed bacterial cells can be performed using known techniques. For example, ultrasonication, high-pressure treatment using a French press or homogenizer, grinding treatment using a bead mill, collision treatment using an impact crusher, enzyme treatment using lysozyme, cellulase, pectinase, etc., freeze-thaw treatment, hypotonic solution treatment, and lysis using phages. Examples include induction treatment, and any of these methods can be used alone or in combination as necessary. When disrupting cells on an industrial scale, considering operability, recovery rate, cost, etc., it is recommended to use high-pressure treatment, grinding treatment, collision treatment, or a combination of these treatments with enzyme treatment, etc. preferable. When performing the grinding process using a bead mill, the beads used are, for example, beads with a density of 2.5 to 6.0 g/cm 3 and a size of 0.1 to 1.0 mm. As the operation method, either a batch type or a continuous type can be adopted. When performing high-pressure treatment, the treatment pressure is not particularly limited as long as the recovery rate of nitrilase protein from cells is sufficiently high, but for example, about 40 to 200 MPa, preferably about 60 to 150 MPa, more preferably about 80 to 120 MPa. Crushing can be carried out at a pressure of If necessary, it is also possible to perform multi-stage processing and improve crushing and operational efficiency by arranging devices in series or using a device with a multi-stage structure. Usually, a temperature rise of 2 to 3°C occurs per 10 MPa of treatment pressure, so it is preferable to perform a cooling treatment as necessary. In the case of collision treatment, for example, cell slurry is frozen into fine particles (e.g., 50 μm or less) by spray rapid freezing treatment (freezing speed: e.g., several thousand degrees Celsius per minute), and then frozen at a high speed (e.g., approximately 300 m/s). ) It is possible to efficiently crush bacterial bodies etc. by colliding with the collision plate using the carrier gas.
無細胞抽出物(粗酵素)は、破砕菌体から破砕残渣(細胞膜や細胞壁等を含む不溶性画分)を除去することによって調製することができる。破砕残渣の除去は、公知の手法により行うことができ、例えば、遠心分離や膜ろ過、ろ布ろ過等を利用することができる。遠心分離操作は、上述したように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細であり、容易に沈降し難い場合は、必要に応じて凝集剤等を使用して残渣沈殿効率を上げることもできる。膜ろ過も、上述のように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細である場合には、特に限外ろ過(UF)膜を使用することができる。ろ布ろ過を行う場合には、ろ過助剤や凝集剤を併用して行うことができる。ろ過助剤としては、珪藻土やセルロースパウダー、活性炭などが挙げられる。凝集剤としては、カチオン系凝集剤、アニオン系凝集剤、両性系凝集剤、ノニオン系凝集剤等が挙げられる。上記いずれかの操作により、菌体が存在しない上清を回収し、無細胞化する(セルフリーにする)ことで、本発明におけるニトリラーゼを含む無細胞抽出物(粗酵素)を調製することができる。 A cell-free extract (crude enzyme) can be prepared by removing disruption residues (insoluble fractions containing cell membranes, cell walls, etc.) from disrupted bacterial cells. The crushed residue can be removed by a known method, for example, centrifugation, membrane filtration, filter cloth filtration, etc. can be used. The centrifugation operation can be performed as described above, but if the crushed residue of the transformant is too fine to be easily sedimented, use a flocculant, etc. as necessary to increase the efficiency of sedimentation of the residue. You can also do that. Membrane filtration can also be carried out as described above, but ultrafiltration (UF) membranes can especially be used when the fragmentation residue of the transformants is fine. When filter cloth filtration is performed, a filter aid or a flocculant may be used in combination. Examples of filter aids include diatomaceous earth, cellulose powder, and activated carbon. Examples of the flocculant include cationic flocculants, anionic flocculants, amphoteric flocculants, nonionic flocculants, and the like. The cell-free extract (crude enzyme) containing the nitrilase of the present invention can be prepared by collecting the supernatant in which no bacterial cells are present and making it cell-free (making it cell-free) by any of the above operations. can.
本発明におけるニトリラーゼを高密度・高効率で取得するためには、上述の菌体等の内部(菌体内)又は菌体外に高濃度で発現させることが好ましい。ニトリラーゼを発現させる細胞や微生物としては、発現ベクター等を利用したタンパク質発現システムによって、酵素を発現することができる宿主であれば、特に限定されるものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、放線菌(例えばロドコッカス属(Rhodococcus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium))などの細菌;酵母(例えばサッカロマイセス属(Saccharomyces)、キャンディダ属(Candida)、ピキア属(Pichia));糸状菌;植物細胞;昆虫細胞、哺乳類細胞などの動物細胞が挙げられる。特に、細菌としては、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌及びロドコッカス属細菌、酵母としては、サッカロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母及びピキア属酵母が好ましい。大腸菌としては、例えば、大腸菌K12株及びB株、ならびにそれらの野生株由来の派生株であるW3110株、JM109株、XL1-Blue株(例えば、XL1-BlueMRF')、K802株、C600株、BL21株、BL21(DE3)株等が挙げられる。 In order to obtain the nitrilase of the present invention at high density and high efficiency, it is preferable to express it at a high concentration inside the above-mentioned bacterial cells (inside the bacterial cells) or outside the bacterial cells. Cells and microorganisms for expressing nitrilase are not particularly limited as long as they are hosts capable of expressing the enzyme using a protein expression system using an expression vector or the like. For example, bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes (e.g. Rhodococcus, Corynebacterium); yeasts (e.g. Saccharomyces, Candida); Candida), Pichia); filamentous fungi; plant cells; and animal cells such as insect cells and mammalian cells. In particular, the bacteria are preferably Escherichia coli, Corynebacterium and Rhodococcus bacteria, and the yeasts are Saccharomyces, Candida and Pichia. Examples of E. coli include E. coli K12 strain and B strain, as well as their wild-type derived strains W3110 strain, JM109 strain, XL1-Blue strain (for example, XL1-BlueMRF'), K802 strain, C600 strain, and BL21 strain. strain, BL21 (DE3) strain, etc.
発現ベクターを用いる場合は、本発明で用いるニトリラーゼ遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。本発明で用いられる発現ベクターは、公知の手法により作製することができ、宿主に応じて、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどから選ばれる適切なものを用いればよい。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、pTrc99A(GEヘルスケア バイオサイエンス)、pACYC184(ニッポンジーン)、pMW118(ニッポンジーン)、pETシリーズベクター(Novagen)などを挙げることができる。また2以上の挿入箇所を有するベクターとしてはpETDuet-1(Novagen)等を挙げることができる。必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。 When using an expression vector, there is no particular limitation as long as it contains the nitrilase gene used in the present invention in an expressible state, and a vector suitable for each host can be used. The expression vector used in the present invention can be produced by a known method, and an appropriate vector selected from plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, artificial chromosome DNA, etc. may be used depending on the host. For example, when using Escherichia coli as a host, pTrc99A (GE Healthcare Biosciences), pACYC184 (Nippon Gene), pMW118 (Nippon Gene), pET series vectors (Novagen), etc. can be used. Furthermore, examples of vectors having two or more insertion sites include pETDuet-1 (Novagen). If necessary, modified versions of these vectors can also be used.
一般的には、所定の酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入すればよい。あるいは、発現ベクターに転写プロモーター及び/又はターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、そのベクターの転写プロモーター及び/又はターミネーターを利用して、その間に所定の酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌宿主において利用できるのものとしては、T7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、ラムダファージ由来PLプロモーター及びPRプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。あるいは、培養温度を低温にすることで発現が誘導可能なcspAプロモーター等を用いることもできる。 Generally, an expression cassette is constructed by inserting a transcription promoter upstream of a gene encoding a given enzyme and, in some cases, a terminator downstream, and this cassette is inserted into an expression vector. Alternatively, if a transcription promoter and/or terminator already exists in the expression vector, the transcription promoter and/or terminator of the vector can be used without constructing an expression cassette, and a gene encoding a predetermined enzyme can be inserted between the expression vector and the transcription promoter and/or terminator. Just insert . The type of promoter is not particularly limited as long as it allows appropriate expression in the host, but examples of promoters that can be used in E. coli hosts include T7 promoter, trp promoter, lac promoter, and lambda phage-derived promoter. Examples include PL promoter, PR promoter, tac promoter, and trc promoter. Alternatively, a cspA promoter or the like whose expression can be induced by lowering the culture temperature can also be used.
発現ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子(選択マーカー)が含めることが好ましい。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。 It is preferable that the expression vector contains a factor (selection marker) for selecting the desired transformant. Selectable markers include drug resistance genes, auxotrophic complementary genes, assimilation-imparting genes, and can be selected depending on the purpose and host. Examples of drug resistance genes used as selection markers in E. coli include ampicillin resistance gene, kanamycin gene, dihydrofolate reductase gene, and neomycin resistance gene.
本発明におけるニトリラーゼをコードする遺伝子(核酸)は、例えば、(i)塩基配列情報に従い、プライマーを作製し、ゲノム等を鋳型として増幅することによって得ることもできるし、(ii)酵素のアミノ酸配列情報に従い、有機合成的にDNAを合成することによって得ることもできる。形質転換体の宿主となる細胞に応じて、遺伝子は最適化されていてもよい。上述の発現ベクターに所定の酵素をコードする遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入してもよい。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。 The gene (nucleic acid) encoding nitrilase in the present invention can be obtained, for example, by (i) preparing primers according to the base sequence information and amplifying the genome etc. as a template, or (ii) the amino acid sequence of the enzyme. It can also be obtained by organically synthesizing DNA according to the information. Genes may be optimized depending on the cell that serves as a host for the transformant. In order to insert a gene encoding a predetermined enzyme into the above-mentioned expression vector, methods using restriction enzymes, methods using topoisomerase, etc. can be used. If necessary during insertion, an appropriate linker may be added. Furthermore, ribosome binding sequences such as SD sequences and Kozak sequences are known as base sequences important for translation into amino acids, and these sequences may be inserted upstream of a gene. Upon insertion, part of the amino acid sequence encoded by the gene may be replaced.
菌体等の生体内にニトリラーゼを高濃度で発現させる方法としては、上述のような発現ベクターを用いる方法が典型的であるが、それ以外の方法を利用することもできる。例えば、ニトリラーゼをコードする遺伝子に、適切なプロモーターやターミネーター、マーカー遺伝子等を連結させた発現カセットを宿主のゲノム上に挿入することで、ニトリラーゼの発現を強化することができる。発現カセットがゲノム上に挿入された形質転換体を取得する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、相同組換えにより発現カセットをゲノム上に挿入する場合は、ニトリラーゼの発現カセットと任意のゲノム領域の配列を有し、宿主内で複製不可能なプラスミドを用いて形質転換を行うことで、当該プラスミド全体又は発現カセットが挿入された形質転換体を得ることができる。その際、SacB遺伝子(レバンスクラーゼをコード)等のネガティブ選択マーカーを搭載したプラスミドや、複製機構が温度感受性(ts)のプラスミドを用いることで、2回の相同組換えにより発現カセットのみがゲノム上にされた形質転換体を効率的に取得することもできる。また、発現カセットのみから成るDNA断片を用いて形質転換を行うことで、ゲノム上のランダムな位置に発現カセットが挿入された形質転換体を得ることもできる。また、もともと宿主がゲノム上に本発明におけるニトリラーゼをコードする遺伝子を有する場合は、ゲノム上の当該ニトリラーゼ遺伝子のプロモーターを強力なものに置換することで、その発現を強化することもできる。プロモーターとしては、上述した発現ベクターにおいて用いるプロモーターを同様に利用することができる。また、ニトリラーゼを発現させる宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法が挙げられる。 A typical method for expressing nitrilase at a high concentration in living organisms such as bacterial cells is to use an expression vector as described above, but other methods can also be used. For example, the expression of nitrilase can be enhanced by inserting into the genome of the host an expression cassette in which a gene encoding nitrilase is linked with an appropriate promoter, terminator, marker gene, etc. A known method can be used to obtain a transformant in which the expression cassette has been inserted into the genome. For example, when inserting an expression cassette into the genome by homologous recombination, transformation is performed using a plasmid that has the nitrilase expression cassette and the sequence of an arbitrary genomic region and cannot be replicated in the host. Transformants into which the entire plasmid or expression cassette has been inserted can be obtained. At that time, by using a plasmid carrying a negative selection marker such as the SacB gene (encoding levansucrase) or a plasmid with a temperature-sensitive (ts) replication mechanism, only the expression cassette is placed on the genome through two homologous recombinations. It is also possible to efficiently obtain transformants. Furthermore, by performing transformation using a DNA fragment consisting only of the expression cassette, it is also possible to obtain a transformant in which the expression cassette is inserted at a random position on the genome. Furthermore, if the host originally has a gene encoding the nitrilase of the present invention on its genome, its expression can be enhanced by replacing the promoter of the nitrilase gene on the genome with a strong one. As the promoter, the promoters used in the expression vectors described above can be similarly used. Furthermore, the method for introducing the expression vector into the host in which nitrilase is to be expressed is not particularly limited as long as it is suitable for the host. Examples of available methods include electroporation, a method using calcium ions, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
上述のようにして得られたニトリラーゼを高発現可能な細胞や微生物、特に細菌や酵母の培養には、通常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、窒素源としてはアンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩及び有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加される。培養はpH5~9、好ましくはpH6~8、温度20~37℃、好ましくは27~32℃で好気的に行われるが、本発明におけるニトリラーゼが高発現される限りは特段限定されない。また、ニトリラーゼの発現を誘導するため、プロモーターに応じた誘導剤を加えてもよい。誘導剤としては、例えば、IPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)やアラビノースが用いられる。あるいは、当該ニトリラーゼ遺伝子を元来有する宿主を培養する場合は、ラクタム化合物(γ-ラクタム、δ-ラクタム、ε-カプロラクタム等)、ニトリル化合物、アミド化合物等が用いられる。 For culturing cells and microorganisms, especially bacteria and yeast, which can highly express the nitrilase obtained as described above, commonly used carbon sources such as glucose, glycerin, organic acids, dextrin, maltose, etc. are used. As nitrogen sources, ammonia and its salts, urea, nitrates, and organic nitrogen sources such as yeast extract, malt extract, peptone, meat extract, etc. are used. Furthermore, inorganic nutrients such as phosphate, sodium, potassium, iron, magnesium, cobalt, manganese, and zinc are appropriately added to the medium. Cultivation is carried out aerobically at pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8, and temperature 20 to 37°C, preferably 27 to 32°C, but there are no particular limitations as long as the nitrilase of the present invention is highly expressed. Furthermore, in order to induce the expression of nitrilase, an inducer depending on the promoter may be added. As the inducing agent, for example, IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) and arabinose are used. Alternatively, when culturing a host that originally has the nitrilase gene, lactam compounds (γ-lactam, δ-lactam, ε-caprolactam, etc.), nitrile compounds, amide compounds, etc. are used.
本発明におけるニトリラーゼを取得するために、いわゆる無細胞タンパク質合成系を用いることもできる。無細胞タンパク質合成系は、生きた細胞や微生物等ではなく、種々の生物から抽出した無細胞抽出物に、アミノ酸、ATP等のエネルギー分子、エネルギー再生系、マグネシウムイオン等の塩類、そして、発現させたいタンパク質をコードする遺伝子(DNAあるいはRNA)を添加した無細胞タンパク質合成反応液により、タンパク質を試験管内(in vitro)で合成するシステムである。無細胞抽出物には、リボソーム、tRNA、アミノアシル化tRNA合成酵素、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子などの翻訳成分が含まれる。本明細書中では、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成反応を行うための溶液を、反応の前後を含めて、無細胞タンパク質合成反応液と呼ぶ。本発明で用いる無細胞タンパク質合成系としては、ニトリラーゼがその活性を有する状態で発現することができるものであればいかなる系でもよいが、例えば、コムギ胚芽由来合成系、大腸菌由来合成系、ウサギ網状赤血球由来系、昆虫細胞由来合成系、ヒト細胞由来合成系を用いることができる。また、必要な可溶性タンパク質因子を組換えタンパク質として調製するPURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)System等を用いてもよい。無細胞系でのタンパク質合成反応プロセスとしては、バッチ法、CFCF(Continuous-Flow Cell-Free)法、CECF(Continuous Exchange Cell-Free)法、重層法等を用いることができる。また、発現させる酵素遺伝子の鋳型としては、RNAでもDNAでもよい。鋳型としてRNAを用いる場合は、Total RNA、mRNA、in vitro転写産物などを用いることができる。 A so-called cell-free protein synthesis system can also be used to obtain the nitrilase of the present invention. A cell-free protein synthesis system uses cell-free extracts extracted from various organisms, rather than living cells or microorganisms, to incorporate amino acids, energy molecules such as ATP, energy regeneration systems, salts such as magnesium ions, and expression. This is a system in which proteins are synthesized in vitro using a cell-free protein synthesis reaction solution containing the gene (DNA or RNA) encoding the desired protein. The cell-free extract contains translation components such as ribosomes, tRNA, aminoacylated tRNA synthetase, translation initiation factors, translation elongation factors, and translation termination factors. In this specification, a solution for performing a protein synthesis reaction using a cell-free protein synthesis system, including before and after the reaction, is referred to as a cell-free protein synthesis reaction solution. The cell-free protein synthesis system used in the present invention may be any system as long as it can express nitrilase in a state with its activity, but examples include wheat germ-derived synthesis system, Escherichia coli-derived synthesis system, rabbit reticulated Red blood cell-derived systems, insect cell-derived synthetic systems, and human cell-derived synthetic systems can be used. Alternatively, the PURE (Protein synthesis Using Recombinant Elements) System, which prepares necessary soluble protein factors as recombinant proteins, may be used. As a protein synthesis reaction process in a cell-free system, a batch method, a CFCF (Continuous-Flow Cell-Free) method, a CECF (Continuous Exchange Cell-Free) method, a multilayer method, etc. can be used. Furthermore, the template for the enzyme gene to be expressed may be RNA or DNA. When using RNA as a template, total RNA, mRNA, in vitro transcription products, etc. can be used.
培養した菌体等から得られた粗酵素、あるいは無細胞タンパク質合成系反応液から、本発明に用いるニトリラーゼを精製することができる。精製酵素の調製は、一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー(Sephadexカラム等)、イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Toyopearl等)、アフィニティークロマトグラフィー(TALON Metal Affinity Resin等)、疎水性クロマトグラフィー(butyl Toyopearl等)、陰イオンクロマトグラフィー(MonoQカラム等))、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等を、単独で又は適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。 The nitrilase used in the present invention can be purified from crude enzyme obtained from cultured bacterial cells or from a cell-free protein synthesis reaction solution. Purified enzymes can be prepared using common biochemical methods, such as ammonium sulfate precipitation, various chromatography (e.g., gel filtration chromatography (Sephadex column, etc.), ion exchange chromatography (DEAE-Toyopearl, etc.), affinity chromatography (TALON, etc.) Metal Affinity Resin, etc.), hydrophobic chromatography (butyl Toyopearl, etc.), anion chromatography (MonoQ column, etc.), SDS polyacrylamide gel electrophoresis, etc. can be used alone or in appropriate combination.
ニトリラーゼは、さらに安定化処理を行ったもの(安定化処理物)を用いることもできる。安定化処理は、未処理の状態よりも、環境因子(温度、pH、化学物質濃度等)に対する所定の各酵素の安定性、あるいは保存時の安定性が向上する処理であればいかなる処理でもよい。例えばアクリルアミド等のゲルへの包含、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類による処理(CLEA:Cross-linked enzyme aggregateを含む)、無機担体(アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等)への担持処理等が挙げられる。 Nitrilases that have been further stabilized (stabilized products) can also be used. The stabilization treatment may be any treatment that improves the stability of each predetermined enzyme against environmental factors (temperature, pH, chemical concentration, etc.) or the stability during storage compared to the untreated state. . Examples include inclusion in a gel such as acrylamide, treatment with aldehydes such as glutaraldehyde (including CLEA: cross-linked enzyme aggregate), and support treatment on an inorganic carrier (alumina, silica, zeolite, diatomaceous earth, etc.).
上述のようにして得られた各種の態様のニトリラーゼは、その酵素活性が保持される限り、如何なる条件で保存することもできる。所望により適切な条件下で(例えば-80℃~-20℃、1日~1年)それらの溶液を凍結し、使用時まで保存するようにしてもよい。 The various embodiments of nitrilase obtained as described above can be stored under any conditions as long as their enzymatic activity is maintained. If desired, the solution may be frozen under appropriate conditions (for example, -80°C to -20°C, 1 day to 1 year) and stored until use.
2.ニトリル化合物からのアミノ酸合成
本発明では、pH10.5以上、好ましくはpH10.8以上、より好ましくはpH11以上のアルカリ条件下で、上記ニトリラーゼをニトリル化合物を含む水溶液に作用させる。ここで、「ニトリル化合物を含む水溶液にニトリラーゼを作用させる」とは、上述したように、ニトリラーゼのみならず、これを産生する菌体やその処理物等を、ニトリル化合物を含む水溶液に作用させることを包含する。ニトリラーゼは、基質であるニトリル化合物中のシアノ基(-CN)を、加水分解によりカルボキシル基(-COOH)に変換する。
2. Amino Acid Synthesis from Nitrile Compounds In the present invention, the nitrilase is allowed to act on an aqueous solution containing a nitrile compound under alkaline conditions of pH 10.5 or higher, preferably pH 10.8 or higher, more preferably pH 11 or higher. Here, "allowing nitrilase to act on an aqueous solution containing a nitrile compound" means, as mentioned above, allowing not only nitrilase, but also the bacterial cells that produce it, its processed products, etc., to act on an aqueous solution containing a nitrile compound. includes. Nitrilase converts a cyano group (-CN) in a nitrile compound, which is a substrate, into a carboxyl group (-COOH) through hydrolysis.
本発明で使用されるニトリル化合物は、目的とするアミノ酸(あるいはその誘導体)に応じて選択される。本発明のニトリラーゼは、pH10.5以上の高アルカリ条件下でも活性を有するため、アンモニアの存在下にシアン化合物とアルデヒド化合物とを反応させて得られたニトリル化合物に直接作用させることができる。 The nitrile compound used in the present invention is selected depending on the target amino acid (or its derivative). Since the nitrilase of the present invention has activity even under highly alkaline conditions of pH 10.5 or higher, it can be made to act directly on a nitrile compound obtained by reacting a cyanide compound with an aldehyde compound in the presence of ammonia.
例えば、グリシンを製造する場合には、ニトリル化合物としてアミノアセトニトリルを使用することができる。アミノアセトニトリルは、公知の方法で合成することができる。例えば、ホルムアルデヒドと青酸及びアンモニアから得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニアを作用させて得る方法で合成することができ、これらの方法はシュトレッカー法として総称されている。このほかに、アミノアセトニトリル硫酸塩から陰イオン交換樹脂を用いてSO4 2-を除去してアミノアセトニトリル水溶液を得ることもできる。 For example, when producing glycine, aminoacetonitrile can be used as the nitrile compound. Aminoacetonitrile can be synthesized by a known method. For example, it can be synthesized by using formaldehyde, hydrocyanic acid and ammonia, or by reacting formaldehyde with hydrocyanic acid to first synthesize glycolonitrile and then reacting with ammonia. These methods are known as the Strecker method. It is called generically. In addition, an aqueous aminoacetonitrile solution can also be obtained by removing SO 4 2- from aminoacetonitrile sulfate using an anion exchange resin.
上述の方法で分離した菌体及び菌体処理物は、pH10.5以上(例えば、pH12)のアミノアセトニトリルの水溶液に懸濁させても、速やかに加水分解反応を進行させ、アミノアセトニトリルからグリシンが得られる。例えば、0.1~0.4重量%及びアミノアセトニトリルを4.5重量%含む水性懸濁液をオートクレーブ等の閉鎖的反応容器に仕込み、温度として例えば0~60℃の条件、好ましくは10~50℃の条件を用いて、反応時間を例えば1~24時間反応させればよい。反応後のグリシンを含む反応液から菌体を遠心濾過、膜分離等によって除去することにより、グリシンを液体クロマトグラフィーで定量することができる。 Even when the bacterial cells and bacterial cell-treated products isolated by the above method are suspended in an aqueous solution of aminoacetonitrile with a pH of 10.5 or higher (for example, pH 12), the hydrolysis reaction proceeds rapidly, and glycine is removed from the aminoacetonitrile. can get. For example, an aqueous suspension containing 0.1 to 0.4% by weight and 4.5% by weight of aminoacetonitrile is charged into a closed reaction vessel such as an autoclave, and the temperature is set at 0 to 60°C, preferably 10 to 50°C. The reaction time may be, for example, 1 to 24 hours. By removing bacterial cells from the reaction solution containing glycine after the reaction by centrifugal filtration, membrane separation, etc., glycine can be quantified by liquid chromatography.
アミノアセトニトリルに代わり、2-アミノプロパンニトリルや2-アミノ-4-メチルチオブチルニトリルを用いて同様の方法で加水分解反応を進行させることで、それぞれアラニンやメチオニンを得ることもできる。 Alanine and methionine can also be obtained by proceeding the hydrolysis reaction in a similar manner using 2-aminopropanenitrile or 2-amino-4-methylthiobutylnitrile instead of aminoacetonitrile.
以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically explained with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[実施例1]
(1)アミノアセトニトリルの合成
アミノアセトニトリル硫酸塩(東京化成工業)を純水に溶かして陰イオン交換樹脂(DIAIONTM PA312)を用いてSO4
2-を除去して15重量%アミノアセトニトリル水溶液を得た。
[Example 1]
(1) Synthesis of aminoacetonitrile Dissolve aminoacetonitrile sulfate (Tokyo Kasei Kogyo) in pure water and remove SO 4 2- using an anion exchange resin (DIAION TM PA312) to obtain a 15% by weight aminoacetonitrile aqueous solution. Ta.
(2)ニトリラーゼ発現プラスミドの作製
本実施例では、表1のAcidovorax facilis 72W由来のニトリラーゼ(AfNit)を使用するため、AfNitの発現プラスミドは以下のように作製した。AfNitニトリラーゼのアミノ酸配列(配列番号2)をコードするDNA(配列番号1)を合成し、発現ベクターpET-26b(+)(Novagen)のNdeI-XhoIサイトにクローニングした(遺伝子合成はジェンスクリプトジャパンで実施)。
(2) Preparation of nitrilase expression plasmid In this example, since the nitrilase (AfNit) derived from Acidovorax facilis 72W shown in Table 1 was used, the AfNit expression plasmid was prepared as follows. DNA (SEQ ID NO: 1) encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of AfNit nitrilase was synthesized and cloned into the NdeI-XhoI site of the expression vector pET-26b(+) (Novagen) (gene synthesis was performed at GenScript Japan). implementation).
(3)ニトリラーゼ発現大腸菌の培養
大腸菌(E. coli)BL21(DE3)株のコンピテントセル(Zip Competent Cell BL21 (DE3)、フナコシ)を氷上で融解し、(2)で作製したプラスミドDNA溶液を混合して氷上で10分間静置した。42℃で45秒間ヒートショックを加えた後、再度氷冷し、SOC培地を添加した。37℃で1時間振とう培養を行った後、LB寒天培地(カナマイシン硫酸塩50mg/L含有)に塗布し、37℃で一晩静置培養を行った。得られたコロニーを、LB培地(シグマアルドリッチL3522、カナマイシン硫酸塩50mg/Lを含む)100mlに植菌した。温度37℃、振とう回転数160rpmで3時間培養を行った後、IPTG(和光純薬)を終濃度0.2mMとなるように添加し、温度を25℃に変更して、さらに18時間培養を行った。
(3) Cultivation of nitrilase-expressing E. coli Competent cells of E. coli BL21 (DE3) (Zip Competent Cell BL21 (DE3), Funakoshi) were thawed on ice, and the plasmid DNA solution prepared in (2) was thawed on ice. The mixture was mixed and left on ice for 10 minutes. After applying heat shock at 42°C for 45 seconds, the mixture was cooled on ice again and SOC medium was added. After culturing with shaking at 37°C for 1 hour, it was applied to an LB agar medium (containing 50 mg/L of kanamycin sulfate), and statically cultured at 37°C overnight. The obtained colonies were inoculated into 100 ml of LB medium (Sigma-Aldrich L3522, containing 50 mg/L of kanamycin sulfate). After culturing for 3 hours at a temperature of 37°C and shaking speed of 160 rpm, IPTG (Wako Pure Chemical Industries) was added to a final concentration of 0.2mM, the temperature was changed to 25°C, and the culture was continued for an additional 18 hours. went.
(4)ニトリラーゼ粗酵素の調製
(3)で得られた培養液を遠心分離(5,000×g、10分間)し、上清を廃棄した。沈殿した菌体に50mM リン酸緩衝液(pH 8.0)を5ml添加して懸濁した後、再度、遠心分離(5,000×g、10分間)により上清を廃棄した。沈殿した菌体に50mM リン酸緩衝液(pH 8.0)を3ml添加して懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機(BRANOSON D250、マイクロチップ使用、出力20%)で10分間破砕した。破砕液を遠心分離(10,000×g、10分間)し、得られた上清を粗酵素とした。粗酵素のタンパク質濃度は、IgG(バイオラッド)を標準タンパク質として、Bio-Rad protein assay(バイオラッド)を用いて測定した。
(4) Preparation of crude nitrilase enzyme The culture solution obtained in (3) was centrifuged (5,000 x g, 10 minutes), and the supernatant was discarded. After adding 5 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) to the precipitated bacterial cells and suspending them, the supernatant was discarded by centrifugation again (5,000 x g, 10 minutes). 3 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) was added to the precipitated bacterial cells and suspended. The obtained cell suspension was disrupted for 10 minutes using an ultrasonic disruptor (BRANOSON D250, using a microchip, output 20%). The disrupted solution was centrifuged (10,000×g, 10 minutes), and the resulting supernatant was used as crude enzyme. The protein concentration of the crude enzyme was measured using Bio-Rad protein assay (Bio-Rad) using IgG (Bio-Rad) as a standard protein.
(5)アミノアセトニトリルの加水分解
4.5重量%アミノアセトニトリル、0.06重量%水酸化カリウム、0.2重量%酵素(タンパク質量基準)のpH12反応液を調合して、30℃にて反応を開始した。反応開始1時間後の反応液を液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析してグリシンを定量した。HPLCによる分析は以下の条件にて行った。限外濾過フィルターを用いて反応液から酵素を分画した後、o-フタルアルデヒドを用いてグリシンを蛍光誘導体化した。誘導化処理した試料中のグリシンをAdvanceBio AAA(4.6×100mm)カラムを装着したHPLC(Agilent1
220、UV検出器)にて定量した。分析の結果、グリシンの生成活性は12.2g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
(5) Hydrolysis of aminoacetonitrile
A pH 12 reaction solution containing 4.5% by weight aminoacetonitrile, 0.06% by weight potassium hydroxide, and 0.2% by weight enzyme (based on protein amount) was prepared, and the reaction was started at 30°C. One hour after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by liquid chromatography (HPLC) to quantify glycine. Analysis by HPLC was conducted under the following conditions. After fractionating the enzyme from the reaction solution using an ultrafiltration filter, glycine was fluorescently derivatized using o-phthalaldehyde. Glycine in the derivatized sample was analyzed using HPLC (Agilent1) equipped with an AdvanceBio AAA (4.6 x 100 mm) column.
220, UV detector). As a result of the analysis, the glycine production activity was 12.2g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例2]
実施例1と同様に、反応液を調合して、30℃にて反応を開始した。反応開始24時間後の反応液を液体クロマトグラフィーで分析してグリシンを定量した。グリシンの生成活性は1.3 g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 2]
A reaction solution was prepared in the same manner as in Example 1, and the reaction was started at 30°C. The reaction solution 24 hours after the start of the reaction was analyzed by liquid chromatography to quantify glycine. The glycine production activity was 1.3 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例3]
実施例1と同様に、アミノアセトニトリルの合成と粗酵素の調製を行った。4.5重量%アミノアセトニトリル、3.3重量%アンモニア、0.2重量%酵素(タンパク質量基準)を含むpH12の反応液を調合して、30℃にて反応を開始した。反応開始24時間後の反応液を液体クロマトグラフィーで分析してグリシンを定量した。グリシンの生成活性は1.2 g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 3]
In the same manner as in Example 1, aminoacetonitrile synthesis and crude enzyme preparation were performed. A reaction solution having a pH of 12 containing 4.5% by weight aminoacetonitrile, 3.3% by weight ammonia, and 0.2% by weight enzyme (based on protein amount) was prepared, and the reaction was started at 30°C. The reaction solution 24 hours after the start of the reaction was analyzed by liquid chromatography to quantify glycine. The glycine production activity was 1.2 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例4]
本実施例では、ニトリラーゼとして、表1のAchromobacter denitrificans由来ニトリラーゼ(Nit02)を使用した。実施例1と同様にして、ニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始1時間後のグリシンの生成活性は30.2 g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 4]
In this example, the Achromobacter denitrificans-derived nitrilase (Nit02) shown in Table 1 was used as the nitrilase. Nitrilase crude enzyme was prepared in the same manner as in Example 1, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 1 hour after the start of the reaction was 30.2 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例5]
本実施例では、ニトリラーゼとして、表1のAcidovorax facilis由来ニトリラーゼ(Nit01)を使用した。実施例1と同様にしてニトリラーゼ粗酵素(Hisタグ付加)を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。但し、Nit01遺伝子の終止コドンを削除してクローニングし、Nit01アミノ酸配列のC末端にLeu-Argを介して6×Hisタグが付加されるようにした。反応開始5時間後のグリシンの生成活性は5.0 g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 5]
In this example, Acidovorax facilis-derived nitrilase (Nit01) shown in Table 1 was used as the nitrilase. Nitrilase crude enzyme (His-tagged) was prepared in the same manner as in Example 1, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. However, the stop codon of the Nit01 gene was deleted and cloned, so that a 6×His tag was added to the C-terminus of the Nit01 amino acid sequence via Leu-Arg. The glycine production activity 5 hours after the start of the reaction was 5.0 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例6]
本実施例では、ニトリラーゼとして、表1のNovibacillus thermophilus由来ニトリラーゼ(Nit09)を用いた。実施例5と同様にして、C末端にHisタグが付加したニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は0.1g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 6]
In this example, Novibacillus thermophilus-derived nitrilase (Nit09) shown in Table 1 was used as the nitrilase. In the same manner as in Example 5, a crude nitrilase enzyme with a His tag added to the C-terminus was prepared, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was 0.1 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例7]
本実施例では、ニトリラーゼとして、表1のRhodosporidium toruloides(Rhodotorula gracilis)由来ニトリラーゼ(Nit07)を用いた。実施例5と同様にして、C末端にHisタグが付加したニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は0.5 g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 7]
In this example, the nitrilase derived from Rhodosporidium toruloides (Rhodotorula gracilis) shown in Table 1 (Nit07) was used as the nitrilase. In the same manner as in Example 5, a crude nitrilase enzyme with a His tag added to the C-terminus was prepared, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was 0.5 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例8]
本実施例では、ニトリラーゼとして、表1のRhodosporidium toruloides(Rhodotorula gracilis)由来ニトリラーゼ(Nit08)を用いた。実施例5と同様にして、C末端にHisタグが付加したニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は0.3 g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 8]
In this example, the nitrilase derived from Rhodosporidium toruloides (Rhodotorula gracilis) (Nit08) shown in Table 1 was used as the nitrilase. In the same manner as in Example 5, a crude nitrilase enzyme with a His tag added to the C-terminus was prepared, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was 0.3 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例9]
本実施例では、ニトリラーゼとして、表1のRhodococcus sp. NS1由来ニトリラーゼ(Nit18)を用いた。実施例5と同様にして、C末端にHisタグが付加したニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は0.5g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 9]
In this example, the Rhodococcus sp. NS1-derived nitrilase (Nit18) shown in Table 1 was used as the nitrilase. In the same manner as in Example 5, a crude nitrilase enzyme with a His tag added to the C-terminus was prepared, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was 0.5 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[実施例10]
本実施例では、ニトリラーゼとして、表1のRhodococcus rhodochrous由来ニトリラーゼ(SKNit)を用いた。実施例5と同様にして、ニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は0.06g(グリシン)/g(酵素)/Hrであった。
[Example 10]
In this example, Rhodococcus rhodochrous-derived nitrilase (SKNit) shown in Table 1 was used as the nitrilase. In the same manner as in Example 5, nitrilase crude enzyme was prepared and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was 0.06 g (glycine)/g (enzyme)/Hr.
[比較例1]
比較例として、表3に記載のAlcaligenes faecalis ATCC8750由来のニトリラーゼ(ALNit)を用いた。Alcaligenes faecalis ATCC8750は、特許文献2において、酵素法によるアミノアセトニトリルからのグリシン製造に用いられている。ALNitの遺伝子情報は、Alcaligenes faecalis ATCC8750株のニトリラーゼをクローニングしている文献(Journal of Fermentation and Bioengineering Volume 73, Issue 6, 1992, Pages 425-430)のFIG.2に記載されているアミノ酸N末端配列を有するタンパク質を、Alcaligenes faecalis ATCC8750株のゲノム配列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001298815.1)から探索することで取得した。実施例1と同様にして、ニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は検出限界以下であった。
[Comparative example 1]
As a comparative example, nitrilase derived from Alcaligenes faecalis ATCC8750 (ALNit) listed in Table 3 was used. Alcaligenes faecalis ATCC8750 is used in the production of glycine from aminoacetonitrile by an enzymatic method in Patent Document 2. The genetic information of ALNit is the amino acid N-terminal sequence described in FIG. 2 of the literature on cloning nitrilase of Alcaligenes faecalis ATCC8750 strain (Journal of Fermentation and Bioengineering Volume 73, Issue 6, 1992, Pages 425-430). was obtained by searching the genome sequence of Alcaligenes faecalis ATCC8750 strain (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001298815.1). Nitrilase crude enzyme was prepared in the same manner as in Example 1, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was below the detection limit.
[比較例2]
比較例として、表3に記載のArthrobacter Aurescense CYC705由来のニトリラーゼ(AaNit)を用いた。AaNitは、J. Gen. Appl. Microbiol. 60, 207(2014)においてニトリラーゼ活性が報告されている。実施例1と同様にして、ニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は検出限界以下であった。
[Comparative example 2]
As a comparative example, Arthrobacter Aurescense CYC705-derived nitrilase (AaNit) listed in Table 3 was used. AaNit has been reported to have nitrilase activity in J. Gen. Appl. Microbiol. 60, 207 (2014). Nitrilase crude enzyme was prepared in the same manner as in Example 1, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was below the detection limit.
[比較例3]
比較例として、表3に記載のRhodococcus rhodochrous tg1-A6からクローニングしたニトリラーゼ(RrNit)を用いた。RrNitは、Appl. Biochem. Biotechnol. 160, 393(2008)においてニトリラーゼ活性が報告されている。実施例1と同様にして、ニトリラーゼ粗酵素を調製し、アミノアセトニトリルの加水分解を行った。反応開始24時間後のグリシンの生成活性は検出限界以下であった。
[Comparative example 3]
As a comparative example, nitrilase (RrNit) cloned from Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 listed in Table 3 was used. RrNit has been reported to have nitrilase activity in Appl. Biochem. Biotechnol. 160, 393 (2008). Nitrilase crude enzyme was prepared in the same manner as in Example 1, and aminoacetonitrile was hydrolyzed. The glycine production activity 24 hours after the start of the reaction was below the detection limit.
これらの酵素を用いた評価結果を表2に示す。また、比較例として使用した酵素を表3に示す。 Table 2 shows the evaluation results using these enzymes. Table 3 also shows the enzymes used as comparative examples.
本発明によれば、グリコロニトリルのアミノ化工程で得られるアミノアセトニトリル水溶液に直接ニトリラーゼを作用させることが可能となり、効率的にグリシンを製造することが可能となる。 According to the present invention, it becomes possible to cause nitrilase to act directly on the aminoacetonitrile aqueous solution obtained in the amination step of glycolonitrile, and it becomes possible to efficiently produce glycine.
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。 All publications, patents, and patent applications cited herein are incorporated by reference in their entirety.
Claims (7)
(1)配列番号2、4、6、8、10、12、14、及び16のいずれかに示されるアミノ酸配列
(2)配列番号2、4、6、8、10、12、14、及び16のいずれかに示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列 The method according to claim 1, wherein the nitrilase has the following amino acid sequence (1) or (2).
(1) Amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16 (2) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16 An amino acid sequence that has 80% or more identity with the amino acid sequence shown in any of the above and encodes a protein that has nitrilase activity.
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